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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
ADÉLIA MARIA PIMENTA DE PÁDUA ALCÂNTARA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA A
DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE
ANTINEOPLÁSICOS EM SUPERFÍCIES E
LUVAS VISANDO A APLICAÇÃO NA
MONITORIZAÇÃO DA EXPOSIÇÃO
OCUPACIONAL
Alfenas/MG
2009
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ADÉLIA MARIA PIMENTA DE PÁDUA ALCÂNTARA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA A
DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE ANTINEOPLÁSICOS
EM SUPERFÍCIES E LUVAS VISANDO A APLICAÇÃO NA
MONITORIZAÇÃO DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas pela Universidade
Federal de Alfenas. Área de concentração:
Desenvolvimento e avaliação microbiológica e
físico-química de fármacos, toxicantes e
medicamentos.
Orientadora: Isarita Martins Sakakibara
.
Alfenas/MG
2009
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Alcântara, Adélia Maria Pimenta de Pádua.
Desenvolvimento de métodos para a determinação simultânea de antineoplásicos em
superfícies e luvas visando a aplicação na monitorização da exposição ocupacional
/ Adélia
Maria Pimenta de Pádua Alcântara.- Alfenas, 2009.
103 f. : il.-
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)-Universidade Federal de Alfenas.
Bibliografia.
1. Antineoplásicos. 2. Cromatografia Líquida. 3. Exposição Ocupacional. 4. Estudos de
Validação. I. Título.
CDD: 615.9
ADÉLIA MARIA PIMENTA DE PÁDUA ALCÂNTARA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA A
DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE ANTINEOPLÁSICOS
EM SUPERFÍCIES E LUVAS PARA APLICAÇÃO NA
MONITORIZAÇÃO DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL
A Banca examinadora abaixo-assinada,
aprova a Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas pela Universidade
Federal de Alfenas. Desenvolvimento e
avaliação microbiológica e físico-química de
fármacos, toxicantes e medicamentos.
Aprovada em 13 de março de 2009
Profª. Drª. Isarita Martins Sakakibara
Instituição: Universidade Federal de Alfenas
Assinatura:________________________
Profª. Drª. Cláudia Regina dos Santos
Instituição: Universidade Federal
de Santa Catarina Assinatura: ______________________
Profª. Drª. Gislaine Ribeiro Pereira
Instituição: Universidade Federal de Alfenas Assinatura:________________________
Dedico este trabalho
Ao Menino Jesus de Praga e à Mãe Rainha.
A minha família pelo amor, compreensão, apoio e estímulo constante.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Alfenas pela oportunidade oferecida;
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação pela política de incentivo à produção
acadêmica;
À CAPES pela bolsa de estudos concedida;
Ao CNPq pelo financiamento concedido através do edital MCT-CNPq 54/2005, projeto nº
402630/2005;
Ao Oncominas pela doação do padrão de doxorrubicina;
Ao Prof. Pietro Apostoli pela doação dos padrões de ciclofosfamida e ifosfamida;
Ao Conselho Federal de Farmácia e à Dendrix Consultoria pelos prêmios concedidos em
mérito ao desenvolvimento do método de identificação dos fármacos em superfícies;
À Prof. Dra. Isarita Martins Sakakibara orientadora científica desta dissertação, agradeço
o compromisso assumido, o empenho que colocou neste trabalho, os níveis de exigência dos
desafios que me lançou e os suportes, formais e informais, que disponibilizou. Agradeço
ainda, porque foi mesmo muito importante para mim, a análise rigorosa e afetuosa de cada
capítulo, as sugestões, os esclarecimentos e os comentários sempre oportunos e que espero
ter sabido aproveitar. Para agradecer a aliança, a confiança e a amizade as palavras serão
sempre poucas.
Quero expressar o meu carinho especial aos professores Fábio, Maria Elisa, Elizabeth e à
Patrícia pelas trocas de pontos de vista, entre os quais os científicos, e por todas as forças
que deram, nos bons e os maus momentos deste processo.
Às professoras Claudia Regina dos Santos e Gislaine Ribeiro Pereira pelas importantes
sugestões na pré-banca.
Ao meu grupo de trabalho (Ricardo, Liliane, Ananda, Jefferson, Suellen, Renata, Gabriela,
Matheus, André e Marcela) e de vida acadêmica, agradeço toda a dedicação e colaboração
nos vários momentos dos estudos, expresso o meu reconhecimento e faço votos que
consigam realizar todos os seus projetos de vida.
Às minhas amigas Daniela, Lusiane e Helineide quero dizer o quanto valorizo a nossa
amizade, o respeito e os bons sentimentos que nos unem.
Á minha amiga Natália pelo auxílio na formatação;
À todo corpo docente, discente, funcionários técnicos e auxiliares (Márcia e Andressa) pelos
ensinamentos, cooperação e amizade;
Aos funcionários de secretária de pós-graduação (Márcio e Marilúcia) e da biblioteca
(Cecília e Ronan) pela ajuda valiosa.
Os meus sinceros agradecimentos
RESUMO
A importância terapêutica e os resultados promissores apresentados pelos antineoplásicos são
inquestionáveis, porém a ampla e crescente utilização desses fármacos, em terapia combinada
entre duas ou mais destas substâncias químicas, é considerada um importante risco químico
para os profissionais expostos. São recomendadas várias medidas, dentre elas a
monitorização, visando a proteção à saúde dos trabalhadores e o controle da exposição. Nesse
contexto, é de suma importância o desenvolvimento de métodos capazes de identificar e /ou
quantificar os fármacos simultaneamente. Assim, este trabalho teve como objetivo
desenvolver métodos analíticos para determinação simultânea de antineoplásicos em
superfícies e luvas, uma vez que a via dérmica é a principal para a absorção dessas
substâncias. Após vários testes, as condições otimizadas para o método de determinação de
CF (ciclofosfamida), doxorrubicina (DOX), 5-FU (5-fluoruracila), IFO (ifosfamida) e MTX
(metotrexato), em superfícies, utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
foram: detecção a 195 nm (UV); coluna C18 (250 x 4,5 mm, 5 µm) com pré-coluna similar;
fase móvel constituída de água pH 4,0: metanol: acetonitrila (70:13:17, v/v/v) com vazão de
0,4 mL min
-1
até 13 minutos e, 1 mL min
-1
até o final da corrida; solução de acetonitrila:
metanol (50:50, v/v), como líquido de limpeza das superfícies de trabalho, sem extração
prévia. Esse método demonstrou-se linear para a 5-FU e MTX, no intervalo de 0,25 a 20 µg
mL
-1
e, para DOX, CF e IFO, de 0,5 a 20 µg mL
-1
, com coeficientes de correlação linear
superiores a 0,99. A recuperação obtida foi em torno de 74 a 106% e o coeficiente de variação
foi inferior a 11%, na avaliação da repetibilidade. Para o método cromatográfico de
determinação em luvas, as condições otimizadas foram, para os analitos 5-FU, MTX e
paclitaxel (PAC): detecção em DAD (detector por arranjo de diodos) e quantificação em UV,
sendo 195 nm, 265 nm e 302 nm, os comprimentos de onda utilizados para o PAC, 5-FU e
MTX, respectivamente; coluna C18 (250 x 4,5 mm, 5 µM) com pré-coluna similar
;
fase móvel
constituída de água pH 4,0: metanol: acetonitrila (35:15:50, v/v/v), com vazão de 1 mL min
-1
.
Recuperação satisfatória foi obtida, para os analitos 5-FU e PAC, quando a amostra foi
submetida à ELL, com acetato de etila e, para o MTX, quando submetida ao procedimento de
extração em fase sólida (SPE), utilizando-se sílica modificada com C18 e eluição com
metanol. O método demonstrou-se linear no intervalo de 0,25 a 20 µg mL
-1
, com coeficientes
de correlação linear superiores a 0,99. A eficiência da extração foi em torno de 71 a 115% e a
repetibilidade foi inferior a 15%. O método revelou-se eficiente na quantificação de amostras
com concentração igual ou superior a 0,25 µg mL
-1
e, na detecção daquelas com valores
abaixo do LQ, através da utilização do DAD. Os resultados sugerem que os métodos podem
ser utilizados na determinação simultânea de antineoplásicos, nas matrizes estudadas, e
constituem ferramentas úteis na monitorização da exposição ocupacional à tais substâncias.
Unitermos: antineoplásicos, determinação simultânea, superfícies e luvas, cromatografia
líquida, detector ultra-violeta, detector arranjo de diodos, exposição ocupacional.
ABSTRACT
Therapeutic importance and benefits obtained from antineoplastic drugs are unquestionable.
However, their side effects are not well-known and extensive use and exposure to multiple
agents may put health care workers involved in the preparation and administration of these
drugs at risk. Therefore, it is important to have accurate methods for simultaneous analysis
and evaluation of the occupational exposure. The aim of this study was to develop methods
for simultaneous determination of antineoplastics in surfaces and gloves since, in the
occupational exposure, the main contamination route is dermal contact, which may occur by
prolonged contact with contaminated surfaces or instruments/materials. The assay was
performed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and the optimized
conditions for 5-fluorouracil (5-FU), methotrexate (MTX), doxorrubicin (DOX),
cyclophosphamide (CP) and ifosfamide (IFO), in surface samples, were: detection in 195 nm,
C
18
column (5 µm, 250 x 4 mm) with a similar guard column; mobile phase was constituted
by water, pH 4: methanol: acetonitrile (70:13:17, v/v/v) with a flow of 0.4 mL min
-1
up to 13
minutes and after this 1 mL min
-1
and cleaning of surfaces with acetonitrile: methanol (50:50),
without previous extraction. The method presented a linear calibration range from 0.25 to 20
µg mL
-1
for 5-FU and MTX and from 0.5 to 20 µg mL
-1
for IFO, DOX and CP with
determination coefficients (r
2
) higher than 0.99. The repeatability, expressed in terms of
percent relative standard deviation was ≤11% and extraction efficiency ranged from 74 to
106%. Optimized conditions for 5-FU, MTX and paclitaxel (PAC), in gloves, were: diode
array (DAD) detection and UV quantification in 195 nm to PAC, 265 nm to 5-FU and 302 nm
to MTX; C
18
column (5 µm, 250 x 4 mm) with a similar guard column; mobile phase was
constituted by water, pH 4: methanol: acetonitrile (35:15:50, v/v/v) with a flow of 1 mL min
-1
.
The method presented a linear calibration range from 0.25 to 20 µg mL
-1
with determination
coefficients (r
2
) higher than 0.99. Extraction efficiency was between 71 to 115% and
repeatability, expressed in terms of percent relative standard deviation was ≤15% and
satisfactory extraction efficiency was obtained when liquid extraction, with ethyl acetate, was
used for 5-FU and PAC and solid phase, with C18 cartridges and elution with methanol, for
MTX. DAD detector allowed drugs detection at concentration below 0.25 µg mL
-1
, in glove
samples. The results obtained suggest that the developed methods can be applied for
simultaneous determination of the drugs studied and are considered useful in exposure
assessment for health care workers.
Uniterms: antineoplastic drugs, simultaneous determination, surfaces, gloves, liquid
chromatography, ultra-violet detection, diode array detection, occupational exposure.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura
1
-
Classificação dos antineoplásicos segundo ponto de interferência no
mecanismo de ação das diferentes etapas da síntese de ADN,
transcrição e transdução ..................................................................... 12
Figura 2
-
Fórmula estrutural da ciclofosfamida.. ..............................................
17
Figura 3
-
Fórmula estrutural da doxorrubicina ................................................. 21
Figura 4
-
Fórmula estrutural da 5-fluoruracila ...................................................
24
Figura 5
-
Fórmula estrutural da ifosfamida ....................................................... 27
Figura 6
-
Fórmula estrutural do metotrexato..................................................... 30
Figura 7
-
Fórmula estrutural do paclitaxel ......................................................... 33
Figura 8
-
Aspectos da exposição ocupacional aos fármacos antineoplásicos....
38
Figura 9
-
Espectros obtidos a partir da análise de: A) 5- fluoruracila, na
concentração de 100 µg mL
-1
; B) metotrexato, concentração de 5 µg
mL
-1
; C) ifosfamida, na concentração de 20 µg mL
-1
; D)
ciclofosfamida, concentração de 20 µg mL-1; E) doxorrubicina,
concentração de 20 µg mL
-1
e F) paclitaxel, na concentração20 µg
mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase
móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila (70:13:17, v/v/v).............
63
Figura 10
-
Cromatogramas obtidos a partir da injeção de: A) solução de
limpeza superfícies ACN: MeOH (50:50, v/v) e B) solução de
limpeza de superfícies ACN: MeOH (50:50, v/v), contendo os
analitos 5-fluoruracila (5- FU) e metotrexato (MTX), na
concentração de 5 µg mL
-1
e ifosfamida (IFO), doxorrubicina
(DOX) e ciclofosfamida (CF) na concentração de 100 µg mL
-1
,
identificados por CLAE-UV nas condições otimizadas..................... 67
Figura 11
-
Fluxograma de injeção direta da matriz acetonitrila:metanol (50:50,
v/v) com os analitos 5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX),
ifosfamida (IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF) em
superfícies...........................................................................................
69
Figura 12
-
Espectros obtidos a partir da análise de metotrexato, na
concentração
20 µg mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),
fase móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila (35:15:50, v/v/v) .......
76
Figura 13
-
Espectros obtidos a partir da análise de 5-fluoruracila, na
concentração 20 µg mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6
mm, 5 µm), fase móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila
(35:15:50, v/v/v) ..................................................................................
77
Figura 14
-
Espectros obtidos a partir da análise de paclitaxel, na concentração
20 µg mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),
fase móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila (35:15:50, v/v/v) .......
77
Figura 15
-
Cromatograma obtido a partir da injeção de solução padrão
contendo os analitos metotrexato (MTX), 5-fluoruracila (5-FU) e
paclitaxel (PAC) na concentração de 20 µg mL
-1
identificados por
CLAE-UV (195 nm) nas condições otimizadas ..................................
79
Figura 16
-
Cromatogramas obtidos a partir da injeção de solução-padrão
contendo os analitos metotrexato (em verde, analisado em 302 nm),
na concentração de 20 µg mL
-1
e 5- fluoruracila (em azul, analisado
em 265 nm), na concentraçãode 10 µg mL
-1
, identificados por
CLAE-DAD nas condições otimizadas................................................ 79
Figura 17
-
Fluxograma da técnica de extração líquido-líquido (ELL) de
antineoplásicos em luvas...........................................................................
80
Figura 18
-
Fluxograma da técnica de extração em fase sólida (SPE) de
antineoplásicos em luvas...........................................................................
81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
-
Classificação dos antineoplásicos segundo Korolkovas.......................... 13
Tabela 2
-
Acrônimos dos protocolos de quimioterapia, seus componentes e sua
principal indicação ..................................................................................
14
Tabela 3
-
Classificação dos fármacos antineoplásicos, quanto à
carcinogenicidade.....................................................................................
36
Tabela 4
- Tipos de amostragem para avaliar a exposição dos trabalhadores da
área da saúde, aos quimioterápicos antineoplásicos e as possíveis
informações fornecidas............................................................................ 40
Tabela 5
-
Avaliação dos antineoplásicos através de análise em superfície/ objeto
pela técnica de amostragem wipe teste de 1992 a 2008 .......................... 43
Tabela 6
-
Valores de pKa e solubilidade de diferentes fármacos antineoplásicos.. 44
Tabela 7
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de
ciclofosfamida, em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008................. 45
Tabela 8
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de ifosfamida,
em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008........................................... 46
Tabela 9
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de
doxorrubicina, em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008...................
47
Tabela 10
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de 5-f
luoruracila, em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008......................
47
Tabela 11
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de
metotrexato, em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008......................
49
Tabela 12
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de
trabalho dos métodos descritos na literatura para análise de paclitaxel,
em matrizes não-biológicas, de 1992 a 2008...........................................
49
Tabela 13
-
Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações.....................
58
Tabela 14
-
Parâmetros de conformidade do sistema* obtidos com os analitos
5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO),
doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF), identificados por CLAE-
UV nas condições otimizadas ................................................................. 69
Tabela 15
-
Linearidade, limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) do
método de determinação simultânea de 5-fluoruracila (5-FU),
metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO), doxorrubicina (DOX) e
ciclofosfamida (CF) em superfícies, por CLAE-UV............................... 71
Tabela 16
-
Precisão intra-corrida (repetibilidade), avaliada pelo desvio padrão
relativo (DPR%), obtida com as sextuplicatas da injeção direta da
matriz acetonitrila: metanol (50:50, v/v), contendo os analitos 5-
fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO),
doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF), nas concentrações baixa,
média e alta ............................................................................................. 72
Tabela 17
-
Precisão intercorrida (intermediária), avaliada pelo desvio padrão
relativo (DPR%), obtida com as sextuplicatas da injeção direta da
matriz acetonitrila: metanol (50:50, v/v), contendo os analitos 5-
fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO),
doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF), nas concentrações baixa,
média e alta ............................................................................................. 73
Tabela 18
-
Recuperação do método de determinação simultânea de 5-
fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO),
doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF) em superfícies (n=6),
fortificadas com 2 µg mL
-1
dos fármacos ...............................................
75
Tabela 19
-
Parâmetros de conformidade do sistema* obtidos com os analitos
metotrexato (MTX), 5-fluoruracila (5-FU) e paclitaxel (PAC) na
concentração de 10 µg mL
-1
identificados por CLAE-DAD-UV, nas
condições otimizadas ..............................................................................
83
Tabela 20
-
Linearidade, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) do
método de determinação simultânea para 5-fluoruracila (5-FU),
metotrexato (MTX) e paclitaxel (PAC), por CLAE-DAD-UV............... 84
Tabela 21
-
Precisão intra-
corrida (repetibilidade) e intercorrida (precisão
int
ermediária), avaliada pelo desvio padrão relativo (DPR%), obtida na
análise de amostras de luvas, contendo antineoplásicos (n=6), por
CLAE-DAD-UV com prévia extração dos analitos ................................
84
Tabela 22
-
Recuperação do método de determinação simultânea de metotrexato
(MTX), 5-fluoruracila (5-FU) e paclitaxel (PAC) em luvas (n=6),
analisadas pelo método CLAE-DAD-UV, com prévia extração dos
analitos.....................................................................................................
86
Tabela 23
-
Concentração de antineoplásicos em amostras de luvas utilizadas por
pesquisadores, determinadas por CLAE-DAD-UV, nas condições
otimizadas ............................................................................................... 86
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
1 A - classificação de grupo segundo IARC
2 B - classificação de grupo segundo IARC
5-FU - 5-fluoruracila
5-FdUMP - 5- fluoro-desoxiuridina
α - fator de separação ou seletividade
µg - micrograma
µL - microlitro
a - coeficiente angular
ACN - acetonitrila
ADN - ácido desoxirribonucléico
ARN - ácido ribonucléico
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BCG - Bacillus Camett Guérin
ºC - grau Celsius
C-18 - fase sólida lipofílica usada em cartuchos para SPE
CAS - Chemical Abstracts Service
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CF - ciclofosfamida
CG-EM - cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-DAD-UV - cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos
e ultra-violeta
CLAE-EM-EM - cromatografia líquida de alta eficiência a acoplada à espectrometria de
massa acoplada à espectrometria de massa
cm
2
- centímetro ao quadrado
CV- coeficiente de variação
CYP2B - isoenzimas do citocromo P450 subfamília 2B
CYP2C - isoenzimas do citocromo P450 subfamília 2C
CYP3A - isoenzimas do citocromo P450 subfamília 3A
DAD - detector de arranjo diodo
DHFR - dihidrofolato redutase
DOX - doxorrubicina
DP - desvio padrão
DPb - desvio padrão do branco
DPR%- desvio padrão relativo (percentual)
dTMP - monofosfato de desoxitimidina
dUMP - monofosfato de desoxiuridina
EBCTCG - Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group
ECC - específicos do ciclo celular
ELL - extração líquido-líquido
EPI - equipamento de proteção individual
FAN - fármaco antineoplásico
g - unidade de medida da força centrífuga relativa, sendo 1 g equivalente à aceleração da
gravidade na superfície da terra.
G
0
- fase da mitose
G
1
- fase da mitose
G
2
- fase da mitose
IARC - International Agency for Research on Cancer
ICC - inespecíficos do ciclo celular
IFO - ifosfamida
k - fator de retenção ou capacidade
kg - kilograma
L - litro
LD - limite de detecção
LQ - limite de quantificação
M - fase da mitose
m
2
-
metro ao quadrado
MeOH - metanol
MESNA - 2-mercaptano sulfonato sódico
mg - miligrama
mL - milílitro
mm - milímetro
mm
3
- milímetro cúbico
mM - milimol
MTX - metotrexato
n= - número de réplicas
N - número de pratos teóricos
NaOH - hidróxido de sódio
ng - nanograma
NIOSH - National Institute for Occupational Safety and Health
OSHA - Occupational Safety and Health Administration
pKa - constante de dissociação ácida
pH - potencial hidrogeniônico
pg - picograma
QT - quimioterapia
r
2
- coeficiente de determinação
S - fase da mitose
SNC - sistema nervoso central
SPE - extração em fase sólida
SOBRAFO - Sociedade Brasileira de Farmacêuticos em Oncologia
PAC – paclitaxel
PALA – n-fosfonoacetil-L-aspartato
Rs - resolução
TA 98 - linhagem de Salmonella typhimurium
TA 100 - linhagem de Salmonella typhimurium
TF - fator de cauda ou assimetria
THF - tetrahidrofolato
tm - tempo de retenção de um composto não retido (tempo morto)
TMP – monofosfato de timidina
TNT - tecido não tecido
U.S. FDA - United States Food and Drug Administration
UV - ultravioleta
v - volume
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
..................................................................................................
1
2 REVISÃO DA LITERATURA
..........................................................................
8
2.1
ASPECTOS TEÓRICOS DO C
ÂNCER
....................................................
....................
.
8
2.2
QUIMIOTERAPIA
......................................................................................
..............
11
2.2.1
Classificação dos fármacos antineoplásicos
...............................................
............
11
2.2.2
Quimioter
apia de combinação ou poliquimioterapia
................................
...........
14
2.2.3
Fármacos utilizados na quimioterapia ..
.....................................................
...........
16
2.2.3.1
Ciclofosfamida (CF)
..........................
...........................................................
...........
16
2.2.3.2
Doxorrubicina (DOX)
..................................................................................
...........
20
2.2.3.3
Fluoruracila (5
-
FU)
...........................
.........................................................
.............
24
2.2.3.4
Ifosfamida (IFO)
...........................................................................................
...........
26
2.2.3.5
Metotrexato (MTX)
.......................
..............................................................
......
.
....
29
2.2.3.6
Paclitaxel (PAC) .............................................................................................
32
2.2.4
Neoplasias induzidas pela quimioterapia
.........
..........................................
........
35
2.3
MONITORIZAÇÃO DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AOS ANTINEOPLÁSICOS
.
........
.
37
2.4
ANÁLISE DOS ANTINEOPLÁSICOS EM MATRIZES NÃO
-
BIOLÓGICAS
..........
............
40
3 OBJETIVOS
.........................................................................................................
50
4 MATERIAIS E MÉTODOS
..............................................................................
51
4.1
MATERIAIS
....................................................
............................................
..............
.
51
4.1.1
Padrões, reagentes e solventes
.....................................................................
......
51
4.1.2
Equipamentos e acessórios
...........................................
................................
.......
51
4.1.3
Soluções
-
padrão
...........................................................................................
......
.
52
4.2
OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO DOS
ANALITOS EM SUPERFÍCIES...................................................................................... 52
4.2.1
Otimização das condições cromatográficas
...............................................
..........
.
52
4.2.2
Otimização da extração líquido
-
líquido
...........
..........................................
..........
53
4.2.3
Injeção direta da matriz
...............................................................................
........
54
4.2.4
Teste de superfícies intencionalmente fortificada com os analitos
...
......
............
.
54
4.3
OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO DOS
ANALITOS EM LUVAS............................................................................................... 55
4.3.1
Otimização das condições cromatográficas
.....
.....................................
.............
.....
55
4.3.2
Otimização das condições de extração
....................................................
..........
....
56
4.3.3
Aplicação do método em amostras de luvas
..............................
..............
...........
...
57
4.4
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DOS MÉTODOS
............
.............................
....
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
.......................................................................
61
5.1
OTIMIZAÇÃO DAS CONDI
ÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO DOS
ANALITOS EM SUPERFÍCIES ...................................................................................... 62
5.1.1
Otimização das condições cromatográficas
........................
...........
....................
....
62
5.1.2
O
timização das condições de extração líquido
-
líquido
..............
.............................
68
5.1.3
Injeção direta
................................................................................................
......
68
5.1.3.1
Cara
cterísticas de desempenho do método de injeção direta
...................
...........
69
5.1.3.2
Aplicação do método de injeção direta em superfícies intencionalmente
fortificadas com os analitos................................................................................... 74
5.2
OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO DOS
ANALITOS EM LUVAS ............................................................................................. 75
5.2.1
Otimização das condições cromatográficas
...
............................................
............
.
75
5.2.2
Otimização das técnicas de extração
...........................................................
..........
80
5.2.3
Características de desempenho do método
................................
................
..........
82
5.2.4
Aplicação do método validado em amostras de luvas
..............................
...........
.
86
6 CONCLUSÕES
...................................................................................................
88
REFERÊNCIAS
...................................................................................................
90
ANEXO I
........................................................................................................
..........
101
ANEXO II
.......
................................................................................................
...........
103
1 INTRODUÇÃO
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o
crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se
para outras regiões do corpo. Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ser muito
agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo de células
cancerosas) ou neoplasias malignas. Entre as características que diferenciam os diversos tipos
de câncer estão a velocidade de multiplicação das células e a capacidade de invadir tecidos e
órgãos vizinhos ou distantes, formando as metástases (INCA, 2008).
Os tipos de câncer responsáveis pelas maiores taxas de incidência e mortalidade no
Brasil são: para homens, próstata, pulmão, estômago; para mulheres, mama, colo de útero e
reto (INCA, 2008).
Menos de um quarto desses pacientes terá prognóstico satisfatório somente com
cirurgia e/ou radiação local. A maioria, no entanto, receberá quimioterapia sistêmica em
algum momento da enfermidade. Em uma pequena parcela (cerca de 10%) dos pacientes com
neoplasias específicas, a quimioterapia pode resultar em cura ou remissão prolongada.
Contudo, na maioria dos casos, o tratamento farmacológico só produz regressão da doença,
sendo mais comum os pacientes apresentarem complicações ou recidivas que podem
eventualmente levar a morte (HOWLAND; MYCEK, 2007).
Os carcinógenos podem, portanto, ser de três tipos: radiações (induzem lesões no
ADN (ácido desoxirribonucléico), como por exemplo a radiação ultravioleta e a radiação
ionizante); vírus (seu papel não é bem conhecido, uma vez que decorre tempo longo entre a
infecção viral e o desenvolvimento do câncer, exemplo: o vírus da hepatite B); e os agentes
químicos (MACHADO; SANTELLI, 2008).
A indução de tumores em seres humanos por agentes químicos é bem estabelecida
(VENEGAS et al., 1995). Os agentes químicos de atuação direta são normalmente compostos
eletrofílicos, isto é, reagem com regiões carregadas negativamente de outros compostos. A
maioria, entretanto, age indiretamente, necessitando ser biotransformada para adquirir
potencial carcinogênico. Neste caso, a conversão em carcinógeno ocorre pela introdução de
centros eletrofílicos na molécula inativa. Essa ativação ocorre paradoxalmente em
conseqüência da ação do sistema de destoxificação do organismo, que tem a função de tornar
as substâncias hidrofílicas para que sejam eliminadas pela urina (MACHADO; SANTELLI,
2003).
O termo quimioterapia (QT) é utilizado na área da saúde para designar tratamento de
neoplasias, porém a sua definição correta é de uma substância química, isolada ou em
combinação, que tem por objetivo tratar uma patologia tumoral ou não. Tem como finalidade:
curar, melhorar a sobrevida e/ou promover efeito paliativo (CHU; SARTORELLI, 2007).
Seu objetivo primário é destruir as células neoplásicas, preservando as normais.
Entretanto, a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não-específica, lesando tanto
células malignas quanto normais (MURAD; KATZ, 1996; ALMEIDA, 2004; CHU;
SARTORELLI, 2007). É a modalidade terapêutica oncológica que mais tem progredido nos
últimos tempos. Pode-se hoje curar ou assegurar longas sobrevidas, com este tipo de
tratamento, a uma variedade de tumores até há pouco tempo rapidamente mortais (CHU;
SARTORELLI, 2007).
Um dos fatores limitantes é a toxicidade dos fármacos em tecidos sadios,
especialmente os que têm taxa de proliferação rápida, como a medula óssea, epitélio
gastrintestinal, folículos pilosos e epitélio germinativo, isto explica a maior parte dos efeitos
colaterais da quimioterapia: náuseas e vômitos, diarréia, alopecia, diminuição da fertilidade e
susceptibilidade maior às infecções (MACHADO, 2000; OLIVEIRA; ALVES, 2002; CHU;
SARTORELLI, 2007). Porém, o corpo recupera-se destes inconvenientes após o tratamento, e
o uso clínico desses fármacos exige que os benefícios sejam confrontados com a toxicidade,
na procura de um índice terapêutico favorável (FOYE et al., 1996; MURAD; KATZ, 1996;
CHU; SARTORELLI, 2007).
Os fármacos antineoplásicos (FAN) constituem um grupo heterogêneo de substâncias
químicas capazes de inibir o crescimento e/ou os processos vitais das células tumorais com
uma toxicidade tolerável sobre as células normais (MINOIA; PERBELLINI, 2000).
Assim, praticamente todos os FAN têm uma curva dose-resposta muito íngreme para
os efeitos tóxicos e terapêuticos (HOWLAND; MYCEK, 2007); ou seja, as substâncias
químicas antineoplásicas mais efetivas terapeuticamente promovem efeitos tóxicos em função
de sua toxicidade. Tais agentes podem promover o aparecimento de câncer secundário depois
de cessado o tratamento, pois muitos são mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos em
vários sistemas experimentais em animais e humanos (FORNI, 1994; FERGUSON;
PEARSON, 1996; MALUF; ERDTMANN, 2000; BERTRAM, 2001).
Os FAN podem ser administrados por várias vias, tais como oral, intramuscular,
subcutânea, intra-arterial, intrapleural, intratumoral, intracística e por infusão intravenosa.
Estes agentes podem ser administrados isoladamente ou em terapia combinada (DEL
GAUDIO; MENONNA-QUINN, 1998).
A terapia combinada também chamada de poliquimioterapia é a modalidade de
tratamento utilizada para superar a destruição celular logarítima limitada ao uso de um único
FAN. Seu diferencial está em recorrer a associações de fármacos diferentes toxicidades e
mecanismos de ação, podendo-se assim obter efeitos citotóxicos aditivos e/ou sinérgicos,
sendo atualmente a abordagem padrão para o tratamento curativo e paliativo do câncer (CHU;
SARTORELLI, 2007).
Ensaios clínicos demonstraram que a administração de esquemas poliquimioterápicos
é mais efetiva que a administração de fármacos de forma isolada, pois a combinação de dois
ou mais agentes pode frequentemente, levar à redução da dose de cada um, quando
comparada às doses que seriam administradas isoladamente (EARLY BREAST CANCER
TRIALISTS COLLABORATIVE GROUP, 1998; CARRICK et al., 2005; JONES; GHERSI;
WILCKEN, 2006).
Face ao exposto acima, os trabalhadores, tais como farmacêuticos (manipulação em
indústrias, farmácias e clínicas oncológicas), enfermeiros, médicos, pessoal envolvido na
limpeza e pesquisadores, estão em contato com vários antineoplásicos na jornada diária de
trabalho, em locais de preparo e administração dessas substâncias.
A exposição ocupacional aos FAN tem sido reconhecida como potencialmente
perigosa à saúde desde a década de 70, quando foi demonstrada a associação entre o contato
com essas substâncias e o aumento da atividade mutagênica em amostras de urina.
Paralelamente a estes resultados muitos estudos têm relatado o aparecimento de efeitos
teratogênicos secundários à exposição profissional (VENEGAS et al., 1995). Em 1975, Sieber
e Adamson relataram que a exposição aos FAN pode levar à formação de aberrações
cromossômicas, malformações congênitas e efeitos na fertilidade.
Embora o potencial mutagênico/ carcinogênico dos FAN esteja baseado em estudos
com exposição intensa e a altas doses, estudos sobre a exposição ocupacional têm mostrado a
presença de níveis baixos, porém detectáveis, de FAN no ar ambiente das unidades de
preparação de quimioterapia (MEDKOVA, 1991; SESSINK et al., 1992).
Cefaléia, tontura, náuseas, irritação da pele/mucosas e reações alérgicas são os
sintomas mais frequentemente relatados em pessoas expostas ocupacionalmente a FAN,
principalmente quando esses são manipulados em unidades inadequadamente equipadas
(VENEGAS et al., 1995).
Em 1992, Sessink e colaboradores avaliaram a presença de metotrexato (MTX), 5-
fluoruracila (5-FU), ifosfamida (IFO), ciclofosfamida (CF) e seus produtos de
biotransformação na urina de enfermeiras e farmacêuticos de unidades de quimioterapia e,
demonstraram que níveis apreciáveis de ciclofosfamida e ifosfamida, não somente, foram
encontrados na urina de profissionais que estavam ativamente envolvidos no preparo e na
administração dos fármacos, mas também, naqueles que apenas estavam presentes nos
mesmos locais, sem contato direto.
Um estudo desenvolvido por Sessink et al. (1994a), mostrou a presença de
ciclofosfamida em luvas de algodão, sob as luvas de látex, utilizadas pelos trabalhadores que
preparavam o fármaco. Os autores sugeriram que a ciclofosfamida pode permear luvas de
látex o que, em condições normais de trabalho, pode resultar em penetração dérmica.
Em outro estudo foi demonstrado que profissionais não paramentados com luvas e
máscaras, nas unidades de preparo de FAN, tinham um nível 50% mais alto de quebras de
ADN (p< 0,005), em relação aos que estavam paramentados (MILKOVIC-KRAUS;
HORVAT, 1991; GOLONI et al., 1992).
Tratando-se de fármacos dotados de ação genotóxica, não é possível estabelecer uma
relação dose-efeito, porém é notório que a exposição dos trabalhadores, mesmo em baixas
doses, é considerada indevida (ALESSIO et al., 1996).
É evidente na literatura a divergência de opiniões quanto à extensão do risco
relacionado ao contato com FAN (JOCHIMSEN, 1992; LEE, 1993). Entretanto, deve ser
mencionado que a exposição diária por períodos prolongados expõe o trabalhador a um
constante risco e, a ausência de sintomas imediatos não é evidência de ausência de efeitos à
longo prazo (WILSON; SOLIMANDO, 1981; VENEGAS et al., 1995).
No âmbito ocupacional, os FAN podem ser absorvidos através da via respiratória,
pela inalação dos aerossóis formados e dispersos no ambiente de trabalho, e através da via
dérmica, que é considerada a principal via de introdução, pelo contato prolongado com
superfícies e/ou indumentárias contaminadas (ALESSIO et al., 1996).
As modalidades de exposição são bem identificáveis. Durante a fase de preparação
algumas operações são particularmente de risco: a abertura da ampola, a extração da agulha
do frasco (pode formar aerossol), a expulsão de ar da seringa, a transferência do fármaco de
um frasco a outro ou a uma bolsa de infusão, por meio da agulha da seringa e o descarte
incorreto do frasco, parcialmente utilizado. Na fase de administração, a exposição pode ser
verificada durante a inserção no defluxor e/ou durante a expulsão do ar da seringa, por
formação de aerossol ou por contato cutâneo direto (APOSTOLI, FACCO, ALESSIO, 2001).
As práticas hospitalares rotineiras, o contato com material biológico ou roupa íntima
utilizada pelos pacientes, tratados com estes tipos de fármacos, representam uma possível
fonte de exposição (FORNI, 1994; PRIANTE, ALESSANDRO, CLONFERO 1994;
PALAZZO et al., 1996; APOSTOLI , FACCO, ALESSIO, 2001).
Além disso, o uso crescente dos antineoplásicos pode acarretar um futuro problema
ambiental, pois, até o momento, não existem normativas para o tratamento do descarte e das
excreções dos pacientes sob terapia com estes fármacos.
Em 1998, Guedes traçou um perfil dos trabalhadores expostos aos FAN em hospitais
do Distrito Federal. A maioria dos trabalhadores era do sexo feminino, faixa etária de 31 a 45
anos, portanto em idade fértil. Grande parte trabalhava a menos de dois anos com
antineoplásicos, contudo um quarto desses trabalhadores manuseava esses agentes a mais de
seis anos. Muitos deles já haviam manipulado os antineoplásicos sem utilizar qualquer
técnica de segurança ou equipamento de proteção. Aproximadamente metade dos
trabalhadores já havia sofrido algum tipo de acidente com antineoplásico, sendo que, em
torno de 95% não fizeram comunicação.
Embora as condições de manuseio e segurança dos trabalhadores com antineoplásicos
tenham melhorado consideravelmente, nos últimos 10 anos, Guedes sugeriu a existência de
muitas deficiências quanto ao treinamento e vigilância à saúde desse grupo de trabalhadores.
Por essa razão, alguns órgãos nacionais e internacionais, destinados à segurança dos
trabalhadores, têm publicado documentos com a finalidade de fornecer indicações precisas
para a redução dos riscos durante a manipulação de FAN (GUEDES, 1998).
Em geral, as recomendações prevêem avaliação periódica da exposição, utilização de
dispositivos de proteção coletiva e individual, vigilância à saúde e programas de formação e
informação a fim de garantir níveis de exposição cada vez mais baixos, uma vez que, não
existem limites de exposição recomendados para essas substâncias (DEMENT; CROMER,
1992; PALAZZO et al., 1996; MINOIA; PERBELLINI, 2000; NIOSH, 2004).
Para a avaliação da exposição aos FAN deve-se fazer um levantamento da exposição
ambiental e biológica determinando em que matrizes esses fármacos poderão ser encontrados
(MARTINS, 2003). Segundo estudos realizados foi prevista seguinte hierarquia: (a)
determinação em superfícies; (b) determinação em material biológico e (c) determinação no ar
(ALESSIO et al., 1996; APOSTOLI, FACCO, ALESSIO, 2001).
Esta hierarquia se deve ao conhecimento da quantidade de substância manipulada, a
modalidade de difusão dos fármacos no ambiente, caracterização da área de maior
contaminação, conhecimento das principais vias de absorção do quimioterápico em questão e
verificação da eficiência dos equipamentos de proteção coletiva (cabine de fluxo laminar) e
individual (máscaras, luvas, avental) (BAKER; CONNOR, 1996; APOSTOLI, FACCO,
ALESSIO, 2001).
Segundo o NATIONAL INSTITUTE FOR OCCUPATIONAL SAFETY AND
HEALTH (NIOSH), em seu manual de métodos analíticos o wipe teste é uma maneira comum
de monitorar superfícies contaminadas. O objetivo desse procedimento é proporcionar uma
metodologia uniforme e reprodutível para a coleta de amostras representativas de superfície
contaminadas com partículas sedimentadas e/ou líquidos de baixa volatilidade. O sistema de
coleta dependerá da natureza do solvente de extração e do agente químico a ser coletado, o
principal cuidado é que este tenha o mínimo impacto sobre as amostras (NIOSH, 1994).
No caso de coleta de FAN em superfícies, o solvente mais adequado é a solução de
hidróxido de sódio (NaOH) 0,03 mol L
-1
(SESSINK et al., 1992; MINOIA; PERBELLINI,
2000; CASTIGLIA et al., 2008).
Vários métodos, utilizando wipe teste, vêm sendo utilizados e a ciclofosfamida (CF) é
o principal analito investigado, para demonstrar a contaminação das superfícies em vários
locais de trabalho.
A determinação dos antineoplásicos em diferentes matrizes requer métodos validados,
principalmente quanto aos limites de detecção e de quantificação, sendo a maioria dos
métodos publicados, até o momento, capazes de analisar o fármaco isoladamente.
A técnica de detecção e quantificação dos FAN por cromatografia líquida de alta
eficiência é comumente empregada, apesar da significativa diferença na estrutura química e
nas propriedades físico-químicas destes agentes (SPARREBOOM et al., 1999; ZAO; DASH,
1999; LARSON; KHAZAELI; DILON, 2003; TURCI et al., 2006; LI et al., 2007).
Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos analíticos para determinação
simultânea de antineoplásicos, em superfícies e luvas, uma vez que a via dérmica é a principal
para a absorção dessas substâncias e, é reduzido o número de métodos que determinem
simultaneamente esses agentes, característica essa importante, sob o ponto de vista analítico,
uma vez que é crescente a utilização da poliquimioterapia.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ASPECTOS TEÓRICOS DO CÂNCER
Os fatores de risco de câncer podem ser encontrados no meio ambiente ou podem ser
hereditários (SPENCE; JONHSTON, 2001). A maioria dos casos (cerca de 80%) está
relacionada ao meio ambiente, onde se encontra um grande número de fatores de risco.
Entende-se por ambiente, o meio em geral (água, solo e ar), o ambiente ocupacional
(quando insalubre), o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida) e o ambiente de
consumo (alimentos e medicamentos, entre outros). As mudanças provocadas no meio
ambiente pelo próprio homem, os hábitos e estilos de vida adotados pelas pessoas podem
determinar os diferentes tipos de câncer (ALMEIDA et al., 2005).
As alterações que geram as neoplasias podem ocorrer em genes especiais
denominados protooncogenes, que a princípio são inativos em células normais. Quando
ativados, os protooncogenes transformam-se em oncogenes, responsáveis pela malignização
(transformação) das células normais. Essas células diferentes são então denominadas
tumorais. As células alteradas passam então a se comportar de forma anormal, multiplicando-
se de maneira descontrolada. Com a constante multiplicação celular, há a necessidade de que
novos vasos sanguíneos sejam formados para que haja a nutrição destas células, em um
processo denominado angiogênese (INCA, 2008).
A manutenção e o acúmulo de massa dessas células formam os tumores malignos. Elas
também podem adquirir a capacidade de se desprenderem do tumor e migrarem, invadindo
inicialmente os tecidos vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sanguíneo ou
linfático e, através desses, disseminarem-se, chegando a órgãos distantes do local onde o
tumor se iniciou, formando as metástases (SPENCE; JONHSTON, 1996; INCA, 2008).
As células cancerosas são, geralmente, menos especializadas nas suas funções que as
suas correspondentes normais. Conforme essas células vão substituindo as normais, os tecidos
invadidos vão perdendo suas funções, assim, por exemplo, a invasão neoplásica dos pulmões
gera alterações respiratórias, com isso há a disfunção orgânica que pode levar à falência do
órgão ou, em casos mais graves à morte (ALMEIDA et al., 2005).
O câncer é classificado de acordo com o tipo de célula normal que o originou, e não de
acordo com os tecidos para os quais se espalhou. Isso é o que se pode chamar de classificação
primária (FOYE et al., 1996; ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2008).
Segundo Murad e Katz (1996), quase todos os tipos podem ser colocados em um dos
seguintes grupos, onde o sufixo -oma significa literalmente tumor:
- carcinomas: são os tipos mais comuns de câncer, originando-se de células que
revestem o corpo, incluindo a pele (ectodermais) e uma série de revestimentos internos
(endodermais), como os da boca, garganta, brônquios, esôfago, estômago, intestino, bexiga,
útero e ovários, e os revestimentos dos ductos mamários, próstata e pâncreas.
Há também os carcinosarcomas, tumores geralmente de alta malignidade, derivados
de dois tipos de tecidos embrionários e os teratomas, derivados de três tipos de tecidos
embrionários (INCA, 2008).
- sarcomas: originam-se de tecidos de suporte, tais como ossos, tecido gorduroso,
músculo e tecido fibroso de reforço, encontrados na maior parte do corpo;
- linfomas: originam-se dos linfócitos, encontradas em todo o organismo,
particularmente em glândulas linfáticas e sangue. Os linfomas são divididos em Hodgkin e
não Hodgkin, de acordo com o tipo de célula afetada;
- leucemia: origina-se dos leucócitos, com alterações na sua concentração, que passa a
ser de 50.000 a 1.000.000 células por microlitro, causando problemas nos quais as células
anormais não funcionam apropriadamente, além de restringirem o espaço da medula óssea,
para que novas células sejam produzidas;
- mielomas: malignidades nas células plasmáticas da medula óssea que produzem os
anticorpos;
- tumores das células germinativas: desenvolvem-se a partir de células dos testículos
e/ou ovários;
- melanomas: originam-se dos melanócitos;
- gliomas: originam-se a partir de células do tecido de suporte cerebral ou da medula
espinhal e, raramente ocorre metástase;
- neuroblastomas: tumor geralmente pediátrico (atinge cerca de 8 milhões de crianças
até 15 anos de idade por ano; 80% dos casos com até 4 anos de idade) derivado de células
malignas embrionárias advindas de células neuronais primordiais, desde gânglios simpáticos
até medula adrenal e outros pontos.
Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia, radioterapia e
quimioterapia (FOYE et al., 1996; MURAD; KATZ, 1996). Mais recentemente tem-se usado
a terapia de fotoradiação com derivados hematoporfirínicos (HTP) e a imunoterapia, sendo
que o objetivo de cada um destes tratamentos é erradicar o câncer, normalmente por meio da
terapia combinada, onde é associado mais de um tipo de tratamento (MACHADO, 2000;
CHU; SARTORELLI, 2007).
A técnica cirúrgica pode levar à remoção de tumores com eficácia, se não houver
metástase; no caso da leucemia, por exemplo, costuma ser necessário o uso de outros tipos
conjuntos de terapia, incluindo o transplante de medula (MURAD; KATZ, 1996).
A radioterapia (geralmente raios gama, radioisótopos como cobalto-60, raios-X e até
prótons e mésons pi negativos) é usada comumente em conjunto com a cirurgia, com
incremento da eficiência do tratamento. Mesmo isoladamente, a radioterapia pode diminuir
tumores grandes, diminuir a recorrência e a chance de metástase, sendo uma metodologia
antineoplásica muito usada; entretanto, mesmo que sejam usados os sensitizadores (que
diminuem os efeitos colaterais) o tratamento por radiação é sujeito a severas limitações
(MURAD; KATZ, 1996).
A técnica antineoplásica de fotoradiação é um importante avanço, pois permite a
localização e a destruição com maior seletividade pelo uso de radiação específica com
fluorescência (l de 620-640 nm), para detecção e destruição de tumores com uso de fibras
óticas. Contudo, pelo acúmulo de porfirinas em órgãos normais ainda não se obtém uso
clínico interno, só em tumores superficiais (MACHADO, 2000).
O tratamento antineoplásico também tem usado o estímulo das próprias defesas do
organismo pela imunoterapia, com o uso de interferona, interleucina-2 e mesmo o BCG
(Bacillus Calmette Guérin) (MACHADO, 2000).
Com esses métodos de tratamento citados, um terço dos pacientes consegue ser curado
através de medidas locais (cirurgia ou radioterapia), que são eficazes quando o tumor ainda
não sofreu metástase por ocasião do tratamento. Todavia, nos demais casos, a neoplasia
caracteriza-se pelo desenvolvimento precoce de micrometástases, indicando a necessidade de
uma abordagem sistêmica, que pode ser efetuada, em cerca de 60-70% dos casos com a
quimioterapia (MACHADO, 2000; CHU; SARTORELLI, 2007).
2.2. QUIMIOTERAPIA
O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células neoplásicas, preservando as
normais. Entretanto, a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não-específica,
lesando tanto células malignas quanto normais (MURAD; KATZ, 1996; CHU;
SARTORELLI, 2007), o que explica a maior parte dos efeitos colaterais (MACHADO, 2000;
OLIVEIRA, 2002).
Segundo Grahame e Smith-Aronson (2004) a resposta do tumor à quimioterapia pode
ser classificada em três categorias:
- tumores altamente quimiossensíveis: são aqueles que exibem uma elevada taxa de
resposta completa (desaparecimento completo de toda a doença detectável clínica e
radiologicamente por, no mínimo, quatro semanas). Em geral, mostram-se sensíveis a
diversos fármacos, e prefere-se a poliquimioterapia;
- tumores moderadamente quimiossensíveis: apresentam baixa taxa de resposta
completa à quimioterapia (cerca de 10%), porém uma elevada taxa de resposta parcial
(redução de mais de 50% da soma dos produtos dos dois maiores diâmetros perpendiculares,
de todas as lesões mensuráveis por um período mínimo de quatro semanas) (cerca de 50%). A
quimioterapia mostra-se útil como adjuvante para a cirurgia e radioterapia;
- tumores quimiorresistentes: apresentam uma taxa de resposta em torno de 20% e
as respostas completas são raras, embora a quimioterapia possa desempenhar um papel
auxiliar no caso de certos tipos de tumores. A quimioterapia de combinação raramente é mais
eficaz do que o tratamento com apenas um único fármaco. Os agentes citotóxicos também
podem ser utilizados para aliviar os sintomas, quando as medidas locais não têm êxito.
2.2.1 Classificação dos fármacos antineoplásicos
A importância clínica dos agentes antineoplásicos induz à necessidade de um estudo
sistemático, o que primeiramente deveria ser feito com o uso de classificações químicas,
levando-se em conta os diferentes grupos funcionais presentes na estrutura das moléculas.
Contudo, a variedade de tipos de compostos utilizados em quimioterapia oncológica é tão
grande, que tal classificação só pode ser feita indiretamente (ALMEIDA et al., 2005).
Chabner e Calabresi (1995) descreveram uma classificação conveniente dos fármacos
antineoplásicos onde o critério baseia-se no mecanismo de ação das diferentes etapas da
síntese de ADN, transcrição e transdução (Figura 1).
Figura 1- Classificação dos antineoplásicos segundo ponto de interferência no mecanismo de
ação das diferentes etapas da síntese de ADN, transcrição e transdução
Fonte: CHABNER; CALABRESI, 1995
De fato, existem diversos mecanismos que estão envolvidos na evolução de uma
célula normal para uma célula potencialmente maligna (HAHN; WEINBERG, 2002), mas a
maior parte deles interfere na divisão celular e, assim, os conhecimentos do ciclo celular ou
dos seus mecanismos são importantes para que haja a compreensão da etiologia do câncer
(CHU; SARTORELLI, 2007).
Muitos fármacos efetivos contra o câncer, exercem sua ação sobre as células que se
encontram no ciclo celular, razão pela qual são denominados fármacos específicos do ciclo
celular (ECC) (MIGUEL JÚNIOR, 2007).
A pós-mitose é o período ativo que se pode chamar de crescimento celular e constitui
a fase denominada G
1
(G de gap em inglês, que significa lacuna ou intervalo) ou interfase, em
que enzimas necessárias à duplicação do ADN, síntese de proteínas e ARN são produzidas. A
fase G
1
é seguida da fase S ou de síntese do ADN, dando seqüência ao período pré-mitótico
da fase G
2
, em que cessa a síntese do ADN, e continua a síntese do ARN, proteínas e são
produzidos os precursores dos microtúbulos e do fuso mitótico. Imediatamente, segue-se a
fase M (mitose), em que as taxas de proteínas e de síntese do ARN diminuem abruptamente,
enquanto o material genético é segregado para as células-filhas, e estas entram novamente na
fase G
1
. Esta fase é antecedida por uma fase G
0
(descanso celular), em que a síntese
macromolecular é inativa, sendo a célula, nesse período, resistente à ação da maioria dos
agentes antineoplásicos (MIGUEL JÚNIOR, 2007).
Um segundo grupo de fármacos, denominados fármacos inespecíficos do ciclo celular
(ICC), tem a capacidade de esterilizar as células tumorais, independentemente de estarem
atravessando o ciclo ou de se encontrarem em repouso no compartimento G
0
(MURAD;
KATZ, 1996; CHABNER; CALABRESI, 1995; CHU; SARTORELLI, 2007).
Outra classificação elaborada por Korolkovas, 2005 engloba os hormônios e análogos,
conforme demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1- Classificação dos antineoplásicos, segundo Korolkovas
Classe de fármacos Exemplos
agentes alquilantes
ciclofosfamida, clorambucila, ifosfamida, melfalano, carmustina,
fotemustina, lomustina, bussulfano, dacarbazina
antimetabólitos
metotrexato, raltitrexato, capecitabina, citarabina, 5-fluoruracila,
gencitabina, cladribina, fludarabina, mercaptopurina, tioguanina
compostos de platina
carboplatina, cisplatina, oxaliplatina
antibióticos
bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dactinomicina,
epirrubicina, idarrubicina, mitomicina
produtos vegetais
vincristina, vimblastina, etoposido, teniposido
hormônios e análogos
dexametasona, prednisona, tamoxifeno
agentes diversos
aminoglutetimida, asparaginase, tretinoína, procarbazina,
interferona α e β, interleucina-2
Fonte: Korolkovas, 2005
Nos esquemas quimioterápicos muitas doses são expressas em miligramas (mg) por
metro quadrado (m
2
) de área de superfície corporal. Essa forma de expressão deve-se ao fato
dos experimentos em animais demonstrarem uma relação mais estreita entre dose e efeito,
quando a dose é corrigida pela área de superfície corporal, do que quando corrigida pelo peso
corporal. Aproximadamente, a área de superfície de um homem de 70 kg é geralmente
considerada como cerca de 1,73 m
2
(GRAHAME; SMITH-ARONSON, 2004).
2.2.2 Quimioterapia de combinação ou poliquimioterapia
As combinações de quimioterápicos são particularmente eficazes nos tumores
quimiossensíveis (GRAHAME; SMITH-ARONSON, 2004). É possível obter uma maior
eficácia global do tratamento com toxicidade aceitável; por exemplo, a vincristina e a
prednisolona não possui acentuada mielotoxicidade e podem ser combinadas com sucesso
com a doxorrubicina, no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (GRAHAME; SMITH-
ARONSON, 2004).
Vários protocolos de tratamento de câncer foram desenvolvidos, e cada um é aplicável
a um estado neoplásico em particular. O tratamento é intermitente para permitir a
recuperação do tecido normal e do sistema imune do paciente, que também é afetado pelos
fármacos, reduzindo assim, o risco de infecção grave (HOWLAND; MYCEK, 2007).
Os protocolos para tratamento na quimioterapia são identificados por acrônimos,
identificando os agentes usados na combinação. A Tabela 2 exemplifica os protocolos mais
usados e suas indicações (CHU; SARTORELLI, 2005; KOROLKOVAS, 2005).
Tabela 2 - Acrônimos dos protocolos de quimioterapia, seus componentes e sua principal
indicação (continua)
Acrônimo do
protocolo
Componentes Principal Indicação
ABVD
adriamicina (doxorrubicina), bleomicina,
vimblastina, dacarbazina
linfoma de Hodgkin
AC
adriamicina, ciclofosfamida
câncer de mama
BEACOPP
bleomicina, etoposida, adriamicina, ciclofosfamida,
oncovin
®
(vincristina), procarbazina, prednisona
linfoma de Hodgkin
Tabela
2
-
Acrônimos dos protocolos de quimioterapia, seus componentes e sua
principal indicação (continua)
Acrônimo do
protocolo
Componentes Principal Indicação
BEP
bleomicina, etoposida, cisplatina
câncer testicular,
tumor
de células germinais
CAF
ciclofosfamida, adriamicina, fluoruracila câncer de mama
CAV
ciclofosfamida, adriamicina, vincristina
câncer de pulmão
CBV
ciclofosfamida, BCNU (carmustina),
VP-16 (etoposida)
linfoma
ChlVPP/EVA
clorambucil, vincristina, procarbazina, prednisona,
etoposida, vimblastina, adriamicina
linfoma de Hodgkin
CHOP
ciclofosfamida, hidroxidorrubicina (doxorrubicina),
oncovin
®
, prednisona
linfoma não - Hodgkin
CHOP ou CVP
ciclofosfamida, oncovin
®
(vincristina), prednisona linfoma não - Hodgkin
CMF
ciclofosfamida, metotrexato, fluoruracila câncer de mama
COPP
ciclofosfamida, oncovin
®
, procarbazina, prednisona
linfoma não - Hodgkin
EC
epirrubicina, ciclofosfamida
câncer de mama
ECF
epirrubicina, cisplatina, fluoruracila câncer do estômago
e
câncer esofágico
FEC
fluoruracila, epirrubicina, ciclofosfamida
câncer de mama
FOLFOX
fluoruracila, leucovorina (ácido folínico
),
oxaliplatina
câncer colorretal
m-BACOD
metotrexato, bleomicina
, adriamicina,
ciclofosfamida, oncovin
®
dexametasona
linfoma não - Hodgkin
MACOP-B
metotrexato, ácido folínico
, adriamicina,
ciclofosfamida, oncovin
®
, prednisona, bleomicina
linfoma não – Hodgkin
MOPP
mecloretamina, oncovin
®
, procarbazina,
prednisona
linfoma de Hodgkin
PCV
procarbazina, CCNU (lomustina), vincristina
tumor cerebral
Tabela 2
-
Acrônimos dos protocolos de quimioterapia, seus componentes e sua
principal indicação (conclusão)
Acrônimo do
protocolo
Componentes Principal Indicação
ProMACE-
CytaBOM
prednisona, adriamicina, ciclofosfamida, etoposida,
citarabina, bleomicina, oncovin
®
, metotrexato,
leucovorina (ácido folínico)
linfoma não- Hodgkin
R-FCM
rituximabe, fludarabina, ciclofosfamida,
mitoxantrona
linfoma não-
Hodgkin
das células B
Stanford V
doxorrubicina, mecloretamina, bleomicina,
vimblastina, vincristina, etoposida, prednisona
linfoma de Hodgkin
VAD
vincristina, adriamicina, dexametasona
mieloma múltiplo
Fontes: KOROLKOVAS, 2005; CHU; SARTORELLI, 2007
2.2.3 Fármacos utilizados na quimioterapia
Dentre os fármacos utilizados nos protocolos de quimioterapia, destacam-se:
ciclofosfamida, doxorrubicina, 5-fluoruracila, ifosfamida, metotrexato e paclitaxel, em vista
da freqüência da utilização e/ou da toxicidade. Abaixo, estão descritos alguns aspectos dessas
substâncias, dentre eles a importância na prática clínica e a toxicidade.
2.2.3.1 Ciclofosfamida (CF)
a. Propriedades
É um agente antineoplásico sintético, pertencente à classe dos agentes alquilantes, no
grupo das mostardas nitrogenadas. As tentativas de modificar a estrutura química da
mecloretamina a fim obter maior seletividade para os tecidos neoplásicos levaram ao seu
desenvolvimento (CHABNER; CALABRESI, 1995).
Constitui-se de um pó branco ou quase branco, cristalino e inodoro. É solúvel em água
e álcool, fracamente solúvel em benzeno, etilenoglicol, tetracloreto de carbono e dioxano,
pouco solúvel em éter e em acetona (MERCK INDEX, 2001).
Apresenta ponto de fusão de 49,9-53ºC e a solução aquosa tem atividade por poucas
horas, à temperatura ambiente (25ºC), ocorrendo hidrólise a temperaturas acima de 30ºC, com
liberação de átomos de cloro e outros fumos tóxicos, tais como óxido de fósforo e fosfina. A
relativa solubilidade em meio aquoso implica no aumento no tempo de exposição
(ANDERSON et al., 1995; MINOIA; PERBELLINI, 2000). Deve ser estocada em recipientes
herméticos com a temperatura de 2 a 8ºC (MERCK INDEX, 2001).
Sua forma molecular é C
7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P. H
2
O e possui peso molecular de 279,1. Seu
nome químico é 2- [bis (2-cloroetil) amino]tetrahidro-2H-1,3,2-oxazafosforina 2-óxido
monohidrato e seu número de registro no Chemical Abstracts Service (CAS) é 50-18-0
(MARTINDALE, 1996). A Figura 2 mostra sua fórmula estrutural.
O
N
P N
H
O
ClCl
Figura 2- Fórmula estrutural da ciclofosfamida
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
A ciclofosfamida pode ser absorvida por via dérmica e inalatória. Sua meia-vida
plasmática, após administração oral ou endovenosa, é de cerca de 6 a 8 horas e, nas primeiras
24 horas, há um rápido declínio da concentração. O pico plasmático dos produtos de
biotransformação ativos é em torno de 3 a 6 horas, com meia-vida de eliminação de cerca de 9
horas (MINOIA; PERBELLINI, 2000). Estudos têm demonstrado que a cinética deste
fármaco é linear e não dose-dependente (ANDERSON et al., 1995; MINOIA; PERBELLINI,
2000).
A via renal é a principal via de excreção do fármaco e de seus produtos de
biotransformação. Na urina pode ser determinada 2/3 da dose administrada, sendo cerca de
10% excretada na forma inalterada. Sua concentração nas fezes não é elevada, entretanto, sua
presença em grande quantidade na bile sugere a passagem pelo ciclo entero-hepático
(MINOIA; PERBELLINI, 2000).
A atividade biológica da ciclofosfamida, bem como do restante dos integrantes do
grupo das mostardas nitrogenadas, baseia-se na presença do grupo bis-(2-cloroetil) o qual
sofre hidroxilação no fígado pelo grupo CYP2B, sendo assim convertida em 4-hidroxi-
ciclofosfamida (CHABNER; CALABRESI, 1995).
A hidroxi-ciclofosfamida fica em equilíbrio dinâmico com seu tautômero acíclico
aldofosfamida. A bioativação da aldofosfamida ocorre espontaneamente formando a acroleína
e a mostarda de fosforamida, a qual se converte em mostarda nitrogenada. A acroleína se liga
covalentemente às proteínas e causa cistite hemorrágica. A hidroxi-ciclofosfamida pode ainda
pode ser oxidada pela aldeído oxidase no fígado ou no tecido tumoral e, talvez por outras
enzimas, produzindo a carboxifosfamida e a 4-cetociclofosfamida, que não possuem atividade
biológica significativa. Aparentemente, a lesão hepática é minimizada por essas reações
secundárias, enquanto quantidades significativas dos metabólitos ativos, como a 4-
hidroxifosfamida e a aldofosfamida são transportadas até o sítio alvo através do sangue
(CHABNER; CALABRESI, 1995). Atravessa parcialmente a barreira hematoencefálica e
placentária (KOROLKOVAS, 2005).
c. Farmacodinâmica
É um pró-fármaco necessitando de processo de ativação complexo (no fígado e
tecidos) antes de exercer função antitumoral (KOROLKOVAS, 2005). A classe dos agentes
alquilantes, a qual essa substância pertence, tem a propriedade de se tornar um eletrólito forte
pela formação de intermediários de íon carbônio ou de complexos com a molécula de ácido
dexorribonucleico (ADN). Essas reações resultam na formação de ligações covalentes entre o
ADN e componentes nucleofílicos, formados pela alquilação, tais como grupos fosfato,
amino, sulfidrila, hidroxila, carboxila e imidazol, causando danos estruturais ao ácido
nucléico (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
d. Indicações clínicas
O espectro clínico de atividade da ciclofosfamida é muito amplo. Entre as vantagens
de seu uso estão a disponibilidade oral e a possibilidade de administração de doses durante
períodos prolongados, possuindo, portanto, grande versatilidade de ação. Apesar de ser eficaz
como único fármaco no tratamento de malignidades susceptíveis, é frequentemente usada em
associação com outros fármacos antineoplásicos, em vista de sua toxicidade (CHABNER;
CALABRESI, 1995).
Entre as principais indicações citam-se as desordens mieloproliferativas e
linfoproliferativas (linfomas malignos, mieloma múltiplo, leucemias e micose fungóide);
tumores malignos sólidos frequentemente sensíveis (neuroblastoma, adenocarcinoma de
ovário e retinoblastoma); tumores malignos raramente sensíveis (carcinoma de mama e
neoplasias malignas do pulmão).
Em virtude de suas potentes propriedades imunossupressoras, esse fármaco recebeu
considerável atenção para o uso no controle da rejeição de órgãos após transplante, bem como
em distúrbios não-neoplásicos associados a alterações de reatividade imune (CHABNER;
CALABRESI, 1995; MARTINDALE, 1996).
e. Efeitos tóxicos
Os efeitos mais comumente observados são de alopecia, náuseas, vômitos e diarréias,
leucocitose e cistite hemorrágica, podendo levar à fibrose da bexiga (HOWLAND; MYCEK,
2007).
Esse efeito pode ser atenuado através do aumento da ingestão de líquidos e
administração de compostos doadores de sulfidrila, como N-acetilcisteína ou MESNA [2-
mercaptoetano sulfonato sódico]. Esses agentes interagem especificamente com a acroleína,
formando compostos detoxificados (RANG et al., 2004).
Outros efeitos incluem aqueles observados nas células germinativas, resultando em
amenorréia, atrofia testicular e esterilidade. Doença venoclusiva do fígado é verificada em
cerca de 25% dos pacientes. Tumores secundários podem aparecer anos após o tratamento
(HOWLAND; MYCEK, 2007).
A International Agency for Research on Cancer (IARC) classifica a ciclofosfamida no
Grupo 1 (agente reconhecidamente carcinogênico, mutagênico e teratogênico para animais e
humanos) (IARC, 2008).
Quanto à mutagenicidade, verificou-se que a ciclofosfamida induz mutações nos pares
de bases de linhagem de Salmonella typhimurium na presença de ativação metabólica, testes
estes negativos para Escherichia coli. Em células somáticas produz mutações nos genes,
aberrações cromossômicas e troca de cromátides-irmãs. É demonstrada a formação de adutos
de ADN, em vários sistemas in vitro, e o risco genético estimado é de 1 mg de ciclofosfamida
por Kg de peso corpóreo, sob condições agudas de exposição (ANDERSON et al., 1995).
Em relação à carcinogenicidade, foi demonstrado que pacientes tratados com
ciclofosfamida apresentam maior risco de desenvolver leucemia e outros tipos de câncer. Em
um estudo realizado com 1349 pacientes, com doenças não-malignas, tratados com
azatioprina, ciclofosfamida ou clorambucila por um período de 3 meses, foi demonstrado que
houve um aumento de 5 vezes na incidência de carcinomas nas células escamosas epiteliais,
de 9 vezes de câncer hepático e de 1,4 vezes de outros carcinomas (TURCI et al., 2003). Os
principais órgãos-alvos da carcinogenicidade da ciclofosfamida são a medula óssea e o
sistema urinário (TOMATIS, 2000).
2.2.3.2. Doxorrubicina (DOX)
a. Propriedades
Em muitos países o nome “adriamicina” é sua marca registrada. É um antibiótico
antitumoral da classe das antraciclinas, produto da fermentação de um fungo denominado
Streptomyces peucetius, variedade caesius (MARTINDALE, 1996).
Os antibióticos doxorrubicina, daunorrubicina e seus derivados estão entre os mais
importantes agentes antimumorais, introduzidos na quimioterapia do câncer há cerca de duas
décadas. Embora existam marcantes diferenças no uso clínico da doxorrubicina e
daunorrubicina, suas estruturas químicas se diferem apenas pela presença de um grupo
hidroxila no carbono 14 (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
Apresenta-se na forma de cloridrato como pó cristalino de cor laranja a vermelho,
higroscópico (MARTINDALE, 1996). Devido a sua forte ação irritante e vesicante ao contato
com a pele, olhos e mucosas em geral, sua manipulação deve ser efetuada com a máxima
cautela (MINOIA ; PERBELLINE, 2000).
É solúvel em água, metanol e cloreto de sódio 0,9%; insolúvel em acetona, benzeno,
clorofórmio, éter etílico e em éter de petróleo (MERCK INDEX, 2001). Soluções aquosas
possuem cor laranja em pH ácido e cor violeta em pH alcalino. Seu ponto de fusão, com
decomposição, é de 204 a 205ºC. Sua estocagem deve ser em recipientes herméticos e
protegidos da luz (MERCK INDEX, 2001).
Sua fórmula molecular é C
27
H
29
NO
11
. HCl com peso molecular de 580,0. Seu nome
químico é 14-hidroxi-daunomicina com número de registro no Chemical Abstracts Service
igual a 25316-40-9 (MARTINDALE, 1996). A Figura 3 demonstra sua fórmula estrutural.
O
CH
3
O
O
OH
OH
H
O O
NH
2
OH
CH
3
OH
O
OH
Figura 3- Fórmula estrutural da doxorrubicina
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
O fármaco que necessita ser administrado por via intravenosa, pois é inativado no trato
gastrointestinal, todavia o extravasamento pode levar à necrose tissular (CHU;
SARTORELLI, 2007). A doxorrubicina é metabolizada extensamente no fígado, e em outros
tecidos pela enzima aldoceto redutase, resultando em doxorrubicinol (adriamicinol), seu
principal metabólito, o qual tem atividade antineoplásica, os outros metabólitos que são
terapeuticamente inativos, incluem doxorrubicinona (adriamicinona), agliconas e conjugados.
O metabólito hidroxilado é a espécie ativa, enquanto a aglicona é inativa.
Até 50% do fármaco são eliminados nas fezes por excreção biliar; por conseguinte, é
necessário reduzir a dose na presença de disfunção hepática. Embora as antraciclinas sejam
habitualmente administradas em um esquema a cada 3 semanas, foi constatado que esquemas
alternativos de administração, como uma dose baixa semanalmente ou infusões contínuas de
72 a 96 h, produzem eficácia clínica equivalente com redução da toxicidade global (CHU;
SARTORELLI, 2007). O fármaco confere coloração vermelha à urina (HOWLAND;
MYCEK, 2007).
c. Farmacodinâmica
Exerce sua ação citotóxica por meio de quatro mecanismos principais: (1) inibição da
topoisomerase II; (2) ligação de alta afinidade ao ADN através de intercalação, com o
conseqüente bloqueio da síntese do ADN e ARN, bem como a ruptura dos filamentos de
ADN; (3) ligação às membranas celulares, alterando a sua fluidez, assim como o transporte de
íons; e (4) produção de radicais livres de semiquinona e de oxigênio por um processo redutor
mediado por enzima e radicais de oxigênio. Esse mecanismo de radicais livres foi
estabelecido como causa da cardiotoxicidade associada às antraciclinas (CHU;
SARTORELLI, 2007).
d. Indicações Clínicas
É um dos fármacos antineoplásicos de maior importância, com grande atividade
clínica nos cânceres de mama, endométrio, ovário, testículo, tireóide, estômago, bexiga e
pulmão; nos sarcomas de tecido mole e em vários cânceres infantis como o neuroblastoma,
osteossarcoma e rabdomiossarcoma. Além disso, é amplamente utilizada em neoplasias
malignas hematológicas, como a leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiplo e linfomas
de Hodgkin e não Hodgkin (CHU; SARTORELLI, 2007).
e. Efeitos tóxicos
A doxorrubicina causa mielossupressão temporária, mucosite (estomatite), as quais
representam a toxicidade aguda, dose-limitante, desse agente. Além disso, são observados
ainda, distúrbios do trato gastrointestinal, aumento da pigmentação da pele, alopecia intensa
(BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004; HOWLAND; MYCEK, 2007). Efeitos
pronunciados são observados sobre o sistema cardíaco, em vista da cardiotoxicidade dose-
dependente e irreversível, resultante da geração de radicais livres e lipoperoxidação. Há
algum sucesso na proteção a esses efeitos com a utilização do ferro, como quelante. A
irradiação do tórax aumenta o risco de cardiotoxicidade. Uma nova formulação de
doxorrubicina encapsulada em lipossomos é apontada como menos cardiotóxica do que a
formulação usual (HOWLAND; MYCEK, 2007). Está demonstrado que pacientes tratados
com antraciclinas apresentam um maior risco de desenvolverem neoplasias secundárias
(SCHMAHL et al (1982); TUCKER et al (1988) apud MINOIA; PERBELLINE, 2000)
A IARC classifica a doxorrubicina (adriamicina) no grupo 2A, como provável
carcinógeno humano, ou seja, há evidências inadequadas sobre a carcinogenicidade em
humanos, mas evidencias suficientes em animais (IARC, 2008).
2.2.3.3. 5-Fluoruracila (5-FU)
a. Propriedades
É um agente antineoplásico pertencente à classe dos antimetabólitos. Constitui-se de
um pó branco ou quase branco, cristalino com leve odor. É pouco solúvel em água, solúvel
em álcool, praticamente insolúvel em clorofórmio e éter (MARTINDALE, 1996). Seu ponto
de fusão é de 282 a 283 ºC sublimando a 190 a 200ºC (NIOSH, 2004).
Sua estocagem deve ser em recipientes herméticos e protegidos da luz
(MARTINDALE, 1996). Sua forma molecular é C
4
H
3
FN
2
O
2
com peso molecular de 130,08.
Seu nome químico é 5-fluor-1H-pirimidina-2,4-diona, e seu número de registro no Chemical
Abstracts Service é 51-21-8 (MARTINDALE, 1996). A Figura 4 demonstra sua fórmula
estrutural.
OO
N
H
NH
F
Figura 4- Fórmula estrutural da 5-fluoruracila
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
Estudos de Minoia; Perbellini, (2000) sugerem a absorção da 5-fluoruracila por via
dérmica e inalatória. Não é administrada por via oral, visto que a sua biodisponibilidade é
comprometida pela presença de altos níveis da enzima de degradação, a dihidropirimidina
desidrogenase, na mucosa intestinal. Até 85% da dose de 5-FU são catabolizados por essa
enzima (CHU; SARTORELLI, 2007).
Por via tópica, a absorção sistêmica é mínima (6%), com início de ação em 2 a 3 dias.
Todavia, após administração intravenosa, é distribuído nos tecidos e fluidos extracelulares,
incluindo tecidos neoplásicos, mucosa intestinal, medula óssea, fígado e cérebro. Atravessa a
barreira hematoencefálica e placentária, sendo seu volume de distribuição de 0,12 L Kg
-1
. A
biotransformação é rápida (em torno de uma hora) nos tecidos, produzindo os produtos 5-
monofosfato de fluoruridina e monofosfato de floxuridina. A meia-vida plasmática é de 8 a 14
minutos (KOROLKOVAS, 2005).
A eliminação se dá principalmente por via respiratória (aproximadamente 90%, como
dióxido de carbono em 8 a 12 horas) e em menor proporção por via renal dentro de 6 horas,
aproximadamente de 7 a 20% na forma inalterada, sendo 90% na primeira hora (CHU;
SARTORELLI, 2007; KOROLKOVAS, 2005).
c. Farmacodinâmica
A 5-fluoruracila, um análogo da pirimidina, tem um átomo estável de fluoreto no lugar
de um átomo de hidrogênio na posição 5 do anel uracila. O fluoreto interfere na conversão do
ácido desoxiuridílico a ácido timidílico, privando assim a célula de um dos precursores
essenciais da síntese de ADN (HOWLAND; MYCEK, 2007).
Na sua forma inalterada a 5-FU não possui atividade antineoplásica. Ela entra na
célula por um sistema de transporte com carregador e é convertida ao desoxinucleotídeo
correspondente (monofosfato de 5-fluor-desoxiuridina (5-FdUMP)), que compete com o
monofosfato de desoxiuridina (dUMP) pela timidilato-sintetase. A síntese de ADN diminui,
levando ao crescimento celular desequilibrado e morte celular.
d. Indicações clínicas
É indicado para o tratamento do carcinoma colo-retal, gástrico, pancreático e de
mama, em pacientes considerados incuráveis por cirurgia ou outros tratamentos. Ainda, para
carcinoma prostático, de bexiga, do epitélio ovariano, cervical, endometrial, anal, esofágico e
tumores metastáticos de carcinoma de pele, hepáticos, de cabeça e pescoço e hepatoblastoma,
carcinoma adrenocortical, vulvar, peniano, tumores carcinóides gastrintestinais e
neuroendócrinos em terapia combinada (BOENTE; SAMPAIO-FILHO; DelGIGLIO, 2002).
Na forma tópica o fármaco é indicado para tratamento de condições pré-cancerosas da
pele e carcinoma de célula basal não sensível a outros tratamentos (CHABNER;
CALABRESI, 1995; BRASIL, 2000).
e. Efeitos tóxicos
Além de náuseas e vômitos, a diarréia e a alopecia são frequentemente verificados,
como também ulcerações graves da mucosa oral e gastrintestinal, depressão da medula óssea
(com a injeção em bolus) e anorexia. Dermopatia denominada “síndrome mãos-pés” é
encontrada depois de infusões prolongadas (HOWLAND; MYCEK, 2007).
A 5-FU é classificada no grupo 3 da IARC, ou seja, um agente não carcinógeno em
humanos (IARC, 2008), entretanto existem controvérsias. TURCI et al. (2003), sugerem que
esta classificação foi baseada em evidências inadequadas sobre carcinógenos em humanos e
animais. A 5-FU é um agente mutagênico e teratogênico bem como a maioria dos fármacos
antineoplásicos (FALCK et al. 1979; SORSA, HEMMINK, VAINIO, 1985; MICOLI et al.
2001). Larson, Khazaeli e Dilon (2003) sugerem que a 5-FU é um fármaco com probabilidade
de causar efeitos teratogênicos durante a gravidez.
A administração por via tópica pode ocasionar reações na pele normal adjacente.
Deve-se evitar exposição prolongada à radiação UV (ultravioleta), pois podem ocorrer
reações de fotossensibilidade (KOROLKOVAS, 2005).
2.2.3.4. Ifosfamida (IFO)
a. Propriedades
É um agente antineoplásico, pertencente à classe dos agentes alquilantes, no grupo das
mostardas nitrogenadas e é um análogo da ciclofosfamida, diferindo dessa pela substituição
por um grupo 2-cloroetil no átomo de nitrogênio do anel da ciclofosfamida, como
demonstrado na Figura 5 (BELIZÁRIO, GARAY, DELUCIA, 2004). Apresenta-se como
pó cristalino, branco e, é solúvel em água, álcool metílico, álcool isopropílico, acetato de etila
e cloreto de metila. Seu pH a 10% em água é de 4 a 7 (MARTINDALE, 1996) e seu ponto de
fusão é de 39 a 40ºC (MERCK INDEX, 2001). Deve ser estocado em recipientes herméticos e
protegido da luz, de preferência sob refrigeração (NIOSH, 2004).
Seu nome químico é 3-(2-cloroetil)-2-(2-cloroetil)-amino)tetrahidro-2H-1,3,2-
oxazafosforina 2-óxido (Figura 5) e sua fórmula molecular é: C
7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P com peso
molecular de 261,09. Seu registro no Chemical Abstracts Service (CAS) é nº 3778-73-2
(MARTINDALE, 1996).
O
NH
P N
O
Cl
Cl
Figura 5- Fórmula estrutural da ifosfamida
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
Estudos de Minoia; Perbellini, (2000) sugerem a absorção da ifosfamida por via
dérmica e inalatória. Ao contrário da maioria dos fármacos alquilantes, a ifosfamida é
administrada preferencialmente pela via oral. In vivo é ativado pelas enzimas microssômicas
hepáticas ao metabólito citotóxico (HOWLAND; MYCEK, 2007).
Sofre hidroxilação, formando o intermediário instável 4-hidroxi-ifosfamida; este se
degrada rapidamente, originando o metabólito urinário estável, 4-cetoifosfamida; forma-se
também o metabólito estável 4-carboxifosfamida, não sendo, esses metabólitos urinários
citotóxicos. A oxidação enzimática das cadeias laterais e a desalquilação, subseqüente,
produzem os metabólitos urinários principais, ifosfamida descloroetila e ciclofosfamida
descloroetila (KOROLKOVAS, 2005).
Para se tornar ativo, o composto também requer alteração metabólica no fígado, onde
é transformado em 4-hidroxifosfamida, a qual está em equilíbrio com a aldofosfamida. A
aldofosfamida sofre então transformação espontânea em mostarda fosforamida, pela
eliminação da acroleína. O composto antitumoral ativo é a mostarda fosforamida, enquanto a
acroleína é responsável pela urotoxicidade (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
Em doses de 3,8 a 5 g m
-2
por dia, as concentrações plasmáticas decaem bifasicamente
e a meia-vida de eliminação terminal é de cerca de 20 horas. Em doses de 1,6 a 2,4 g m
-2
por
dia, as concentrações plasmáticas decaem exponencialmente e a meia-vida de eliminação é de
cerca de 7 horas. Após doses de 5 g m
-2
, é eliminada pela urina, na proporção de 70 a 86%,
sendo em torno de 61% na forma inalterada. Após doses de 1,6 a 2,4 g m
-2
só 12 a 18% são
excretados pela urina na forma inalterada, dentro de 72 horas (KOROLKOVAS, 2005).
Quantidades mínimas do fármaco são excretadas nas fezes após o transporte biliar
(HOWLAND; MYCEK, 2007).
c. Farmacodinâmica
A classe dos agentes alquilantes, a qual essa substância pertence, tem a propriedade de
se tornar um eletrólito forte pela formação de intermediários de íon carbônio ou de complexos
com a molécula de ácido dexorribonucleico (ADN). Essas reações resultam na formação de
ligações covalentes entre o ADN e componentes nucleofílicos, formados pela alquilação, tais
como grupos fosfato, amino, sulfidrila, hidroxila, carboxila e imidazol, causando danos
estruturais ao ácido nucléico (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
d. Indicações Clínicas
Apresenta um amplo espectro de atividade antitumoral quando usado isolado ou em
combinação com outros fármacos citostáticos, especialmente em pacientes refratários a outros
regimes terapêuticos. Os melhores resultados foram observados em tumores de testículo,
câncer de pulmão, ovário, sarcomas de partes moles e também em linfomas (BELIZÁRIO;
GARAY; DELUCIA, 2004).
e. Efeitos tóxicos
A ifosfamida faz parte de vários esquemas alternativos e apresenta toxicidade
hematológica mais pronunciada que a ciclofosfamida (BOENTE; FILHO-SAMPAIO; Del
GIGLIO, 2002). A toxicidade da ifosfamida é marcada pelo aparecimento de náuseas,
vômitos, alopecia e moderada mielossupressão, elevação das enzimas hepáticas,
nefrotoxicidade e urotoxicidade (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
O fator dose-limitante em vista disso é a urotoxicidade que se caracteriza pelo
aparecimento de cistite hemorrágica, e no esforço para prevenir a cistite hemorrágica, várias
medidas têm sido empregadas, incluindo grande ingestão de líquidos, alcalinização da urina, a
administração de diuréticos e instilação vesical de compostos como N-acetilcisteína e
MESNA (BELIZÁRIO; GARAY; DELUCIA, 2004).
A ifosfamida tem demonstrado ser carcinogênica em animais, não havendo evidências
de carcinogenicidade em humanos. Por este motivo, a IARC a classifica no grupo 3 (não
carcinógena para humanos) (IARC, 2008). Entretanto devido a sua similaridade estrutural
com a ciclofosfamida, a ifosfamida deve ser considerada um suspeito carcinógeno (TURCI et
al., 2003; CHABNER; CALABRESI, 1996).
2.2.3.5. Metotrexato (MTX)
a. Propriedades
É um agente antineoplásico da classe dos antimetabólitos (HOWLAND; MYCEK,
2007). Apresenta-se como um pó cristalino, de cor amarela a laranja, higroscópica, não
contendo mais que 13% de água (MERCK INDEX, 2001). É praticamente insolúvel em água,
álcool, clorofórmio, éter e diclorometano, solúvel em soluções diluídas de ácidos minerais,
soluções alcalinas de hidróxidos e carbonatos. Possui ponto de fusão de 185 a 204ºC
(MARTINDALE, 1996).
Sofre degradação se exposto à luz direta, com perda de aproximadamente 11,0% do
fármaco, após 7 horas (MARTINDALE, 1996). Seu nome químico é (S)-2-(4-(((2,4-
diaminopteridino-6-il)
metil
) metilamino) benzamido) ácido pentanodióico, ou 4 –amino-4-
deoxi-10-metilpteroil-L-glutâmico e seu registro no Chemical Abstracts Service é nº 59-05-
02.
Sua forma molecular é C
20
H
22
N
8
O
5
, com peso molecular de 454,44 (MARTINDALE,
1996). Sua fórmula estrutural está representada na Figura 6.
N
N
N
N
NH
2
NH
2
N
CH
3
NH
O
O
O H
O HO
Figura 6- Fórmula estrutural do metotrexato
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
Estudos de Minoia; Perbellini, (2000) sugerem a absorção do metotrexato, por via
dérmica e inalatória.
A absorção oral é considerada elevada em doses inferiores a 30 mg m
-2
;
em doses maiores, é incompleta. A biodisponibilidade oral é de 90% em doses até 30 mg m
-2
e diminui à medida que a dose é aumentada, sendo que o pico plasmático ocorre de 0,6 a 4
horas após administração oral. É absorvido completamente por via intramuscular e a
biodisponibilidade é de 76 a 100%, não variando com a dose, com pico plasmático de 0,5-2
horas (KOROLKOVAS, 2005).
A taxa de ligação a proteínas é de 50% e seu volume de distribuição é de 0,4- 0,9 L
por Kg de peso corpóreo. Atravessa a placenta e se distribui no epitélio intestinal, fígado e
rins. É observado em líquido de ascite e derrames pleurais. A meia-vida de eliminação é de 8-
15 horas para altas doses e de 3-10 horas, em doses baixas. É pouco metabolizado (<10%) no
fígado com produção de 7-hidroxi-metotrexato e poliglutamatos. É excretado pelos rins na
forma inalterada (80 - 90%) e pela bile (0 - 10%), não podendo ser removido por diálise
(CHABNER; CALABRESI, 1995).
c. Farmacodinâmica
Por ser um agente antimetabólito e antagonista do ácido fólico está estruturalmente
relacionado com compostos normais encontrados do interior da célula. Estes compostos
geralmente interferem na disponibilidade de precursores nucleotídeos de purina ou pirimidina,
por inibirem a síntese de ADN ou de ARN (HOWLAND; MYCEK, 2007).
O
MTX
inibe competitivamente a enzima dihidrofolato redutase (DHFR) que é
responsável pela conversão do ácido fólico em tetra-hidrofolato (THF). O THF é um co-fator
necessário para a transferência de carbono de muitas reações metabólicas, incluindo a síntese
de bases púricas e timidilato sintetase. A proliferação celular é afetada porque diminui a
síntese de timidilato sintetase e consequentemente de percursores de nucleotídeos (bases
púricas) que integram o ADN e ARN; afeta reparação e replicação dos ácidos nucléicos
(HOWLAND; MYCEK, 2007).
Os tecidos com maior atividade metabólica e com maior crescimento celular são mais
afetados pelo
MXT
e, nesses incluem-se os tecidos com células cancerígenas, folículos
capilares, células epiteliais, do trato gastrointestinal e células de medula óssea, o que explica
alguns
efeitos farmacológicos
e tóxicos (HOWLAND; MYCEK, 2007).
d. Indicações Clínicas
É indicado na terapia de tumores sólidos e leucemias, e mais recentemente como
agente imunossupressor em transplante de orgãos, no tratamento de doenças auto-imunes,
assim como psoríase, reumatismo e terapia severa da asma (RUBINO, 2001).
e. Efeitos tóxicos
Além de náuseas, vômitos e diarréias, os efeitos tóxicos mais freqüentes ocorrem em
tecidos que estão em permanente renovação. Assim, o MTX causa mucosite (estomatite)
mielossupressão, eritema, urticária e alopecia (KOROLKOVAS, 2005).
De acordo com a IARC, o metotrexato não é classificado como um carcinógeno para
humanos (grupo 3) (IARC, 2008), com controvérsias entre os autores. TURCI et al.(2003)
considera o MTX como um agente mutagênico e teratogênico para humanos. A United States
Food and Drug Administration (US-FDA) alerta para que o MTX seja evitado nas seguintes
condições: gravidez, aleitamento, insuficiência hepática e renal (US- FDA, 2008).
2.2.3.6 Paclitaxel (PAC)
a. Propriedades
Denominado também como taxol, pertence à classe dos taxanos, é um alcalóide
extraído da casca do teixo oriental, Taxus brevifolia (KOROLKOVAS, 2005). Apresenta-se
como pó cristalino branco, altamente lipofílico, muito solúvel em acetato de etila,
clorofórmio, metanol, solúvel em isopropranol e insolúvel em água. Possui ponto de fusão
entre 216- 217º
C (MARTINDALE, 1996).
A solução injetável é viscosa, incolor ou ligeiramente amarelada, contendo óleo
polietoxilado de castor e álcool absoluto, como veículos (TURCI et al., 2003). Deve ser
armazenado em recipientes herméticos sobre refrigeração e ao abrigo da luz (MERCK
INDEX, 2001).
O paclitaxel é um triterpeno polidroxilado e possui também uma cadeia lateral ligada
ao C-13 do sistema terpênico, que é essencial para a atividade biológica, conforme
demonstrado na Figura 7 (SOUZA, 2004), sendo seu número de registro no CAS 33-069.62.4,
com fórmula molecular C
47
H
51
NO
14
e peso molecular de 853,9 ((MARTINDALE, 1996).
O
NH
O
OH
O CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
O
O
CH
3
OH
O
O
H
O
OH
O
CH
3
O
Figura 7- Fórmula estrutural do paclitaxel
Fonte: adaptado de CHU; SARTORELLI, 2007
b. Farmacocinética
Estudos de Minoia; Perbellini, (2000) sugerem a absorção do paclitaxel, por via
dérmica e inalatória. A absorção pelo trato gastrintestinal é elevada e o pico plasmático é
atingido entre 4 e 7 horas, após administração oral. Concentrações de equilíbrio são atingidas
em 4 a 6 semanas. Por via intravenosa, a concentração apresenta declínio bifásico
(HOWLAND; MYCEK, 2007). A meia-vida de eliminação é de 7 a 14 dias. Sofre intenso
metabolismo hepático mediado pelo citocromo P450 (isoenzimas CYP3A e CYP2C)
originando o 6a-hidroxipaclitaxel e dois metabólitos menores, o 3-p-hidroxipaclitaxel e o 6-
alfa,3'-p-diidroxipaclitaxel. Em torno de 80% é excretado nas fezes, pela via hepatobiliar. Por
conseguinte, é necessário efetuar uma redução da dose na presença de disfunção hepática
(GRAHAME-SMITH; ARONSON, 2004; CHU; SARTORELLI, 2007).
c. Farmacodinâmica
É um taxano diterpênico anelar complexo, atuando como agente antimicrotúbulo. Os
microtúbulos formados, excessivamente estáveis, não são funcionais, e não ocorre
desagregação dos cromossomos, resultando na morte celular. Os efeitos inibitórios
interrompem o ciclo celular na fase G
2
final ou na mitose (GRAHAME; SMITH-ARONSON,
2004; KOROLKOVAS, 2005).
d. Indicações Clínicas
É indicado para o tratamento de tumores sólidos, sarcoma de Kaposi, carcinoma de
ovário, carcinoma de mama metastático e carcinoma de pulmão (CHU; SARTORELLI,
2007).
e. Efeitos tóxicos
Como efeitos decorrentes da toxicidade aguda, podem ser observados: náuseas,
vômitos, hipotensão, arritmias e reações de hipersensibilidade (CHU; SARTORELLI, 2007).
A neutropenia é um efeito tóxico limitante para a dose e, pacientes com menos de 1.500
neutrófilos mm
-3
não devem receber este fármaco. Devido a graves reações de
hipersensibilidade o paciente é pré-medicado com dexametasona e difenidramina, bem como
bloqueadores H
2
(CHABNER; CALABRESI, 1995; CHU; SARTORELLI, 2007).
Os sintomas de toxicidade tardia são a depressão da medula óssea e a neuropatia
sensorial periférica (CHU; SARTORELLI, 2007). Os fármacos antimetabólitos e inibidores
do fuso mitótico são classificados no grupo 3, pela IARC, ou seja, não carcinógenos para
humanos (IARC, 2008).
Devido ao seu uso ser recente, não é possível classificá-lo como um agente
carcinogênico, mutagênico e teratogênico. Entretanto é possível considerá-lo como um agente
potencialmente tóxico e medidas de precaução devem ser tomadas durante a manipulação,
preparação e administração do paclitaxel (TURCI et al., 2003).
Segundo orientações do United States Food and Drug Administration (US-FDA), o
paclitaxel apresenta classificação D na categoria de risco, ou seja, não deve ser usado durante
a gravidez, pois pode causar danos ao feto (US-FDA, 2008).
2.2.4. Neoplasias induzidas pela quimioterapia
São indiscutíveis os efeitos benéficos da terapia antineoplásica. Todavia, as
substâncias antineoplásicas mais efetivas também promovem vários efeitos tóxicos, que
podem ser classificados como leves, moderados ou graves. Tais agentes podem promover o
aparecimento de câncer secundário, depois de cessado o tratamento quimioterápico, pois
muitos são mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos em vários sistemas experimentais e
em humanos (FORNI, 1994; FERGUSON; PEARSON, 1996; BERTRAM, 2001).
Dados epidemiológicos sobre a associação de neoplasia secundária com o tratamento
quimioterápico específico estão disponíveis para cerca de 30 agentes, e no caso das provas
globais 10 compostos tem sido avaliados como conclusivos (SORSA; ANDERSON, 1996).
Foi relatado por Jackson, Stack, Waters, que pacientes que receberam tratamento por
radiação seguido de quimioterapia apresentaram maior risco de desenvolver câncer
secundário em relação aos pacientes que receberam primeiro a quimioterapia seguida de
radiação (JACKSON; STACK; WATERS, 1996).
O estudo das propriedades carcinogênicas dos fármacos antineoplásicos é complexo e
não uniforme, como o teste de mutagenicidade em bactérias. Na literatura é encontrada uma
multiplicidade de métodos e modelos animais, envolvendo várias espécies, doses, esquemas e
vias de administração, bem como várias maneiras de se analisar a capacidade de induzir a
formação de tumores (WALKER; BOLE; 1973; VENEGAS et al., 1995).
Tal fato torna difícil a interpretação e comparação dos resultados, porém tem sido
discutido que, apesar dos diferentes métodos utilizados, os resultados tomados como um todo
são relativamente uniformes, e mostram que as ações carcinogênicas observadas em animais
podem ser extrapoladas para seres humanos (WEISBURGER, 1977; VENEGAS et al., 1995).
A IARC tem reconhecido haver evidências suficientes de carcinogenicidade para
alguns fármacos, como demonstrado na Tabela 3 (IARC, 2008).
O risco de tumor, após o tratamento com estes fármacos, é confirmado pela
constatação da maior incidência de neoplasias em indivíduos que recebem tais substâncias
como parte do tratamento, após o transplante de órgãos. Também nos pacientes com neoplasia
e tratados com esses fármacos, foi documentado o desenvolvimento de câncer secundário que
não faziam parte da história natural da patologia tumoral primitiva, tal como elevada
incidência de leucemia mielóide aguda em indivíduos com tumores sólidos. Efeitos sobre o
sistema reprodutivo, que consistem em aumento da indução ao aborto e malformações, foram
também documentados (ALESSIO et al. 1996).
Tabela 3 - Classificação dos fármacos antineoplásicos, quanto à carcinogenicidade
Grupo Fármaco
1
carcinógenos para o ser humano
- ciclofosfamida
- N,N-bis(2-cloroetil)-2-naftilamina
- 1,4-butanodiol dimetansulfonato
- clorambucila
- 1-(2-cloroetil)-3-(4-metlcicloexil)-1-nitrosouréia
- melfalano
- terapia composta por mostarda nitrogenada,
vincristina, procarbazina e prednisona
2A
prováveis carcinógenos para o
ser humano
- adriamicina
- biscloroetilnitrosouréia
- 1-(2-cloroetil)-cicloexil-1-nitrosouréia
- cisplatina
- N-metil-N-nitrosouréia
- mostarda nitrogenada
- cloridrato de procarbazina
- azacitidina e clorozotocina
2B
possíveis carcinógenos para o ser humano
- mostarda nitrogenada N-óxido
- dacarbazina
- daunorrubicina e mitomicina c
3
não classificados com relação à
carcinogenicidade humana
- ifosfamida
- 5- fluoruracila
- prednisona
- metotrexato
- vincristina e vimblastina
Fonte: IARC, 2008
2.3 MONITORIZAÇÃO DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AOS
ANTINEOPLÁSICOS
Falck et al. (1979) foram os primeiros autores a evidenciar a atividade mutagênica em
amostras de urina de enfermeiras que manipulavam fármacos antineoplásicos. A urina dessas
trabalhadoras foi coletada no início e no final da semana de trabalho, e os resultados obtidos
foram comparados, concluindo-se que o risco de mutagenicidade aumenta quando se eleva o
tempo de exposição.
A ocorrência de perdas fetais e malformações entre os filhos de profissionais da área
de saúde em contato com antineoplásicos foram estudadas por Selevan et al. (1985). Nesse
estudo foi relatado que a ocorrência desses efeitos poderia estar associada à exposição à
ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina, sendo a chance de perda fetal duas vezes maior
nas enfermeiras expostas no primeiro trimestre. Estudos evidenciam a redução de riscos
quando medidas efetivas de proteção são adotadas (SORSA; HEMMINK; VAINIO, 1985,
CASTIGLIA et al., 2008).
Os trabalhadores expostos aos FAN são aqueles que não só manuseiam os agentes
durante o preparo e a administração aos pacientes mas também, aqueles envolvidos na
fabricação dos fármacos em indústrias farmacêuticas e na limpeza, pelo contato com as
excretas do pacientes. Os pesquisadores também podem ser considerados como um grupo
exposto (ALMEIDA, 2004).
Para a avaliação da exposição aos antineoplásicos deve ser planejada uma diretriz que
compreenda os cuidados com o ambiente de trabalho, com a manipulação dos fármacos e com
os profissionais envolvidos. Neste planejamento, revestem-se de grande importância os
procedimentos de monitorização ambiental e biológica.
A avaliação da exposição ocupacional aos antineoplásicos pode ser realizada através
da monitorização ambiental, da análise de superfícies, luvas e máscaras e da monitorização
biológica. Biologicamente, pode ser efetuada a determinação dos agentes ou de seus produtos
de biotransformação, testes de atividade mutagênica em amostras de urina, testes
citogenéticos, determinação de tio éteres urinários, ensaio da hipoxantina guanina
fosfororiboxitransferase, avaliação de danos ao ADN e determinação dos níveis de ácido D-
glicárico (BAKER; CONNOR, 1996; SORSA; ANDERSON, 1996).
A Figura 8 resume os aspectos da avaliação da exposição ocupacional aos antineoplásicos.
Figura 8- Aspectos da exposição ocupacional aos fármacos antineoplásicos
Fonte: adaptado de SORSA; ANDERSON, 1996
Para a obtenção das informações deve ser utilizado um questionário para caracterizar
toda a atividade pertinente ao emprego e ao contato com os fármacos. O modelo padronizado
se divide em quatro sessões: ambiente, pessoal, fármacos e descarte (APOSTOLI; FACCO;
ALESSIO, 2001).
Este questionário, além de fornecer dados sobre as condições de trabalho, garante uma
correta aplicação da monitorização ambiental e biológica.
A determinação dos antineoplásicos no ambiente e nos fluídos biológicos (sangue e
urina) requer métodos validados quanto à sensibilidade, já que a exposição é a baixas
concentrações. Parâmetros como a precisão e exatidão são, também, quesitos essenciais na
validação de um método analítico confiável (SESSINK; BOS, 1999; APOSTOLI; FACCO;
ALESSIO, 2001).
Partindo do pressuposto que na população em geral estes fármacos não são
encontrados, exceto compostos com platina, os resultados biológicos, ainda que baixos (em
particular das classes 1, 2A, 2B, segundo a IARC) fornecem indicações úteis sobre os
procedimentos adotados na manipulação de tais substâncias (APOSTOLI; FACCO;
ALESSIO, 2001).
Para a monitorização biológica dos FAN, os métodos podem ser divididos em dois
grupos: seletivos e não-seletivos. Para os métodos seletivos, a concentração da substância ou
Fontes de exposição
-preparo
-administração
-limpeza
-descarte dos materiais
Monitorização ambiental
-análise de ar
-análise de superfícies
-análise de materiais (luvas,
máscaras, bolsas de infusão)
Monitorização biológica
- análise urinária: fármaco
inalterado; produtos de
biotransformação
- outros testes: efeitos
citogenéticos (troca de
cromátides-irmãs;
micronúcleo; aberrações
cromossômicas) e mutações
Doenças profissionais
- intoxicações agudas
- câncer
- efeitos reprodutivos
- efeitos teratogênicos
Vigilância à saúde
do seu produto é determinada. Já para os não seletivos, neste caso os mais utilizados, são
determinadas as propriedades em comum a um determinado grupo químico, tais como
mutagenicidade e eletrofilicidade (SESSINK; BOS, 1999).
Durante a última década foram desenvolvidos novos métodos para a avaliação da
exposição ocupacional aos agentes antineoplásicos que detectam efeitos biológicos precoces.
Entre estes efeitos, a freqüência de aberrações cromossômicas, troca de cromátides-irmãs,
presença de micronúcleos, são os mais estudados e propostos. Convém ressaltar que, nos
estudos realizados em grupos de trabalhadores que adotam medidas de proteção, os
indicadores citogenéticos mostraram-se negativos (SESSINK et al., 1993; ALESSIO et al.,
1996; FORNI; BONATTI; MERLER, 1996; SESSINK; BOS, 1999).
Os testes de atividade mutagênica em amostras de urina são afetados por diversos
fatores tais como a dieta, o hábito de fumar ou o manuseio de outras substâncias mutagênicas.
Há muita controvérsia entre laboratórios que testam a mesma substância. TUFFNEL et al.
(1986) avaliaram a sensibilidade do teste de Ames. Os autores utilizaram a bactéria
Salmonella typhimurium
, linhagens TA98 e TA 100, e 17 antineoplásicos. A avaliação na
urina dos pacientes tratados demonstrou que 11 dos 17 fármacos não apresentaram atividade
mutagênica, todavia muitos destes foram considerados tóxicos aos organismos. A urina dos
pacientes tratados com ciclofosfamida e doxorrubicina mostrou atividade mutagênica dose-
dependente, não sendo detectada em indivíduos que trabalham com medidas de proteção. Os
autores sugeriram que devido à baixa sensibilidade do teste de Ames e à interferência do
ambiente nos resultados, advindos de vários outros fatores, esse teste não deveria ser utilizado
rotineiramente na avaliação da exposição ocupacional aos FAN.
2.4 ANÁLISE DE ANTINEOPLÁSICOS EM MATRIZES NÃO-BIOLÓGICAS
Para avaliar a exposição potencial a uma mistura de FAN, são considerados
individualmente a ciclofosfamida, a 5-fluoruracila, o metotrexato e os compostos de
coordenação de platina. Em uma escala de prioridade, as amostras obtidas de superfícies de
trabalho devem ser as primeiras a serem coletadas e analisadas, seguidas de amostras
biológicas, tais como sangue e urina (APOSTOLI; FACCO; ALESSIO, 2001).
A monitorização dos antineoplásicos aerodispersos não fornece indicações úteis sobre
o nível de exposição dos trabalhadores. Quando esta informação se faz necessária, a
amostragem da área e pessoal deve ser realizada, individualizando pontos significativos e
dispendendo particular atenção à área caracterizada como a de maior contaminação
(SESSINK; BOS, 1999; APOSTOLI; FACCO; ALESSIO, 2001).
A Tabela 4 apresenta diversos tipos de amostragem ambiental utilizados para a
avaliação da exposição ocupacional aos antineoplásicos.
Tabela 4
- Tipos de amostragem para avaliar a exposição dos trabalhadores da área da
saúde, aos quimioterápicos antineoplásicos e as possíveis informações fornecidas
Tipo de amostragem Informações fornecidas
-ambiental, do tipo pessoal concentração aerodispersa do fármaco na zona respiratória do
trabalhador
-ambiental, no centro do local de trabalho concentração aerodispersa difusa no ambiente de trabalho
-ambiental, na saída do filtro da
cabine de exaustão
verifica o sistema de filtração da cabine a fluxo laminar
-wipe teste, na bancada da
cabine de exaustão
nível de contaminação dos quimioterápicos sobre a superfície
de trabalho, vidro e parede lateral da cabine
- wipe teste, no pavimento próximo à
cabine de exaustão
presença de resíduos de quimioterápicos fora da cabine com
fluxo laminar ou nas vestimentas de trabalho contaminadas
- wipe teste, em diversos pontos do local
de manipulação do fármaco
verifica a possível contaminação difusa interna e
externamente no local de preparação do fármaco
- wipe teste, nos objetos e maçanetas de
portas
procedimento de trabalho não efetuado em condições de
segurança
Fonte: APOSTOLI; FACCO; ALESSIO, 2001
O método mais empregado para a obtenção de informações sobre a exposição é o
wipe
teste, que avalia a presença de resíduos sobre uma superfície específica ou objetos, coletados
com auxílio de tecido. A análise da superfície é mais útil, sensível, reprodutível, em relação à
análise ambiental e, a técnica para efetuá-la é de baixo custo e relativamente acessível. Do
mesmo modo, a análise de materiais, tais como luvas e máscaras, pode ser útil, quando
corretamente padronizada (MARTINS, 2003).
Utilizando esta técnica para monitorizar a superfície de trabalho, no local de
preparação dos fármacos, é possível adquirir diversos tipos de informações. O número de
wipe
teste pode ser aumentado ou diminuído em função da exigência específica. Por exemplo,
para verificar a eficiência do procedimento de descontaminação da parede interna da cabine
(incluindo a superfície de trabalho), é recomendável a execução de dupla amostragem: uma
primeira série de
wipe
teste é feita ao final da atividade de preparação do fármaco, antes da
descontaminação, sucessivamente se procede à segunda amostragem, no mesmo ponto
anterior, após a limpeza da superfície. A análise do
wipe
teste
pode ser limitada a 1 ou 2
fármacos (em geral, aqueles mais usados) ou extensiva a todas as substâncias utilizadas
(APOSTOLI; FACCO; ALESSIO, 2001).
Considerando a estrutura molecular e o estado físico dos quimioterápicos mais
empregados e sua lenta degradação, o
wipe
teste pode evidenciar o acúmulo de tais agentes
sobre a superfície (APOSTOLI et al., 1996). Levando-se em conta a via transcutânea como
uma das mais importantes para a absorção destes agentes, a demonstração do grau de
contaminação da superfície parece ser perfeitamente justificável.
Para o
wipe
teste é necessário delimitar uma superfície, utilizar um sistema de coleta
(por exemplo, uma gaze de algodão estéril de 1 a 2g) previamente embebido em uma solução
ou em solvente de extração. A superfície é esfregada realizando-se ligeira pressão com a gaze,
posteriormente colocada em frasco, com tampa de teflon. Esse procedimento pode ser
utilizado também para análise de materiais (luvas, máscaras), modificando para isto alguns
procedimentos de coleta (APOSTOLI et al., 1996).
Os
wipe
teste
são geralmente constituídos de tecido de algodão, sobrepostos em
número variável de 2 a 5, umedecidos com solvente de extração ou solução tampão a pH
adequado. Todavia, pode ser observada interferência entre as partículas do tecido de algodão e
os analitos e, por este motivo, é aconselhado o uso de TNT (tecido não tecido) que não deixa
partículas. Para limpar as superfícies e os objetos de trabalho, utilizam-se tecidos embebidos
em solução, geralmente, de hidróxido de sódio. Em particular, para os pavimentos, o tecido
não é umedecido sendo a solução de NaOH colocada diretamente sobre a superfície
(MINOIA; PERBELLINI, 2000).
Os possíveis pontos de amostragem de
wipe
teste nos locais de preparação dos FAN
são a cabine com fluxo laminar, bancadas, maçanetas, pavimento próximo a cabine e próximo
às bancadas, entre outros. Analogamente ao que foi exposto para a unidade de preparação do
fármaco, deve ser avaliada com atenção a possibilidade de transferência de micro quantidades
residuais à área externa de trabalho. Por este motivo, deve ser realizada amostragem
wipe
teste em diversos locais, tais como maçanetas, leitos dos pacientes, bolsas de infusão entre
outros (APOSTOLI; FACCO; ALESSIO, 2001).
Luvas e bolsas de infusão também podem ser ferramentas importantes para a
monitorização da exposição ocupacional aos FAN. As bolsas podem ser contaminadas pelo
contato com luvas, utilizadas durante a preparação dos fármacos e são importantes fontes de
contaminação para os trabalhadores e outras pessoas presentes nos locais de administração, já
que em muitos hospitais o acesso não é restrito.
Em estudo realizado em 1992, SESSINK et al. obtiveram concentrações em torno de
11 e 21
µ
g de ciclofosfamida por par de luvas. Priante; Alessandro; Clonfero (1994)
sugeriram que com a análise de luvas utilizadas pelos trabalhadores pode ser estimada a
exposição cutânea aos FAN.
Em investigação conduzida por Minoia et al. (1998), em hospitais italianos a
determinação de ciclofosfamida na parte interna de luvas forneceu uma positividade superior
a 50%. Os resultados encontrados por esses autores sugerem significativa introdução do
fármaco pela via dérmica, quando as luvas utilizadas pelos trabalhadores são de vinil ou de
látex, pois foi evidenciado que a ciclofosfamida é permeável às luvas confeccionadas com
estes dois tipos de materiais.
Na Tabela 5 podem ser verificados os estudos nos quais a técnica de amostragem
wipe
teste foi utilizada para a avaliação da exposição aos antineoplásicos.
Tabela 5 -
Avaliação dos antineoplásicos através de análise em superfície/objeto pela
técnica de amostragem
wipe
teste de 1992 a 2008
Princípio Ativo Superfície / Objeto Referência
ciclofosfamida,
5-fluoruracila, metotrexato
pavimento, mesa, superfície da cabine SESSINK et al. (1992)
ciclofosfamida pavimento, cabine, superfície de trabalho McDEVITT; LEES,
McDIARMID (1993)
ciclofosfamida balança, mesa de trabalho, maçaneta da
porta, pavimento, telefone
SESSINK et al. (1993)
5-fluoruracila balança, pavimento, maçaneta da porta SESSINK et al. (1994b)
ciclofosfamida, ifosfamida,
5-fluoruracila, metotrexato
cabine, mesa de trabalho, pavimento,
telefone, maçaneta da porta e geladeira,
sola do calçado dos trabalhadores
MINOIA et al. (1998)
ciclofosfamida e ifosfamida maçaneta da porta, superfície da cabine,
superfícies próximas ao filtro da cabine,
pavimento
MINOIA et al. (1999)
ciclofosfamida, ifosfamida e
5-fluoruracila
cabine e pavimento CONNOR et al. (1999)
metotrexato cabine, pavimento, telefone, maçaneta,
janelas
FLORIDIA et al. (1999a)
5-fluoruracila cabine, pavimento, telefone, maçaneta,
janelas
FLORIDIA et al. (1999b)
ciclofosfamida, ifosfamida,
5-fluoruracila, platina
pavimento, bancadas, caixas, frascos SCHMAUS; SCHIERL;
FUNCK, (2002)
ciclofosfamida cabine, pavimento, maçaneta, luvas,
bolsas de infusão
MARTINS ; APOSTOLI;
DELLA ROSA, (2008)
Em estudo conduzido por Martins; Apostoli; Della Rosa (2004), de 42 bolsas de
infusão analisadas, somente 6 apresentaram ciclofosfamida abaixo do limite de detecção do
método. As outras 36, revelaram contaminação em níveis quantificáveis, sendo o valor
máximo encontrado em torno de 42 µg. Já, em 2008 esses mesmos autores, analisaram
wipe
testes provenientes de superfícies de trabalho, luvas e bolsas de infusão e demonstraram
contaminação com níveis de até 141 µg de ciclofosfamida, com valores altos e inesperados,
mesmo após os procedimentos de descontaminação das superfícies.
As técnicas instrumentais empregadas para a determinação de antineoplásicos em
matrizes não-biológicas variam em função do material utilizado para a coleta e da
característica do composto a ser analisado.
O limite de detecção é um requisito fundamental para os métodos empregados na
análise dos antineoplásicos. Como conseqüência da adoção de medidas preventivas e
protetivas, os níveis de exposição devem ser baixos e, assim, a metodologia empregada deve
ser capaz de revelar o analito na ordem de traços (ng) e, em alguns casos, como na análise de
platina, ultratraços (pg) (MARTINS, 2003).
Larson; Khazaeli; Dilon (2002) sugeriram que o método por cromatografia líquida de
alta eficiência pode ser utilizado para a determinação de antineoplásicos em amostras
wipe
teste
,
pois em estudo realizado por estes autores, os resultados foram suficientemente exatos e
precisos nas áreas de manipulação destes fármacos em hospitais.
Para a análise dos antineoplásicos são escassos métodos que os determinem
simultaneamente, visto que apresentam diferentes propriedades físico-químicas. Na Tabela 6
podem ser verificados os valores de pKa (constante de dissociação ácida) e solubilidade de
diferentes fármacos, demonstrando a diversidade entre eles e, consequentemente a dificuldade
em determiná-los simultaneamente.
Tabela 6 -
Valores de pKa e solubilidade de diferentes fármacos antineoplásicos
Fármaco Peso Molecular pKa Solubilidade
ciclofosfamida 279 2,84 água, álcool e levemente em éter
doxorrubicina 580 7,35/8,68 água, cloreto de sódio 0,9%, metanol
5-fluoruracila 130 7,68 pouco solúvel em água, solúvel em
álcool
ifosfamida 261 1,45 água, álcool e levemente em éter
metotrexato 454 3,54/5,09 soluções diluídas de ácidos minerais e
alcalinas de hidróxidos e carbonatos
paclitaxel 854 não
disponível
insolúvel em água, solúvel em
isopropanol
Fonte: Martindale, 1996; Merck Index, 2001; SciFinder, 2006.
A determinação de CF e IFO em superfícies, máscaras, luvas, entre outras matrizes,
geralmente é efetuada através de cromatografia à gás, com detector de nitrogênio-fósforo ou
acoplada à espectrometria de massa. Ressalta-se que por serem isômeros, geralmente, esses
dois fármacos são determinados em uma única análise, que pode ser realizada por CLAE,
conforme demonstram as Tabelas 7 e 8. Apesar dessa técnica apresentar maior limite de
detecção, os autores dos estudos discutem que ainda assim, ela é válida pois, na maioria das
vezes, é suficiente para detectar os compostos em locais contaminados.
Para esses analitos, quando se utiliza a CLAE (cromatografia líquida de alta
eficiência), o comprimento de onda varia de 193 a 207 nm e as colunas de fase reversa, C18,
são as mais empregadas, sendo a constituição da fase móvel, predominantemente aquosa e
tamponada (MINOIA; PERBELLINI, 2000; TURCI et al., 2003).
Tabela 7-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de ciclofosfamida, em matrizes não-biológicas, de
1992 a 2008
(continua)
Amostra Técnica de
Detecção
Limite de
Detecção
Limite de
Quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies e
luvas
CG-EM 0,01 ng cm
-
2
0,1 µg por par
luvas
não
especificado
não
especificado
SESSINK et al.
(1992)
superfícies CLAE-UV 0,003 µg cm
-
2
não
especificado
não
especificado
McDEVITT; LEE;
McDIARMID, (1993)
luvas CG-EM 0,08 µg por par de
luvas
não
especificado
não
especificado
SESSINK et al.
(1994a)
luvas CG-EM 0,13 µg por par de
luvas
não
especificado
não
especificado
SESSINK et al.
(1997)
superfícies e
luvas
CLAE-
EM/EM
1 ng dm
-
2
20 ng (par de
luvas)
não
especificado
não
especificado
MINOIA et al.
(1998)
superfícies CG-
EM/EM
0,1 ng mL
-
1
não
especificado
não
especificado
CONNOR et al.
(1999)
superfícies CG-EM 2,5 pg cm
-
2
7,5 pg cm
-
2
não
especificado
SCHMAUS, SCHIERL;
FUNCK, (2002)
superfícies CLAE-UV 0,5 µg mL
-
1
não
especificado
0,5- 10 µg mL
-
1
LARSON, KHAZAELI;
DILON, (2003)
superfícies e
luvas
CG-
EM/EM
0,1 ng cm
-
2
não
especificado
não
especificado
CRAUSTE-MANCIET et
al. (2005)
superfícies CLAE -
EM/EM
0,05 pg cm
-
2
0,2 pg cm
-
2
0,1- 2000 ng HEDMER
et al. (2005)
Tabela 7
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de ciclofosfamida, em matrizes não-biológicas, de
1992 a 2008 (
conclusão)
Amostra Técnica de
Detecção
Limite de
Detecção
Limite de
Quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies CG-
EM/EM
0,1-0,5 ng mL
-
1
não
especificado
0,1ng -1µgmL
-
1
SCHULZ et al. (2005)
superfícies CLAE-UV 2,5 µg mL
-
1
10 µg mL
-
1
10- 700 µgmL
-
1
ROBERTS
et al. (2006)
superfícies CG-
EM/EM
0,012 µg dm
-
2
0,02 µg dm
-
2
0, 156-10 µg dm
-
2
CASTIGLIA
et al. (2008)
Tabela 8
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de ifosfamida, em matrizes não-biológicas
Amostra Técnica de
detecção
Limite de
detecção
Limite de
quantificação
Faixa de trabalho Referência
superfícies e
luvas
CLAE-
EM/EM
0,1 ng dm
-
2
20 ng por par de
luvas
não
especificado
não especificado MINOIA et al. (1998)
superfícies CG-
EM/EM
0,1 ng mL
-
1
não
especificado
não especificado CONNOR et al. (1999)
superfícies CG-EM 2,5 pg cm
-
2
7,5 pg cm
-
2
não especificado SCHMAUS SCHIERL;
FUNCK, (2002)
superfícies CLAE-UV 0,5 µg mL
-
1
não
especificado
0,5- 10 µg mL
-
1
LARSON; KHAZAELI;
DILON, (2003)
superfícies CLAE-
EM/EM
0,1 pg cm
-
2
0,1 pg cm
-
2
0,1- 2000 ng HEDMER et al. (2005)
superfícies e
luvas
CG-
EM/EM
0,1 ng cm
-
2
não
especificado
não especificado CRAUSTE- MANCIET
et al. (2005)
superfícies CG-
EM/EM
0,060 µg dm
-
2
0,1 µg dm
-
2
0,156-10µgdm
-
2
CASTIGLIA
et al. (2008)
São escassos na literatura métodos para a determinação de antraciclinas em matrizes
não-biológicas, cuja finalidade seja avaliar a exposição ocupacional, todavia nos dois
trabalhos encontrados, na revisão realizada no presente estudo, os métodos utilizam a CLAE,
com detector de UV, para amostras de superfície, conforme demonstrado na Tabela 9.
Tabela 9
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de doxorrubicina, em amostras de superfícies.
Amostra Técnica de
Detecção
Limite de
Detecção
Limite de
Quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies CLAE-UV 0,5 µg mL
-
1
não especificado 0,5-10 µg mL
-
1
LARSON
KHAZAELI;
DILON, (2003)
superfícies CLAE-UV 0,25 µg mL
-
1
1 µg mL
-
1
1 - 20 µg mL
-
1
ROBERTS et al.
(2006)
Já, para a 5-FU, a técnica comumente utilizada é a CLAE-UV, conforme demonstra a
Tabela 10, com comprimento de onda em torno de 265 nm, coluna de fase reversa e fase
móvel aquosa (MINOIA; PERBELLINI, 2000).
Tabela 10
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho
dos métodos descritos na literatura para análise de 5-fluoruracila, em matrizes não-
biológicas
(continua)
Amostra Técnica de
Detecção
Limite de
Detecção
Limite de
Quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies e
luvas
CLAE-UV 0,04 ng cm
-
2
0,7 µg por
par de luvas
não especificado não especificado SESSINK et al.
(1992)
luvas CG-EM 4,0 µg por
par de luvas
não especificado não especificado SESSINK et al.
(1994a)
luvas CG-EM 2 µg por par
de luvas
não especificado
não especificado SESSINK et al.
(1997)
superfícies CLAE-UV 20 ng ml
-
1
não especificado não especificado CONNOR et al.
(1999)
Tabela 10
-
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho
dos métodos descritos na literatura para análise de 5-fluoruracila, em matrizes não-
biológicas
(conclusão)
Amostra Técnica de
Detecção
Limite de
Detecção
Limite de
Quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies CLAE-UV 4 - 30 µg m
-
2
não especificado não especificado FLORIDIA
et al. (1999b)
superfícies CLAE-UV
1 µg
3 µg 1-32 µg MICOLI et al.
(2001)
superfícies CG-EM 0,25 pg cm
-
2
2,5 pg cm
-
2
não especificado SCHMAUS;
SCHIERL;
FUNCK, (2002)
superfícies CLAE-UV 0,5 µg mL
-
1
não especificado 0,5 - 10
µg mL
-1
LARSON
KHAZAELI;
DILON, (2003)
superfícies e
luvas
CLAE-UV 20 ng cm
-
2
não especificado não especificado CRAUSTE-
MANCIET
et al. (2005)
superfícies CLAE-UV 0,2 µg mL
-
1
0,5 µg mL
-
1
0,5 - 30 µg mL
-
1
ROBERTS
et al. (2006)
superfícies CLAE-UV 0,440 µg m
-
2
0,740 µg dm
-
2
0,78-50 µg dm
-
2
CASTIGLIA et
al. (2008)
A técnica mais comumente empregada para análise de MTX é a CLAE-UV, com
comprimento de onda em torno de 300 nm, coluna de fase reversa e fase móvel predominante
aquosa e tamponada (MINOIA; PERBELLINI, 2000). A Tabela 11 demonstra os métodos
cromatográficos para análise dessa substância.
Tabela 11
- Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de metotrexato, em matrizes não-biológicas
Amostra Técnica de
detecção
Limite de detecção Limite de
quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
superfícies e
luvas
CLAE/UV 4,0 ng cm
-
2
6,0 µg por par de
luvas
não especificado não especificado SESSINK et
al. (1992)
luvas CG-EM 20 µg por par de
luvas
não especificado não especificado SESSINK et
al. (1994a)
luvas CG-EM 10 µg por par de
luvas
não especificado não especificado SESSINK et
al. (1997)
superfícies CLAE/UV 47 ng mL
-
1
não especificado 62,5- 1000 ngL
-
1
FLORIDIA
et al. (1999a)
São escassos na literatura os estudos que determinaram o PAC em amostras de luvas e
superfícies, todavia, a técnica mais comumente empregada é CLAE (Tabela 12), com detector
de UV ou acoplado à espectrometria de massa (MINOIA; PERBELLINI, 2000).
Tabela 12 -
Técnica de detecção, limites de detecção e de quantificação, faixa de trabalho dos
métodos descritos na literatura para análise de paclitaxel, em matrizes não-biológicas
Amostra Técnica de
detecção
Limite de detecção Limite de
quantificação
Faixa de
Trabalho
Referência
luvas CLAE-
EM/EM
0,2 µg por par luvas não especificado não especificado SOTTANI
et al. (2000)
superfícies CLAE/UV 2.0 µg mL
-
1
não especificado 2,0 - 20
µg mL
-1
LARSON
KHAZAELI;
DILON,
(2003)
3 OBJETIVOS
A partir da revisão da literatura foi possível observar que é crescente a utilização de
fármacos antineoplásicos na prática clínica e, principalmente em terapia combinada. Em
contrapartida, isto constitui importante risco químico e sanitário tanto para os pacientes, pois
podem levar a uma neoplasia secundária, como para as populações ocupacionalmente
expostas. Nesse contexto, é de suma importância a monitorização da exposição ocupacional,
através da determinação dessas substâncias em superfícies e materiais. Entretanto, a maioria
dos métodos disponíveis na literatura não foram devidamente validados e, geralmente, não
determinam mais de um fármaco em uma mesma análise.
Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar métodos para
determinação simultânea de ciclofosfamida, doxorrubicina, 5-fluoruracila, ifosfamida,
metotrexato e paclitaxel em superfícies e luvas, por cromatografia líquida de alta eficiência,
como também avaliar a aplicação desses em situação de exposição aos fármacos. Ressalta-se
que os fármacos foram escolhidos em função de sua dose/ freqüência de utilização na prática
oncológica e de sua toxicidade.
Os objetivos específicos foram:
-testar diferentes condições cromatográficas, tais como: coluna, fase móvel, vazão da
fase móvel, volume de injeção, comprimento de onda, de forma a determinar os fármacos na
mesma corrida analítica;
-otimizar as condições cromatográficas para a determinação simultânea dos analitos
que apresentarem condições de serem determinados na mesma corrida analítica;
-otimizar o procedimento de extração dos analitos, que apresentarem condições de
serem determinados na mesma corrida analítica;
-validar o método constituído das técnicas de extração e de
identificação/quantificação, por cromatografia líquida de alta eficiência para a determinação
dos analitos, que apresentarem condições de serem determinados na mesma corrida analítica;
-aplicar o método em amostras reais, isto é, superfícies e luvas de trabalhadores que
manipulam os fármacos estudados.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Padrões, reagentes e solventes
Foram utilizados os seguintes padrões: ciclofosfamida, 5-fluoruracila, metotrexato e
paclitaxel (Aldrich
®
); doxorrubicina (Adriblastina
®
), doado por um Hospital Oncológico e
ifosfamida (Holoxan
), doado por um laboratório de Higiene Industrial e Toxicologia.L
Os solventes e reagentes usados no preparo de soluções e nos testes de otimização das
condições cromatográficas foram: metanol, grau CLAE J.T. Baker
;
etanol grau CLAE
Nuclear
; acetonitrila, grau CLAE Merck
; diclorometano Mallinckrodt
, isopropanol, grau
CLAE, Vetec
; ácido acético, p.a., Merck
; acetato de sódio triidratado, p.a., Vetec
;
acetato
de etila p.a. Vetec
, n-hexano, p.a., J.T. Baker
; cloreto de sódio, p.a., Merck
; hidróxido de
sódio, p.a., Vetec
. Todos os ajustes de pH foram feitos com ácido clorídrico 1% e hidróxido
de sódio 1% assim, sempre que nesse estudo for citado o pH de uma solução ou fase móvel,
refere-se ao ajuste com tais soluções.
4.1.2 Equipamentos e acessórios
Foram utilizados nesse estudo, cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu
LC-
10ATvp, controladora SCL-10Avp, sistema de bombas LC-10ATvp, forno de colunas CTO-
10ASvp, injetor automático SIL-10AF, detector UV SPD-10Avp e detector DAD
(
arranjo de
diodos)
SPD-M10Avp. A aquisição e tratamento de dados foram feitos com auxílio de
software Class-VP software (Shimadzu
). As colunas analíticas testadas foram Shim-pak
®
CLC-ODS(M) (250 x 4,6 mm, 5
µ
m); Supelcosil
®
TM LC-18 (150 x 4,6 mm, 5
µ
m) e pré-
coluna LC-18 (Shimadzu
).
Ainda, empregou-se sistema de purificação de água Milli-Q Plus, Millipore
; banho
de ultrassom Unique
; peagâmetro digital Marte
; balança eletrônica de precisão BG 440,
Gehaka
;
balança analítica Kern 410
; agitador mecânico tipo vórtex MA 162, Marcon
;
centrífuga NT-811, Nova Técnica
; sistema de suporte e extração
manifold
da Supelco
;
micropipetas Gilson
®
e Digipet
®
.
4.1.3 Soluções-padrão
Foram preparadas soluções-padrão na concentração de 1 g L
-1
, em metanol,
denominadas solução-estoque, dos analitos: ciclofosfamida, doxorrubicina, 5-fluoruracila,
ifosfamida e paclitaxel. A solução de metotrexato foi preparada em metanol acidificado, com
ácido clorídrico 1%. A partir dessas, foram obtidas as soluções de trabalho, a 100 mg L
-1
e
dessas, foram realizadas as diluições, para os estudos de otimização e validação analítica.
Todas as soluções-estoque e de trabalho foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e
mantidas a -20ºC, por tempo determinado pelo teste de estabilidade, todavia as diluições
foram preparadas diariamente.
4.2 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO
DOS ANALITOS EM SUPERFÍCIES
4.2.1 Otimização das condições cromatográficas
Para se obter a condição otimizada foram testados os seguintes parâmetros:
- coluna cromatográfica: C18 (150 x 4,6 mm; 5
µ
m) e C18 (250 x 4,6 mm; 5
µ
m);
- fase móvel (testadas em modo isocrático): água: MeOH (80:20, v/v); tampão acetato
de amônio 10 mmol L
-1
: MeOH: ACN (70:15:15, v/v/v); água: MeOH: ACN (70:15:15,
v/v/v); (70:13:17, v/v/v) (70:10:20, v/v/v); (65:15:20, v/v/v); (55:15:30, v/v/v); (35:25:40,
v/v/v) e (35:15:50, v/v/v);
- faixa de pH para a fase móvel: de 3 a 6;
- temperatura da coluna: ambiente, 35°C e 40°C;
- vazão da fase móvel:
a) constante: 0,5 mL min
-1
e 0,7 mL min
-1
;
b) com modificações durante a corrida cromatográfica: 0,5 mL min
-1
até 7 min e 0,9
mL min
-1
até fim da corrida; 0,4 mL min
-1
até 10 min e 0,9 mL min
-1
até fim da corrida; 0,4
mL min
-1
até 13 min e 1 mL min
-1
, até fim da corrida.
4.2.2 Otimização da extração líquido-líquido
As condições testadas para a extração líquido-líquido foram:
- matriz: NaOH 0,03 mol L
-1
(líquido de limpeza de superfícies utilizado por Sessink et
al. 1992, Connor et al. 1999 e Martins et al. 2008a), cujo pH foi ajustado na faixa de 4 a 8;
- solvente extrator: n-hexano, diclorometano, acetato de etila e acetato de etila:
isopropanol (3:7, v/v), (7:3, v/v) e (10:1, v/v);
Após vários testes, a técnica de extração otimizada para os analitos, 5-FU, MTX, IFO ,
DOX e CF, foi:
- em um tubo de 15 mL, colocou-se 1 mL de solução NaOH 0,03 mol L
-1
fortificada
com os analitos e ajustada a pH 4;
- adicionou-se 2,5 mL de acetato de etila: isopropanol (7:3, v/v). Em seguida, o tubo
foi agitado por 2,5 minutos;
- após a separação das fases, a fase orgânica foi transferida para um béquer afunilado e
a fase aquosa foi re-extraída com outra alíquota de 2,5 mL de acetato de etila: isopropanol
(7:3, v/v), com agitação por 2,5 minutos;
- na fase aquosa restante foi realizado um novo ajuste de pH para 8, e repetiu-se o
processo de extração com acetato de etila: isopropanol (7:3, v/v), sendo a fase orgânica
transferida para o mesmo béquer afunilado, onde estava contida a fase orgânica, proveniente
da extração ácida;
- a fase orgânica foi levada à secura sob fluxo de N
2
, sendo o resíduo ressuspenso em
200
µ
L de fase móvel e 50
µ
L foram injetados no cromatógrafo.
4.2.3 Injeção direta da matriz
Testou-se
também a injeção direta da matriz (NaOH 0,03 mol L
-1
, como líquido de
limpeza de superfícies) fortificada com os analitos. Foi avaliado, o ajuste de pH para 4 e 8,
filtração em filtro de solvente aquoso Millipore
®
GSWPO 1300 (0,22
µ
m x 13 mm) e 50 µL
foram diretamente injetados no CLAE. Um outro líquido constituído de metanol: acetonitrila
(50:50, v/v) também foi testado, como líquido de limpeza das superfícies e, nesse caso,
injetou-se diretamente no cromatógrafo, sem extração prévia, 50
µ
L dessa solução fortificada
com os analitos.
4.2.4 Teste de superfícies intencionalmente fortificadas com os analitos
Foram realizados diversos contatos com unidades de quimioterapia para a obtenção da
permissão para a coleta de amostras reais, nesses ambientes, visando à aplicação do presente
método. Não houve retorno por parte das autoridades responsáveis por esses locais contatados
e, como não seria ético fortificar as bancadas de trabalho, do laboratório de pesquisa, expondo
intencionalmente vários indivíduos, optou-se por realizar o estudo em superfícies em
miniatura, as quais poderiam ser descartadas com segurança, após o teste.
O teste foi feito de acordo com o estudo desenvolvido por Roberts et al. (2006),
através de cortes em uma seringa de 10 mL, em intervalos de 5 cm. Os anéis resultantes foram
cortados transversalmente, de modo que foram obtidas superfícies retangulares de 3,5 x 3 cm.
O polipropileno, uma superfície inerte, foi usado com objetivo de eliminar qualquer
interferência externa.
O teste foi realizado em sextuplicata e 20 µL da solução a 100 µg mL
-1
, de cada
fármaco, foram adicionados ao lado côncavo da superfície e, paralalemente foi realizado um
não adicionado (n=6), que consistiu na análise de superfície não fortificada com os analitos,
nas mesmas condições.
Todas as superficies foram secas à temperatura ambiente e, essas foram lavadas com 2
mL de metanol: acetonitrila: (50: 50, v/v), em um tubo de centrífuga. Os tubos foram
centrifugados por 5 minutos a 580 g e, 50 µL do sobrenadante foram injetados no
cromatógrafo. A recuperação foi calculada comparando-se a área obtida nesse teste com
aquela obtida pela injeção de solução padrão, não sujeita a essas condições.
Extrapolando esse teste para uma superfície de trabalho, a técnica de determinação dos
analitos estudados, pode ser descrita como:
- delimitar a superfície de trabalho a ser analisada;
- colocar sobre ela, quantidade suficiente de solução de metanol:acetonitrila (50:50,
v/v), em torno de 5 mL (em uma superfície de 400 cm
2
)
- esfregar as superfícies com TNT ou lenços de papel Kleenex
®
;
- colocar o TNT ou os lenços, em um tubo de centrifuga graduado completar o
volume, para 18 mL, com a solução metanol:acetonitrila (50:50, v/v);
- centrifugar e recolher o sobrenadante para a detecção/ quantificação dos analitos.
4.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO
DOS ANALITOS EM LUVAS
4.3.1 Otimização das condições cromatográficas
Para se obter a condição otimizada foram testados os seguintes parâmetros:
- coluna cromatográfica:
C18 (150 x 4,6 mm; 5
µ
m) e C18 (250 x 4,6 mm; 5
µ
m);
- fase móvel (testadas em modo isocrático): água: MeOH (80:20, v/v), tampão acetato
de amônio 10 mmol L
-1
: MeOH: ACN (70:15:15, v/v/v), tampão fosfato 10 mmol L
-1
pH 6,0:
MeOH:ACN (40:30:30, v/v/v), água:MeOH:ACN: (70:15:15, v/v/v); (70:13:17: v/v/v);
(70:10:20: v/v/v); (65:15:20, v/v/v); (55:15:30, v/v/v); (40:15:45: v/v/v); (35:25:40, v/v/v) e
(35:15:50, v/v/v);
- ajuste do pH da água da fase móvel: de 4,0 a 6,0;
- gradiente de fases: água ajustada a pH 4,0 (bomba A
),
MeOH (bomba B) e ACN
(bomba C), nas condições: a) tempo zero até 10 min, proporção de 70:15:15, v/v/v e, após 10
minutos até final da corrida, proporção de 55:15:30:, v/v/v e b) tempo zero até 10 min,
proporção de 70:15:15, v/v/v e, após 10 minutos até fim da corrida, proporção de 55: 25:40,
v/v/v;
- temperatura da coluna:
ambiente, 35ºC e 40ºC;
- vazão da fase móvel:
a) constante: 0,5 mL min
-1
; 0,7 mL min
-1
e 1 mL min
-1
b) com modificações no decorrer da corrida: 0,4 mL min
-1
até 10 min e após 0,9 mL
min
-1
, até fim da corrida; 0,4 mL até 13 min e após 1 mL min
-1
, até fim da corrida; 0,5 mL
min
-1
até 7 min e 0,9 mL min
-1
, até fim da corrida;
- comprimento de onda: 195 e 265 nm e varredura no DAD.
4.3.2 Otimização das condições de extração
Para a lavagem da luvas foram testadas as seguintes variáveis:
- tempo de agitação (shaker): 5, 15, 30 e 90 min;
- tempo de banho ultrassônico: 15, 30 e 90 min;
- tempo de centrifugação a 580 g: 15 e 30 min;
- pH da matriz: de 4 a 8.
Para a extração líquido-líquido (ELL) foram:
- solvente extrator: n-hexano, diclorometano, acetato de etila e acetato de etila:
isopropanol, nas proporções 3:7, 7:3, e 10:1, v/v, acetato de etila: octanol, na proporção 1:1,
v/v, acetato de etila: butanol, nas proporções 5:3, 7:3 e 8:2, v/v;
Para a extração em fase sólida (SPE), utilizou-se o sistema de extração a vácuo
manifold
da Supelco
®
e cartuchos com fase C18/ 200 mg (Applied Separations
)
.
Para a
retenção dos interferentes, foram testados a terra de diatomácea (Merck
) e o florisil
(Sigma
), em cartuchos empacotados no laboratório com 700 mg, dessas fases.
Em todos os testes foram utilizados diversos solventes, para otimizar cada uma das
etapas de extração: condicionamento, carregamento, lavagem e eluição.
4.3.3 Aplicação do método em amostras de luvas
As amostras de luvas foram coletadas em um laboratório de pesquisa do sul de Minas
Gerais. Os usuários dessas luvas trabalharam com o MTX, a 5-FU e o PAC, em
projetos de pesquisa, expondo-se a esses fármacos de maneira diversa. Sendo assim, não foi
possível precisar a quantidade manipulada pelos pesquisadores, durante a jornada de trabalho.
Estes indivíduos estavam cientes sobre o procedimento operacional padrão (POP),
para a manipulação e manejo de FAN. Para tal, conforme explícito no POP, a
descontaminação das luvas após o contato com estes fármacos deve ser feita, primeiramente,
esfregando-se as mãos enluvadas com álcool etílico comercial e, logo em seguida com
hipoclorito de sódio. Segundo literaturas específicas, tanto o álcool etílico como o hipoclorito
de sódio inativam os antineoplásicos (CASTEGNARO et al., 1997; MORITA et al., 2000,
KIURA et al., 2002; NAKAJIMA et al., 2004; HIROSE et al., 2005; ROBERTS et al., 2006).
O hipoclorito de sódio utilizado trata-se de uma solução que contém 2,5% de cloro ativo em
água, segundo descrito em seu rótulo.
Até o momento da análise as luvas foram acondicionadas em saco plástico, com fecho
hermético e mantidas no freezer (-20º C).
4.4. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DOS MÉTODOS
Para avaliar o desempenho dos métodos foram realizados testes de conformidade do
sistema e validação analítica. Abaixo são descritos os parâmetros avaliados:
-
conformidade do sistema
(s
ystem suitability
), que pode ser definida como um
conjunto de testes para garantir que o equipamento utilizado está apto a gerar resultados de
exatidão e precisão aceitáveis. Os parâmetros avaliados foram: fator de retenção ou
capacidade (k); resolução (Rs); fator de cauda ou assimetria (T) e o número de pratos teóricos
(N).
As recomendações para esse teste, de acordo com o Shabir et al., (2003), podem ser
observadas na Tabela 13. Tipicamente, no mínimo dois destes critérios são requeridos para
garantir a conformidade do sistema.
Tabela 13 -
Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações
Parâmetro Recomendação
fator de retenção (k) o pico deve estar bem separado de outros picos
e do pico correspondente ao tempo de retenção
de um composto não retido (t
M
), k > 1 para
garantir que o primeiro pico de interesse está
bem separado do solvente
resolução (Rs) Rs > 2 entre o pico de interesse e o interferente
potencial mais próximo (impureza, produto de
degradação)
fator de assimetria (T) T ≤ 2
número de pratos teóricos (N) em geral deve ser > 2000
Fonte: Shabir et al. (2003)
- limite de detecção (LD)
é definido como a menor concentração de uma substância
que o método analítico consegue diferenciar do ruído de fundo. É estabelecido por meio da
análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes, até o menor nível detectável
(BRASIL, 2003). Também pode ser calculado através da curva de analítica, pela equação
(RIBANI et al., 2004):
Onde:
DPb = desvio padrão do branco (intercepto) e a= coeficiente angular
- limite de quantificação (LQ)
é definido como a menor concentração do analito que
pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis, geralmente constitui o primeiro
ponto da curva de calibração (BRASIL, 2003).
Pode ser calculado utilizando a razão de 10:1 entre o sinal e o ruído da linha de base
(PETERS; DRUMMER; MUSSHOFF, 2007). Deve ser identificável e reprodutível com
precisão de 20% e exatidão de 80 a 120%, através de análise de padrões (BRASIL, 2003).
3,3 x DPb
LD=
a
Também pode ser calculado através da curva de analítica, pela equação (RIBANI et al.,
2004):
Onde:
DPb = desvio padrão do branco (intercepto) e a= coeficiente angular
Nesse estudo, foi obtido de através de diluições sucessivas das amostras contendo os
analitos, até os valores de aceitação supracitados.
- linearidade
é definida como a
capacidade do método de gerar resultados diretamente
proporcionais à concentração do analito. Foi determinada através da análise, em sextuplicata,
de amostras contendo os analitos e submetidas às técnicas otimizadas, no intervalo de 0,25 a
20 µg mL
-1
. O coeficiente de determinação (r²) foi utilizado para avaliação deste parâmetro
(BRASIL, 2003).
- precisão
é expressa em função do desvio padrão relativo (DPR%), sendo
determinada em termos de repetibilidade e precisão intermediária, através da análise de
amostras contendo os analitos, nas concentrações baixa, média e alta, mediante a
determinação no mesmo dia (precisão intra-corrida, n=6) e em três dias diferentes (precisão
intercorrida) (BRASIL, 2003).
- eficiência da extração
visa avaliar a recuperação dos analitos após o procedimento
de extração. Nesse estudo, as amostras contendo os fármacos, nas concentrações baixa, média
e alta, foram analisadas em sextuplicata e os resultados (áreas) foram confrontados com
aqueles obtidos quando os analitos foram adicionados ao extrato de amostra não fortificada
(BRASIL, 2003).
- robustez da técnica cromatográfica
é a medida da capacidade do método em
resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos (BRASIL, 2003). Esse
teste foi realizado com relação à variação na composição e pH da fase móvel e temperatura da
coluna.
- estabilidade:
para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis, as amostras, os
padrões e reagentes usados devem ser estáveis por um período razoável (por ex. um dia, uma
semana, um mês, dependendo da necessidade). Freqüentemente, em equipamentos
automatizados, as corridas cromatográficas são realizadas durante a noite. Esta prática requer
10 x DPb
LD=
a
maior estabilidade das soluções (MARTINS, 2008). Nesse estudo, para esse parâmetro, foram
realizados 3 testes:
a) estabilidade no auto-injetor:
foram analisadas amostras nas concentrações baixa e
alta, em triplicata, sendo que a resposta da primeira injeção, considerada como tempo zero, foi
comparada com as respostas obtidas após 4 e 8 horas de permanência no auto-injetor;
b) estabilidade em geladeira:
foram analisadas amostras nas concentrações baixa e
alta, em triplicata, sendo que a resposta da primeira análise, considerada como tempo zero, foi
comparada com as respostas obtidas após 8 e 17 dias de permanência na geladeira (4ºC);
c) estabilidade em freezer:
foram analisadas amostras nas concentrações baixa e alta,
em triplicata, sendo que a resposta da primeira análise, considerada como tempo zero, foi
comparada com as respostas obtidas após 8 e 17 dias, de permanência em freezer (-20ºC).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não obstante a utilização de medidas protetivas, é necessário avaliar
se, efetivamente,
há exposição ocupacional aos antineoplásicos nos diversos locais de manipulação. Em saúde
ocupacional, muitas técnicas para monitorizar a exposição são disponíveis e, a análise de
superfícies e materiais, tais como luvas, máscaras e maçanetas, entre outros tem sido utilizada
pelos pesquisadores, para avaliar tal exposição, conforme demonstrado anteriormente na
Tabela 5.
É também reconhecido que luvas e bolsas de infusão podem propagar a contaminação,
aumentando a probabilidade de exposição para trabalhadores, não originalmente envolvidos
no preparo e na administração dos fármacos, fazendo com que, como conseqüência, a análise
desses objetos seja de suma importância. SESSINK et al. (1997), detectaram a presença de
ciclofosfamida na urina de farmacêuticos e enfermeiros, não diretamente envolvidos na
manipulação de FAN.
Uma vez que os trabalhadores estão expostos a uma variedade de fármacos, faz-se
necessário identificar algumas substâncias que possam ser consideradas indicadores da
exposição, tais como a ciclofosfamida e a 5-fluoruracila. Todavia, são escassos na literatura
métodos que determinem esses fármacos simultaneamente, o que é considerado uma
vantagem por representar de maneira global a exposição ocupacional.
As técnicas de amostragem e de análise empregadas fornecem uma estimativa
aproximada da exposição real, no ambiente de trabalho, e dependem da confiança na
metodologia utilizada. No entanto, os métodos analíticos relatados na literatura apresentam
dados incompletos da etapa de validação.
Nesse estudo, foram desenvolvidos métodos capazes de detectar simultaneamente a
presença de antineoplásicos, amplamente utilizados na prática clínica, em superfícies e luvas,
visando sua aplicação na monitorização da exposição ocupacional. Ressalta-se que esse
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Anexo 1).
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO
DOS ANALITOS EM SUPERFÍCIES
5.1.1 Otimização das condições cromatográficas
As condições otimizadas para a determinação dos antineoplásicos estudados, 5-
fluoruracila, metotrexato, ifosfamida, doxorrubicina e ciclofosfamida, em superfícies foram:
- comprimento de onda: 195 nm;
- coluna: Shim-Pak
CLC-ODS(M) C18 (250 x 4,6 mm, 5
µ
m);
- temperatura do forno: ambiente (21°C);
- fase móvel: água pH 4,0: MeOH: ACN (70:13:17, v/v/v), com vazão de 0,4 mL min
-1
até 13 min e, após esse tempo, 1 mL min
-1
, até o final da corrida cromatográfica.
Vários comprimentos de onda foram utilizados para a detecção desses fármacos, em
estudos anteriores, variando de 193 a 302 nm (NEAL; WADDEN; CHIOU, 1983; PYY;
SORSA; HAKALA, 1988; BENVENUTO et al., 1993). No presente estudo, as soluções-
padrão foram avaliadas pelo detector por arranjo de diodos (DAD) e, após essa análise optou-
se por utilizar o detector UV a 195 nm, uma vez que esse é um comprimento de onda capaz de
detectar todos os analitos, conforme demonstra a Figura 9. Além disso, foi anteriormente
utilizado por Larson; Khazaeli; Dilon (2003).
Figura 9-
Espectros obtidos a partir da análise de: A) 5- fluoruracila, na concentração de 100
µ
gmL
-1
, B) metotrexato, na concentração de 5
µ
g mL
-1
C) ifosfamida, na concentração 20
µ
g
mL
-1
D) ciclofosfamida, na concentração 20
µ
g mL
-1
E) doxorrubicina, na concentração 20
µ
g
mL
-1
e F) paclitaxel, na concentração 20
µ
g mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6
mm, 5
µ
m), fase móvel constituída de água pH 4,0: metanol: acetonitrila (70:13:17, v/v/v).
(continua)
A
B
C
Figura 9-
Espectros obtidos a partir da análise de: A) 5- fluoruracila, na concentração de 100
µ
g mL
-1
, B) metotrexato, na concentração de 5
µ
g mL
-1
C) ifosfamida, na concentração 20
µ
g
mL
-1
D) ciclofosfamida, na concentração 20
µ
g mL
-1
E) doxorrubicina, na concentração 20
µ
g
mL
-1
e F) paclitaxel, na concentração 20
µ
g mL
-1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6
mm, 5
µ
m), fase móvel constituída de água pH 4,0: metanol: acetonitrila (70:17:13, v/v/v).
(conclusão)
D
E
F
Nesse estudo, foi utilizado o detector por arranjo de diodos (DAD), o qual é o segundo
tipo de detector espectrofotométrico mais comum. De modo simplificado, um arranjo de
diodos consiste em uma série de detectores fotodiodo posicionado lado a lado em um cristal
de silício, de modo que cada comprimento de onda, difratado pela grade, atinge um ponto
desse arranjo, e conseqüentemente um detector. Deste modo, a radiação que atravessa a
amostra é integral e, instantaneamente, analisada determinando-se, portanto, a absorvância em
todos os comprimentos de onda, de modo simultâneo (ATVARS; MARTELLI, 1996).
Um fator importante é que os detectores por arranjo de diodos têm sensibilidades
diferentes, aos diversos comprimentos de onda, de modo que é necessário que se especifique a
região de trabalho do espectro. Além disso, a qualidade do instrumento, em termos de sua
resolução espectral, depende do tipo e do número de diodos que compõe o arranjo (ATVARS;
MARTELLI, 1996).
Esse detector associado à CLAE permite a leitura de uma mesma amostra, em vários
comprimentos de onda, simultaneamente, com prévia separação cromatográfica dos analitos.
Os componentes de uma mistura podem ser identificados pelo espectro de absorção, quando
se analisa padrão puro, nas mesmas condições cromatográficas otimizadas, associado ao
tempo de retenção e à pureza dos picos, o que fornece confiança nos resultados analíticos.
As condições cromatográficas inicialmente testadas foram: coluna C18 com
comprimento de 150 mm, fase móvel constituída de tampão fosfato pH 6,0: acetonitrila
(77,25: 22,75v/v) na vazão de 1 mL min
-1
, na tentativa de reproduzir o estudo realizado por
Larson; Khazaeli; Dilon (2003). Esses autores publicaram um método para determinação
simultânea de cinco antineoplásicos: 5-FU, IFO, CF, DOX e PAC por CLAE-UV, nas
seguintes condições: comprimento de onda de 195 nm, coluna C18 (150 x 4,6 mm, 3,5
µ
m) e
fase móvel constituída de tampão fosfato pH 6,0: acetonitrila (77,25: 22,75, v/v), para a
eluição da 5-FU, IFO, CF e DOX e, reversão da fase (22,75: 77,25, v/v), para a eluição do
PAC. De acordo com os autores, por esse último analito ser extremamente apolar, a fase
móvel deveria conter maior proporção de solventes orgânicos apolares. Os tempos de retenção
foram: 2,89 minutos para a 5-FU, 8,64 minutos para a IFO, 9,70 minutos para a CF, 17,50
minutos para a DOX e 39,47 minutos para o PAC. Ressalta-se que esses autores não
avaliaram o MTX.
No presente estudo, nas condições semelhantes às de Larson; Khazaeli; Dilon (2003),
com a coluna cromatográfica de comprimento de 150 mm, não foi possível separar o MTX e a
5-FU. Assim, testou-se a coluna C18 de comprimento de 250 mm e outras constituições para
a fase móvel, em diferentes vazões.
Esses testes demonstraram que não seria necessário tamponar a fase móvel, pois
somente com o ajuste do pH da água, para 4 com HCl 1%, sem a adição de sal, a eficiência e
a resolução cromatográfica foram satisfatórias todavia, foi necessário a adição de MeOH.
Com a vazão da fase móvel de 0,4 mL min
-1
, observou-se a eluição do MTX e da 5-FU e, com
o aumento da vazão para 1 mL min
-1
, foram eluídos os analitos mais apolares, IFO, DOX e
CF, nas condições otimizadas. Apesar do cromatógrafo disponível no laboratório operar em
sistema gradiente, não foram obtidas respostas satisfatórias para o PAC, em nenhuma das
condições testadas e, assim, optou-se pela retirada desse fármaco, do método de determinação
de antineoplásicos em superfícies.
Com as condições estabelecidas realizou-se a injeção direta da fase móvel, de MeOH:
ACN (50:50, v/v) e de NaOH 0,03 mol L
-1
(soluções de limpeza de superfícies) e, não foram
observados interferentes, nos tempos de retenção dos analitos, em nenhuma das 3 análises.
Os resultados dos analitos serão discutidos segundo a ordem de eluição na corrida
cromatográfica. Separação cromatográfica satisfatória, de 5-FU, MTX, IFO, DOX e CF,
conforme demonstrado na Figura 10, foi obtida isocraticamente e, nas condições otimizadas
foi possível detectar os cinco analitos, em um tempo de 30 minutos, demonstrando a aplicação
rotineira da técnica desenvolvida. Os tempos de retenção obtidos estão descritos na Tabela 14.
Figura 10-
Cromatogramas obtidos a partir da injeção de: A) solução de limpeza de
superfícies MeOH:ACN (50:50, v/v) e B) solução de limpeza de superfícies MeOH:ACN
(50:50, v/v) contendo os analitos 5-fluoruracila (5-FU) e metotrexato (MTX), na concentração
de 5
µ
g mL
-1
e ifosfamida (IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF) na
concentração de 100
µ
g mL
-1
, identificados por CLAE-UV nas condições otimizadas.
A
B
5.1.2 Otimização das condições de extração líquido-líquido
Dentre os solventes testados para a extração líquido-líquido, aquele que apresentou
melhor desempenho, para os cinco analitos foi a solução de acetato de etila: isopropanol (7:3,
v/v), com ajuste de pH da matriz para 4, obtendo-se as seguintes porcentagens de
recuperação: 88% para a 5-FU, 112% para o MTX, 79% para a IFO, 119 % para a DOX e
103% para a CF.
Apesar dessa técnica ser promissora, não foi validada pois, testou-se a injeção direta
do líquido de limpeza, que apresentou resultados satisfatórios.
5.1.3 Injeção direta
A solução de NaOH 0,03 mol L
-1
é utilizada em diversos estudos (SESSINK et al.,
1992; McDEVITT; LEES; McDIARMID, 1993; FLORIDIA et al., 1999a; MARTINS;
APOSTOLI; DELLA ROSA, 2008) para a limpeza de superfícies, todavia quando se analisou
diretamente essa solução fortificada, com os analitos, nas condições desse estudo, os picos de
MTX e 5-FU não se separaram cromatograficamente. Assim, como Larson; Khazaeli; Dilon
(2003) sugeriram a limpeza de superfícies com soluções orgânicas, avaliou-se a solução de
metanol: acetonitrila (50:50, v/v) e, foram obtidas separação e eficiência cromatográficas
satisfatórias.
Em face ao exposto, optou-se por validar o método de injeção direta de metanol:
acetonitrila (50:50, v/v), uma vez que não requer extração prévia, sendo então uma técnica
simples, de baixo custo e limpa ambientalmente, pois não gera descarte de solventes.
Figura 11-
Fluxograma de injeção direta da matriz acetonitrila:metanol (50:50, v/v) com os
analitos 5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO), doxorrubicina (DOX) e
ciclofosfamida (CF)
em superficies
5.1.3.1 Características de desempenho do método de injeção direta
Anteriormente à validação, o teste de conformidade do sistema foi realizado, e os
seguintes parâmetros foram avaliados: número de pratos teóricos (N), resolução (Rs),
assimetria 10% (T) e fator de capacidade (k), sendo que esse teste indica que as condições
cromatográficas são apropriadas para a sua finalidade. Os resultados obtidos no presente
estudo foram considerados satisfatórios de acordo Shabir et al. (2003), conforme mostra a
Tabela 14. Somente entre a DOX e a IFO, a resolução foi abaixo do preconizado, todavia isso
não afetou a quantificação dos analitos.
Tabela 14
-
Parâmetros de conformidade do sistema* obtidos para os analitos 5-
fluoruracila (5-
FU), metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO), doxorrubicina
(DOX) e ciclofosfamida (CF), identificados por CLAE-
UV nas condições
otimizadas
(continua)
analitos
tempo
retenção
(min)
Pratos
teóricos
(N)
resolução**
(Rs)
assimetria
(T)
fator de
capacidade
(k)
5-FU 7,8 3456 0 1,4 6,8
Filtração
(membrana 0,45 µm)
1 mL solução limpeza
(acetonitrila: metanol 50:50)
Injeção no CLAE
(50 µL)
Tabela 14
-
Parâmetros de conformidade do sistema* obtidos para os analitos 5-
fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfami
da (IFO), doxorrubicina
(DOX) e ciclofosfamida (CF), identificados por CLAE-
UV nas condições
otimizadas
(conclusão)
analitos
tempo
retenção
(min)
Pratos
teóricos
(N)
resolução**
(Rs)
assimetria
(T)
fator de
capacidade
(k)
MTX 9,4 3388 2,6 2,1 8,4
IFO 26,1 27719 0 1,1 25,1
DOX 27,1 28566 1,6 1,1 26,9
CF 28,9 26807 2,7 1,2 27,9
Nota:* N ≥ 2000; Rs ≥ 2; 0,5 ≤ T ≤ 2; k > 2, de acordo com Shabir et al. (2003)
** parâmetro calculado entre MTX and 5-FU; DOX e IFO; CF e DOX
A linearidade foi demonstrada no intervalo de concentrações de 0,25 a 20 µg mL
-1
para 5-FU e MTX e, de 0,5 a 20 µg mL
-1
para IFO, DOX e CF. Esses resultados podem ser
observados na Tabela 15.
O método demonstrou robustez, uma vez que as variações estudadas, na constituição e
na vazão da fase móvel e, ainda na temperatura da coluna, não promoveram variações maiores
que 1% nos resultados analíticos.
Larson; Khazaeli; Dilon (2003), para a 5-FU, no intervalo de 0,5 a 5 µg mL
-1
,
obtiveram um r
2
de 0,9439. Para a CF e IFO, no intervalo de 0,5 a 10 µg mL
-1
, os valores de r
2
foram 0,9906 e 0,9703, respectivamente.Para a DOX, no intervalo de 0,5 a 5 µg mL
-1
, o valor
de r
2
foi de 0,9883. Floridia et al. (1999a), em análise realizada para o MTX, no intervalo de
62,5 a 1000 µg mL
-1
, obtiveram um r
2
de 0,9991.
Tabela 15 -
Linearidade, limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) do método de
determinação simultânea de 5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida
(IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF) em superfícies, por CLAE-UV
parâmetros 5-FU MTX IFO DOX CF
linearidade
(r
2
)
0,9999 0,9996 0,9986 0,9997 0,9974
intervalo
(µg mL
-1
)
0,25- 20 0,25-20 0,5-20 0,5-20 0,5-20
equação de
regressão
linear
597902x-
6698,4
417030x-
39640
12890x-
4295,5
35185x-
48324
5805,9x-
14542
LD
(µg mL
-1
)
0,1 0,1 0,3 0,3 0,3
LQ
(µg mL
-1
)
0,25 0,25 0,5 0,5 0,5
Com base nos resultados obtidos, considerados na Tabela 15, o limite de detecção do
método foi 0,1 µg mL
-1
para a 5-FU e MTX e, 0,3 µg mL
-1
para IFO e DOX. A
ciclofosfamida, um dos agentes de maior interesse nesse estudo, devido a sua freqüência de
utilização e carcinogenicidade, apresentou um limite de detecção de 0,3 µg mL
-1
. O limite de
quantificação foi 0,25 µg mL
-1
para 5-FU e MTX e 0,5 µg mL
-1
para IFO, DOX e CF, quando
50 µL foram injetados na cromatógrafo.
Esses limites foram determinados pela equação de regressão linear, uma vez que o
ruído do branco, foi muito elevado, o que poderia levar a erros no estabelecimento da relação
sinal ruído.
Segundo Ribani et al. (2004), apesar do método para a determinação do LD, mais
utilizado, ser o da relação sinal-ruído, em geral, em técnicas analíticas de separação, como as
cromatográficas e eletroforéticas, a medição do ruído não é trivial e às vezes é subjetiva (já
que a curva analítica é construída com a área e não somente o sinal do detector). Além disso,
tanto o LD quanto o LQ podem ser afetados pelas condições cromatográficas. Picos maiores
aumentam a relação sinal-ruído, resultando em LD e LQ mais baixos. A determinação
cromatográfica desses parâmetros deve considerar tanto o tipo quanto o tempo de uso da
coluna. O melhor caminho para resolver esse problema, do cálculo do LD e LQ, é utilizar o
método baseado nos parâmetros da curva analítica, que é estatisticamente mais confiável.
Roberts et al. (2006) investigaram a eficiência da descontaminação de superficies de
trabalho. Os três fármacos utilizados, como indicadores de contaminação, foram: 5-
fluoruracila, ciclofosfamida e doxorrubicina. Todavia, para tal estudo, foram utilizadas três
diferentes condições cromatográficas e, os limites de detecção e de quantificação foram,
respectivamente, para 5-FU, 0,2 e 0,5 µg mL
-1
; para a CF, 2,5 e 10 µg mL
-1
e para DOX, 0,3 e
1 µg mL
-1
.
Sessink et al. (1992), obtiveram limites de detecção, para 5-FU e MTX, de 0,3 e 3 µg
mL
-1
, respectivamente, quando CLAE-UV foi utilizada na análise não simultânea de
superfícies de embalagens e parte externa de ampolas. A diferença entre as análises foi a fase
móvel, constituída de tampão acetato de sódio para a 5-FU e, para o MTX foi necessário usar
uma solução desse mesmo tampão com metanol.
Ainda que o LD e o LQ, para a CF e para a IFO, tenham sido superiores aos obtidos
em estudos que utilizaram a espectrometria de massas, o método apresentou detectabilidade
suficiente para os demais analitos estudados, confirmando os achados anteriores.
A precisão é um critério importante na avaliação de um método, pois determina os
erros aleatórios da análise e, nesse trabalho, foi expressa como desvio padrão relativo.
Os resultados de repetibilidade podem ser considerados satisfatórios, para as
concentrações média e alta (Tabela 16). Todavia, os níveis mais baixos apresentaram desvios
altos, em torno de 8%, para a 5-FU e MTX, e 10% para IFO.
Tabela 16 -
Precisão intra-corrida (repetibilidade), avaliada pelo desvio padrão relativo
(DPR%), obtida com as sextuplicatas da injeção direta da matriz metanol: acetonitrila
(50:50, v/v), contendo os analitos 5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida
(IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF), nas concentrações baixa, média e alta
desvio padrão relativo (DPR%)
concentração
(µg mL
-1
)
analito concentração
(µg mL
-1
)
analito
IFO DOX CF 5-FU MTX
1 9,6 6,1 5,5 0,5 7,9 7,6
5 4,6 4,4 7,1 2,5 2,1 4,3
20 5,7 2,0 4,3 10 3,1 3,2
Os ensaios de precisão intercorrida, ou intermediária, forneceram resultados de DPR
superiores a 5% para as concentrações baixas, para os cinco analitos, como demonstrado pela
Tabela 17. No estudo conduzido por Larson; Khazaeli; Dilon (2003), os valores de DPR
obtidos foram de até 9%, quando as soluções-padrão foram analisadas em quadruplicata.
Tabela 17-
Precisão intercorrida (intermediária), avaliada pelo desvio padrão relativo
(DPR%), obtida com as sextuplicatas da injeção direta da matriz metanol: acetonitrila
(50:50, v/v) contendo os analitos 5-fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX), ifosfamida
(IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF), nas concentrações baixa, média e alta
desvio padrão relativo (DPR%)
concentração
(µg mL
-1
)
Analito concentração
(µg mL
-1
)
analito
CF DOX IFO 5-FU MTX
1 10,7 6,0 9,6 0,5 7,9 7,6
5 3,4 1,8 4,1 2,5 2,1 1,5
20 1,8 1,7 0,8 10 1,0 1,9
A estabilidade é um parâmetro importante para a geração de resultados confiáveis e
reprodutíveis. É importante em termos de temperatura e tempo. A estabilidade determinada
para um tipo de matriz e de material de acondicionamento específico não pode ser extrapolada
para outros (MARTINS, 2008).
O critério de avaliação da estabilidade utilizado nesse estudo, foi a comparação entre
os resultados obtidos na primeira análise e, após o armazenamento, sendo que a resposta
obtida não poderia variar 2 desvios-padrão, em relação à resposta inicial.
Mimetizando as condições de trabalho durante todo desenvolvimento deste
experimento, optou-se por avaliar as condições de maior ocorrência durante a rotina
laboratorial. Para isto, avaliou-se a estabilidade da solução no auto-injetor do CLAE durante
os tempos zero, 4 e 8 horas. A solução permaneceu no auto-injetor e decorrido o tempo
previsto, a mesma amostra era re-injetada no CLAE e, os resultados foram comparados. Em
relação a esse teste, apenas a ifosfamida e o paclitaxel demonstraram serem estáveis após oito
horas, quando a amostra foi mantida a temperatura em torno de 21 ± 2ºC.
Foi determinada a estabilidade das amostras quando submetidas ao armazenamento em
geladeira e freezer, no intervalo de tempo previsto. Em relação a esse teste, a 5-FU e o MTX
demonstraram serem estáveis após oito dias, quando a amostra foi acondicionada em freezer,
não sendo estáveis em geladeira, após esse mesmo período.
A ifosfamida demonstrou ser estável após dezessete dias em geladeira e em freezer, a
doxorrubicina demonstrou ser estável, somente quando armazenada em freezer, após
dezessete dias e, a ciclofosfamida foi estável quando condicionada em geladeira e em freezer,
após oito dias. Finalmente, o paclitaxel foi estável após 8 dias em geladeira, ressaltando-se
que o teste de estabilidade em freezer não foi realizado para esse analito.
Schmaus; Schierl; Funck (2002) obtiveram estabilidade de um dia, quando a amostra
contendo ciclofosfamida foi conservada à temperatura ambiente (22ºC), e quatro dias, quando
conservada a 4ºC.
Larson; Khazaeli; Dilon (2003) analisando as soluções-padrão, a temperatura
ambiente, observaram perdas de 20% da 5-FU, após a primeira semana e 41%, após 31 dias.
Para os analitos, CF e IFO as perdas foram de 32%, após 14 dias e para a DOX, após 17 dias,
foram observadas perdas de 75%. Esses autores discutem que esse analito é extremamente
instável em superfícies e, quando em contato com outras substâncias, tais como a 5-
fluoruracila.
5.1.3.2 Aplicação do método de injeção direta em superfícies intencionalmente
fortificadas com os analitos
Para o
wipe
teste, a verificação da eficiência da amostragem e do método desenvolvido
pode ser efetuada através de uma prova que consiste em depositar, sobre uma superfície
definida, micro quantidades de solução-padrão do fármaco de interesse (isolado ou em
misturas). Após a evaporação, efetua-se o recolhimento com vários solventes, verificando,
assim, em que condições é obtida maior porcentagem de recuperação (MINOIA;
PERBELLINI, 2000).
O método foi aplicado nas superfícies fortificadas, sendo a recuperação superior a
70%, para todos os analitos. Esse estudo foi considerado preciso, com um desvio padrão
relativo de 5%, conforme demonstra a Tabela 18.
Tabela 18-
Recuperação do método de determinação simultânea de 5-fluoruracila (5-(FU),
metotrexato (MTX), ifosfamida (IFO), doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CF) em
superfícies (n=6), fortificadas com 2 µg mL
-1
Fármaco Recuperação (%) Precisão (DPR%)
5- fluoruracila 103,0 4,0
metotrexato 81,0 5,0
ifosfamida 106,0 4,0
doxorrubicina 99,0 4,0
ciclofosfamida 74,0 1,0
Apesar do presente método não ter sido aplicado em amostras reais, esse teste permitiu
avaliar o desempenho do método. Os resultados obtidos foram satisfatórios e sugerem que,
por sua capacidade de detecção simultânea, o presente método pode ser utilizado como
triagem na avaliação global da exposição ocupacional aos antineoplásicos.
5.2 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E DE EXTRAÇÃO
DOS ANALITOS EM LUVAS
5.2.1 Otimização das condições cromatográficas
O método para determinação dos antineoplásicos em superfícies foi testado em luvas,
uma vez que esses analitos podem permear o látex e assim, serem absorvidos pela via
dérmica. Esses materiais constituem ferramentas importantes para a monitorização da
exposição ocupacional aos FAN.
Foi considerada de suma importância a análise do PAC, tendo em vista que nos
levantamentos realizados, observou-se que é um dos fármacos mais utilizados na prática
oncológica e, ainda pouco estudado. Assim, foram testadas condições, a fim de otimizar
método que fosse capaz de detectá-lo, simultaneamente aos outros analitos.
As condições otimizadas para a determinação de 5-fluoruracila, metotrexato e
paclitaxel, em luvas, foram:
- comprimento de onda: 302 nm, para o metotrexato; 265 nm, para a 5-fluoruracila e
195 nm para o paclitaxel;
- coluna Shim-Pak
CLC-ODS(M) C18 (250 x 4,6 mm, 5
µ
m);
- temperatura do forno: 35°C;
- fase móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila (35:15:50 v/v), com vazão de 1 mL
min
-1
, durante toda corrida cromatográfica.
Nas condições acima, não foi possível separar cromatograficamente os analitos CF,
DOX, IFO então, optou-se por excluí-los do estudo em luvas. Corroborou para essa decisão,
os altos limites de detecção e de quantificação obtidos quando se utiliza CLAE-UV, para a
análise dessas substâncias químicas.
As Figuras 11, 12 e 13 demonstram os espectros obtidos para os três analitos contidos
em uma mesma solução, porém submetidos a comprimentos de ondas diferentes na condição
cromatográfica otimizada.
Figura 12-
Espectros obtidos a partir da análise de metotrexato, na concentração 20
µ
g mL
-1
no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel: água pH 4,0: metanol:
acetonitrila (35:15:50, v/v/v)
Figura 13-
Espectros obtidos a partir da análise de 5-fluoruracila, na concentração 20
µ
g mL
-
1
, no detector DAD, coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel: água pH 4,0: metanol:
acetonitrila (35:15:50, v/v/v)
Figura 14-
Espectros obtidos a partir da análise de paclitaxel, a 20
µ
g mL
-1
, no detector DAD,
coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel: água pH 4,0: metanol: acetonitrila
(35:15:50, v/v/v)
As quatro vistas (telas), demonstradas nas Figuras 11, 12 e 13 podem ser descritas
como:
a)
Mixed View
(superior esquerda), que corresponde a uma visão superior dos picos.
Nessa tela é possível ajustar o comprimento de onda de absorção máxima, relacionando-o ao
tempo de retenção;
b)
Spectrum
(superior direita), que corresponde ao espectro de absorção (varredura) do
pico, no tempo de retenção selecionado;
c) Cromatograma (inferior esquerda), que corresponde ao comprimento de onda
selecionado no
Mixed View
;
d) 3D (inferior direita), que corresponde a visualização do cromatograma em três
dimensões.
Após a eluição da solução contendo os três analitos, selecionou-se o pico de interesse,
pelo tempo de retenção e, esse era então, comparado com uma biblioteca criada, a partir da
análise de soluções-padrão dos analitos, nas mesmas condições cromatográficas otimizadas
nesse estudo. Considerou-se como 98% o valor mínimo de similaridade todavia, não foi
possível encontrar na literatura dados que corroborassem esse critério.
O detector utilizado permitiu a seleção de comprimentos de onda diferentes,
dependendo somente da maior absorção dos analitos. Assim, é possível observar na Figura 11
que, para o MTX, o comprimento de onda de maior absorção é 302 nm, o que está de acordo
com os valores descritos por Rubino (2001). Já, para a 5-FU, o comprimento de onda de
maior absorção foi 265 nm (Figura 12), apesar da revisão de Turci et al. (2003) referenciar
estudos que utilizaram comprimentos de onda de 254 e 260 nm. Para o PAC, o comprimento
de onda de maior absorção foi 195 nm (Figura 13), o qual fora anteriormente utilizado por
Larson; Khazaeli; Dilon (2003).
Quanto à coluna cromatográfica, utilizou-se a mesma já utilizada no método para
superfícies, todavia em uma temperatura do forno maior, o que proporcionou uma melhor
definição dos picos. O sistema em fase reversa é o mais utilizado para esses três analitos, de
acordo com Larson; Khazaeli; Dilon (2003) e Turci et al. (2003).
Conforme demonstrado na Figura 14, não houve separação cromatográfica, em 195
nm, entre o MTX e a 5-FU, pois esses co-eluíram, sendo satisfatório somente para o PAC.
Esse comprimento de onda foi otimizado no método para análise dos fármacos em superfícies,
em UV e, também, utilizado por Larson; Khazaeli; Dilon (2003).
Figura 15-
Cromatograma obtido a partir da injeção de solução padrão contendo os analitos:
metotrexato (MTX), 5-fluoruracila (5-FU) e paclitaxel (PAC) na concentração de 20
µ
g mL
-1
,
identificados por CLAE-UV( 195 nm) nas condições otimizadas
Quando a mesma amostra foi analisada em diferentes comprimentos de onda,
simultaneamente, em função do pico de maior absorção de cada um, foi possível detectá-los
separadamente, conforme demonstra a Figura 15.
Figura 16-
Cromatogramas obtidos a partir da injeção de solução-padrão contendo os
analitos metotrexato (em verde, analisado em 302 nm), na concentração de 20 µg mL
-1
e 5-
fluoruracila (em azul, analisado em 265 nm), na concentração de 10
µ
g mL
-1
, identificados
por CLAE-DAD nas condições otimizadas
5.2.2 Otimização das técnicas de extração
Após vários testes, otimizou-se a técnica para a análise das luvas, que consistiu em
acrescentar-se 18 mL de NaOH 0,03 mol L
-1
ao par de luvas, de modo que esse volume
escorresse por toda a superfície, em recipiente apropriado. Em seguida, o recipiente foi levado
ao banho ultrassônico por 30 minutos. Recolheu-se então 15 mL do líquido, o qual foi
submetido à centrifugação por 30 min a 580 g. O sobrenadante foi utilizado para a ELL
(Figura 16) e para a SPE (Figura 17) destacando-se que o produto de cada extração foi
reunido em um mesmo tubo e seco, antes de ser ressupenso na fase móvel.
Figura 17 -
Fluxograma da técnica de extração líquido-líquido (ELL) de antineoplásicos em
luvas
Desprezar
Fase Aquosa
1 mL de NaOH 0,03 mol L
-
1
(proveniente
do sobrenadante da centrifugação)
4 mL de Fase Orgânica
Ressuspensão em 1 ml de fase móvel
50 µL no CLAE
Fase Aquosa
5 mL de Fase Orgânica
+ 5 mL de acetato de etila
agitação no vórtex,
5 minutos
+ 5 mL de acetato de etila
agitação no vórtex,
secar sob fluxo de N
2
Este tubo receberá o
eluato da SPE
Figura 18-
Fluxograma da técnica de extração em fase sólida (SPE) de antineoplásico em
luvas
Ressalta-se que, primeiramente foram realizados testes de injeção direta tendo como
líquido de limpeza a solução de acetonitrila: metanol (50:50, v/v), todavia esta solução reagiu
com o látex das luvas, por este motivo considerada como inadequada.
Outra solução de limpeza investigada foi a solução de NaOH 0,03 mol L
-1
;
contudo,
os resultados não foram satisfatórios, pois o MTX, o primeiro analito a eluir, começou a
apresentar integração insatisfatória. Além disso, analisando-se os resultados provenientes de
luvas não fortificadas foi possível observar picos nos tempos de retenção dos analitos. Assim,
concluiu-se que para as luvas teria que ser realizada a etapa de extração.
O preparo de amostra num processo analítico, tipicamente, consiste na extração de
componentes de interesse da matriz e o procedimento varia no grau de seletividade,
velocidade e conveniência e sua otimização, para cada situação, é de importância relevante no
Condicionamento do cartucho SPE C
18
com 10 mL de
metanol e 10 mL de tampão acetato 0,05 mol L
-1
pH=4
1 mL de NaOH 0,03 mol L
-1
(proveniente do sobrenadante
da centrifugação) é percolado pelo cartucho
Lavagem com 10 mL de acetato de etila
Eluição com 3 alíquotas de 1 mL de metanol
Secagem sob fluxo de N
2
Ressuspensão em 1 ml de fase móvel
50 µL no HPLC
Recolher sobre o extrato da ELL
procedimento analítico. A escolha de um processo deve ser fundamentada na compreensão
dos princípios fundamentais que governam a transferência de massa dos analitos em sistemas
multifásicos. O pré-tratamento de amostras é a etapa mais crítica e trabalhosa da análise
cromatográfica (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001). Admite-se que um preparo de
amostra apropriado afeta grandemente a exatidão e confiança na análise (FLANAGAN et al.,
2006).
A técnica de extração primeiramente estudada foi a líquido-líquido e, os resultados de
recuperação foram satisfatórios somente para a 5-FU e para o PAC, nas condições
representadas na Figura 16. Esses analitos têm afinidade por solventes orgânicos e, assim o
acetato de etila foi o solvente adequado para ambos. Porém, a técnica não apresentou
recuperação satisfatória para o MTX.
Diferentemente dos outros dois analitos, o MTX é solúvel em solventes polares, o que
dificultaria sua extração líquido-líquido, já que as luvas foram lavadas com solução de NaOH.
Assim, optou-se por testar a extração em fase sólida e, após revisão da literatura foi
possível observar que a fase octadecila (C18), usando MeOH para a eluição do analito, foi a
condição mais adequada e, é uma das mais utilizadas para esse fármaco, conforme verificado
na revisão de Minoia e Perbellini (2000).
De fundamental importância ressaltar que o processo de extração reúne em um
mesmo tubo, os produtos das técnicas de extração líquido-líquido (fase orgânica) e da
extração em fase sólida (eluato) como demonstram os fluxogramas (Figura 16 e Figura 17).
5.2.3 Características de desempenho do método
Na Tabela 19 podem ser observados os parâmetros de conformidade do sistema,
avaliados nesse estudo. Os resultados foram considerados satisfatórios, de acordo com Shabir
et al. (2003). O MTX apresentou fator de capacidade menor que 2, o que não afetou a
quantificação desse analito.
Tabela 19 -
Parâmetros de conformidade do sistema* obtidos com os analitos metotrexato
(MTX), 5-fluoruracila (5-FU) e paclitaxel (PAC) na concentração de 10
µ
g mL
-1
identificados
por CLAE-DAD-UV nas condições otimizadas
analitos
tempo
retenção
(min)
pratos
teóricos (N)
resolução**
(Rs)
assimetria
(T)
fator capacidade
(K)
MTX
2,0 2323 0 1,3 1
5-FU
2,8 5987 2,5 1,4 2
PAC
7,7 16052 12,6 1,2 7
Nota:* N ≥ 2000; Rs ≥ 2; 0,5 ≤ T ≤ 2; k > 2, de acordo Shabir et al. (200
3)
** parâmetro calculado entre MTX and 5-FU e entre o 5-FU e o PAC
Crauste-Manciet et al. (2005), em seu estudo de detecção de FAN em superfícies e
luvas, obtiveram o LD para 5-FU de 0,02 µg mL
-1
e, para o MTX de 0,01 µg mL
-1
. Para o
PAC, Larson; Khazaeli; Dilon (2003) obtiveram o LD de 2,0 µg mL
-1
. Ao compararmos os
limites de detecção, referenciados nas Tabelas 9, 10 e 11 com o presente estudo, verifica-se
que os resultados obtidos estão de acordo com outros autores.
A linearidade foi estudada no intervalo de 0,25 a 20 µg mL
-1
para os três analitos e, os
resultados estão demonstrados na Tabela 20.
As equações de regressão linear foram obtidas pelo método dos mínimos quadrados e,
os coeficientes de determinação (r
2
) superiores a 0,99, foram considerados satisfatórios, de
acordo com a RE 899/03, da ANVISA (BRASIL, 2003).
Com base nos resultados obtidos, o limite de detecção do método foi 0,1 µg mL
-1
para
a PAC e , 0,2 µg mL
-1
para 5-FU e MTX. O limite de quantificação foi 0,25 µg mL
-1
para 5-
FU, MTX e PAC.
Esses limites foram determinados pela equação de regressão linear, uma vez que o
ruído do branco,quando submetido ao processo de extração foi muito elevado, o que poderia
levar a erros no estabelecimento da relação sinal ruído.
Tabela 20 -
Linearidade, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) do
método de determinação simultânea para 5- fluoruracila (5-FU), metotrexato (MTX) e
paclitaxel (PAC), por CLAE-DAD-UV
parâmetros 5-FU MTX PAC
linearidade (r²)
0,9986 0,9966 0,9990
faixa trabalho
(µg mL
-1
)
0,25 – 20 0,25 – 20 0,25 - 20
equação de
regressão linear
y = 180915x+
33007
y = 107739x-
1936,8
y = 159801x+
9124,5
LD (µg mL
-
1
)
0,2 0,1 0,2
LQ (µg mL
-
1
)
0,25 0,25 0,25
A precisão é um critério que determina os erros aleatórios da análise. Nesse trabalho,
foi expressa como desvio padrão relativo, cujos valores são apresentados na Tabela 21.
Tabela 21 -
Precisão intra-corrida (repetibilidade) e intercorrida (precisão intermediária),
avaliada pelo desvio padrão relativo (DPR%), obtida na análise de luvas, contendo
antineoplásicos (n=6), por CLAE-DAD-UV com prévia extração dos analitos
DPR%
*conc.
(µg mL
-1
)
MTX 5-FU PAC
intra-
corrida
intercorrida
intra-
corrida
intercorrida
intra-
corrida
intercorrida
0,25 8,0 9,0 8,0 12,0 9,0 14,0
2 13,0 2,0 13,0 7,0 15,0 2,0
20 14,0 14,0 13,0 11,0 9,0 8,0
Nota: *conc = concentração.
Segundo recomenda a ANVISA (BRASIL, 2003), a repetibilidade do método, pode
ser considerada satisfatória se valores obtidos possuírem um desvio menor ou igual a 20%,
em relação a concentração nominal, para o LQ e, desvio menor ou igual a 15%, em relação à
concentração nominal, para as outras concentrações da curva de calibração.
Os resultados obtidos no presente trabalho foram satisfatórios para esse parâmetro da
validação. Convém ressaltar que esses valores, na referida resolução, são preconizados para
métodos bioanalíticos, que passam pela etapa de preparo de amostra. Assim, apesar desse
estudo não utilizar amostras biológicas, a técnica de preparo de amostra foi fundamental para
a otimização do método.
No estudo de Floridia et al. (1999a), que analisaram a parte interna de toucas, e
superfícies de trabalho, tais como pavimento, prateleiras, maçanetas, valores obtidos para a
precisão foram de 2 a 15%, no intervalo estudado para o MTX. Larson; Khazaeli; Dilon
(2003) relataram dados sobre precisão, para a 5-FU, de 0,19 a 2,0% e de 3,5 a 19,7%, para o
PAC, quando foram injetadas solução-padrão, diretamente no CLAE.
Castiglia et al. (2008), na análise de luvas, obtiveram um DPR intra-dia de até 8,5% e
interdia de até 13,1%, para a 5-FU. Ressalta-se que, nesse trabalho, os autores usaram a
técnica de
wipe
teste, com terra de diatomácea como sorvente para a extração do analito.
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um método analítico
dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação próximas a 100% são
desejáveis, porém, admite-se valores diferentes, desde que seja precisa e exata (BRASIL,
2003).
A porcentagem de recuperação (Tabela 22) foi obtida a partir da relação entre as
respostas (áreas) das amostras extraídas e não-extraídas. Para tanto, foram analisadas três
concentrações em sextuplicata, contemplando a faixa de linearidade do método, e as áreas
obtidas nas amostras não extraídas ou seja, quando se extraiu a solução de NaOH 0,03 mol L
-
1
, sem adição de analitos e, ao extrato adicionou-se os padrões nas respectivas concentrações,
que representam 100% de recuperação, foram comparadas àquelas obtidas quando a amostra
foi submetida ao procedimento de extração. Dessa forma, além de observar a eficiência do
processo de extração, levou-se em conta o efeito da matriz. Sottani et al. (2000), obtiveram
recuperação superior a 80% quando extraíram o PAC de amostras de luvas, com acetato etila
e detecção por CLAE-EM.
Tabela 22 -
Recuperação do método de determinação simultânea de metotrexato (MTX), 5-
fluoruracila (5-FU) e paclitaxel (PAC) em luvas (n=6), analisadas pelo método CLAE-DAD-
UV, com prévia extração dos analitos
concentração MTX 5-FU PAC
(µg mL
-
1
) (%) (%) (%)
1 115,0 90,0 89,0
2 115,0 103,0 71,0
20 86,0 94,0 96,0
5.2.4 Aplicação do método em amostras de luvas
Foram coletadas 6 amostras de indivíduos que trabalhavam em um laboratório de
pesquisa, sendo que somente as amostras 5 e 6 foram submetidas ao processo de
descontaminação, efetuado conforme procedimento do laboratório. Os resultados,
demonstrados na Tabela 23, indicam que o MTX e o PAC foram detectados e quantificados
em três, das seis, amostras analisadas. Já, a 5-FU foi detectada em todas as amostras porém,
quantificada somente em três delas.
Tanto a detecção quanto a quantificação dos analitos sugerem que os procedimentos
de manipulação, dos FAN, precisam ser revisados pois, as luvas podem disseminar a
contaminação no ambiente de trabalho. Ainda, é preocupante o fato da 5-FU ter sido
detectada em luvas que foram supostamente descontaminadas, apesar de não ter sido possível
sua quantificação pois, as áreas obtidas foram menores do que as do LQ desse método. Isso
sugere que o processo utilizado para descontaminação não foi eficiente, apesar de ser o
recomendado na literatura.
Tabela 23 -
Concentração de antineoplásicos em amostras de luvas utilizadas por
pesquisadores, determinadas por CLAE-DAD-UV, nas condições otimizadas
(continua)
amostra metotrexato 5-fluoruracila paclitaxel
(µg mL
-1
) (µg mL
-1
) (µg mL
-1
)
1 3,0 0,5 0,5
2 4,8 D** ND*
3 3,2 0,7 0,8
Tabela 23
-
Concentração de antineoplásicos em amostras de luvas utilizadas por
pesquisadores, determinadas por CLAE-DAD-UV, nas condições otimizadas
(conclusão)
amostra metotrexato 5-fluoruracila paclitaxel
(µg mL
-1
) (µg mL
-1
) (µg mL
-1
)
4 ND* 0,4 0,3
5 ND* D** ND*
6 ND* D** ND*
Nota: ND*= não detectado pelo método; D**= detectado porém, não quantificado pelo método
Conforme pode ser observado na Tabela 23, os resultados obtidos sugerem que a
exposição dos voluntários foi a diferentes concentrações, não controladas, uma vez que o
objetivo desse teste foi aplicar o método desenvolvido em situação de real exposição.
Todavia, existem alguns fatores, tais como a concentração manuseada, o tempo e/ou a
freqüência de exposição, que aumentam a probabilidade de absorção, com conseqüente
aumento do risco. Desde 1979, existem relatos que o risco de mutagenicidade aumenta
quando se eleva o tempo/ freqüência de exposição (Falck et al., 1979).
Roberts et al. (2006) após estudarem a descontaminação de superfícies,
demonstraram que a 5-FU não foi degradada, mesmo após exposição durante 1 hora a
detergentes fortemente alcalinos, ácidos e neutros. Martins; Apostoli e Della Rosa (2008),
demonstraram a permanência da ciclofosfamida nas superfícies, mesmo após a
descontaminação.
Apesar dos achados do presente trabalho não serem suficientes para delimitar a real
dimensão da contaminação do ambiente com os FAN, reforçam os achados anteriores e,
demonstram que o presente método pode ser utilizado para a monitorização da exposição
ocupacional a tais substâncias, simultaneamente.
6 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho foi possível concluir que,
para a determinação em superfícies:
a) as condições otimizadas para o método analítico de determinação simultânea dos
antineoplásicos, 5-fluoruracila, metotrexato, ifosfamida, doxorrubicina e ciclofosfamida,
utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência, foram: detecção a 195 nm (UV), coluna
C18 (250 x 4,6 mm, 5
µ
m) com pré-coluna similar, fase móvel constituída de água pH 4,0:
metanol: acetonitrila (70:13:17, v/v/v), vazão de 0,4 mL min
-1
até 13 minutos e 1 mL min
-1
,
até o fim da corrida cromatográfica;
b) foram obtidos valores de recuperação satisfatórios para a determinação simultânea
dos fármacos estudados, utilizando NaOH 0,03 mol L
-1
, como líquido de limpeza das
superfícies, e extração líquido-líquido com acetato de etila: isopropanol (7:3, v/v);
c) foram obtidos resultados satisfatórios para determinação simultânea dos fármacos
estudados, utlizando metanol: acetonitrila (50:50, v/v), como líquido de limpeza de
superfícies, e injeção direta, sem prévia extração. O método demonstrou-se linear para a 5-FU
e MTX, no intervalo de 0,25 a 20
µ
g mL
-1
e, para IFO, DOX e CF, no intervalo de 0,5 a 20
µ
g mL
-1
, com coeficientes de determinação superiores a 0,99. A recuperação obtida foi em
torno de 74 a 106%, para todos os analitos e a repetibilidade foi inferior ou igual a 11%;
d) método desenvolvido é de fácil execução, de baixo custo e, pode ser empregado na
avaliação da exposição ocupacional dos fármacos antineoplásicos estudados.
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho foi possível concluir que,
para a determinação em luvas:
a) as condições otimizadas para o método analítico de determinação simultânea dos
antineoplásicos, metotrexato, 5-fluoruracila e paclitaxel, utilizando a cromatografia líquida de
alta eficiência, foram: detecção em DAD e quantificação em UV, sendo 195 nm, 265 nm e
302 nm, os comprimentos de onda utilizados para o PAC, 5-FU e MTX, respectivamente,
coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5
µ
m) com pré-coluna similar, fase móvel constituída de água pH
4,0: metanol: acetonitrila (35:15:50, v/v/v) na vazão de 1 mL min
-1
;
b) a porcentagem de recuperação foi satisfatória, para os analitos 5-FU e PAC, quando
a amostra foi submetida a extração líquido-líquido, com acetato de etila, com valores em
torno de 71 a 103%;
c) porcentagem de recuperação satisfatória foi obtida, para o analito MTX, quando a
amostra foi submetida ao procedimento de extração em fase sólida, em cartuchos C18 e
eluição com MeOH, com valores de 86 a 115%;
d) o método demonstrou-se linear no intervalo de 0,25 a 20
µ
g mL
-1
, com coeficientes
de determinação superiores a 0,99 e, a repetibilidade foi inferior ou igual a 15%, para todos os
analitos;
e) o método revelou-se eficiente para ser aplicado em situações de exposição
ocupacional pois, permitiu quantificar os analitos, em amostras reais, com valores iguais ou
acima de 0,25 µg mL
-1
. O uso do detector por arranjo de diodos permitiu a detecção, por
comparação da similaridade (pureza do pico), ainda que a concentração dos analitos, nas
amostras, estivessem abaixo do LQ do método.
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ANEXO I
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
ANEXO II
Confirmação de recebimento e submissão do artigo ao Journal of Occupational &
Environmental Hygiene
Manuscript Central Account Created - Journal of Occupational & Environmental Hygiene
De:
Enviada:
quarta-feira, 12 de novembro de 2008 20:00:07
Para: [email protected]
12-Nov-2008
Dear Mrs. Alcântara:
Welcome to the Journal of Occupational & Environmental Hygiene.
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Eastern Time (USA); email the Helpdesk by clicking on "Get Help Now" at the
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[email protected]ashington.edu.
You may check the status of submitted manuscripts or submit a new
manuscript by logging onto Manuscript Central and clicking on your "Author
Center."
If you have any questions or comments, or if you already have a Journal of
Occupational & Environmental Hygiene account on Manuscript Central, would
you kindly contact me at ccarol@u.washington.edu. Thank you for your
participation.
Sincerely,
Cathi Carol
Editorial Office
Journal of Occupational & Environmental Hygiene
Fwd: JOEH-08-0175 Has Been Submitted to the Journal of Occupational & Environmental
Hygiene]
De:
Enviada:
sábado, 21 de fevereiro de 2009 19:02:13
Para: [email protected]
--------------------------- Mensagem Original ----------------------------
Assunto: JOEH-08-0175 Has Been Submitted to the Journal of Occupational &
Environmental Hygiene
De: c[email protected]ington.edu
Data: Qua, Novembro 12, 2008 4:58 pm
Para: isarita@unifal-mg.edu.br
--------------------------------------------------------------------------
12-Nov-2008
Dear Dr. Martins:
Thank you for submitting manuscript "A LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF ANTINEOPLASTIC DRUGS IN SURFACES" to the
Journal of Occupational & Environmental Hygiene.
The ID number for this manuscript is "JOEH-08-0175". Please reference
this ID number in all future correspondence with the Editorial Office
regarding this manuscript.
You may track the Manuscript Central operational status of this manuscript
in your Author Center. If you have any questions about the review of your
manuscript, please email me at cca[email protected]gton.edu.
We welcome feedback about our manuscript submission and review process.
If you have any comments or suggestions for our consideration, you may
email them to me at cc[email protected]ngton.edu.
You may contact me if you have any questions about your manuscript
submission now or in the future.
Thank you again for your submission to the Journal of Occupational &
Environmental Hygiene.
Sincerely,
Cathi Carol
Editorial Office
[email protected]ashington.edu
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