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Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Davi Silva Moreira
“DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA POR
CROMATOGRAFIA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA
AVALIAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE PERTURBADORES
ENDÓCRINOS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO DA
REGIÃO METROPOLITANA DE BELO HORIZONTE.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Ambiental,
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
dos requisitos necessários para a obtenção do
título: “Mestre em Engenharia Ambiental –
Área de Concentração: Saneamento Ambiental”
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino
Ouro Preto, MG
2008
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ii
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
M838D MOREIRA, DAVI SILVA.
Desenvolvimento da metodologia analítica por cromatografia/
espectrometria de massas para avaliação da ocorrência de pertubadores
endócrinos em mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de
Belo Horizonte [manuscrito] / Davi Silva Moreira. – 2008.
123f. : il. color., graf., tabs.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Recursos Hídricos
Pró-Água.
1. Belo Horizonte - Abastecimento de água - Teses. 2. Mananciais
hídricos - Teses. 3. Análise cromatográfica - Teses. I. Universidade
Federal de Ouro Preto. II. Título.
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iii
iv
“Por falta de reflexão os projetos
fracassam, mas se realizam quando
há muitos conselheiros.”
Provérbios 15,22
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele não
seria possível completar esta importante etapa na vida.
Ao professor Sérgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande
professor nos ensinamentos de vida acadêmica e profissional. Ao professor Robson por
ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos.
Aos professores do DEQUI pela dedicação em repassar seus conhecimentos a
todos nós alunos durante a graduação e mestrado.
Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fábio e a Eliane
que ajudaram no projeto sempre que necessário.
Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto
PROSAB 5.
Aos amigos do laboratório Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande
amizade e o intercâmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evolução
de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as análises
complementares.
Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e
piores momentos de UFOP, que já são seis anos. Obrigado!
A UFOP pela bolsa concedida.
A COPASA pela colaboração na coleta das amostras.
E finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmãos Saulo e
Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforço vale a pena.
Muito obrigado!
vi
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 1
2. OBJETIVOS................................................................................................. 4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................... 5
3.1. O sistema endócrino.................................................................................. 5
3.2. Perturbadores endócrinos......................................................................... 7
3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos.............................
9
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos relatados em animais silvestres
e de laboratório.................................................................................................
11
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos relatados em humanos...............
13
3.3. Análise e monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas
Superficiais........................................................................................................ 14
3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos.......................
15
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais.....
24
3.3.3. Técnicas de remoção de perturbadores endócrinos................................
30
3.3.4. Considerações finais................................................................................
32
4. MATERIAIS E MÈTODOS....................................................................... 34
4.1. Desenvolvimento e Otimização do Método Analítico............................... 34
4.1.1. Amostragem, filtração e ajuste do pH ....................................................
36
4.1.2. Extração e concentração dos analitos.....................................................
36
4.1.3. Secagem e suspensão dos analitos...........................................................
38
4.1.4. Análise Cromatográfica...........................................................................
38
4.2. Validação do método analítico.................................................................. 42
4.2.1. Estabilidade.............................................................................................
43
4.2.2. Seletividade..............................................................................................
44
4.2.3. Curva analítica........................................................................................
44
4.2.4. Linearidade e Sensibilidade....................................................................
47
4.2.5. Precisão...................................................................................................
47
4.2.6. Ensaio de supressão................................................................................
48
4.2.7. Ensaio de recuperação............................................................................
48
4.2.8. Ensaio de calibração interlaboratorial...................................................
49
4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos nos Mananciais da
Região Metropolitana de Belo Horizonte........................................................ 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................... 58
5.1.Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização em Chama.............
58
5.2. Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de massas -
Desenvolvimento do Método Analítico.............................................................
61
5.3. Validação do Método Analítico para LCMS............................................. 65
5.3.1. Estabilidade.............................................................................................
65
5.3.2. Seletividade..............................................................................................
66
5.3.3. Curva Analítica.......................................................................................
67
5.2.4. Linearidade e Sensibilidade.....................................................................
69
5.2.5. Precisão...................................................................................................
70
vii
SUMÁRIO (continuação)
Página
5.3.6 Ensaio de Supressão.................................................................................
71
5.3.7 Ensaio de Recuperação............................................................................
73
5.3.8. Ensaio de calibração interlaboratorial...................................................
74
5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos em Mananciais da
Região Metropolitana de Belo Horizonte......................................................... 76
5.5 Estimativa de valores críticos de toxicidade dos PE estudados................. 94
6. CONCLUSÕES............................................................................................ 97
7. PERSPECTIVAS......................................................................................... 99
8. REFERÊNCIAS........................................................................................... 100
viii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 3.1:
Órgãos do sistema endócrino.......................................................
5
Figura 3.2:
Funcionamento do hipotálamo.....................................................
6
Figura 3.3:
Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos
comumente encontrados em águas superficiais...........................
8
Figura 3.4:
Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista;
(c) efeito antagonista....................................................................
11
Figura 3.5:
Diagrama esquemático para preparação e análise dos
perturbadores endócrinos.............................................................
16
Figura 3.6:
Etapas da extração por fase sólida para isolamento de
compostos de interesse.................................................................
19
Figura 3.7:
Exemplo dos dois passos genericamente associados aos
imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao
suporte, seguido de incubação após a adição da amostra
contendo estrogénios e de anticorpos; B) Adição da solução
adequada ao tipo de detecção pretendida.....................................
22
Figura 4.1:
Diagrama geral para preparação e análises dos PE. ....................
35
Figura 4.2:
Cartucho SPE C18 500mg Unitech.............................................
37
Figura 4.3:
Sistema de extração em fase sólida utilizado para extração dos
analitos de interesse das amostras ambientais..............................
38
Figura 4.4:
Reação de Silanização a partir dos analitos a serem
derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o
reagente de derivatização utilizado (BSTFA)..............................
39
Figura 4.5:
Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de
massas íon-trap – time-of-flight..................................................
41
Figura 4.6:
Fórmula Estrutural da Fenolftaleína............................................
45
Figura 4.7:
Localização dos 3 mananciais estudados na Região
Metropolitana de Belo Horizonte................................................
51
Figura 4.8:
Contribuição das ETAs no abastecimento da Região
Metropolitana de Belo Horizonte.................................................
51
Figura 4.9:
Vista aérea ETA Rio das Velhas..................................................
53
Figura 4.10:
Local de amostragem para água bruta do manancial Rio das
Velhas..........................................................................................
53
Figura 4.11:
ETA Vargem das Flores...............................................................
54
Figura 4.12:
Vista aérea ETA Vargem das Flores............................................
55
Figura 4.13:
Vista aérea da ETA Sistema Morro Redondo..............................
56
Figura 4.14:
ETA Morro Redondo...................................................................
56
Figura 5.1:
Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeção de
mistura de padrões em diferentes concentrações. ........................
60
Figura 5.2
Curva de calibração obtida com a mistura dos padrões
analisados......................................................................................
60
ix
LISTA DE FIGURAS (continuação)
Página
Figura 5.3:
Cromatograma típico da análise dos PE em questão: 1 –
Fenolftaleína, 2 – Estradiol, 3 – Etinilestradiol, 4 – ms²
Etinilestradiol, 5 – ms² Estradiol, 6 – Nonilfenol , 7 – ms²
nonilfenol ) ..................................................................................
63
Figura 5.4:
Cromatogramas relativos aos íons precursores ms
1
e ms²
(modos negativo) característicos de cada composto....................
64
Figura 5.5:
Cromatograma do metanol puro (branco). Ausência de picos
para E2, EE2 (Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presença
de interfente no tempo de retenção do NP (Segmento 2 -
6,8minutos - direito)....................................................................
66
Figura 5.6:
Amostra Morro Redondo (água bruta) com adição de estradiol
e etinilestradiol (100 μg.L
-1
, quadro da esquerda) e n-nonilfenol
(200 μg.L
-1
, quadro da direita). ...................................................
67
Figura 5.7:
Curvas analíticas obtidas com soluções-padrão para os quatro
padrões de PE...............................................................................
70
Figura 5.8:
Chuva acumulada mensal na RMBH durante o período de
monitoramento (fev/07 a jan/08).................................................
76
Figura 5.9:
Box-plot da concentração dos três compostos determinados nos
mananciais estudados em todas as campanhas amostrais. Água
Bruta............................................................................................
78
Figura 5.10:
Variação da concentração de nonilfenol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08.........................
80
Figura 5.11:
Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas –
Nov. 2007 e as diferentes fragmentações (ms²) de seus
isômeros (esquerda). Exemplos de estruturas químicas de 5 dos
550 Isômeros de nonilfenol existentes (direita)...........................
81
Figura 5.12:
Boxplot da concentração de nonilfenol na água bruta nos 3
mananciais...................................................................................
82
Figura 5.13:
Índice de remoção de NP (água bruta – água filtrada) durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008................................
83
Figura 5.14:
Variação da concentração de estradiol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08.........................
84
Figura 5.15:
Variação da concentração de etinilestradiol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08.........................
86
Figura 5.16:
Índice de remoção (água bruta – água filtrada) de EE2 durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008...............................
87
Figura 5.17:
Confirmação da presença de Bisfenol A na água a partir do
LCMS. Amostra: Rio das Velhas janeiro de 2008.......................
88
Figura 5.18:
Análise quimiométrica das amostras referentes aos meses de
jun/07 a set/07 com base no PCA................................................
89
x
LISTA DE FIGURAS (continuação)
Página
Figura 5.19:
Variação do pH nas amostras de água bruta dos três
mananciais durante o período de monitoramento........................
91
Figura 5.20:
Variação da turbidez nas amostras de água bruta dos três
mananciais durante o período de monitoramento........................
91
Figura 5.21:
Variação da cor aparente nas amostras de água bruta durante o
período de monitoramento nos 3 mananciais...............................
92
Figura 5.22:
Variação da cor verdadeira nas amostras de água bruta durante
o período de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais............................
92
Figura 5.23:
Análise da Componente principal (PCA) dos seis parâmetros
utilizados para o monitoramento dos mananciais escolhidos......
93
xi
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 3.1:
Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os
Perturbadores Endócrinos.............................................................
9
Tabela 3.2:
Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em
animais..........................................................................................
12
Tabela 3.3:
Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de
Mol et al. 2000)............................................................................
15
Tabela 3.4:
Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes..
19
Tabela 3.5:
Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de
nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais.........
26-28
Tabela 3.6:
Principais fontes de perturbadores endócrinos em águas
superficiais....................................................................................
30
Tabela 3.7:
Metodologias estudadas para remoção de perturbadores
endócrinos.....................................................................................
32
Tabela 4.1:
Nome IUPAC, massa, fórmula molecular, pureza, marca e
número CAS dos compostos determinados..................................
35
Tabela 4.2:
Descrição do procedimento de extração com cartucho Unitech
C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extração
simultânea dos três compostos de interesse..................................
37
Tabela 4.3:
Condições de análise dos Perturbadores endócrinos por
cromatrografia gasosa...................................................................
40
Tabela 4.4:
Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida
acoplada à espectrometria de massas............................................
42
Tabela 4.5:
Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas........................
54
Tabela 4.6:
Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores..................
55
Tabela 4.7:
Campanhas realizadas para determinação dos Perturbadores
Endócrinos na Região Metropolitana de Belo Horizonte – ETA
Morro Redondo.............................................................................
57
Tabela 5.1:
Tempo de retenção, área obtida em relação à concentração e
limite de detecção dos compostos analisados por cromatografia
gasosa...........................................................................................
59
Tabela 5.2:
Fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons primários
(ms
1
) e secundários (ms
2
) característicos para cada padrão
utilizado........................................................................................
64
Tabela 5.3:
Variação da concentração dos compostos em relação ao tempo
de preparo das amostras................................................................
66
xii
LISTA DE TABELAS (continuação)
Página
Tabela 5.4:
Faixa de trabalho, limite de detecção (LD) e limite de
quantificação (LQ) dos quatro compostos determinados por
LCMS-IT-TOF.............................................................................
68
Tabela 5.5:
Coeficiente de correlação (r) obtido para os 4 padrões
determinados por LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento...
69
Tabela 5.6:
Repetibilidade dos resultados obtidos para soluções-padrão dos
três PE expressa por meio do coeficiente de variação (CV).........
71
Tabela 5.7:
Resultados dos testes de supressão realizados com amostras
coletadas na entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008)...........
72
Tabela 5.8:
Variação da supressão nas amostras de água bruta no mês de
janeiro 2008..................................................................................
73
Tabela 5.9:
Valores obtidos pelos ensaios de recuperação de E2, EE2 e NP
em função da fortificação das amostras coletadas na entrada da
ETA Morro Redondo....................................................................
74
Tabela 5.10:
Resultados obtidos pela calibração interlaboratorial UFOP-
CIRRA..........................................................................................
70
Tabela 5.11:
Concentração de nonilfenol (ng.L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem...........................................................
79
Tabela 5.12:
Concentração de 17β-estradiol (ng .L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem...........................................................
84
Tabela 5.13:
Concentração de 17α-etinilestradiol (ng.L
-1
) encontrada durante
as campanhas de amostragem......................................................
86
Tabela 5.14:
Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (água
bruta).............................................................................................
89
Tabela 5.15:
Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores
(água bruta)...................................................................................
90
Tabela 5.16:
Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (água
bruta).............................................................................................
90
Tabela 5.17:
Exemplos de pertubação endócrina observada em animais do
sexo masculino expostos aos estradióis e nonilfenol durante o
período pré-natal. (adaptado Damstra et al.,
2002).............................................................................................
94
xiii
LISTA DE NOTAÇÕES
APEO
Alquilfenóis Polietoxilados
BPA
Bisfenol A
BSTFA
N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
CAS
Chemical Abstract Service
CETESB
Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
CG
Cromatografia Gasosa
CG-FID
Cromatrografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama
CGMS
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CSTEE
Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
DAD
Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia líquida)
DDE
Diclorodifeniltricloroetileno
DDT
Dicloro-difenil-tricloro-etano
DES
Dietilestilbestrol
DIC
Detector de Ionização em Chama (para cromatografia Gasosa)
E1
Estrona
E2
Estradiol
E3
Estriol
EDC
Endocrine Disrupting Chemicals
EE2
Etinilestradiol
EM
Espectrometria de Massas
ESI
Eletronspray ionization
ETA
Estação de tratamento de água
ETE
Estação de tratamento de esgoto
FE
Fase estacionária
FM
Fase móvel
H
2
SO
4
Ácido Sulfúrico
HCl
Ácido Clorídrico
HPLC
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IEH
Institute for Ecological Health
IPCS
Programa Internacional de Segurança Química
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
LC
Cromatografia Líquida
LCMS
Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas
LCMS-IT-
TOF
Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas. Detecção por
Ion Trap e Time of Flight
MSTFA
N-metil-n-trifluoroacetamida
MTBSTFA
N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida
4NP
4-nonilfenol
xiv
LISTA DE NOTAÇÕES (continuação)
NP
Nonilfenol ou n-nonilfenol
NPEO
Nonilfenol Polietoxilado
OCDE
Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OMS
Organização Mundial da Saúde
PCA
Análise de componente principal
PE
Perturbadores Endócrinos
POP
Poluentes Orgânicos Persistentes
RMBH
Região Metropolitana de Belo Horizonte
SPE
Extração por fase sólida
SPME
Microextração em fase sólida
STP
Substâncias Tóxicas Persistentes
UE
União Européia
UKEA
Agência de Proteção Ambiental do Reino Unido
USEPA
Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
UV/VIS
Detector ultravioleta na região do visível
VTG
Vitelogenina
xv
RESUMO
Alguns compostos orgânicos classificados como Perturbadores Endócrinos (PE) são
encontrados em águas superficiais e têm atraído a atenção da comunidade científica
devido à alteração que eles causam no sistema endócrino da fauna aquática e ao
potencial risco à saúde humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormônios
(17β-estradiol, 17α-etinilestradiol) e subprodutos da degradação de surfactantes não-
iônicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, há poucos trabalhos nacionais
publicados abordando o monitoramento e a remoção de PE de águas naturais, não
havendo ainda uma legislação que regulamente a emissão de hormônios e nonilfenóis
no ambiente ou que estabeleça padrões de potabilidade para tais compostos. Sendo
assim, essa dissertação teve como objetivo desenvolver metodologia analítica para
quantificação de 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em
amostras de água superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em três
mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A
quantificação dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) após extração e
concentração em cartuchos tipo C18. A recuperação dos PE pelo processo de extração
em fase sólida variou de 90 a 96¨% ao passo que os limites de detecção do método
foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L
-1
para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Após validação do
método analítico, foi feito o monitoramento do afluente e da água filtrada (em filtro de
areia) de três estações de tratamento de água (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio
das Velhas) da região Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os três compostos
monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol
esteve presente em todas amostras de água bruta, na faixa de concentração de 44 a 1.918
ng.L
-1
. Os compostos 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram determinados em apenas
15% das amostras, na faixa de concentração de 2 a 54 ng.L
-1
. As análises das amostras
coletadas nas ETAs após o filtro de areia mostraram que as etapas de pré-cloração,
coagulação, sedimentação e filtração não foram capazes de remover, em sua totalidade,
os PE monitorados.
Palavras-chave: Perturbadores endócrinos; microcontaminantes orgânicos; qualidade
da água; tratamento de água; espectrometria de massas.
xvi
ABSTRACT
Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been
found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to
their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the
potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine
properties, the hormones (17β-estradiol 17α- ethinylestradiol) and a by-product of the
degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There
are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no
Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water.
Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 β-
estradiol (E2), 17 α-ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of
surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area,
Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid
chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being
extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase
extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical
procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L
-1
for E2, EE2 and NP, respectively.
After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered
water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das
Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results
showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the n-
nonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to
1,918 ng.L
-1
. The estrogens 17β-estradiol and 17 α-ethinylestradiol were detected in
only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of
samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination,
coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely
removing the EDC present in the raw water.
Keywords: Endocrine Disruptors Compounds; organic microcontaminants; Water
Quality; Water Treatment; mass spectrometry
1
1. INTRODUÇÃO
A água é hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do
planeta. Seus múltiplos usos são indispensáveis a um amplo espectro das atividades
humanas. Devido a crescente degradação dos corpos d’água, as preocupações com o uso
e destino têm mobilizado pessoas de diversas áreas acadêmicas a pesquisas científicas
com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.
A partir da década de 70, o interesse da comunidade acadêmica e a criação de
órgãos de proteção ambiental, como a Agência de Proteção Ambiental dos Estados
Unidos (USEPA), promoveram um crescimento de pesquisas envolvendo
monitoramento de microcontaminantes orgânicos em diversos setores ambientais. Com
isso, o interesse dos setores público e privado por assuntos ambientais resultou em
várias organizações governamentais e não-governamentais que hoje debatem,
estabelecem normas e discutem práticas de minimização e remediação de substâncias
químicas potencialmente poluentes.
Dentre as substâncias químicas potencialmente poluentes, nos últimos anos,
destacaram-se alguns compostos denominados perturbadores endócrinos (PE), que são
substâncias que podem provocar alterações no sistema endócrino de animais e de
humanos. Os PE constituem uma classe de substâncias não definidas pela sua natureza
química, mas pelo seu efeito biológico, que pode causar distúrbios no sistema endócrino
mesmo em baixas concentrações. Muitos dos perturbadores endócrinos listados por
algumas organizações como a USEPA e a Agência Ambiental do Reino Unido (UKEA),
também estão classificados numa série de grupos de compostos orgânicos
potencialmente tóxicos, tais como as substâncias tóxicas persistentes (STP), poluentes
orgânicos persistentes (POP), poluentes emergentes, dentre outros. A União Européia
também elaborou um relatório contendo uma vasta lista de 118 compostos suspeitos de
interferir no sistema endócrino, tanto de seres humanos como de diferentes espécies
animais (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002).
O interesse no estudo de compostos classificados como PE foi motivado a partir
de observações sobre a ocorrência de anormalidades no sistema endócrino e reprodutivo
de animais. Os sintomas observados têm sido atribuídos à presença de uma grande
variedade de substâncias químicas, mesmo em concentrações-traço, principalmente em
sistemas aquáticos naturais (Auger et al. 1995; Routledge et al. 1998). Uma evidência
dos possíveis efeitos dos PE em seres humanos foi obtida a partir da experiência
2
envolvendo mulheres grávidas que tomaram o estrogênio sintético dietilestilbestrol
(DES), prescrito para evitar o aborto espontâneo e promover o crescimento do feto, no
período entre 1948 a 1971. Muitas das filhas dessas mulheres são hoje estéreis e, uma
minoria, tem desenvolvido um tipo raro de câncer vaginal (Damstra et al., 2002).
Homens adultos que foram expostos a estradiol mostram maior incidência de
anormalidades em seus órgãos sexuais, apresentam contagem média de espermatozóides
diminuída e podem sofrer um risco maior de desenvolver câncer de testículos (Colucci
et al. 2001; Guillette et al. 1996; Legler et al. 2002).
Dentre a vasta quantidade de PE que já foram avaliados pela comunidade
científica, destacam-se três compostos que são comumente avaliados em diversos
trabalhos, que pode ser justificado pelos seguintes fatores:
i) n-nonilfenol ou nonilfenol: é um subproduto da degradação dos
alquillfenóis polietoxilados (APEO), que são agentes surfactantes de
amplo uso tanto em processos industriais como em produtos de uso
doméstico, por exemplo, detergentes (USEPA 2001);
ii) 17β-estradiol ou estradiol: é um hormônio natural que nas mulheres é
responsável pela síntese de estrogênio circulante, sendo por isso
naturalmente e diariamente excretado na urina humana e, assim,
descartado no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2003);
iii) 17α-etinilestradiol ou etinilestradiol: é um dos estrogênios sintéticos
mais usados como contraceptivos orais, na reposição terapêutica na
menopausa ou na prevenção do aborto (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli e
Jardim 2007).
De acordo com trabalhos nacionais e internacionais, compostos classificados
como PE têm sido detectados em amostras de águas superficiais, principalmente em
função da atividade antrópica (Alda e Barceló 2001). Pesquisas também têm mostrado
que substâncias estrogênicas são encontradas em rios receptores de esgotos domésticos,
tratados ou in natura. Potencialmente danosos à saúde, os PE têm se mostrado
resistentes aos processos de tratamento convencionais utilizados nas estações de
tratamento de esgotos (ETE) e de águas (ETA), sendo a intensidade de remoção dos PE
dependente das condições operacionais impostas no sistema de tratamento. Os poucos
trabalhos existentes sobre o tema indicam que os tratamentos convencionais não
3
conseguem remover completamente tais micropoluentes, havendo relato da presença de
diversos fármacos e de estrogênios naturais e sintéticos no esgoto doméstico e efluentes
de ETEs (Jeannot et al. 2002; Körner et al. 2000).
Em relação aos corpos d’água, outro fator importante é que pouco se sabe sobre
o real impacto desses compostos sobre o ambiente aquático e, principalmente, sobre a
saúde humana. No caso do Brasil, a ausência de ETEs em grande parte dos municípios
brasileiros agrava ainda mais o quadro de possível contaminação das águas superficiais
por PE.
Tendo em vista a crescente preocupação ambiental dedicada aos “perturbadores
endócrinos”, principalmente no Brasil, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma
metodologia analítica que permita a detecção e quantificação de três PE (NP, E2 e EE2)
em amostras de água superficiais a partir da técnica de LCMS. Serão também
discutidos, brevemente, resultados sobre análises dos três compostos a partir da
cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (CG-FID). Após o
desenvolvimento da técnica de análise, será feito o monitoramento de três mananciais
de abastecimento da RMBH: Rio das Velhas e Morro Redondo e Vargem das Flores.
Dessa forma, o primeiro capítulo de resultados apresentará o procedimento para
validação da metodologia analítica empregada e discutirá os parâmetros mais relevantes
para análise. O segundo capítulo de resultados apresentará os dados do monitoramento
de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em três pontos de captação de água da região
metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) e discutirá os resultados obtidos. Finalmente,
o capítulo de conclusões consubstanciará as informações mais relevantes e destacará a
contribuição da dissertação para o tema pesquisado.
4
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a
detecção e quantificação dos perturbadores endócrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) em amostras de água usando cromatografia acoplada a
espectrometria de massas (LCMS).
Objetivos específicos:
• Monitorar, pelo período de um ano, a água de três mananciais da região
metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presença de NP, E2 e EE2;
• Avaliar, de forma geral, a eficiência das etapas de pré-cloração, coagulação,
sedimentação e filtração, empregadas nas estações de tratamento de água (ETA)
monitoradas, na remoção de NP, E2 e EE2.
5
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. O sistema endócrino
Dá-se o nome de sistema endócrino ao conjunto de órgãos que apresentam como
atividade característica a produção de secreções denominadas hormônios, que são
lançados na corrente sangüínea e irão atuar em outra parte do organismo, controlando
ou auxiliando o controle de sua função. Os órgãos que têm sua função controlada e/ou
regulada pelos hormônios são denominados órgãos-alvo (Guyton 1988).
Os hormônios influenciam praticamente todas as funções dos demais sistemas
corporais. Freqüentemente o sistema endócrino interage com o sistema nervoso,
formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer
ao endócrino a informação sobre o meio externo, ao passo que o sistema endócrino
regula a resposta interna do organismo a esta informação. Dessa forma, o sistema
endócrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenação e regulação das
funções corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os órgãos do sistema
endócrino. As propriedas dos órgãos do sistema endócrino serão discutidas a seguir.
Figura 3.1 - Órgãos do sistema endócrino (Fonte: AFH, 2007).
Hipófise ou pituitária:
os hormônios produzidos pela hipófise são denominados tróficos
por atuarem sobre outras glândulas endócrinas. São responsáveis por ativar a secreção
de outros hormônios como os da glândula tireóide, glândula adrenal, gônadas e do
crescimento.
6
Hipotálamo: responsável pelo controle da hipófise através de conexões neurais e
substâncias semelhantes a hormônios chamados fatores desencadeadores (ou de
liberação), o meio pelo qual o sistema nervoso controla o comportamento sexual via
sistema endócrino. Em mulheres, a glândula-alvo do hormônio gonadotrófico é o
ovário; no homem, são os testículos. O hipotálamo é responsável pelo controle de
inibição ou liberação destes hormônios. Como a hipófise secreta hormônios que
controlam outras glândulas e está subordinada, por sua vez, ao sistema nervoso, pode-se
dizer que o sistema endócrino é subordinado ao nervoso e que o hipotálamo é o
mediador entre esses dois sistemas A Figura 3.2 apresenta um diagrama de
funcionamento do hipotálamo.
Figura 3.2 - Funcionamento do hipotálamo (Fonte: AFH, 2007).
Tireóide: responsável pela produção de hormônios como triiodotironina (T3) e tiroxina
(T4), que aumentam a velocidade dos processos de oxidação e de liberação de energia
nas células do corpo, elevando a taxa metabólica e a geração de calor. A calcitonina,
outro hormônio secretado pela tireóide, participa do controle da concentração sangüínea
de cálcio, inibindo a remoção do cálcio dos ossos e a saída dele para o plasma
sangüíneo, estimulando sua incorporação pelos ossos.
Paratireóides: glândulas responsáveis pela secreção do paratormônio, hormônio que
estimula a remoção de cálcio da matriz óssea (o qual passa para o plasma sangüíneo), a
absorção de cálcio dos alimentos pelo intestino e a reabsorção de cálcio pelos túbulos
renais, aumentando a concentração de cálcio no sangue.
Adrenais ou supra-renais: são duas glândulas localizadas sobre os rins, divididas em
duas partes independentes, medula e córtex.
7
Pâncreas: é uma glândula mista, ou seja, apresenta determinadas regiões endócrinas e
exócrinas ao mesmo tempo. As funções endócrinas do pâncreas são responsáveis por
células que secretam dois hormônios: insulina e glucagon.
3.2. Perturbadores endócrinos
O termo “Pertubador Endócrino” é utilizado nesse texto como sinônimo de
disruptores endócrinos, interferentes endócrinos e agentes hormonalmente ativos, que
na literatura internacional corresponde aos “endocrine disrupting compounds or
chemicals” (EDC). Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e disruptores
endócrinos. Muitas definições têm sido propostas para tal classe de compostos,
entretanto, para todas elas existe um ponto em comum: trata-se de uma substância
química que pode interferir no funcionamento natural do sistema endócrino de espécies
animais, incluindo os seres humanos.
Alguns pesquisadores definem um interferente endócrino com base nos seus
efeitos, ou seja, trata-se de uma substância química que, mesmo presente em
concentração extremamente baixa, é capaz de interferir no funcionamento natural do
sistema endócrino, podendo causar câncer, prejudicar os sistemas reprodutivos e causar
outros efeitos adversos (Mozaz et al. 2007; Yang et al. 2006). Em maio de 1997, a
agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency -
USEPA), definiu um interferente endócrino como “agente exógeno que interfere com
síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo,
que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou
comportamento dos organismos”.
O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS), em conjunto com o
Japão, os EUA, o Canadá, a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento
Econômico (OCDE) e a União Européia, adotou a seguinte definição para os
perturbadores endócrinos: “Um perturbador endócrino é uma substância ou um
composto exógeno que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem,
conseqüentemente, efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua
descendência, ou (sub) populações” (CEC 1999).
Os PE podem ser produtos naturais, como os fitoestrógenos produzidos por
plantas, e por isso bastante comuns em alimentos de origem vegetal; ou produtos
sintéticos, como no caso de solventes clorados, aditivos alimentares, constituintes de
8
produtos de limpeza, agrotóxicos, e cosméticos; pílulas anticoncepcionais e outros
fármacos. Desta forma, a exposição aos perturbadores endócrinos pode ocorrer a partir
de uma variedade de fontes, de forma voluntária ou não, inclusive por meio da dieta
diária e do consumo de água potável (Damstra et al. 2002; Solé et al. 2003; Veras
2006). A Figura 3.3 mostra exemplos de perturbadores endócrinos comumente
presentes no ambiente (Laganà et al. 2004).
Figura 3.3 – Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente
encontrados em águas superficiais (Laganà et al. 2004).
Embora desde o início do século XX já existissem hipóteses prevendo alterações
no funcionamento do sistema endócrino de algumas espécies animais expostas a
determinadas substâncias químicas tóxicas, apenas recentemente esta importante
questão tem recebido a devida atenção por parte da comunidade científica. Isso pode ser
constatado pelo número crescente de publicações que relatam o aumento da incidência
de disfunções no sistema endócrino de seres humanos (incluindo a infertilidade
masculina), e mais significativamente, efeitos fisiológicos adversos observados em
espécies animais para as quais a relação causa/efeito é mais evidente (Damstra et al.
2002).
De fato, as evidências observadas em estudos envolvendo moluscos, crustáceos,
peixes, répteis, pássaros e alguns mamíferos têm sugerido que possíveis alterações de
saúde humana envolvendo o sistema reprodutivo, tais como o câncer de mama e de
testículo, podem estar relacionadas à exposição aos Perturbadores Endócrinos
(Lintelmann et al. 2003). Para esclarecer, desenvolver estratégias e solucionar o
problema dos perturbadores endócrinos, várias organizações governamentais e não
governamentais, como, União Européia (UE), US-EPA, Damstra et al. 2002, IPCS e a
9
Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), investigaram
o tema “perturbadores endócrinos”, conforme mostra a Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores
Endócrinos (Bila e Dezotti 2007).
Ano Organização Objetivos do Estudo
1995 Agência Ambiental Federal
Alemã
Discussão sobre evidência e impactos dos PE e riscos
potenciais que podem causar em humanos e animais
1995 Agência Proteção Ambiental
Americana (USEPA)
Seminários para avaliar os riscos à saúde e efeitos
ambientais dos PE
1995 Ministério do Meio Ambiente e
Energia da Dinamarca
Avaliação dos efeitos de substâncias estrogênicas no
desenvolvimento e nas funções do sistema
reprodutivo masculino
1996 USEPA Seminário para desenvolvimento de estratégia para
avaliar o risco dos PE no ambiente
1996 USEPA Desenvolvimento de programa de testes e análises
(screening) para avaliar a ação dos PE
1997 USEPA Relatório sobre os PE presentes no meio ambiente
1998 USEPA Revisão e discussão das informações científicas
disponíveis sobre PE
1998 Organização para a Cooperação
e Desenvolvimento Econômico
(OCDE)
Desenvolvimento de métodos de ensaio para os PE
1999
Committee on Toxicity,
Ecotoxicity and the Environment
(CSTEE)
Revisão da literatura existente e opinião científica nas
evidências dos PE, em particular, avaliação dos riscos
ecológicos e diretrizes de ensaios toxicológicos
1999 Comissão das Comunidades
Européias
Identificação do problema dos PE, suas causas,
conseqüências e definição das medidas adequadas
para dar uma resposta ao problema
2001 Comissão das Comunidades
Européias
Primeiro relatório sobre o progresso dos trabalhos da
comunidade européia sobre os PE
2002 Comissão das Comunidades
Européias
Programa COMPREHEND: Avaliação das
evidências dos PE no ambiente aquático na Europa
2002 OCDE Avaliação dos métodos de ensaios para as substâncias
estrogênicas
2002 Organização Mundial da Saúde
(OMS)
Avaliação global do estado da arte da ciência dos PE
2003 Instituto de Saúde Ecológica
(IHE)
Relatório de avaliação do progresso internacional da
pesquisa dos PE
2004 Comissão das Comunidades
Européias
Segundo relatório sobre o progresso dos trabalhos
sobre os PE.
3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos
A ação de um determinado hormônio inicia-se através da sua ligação a um
receptor específico, no interior de uma célula. O complexo resultante liga-se a regiões
10
específicas do DNA presente no núcleo da célula, o que determina a ação dos genes.
Certos compostos químicos podem também se ligar ao receptor hormonal e,
conseqüentemente, mimetizar ou bloquear a ação do próprio hormônio (Ghiselli e
Jardim 2007; Damstra et al. 2002; Soto et al. 1991).
Esta mudança de atividade é transmitida por várias vias metabólicas, através da
membrana plasmática, dependendo do tipo de hormônio. Os diferentes processos
fisiológicos (em cascata e independentes) obtidos são controlados por mecanismos
complexos, que são ativados ou desativados de acordo com os níveis dos hormônios
encontrados no organismo. Embora muitas destas vias metabólicas possam ser
influenciadas por estimulações externas ao organismo, a grande maioria das disfunções
endócrinas observadas é atribuída ao funcionamento das gônadas, responsáveis pelas
características sexuais secundárias e pelo desenvolvimento e funcionamento dos órgãos
sexuais (Ghiselli e Jardim 2007; OMS 2002).
Um receptor hormonal possui elevada sensibilidade e afinidade por um
hormônio específico produzido no organismo. Por isso, concentrações extremamente
baixas de um determinado hormônio geram um efeito, produzindo uma resposta natural
(Figura 3.4a). Entretanto, estes receptores hormonais também podem se ligar a outros
compostos químicos, e isso explica o porquê de determinados perturbadores endócrinos
presentes no organismo, mesmo em baixíssimas concentrações, serem capazes de gerar
um efeito, provocando conseqüentemente uma resposta (Damstra et al., 2002).
A alteração no sistema endócrino ocorre quando o PE interage com os receptores
hormonais modificando a sua resposta natural, e para isso dois processos distintos
podem ser desencadeados. O PE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma
resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um
determinado hormônio, processo este denominado de efeito agonista (Figura 3.4b). Se o
PE se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ele estará agindo como
um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e o seu
respectivo receptor. Este processo é denominado de efeito antagonista (Figura 3.4c)
(Ghiselli 2006).
Um exemplo de perturbação endócrina é o caso do estradiol. Muitos PE
competem com o estradiol, pelos receptores de estrogênio. Outros competem com a
dihidrotestosterona (hormônio sexual masculino produzido naturalmente pelo
organismo), pelos receptores de androgênio. Portanto, estes compostos exercem efeitos
de feminização ou masculinização sobre o sistema endócrino. Compostos que produzem
11
efeitos de feminização são conhecidos como estrogênicos, enquanto que os que
produzem efeitos de masculinização são conhecidos como androgênicos. Assim, se um
determinado composto é considerado anti-androgênico como a flutamida (fármaco
utilizado no tratamento de câncer de próstata) ele certamente inibirá a ação biológica
dos androgênios, ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de
androgênios presentes nos tecidos-alvo. Já um composto anti-estrogênico como o
tamoxifeno (fármaco utilizado no tratamento de câncer de mama) inibe a ação biológica
dos estrogênios ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de estrogênios
presentes nos tecidos-alvo (Joon Kang et al. 2002; Panter et al. 2000).
Figura 3.4 - Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito
antagonista (Ghiselli, 2006).
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos em animais silvestres e de laboratório
Vários estudos relacionam a poluição ambiental das águas naturais com
anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de diferentes espécies de
animais. A exposição aos perturbadores endócrinos pode ser responsável por alterações
fisiológicas e histológicas em animais silvestres e de laboratório, incluindo alterações
nos níveis de vitelogenina (VTG) no plasma sangüíneo, feminização de peixes machos,
indução ao hermafroditismo, inibição no desenvolvimento das gônadas e declínio na
reprodução. Essas e outras anomalias relatadas em várias espécies de animais são
apresentadas na Tabela 3.2.
12
Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais
(Bila e Dezotti 2007)
Espécie Contaminante Efeitos Referência
Feminização de Peixes (Allen et al. 1999)
Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003)
Efluente de
ETE
Indução da síntese de VTG
(Allen et al. 1999; Solé et al.
2000; Solé et al. 2003)
Feminização de Peixes (Körner et al. 2000)
Alteração nas gônadas (Panter et al. 2000)
Hermafroditismo (Hartley et al. 1998)
Incidência de Testículo-Ovulos nas
gônadas (Joon Kang et al. 2002)
Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000)
Mortalidade elevada dos
descendentes (Knorr e Braunbeck 2002)
17β-Estradiol
Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998)
Indução da síntese de VTG (Folmar et al. 2000)
Mortalidade da espécie (Schmid et al. 2002)
17α-
etinilestradiol
Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003)
Estrona Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998)
Declínio da Reprodução
Indução da síntese de VTG
(Jobling e Sumpter 1993;
Routledge et al. 1998) Octilfenol
Nonilfenol
Butilfenol
Mortalidade elevada dos
descendentes
Feminização de Peixes (Knorr e Braunbeck 2002)
Peixe
Bisfenol A Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000)
Bisfenol A
Anomalia no sistema reprodutivo de
ratos
(Markey et al. 2002)
Mamífero
PCB Alta mortalidade de golfinhos (Aguilar e Borrell 1994)
DDE e DDT
Concentrações anormais de
hormônios sexuais no plasma e
anomalias morfológicas nas gônadas
(Guillette et al. 1996;
Guillette et al. 1999; Milnes
et al. 2002)
Réptil
17β-Estradiol
Indução da síntese de VTG no
sangue e alterações na produção de
ovos de tartaruga (Irwin et al. 2001)
Feminização de Gaivotas machos (Fry e Toone 1981)
DDT
Anomalia no sistema reprodutivo (Bitman et al. 1968)
Aves
DDE Nascimento prematuro de aves (Damstra et al. 2002)
Anfíbio
Efluente de
ETE
Indução à síntese de VTG no sangue
e hermafroditismo (Bogi et al. 2003)
Vários estudos mostram que organismos aquáticos respondem com indução da
síntese de VTG à exposição a determinadas concentrações de estrogênios (Panter et al.
2000; Robinson et al. 2003). No estudo de Routledge et al. 1998, duas espécies de
13
peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a
concentrações de E2 e estrona (E1) ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L
-1
). Os
resultados mostraram que as espécies do sexo masculino são sensíveis para E2 e E1 nas
concentrações utilizadas, pois ocorreu aumento na concentração de VTG no plasma
sanguíneo durante o período de exposição. Entre as fêmeas da espécie Rutilus rutilus
ocorreu diminuição do tamanho do ovo.
De acordo com esses e outros pesquisadores, os resultados confirmaram que os
estrogênios identificados em efluentes domésticos estão presentes em quantidades
suficientes para induzir o surgimento de órgãos masculinos em peixes fêmeas,
conhecido como “imposex”, ou imposição sexual (Ghiselli 2006). Este fenômeno é
irreversível e provoca a esterilização das espécies, podendo causar declínio considerável
nas populações de espécies mais sensíveis. Segundo o estudo de Fernandez et al (2002),
os PE encontrados nas águas estudadas (organoestânicos) interferiram na síntese da
testosterona (hormônio masculino), ocorrendo aumento na produção deste pelas fêmeas.
Consequentemente, a alteração hormonal faz surgir estruturas sexuais masculinas não
funcionais, mantendo-se, porém, a anatomia interna do organismo (Fernandez et al.
2002; Damstra et al. 2002).
Foram observadas anomalias em embriões machos e fêmeas de trutas, como por
exemplo, a feminização dos machos (Körner et al. 2000; Damstra et al. 2002). Várias
espécies de peixes são usadas como modelo para detectar os efeitos de perturbadores
endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo. O estudo de
Legler et al (2002) mostrou que as substâncias com atividade estrogênica não só são
importantes na fase aquosa, mas também podem acumular-se em sedimentos marinhos e
expor os organismos em ambientes aquáticos a substâncias com atividade estrogênica.
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos em humanos
Uma variedade de substâncias químicas é suspeita de causar efeitos adversos na
saúde humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no
sistema reprodutivo feminino e masculino. Os efeitos dos PE em humanos foram
revisados em alguns estudos como o relatório “Global Assessment of the State-of-the-
Science of Endocrine Disrupters” do estudo feito pela International Pannel on
Chemical Safety (IPCS) encomendado pela Organização Mundial da Saúde (Damstra et
al. 2002). Uma das conclusões do estudo foi a possível relação entre alguns PE e
14
alterações na saúde humana, como o câncer de testículo, mama e próstata. A
conseqüência da exposição aos PE foi relacionada ao declínio das taxas de
espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos e disfunção da tireóide.
Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina
sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece
estar relacionado à presença de estradióis nas águas (Damstra et al., 2002). De 1973 a
1994, analisaram a qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis,
levando em conta o volume do fluido seminal, a concentração de esperma e a
mobilidade e morfologia dos espermatozóides. Os autores observaram um declínio na
concentração e mobilidade dos espermas nos homens por um período de 20 anos, e esse
decréscimo da qualidade do sêmen coincide com o aumento na incidência de anomalias
no sistema reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular (Auger et al. 1995).
O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do
balanço e das concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos).
Portanto, uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais
como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade e ovários policísticos.
No entanto, devido à capacidade dos PE em modular ou alterar a intensidade dos
hormônios, resta saber se essas substâncias podem realmente afetar as funções do
sistema reprodutivo feminino. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente
ocorrer, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grávidas na década de 70.
Uma das conseqüências foram anomalias do sistema reprodutivo feminino (câncer
vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) de crianças nascidas a partir de mães
que fizeram uso desse medicamento. Este fato é, sem dúvida, uma evidência dos efeitos
à exposição aos perturbadores endócrinos (Damstra et al. 2002).
Apesar de alguns pesquisadores não sugerirem uma correlação entre a exposição
aos perturbadores endócrinos e efeitos danosos em humanos, revisões como a da OMS
(Damstra et al. 2002) indicam que há claras evidências experimentais e epidemiológicas
dessas substâncias na disfunção no sistema reprodutivo humano (Ghiselli 2006).
3.3. Análise e Monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais
Uma importante fonte de contaminação de águas superficiais com perturbadores
endócrinos (PE) é o lançamento de esgotos domésticos tratados ou in natura. Vários
estudos mostram que as águas receptoras de efluentes de estações de tratamento de
15
esgoto doméstico (ETEs) foram estrogênicas para peixes,
e que a proporção da
intersexualidade nos peixes estava correlacionada com a quantidade dos efluentes
lançados nas águas dos rios estudados (Folmar et al. 2000; Solé et al. 2003; Van den
Belt et al. 2004). Além das emissões pontuais de efluentes doméstico e industrial,
emissões difusas, associadas à chuva e ao escoamento que dela resulta, chegam aos
corpos de água e podem contribuir para o aporte de PE. A poluição difusa pode ocorrer
devido às deposições atmosféricas (poluição industrial e veicular), à lixiviação de solo
contaminado (Ex. drenagem de lixões) e ao escoamento de águas pluviais em ambientes
rurais (Ex. pesticidas) e urbanos (Ex. óleos, lixo). A Tabela 3.3 mostra as classes de
alguns perturbadores endócrinos e a Figura 3.3 mostra a estrutura química de alguns
perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais.
Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al.
2000)
Tipo de composto Uso
Pesticidas Agricultura (ex: DDT)
Hormônios naturais e
sintéticos
Contraceptivos, agentes de crescimento (ex:
estradiol e etinilestradiol)
Alquilfenóis
polietoxilados
(APEOs)
Detergentes, cosméticos, agroquímicos
Alquilfenóis Produtos de degradação dos APEOs (ex:
nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes
PCBs / dioxinas Fluidos para refrigeração / subprodutos da
combustão
Ésteres ftalatos Plastificantes
Fitoestrogênios Ocorrência natural em plantas
Bisfenol A Produção de polímeros, degradação de plásticos
(policarbonatos)
3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos
Diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a determinação de
perturbadores endócrinos em amostras ambientais (Mol et al. 2000). A metodologia de
análise ideal deve ser rápida, exata, precisa, de fácil adaptação e consumir a menor
quantidade de insumos possíveis (Mozaz et al. 2007). As metodologias utilizadas para a
análise de perturbadores endócrinos são, em sua maioria, técnicas cromatográficas que
podem utilizar equipamentos de cromatografia líquida (Hu et al. 2005; Komori et al.
16
2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os
casos, a quantificação dos perturbadores endócrinos nas concentrações ambientais é
normalmente feita com espectrômetros de massa, dada à sua elevada especificidade.
Outro método de análise baseado em técnicas enzimáticas ou bioensaios também têm
sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do
método tem favorecido o uso das técnicas cromatográficas na análise de perturbadores
endócrinos (Farré et al. 2007)
Basicamente, a determinação dos PE em amostras aquosas envolve três etapas:
amostragem, pré-concentração e análise. Para a determinação de perturbadores
endócrinos é necessário usar critérios analíticos rigorosos para que as várias etapas,
como amostragem, transporte, estocagem e análise, tenham o menor erro possível, tendo
em vista a baixa quantidade dos PE (µg.L
-1
a ng.L
-1
) nas amostras ambientais (Liu et al.
2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de análise dos PE.
Figura 3.5 - Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores
endócrinos
Amostragem, filtração e ajuste de pH
A primeira etapa da análise é a amostragem, e a qualidade do processo de
amostragem e preparação das análises é um fator determinante para um resultado
correto (Mozaz et al. 2007). Como os PE em amostras de água podem sofrer degradação
biológica durante o transporte e estocagem, é comum adicionar alguns biocidas, como o
formaldeído ou metanol, bem como manter as amostras em baixa temperatura (4 ºC) até
17
o procedimento de extração e concentração. O tempo máximo recomendado entre a
coleta e a extração é de 48 horas (Fountoulakis et al. 2005; Wang et al. 2005), sendo a
coleta feita em frascos de cor escura uma vez que alguns estrogênios, como estradiol,
podem ser foto-degradados (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005).
A quantidade de água coletada pode variar de acordo com as propriedades
intrínsecas da água analisada, tipo de composto, método de extração e aparelho utilizado
para quantificação. Aparelhos com grande sensibilidade, águas com nível alto de
poluição e alguns métodos de extração como a microextração por fase sólida (SPME)
geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (Yang et al 2006). Contudo,
para a maioria dos casos é necessária uma quantidade maior de água, que normalmente
varia de 250 a 1000 mL (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). Como exemplo,
Lagana et al (2004) fizeram análise de perturbadores endócrinos em diferentes matrizes,
e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para água de rio.
Após coletada a amostra, a primeira etapa de preparação consiste na sua
filtração. A filtração tem a finalidade de retirar os sólidos presentes na água, evitando
assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtração) da etapa posterior
de concentração em cartuchos de extração em fase sólida. Embora a maioria das
membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a
utilização de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para
evitar a adsorção de perturbadores durante a etapa de filtração. As membranas mais
utilizadas na filtração são de 0,45µm feitas de acetato de celulose. Etapas preliminares
de filtração, como a utilização de filtros de 8µm, podem ser necessárias dependendo da
quantidade de sólidos presentes na água. Isso é particularmente importante durante a
amostragem de água de mananciais superficiais durante períodos chuvosos.
Em seguida é feito o ajuste do pH da amostra, que tem como finalidade
aumentar a afinidade dos perturbadores endócrinos, principalmente aqueles de caráter
ácido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionária do cartucho de
extração, aumentando assim sua extração da fase aquosa (Raimundo 2007). De fato, Liu
et al (2004b) fizeram um trabalho para avaliar a influência do pH inicial da amostra na
eficiência de extração, e os resultados obtidos mostraram que a melhor recuperação
obtida foi àquela feita em meio mais ácido. À medida que o pH era diminuído, o índice
de recuperação aumentava, chegando a 100% para alguns compostos no pH igual a 3. O
pH escolhido para as amostras pode variar de acordo com a capacidade máxima que o
cartucho de extração suporta, mas a maioria dos trabalhos de fato utilizam o pH
18
variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et
al. 2005). Os ácidos mais utilizados para a correção do pH são o clorídrico (HCl) ou o
sulfúrico (H
2
SO
4
).
Concentração e eluição dos compostos de interesse
Os PE são, em sua maioria, compostos orgânicos hidrofóbicos encontrados em
baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos não consegue
detectá-los nas concentrações usualmente encontradas, uma etapa de concentração é
usualmente necessária (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considerável
interesse no desenvolvimento de novos métodos seletivos para extração e isolamento
dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A
seletividade da fase estacionária é um importante parâmetro, uma vez que um dos
principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as análises posteriores
feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais
utilizada para contornar esses problemas tem sido a extração em fase sólida (Solid
Phase Extration - SPE). A SPE é uma técnica de separação líquido-sólido que, do ponto
de vista prático, pode ser descrita como uma cromatografia líquida, onde se usa uma
pequena coluna aberta, denominada cartucho de extração, que contém a fase sólida (o
correspondente à fase estacionária em cromatografia).
No procedimento de extração a amostra contendo o analito de interesse é
colocada no topo do cartucho e aspirada através dele pela aplicação de um pequeno
vácuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase
sólida, de forma a ser posteriormente eluído com um pequeno volume de solvente, e
essa etapa de eluição permite a determinação do grau de concentração necessário para a
análise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente
eluído. Se houver contaminantes que possam interferir na análise, uma lavagem e/ou
clean-up precede a eluição, com a utilização de um solvente que tenha afinidade pelo
contaminante e não pelos compostos de interesse. Em muitos casos, onde a amostra não
precisa ser filtrada, a própria etapa de extração em fase sólida funciona como clean-up
(Lanças 2004a). A Figura 3.6 exemplifica as etapas envolvidas na extração em fase
sólida.
19
Figura 3.6 - Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de
interesse (Lanças 2004a)
Atualmente um grande número de cartuchos de SPE está disponível de modo
que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicações. Um adsorvente genérico é
capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos específicos
exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado é a interação hidrofóbica
e as fases sólidas mais reportadas nos trabalhos são as compostas de octadecil (C18) e
sílica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extração por fase sólida para
os perturbadores endócrinos nonilfenol e estradióis.
Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes
Cartuchos Descrição Fabricante
Oasis HLB Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona) Waters
C18 Polimericamente ligado, octadecil (18% C) Vários
C18/ENV
+
C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno IST
Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficiência de recuperação dos
PE em relação ao tipo de cartucho SPE. A conclusão obtida foi que o melhor cartucho
para adsorção de alquilfenóis e estrogênios é o conhecido como Oasis HLB 500mg. O
maior inconveniente na utilização deste tipo de cartucho é o preço, cerca de cinco vezes
superior aos cartuchos de eficiência de recuperação semelhante, como o DSC-18. Dessa
forma, fases estacionárias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relação custo-
benefício.
Uma das grandes desvantagens obtidas na extração em fase sólida é a quantidade
de amostra a ser coletada para análise. Para uma concentração de 1000 vezes, por
exemplo, necessita-se, em média, de 1 litro da amostra, e o tempo de extração pode ser
bastante demorado, podendo chegar a até 3 horas (Wang et al. 2005). Kuch e
Ballschmiter (2001) e Snyder et al (1999) alcançaram baixos limites de detecção de
20
estradiol natural, etinilestradiol e nonilfenol devido ao grande volume de amostra
utilizado, que chegou a 5 litros com uma pré concentração de 5000 vezes.
Uma das soluções apresentadas seria a microextração por fase sólida (SPME), a
qual possui as mesmas funcionalidades da SPE e reduz consideravelmente a quantidade
de amostra e tempo de extração para análise. Yang et al (2006) compararam as
metodologias SPME e SPE e os resultados obtidos mostraram que a SPME é bastante
promissora para a análise de estrogênios, anabolizantes e alquilfenóis, sendo possível
utilizar apenas 3mL de amostra para obter fatores de concentração de 100 vezes.
Recentemente, Wang et al (2008) criaram um método alternativo de extração utilizando
filtros de cigarro como cartuchos de SPE. Uma vez que os filtros de cigarro são
utilizados para a retenção de parte dos poluentes orgânicos gerados pela fumaça,
avaliou-se a capacidade destes em reter alguns PE como o estradiol. Uma das grandes
vantagens seriam o baixo custo e a facilidade de aplicação. Os resultados obtidos
chegaram a 100% de recuperação do estradiol para amostras do rio monitorado.
A eluição do cartucho, ou seja, a dessorção dos compostos de interesse vai
depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam
geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de
eluição (Alda e Barceló 2001; Gibson et al. 2007; Laganà et al. 2004; Wang et al.
2005). É importante destacar que a eluição é normalmente feita com um volume maior
de solvente (5 a 15 ml) para assegurar a completa dessorção dos analitos de interesse.
Desta forma, para se obter um elevado grau de concentração é preciso secar o extrato
orgânico e re-solubilizar o analito em volume adequado de solvente.
Além de obter o grau de concentração adequado, a secagem permite ainda
adequar o solvente ao método de análise tendo em vista que o solvente utilizado na
eluição pode ser incompatível com o equipamento cromatográfico. Um exemplo é o
diclorometano, que não é recomendado para análises em cromatografia líquida devido a
sua alta volatilidade, mas que foi utilizado (junto com o metanol em solução 1:1) por
Laganà et al (2004) para a eluição de fitoestrogênios, micoestrogênios, estrogênios e
alquilfenóis.
A secagem dos extratos orgânicos é normalmente feita em banho-maria à
temperatura pouco maior que a ambiente. Além disso, é comum utilizar fluxo de
nitrogênio sobre os extratos orgânicos para acelerar o processo de secagem. Conforme
dito anteriormente, a reconstituição do extrato seco é feita com o solvente mais
apropriado para análise cromatográfica. Para a cromatografia líquida geralmente utiliza-
21
se acetonitrila e metanol como solventes de reconstituição, ao passo que para
cromatografia gasosa é comum o uso de solventes mais voláteis como acetona e acetato
de etila (Jeannot et al. 2002). Outros métodos analíticos, como a utilização de kits
enzimáticos, exigem a reconstituição em soluções tampão de fosfato (Farré et al. 2007).
Análise Instrumental
Do ponto de vista analítico, os métodos mais adequados para monitoramento dos
PE em amostras ambientais incluem, genericamente, métodos biológicos e métodos de
separação (Farré et al. 2007). Dentre os métodos biológicos destacam-se,
principalmente, os imunoensaios, cujos princípios são a produção de anticorpos e/ou
receptores que se ligam especificamente a substâncias que apresentam atividade
estrogênica. A Figura 3.7 exemplifica os dois passos genericamente associados aos
imunoensaios. Inicialmente ocorre a imobilização do receptor específico a um suporte,
seguido de adição da amostra contendo estrogênios e anticorpos, ocorrendo então um
período de incubação, que varia de 1 a 4 horas. Em seguida, por adição de uma solução
adequada ao tipo de detecção pretendida, procede-se à quantificação por medidas de
fluorescência ou isotópicas (Ex. ELRA: "Enzyme Linked Receptor Assay"; ELISA:
"Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"; RIA: "Radio Immuno Assay") (Mozaz et al.
2007; Nogueira 2003).
Com o intuito de análise vestigial em amostras ambientais, têm-se desenvolvido
inúmeros anticorpos e receptores específicos para os mais diversos tipos de poluentes
químicos, permitindo a tais métodos elevada rapidez de screening (Nogueira 2003). As
vantagens dos métodos biológicos são: rapidez, seletividade, especificidade e
sensibilidade. Por apresentarem limites de detecção na ordem de ng/L não necessitam,
em alguns casos, de pré-concentração da amostra. Algumas desvantagens incluem a
necessidade de se fazer análises individualizadas dos PEs e problemas causados por
alguns interferentes da matriz, podendo levar a resultados superestimados. Farré et al
(2007) observaram que seria necessário um clean-up da amostra para que não ocorresse
este efeito e concluíram também que, para análise de estrogênios como o estradiol,
poderia haver interferência de outros contaminantes como estrona e nonilfenol. Para
contornar esta limitação recorre-se, usualmente, a métodos cromatográficos de
separação, que têm se mostrado bastante eficazes e versáteis no monitoramento de um
grande grupo de PE.
22
Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A)
Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da
amostra contendo estrogênios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo
de detecção pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).
Os métodos cromatográficos implicam em interações fisico-químicas entre os
compostos presentes na amostra e a coluna cromatográfica, e sua aplicação permite a
análise qualitativa ou quantitativa de vários microcontaminantes de interesse ambiental.
A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura através de sua
distribuição em duas fases: uma estacionária (fixa na coluna cromatográfica) e outra
móvel. A cromatografia acoplada à espectrometria de massas, seja líquida ou gasosa,
apresenta-se como a técnica analítica mais robusta, abrangente, reprodutível e sensível,
para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentação disponível combina
baixos limites de detecção e reprodutibilidade analítica através do monitoramento de
íons pré-selecionados.
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGMS) tem sido
uma técnica comumente empregada, apesar de a cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massas (LCMS) ter ganhado popularidade. O pré-requisito necessário
para análise em cromatografia gasosa é que o analito de interesse seja volatilizável e
termicamente estável, muito embora a derivatização possa ser usada em alguns casos
para superar esta limitação. Tradicionalmente, a cromatografia gasosa necessita do
emprego de derivatização para determinar compostos estrogênicos, e os compostos mais
utilizados com tal finalidade são o MSTFA (n-metil-n-trifluoroacetamida), BSTFA (n-
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) e MTBSTFA (n-metil-n-(tert-
butildimetilsilil)trifluoroacetamida). A diferença entre eles se baseia no tipo de reação
que ocorre com o grupo hidroxila dos compostos. Quintana et al (2004) fizeram um
23
estudo comparando os três compostos e mostrando que o MTBSTFA é mais seletivo e o
MSTFA o mais reativo. Apesar da derivatização ser mais comum quando se usa
cromatografia gasosa, Matsumoto et al (2002) utilizaram o anidrido de
pentafluorpropionil (CDPP) em cromatografia líquida, reduzindo assim os limites de
detecção para os estradióis analisados. As desvantagens do procedimento de
derivatização estão relacionadas ao maior trabalho laboratorial para preparo das
amostras, ao maior tempo de análise, e à possibilidade de perdas de analito, uma vez
que a baixa eficiência da hidrólise dos conjugados a estrogênios livres, via
derivatização, pode compor erros nos estágios de recuperação, extração e quantificação.
Tais desvantagens têm dado mais popularidade à cromatografia líquida para a
determinação de estrogênios (Reis Filho et al. 2006) e outros contaminantes ambientais
pouco voláteis.
A cromatografia líquida tem várias vantagens para análise de compostos
orgânicos em água, e uma delas refere-se ao fato de os compostos voláteis serem apenas
uma pequena fração de poluentes usualmente presentes em água e esgotos. De fato, a
maior parte dos perturbadores endócrinos não é volátil, tornando a cromatografia líquida
a técnica mais adequada para sua análise. Isto é especialmente verdade para esgotos, os
quais contêm muito material húmico e compostos orgânicos polares, tais como os
carboidratos. Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida, tais como
ultravioleta-visível, arranjo de diodos, fluorescência e espectrômetro de massas (Alda e
Barceló 2001; Mao et al. 2004; Matsumoto et al. 2002; Raimundo 2007; Solé et al.
2000; Wang et al. 2008).
Os detectores de arranjo de diodos e fluorescência são menos utilizados como
alternativas devido a sua especificidade, mas são poderosas ferramentas adicionais para
análise ou confirmação de alguns grupos específicos de PE (Mozaz et al. 2007).
Conforme mencionado anteriormente, a detecção de perturbadores endócrinos por
espectrometria de massas (MS) tem sido a técnica preferida pela comunidade científica
devido à sua elevada sensibilidade, reprodutibilidade, abrangência e robustez. A
instrumentação atualmente disponível combina a diminuição dos limites de detecção e
excelente reprodutibilidade analítica e elevada seletividade seja no modo de varredura
(modo Full-SCAN), seja através do monitoramento de íons selecionado (modo SIM)
(Hu et al. 2005; Liu et al. 2004b).
Segundo Nogueira (2003), a tendência para um eficiente monitoramento dos PE
em amostras ambientais parece ser a combinação entre métodos biológicos, através de
24
ensaios de imunoextração que consistem no isolamento seletivo de classes restritas de
PE de amostras ambientais com a utilização de "immunosorbents", que seria uma SPE
contendo anticorpos muito específicos na constituição da fase estacionária. Os
compostos de interesses que ficariam retidos na fase estacionária seriam analisados por
cromatografia. Atualmente pouco se desenvolveu neste tipo de técnica, mas a
expectativa para a criação ainda existe, pois o desenvolvimento de uma metodologia de
alta especifidade onde baseia-se em reações enzimáticas é possível. A principal
vantagem deste método estaria na minimização de interferentes durante a análise
cromatográfica.
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais
A Tabela 3.5 resume resultados disponíveis na literatura do monitoramento de
três perturbadores endócrinos encontrados em águas superficiais: um estrogênio natural
(17β-estradiol ou E2), um estrogênio artificial (17α-etinilestradiol ou EE2) e um
produto da degradação dos surfactantes alquilfenóis etoxilados (nonilfenol ou NP), que
foram escolhidos pelo potencial de risco aos seres vivos e pela freqüência com que
foram reportados em trabalhos nacionais e internacionais.
O 17β-estradiol (conhecido também como estradiol ou pela sigla E2) é um
hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante.
Esses estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e, assim,
descartados no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). O 17α-
etinilestradiol ou etinilestradiol é um dos estrogênios sintéticos mais usados como
contraceptivos orais (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). Os alquilfenóis, por sua vez,
apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes industriais e
domésticos, lubrificantes, emulsificantes, formulações de pesticidas, de tintas, bem
como produtos de higiene pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e
banho). Nas ETEs e mananciais, os alquilfenóis polietoxilatos (APEOs) são
inicialmente biodegradados, derivando em metabólitos persistentes e altamente
lipofílicos que incluem os alquilfenóis etoxilatos e, finalmente, os alquilfenóis, tais
como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP).
Os trabalhos apresentados na Tabela 3.5 mostram que a técnica de preparo de
amostra usada predominantemente na análise dos estradióis e do nonilfenol utiliza a
extração em fase sólida, sendo o cartucho Oasis HLB e o octadecilsilano (C18) os mais
25
comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as técnicas de
cromatografia (tanto gasosa como líquida) acopladas à espectrometria de massas são as
mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqüência, cromatografia acoplada a
detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescência. Quando a cromatografia
gasosa é utilizada percebe-se que a derivatização por reações de silanização é preferida
e que os reagentes mais utilizados para tanto são o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA.
As técnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de detecção na ordem de
0,15 a 2,0 ng.L
-1
para os PE investigados. Valores baixos de limite de detecção
dependerão do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as
técnicas de análise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de detecção semelhantes.
A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais o estradiol (E2) e o
nonilfenol (NP) são os compostos frequentemente presentes, sendo o etinilestradiol
(EE2) sempre presente em menor quantidade. Em esgotos domésticos in natura, os
compostos E2 e EE2 foram encontrados com mais freqüência que o NP. Um dos
possíveis fatores é a maior degradação/adsorção dos alquilfenóis ao longo da rede de
coleta. A Tabela 2.5 mostra ainda que apenas o trabalho de Beck et al (2005) investigou
a presença de PE em água marinha. As amostras foram coletadas em um estuário
próximas da ETE municipal de uma cidade alemã com 90.000 habitantes. Os valores
médios encontrados para EE2 e NP foram de 17,9 e 6,3 ng.L
-1
, respectivamente.
De acordo com a Tabela 3.5, também pode ser observado que as maiores
concentrações de PE foram reportadas em trabalhos feitos no continente americano e
asiático, onde se verificou valores médios acima de 100 ng.L
-1
para NP e E2. Apesar da
grande quantidade de trabalhos europeus relacionados, não foram encontradas grandes
quantidades de estrogênios em águas superficiais, e os valores máximos de estradiol e
de etinilestradiol reportados foram de 13,9 ng.L
-1
e 17,9 ng.L
-1
, respectivamente. Dos
trabalhos feitos na Europa salta aos olhos o monitoramento feito por Azevedo et al
(2001) em Portugal, onde se verificou a presença de nonilfenol em concentrações de até
10 mg.L
-1
. Como grande parte dos trabalhos feitos com águas superficiais de cidades
européias não detectou nenhum dos três PE destacados (NP, E2 e EE2) é provável que
estes se encontravam abaixo do limite de detecção analítico (Jeannot et al, 2004;
Matsumoto et al, 2002). Tais resultados indicam que os PE podem estar presentes no
ambiente em valores na ordem de pg/L, tornando-se necessário pesquisar novos
métodos para análise e extração bem como técnicas que permitam avaliar a
estrogenicidade de tais compostos em baixas concentrações.
26
Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais.
Concentração detectada (ng.L
-1
)
Referência
Localização
Fonte de
Origem
Tipo de
extração
Tipo de
detecção
Reagente de
Derivatização
Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Azevedo et al. 2001)
Portugal
Vários locais
Rio
Oasis HLB CG-MS - (0,01 a 10)x10
6
NA
1
NA
(Beck et al. 2005)
Mar Báltico
(Parte Alemã)
Água
Marinha
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - 3,1 a 6,3 < 4,0 2,1 a 17,9
(Bruchet et al. 2004)
França Efluente
Doméstico SPE C18 CG-MS PFPA <0,1x10
3
10,0 2,5
(Farré et al. 2007)
Espanha
Rio
SPE C18 e
NH2
LC-MS/MS
Kit ELISA - NA 0,5 a 1,1 <1,0
(Ghiselli 2006)
Campinas
(Brasil) Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS MTBSTFA (1,1 a 1,8)x10
3
(1,8 a 6,0)x10
3
(1,3 a 3,5)x10
3
(Gibson et al.) 2008
Cidade do
México
(México)
Nascente
SPE C18 ou
(Oasis HLB)
CG-MS/MS
BSTFA +
Piridina
1,8 a 8
0,01 a 0,02
0,04 a 0,08
(Hu et al. 2005)
Pequim
(China) Rio SPE C18 LC-MS/MS NA < 0,1 < 0,1
(Jeannot et al. 2002)
França e
Canadá
Efluente
doméstico
SPE C18 ou
(Oasis HLB)
CG-MS/MS
LC-MS/MS
BSTFA (para CG-
MS) < 2,0 < 2,0 < 5,0
(Kolpin et al. 2002)
Estados
Unidos
Efluente
Doméstico
Líquido -
Líquido CG-MS
TMS (para
hormônios) (0,8 a 40)x10³ 9,0 a 93,0 73 a 831
(Komori et al. 2004)
ETE’s
(Japão)
Efluente
doméstico
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - NA 27 a 220 N.D
2
(Kuch e Ballschmiter
2001)
Alemanha
Rio
SPE
(LiChrolut
EN) CG-MS
Cloreto de
pentafluorbenzoila
(para alquilfenóis) 6,7 a 134 0,15 a 3,6 0,10 a 5,1
(Laganà et al. 2004)
Roma
(Itália) Rio
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - (1,3 a 1,5)x10
3
2,0 a 6,0 N.D
1
NA – não analisado,
2
ND – não detectado
27
Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais (continuação...)
1
NA – não analisado
Concentração detectada (ng.L
-1
)
Referência
Localização
Fonte de
Origem
Tipo de
extração
Tipo de
detecção
Reagente de
Derivatização
Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Liu et al. 2004a)
East Sussex
(Reino Unido)
Sedimento
de Rio
Microondas e
Sílica Gel CG-MS BSTFA 2,9 a 7,5 1,3 a 5,5 2,0 a 7,6
(Liu et al. 2004b)
East e West
Sussex
(Reino Unido)
Rio
SPE
(Oasis HLB)
CG-MS
BSTFA
< 0,8
14 a 17
< 0,8
(Matsumoto et al.
2002)
Japão
Rio SPE C18
LC-
Fluorescência CDPP NA
1
<0,65 <0,65
(Mibu et al. 2004)
Japão
Rio
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - (0,10 a 0,25)x10
3
NA NA
(Mol et al. 2000)
Holanda
Rio SPE C18 CG-MS MTBSTFA < 4,0 < 300 < 50,0
(Quintana et al.
2004)
Espanha
Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS/MS MSTFA NA
3,0-13,9 < 5,0
(Raimundo 2007)
Campinas
(Brasil)
Rio
SPE
(Oasis HLB)
LC-DAD
LC-
Fluorescência
- (0,017 a 0,22)x10
3
(0,045 a
1,31)x10
3
(0,106 a 4,3)x10
3
(Snyder et al. 1999)
Estados
Unidos
Rio
SPE
PFA
(fluorpolímero)
LC-
Fluorescência
Kit ELISA
-
0,16 a 1,17 0,27 a 2,82 0,25 a 0,55
(Solé et al. 2000)
Espanha
Rio SPE C18 LC-DAD-MS - (0,02 a 0,64)x10
3
NA NA
(Ternes et al. 1999)
Brasil Efluente
Doméstico SPE C18 CG-MS MSTFA NA 21,0 <1,0
(Wang et al. 2005)
Tianjin,
(China)
Água
reutilizada SPE C18 CG-MS MTBSTFA 1,0 a 7,0 1,0 a 4,0 6,9
(Wang et al. 2008)
Tianjin,
China Rio
SPE (Filtro de
cigarro e C18) LC-UV - NA (1,3 a 1,5)x10
3
NA
28
Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais (continuação...)
Concentração detectada (ng.L
-1
)
Referência
Localização
Fonte de
Origem
Tipo de
extração
Tipo de
detecção
Reagente de
Derivatização
Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Yang et al. 2006)
Guangdong,
(China) Rio SPME CG-MS MSTFA (4,0 a 5,3) ×10
3
98 a 102 NA
1
(Zhang et al. 2008)
Reino Unido
Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS Não Informado NA 11,8 NA
1
NA – não analisado
29
A Tabela 3.5 mostra que grande parte das amostras aquáticas analisadas indicou
a presença de PE em concentrações que variaram de 1,8 a 10000 ng.L
-1
para o NP e de
0,01 a 6000 ng.L
-1
para o E2 e 0,04 a 3.500 ng.L
-1
para EE2. Apesar de a Tabela 3.5 só
ter apresentado três PE, salienta-se que muitos dos trabalhos relatados detectaram ainda
a presença de outros PE, tais como bisfenol A e estrona (Laganà et al. 2004; Raimundo
2007; Wang et al. 2005). Trabalhos brasileiros como de Ghiselli (2006) e Raimundo
(2007) detectaram também em águas brasileiras o estrogênio natural progesterona, o
estrogênio sintético levonorgestrel e os xenoestrogênios dietilftalato, dibutilftalato e
octilfenol. Compostos considerados PE, mas que enquadram em outras classes como
pesticidas e HPA’s, também foram analisados e detectados por Ghiselli (2006) e
Raimundo (2007).
A Portaria 518/2004 do Ministério da Saúde não determina os valores máximos
permitidos das substâncias analisadas em água de abastecimento. Outros órgãos
mundiais como a Agência Ambiental Americana (USEPA) e a Organização Mundial da
Saúde (OMS) também não apresentam valores máximos permitidos devido à falta de
comprovação concreta dos limites tóxicos dos PE. A Tabela 3.5 mostra que são poucos
os trabalhos realizados em águas brasileiras. Os resultados apresentados por Ghiselli
(2006) e Raimundo (2007) indicaram uma quantidade de estradiol e etinilestradiol
superior àquela normalmente encontrada em águas estrangeiras. Cálculos de
concentrações médias encontradas em trabalhos internacionais apresentaram valores de
34 ng.L
-1
para E2 e 5,5 ng.L
-1
para EE2 enquanto que trabalhos brasileiros, feitos na
bacia do rio Atibaia em Campinas-SP (Ghiselli, 2006), chegaram a concentrações
máximas de 6,0 x 10
3
ng.L
-1
para E2 e 3,5 x 10
3
ng.L
-1
para EE2.
Não há muitos resultados publicados de monitoramento de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em águas superficiais. Além disso, os artigos disponíveis
relatam o monitoramento destes PEs em diferentes tipos de corpo d’água localizados
em diferentes países, o que torna a comparação de resultados difícil e limitada. A
quantidade existente de um PE no ambiente depende de vários fatores. Locais onde há
uma forte presença da agricultura e pecuária possuem tendência de conterem pesticidas
e hormônios, enquanto que esgotos domésticos possuem uma maior probabilidade de
conter alquilfenóis. A Tabela 3.6, adaptada de Raimundo (2007), resume os possíveis
perturbadores endócrinos presentes de acordo com a fonte de poluição.
30
Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endócrinos em águas superficiais.
(adaptada de Raimundo 2007).
Fontes Tipos de
fontes
Perturbadores endócrinos presentes
Efluente
industrial
Pontual Hormônios naturais e sintéticos, alquilfenóis,
ftalatos, bisfenol A, fármacos, cafeína, pesticidas,
bifenilas policloradas (PCB), hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPA), retardantes de chama,
pesticidas, dioxinas
Esgoto doméstico Pontual Hormônios naturais e sintéticos, alquilfenóis,
ftalatos, bisfenol A, fármacos, cafeína.
Deflúvio pecuário Difusa Hormônios naturais e sintéticos, antibióticos,
fármacos veterinários
Natural Difusa HPA, estrogênios naturais e fitoestrogênios
3.3.3. Técnicas de remoção de perturbadores endócrinos
Em virtude da presença de NP, E2 e EE2 em potenciais mananciais de
abastecimento de água, faz-se necessário avaliar a eficiência de técnicas de tratamento
de água na remoção de tais compostos. Salienta-se que pouco se sabe sobre a eficiência
das operações unitárias e processos químicos usualmente usados no tratamento
convencional de água na remoção de tais compostos.
Recentes estudos mostram que os processos oxidativos, tais como, ozonização e
os processos oxidativos avançados (POAs) são tecnologias promissoras na remoção
desses micropoluentes no tratamento de água potável ou de outros sistemas aquosos.
Outros tratamentos também foram investigados na remoção de PE em sistemas
aquosos, como, filtração em carvão ativado, processos com membranas de
nanofiltração e osmose reversa, cloração, dentre outros (Deborde et al. 2004; Veras
2006; Wang et al. 2005).
A ozonização tem sido considerada uma tecnologia promissora na remoção de
estrogênios naturais e sintéticos tanto de água para abastecimento quanto de efluentes.
Wang et al (2005) avaliaram o índice de remoção dos compostos E2, EE2 e NP, que
chegou a 53% na etapa de ozonização para o E2, 71% para o EE2 e de apenas 21% para
o NP. A estação avaliada recebia o efluente doméstico tratado em sistema de lodos
ativados, sendo o tratamento terciário feito com coagulação-floculação utilizando o
cloreto de polialumínio (PAC) como coagulante (dose de 15 mg.L
-1
) seguido de
filtração com membranas de 0,2 μm e, finalmente, tratamento por ozonização com
dosagem de 5 a 6 mg.L
-1
de O
3
. Os valores de PE residuais (após a ozonização) foram
31
de 0,7 ng.L
-1
para E2, 0,8 ng.L
-1
para EE2 e 1,8 ng.L
-1
para NP. Infelizmente maiores
informações a respeito do tratamento (Ex. tempo de contato, temperatura...) não são
informados no artigo.
Outros estudos em escala laboratorial (Alum et al. 2004; Huber et al. 2003)
indicaram que os estrogênios são rapidamente oxidados com baixas doses de ozônio (1,5
mg.L
-1
e tempo de contato de 10 minutos) que são usadas em estações de tratamento de
água potável, alcançando altas remoções (> 97%). Contudo, como no caso anterior,
apesar da atividade estrogênica ter diminuído consideravelmente, uma estrogenicidade
residual permaneceu, provavelmente, devido aos subprodutos de oxidação e a não
remoção completa.
Rudder et al. (2004) estudaram um sistema de filtro biológico em conjunto com o
óxido de manganês (MnO
2
) para oxidação dos PE em esgoto doméstico, e obtiveram
eficiências de 81,7% na remoção de EE2. O MnO
2
oxidou os micropoluentes em
moléculas menores, que junto com o Mn
2+
foram degradados biologicamente, sendo o
manganês reoxidado (Mn
4+
) re-depositado no reator MnO
2
.
Os processos oxidativos avançados (POAs) também são bons candidatos para a
remoção de PE em águas e efluentes. A revisão da literatura mostra que os seguintes
processos já foram investigados para a degradação de perturbadores endócrinos em
ambientes aquáticos: O
3
/H
2
O
2
, H
2
O
2
/UV, Fenton, TiO
2
/UV. A fotocatálise com TiO
2
tem sido bastante estudada na degradação de estrogênios (17β-estradiol, estrona) e
outros PE, alcançando boas remoções dos poluentes (Bila e Dezotti 2007; Veras 2006).
A Agência Ambiental Americana (USEPA 2001) realizou um estudo para
avaliar quais processos no tratamento de água podem ser usados para remoção de
alguns PE. O relatório conclui que a melhor tecnologia disponível no tratamento de
água para remoção de pesticidas, ftalatos, alquilfenóis, alquilfenóis etoxilados e PCB é
o processo de filtração em CAG (Carvão Ativado Granular). O carvão ativado em pó
(CAP) é comumente usado no tratamento de água potável para remoção de
micropoluentes. Alguns autores investigaram o uso de processos de filtração com
carvão ativado na remoção dos PE, tais como, E2, bisfenol A e EE2, e os resultados
mostraram que são alcançadas remoções maiores que 99% de eficiência em com
concentrações iniciais do poluente de aproximadamente 100 ng.L
-1
, onde foi utilizado
concentrações de 5 a 50mg.L
-1
de carvão ativado em pó (Fuerhacker et al. 2001; Yoon
et al. 2003). Veras (2006) estudou a capacidade de remoção do estradiol por Carvãp
32
ativado em pó (CAP) e a remoção chegou a 100% com o carvão ativado a partir de osso
bovino com uma concentração de carvão de 20 mg.L
-1
.
Outra tecnologia que pode ser usada na remoção de PE são os processos de
membrana. De fato, a aplicação de processos com membranas de nanofiltração (NF),
ultrafiltração (UF) e osmose reversa (OR) em plantas de tratamento de água tem
aumentado de forma significativa (Mierzwa et al. 2005; Van der Bruggen e
Vandecasteele 2003). Há poucos trabalhos publicados sobre a remoção de PE por
processos de membranas, mas o trabalho de Mierzwa et al (2005) relataram eficiência de
remoção acima de 90% para EE2 e NP usando membranas de ultrafiltração.
A Tabela 3.7 resume os dados disponíveis na literatura relacionados às
eficiências de remoção de E2, EE2 e NP por diferentes técnicas de tratamento de água.
Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoção de perturbadores endócrinos.
Tecnologia PE estudados Remoção Referência
Ozonização
E2, EE2, NP
1
53% (E2)
71% (EE2)
21% (NP)
Wang et al (2005)
Ozonização E2, EE2 > 97% Alum et al (2004)
Adsorção por carvão
Ativado em pó
E2 > 95% Veras et al (2006)
Separação com utilização de
Membranas
EE2, NP > 90% Mierzwa et al (2005)
Filtro biológico com MnO
2
EE2 81,7% (Rudder et al. 2004)
1
E2 – estradiol; EE2 – etinilestradiol; NP - nonilfenol.
Percebe-se que há pouquíssimos trabalhos publicados sobre tecnologias de
remoção de perturbadores endócrinos em águas destinadas ao abastecimento público.
Nesse sentido cabe destacar que pesquisas financiadas pelo Programa Nacional de
Saneamento Básico (PROSAB) têm sido conduzidas por algumas instituições brasileiras
(UFMG-UFOP, USP) para avaliar a ocorrência de perturbadores endócrinos em
mananciais superficiais bem como a eficiência de diferentes tecnologias de tratamento
na remoção de tais compostos.
3.3.4. Considerações finais
Este capítulo revisou as metodologias utilizadas para análise dos PE em amostras
ambientais e compilou os valores de monitoramento de estradiol, etinilestradiol e
33
nonilfenol, apresentados em artigos nacionais e internacionais. Além disso, a revisão
apresentou dados de experimentos que objetivaram avaliar diferentes tecnologias na
remoção de tais poluentes.
De modo geral, os procedimentos analíticos empregados nos trabalhos, em sua
maioria usando técnicas cromatográficas acopladas a espectrômetros de massa,
mostraram-se efetivos para a identificação e quantificação de PE presentes nas amostras
ambientais. O tipo de análise a ser escolhida (GC-MS ou LC-MS) vai depender
basicamente do tipo de amostra e disponibilidade de equipamento, sendo recomendado o
uso de kits de bioensaios nos casos em que tais equipamentos não são disponíveis. Em
relação ao procedimento de extração, os cartuchos SPE Oasis HLB e octadecil (C18) são
os mais utilizados para a análise quantitativa da maioria dos PE e, como ambos
apresentam índices de recuperação semelhantes, o cartucho C18 torna-se uma opção
com melhor relação de custo-benefício.
A revisão mostra que os hormônios sexuais (naturais e sintéticos) e os
alquilfenóis estiveram presentes na maioria das amostras de água superficial analisadas,
e em concentrações que variaram de 1,8 a 5.300 ng.L
-1
para o nonilfenol; de 0,01 a 6.000
ng.L
-1
para o estradiol natural; e de 0,04 a 3.500 ng.L
-1
para o etinilestradiol. Os
trabalhos apresentados mostram que a eficiência de remoção dos PE varia muito com a
condição operacional e tecnologia utilizada; e que na maioria dos casos o tratamento
com ozonização, ultrafitração e adsorção em carvão ativado reduziu significativamente a
concentração dos PE estudados.
Percebe-se que há pouquíssimos trabalhos nacionais sobre o tema “perturbadores
endócrinos”, tanto no que diz respeito ao monitoramento da ocorrência de PE em
mananciais superficiais, quanto ao estudo das tecnologias de remoção dos PE de águas
superficiais. A necessidade de estudo sobre os valores máximos permitidos de certos PE
não relacionados na Portaria MS 518/2004 também é importante, uma vez que certos
PE, como o estradiol, possuem a capacidade de alterar funções endócrinas em humanos
e não possuem regulamentação de seu teor em água.
34
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Para que se pudesse desenvolver um procedimento analítico capaz de identificar
e quantificar os possíveis PE em amostras ambientais, o trabalho experimental foi
dividido em três etapas. Na primeira etapa do trabalho foi adaptado, a partir da literatura
pertinente, um procedimento para a determinação do nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, utilizando SPE-LCMS-IT-TOF. A segunda etapa consistiu na validação
do método empregado, e na terceira etapa foram analisadas amostras de água superficial
de três mananciais da RMBH em doze campanhas amostrais.
A escolha de E2, EE2 e NP como micropoluentes a serem monitorados, além de
sua importância ambiental, é também devido ao fato de outros pesquisadores no âmbito
do PROSAB, Edital 5, estarem realizando pesquisas com estes micropoluentes em
outros estados brasileiros. Dessa forma, os resultados obtidos poderão ser comparados
com outros pesquisadores da rede.
4.1. Desenvolvimento e Otimização do Método Analítico
Inicialmente foi adaptado, dois procedimentos para a separação e quantificação
dos três compostos escolhidos empregando CG-FID (apenas análises de teste) e LCMS-
IT-TOF (otimização e validação), depois disso, foram avaliados métodos de extração
dos analitos da amostra baseados em SPE. Devido às baixas concentrações dos
compostos de interesse encontrados em ambientes aquáticos naturais, foram adotados
procedimentos para reduzir contaminações originadas durante as etapas de amostragem,
preservação e pré-tratamento.
Desta forma, foram empregados procedimentos fundamentados no uso de
técnicas com baixo índice de contaminação em todas as etapas envolvidas na realização
deste trabalho. Todos os materiais e vidrarias foram primeiramente lavados com água
corrente, detergente. Em seguida, foram lavados em triplicata com uma solução de
Extran 2,5% e enxaguados exaustivamente com água destilada. Após a lavagem com
Extran, as vidrarias foram imersas em uma solução de HNO
3
2,5% por um período de 24
horas e, finalmente, submetidos à limpeza final com água deionizada. Durante todo o
processo de limpeza, a vidraria foi colocada em bandejas limpas. Além disso, o
manuseio e as etapas de preparo de amostra, incluindo filtração, extração e concentração
dos analitos, foram realizados em sala para amostras de água. A Tabela 4.1 traz
35
informações sobre os três padrões analíticos utilizados nesse trabalho, enquanto que a
Figura 4.1 apresenta um procedimento geral de preparação e análises dos PE
monitorados neste trabalho. Os números apresentados no fluxograma da Figura 4.1,
serão utilizados para melhor identificação dos procedimentos descritos posteriormente
neste capítulo.
Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, fórmula molecular, pureza, marca e número CAS dos
compostos determinados.
Composto Fórmula
Molecular
Massa
Molar
(g/mol)
CAS
1
Marca Pureza Nome IUPAC
2
Estrogênio Natural
17β-estradiol C
18
H
24
O
2
272,1776 50-28-2 Sigma-
Aldrich
97% estra-1,3,5(10)-
trieno-3,17β-diol
Estrogênio Sintético
17α-
etinilestradiol
C
20
H
24
O
2
296,1776 57-63-6 Sigma-
Aldrich
98% 19-norpregna-
1,3,5(10)-trien-
20-ino-3,17α-
diol
Xenoestrogênio
Nonilfenol
mistura técnica
C
15
H
24
O 220,1827 84852-15-
13
Pestanal 94% n-nonilfenol
4 - Nonilfenol C
15
H
24
O 220,1827 104-40-5 Riedel-de
Haën
99.9% 4-n-nonilfenol
1
CAS: Chemical Abstract Service,
2
IUPAC: International Union of Pure and Applied
Chemistry
Figura 4.1 - Diagrama geral para preparação e análises dos PE.
36
O acetato de etila utilizado no preparo das amostras foi de grau CG (Sigma-
Aldrich), enquanto que o metanol utilizado na separação cromatográfica e no preparo de
amostras foi de grau HPLC (JT Baker). A água utilizada como fase móvel em todas as
análises foi deionizada em sistema de água ultra pura TKA com resistividade igual a
0,058 μS.
4.1.1. Amostragem, filtração e ajuste do pH (etapas 1 a 3)
Utilizando um frasco de vidro escuro, coletou-se 1 litro de água dos mananciais
escolhidos na entrada das respectivas estações de tratamento de água (ETA). Adicionou-
se em cada frasco, in loco, 5mL de metanol para evitar o crescimento de microrganismos
e efetuou-se o transporte para os laboratórios do DESA-UFMG, onde as extrações foram
realizadas. O tempo limite de preservação foi de 48 horas.
Após a amostra ser coletada, foi feito a filtração (2) cuja função consistiu em
reter partículas suspensas presentes na amostra bruta, permitindo assim que a extração
por fase sólida fosse feita sem problemas de entupimento dos cartuchos. Foram
utilizadas membranas de fibra de vidro (de 1,2 μm) em série com membranas de acetato
de celulose (de 0,45 μm). Após a filtração, o pH da amostra foi ajustado para o valor 3,0
com gotas de uma solução de ácido sulfúrico (50% v/v) (Wang et al. 2005).
4.1.2. Extração e concentração dos analitos (etapas 4 e5)
A etapa de extração foi feita com o objetivo de concentrar os compostos de
interesse (analitos) bem como separá-los das espécies que poderiam interferir na análise.
A remoção de compostos orgânicos da fase aquosa foi feita por SPE, adaptando-
se a metodologia descrita por Wang et al (2005). Vale salientar que a metodologia
utilizada é bastante parecida com outros trabalhos (Ghiselli 2006; Raimundo 2007;
Wang et al. 2008; Wang et al. 2005), ou seja, pequenas modificações foram feitas para
adequar a extração aos compostos analisados e ao equipamento utilizado na
quantificação dos mesmos (Tabela 4.2). Na parte de validação do método analítico, foi
verificada a eficiência da etapa de extração a fim de se obter os resultados relacionados à
extração simultânea dos três compostos analisados.
A extração em fase sólida utiliza uma coluna contendo um sorvente apropriado
para reter o analito que é então eluído com um solvente específico. A SPE envolve
37
basicamente quatro etapas: condicionamento do cartucho (uso de solvente adequado para
disponibilizar os sítios ativos e para ajustar as forças dos solventes de eluição com o
solvente da amostra); extração dos analitos da amostra; lavagem do cartucho para
eliminar possíveis interferentes; eluição dos analitos de interesse para posterior análise
(Lanças, 2004a). Nesse trabalho foram utilizados cartuchos C18 (UNITECH) contendo
500 mg de fase sólida (Figura 4.2), que é o cartucho adequado para adsorver compostos
de interesse em meio aquoso. A Tabela 4.2 descreve os principais detalhes do método.
Figura 4.2 – Cartucho SPE C18 500mg Unitech
Tabela 4.2: Descrição do procedimento de extração com cartucho Unitech C18 (500
mg) utilizado nesse trabalho para a extração simultânea dos três compostos de interesse.
Etapa Descrição
Filtração de 5,0 mL de acetato de etila
Filtração de 5,0 mL de metanol
Condicionamento
Filtração de 5,0 mL de água deionizada
Extração Filtração de 1,0 L de amostra em pH=3,0 (vazão aproximada: 5mL .
min
-1
)
Secagem Aplicação de vácuo por 20 minutos
Eluição Filtração de duas alíquotas de 5 mL de acetato de etila (vazão
aproximada: 1,0 mL . min
-1
)
A extração foi realizada utilizando-se uma bomba de vácuo (Fanem) por meio da
fixação dos cartuchos em um sistema de manifold com capacidade para 16 estrações
simultâneas (Figura 3.3). Para a etapa de eluição, tubos de ensaio de vidro (16,0 x 1,5
cm) foram utilizados para armazenar o acetato de etila eluído, conforme a tabela 4.2.
38
Figura 4.3 – Sistema de extração em fase sólida utilizado para extração dos analitos de
interesse das amostras ambientais.
4.1.3. Secagem e suspensão dos analitos (etapas 6,7 e 10)
Os eluatos (~10 ml) coletados nos tubos de ensaio foram então levados à
completa secura com auxílio de nitrogênio comercial. Durante o processo de secagem, o
volume era recomposto lavando as paredes do tubo de ensaio para evitar perdas de
analito até que todo o extrato se concentrasse apenas no fundo do tubo. O extrato seco
foi então avolumado para 1,0mL pela adição acetato de etila (etapa 7) ou metanol (etapa
10), e o extrato concentrado foi então transferido para ‘vials’ cromatrográficos (1,5mL)
que ficaram conservados em freezer (-20ºC) até o momento da análise cromatográfica
por um período máximo de 15 dias.
4.1.4. Análise Cromatográfica (etapas 8,9 e 11)
Análise por cromatografia gasosa (8 e 9)
A re-suspensão do extrato seco em acetato de etila (etapa 7) foi feita para
determinar os PE por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama.
Conforme visto na revisão da literatura, as análises de E2, EE2 e NP por cromatrografia
gasosa necessitam da etapa de derivatização. Este procedimento consiste em transformar
um composto em um derivado, cujas características de volatilização e interação com a
fase estacionária da coluna utilizada permitam a análise do composto em questão. No
39
caso dos PE analisados, a etapa de derivatização é utilizada ainda para aumentar a
seletividade e a sensibilidade da análise, pois os compostos formados após a
derivatização não são degradados a altas temperaturas. Nesse caso, o derivado obtido
será de polaridade menor e volatilidade maior, o que possibilita sua análise por
cromatografia gasosa.
A reação utilizada para derivatizar os PE foi a de silanização, que consiste em
substituir o hidrogênio da hidroxila (-OH) pelo grupo trimetil-silil (-Si(CH
3
)
3
)
diminuindo assim a polaridade desses compostos e aumentando sua volatilidade. A
Figura 4.4 apresenta uma reação geral de silanização e os compostos utilizados nessa
etapa.
Figura 4.4 – Reação de Silanização a partir dos analitos a serem derivatizados
(nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatização utilizado (BSTFA)
O procedimento para derivatização dos compostos a serem analisados por CG-
FID consistiu nas seguintes etapas:
• A partir do extrato re-suspendido com acetato de etila (1,0 mL – grau CG,
Sigma-Aldrich) (etapa 7), transferiu-se 50µL da solução para outro vial no qual
foi novamente secado com nitrogênio.
• No extrato seco, foi adicionado 50µL de BSTFA (sigma-aldrich).
• O vial foi fechado e colocado sob uma temperatura constante de 75°C durante 45
minutos.
O extrato derivatizado foi levado para análise no CG-FID Varian CP 3380 no
qual foi analisado de acordo com as condições apresentadas na Tabela 4.3.
40
Tabela 4.3: Condições de análise dos PE por cromatrografia gasosa
Aparelho
Varian CP 3380
Coluna
BPX-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano)
Características
*Comprimento: 25m
*Diâmetro interno: 0,15 mm
*Espessura do filme: 0,25 µm
Gases utilizados
N
2
(make-up), Ar Sintético (comburente) e
H
2
(gás de arraste e combustível)
Vazões dos
Gases
N
2
: 30mL/min
Ar Sintético: 300mL/min
H
2
: 30mL/min
Fase Móvel: 30mL/min
Injeção
2 µL, splitless total
Temperatura do
injetor
280°C
Temperatura do
detector
300°C
Programação de
temperatura
*50°C por 1min;
*50 a 120°C a 20°C/min;
*120 a 280°C a 10°C/min estabilizando a
280°C por 11minutos.
Tempo total: 32minutos
Análise por cromatografia líquida com espectrometria de massas (etapa 11)
Diferentemente da cromatrografia gasosa, os perturbadores endócrinos a serem
analisados não necessitam de ser derivatizados para análise por cromatografia líquida.
Portanto, após a secagem do extrato de SPE, foi feito a suspensão com 1 mL de metanol
(grau HPLC, J.T. Baker). As análises por cromatografia líquida foram realizadas em um
equipamento da Shimadzu, modelo LCMS-IT-TOF (Cromatografia Líquida acoplado a
espectrômetro de massas, detector do tipo ion-trap - time-of-flight), e configurado de
acordo com a Tabela 4.4. Os solventes utilizados como fase móvel foram degaseificados
pelo sistema DGU-20A
3
(Shimadzu).
O LCMS-IT-TOF é um equipamento híbrido ideal para identificação de
compostos orgânicos não-voláteis. Acoplando ionização a pressão atmosférica com as
tecnologias de Ion Trap (IT) e Tempo de vôo (TOF), o LCMS-IT-TOF permite obter alta
exatidão de massa e alta resolução (10.000 a 1000 m/z) em todos os modos MS.
Disponibiliza a capacidade de MSn (MS/MS, MS/MS/MS, MS/MS/MS/MS.) utilizando
o método de ion-trap e também a capacidade de realizar medições de massa de alta
resolução e alta precisão utilizando o método TOF, propiciando uma grande seletividade
41
e especificidade dos íons. Pode ser utilizado para obter uma larga variedade de
informações analíticas que são importantes para análise estrutural (shimadzu). A Figura
4.5 mostra o diagrama de funcionamento do espectrômetro de massas de acordo com a
metodologia utilizada.
Figura 4.5 – Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de massas íon-
trap – time-of-flight (fonte: Shimadzu, 2007)
No desenvolvimento da análise cromatográfica foi avaliada a detecção dos
compostos usando como fase móvel (FM) acetonitrila/água e metanol/água. Para isso
foram estudados três parâmetros: FM, vazão da FM e tipo de eluição (isocrática ou
gradiente). A vazão da fase móvel escolhida foi 0,2 mL min
-1
com a utilização dos
solventes metanol/água definida a partir da análise dos picos dos compostos obtidos com
vazões que variaram entre 0,1 e 0,3 mL min
-1
. O método de eluição por gradiente obteve
melhores resultados cromatográficos. O volume de injeção foi mantido em 5 μL durante
todas as análises. Uma vez que a concentração da amostra foi multiplicada por um fator
de 1000 vezes, grande quantidade e variedade de compostos orgânicos estiveram
presente no extrato, o que resultou em uma amostra de elevada complexidade. Devido a
isso, foi utilizada uma pré-coluna apenas, uma vez que a separação dos compostos não
ocorreria em colunas convencionais (colunas maiores). Para as análises foram utilizadas
pré-colunas Phenomenex C18 (4,0 mm x 2,0 mm). A freqüência de troca ocorreu a cada
100 análises aproximadamente, devido a durabilidade menor das pré-colunas. Maiores
informações da análise são apresentados na Tabela 4.4.
42
Tabela 4.4: Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida acoplada à
espectrometria de massas
Aparelho
Shimadzu LCMS-IT-TOF
Módulos
CBM-20A (Controlador de Sistema)
DGU-20A3 (Degaseificador)
LC-20AD (Propulsão de Solventes)
SIL-20ª (Injetor Automático)
IT-TOF (Espectrômetro de massas)
Pré-Coluna
Phenomenex C18 (ODS) (4,0 mm x 2,0 mm)
Vazão da Fase Móvel
0,2 mL . min
-1
(metanol e água)
Gradiente de concentração
(água e metanol)
*Variação de 30 a 85% de metanol em 5 minutos;
*Estabilização a 85% de metanol por 3 minutos;
*Aumento para 100% de metanol e estabilização
por 8 minutos;
*Redução para 0% de metanol e estabilização por
2 minutos;
*Aumento para 30% de metanol e estabilização
por 5 minutos.
Tempo total de análise: 23 minutos.
Volume de injeção da amostra
5µl (injeção automática)
Gases Utilizados
Argônio (gás de colisão)
Nitrogênio (gás de nebulização). Pressão: 100kPA
Temperatura do CDL
1
200°C
Voltagem do detector
1,65 kV
Interface
Eletronspray ionization (ESI) - modo negativo
Intervalo de varredura m/z
100 a 350
Íons monitorados
Nonilfenol: m/z = 219,17
Estradiol: m/z = 271,17
Etinilestradiol: m/z = 295,17
Tempo de acumulação de íons
Nonilfenol: 30 milisegundos
Estradiol: 100 milisegundos
Etinilestradiol: 100 milisegundos
1
CDL: Curved Dessolvation Line(Kaihara et al. 2002; Schug e McNair 2003)
4.2. Validação do Método Analítico (apenas para LCMS)
A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
atenda as exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
43
resultados (Lanças 2004b). Embora não existam ainda sistemas de validação que
assegurem a confiabilidade dos procedimentos analíticos que vem sendo empregados na
determinação de PE em amostras ambientais, procurou-se seguir os critérios e
recomendações de alguns órgãos nacionais de avaliação da qualidade de laboratórios de
análise, como o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial -
INMETRO e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, bem como
sugestões de especialistas da área.
Após a utilização de duas técnicas analíticas para determinação de PE (que será
discutido no próximo capítulo) em amostras ambientais, escolheu-se apenas a
metodologia baseada em análises por LCMS. Essa opção foi fundamentada nos dados do
limite de detecção e especificidade, onde a cromatografia líquida obteve melhores
resultados. A ausência do requisito volatilidade também foi de grande importância para a
escolha do método, uma vez que não seria necessário a derivatização dos compostos E2
e EE2, pois são facilmente degradados a temperaturas elevadas. Como apenas um
método seria escolhido para o monitoramento dos PE, sendo que a técnica LCMS obteve
melhores resultados, não foi necessário a validação da técnica CG-FID.
Portanto, os critérios adotados neste trabalho tiveram como principais referências
os seguintes documentos: Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios
Químicos, do INMETRO; Resolução n° 899 de 29/05/03, da ANVISA; os artigos
científicos publicados por Vilagrassa et al (2007) e Abreu et al (2008); e ainda o livro
“Validação de Métodos Cromatográficos de Análise”, de Lanças (2004b).
A validação do método proposto para esse trabalho consistiu primeiramente da
verificação da calibração do cromatógrafo, baseada em parâmetros definidos pela
Shimadzu. Outros parâmetros como estabilidade das amostras e soluções-padrão,
seletividade, linearidade, intervalos da curva analítica, limite de detecção, limite de
quantificação e eficiência da extração em fase sólida foram avaliados baseados nos
documentos da ANVISA e do INMETRO descritos anteriormente.
4.2.1. Estabilidade
A estabilidade das amostras e padrões foi verificada em termos de temperatura e
tempo. Nesse trabalho foi construída uma curva analítica com novos padrões a cada
análise e os extratos eluídos das amostras foram analisados em um período máximo de
44
15 dias. Além disso, todos os padrões e amostras foram conservados em freezer a -20ºC
e protegidos da luz, envoltos em papel alumínio.
A estabilidade dos padrões foi analisada com cinco soluções contendo os três
compostos de interesse em concentrações de 5 a 400 μg.L
-1
em três momentos
diferentes: logo que o padrão foi preparado; depois de 1 mês de preparo; 24 horas após
ter sido analisado, porém tendo ficado a temperatura e luz ambiente. A estabilidade das
amostras foi avaliada através da análise do extrato da amostra do Rio das Velhas na
primeira campanha amostral em três momentos: imediatamente após ter preparado o
extrato; após 1 e 6 meses que o extrato foi preparado e mantido sob as condições de
preservação (freezer a -18°C).
4.2.2. Seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medição pelo detector selecionado, sem causar um sinal visível no teste de
especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do
efeito também pode depender da sua concentração (INMETRO 2007).
A seletividade do método cromatográfico foi determinada por meio da avaliação
da pureza dos picos cromatográficos obtidos, tanto para os padrões como para os
compostos presentes nas amostras, comparando-se os espectros de massas obtidos para
os padrões empregados na calibração do LC/MS com amostras que continham os
compostos. A avaliação foi feita por meio dos íons primários (ms
1
) e secundários (ms
2
)
obtidos para cada composto, portanto uma maneira segura de diferenciar o composto
analisado de um interferente presente na matriz (IMMETRO 2007; Ribani et al. 2004).
4.2.3. Curva analítica
A quantificação dos compostos de interesse nas amostras ambientais foi obtida
por padronização externa e interna. A padronização externa foi utilizada para a
quantificação de NP, enquanto que para E2 e EE2 foi utilizado esse método apenas
durante os meses de fevereiro a junho de 2007. A determinação por padronização interna
foi utilizada a partir do mês de julho/2007 para E2 e EE2 com o objetivo de minimizar
os interferentes da matriz para o efeito supressivo.
45
O método de padronização externa compara a área da substância a ser
quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas
preparadas a partir de um padrão. Preparam- se soluções da substância a ser quantificada
em diversas concentrações; obtém-se o cromatograma correspondente a cada uma delas
e, em um gráfico, relacionam-se as áreas obtidas com as concentrações. Utilizando este
gráfico ou a equação da curva resultante, pode-se calcular a concentração desta
substância na amostra a partir da área da substância obtida no cromatograma resultante
de uma injeção separada (Ribani et al. 2004).
O método de padronização interna consiste na preparação das soluções padrão de
concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se adiciona a mesma
quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno. Após análise dessas
soluções, constrói-se um gráfico, relacionando a razão de áreas (área da substância/ área
do padrão interno que tem concentração constante) com a concentração (variada) da
substância. A amostra também é analisada após a adição da mesma quantidade
conhecida do padrão interno. Através da razão de áreas obtidas no cromatograma tem-se
a concentração da substância na amostra. Idealmente, a substância usada como padrão
interno deve ser similar à substância a ser quantificada, ter tempo de retenção próximo a
esta substância, não reagir com a substância ou outro componente da matriz, não fazer
parte da amostra (Ribani et al. 2004).
Usualmente, para adequar-se aos critérios de um padrão interno ideal, são
escolhidos os compostos deuterados dos analitos de interesse. Devido à dificuldade de
obtenção e o alto custo de aquisição, essa opção tornou-se inviável para o
desenvolvimento do método. Como solução, foi proposto o uso da fenolftaleína (Figura
4.6). A fenolftaleína possui estrutura semelhante, em alguns aspectos, aos perturbadores
endócrinos estudados. Além disso, a fenolftaleína é estável, altamente sensível ao
método e não foi detectada nas amostras coletadas.
O
O
OH
HO
Figura 4.6 – Fórmula estrutural da Fenolftaleína
46
Durante as análises de LCMS, o padrão interno obteve um comportamento
semelhante aos estrogênios para o efeito supressivo (será discutido posteriormente), o
que tornou possível o seu uso durante o monitoramento dos estrogênios em água. Para o
NP não foi detectado efeito supressivo, portanto não foi necessário o uso de um padrão
interno.
As soluções padrão foram preparadas a partir de uma solução mais concentrada
(1000 mg.L
-1
) obtida pela pesagem do padrão (solução estoque) e as soluções de
trabalho foram preparadas por diluição direta da solução estoque. Todas as soluções
foram preparadas em metanol (grau HPLC, J.T. Baker). A fenolftaleína foi adicionada
após todo o processo de preparação das amostras a uma concentração de 50 µg.L
-1
em
todos os vials. Um branco também foi feito injetando-se 5 µL de metanol.
Por fim, foram também determinados os limites de detecção (LD) e quantificação
(LQ) do método. O limite de detecção representa a menor quantidade do composto de
interesse que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um valor
exato. Já o limite de quantificação corresponde à menor quantidade do composto de
interesse que pode ser quantificada com exatidão, utilizando-se um determinado
procedimento experimental (Lanças, 2004b). Ambos os limites podem ser determinados
de 3 maneiras diferentes: empregando-se o método visual, o método da relação sinal-
ruído e o método baseado nos parâmetros da curva analítica. Dentre os métodos
apresentados, o que apresentou resultados mais satisfatórios foi o baseado nos
parâmetros da relação sinal/ruído.
Para determinar o LD e LQ através da relação sinal-ruído, é feita a comparação
entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações conhecidas do
composto de interesse na matriz e um branco destas amostras. Assim, é estabelecida uma
concentração mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada. A relação
sinal-ruído geralmente aceitas para LD e LQ são de 3:1 e 10:1 repectivamente como são
expressos pelas equações 1 e 2:(Ribani et al. 2004)
LQ: N/R > 10 (1)
LD: N/R > 3 (2)
onde: N é a intensidade do sinal obtido pelo composto com uma concentração
conhecida. R é o ruído gerado pelo mesmo composto quando não está presente (branco).
Segundo Ribani et al (2004), o método mais utilizado para a determinação dos
LD e LQ é o da relação sinal-ruído para técnicas analíticas em geral. Assim sendo, o
47
melhor caminho para resolver o problema de cálculo destes limites foi utilizar o método
descritos nas equações 1 e 2. Neste trabalho ambos os limites de detecção e
quantificação foram determinados e calculados usando os softwares LCMS Solutions,
Microsoft Excel e Microcal Origin.
4.2.4. Linearidade e Sensibilidade
A faixa linear de trabalho de um método de ensaio é o intervalo entre os níveis
inferior e superior de concentração do analito no qual foi demonstrado ser possível a
determinação com a precisão, exatidão e linearidade exigidas, sob as condições
especificadas para o ensaio. A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na
qual a sensibilidade pode ser considerada constante. A faixa linear é normalmente
expressa nas mesmas unidades do resultado obtido pelo método analítico (Lanças
2004b).
Nesse trabalho, a linearidade foi obtida por padronização externa, e de acordo
com a resolução do INMETRO um valor de coeficiente de correlação (r) maior que 0,90
é aceitável. A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente de inclinação da curva de
calibração e avaliando simultaneamente o intervalo onde ocorre uma variação linear
entre a concentração do analito e a área obtida.
4.2.5. Precisão
A repetitividade é geralmente dependente da concentração do analito e, deste
modo, deve ser determinada para um diferente número de concentrações. O coeficiente
de variação (CV%) pode ser mais útil neste caso, pois foi normalizado com base na
concentração e deste modo ele é praticamente constante ao longo da faixa de interesse,
contanto que esta não seja muito grande (INMETRO 2007). O Coeficiente de Variação é
calculado de acordo com a equação 3:
CV = DP/CMD x 100 (3)
Onde:
DP = desvio padrão;
CMD = concentração média determinada
48
A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade através do cálculo da
estimativa do DP e do CV para um número de sete repetições para duas concentrações
diferentes, onde são aceitos CV de até 20 % (INMETRO 2003).
4.2.6 Ensaio de Supressão
Uma variável acrescentada para avaliar a resposta de espectrômetros de massas é
o teste de supressão. O teste de supressão é utilizado para determinar se a presença de
interferentes na amostra alteram a área cromatográfica dos compostos de interesse. Isso
pode resultar em uma diminuição da intensidade dos íons dos compostos de interesse na
amostra real fazendo com que seja necessária a correção dos dados para uma melhor
exatidão dos resultados (Villagrasa et al. 2007).
O ensaio de supressão, feito em triplicata, consistiu na adição de uma
concentração de 20µg.L
-
¹ de, E2 e EE2, e de 50 µg.L
-
¹ de ambos, NP e fenolftaleína na
amostra real após ela ter sido submetida a todo o processo de preparação (entre o item 10
e 11 da Figura 3.1). Se não houver efeito supressivo, a diferença de área observada entre
a amostra fortificada com o padrão e a amostra original (sem a adição do padrão) deve
ser igual a área obtida pelo padrão de mesma concentração. Sendo assim, a porcentagem
de supressão é calculada pela equação 4.
Fator de Supressão (%) = (1 – [(A
f
– A
m
) / A
t
]) x 100 (4)
Onde:
A
f
= Área do composto de interesse na amostra fortificada após todo o processo de
extração e eluição (no vial);
A
m
= Área da amostra sem a fortificação (branco)
A
t
= Área teórica em relação à quantidade de padrão adicionado a amostra. Calculado
pela curva de calibração.
4.2.7. Ensaio de recuperação
Os ensaios de recuperação foram utilizados para averiguação da precisão e
exatidão do método. O ensaio de recuperação constitui-se no método mais utilizado para
validação de processos analíticos (Lanças 2004b).
49
A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de
determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na
amostra. A exatidão é expressa como erro sistemático percentual, inerente ao processo.
O erro sistemático ocorre pela perda da substância devido à baixa recuperação da
extração, medidas volumétricas imprecisas ou substâncias interferentes na amostra.
Segundo o INMETRO, o índice de recuperação é calculado da seguinte forma
(equação 5):
Recuperação (%) = [(C
1
- C
2
) / C
3
] x 100 (5)
onde:
C
1
= concentração determinada na amostra fortificada;
C
2
= concentração determinada na amostra não fortificada;
C
3
= concentração adicionada.
Neste trabalho, os ensaios de recuperação foram avaliados usando 9
determinações, cada qual usando 3 níveis de concentrações, com triplicatas em cada
nível. As concentrações preparadas foram de 20, 100 e 200 ng.L
-1
para E2 e EE2 e 300
ng.L
-1
para NP.
A faixa escolhida para os estrogênios coincide com a faixa de trabalho utilizada
(próximo ao LD, concentração média e máxima da curva de calibração). Isso foi
possível devido a ausência de tais compostos nas amostras. Diferentemente para o NP,
onde não foi possível a determinação a baixas concentrações (20 e 150 ng.L
-1
), pois o
alquilfenol esteve presente sempre em valores acima de 200 ng.L
-1
durante os testes de
recuperação, impossibilitando a determinação do índice de recuperação com valores
abaixo de 300 ng.L
-1
.
As amostras utilizadas para o ensaio foram coletadas na entrada da ETA Morro
Redondo totalizando 12 amostras, já que é necessário observar as concentrações dos PE
na, amostra, anteriores à adição. Os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de
compostos em concentrações-traço estão entre 70 e 120 %, segundo Wang et al, (2005).
4.2.8. Ensaio de calibração interlaboratorial
A calibração interlaboratorial possui o objetivo de avaliar a precisão das análises
feitas por laboratórios ou metodologias diferentes. Consiste em uma importante etapa de
validação, uma vez que cada laboratório busca a verificação do desempenho dos seus
50
métodos em relação aos dados de validação obtidos por meio de comparação
interlaboratorial (Immetro, 2007).
Com objetivo de avaliar a confiabilidade dos resultados obtidos para a
metodologia LCMS-IT-TOF, em parceria com o Centro Internacional de Referência e
Reuso da Água (CIRRA – Butantã, SP), foram feitas análises dos 3 compostos por duas
metodologias diferentes:
- Análise por Espectrometria de Massas – DEQUI-UFOP.
- Análise por Imunoensaio (kit ELISA) – CIRRA-USP.
A intercalibração foi feita em duas etapas. A primeira etapa consistiu em uma
análise de amostra que foi preparada na UFMG (rio das Velhas fevereiro/2008) e
enviada para os dois laboratórios. A segunda etapa foi a análise dos padrões com
concentrações pré-estabelecidas, de modo que cada padrão preparado em seu respectivo
laboratório foi enviado ao outro e analisado. Esta etapa consistia na verificação da curva
de calibração de ambos, pois em teoria, a concentração dos padrões deveria ser igual nos
dois procedimentos.
Para a análise por LCMS foram enviados, pelo CIRRA-USP, apenas os padrões
de EE2 devido à incompatibilidade, com as colunas cromatográficas, do padrão de NP
utilizado no kit ELISA. Para análise por kit ELISA foram enviados, pelo DEQUI-UFOP,
todos os padrões (4NP, NP mix, E2 e EE2) em meio aquoso.
4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos nos Mananciais da Região
Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH)
Por meio da técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas (LCMS), foram avaliadas a qualidade de águas destinadas ao abastecimento
público na Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) no que diz respeito aos
três PE já mencionados: nonilfenol, estradiol e etinilestradiol.
Foram realizadas doze campanhas amostrais a fim de se obter dados referentes às
variações sazonais da concentração dos três PE avaliados em três distintos corpos
d’água. Assim, as coletas foram feitas ao longo de um ano hidrológico completo,
contemplando períodos de elevada pluviosidade e de estiagem. As campanhas amostrais
foram mensais (de 02/2007 a 01/2008) e a coleta das amostras de água feitas de forma
pontual.
51
Um levantamento feito pelo DESA-UFMG em conjunto com a COPASA-MG
avaliou as condições de proteção sanitária dos mananciais da RMBH. Foram escolhidos
dois mananciais que apresentaram condições críticas de preservação, sendo um deles
lótico (Rio das Velhas) e outro lêntico (Vargem das Flores), e um manancial mais
protegido (Morro Redondo). As Figuras 4.7 e 4.8 apresentam a localização dos
mananciais e a contribuição dos mesmos para o abastecimento público na RMBH.
Figura 4.7 – Localização dos 3 mananciais estudados na Região Metropolitana de Belo
Horizonte (COPASA, 2006)
Figura 4.8 – Contribuição das ETAs no abastecimento da Região Metropolitana de Belo
Horizonte (COPASA, 2006)
52
Além de monitorar a qualidade da água dos mananciais Rio das Velhas, Vargem
das Flores e Morro Redondo no que se refere à presença de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, a dissertação também buscou avaliar, ainda que de forma preliminar, a
ocorrência dos PE estudados na água parcialmente tratada (antes da etapa de
desinfecção). Para tanto, a partir de Junho de 2007, amostras foram coletadas não só na
entrada das ETAs dos três mananciais avaliados, mas também após a etapa de filtração,
podendo assim, avaliar a eficiência do tratamento clássico (exceto desinfecção) na
remoção de E2, EE2 e NP. A eficiência de remoção foi calculada conforme a equação 6:
Eficiência de Remoção (%) = 100 × (C
Ab
- C
At
)/C
Ab
(6)
onde:
C
At
= concentração determinada na água após o processo de filtração;
C
Ab
= concentração determinada na água bruta;
As amostras foram coletadas com o auxílio de um frasco previamente
ambientado com a própria água a ser coletada, ou diretamente em frascos de vidro âmbar
de 1 litro de capacidade também ambientados. Em cada ponto de amostragem foram
coletados cerca de 3L de amostra. Em cada recipiente de amostragem foram adicionados
5mL de metanol para fins de inibição microbiana, e em seguida os frascos foram
fechados e colocados em caixa térmica com gelo para seu transporte. Durante todo o
período de amostragem foram utilizadas luvas de látex e todas as amostras foram
preservadas a 4 °C, em refrigerador, até a extração dos compostos de interesse, o que foi
feito em até 48 horas da coleta.
Anterior ao processo de extração das amostras de água bruta, medidas de pH,
turbidez, cor verdadeira (fev/07 – jan/08) e cor aparente (set/07 – jan/08) foram feitas
para uma possível correlação destes parâmetros com as concentrações dos PE presentes
na amostra a partir de análises estatísticas dos dados (Sousa et al. 2006). As análises
físico químicas foram feitas baseadas na metodologia descrita no livro Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, considerado livro de referência
para análises em água e efluentes (Eaton et al. 2005).
As extrações e eluições das amostras foram feitas em laboratórios devidamente
equipados para análise de água localizados no Departamento de Engenharia Sanitária e
Ambiental da UFMG (DESA-UFMG) por pessoas previamente treinadas para tal
função. No laboratório, alíquotas da água coletada foram preparadas para a extração em
duplicata. As amostras foram previamente filtradas a vácuo em sistema tipo manifold
53
utilizando membranas de acetato de celulose com 0,45 μm de porosidade e 47 mm de
diâmetro, para remover sólidos em suspensão presentes na matriz (ver Figura 4.1).
ETA Rio das Velhas (coordenadas 20° 00’ 23.84” S e 43° 49’ 36.42” O)
A ETA-Rio das Velhas trata em média 24.300 m
3
/h de água, sendo responsável
por cerca de 43% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). A qualidade da água desse
manancial é prejudicada em função do aporte de esgotos doméstico e industrial (tratados
ou in natura) por cidades e indústrias localizadas à montante da ETA (Sabará, Raposos,
Santa Luzia, Lagoa Santa, etc.), bem como por atividades agrícola e pecuária
desenvolvidas em sua bacia. O tratamento utilizado na ETA é do tipo convencional com
coagulação/floculação, decantação, filtração, e etapas de pré- e pós-cloração. A Figura
4.9 mostra uma vista aérea da ETA-Rio das Velhas indicando os pontos de coleta. A
Figura 4.10 mostra o local de amostragem da água bruta ao passo que a Tabela 4.5
resume as campanhas amostrais realizadas no local.
Figura 4.9 – Vista aérea da ETA Rio das Velhas
Figura 4.10 – Local de amostragem para água bruta do manancial Rio das Velhas
54
Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol na ETA Rio das Velhas.
Tipo de Amostra Código das Amostras Mês
007RV e 008RV Fevereiro/07
013RV e 014RV Março/07
019RV e 020RV Abril/07
029RV e 030RV Maio/07
040RVB e 041RVB Junho/07
050RVB e 051 RVB Julho/07
064RVB e 065RVB Agosto/07
084RVB e 085RVB Setembro/07
098RVB e 099RVB Outubro/07
118RVB e 119RVB Novembro/07
130RVB e 131RVB Dezembro/07
Entrada da ETA
(antes da pré-
cloração)
142RVB e 143RVB Janeiro/08
042RVE e 043RVE Junho/07
056RVE e 057RVE Julho/07
066RVE e 067RVE Agosto/07
086RVE e 087RVE Setembro/07
096RVE e 097RVE Outubro/07
116RVE e 117RVE Novembro/07
Efluente do filtro
132RVE e 133RVE Dezembro/07
ETA Vargem das Flores (coordenadas 19° 55’ 13.18” S e 44° 10’ 15.22” O)
A ETA-Vargem das Flores trata em média 3.600 m
3
/h de água e é responsável
por cerca de 10% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). A captação superficial, que
é feita em barragem, apresenta histórico de estratificação e floração de cianobactérias
(Jardim et al. 2000; Jardim e Viana 2003). O tratamento utilizado na ETA é do tipo
“filtração direta descendente” com coagulação/floculação e filtração, e etapas de pré- e
pós-cloração. As Figuras 4.11 e 4.12 mostram a localização da ETA Vargem das Flores.
A Tabela 4.6 apresenta as campanhas amostrais realizadas no local.
Figura 4.11 – ETA Vargem das Flores
55
Figura 4.12 – Vista aérea ETA Vargem das Flores
Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores.
Tipo de Amostra Código das Amostras Mês
009VF e 010VF Fevereiro/07
015VF e 016VF Março/07
021VF e 022VF Abril/07
031VF e 032VF Maio/07
036VFB e 037VFB Junho/07
052VFB e 053VFB Julho/07
076VFB e 077VFB Agosto/07
092VFB e 093VFB Setembro/07
106VFB e 107VFB Outubro/07
108VFB e 109VFB Novembro/07
122VFB e 123VFB Dezembro/07
Entrada da ETA
(antes da pré-
cloração)
136VFB e 137VFB Janeiro/08
038VFE e 039VFE Junho/07
058VFE e 059VFE Julho/07
082VFE e 083VFE Agosto/07
094VFE e 095VFE Setembro/07
104VFE e 105VFE Outubro/07
110VFE e 111VFE Novembro/07
124VFE e 125VFE Dezembro/07
Efluente do filtro
134VFE e 135VFE Janeiro/08
ETA Morro Redondo (coordenadas 19° 57’ 42.41” S e 43° 56’ 31.05’’ O)
A ETA-Morro Redondo trata em média 2.500 m
3
/h de água, sendo responsável
por cerca de 5% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). O “Sistema Morro Redondo”
56
é um conjunto de três mananciais localizados em áreas de preservação (Cerqueira et al.
2000). As Figuras 4.13 e 4.14 mostram uma vista aérea da ETA-Morro Redondo
Figura 4.13 – Vista aérea da ETA Sistema Morro Redondo
Figura 4.14 – ETA Morro Redondo
A captação da água bruta da ETA Morro Redondo é feita nos mananciais de
Fechos, Mutuca e Cercadinho e o tratamento utilizado é do tipo convencional com
coagulação/floculação, decantação, filtração, e etapas de pré- e pós-cloração. A Tabela
4.7 apresenta as campanhas amostrais realizadas no local.
A partir das amostras coletadas dos três locais, os dados obtidos em relação às
concentrações dos PE em estudo foram compilados e analisados através de gráficos
estatítiscos onde foram avaliados em conjunto com os parâmetros físico-químicos.
As análises quimiométricas foram feitas utilizando o métode de PCA (análise de
componente principal). Com este método é possível observar uma possível correlação,
caso exista, entre as concentrações dos PE aos parâmetros físico-químicos utilizados
durante o monitoramento (pH, cor aparente e turbidez). O software utilizado foi o
Minitab 14.
57
Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinação dos Perturbadores Endócrinos na
Região Metropolitana de Belo Horizonte – ETA Morro Redondo
Tipo de Amostra Código das Amostras Mês
011MR e 012MR Fevereiro/07
017MR e 018MR Março/07
023MR e 024MR Abril/07
027MR e 028MR Maio/07
044MRB e 045MRB Junho/07
049MRB e 050MRB Julho/07
068MRB e 069MRB Agosto/07
088MRB e 089MRB Setembro/07
102MRB e 103MRB Outubro/07
112MRB e 113MRB Novembro/07
128MRB e 129MRB Dezembro/07
Entrada da ETA
(antes da pré-
cloração)
140MRB e 141MRB Janeiro/08
046MRE e 047MRE Junho/07
054MRE e 055MRE Julho/07
074MRE e 075MRE Agosto/07
090MRE e 091MRE Setembro/07
100MRE e 101MRE Outubro/07
114MRE e 115MRE Novembro/07
126MRE e 127MRE Dezembro/07
Efluente do filtro
138MRE e 139MRE Janeiro/08
58
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Este capítulo está estruturado em 4 partes de forma a apresentar os resultados de
acordo com as etapas descritas a seguir:
Criação de um método analítico para CG-FID (testes preliminares) – 1 parte. Neste
tópico será mostrado apenas procedimentos iniciais de análise dos PE por cromatografia
gasosa com detector de ionização em chama. Durante os testes foram usados padrões
sintéticos e apenas quatro amostras de água bruta e, devido aos resultados obtidos, não
foi desenvolvido um processo de validação para o mesmo.
Criação de um método analítico para LCMS (completo) – 3 partes. As análises
utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas
obtiveram resultados satisfatórios e, portanto, foi desenvolvido todo o processo
necessário para a utilização do método como padrão para o monitoramento dos PE em
mananciais da RMBH. Os processos de desenvolvimento e validação do método
analítico consistiram desde a etapa de pré-concentração dos analitos a análise
instrumental por LCMS-IT-TOF totalizando 3 partes: Desenvolvimento, validação e
monitoramento dos PE.
5.1. Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização em Chama (testes).
A cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama (CG-FID) não é
uma técnica comum para determinação de PE, e da análise da Tabela 3.5 percebe-se que
não foi mencionado nenhuma análise utilizando esta técnica. O desenvolvimento de
metodologia de análise dos PE por CG-FID foi motivada pelo fato de tal equipamento
ser mais disponível nos laboratórios de Universidades e Companhias de Saneamento. O
desenvolvimento da metodologia para análise no CG-FID foi feito baseando-se nos
métodos utilizados para CG-MS. Valores como a variação de temperatura, coluna
utilizada e temperatura do injetor foram feitas com base na técnica de Wang et al (2005)
(Tabela 4.3). A técnica para a derivatização dos compostos foi adaptada a partir de Liu
et al. (2004b), conforme descrito no item 4.1.4. A reação obteve um rendimento de
100% para a formação dos 3 compostos derivatizados, uma vez que o BSTFA estava em
excesso e é considerado altamente reativo (Zhang et al. 2006).
59
Para uma melhor separação dos picos, os padrões de análise foram preparados
em acetato de etila. Como este teste foi feito em março de 2007 e o padrão nonilfenol
mistura técnica (n-nonilfenol) foi utilizado apenas no último período de análise
(Outubro/2007 a Janeiro/2008), apenas os padrões 4-nonilfenol (4NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) foram utilizados no desenvolvimento do método.
Os padrões de E2, EE2 e 4NP foram preparados em cinco concentrações
diferentes (Tabela 5.1) na faixa de 50 a 185. mgL
-1
a partir da solução estoque
(1000mg.L
-1
).
Tabela 5.1: Tempo de retenção, área obtida em relação à concentração e limite de
detecção dos compostos analisados por cromatografia gasosa.
Padrões Concentração
(ppm)
TR (min) Áreas Limite de detecção do
Equipamento
184,93 12,455 3691088
123,28 12,438 2078226
92,46 12,432 1435391
84,06 12,411 1238373
4-Nonilfenol
(4NP)
52,84 12,415 685394
28,21mg.L
-1
166,67 19,251 1308655
111,07 19,232 711236
83,33 19,225 448051
75,73 19,208 350391
17β-Estradiol
(E2)
47,66 19,209 58367
41,87 mg.L
-1
17α-Etinilestradiol
(EE2)
166,67
111,07
83,33
75,73
19,813
19,796
19,794
19,777
360243
214430
130077
112679
36,62 mg.L
-1
A Figura 5.1 mostra que não houve grande variação no tempo de retenção dos
compostos analisados (desvio padrão de 0,015 min para EE2 e 0,018 min para 4NP e
E2), e a Figura 5.2 mostra que as curvas de calibração obtidas tiveram uma boa
correlação linear. Portanto, para a faixa de concentração analisada, há possibilidade
determinar por CG-FID a concentração dos PE estudados.
A partir dos limites de detecção obtidos para cada composto, de acordo com a
Tabela 5.1 e a Figura 5.2, pode-se concluir que a senbilidade do 4-NP foi melhor, pois
ele resultou em maior coeficiente angular. O sinal obtido com o 4-NP foi o de maior
intensidade de resposta frente à técnica utilizada.
60
Figura 5.1 – Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeção de mistura de
padrões em diferentes concentrações.
Figura 5.2 – Curva de calibração obtida com a mistura dos padrões analisados.
Considerando que se pode obter, durante a técnica de extração em fase sólida, um
fator de concentração de 1000 vezes, os valores mínimos de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol que poderiam ser quantificados por CG-FID seriam de 28µg.L
-1
, 41 µg.L
-1
e 36 µg.L
-1
respectivamente.
Apesar de o CG-FID resultar em relativamente baixos valores de detecção,
trabalhos internacionais como de Wang et al (2005) e Yang et al. (2006) quantificaram o
4-NP, o etinilestradiol e o estradiol em amostras de água superficiais com concentrações
máximas de 50ng. L
-1
, inviabilizando assim o uso de GC–FID para monitoramento
ambiental de águas superficiais. Contudo, a técnica de extração em C-18 seguida de
derivatização e análise por CG-FID, desde que validada, poderia ser utilizada no
monitoramento de estradiol, etinilestradiol e 4-nonilfenol presentes em amostras de
esgotos sanitários, ou em experimentos de tratamento de água em escala de bancada ou
piloto em que a água é fortificada com os padrões resultando em concentrações mais
elevadas desses PE.
61
Quatro amostras teste do rio das Velhas foram utilizadas para verificação da
presença dos PE nas concentrações estabelecidas pelo método. Uma amostra preliminar
(Rio das Velhas fev./2007) foi analisada por CG-FID, não sendo detectado nenhum dos
três compostos de interesse nos limites obtidos pela a metodologia. Os resultados não
puderam ser diretamente comparados com análises por LCMS devido à ausência do
equipamento no período que os ensaios foram feitos por CG-FID (fevereiro /2007).
Contudo, como será visto posteriormente, o composto nonilfenol esteve presente de
forma consistente em todos os mananciais pesquisados, e provavelmente estava presente
na amostra analisada por CG-FID.
De acordo com os resultados obtidos em relação ao limite de detecção para a
técnica utilizada, não foram feitos testes para validação e recuperação, pois a
metodologia não poderia ser utilizada para o monitoramento dos PE nos mananciais
escolhidos.
5.2. Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de massas -
Desenvolvimento do Método Analítico
O método analítico envolveu a extração, concentração dos analitos da amostra e a
sua determinação por LCMS-IT-TOF. Há vários métodos descritos na literatura (Tabela
3.5), porém ainda não há nenhum método padrão para a determinação desses compostos
em matrizes aquáticas. O que se encontra nos artigos dessa área são procedimentos de
extração e determinação aplicados a várias classes de compostos, como os estrogênios
(Laganà et al 2004) ou os fenóis (Liu et al 2004a), por exemplo. Portanto, essa primeira
etapa do trabalho consistiu no desenvolvimento de um método analítico compatível com
os equipamentos utilizados, de forma a permitir a determinação simultânea de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em águas superficiais.
Inicialmente foi estudada a melhor separação cromatográfica para os três analitos
(E2, EE2 e 4NP) usando eluição isocrática com fase móvel composta por
acetonitrila/água e metanol/água, ambas com 75% de metanol ou acetonitrila e 25%
água. A vazão de 0,2 mL.min
-1
foi escolhida devido a melhor resolução dos picos
obtidos em comparação às vazões de 0,1 e 0,3 mL.min
-1
. Para o estudo de eluição por
gradientes de fase móvel foram utilizados apenas os solventes metanol/água já que
acetonitrila/água obteve um baixo sinal de resposta.
62
A separação cromatográfica dos compostos não é importante quando a detecção é
feita por espectrometria de massas, na qual cada composto produz um espectro
característico (Ribani et al 2004). Tendo em vista essa característica, foi utilizada apenas
uma pré-coluna (phenomenex C18) para a cromatografia devido à complexidade das
amostras que foram preparadas. Apesar do tamanho reduzido (4,0mm), a pré-coluna
obteve os parâmetros necessários (número de pratos teóricos, capacidade) para o seu uso
como coluna principal. Considerando que ocorreu uma concentração no fator de 1000
para os analitos presentes na amostra, a separação por cromatografia apenas seria
bastante difícil, pois a grande quantidade de compostos orgânicos presentes não seriam
separados por colunas maiores resultado em sobreposição de picos e resultados
duvidosos. Em contrapartida, além do tempo de retenção, a detecção por LCMS foi com
base no espectro característico obtido para cada substância, o que torna altamente
específico o resultado obtido, uma vez que o aparelho trabalha com espectros de alta
resolução (10000ppm).
A utilização do gradiente de concentração descrito na Tabela 4.4 mostrou-se
eficaz para a análise dos três compostos de interesse. Mesmo com um tempo total de
análise de 23 minutos, a utilização deste gradiente de concentração é justificável por se
tratar de substâncias químicas pertencentes a classes de compostos que possuem
diferentes propriedades químicas. Esse gradiente foi adequado à detecção não só dos três
compostos, mas também para que ocorresse o condicionamento da coluna para a
próxima análise resultando em uma limpeza adequada da coluna e minimização de
contaminação cruzada.
Com a utilização do gradiente descrito na Tabela 4.4, a análise ocorreu em dois
segmentos. No primeiro segmento (inicial: 30% metanol, 70% água – Final: 85%
metanol, 15% água) era feito o monitoramento dos íons da fenolftaleína (padrão
interno), E2 e EE2 no período de zero a 5,5 minutos. No segundo segmento (inicial: 85%
metanol, 15% água – Final: 100% metanol, 0% água) era feito o monitoramento apenas
do íon nonilfenol no período de 5,6 a 12 minutos. Essa separação favoreceu a obtenção
de picos de maior intensidade, uma vez que seria monitorado o E2 e EE2 no primeiro
segmento e apenas o NP no segundo. Não foi possível a criação de 3 segmentos devido a
eluição conjunta de E2 e EE2 no tempo de retenção de aproximadamente 4,8 minutos. A
Figura 5.3 mostra um cromatograma típico da análise dos PE em questão e seus
respectivos fragmentos.
63
Figura 5.3: Cromatograma típico da análise dos PE em questão: 1 – Fenolftaleína, 2 –
Estradiol, 3 – Etinilestradiol, 4 – ms² Etinilestradiol, 5 – ms² Estradiol, 6 – Nonilfenol , 7
– ms² nonilfenol ). Condições de análise de acordo com a Tabela 4.4.
A análise quantitativa dos três compostos foi realizada com os cromatogramas
obtidos pelo por LCMS-IT-TOF no modo negativo onde foi utilizado a ionização por
eletronspray (ESI) e o gás nitrogênio como nebulizador e Argônio como gás de colisão.
Parâmetros como a temperatura do CDL, voltagem do detector e pressão do gás de
nitrogênio (100 kPA) não foram alterados, sendo utilizados os parâmetros recomendados
pela Shimadzu.
A sensibilidade do aparelho pode ser também relacionada com o tempo de
acumulação dos íons. Devido à alta sensibilidade do NP, o tempo de acumulação de íons
foi reduzido para 30 milisegundos enquanto que para o E2 e EE2 manteve-se o tempo de
acumulação de 100 milisegundos (Tabela 4.4).
A Tabela 5.2 apresenta as fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons
primários (ms
1
) e secundários (ms
2
) que são característicos de cada composto. A Figura
5.4 apresenta os cromatogramas com o ms
1
e ms² característicos de cada composto.
O LC-MS não possui uma biblioteca de espectros característicos para cada
composto, pois não possui uma energia de ionização fixa para a quebra das moléculas
(70eV), como em aparelhos CG-MS. Sendo assim, os íons característicos apresentados
na Tabela 5.2 foram obtidos por meio de análises dos padrões no aparelho LCMS-IT-
TOF sob as condições descritas na Tabela 4.4. Observando-se a Figura 5.4, percebe-se
que os íons secundários possuem uma intensidade relativamente menor em relação aos
íons primários, de forma que eles só podem ser detectados se estiverem presentes em
concentrações mais elevadas. De fato, análises de padrões mostraram que os fragmentos
gerados pelos compostos de interesse só puderam ser detectados em concentrações
acima de 30μg.L
-1
, de acordo com o procedimento adotado.
64
Tabela 5.2 - Fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons primários (ms
1
) e
secundários (ms
2
) característicos para cada padrão utilizado.
Composto Fórmula
Molecular
Tempo de
Retenção
(min)
Íon Primário
(ms
1
)
m/z (negativo)
Íons Secundários (ms
2
)
m/z (negativo)
4-nonilfenol
C
15
H
24
O
7,12 219.17 106.04 (C
7
H
7
O)
n-nonilfenol
C
15
H
24
O
6,65
219.17
147.07 (C
10
H
12
O)
119.04 (C
8
H
8
O)
106.04 (C
7
H
7
O)
Estradiol
C
18
H
24
O
2
4,85 271.17 183.08 (C
13
H
12
O)
145.06 (C
10
H
10
O)
Etinilestradiol
C
20
H
24
O
2
4,95 295.17 185.10 (C
13
H
12
O)
267.14 (C
18
H
20
O
2
)
Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos íons precursores ms
1
e ms² (modos negativo)
característicos de cada composto.
No decorrer do trabalho, anterior as análises de validação e monitoramento, foi
trocado o 4-nonilfenol (4-NP) por nonilfenol mistura técnica (n-nonilfenol ou NP), uma
vez que a amostra ambiental continha outros isômeros de nonilfenol além do 4-NP. A
troca dos padrões foi feita no sentido de permitir a confirmação do tipo de nonilfenol
presente nas amostras, uma vez que o tempo de retenção dos isômeros de nonilfenol e a
65
intensidade do sinal observado no modo ms
1
eram semelhantes. Dessa forma a distinção
entre os padrões foi baseada nos fragmentos de nonilfenol obtidos no modo ms
2
. O 4-NP
basicamente produzia apenas um tipo de fragmento (m/z = 106.04) enquanto que o NP
mistura técnica produzia dois fragmentos de grande intensidade e bastante frequentes
nas amostras analisadas (m/z = 119.06 e 147.04). Esse resultado indicou que as amostras
analisadas continham, além do 4-NP, outros isômeros de nonilfenol, o que também foi
observado por outros pesquisadores (Guenther et al. 2005).
As condições de preparo dos cartuchos de SPE e da pré-coluna foram avaliadas
usando a metodologia descrita nas Tabelas 4.2 e 4.4. As pré-colunas foram trocadas
quatro vezes devido a sua vida útil ser menor em relação às colunas tradicionais, que são
a cada 120 análises aproximadamente, ou em caso de uma separação ineficiente dos
compostos. As quatro pré-colunas utilizadas mantiveram-se adequadas ao uso durante
todo o período de trabalho. A verificação era feita com os padrões em estudo onde era
avaliado o tempo de retenção e a intensidade dos íons obtidos.
5.3. Validação do Método Analítico paraLCMS
5.3.1. Estabilidade
De acordo com as análises para a verificação da estabilidade nos padrões e
amostra em diferentes momentos, constatou-se que houve conformidade do sistema
cromatográfico, ou seja, não ocorreu grande variação no tempo de retenção e nos
resultados obtidos para a concentração das amostras. A Tabela 5.3 apresenta a variação
da concentração dos compostos presentes na amostra Rio das Velhas (fevereiro e
dezembro de 2007). A estabilidade foi avaliada com a análise da amostra imediatamente
eluída e após um e seis meses de conservação (mantido em a -20
o
C sob ausência de
luz). As amostras foram analisadas de acordo com o procedimento descrito na Tabela
4.4, sendo que quantificação dos compostos E2 e EE2 foi feita por padrão externo (Rio
das Velhas – Fev/07) e interno (Rio das Velhas – Dezembro/07). O NP foi quanticado
apenas por padronização externa.
66
Tabela 5.3 – Variação da concentração dos compostos em relação ao tempo de preparo
das amostras.
Rio das Velhas – Fevereiro/2007 Rio das Velhas – Dezembro/2007
Amostra
Análise Imediata
(ng.L
-1
)
Após 1 mês
(ng.L
-1
)
Análise Imediata (ng/L) Após 6 meses
(ng.L
-1
)
NP
44,3 43,8
649,0
632,0
E2
11,8 12,1 0 0
EE2
3,0 3,0 0 0
5.3.2. Seletividade
A seletividade do método cromatográfico empregado também foi verificada
injetando-se os brancos de laboratório obtidos, e observando se havia ou não picos na
região do tempo de retenção dos compostos de interesse, conforme descrito por Lanças
(2004b). A pureza dos picos cromatográficos obtidos para os compostos identificados
nas amostras também foi avaliada, por meio da comparação dos respectivos espectros de
massas com aqueles obtidos para os padrões.
De acordo com a Figura 5.5, no branco (metanol HPLC) observa-se a ausência de
picos nos tempos de retenção de E2 e EE2 enquanto que um pico de baixa intensidade
aparece na região do NP, que mostra a presença de interferentes durante a análise. Como
pode ser observado na Figura 5.5, o interferente não apresenta os fragmentos
característicos (ms
2
) do NP (Tabela 5.2), confirmando que o pico apresentado no
matanol não se trata do alquilfenol em questão. Devido a presença do interferente, a
análise de NP só deve ser feita com a confirmação de seus íons secundários, pois a
presença de apenas um pico com m/z = 219,17 não é suficiente para a caracterização do
mesmo.
Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausência de picos para E2, EE2
(Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presença de interfente no tempo de retenção do
NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito).
67
A Figura 5.6 apresenta uma amostra coletada na entrada da ETA Morro Redondo
à qual foi adicionada os padrões de E2, EE2 e NP nas concentrações de 100μg.L
-1
para
os estrogênios e 200μg.L
-1
para o alquilfenol. De acordo com os picos obtidos para os
compostos (ms
1
e ms
2
), o método cromatográfico é seletivo para a maioria dos
compostos, tanto na determinação dos íons primários quanto secundários, pois a
presença dos espectros relativos dos PE utilizados é confirmada na Figura 5.6. A
determinação empregando o detector de massas ion trap – time of flight (IT-TOF),
possibilita a identificação no cromatograma, do pico referente ao analito de interesse, o
que é feito pelo espectro de massas característico de cada composto, uma vez que a
máquina obtém espectros de altíssima resolução. A comparação pode ser feita pelo
cromatograma dos picos obtidos nos cromatogramas da amostra de Morro Redondo
(Figura 5.6), água bruta, onde foi adicionado 200 μg.L
-1
do NP e 100 μg.L
-1
de E2 e
EE2, comprovando, portanto, a capacidade de análise dos PE nos analitos na matriz.
Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (água bruta) com adição de estradiol e
etinilestradiol (100 μg.L
-1
, quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 μg.L
-1
, quadro da
direita).
5.3.3. Curva Analítica
Neste trabalho, a padronização externa (NP, E2 e EE2) e interna (E2 e EE2)
foram empregadas para a quantificação dos compostos de interesse nas amostras de água
superficial. As soluções de trabalho foram preparadas em metanol a partir da diluição de
uma solução concentrada contendo os três padrões (1,0 mg.L
-1
). Por sua vez, tal solução
foi preparada a partir de uma solução estoque de 1000 mg.L
-1
para cada composto.
Para a curva analítica utilizando a padronização interna, foi adicionada
fenolftaleína a uma concentração de 50 μg.L
-1
nos padrões e na amostra (após todo o
68
processo de preparação). A fenolftaléina pôde ser usada como padrão interno devido a
sua estrutura química ser semelhante a dos estrogênios E2 e EE2, a alta sensibilidade de
análise (tanto no modo negativo quanto positivo) e a sua ausência nas amostras
localizadas na RMBH. Sendo assim, foi possível obter a concentração de E2 e EE2 a
partir da razão entre a área dos estrogênios com a área da fenolftaleína. Para a curva
analítica utilizando a padronização interna e externa, foram consideradas apenas as áreas
dos picos dos íons primários, pois os espectros ms
2
dos PE não apresentaram linearidade
durante a análise.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para cada um dos três
padrões foram determinados pelo método baseado na relação sinal-ruído, no qual os
resultados são apresentados na Tabela 5.4.
Tabela 5.4 – Faixa de trabalho, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF.
Composto Faixa de trabalho
a
(mg . L
-1
)
LD
b
(ng . L
-1
)
LQ
b
(ng . L
-1
)
4-nonilfenol
c
0,030 a 0,400
4,9 16,4
n-nonilfenol
d
0,030 a 0,400 6,5 21,8
17β-Estradiol
d
0,005 a 0,200 1,4 4,7
17α-Etinilestradiol
d
0,005 a 0,200 0,9 3,0
a
Empregando-se soluções-padrão dos compostos em metanol
c
Utilizando padronização externa
b
Considerando-se um fator de concentração de 1000 vezes
d
Utilizando padronização externa e interna
Vale salientar que o LD para um composto utilizando a detecção por IT-TOF é
variável. A sensibilidade da análise pode ser determinada de acordo com o tempo de
acumulação de íon no detector de íon-trap, ou seja, podendo ser aumentada ou
diminuída a partir da escolha. De acordo com a metodologia utilizada (Tabela 4.4)
observa-se que a acumulação dos íons obtidos pelo NP é cerca de três vezes menor
(30milisegundos) devido à elevada intensidade obtida pelo íon gerado. Essa diminuição
foi feita para que se construísse uma curva de calibração com maior intervalo de
concentração, pois se fosse utilizado para o NP o mesmo tempo de acumulação do E2 e
EE2 (100milisegundos) a faixa de linearidade do NP seria menor, de 5 a 200 μg.L
-1
.
Com a diminuição do tempo de acumulação, obteve-se uma linearidade de 30 a 400
μg.L
-1
, e como as amostras analisadas se enquadram nesta faixa de concentração, esse
procedimento foi preferido. Apesar da possibilidade de melhora do LD com o aumento
do tempo de acumulação de íons, existe um valor limite, pois os compostos E2 e EE2
69
sofrem um aumento no ruído de seus cromatogramas caso utilize um tempo de
acumulação acima de 100 milisegundos. Dessa forma, esse seria o melhor valor obtido
para a determinação dos 2 padrões, uma vez que possuem valores aceitáveis para LD e
um nível baixo de ruído.
O limite de quantificação dos três PE analisados pelo método proposto pode ser
considerado satisfatório uma vez que é inferior ao limite de quantificação encontrado no
trabalho de Raimundo (2007) e semelhante a alguns trabalhos internacionais (Kolpin et
al. 2002; Laganà et al. 2004; Yang et al. 2006). Sendo assim, a metodologia aqui
desenvolvida possibilita o monitoramento de estradiol, etinilestradiol e nonilfenol nas
concentrações em que são usualmente reportados na literatura nacional e internacional
(Bruchet et al. 2004; Wang et al. 2005).
5.3.4. Linearidade e Sensibilidade
Dentro das faixas lineares descritas na Tabela 5.3, o método analítico
empregando LCMS-IT-TOF atendeu as exigências do INMETRO em relação à
linearidade em 100 % dos casos, pois o coeficiente de correlação (r) foi superior a 0,90
(Tabela 5.5). Durante a criação das curvas analíticas, foram utilizados sete padrões de
diferentes concentrações que se encontravam na faixa descrita na Tabela 5.4.
Tabela 5.5 – Coeficiente de correlação (r) obtido para os 4 padrões determinados por
LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento.
Valores obtidos dos coeficientes de correlação (r)
Compostos
Fev - Mai Jun - Jul Ago - Set Out-Jan
4-nonilfenol 0,998 0,994 0,993 0,991
Nonilfenol Mistura N.A.
N.A. N.A.
0,997
17β-Estradiol 0,998 0,999 0,999 0,992
17α-Etinilestradiol 0,998 0,999 0,993 0,995
N.A: Não Avaliado
A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente angular da curva analítica, e a
Figura 5.7 apresenta as tendências observadas. Utilizando a metodologia descrita na
Tabela 4.4, pode-se concluir que a sensibilidade foi maior para os nonilfenoís. Pela
Figura 5.7, pode-se observar que a sensibilidade foi semelhante entre os nonilfenóis, e,
com uma sensibilidade menor, para os estrogênios. Essa relação era esperada devido à
semelhança nas estruturas moleculares dos grupos (NP e 4NP; E2 e EE2 – Figura 3.3).
70
Apesar do tempo de acumulação de íons do NP ser menor em relação aos estrogênios, a
sensibilidade deste composto mantém-se elevada mostrando a eficiência da técnica para
a análise de tal composto.
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
0 50 100 150 200 250 300
Concentração (µg/L
)
Área
Nonilfenol Mistura Técnica
Estradiol
Etinilestradiol
4-Nonilfenol
Figura 5.7: Curvas analíticas obtidas com soluções-padrão dos quatro padrões de PE.
5.3.5. Precisão
A precisão instrumental (do método cromatográfico empregado) foi determinada
em condições de repetibilidade, isto é, os resultados foram obtidos utilizando-se várias
injeções em uma mesma amostra, no mesmo laboratório, com o mesmo equipamento e
mesmo operador, e em um curto intervalo de tempo (determinação feita em um único
dia), através da injeção automática em sete replicatas de duas soluções-padrão. A Tabela
5.6 fornece os coeficientes de variação calculados para as áreas obtidos após sucessivas
injeções do padrão.
De acordo com a Tabela 5.6, os coeficientes de variação foram inferiores a 20 %
para todos os compostos, apresentando-se próximos a 5 % para o estradiol e
etinilestradiol e de 12% para o nonilfenol. Esses valores foram considerados suficientes
para a análise em soluções padrão, pois geralmente o valor máximo de CV é definido de
acordo com o procedimento empregado, a concentração na amostra, o tipo de matriz e a
finalidade do método.
71
Tabela 5.6 – Repetibilidade dos resultados obtidos para soluções-padrão dos três PE
expressa por meio do coeficiente de variação (CV).
Coeficiente de Variação – CV (%) Composto
E2 e EE2(20 μg . L
-1
)
NP (50 μg . L
-1
)
E2 e EE2(130 μg . L
-1
)
NP (300 μg . L
-1
)
E2
6,5 8,4
EE2
13,3 10,6
NP
3,3 4,5
O INMETRO não recomenda valores de CV superiores a 20 % (INMETRO,
2003), e como não há uma legislação específica para a determinação desses PE em águas
superficiais, os limites admitidos para CV podem variar dependendo se a validação é
feita com padrões ou com amostras ambientais (água superficial). No caso de validação
com amostras ambientais os limites de CV podem ser menos rigorosos (acima de 20%),
uma vez que a análise é feita em uma matriz mais complexa (Raimundo, 2007).
5.2.6 Ensaio de Supressão
Trabalhos como de Snyder (2007), Vilagrassa et al (2007) e Lagana et al (2004)
evidenciam a ocorrência de efeito supressivo em análises de amostras ambientais, devido
a grande quantidade de compostos orgânicos presentes. Para verificar uma possível
variação na intensidade dos cromatogramas dos PE em questão foi estabelecido um
procedimento para a verificação do efeito supressivo em amostras reais. Portanto, para
analisar o efeito de supressão em amostras ambientais, triplicatas de amostras de água
bruta coletadas na ETA Morro Redondo (fev. 2008), foram fortificadas (spikes) com 20
µg.L
-1
de E2 e EE2 e com 50 µg.L
-
¹ de NP e fenolftaleína (padrão interno) após as
amostras terem sido submetidas a todo o processo de preparação (extração e eluição). O
resultado obtido foi então subtraído da intensidade obtida com a análise da amostra
original (antes da adição dos padrões). A Tabela 5.7 apresenta os resultados obtidos para
o teste de supressão.
Os resultados mostraram que o E2 é a substância que mais sofre supressão nas
amostras enquanto que no NP não ocorre supressão. Isso ocorre devido a grande
quantidade de NP presente nas amostras analisadas, pois o efeito supressivo ocorre
geralmente em compostos de menor concentração, como o E2 e o EE2.
72
Tabela 5.7 – Resultados dos testes de supressão realizados com amostras coletadas na
entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008).
Substância
E2
1
EE2
2
NP
3
Fenolftaleína
Área média obtida pelo spike
a
2579879 39655940 11787781 21315526
Área teórica
b
2842807 42105894 11563345 22864172
Supressão (%)
c
9,25 5,82 -1,94 6,77
1- Estradiol; 2 – Etinilestradiol; 3 – Nonilfenol
a
Valor subtraído da amostra sem adição.
b
Calculada através da equação obtida com a padronização externa.
c
Calculado a partir da equação 4, item 4.2.6.
A utilização da fenolftaleína como padrão interno pode ser usada para a correção
das áreas de E2 e EE2, uma vez que a supressão dos estrogênios e da fenolftaleína foram
bastante semelhantes. De acordo com Ribani et al (2004), o método de padronização
interna é extremamente útil, especialmente pelo fato de que ela independe de pequenas
mudanças em variáveis experimentais.
A padronização interna é muito utilizada para a quantificação dos compostos por
cromatografia líquida e gasosa (Gibson et al. 2007; Wang et al. 2005; Yang et al. 2006;
Zhang et al. 2006). Geralmente, compostos deuterados são utilizados para comparar seu
comportamento em relação aos não-deuterados, uma vez que possuem a mesma estrutura
e praticamente não estão nas amostras (Snyder 2007). Mas a dificuldade de importação e
o alto custo desses compostos dificultam a utilização destes para tal fim em instituições
brasileiras. A utilização da fenolftaleína apresenta bons resultados obtendo uma boa
relação custo/benefício sendo uma grande aliada na confiabilidade dos resultados
adquiridos.
Devido a estes fatores e a grande quantidade de NP nas amostras, não foi
observado seu efeito supressivo, uma vez que não houve diminuição da área de seus
picos na amostra. Portanto, a curva de calibração de nonilfenol não poderá ser
determinada em função do padrão interno, pois a fenolftaleína sofre o processo de
supressão e a sua utilização pode comprometer os resultados. Pelos resultados obtidos,
os cálculos de concentração com base na fenoltaléina como padrão interno foram feitos
apenas com E2 e EE2. Em todas amostras que foram adicionadas fenolftaleína como
padrão interno foram observadas variações de intensidade, confirmando o efeito
supressivo.
A Tabela 5.8 apresenta a variação do efeito supressivo da fenolftaleína
encontrado em algumas amostras de água bruta. Os resultados mostram que a variação
73
da intensidade da fenolftaleína não é constante, pois a supressão varia em todas as
amostras, uma vez que a sazonalidade e o tipo poluição despejada nos mananciais
influenciam a característica da matriz.
Tabela 5.8 – Variação da supressão nas amostras de água bruta no mês de janeiro 2008
Amostra
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Obtido Teórico
a
Obtido Teórico Obtido Teórico
Área do
cromatograma
de Fenolftaleína
41832358
44009401
27196706
41649946
41349854
41649946
Supressão
c
(%)
5,0 34,7 0,7
a
Calculado a partir da área média obtida na curva analítica com padrões em metanol
c
Calculado a partir da equação 4, item 4.2.6.
De acordo com a tabela 5.8, quanto maior a quantidade de matéria orgânica
presente na água, maior o efeito supressivo, pois o reservatório de Vargem das Flores é o
que recebe maior quantidade de esgoto doméstico, conforme percebido pelo elevado
grau de eutrofização (Jardim e Viana 2003).
5.3.7 Ensaio de Recuperação
A eficiência da extração em fase sólida foi avaliada por meio de teste de
recuperação dos compostos estudados. Para o cálculo da porcentagem de recuperação
em amostras ambeintais, foram preparadas triplicatas de amostras de água bruta
provenientes da ETA Morro Redondo (fev. 2008) devidamente enriquecidas com 20,
100 e 200 ng L
-1
para E2 e EE2 e com 300 ng.L
-1
para NP. Neste experimento, a
extração em fase sólida foi feita seguida da eluição dos compostos em duas alíquotas de
cinco mililitros de acetato de etila, conforme recomendado por Wang et al (2005) e
detalhado no Capítulo 4.
Na Tabela 5.9 são apresentados os resultados obtidos para o teste de recuperação
em função da adição de E2, EE2 e NP. A recuperação dos compostos foi calculada por
partir da equação presente no item 4.2.7. Observa-se que a porcentagem de recuperação
dos compostos variou em função da concentração adicionada (80 a 110%), obtendo uma
recuperação média de 96% para E2, 90% para EE2 e 96% para o NP. Este resultado é
satisfatório considerando-se que estas substâncias pertencem a diferentes classes de
compostos e os valores obtidos encontram-se dentro do intervalo de recuperação
74
reportado na literatura, que seria de 70 a 120% (Wang et al 2005). Devido à grande
quantidade de NP presente na amostra bruta, não foi possível avaliar a recuperação do
NP a baixas concentrações, uma vez que em baixas adições, somadas a grande
quantidade de NP (acima de 100 ng.L
-1
, em média) e a complexidade presente na
amostra bruta, pode ocorrer uma grande oscilação de valores, acarretando em resultados
contraditórios. Para corrigir este problema, a recuperação poderia ser feita com amostras
sem a presença do NP, como a água deionizada. Entretanto, os resultados obtidos por
este tipo de experimento podem gerar resultados equivocados, pois a ausência de
interferentes na amostra acarretaria em uma melhor eficiência de recuperação
apresentando um comportamento diferente em relação a amostras reais.
Tabela 5.9 – Valores obtidos pelos ensaios de recuperação de E2, EE2 e NP em função
da fortificação das amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo.
E2 (ng.L
-1
) EE2 (ng.L
-1
) NP (ng.L
-1
)
C.Esp. C. Obs. % Rec. C.Esp. C. Obs. % Rec. C.Esp. C. Obs. % Rec.
20 21,29 106,45 20 21,75 108,75
100 83,15 83,15 100 79,77 79,77
200 197,72 98,86 200 165,61 82,80
300
288
96
Considerando que em amostras ambientais espera-se que encontre os PE
próximos às concentrações utilizadas para fazer o teste de recuperação, a eficiência da
extração em fase sólida foi considerada satisfatória (Tabela 3.4). Essa variação na
eficiência de extração para os diferentes compostos se deve ao fato de se tratar de
substâncias químicas muito diferentes e que sofrem interações distintas com o meio
adsorvente.
5.3.8. Ensaio de calibração interlaboratorial
A avaliação da precisão do método de análise foi feita comparando os resultados
obtidos pelas metodologias de imunoensaio (kit ELISA) e LCMS. Os ensaios
consistiram em análises de amostras identicamente preparadas e de padrões dos
respectivos compostos. A Tabela 5.10 apresenta os resultados obtidos para a
intercalibração feita entre o DEQUI-UFOP e o CIRRA-USP.
De acordo com a Tabela 5.10, pode-se observar que os padrões de E2 e EE2
apresentaram resultados semelhantes, enquanto que na amostra real os resultados foram
75
bem diferentes. O NP foi o composto que teve a maior divergência dos 3 analisados,
sendo que o 4NP foi detectado com uma concentração cerca de 30 vezes menor para o
método ELISA em relação ao valor obtido por LCMS.
Em relação à amostra Rio das Velhas fev/2008 podemos observar que as maiores
divergências ocorreram em relação ao EE2 e E2. Apesar do valor de EE2 ter sido 10
vezes menor para o método ELISA, vale salientar que o valor obtido por LCMS
encontra-se abaixo do Limite de Quantificação (3,0 µg. L
-1
), podendo gerar valores
imprecisos. Quanto ao E2, o fato dele não ter sido detectado por LCMS e ter sido
detectado no kit ELISA pode ser devido ao método ELISA não quantificar somente o
17β-Estradiol durante a análise do estradiol. De acordo com Nogueira (2003) e Farré et
al (2007) o método ELISA pode sofrer interferência de diversos estrogênios como a
estrona, estriol e estradiol sendo que os traços de estrogênios podem interferir nas
análises de NP e vice versa, o que justificaria a concentração mais elevada de NP na
amostra bruta e menor quantidade nos padrões de NP comparados a metodologia do
LCMS. Portanto este fator pode explicar parte da discrepância dos resultados obtidos.
Tabela 5.10 - Resultados obtidos pela calibração interlaboratorial entre UFOP e CIRRA.
Resultados das análises
Laboratóriais
Amostras
Concentração
teórica
UFOP (LCMS) CIRRA (ELISA)
Concentração de NP - 200 µg. L
-1
280 µg. L
-1
Concentração de E2 - < LD 8,78 µg. L
-1
A
Rio das
Velhas
fev/2008
Concentração de EE2 - 2,68 µg. L
-1
0,28 µg. L
-1
A
4-NP (P. Sigma) 200µg. L
-1
215 µg. L
-1
24,3 µg. L
-1
A
NP Mistura técnica (P. Sigma) 200µg. L
-1
165 µg. L
-1
5,2 µg. L
-1
A
E2 (P. Sigma) 15µg. L
-1
15,0 µg. L
-1
17,3 µg. L
-1
A
EE2 (P. Sigma) 15µg. L
-1
17,6 µg. L
-1
15,2 µg. L
-1
B
EE2 (pílula anticoncepcional) 35µg. L
-1
33,4 µg. L
-1
42 µg. L
-1
B
EE2 (pílula anticoncepcional) 35µg. L
-1
34,5 µg. L
-1
42 µg. L
-1
A
Preparadas no DESA-UFMG
B
Preparadas no CIRRA
Em relação aos padrões puros contendo os PE em questão, o resultado foi
considerado satisfatório para E2 e EE2, pois as amostras enviadas/recebidas pelo
DEQUI-UFOP e CIRRA-USP tiveram resultados bastante semelhantes, confirmando a
exatidão e a precisão do método. Quanto ao 4NP, considerando que o ELISA utiliza
anticorpos e receptores específicos para suas análises (Nogueira, 2003), possivelmente
76
não pode ser detectado com grande eficiência. Considerando que a metodologia LCMS
analisa todos os isômeros de NP com m/z de 220,19 a dosagem de NP deveria ser mais
exata em relação ao método de imunoensaio.
5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos em Mananciais da Região
Metropolitana de Belo Horizonte
Para a determinação dos três compostos nas matrizes aquáticas foram feitas doze
campanhas amostrais nos três mananciais estudados (Rio das Velhas, Vargem das Flores
e Morro Redondo). O monitoramento pelo período de um ano permitiu avaliar uma
possível correlação entre a influência da sazonalidade com a concentração dos PE nos
corpos d’água. A Figura 5.8 apresenta a variação da precipitação de chuva durante o
período de amostragem na RMBH.
0
50
100
150
200
250
300
350
feb/07 mar/07 apr/07 may/07 jun/07 jul/07 aug/07 sep/07 oct/07 nov/07 dec/07 jan/08
Precipitação (mm)
Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o período de monitoramento
(fev/07 a jan/08). Fonte: Site do INMET (Instituto Nacional de Meteorologia).
A Figura 5.8 confirma o quadro típico de chuvas na região sudeste brasileira,
com escassez de chuvas no período de maio a setembro e maior pluviosidade no período
de novembro a fevereiro. Tais resultados serão utilizados para tentar explicar a variação
sazonal dos PE nos mananciais monitorados.
77
Durante o período de amostragem, a partir do mês de junho, foram adicionadas
ao monitoramento amostras de água oriundas dos tratamentos das respectivas ETA’s
(coletadas antes da etapa de desinfecção com cloro), com o objetivo de avaliar, de forma
preliminar, a eficiência de remoção dos compostos estudados pelos processos de pré-
cloração, coagulação/decantação e filtração. Além disso, com o intuito de futuras
análises de outras classes de PE, buscou-se uma avaliação da presença de “bisfenol A”
nas amostras coletadas no último mês de amostragem (jan/2008), onde foi possível
confirmar que tal pertubador endócrino é importante e bastante prevalente nos
mananciais analisados.
Considerando-se as 72 amostras de água bruta coletadas, referentes aos três
locais de coleta e às doze campanhas amostrais, em 100% das amostras foram detectadas
um dos três perturbadores endócrinos de interesse desse trabalho. Este resultado é
bastante similar ao encontrado em estudos realizados pela Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP) que avaliaram a presença de 15 compostos em 5 corpos de água
na Região Metropolitana de Campinas encontrando traços de substâncias emergentes em
94 % das amostras (Raimundo, 2007). Mais do que isso, estes resultados mostram a
relevância dos três compostos classificados como perturbadores endócrinos selecionados
no presente trabalho quanto à possibilidade de serem encontrados em águas naturais. Os
três PE de interesse foram detectadas ao menos uma vez em cada amostra.
Dentre os três perturbadores endócrinos quantificados, o NP foi encontrado em
maior número de vezes (100%) nas 72 amostras analisadas. Os estradióis natural (E2) e
sintético (EE2) apareceram em 19% das amostras. As concentrações encontradas para
NP, E2 e EE2 são apresentadas na Figura 5.9 onde se observa que as suas concentrações
variaram em até duas ordens de magnitude para NP. Ao contrário do comportamento
observado para o NP, os estradióis apresentaram baixa prevalência e estavam presentes
em concentrações bem menores nos mananciais estudados. As concentrações de NP em
água bruta variaram de 44 a 1918 ng. L
-1
enquanto que para o EE2 foram detectados
valores na faixa de 3,0 a 54,0 ng.L
-1
. Para o E2 as concentrações observadas foram ainda
menores, com valores na faixa de 1,5 a 36,0 ng. L
-1
.
Um dos fatores que poderiam justificar a grande quantidade de NP nas amostras
analisadas seria o aporte de esgoto doméstico. Considerando as diversas fontes, o NP é
originado principalmente de produtos de limpeza que contém surfactantes, como os
detergentes (USEPA, 2001). Segundo o estudo de Soto et al (1991),o nonilfenol é usado
78
como aditivo plastificante na produção de PVC e poliestireno, podendo ainda ser
lixiviado de tubulação feita com esses polímeros.
Em relação ao E2 e EE2, uma menor concentração de ambos em relação a NP
pode ser devido ao fato deles possuírem maior biodegradabilidade, uma vez que o E2 é
excretado naturalmente por homens e mulheres, principalmente as grávidas (Bila e
Dezotti, 2007).
Os padrões de NP, E2 e EE2 assemelham muito aos trabalhos realizados por
Gibson et al (2008), Kolpin et al (2002) e Kuch e Ballschmiter (2001) onde foi
encontrado em maior quantidade o NP seguido por EE2 e E2 respectivamente. Eles
também sugerem que os valores obtidos são atribuídos principalmente ao esgoto
doméstico.
0
500
1000
1500
2000
Concentração (ng. L
-
1
)
Nonilfenol (n=72)
0
10
20
30
40
50
60
Concentração (ng. L
-1
)
Etinilestradiol (n=14)
Estradiol (n=14)
Figura 5.9: Box-plot da concentração dos três compostos determinados nos mananciais
estudados em todas as campanhas amostrais. Água Bruta.
79
As concentrações de NP nos mananciais analisados (entrada da ETA e saída do
filtro) e sua variação durante o período de fevereiro/2007 a janeiro/2008 são
apresentadas na Tabela 5.11 onde nota-se que tal alquilfenol foi encontrado em quase
todos os pontos amostrais e em todas as campanhas, com exceção na amostra referente
ao mês de junho 2007, na saída do filtro na ETA Vargem das Flores. Maiores
concentrações de tal pertubador endócrino foram determinadas no mês de agosto/07 nos
mananciais de Morro Redondo e Rio das Velhas e em outubro/07 em Vargem das
Flores, contemplando o período de seca que pode justificar a elevada concentração de tal
composto na água. Uma vez que a amostra de Vargem das Flores foi coletada no início
do mês de outubro, as chuvas ocorridas neste mês não tiveram influência na sua alta
concentração. A Figura 5.10 apresenta a variação do nonilfenol no período analisado.
Tabela 5.11 - Concentração de nonilfenol (ng.L
-1
) encontrada durante as campanhas de
amostragem.
Concentrações (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Meses
Bruta Água Filtrada
a
Bruta Água Filtrada Bruta Água Filtrada
Fevereiro
44,4 N.A
b
47,9 N.A 42,8 N.A
Março
68,2 N.A 63,7 N.A 41,8 N.A
Abril
65,6 N.A 110,2 N.A 40,1 N.A
Maio
161,7 N.A 139,2 N.A 176,6 N.A
Junho
263,1 225,3 260,4 < L.D.
c
318,8 5,7
Julho
294,4 221,3 156,4 128,4 329,2 226,8
Agosto
1045,1 683,1 719,1 41,4 865,7 151,5
Setembro
723,0 397,5 412,2 333,4 747,3 565,4
Outubro
428,1 32,4 1918,2 254,2 554,3 229,4
Novembro
436,0 256,2 447,0 412,4 310,2 265,3
Dezembro
649,0 488,9 543,9 504,1 575,6 577,8
Janeiro
387,5 N.A 513,7 465,0 605,5 472,1
a
Anterior ao processo de cloração, ocorreu apenas pré-cloração.
b
Não Analisado
c
Abaixo do Limite de Detecção (6,5 ng.L
-1
)
80
0
500
1000
1500
2000
2500
fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
Concentração (ng.L-¹)
Rio Das Velhas
Vargem Das Flores
Morro Redondo
Figura 5.10: Variação da concentração de nonilfenol em água bruta nos mananciais
durante o período de fev/07 a jan/08
De acordo com a Figura 5.10 pode-se observar uma concentração relativamente
baixa de NP no primeiro semestre de 2007. Apesar dos resultados aparentemente
contraditórios nenhum equívoco foi observado durante as análises, uma vez que as
curvas de calibração feitas durante este período obtiveram excelentes correlações
lineares, mostrando que os resultados eram confiáveis.
A Figura 5.11 (esquerda) apresenta um cromatograma típico de amostra coletada
no Rio das Velhas (nov. 2007) onde são evidenciadas a ausência do 4-NP (ausência do
íon m/z = 106.04) e a presença de vários outros isômeros de nonilfenol, caracterizados
pelos picos m/z = 147 (mais característico), m/z = 175,11 e m/z = 119,04. A Figura
também apresenta algumas das 550 estruturas possíveis de NP existentes (direita)
(Guenther et al. 2005).
81
Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas – Nov. 2007 e
as diferentes fragmentações (ms²) de seus isômeros (esquerda). Exemplos de estruturas
químicas de 5 dos 550 Isômeros de nonilfenol existentes (direita). Fonte: Guenther et al,
2005.
As concentrações encontradas para o NP são até de nove vezes maiores do que
àquelas encontradas em mananciais de Campinas onde Raimundo (2007) utilizou a
técnica de Cromatografia Líquida acoplada ao detector Arranjo de Diodo (HPLC-DAD)
para a detecção de nonilfenol (isômeros). Em relação aos trabalhos internacionais
publicados, a concentração de NP encontrada nos três mananciais estudados é
semelhante aos valores encontrados em Roma (manancial não informado), Itália (Laganà
et al. 2004) e corresponde a 30% dos valores médios encontrados em Guangdong
(manancial não informado), China (Yang et al. 2006).
Apesar dos valores encontrados nas águas da Região Metropolitana de Belo
Horizonte serem relativamente altos em comparação a maioria dos dados de
monitoramento apresentados na Tabela 3.5, vale salientar que o método utilizado neste
trabalho quantificou todos os isômeros de nonilfenol presentes, utilizando o padrão de
nonilfenol mistura técnica, enquanto que alguns trabalhos quanticaram o NP com base
na presença do nonilfenol linear ou 4-NP (Kolpin et al. 2002; Wang et al. 2005). O 4-NP
não foi detectado na maioria das amostras analisadas nesse trabalho, e tal afirmação é
82
baseada no monitoramento dos íons secundários com valores de m/z iguais a 106.04,
específicos para o 4-NP.
A Figura 5.12 apresenta a variação da concentração de NP ao longo do ano nos
três locais de amostragem. A maior variabilidade foi verificada no reservatório de
Vargem das Flores, onde se observou uma variabilidade na concentração de NP em até 3
ordens de magnitude, enquanto que a menor diferença foi encontrada no Rio das Velhas
onde as concentrações médias e mediana foram em torno de 250 ng. L
-1
. De Modo
geral, os três locais apresentaram 75% dos dados com concentrações variando de 40 a
500 ng. L
-1
mostrando que os três locais apresentam semelhança quanto a quantidade de
nonilfenol.
0
500
1000
1500
2000
Morro Redondo
(n=24)
Vargem das Flores
(n=24)
Rio Das Velhas
(n=24)
Concentração (ng.L
-1
)
Figura 5.12: Boxplot da concentração de nonilfenol na água bruta nos 3 mananciais.
A Figura 5.13 apresenta o índice de remoção (calculado de acordo com a equação
6, item 4.3) de NP pelas ETA’s em questão. Percebe-se que há variabilidade na
eficiência de remoção, o que pode ser explicado em parte pelo fato da coleta ter sido
pontual, ou seja, não foi considerado o tempo de reteção hidráulico entre a pré-cloração
e o processo de filtração, que situa-se na faixa de 2 a 4 horas (COPASA). Outro fator é a
diferença entre os processos de tratamentos das ETAs, como a estação de Vargem das
flores, onde não utiliza o processo de decantação . De acordo com os resultados obtidos,
nota-se que a eficiência de remoção foram variados, com uma média de 35%. Todavia,
83
os resultados mostraram que o processo de pré-cloração (1,5 a 2,0mg.L
-1
, 2 a 4 horas de
contato) empregados nas 3 ETA’s não foram capazes de renover completamente tal
alquilfenol. Uma das causas poderia ser a competição com contaminantes inorgânicos
(ferro e manganês por exemplo) pela oxidação do cloro. Possivelmente o nonilfenol
restante seja oxidado após o processo de filtração, durante a etapa de desinfecção.
Futuros monitoramento após todo o processo de tratamento são necessários para uma
melhor averiguação da remoção de nonilfenol no tratamento convencional de água.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
jun jul ago set out nov dez jan
Eficiência de Remoção (%)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.13: Índice de remoção de NP (água bruta – água filtrada) durante as
campanhas de junho 2007 a janeiro 2008.
O NP pertence à classe dos alquilfenóis, e compostos pertencentes a esta classe
são bastante utilizados como surfactantes na fabricação de produtos de limpeza,
plastificantes na preparação de resinas fenólicas, polímeros, agentes de cura e
antioxidantes (USEPA 2001). Em um levantamento da ocupação humana à margem do
Rio das Velhas, do sistema Morro Redondo e do reservatório de Vargem das Flores
foram observados que em locais afastados das respectivas ETAs, ocorre a emissão de
esgotos domésticos (nos três) e efluentes industriais (Rio das Velhas) onde se destacam
uma fábrica de reciclagem de plástico e indústrias de produtos de limpeza. Portanto,
como as concentrações de NP na ETA Morro Redondo foram bastante semelhantes à
encontrada nos outros dois mananciais, percebe-se que a água proveniente do Ribeirão
Mutuca, Fecho e Cercadinho encontram-se possivelmente em processo de degradação,
uma vez que têm ocorrido ocupações de residências próximas a estes locais (ALMG,
84
2008). A presença de tais emissões mostra que a atividade antrópica contribui para as
emissões de NP nas regiões estudadas.
O E2 foi detectado em 14 das 72 amostras de água bruta analisadas nesse
trabalho. A Tabela 5.12 e a Figura 5.14 apresentam as concentrações desse esteróide
determinadas nas amostras durante as campanhas.
Tabela 5.12 - Concentração de 17β-estradiol (ng . L
-1
) encontrada durante as campanhas
de amostragem.
Concentrações (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Meses
Bruta Água Filtrada
a
Bruta Água Filtrada Bruta Água Filtrada
Fevereiro
11,8 N.A
b
< L.D. N.A < L.D. N.A
Março
4,1 N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Abril
36,8 N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Maio
< L.D.
c
N.A < L.D. N.A 6,2 N.A
Junho
1,5 < L.D. 21,3 10,0 < L.D. < L.D.
Julho
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Agosto
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Setembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. 8,5 5,9
Outubro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Novembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Dezembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Janeiro
< L.D. N.A < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
a
Anterior ao processo de cloração. Apenas pré-cloração.
b
Não Analizado
c
Abaixo do Limite de detecção (1,4 ng.L
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
Concentração (ng.L-¹)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.14: Variação da concentração de estradiol em água bruta nos mananciais
durante o período de fev/07 a jan/08
85
De acordo com a Tabela 5.12 o E2 foi quantificado principalmente no Rio das
Velhas durante o período de fevereiro a abril de 2007. As concentrações nos três locais
variaram entre 1,5 a 36,8 ng.L
-1
, evidenciando a degradação de ambos os corpos de água
em função da atividade antrópica (Bila e Dezotti 2007). Na entrada das ETA’s de Morro
redondo e Vargem das Flores foi detectadas o E2 apenas uma vez durante os meses de
maio (6 ng.L
-
) e junho (21 ng.L
-1
) respectivamente.
Com o início das coletas do efluente após filtração nas 3 ETA’s, o Rio das
Velhas apresentou remoção de 100% enquanto que em Vargem das Flores e Morro
Redondo a remoção média foi 52% e 30% respectivamente, evidenciando a ineficiência
de remoção de E2 em algumas amostras (Tabela 5.12). Comparando-se os valores
encontrados entre os períodos de seca e chuva durante o ano (Figura 5.9), observa-se que
a concentração de E2 parece não sofrer influência, mas existem poucos dados para uma
conclusão mais precisa. Os resultados mostraram que o estrogênio esteve presente tanto
em períodos de chuva quanto de seca.
De acordo com a Tabela 3.5, essas concentrações são semelhantes aos trabalhos
internacionais de Liu et al (2004b), Bruchet et al (2004) e Quintana et al (2004). Em
relação a trabalhos nacionais, a concentração foi menor em relação ao trabalho efetuado
por Raimundo (2007), onde foi encontrado uma concentração de até 1,3 μg . L
-1
nos rios
localizados próximo a região metropolitana de Campinas.
O EE2 foi detectado em 14 das 72 amostras de água bruta analisadas nesse
trabalho. A Tabela 5.13 e a Figura 5.15 mostram as concentrações desse esteróide
determinadas nas amostras durante as campanhas. As concentrações encontradas nos
mananciais variaram na faixa de 3 a 54 ng .L
-1
, tendo sido detectado com maior
frequência nos meses de dezembro e junho. Em períodos de estiagem, o EE2 foi
encontrado durante o mês de junho no Rio das Velhas e em Vargem das Flores nas
concentrações de 15,5 e 6,7 ng .L
-1
respectivamente, e no mês de setembro em Morro
Redondo na concentração de 13 ng .L
-1
.
O EE2 é um hormônio sintético utilizado principalmente em medicamentos
anticoncepcionais. No corpo humano, apenas 15 % da substância é metabolizada
enquanto que o restante é eliminado pela urina. Devido a esta característica, o EE2 pode
ser considerado como um indicador de atividade artrópica (Raimundo 2007). Assim,
como o E2, o EE2 é encontrado em águas superficiais de países como China, Estados
Unidos e Reino Unido em concentrações entre 0,3 e 7,6 ng L
-1
(Wang et al, 2005;
Snyder et al, 1999 e Liu et al, 2004a). As concentrações máximas detectadas
86
assemelham-se àquelas encontradas em efluentes domésticos dos Estados Unidos
(Kolpin et al, 2002) mostrando mais uma vez a influência do esgoto doméstico. Em
relação ao levantamento feito por Raimundo (2007) as concentrações de EE2
encontradas na RMBH foram de até 80 vezes menores em relação à região
Metropolitana de Campinas, onde foram encontradas concentrações de até 4,4 μg . L
-1
.
Tabela 5.13 - Concentração de 17α-etinilestradiol (ng . L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem.
Concentrações (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Meses
Bruta Água Filtrada
a
Bruta Água Filtrada Bruta Água Filtrada
Fevereiro
3,0
N.A
b
< L.D. N.A < L.D. N.A
Março
< L.D.
N.A 31,6 N.A < L.D. N.A
Abril
< L.D.
N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Maio
< L.D. N.A < L.D. N.A < L.D.
N.A
Junho
15,5
14,8 6,7
< L.D. < L.D. < L.D.
Julho
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Agosto
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Setembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. 13,0 7,9
Outubro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Novembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Dezembro
< L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Janeiro
< L.D. N.A 54,0 < L.D. 35,0 22,1
a
Anterior ao processo de cloração. Apenas pré-cloração.
b
Não Analizado
c
Abaixo do Limite de detecção (0,9 ng.L
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
Concentração (ng.L-¹)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.15: Variação da concentração de etinilestradiol em água bruta nos mananciais
durante o período de fev/07 a jan/08.
87
Com o monitoramento na filtrada da ETA (anterior à cloração) a partir do mês de
junho 2007, foi avaliada a eficiência de remoção do EE2 (Figura 5.16). Observa-se que a
ETA Vargem das Flores obteve resultados satisfatórios de remoção, pois não foi
detectado o composto na saída do filtro de areia. Em relação à amostra de Rio das
Velhas e Morro Redondo os índices de remoção foram inferiores variando de 4,5 a 40%
respectivamente. Conforme discutido anteriormente, é preciso cautela na interpretação
desses resultados tendo em vista que a coleta das amostras foi feita de forma pontual, e
que é possível haver variações na concentração dos PE na água bruta ao longo do dia.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
jun jul ago set out nov dez jan
Eficiência de Remoção (%)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.16: Índice de remoção (água bruta – água filtrada) de EE2 nas campanhas de
junho 2007 a janeiro 2008.
Um levantamento preliminar em relação à presença do bisfenol A nos corpos
d’água foi avaliado no final da campanha de monitoramento, quando o padrão de tal
composto foi adquirido. O bisfenol A é uma substância amplamente utilizada nos
processos industriais. A principal aplicação é como monômero na produção de
policarbonato e resinas-epóxi além de aditivos de resinas de poliéster-estireno
insaturadas e retardantes de chama. Compostos persistentes à biodegradação, possuem
um tempo de meia-vida em águas superficiais de 1 a 150 dias. A maior contribuição é
devida aos processos de produção e manufatura do bisfenol A, despejos de efluentes
industriais sem tratamento adequado, e uma pequena contribuição pode ser atribuída à
lixiviação dos produtos finais de consumo como embalagens plásticas (USEPA, 2001).
De acordo com as 12 amostras coletadas durante o período de janeiro de 2008,
em 100% dos casos foi confirmada a presença deste PE, inclusive após o tratamento
(exceto desinfecção) nas ETAs. A Figura 5.17 apresenta a amostra de Rio das Velhas
onde pode ser observada a presença do composto e a estrutura química do Bisfenol A.
88
Figura 5.17: Confirmação da presença de Bisfenol A na água a partir do LCMS.
Amostra: Rio das Velhas - Janeiro de 2008.
Uma análise estatística dos dados cromatográficos referentes às amostras de
jun/07 a set/07 foi feito, para avaliar o perfil das amostras estudadas, utilizando apenas o
método SCAN, onde as análises são feitas a partir do monitoramento da intensidade
compostos orgânicos presentes com a relação massa/carga de 100,00 a 900,00 m/z nas
amostras estudadas (80000 dados por amostra). Os dados compilados são apresentados
na Figura 5.18 onde foi utilizado o método de Análise da Componente Principal (PCA),
uma técnica estatística poderosa que pode ser utilizada para redução do número de
variáveis e para fornecer uma visão estatisticamente privilegiada do conjunto de dados
(Sousa et al. 2006). Com base na Figura 5.18, pode-se observar que as amostras dos
distintos mananciais diferem entre si, pois aparecem de forma separada no gráfico PCA1
versus PCA2. Isso ocorre possivelmente devido à presença diferenciada nos mananciais
de outros compostos orgânicos (Ex. ácidos húmicos e fúlvicos, compostos orgânicos
sintéticos), uma vez que os dados compilados foram feitos a partir do monitoramento
dos íons detectados (50 a 900 m/z) nas amostras estudadas.
A Figura 5.18 mostra ainda que as amostras da entrada e da saída de cada ETA
estão agrupadas, sugerindo que elas têm o mesmo perfil químico do ponto de vista dos
compostos orgânicos detectados no LC-MS. Tais resultados são preliminares mas
indicam que o perfil químico da amostra de água bruta não se difere muito da água
tratada.
Análises físico-químicas de pH, turbidez e cor foram feitas juntamente com as
análises de PE para todas as amostras referentes a água bruta. Os dados obtidos são
apresentados nas Tabelas 5.14, 5.15 e 5.16. O monitoramento de tais parâmetros nos
mananciais é apresentado nas Figuras 5.19 a 5.22.
89
Figura 5.18: Análise quimiométrica das amostras referentes aos meses de jun/07 a
set/07 com base no PCA
Tabela 5.14 – Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (água bruta).
Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uH) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07 7,8 11,5 106 N.A.
1
Março/07 8,1 14,3 86 N.A.
Abril/07 7,4 67,5 427 N.A.
Maio/07 7,6 5,7 75 N.A.
Junho/07 7,4 3,6 36 N.A.
Julho/07 6,8 4,3 36 N.A.
Agosto/07 7,8 6,9
57
N.A.
Setembro/07 6,8 5,4
52
5,6
Outubro/07 6,0 13,1 89 13,8
Novembro/07 5,9 217,0 1319 19,1
Dezembro/07 6,3 56,1 241 10,0
Janeiro/08 6,1 93,3 440 13,7
1
N.A.: Não analisado
90
Tabela 5.15 – Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (água bruta).
Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uH) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07
7,6 4,7 106
N.A.
1
Março/07
7,8 2,3 44
N.A.
Abril/07
7,2 4,8 86
N.A.
Maio/07
7,9 2,7 34
N.A.
Junho/07 7,1 1,4 164 N.A.
Julho/07 7,3 2,1 30 N.A.
Agosto/07 7,3 3,9
39
N.A.
Setembro/07 7,1 N.A. N.A. N.A.
Outubro/07 6,6 3,3 54 3,1
Novembro/07 7,6 2,0 80 0,3
Dezembro/07 7,2 2,9 16 N.A.
Janeiro/08 6,8 2,1 22 N.A.
1
N.A.: Não analisada
Tabela 5.16 – Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (água bruta).
Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uC) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07
7,4 3,2 26
N.A.
1
Março/07
7,8 3,6 17
N.A.
Abril/07
7,2 3,9 24
N.A.
Maio/07
7,5 1,9 15
N.A.
Junho/07 7,9 1,3 3,6 N.A.
Julho/07 6,9 0,7 3,5 N.A.
Agosto/07 7,6 0,7 4,0 N.A.
Setembro/07 6,9 0,6 1,7 0,7
Outubro/07 6,4 2,1 12 3,9
Novembro/07 7,6 2,1 1,6 1,6
Dezembro/07 6,6 2,5 9,5 2,0
Janeiro/08 5,8 18,1 85 5,5
1
N.A.: Não analisado
91
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan
pH
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.19: Variação do pH nas amostras de água bruta dos três mananciais durante o
período de monitoramento.
0
50
100
150
200
250
Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan
Turbidez (uT)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.20: Variação da turbidez nas amostras de água bruta dos três mananciais
durante o período de monitoramento.
92
1
10
100
1000
10000
Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan
Cor Aparente (uH)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.21: Variação da cor aparente nas amostras de água bruta durante o período de
monitoramento nos 3 mananciais.
0
5
10
15
20
25
Set Out Nov Dez Jan
Cor Verdadeira (uH)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo
Figura 5.22: Variação da cor verdadeira nas amostras de água bruta durante o período
de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais.
De acordo com a Tabela 5.14 e a Figura 5.19 pode-se observar que o pH
manteve-se na faixa de 6 a 8 durante todo o período de amostragem nos 3 mananciais
93
com uma média em torno de 7,1. A Tabela 5.15 e a Figura 5.17 mostram que os menores
índices de turbidez foram encontrados nos locais de Vargem das Flores e Morro
Redondo (exceto janeiro 2008) onde ambos obtiveram uma média de 2,4 uT. Conforme
esperado, o Rio das Velhas (ambiente lótico) teve as maiores variações de turbidez onde
foram encontrados valores de 3,6 uT (junho) a 217 uT (novembro). As mesmas
considerações podem ser feitas para a cor aparente (Tabela 5.16 e Figura 5.18) que,
como esperado, teve grande correlação com a turbidez. A cor verdadeira, determinada
após filtração da amostra (Tabela 5.16 e Figura 5.21), manteve-se abaixo de 6,0 uC para
Morro Redondo e Vargem das Flores, enquanto que o Rio das Velhas obteve o valor
médio de 12,5 uC chegando a um valor máximo de 20,0 uC durante o mês de novembro.
Este resultado também pode ser visto analisando-se a Figura 5.23 que apresenta a
análise quimiométrica dos dados de PCA, feita com a compilação dos parâmetros
utilizados neste trabalho, com exceção da cor verdadeira, que só foi analisada nos meses
finais da campanha de monitoramento. De acordo com a Figura 5.23 podemos observar
que todos os parâmetros são independentes entre si, com exceção da turbidez e cor
aparente, cujos valores da 1ª e 2ª componentes principais aparecem agrupados no gráfico
PCA1 versus PCA2. Conforme discutido anteriormente, este resultado já era esperado.
0,750,500,250,00-0,25-0,50
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
-0,75
PCA 1
PCA 2
Cor Aparente
Estradiol
Etinilestradiol
Nonilfenol
PH
Turbidez
C1
Scatterplot of PCA 2 vs PCA 1
Figura 5.23: Análise da Componente principal (PCA) dos seis parâmetros utilizados
para o monitoramento dos mananciais escolhidos.
94
A baixa correlação entre os PE e os parâmetros globais de monitoramento pode
ser explicada por alguns fatores. As amostras coletadas são ajustadas para o pH igual a
3, ou seja, todas são extraídas sob uma mesma condição. Em relação à turbidez, as
amostras são filtradas com membranas de 0,45μm onde são retiradas grande parte das
partículas presentes. A turbidez poderia ter alguma influência se os PE sofressem
adsorção pelas partículas presentes na água. Isso não ocorre, pois o índice de remoção é
baixo nas ETA’s após a sedimentação.
Para futuras análises, parâmetros como COT (carbono orgânico total) da amostra
filtrada poderiam ser utilizados para possíveis correlações, uma vez que tal análise
quantifica compostos orgânicos que se encontram dissolvidos em água.
5.5. Estimativa de valores críticos de toxicidade dos PE estudados
Um trabalho realizado pela Organização Mundial da Saúde (Damstra et al.
2002), mostra que baixas quantidades de E2, EE2 e NP são capazes de alterar tamanho
da próstata de camundongos. A Tabela 5.17 resume os efeitos causados pelos
perturbadores endócrinos citados neste trabalho.
Tabela 5.17 - Exemplos de pertubação endócrina observada em animais do sexo
masculino expostos aos estradióis e nonilfenol durante o período pré-natal. (adaptado
Damstra et al., 2002)
Composto Espécie e período
de exposição (dias)
Dose Efeitos
Nonilfenol Rato
(1 a 18)
0,08 a 8
mg/kg/dia
(ingestão oral)
0,8 mg/kg/dia: redução do
testículo, epidídimo, vesícula
seminal e próstata.
8,0 mg/kg/dia: Redução da
quantidade de espermas.
Camundongo
(13 a 19)
25 a 300
µg/camundongo
(subcutâneo)
De 25 a 100µg aumento do
tamanho da próstata.
Estradiol
Ratos
(uma geração)
0,003 a 4,12
mg/kg/dia
(ingestão oral)
De 10 a 50 mg.Kg
-1
, redução
dos testículos e epidídimo,
redução do número de
espermas.
Etinilestradiol Camundongo
(0 a17)
0,002 a 200
µg/kg/dia
(ingestão oral)
De 0,02 a 2 µg/kg/dia:
diminuição da próstata
95
Considerando, as quantidades limite para os ratos, e com base no trabalho de
Snyder (2007) e nos procedimentos descritos em Baird (2001) e em OMS (2006),
estimaram-se valores de referência para a toxicidade de estradiol, etinilestradiol e
nonilfenol na água para consumo humano. Os dados que serão apresentados a seguir são
apenas estimativas e não devem ser utilizados como parâmetros de toxicidade, uma vez
que a OMS, a comunidade européia ou os países desenvolvidos (Ex. Canadá, Estados
Unidos, Japão) não estabelecem valores máximos permitidos (VMP) de tais
contaminantes nos seus guias de potabilidade de água. Os resultados, que possuem
apenas caráter informativo, foram calculados da seguinte forma:
a) Considerou-se que a faixa de valores toxicológicos apresentados na Tabela 5.17
contempla os divergentes dados da literatura. Dessa forma as doses críticas, ou seja,
valores abaixo dos quais não se observam algum efeito adverso (NOAEL – non
observed adverse effect level) seriam de 0,08 a 8 mg/kg/d para o NP; de 0,003 a 4,12
mg/kg/d para E2 e de 0,02 a 2 µg/kg.d para o EE2;
b) Converteram-se esses valores para uma dose equivalente em humanos, e isso é
geralmente feito usando um fator de divisão de 100 (pela extrapolação entre espécies e
para considerar membros frágeis na comunidade como imunodeficientes, crianças e
idosos). Dessa forma as concentrações críticas seriam de 0,8 a 80 μg/kg.d para o NP; de
0,03 a 41,2 μg/kg.d para o E2 e de 0,2 a 20 ng/kg.d para o EE2;
c) Multiplicaram-se os valores encontrados no passo b) pela massa corpórea média de
um ser humano (70 kg) e dividiu-se o valor encontrado pelo consumo médio (por
ingestão) de água por habitante (2 L/d). Desta forma a faixa de valores considerados
tóxicos para humanos foram estimados em 28 a 2.800 µg/L para o NP; 1 a 1.442 ng.L
-1
para o E2; e 0,7 a 70.000 ng.L
-1
para o EE2.
De acordo com os dados apresentados, os valores de NP (0,044 a 1,9 μg/L)
encontrados nas águas da RMBH encontraram-se bem abaixo dos valores supostamente
tóxicos estimados. Para os estradióis, sabidamente mais estrogênicos que o nonilfenol,
os valores encontrados nos mananciais (3 a 54 ng.L
-1
para E2 e 1,5 a 36 ng.L
-1
para EE2)
caem dentro da faixa calculada como supostamente tóxica para a saúde humana.
Contudo é preciso salientar que tais compostos foram detectados em poucas amostras e
96
que toda essa análise está sendo feita com os valores encontrados na água bruta. Como
visto anteriormente o tratamento convencional remove parcilamente os PE estudados, e é
bem provável que a etapa final de desinfecção (não avaliada nesse estudo) consiga, de
forma efetiva, reduzir a concentração de NP, E2 e EE2 para valores inferiores àqueles
considerados tóxicos. De qualquer forma estudos posteriores são necessários para avaliar
se a cloração da água consegue remover perturbadores endócrinos promovendo
simultaneamente redução na estrogenicidade da água.
97
6. CONCLUSÕES
O presente trabalho avaliou a presença de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol
em três mananciais de abastecimento da região metropolitana de Belo Horizonte
(RMBH). Este trabalho pode contribuir para o entendimento de uma área onde dados
deste tipo de levantamento são escassos devido à atualidade do tema. A partir da
identificação e monitoraramento de E2, EE2 e NP, considera-se este trabalho pioneiro
em Minas Gerais uma vez que a comunidade científica não dispõe, até o momento, de
tais informações.
De modo geral, os procedimentos analíticos empregando amostragem, extração
por SPE e análise por LCMS se mostraram eficientes na determinação dos três
compostos de interesse usando um volume de amostra igual a 1 litro. As concentrações
de 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol e nonillfenol, presentes na faixa de nanogramas por
litro, só foram possíveis de serem determinadas devido à elevada sensibilidade e
seletividade obtida com o detector por espectrometria de massas íon-trap - time-of-flight.
Devido aos teores encontrados nas águas, recomenda-se que as análises sejam feitas por
este tipo de aparelho, pois obteve um limite de detecção aproximadamente mil vezes
menor em relação ao CG-FID, onde também foram apresentados excelentes parâmetros
de linearidade e separação, mas um alto limite de detecção.
Os parâmetros de validação verificados para o procedimento proposto
aumentaram a confiabilidade dos resultados apresentados, uma vez que ainda não se tem
um método oficial para a determinação simultânea desses compostos. Esse procedimento
poderá ainda servir como base para se iniciar estudos de monitoramento desses
compostos em diversas matrizes aquáticas e, futuramente, adicionar outros compostos
como o bisfenol-A que foi detectado em análises preliminares nas amostras do mês de
janeiro 2008.
O alquilfenol NP foi o composto que esteve presente em todas amostras em
concentrações elevadas (44 a 1900 ng.L
-1
) quando comparado com a literatura
internacional. Por sua vez, os hormônios E2 e EE2 foram identificados em apenas 15%
das amostras na faixa de concentração de 3 a 54 ng.L
-1
para o E2 e de 1,5 a 36 ng.L
-1
para o EE2.
Em relação à remoção dos compostos após o processo de pré-cloração,
coagulação, sedimentação e/ou filtração, utilizado nas ETAs estudadas, observou-se que
tais operações unitárias não removeram completamente os perturbadores NP, E2 e EE2,
98
indicando que tais compostos não são adsorvidos no lodo formado na etapa de
coagulação.
Neste contexto, pode-se entender que no Brasil certos corpos d’água encontram
em processo de degradação, pois as concentrações dos compostos estudados encontrados
nas águas superficiais da RMBH são semelhantes àquelas presentes em efluentes de ETE
de países da Europa e Estados Unidos, reflexo da deficiência de ETE’s em grande parte
dos municípios do país.
99
7. PERSPECTIVAS
Para trabalhos futuros, sugere-se um estudo mais abrangente da presença de NP,
E2 e EE2 em outros corpos d’água, como águas subterrâneas, por exemplo, uma vez que
muitos municípios utilizam essa fonte para abastecimento público. Também seria
interessante um estudo que avaliasse a eficiência das estações de tratamento de água e
esgoto com relação à remoção destes compostos, bem como a aplicação de métodos de
tratamento complementares que promovam a degradação completa desses
contaminantes.
A avaliação da capacidade de biodegradação das substâncias nas águas naturais
brasileiras e a formação de derivados mais ou menos tóxicos que os compostos originais
também poderiam ser melhores estudadas futuramente. E finalmente, devido a presença
de E2, EE2 e NP nas amostras durante o monitoramento, sugere-se um levantamento de
outros possíveis compostos, preferencialmente fenóis, devido a presença de nonilfenol e
bisfenol A. Um novo levantamento preliminar poderia ser feito utilizando métodos de
varredura mais amplos (m/z de 100 a 5000 por exemplo) nos dois modos de detecção
por espectrometria de massas (positivo e negativo).
100
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