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Anicet Okinga
Depressão e Privação Materna. Há um Lugar Para a Via L-Arginina-Óxido
Nítrico?
Rio de Janeiro
2009
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E
EXPERIMENTAL – FISCLINEX
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Anicet Okinga
Depressão e Privação Materna. Há um Lugar Para a Via L-Arginina-Óxido
Nítrico?
Dissertação apresentada, como requisito
para obtenção do grau de Mestre em
Fisiopatologia Clínica Experimental, ao
centro Biomédico da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro.
Orientadora: Professora Dra. Tatiana Marlowe Cunha Brunini
Co-orientador: Professor Dr. Marcos Rochedo Ferraz
Rio de Janeiro
2009
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Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial
desta tese.
__________________________ _________________
Assinatura Data
Okinga, Anicet
Depressão e privação materna. Há um lugar para a via da L-
arginina-óxido nítrico?/ Okinga Anicet. – 2009.
xiii, 73p.: il.
Orientadores: Tatiana Marlowe Cunha Brunini e Marcos
Rochedo Ferraz.
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas.
1. L-arginina. 2. Óxido Nítrico. 3. Depressão. 4. Privação
materna. I. Brunini, Tatiana Marlowe Cunha e Ferraz, Marcos
Rochedo. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Centro
Biomédico, Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Anicet Okinga
Depressão e Privação Materna. Há um Lugar Para a Via L-Arginina-Óxido
Nítrico?
Dissertação apresentada, como requisito
para obtenção do grau de Mestre em
Fisiopatologia Clínica Experimental, ao
centro Biomédico da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro.
Aprovado em_____________________________________________________
Banca Examinadora:_______________________________________________
_____________________________________________________
Profº. Dr. Sérgio Fernando Ferreira dos Santos (Presidente)
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
_____________________________________________________
Profª. Drª. Marilda Emmanuel Novaes Lipp
Pontifica Universidade Católica de Campinas
_____________________________________________________
Profª. Drª. Márcia Barbosa Águila
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
_____________________________________________________
Profª. Drª. Tânia Tano (Suplente)
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
_____________________________________________________
Profª. Drª Lúcia Emmanoel Novaes Malagris (Suplente)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de janeiro
2009
DEDICATÓRIA
Dedico esta obra aos meus pais,
Ekangui Benoît e Ambieni Augustine,
e às minhas quatro irmãs queridas
(Mfoudou Gisèle, Ngouandjoumbi
Blandine, Anguélé Béatrice e Assanda
Cosette) que, sem os quais, eu não
havia de existir; e ao meu grande
amor e sempiterna companheira
Lucimarta, a Martinha, pelo amparo,
incentivo e por tornar-me um homem
completo, e, sobretudo ao Deus que
sempre me acompanha desde o
ventre da minha mãe, o Senhor Jesus
Cristo, que faz de mim mais do que
um vencedor.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof
o
. Doutor Antônio Cláudio Mendes Ribeiro, pela orientação
constante e eficaz, por acrescentar ao meu trabalho a experiência e sabedoria
cruciais para o cumprimento de todas as tarefas e alcance dos objetivos. Nesses
dois anos, não se importou em compartilhar de seu vasto conhecimento. De quem
sempre guardarei os bons ensinamentos.
À minha orientadora, Prof
a
. Doutora Tatiana Marlowe Cunha Brunini pelos
momentos de dedicação, pela liberdade de pensamento, pelas palavras de força e
incentivo, pela busca constante em suprir as necessidades de equipamentos e
materiais para o bom desempenho dos experimentos, mas, principalmente, pela
prontidão e ajuda sábia nos momentos difíceis.
Ao Prof
o
. Doutor Marcos Rochedo Ferraz, por ter acreditado em mim e me
incentivado a fazer parte do fascinante mundo científico, mas, principalmente, por ter
sido não somente um professor, mas um grande amigo.
Ao Prof
o
. Doutor Egberto Gaspar de Moura, que apesar do pouco contato,
me inspirou por sua sabedoria e, ao mesmo tempo, por sua simplicidade.
Às colegas e amigas, Monique Moss, Mariana Siqueira, Natália Pereira,
Marcela Anjos, Carmen Assumpção, Cristiane Matsuura, Luísa Meirelles, Vivian
Liane, por estarem sempre presentes nos momentos alegres e nem sempre alegres.
Partilhamos, não só o mesmo espaço de trabalho, mas também, o sucesso e
insucesso que cada experimento proporcionava, como também a satisfação pelos
resultados obtidos.
Às amigas Cristiane Costa, Dayane Ognibene e Lenise Carvalho pela
valiosa colaboração que tornou possível a realização dessa dissertação; esse
convívio nos levou a compartilhar de uma amizade sincera e benigna.
Aos amigos Gabriela Skinner, Márcia Martins, Fábio Damasceno, Viviane
Yunes Rappozo, Sérgio Sebastião, Tiago Savignon, Ive Sab pela amizade e
solidariedade dispensadas. É sempre bom poder contar com o apoio de pessoas
como vocês.
À Amélia, por sua disponibilidade e interesse por cada aluno, merecendo ser
mencionada em todas as dissertações e teses concluídas na Fisclinex.
Aos bioteristas, em especial ao Nelcir Rodrigues (um grande amigo e
conselheiro) pela paciência e dedicação ao biotério, sem as quais não seria possível
a realização dos experimentos e conclusão desta dissertação.
À amiga e fiel Alessandra de Souza pelos momentos confidenciais e
amizade que compartilhamos, estará sempre em meu coração.
À família da minha amada Lucimarta: Dona Zita, Sr. Paulo, irmãos, irmãs,
tios, tias e sobrinhos queridos, dos quais sempre recebi todo o apoio e também
por me aceitarem simplesmente como parte da família.
A todos os professores que, de certo modo, cruzaram o meu caminho e me
ensinaram a ciência; em excelência, o Professor Wladimir Cortezzi.
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho deixo o meu agradecimento.
Ao único DEUS sábio, para o Qual toda glória é dada por JESUS CRISTO
para todo o sempre, por endireitar os caminhos tortuosos e tornar possível o término
desta dissertação.
“Deus escolheu as coisas loucas
deste mundo para confundir as
sábias; Deus escolheu as coisas
fracas deste mundo para confundir as
fortes. Deus escolheu as coisas vis
deste mundo, e as desprezíveis, e as
que não são, para aniquilar as que
são”.
1Coríntios 1:27-28
RESUMO
Os eventos adversos ocorridos no início da vida podem funcionar como uma
resposta mal-adaptada ao estresse, e aumentar a vulnerabilidade a doenças como
hipertensão e cardiopatia isquêmica no decorrer da vida. As manipulações
imediatamente após o nascimento (separação materna em ratos) são usadas em
animais para estudar os efeitos negativos do estresse ou trauma ligados ao início do
desenvolvimento. Distúrbios tal como depressão estão associados ao stress
perinatal e às doenças cardiovasculares (DCV). A via L-arginina-óxido nítrico (NO)
participa da gênese e manutenção das DCVs. O NO está associado a varias funções
fisiológicas como vasodilatação e função plaquetária, sendo sintetizado a partir do
aminoácido básico L-arginina por uma família de enzimas denominada óxido nítrico-
sintases (NOS). O transporte de L-arginina em plaquetas, mediado pelo sistema
transportador y
+
L, modula a síntese do NO. Esta dissertação objetiva investigar as
alterações da via L-arginina-NO em um modelo de estresse pós-natal (EPON) e sua
relação com a depressão. Neste estudo o transporte intraplaquetário de L-arginina, a
atividade basal e a expressão de NOS em plaquetas, a reatividade vascular à
noradrenalina (NA), à acetilcolina (ACh) e à nitroglicerina (NG) em leito arterial
mesentérico (LAM), a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e a formação de subprodutos da lipoperoxidação
[malondialdeído (MDA)] por TBARS em homogenato de vasos mesentéricos foram
investigados em ratos machos normotensos (NT) Wistar e em ratos machos
espontaneamente hipertensos (SHR). O EPON foi realizado através do modelo de
separação materna única (SMU) onde os filhotes são separados da mãe por oito
minutos. Foram quatro grupos: NT controles (NT-C), NT submetidos ao SMU (NT-
SMU), SHR não-separados das mães (SHR-NS) e SHR submetidos ao SMU (SHR-
SMU). Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que nos ratos Wistar
NT-SMU ocorre um aumento (p<0,05) na pressão arterial enquanto o transporte de
L-arginina e produção de NO plaquetário estão reduzidos (p<0,05). A expressão da
enzima NOS endotelial não foi afetada ao contrário da NOS induzível (iNOS)
plaquetária, reduzida (p<0,05) em ratos com privação materna. Em ratos SHR-SMU
houve uma redução (p<0,05) na pressão arterial, um aumento (p<0,05) no fluxo de
L-arginina, através do sistema y
+
L, um aumento (p<0,05) na expressão da enzima
iNOS plaquetária. Não houve alteração na atividade das enzimas antioxidantes SOD
e CAT nos animais estudados, assim como nos níveis de MDA. Os ratos SHR nesta
dissertação apresentaram uma vasoreatividade mesentérica em resposta
aumentada a NA, ACh e NG. Os resultados desta dissertação sugerem que,
provavelmente, a associação de SMU à hipertensão afeta de maneira independente
mecanismos celulares ainda não esclarecidos. Assim a privação materna parece
levar a alterações da via L-arginina-NO. Estes resultados representam um passo à
frente na validação de uma alteração da via L-arginina-NO como marcador de
privação materna e depressão.
Palavras-chave: Privação materna; L-arginina; Óxido-nítrico; Depressão; e
Separação materna única.
ABSTRACT
Traumatic events early in the life are associated with a maladaptive stress response,
and might increase the vulnerability to diseases like hypertension and isquemic
cardiopathy later in life. Immediate postnatal manipulations such as maternal
withdrawal in rats represent models useful to study the negative effects of perinatal
stress. Diseases such as depression are associated with early life stress and
cardiovascular disease (CVD). The L-arginine-nitric oxide (NO) pathway is involved in
the genesis and maintenance of CVDs. NO is associated with several physiologic
function such as vasodilatation and platelet function, it is synthesized from the basic
amino acid L-arginine by an enzyme family named nitric oxide synthases (NOS). The
platelet L-arginine transport mediated by the y+L system modulates the synthesis of
NO in platelets. The objective of this thesis was to investigate the alterations of L-
arginine-NO pathway in a postnatal model stress (PMS). The L-arginine transport,
the basal activity and the expression of NOS, the vascular reactivity of
norepinephrine (NE), acetylcholine (ACh) and nitroglycerin (NG) in mesenteric
arterial bed (MAB), the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD),
catalase (CAT), and the lipid peroxidation measured by the thio-barbituric assay
(TBARS) for malondialdehyde (MDA) in mesenteric homogenate were investigated in
platelets from normotense (NT) male rats WISTAR and male spontaneously
hypertensive rats (SHR). PMS was consequence of a single maternal separation
(SMS) where the offspring was separated from its mother during eight minutes. Four
groups were obtained: NT controls (NT-C), NT submitted to SMS (NT-SMS), SHR
non-separated (SHR-NS), and SHR submitted to SMS (SHR-SMS). The results
elicited in the present study provided evidence that in Wistar rats NT-SMU show an
elevation of blood pressure (p<0.05), whilst L-arginine transport and platelet NO
production were reduced (p<0.05). In platelets taken from this group of rats the
endothelial NOS (eNOS) expression was not affected, in contrast to inducible NOS
(iNOS) was reduced (p<0.05). In SHR-SMU the blood pressure was reduced
(p<0.05), L-arginine transport by system y
+
L was increased and associated with an
increase of the iNOS expression from platelets (p<0.05). The activity of SOD and
CAT was no significant among these four groups; the levels of MDA also were no
significant. The SHR rats in this thesis showed a mesenteric vasoreactivity response
to NE, ACh, and NG increased. The results of this thesis suggest that in the SMS
model, hypertension has a cellular mechanism not yet elucidated. The present
results represent a step to the understanding of the L-arginine-NO pathway as a
marker of maternal privation and depression.
Key-words: Maternal privation; L-arginine-nitric oxide pathway; Depression; and
Single maternal separation.
Key-words: Maternal privation; L-arginine; Nitric oxide; Depression; and Single
maternal separation.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Média do Peso e da Pressão Arterial Sistólica de todos os grupos
experimentais
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Forma estrutural da L-arginina 25
Figura 2 - Síntese do NO 26
Figura 3 - A via L-arginina-óxido nítrico-GMPc 27
Figura 4 - Metabolismo da L-arginina, com ênfase na sua interrelação com a
formação de óxido nítrico 29
Figura 5 - Esquema de perfusão do leito arterial mesentérico 40
Figura 6 - Influxo de L-arginina nas plaquetas de animais controles (NT-C),
hipertensos (SHR-NS), normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) 47
Figura 7 - Produção de L-citrulina nas plaquetas de animais controles (NT-C),
hipertensos (SHR-NS), normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) 48
Figura 8 - Resposta vasoconstritora induzida pela NE em leito arterial mesentérico
de animais controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS),
normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) e SHR submetidos
a SMU (SHR-SMU) 49
Figura 9 - Resposta vasodilatadora de ACh em leito arterial mesentérico de animais
controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS), normotensos
submetidos a SMU (NT-SMU) e SHR submetidos a SMU
(SHR-SMU) 50
Figura 10 - Resposta vasodilatadora da NG em leito arterial mesentérico de animais
controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS), normotensos
submetidos a SMU (NT-SMU) e SHRsubmetidos
a SMU (SHR-SMU) 51
Figura 11 - Os níveis de TBARS em amostras de mesentério dos animais
controles NT-C e dos animais NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU 52
Figura 12 - A atividade da enzima SOD em amostras de mesentério dos
animais controles NT-C e dos animais NT-SMU, SHR-NS,
SHR-SMU 52
Figura 13 - A atividade da enzima catalase em homogenato de vasos
Mesentéricos dos animais controles NT-C e dos animais
NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU 53
Figura 14 - (A) Expressão da enzima eNOS, Western Blotting representativo com
anticorpo anti-eNOS e (B) expressão da enzima iNOS, Western Blotting
representativo com anticorpo anti-iNOS normalizadas com anticorpo
anti-beta-tubulina nas plaquetas dos animais controles NT-C e dos
animais NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU; Valores estão expressos
em média + erro padrão, n= 3 animais por grupo. p<0.05. 54
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACh Acetilcolina
ADMA Dimetil-L-arginina-assimétrica
β-Tub β-tubulina
BH
4
Tetrahidrobiopterina
Ca
++
Íon cáclcio
CAT Catalase
DALY Disability Adjusted Life Years (anos de vida perdida ajustadas pela
incapacidade)
DCV Doença cardiovascular
DPN Dia pós-natal
DSM-IV Manual Estatístico Diagnóstico da Associação Norte-americana de
Psiquiatria – quarta versão
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EPON Estresse pós-natal
EROs Espécies reativas de oxigênio
FAD Dinucleotídeo adenina-flavina
FMN Mononucleotídeo flavina
GC Guanilato ciclase
GCs Glicocorticóides
GMPc Guanosina monofosfato cíclica
GTP Guanosina trifosfato
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
HPA Hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo)
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
K
m
Constante de afinidade
LAM Leito arterial mesentérico
L-NAME N
G
-nitro-L-arginina-metil-éster
L-NMMA N
G
-monometil-L-arginina
L-NNA N
G
-nitro-L-arginina
MDA Malondialdeído
NA Noradrenalina
Na
+
Íon sódio
NADPH Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato-reduzida
NG Nitroglicerina
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NT-C Ratos normotensos Wistar controles
NT-SMU Ratos normotensivos Wistar submetidos à SMU
O
2
Oxigênio molecular (dioxigênio)
O
2
-
Ânion superóxido
OH• Radical hidroxil
OMS Organização Mundial da Saúde
PA Pressão arterial
PAS Pressão arterial sistólica
PP Pressão de perfusão
SHR Ratos espontaneamente hipertensos
SHR-NS Ratos espontaneamente hipertensos não-separados
SHR-SMU Ratos espontaneamente hipertensos submetidos à SMU
SMU Separação materna única
SOD Superóxido dismutase
TBA Ácido tiobarbitúrico
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO............................................................................................15
1. 1 Stress e Depressão...................................................................................18
1. 2 Modelo Animal de Depressão...................................................................20
1. 3 Depressão versus Doenças Cardiovasculares.......................................22
1. 4 A Via L-arginina-NO-GMPc........................................................................23
1. 4. 1 L-Arginina e o seu Paradoxo.......................................................................24
1. 4. 2 Metabolismo da L-arginina..........................................................................28
1. 4. 3 Estresse Oxidativo e a Síntese de Óxido Nítrico.........................................30
1. 5 Depressão, sua Relação com a via L-Arginina-NO-GMPc e a
Doença cardiovascular.............................................................................33
2 OBJETIVOS DO ESTUDO..........................................................................35
2. 1 Objetivo Geral............................................................................................35
2. 2 Objetivos Específicos...............................................................................35
3 MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................36
3. 1 Animais Utilizados....................................................................................36
3. 2 Aferição da Pressão Arterial....................................................................36
3. 3 Separação Materna Única........................................................................37
3. 4 Protocolos Experimentais com Leito Arterial Mesentérico..................37
3. 4. 1 Isolamento do Leito Arterial Mesentérico (LAM).........................................37
3. 4. 2 Reatividade do Leito Arterial Mesentérico..................................................38
3. 4. 3 Atividade Enzimática em Leito Arterial Mesentérico
...................................40
3. 4. 3. 1 Medida da Superóxido Dismutase..............................................................40
3. 4. 3. 2 Medida da Catalase....................................................................................41
3. 4. 3. 3 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARs).............................41
3. 5 Protocolos Experimentais com Plaquetas.............................................42
3. 5. 1 Transporte de L-arginina em Plaquetas .....................................................42
3. 5. 2 Análise da Atividade da NOS Plaquetária...................................................43
3. 5. 3 Extração de Proteína e Western Blotting em Plaquetas.............................43
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................45
5 RESULTADOS...........................................................................................46
5. 1 Análise do Peso e da Pressão Arterial Sistêmica dos Animais...........46
5. 2 Influxo da L-arginina em Plaquetas........................................................46
5. 3 Atividade Basal de NOS Intraplaquetária...............................................47
5. 4 Resposta Vasoconstritora no Leito Arterial Mesentérico.....................48
5. 5 Diminuição da Pressão de Perfusão Induzida pela Acetilcolina..........49
5. 6 Diminuição da Pressão de Perfusão Induzida pela Nitroglicerina.......50
5. 7 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)......................51
5. 8 Superóxido Dismutase (SOD)..................................................................52
5. 9 Catalase.....................................................................................................52
5.10 Expressão das enzimas eNOS e iNOS....................................................53
6 DISCUSSÃO..............................................................................................55
7 CONCLUSÃO............................................................................................62
REFERÊNCIAS.........................................................................................63
ANEXOS....................................................................................................72
1 INTRODUÇÃO
A exposição precoce a um ambiente adverso, ao stress ou a traumatismos
pode propiciar condições que levarão os organismos a uma variedade de doenças,
desde desordens cardiovasculares até psicopatologias, que se manifestam
tardiamente na vida em humanos e em animais (WINNICOTT, 1987; BARKER e
cols., 1989; JOYNT; WHELLAN; O'CONNOR, 2003; MACRÌ; CHIAROTTI; WÜRBEL,
2008). Por exemplo, os indivíduos que sofreram abusos físico, sexual e
emocional ou que foram abandonados, enquanto crianças apresentam um risco
aumentado de desenvolver um transtorno emocional na vida adulta como, pela
ótica psiquiátrica atual, um grande número de desordens: stress pós-traumático,
pânico, fobias, ansiedade generalizada, hiperatividade, déficit de atenção,
transtornos depressivos etc. (WINNICOTT, 1948; BECK, 1976; HEIM; NEMEROFF,
2001; NEMEROFF, 2004)
.
Na investigação dos mecanismos subjacentes aos transtornos psíquicos
humanos, muitos modelos animais usando roedores são empregados (PINTO e
cols., 2008; ABRAHAM; KOVACS, 2000; BODNOFF e cols., 1987). As alterações
´´psíquicas`` em animais como espelho de seres humanos apresentam
complicações adicionais como a limitada presença de uma comunicação simbólica
nestes modelos. Em doenças somáticas, os efeitos produzidos, em geral, podem ser
mensurados por alterações quantitativas como níveis plasmáticos de glicose ou
níveis de tensão arterial, por exemplo. Assim, a destruição de células secretoras de
insulina em animais resulta em quadro semelhante à diabete mellitus humana.
Embora a transposição dos achados para pacientes sempre apresentará problemas,
assim as alterações qualitativas podem não ser abordadas. Por outro lado, nos
16
modelos de transtorno emocional, o paralelo entre alterações do modelo animal e
doença humana é mais delicado pelo aspecto de confirmar abstratamente as
alterações. Por exemplo, todos os modelos animais de depressão falham em
associar bioquímica ou geneticamente esta alteração. Deste modo, não preenchem
a condição para validação de modelos experimentais de doenças mentais sugerido
ideal e cartesianamente por McKinney e Bunnel em 1969, onde o modelo
experimental ideal deve ser similar à entidade clínica em sua etiologia,
sintomatologia, fisiopatologia e tratamento. O termo “etiologia” limita os modelos
animais ditos de depressão quanto a sua mimetização do ser humano. Freud (1917)
assinala que a depressão pode advir do luto ou da melancolia, o que dificilmente
pode ser avaliado em modelos animais. Curiosamente, a privação materna acarreta
sinais de depressão e até de esquizofrenia em animais, de maneira paralela ao que
ocorre em seres humanos.
Apesar da limitação que possuem os modelos animais de depressão, estudos
com animais permitem estudar a contribuição de um “fator” em determinada
alteração psíquica. Considerando-se a característica multidimensional dos
transtornos mentais, esses modelos também tornam possível estudar a interação
entre várias alterações quantitativas, o que pode delimitar a qualidade de um
comportamento (WEISS; KILTS, 1998). A aplicabilidade dos modelos animais na
compreensão da neurobiologia dos transtornos afetivos pode ser constatada pelo
grande número de teorias propostas para a depressão podendo representar um fator
importante para melhor compreensão da sua fisiopatologia (McARTHUR; BORSINI,
2006; MARAIS e cols., 2008).
Alguns investigadores propuseram modelos animais de estresse pós-natal
(EPON) como modelos de depressão, pois muitos das anormalidades assim
17
encontradas são similares àquelas manifestadas em pacientes deprimidos (KAISER;
SACHSER, 2005; MORLEY-FLETCHER e cols., 2003).
Pacientes deprimidos não tratados possuem um aumento da ativação
plaquetária similar a pacientes com doença aterosclerótica (MARKOVITZ;
MATTHEWS, 1991; NAIR e cols., 1999; NEMEROFF; MUSSELMAN, 2000,
MUSSELMAN e cols., 2002).
A via L-arginina-óxido nítrico (NO) modula a ativação e agregação
plaquetária. A redução da biodisponibilidade de óxido nítrico em depressão severa
poderia ser a explicação para o aumento da doença cardiovascular (DCV) nesta
síndrome, através da ativação plaquetária, disfunção endotelial em conjunto com a
concentração elevada de citocinas pró-inflamatórias circulantes (PENNINX e cols.,
2003; CHRAPKO e cols., 2004; RYBAKOWSKI e cols., 2006, NOVAES MALAGRIS,
2004).
O modelo experimental do leito vascular mesentérico isolado de ratos, como
descrito por McGregor (1965), é uma preparação vascular que permite obter
resultados sistêmicos válidos de tensão arterial. As artérias de resistência como as
mesentéricas controlam localmente o fluxo determinando a resistência periférica
total. (MULVANY; AALKJAER, 1990).
Duas forças básicas são aplicadas continuamente nas artérias: o estresse de
cisalhamento (shear-stress) proporcionado pelo atrito do sangue na interface
sangue-endotélio e a tensão parietal que distende a parede da artéria (DOBRIN,
1984). As células endoteliais, diretamente expostas a essas duas forças, respondem
liberando NO que relaxa a célula muscular lisa vascular subjacente. O modelo
experimental do leito vascular mesentérico isolado de ratos é um método validado
na avaliação da função endotelial (RESENDE; PIMENTEL; de MOURA, 2004).
18
Esta dissertação tem como objetivo investigar a participação da via L-
arginina-NO nas plaquetas e nos vasos mesentéricos dos ratos machos
normotensos Wistar e dos ratos espontaneamente hipertensos (SHR) submetidos à
separação materna única de curta duração.
1. 1 Stress e Depressão
No século XVII, o termo “stress” foi utilizado por Robert Hooke, no campo da
Física, para designar uma pesada carga que afeta uma determinada estrutura física
(Lazarus, 1993). Este conceito foi valorizado por alguns psicólogos em uma visão
expandida de doença psíquica. A psicanálise introduz uma complexidade estrutural
visando enquadrar a neurose e outros distúrbios psíquicos sob um ângulo
complementar. Na área da saúde, o conceito de stress desenvolveu-se a partir dos
estudos primeiramente descritos por Hans Selye (1936) que construiu o arcabouço
da teoria do stress ao observar que pacientes sofrendo das mais diversas doenças
apresentavam um conjunto de alterações fisiopatológicas comuns. Com auxílio de
experimentos em animais, ele, então, denominou essa série de reações
experimentadas pelo organismo “síndrome geral de adaptação”. Posteriormente,
dando seguimento aos seus estudos, definiu o stress como sendo, essencialmente,
o grau de desgaste total causado pela vida (SELYE, 1959; LIPP; MALAGRIS, 1995).
O conceito da genese do stress levou a quatro componentes essenciais: um agente
causal interno ou externo chamado estressor; uma avaliação que diferencia tipos de
stress (dano, ameaça e desafio); os processos de coping (utilizados para lidar com
os estressores tanto ambientais como internos) e uma série complexa de efeitos na
mente ou no corpo, freqüentemente referida como reação de stress (LAZZARUS,
1993). O stress pode representar uma adaptação inadequada à mudança imposta
19
pela situação externa, uma tentativa frustrada de lidar com os problemas; pode ser
também definido como um referente, tanto para descrever uma situação de muita
tensão quanto para definir a tensão a tal situação (LIPP; ROCHA, 1994). A reação
de uma pessoa a um perigo externo real pode tornar-se inadequada se a ameaça é
totalmente imaginária. Alguém submetido a tal situação apresenta sinais e sintomas
específicos que se diferenciam de acordo com a herança genética e possíveis
vulnerabilidades desenvolvidas ao longo da vida, ocorrendo assim desgaste e
desregulação de múltiplos sistemas fisiológicos, levando a patologias diversas
(LIPP, 1984).
A ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) leva à liberação de
glicocorticóides (GC) pela supra-renal (HERMAN; CULLINAN, 1997). Os GCs
servem para preparar o organismo para desafios fisiológicos ou ambientais e são
importantes para a consolidação da resposta à agressão emocional (PEETERS;
BROEKKAMP, 1994). A persistência e a intensidade exagerada ao trauma, bem
como a incapacidade do organismo em terminar sua apresentação, podem tornar o
eixo exageradamente ativo, com danos potenciais ao organismo (HUETHER e cols.,
1999). Em pacientes deprimidos, o controle inibitório da atividade do eixo HPA está
comprometido. Esses pacientes podem apresentar níveis basais elevados de cortisol
e também podem não responder ao teste de supressão com o corticosteróide
sintético dexametasona (BAUNGARTNER; GRAF; KURTEN, 1985). O envolvimento
do eixo HPA na neurobiologia da depressão também foi demonstrado pela
observação de que indivíduos com síndrome de Cushing apresentam déficits
cognitivos e alterações na estrutura e na função do hipocampo, semelhantes
àquelas encontradas em pacientes com depressão (STARKMAN e cols., 1992). A
exposição a um agente emocional traumatizante parece ser um dos principais
20
fatores ambientais que predispõem um indivíduo à depressão. Em 1992, um estudo
demonstrou que em cerca de 60% dos casos, os episódios depressivos são
precedidos pela ocorrência de fatores ou eventos traumatizantes, principalmente de
origem psicosocial (POST, 1992). Parece existir uma influência de fatores genéticos
no desenvolvimento da depressão (KENDLER e cols., 1995). A maior parte dos
modelos animais de depressão, como o nado forçado, o estresse prenatal, o stress
crônico, avalia o desenvolvimento de alterações comportamentais e fisiológicas em
resposta à pré-exposição a evento traumatizante inescapável (PINTO e cols., 2008)
1. 2 Modelo Animal de Depressão
Os transtornos depressivos são complexos quanto a sua apresentação
clínica, como descrito no Manual Estatístico Diagnóstico da Associação Norte-
americana de Psiquiatria, na sua quarta versão (DSM-IV, 2002), desiguais no seu
desenvolvimento e etiologia (KATZ, 1982). Um conhecimento adequado desse
transtorno e uma avaliação minuciosa das formas efetivas da terapia são
necessários podendo requerer eventualmente intervenções bio-psico-sociais. O
modelo animal existe, com suas limitações, como uma alternativa aos estudos
clínicos nas neurociências. Como esta tese já descreveu anteriormente, embora
numerosos modelos animais de depressão tenham sido propostos na literatura, a
maioria, se não todos, possui várias desvantagens como a dificuldade de mimetizar
a sintomatologia depressiva humana (TELNER, 1984). Na depressão, tanto a de
modelos animais quanto a humana existe uma hiperatividade simpática
(RICHARDSON, 1991). A depressão em humanos quando apresenta uma
motivação diminuída é um sintoma central de depressão clínica que pode ser
manifestado como anedonia e alterações do apetite, do sono e da disfunção sexual
21
(SHABSIGH, 2001; MARTINEZ-MOTA, 2005). De acordo com o DSM-IV, depressão
é uma doença psíquica enquadrada entre os Transtornos do Humor e se caracteriza
por um ou mais episódios maiores, ou seja, pelo menos duas semanas de humor
deprimido ou perda de interesse, acompanhados por pelo menos quatro sintomas
adicionais depressivos. Semelhantemente, os roedores submetidos a procedimentos
que induzem um estado similar à depressão, exibem déficits que incluem mudanças
no sono e no padrão de consumo alimentar, perda da resposta ao estímulo de
recompensa cerebral, um déficit no desempenho de fuga passiva e alteração no
comportamento sexual (RICHARDSON, 1991). Muitos modelos animais de
depressão são baseados na indução de certos comportamentos após exposição a
um agente estressor externo ou a eventos pós-natais como privação materna
(SENAY, 1966; CRAWLEY, 1984). Interessantemente, o modelo de separação
materna, também já referido como privação ou deprivação materna é o que mais se
aproxima da depressão humana.
Um procedimento de separação materna consiste em remover os filhotes da
sua mãe e colocá-los em uma nova gaiola com outra temperatura durante um
determinado tempo antes de devolvê-los à mãe; esse modelo animal de depressão é
extremamente traumatizante já que ele envolve tanto a separação materna e o
stress fisiológico induzido pela alteração de temperatura e de ambiente
(DARNAUDÉRY e cols., 2004). Esse tipo de modelo animal de depressão
representa o modelo que mimetiza mais a depressão em humanos. Winnicott
descreveu como a privação da mãe na infância causa mudanças negativas ao longo
da vida do indivíduo tais como violência, delinqüência, esquizofrenia e depressão
(RIZZUTO, 1990; ELLENBROEK; VAN DEN KROONENBERG; COOLS, 1998). Nos
seus estudos psicanalíticos, Winnicott enfatiza que o abandono é um dos maiores
22
problemas da criança pequena, e dos três tipos de abandono: o abandono simples,
o abandono negativo e o abandono repentino; pode-se salientar este último que ele
chama de “deprivação”. O abandono repentino ocorre quando, num relacionamento
bastante bom entre o bebê e quem cuida dele, normalmente a mãe, essa última ou
desaparece (morre, vai embora, passa um longo tempo ausente) ou entra em
depressão grave, o que a impede de interagir emocionalmente com a criança. As
conseqüências dessa condição são uma "quebra" na personalidade da criança, que
entra em estado de choque e posteriormente reorganiza a sua vida em função desse
trauma. Em verdade, toda a existência dessa pessoa ficará comprometida — com
forte insegurança, dificuldade em confiar em relacionamentos mais profundos,
permanente medo de uma catástrofe que irá ocorrer (quando na verdade já ocorreu),
depressão e assim por diante (WINNICOTT, 1948, 1960, 1963). A retirada repentina
de ratos recém-nascidos resulta em um estado de abandono materno.
1. 3 Depressão e Doenças Cardiovasculares
A depressão é uma emoção universalmente sentida por quase todas as
pessoas em algum momento da vida. Porém, é necessário, distinguir entre a
emoção “normal” de depressão e a doença do humor, comumente denominada
como transtorno afetivo. Por exemplo, sentir tristeza é uma resposta comum aos
eventos da vida, como o sofrimento de uma perda (o luto), a melancolia ou um
desapontamento, e, assim, não podemos chamá-la de “transtorno” (LIPP, 2001).
O transtorno afetivo que chamamos de depressão é, entretanto, algo mais
prolongado e muito mais grave, caracterizado por um sentimento de descontrole
sobre o próprio estado emocional; o indivíduo afetado não mais vê motivos para
sua própria existência, sendo ele incapaz de lidar com situações aversivas (DSM-IV,
23
2002). Devido à alta prevalência (aproximadamente 121 milhões de pessoas
afetadas no mundo inteiro), e aos inúmeros problemas que esse transtorno
provoca, a depressão já é considerada um problema de saúde pública mundial.
Um estudo realizado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) concluiu que a
depressão é a principal causa de incapacitação social; e estimou para o ano de
2020 um aumento da sua incidência, principalmente entre as mulheres e nos
países em desenvolvimento, alcançando assim o segundo lugar de causas de
anos de vida perdidos ajustados pela incapacidade (Disability Adjusted Life Years —
DALY), ficando atrás apenas das doenças cardíacas (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1990).
Tanto a depressão como as DCVs consomem uma grande fração dos
recursos destinados à saúde. A primeira está associada a alterações psíquicas,
fisiológicas e comportamentais importantes. Dentre esses distúrbios, está presente
um aumento inexplicável na ocorrência de eventos cardiovasculares em pacientes
depressivos (ORTH-GOMER e cols., 2005). A prevalência aumentada de
alterações cardiovasculares na depressão abrange doença arterial coronariana,
hipertensão arterial sistêmica e acidente vascular cerebral (O’CONNOR;
GRUBEL; SEREBRUANY, 2000; KRISHNAN, 2000; EDWARDS; KING; FRAY,
2000; STEWART e cols., 2001).
1. 4 A via L-arginina-NO-GMPc
Em 1980, Furchgott e Zawadzki descobriram que as células endoteliais
estimuladas pela acetilcolina (ACh) liberam um fator vasodilatador, inicialmente
denominado de fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF).
Posteriormente, essa molécula foi identificada como NO (FURCHGOTT;
24
ZAWADZKI, 1980; PALMER e cols., 1987; IGNARRO e cols., 1987). NO é um gás
inorgânico lipossolúvel que possui uma meia-vida curta de menos de 30 segundos
(em sistemas biológicos de mamíferos), o NO é produzido por diferentes tipos
celulares tais como plaqueta, célula endotelial, células fagocitárias da resposta
imune, e controla ou influencia importantes processos fisiológicos como
vasodilatação, neurotransmissão, atividade citotóxica do sistema imune, adesão e
agregação plaquetárias
(MONCADA e cols., 1991; HUYNH; CHIN-DUSTING, 2006;
MONCADA; HIGGS, 2006). A síntese de NO é realizada a partir do aminoácido L-
arginina por uma família de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS)
[neuronal (nNOS), endotelial (eNOS) e induzível (iNOS)] (MENDES RIBEIRO e cols.,
2001; BRUNINI e cols., 2007).
1. 4. 1 L-Arginina e o seu Paradoxo
A descoberta recente das muitas funções biológicas e diversas do NO
verteu uma nova luz no papel da L-arginina (Figura 1) que é o único substrato
fisiologicamente significante para a síntese de NO (MONCADA; HIGGS, 2006). A
L-arginina é um aminoácido básico semi-essencial, descoberto por Schultze em
1886, e representa um componente de múltiplas vias bioquímicas, incluindo
síntese protéica, o ciclo da uréia, sínteses de agmatina e de poliaminas,
modulação da liberação de hormônios (BARBUL, 1985; CYLWIK e cols., 2005).
25
Figura 1- Forma estrutural da L-arginina
Em suma, a L-arginina está envolvida em diversos processos celulares
variando do equilíbrio redox ao ciclo da célula e, além disso, uma de suas
principais funções é ser o substrato para a produção de NO (WU; MORRIS, 1998).
Para entrar nas células, a L-arginina necessita de um transportador; até o
momento, quatro sistemas de transportadores foram identificados em mamíferos
como responsáveis pelo influxo de aminoácidos catiônicos, incluindo a L-arginina:
y
+
, y
+
L, B
0,+
e b
0,+
(DEVES; BOYD, 1998; IGNARRO, 2002; MANN e cols., 2003).
O sistema y
+
transporta apenas aminoácidos catiônicos, enquanto os demais
transportam tanto aminoácidos catiônicos quanto neutros. O transporte de
aminoácidos catiônicos, mas não de neutros, via sistema y
+
L não depende do íon
sódio (Na
+
). Esses transportadores não dependem de energia e funcionam de
acordo com o gradiente de concentração (MENDES-RIBEIRO e cols., 2001;
MANN e cols., 2003; BRUNINI e cols., 2007). O transporte através dos sistemas
y
+
e b
0,+
é Na
+
-independente, enquanto que através do sistema B
0,+
é Na
+
-
dependente, (CHRISTENSEN; CULLEN, 1973; SAIER, 2000; BRUNINI e cols.,
2005).
Em plaquetas, o transportador y
+
L foi o único sistema de transporte
identificado (IGNARRO, 2002; MANN e cols., 2003), onde possui importante papel
26
na troca de aminoácidos e na produção de NO (MENDES-RIBEIRO e cols., 1999;
BRUNINI e cols., 2003). Ao transportar a L-arginina para dentro da plaqueta, precisa
carrear, simultaneamente, para fora, um aminoácido neutro (p. ex., L-leucina) na
presença de Na
+
ou um aminoácido catiônico de forma Na
+
-independente. O sistema
de transporte y
+
L apresenta elevada afinidade com a L-arginina (K
m
=10 μM) e baixa
capacidade de transporte (MENDES-RIBEIRO e cols., 1999).
A clivagem hidrolítica da L-arginina em NO e L-citrulina (Figura 2) é
catalisada pelas isoformas NOS (GROSS, 1997). Esta conversão é feita em duas
etapas, uma hidroxilação, seguida de uma redução; sendo necessária, na primeira
etapa, a presença dos co-fatores oxigênio molecular (O
2
) e Nicotinamida-adenina-
dinucleotídeo-fosfato-reduzida (NADPH) para a formação de um intermediário, a N
G
-
hidroxi-L-arginina (GROSS, 1997; HUNYNH; CHIN-DUSTING, 2006); enquanto que,
para a formação do NO, na segunda etapa, devem estar presentes os seguintes co-
fatores: dinucleotídeo adenina-flavina (FAD), o mononucleotídeo flavina (FMN) e a
tetrahidrobiopterina (BH
4
) (STEUHR, 2004).
Figura 2 - Síntese do NO (Adaptado: LINCOLN e cols., 1997)
Mesmo na presença de concentrações de L-arginina intracelulares mais que
suficientes para a síntese de NO, é necessário que haja o influxo de L-arginina para
dentro de células como plaquetas e leucócitos para que a enzima NOS seja ativada,
27
este fenômeno é denominado o “paradoxo da L-arginina” (DEVES; BOYD, 1998;
BRUNINI e cols., 2003). Para uma melhor noção, em termos de valores, estudos
mostraram que os níveis intracelulares de L-arginina variam entre 0,1 a 2 mM
(BOGLE e cols., 1996; MCDONALD e cols., 1997; XU e cols., 2004), enquanto o K
m
das isoformas das NOS varia entre 1 a 32 μM (PALMER e cols., 1988, BOGLE e
cols., 1996, RODRÍGUEZ-CRESPO e cols., 1996).
Uma vez que o NO é produzido, seus efeitos são mediados diretamente por
segundos mensageiros, sendo a via da ativação da enzima guanilato ciclase (GC) a
mais estudada. Esta enzima converte a guanosina trifosfato (GTP) em guanosina
monofosfato cíclica (GMPc), a qual promove o relaxamento da musculatura lisa
vascular e a inibição da adesão e agregação plaquetárias. Na maior parte das
vezes, o GMPc se liga a proteínas-alvo, como proteínas quinase (dependentes de
GMPc) e canais iônicos regulados por GMPc, o que leva a uma redução da
concentração intracelular de Ca
++
, provocando o relaxamento do músculo liso [Fig.
3] (MONCADA e col., 1991; IGNARRO, 2002; MONCADA; HIGGS, 2006).
Figura 3 - A via L-arginina-óxido nítrico-GMPc.
L-citrulina
Inativação
L-arginina L-arginina
NOS
N
O NO
Célula Geradora
Célula Alvo
NO
-GC
GTP GMPc
28
A redução da biodisponibilidade do NO ou de seu precursor faz parte da
patogênese de várias doenças cardiometabólicas e renais, tais como insuficiência
cardíaca, diabetes mellitus, hipertensão arterial e insuficiência renal crônica (HOBBS
e cols., 1999; MENDES RIBEIRO; BRUNINI, 2004; MOSS e cols., 2004; BRUNINI e
cols., 2005, BRUNINI e cols., 2007; de MEIRELLES e cols., 2008).
1. 4. 2 Metabolismo da L-arginina
O metabolismo da L-arginina in vivo pode ser estimado pelos níveis
plasmáticos de L-arginina, L-citrulina, amônia, uréia e creatinina, e níveis urinários e
plasmáticos de GMPc, nitratos e nitritos (WU; MORRIS, 1998; MORRIS, 2006). A
característica proeminente do seu metabolismo é uma expressão complexa e
diferencial de enzimas relevantes quando se procura nos órgãos principais de
mamíferos (Fig. 4). Entretanto, não há um único órgão ou célula que expressa
todas as enzimas mostradas na Figura 3.
29
Figura 4 - Metabolismo da L-arginina, com ênfase na sua interrelação com a formação de óxido
nítrico. ADC = a arginina descarboxilase mitocondrial; AS = arginossuccinato; ASL =
argininossuccinato liase; ASS = argininossuccinato sintase citosólica; CPS I = carbamilfosfato
sintase I; OTC = carbamiltransferase; PC = piruvato carboxilase mitocondrial
O organismo dos seres humanos sintetiza a L-arginina principalmente no
fígado e no rim, a partir da L-citrulina liberada pelo intestino como produto do
metabolismo nitrogenado da glutamina (FEATHERSTON e cols., 1973; MORRIS,
2006) (Figura 4). No entanto, o fígado utiliza praticamente toda a L-arginina que
produz na síntese da uréia através da intensa atividade da via da arginase. Dessa
forma, a manutenção dos níveis plasmáticos normais de L-arginina (80-100 µM)
depende da síntese renal, por um mecanismo que parece ser independente da
ingesta de L-arginina ou de proteína (REYES e cols., 1994; MENDES-RIBEIRO e
BRUNINI, 2004). O pivô central no metabolismo da L-arginina é o ciclo da uréia.
Esse primeiro ciclo bioquímico descrito em 1932 por Krebs e Henseleit é a rota
30
fisiológica da eliminação do nitrogênio excessivo e, portanto, a saída deste de vários
sistemas fisiológicos.
Os seres humanos produzem endogenamente, análogos da L-arginina, como
o N
G
-monometil L-arginina (L-NMMA), N
G
- nitro-L-arginina (L-NNA), N
G
-nitro-L-
arginina-metil-éster (L-NAME) e L-arginina dimetil assimétrica (ADMA), que são
inibidores tanto da NOS como do transporte de L-arginina (MENDES RIBEIRO e
cols., 1997; MENDES RIBEIRO e cols., 1999; BRUNINI e cols., 2004). Esses
análogos endógenos da L-arginina parecem estar envolvidos no processo de
disfunção endotelial e por isso são considerados um novo fator de risco para
doenças cardiovasculares (BOGER, 2004). Os achados indicam a possibilidade de
que a inibição competitiva da L-arginina representa um mecanismo que reduz a sua
disponibilidade em condições onde existem níveis plasmáticos aumentados desses
análogos (BRUNINI e cols., 2005).
1. 4. 3 Estresse Oxidativo e a Síntese de Óxido Nítrico
Em condições fisiológicas, baixos níveis de NO produzidos pela família das
enzimas NOS irão ativar a GC, levando à produção de GMPc que, além do
relaxamento do músculo liso vascular endotélio-dependente, está associada a uma
série de processos fisiológicos tais como, inibição da proliferação e da migração
celulares do músculo liso, da agregação e adesão plaquetárias, do recrutamento das
plaquetas ativadas para agregar, oxidação das lipoproteínas de baixa densidade,
também desagregação de agregados plaquetários e inibição do recrutamento das
plaquetas ativadas para agregar e neurotransmissão (RADOMSKI; PALMER;
MONCADA, 1987)
. No entanto, em elevadas concentrações, especialmente na
presença de superóxidos, o NO pode inibir vários processos metabólicos pela
31
depleção de energia na célula-alvo e causar dano direto no DNA (LINCOLN, 1997;
MONCADA; HIGGS, 2006). A biodisponibilidade do NO depende tanto de sua
síntese quanto de sua degradação pelas espécies reativas de oxigênio (EROs)
(MONCADA; HIGGS, 2006).
EROs estão envolvidos numa série de processos degenerativos, devido à
propriedade de serem ou gerarem radicais livres que são definidos como qualquer
espécie química capaz de existência independente contendo um ou mais elétrons
desemparelhados no orbital atômico ou molecular (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1999). Assim sendo, os EROs são altamente reativos e possuem a capacidade de
atacar qualquer biomolécula, e de meia-vida curta. A formação dessas espécies
ocorre durante os processos oxidativos biológicos a partir de compostos endógenos
e derivam também do metabolismo do oxigênio encontrado no ambiente produzindo
diversos radicais livres (BELLÓ, 2002; TOUYZ, 2004). Essa formação ocorre a partir
do oxigênio que pela sua configuração eletrônica tende a receber um elétron de
cada vez, formando compostos intermediários altamente reativos, realçam-se o
ânion superóxido (O
2
-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxil (OH
.
)
(BELLÓ, 2002).
No sistema cardiovascular, os EROs desempenham um papel fisiológico
essencial, mantendo a integridade cardíaca e vascular e um papel fisiopatológico na
disfunção cardiovascular associado às condições como aterosclerose, hipertensão e
diabetes (LANDMESSER; HARRISON, 2001). Os EROs, também denominados pró-
oxidantes, em condições fisiológicas, encontram-se em equilíbrio com moléculas
conhecidas como anti-oxidantes tais como superóxido desmutase (SOD), catalase e
glutationa peroxidase (GSH-Px) e outras moléculas pequenas (STRALIN e cols.,
1995; HALLIWELL, 1999; CHANNON; GUZIK, 2002; HERKEN e cols., 2006). No
32
equilíbrio, os EROs funcionam, como moléculas de sinalização regulando o
complexo contração-relaxamento e o crescimento da célula do músculo liso vascular
(RAO; BERK, 1992; TOUYZ, 2004). Porém, a ausência do equilíbrio entre esses
compostos antagônicos, sobretudo a produção aumentada de EROs, leva à
contratilidade exacerbada, ao crescimento do músculo liso vascular ou à apoptose, à
migração de monócito, à peroxidação lipídica, à inflamação e deposição aumentada
de proteínas da matriz extracelular, à disfunção endotelial, que delineiam os
principais processos que contribuem para o dano vascular na DCV (RAO; BERK,
1992; HARRISON, 1997). NO vaso, o O
2
-
destaca-se por reagir com o NO,
produzindo um potente oxidante, peroxinitrito e, conseqüentemente, reduzindo a
biodisponibilidade do NO (HIGASHI e cols., 2002). Todas as isoformas de NOS
podem gerar o O
2
-
, quando o substrato L-arginina não está presente em
quantidade suficiente (GRYGLEWSKI; PALMER; MONCADA, 1986).
Destarte, um desequilíbrio entre a geração de EROs e as defesas
antioxidantes enzimáticas resulta, então, na alteração da biodisponibilidade de
EROs, levando assim a um estado fisiopatológico chamado de estresse oxidativo
(LANDMESSER; HARRISON, 2001; ZALBA e cols., 2001). O estresse oxidativo tem
como desfecho patogênico o dano oxidativo, que representa a principal causa de
dano vascular na hipertensão (SCHAFER; BUETTNER, 2001). Para tanto, as
enzimas antioxidantes (catalase, SOD e GSH-Px) mantêm a sobrevivência dos
organismos contra o estresse oxidativo (HERKEN e cols., 2006).
Com efeito, o estresse oxidativo se estabelece quando a produção de EROs
supera a capacidade antioxidante do corpo, ora pelo aumento da produção das
EROs, ora pela diminuição do mecanismo de defesa antioxidante. Portanto, a
diminuição do NO observada em algumas desordens fisiopatológicas pode provir do
33
aumento do estresse oxidativo, o qual impede o NO de efetuar suas ações
(MÜNZEL e cols., 2008).
1. 5 Depressão, sua Relação com a via L-Arginina-NO-GMPc e a
Doença cardiovascular
Tem sido sugerido que as alterações na via da L-arginina-NO pode ser o elo
entre a depressão e a DCV (CHRAPKO e cols., 2004; ARSLAN; UZUN, 2008). Uma
teoria atraente para explicar a associação DCV-depressão é que o aumento da
agregação plaquetária na depressão seria responsável pela ocorrência aumentada
de eventos aterotrombóticos nesse grupo de pacientes (PINTO e cols., 2008). Um
importante modulador da função plaquetária é a via L-arginina-NO cuja ativação
desempenha um papel na regulação cardiovascular e inibe tanto a adesão como a
agregação de plaquetas. Com efeito, a redução da produção de NO pelas plaquetas
foi associada com vários fatores de risco cardiovasculares (ARSLAN; UZUN, 2008).
Em 2004, um estudo relatou que a produção de NO tanto plaquetária como
sistêmica foi reduzida em 15 pacientes com depressão maior (CHRAPKO e cols.,
2004). Esse e outros achados sugerem que a produção diminuída de NO pelas
plaquetas e o endotélio pode ser um elo entre os eventos cardiovasculares e a
depressão (MONCADA e cols., 1989). Nessa linha de raciocínio, pacientes com
depressão maior apresentam uma menor atividade da NOS e provavelmente uma
diminuição no transporte da L-arginina em plaquetas e menor concentração de
nitritos e nitratos plasmáticos (CHRAPKO e cols., 2004).
A depressão é um fator de risco cardiovascular independente, tão
importante quanto os fatores de risco clássicos para a DCV como fumo,
dislipidemia e hipertensão. A sugestão da diminuição da biodisponibilidade de NO
como podendo ser um elo entre a depressão e a DCV, através de uma série de
34
eventos fisiopatológicos, suscita mais interesse no estudo da via L-arginina-NO
(KAZDIN, 2007). Existe um importante papel da via L-arginina-NO nos processos
aterotrombóticos freqüentemente associados a fatores de risco cardiovasculares
como a hipertensão arterial sistêmica e dislipidemia (STAESSEN e cols., 2005).
Apesar da evidência de que a DCV e a depressão estejam associados através da
via L-arginina-NO, a questão das reais alterações dessa via que podem afetar a
função plaquetária e endotelial no transtorno depressivo ainda precisa ser
elucidada (NOVAES MALAGRIS, 2004).
2 OBJETIVOS DO ESTUDO
2. 1 Objetivo Geral
Investigar a via L-arginina-NO-GMPc nos vasos mesentéricos e em plaquetas
de ratos normotensos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHR)
submetidos ao estresse pós-natal (EPON).
2. 2 Objetivos específicos
• Avaliar o transporte de L-arginina e a atividade da enzima óxido nítrico sintase
nas plaquetas;
• Correlacionar a expressão das enzimas eNOS e iNOS nas plaquetas com a
função da via L-arginina;
• Verificar a reatividade vascular no leito arterial mesentérico (LAM);
• Analisar a atividade enzimática antioxidante no homogenato do LAM.
36
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3. 1 Animais Utilizados
Seis ratas virgens Wistar normotensas (250-300 g) de nossa própria colônia
foram usadas. Os animais foram mantidos em caixas separadas com acesso livre à
comida e água potável, em uma sala sob controle ambiental: ciclo luz/escuro (12h
luz/ 12h escuro; claridade das 6:00 às 18:00h), por um período de aclimatização de
pelo menos duas semanas. A temperatura ambiental foi guardada em torno de 23 ±
1 °C. Após esse período, cada fêmea recebeu dois machos Wistar normotensos
(300-350 g) para acasalamento. Após seis dias, as fêmeas grávidas foram
separadas randomicamente dos machos e divididas em dois grupos: controle e
EPON. A gestação dura em torno de 21 dias. Os filhotes do grupo EPON foram
submetidos à separação materna, por 8 minutos, em temperatura de 22 ºC, no dia
seguinte ao nascimento (DPN 2). Nas mesmas condições de estudo relatadas
anteriormente, dois machos SHR foram usados para o acasalamento de cada
fêmea, a razão de seis fêmeas SHR.
Toda prole fêmea foi excluída do estudo e cada rata amamentou somente oito
filhotes machos (número médio de mamilos). O número de animais utilizados para o
presente estudo foi 42 ratos, sendo quatro grupos experimentais (Tabela 1).
3. 2 Aferição da Pressão Arterial
A pressão arterial sistólica (PAS) foi mensurada por método não invasivo,
com auxílio de um pletismógrafo de cauda (Letica LE 5000). Os ratos de todos os
grupos experimentais foram treinados durante duas semanas antes de iniciar o
protocolo experimental, minimizando-se assim o stress durante a aferição da
pressão arterial (PA). Um garrote e um sensor de pulso são posicionados em torno
37
da cauda do animal e conectados ao registrador, o qual insufla e desenche
automaticamente o garrote, e detecta o aparecimento e o desaparecimento da onda
de pulso na artéria caudal dos ratos, o que determina a PAS. As medidas foram
realizadas três vezes por semana a partir do sexagésimo dia pós-natal (DPN 60) e
imediatamente antes do sacrifício.
A medição da PAS foi feita três vezes por semana e foi registrada somente
após a obtenção de três valores consecutivos da PA sem distúrbios do sinal.
3. 3 Separação Materna Única
No segundo dia após o nascimento, os filhotes são removidos das mães e
colocados em uma nova gaiola sem maravalha em outra sala à temperatura de
22°C. O procedimento de separação que representa o EPON consistiu numa
separação materna única (SMU), com uma duração de oito minutos e em seguida os
filhotes foram devolvidos a sua gaiola de origem para suas respectivas mães.
Foram quatro grupos: ratos normotensos controles (NT-C), SHR não-
separados (SHR-NS), Ratos normotensos e SHR submetidos à SMU (NT-SMU;
SHR-SMU, respectivamente). Entre oito a 10 semanas pós-SMU os animais foram
anestesiados com pentobarbital (70 mg/kg, i.p.), o sangue foi coletado pela punção
aórtica descendente e o LAM foi rapidamente removido. Os experimentos e os
cuidados de animais foram de acordo com os princípios do Comitê de Ética dos
Animais Experimentais da Universidade Estadual do Rio de Janeiro.
3. 4 Protocolos Experimentais com Leito Arterial Mesentérico
3. 4. 1 Isolamento do Leito Arterial Mesentérico (LAM)
38
As preparações de LAM foram isoladas de ratos dos quatro grupos
experimentais, conforme descrito por McGregor (1965). Os ratos foram
anestesiados e, em seguida submetidos à laparotomia, o LAM foi estendido para o
exterior da cavidade abdominal e envolto em gaze umedecida com solução de
Krebs [composição em mM: NaCl (118.3); KCl (4.7); CaCl
2
.2H
2
O (2.5);
MgSO
4
.6H
2
O (1.2); NaHCO
3
(25.0); KH
2
PO
4
(1.2); glicose (11.1); ácido
etilenodiamino tetra acético – EDTA (0.026)]. Os ramos pancreático, duodenal, íleo-
cólico e cólico direito da artéria mesentérica superior foram ligados e seccionados.
O intestino delgado foi ligado e seccionado à altura do jejuno proximal e do íleo
distal. A artéria mesentérica superior foi isolada na sua origem, à altura da artéria
aorta abdominal e canulada com um tubo de polietileno (PE 50, Clay Adams Brand
CA – Becton Dickinson) preenchido com solução de Krebs heparinizada. Em
seguida, o intestino delgado foi separado do leito vascular, cortando-se rente à
borda intestinal, e a preparação lavada com solução de Krebs.
3. 4. 2 Reatividade do Leito Arterial Mesentérico
Após o isolamento, a preparação vascular foi colocada em uma cuba
(volume de 10 mL) e constantemente perfundida por meio da cânula inserida na
artéria mesentérica superior, que foi conectada a uma bomba peristáltica (Life Care
Pump, Model 4 – Abbot / Shaw). A solução de Krebs, mantida a 37 ºC e aerada
com mistura carbogênica (95% O
2
e 5% CO
2
) foi infundida em fluxo constante de 4
mL/min e a pressão de perfusão (PP) registrada continuamente em polígrafo
(Hewlett Packard – 7754 A), por meio de um transdutor de pressão (Hewlett
Packard – 1280) (figura 5).
Os experimentos foram precedidos de um período de 30 minutos de
39
estabilização da preparação, durante o qual a PP basal manteve-se próxima de 20 a
40 mmHg (RESENDE e cols., 2004). Em seguida, testou-se a viabilidade dos vasos
mesentéricos por meio de injeção in bolus de 120 µmol de KCl. Logo após, iniciou-se
o período de sensibilização da preparação vascular, no qual a noradrenalina (NA) foi
adicionada à solução de perfusão, em concentração suficiente (1-100 µM) para que
a PP fosse mantida estável em torno de 80-100 mmHg. Logo após a obtenção de
uma resposta pressora constante da NA, testamos a viabilidade do endotélio
vascular, com a injeção de ACh (10 pmol), que produz um efeito vasodilatador que é
dependente da liberação de NO pelas células endoteliais. Testamos também a
capacidade dilatadora direta do músculo liso vascular com a injeção de nitroglicerina
(NG) 10 nmol, substância que atua diretamente no músculo liso vascular, liberando
NO de sua estrutura, sendo seu efeito independente do endotélio.
A resposta vasodilatadora foi expressa em termos de percentagem de queda
da resposta pressora induzida pela NA. Todas as injeções foram realizadas
imediatamente antes da cânula arterial, em um injetor acoplado ao sistema de
perfusão, por meio de micro-seringas de 10 e 100 µL (Hamilton). O intervalo entre as
injeções foi de aproximadamente cinco minutos, permitindo sempre o retorno e a
estabilização da PP aos níveis anteriores.
40
Figura 5 - Esquema de perfusão do leito arterial mesentérico.
3. 4. 3 Atividade Enzimática em Leito Arterial Mesentérico
A medida da atividade das enzimas anti-oxidantes, superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT), foi realizada em homogenato de vasos mesentéricos
preparados com tampão fosfato.
3. 4. 3. 1 Medida da Superóxido Dismutase
O produto resultante da reação catalisada pela SOD é o H
2
O
2
que deve ser
retirado do meio o mais rápido possível. Uma unidade de enzima é definida pela
quantidade transformada em 1 µmol de substrato por minuto. A atividade enzimática
foi estimada pela inibição da auto-oxidação da NA medida no espectrofotômetro
(Ultrospec 2100 Pro; 480 nm). A NA é oxidada pelo O
2
-
para formar um produto
róseo. Esta padronização foi realizada utilizando a técnica descrita por Bannister e
Calabrese (1987) e adaptada para o tecido vascular.
Foram utilizados 20, 40 e 60μl de cada amostra em cubetas separadas. Em
cada cubeta, foi adicionado 20μl de CAT (0,0024g/ml de água destilada – C9322,
SIGMA) + 970μl de tampão glicina (0,75g em 200ml de água destilada – 32ºC) + 40
μl de NA (95 mg em 5ml de água destilada + 15μl/ml de HCl fumegante).
Líquido de
Perfusão
Injeções
“in bolus”
LAM
Bomba de
perfusão
Transdutor de
pressão
Entrada
da água
Passagem
da água
A
quecimento do circuito
Ligado ao polígrafo
(registro)
Cuba
Escape do
Líquido de
perfusão
Saída da
água
41
Para o cálculo foi utilizado o alfa da reta de cada amostra em todas as
concentrações utilizadas em planilha do Excel. Os resultados foram ponderados em
mg de proteína.
3. 4. 3. 2 Medida da catalase
A CAT é uma hemoproteína que catalisa a degradação do H
2
O
2
. Na reação,
uma molécula de H
2
O
2
é oxidada a oxigênio molecular (O
2
) e outra molécula
reduzida à água. Este método mede a atividade da enzima produzida pelas células e
organelas em resposta à quantidade de H
2
O
2
medida pelo espectrofotômetro
(Ultrospec 2100). Foi utilizado 200 μl de homogenato de mesentério em cubetas
separadas (quartzo). Em cada cubeta foi adicionado 1 ml de PBS com H
2
O
2
(25ml de
tampão para 40μl de H
2
O
2
). O comprimento de onda utilizado foi 240nm e a leitura
foi feita nos tempos 0, 30 e 60 segundos (AEBI, 1984).
3. 4. 3. 3 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
Método utilizado para a avaliação do estado de oxidação dos ácidos graxos
em sistemas biológicos. O dano em lipídeos de membrana é determinado pela
formação de subprodutos da lipoperoxidação [malondialdeído (MDA)], que são
substâncias reativas ao aquecimento do ácido tiobarbitúrico (TBA) formadas durante
a peroxidação em sistemas de membranas e microssomos. O MDA reage com o
TBA gerando um produto colorido róseo lido em espectrofotômetro (Ultrospec 2100
Pro; 532 nm). Essa padronização foi realizada utilizando a técnica descrita por
Draper e colaboradores (1990) e adaptada para medida em soro.
Foi utilizado 200 μl de homogenato de vasos mesentéricos para 400 μl de
ácido tricloroacético (TCA). As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 1000
42
rpm a 4ºC. Separou-se 500 μl do sobrenadante em um tubo de ensaio com tampa e
adicionou-se 500 μl de TBA (0,67%). Os tubos foram colocados em um banho seco
(100ºC) por 30 minutos. Deixou-se esfriar por cinco minutos e posteriormente foi
feita a leitura em espectrofotômetro (Ultrospec 2100 Pro; 532 nm).
Para o cálculo foi utilizado:
- Fator de Correção (FC) médio do TBA → FC = [nmol.TMP]/Absorção. ptn
- Abs. da amostra x FC médio = nmol de TBARS
- nmol de TBARS ÷ quantidade de proteína da amostra (nmol de TBARS/mg de
proteína).
3. 5 Protocolos Experimentais com Plaquetas
3. 5. 1 Transporte de L-arginina em Plaquetas
O influxo de L-arginina foi realizado de acordo com um protocolo previamente
estabelecido (MENDES RIBEIRO e cols., 1999).
Para os experimentos de transporte de L-arginina em plaquetas, o sangue foi
coletado em tubos contendo ACD [ácido cítrico (73.7 mM), citrato de trisódico (85.9
mM) e glicose (111 mM); pH=4] através de uma cânula introduzida na aorta
descendente. Após centrifugação (Eppendorf Centrifuge 5804 R) a 1200 rpm por 10
minutos, o plasma rico em plaquetas (PRP) foi retirado e centrifugado novamente
(Eppendorf Centrifuge 5804 R) a 2520 rpm por 10 minutos. As plaquetas isoladas
foram ressuspensas em solução Krebs [composição em mM: NaCl (119), MgCl
2
(1.2), KCl (4.6) CaCl
2
(1.5), NaHCO
3
(15), Glicose (11), NaH
2
PO
4
(1.2); pH=7.4]. Em
seguida, as plaquetas foram quantificadas (Amersham Biosciences). A L-[
3
H]-
arginina (100 µM) foi adicionada à suspensão de plaquetas e incubada por cinco
43
minutos a 37 ºC. Após a incubação, a amostra de plaquetas ressuspensas foi
centrifugada (Eppendorf Centrifuge 5417 C) a 14.000 rpm por 15 segundos. O
sobrenadante foi desprezado e o pellet de plaquetas ressuspenso em 1 mL de
solução de Krebs, seguido por nova centrifugação a 14.000 rpm por 15 segundos.
As células foram lisadas com Tryton X-100 (0.1%), e a radioatividade medida em um
contador de cintilação (Bekman-Coulter).
3. 5. 2 Análise da Atividade da NOS Plaquetária
A atividade da NOS foi avaliada pela conversão de L-[
3
H]-arginina em L-[
3
H]-
citrulina (Brunini e cols., 2003).
L-[
3
H]-arginina (100 µM) foi adicionada à suspensão de plaquetas e incubada
a 37 °C por 15 minutos. Após a incubação, a amostra de plaquetas ressuspensas foi
centrifugada (Eppendorf Centrifuge 5417 C) a 14.000 rpm por 15 segundos. O
sobrenadante foi desprezado e o pellet de plaquetas ressuspenso em 1 mL de
solução de Krebs, seguido por nova centrifugação a 14.000 rpm por 15 segundos.
As plaquetas foram lisadas com Tryton (0.1%) e transferidas para uma coluna
contendo a resina Dowex. L-[
3
H]-citrulina foi removida para tubos de cintilação, o
líquido cintilante foi adicionado e a radioatividade medida em um aparelho de
cintilação (Bekman-Coulter). A contagem de plaquetas foi realizada como no ensaio
do transporte de L-arginina em plaquetas.
3. 5. 3 Extração de proteína e Western Blotting em plaquetas
A expressão plaquetária das isoformas de NOS endotelial e induzível foi
avaliada através de Western Blotting.
44
As proteínas foram extraídas a partir da suspensão de plaquetas, obtida como
descrito anteriormente. O pellet de plaquetas foi dissolvido em tampão de extração
de proteínas contendo inibidores de proteases (Protease inhibitor Cocktail – Sigma
EUA), seguido por rápido congelamento em nitrogênio líquido. Posteriormente, as
amostras foram submetidas a um banho de ultrassom (MaxiClean 1400) por 15
minutos e centrifugadas a 14000 rpm por 15 minutos a 4
o
C para a remoção de
remanescentes celulares e o sobrenadante foi armazenado a -80
o
C até a sua
utilização.
Os ensaios de Western Blotting foram realizados com 10 μg de proteína dos
lisados de plaquetas suspensos em tampão de amostra após desnaturação das
proteínas por incubação a 90 °C por 10 minutos. As amostras foram aplicadas em
gel de poliacrilamida NuPAGE® Novex Bis-Tris 10% (Invitrogen - CA), as proteínas
separadas por eletroforese (200V, 50mA por 45 minutos) e transferidas para
membrana de polivinilidina (15V, 328mA por 1 hora). Foram utilizados anticorpos
primários monoclonais para eNOS e iNOS (BD Biosciences – UK) na concentração
de 1:1000. O procedimento para detecção foi o sistema cromogênico Western
Breeze (Invitrogen - CA). Foi utilizado como padrão de peso molecular o Full-Range
Rainbow
TM
Molecular Weight Marker (GE Healthcare – EUA).
As bandas foram quantificadas por densitometria, utilizando-se o programa Adobe
Photoshop 7.0. Além dessa quantificação de proteína, foi usada a expressão da β-
tubulina (β-Tub) utilizando-se o anticorpo monoclonal anti- β-Tub (Santa Cruz
Biotechnology Inc. — USA) para normalização dos resultados de expressão
protéica.
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todos os resultados foram analisados por meio de “One-way analysis of
variance” (ANOVA), utilizada para comparar diferenças entre os grupos experimentais,
com posterior utilização do teste de Bonferroni. As diferenças entre os grupos foram
consideradas significativas quando p < 0,05. Os programas Prism 5.0 e SigmaPlot
foram usados para as análises estatísticas.
5 RESULTADOS
5. 1 Análise do Peso e da Pressão Arterial Sistêmica dos Animais
As PAS dos ratos dos grupos NT-SMU, SHR-NS e SHR-SMU foram
significantemente mais altas do que as dos ratos controles NT-C. Em comparação
com o grupo NT-SMU, os ratos SHR-NS e SHR-SMU apresentaram uma elevação
significante da PAS. Curiosamente, quando o grupo SHR-SMU foi comparado aos
ratos SHR-NS, observou-se uma diminuição da PAS naqueles ratos. Os animais dos
grupos SHR-NS e SHR-SMU apresentaram pesos menores do que os animais
controles NT-C. Em comparação aos animais NT-SMU, o grupo SHR-SMU
apresentou pesos menores (Tabela 1).
Tabela 1 Média do Peso e da Pressão Arterial Sistólica de todos os grupos experimentais.
Grupos Números Peso (gramas) PAS (mmHg)
NT-C
10
295,6 ± 6.01
122,6 ± 3,47
NT-SMU
10
281,8 ± 3,99
132,7 ± 2,01
#
SHR-NS
6
212,7 ± 8,09
#
190,3 ± 2,55
#, &
SHR-SMU
6
187,7 ± 3,20
#, &
174,2 ± 0,87
#, +, &
5. 2 Influxo da L-arginina em Plaquetas
Em comparação com o grupo controle NT-SMU (0,240 ± 0,039 mmol/L/h), o
transporte aparente total da L-arginina foi significantemente reduzido em plaquetas
#
vs. NT-C,
+
vs. SHR-NS,
&
vs. NT-SMU.
#
, +,
&
P < 0,05%
47
0.0
0.2
0.4
0.6
*
*
*
*
NT-C (n=5)
NT-SMU (n=5)
SHR-NS (n=5)
SHR-SMU (n=5)
V
máx
(
μ
mol/L/h
)
dos grupos NT-C (0,508 ± 0,039 mmol/L/h), SHR-NS (0,198 ± 0,037 mmol/L/h) e
SHR-SMU (0,360 ± 0,038 mmol/L/h). E, no entanto, este último grupo quando
comparado com o grupo SHR-NS, denotou um significativo aumento (Figura 6).
5. 3 Atividade Basal de NOS Intraplaquetária
A atividade basal de NOS, em relação aos ratos controles NT-C (0,158 ±
0,012 pmol/10
8
céls), foi reduzida em plaquetas dos ratos NT-SMU (0,068 ± 0,009
pmol/10
8
céls), SHR-NS (0,033 ± 0,012 pmol/10
8
céls) e SHR-SMU (0,061 ± 0,007
pmol/10
8
céls) (Figura 7).
Figura 6 - Influxo da L-arginina nas plaquetas de animais controles (NT-C),
hipertensos não-separados (SHR-NS), normotensos submetidos a SMU (NT-
SMU) e SHR submetidos a SMU (SHR-SMU). Valores estão expressos em
média +
erro padrão. (* P < 0,05). NT-C (0.508 ± 0.039 µmol/L/h, n=5); NT-
SMU (0,240 ± 0,039 µmol/L/h, n=5); SHR-NS (0.198 ± 0.037 µmol/L/h, n=5);
SHR-SMU (0.360 ± 0.038 µmol/L/h, n=5).
48
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
NT-C (n=5)
NT-SMS (n=5)
SHR-NS (n=5)
SHR-SMS (n=5)
*
*
*
L-citrulline Production
(pmol/10
8
cells)
5. 4 Resposta Vasoconstritora no Leito Arterial Mesentérico
A vasoconstrição produzida por injeções in bolus de NA (1-300 nmol) foi
significativa entre os grupos SHR-NS e controle NT-C nas doses de 1 nmol (10,0 ±
0,9; 2,7 ± 2,6; respectivamente), 10 nmol (43,2 ± 7,5; 72,0 ± 5,8; respectivamente).
Houve diferença entre os grupos NT-SMU e SHR-SMU nas doses de 30 nmol (107,0
± 11,8; 156,8 ± 7,4; respectivamente), 100 nmol (126,4 ± 9,7; 206,4 ± 13,0;
respectivamente) e 300 nmol (137,6 ± 8,5; 206,4 ± 10,2; respectivamente). Em
comparação com o grupo SHR-NS, o grupo SHR-SMU apresentou um aumento na
resposta vasoconstritora nas doses 30 nmol (110,0 ± 8,4; 156,8 ± 7,4;
respectivamente) 100 nmol (136,7 ± 7,2; 206,4 ± 13,0; respectivamente) e 300 nmol
(140,7 ± 9,7; 206,4 ± 10,2, respectivamente). Quando se compara o grupo NT-SMU
com o controle NT-C, houve diferença apenas na dose de 1 nmol (2,7 ± 2,6; 12,0 ±
2,5; respectivamente) (Figura 8)
Figura 7 - Produção de L-citrulline nas plaquetas de animais controles
(NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS), normotensos submetidos
a SMU (NT-SMU) e SHR submetidos a SMU (SHR-SMU). Valores estão
expressos em média +
erro padrão. (* P < 0.05). NT-C (0.158 ± 0.012
pmol/10
8
céls, n=5); NT-SMU (0.068 ± 0.009 pmol/10
8
céls, n=5); SHR-
NS (0.033 ± 0.012 pmol/10
8
céls, n=5); SHR-SMU (0.061 ± 0.007
pmol/10
8
céls, n=5).
49
Vasoconstrição (mmHg)
0
50
100
150
200
250
NT-C (n = 5)
NT-SMU (n = 5)
SHR-NS (n = 6)
SHR-SMU (n = 5)
1 3 10 30 100 300
#
#
#
&
+
&
+
&
+
# vs NT-C
+ vs SHR-NS
& vs NT-SMU
(nmol)
5. 5 Diminuição da Pressão de Perfusão Induzida pela Acetilcolina
A figura 9 mostra a relação entre diferentes concentrações de ACh e a PP no
LAM pré-contraído com NA. O grau da diminuição dose-dependente da PP foi
significantemente maior no grupo SHR-NS (
44,1± 3,3 % na dose de 1 pmol de ACh;
61,6 ± 5,0% na dose de 3 pmol de ACh; 75,4 ± 3,5% na dose de 10 pmol de ACh; 72,6 ±
3,6% na dose de 30 pmol de ACh; 82,9 ± 3,8% na dose de 100 pmol de ACh.
) do que no
grupo controle NT-C (4,0 ± 2,2% na dose de 1 pmol de ACh; 14,4 ± 3,3% na dose de 3
pmol de ACh; 36,5 ± 5,4% na dose de 10 pmol de ACh; 44,8 ± 7,5% na dose de 30 pmol de
ACh; 61,2 ± 5,3% na dose de 100 pmol de ACh
). Entre os grupos SHR-NS e SHR-SMU,
houve uma diferença nas doses de ACh de 1 pmol (SHR-NS: 44,1± 3,3 %; SHR-SMU:
18,3 ± 2,1%
) e 3 pmol (SHR-NS: 61,6 ± 5,0 %; SHR-SMU: 41,9 ± 3,0%). Observou-se
uma diminuição na PP maior no grupo NT-SMU, nas doses de 1 pmol (NT-C: 4,0 ±
Figura 8 - Resposta vasoconstritora induzida pela NE em leito arterial
mesentérico de animais controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-
NS), normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) e SHR submetidos a SMU
(SHR-SMU). Valores estão expressos em média +
erro padrão. # P < 0,05,
NT-C vs SHR-NS (n=6); + P < 0,05, SHR-NS vs SHR-SMU (n=5); & P < 0,05;
NT-SMU vs SHR-SMU).
50
% Relaxamento
0
20
40
60
80
100
NT-C (n = 5)
NT-SM U (n = 5)
SHR-NS (n = 6)
SHR-SMU (n = 6)
1
3
30 10010
#
#
+
#
+
#
#
#
#
(pm ol)
# vs NT-C
+ vs SHR-NS
2,2%; NT-SMU: 29,3 ± 3,7%) e 30 pmol (NT-C: 44,8 ± 7,5%; NT-SMU: 65,6 ± 5,1%)
quando comparado com o grupo controle NT-C.
5. 6 Diminuição da Pressão de Perfusão Induzida pela Nitroglicerina
Em injeções in bolus de NG, os efeitos redutores na PP foram
significativamente maiores no grupo SHR-NS que no grupo controle NT-C nas doses
3 nmol (48,9 ± 4,5%; 21,0 ± 1,8%; respectivamente), 10 nmol (54,9 ± 2,1; 27,7 ± 3,2%,
respectivamente
), 30 nmol (61,8 ± 2,5%; 33,3 ± 2,2%, respectivamente) e 100 nmol (74,1
± 6,9; 41,3 ± 1,1%, respectivamente
). Nessas mesmas doses houve uma significativa
redução na PP no grupo SHR-SMU quando comparado com o grupo NT-SMU (63,4
± 5,3%; 44,2 ± 5,2%, na dose de 3 nmol de ACh respectivamente; 65,7 ± 3,6%; 47,2 ± 5,6%,
na dose de 10 nmol de ACh respectivamente; 72,6 ± 3,4%; 45,6 ± 5,3%, na dose de 30 nmol
de ACh respectivamente; 77,6 ± 2,6%; 53,0 ± 5,6%, na dose de 100 nmol de ACh
respectivamente
). Em comparação ao grupo controle NT-C, a redução na PP foi
significantemente maior no grupo NT-SMU nas doses de 1 nmol (39,4 ± 4,6%; 13,6 ±
3,5%, respectivamente
), 3 nmol (44,2 ± 5,0%; 21,0 ± 1,8%, respectivamente) e 10 nmol
Figura 9 - Resposta vasodilatadora da Ach em leito arterial mesentérico
de animais controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS),
normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) e SHR submeitdos a SMU
(SHR-SMU). Valores estão expressos em média +
erro padrão. # P < 0,05,
NT-C vs SHR-NS (n=6); + P < 0,05, SHR-NS vs SHR-SMU (n=6).
51
% Relaxamento
0
20
40
60
80
100
NT-C (n = 5)
NT-SMU (n = 5)
SHR-NS (n = 5)
SHR-SMU (n = 5)
1 3 10 30 100
#
&
#
#
&
#
#
&
#
&
# &
# vs NT-C
& vs NT-SMU
(nmol)
(47,2 ± 5,6%; 27,7 ± 3,2%, respectivamente). Em comparação com o grupo SHR-NS, a
redução na PP foi significativamente maior no grupo SHR-SMU apenas na dose de 1
nmol (42,0 ± 6,7%; 29,3% ± 1,9%, respectivamente) (Figura 10).
5. 7 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
Não houve alteração significativa na formação de subprodutos
(malondialdeído-MDA) da peroxidação lipídica em amostras de mesentério dos
grupos NT-SMU, SHR-SMU e SHR-NS quando comparado entre si e com os
animais controles (Figura 11).
Figura 10 - Resposta vasodilatadora da NG em leito arterial mesentérico de
animais controles (NT-C), hipertensos não-separados (SHR-NS),
normotensos submetidos a SMU (NT-SMU) e SHR submeitdos a SMU (SHR-
SMU). Valores estão expressos em média +
erro padrão. * P < 0,05, NT-C
(n=5) vs NT-SMU (n=5); # P < 0,05, NT-C vs SHR-NS (n=5); + P < 0,05,
SHR-NS vs SHR-SMU (n=5); & P < 0,05; NT-SMU vs SHR-SMU).
52
0.0
0.2
0.4
0.6
NT-C (n=5)
NT-SMU (n=5)
SHR-NS (n=4)
SHR-SMU (n=5)
SOD (U/ mg proteína)
0.0
0.2
0.4
0.6
NT-C (n=5)
NT-SMU (n=5)
SHR-NS (n=4)
SHR-SMU (n=5)
TBARS (nmol TBA/ mg proteína)
5. 8 Superóxido Dismutase (SOD)
Não houve alteração na atividade da enzima SOD nas amostras dos vasos
mesentéricos dos animais estudados (Fig. 12).
5. 9 Catalase
Não houve alteração na atividade da enzima em amostras de mesentério nos
grupos NT-SMU, SHR-NS e SHR-SMU quando comparados entre si e com os
animais controles NT-C (Figura 13).
Figura 11 - Os níveis de TBARS em amostras de mesentério dos
grupos NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU e dos animais controles NT-C.
Valores estão expressos em média +
erro padrão, p<0,05.
Figura 12 - A atividade da enzima SOD em amostras de mesentério dos grupos
NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU e dos animais controles NT-C. Valores estão
expressos em média +
erro padrão, p<0.05.
53
0
1
2
3
4
NT-C (n=4)
NT-SMU (n=5)
SHR-NS (n=3)
SHR-SMU (n=5)
CAT (U/mg de proteínas)
5. 10 Expressão das enzimas eNOS e iNOS
Os resultados para a expressão protéica são apresentados em unidades
arbitrárias de intensidade (pixels) normalizados pela expressão da proteína
constitutiva β-Tub.
A expressão da eNOS não foi alterada nas plaquetas dos animais dos grupos
NT-SMU, SHR-NS e SHR-SMU quando comparados entre si e com os animais
controles NT-C (Figura 14 a). Entretanto, a expressão da iNOS foi significantemente
reduzida nos grupos NT-SMU (0,86 ± 0,03) e SHR-NS (0,97 ± 0,02) quando
comparada com a do grupo controle NT-C (1,49 ± 0,12). No entanto, a expressão da
iNOS foi significativamente elevada no grupo SHR-SMU (1,39 ± 0,03) quando
comparada com a do grupo SHR-NS (Figura 14 b).
Figura 13 - A atividade da enzima catalase em homogenato de vasos
mesentéricos dos animais controles NT-C e dos animais NT-SMU, SHR-
NS, SHR-SMU; Valores estão expressos em média +
erro padrão,
animais por grupo. p<0.05.
54
0.0
0.5
1.0
1.5
NT-C (n=3)
NT-SMU (n=3)
SHR-NS (n=3)
SHR-SMU (n=3)
(A)
Expressão de eNOS
(Unidades arbitrárias)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
NT-C (n=3)
NT-SMU (n=3)
SHR-NS (n=3)
SHR-SMU (n=3)
#
#
+
&
# vs NT-C
+ vs SHR-NS
& vs NT-SMU
(B)
Expressão de iNOS
(Unidades arbitrárias)
Figura 14 - (A) Expressão da enzima eNOS, Western Blotting
representativo com anticorpo anti-eNOS e (B) expressão da enzima
iNOS, Western Blotting representativo com anticorpo anti-iNOS
normalizadas com anticorpo anti-beta-tubulina nas plaquetas dos animais
controles NT-C e dos animais NT-SMU, SHR-NS, SHR-SMU; Valores
estão expressos em média +
erro padrão, n= 3 animais por grupo.
p
<0.05.
eNOS →
β-Tub →
iNOS →
β-Tub →
6 DISCUSSÃO
A depressão é uma psicopatologia bastante investigada em laboratório.
Muitos modelos animais de depressão já foram propostos, mas seu uso é limitado
pela extrapolação dos achados encontrados em animais com seres humanos. Assim
resultados em modelos animais de depressão apresentam uma validade relativa até
para seus defensores Willner (1984). Segundo McKinney e Bunnel (1969), a análise
dos modelos de depressão deve passar por critérios objetivos de validação
propostos como forma de selecionar os mais adequados para a investigação
científica. A concordância entre o modelo e a psicopatologia humana possui uma
similaridade limitada quanto à etiologia, sintomatologia, bases bioquímicas ou
fisiopatologia e tratamento (WILLNER, 1985). Sabe-se que na prática, a avaliação
de todos esses aspectos nem sempre é simples em animais.
Quanto a sua etiologia, por exemplo, alguns autores apontam indícios de que
a depressão humana tem tanto causas genéticas como ambientais (FREUD, 1817;
SULLIVAN; NEALE; KENDLER, 2000; NOVAES MALAGRIS, 2004). Paralelamente,
os estudos sobre as bases bioquímicas da depressão fornecem dados conflitantes
sobre a importância de disfunções nos sistemas de neurotransmissão
noradrenérgica, serotoninérgica e dopaminérgica, além de outros (BELMAKER,
2008). Tendo a depressão geralmente etiologia e sintomatologia distintas, ainda se
investiga o modelo animal que poderia ser o mais aproximado dessa síndrome em
humanos.
Analisando alguns dos sintomas de depressão apontados pelo Manual
Estatístico Diagnóstico da Associação Norte-americana de Psiquiatria (DSM-IV,
2002), observa-se que muitos desses sintomas são totalmente subjetivos: tristeza,
pessimismo, sentimentos de impotência diante de dificuldades corriqueiras, auto-
56
reprovação ou sentimentos exagerados de culpa, pensamentos suicidas. E,
sabemos que esses sintomas são difíceis de serem avaliados em animais. Restam
para análise da similaridade de sintomas apenas as alterações comportamentais
que podem ser objetivamente avaliadas, por exemplo, redução da atividade sexual
perda da motivação ou anedonia, baixa atividade locomotora, perda de peso ou do
apetite, e distúrbio de sono. Mesmo assim, a similaridade de sintomas não é um
aspecto conclusivo do modelo experimental já que dependendo do tipo de
depressão humana eles podem até ser opostos ao esperado (GRAEFF, 1989).
No que diz respeito à similaridade de tratamento, o esperado é que um bom
modelo animal de depressão responda seletivamente a drogas antidepressivas, mas
não a outras drogas psicoativas, imitando os efeitos farmacoterapêuticos
observados na maioria dos pacientes deprimidos (WILLNER, 1985; McARTHUR;
BORSINI, 2006). Entretanto, como é notório, uma parcela considerável dos
pacientes deprimidos, aproximadamente um terço, não responde aos
antidepressivos devido à falha terapêutica que esses apresentam quanto ao seu
mecanismo de ação (BELMAKER, 2008). Por outro, um terço dos pacientes
responde a placebo. Além disso, não é raro que a depressão venha associada à
ansiedade, sendo que nesses casos os fármacos ansiolíticos podem ter algum efeito
terapêutico (TURNER e cols., 2008). Assim, não se pode adotar nenhum critério
isoladamente como definidor de um bom modelo animal de depressão e,
verdadeiramente, parece ser inalcançável que um único modelo animal abarque
toda a complexidade de uma psicopatologia.
Essa ausência de modelos genéticos ou bioquímicos de depressão, então,
suscita o interesse ávido de encontrar um modelo de depressão em animais que
possa retratar a síndrome a partir da sua etiologia. Assim sendo, detenhamo-no nos
57
estudos psicanalíticos de Winnicott (1960) sobre a privação materna ou o abandono
materno, nos quais ele aponta os aspectos negativos manifestados ao longo da vida
de um indivíduo como tendo uma origem no início da vida. Essas mudanças
negativas são expressas como violência, delinqüência, nervosismo extremo,
ansiedade generalizada, esquizofrenia, depressão etc. (RIZZUTO, 1990). Todos
esses aspectos, segundo o autor, originam da relação mãe-bebê ou de quem cuida
da criança. Dos três tipos de abandono estudados por Winnicott, destacam-se dois
deles, a saber, o abandono simples e o abandono repentino. O primeiro que ele
chama de "privação" ocorre por falta de responsabilidade de quem cuida do bebê.
Geralmente é constante, e acontece desde o nascimento em diante. Nessa fase,
Winnicott relaciona o abandono com a ausência de um relacionamento direto entre a
mãe (ou a figura materna) e o bebê. Não é preciso deixar o bebê passar fome: basta
não se relacionar com ele, apesar de alimentá-lo. Esse tipo de abandono possui
efeitos deletérios. O bebê simplesmente não se desenvolve emocionalmente, e pode
apresentar posteriormente perda de personalidade. Disso pode derivar uma psicose
grave, ou uma espécie de apatia que muitas vezes dá a impressão de deficiência
mental (Winnicott, 1984). O abandono repentino, por sua vez, Winnicott denomina-o
“deprivação”, o que em português pode ser considerado também como “privação”;
esse tipo ocorre quando, num relacionamento bastante firme entre o bebê e a mãe,
esta última desaparece ou morre, ausenta-se por um longo tempo ou ainda entra em
depressão grave que a impede de interagir emocionalmente com a criança. Os
efeitos oriundos desse tipo de privação materna também são muito danosos ao
longo da vida do bebê.
Fundamentando-se nesses estudos, o modelo animal de separação materna
única tende a imitar o abandono repentino. Certos estudos demonstram que os
58
eventos perinatais precoces causam vários distúrbios nos desempenhos cognitivo,
emocional e comportamental e que o estresse pós-natal está relacionado com o
funcionamento anormal psicossomático visto tardiamente na vida (FARKAS e cols.,
2009). Isso vai ao encontro dos estudos de Winnicott e aponta o modelo animal de
separação materna como, certamente, um modelo mais reprodutível da depressão
em humanos. Várias mudanças neuroquímicas têm sido também reveladas após o
uso de separação materna, tais como mudanças no sistema dopaminérgico
mesolímbico e alterações na expressão de neuropeptídeos no encéfalo (da SILVA,
1999; BRAKE e cols., 2004; CANNIZZARO e cols.,
2005). Foi mostrado que a
separação drástica leva às reduções dos fatores tróficos e a outros marcadores de
plasticidade no encéfalo (BURTON e cols., 2007). Tem sido relatado também que
uma simples privação materna de longa duração (24 horas) retarda o
desenvolvimento neurocomportamental de ratos recém-nascidos (ELLENBROEK;
DERKS; PARK, 2005). O modelo animal de privação materna, além de mimetizar
melhor a depressão em humanos, muitas vezes é considerado como um modelo
animal de esquizofrenia (ELLENBROEK, 1998), apoiando assim as idéias de
Winnicott segundo as quais os indivíduos que sofreram privação materna na sua
infância apresentarão aspectos negativos ao longo de sua vida. Destarte, o nosso
modelo de separação materna única aproxima-se da psicopatologia em humanos,
embora o modelo animal de separação materna relatado na literatura científica
consista em longos períodos de privação intermitentes, uma simples separação
materna de 1 minuto no primeiro dia de vida pode levar a distúrbios na vida adulta
(LEHMANN e cols., 2002; DARNAUDÉRY e cols., 2004).
A presente dissertação fornece pela primeira vez clara evidência que a
privação materna em um único dia e em curta duração afeta a fisiologia
59
cardiovascular dos ratos. Na verdade, os eventos que interrompem o
desenvolvimento aumentam a vulnerabilidade a uma variedade de desordens
variando de doenças cardiovasculares a depressão (HEIM; NEMEROFF, 2001;
COHEN; JANICKI-DEVERTS; MILLER, 2007). O modelo de separação materna
única, usado neste estudo, demonstrou de maneira pioneira que ratos recém-
nascidos separados por oito minutos no primeiro dia após o nascimento apresentam
uma alteração considerável na via L-arginina-NO que pode ser um elo entre a
depressão e os eventos cardiovasculares (LICHTMAN e cols., 2008). Os ratos
normotensos apresentam resultados diversos dos ratos hipertensos quando
submetidos ao modelo de depressão. Os resultados deste estudo demonstram que
os ratos normotensos Wistar, submetidos à separação materna única, apresentam
pressão arterial sistólica aumentada em relação aos ratos normotensos Wistar
controles, sugerindo que o evento pós-natal sofrido por esses ratos leva a um
distúrbio no sistema cardiovascular. (MACRÌ e cols., 2008; MARAIS e cols., 2008).
No grupo de ratos normotensos submetidos ao modelo de separação materna única,
o influxo de L-arginina está significantemente diminuído nas plaquetas e também há
uma redução da atividade basal da NOS plaquetária. Esses achados sugerem que a
produção de NO está diminuída nos ratos machos normotensos expostos à
separação materna, implicando provavelmente distúrbios cardiovasculares
(BRUNINI e cols., 2005; MENDES RIBEIRO e cols., 2001). E, também, a diminuição
significante da expressão da enzima iNOS nas plaquetas do grupo de ratos Wistar
submetidos à separação materna única quando comparado ao grupo controle,
demonstra uma concatenação com os achados discutidos.
Curiosamente, os ratos machos hipertensos SHR submetidos à separação
materna única apresentaram sua pressão arterial sistólica diminuída em relação aos
60
ratos SHR não-separados. Esse achado vai ao encontro do que foi visto no influxo
de L-arginina plaquetário e na expressão da enzima iNOS nas plaquetas, onde há
um aumento significativo no transporte da L-arginina plaquetária e na expressão de
iNOS nos ratos SHR submetidos à separação materna única quando comparados
com os SHR não-separados. O aumento do transporte de L-arginina nas plaquetas
em ratos SHR também já foi demonstrado em um estudo com stress agudo
(NOVAES MALAGRIS, 2004). Como os ratos SHR possuem uma disfunção
cardiovascular
per se, o resultado desta tese parecem indicar para um mecanismo
compensatório adicional em ratos SHR. Esse resultado confirma fortemente o
conceito de aumento compensatório da função de NO na hipertensão (CHANG e
cols., 2002). Os ratos SHR estavam ainda em uma fase onde o endotélio ainda
estava preservado. Neste contexto foi sugerido que ratos SHR apresentam um
aumento de síntese de NO que previne estes animais de efeitos deletérios quando
submetidos a uma situação de stress suplementar (CHANG e cols
., 2002; NOVAES
MALAGRIS, 2004).
A magnitude das respostas à acetilcolina, nitroglicerina (doador de NO) e
noradrenalina é maior nos ratos SHR (tanto submetidos à separação materna única
como não-separados) do que nos ratos normotensos Wistar submetidos à privação
materna e controles. Mais uma vez, esse resultado vai de encontro ao conceito de
um aumento compensatório da via L-arginina-NO. Os dados de resposta aumentada
a noradrenalina indicam uma vasoconstrição independente do endotélio na
hipertensão (CHEN; HU, 1997). A função diminuída de NO e consequente disfunção
endotelial faz parte da patogênese primária da hipertensão (RESENDE; PIMENTEL;
de MOURA, 2004
). Os resultados em ratos normotensos submetidos à separação
materna única, demonstram uma diminuição do transporte l-arginina e redução da
61
atividade e expressão da NOS plaquetária. Estes achados confirmam o papel
essencial do NO na hipertensão, ofuscando inclusive os efeitos do modelo de
depressão (NOVAES MALAGRIS, 2004).
Nesta dissertação, o equilíbrio entre os processos pró-oxidantes secundários
aos EROs como peroxidação lipídica e as defesas enzimáticas anti-oxidantes não foi
alterado em nenhum grupo. O modelo de estresse oxidativo desta dissertação foi a
mensuração da SOD, malondialdeido e catalase. A SOD é o maior sistema de
defesa da célula vascular, atuando por catalisar a dismutação do ânion superóxido
em peróxido de hidrogênio; já a catalase transforma o peróxido de hidrogênio em
água e oxigênio (CAI, 2005). O malondialdeído, porém, é um dos principais
biomarcadores por ser um dos produtos secundários da peroxidação lipídica mais
utilizado (ESTERBAUER e cols., 1991, BONNES; GUÉRIN, 1992). Estes modelos
são limitados e é necessário no futuro usar técnicas mais apuradas de avaliação do
estresse oxidativo.
Resumindo a separação materna única, além de depressão leva a alterações
dependentes e independentes da via L-arginina-NO. As repercussões detalhadas
destes achados em relação aos mecanismos fisiopatológicos necessitam ser
exaustivamente investigadas (JOYNT; WHELLAN; O'CONNOR, 2003).
7 CONCLUSÃO
A separação materna única leva ao aumento da pressão arterial sistólica, à
inibição do transporte da L-arginina e da atividade basal de NOS nas plaquetas,
além de reduzir a expressão da enzima iNOS nas plaquetas dos ratos machos
normotensos Wistar, o que pode desempenhar um papel fisiopatológico na
disfunção cardiovascular associado a stress e depressão. Os resultados em ratos
machos hipertensos SHR são intrigantes, podendo prevenir uma exacerbação da
hipertensão frente a novos estressores. Apesar da evidência de que a doença
cardiovascular e o transtorno depressivo estejam epidemiologicamente associados,
ainda nos resta conhecer por completo os mecanismos desta relação. Esta
associação certamente levará a aspectos mente/encéfalo que exigirão uma visão
etiológica pluralista.
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ANEXO
ARTIGOS PUBLICADOS
Pinto, V.L.M.; BRUNINI, Tatiana M C; FERRAZ, M. R.; OKINGA, Anicet ;
RIBEIRO, Antônio Cláudio Mendes. Depression and Cardiovascular
Disease: Role of Nitric Oxide. Cardiovascular & Hematological Agents in
Medicinal Chemistry, 2008.
TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS E PUBLICADOS EM FORMA
DE RESUMO
OKINGA, A.; Brunini,TMC; Moss, M.B.; Resende, A.C.; Costa, C.;
Ognibene, D.; Ribeiro, ACM. Intraplatelet L-arginine-nitric oxide and
vascular reactivity in an animal model of postnatal stress. In: Physiological
Society Meeting, 2008, Londres. King's College London Proc Physiol Soc.
Londres : Proc Physiol Soc, 2008. v. 13. p. PC30.
OKINGA, A.; FERRAZ, M. R.; Brunini,TMC; Ribeiro, ACM. A via L-arginina-
óxido nítrico em modelo de estresse pós-natal. In: 3.2.1.70 40 Congresso
Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental. In: 40º Congresso
Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 2008, Águas de
lindóia. 2008 - 40º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica
Experimental, 2008.
Perreira, N.R.; Assumpção, C.R.; Brunini,TMC; OKINGA, A.; Cardoso, C.;
Ribeiro, ACM. Anorexia nervosa,via L-arginina-óxido nítrico e plaquetas..
In: 40 Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental,
2008, Águas de Lindóia. 40º Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapêutica Experimental, 2008.
Pinto, V. L. M.; Fontoura, PCS; Mendes, MAP; OKINGA, A.; Brunini,TMC;
Ribeiro, ACM. A VIA L-ARGININA-ÓXIDO-NÍTRICO, TRANSTORNO
DEPRESSIVO E DOENÇAS CARDIOVASCULARES.
In: XXII Reunião Anual da
FeSBE, 2007, Águas de Lindóia. XXII Reunião Anual da FeSBE 2007, 2007
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