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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Faculdade de Medicina
EXPRESSÃO DA ANGIOTENSINA-(1-7),
DO RECEPTOR Mas E DA
ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA
TIPO 2
NO ENDOMÉTRIO HUMANO
JOÃO VAZ DA SILVA
Belo Horizonte
2008
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JOÃO VAZ DA SILVA
EXPRESSÃO DA ANGIOTENSINA-(1-7),
DO RECEPTOR Mas E DA
ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA
TIPO 2
NO ENDOMÉTRIO HUMANO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde da Mulher, do
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal de Minas Gerais, para a obtenção do
título de Doutor em Medicina.
Área de concentração: Ginecologia e
Obstetrícia
Orientador:Prof.Dr. Fernando Marcos dos Reis
Belo Horizonte
2008
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Dedicatória
Dedico esta tese a minha esposa Helena, e aos
meus filhos Eduardo e Gustavo, pelo apoio
incondicional, e pelo estímulo durante todo o
tempo.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Fernando Marcos dos Reis, pesquisador arguto, de rara
grandeza, agradeço por ter aceito me orientar. Devo-lhe a minha introdução
em um mundo científico de alto nível. Aprendi muito. Agradeço o convívio, a
amizade, a disponibilidade e as horas passadas na bancada.
À Professora Adelina Marta dos Reis, pela amizade, pelo acolhimento e por me
franquear as portas do Laboratório de Endocrinologia do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG.
Ao Professor Cândido C. Coimbra e Professora Umeko Marubyashi pelo
estímulo e conselhos no convívio diário, o meu muito obrigado.
Ao Professor Robson Augusto Souza dos Santos, por sua contribuição
intelectual, suprimento de reagentes e abertura do Laboratório de Hipertensão
para a realização deste trabalho.
Ao Professor João Gilberto de Castro e Silva pelo apoio incondicional e
incentivo ao meu trabalho.
Aos Professores João Lúcio dos Santos Junior e Marcos Mendonça, pelo
estímulo.
Aos Professores Sérgio Veloso Brant Pinheiro e Agnaldo Lopes da Silva Filho,
pela contribuição neste trabalho.
À Dra. Márcia C. Ferreira e à Profa. Márcia Mendonça Carneiro, pelo material
cedido, fundamental na execução do trabalho, muito obrigado.
Aos colegas do Laboratório, Juliana Barra, Gregório e Virgínia Pereira, que me
auxiliaram nos primeiros passos. Ainda colegas de bancada, Alécio, Laura,
Daniele Boissu, Alex, Samuel, Fabiano, Marcivane, Michelle, Renato, e tantos
outros, pelo ambiente agradável no local de trabalho.
Ao insuperável André Pimenta, químico do Laboratório de endocrinologia,
Janine C. Ivo e Patrícia Mitre, sempre prontos a auxiliar.
À Elba, amiga e colaboradora, Emanuelle e Roseli, obrigado.
Ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro.
RESUMO
O sistema renina-angiotensina está presente em diversos tipos de
tecidos, além do sistema cardiovascular. A angiotensina-(1-7), [Ang-(1-7)] é
um componente do sistema renina-angiotensina, que produz efeito
vasodilatador, anti-angiogênico e anti-proliferativo em diversos órgãos. A Ang-
(1-7) é produzida a partir da clivagem da Ang-II pela enzima conversora de
angiotensina tipo 2 (ECA2) e atua por meio de um receptor acoplado à
proteína G específico, o receptor Mas. O objetivo deste estudo foi avaliar se o
endométrio humano expressa Ang-(1-7), o receptor Mas e a enzima
conversora de angiotensina tipo 2 (ECA2), em diferentes fases do ciclo
menstrual. Usando radioimunoensaio, Ang-(1-7) foi detectada no lavado
endometrial em concentrações picomolares. Por imunofluorescência, tanto o
peptídeo como seu receptor foram identificados em células endometriais
cultivadas (epiteliais e estromais). Por imunoistoquímica, Ang-(1-7) foi
localizada no endométrio em todas as fases do ciclo menstrual, sendo mais
concentrada no epitélio glandular da fase secretora intermediária e tardia, bem
como no estroma da fase proliferativa. Este padrão correspondeu à expresão
do mRNA para ECA2, que foi significativamente mais abundante nas células
epiteliais do que nas estromais (aumento de duas vezes, p<0,05) e na fase
secretora em relação à fase proliferativa (aumento de 6,6 vezes, p<0,01). O
receptor Mas foi detectado com a mesma intensidade nas células epiteliais e
estromais e não variou durante o ciclo menstrual, apesar da redução no seu
mRNA nas amostras de fase secretora. Em conclusão, o peptídeo vasoativo
Ang-(1-7), a enzima envolvida na sua síntese e seu receptor Mas são
expressos no endométrio humano. O peptídeo Ang-(1-7) e a enzima ECA2 têm
sua expressão aumentada na fase secretora do ciclo menstrual.
Palavras-chave: Endométrio. Angiotensina-(1-7). Mas. Sistema renina-
angiotensina. Ciclo menstrual.
ABSTRACT
Angiotensin (Ang)-(1-7) is a newly characterized member of the
renin-angiotensin system, which has vasodilatory, anti-angiogenic and anti-
proliferative effects in several organs. Ang-(1-7) is produced from cleavage of
Ang-II by angiotensin-converting-enzyme type 2 (ACE2), and acts through a
specific G protein-coupled receptor, Mas. The aim of the present study was to
investigate whether the human endometrium expresses Ang-(1-7), the receptor
Mas, and the mRNA encoding ACE2 at different phases of menstrual cycle. By
radioimmunoassay, Ang-(1-7) was detected in endometrial wash fluid at
picomolar concentrations. Using immunofluorescence, both the peptide and its
receptor were identified in cultured endometrial epithelial and stromal cells. By
immunohistochemistry, Ang-(1-7) was localized in the endometrium throughout
menstrual cycle, being more concentrated in the glandular epithelium of mid-
and late secretory phase and in the stroma of early proliferative phase. This
pattern corresponded to the ACE2 mRNA, which was significantly more
abundant in epithelial cells than in stromal cells (2-fold increase, p<0.05) and in
the secretory vs. proliferative phase (6.6-fold increase, p<0.01). The receptor
Mas was equally distributed between epithelial and stromal cells and did not
change during menstrual cycle. In conclusion, the vasoactive peptide Ang-(1-7),
the enzyme involved in its synthesis and its receptor Mas are all expressed in
the human endometrium, and the peptide is up-regulated during the secretory
phase of menstrual cycle. The physiological role of this peptide system in
normal and pathological endometrium warrants further investigation.
Key words: Endometrium. Angiotensin-(1-7). Mas. Renin-angiotensin system.
Menstrual cycle.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
AKT Proteína Kinase B
Ang Angiotensina
cAMP Adenosina monofosfato cíclico
COEP Comitê de Ética em Pesquisa
CT
Threshold cycle
DAB Diaminobenzidina
DEPC Dietilpirocarbonato
DEPE Diretoria de Ensino, Pesquisa e Extensão
DIU Dispositivo intra-uterino
DNA Ácido desoxirribonucléico
ECA Enzima conversora de angiotensina
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
EGF Fator de crescimento epidérmico
ERK Sinal extracelular de kinase
FGF Fator de crescimento de fibroblasto
HC Hospital das Clínicas
hCG Gonadotrofina coriônica humana
ICB Instituto de Ciências Biológicas
IGFBP Proteína ligadora do fator de crescimento insulina “símile”
IRS1 Substrato para receptor de insulina 1
JAK2
Janus kinase 2
MAPK Proteina ativadora de mitose kinase
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
NCBI
National Center for Biotechnology Information
PBS
Solução salina de fosfato tamponada (Phosfate buffered saline)
PLA2 Fosfolipase A2
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
SNC Sistema nervoso central
SRA Sistema renina-angiotensina
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras
Figura 1 - Diagrama representando as três séries de casos incluídas
no estudo, além das amostras de culturas de células de
endométrio........................................................................................
36
Figura 2 - Curvas de dissociação da PCR em tempo real..................... 44
Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose 4% comprovando a
presença de banda única nos produtos de amplificação dos genes
da ECA2, do receptor Mas e da proteína ribossomal S26...............
45
Figura 4 - Curvas de amplificação da PCR em tempo real.................... 46
Figura 5 - Curvas de regressão linear utilizadas para cálculo dos
resultados da PCR em tempo real....................................................
47
Figura 6 - Localização de Ang-(1-7) no endométrio humano em
diferentes fases do ciclo menstrual..................................................
50
Figura 7 - Imunofluorescência e microscopia confocal mostrando a
localização intracelular da imunomarcação para Ang-(1-7) em
células endometriais cultivadas........................................................
51
Figura 8 - Expressão do mRNA para ECA2 em células endometriais
cultivadas e em amostras de tecido endometrial datadas como
endométrio proliferativo ou periovulatório (Prol+M) vs. secretor......
53
Figura 9 - Localização do receptor Mas no endométrio humano em
diferentes fases do ciclo menstrual..................................................
54
Figura 10 - Imunofluorescência e microscopia confocal mostrando a
localização intracelular da imunomarcação para Mas em células
endometriais cultivadas....................................................................
55
Figura 11 - Expressão do mRNA para o receptor Mas em células
endometriais cultivadas e em amostras de tecido endometrial
datadas como endométrio proliferativo ou periovulatório (Prol+M)
vs. secretor.......................................................................................
55
Figura 12 - Resumo esquemático da intensidade de imunocoloração
para Ang-(1-7) e seu receptor Mas nas amostras endometriais
obtidas em diferentes fases do ciclo menstrual................................
56
Quadro
Quadro 1 - Oligonucleotídeos iniciadores usados nas reações de PCR
em tempo real..........................................................................
44
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................... 14
1.1 O endométrio humano..................................................................... 16
1.1.1 Irrigação do endométrio................................................................ 17
1.1.2 Modificações cíclicas do endométrio............................................ 17
1.1.3 Decidualização.............................................................................. 20
1.1.4 Alterações funcionais do endométrio............................................ 21
1.2 O sistema renina-angiotensina (SRA)............................................. 22
1.2.1 Angiotensina II.............................................................................. 24
1.2.2 Angiotensina-(1-7)..................................................................... 24
1.2.2.1 Formação da angiotensina-(1-7)............................................... 26
1.2.2.2 Mecanismo da Ang-(1-7) na regulação da pressão
arterial...................................................
27
1.2.2.3 Mecanismos de ação da Ang-(1-7) no nível molecular.............. 27
1.2.3 A relação da ANG-(1-7) com a ANG II.......................................... 28
1.2.4 O receptor Mas............................................................................. 28
1.3 A relação do sistema renina-angiotensina com o sistema
reprodutor...............................................................................................
30
1.3.1 O sistema renina-angiotensina no endométrio............................. 31
2 OBJETIVOS........................................................................................ 33
2.1 Objetivo geral................................................................................... 33
2.2 Objetivos específicos....................................................................... 33
3 METODOLOGIA................................................................................. 34
3.1 Parecer ético.................................................................................... 34
3.2 Sujeitos da pesquisa........................................................................ 34
3.3 Dosagem de Ang-(1-7) por radioimunoensaio................................. 36
3.4 Imunoistoquímica do tecido endometrial...................................... 37
3.4.1 Princípios da técnica..................................................................... 37
3.4.2 Materiais utilizados........................................................................ 38
3.4.3 Seqüência do processo................................................................. 39
3.4.4 Análise da imunoistoquímica..................................................... 40
3.5 Avaliação da expressão gênica da ECA2 e do receptor Mas.......... 40
3.5.1 Extração do RNA total................................................................... 40
3.5.2 Quantificação do RNA extraído..................................................... 41
3.5.3 Síntese do DNA complementar..................................................... 41
3.5.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.............. 42
3.5.5 Análise da especificidade dos produtos da PCR.......................... 45
3.5.6 Análise quantitativa dos resultados do PCR................................. 46
3.6 Imunofluorescência e microscopia confocal.................................... 48
3.7 Análise estatística............................................................................ 48
4 RESULTADOS.................................................................................... 49
4.1 Detecção de Ang-(1-7) imunorreativa no lavado endometrial.......... 49
4.2 Localização da Ang-(1-7) no endométrio........................................ 49
4.3 Expressão da enzima conversora de angiotensina tipo 2 no
endométrio.............................................................................................
51
4.4 Localização do receptor Mas no endométrio................................... 51
4.5 Expressão do mRNA do receptor Mas nas células epiteliais e
estromais do endométrio........................................................................
52
4.6 Resumo dos achados de imunolocalização da Ang-(1-7) e Mas no
endométrio humano...............................................................................
56
5 DISCUSSÃO....................................................................................... 57
6 CONCLUSÕES................................................................................... 63
REFERÊNCIAS...................................................................................... 64
ANEXO .................................................................................................. 76
14
1 INTRODUÇÃO
O estudo da célula e do seu metabolismo sempre foi um desafio aos
pesquisadores devido, em parte, ao tamanho desta estrutura e, em contraste, à
variada gama de substâncias presentes no seu interior. Outro aspecto que
também dificulta a investigação é a especialização das células, também bastante
diversificada. Foram necessários métodos e técnicas apropriados, desenvolvidos
ao longo do tempo, para vencer os obstáculos impostos.
As células apresentam, ainda, diferentes reações frente a diversos
estímulos do próprio organismo e do meio exterior, o que aumenta as variáveis a
serem consideradas nos estudos. Por vezes, uma mesma substância produz
determinado estímulo em um tipo de célula e, em outro tipo celular, o efeito será o
inverso. Como exemplo disso, tem-se a prostaglandina E, que pode tanto inibir a
adenosina monofosfato cíclico (AMPc) quanto estimular a sua ação, em tipos
celulares distintos. Isto se deve a diferentes tipos de proteínas acopladas ao
receptor, que comutam o efeito de um mesmo estímulo (LEHNINGER, 2002).
Outras funções celulares no organismo são tão importantes para a vida,
que há mais de um efetor responsável por ela, o que aumenta a segurança na
execução. A seleção natural se encarregou disto. Um exemplo é o estímulo para
clivar o glicogênio, em que várias substâncias como a adrenalina, o glucagon e o
hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) podem desempenhar este estímulo
(LODISH et al., 2005). Outra situação encontrada é uma mesma proteína
exercendo sua função em substratos diferentes; fato não raro, como a enzima
conversora de angiotensina (ECA), que produz a angiotensina II (Ang II) e
também degrada a bradicinina (ERDÖS, 1990; FERRARIO, 2003).
Geralmente, um tecido típico é constituído de um mesmo tipo celular,
como o tecido muscular, mas outros são mais complexos e apresentam mais de
uma espécie celular na sua composição. O endométrio humano é um exemplo,
sendo constituído de células epiteliais na sua superfície, que se invaginam na
profundidade tecidual, formando o lúmen glandular. As células do epitélio
superficial não apresentam as mesmas modificações cíclicas do epitélio glandular,
apesar de aparentemente serem o mesmo tipo celular (HALBE, 1993). Abaixo
15
dessa camada epitelial encontra-se um conjunto celular estromal bem distinto do
epitélio superficial, apresentando morfologia celular que se modifica durante o
ciclo menstrual. Esse tecido também apresenta alterações vasculares e, em
determinada época do ciclo menstrual, ocorre infiltração leucocitária, com
predomínio de mononucleares, que são também participantes ativos do
metabolismo tecidual (JABBOUR et al., 2005). Trata-se de um tecido heterogêneo
e dinâmico, com intenso metabolismo relacionado ao crescimento celular,
mecanismo de apoptose, angiogênese, secreção glandular e mecanismo de
controle imunológico. Para tanto, existe intensa produção de fatores de
crescimento, como fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento
epidérmico (EGF), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF),
prostaglandinas, prolactina, interleucinas, óxido nítrico e peptídeos do sistema
renina-angiotensina (SRA). Diz-se que o endométrio é um dos tecidos mais
complexos do organismo (SPEROFF; FRITZ, 2005). Compreender e estudar
essas substâncias autócrinas e parácrinas é de suma importância para elucidar
funções relacionadas com a reprodução e controle do crescimento celular ou
compreender melhor o controle do fluxo sangüíneo menstrual.
Por isto, frente à profusão de substâncias parácrinas, a progressão do
conhecimento relacionado ao metabolismo celular, nos diversos tipos de tecido,
se faz de maneira lenta e gradual, pela agregação de novos achados, de
pequenas descobertas, por vezes desprovidas de utilidade imediata. Esses novos
conhecimentos constituem as unidades, os tijolos que constroem o entendimento
de algo maior.
O sistema renina-angiotensina vem evoluindo desta maneira,
gradativamente, há mais de um século. Com a aglutinação de novas descobertas,
suas funções foram ampliadas, tornando-se então um sistema mais complexo,
ocorrendo, inclusive, mudanças conceituais.
Esse sistema foi caracterizado no passado como substâncias
localizadas nos rins, que agiriam na pressão do sangue (GASPARO et al., 2000).
Posteriormente, passou a ser compreendido como um conjunto de substâncias
presentes na circulação, algumas das quais atuariam em sítios distantes do local
onde foram produzidas (CAMPBELL, 1987).
Um fator importante que veio auxiliar e ampliou o conhecimento do SRA
foi o aparecimento e aprimoramento, nas últimas três décadas, dos métodos de
16
biologia molecular e de análise da expressão gênica, tendo permitido o estudo e
detecção da expressão de proteínas, em determinado momento, na célula (LI et
al., 2000; SOUBRIER; CORVOL, 2000). Isto acrescentou novos dados e propiciou
uma ampliação conceitual, confirmando, então, ações autócrinas e parácrinas, em
diversos tecidos e órgãos, não relacionadas ao controle da pressão arterial e ao
equilíbrio hidroeletrolítico (HUSAIN et al., 1983), sugerindo outras ações, seja na
função da célula madura ou no processo da diferenciação celular (GASPARO et
al., 2000).
1.1 O endométrio humano
O endométrio é um tecido responsivo a hormônios esteróides e a
fatores autócrinos e parácrinos e apresenta modificações morfológicas e
funcionais em um período de tempo relativamente curto, que compreende o ciclo
menstrual. As alterações morfológicas apresentam sincronismo com o ciclo
menstrual, permitindo a compreensão parcial da fisiologia, a partir da avaliação
específica dos componentes vasculares, glandulares e estromais desse tecido
(GLASSER et al., 2000; NOYES; HERTIG; ROCK, 1950).
O endométrio origina-se, embriologicamente, durante a fusão dos
ductos de Müller, a partir da 10ª semana de gestação, com o início da formação
do útero; e completa sua embriogênese na 20ª semana da gravidez. O epitélio
que reveste internamente a cavidade dos ductos müllerianos dará origem ao
epitélio endometrial e o mesênquima adjacente a este epitélio dará origem ao
estroma (GLASSER et al., 2000; SPEROFF; FRITZ, 2005).
Morfologicamente, o endométrio apresenta na superfície um epitélio
simples, cúbico, que reveste toda a cavidade uterina, com algumas células
ciliadas que se concentram em maior número perto dos orifícios glandulares e são
raras dentro do lúmen glandular, aumentando em número sob estímulo
estrogênico. Apesar do revestimento da cavidade uterina ser constituído do
mesmo epitélio que reveste as glândulas, funcionalmente não mostra as mesmas
transformações cíclicas do epitélio glandular (HALBE, 1993).
Abaixo do epitélio superficial aparece o estroma endometrial. É
constituído principalmente por células pequenas e fusiformes, com escasso
17
citoplasma, e fibras colágenas entremeadas, no início do ciclo menstrual. Com o
evoluir do ciclo, essas células apresentam aumento do tamanho e os núcleos se
tornam mais redondos. A região superficial do estroma é intensamente reativa aos
hormônios esteróides e no final do ciclo menstrual é conhecida como camada
compacta. Nessa região está localizado o colo das glândulas, com estrutura mais
retilínea do que o corpo glandular, que aparece em região mais profunda.
A região média do estroma, também conhecida como camada
esponjosa, apresenta a maior concentração de glândulas endometriais, sendo
este epitélio glandular muito reativo, também, aos hormônios esteróides, com
alterações morfológicas marcantes durante o ciclo menstrual.
Na região profunda do estroma, ou camada basal, aparecem algumas
glândulas que apresentam pouca alteração morfológica durante o ciclo menstrual,
funcionando como região tecidual permanente, como reserva, contribuindo para a
regeneração do tecido durante o período menstrual (HALBE, 1993).
1.1.1 Irrigação do endométrio
No local em que a artéria radial deixa o miométrio e penetra no
endométrio, ela se bifurca, dando origem a um ramo curto que irá nutrir a camada
basal do tecido endometrial (arteríola basal). A jusante da bifurcação, o vaso
passa a uma forma helicoidal e percorre toda a espessura do endométrio,
ramificando em capilares que se anastomosam com outros capilares e vênulas.
Essas artérias espiraladas são sensíveis aos estímulos hormonais e são
encontradas exclusivamente em primatas (HALBE, 1993).
1.1.2 Modificações cíclicas do endométrio
A) Endométrio menstrual
Em um ciclo idealizado de 28 dias, durante o primeiro dia observa-se
retração do tecido endometrial, com formação de áreas hemorrágicas
subepiteliais e infiltração leucocitária. No segundo dia, já se pode verificar
18
desorganização tecidual ampla, exibindo focos de necrose com grandes áreas do
tecido, sofrendo clivagem na junção da camada esponjosa com a camada basal e
amplas áreas hemorrágicas. O terceiro dia já apresenta um início de regeneração
tecidual nos cotos glandulares remanescentes da camada basal. Com a cessação
do fluxo menstrual, geralmente todo o epitélio que reveste a cavidade uterina se
encontra reconstituído (GLASSER et al., 2000; JABBOUR et al., 2005).
B) Fase proliferativa
Após o fluxo menstrual, o endométrio é fino, medindo, em média, 1 mm
de espessura (HALBE, 1993). À microscopia eletrônica, as células apresentam
vários ribossomos e pouco retículo endoplasmático, com aumento gradativo dos
corpúsculos de Golgi e aumento no tamanho das mitocôndrias (LUDWIG;
SPORNITZ, 1991).
A fase proliferativa inicial é marcada pelo aumento do número de
mitoses, aumento do ácido desoxirribonucléico (DNA) e do ácido ribonucléico
(RNA) citoplasmático, refletindo mais um metabolismo de crescimento celular
(GLASSER et al., 2000).
Histologicamente, à microscopia ótica, a fase proliferativa inicial é
caracterizada por um tecido endometrial fino, variando entre 0,5 e 2 mm de
espessura. Apresenta glândulas retilíneas, com diâmetro luminal estreito,
formadas por epitélio colunar baixo e núcleos redondos situados na base das
células (NOYES; HERTIG; ROCK, 1950).
Na fase proliferativa média, o endométrio tem espessura que atinge 5
mm, às expensas do crescimento celular e de um edema discreto e transitório no
estroma. As mitoses são freqüentes e as células ciliadas aumentam em número
(LUDWIG; SPORNITZ, 1991; NOYES; HERTIG; ROCK, 1950). O epitélio
glandular aparece como colunar alto, as glândulas se tornam um pouco mais
tortuosas, originando o fenômeno da pseudo-estratificação (SPEROFF; FRITZ,
2005).
A fase proliferativa avançada mostra glândulas longas, diminuição das
mitoses e expressão máxima da pseudo-estratificação acompanhada da
diminuição do edema estromal (NOYES; HERTIG; ROCK, 1950)
19
C) Fase secretora
Após a proliferação, o endométrio estabiliza-se numa espessura média
de 6 mm, proporcionado, em parte, pela diminuição dos níveis plasmáticos do
estrogênio e sob o efeito da progesterona (GRAHAM; CLARKE, 1997).
Considera-se que a progesterona produz esse resultado por inibição parcial sobre
os receptores de estrogênio (CLARKE; SUTHERLAND, 1990; OKULICZ;
BALSAMO; TAST, 1993). O endométrio secretor, diferentemente do proliferativo,
tem modificações gradativas e nítidas, com constância cronológica, o que
possibilita a datação das amostras obtidas desse tecido. As modificações nos
primeiros sete dias da fase secretora ocorrem principalmente no epitélio glandular
e, na última semana do ciclo, preponderam as modificações no estroma
endometrial (NOYES; HERTIG; ROCK, 1950; SPEROFF; FRITZ, 2005).
Histologicamente, a fase secretora do endométrio inicia-se com o
aparecimento de vacúolos entre os núcleos e a base das células no epitélio
glandular, aproximadamente 48 horas (16˚ dia do ciclo) após a ovulação, apesar
da microscopia eletrônica perceber o fenômeno com mais antecedência
(LUDWIG; SPORNITZ, 1991). Nota-se também pseudo-estratificação no epitélio
glandular e mitoses. Com o aumento do número de vacúolos nas células
glandulares, os núcleos se posicionam no centro das células, de maneira
simétrica, com o citoplasma acima e os vacúolos abaixo dos núcleos,
desaparecendo a pseudo-estratificação. As mitoses nas células glandulares e
estromais estão presentes. Com o evoluir do ciclo, os vacúolos passam a ser
encontrados abaixo e também acima dos núcleos e estes têm agora alinhamento
mais homogêneo no centro das células. Já se observa formação de vesículas
secretoras na borda luminal e as mitoses se tornam raras. Ocorre, então,
diminuição no número de vacúolos e verifica-se secreção aumentada no lúmen
glandular. Não se percebem mais, então, as mitoses nem a pseudo-estratificação.
No 20˚ dia do ciclo, o lúmen glandular passa a exibir grande quantidade
de secreção e a borda das células do epitélio glandular se mostra anfractuosa.
Não se notam mais vacúolos subnucleares, permanecendo alguns, ainda, acima
dos núcleos.
Com o aparecimento súbito de edema estromal, a secreção se torna
abundante no lúmen glandular. Aparecem também núcleos nus no estroma. O
20
edema estromal se torna acentuado. As mitoses estromais são raras
(FERENCZY, 1976; NOYES; HERTIG; ROCK, 1950).
As arteríolas espiraladas aparecem proeminentes, com a bainha
periarteriolar aumentada de volume e com células estromais circundantes, já com
aumento do citoplasma e do núcleo e com formato mais poliédrico. As glândulas
estão exauridas e as células glandulares se mostram de formato cilíndrico, baixo.
As células pré-deciduais se tornam mais definidas e se colocam em torno das
arteríolas. Mitoses estromais se tornam mais freqüentes.
No 25˚ dia do ciclo menstrual, ocorre o início de infiltração do estroma
por polimorfonucleares e linfócitos; a secreção no lúmen glandular se torna mais
espessa. No evoluir dos dias, as células pré-deciduais, na camada superficial do
estroma, se justapõem, assumindo o aspecto de camada compacta. Todo o
estroma apresenta reação pré-decidual focal. O tecido endometrial passa a ter
intensa infiltração linfocitária. Aparecem áreas de necrose e hemorragia, com
infiltração polimorfonuclear significativa. O estroma se retrai e inicia-se a
fragmentação das glândulas (NOYES; HERTIG; ROCK, 1950).
1.1.3 Decidualização
Após a ovulação, a progesterona impõe mudanças importantes ao
endométrio, preparando o ambiente tissular para a implantação do embrião. No
intervalo de tempo propício à nidação, surge na membrana apical das células
epiteliais projeções denominadas pinópodos, estruturas que parecem ter
importância na implantação do embrião (NARDO et al., 2002). Isto parece ter
relação com as mudanças encontradas na expressão das proteínas do
citoesqueleto, como a actina, α-actina, plectina e placoglobina. Também nesse
período o endométrio se mostra receptivo ao embrião (PNG; MURPHY, 2002).
O contínuo estímulo progesterônico somado ao novo estímulo da
gonadotrofina coriônica humana (hCG) faz com que as células epiteliais formem
placas (FAZLEABAS; STRAKOVA, 2002; SRISUPARP; STRAKOVA;
FAZLEABAS, 2001). As células estromais da camada superficial aumentam de
volume, tornam-se poliédricas, como um conjunto que faz lembrar um mosaico.
Contribui para essa aparência o aumento da deposição de laminina entre as
21
células (GLASSER et al., 2000). A camada média do estroma exibe um padrão
hipertrófico, no qual as glândulas assumem aspecto rendilhado complexo. A
camada basal tem contraste ainda maior em relação às camadas superiores, com
as extremidades das glândulas revestidas por um epitélio não secretor, bastante
diferente da região superior da glândula (GLASSER et al., 2000; SPEROFF;
FRITZ, 2005). No infiltrado de leucócitos, sobressaem-se os linfócitos grandes e
com aspecto granular (ENDERS, 1991). Esse duplo estímulo hormonal ativa a
expressão de α-actina de músculo liso nas células estromais e a expressão de
glicodelina nas células glandulares (FAZLEABAS et al., 1999; SRISUPARP;
STRAKOVAS; FAZLEABAS, 2001). O endométrio decidualizado aumenta a
expressão da proteína ligadora do fator de crescimento insulina “símile” (IGFBP-
1), sendo esta proteína sugerida como um marcador de decidualização em
primatas (STRAKOVA; SRISUPARP; FAZLEABAS, 2002).
A decídua, ao longo da gravidez, secreta os seus produtos no sangue
materno e também exporta produtos para o líquido amniótico após o primeiro
trimestre da gestação (GLASSER et al., 2000).
1.1.4 Alterações funcionais do endométrio
Durante o ciclo menstrual, juntamente com as modificações
morfológicas, o endométrio apresenta alterações nas funções celulares como a
produção de enzimas, hormônios, citocinas, fatores de crescimento e peptídeos,
devido, em parte, à expressão gênica modulada pelos hormônios esteróides.
O endométrio é um tecido extremamente sensível ao estrogênio. Este
esteróide produz neste tecido, com extrema rapidez, notáveis modificações
celulares morfológicas e funcionais. O estrogênio penetra a membrana celular e
chega ao núcleo, onde se liga ao receptor (KING; GREENE, 1984; MYLONAS et
al., 2004). Esses receptores de estrogênio estão associados a proteínas
nucleares. A ligação do hormônio ao receptor induz a uma modificação na sua
conformação, produzindo sua dissociação das proteínas nucleares, tornando ativo
o complexo estrogênio-receptor.
O estrogênio produz variada gama de efeitos, dependendo do tipo
celular em que estiver atuando, sendo o efeito mitogênico um dos mais
22
característicos, principalmente no endométrio, durante a fase proliferativa, quando
esse efeito marcante se apresenta de maneira rápida e intensa (GOODMAN;
GILMAN, 1991; SPEROFF; FRITZ, 2005).
A progesterona atua no endométrio, onde é responsável por
modificações estruturais e funcionais, objetivando a implantação do embrião. O
receptor de progesterona localiza-se no núcleo da célula (PRESS; GREENE,
1988) e, quando ativo, apresenta-se como um dímero que se liga a elementos
responsivos de determinados genes, produzindo um controle na transcrição
(KIRKLAND; MURTHY; STANCEL, 1992; MYLONAS et al., 2004). Um dos
principais efeitos da progesterona no endométrio é a inibição da proliferação
celular induzida pelo estrogênio. Esse efeito é conseguido a partir da inibição
parcial da expressão do receptor estrogênico (HSUEH; PECK; CLARK, 1976) e
da estimulação da 17β-hidroxesteróide desidrogenase e sulfotransferase, que
convertem o 17β-estradiol em sulfato de estrona, um estrogênio menos potente
excretado pela célula (BENEDETTO; TABANELLI; GURPIDE, 1990; TSENG;
GURPIDE, 1975; ZHU; CONNEY, 1998). A progesterona também apresenta
outros efeitos pronunciados no endométrio, relacionados ao mecanismo de
secreção, ao metabolismo do glicogênio, à ativação e inibição de genes, o que
mantém o endométrio estável durante a fase lútea (GLASSER et al., 2000).
1.2 O sistema renina-angiotensina (SRA)
Tiegerstedt e Bergman (1898) relataram que o extrato salino de rim de
coelho apresentava um princípio pressórico ao qual denominaram renina
(GOODMAN; GILMAN, 1991; PAUL; MEHR; KREUTZ, 2006; TIGERSTEDT;
BERGMAN, 1898). Em 1940, o grupo argentino liderado por Braum-Menendez et
al. (1940) e, independentemente, Page e Helmer (1940) na Clínica Cleveland
publicaram que a renina atuava sobre um substrato protéico plasmático, gerando
o verdadeiro princípio pressor, um peptídeo que os primeiros denominaram
hipertensina e o segundo grupo denominou angiotonina. Posteriormente, ficou
acordado que o peptídeo seria denominado angiotensina.
Na década de 50, foram identificadas duas formas de angiotensina,
sendo a primeira um decapeptideo, a angiotensina I (Ang I), e a segunda um
23
octapeptideo, a angiotensina II (Ang II), derivadas da extremidade N-terminal do
angiotensinogênio. A conversão da primeira na segunda ocorre pela atuação de
uma enzima denominada “enzima conversora de angiotensina” (ECA), que produz
a clivagem entre as posições oito e nove na Ang I. O octapeptideo assim
produzido é a forma mais ativa, manifestando potente efeito pressor e está
envolvido no mecanismo de liberação da aldosterona (EHLERS; RIORDAN, 1989;
GOODMAN; GILMAN, 1991).
Na década de 60, foi detectado que um fator presente no veneno de
serpentes do gênero Bothrops inibe uma enzima que degrada a bradicinina, um
potente vasodilatador (FERREIRA, 1965) e que, posteriormente, confirmou-se ser
esta enzima a mesma que converte a Ang I em Ang II (ERDÖS, 1990), ou seja, a
ECA, o que interligou os sistemas renina-angiotensina e o sistema cinina-
calicreína. A ECA é uma dipeptidilcarboxipeptidase que atua sobre diversos
substratos protéicos, removendo os dois últimos aminoácidos do flanco
carboxílico, desde que o penúltimo aminoácido não seja a prolina, o que, portanto,
impede a sua ação sobre a própria Ang II (GOODMAN; GILMAN, 1991). O
conhecimento sobre esta enzima proporcionou o aparecimento de potentes
drogas hipotensoras, genericamente chamadas de inibidores da ECA (TRASK;
FERRARIO, 2007).
Outras enzimas atuam sobre os substratos protéicos do SRA, como as
endopeptidases, as aminopeptidases, a tonina e a catepsina, sempre diminuindo,
por clivagem, o comprimento das cadeias protéicas (JACKMAN et al., 2002;
TRASK; FERRARIO, 2007).
A percepção de que outros órgãos além do rim e do endotélio vascular
expressavam angiotensinogênio (CAMPBELL; HABENER, 1986), renina
(FERRIS; GORDEN; MULROW, 1967), Ang I, Ang II e ECA (PANDEY; MISONO;
INAGAMI, 1984) incentivou e orientou a pesquisa em outras direções. Assim,
notou-se que a depleção de sódio em ratos aumentava a expressão da renina
tecidual no rim, coração e adrenal, mas não nas glândulas submandibulares
(DZAU et al., 1987a). Outras evidências surgiram com a demonstração de que,
durante a prenhez de coelhas, a renina plasmática diminui enquanto que a renina
uterina aumenta (DZAU et al., 1987b). Esta independência entre o SRA
circulatório e tecidual foi lentamente se consolidando e ampliou as funções deste
sistema.
24
No ano 2000, foi identificada uma nova enzima, a “enzima conversora
da angiotensina tipo 2” - ECA2 (DONOGHUE et al., 2000; TIPNIS et al., 2000),
que não é bloqueada pelos inibidores da ECA e que remove apenas um
aminoácido do substrato protéico na extremidade carboxílica, transformando a
Ang I em Ang-(1-9) e removendo também o último resíduo da Ang II, produzindo a
Ang-(1-7) (DONOGHUE et al., 2000; VICKERS et al., 2002).
1.2.1 Angiotensina II
A Ang II, o membro mais estudado do SRA, é um octapeptídeo que
apresenta potente efeito vasoconstritor, promove apoptose, angiogênese e
proliferação celular em diversos tipos celulares (BAKER; ACETO, 1990; DAEMEN
et al., 1991; DIMMELER et al., 1997; GOLDENBERG et al., 2001; GRIENDLING
et al., 1997). É formada pela ação da ECA sobre a Ang I, com remoção de dois
aminoácidos do flanco carboxílico. Atua através de dois receptores situados na
membrana celular, o AT1 e o AT2, acoplados à proteína G, sendo que a maioria
das ações conhecidas se produz por meio do receptor AT1 (BERRY et al., 2001;
VINSON et al., 1997).
1.2.2 A angiotensina-(1-7)
A Ang-(1-7) é um peptídeo constituído por sete aminoácidos.
Acreditava-se, a princípio, que se tratava apenas de um metabólito inativo da Ang
II, como demonstrado em preparações de cérebro de rato, em que a Ang II era
rapidamente metabolizada em pH=7,4 em Ang-(2-8); e em pH=5,4 era gerado
somente um fragmento, caracterizado como Ang-(1-7) (FITZSIMONS et al., 1971;
TONNAER et al., 1983). Mas a demonstração de que, em homogenados de
cérebro canino, a Ang I, ao ser metabolizada, tinha como principal metabólito o
heptapeptídeo, encorajou novas pesquisas para melhor compreensão (SANTOS
et al., 1988).
Experimentos utilizando Ang-(1-7) revelaram que este peptídeo era
capaz de produzir a liberação de vasopressina em cérebro canino (SCHIAVONE
25
et al., 1988). Tal foi a importância dada a este fato, que o líder do grupo de
pesquisadores da Clínica Cleveland afirmou que se deveria reavaliar os conceitos
vigentes em relação aos fragmentos de angiotensina, que até então se acreditava
serem desprovidos de atividade biológica (FERRARIO, 2006; FERRARIO et al.,
1988).
Logo, ensaio com imunoistoquímica demonstrou que a Ang-(1-7), em
cérebro de rato, se expressava nas áreas paraventriculares, supra-ótica,
supraquiasmática, substância inominada, eminência mediana e neuro-hipófise.
Devido à ampla distribuição cerebral e ao fato da Ang-(1-7) liberar vasopressina,
foi sugerido que este heptapeptídeo poderia funcionar como um neuromodulador
(BLOCK et al., 1988).
Nesta linha, para avaliar ações da Ang-(1-7), o peptídeo foi injetado na
medula dorsal de ratos anestesiados e no núcleo do trato solitário e os animais
apresentaram hipotensão. Isso também foi observado com a injeção do peptídeo
no núcleo dorsal motor do nervo vago (CAMPAGNHOLE-SANTOS et al., 1989).
Esta ação produzida com a Ang-(1-7) era algo novo, inesperado, pois a função
primordial do SRA era atuar no tônus arteriolar, elevando a pressão arterial, e
liberar aldosterona.
Sendo a Ang II um peptídeo vasopressor, surgiu, então, outro peptídeo
no sistema renina-angiotensina, com efeito antagônico, produzindo hipotensão.
Experimento utilizando cromatografia líquida de alta performance
extraiu angiotensinas do cérebro, glândula supra-renal e plasma de ratos,
registrando, pela primeira vez, a presença da Ang-(1-7) em nível central e
periférico. Sugeriu-se, assim, que a Ang-(1-7) poderia representar um novo
membro ativo e não mais um metabólito do SRA (CHAPPELL et al., 1989).
Ensaios utilizando um inibidor da ECA, portanto, inibindo a conversão da Ang I em
Ang II, preconizaram que a Ang-(1-7) poderia ser formada diretamente a partir da
Ang I (KOHARA; BROSNIHAN; FERRARIO, 1993).
Tendo a Ang-(1-7) apresentado efeito hipotensor após infusão em áreas
do cérebro, as pesquisas orientaram-se para o sistema cardiovascular. Assim,
experimentos com células do endotélio de aorta de porco encontraram que o
heptapeptídeo produzia liberação de prostaglandina e que esta estimulação não
ocorria através dos receptores AT1 ou AT2 da Ang II, implicitando a possível
existência de um receptor específico para a Ang-(1-7) (JAISWAL et al., 1992).
26
A existência de um receptor específico também foi sugerida por vários
pesquisadores (BUCZKO; KUCHAREWICZ, 2000; FONTES et al., 1999; PÖRSTI
et al., 1994; SANTOS et al., 1994; 1996; SANTOS; CHAMPAGNOLE-SANTOS,
1994).
Em 2003, foi relatado que a Ang-(1-7) se liga ao receptor Mas, uma
proteína com sete domínios transmembrana, acoplada à proteína G, até então um
receptor órfão (SANTOS et al., 2003).
1.2.2.1 Formação da angiotensina-(1-7)
No SRA a Ang I é convertida em Ang II pela ECA. A Ang II é então
clivada pela ECA2 e se transforma em Ang-(1-7). Uma outra via é a hidrólise da
Ang I pela ECA2, que é transformada em Ang-(1-9), que, por sua vez, é clivada
pela ECA e transformada em Ang-(1-7). É bom lembrar que a ECA também
degrada a Ang-(1-7) em Ang-(1-5) - (FERRARIO et al., 1997). Portanto, o uso de
inibidores da ECA pode aumentar os níveis circulantes da Ang-(1-7) devido tanto
ao aumento da Ang I quanto à diminuição da degradação da Ang-(1-7)
(CHAPPELL et al., 1998).
Foram descritas, ainda, três outras enzimas que podem atuar na
formação da Ang-(1-7) a partir da Ang I: a prolilendopeptidase (E.C. 3.4.24.26),
descrita em cérebro canino e no endotélio vascular (SANTOS et al., 1992;
WELCHES et al., 1991); a endopeptidase neutra (E.C.3.4.24.11), presente na
circulação sangüínea (YAMAMOTO et al., 1992); e a oligo endopeptidase,
estudada em células de músculo liso (CHAPPELL et al., 1994). Essas
endopeptidases apresentam expressão relacionada a diferentes tipos de tecidos,
o que se acredita ter a produção do heptapepitídeo um controle direto no tecido,
sugerindo funções parácrinas.
É importante salientar que a ECA2 possui 400 vezes mais eficiência
catalítica com a Ang II do que com a Ang I (VICKERS et al., 2002). Com a
ampliação do conhecimento metabólico relacionado à Ang-(1-7), autores já
consideram o peptídeo um novo componente do SRA (FERRARIO; IYER, 1998).
27
1.2.2.2 Mecanismos da Ang-(1-7) na regulação da pressão arterial
O efeito anti-hipertensivo da Ang-(1-7) parece ser devido a vários
mecanismos diferentes. Sendo a Ang-(1-7) um dos mais substratos da ECA
(FERRARIO et al., 1996), ocorre uma competição com a bradicinina, no processo
de degradação (LI et al., 1997). Um segundo mecanismo regulador seria a partir
da liberação de prostaglandinas (IYER et al., 2000; PAULA et al., 1995) e um
terceiro pela liberação de óxido nítrico pelo endotélio vascular (BROSNIHAN,
1998; PÖRSTI et al., 1994). Outro efeito favorecendo a hipotensão seria no rim,
onde a Ang-(1-7) produz natriurese e concomitante diminuição da excreção renal
de potássio, além de induzir a produção de prostaciclina (HILCHEY; BELL-
QUILLEY, 1995).
1.2.2.3 Mecanismos de ação da Ang-(1-7) no nível molecular
Em relação ao metabolismo celular, experimento investigativo do
mecanismo de transdução de sinal envolvendo Ang-(1-7) em células de músculo
liso de aorta de coelho, foi encontrado estimulação da liberação do ácido
aracdônico e síntese aumentada de 6-keto-PGF1 concomitante com a liberação
de prostaciclina. Foi constatado, ainda, que a Ang-(1-7) causa translocação da
fosfolipase A2 do citoplasma para o envelope nuclear (MUTHALIF et al., 1998).
Em outro estudo, verificou-se que Ang-(1-7) fosforila a janus kinase 2 (JAK2), o
substrato para receptor de insulina 1 (IRS-1) e a proteína kinase B (AKT) no
coração de rato (GIANI et al., 2007).
No que se refere a crescimento celular, foi observado que a Ang-(1-7)
inibe o crescimento das células de músculo liso (FREEMAN et al., 1996) e que
também é capaz de atenuar a formação do endotélio vascular após injúria
produzida por balão intra-arterial (STRAWN; FERRARIO; TALLANT, 1999). Além
disso, a Ang-(1-7) atenuou a formação da camada endotelial em coronária, após a
colocação de stent (LANGEVELD et al., 2005).
Investigações dos mecanismos moleculares que inibem o crescimento
vascular produzidos pela Ang-(1-7) concluíram que ocorre liberação de
28
prostaciclina e que a Ang-(1-7) também inibe o estímulo da Ang II na via ERK1/2
(TALLANT; CLARK, 2003). Em ensaio com células neoplásicas, foi encontrado
que a Ang-(1-7) reduz o crescimento das células, também por inibição da via
ERK1/2 (GALLAGHER; TALLANT, 2004; MENON et al., 2007).
1.2.3 A relação da ANG-(1-7) com a ANG II
Alguns efeitos da Ang II no sistema cardiovascular já eram bem
conhecidos, como a vasoconstrição e a liberação de aldosterona (GOODMAN;
GILMAN, 1991). Outros efeitos relacionados são o estímulo à produção de
proteínas e o crescimento celular de cardiomiócitos (BAKER; ACETO, 1990;
DAEMEN et al., 1991), o estímulo à angiogênese (ANDRADE et al., 1996;
MACHADO; SANTOS; ANDRADE, 1999) e ao processo de apoptose
(GOLDENBERG et al., 2001).
O primeiro efeito produzido pela Ang-(1-7) a ser notado foi a liberação
de vasopressina em cérebro de rato, efeito este semelhante ao da Ang II. Desde
então, no evoluir das pesquisas, os novos efeitos relacionados com a Ang-(1-7)
são geralmente contrários aos da Ang II, sendo o efeito anti-hipertensivo o mais
evidente. Em modelo experimental murino, para estudo de angiogênese,
demonstrou-se que enquanto a Ang II estimula a angiogênese, a Ang-(1-7) inibe-a
(MACHADO; SANTOS; ANDRADE, 1999).
Em experimentos com células de músculo liso, foi verificado que a Ang-
(1-7) inibe o efeito mitogênico da Ang II, (TALLANT; DIZ; FERRARIO, 1999). Um
dos mecanismos possíveis para esta inibição poderia ser que a Ang-(1-7) reduz a
expressão dos receptores At1 da Ang II, cujo efeito é mediado por produtos
oriundos da ciclooxigenase (CLARKE et al., 2003). Investigação relacionada à
contra-regulação da Ang-(1-7) sobre a Ang II na transdução de sinal mostrou
inibição parcial sobre a vasoconstrição e sobre o crescimento celular em músculo
liso. Foi encontrada, também, inibição na estimulação da proteína kinase C e no
sinal extracelular de kinase (ERK) (ZHU et al., 2002).
Ensaio com astrócitos da medula e cérebro de ratos enfatizou que a
Ang II diminuiu em 60% a transcrição gênica da ECA2, sendo esta enzima
29
importante na geração da Ang-(1-7) e na degradação da própria Ang II
(GALLAGER et al., 2006).
1.2.4 O receptor Mas
Em 1986, foram descritos a clonagem e o seqüenciamento de um
protooncogene que foi denominado Mas. Esse protooncogene codifica uma
proteína hidrofóbica que possui sete passagens transmembranárias. A proteína
codificada Mas foi comparada com o receptor de acetilcolina e com o receptor da
rodopsina visual. Esta, quando estimulada, ativa uma proteína intracelular ligada
ao nucleotídeo guanina. Foi sugerido, então, que a proteína Mas poderia ser um
receptor que, ao ser ativado, atuaria numa via metabólica relacionada à regulação
do crescimento celular (YOUNG et al., 1988). Posteriormente, os mesmos autores
examinaram a expressão da proteína em vários tecidos de rato, descrevendo
maior transcrição do RNA em regiões do sistema nervoso central (SNC),
principalmente no hipocampo e no córtex cerebral. Sugeriram, ainda, que pela
semelhança da seqüência da proteína, ele se parecia com a família de receptores
de alguns hormônios (YOUNG et al., 1986). Pesquisa em células transfectadas
com o protooncogene Mas relatou que ele codifica um receptor de um peptídeo
neural, indicando a possibilidade de estar envolvido em processo de diferenciação
e proliferação celular (HANLEY et al., 1990).
O estudo do receptor Mas, de forma comparativa com outros
receptores, destacou que esta proteína deveria ser um receptor de angiotensina
(JACKSON et al., 1988), enquanto que experimentos posteriores não
encontraram resultados que encorajassem essa idéia (AMBROZ; CLARK; CATT,
1991).
A expressão do receptor Mas foi estudada em cérebro de rato, com
técnica de hibridização in situ, tendo sido encontrada forte marcação no giro
dentado, nas áreas CA3 e CA4, hipocampo, tubérculo olfatório, córtex piriforme,
bulbo olfatório e marcação fraca a moderada no lobo frontal (BUNNEMANN et al.,
1990). Foi também estudado em cérebro e testículo de camundongo, tendo sido
relatado que no testículo o RNAm aumenta marcadamente durante o
desenvolvimento do indivíduo (METZGER et al., 1995), aparecendo aos 18 dias
30
de vida e aumentando até seis meses (ALENINA et al., 2002). O receptor Mas foi
ainda descrito no ovário de ratas (PEREIRA et al., 2005).
Em 2003, foram apresentadas evidências de que o receptor Mas, antes
um receptor órfão, é o receptor da Ang-(1-7) - (SANTOS et al., 2003).
Foi referido, também, em cultura de células de mamífero, que o
receptor Mas pode formar um complexo com o receptor AT1, na forma de
heterodímero, produzindo efeito inibitório parcial na função do receptor da Ang II
(KOSTENIS et al., 2005).
1.3 A relação do sistema renina-angiotensina com o sistema reprodutor
Sendo a renina a enzima iniciadora da cascata de eventos no SRA, as
pesquisas nela se concentraram. Esta enzima, que antes se pensava ser apenas
de origem renal, foi identificada, por técnica de imunoistoquímica, no útero de
coelha (FERRIS; GORDEN; MULROW, 1967). Foi também registrada no
endométrio de camundongos fêmeas, em maior intensidade nas células
glandulares e também nas células perivasculares no miométrio, variando com o
ciclo estral, aumentando no estro e diminuindo no diestro (HACKENTHAL et al.,
1980). Posteriormente, encontraram Ang I, Ang II, ECA e renina no testículo de
rato, nas células de Leydig (PANDEY; MISONO; INAGAMI, 1984).
Estudo utilizando um anticorpo específico para renina ressaltou não
existir correlação entre a atividade da renina no testículo de rato e a renina
plasmática, indicando independência no controle da enzima tecidual. Revelou,
ainda, que em ratos hipofisectomizados, os níveis de renina testicular decrescem
significativamente e que a administração de gonadotrofina aumenta novamente a
quantidade da enzima (NARUSE et al., 1984).
Durante a prenhez de coelhas, a renina plasmática diminui, enquanto
que a renina uterina aumenta (DZAU et al., 1987b), sendo que a maior parte da
renina uterina se origina do endométrio (HAGEMANN; NIELSEN; POULSEN,
1994; HSUEH, 1988; SHAW et al., 1989).
Em cultura de células do estroma endometrial, observou-se que a
progesterona estimula a síntese de renina (SHAH et al., 1991).
31
Em outros órgãos do sistema reprodutor também foram encontradas
ações do sistema renina-angiotensina, como no ovário e testículos. Em cultura de
células de ovário de rata, a Ang II estimula a produção de estradiol, mas não
apresenta estímulo na produção de progesterona (PUCELL; BUMPUS; HUSAIN,
1987; Pereira et al., 2005).
Em pacientes tratados com hCG, houve aumento de Ang II no sangue
da veia espermática, sugerindo que os esteróides gonadais poderiam influenciar o
SRA nas células de Leydig (OKUIAMA et al., 1988).
1.3.1 O sistema renina-angiotensina no endométrio
O conhecimento do SRA no endométrio é incipiente e fragmentado. A
primeira citação na literatura foi o relato de renina no útero de coelha (FERRIS;
GORDEN; MULROW, 1967). Em estudo posterior, esses autores identificaram
renina no endométrio de camundongo fêmea. Por meio de imunoistoquímica,
referiram a existência da enzima nas células glandulares, sendo que a marcação
era mais intensa durante o estro e menos intensa no diestro (HACKENTHAL et
al., 1980). Durante prenhez de coelha, a forma ativa da renina uterina aumenta 40
vezes e esse aumento parece ser independente da renina renal (DZAU et al.,
1987b).
Na espécie humana, no útero, a maior fonte de renina é o endométrio
(HSUEH, 1988). A renina é expressa no endométrio em maior quantidade na sua
forma inativa, ocorrendo em quantidade menor na forma ativa (SHAH et al.,
1991).
A renina foi identificada primeiramente nas células estromais, tendo
sido demonstrado que a progesterona, em cultura celular, induz a aumento na
expressão e que a decídua produz maior quantidade de renina do que as células
do estroma (SHAW et al., 1989; SHAH et al., 1991).
Em outro relato, a renina foi demonstrada por imunoistoquímica nas
células do epitélio glandular do endométrio, com marcação intensa, e nas células
estromais a marcação foi de fraca a moderada, durante a fase proliferativa, e
negligível na fase secretora (LI; AHMED, 1997).
32
A ECA é expressa no endométrio pelas células do epitélio glandular e
pelas células do endotélio vascular. No estroma, a marcação por imuno-
histoquímica foi fraca a moderada na fase proliferativa e na fase secretora a
marcação foi negligível. Foi demonstrado, por técnica de western blot, que a ECA
aparece em maior quantidade no endométrio menstrual e no endométrio secretor
tardio. A menor quantidade foi encontrada no endométrio proliferativo tardio e no
endométrio secretor inicial (LI; AHMED, 1997).
A Ang II foi localizada no endométrio, durante a fase proliferativa, no
epitélio glandular e no estroma, tendo apresentado marcação fraca em torno do
tecido vascular. Em contraste, no endométrio secretor, intensa marcação foi
detectada nas células estromais, em torno dos vasos, onde foi sugerido estar
participando do fenômeno da decidualização (SQUIRES; KENNEDY, 1992); e
fraca marcação nos outros tipos celulares (AHMED et al., 1995).
Inicialmente, acreditou-se que o útero humano só expressava o
receptor AT2 da Ang II (WHITEBREAD et al., 1989), mas evidências posteriores
mostraram que é o miométrio quem expressa somente esse receptor e o
endométrio expressa os dois receptores da Ang II (AHMED et al., 1995;
SARIDOGAN et al., 1996). O receptor AT1 aumenta a sua expressão do início até
o final da fase proliferativa, e alcança o máximo da sua expressão no início da
fase secretora (AHMED et al., 1995).
Em que pese a importância fisiológica dos novos componentes do SRA,
até o momento nenhum estudo avaliou se o heptapeptídeo Ang-(1-7), seu
receptor Mas e a enzima ECA2 estão presentes no endométrio.
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Determinar a expressão da Ang-(1-7), do receptor Mas e da ECA2 no
endométrio humano.
2.2 Objetivos específicos
• Verificar a localização imunoistoquímica da Ang-(1-7) nas células epiteliais
e estromais do endométrio humano, nas fases proliferativa e secretora.
• Verificar a presença do receptor Mas nas células epiteliais e estromais, nas
fases proliferativa e secretora do endométrio humano.
• Determinar a expressão gênica da ECA2 nas células epiteliais e estromais,
nas fases proliferativa e secretora do endométrio humano.
34
3 METODOLOGIA
3.1 Parecer ético
O projeto desta pesquisa foi primeiramente aprovado pela Câmara
Departamental de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da UFMG.
O protocolo final da pesquisa, sob o número 0076.0.203.000-07, foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas
Gerais (COEP-UFMG) em 25/04/07 (ANEXO A). Parte do protocolo havia sido
aprovada pelo COEP em 14/09/2005, sob o número 0010.0.203.000-5.
A execução da pesquisa também requereu a aprovação da Diretoria de
Ensino, Pesquisa e Extensão (DEPE) do Hospital das Clínicas (HC) da UFMG, da
Unidade Funcional Centro Cirúrgico HC-UFMG, do Serviço de Ginecologia HC-
UFMG e do Laboratório de Endocrinologia e Metabologia do Departamento de
Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG.
3.2 Sujeitos da pesquisa
Foram selecionadas mulheres no menacme, com ciclos regulares, que
não estavam em uso de medicamentos hormonais há pelo menos três meses.
Essas pacientes não haviam usado dispositivo intra-uterino (DIU) nos últimos seis
meses, não eram portadoras de doenças sistêmicas e não apresentavam
evidência clínica, ecográfica ou histeroscópica de doença endometrial.
Três séries de casos e uma coleção de culturas celulares foram
incluídas no estudo (FIG. 1). A série de casos 1 (n=10) foi constituída por
mulheres de 38-47 anos que iriam se submeter à histerectomia por condição
benigna, como mioma, na fase folicular do ciclo menstrual. No bloco cirúrgico do
Hospital das Clínicas, imediatamente após a histerectomia, procedeu-se ao
lavado endometrial ex-vivo, com instilação de 1 mL de coquetel de inibidores de
proteases diluído em 1 mL de solução fisiológica estéril, perfazendo um volume
final de 2mL. O coquetel de inibidores de proteases consistia em
35
fenilmetilsulfonilfluorida 10
5
M, pepstatina a 10
5
M, ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA) 10
-5
M, p-hidroximercuribenzoato 10
-5
M e ortofenantrolina 9 x 10
-4
M, todos
adquiridos da Sigma-Aldrich Corp. O lavado endometrial era aspirado, transferido
para um tubo imerso em gelo e estocado a −80ºC até o momento da extração dos
peptídeos para quantificação por radioimunoensaio.
A série 2 foi constituída por 24 mulheres submetidas à histeroscopia ou
laparoscopia no setor de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da
UFMG, em preparação para tratamentos de infertilidade por fator masculino ou
tubário. As pacientes, com idades de 26-41 anos, apresentavam exame
histeroscópico normal, ciclos menstruais regulares e ovulação confirmada por
rastreamento ecográfico. Biópsias endometriais foram obtidas por aspiração com
Pipelle após histeroscopia ou laparoscopia. O material foi fixado em formol 10%
tamponado em solução salina de fosfato tamponada (PBS), incluído em parafina e
posteriormente processado para análise histológica e imunoistoquímica. As
pacientes dessa série haviam sido recrutadas para um estudo anterior, em 2003,
e as respectivas amostras endometriais, conservadas em blocos de parafina,
foram recuperadas para inclusão no presente estudo.
A série 3 foi formada por 11 mulheres com idades de 30-47 anos
submetidas à histeroscopia diagnóstica ou cirúrgica por condições benignas nas
fases proliferativa (n=6) e secretora (n=5) do ciclo menstrual. A fase do ciclo foi
confirmada pelos exames histopatológicos. Amostras de endométrio foram
coletadas durante ou após a histeroscopia e conservadas em solução inibidora de
RNAse (RNA holder, BioAgency, São Paulo, SP) a –20°C até a extração do RNA.
As amostras de culturas celulares foram oriundas do Departamento de
Ginecologia e Obstetrícia da Universidade do Texas em San Antonio (Estados
Unidos da América - EUA), gentilmente cedidas pelos Drs. Márcia C. Ferreira e
Craig A. Witz. As técnicas de coleta endometrial, digestão enzimática, purificação,
caracterização e cultivo primário de células epiteliais e estromais derivadas do
endométrio humano foram descritas detalhadamente em publicações recentes
(LUCIDI et al., 2005; FERREIRA et al., 2008). Neste estudo, utilizaram-se lâminas
de cultura (chamber slides) e amostras de DNA complementar correspondentes a
culturas de células epiteliais (n=7) e estromais (n=6).
36
Pacientes de
histerectomia por
causas benignas
(n = 10)
Pacientes ovulatórias
em propedêutica para
infertilidade
(n=24)
Pacientes de
histeroscopia por
causas benignas
(n=11)
Lavado endometrial
ex-vivo com inibidores de
protease
Dosagem de Ang-(1-7)
por radioimunoensaio
Biópsias endometriais
(blocos de parafina em
arquivo)
Revisão da datação
endometrial
Imunoistoquímica para
Ang-(1-7) e Mas
Comparação descritiva entre
fases do ciclo
Culturas primárias de células
endometriais
(n=13)
Proliferativo inicial (n=3)
Proliferativo intermediário (n=9)
Periovulatório (n=3)
Secretor intermediário (n=6)
Secretor tardio(n=3)
Biópsias endometriais
congeladas
Extração de RNA
Síntese de cDNA
PCR em tempo real para
ACE2 e Mas
Comparação estatística entre
fases do ciclo e tipos celulares
Células fixadas em
lâminas de cultura
Imunofluorescência para
Ang-(1-7) e Mas
Microscopia confocal
Comparação descritiva
entre tipos celulares
Série 1 Série 2 Série 3
FIGURA 1 - Diagrama representando as três séries de casos incluídas no estudo,
além das amostras de culturas de células de endométrio.
Os resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real puderam ser avaliados
estatisticamente comparando-se dois grupos de pacientes classificadas de acordo com a fase do
ciclo menstrual (série de casos 3, subdividida entre fases proliferativa e secretora) e confrontando-
se dois grupos de culturas celulares: epiteliais vs. estromais.
3.3 Dosagem de Ang-(1-7) por radioimunoensaio
As amostras congeladas de lavado endometrial foram enviadas ao
Laboratório de Hipertensão do ICB-UFMG para determinação da concentração de
Ang-(1-7) por radioimunoensaio. A equipe técnica do laboratório utilizou, nas
etapas de extração e dosagem do peptídeo, as metodologias já publicadas pelo
mesmo grupo (BOTELHO et al., 1994; COSTA et al., 2003; SIMÕES E SILVA et
al., 2004). O limite de detecção do ensaio é de 3,25 pg/tubo, correspondentes à
37
concentração de Ang-(1-7) nas amostras de 32,5 pg/mL. Os coeficientes de
variação intra e interensaio foram, respectivamente, 4,8 e 8,6%.
3.4 Imunoistoquímica do tecido endometrial
Os blocos de parafina contendo amostras de tecido endometrial (série
de casos 2, FIG. 1) foram resfriados, levados ao micrótomo e seccionados em
fatias de 4 µm de espessura. Os cortes foram recolhidos em banho de água
aquecida e cuidadosamente transferidos, com a ajuda de um pincel fino, para
lâminas de vidro previamente gelatinizadas. As lâminas foram então incubadas
em estufa a 60˚C durante 20 minutos para escorrer o excesso de parafina.
Um corte de cada amostra foi corado por hematoxilina e eosina para se
aferir a datação do endométrio segundo os critérios de Noyes, Hertig e Rock
(1950), tendo sido esta aferição realizada por outro pesquisador. As amostras
foram datadas como endométrio proliferativo inicial (n=3), proliferativo
intermediário (n=9), periovulatório (n=3), secretor intermediário (n=6) e secretor
tardio (n=3). Uma amostra de implante endometriótico peritoneal datado como
secretor intermediário foi também incluída nos testes imunoistoquímicos, para
efeito de controle de especificidade.
3.4.1 Princípios da técnica
Os ensaios de imunoistoquímica foram realizados com a técnica da
avidina-biotina-peroxidase (HSU; RAINE; FINGER, 1981). A avidina é uma
glicoproteína presente na clara do ovo de galinha, de alto peso molecular
(PM=68.000 D), de caráter básico (pH=10,4), que apresenta forma tetramérica
com quatro subunidades de 128 aminoácidos cada uma, apresentando grande
afinidade pela biotina.
A biotina é uma vitamina de baixo peso molecular (PM=244,3 D),
hidrossolúvel, produzida por bactérias intestinais, presente também no fígado e na
gema do ovo. Pode ser ligada covalentemente a carboidratos e proteínas sem
interferir nessas moléculas, devido, em parte, ao seu tamanho.
38
As peroxidases formam um grande grupo de enzimas que participam
dos processos de oxidação e redução. A peroxidase utilizada nesse ensaio é uma
horseradish peroxidase, enzima de 40 kD isolada da planta horseradish,
pertencente à família Brassicacea. Apresenta um grupo heme ligado a um átomo
de ferro que funciona como um comutador de elétrons.
A reação se processa com a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno
investigado; e o segundo anticorpo, já conjugado à biotina, se acopla ao primeiro.
Aplica-se à avidina, que se liga através de um dos seus quatro sítios à biotina do
segundo anticorpo, enquanto a biotina ligada à peroxidase ocupa os três sítios
livres da avidina, produzindo efeito amplificador do processo. A introdução do
cromógeno 3,3’-diaminobenzidina (DAB) produz uma coloração marrom-
amarelado estável, que permite identificar, ao microscópio, os sítios de
imunomarcação.
3.4.2 Materiais utilizados
Os anticorpos primários foram produzidos no Laboratório de
Hipertensão do ICB-UFMG. O anticorpo policlonal para Ang-(1-7) foi feito em
coelho, utilizando como imunógeno Ang-(1-7) sintética, e não apresenta reação
cruzada com outros membros do sistema renina-angiotensina (SIMÕES E SILVA
et al., 2004). O anticorpo para o receptor Mas foi produzido em camundongo
knockout, usando como imunógeno o peptídeo sintético LAEEKAMNTSSR,
correspondente à porção amino-terminal do receptor Mas de camundongo
(COSTA-GONÇALVES et al., 2007). Esse anticorpo reconhece o receptor Mas
humano devido à homologia de seqüências entre as duas espécies e é
comparável ao anticorpo anti-Mas humano comercialmente disponível (SAMPAIO
et al., 2007a).
O kit utilizado nos ensaios foi o Vectastain (Vector Laboratories,
Burlingame, CA, EUA) contendo anticorpo secundário biotinilado universal
(anticoelho e camundongo) produzido em eqüino, soro de eqüino normal e
complexo avidina-biotina-peroxidase.
39
3.4.3 Seqüência do processo
Primeiro dia:
• desparafinização dos cortes com xilol (xilol 1 e 2; 15 minutos cada);
• hidratação nos álcoois (98-90-80-70-50%; 5 minutos cada);
• lavagem em água destilada, por 1 minuto;
• digestão enzimática com solução de tripsina durante 15 minutos para
recuperação de sítios antigênicos (somente na imunocoloração para o
receptor Mas);
• bloqueio das peroxidases endógenas com metanol + H
²
O
²
a 3% por 30
minutos;
• lavagem em PBS, 10 minutos;
• incubação com soro normal, para bloqueio de sítios antigênicos
inespecíficos; 30 minutos (diluição 1:30);
• incubação com anticorpo primário:
a) antiAng-(1-7) diluído 1:2000 em PBS e incubado por 16-18 horas a 4˚C;
b) antiMas diluído 1:100 e aplicado por 48 horas a 4ºC;
Segundo dia:
• lavagem com PBS, 10 minutos;
• incubação com anticorpo secundário (1:200), 30 minutos;
• lavagem com PBS, 10 minutos;
• incubação com complexo AB (1:200) 1 hora;
• lavagem com PBS, 10 minutos;
• coloração com DAB (3 a 5 minutos);
• lavagem com PBS, 5 minutos;
• contracoloração com hematoxilina (imersão rápida);
• lavagem em água destilada, 5 minutos;
• desidratação com álcoois graduados (50-98%), 5 minutos cada;
• passagem em xilol 3 e 4, por 5 minutos em cada;
• montagem com lamínula e Entellan.
40
Como controle negativo, foi utilizado o mesmo tecido endometrial; e na
seqüência do processo de imunoistoquímica substituiu-se o primeiro anticorpo por
imunoglobulina de coelho não imunizado. O controle positivo utilizado foi corte de
testículo de camundongo adulto (ALENINA et al., 2002; METZGER et al., 1995).
3.4.4 Análise da imunoistoquímica
As lâminas foram fotografadas em microscópio ótico (Olympus BX-41)
acoplado à microcâmera e as imagens captadas em microcomputador pelo
software Spot Insight Color. As lâminas foram examinadas no mesmo
microscópio, com a mesma intensidade de luz, por dois examinadores
independentes, sendo os resultados anotados como:
– negativo
+ intensidade fraca da coloração
++ intensidade moderada da coloração
+++ intensidade forte da coloração
3.5 Avaliação da expressão gênica da ECA2 e do receptor Mas
3.5.1 Extração do RNA total
Os fragmentos de endométrio estocados a –20˚C em RNA holder (série
de casos 3, FIG. 1) foram colocados em tubos plásticos estéreis contendo solução
de fenol e isotiocianato de guanidina (TRIzol® Reagent, Invitrogen, Carlsbad CA,
USA), na proporção de 1 mL para cada 100 mg de tecido. Os fragmentos foram
triturados com homogenizador elétrico Polytron até dissociação completa do
tecido e, em seguida, os tubos foram tampados e deixados em temperatura
ambiente por 5 minutos.
Foram adicionados a cada tubo 200 µL de clorofórmio e realizada
agitação manual vigorosa por 3 vezes e novamente deixado em repouso por 3
minutos. A seguir, o material foi centrifugado durante 15 minutos a 12.000
rotações por minuto (rpm) a 4˚C. Após a centrifugação, a fase líquida foi pipetada
41
com cuidado para novos tubos estéreis e numerados e adicionado isopropanol
gelado, 500 µL em cada tubo, realizada homogenização manual e armazenados a
–20˚C (CHOMCZYNSKI; SACCHI, 1987).
No dia seguinte, os tubos passaram por uma segunda centrifugação
durante 15 minutos, a 12.000 rpm, a 4˚C. O sobrenadante foi descartado com
cuidado e o precipitado foi tratado com 1 mL de etanol a 75% em água
autoclavada com dietilpirocarbonato (DEPC) e feita homogenização rápida no
vórtex (rotação n˚ 2, por duas vezes). Os tubos foram centrifugados novamente a
7.500 rpm, a 4˚C, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado com cuidado e o
precipitado deixado secar no tubo por 15 minutos.
3.5.2 Quantificação do RNA extraído
O precipitado de RNA foi dissolvido em 50 µL de água DEPC e
aquecido a 60˚C por 10 minutos para desnaturar. Foi retirada uma alíquota de 10
µL de cada amostra e diluída em 990 µL de água DEPC e a solução resultante
submetida à leitura em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 260 nm
e 280 nm. A pureza do RNA foi considerada satisfatória quando a razão das
absorbâncias a 260 nm e 280 nm se situava entre 1,6 e 2,0.
Considerando-se que uma unidade de absorbância a 260 nm
corresponde a 40 µg de RNA por mL de solução, a concentração de RNA na
solução original foi calculada pela fórmula:
[ RNA ] = A260 nm x D x 40 µg/mL
onde: A= absorbância
D= diluição da alíquota usada para quantificação, no caso 100, visto
que 10 µL da solução original foram diluídos em 990 µL de água.
Da amostra original, foi coletada alíquota de 1 µg para construção do
cDNA.
3.5.3 Síntese do DNA complementar
42
A obtenção do DNA complementar (cDNA) foi realizada a partir de
transcrição reversa utilizando oligonucleotídeos complementares à cauda poliA do
mRNA. Foi utilizado o kit SuperScript™ III First-Strand Syntesis Super Mix
(Invitrogen Corporation, Brasil).
Em tubo estéril foram colocados: 1 µg de RNA, 1 µL de oligo (dT), 1 µL de
tampão específico e 1 µL de água livre de DNAse/RNAse. Os tubos foram
incubados a 65˚C por 5 minutos e logo após acondicionados em gelo.
Adicionaram-se 10 µL de solução 2x First-Strand Reaction Mix e 2 µL de solução
contendo a enzima transcriptase reversa Superscript™ III e inibidor de RNAse. A
solução foi mantida a 50˚C por 50 minutos para a síntese do DNA complementar.
A reação foi encerrada por aquecimento a 70˚C por 5 minutos e resfriamento a
4˚C.
Como controle negativo, uma amostra de RNA extraído de tecido
endometrial foi submetida à reação de síntese de cDNA, com omissão da
transcriptase reversa, que foi substituída por 1 µL de água DEPC.
3.5.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real
A reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real é metodologia
adequada para se estudar a expressão de determinado gene. Essa tecnologia
apresenta precisão, sensibilidade e resolução superiores às da PCR tradicional.
Os resultados são expressos em números e podem ser acessados rapidamente,
enquanto a reação está ainda se processando, em sua fase exponencial. Na PCR
utilizou-se um composto fluorescente, o SYBR GREEN, substância com afinidade
por nichos (minor groove) na dupla hélice do DNA. Quando em solução, esta
substância apresenta pouca fluorescência, mas durante os ciclos da PCR, quando
são gerados cada vez mais amplicons, o acúmulo do corante nos nichos faz com
que a fluorescência aumente a cada ciclo da reação, em razão direta à formação
dos amplicons, podendo ser detectada, quantificada e comparada.
No primeiro ciclo da reação, as fitas do cDNA são copiadas em fitas
longas, não delimitadas na extremidade 3’ e, com a sucessão dos ciclos,
começam a ser gerados os amplicons de fitas curtas, que terão a quantidade
mensurada. As cópias de fitas longas continuarão a ser produzidas, mas isto
43
ocorre em progressão linear e, portanto, se tornarão negligenciáveis frente à
quantidade de amplicons que serão gerados de modo exponencial. É este
aumento exponencial o determinante da ascensão da curva logarítmica.
O método possui uma linha de corte que é situada nas curvas
logarítmicas, em um ponto denominado CT (threshold cycle), definido como o
local em que a fluorescência emitida apresenta o primeiro registro
estatisticamente superior à fluorescência basal. Este local situa-se sempre na
fase de crescimento exponencial da curva, sempre abaixo das fases de
crescimento linear e do platô (GIBSON; HEID; WILLIAMS, 1999). Aí são obtidos
os valores de quantificação absoluta ou relativa (LIVAK; SCHMTTIGEN, 2001;
YUAN et al., 2006).
A metodologia da PCR em tempo real utilizou o mesmo protocolo em
todas as reações, mantendo as concentrações usuais de reagentes para um
volume final de 25 µL. Cada amostra foi preparada em duplicata. Foram usados 2
µL de cDNA e 23µL de uma solução mix composta de 2 µL de água para PCR, 2
µL do primer senso (10 pmol/µL), 2 µL do primer anti-senso (10 pmol/µL) -
(Invitrogen do Brasil, São Paulo, SP) e 17 µL de SYBR GREEN Mix (Applied
Biosystems, Warrington WA, UK).
Foram desenhados três pares de oligonucleotídeos iniciadores da PCR
referentes aos genes da ECA2, do receptor Mas e da proteína ribossomal S26
(controle interno) a partir das seqüências publicadas na base de dados do
National Center for Biotechnology Information (NCBI). A escolha das seqüências
foi feita com auxílio de um software livre (GenScript Corp., Piscataway, NJ, EUA),
que observa, entre outros critérios, a similaridade na temperatura de fusão e a
não-complementaridade nas extremidades 3’ de cada par de oligonucleotídeos.
Foi utilizada a estratégia de situar os oligonucleotídeos em regiões de transição
intron-exon, para prevenir a amplificação de DNA genômico contaminante. A
seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores é visualisada no QUADRO 1.
As reações foram realizadas em um termociclador ABI PRISM 7000 SDS
(Applied Biosystems Warrington WA, UK) com a seguinte programação:
• Estágio 1: um ciclo de 52˚C/2 minutos
• Estágio 2: um ciclo termal de 95˚C/10 minutos
• Estágio 3: 40 ciclos de 95˚C/15 minutos e 50˚C/1minuto.
44
QUADRO 1
Oligonucleotídeos iniciadores usados nas reações de PCR em tempo real
Seqüência (5’ to 3’) Fragmento Código GenBank
Mas
senso
anti-senso
ttccggatgagaagaaatcc
atggccagaagaaagctcat
129 pb
NM_002377
ECA2
senso
anti-senso
ctgctcatttgcttggtgat
ggtccaccattgcatcagta
111 pb
NM_021804
S26
senso
anti-senso
tgtgcttcccaagctgtatgtgaag
cgattcctgactactttgctgtgaa
75 pb
NM001029
ACE2
Mas
S26
FIGURA 2 - Curvas de dissociação da PCR em tempo real.
A presença de pico único denota a pureza dos produtos da PCR.
45
3.5.5 Análise da especificidade dos produtos da PCR
Conforme a FIG. 2, as reações da PCR exibiram curvas de dissociação
uniformes, com pico único, indicando a especificidade dos produtos gerados.
Os amplicons dos genes Mas, ECA2 e S26 obtidos por PCR em tempo
real foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 4%. O gel foi preparado
com diluição de 2 g de agarose em 50 mL de tampão para eletroforese (TAE,
Invitrogen do Brasil) e deixado polimerizar à temperatura ambiente. Foi então
colocado em cuba de eletroforese e imerso em tampão TAE. Foram depositadas
no gel alíquotas de 12 µL de cada solução obtida na reação de PCR e também
um marcador de pares de base como indicador de migração (50 pb). Foi
adicionado também brometo de etídio (2 µl/50mL de gel) para posterior
visualização sob luz ultravioleta em um transiluminador acoplado a uma câmara
fotográfica digital.
Na FIG. 3, verificam-se fragmentos de 111, 129 e 75 pares de bases
obtidos nas reações de PCR para ECA2, Mas e S26, respectivamente, o que
corresponde exatamente ao tamanho dos amplicons previstos, com base na
localização dos oligonucleotídeos iniciadores na seqüência de cada gene
(QUADRO 1).
150
100
50
Pares de
bases
200
ACE2
(111)
Mas
(129)
S26
(75)
M
FIGURA 3 - Eletroforese em gel de agarose 4% comprovando a presença
de banda única nos produtos de amplificação dos genes da ECA2,
do receptor Mas e da proteína ribossomal S26.
M = marcador de peso molecular (escada de 50 pares de bases).
46
3.5.6 Análise quantitativa dos resultados do PCR
Os valores do CT obtidos de cada reação em duplicata foram usados
para calcular o CT médio de cada amostra. Esses valores foram usados para
quantificar o cDNA presente na amostra, por meio de uma curva-padrão
construída com diluições seriadas de uma amostra de referência (FIG. 4 e 5). A
partir da equação linear obtida pela análise de regressão dos resultados da curva-
padrão (CT = a. Log ng cDNA + b), calculou-se, para cada amostra em estudo, o
conteúdo de cDNA correspondente a cada gene amplificado. Os resultados foram
então expressos como razão da expressão do gene de interesse (ECA2 ou Mas),
pela expressão do gene de controle interno (S26).
ACE2
Mas
S26
FIGURA 4 - Curvas de amplificação da PCR em tempo real.
As séries de curvas correspondem, da esquerda para a direita, à amostra padrão de cDNA não
diluída, diluída 1:10, 1:100 e 1:1000.
47
-3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0
25
30
35
40
Log ng cDNA
CT
ACE2
-3 -2 -1 0 1
20
25
30
35
40
Log ng cDNA
CT
Mas
-3 -2 -1 0 1
10
15
20
25
30
Log ng cDNA
CT
S26
y = -3.1107x + 17.125
r
2
= 0.9689
y = -3.2854x + 28.064
r
2
= 0.9378
y = -2.4304x + 26.899
r
2
= 0.9683
FIGURA 5 - Curvas de regressão linear utilizadas para cálculo
dos resultados da PCR em tempo real.
CT= ciclo limiar. A curva da ECA2 foi construída com apenas três dos quatro padrões, para
permitir melhor ajuste da equação (r
2
=0,94) na faixa de concentração correspondente à maioria
das amostras em estudo. As linhas pontilhadas indicam o intervalo de confiança de 95%.
48
3.6 Imunofluorescência e microscopia confocal
Células epiteliais e estromais cultivadas em lâminas de vidro com
subdivisões (chamberslides) foram lavadas com solução de tampão fosfato duas
vezes, fixadas com acetona resfriada (-20˚C), cobertas com uma camada de
parafina e mantidas a 4˚C até os procedimentos de coloração. As lâminas foram
desparafinizadas em xilol, reidratadas por meio de série de álcoois em
concentrações decrescentes e incubadas em tampão fosfato, Tween 0,2%
(peso/volume) e albumina bovina sérica a 5% por 15 minutos.
Em seguida, as células foram incubadas com o primeiro anticorpo (o
mesmo utilizado na imunoistoquímica) diluído a 1:200, por 24 horas a 4˚C. Após a
incubação, as lâminas foram lavadas em tampão fosfato (três vezes por 5
minutos) e incubadas com o segundo anticorpo (diluição a 1:400, Alexa 594,
Molecular Probes) por 2 horas à temperatura ambiente. A reação foi interrompida
com tampão Tris 50 mM e as células foram cobertas com meio de montagem
glicerol/Tris e lamínula de vidro. Imagens fluorescentes foram obtidas usando um
microscópio confocal Zeiss 510 metalaser, equipado com objetiva de imersão
(63x).
3.7 Análise estatística
Os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, que
comprovou que sua distribuição não divergia significativamente da curva normal.
Portanto, os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média.
Diferenças entre dois grupos de tecido endometrial foram analisadas pelo teste t
de Student para amostras independentes, ao passo que diferenças entre dois
tipos celulares foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon para dois grupos pareados.
Diferenças com p<0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.
49
4 RESULTADOS
4.1 Detecção de Ang-(1-7) imunorreativa no lavado endometrial
Por meio de radioimunoensaio, a presença de Ang-(1-7) foi detectada
nas amostras de lavado endometrial. As concentrações de Ang-(1-7) variaram de
33 pg/mL, que corresponde ao limite de detecção do ensaio, a 121 pg/mL.
4.2 Localização da Ang-(1-7) no endométrio
Como pode ser visto na FIG. 6, a Ang-(1-7) apresentou, nas células
epiteliais glandulares, imunomarcação fraca a moderada na fase proliferativa e
moderada marcação na fase periovulatória, com intensa imunocoloração na fase
secretora intermediária e tardia.
As células epiteliais superficiais mostraram moderada intensidade na
marcação tanto na fase proliferativa quanto na fase secretora do endométrio. As
células estromais tinham moderada a intensa imunocoloração na parte inicial da
fase proliferativa e fraca imunocoloração na fase secretora. As estruturas
microvasculares do endométrio possuíam intensidade negativa a fraca na
imunocoloração, na pesquisa da Ang-(1-7), tanto na fase proliferativa quanto na
fase secretora (FIG. 6).
Nas células endometriais cultivadas e marcadas com
imunofluorescência, a microscopia confocal evidenciou marcação
predominantemente citoplasmática para Ang-(1-7) nas células epiteliais, ao passo
que nas células estromais o peptídeo teve expressão muito fraca, quase
indetectável (FIG. 7).
50
FIGURA 6 - Localização de Ang-(1-7) no endométrio humano
em diferentes fases do ciclo menstrual.
As áreas coradas em marrom indicam imunomarcação para Ang-(1-7) no epitélio glandular (setas
brancas) e no estroma (triângulos pretos). Alguns vasos estromais são apontados por setas
pretas. a) proliferativo inicial, com forte marcação do epitélio de superfície (triângulo duplo); b)
proliferativo intermediário; c,d) periovulatório; e) secretor intermediário; f) secretor tardio; g)
endometriose peritoneal na fase secretora; h) controle negativo. Barra = 50 µm.
a
b
c
d
e
f
g
h
51
FIGURA 7 - Imunofluorescência e microscopia confocal mostrando a localização
intracelular da imunomarcação para Ang-(1-7) em células endometriais cultivadas.
4.3 Expressão da enzima conversora de angiotensina tipo 2 no endométrio
A expressão gênica da ECA2, determinada por reação de PCR em
tempo real, demonstrou que a quantidade de mRNA encontrado na fase secretora
foi 6,6 vezes maior do que a encontrada na fase proliferativa do endométrio
(p<0,01, FIG. 8, GRÁF. B).
A expressão gênica da ECA2 nas células epiteliais foi duas vezes maior
do que nas células estromais (p<0,05, FIG. 8, GRÁF. A).
4.4 Localização do receptor Mas no endométrio
A imunolocalização da proteína Mas mostrou marcação nas células
epiteliais superficiais, no epitélio glandular e nas células estromais, com
Ang-(1-7) C. Negativo
Estromais
Epiteliais
52
intensidade semelhante nesses diferentes tipos celulares (FIG. 9). Também não
foi evidenciada diferença na intensidade entre as fases proliferativa e secretora.
As estruturas microvasculares do endométrio exibiram imunocoloração
negativa a fraca (FIG. 9).
Nas células endometriais cultivadas e marcadas com
imunofluorescência, a localização do receptor Mas foi predominantemente
extranuclear (FIG. 10).
4.5 Expressão do mRNA do receptor Mas nas células epiteliais e estromais
do endométrio
A reação de PCR em tempo real comprovou a expressão do mRNA do
receptor Mas nas biópsias endometriais de ambas as fases do ciclo menstrual,
assim como nas células endometriais cultivadas in vitro. Não se observou
diferença significativa na expressão gênica do receptor MAS nas células epiteliais,
quando comparadas com a expressão nas células estromais (FIG. 11, GRÁF. A).
Na comparação entre biópsias endometriais obtidas em diferentes fases do ciclo
menstrual, observou-se maior concentração de mRNA do receptor Mas nas
amostras de endométrio proliferativo em comparação com aquelas de endométrio
secretor (p<0,05, FIG. 11, GRÁF. B).
53
FIGURA 8 - Expressão do mRNA para ECA2 em células endometriais
cultivadas e em amostras de tecido endometrial datadas como
endométrio proliferativo ou periovulatório (Prol+Int) vs. secretor.
Os dados são expressos como média ± erro-padrão da expressão gênica corrigida de ECA2
corrigada para o controle interno S26. *p<0,05 para comparações entre tipos celulares (teste de
Wilcoxon) ou entre fases do ciclo (teste t de Student).
A
Epiteliais Estromais
0.0
0.1
0.2
*
Relação ACE2 / S26
(unidades arbitrárias)
B
Prol+Int Sec
0
1
2
3
*
Relação ACE2 / S26
(unidades arbitrárias)
54
FIGURA 9 - Localização do receptor Mas no endométrio humano
em diferentes fases do ciclo menstrual.
As áreas coradas em marrom indicam imunomarcação para o Mas no epitélio glandular (setas
brancas) e no estroma (triângulos pretos). Alguns vasos estromais são apontados por setas pretas. a)
proliferativo inicial; b) proliferativo intermediário; c,d) periovulatório; e) secretor intermediário; f)
secretor tardio; g) endometriose peritoneal na fase secretora e; h) controle negativo. Barra = 50 µm.
a
b
c
d
e
f
g
h
55
Mas C. Negativo
Estromais
Epiteliais
FIGURA 10 - Imunofluorescência e microscopia confocal mostrando a localização
intracelular da imunomarcação para Mas em células endometriais cultivadas.
A
Epiteliais Estromais
0
10
20
30
Relação Mas / S26
(unidades arbitrárias)
B
Prol+Int Sec
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
Relação Mas / S26
(unidades arbitrárias)
FIGURA 11 - Expressão do mRNA para o receptor Mas em células endometriais
cultivadas e em amostras de tecido endometrial datadas como endométrio
proliferativo ou periovulatório (Prol+Int) vs. Secretor
Os dados são expressos como média ± erro padrão da expressão gênica corrigida de Mas
corrigida para o controle interno S26. *p<0,05 para comparações entre tipos celulares (teste de
Wilcoxon) ou entre fases do ciclo (teste t de Student).
56
4.6 Resumo dos achados de imunolocalização da Ang-(1-7) e Mas no
endométrio humano
A FIG. 12 apresenta um resumo esquemático da intensidade de
imunocoloração para Ang-(1-7) e seu receptor Mas nas amostras endometriais
obtidas em diferentes fases do ciclo menstrual.
FIGURA 12 - Resumo esquemático da intensidade de imunocoloração
para Ang-(1-7) e seu receptor Mas nas amostras endometriais
obtidas em diferentes fases do ciclo menstrual.
1 = proliferativo inicial; 2 = proliferativo intermediário; 3 = periovulatório; 4 = secretor intermediário;
5 = secretor tardio. A intensidade de imunocoloração é representada pelas cores:
branco = intensidade fraca; cinza = intensidade moderada; e preto = intensidade forte.
1
2
3
4
5
Glândulas
Estroma
Vasos
Ang-(1-7)
Mas
Epit.Superfície
Glândulas
Estroma
Vasos
Epit.Superfície
57
5 DISCUSSÃO
O sistema renina-angiotensina foi estudado, no início, principalmente
pelas suas ações no sistema vascular, sendo a Ang II o principal efetor. Em
alguns tecidos como o do cérebro, a existência da barreira hemato-encefálica
levantava dúvidas de como alguns componentes deste sistema alcançariam
determinadas regiões do órgão. Evidências foram se acumulando no sentido de
que diferentes tipos de tecidos do organismo também expressam vários dos
componentes do SRA e, portanto, a noção de compartimentalização do SRA foi
se sedimentando (HUSAIN et al., 1983). Além disto, foi constatado que essa
expressão tecidual de enzimas e peptídeos do SRA é independente da que ocorre
no sistema cardiovascular, seja na quantidade ou no momento, estando, portanto,
subordinada à fisiologia local de cada órgão ou tecido em particular (NARUSE et
al., 1984; OKUIAMA et al., 1988; PANDEY; MISONO; INAGAMI, 1984; PAUL;
MEHR; KREUTZ, 2006l).
O endométrio é um tecido muito vascularizado, que apresenta
modificações morfológicas e funcionais de maneira cíclica, sob estímulo de
hormônios esteróides. Neste tecido, o conhecimento relativo ao SRA é escasso.
Sabe-se que o endométrio expressa renina e que esta expressão aumenta sob
estímulo da progesterona (SHAH et al., 1991). Foi demonstrado também que o
endométrio expressa Ang II, seus receptores AT1 e AT2 e a ECA (AHMED et al.,
1995; LI; AHMED, 1997; SARIDOGAN et al., 1996).
No endométrio, durante a fase proliferativa, a Ang II se localiza nas
células do epitélio glandular e nas células estromais, aparecendo pouco em torno
dos vasos. Na fase secretora, ao contrário, foi imunolocalizada
predominantemente nas células estromais perivasculares (pré-deciduais) e
apresentou padrão negligível nos outros tipos celulares (AHMED et al., 1995)
O receptor AT2 possui maior expressão no endométrio do que o
receptor AT1 (AHMED et al., 1995). O receptor AT1 foi identificado no endométrio,
nas células do epitélio glandular e no endotélio vascular, com expressão
negligível nas células estromais. A marcação deste receptor predomina na fase
proliferativa. Foi observado crescente aumento na intensidade da
58
imunocoloração, da parte inicial da fase proliferativa até o periovulatório
(SARIDOGAN et al., 1996).
A ECA foi descrita e avaliada no endométrio por técnica de western blot
e imunoistoquímica, com expressão maior no endométrio menstrual e na parte
média e final da fase secretora. A imunoistoquímica localizou a ECA nas células
epiteliais glandulares e nas células endoteliais e menor expressão nas células
estromais (LI; AHMED, 1997).
O acúmulo de evidências de que a Ang-(1-7) é um peptídeo ativo, que
se acopla ao receptor Mas e apresenta a maioria dos seus efeitos de forma
antagônica aos da Ang II e a descoberta da ECA2 fizeram com que os estudos
relacionados ao SRA se ampliassem nas duas últimas décadas para além do foco
da fisiopatologia da hipertensão arterial.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a presença e a
localização da Ang-(1-7), do receptor Mas e da ECA tipo 2 no endométrio
humano, um tecido dinâmico, devido à influência de hormônios esteróides e
constituído de tipos celulares diversos. Além disso, é a primeira vez que se
demonstram a presença e a localização da Ang-(1-7) e a expressão do receptor
Mas e da ECA2 no endométrio humano.
A expressão gênica da ECA2 e do receptor Mas foi avaliada por meio
da PCR em tempo real. O método apresenta ótima sensibilidade e
reprodutibilidade. Os três pares de oligonucleotídeos iniciadores foram
desenhados de forma a inibir a amplificação de possível DNA genômico
contaminante. Como referência comparativa, foi utilizada no controle interno a
expressão do gene da proteína ribossomal S26, de expressão constitutiva que
não sofre variação na expressão sob diversas condições (VINCENT; MARTY;
FORT, 1993). As amostras foram aferidas em duplicatas e extraídas as médias
dos valores obtidos.
A ECA tipo2, uma enzima homóloga à ECA, foi estudada em células
epiteliais e estromais cultivadas. O mRNA foi detectado nos dois tipos celulares,
mas aparece em maior quantidade (duas vezes mais) nas células epiteliais do
que nas estromais e tem expressão 6,6 vezes maior na fase secretora do que na
fase proliferativa.
A expressão do receptor Mas no material analisado não apresentou
diferença significativa quando foram comparadas as células epiteliais com as
59
células estromais. Também não houve diferença significativa na expressão do
Mas entre a fase proliferativa e a fase secretora do endométrio. É interessante
relatar que foi verificado, em experimento recente, que o receptor Mas pode
formar um complexo hetero-oligomérico com o receptor AT1 da Ang II, inibindo as
ações deste peptídeo (KOSTENIS et al., 2005).
Apesar do método utilizado para avaliar a expressão gênica ser um
processo automatizado, bastante sensível, e as reações se processarem em um
ambiente fechado, foram tomados cuidados de estringência técnica referentes ao
manuseio dos materiais utilizados. Foram também realizadas curvas de diluição e
curvas de dissociação, no intuito de se avaliarem possíveis desvios no método.
Os amplicons produzidos na reação de RT-PCR foram submetidos à eletroforese
em gel de agarose e aferidos com um marcador de pares de base, também com o
objetivo de conferir os resultados obtidos no processo.
O método utilizado para a localização do heptapeptídeo foi a imuno-
istoquímica, um método que apresenta grande especificidade. Sendo a Ang-(1-7)
um peptídeo formado no metabolismo intermediário das células, os métodos de
biologia molecular obviamente não se prestam ao seu estudo. Uma limitação da
imunoistoquímica é que este método não diferencia entre o peptídeo ligado ao
receptor e o peptídeo livre, nem atesta a sua origem.
A imunolocalização da Ang-(1-7) mostrou marcação intensa nas células
epiteliais glandulares na parte média e final da fase secretora, em contraste com
as amostras da fase proliferativa, na qual a marcação foi fraca a moderada. Nas
células epiteliais superficiais, a imunocoloração apresentou intensidade moderada
tanto na fase proliferativa quanto na fase secretora. Nas células estromais, a
imunocoloração foi moderada a intensa na parte inicial da fase proliferativa e fraca
marcação na fase secretora.
Foi descrito anteriormente que a Ang II, considerado um efetor
multifuncional do SRA, foi detectada principalmente nas células epiteliais
glandulares e estromais durante a fase proliferativa do endométrio (AHMED et
al.,1995). Relevante é a presença desse peptídeo na fase de crescimento do
endométrio, dado seu efeito mitogênico e angiogênico (ANDRADE et al., 1996;
BAKER; ACETO, 1990; DAEMEN et al., 1991; FERNADEZ; TWICKLER; MEAD,
1985; LE NOBLE et al., 1991; MACHADO; SANTOS; ANDRADE, 1999),
contrastando com os achados deste trabalho, em que a Ang-(1-7), sabidamente
60
um peptídeo com efeito anti-proliferativo e anti-angiogênico, predominou na fase
secretora, quando o endométrio não tem crescimento expressivo e possui certa
estabilidade morfológica. Encontrou-se também uma marcação importante da
Ang-(1-7) na fase inicial da fase proliferativa, quando o endométrio não tem,
ainda, crescimento expressivo.
É interessante notar que a imunocoloração das estruturas
microvasculares do endométrio exibiram marcação fraca para a Ang-(1-7), em
contraste com a importância dada a este peptídeo no sistema cardiovascular,
relativas ao seu efeito vasodilatador. A Ang II também não é encontrada nas
estruturas microvasculares e sim nas células estromais perivasculares na fase
secretora, podendo atuar nesses vasos de forma parácrina (AHMED et al., 1995).
A Ang-(1-7) é capaz de liberar prostaglandina, assim como a Ang II
(HILCHEY; BELL-QUILLEY, 1995; IYER et al., 2000; JAISWAL et al., 1992;
TALLANT; CLARK, 2003). Investigações relacionadas com a transdução do sinal
da Ang-(1-7) e Ang II, em células do músculo liso da aorta de coelho,
demonstraram a liberação de ácido aracdônico pelos dois peptídeos, só que a
produção de 6-keto PGFıα, um metabólito estável da prostaciclina, foi muito maior
com a estimulação ocorrendo com Ang-(1-7).
Verificou-se, também, que o heptapeptídeo, a partir da estimulação do
íon Ca++ e MAP kinase (MAPK), produz a translocação da fosfolipase A² (PLA²)
do citoplasma para o envelope nuclear, estimulando a síntese de prostaglandina
(MUTHALIF et al., 1998). A prostaciclina possui, além de efeito vasodilatador,
também inibição na síntese de DNA, reduzindo a proliferação celular (MORISAKI
et al., 1988), assim como outras prostaglandinas (NILSSON; OLSSON, 1984).
Vale lembrar aqui que, na parte média da fase secretora do endométrio, ocorre
um edema nesse tecido, possivelmente mediado por prostaglandinas.
Outra substância que também inibe a proliferação celular e apresenta
efeito vasodilatador é o óxido nítrico, uma substância muito estudada no endotélio
e na musculatura lisa vascular (FARHY et al., 1993; GARG; HASSID, 1989;
ZUCKERBRAUM et al., 2007). É sabido que a Ang-(1-7) também libera óxido
nítrico (BROSNIHAN, 1998; BROSNIHAN; LI; FERRARIO, 1996; HEITSCH et al.,
2001; PÖRSTI et al., 1994; SAMPAIO et al., 2007a), sendo este um dos
mecanismos que explicam o seu efeito vasodilatador. O endométrio expressa
tanto prostaglandinas quanto óxido nítrico. As duas isoformas da enzima óxido
61
nítrico sintase, uma constitutiva e a outra induzível, são expressas principalmente
pelas células do epitélio glandular, sendo que a expressão é nitidamente
preponderante na fase secretora do endométrio (KHORRAM; GARTHWAITE;
MAGNESS, 1999; TSCHUGGUEL et al., 1999; TSENG et al., 1996).
A Ang-(1-7) nitidamente inibe, mesmo que parcialmente, mecanismos
de proliferação celular, como demonstrado em células de músculo liso vascular,
no endotélio e em cultura de células neoplásicas (GALLAGHER; TALLANT, 2004;
MENON et al., 2007; STRAWN; FERRARIO; TALLANT, 1999; TALLANT; CLARK,
2003; TALLANT; FERRARIO; GALLAGHER, 2005). A inibição da Ang-(1-7) sobre
a Ang II é devida, em parte, à interferência na via ERK1/2 (SAMPAIO et al.,
2007b; ZHU et al., 2002), sendo possível também um aumento do cAMP, levando
à redução na atividade da MAPK. Estas ações contrabalançam os estímulos
produzidos pela Ang II.
O estrogênio se relaciona com fatores de crescimento celular (NELSON
et al., 1991). No tecido endometrial, o estímulo estrogênico produz proliferação
celular. Outros fatores de crescimento e seus receptores também já foram
descritos no endométrio, como o VEGF, o FGF e EGF (MÖLLER et al., 2001;
SANGHA et al., 1997), sendo alguns destes, agonistas dos receptores tirosino-
kinase (ÉTIENNE; MILLOT, 2003), que atuam na via ERK1/2, via esta que pode
sofrer inibição por ação da Ang-(1-7).
A progesterona, por sua vez, produz no endométrio uma inibição da
proliferação celular, sendo alguns desses mecanismos, a diminuição da
expressão dos receptores estrogênicos nos núcleos celulares (CLARKE;
SUTHERLAND, 1990; HSUEH; PECK; CLARK, 1976; OKULICZ; BALSAMO;
TAST, 1993) e a conversão do 17β-estradiol em sulfato de estrona, que é
rapidamente excretado da célula (TSENG; GURPID, 1975). É possível que
existam outros mecanismos deflagrados pela progesterona na fase secretora do
endométrio, para inibir a proliferação e estabilizar o tecido após a ovulação,
mantendo-o apto à nidação. Foi demonstrado, neste trabalho, que a ECA tipo2,
enzima que converte a Ang II em Ang-(1-7), apresenta expressão 6,6 vezes maior
na fase secretora do que na fase proliferativa. É possível, portanto, que a
progesterona ative a expressão do gene dessa enzima, que atuará degradando a
Ang II, um fator que ativa a proliferação celular, produzindo, por outro lado, um
efetor que iniba também vias mitogênicas, como é o caso da Ang-(1-7).
62
Tem-se, então, que a Ang II se expressa mais na fase proliferativa e a
Ang-(1-7) mais na fase secretora. Esta idéia sugere um equilíbrio no que tange à
proliferação celular, um contraponto entre os dois peptídeos, como ocorre entre o
estrogênio e a progesterona. Seria plausível, portanto, sugerir, para estudos
futuros, experimentos que venham a corroborar a idéia de que a Ang-(1-7)
poderia ser um efetor da progesterona na inibição do crescimento celular
endometrial, seja através da prostaciclina ou do óxido nítrico ou de ambos.
Os resultados deste trabalho vieram contribuir para a complementação
do conhecimento relacionado ao SRA no endométrio e sugerem a existência de
um sistema tecidual, tendo sido demonstrada pela primeira vez a presença e
localização espaço-temporal da Ang-(1-7), do Mas e da ECA tipo2. É possível que
essa ampliação do conhecimento sobre o SRA nesse tecido venha a contribuir
com áreas do conhecimento como a contracepção ou o tratamento das
hiperplasias e neoplasias endometriais.
63
6 CONCLUSÕES
• O peptídeo vasoativo Ang-(1-7), a enzima envolvida na sua síntese e seu
receptor Mas são expressos no endométrio humano em todas as fases do
ciclo menstrual.
• A expressão do receptor Mas não apresentou diferença significativa entre
as células epiteliais e estromais, nem entre a fase proliferativa e a fase
secretora do endométrio humano. A expressão de Ang-(1-7) no endométrio
humano aumenta na fase secretora do ciclo menstrual.
• A expressão da enzima conversora de angiotensina tipo 2 é duas vezes
maior nas células epiteliais do que nas células estromais e é 6,6 vezes
maior na fase secretora do que na fase proliferativa.
64
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