( PDF ) Alterações epigenéticas em adenocarcinomas de próstata

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA

CAMPUS DE BOTUCATU

ALTERAÇÕES EPIGENÉTICAS EM ADENOCARCINOMAS DE

PRÓSTATA

FLÁVIA CILENE MACIEL DA CRUZ ALVES

BOTUCATU-SP

2009

Tese apresentada ao Programa de

Pós – Graduação em Patologia da

Faculdade de Medicina de

Botucatu, Universidade Estadual

Paulista – UNESP, para a obtenção

do título de Doutor em Patologia.

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA

CAMPUS DE BOTUCATU

ALTERAÇÕES EPIGENÉTICAS EM ADENOCARCINOMAS DE

PRÓSTATA

Doutoranda: Flávia Cilene Maciel da Cruz Alves

Orientadora: Profa. Dra. Sílvia Regina Rogatto

BOTUCATU-SP

2009

Tese apresentada ao Programa de

Pós – Graduação em Patologia da

Faculdade de Medicina de

Botucatu, Universidade Estadual

Paulista – UNESP, para a obtenção

do título de Doutor em Patologia.

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU – UNESP

Bibliotecária responsável: Selma Maria de Jesus

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz.

Alterações epigenéticas em adenocarcinomas de próstata / Flávia Cilene

Maciel da Cruz Alves. – Botucatu : [s.n.], 2009.

Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu,

Universidade Estadual Paulista, 2009.

Orientadora: Sílvia Regina Rogatto

Assunto CAPES: 40105008

1. Próstata - Câncer - Aspectos genéticos

CDD 616.99263

Palavras chave: Câncer de Próstata Gene CDH1; Gene RARB; Gene RASSF1A;

IHC; Metilação; MSP-PCR; RT-PCR

.... o meu caminho está encoberto ao Senhor.... Não sabes, não ouviste que o eterno

Deus, o Senhor, o Criador dos fins da terra, nem se cansa, nem se fatiga?.... Faz forte

ao cansado e multiplica as forças ao que não tem nenhum vigor.... mas os que esperam

no Senhor renovam as suas forças, sobem com asas como águias, correm e não se

cansam, caminham e não se fatigam....

Isaías cap.40 vers.27 a 31

DEDICATÓRIA

DEDICATÓRIADEDICATÓRIA

DEDICATÓRIA

Às minhas filhas Ana Carolina e Mariana,

minha eterna gratidão pelo carinho e paciência e

ao meu marido Jaime pelo amor, incentivo,

respeito, carinho e apoio nas dificuldades e por

fazer parte da minha vida.

Obrigado por tudo que vocês fizeram por

mim!!!!

Aos meus pais, Osvaldo e Neide agradeço

pela confiança em mim depositada, ajudando a

buscar forças para concluir esta etapa da minha

formação profissional, propiciando a mim

atenção nos momentos difíceis.

Obrigado por tudo e eu amo muito

vocês!!!!

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, pois sem Ele nada do que foi feito se

faria.

Aos meus irmãos Fábio e Fernando, cunhadas Margareth e Regina, sobrinhos

Ricardo, Beatriz e Luccas, minha sogra Dalila e meu sogro Waldomiro (in memorian),

cunhada Suely, cunhado Santana, que, com os seus auxílios, orações e contribuições,

permitiram a realização deste curso.

À minha orientadora Prof. Dra. Sílvia Regina Rogatto, pelo incentivo e apoio

durante todo este processo de crescimento profissional, intelectual e pessoal. E

também pela integridade de caráter científico e pela amizade.

À Dra. Sandra Drigo, por sua participação essencial em todas as etapas deste

trabalho, pelo carinho, orientação segura e disponibilidade. Muito Obrigado!

À Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues, um especial agradecimento ao

incentivo constante e pela atenção, presteza e disposição a mim sempre dispensadas.

Obrigado de coração minha amiga...

Ao Dr. José Carlos de Souza Trindade, Dr. José Carlos de Souza Trindade

Filho e Dr. Márcio Nobrega de Jesus, pela participação essencial na análise das

informações clínicas, cujos ensinamentos nortearam minha vida profissional.

Ao Prof. Dr. João Lauro Viana de Camargo, agradeço a oportunidade de

cursar este doutorado e pela acolhida em Botucatu!!!

À Dra. Daisy Maria Favero Salvadori, pelo apoio, incentivo e pela amizade

cultivada.

À Dra. Cláudia Aparecida Rainho, pelas importantes sugestões que

enriqueceram este trabalho.

À todos os amigos do laboratório NeoGene, Fabíola, Renata Canevari, Renata

Bueno, Rodrigo, Fábio, Lívia, Luciana, Eliana, Míriam, André, Cássia, Fernanda,

Sara, Priscila, Nádia, Leda, Érica, Michele (USP/Bauru) e Greicy que participaram

efetivamente deste trabalho científico e também participaram emocionalmente desta

minha jornada.

A todos os amigos do Departamento de Patologia, Professora Maria Luíza,

Lúcia, Denise, Cícera, Luciano, Cristina, José Carlos, Priscila Negraes e Shadia, e

também do Departamento de Urologia, Andréa e Glaucia, pela convivência

harmoniosa dos últimos anos.

À Tânia, secretária do programa de pós-graduação em Patologia, por sua

sempre gentil presteza em informações.

Aos técnicos do laboratório de Imunohistoquímica, Marquinhos e Celene, pela

importante participação na realização da imunohistoquímica e pela boa vontade em

sempre ajudar.

Ao Dr. Francisco Fonseca, Dr. Fernando Soares, Ivan (laboratório de

imunohistoquímica) e a Cláudia, do Hospital A.C. Camargo, pela contribuição na

disponibilização dos dados clínicos dos pacientes e pelas valiosas orientações.

À Janete Aparecida Silva, Nathanael Pinheiro Salles e Regina Célia Spadin,

membros da seção de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina, pela prontidão com

que sempre me atenderam.

À todos os membros da Igreja Presbiteriana Maranata que de alguma forma

contribuíram para a execução deste trabalho, pois fazemos parte de uma grande

família abençoada por Cristo Jesus.

RESUMO

RESUMORESUMO

RESUMO

Introdução: As alterações epigenéticas desempenham funções críticas na regulação de

vários genes, funções celulares e conseqüentes mudanças no controle do ciclo celular. Estas

modificações têm sido associadas ao desenvolvimento tumoral. Em câncer de próstata, muitos

genes hipermetilados foram descritos e indicados como potenciais marcadores diagnósticos,

incluindo RARB, RASSF1A, SFN e CDH1. O presente estudo tem como objetivo avaliar a

freqüência da hipermetilação dos genes SFN, RARB, RASSF1A e CDH1 nos adenocarcinomas

de próstata (CaP) e correlacionar essas alterações com a expressão gênica e proteica e com

parâmetros clínicos e histopatológicos.

Métodos: O padrão de metilação dos genes SFN, RARB, RASSF1A e CDH1 foi

determinado por PCR-metilação específica em 68 amostras de CaP e em 27 amostras de

próstata não neoplásicas (PNN). Expressão dos transcritos RARB e RASSF1A foram avaliados

por RT-PCR quantitativo em 73 amostras de CaP, 15 amostras de tecidos prostáticos

adjacentes não neoplásicos (PAdj) e dois tecidos prostáticos normais (N). A expressão das

proteínas foi avaliada por imunohistoquímica em 141 amostras de CaP, 40 PAdj e dois N. Os

resultados foram correlacionados com parâmetros clinico-histopatológicos. A expressão

proteica de E-caderina também foi investigada em uma série de 39 CaP e 27 PNN.

Resultados: Os genes RARB e RASSF1A apresentaram-se hipermetilados em CaP

(P<0,0001 e P = 0,0017, respectivamente), mas nenhuma diferença foi detectada para SFN.

Os níveis dos transcritos e proteínas RASSF1A foram semelhantes entre amostras de CaP e

PAdj. Entre os tumores foi detectada a diminuição dos níveis de transcritos de RARβ

(P=0,001) e da proteína (P=0,0007). Níveis diminídos do mRNA foram associados com a

hipermetilação de RARB. A expressão proteica de RARβ era nuclear e citoplasmática nos

tecidos tumorais. A análise multivariada demonstrou que a presença de RARβ citoplasmático

estava independentemente associada com a diminuição da sobrevida livre de recorrência

bioquímica (P=0,019, HR = 1,891). Não houve nenhuma diferença significativa entre a

hipermetilação do promotor de CDH1 em CaP (56 %) e nas amostras PNN (56 %) pareados

pela idade. Além disso, nenhuma associação foi encontrada entre a hipermetilação e a

expressão de E-caderina nas amostras CaP e PNN. A ausência de associação entre o padrão de

metilação de CDH1 e a expressão proteica foi confirmada em análise posterior utilizando

células tumorais isoladas por microdissecção por captura a laser (LMC). Em um subconjunto

de amostras tumorais, os padrões de expressão da E-caderina apresentaram-se heterogêneos e

foram associados com escore de Gleason alto e pior prognóstico (recidiva bioquímica em três

casos). A análise da proteína E-caderina em um número maior de pacientes (TMA) não

mostrou nenhuma associação na comparação com os parâmetros clínico-histopatológicos.

Conclusões: Foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos padrões de

metilação entre CaP e tecidos PNN pareados quanto a idade apenas para os genes RARB e

RASSF1A. A hipermetilação de RARB parece ser um dos mecanismos envolvidos na

diminuição de expressão de RARβ em CaP. Sugerimos que a presença de marcação

citoplasmática da proteína RARβ é um marcador de pior prognóstico independente e que pode

ser considerado um novo biomarcador em câncer de próstata. A hipermetilação do promotor

de CDH1 não foi associada à expressão protéica. Em um subconjunto de amostras, o padrão

de expressão heterogênea da proteína foi significativamente associado a um alto escore de

Gleason, corroborando sua associação com tumores mais agressivos.

ABSTRACT

ABSTRACTABSTRACT

ABSTRACT

Introduction: Epigenetic alterations play critical roles in regulation of several genes and cellular

functions and their deregulation may disrupt the cellular control leading to tumor development. In

prostate cancer (PCa), many hypermethylated genes have been described and indicated as potential

prostate cancer diagnostic markers, including RARB, RASSF1A, SFN and CDH1. The current study

aimed to evaluate SFN, RARB, RASSF1A, and CDH1hypermethylation frequencies in prostate

carcinoma (PCa) and to correlate these alterations with down-regulations at transcriptional and

protein levels and with clinical outcome.

Methods: Methylation pattern of SFN, RARB, RASSF1A and CDH1 were determined by methylation-

specific PCR (MSP) in 68 PCa samples and 27 non-neoplastic prostate tissues (NNP). RARB and

RASSF1A transcripts expression were evaluated by quantitative RT-PCR in 73 PCa, 15 adjacent non-

neoplastic prostate tissues (AdjP) and two normal prostate (N). Methylation and mRNA analysis for

RARB and RASSF1A were done in matched samples from 30 PCa and 10 AdjP. Protein expression

assessed by immunohistochemistry was evaluated in an independent cohort of 141 PCa, 40 AdjP and

two normal prostate tissues. Paired E-cadherin protein and methylation analysis was also investigated

in 33 PCa and 20 NNP. The findings were correlated with clinicopathological parameters.

Results: RARB and RASSF1A genes were hypermethylated in PCa (P <0.0001 and P = 0.0017,

respectively), but no difference was detected for SFN. RASSF1A mRNA and protein levels were

similar in PCa and AdjP samples. Down-expression of RARβ in transcript (P=0.001) and protein

(P=0.0007) levels were detected in tumors. Lower mRNA levels were associated with RARB

hypermethylation. Nuclear and cytoplasmic RARβ protein expression was detected in tumor tissues.

Multivariate analysis demonstrated that cytoplasmic RARβ immunostaining was independently

associated with decreased biochemical recurrence-free survival (P=0.019, HR=1.891). There were no

differences between the CDH1 promoter hypermethylation in PCa (56%) and age-matched NNP

(56%) samples. None association was also found between CDH1 hypermethylation and protein

expression in prostate tissues. Absence of association between CDH1 methylation status and protein

expression was confirmed in further MSP analysis in distinct tumor cells isolated by laser

microdissection capture (LMC) according to protein expression patterns. Heterogeneous E-cadherin

protein expression patterns were detected in a subset of tumor samples and was associated with high

Gleason score and worse outcome. E-cadherin protein analysis in a large number of patients (TMA)

showed no association with clinicopathological parameters.

Conclusions: Statistically significant differences in methylation patterns between PCa and age-

matched NNP tissues were observed only for the RARB and RASSF1A genes. RARB

hypermethylation seems to be one of the mechanisms involved in RARβ down-expression in PCa.

Cytoplasmic RARβ protein was an independent predictor of poor prognosis that may be considered

as a new biomarker in prostate cancer. CDH1 promoter hypermethylation was not associated with

protein expression level. In a subset of samples was detected a heterogeneous protein expression

pattern significantly associated with higher Gleason score, giving an additional evidence of its

association with more aggressive tumors.

LISTA DE

LISTA DE LISTA DE

LISTA DE

ABREVIATURAS

ABREVIATURASABREVIATURAS

ABREVIATURAS

Lista de Siglas e Abreviaturas

Genes

APC

adenomatous polyposis coli

AR Receptor de Andrógeno

ARF ou CDKN2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

ASC ou PYCARD

PYD and CARD domain containing

BRCA2 breast cancer 2

Catenina

catenin (cadherin-associated protein), alpha

Catenina

ou CTNNB1

catenin (cadherin-associated protein), beta 1

CAV1 caveolin 1

CCND2 cyclin D2

CD44 CD44 molecule (Indian blood group)

CDC20 cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae)

CDH1 ou E-caderina cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)

CDH13 cadherin 13, H-cadherin (heart)

CDKN1A

cyclin

dependent kinase inhibitor 1A

CDKN2A ou p16 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16)

CLSTN1 calsyntenin 1

DAB2IP

DAB2 interacting protein

DAPK1 death-associated protein kinase 1

DNMT DNA-methyltransferase

DPYS

dihydropyrimidinase

EDNRB endothelin receptor type B

EFP ou TRIM25 estrogen -responsive finger protein

ESR1 estrogen receptor 1

ESR2 estrogen receptor 2

GPX6 glutathione peroxidase 6

GSTP1

glutathione S

transferase pi 1

GSTT1 glutathione S-transferase theta 1

HIC1 hypermethylated in cancer 1

HIN

1 ou SCGB3A1

secretoglobin, family 3A, member 1

LAMA3 laminin, alpha 3

MCAM melanoma cell adhesion molecule

MDR1 ou ABCB1

ATP

binding cassette, sub

family B (MDR/TAP), member 1

MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

MMP9 matrix metallopeptidase 9

MSMB microseminoprotein, beta

NKX2

NK2 transcription factor related, locus 5

NSE1 ou FAM84A family with sequence similarity 84, member A

PTGS2 prostaglandin-endoperoxide synthase 2

RARB

retinoic acid receptor, beta

RARB2 retinoic acid receptor, beta 2

RARRES1 retinoic acid receptor responder

RAS

Rat Sarcoma Virus

RASSF1A Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1

RUNX3 runt-related transcription factor 3

SFN (14-3-3σ) Stratifin

SLC16A12 solute carrier family 16, member 12 (monocarboxylic acid

transporter 12)

SMAD4 SMAD family member 4

SPOCK2 sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains

proteoglycan (testican) 2

SSBP2

single

stranded DNA binding protein 2

TIG1

mediator complex subunit 15

TGF-

transforming growth factor, beta 1

TP16

cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

TP53 tumor protein p53

XPA xeroderma pigmentosum complementation group A

Metodologias

CGH-array Comparative Genomic Hybridization-arrays

IHQ Imunohistoquímica

PCR

Methylation

Specific Polymerase Chain Reaction

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

qMSP

Quantitative

MSP

qRT-PCR Quantitative RT-PCR

TMA Tissue microarray

Geral

ADT Terapia Privativa de Androgênio

AIP

Progressão Independente de Andrógeno

AJCC American Joint Committee on Cancer

Ca Câncer

CaP

Câncer de Próstata

CPRH Câncer de Próstata Refratário a Hormônios

DNA Ácido desoxirribonucleico

ECM Matriz extracelular

H3-H9 Histona H3-Lysine 9

HDAC Histona Desacetilase

HNP Hiperplasia Nodular da Próstata

HPB Hiperplasia Prostática Benigna

INCA Instituto Nacional de Câncer

LNCaP

células cancerígenas de próstata

M Metástases à Distância

mRNA RNA mensageiro

miRNA

Micro RNA

MVI Invasão Microvascular

N Linfonodos Regionais

NCCN

National Comprehensive Cancer Network

PIN Neoplasia Intraepitelial Prostática

PSA Antígeno Prostático Específico

PSADT PSA doubling-time

RDA Análise Representativa Diferencial

RISC Complexo de silenciamento RNA induzido

RNA Ácido ribonucleico

RNAi RNA de interferência

SNPs single nucleotide polymorphisms

Tumor Primário

EMT Transição Epitélio-Mesênquima

ÍNDICE

ÍNDICEÍNDICE

ÍNDICE

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Índice

I. Revisão de Literatura

1. Câncer de Próstata: incidência e fatores de risco 15

2. Aspectos anatômicos e histopatológicos do Câncer de Próstata 18

Aspectos clínicos do Câncer de Próstata

4. Alterações Genéticas e Epigenéticas 24

5. Metilação do DNA e silenciamento gênico 28

6. Alterações Genéticas e Epigenéticas no C

âncer de Próstata

7. Gene CDH1 33

8. Gene

SFN

9. Gene RARB 39

10. Gene RASSF1 43

11. Justificativa

II. Objetivos

III. Referências

IV. Artigos

RARB

is a biomarke

r of poor prognosis in prostate c

arcinomas

Referências 80

Tabela 1 83

Tabela 2

Tabela 3 86

Tabela 4

Tabela 5

Figura 1 90

Figura 2

2. CDH1 methylation pattern and heterogeneous E-cadherin expression in prostate cancer 92

Referências 106

Tabela 1

110

Tabela 2 112

abela 3

113

Tabela 4

114

Tabela 5 115

Figura

118

Figura 2 119

Figura 3 120

V. Conclusão

121

VI. Anexos

Termo de Consentimento

Parecer Comitê de Ética

Parece

r Consubstânciado

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

REVISÃO DA

REVISÃO DA REVISÃO DA

REVISÃO DA

LITERATURA

LITERATURALITERATURA

LITERATURA

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

1. Câncer de Próstata: incidência e fatores de risco

O câncer de próstata (CaP) representa um sério problema de saúde pública, em função

de suas altas taxas de incidência e mortalidade. No Brasil, esta neoplasia é a segunda causa de

óbitos por câncer em homens, sendo superada apenas pelo câncer do pulmão. Dados de

Incidência e Morte por Câncer estimaram a ocorrência de 49.530 novos casos para o ano de

2008, segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2008). Estes valores correspondem a

um risco estimado de 52 novos casos a cada 100 mil homens. O aumento observado nas taxas

de incidência, comparado aos últimos anos, pode ser parcialmente justificado pela evolução

dos métodos diagnósticos, pela melhoria na qualidade dos sistemas de informação do país e

pelo aumento na expectativa de vida do brasileiro.

Os fatores de risco associados ao risco de desenvolvimento do câncer de próstata são

idade avançada, etnia e predisposição familial. O CaP é a doença com a mais alta incidência

em homens idosos no mundo ocidental (Linton e Hamdy, 2003; Chan et al., 2004). As taxas

elevadas de lesões encontradas post mortem em homens assintomáticos apontam a estreita

correlação entre CaP e a idade. Estima-se que aos 80 anos, aproximadamente 70% dos

homens devam possuir células cancerosas na próstata (Carter et al., 1990; Sakr et al., 1994;

Soos et al., 2005) e que mais de 80% possuem lesões atípicas à autopsia (Billis, 1986). Este

tumor raramente é observado em homens com menos de 40 anos de idade e o risco para seu

desenvolvimento aumenta a cada década subseqüente. Jemal et al. (2003) relataram que a

probabilidade de um homem com menos de 40 anos ser diagnosticado com CaP é de 1:19.299

homens; na faixa etária de 40 a 59 anos o risco aumenta para 1:45 e entre 60 e 79 anos é ainda

maior chegando a acometer 1:7 homens. Ao longo da vida, o risco total foi estimado em

aproximadamente 1 a cada 6 homens.

As taxas de incidência do câncer de próstata são variáveis entre as populações do

mundo (Stanford et al., 1999). As menores incidências foram relatadas entre os asiáticos e as

maiores entre os europeus (Parkin et al., 1997; Hsing et al., 2000). Os afro-americanos, no

entanto, apresentam a maior incidência de CaP do mundo, na América do Norte, a incidência

é 60% maior do que em indivíduos caucasianos (Miller et al., 1996). Tais diferenças podem

ocorrer devido a fatores genéticos, ambientais e sociais (Haas e Sakr, 1997).

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Além da etnia e idade, a historia familial é o terceiro fator de risco atribuído ao CaP

(Bracarda et al., 2005). Estudos em várias populações sugerem que a história familial é um

dos mais importantes fatores de risco para o câncer de próstata (Cannon et al., 1982; Carter et

al., 1992; Grönberg et al., 1996). A presença do câncer de próstata em um pai ou irmão

aumenta o risco para a doença, sendo inversamente relacionado à idade do parente afetado

(Cannon et al., 1982; Grönberg et al., 1996; Ghadirian et al., 1997; Matikaine et al., 2001;

Stanford e Ostrander, 2001). Uma meta-análise de 33 estudos epidemiológicos demonstrou

que o risco parece ser maior para homens com irmãos afetados do que para homens com pais

afetados (Zeegers et al., 2003). Uma hipótese para explicar este fato inclui herança ligada ao

X ou herança recessiva. Em adição, o risco para o desenvolvimento da doença aumenta com o

número de parentes de primeiro grau afetados.

Até o presente, não são conhecidos genes de alta penetrância que confiram

predisposição ao carcinoma de próstata. O candidato mais próximo é o BRCA2, que confere

um risco para o desenvolvimento do câncer de próstata 20 vezes maior em pacientes

portadores de mutações do que na população geral. Os cânceres de próstata associados ao

BRCA2 são agressivos, sugerindo a necessidade testes de triagem nos membros das famílias

de pacientes afetados pela mutação. Entretanto as mutações em BRCA2 são raras em homens

com câncer de próstata. Estudos em larga escala tem identificado vários novos genes loci

candidatos. O gene MSMB foi considerado como promissor, porque ele codifica um fator de

ligação de imunoglobulina que está presente no fluido seminal (revisado em Foulkes, 2008).

Vários SNPs (single nucleotide polymorphisms) localizados em genes candidatos

relacionados ao desenvolvimento de câncer de próstata, incluindo os componentes de resposta

ao antígeno prostático, enzimas, hormônios e seus receptores, proteínas de regulação do ciclo

celular, citocinas, moléculas de adesão entre outros tem sido o foco de centenas de estudos

epidemiológicos. Deleções nos genes das glutationa S-transferases (GSTs), especialmente

GSTT1, são as alterações mais amplamente estudadas na suscetibilidade ao CaP. Em um

contexto de análise de todo o genoma, Amundadottir et al. (2006) relataram que múltiplos

SNPs localizados em 8q24 apresentavam uma significativa associação com a suscetibilidade a

esse carcinoma. Subseqüentemente, estudos de múltiplas populações e do tipo caso-controle

confirmaram esta região como um lócus de suscetibilidade ao CaP. Em 2007, Gudmundsson

et al. (2007) relataram dois locos de suscetibilidade ao CaP localizados em 17q12 e 17q24.3.

Zheng et al. (2008) relataram um efeito cumulativo de cinco SNPs mapeados em 8q24 e 17q

associados a risco no CaP em um grande estudo caso-controle. Eles relataram uma associação

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

entre estes SNPs com CaP avançado. Contudo, não é bem estabelecida em literatura a relação

entre esses locos de suscetibilidade e a agressividade tumoral (Xu et al., 2008).

Além dos fatores de risco mencionados, para o desenvolvimento do câncer de próstata,

alterações nos níveis de hormônios masculinos (Epstein et al., 2004) e fatores ambientais tais

como a dieta, tem sido relatados. A vitamina E, o licopeno e o selênio podem exercer um

efeito protetor à carcinogênese, enquanto os alimentos ricos em gordura podem exercer efeito

contrário (Hsing, 2001; Platz e Helzlsover, 2001; Kolonel, 2001; Chan e Giovannucci, 2001).

Como cada um dos fatores dietéticos que parecem proteger contra o CaP são antioxidantes

potentes, está amplamente difundido que o stress oxidativo pode contribuir para

carcinogênese da próstata.

Recentemente, Gurel et al. (2008) descreveram um modelo pelo qual lesões atróficas

locais, que são extremamente comuns na próstata, resultam de lesões celulares iniciadas por

dietas e lesões inflamatórias. Estas lesões atróficas mostram transições morfológicas de uma

neoplasia intra-epitelial de alto grau e por vezes diretamente para um “microcarcinoma”.

Assim, certas lesões atróficas freqüentemente encontradas em associação com a inflamação

crônica podem ser “fatores de risco” para o desenvolvimento de neoplasia intraepitelial

prostática (PIN) e adenocarcinoma da próstata. Um dos aspectos importantes desta

investigação é que, como a inflamação e a dieta são conhecidas por desempenharem um papel

importante no desenvolvimento de câncer, eles podem tornar-se alvos para a implantação de

novas estratégias de prevenção do câncer de próstata.

Diferenças nas práticas de detecção também influenciam substancialmente a

incidência do câncer de próstata permitindo o diagnóstico precoce, ou seja, antes do

surgimento dos sintomas ou da detecção de anormalidades ao exame físico. Nesse sentido, o

uso de marcadores moleculares como o antígeno prostático específico (PSA) tem um papel

importante no diagnóstico de CaP em estágios iniciais (Nelson et al., 2003). Desde a sua

descoberta em 1970 (Ablin et al., 1970 a;b), o teste de rotina de PSA se tornou a principal

ferramenta na detecção do câncer de próstata. Concomitantemente ao uso da dosagem do PSA

sérico como ferramenta diagnóstica, a incidência da doença aumentou consideravelmente ao

passo que as taxas de mortalidade decresceram (McDavid et al., 2004). Estima-se que

aproximadamente 86% dos homens diagnosticados não morram devido à doença (Klotz,

2006). A difusão do uso do exame do PSA resultou na detecção dos casos da doença em

estadios mais precoces. Entretanto, há controvérsias quanto à definição de níveis considerados

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

"normais" do PSA sérico. Os valores normais foram questionados pelos dados de Prostate

Cancer Prevention Trial (Thompson et al., 2004), pois em uma grande proporção de homens

com nível de PSA <2,5ng/ml foi detectado câncer de próstata. Atualmente, vários

investigadores tem sugerido que há uma proporção significativa de CaP que ocorrem abaixo

deste nível, embora hajam controvérsias sobre o seu significado clínico (Gosselaar et al.,

2005; Chun et al., 2007; Roddam et al., 2007). Além disso, quando o nível de PSA está entre

4 – 10 ng/mL a especificidade do teste é baixa, sendo necessária a exclusão diagnostica de

câncer por meio de biopsias em um número relativamente elevado de pacientes. A redução do

valor de normalidade do PSA de 4 para 2 ng/mL poderia aumentar a taxa total de detecção do

câncer e conseqüentemente os casos a serem tratados, incluindo aqueles com doença clínica

insignificante. Além disso, aumentariam as indicações de biópsia, muitas das quais

desnecessárias (Roddam et al., 2007).

As opções de tratamento para os CaP primários detectados precocemente incluem

prostatectomia radical, terapia radioativa e sobrevivência ativa (Nelson et al., 2003). Ao

diagnóstico, aproximadamente 30% dos homens apresentam a doença se estendendo através

da glândula prostática, e alguns apresentam a doença metastática. Outros pacientes

apresentam recorrência clínica após prostatectomia radical curativa e terapia radioativa. Os

carcinomas de próstata avançados são geralmente tratados com terapia deprivativa de

androgênio (ADT) utilizando castração cirúrgica ou médica (Nelson et al., 2003). Entretanto,

para a maioria dos homens, o CaP irá recorrer neste ambiente debilitado de andrógeno, como

uma doença comumente chamada de progressão independente de andrógeno (AIP) (Labrie et

al., 1993). Não há atualmente biomarcadores que determinem com precisão quais cânceres

serão mais agressivos e eventualmente irão se desenvolver em doença metastática e/ou AIP

(Camoriano et al., 2008).

2. Aspectos anatômicos e histopatológicos do Câncer de Próstata

A próstata é um órgão glandular e fibromuscular, localizado no interior da cavidade

pélvica, abaixo da bexiga, à frente do reto, circundando a uretra (Figura 1a). A uretra

atravessa-a longitudinalmente e, por esta razão, qualquer aumento desse órgão se traduz

freqüentemente em obstrução urinária originando a síndrome do prostatismo.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Sob o ponto de vista anatômico, a próstata é formada por três zonas glandulares e pelo

estroma fibromuscular (McNeal et al., 1988; Sampson, 2007). A Zona de Transição envolve a

uretra prostática proximal e compreende 5% do tecido glandular. A maioria das Hiperplasias

Prostáticas Benignas (HPB), também denominadas hiperplasias nodulares da próstata (HNP),

e cerca de 20% dos cânceres de próstata ocorrem nessa área. A Zona Central representa

aproximadamente 20-25% da massa glandular total da próstata e se encontra envolvendo os

ductos ejaculatórios. Aproximadamente 5 a 10% dos CaP estão localizados nessa região

prostática. A Zona Periférica é a de maior tamanho situada posterior e lateralmente.

Corresponde à região apical da próstata, envolvendo a zona central e compreendendo 70-75%

do tecido glandular. A maioria (70%) dos CaP e PIN ocorrem nesta área (McNeal, 1986; Che

e Grignon, 2002). O estroma fibromuscular ocupa a superfície anterior da próstata e é

constituído principalmente de músculo liso.

Histologicamente, a próstata é composta por glândulas túbulo-alveolares arranjada em

lóbulos envolvidos por um estroma, ambos contidos dentro da cápsula prostática (Brandes et

al., 1964). As glândulas são constituídas por ácinos e ductos prostáticos, formados por um

epitélio glandular composto por duas camadas celulares: basal e secretora. Os ácinos e os

ductos estão imersos em uma matriz estromal, tecido fibromuscular, vascular e conjuntivo. No

estroma é possível distinguir dois tipos celulares distintos: os miofibroblastos e as células

musculares lisas. A camada basal do epitélio glandular é formada por uma ou duas camadas

de células basais localizadas entre a membrana basal e a camada de células secretoras. Esta,

por sua vez, é formada por uma camada de células colunares que se projetam para o lúmen

glandular. Uma diferença entre estas duas camadas celulares é a expressão do PSA e da

fosfatase ácida que ocorre apenas nas células secretoras (Grignon et al., 1988). Em ambas as

camadas se verifica a expressão do receptor de andrógeno (AR), a qual está

significativamente aumentada nas células secretoras. Outra diferença entre estas duas camadas

de células refere-se à expressão de determinadas citoqueratinas que pode ser indicativa do

grau de diferenciação das células epiteliais (Alberti et al., 2000).

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Figura 1. A) Localização anatômica da próstata. B) Subdivisão anatômica da próstata em três

regiões glandulares: zona de transição, zona central e zona periférica.

Os cânceres de próstata são comumente subdivididos por sítios de origem: acinar e

de ducto proximal (adenocarcinoma, carcinoma mucinoso, carcinoma cístico adenóide, tumor

carcinóide, carcinoma indiferenciado) ou de ducto distal (carcinoma de célula transicional,

carcinoma de célula escamosa, carcinoma papilífero, carcinoma ductal com características

endometrióides). A grande maioria dos CaP é representada pelo adenocarcinoma acinar.

As lesões prostáticas são heterogêneas e de natureza multifocal. Essa heterogeneidade

encontrada à análise histológica é representada por uma justaposição de glândulas benignas,

focos pré-neoplásicos e neoplásicos que variam em severidade. As lesões neoplásicas

individuais em uma determinada seção de tecido de câncer de próstata são descritas como

geneticamente distintas (não clonais), mesmo aquelas em íntima proximidade. Sugere-se que

essas lesões podem emergir de múltiplos focos neoplásicos e evoluir independentemente,

apresentando implicações significantes nos mecanismos moleculares da doença (Bostwick et

al., 1998; Macintosh et al., 1998).

A heterogeneidade e a multifocalidade das lesões de próstata combinadas ao tamanho

pequeno da glândula torna difícil a obtenção de material homogêneo e em quantidade

suficiente para análise molecular. Estes fatores representam uma limitação significativa na

identificação de genes associados à carcinogênese prostática, assim como os mecanismos

moleculares envolvidos na iniciação e progressão deste carcinoma (Epstein e Potter, 2001).

Próstata

Zona de

transição

Zona

central

Zona

periférica

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

3. Aspectos clínicos do Câncer de Próstata

Em geral, o desenvolvimento do CaP é lento e sem manifestações clínicas, sendo que

aproximadamente 75% dos pacientes já apresentam doença local extensa ou metástase quando

diagnosticadas (Foster e Ke, 1997). Em vista disso, os estudos se voltaram para o diagnóstico

precoce da doença, sendo que os níveis séricos do PSA são os mais amplamente utilizados na

rotina clínica.

Os fatores primários utilizados como indicadores prognósticos do CaP são

estadiamento, grau histológico e PSA (Koff et al., 2005). O estadiamento se refere à

extensão/tamanho do tumor primário (T) e, portanto, a capacidade de invasão e de

disseminação da neoplasia. Os adenocarcinomas de próstata são classificados por um dos

sistemas de estadiamento disponíveis (TNM proposto pela AJCC) (Billis, 2003). É

considerada também a ausência ou presença da extensão de metástase em linfonodos

regionais (N) e a ausência ou presença de metástase à distância (M) (Epstein et al., 2004).

Segundo o sistema TNM, os tumores pT1 são do tipo incidental, ou seja, encontrados

acidentalmente em ressecções por hiperplasia nodular de próstata ou em necropsias.

Dependendo do tamanho no órgão primário, podem-se considerar os tumores pT2 (confinados

na próstata), sendo subdivididos em pT2a (apresentam 50% ou menos de envolvimento de um

lobo), pT2b (envolvem mais de 50% de um lobo) e pT2c (envolvem ambos os lobos). Os

tumores pT3 são subdivididos em pT3a (apresentam extensão extra-prostática) e pT3b

(apresentam invasão das vesículas seminais). Os tumores pT4 são aqueles fixados ou

invadindo as estruturas adjacentes, além das vesículas seminais, colo da bexiga, esfíncter

externo, reto, músculos elevadores do ânus e/ou parede pélvica.

Quando diagnosticados, os adenocarcinomas de próstata são graduados pelo sistema

de Gleason (Gleason, 1992). Esse sistema inclui cinco padrões histológicos do tumor,

indicados por escores de 1 a 5, dependendo do grau de indiferenciação crescente da neoplasia.

O escore da graduação histológica de Gleason resulta da soma dos dois padrões histológicos

neoplásicos mais prevalentes em determinado tumor, de modo que varia de 2 (quando existe

só o padrão 1 - bem diferenciado - escore 1+1) até 10 (ou 5+5) quando todo o tumor é

praticamente indiferenciado. Tumores com baixos escores de Gleason geralmente são

menores em volume e tem baixo potencial metastático, enquanto tumores com altos escores

tendem a ser maiores e apresentarem potencial metastático aumentado. O escore de Gleason

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

pré-operatório está correlacionado com indicadores importantes de extensão da doença, tais

como envolvimento de linfonodos e metástase à distância (Gleason, 1977). Em termos de

prognóstico, os escores 2 a 4 são classificados como bem diferenciados; 5, 6 e 7 (ou 3+4)

como moderadamente diferenciados, e 7 (ou 4+3), 8 a 10 como pouco diferenciados. Um

escore 7 de Gleason pode, além disso, ser subclassificado com [3+4] ou [4+3] como

exemplificado acima e o pior prognóstico associado com [4+3] pode afetar a decisão ao

tratamento (DeMarzo et al., 2003).

Tem sido proposto que pacientes com escore de Gleason 7 poderiam estar associados à

falha no tratamento da braquiterapia. Neste sentido, Merrick et al. (2007) avaliaram o impacto

do escore de Gleason 7 na sobrevida de pacientes tratados por radioterapia. Os autores

demonstraram que o escore de Gleason não influencia a sobrevida global nestes dois grupos

de pacientes.

O valor de PSA considerado normal (até 4,0 ng/mL) até o momento tem se mostrado

eficiente na detecção da doença em estágios em que a terapia tem alto potencial de cura

(prostatectomia radical). Entretanto, como já mencionado anteriormente, há críticas quanto à

eficácia desse exame, as quais se referem à sua inespecificidade em diferenciar o câncer de

doenças benignas, como a hiperplasia nodular de próstata e prostatites, e à existência de casos

de CaP com valores baixos de PSA, como por exemplo no caso de pacientes com história

familial para esta neoplasia e tumores hormônio-independentes (DeMarzo et al., 2007).

Pacientes com CaP após prostatectomia radical normalmente apresentam níveis de

PSA próximos a zero. Valores acima de 0,4ng/mL indicam pior prognóstico e estão

associados a progressão da doença metastática. Valores de PSA ≥0,2 ng/mL estão

relacionados com recorrência bioquímica indicando recorrência local da doença e predição de

metástases a distância (Stephenson et al., 2006).

O PSADT (PSA doubling-time) tem se mostrado um método eficiente para melhorar a

sensibilidade do PSA em predizer o risco de recorrência da doença após a cirurgia. Este se

trata de um cálculo usando regressão linear logarítmica que estima o tempo de duplicação do

PSA em meses após a cirurgia, quanto menor o PSADT maior é a chance de recorrência

tumoral (Roberts et al., 2006).

Segundo Partin et al. (1997), a combinação dessas três variáveis, estadiamento, escore

de Gleason e PSA, contribui significativamente para a predição do estágio patológico,

podendo se estimar o risco de recorrência da doença em baixo, moderado e alto risco, de

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

acordo com as diretrizes estabelecidas pela National Comprehensive Cancer Network. A

tabela 1 mostra os critérios utilizados para categorização do risco de recorrência.

Tabela 1. Critérios considerados na análise de risco segundo características clínicas e

morfológicas.

RISCO DE

RECORRÊNCIA

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E

MORFOLÓGICAS

Baixo

pT1-pT2a e escore de Gleason 2-6 e PSA < 10 ng/mL

Moderado

pT2b-pT2c ou escore de Gleason 7 ou PSA = 10 – 20 ng/mL

Alto

pT3a ou pTxN1 ou pTx Nx M1 ou escore de Gleason 8-10

ou PSA > 20 ng/mL

Adaptado de NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology

TM:

Prostate Cancer, V2, 2007.

Outra característica com importância prognóstica é a capacidade de o tumor invadir as

estruturas angiolinfáticas, a qual não é abordada pelo sistema TNM. Antunes et al. (2006)

avaliaram a relação da invasão microvascular (MVI) com outras características patológicas e

sugeriram seu uso como um fator prognóstico independente em pacientes com CaP. Segundo

os autores 11% de 428 pacientes com CaP submetidos a prostatectomia radical apresentaram

MVI. Desses, 44,6% apresentaram recorrência da doença comparados aos 20,2% dos

pacientes sem MVI (P<0,001). Além disso, a MVI se mostrou uma característica prognóstica

independente da recorrência bioquímica.

Os conhecimentos desses fatores, que tem papel prognóstico e preditivo, repercutem

sobre os cuidados ministrados ao paciente e sobre as pesquisas na área. No entanto, os

adenocarcinomas de próstata são heterogêneos em seus aspectos clínicos, morfológicos e

biomoleculares. Em geral, os marcadores utilizados para prever a progressão da doença não

correspondem de forma satisfatória à evolução dos pacientes e, portanto, há necessidade de

identificação de marcadores novos e mais efetivos.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

4. Alterações Genéticas e Epigenéticas

Alterações genéticas e epigenéticas fundamentam o rompimento das vias de

sinalização celular no câncer. Os oncogenes podem se apresentar com expressão aumentada

por ganho no número de cópias de DNA, amplificação gênica, translocações e mutações em

ponto, e os genes supressores de tumor podem ser inativados pela perda de cromossomos,

grandes deleções, deleções intragênicas e mutações em ponto. Estas constituem as principais

alterações genéticas observadas no câncer.

Entretanto, está claro como o silenciamento epigenético de genes supressores de

tumor, os quais podem ser considerados funcionalmente equivalentes a mutações e deleções,

atua no desenvolvimento do câncer (Jones et al., 2002; Herman et al., 2003). Acredita-se que

eventos genéticos e epigenéticos nos dois alelos de genes supressores tumorais poderiam ser

responsáveis pela inativação destes genes na carcinogênese (Figura 2).

Figura 2. Esquema representativo dos mecanismos de inativação bialélica em genes

supressores de tumor. Se o primeiro alelo está metilado, o segundo alelo pode ser inativado

por metilação, deleção ou mutação em ponto. A sequência de eventos inativadores pode

ocorrer em qualquer ordem, por exemplo, a inativação por mutação em ponto pode ser o

primeiro evento seguido por metilação (Modificado de Gronbaek et al., 2007).

A epigenética está relacionada a alterações na expressão dos genes que são

constitutivamente herdadas e que não envolvem uma mudança na seqüência do DNA (Wu e

Morris, 2001). Refere-se ainda a um conjunto de alterações que atua em associação com a

seqüência do DNA na determinação da expressão gênica (Dobosy et al., 2007). Assim, os

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

mecanismos epigenéticos podem ser classificados em metilação do DNA, acetilação e outras

modificações covalentes das histonas que empacotam o DNA formando a cromatina

(modificações nucleares herdadas), além dos RNA de interferência (RNAi) (Figura 3).

Figura 3. Esquema representativo dos diferentes tipos de alterações epigenéticas. A metilação

do DNA é uma modificação covalente da citosina (C) que está localizada na posição 5’ a uma

guanina em um dinucleotídeo CpG. Modificações nas histonas (cromatina) incluem as

modificações covalentes posteriores à tradução e das caudas N-terminais dos quatro cores de

histonas (H3, H4, H2A e H2B). O mais recente mecanismo epigenético de herança envolve

RNAs, o qual pode alterar a expressão gênica de maneira hereditária. (Modificado de Sawan

et al., 2008)

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

O termo “metilação do DNA” é usado para descrever a modificação pós-duplicação do

DNA, no qual um nucleotídeo adquire um grupamento metil covalentemente ligado (Bird,

1986). A 5-metilcitosina é o único nucleotídeo metilado no DNA humano e, como isto produz

uma modificação na informação genômica e não uma variação na seqüência do DNA, este

processo é chamado epigenético (Wang e Leung, 2004). A metilação dos genes ocorre

primariamente na região promotora que freqüentemente contem ilhas de CpG. Ilhas de CpG

são definidas como regiões de DNA maiores que 200 pb com conteúdo de [C+G] maior do

que 50% e onde a freqüência de sítios CpG é igual ou superior à esperada (Gardiner-Garden e

Frommer, 1987). Entretanto, mais recentemente, Takai e Jones (2002) propuseram critérios

mais estringentes para caracterizar uma ilha de CpG. Os autores sugeriram que as seqüências

de DNA devem ser maiores que 500pb e apresentar um conteúdo de [C+G] igual ou superior

a 55%, sendo este critério amplamente aplicado na literatura.

O processo de metilação, ainda parcialmente entendido, é caracterizado pelo excesso

de metilação de seqüências ricas em CpG, presentes nas regiões promotoras de 50-60% dos

genes humanos (Ushijima, 2005; Dobosy et al., 2007). A metilação é catalisada por DNA-

metiltransferases (DNMTs) e pode ser revertida por desmetilases ou tratamento com drogas

desmetilantes como a 5-aza-C (Goffin e Eisenhauer, 2002; Nelson et al., 2007).

As principais enzimas envolvidas no estabelecimento e na manutenção do padrão de

metilação são a DNMT3A e a DNMT3B, chamadas metiltransferases de novo, ou seja,

aquelas que efetuam novas metilações em locais do DNA não metiladas, ou mesmo na hélice

oposta de DNA, para iniciar a metilação. As DNMT1 são metiltransferases de manutenção,

que asseguram que o padrão de metilação seja fielmente copiado em cada divisão celular

(Klose et al., 2006).

Em adição aos mecanismos gênicos clássicos envolvendo alterações cromossômicas e

mutações em ponto, os genes podem ser funcionalmente ativados ou inativados por metilação

do DNA (Perry et al., 2006). As ilhas de CpG, são conservadas durante a evolução, portanto

não metiladas, conduzindo a expressão gênica. A metilação destas ilhas pode resultar no

silenciamento transcricional de genes por vários mecanismos: 1) inibição da ligação de fatores

de transcrição sensíveis à metilação (Hark et al., 2000); 2) as metil-citosinas interagem com

as histonas desacetilases (HDACs), que por sua vez promovem o remodelamento da

cromatina e condensação da mesma, impedindo o acesso de fatores de transcrição; e 3) a

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

inacessibilidade de fatores promotores de transcrição (Burgers et al., 2002; Wiencke et al.,

2008).

As relações entre a metilação do DNA e as modificações das histonas tem sido alvo de

muitos estudos. Os nucleossomas, unidade fundamental da cromatina consistindo de 146 pb

de DNA genômico envolvido ao redor de um octâmero de quatro cores de histonas, estão

sujeitos a diferentes modificações incluindo a acetilação, metilação, fosforilação e

ubiquitinação. A modificação das histonas pode ser mantida pela divisão celular, sendo então

consideradas como verdadeiro mecanismo epigenético herdado (Strahl et al., 2000; Jenuwein

et al., 2001). Tem-se mostrado que diferentes modificações das histonas são essenciais para o

processo normal da célula. Por exemplo, a acetilação das histonas e a metilação estão

intimamente ligadas à transcrição do gene, reparo e duplicação do DNA. Inúmeros relatos

indicam que estas modificações, com conseqüente perda da regulação dos produtos gênicos,

estão implicadas nas neoplasias humanas. Desta forma, as modificações das histonas no

câncer e em outras doenças estão se tornando amplamente reconhecidas (Jones et al., 2002;

Feinberg et al., 2004; Hake et al., 2004).

RNAs não codificantes representam a mais recente classe de mecanismos

epigenéticos, onde pequenos RNAs (microRNAs) podem manter a transcrição do gene de

maneira hereditária (Bartel, 2004; Ambros, 2004). Os microRNAs regulam a expressão

gênica em nível pós transcricional por meio do complexo (RISC) (complexo de silenciamento

RNA induzido). Vários estudos recentes envolvem alterações dos microRNAs em diferentes

estágios do desenvolvimento tumoral e progressão metastática (Calin et al., 2006). Ma et al.

(2007) sugerem que o funcionamento de uma via regulatória inclui um fator de transcrição

pleiotropico que induz a expressão de um microRNA específico, o qual suprime o alvo

diretamente e, por sua vez ativa outro gene pró-metastático, podendo levar a invasão de

células tumorais e metástase.

Hammond (2006) demonstrou que alguns miRNAs se ligam especificamente e

bloqueiam a tradução de mRNAs de supressores de tumor e proto-oncogenes, e assim eles

mesmos passam a atuar como oncogenes e supressores de tumor, respectivamente. Lu et al.

(2005) realizaram a comparação entre os perfis de expressão dos tecidos normais e tumorais e

demonstraram que uma maioria dos miRNAs não são expressos no câncer, e um mecanismo

pelo qual isso ocorre é o silenciamento epigenético.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Em resumo, as associações dos eventos epigenéticos são essenciais para a regulação

dos diversos processos celulares e, a interrupção do estado epigenético “normal” pode

despertar eventos iniciadores de fenótipos anormais e doenças. Assim, considerando-se que o

câncer pode evoluir da expressão anormal de genes e a perda da metilação do DNA está

associada com a expressão gênica, Holliday (1979) sugeriu que uma falha na metilação do

DNA poderia perturbar a regulação gênica, e seria um dos mecanismos envolvidos no

desenvolvimento do câncer.

5. Metilação do DNA e silenciamento gênico

Em células tumorais foram identificados dois padrões distintos de alterações no perfil

de metilação do DNA: o primeiro refere-se à hipometilação generalizada do genoma e o

segundo, a hipermetilação que se apresenta restrita às ilhas de CpG (Laird, 2003). Baseados

nestes dois padrões, algumas hipóteses foram propostas para relacionar esta alteração

epigenética com o processo da carcinogênese: a perda da metilação poderia ativar a expressão

de proto-oncogenes quiescentes, ativando uma cascata de eventos que culminaria com a

transformação maligna; ou, alternativamente, a metilação aumentada em sítios previamente

não metilados, como a região promotora de um gene supressor de tumor, que poderia resultar

na sua inativação pela inibição da transcrição e conseqüente incapacidade de suprimir a

proliferação celular (Gonzalgo e Jones, 2002; Perry et al., 2006; Dobosy et al., 2007). Além

disso, níveis alterados de metilação, especialmente hipometilação, podem causar instabilidade

genômica e, conseqüentemente levar à formação de tumores (Fazzari e Greally, 2004;

Ushijima, 2005).

Para a identificação de genes que são inativados pela metilação é preciso investigar

uma região genômica sabidamente responsável pelo seu silenciamento. Como a condição

metilada é variável dentro de uma mesma ilha, apenas uma porção relativamente pequena

(core) abrangendo o sítio de início da transcrição está consistentemente associada ao

silenciamento gênico. Porém, quando se pretende isolar um marcador para a doença, o efeito

sobre a transcrição gênica não é importante, mas sim o estabelecimento de uma estreita

associação entre as modificações no padrão de metilação de ilhas de CpG específicas e o

fenótipo. Desta forma, a associação entre a presença de metilação tumor específica numa dada

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

ilha de CpG pode ser um achado prognóstico relevante, mesmo não promovendo o

silenciamento gênico (Ushijima, 2005).

6. Alterações Genéticas e Epigenéticas no Câncer de Próstata

Na maioria das vezes, a metilação do DNA tem o mesmo papel crítico dos fatores

genéticos relacionados à iniciação do câncer de próstata. Essa hipótese é apoiada pela

observação de que a metilação medeia a inativação de vários genes, especialmente aqueles

envolvidos na carcinogênese e nos mecanismos de reparo a danos do DNA que ocorrem em

lesões pré-malignas da próstata. Todos estes eventos são seletivos para o aumento da taxa de

crescimento e levam as alterações fenotípicas irreversíveis do carcinoma pela expansão

clonal. Subseqüentemente, a inativação epigenética de genes envolvidos no controle do ciclo

celular, transdução de sinal e resposta hormonal está relacionado com o câncer de próstata

avançado (Perry et al., 2006; Reynolds, 2008). Aitchison et al. (2008) compararam os

resultados das análises de MS-PCR (Methylation Specific-Polymerase Chain Reaction), RT-

PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) e CGH-arrays (Comparative

Genomic Hybridization-arrays) quanto ao padrão de metilação, expressão e o número de

cópias, respectivamente, do gene SMAD4, um supressor tumoral conhecido como transdutor

da via de sinalização do TGF-β, em amostras de cânceres de próstata avançados. O grupo

encontrou correlação entre a metilação do promotor de SMAD4 e a perda de expressão deste

gene nas mesmas amostras, reforçando a importância das mudanças epigenéticas na expressão

de genes importantes para o desenvolvimento e progressão do CaP.

Vários genes com alterações no padrão de metilação foram correlacionados com as

diferentes etapas de progressão do câncer de próstata (Li LC et al., 2004; Li e Dahija, 2007).

A hipermetilação na região promotora do gene GSTP1 foi relatada em mais de 70% dos CaP

primários, porém raramente detectada em tecidos prostáticos normais ou em tecidos

prostáticos hiperplásicos benignos (Harden et al., 2003; Nakayama et al., 2003;

Yegnasubramanian et al., 2004; Lodygin et al.., 2005a; Meiers et al., 2007). Entretanto, a

metilação neste gene foi também encontrada em atrofias proliferativas inflamatórias da

próstata, uma entidade limitada que tem sido associada ao desenvolvimento de CaP

(Nakayama et al., 2003). A hipermetilação do gene RARB também tem sido associada ao

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

processo tumorigênico prostático. Há relato de acúmulo progressivo de células neoplásicas

com alelos metilados no gene RARB avaliadas em neoplasias prostáticas intra-epiteliais de

alto grau para CaP (Jeronimo et al., 2004a).

Outros genes que tem sido relacionados como envolvidos no CaP são o APC (Kang et

al., 2004), MDR1 (Yegnasubramanian et al., 2004), entre outros como HIC1 (Yamanaka et

al., 2003) e GPX6 (Lodygin et al., 2005a). A Figura 4 apresenta alguns genes em que foram

identificados padrões de metilação anormal como GSTP1 (Singal et al., 2001), MGMT (Fu et

al., 2004), RASSF1A (Liu et al., 2002), RARB (Nakayama et al., 2001), CDH1 ou E-caderina

(Graff et al., 1995).

Vários estudos tem demonstrado que o índice de metilação, definido como a

proporção de genes metilados em relação ao número total de genes analisados, tem correlação

com os indicadores clinicopatológicos de pior prognóstico (Maruyama et al., 2002; Kang et

al., 2004; Bastian et al., 2005; Costa et al., 2007). Entre os genes associados com parâmetros

prognósticos no câncer de próstata estão incluídos o LAMA3 (Sathyanarayana et al., 2003),

HIN-1 (Shigematsu et al., 2005), CDH13 (Maruyama et al., 2002), Cyclin D2 (Padar et al.,

2003), TIG1 (Zhang et al., 2004) e ASC (Collard et al., 2006). Para alguns genes, como APC,

CD44, CDH1, MDR1, RARB e RASSF1A, as correlações observadas precisam ser confirmadas

em estudos mais robustos, pois os resultados são inconsistentes (Maruyama et al., 2002;

Yamanaka et al., 2003; Enokida et al., 2004; Jeronimo et al., 2004a, 2004b; Kang et al.,

2004).

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Figura 4. Alterações epigenéticas para os estágios iniciais do câncer de próstata, progressão e

metástase. Uma série de fatores tais como alterações genéticas, idade, dietéticos e ambientais

contribuem para a carcinogênese da próstata. É provável que a metilação do DNA

desempenhe a mesma função crítica como os fatores genéticos no início do câncer de próstata,

o que é suportado pela observação que a inativação mediada por metilação de vários genes,

especialmente de genes envolvidos no metabolismo da carcinogênese e dano de reparo ao

DNA como GSTP1 e MGMT, ocorrem com freqüência em lesões pré-malignas da próstata,

que, por sua vez, provocam alterações genéticas em células afetadas. Todos estes

acontecimentos são seletivos para aumentar a taxa de crescimento e conduzir a irreversíveis

alterações de fenótipo do carcinoma através da expansão clonal. Posteriormente, a inativação

epigenética simultânea de genes envolvidos no controle do ciclo celular, transdução de sinal e

resposta a efeitos hormonais fornece uma vantagem no crescimento, conduzindo ao câncer de

próstata avançado. Porém, a perda de função de genes de vias de invasão tumoral/metástase

como APC, CDH1 e CD44 faz com que células tumorais se abalem e formem sub-clones em

sítios distantes (Modificado de Li LC et al., 2004).

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Alguns estudos mostraram que as freqüências de metilação para o gene CDH1, como

também para os genes PTGS2 e RUNX3, tem apresentado correlação com alto risco de

recorrência bioquímica independentemente do escore de Gleason ou do estadio patológico

(Maruyama et al., 2002; Kang et al., 2004; Yegnasubramanian et al., 2004). Em adição,

estudos quantitativos tem demonstrado uma relação entre níveis crescentes de metilação para

certos genes (GSTP1, APC, RARB e EDNRB) em tumores com estadios patológicos

avançados e/ou escore de Gleason (Jeronimo et al., 2004b; Yegnasubramanian et al., 2004).

Liu et al. (2008) relataram uma correlação positiva entre a metilação do promotor de MCAM,

uma molécula de adesão celular, e o estadio do tumor ou escore de Gleason em carcinomas

prostáticos primários, sugerindo que a hipermetilação do promotor de MCAM pode ser

marcador diagnóstico no câncer de próstata humano.

Patra e Bettuzzi (2007) relataram que muitas moléculas de adesão de superfície

celular, de matriz extracelular (ECM, extracellular matrix) e proteínas sinalizadoras (como E-

caderina, catenina, CD44, MMP-9 e caveolina-1) estão ausentes ou diminuídas como

resultado da hipermetilação das ilhas de CpG no promotor destes genes em tumores menos

agressivos. Porém, estas proteínas voltam a se expressar em carcinomas mais agressivos

devido a perda da metilação das ilhas de CpG. Este fenômeno tem sido relatado em

carcinomas de pulmão metastático, prostático e sarcomas.

Liu et al. (2008), por meio da análise quantitativa MSP (qMSP) e RT-PCR, relataram

pela primeira vez que o gene SSBP2 é hipermetilado em câncer de próstata e levando a

alteração na expressão da proteína SSBP2. A expressão induzida de SSBP2 é capaz de inibir o

crescimento celular levando à parada do ciclo celular em células tumorais prostáticas,

revelando seu papel na tumorigênese do CaP.

Na busca de melhorar a sensibilidade e especificidade de marcadores moleculares

alterados por metilação e com potencial de serem utilizados no diagnóstico de câncer, Hoque

et al. (2005) examinaram a hipermetilação do promotor de nove genes distintos na urina de 52

pacientes com e sem CaP. A combinação de quatro genes (TP16, ARF, MGMT e GSTP1) foi

capaz de detectar 87% dos pacientes com CaP com 100% de especificidade. Rouprêt et al.

(2007) analisaram a hipermetilação do promotor de 10 genes distintos na urina de 95

pacientes com e sem CaP e verificaram que a combinação de quatro deles (GSTP1, RASSF1A,

RARB e APC), contribui para uma melhor discriminação dos pacientes com CaP malignos dos

não malignos.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Técnicas de triagem em larga escala do genoma na avaliação de metilação aberrante

das ilhas de CpG tem sido usadas para identificar marcadores epigenéticos prostáta-

específicos. Chung et al. (2008) realizaram amplificação das ilhas de CpG metiladas (MCA)

acoplado com análise representativa diferencial (RDA) (Toyota et al., 1999) em linhagens

celulares de CaP. O grupo isolou 34 clones correspondentes às ilhas de CpG em regiões

promotoras, incluindo cinco alvos repórteres de hipermetilação em câncer. Em seguida, os

autores confirmaram 17 das ilhas de CpG por outras técnicas incluindo o pirosequenciamento.

Assim, após a comparação entre tumores primários e tecidos normais adjacentes foram

identificados como marcadores candidatos em CaP os genes NKX2-5, CLSTN1, SPOCK2,

SLC16A12, DPYS e NSE1. Estes genes apresentavam um padrão de metilação variando de

50% a 85%. Foi observada uma sensibilidade de 80% e especificidade de 95% na

diferenciação entre o câncer e o tecido normal quando foram incluídos os dois genes

hipermetilados NSE1 e SPOCK2.

Os genes CDH1, SFN (14-3-3σ), RARB, e RASSF1 avaliados neste estudo estão

alterados por hipermetilação. A Tabela 2 apresenta os processos celulares que estes genes

participam.

Tabela 2. Genes hipermetilados envolvidos em processos celulares no câncer de próstata

(modificado de Li e Dahija, 2007).

PROCESSOS CELULARES GENES HIPERMETILADOS

Invasão de célula tumoral/arquitetura tumoral

APC, CAV1, CD44, CDH1, CDH13

Resposta hormonal

AR, ESR1, ERS2, RARB, RARRES1

Controle do ciclo celular

CCND2, CDKN2A, CDKN1A, SFN

Transdução de sinal

DAB2IP, DAPK1, EDNRB, RASSF1

7. Gene CDH1 [cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)]

O gene CDH1, mapeado em 16q22.1, codifica a proteína E-caderina, envolvida no

sistema de adesão celular caderina-catenina, responsável pela preservação da arquitetura

normal dos tecidos (Kemler, 1993). As caderinas pertencem a uma família de proteínas

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

transmembranas com a função primária de mediar a adesão intercelular essencial para a

manutenção da arquitetura tecidual normal (Gumbiner, 1996). É uma glicoproteína de 120kDa

e possui três domínios, o extracelular, o transmembrânico e o domínio intracelular (Overduin

et al., 1995). O domínio citoplasmático das caderinas interage com proteínas como as

cateninas e ancoram o citoesqueleto. Além disso, suas funções são dependentes da presença

de cálcio extracelular (Takeichi, 1991).

Em carcinomas humanos, a perda da expressão da E-caderina foi correlacionada a

vários fatores associados com pior prognóstico, incluindo grau do tumor, estadio e ploidia em

tumores de esôfago, cólon, mama, nasofaringe, ducto biliar, estômago e próstata (Frixen et

al., 1991; Kallakury et al., 2001; Caldeira et al., 2006; Mol et al., 2007; Masterson e O’Dea,

2007). Os principais mecanismos que levam à diminuição da expressão gênica de CDH1 são

as deleções envolvendo 16q22 (Cher et al., 1996; Gibbs et al., 2000; Suarez et al., 2000;

Saramaki e Visakorpi, 2007) ou a metilação anormal da sua região promotora (Graff et al.,

1995; Kallakury et al., 2001; Li et al., 2005).

Ikonen et al. (2001) e Jonsson et al. (2002) analisaram mutações do gene CDH1 em

linhagens germinativas de CaP e a associação destas mutações com síndromes familiais de

cânceres de mama, gástrico e prostático; entretanto as mutações identificadas não se

mostraram significativamente associadas com estes tipos tumorais, sugerindo que outros

genes desconhecidos possam estar envolvidos. Mais recentemente, foi verificado que

mutações raras individuais e polimorfismos do gene CDH1 (-160C/A; rs16260) podem

explicar uma pequena proporção dos CaP hereditários e/ou familiais (Jonsson et al., 2004;

Lindström et al., 2005).

A metilação em graus variáveis do promotor do gene CDH1 e a expressão reduzida da

proteína foram detectadas nos tumores de próstata (Kang et al., 2004; Musial et al., 2007). Li

et al. (2001) verificaram que as amostras tumorais de próstata que mostravam metilação no

promotor do gene CDH1 ocorrem em uma freqüência de 30% nas amostras de baixo grau e

70% nas amostras tumorais de alto grau. Em adição, o processo de metilação foi associado

com ausência ou redução da expressão protéica da E-caderina detectado por análise de

imunohistoquimica (IHQ). Estes dados são consistentes com os resultados obtidos por

Kallakury et al. (2001), que detectaram uma prevalência de 80% de metilação de CDH1 em

amostras com CaP. Estes autores observaram também uma associação positiva entre aumento

da metilação do promotor do gene CDH1 e progressão do tumor, sugerindo que este poderia

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

ser um biomarcador de progressão nos cânceres de próstata. Além disso, outros autores

detectaram a redução da expressão de E-caderina em subgrupos de CaP agressivos (Richmond

et al., 1997; Umbas et al., 1994).

Resultados discordantes tem sido publicados quanto aos níveis de metilação e da

expressão da proteína no CaP, bem como sua associação com pior prognóstico (Rubin et al.,

2001). Em carcinomas mamários, Caldeira et al. (2006) relataram que a hipermetilação do

gene CDH1 foi observado em 72% dos casos enquanto que os níveis reduzidos da proteína E-

caderina foram observados em 85% das amostras. Embora não significativos, os níveis de

expressão da proteína tendiam a diminuir com a metilação da região promotora do gene

CDH1. Segundo os autores, a natureza dinâmica da regulação epigenética incluindo alterações

no padrão de metilação do DNA, na expressão e/ou função dos fatores trans-ativadores e

efeitos mediados na cromatina, podem explicar a falta de uniformidade da hipermetilação de

CDH1 e a perda da expressão da proteína E-caderina observada pela análise

imunohistoquímica.

Acredita-se que a progressão metastática dos tumores epiteliais mais comuns envolve

a perda transitória e heterogênea da expressão da E-caderina. Graff et al. (2000) utilizando um

modelo in vitro de tumor epitelial (células de carcinoma de mama) e propuseram um modelo

de hipermetilação dinâmico e heterogêneo associado ao processo tumoral e metastático. Os

autores sugerem que no início do processo tumoral são geradas células com diferentes graus

de metilação no gene CDH1. As células com maiores níveis de metilação e níveis reduzidos

da expressão da proteína teriam mais chance de se dissociar do tumor primário e se alojar

num órgão distal secundário. Neste órgão, a sobrevivência da célula dependeria da redução

dos níveis de metilação e conseqüente restauração parcial da expressão da E-caderina, que

pode ser em parte modulada e/ou selecionada pelo microambiente do tumor.

Rubin et al. (2001) analisaram a expressão da E-caderina em tumores benignos de

próstata clinicamente localizados e CaP metastáticos em uma plataforma de tissue microarray

(TMA) por imunohistoquímica. O estudo demonstrou um largo espectro da expressão de E-

caderina no carcinoma prostático. Os CaP clinicamente localizados, tratados somente com

cirurgia, apresentaram um elevado nível de expressão da E-caderina. Foi observada uma

associação significativa entre a expressão diminuída da E-caderina e tumores maiores, como

também, para níveis maiores de escore de Gleason, margens cirúrgicas positivas e alto nível

de PSA. Nos CaP metastáticos refratários a hormônios foi encontrada expressão aumentada da

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

E-caderina e somente alguns casos apresentaram expressão diminuída. Estes achados são

consistentes com o modelo de hipermetilação transitória do gene CDH1, levando a baixa

regulação da E-caderina em CaP localizados e sua expressão normal ou aumentada em CaP

metastáticos.

Resumidamente, estes estudos indicam que a perda da E-caderina pode promover a

invasão e agressividade tumoral enquanto a re-ativação da expressão poderia facilitar a

sobrevivência das células metastáticas. Embora os mecanismos envolvidos neste processo não

são ainda bem conhecidos, sugere-se que a perda da E-caderina seja um dos eventos

associados ao processo de transição epitélio-mesênquima (EMT), que tem sido considerado

como um pré-requisito para a infiltração tumoral e metástase (Kang e Massague, 2004;

Christiansen e Rajasekaran, 2006). Neste sentido, Gravdal et al. (2007) avaliaram a expressão

de algumas moléculas de adesão celular em 104 CaP e sugeriram a importância do

mecanismo de transição epitélio-mesênquima na progressão e prognóstico do câncer de

próstata. Os autores relataram um aumento na expressão da N-caderina e a diminuição de E-

caderina. Previamente, demonstrou-se que níveis aumentados da N-caderina solúvel estava

presente no soro de pacientes com CaP (Kuefer et al., 2005; Derycke et al., 2006). Estes

resultados sugerem que este gene pode ser um marcador de evolução da EMT e progressão

dos carcinomas de próstata.

Van Oort et al. (2007) analisaram por IHQ o padrão de expressão da E-caderina,

cateninas-alpha, -beta, -gama e -delta 1, em 65 amostras de CaP. Os autores detectaram

correlação entre a expressão de E-caderina e as outras moléculas. Uma correlação inversa

significativa foi encontrada entre os membros imunorreativos do complexo da E-caderina e o

escore de Gleason. Segundo os autores, a catenina-alfa foi um bom marcador prognóstico em

pacientes com CaP.

Recentemente, Saha et al. (2008) analisaram por imunohistoquímica a expressão de E-

caderina e catenina-beta em hiperplasias prostáticas benignas, CaP primários e CaP

metastáticos. O estudo demonstrou que a expressão elevada de E-caderina e catenina-beta

estão significantemente associados ao CaP metastático e que a alta freqüência de expressão

sugere seu envolvimento na adesão celular das células metastáticas.

Em resumo, são conflitantes os dados da literatura referentes aos níveis de metilação

do gene CDH1 bem como da proteína E-caderina e sua relação com a evolução clínica dos

carcinomas de próstata.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

8. Gene SFN (stratifin)

Dentre os vários genes envolvidos na regulação das vias de transdução de sinais

empregados no controle da proliferação celular, diferenciação e sobrevivência encontra-se a

família gênica 14-3-3, com alta homologia e conservação entre as espécies, codificante das

isoformas alfa, beta, delta, sigma, tau e zeta, que são expressas em todas as células

eucarióticas (Fu et al., 2000). As proteínas 14-3-3 participam da sinalização da adesão

integrina-dependente, organização do citoesqueleto, controle do ciclo celular em resposta ao

estresse genotóxico e transformação tumoral (Fu et al., 2000).

Das isoformas da família 14-3-3, a sigma (σ) ou estratifina (14-3-3σ) é a única

diretamente ligada ao câncer. O gene SFN está localizado em 1p36.11 e codifica uma proteína

dimérica de aproximadamente 30 kDa responsável pelo controle do checkpoint da fase G

do ciclo celular em resposta a danos no DNA (Hermeking et al., 1997; 2003; revisado em

Lodygin e Hermeking, 2006). Defeitos nos checkpoints do ciclo celular podem resultar em

mutações gênicas, alterações cromossômicas e aneuploidias, levando a modificações

permanentes no genoma (Paulovich et al., 1997; Chan et al., 1999; Lodygin et al., 2004).

Estudos funcionais confirmaram o envolvimento da proteína SFN no controle do ciclo celular.

A proteína SFN, regulada pelo gene TP53, é ativadora de tirosina quinase-dependente e

inibidora endógena da proteína quinase C (Chan et al., 2000; Pellegrini et al., 2001). A perda

da expressão de SFN está envolvida com a formação do tumor in vivo, sugerindo seu papel

como supressora tumoral (Hermeking, 2005; revisado em Lodyngin e Hermeking, 2006).

No mínimo três mecanismos já são conhecidos como sendo reguladores do gene SFN.

O primeiro é a via TP53: após o dano no DNA, a expressão da proteína TP53 leva a ativação

de SFN, resultando no seqüestro da ciclina-B1 no citoplasma, impedindo-a de entrar no

núcleo e assim, evitando a iniciação da mitose (Taylor e Stark, 2001; revisado em Lodygin e

Hermeking, 2006). A segunda via envolve a proteína EFP (estrogen finger protein) em órgãos

influenciados pelo estrógeno, tais como a mama e a próstata. EFP se liga a SFN levando a sua

degradação, o que permite a proliferação ilimitada das células tumorais (Ikeda et al., 2000;

Nalepa e Harper, 2002; revisado em Lodygin e Hermeking, 2006). Em terceiro, a diminuição

da expressão da proteína SFN devido a hipermetilação de ilhas de CpG tem sido observada

em vários cânceres humanos tais como de pulmão, vulva, cólon, fígado, mama, próstata e pele

(Ferguson et al., 2000; Herman e Baylin, 2003; Lodygin et al., 2003; Mhawech et al., 2005;

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Oshiro et al., 2005; revisado em Lodygin e Hermeking, 2006). Estes dados sugerem que a

perda da expressão da SFN pode estar envolvida na progressão tumoral (Lodygin et al.,

2005b; Horie-Inoue e Inoue, 2006).

Inicialmente, achava-se que a alta freqüência de metilação na ilha de CpG do locus

SFN, detectada em linhagens de células de CaP, era resultado de prolongadas passagens

dessas células in vitro. Entretanto, foi observado que tumores primários de próstata

apresentavam a metilação anormal, caracterizando um evento carcinoma específico (Lodygin

et al., 2004). A perda da expressão da isoforma SFN é causada mais freqüentemente pela

hipermetilação do que por deleção ou mutação (Iwata et al., 2000; Osada et al., 2002; Oshiro

et al., 2005). Em concordância, Suzuki et al. (2000) relataram o restabelecimento da

expressão de SFN por agentes desmetilantes do DNA (como por exemplo, 5-aza-2’-

deoxicitidina) que normaliza o controle do ciclo celular. Um grande número de carcinomas

invasivos, incluindo carcinomas de células basais (Lodygin et al., 2003), cânceres de próstata

(Lodygin et al., 2004; Mhawech et al., 2005), ovário (Mhawech et al., 2005), câncer de mama

(Ferguson et al., 2000) e de endométrio (Mhawech et al., 2005), mostraram uma alta

freqüência de silenciamento epigenético do gene SFN por metilação das ilhas de CpG

(revisado em Hermeking, 2003). A perda de expressão da SFN parece ocorrer em estágios

iniciais do desenvolvimento do câncer (Hermeking, 2003; Lodygin et al., 2004).

Sugere-se que a diminuição de expressão da proteína SFN está envolvida na

tumorigênese prostática, o que foi confirmado pela diminuição de sua expressão nas linhagens

prostáticas tumorais LNCaP, DU145 e PC3. No entanto, os mecanismos de regulação deste

gene nestas linhagens parecem ser diferentes. Enquanto a diminuição de expressão é mediada

por metilação do gene SFN na linhagem LNCaP, nas linhagens DU145 e PC3 o controle da

expressão da proteína parece ser mediado por degradação proteossômica (Urano et al., 2004).

Como as linhagens LNCaP são receptor de andrógeno-positivas (AR), enquanto que as

linhagens PC3 e DU145 são AR-negativas, estes dados sugerem que os mecanismos que

medeiam a diminuição de expressão são diferentes de acordo com a resposta ao andrógeno

(revisado em Horie-Inoue e Inoue, 2006).

Análises de MS-PCR mostraram hipermetilação do gene SFN em 41 amostras de CaP

primários (Lodygin et al., 2004). Em concordância com estes achados, foi também

demonstrada alta expressão da proteína 14-3-3σ detectada por IHQ em células do epitélio de

próstata normal e de hiperplasias benignas prostáticas, enquanto células de cânceres de

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

próstata demonstraram baixa ou ausência de expressão (Lodygin et al., 2004; Urano et al.,

2004). Mais recentemente, Reinbenwein et al. (2007), por meio de MS-PCR, encontraram

hipermetilação do gene SFN no soro de pacientes com cânceres de próstata refratário a

hormônios (CPRH) e esta diferença foi significativa quando comparada aos controles

negativos.

Uma localização nuclear da proteína SFN foi encontrada numa proporção elevada de

CaP (escore Gleason > 8), entretanto o significado deste achado ainda não foi estabelecido

(Huang et al., 2004).

Em resumo, o gene SFN tem possível papel de supressor tumoral e sua expressão é

freqüentemente reduzida ou diminuída em cânceres de mama e próstata. O silenciamento

epigenético por metilação de ilhas de CpG, inativação do TP53, e proteólise dependente de

proteossomas são responsáveis pela perda da expressão de SFN. O padrão de metilação do

gene SFN e os níveis de expressão da proteína podem ser marcadores prognósticos do câncer,

e reagentes que induzem a desmetilação do gene SFN ou que inibem a proteólise

proteossoma-dependente da proteína podem levar ao aumento dos níveis proteicos e, portanto,

serem opções terapêuticas potenciais para os cânceres (para revisão, Horie-Inoue e Inoue

(2006).

9. Gene RARB (retinoic acid receptor, beta)

O gene RARB, localizado em 3p24, codifica o receptor de ácido retinóico-beta

(RARβ), um membro da superfamília de receptores hormonais tiróide-esteróide que atua

como regulador transcricional. Esse receptor, encontrado no citoplasma e em compartimentos

subnucleares, liga-se ao ácido retinóico (forma biológica ativa da vitamina A), que participa

da sinalização celular durante a morfogênese embrionária, crescimento e diferenciação celular

(Campbell et al., 1998; Dragnev et al., 2000). Acredita-se que esta proteína limita o

crescimento de muitos tipos celulares por meio da regulação da expressão gênica (Richter et

al., 2002; revisado em Soprano et al., 2004 e em Xu, 2007).

Diferenças entre as ações de P1 e P2, os dois conhecidos promotores do gene RARB

(P1 inicia a transcrição das isoformas 1 e 3 e P2 inicia a transcrição das isoformas, 2 e 4), e

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

splicing alternativos (Zelent et al., 1991; Nagpal et al., 1992; Mangelsdorf et al., 1995;

Chambon, 1996; revisado em Xu, 2007) dão origem a quatro grandes isoformas de RARB em

ratos (B1, B2, B3 e B4) e três nos seres humanos (B1, B2 e B4). Isoformas adicionais (por

exemplo, RARB5 e RARB1') foram também identificadas em células tumorais humanas (Peng

et al., 2004; Petty et al., 2005).

A isoforma RARβ2 é a mais abundante e a principal indutora do ácido retinóico e, por

conseguinte, o termo RARβ em literatura normalmente refere-se a isoforma RARβ2. A

RARβ4 é gerada por splicing alternativo das mesmas transcrições primárias que geraram a

RARβ2 e é iniciada pelo códon CUG (Nagpal et al., 1992). Por isso, a isoforma RARβ4 pode

atuar estruturalmente como uma forma dominante-negativa de RARβ2 (Chen et al., 2002).

A isoforma RARβ1 é fetal e parece ser crucial para desenvolvimento em seres

humanos, sendo expressa em câncer de pulmão de pequenas células (Houle et al., 1994).

Berard et al. (2003), utilizando ratos transgênicos, relataram que RARβ1 apresentava

atividade supressora de tumor que não poderia ser inteiramente compensada pela expressão

aumentada de RARβ2 e pela supressão da RARβ4 .

Pouco se sabe ainda sobre as isoformas mais recentemente descobertas, RARβ5 e

RARβ1'. A isoforma RARβ5 é expressa em células tumorais de mama e esta relacionada a

resistência ao acido retinóico nas células tumorais de mama estrogênio-negativas (Peng et al.,

2004). Demonstrou-se que a isoforma RARβ1' tem atividade antitumoral no câncer de pulmão

(Petty et al., 2005) .

Assim, as várias isoformas RARβ tem afinidades diferentes ao ácido retinóico (pelo

menos a RARβ2 e RARβ4) e diferentes funções biológicas (por exemplo, RARβ2 tem

funções supressoras de tumor enquanto RARβ4 tem propriedades oncogênicas).

Há relatos de expressão de RARβ em vários tecidos. Entre estes receptores, vários

estudos tem mostrado que o nível de expressão da isoforma β2 (RARβ2) está diminuído em

tumores de pulmão, mama, esôfago e de cabeça e pescoço (Lotan et al., 1995; Xu et al., 1997;

Picard et al., 1999; Qiu et al., 1999; revisado em Alvarez et al., 2007). Há evidências que este

gene tem papel de supressor tumoral (Sirchia et al., 2002; revisado em Alvarez et al., 2007 e

em Xu, 2007). Além disso, já foi demonstrado que o promotor do gene RARB2 contém uma

ilha de CpG que está intensamente metilada em diferentes tumores, como mama (Yang et al.,

2001), cervicais (Ivanova et al., 2002), bexiga (Maruyama et al., 2001) e próstata (Nakayama

et al., 2001).

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Usando MS-PCR, Nakayama et al. (2001) detectaram hipermetilação do gene RARB2

em 80% de CaP primários (11/14 amostras) e em 90% dos carcinomas refratários a tratamento

(metástases em órgão secundários, 9/10); 10 amostras de próstata normal (oriunda de

necrópsia) estavam hipermetilada. Estes resultados levaram os autores a sugerir que o RARB2

é um bom marcador molecular para detecção de tumores primários. Em concordância com

estes achados, Maruyama et al. (2002) observaram que a freqüência de metilação do gene

RARB2 era de 53% (54/101) nos CaP e 3% (1/30) nas amostras de tecido adjacente prostático

não neoplásico. Yamanaka et al. (2003) encontraram alta freqüência de metilação do gene

RARB2 nos CaP (78%, 85/109), baixa freqüência em tecidos não neoplásicos e em PIN (17%,

5/30 e 20%, 4/20, respectivamente) e ausência de metilação em amostras de HPB (0/36).

Utilizando PCR quantitativa para avaliar os níveis de metilação, Jeronimo et al. (2004a)

relataram que, embora os CaP e os PIN de alto grau apresentassem freqüências semelhantes

de metilação do gene RARB2 (97,5% e 94,7%, respectivamente), os CaP eram mais

freqüentemente hipermetilados. Os autores sugeriram que eventos progressivos de metilação

estariam envolvidos na carcinogênese prostática, além do acúmulo de outras alterações

genéticas mais comuns. Além disso, o mesmo estudo mostrou correlação entre os níveis de

metilação e estadios patológicos, mas não com o escore de Gleason. De acordo com os

autores este evento ocorre no início da carcinogênese e, portanto, a utilização de agentes

desmetilantes associados ao uso de retinóides poderiam trazer benefícios para o tratamento

e/ou quimioprevenção do CaP (Jeronimo et al., 2004a).

Woodson et al. (2004b) avaliaram a metilação do gene RARB2 por PCR quantitativa e

detectaram maior freqüência de metilação nos CaP (73%, 18/24) em comparação às amostras

de PIN de alto grau (30%, 3/10). Hoque et al. (2005) detectaram na urina de pacientes com

CaP primários uma baixa freqüência de hipermetilação do gene RARB2 (35%, 18/52).

Kwabi-Addo et al. (2007) avaliaram o padrão de metilação pelo método de piro-

sequenciamento de diversos genes implicados no câncer de próstata, entre eles o gene RARB2,

em 90 próstatas normais e em 12 amostras pareadas de tecido não neoplásico de pacientes

com CaP. Os autores detectaram correlação positiva entre a hipermetilação e a idade no grupo

de próstatas normais. Além disso, os tumores mostraram que a hipermetilação era 2,7 vezes

maior quando comparada com tecidos normais de indivíduos com mais de 50 anos e 2 vezes

maior na comparação com as amostras normais pareadas. Estes resultados indicaram que a

hipermetilação deste gene na próstata normal aumenta com a idade e que pode preceder e

predispor ao CaP.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

A associação entre a metilação e fatores prognósticos no CaP foi relatada por Bastian

et al. (2007), que avaliaram o padrão de metilação de treze genes, incluindo RARB, em 78

amostras de CaP e 32 de HPB. Os autores encontraram uma correlação inversa entre a

hipermetilação do gene RARB e a probabilidade de sobrevida livre de recorrência bioquímica.

Além disso, Singal et al. (2004), avaliando 81 pacientes com CaP, encontraram a

hipermetilação deste gene mais freqüentemente em pacientes mais jovens (idade<55anos) ao

diagnóstico, quando comparado com os pacientes em idade mais avançada (idade>70 anos).

Além da idade, foi observada maior freqüência de hipermetilação nos tumores com estádio III

(62,5%) comparado ao estádio II (33,3%). Recentemente, Bastian et al. (2008) estudaram o

padrão de metilação do gene RARB2 no soro de 192 pacientes com CaP. A hipermetilação foi

detectada apenas no soro dos pacientes com CaP metastático numa freqüência de 38,9%

(n=18). Adicionalmente, Rouprêt et al. (2008) avaliaram a hipermetilação do RARB2 por

qMSP nas células circulantes do sangue de pacientes com CaP obtidas de duas coletas

seqüenciais, ou seja, ao diagnóstico e durante a progressão da doença. Os autores observaram

que pacientes com alto risco de progressão do CaP apresentaram maiores níveis de metilação

do que aqueles sem a progressão e/ou sem informação biológica (incluindo nível de PSA).

Vener et al. (2008), utilizando a metodologia qMSP, analisaram o padrão de metilação dos

genes GSTP1, RARB e APC na urina de 234 pacientes com CaP que apresentavam PSA ≥ que

2,5 µg/mL. As amostras que exibiam metilação para GSTP1 ou RARB eram provenientes de

pacientes com tumores de maiores volume à prostatectomia.

Recentemente, Mehrotra et al. (2008), combinaram dados histológicos de carcinomas

de próstata e resultados de qMSP de 4 genes, incluindo RARB2, na avaliação do efeito de

cancerização de campo. Para o experimento, os autores realizarem biopsias espaçadas a cada

1mm provenientes de 37 amostras de prostatectomias. A primeira biópsia foi confirmada

como histologicamente positiva para o câncer e as subseqüentes como negativas. Os autores

relataram um efeito de campo, definido pela presença de células epigeneticamente

transformadas na avaliação dos genes RARB2 e RASSF1A, sendo mais pronunciado no

primeiro. Os achados foram confirmados por seqüenciamento do RARB2 sugerindo o

potencial deste gene na avaliação de margens cirúrgicas e predição de recorrência tumoral.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

10. Gene RASSF1 [Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1]

O gene RASSF1, localizado na região 3p21.3, codifica uma proteína similar às

proteínas efetoras RAS e a perda ou alteração da sua expressão tem sido associada com a

patogênese de uma variedade de tumores, o que sugere uma função supressora tumoral

(Dammann et al., 2000; revisado em van der Weyden e Admans, 2007). Foi observado que a

proteína codificada RASSF1 é capaz de interagir com a proteína XPA (de reparo do DNA),

além de inibir o acúmulo de ciclina D1 e, assim, induzir a interrupção do ciclo celular

(Dammann et al., 2003a; Song et al., 2004; Hesson et al., 2007). Sete transcritos alternativos

deste gene codificando isoformas distintas já foram descritos

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink), sendo que as três isoformas principais são

RASSF1A, RASSF1C e RASSF1F. A inativação transcricional deste gene foi relacionada a

hipermetilação da ilha de CpG em sua região promotora, sendo que duas ilhas de CpG

separadas por aproximadamente 3,5Kb foram descritas. As isoformas RASSF1A e RASSF1C

apresentam quatro éxons em comum, a porção N-terminal de RASSF1A tem alta homologia

com a região 1 conservada da proteína quinase C, que contém um domínio zinc finger

(Newton, 1995; Donninger et al., 2007; revisado em van der Weyden e Admans, 2007).

A expressão aumentada de RASSF1A, relatada numa variedade de linhagens de

células tumorais (próstata, rim, carcinomas nasofaríngeos e gliomas), parece resultar em

células menos viáveis, com crescimento diminuído e que mostraram uma diminuição da

independência de ancoragem ao substrato, sendo portanto, menos invasivas. A expressão

aumentada ou ectópica de RASSF1A nestes tipos tumorais causaram redução drástica da

tumorigênese tanto in vitro como in vivo, enquanto a expressão de isoformas mutantes deste

gene mostrou redução da atividade supressora do crescimento tumoral (Li J et al., 2004; van

der Weyden e Adams, 2007).

Se a inativação do RASSF1A contribui para o desenvolvimento de um fenótipo

transformado, então uma possível re-introdução de RASSF1A em células RASSF1A-negativas

poderia prevenir ou diminuir a capacidade tumorigênica destas células transformadas. Alguns

estudos demonstraram que a re-expressão deste gene em linhagens celulares tumorais

RASSF1A-negativas resultaram na redução de formação de colônias em meio ágar e na

supressão da formação de colônia independente de ancoragem (Dammann et al., 2000;

Burbee et al., 2001; Dreijerink et al., 2001; Kuzmin et al., 2002). Dois grupos independentes

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

desenvolveram camundongos knockout para o gene RASSF1A (Tommasi et al., 2005; van der

Weyden et al., 2005). Nos dois casos os animais exibiram maior tendência a desenvolver

tumores espontâneos. Estes achados confirmam a função supressora tumoral do gene

RASSF1A (Donninger et al., 2007).

A análise funcional da isoforma RASSF1A mostrou que a proteína codificada pode

estar envolvida na sinalização apoptótica, estabilização de microtúbulos e na progressão do

ciclo celular (Pfeifer e Dammann, 2005; Donninger et al., 2007). Song et al. (2004) relataram

que o gene RASSF1A controla o progresso mitótico por se ligar e inibir o CDC20, entretanto,

um estudo mais recente (Liu et al., 2007) não encontrou nenhuma interação entre RASSF1A e

CDC20.

Alterações no padrão de metilação da região promotora do gene RASSF1A tem sido

freqüentemente detectadas em muitos tipos tumorais (Dammann et al., 2003b; Pfeifer e

Dammann, 2005; revisado em van der Weyden e Admans, 2007). Lee et al. (2001) e Dulaimi

et al. (2004) relataram uma alta freqüência de metilação do RASSF1A em tumores de bexiga e

correlacionaram este achado com a progressão tumoral e pior prognóstico. Outros autores

observaram o mesmo achado em tumores cerebrais (Astuti et al., 2001; Ramirez et al. 2003);

em tumores de mama e pulmão (Burbee et al., 2001; Dammann et al., 2001; Koul et al., 2002,

2004; Krassenstein et al., 2004); em carcinomas pancreáticos (Dammann et al., 2003a).

Nos tumores de próstata, a metilação da região promotora do gene RASSF1A é um

evento comum. Florl et al. (2004) avaliaram o padrão de metilação por MS-PCR de quatro

genes, entre eles RASSF1A e RARB2, e mostraram que as frequências de hipermetilação de

RASSF1A eram de 78% nos CaP e 53% nos tecidos prostáticos não neoplásicos, sendo que os

tumores mostraram mais frequentemente mais de um gene hipermetilado, enquanto que estes

eventos eram mais raros nos tecidos não neoplásicos.

A associação entre a metilação e escores de Gleason foi demonstrada por Liu et al.

(2002). Os autores detectaram maior frequência de hipermetilação nos tumores com Gleason

7-10 (25/30, 83%) comparado com os tumores com Gleason 4-6 (11/20, 55%, P=0,032).

Maruyama et al. (2002), já mencionado anteriormente, relataram que o RASSF1A apresentou

as maiores frequências de metilação associadas aos escores de Gleason alto (>7) e altos níveis

de PSA pré-cirúrgico (PSA>8ng/mL). Estes dados indicaram que a inativação epigenética do

RASSF1A se correlaciona com características clinico-patológicas de pior prognóstico.

Woodson et al. (2004a) relataram que a metilação de RASSF1A está associada com o grau do

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

tumor, entretanto, a metilação do gene não diferiu de acordo com o estadio da doença. Além

disso, não foi observada metilação nas sete amostras de HPB avaliadas.

Bastian et al. (2005) identificaram hipermetilação no gene RASSF1A por qMSP em

28,5% (4/14) das amostras de HPB e em 67,9% (36/53) dos CaP, porém não foi observada

nenhuma correlação significativa deste gene com as variáveis clínico-patológicas.

Adicionalmente, Woodson et al. (2004b) também identificaram metilação de RASSF1A em 3

de 10 amostras PIN de alto grau, sugerindo que o silenciamento deste gene pode ocorrer no

início da progressão dos cânceres de próstata.

Em outro estudo, foram avaliados por qMSP 16 ilhas de CpG em 16 genes, entre eles

RASSF1A, em 13 próstata normais provenientes de necrópsias, 12 tecidos não neoplásicos

adjacentes ao tumor e em 73 amotras de CaP (Yegnasubramanian et al., 2004). Os autores

detectaram por meio do índice normalizado de metilação das 16 ilhas avaliadas, que 96% dos

tumores apresentavam hipermetilação de RASSF1A e ausência de metilação nas amostras de

tecido normal adjancente e de próstata normal. Estes autores avaliaram também as metástases

microdissecadas de órgãos secundários (n=87) e verificaram que embora as frequências de

metilação entre tumores primários e metástases eram semelhantes, a mediana do índice de

metilação era maior nas metástases que nos tumores primários. O conjunto destes resultados

indicaram que as alterações epigenéticas, em especial relacionadas ao gene RASSF1A,

ocorrem inicialmente, inclusive em lesões pré-malignas, e que tendem a se acumular à medida

que o tumor progride.

Henrique et al. (2007), usando qMSP, avaliaram 83 CaP e identificaram que maiores

níveis de metilação do gene RASSF1A estavam associados a escores de Gleason mais altos.

Além disso, a análise univariada indicou que hipermetilação deste gene estava associada com

menor tempo de sobrevida livre da doença. No entanto, após análise multivariada, o RASSF1A

não se mostrou um marcador prognóstico independente. Kawamoto et al. (2007) sugeriram

que a redução da acetilação de histonas ou a metilação de H3K4me2 e o aumento da metilação

de dimetil-H3-K9 tem um papel crítico na manutenção da metilação do promotor do gene

RASSF1A silenciado em cânceres de próstata.

Recentemente, Bastian et al. (2008) não detectaram a hipermetilação do gene

RASSF1A no soro dos 192 pacientes com CaP, mas encontraram aproximadamente 16,7% de

hipermetilação em pacientes com CaP metastático. Em adição, Rouprêt et al. (2008)

analisaram as células circulantes do sangue de pacientes com alto risco de progressão do CaP

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

e verificaram que quanto maior o nível de hipermetilação do gene RASSF1A, maior era o risco

de progressão da doença.

11. Justificativa

A lista de genes mostrando padrões anormais de metilação no câncer está se

expandindo; porém, provavelmente somente alguns destes serão promissores como

marcadores de risco de desenvolvimento tumoral, podendo ser utilizados no diagnóstico

precoce ou como indicativos de agressividade tumoral. Os estudos de metilação nos quatro

genes apresentados neste estudo (CDH1, RASSF1, RARB e SFN) em tumores de próstata são

discrepantes tanto no que se refere às freqüências observadas em diferentes populações

quanto à associação descrita com características clínicas e patológicas de pior prognóstico.

Assim, é justificado um maior número de estudos e em diferentes populações para identificar

os genes relevantes na carcinogênese prostática. Para o nosso conhecimento, não há relatos

destes genes em tumores de próstata de pacientes brasileiros. Adicionalmente aos fatores de

risco associados ao desenvolvimento dos carcinomas de próstata, tem sido demonstrado que o

background genético das diferentes populações influencia na incidência e gravidade dos

tumores humanos. Assim, é fundamental a identificação dos fatores comuns ou biomarcadores

nas diferentes populações relacionados à carcinogênese prostática. Este conhecimento poderá

ser aplicado no diagnóstico e prognóstico dos pacientes com CaP e indicar alvos interessantes

para novas modalidades ou abordagens terapêuticas.

Este estudo propôs a avaliação do padrão de metilação dos genes CDH1, SFN, RARB e

RASSF1A por MSP em amostras de adenocarcinoma de próstata, amostras não-neoplásicas e

em tecidos de próstata normais e correlacionar os achados com os parâmetros clínicos-

histopatológicos. Para consubstanciar os dados preliminares do envolvimento destes genes no

CaP, foi também investigada a expressão da proteína E-caderina por IHQ em cortes

histológicos das mesmas amostras avaliadas quanto ao padrão de metilação do gene CDH1; A

expressão dos transcritos RARB e RASSF1A foi avaliada por RT-PCR quantitativa em tempo

real (qRT-PCR) e comparada com os parâmetros clínico-histopatológicos. Finalmente, foi

investigada, em um grupo independente de amostras, a expressão das proteínas RARβ2 e

RASSF1A por IHQ em uma plataforma de tissue microarray (TMA). O impacto prognóstico

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

da expressão destes genes foi analisado por regressão logística em relação à ocorrência de

recorrência local ou metástases à distância, assim como em relação à sobrevida livre de

recorrência.

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

OBJETIVOS

OBJETIVOSOBJETIVOS

OBJETIVOS

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

12. Objetivos

• Avaliar o padrão de metilação dos genes CDH1, SFN, RARB e RASSF1A (por MSP)

em amostras de adenocarcinomas de próstata comparadas com amostras mostrando ausência

de neoplasia;

• Avaliar a expressão dos transcritos RARB2 e RASSF1A (por qRT-PCR) e das

respectivas proteínas (por imunohistoquímica) em amostras de adenocarcinoma de próstata;

• Comparar os resultados de metilação do gene CDH1 com a expressão da proteína E-

caderina (por imunohistoquímica) em amostras de adenocarcinoma de próstata;

• Correlacionar os resultados da análise de metilação com os níveis de expressão

protéica e/ou transcricional e compará-los com os parâmetros clínicos e histopatológicos.

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Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

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MANUSCRITO

MANUSCRITOMANUSCRITO

MANUSCRITOS

ARTIGO 1

ARTIGO 1ARTIGO 1

ARTIGO 1

RARB IS A BIOMARKER OF POOR PROGNOSIS IN PROSTATE

CARCINOMAS

Flávia Cilene Maciel da Cruz Alves

a,b*

, Sandra Aparecida Drigo

, Cláudia Aparecida Rainho

João Lauro Viana de Camargo

, Francisco Paulo da Fonseca

, Fernando Augusto Soares

, José

Carlos Souza Trindade Filho

, Maria Aparecida Custódio Domingues

, Silvia Regina Rogatto

b**

Department of Pathology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao Paulo, Brazil

NeoGene Laboratory, Department of Urology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao

Paulo, and AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao Paulo, Brazil

Department of Genetics, Biosciences Institute, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao

Paulo, Brazil

Department of Pelvic Surgery, AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao

Paulo, Brazil,

Department of Pathology, AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao Paulo,

Brazil

Department of Urology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao Paulo, Brazil

*Both authors contributed equally to this work.

**Corresponding author:

Silvia Regina Rogatto, PhD

NeoGene Laboratory, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo

Rua Professor Antonio Prudente, 211, Liberdade, São Paulo, Brazil

CEP: 01509-010

Phone: 55 11 21895163 Fax: 55 11 21895163

e-mail: [email protected]p.br and silvia.rogatto@hcancer.org.br

Supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brazil.

Runnning title: RARB and prognosis in prostate carcinomas

Keywords (1 to 5): prostate cancer, SFN, RARB, RASSF1A, biochemical recurrence.

Journal of Urology (IF: 4.053)

ABSTRACT

Purpose: Epigenetic alterations play critical roles in regulation of several genes and cellular

functions and their deregulation may disrupt the cellular control leading to tumor

development. The current study aimed to evaluate SFN, RARB, and RASSF1A

hypermethylation frequencies in prostate carcinoma (PCa) and to correlate these alterations

with down-regulations at transcriptional and protein levels.

Methods: Methylation pattern of SFN, RARB, and RASSF1A were determined by

methylation-specific PCR in 68 PCa samples and 27 non-neoplastic prostate tissues. Gene

expression was evaluated by quantitative RT-PCR in 73 PCa, 15 adjacent non-neoplastic

prostate tissues (AdjP) and two normal prostate (N). Protein expression was evaluated by

immunohistochemistry in 141 PCa, 40 AdjP and two N tissues. The findings were correlated

with clinicopathological parameters and biochemical recurrence-free survival (BRFS).

Results: RARB and RASSF1A genes were hypermethylated in PCa (P <0.0001 and P =

0.0017, respectively), but no difference was detected for SFN. RASSF1A mRNA and protein

levels were similar in PCa and AdjP samples. Down-expression of RARβ in transcript

(P=0.001) and protein (P=0.0007) levels were detected in tumors. Lower mRNA levels were

correlated with RARB hypermethylation. Nuclear and cytoplasmic RARβ protein expression

was detected in tumor tissues. Multivariate analysis demonstrated that cytoplasmic RARβ

immunostaining was independently associated with decreased BRFS (P=0.019, HR=1.891).

Conclusions: RARB hypermethylation seems to be one of the mechanisms involved in RARβ

down-expression in PCa. Cytoplasmic RARβ protein is an independent predictor of poor

prognosis that may be considered a new biomarker in prostate cancer providing, therefore,

relevant information for patient management.

INTRODUCTION

Epigenetic alterations are modifications that influence phenotype without altering the

genotype and have been described as important mechanisms involved in carcinogenesis. The

most studied epigenetic modification is the cytosine methylation of DNA within the CpG

island (CGi). CGi is preferentially found in the gene promoter region and displays tissue

restricted profile.

Cancer development is accompanied by methylation changes, with global

hypomethylation and also hypermethylation at specific promoters. Hypermethylation of tumor

suppressor genes has been described as one of the mechanisms involved in gene silencing,

1, 2

and has already been detected in pre-malignant lesions, suggesting that epigenetic alterations

may occur in early stages of neoplasia development.

Besides the tumor suppressor genes,

hypermethylation of genes involved in the cell cycle, DNA repair, apoptosis, cell adhesion

and angiogenesis have been detected in tumors.

It has been proposed that gene methylation

profile can be used as biomarkers in oncology, since hypermethylation of specific genes is

rarely found in healthy individuals compared with cancer patients, although it has been

demonstrated that methylation increases with aging and environmental exposition.

3, 4

Molecular studies in specific genes (oncogenes and tumor suppressor genes) have

revealed potential markers in prostate carcinomas; nevertheless, these changes were not

sufficient to explain the development and progression of the disease.

In prostate cancer,

many hypermethylated genes have been described and indicated as potential prostate cancer

diagnosis markers, including RARB, RASSF1A and SFN.

2, 5, 6

The RARB (retinoic acid

receptor beta) gene encodes a member of nuclear hormone receptor that binds retinoic acid.

Retinoic acid regulates several essential biological processes that include cell growth,

differentiation and apoptosis, and also can suppress carcinogenesis in different tissues.

RASSF1A (Ras-association domain family 1A) gene is a tumor suppressor associated with

regulation of the cell cycle, apoptosis and genetic instability.

SFN (stratifin) is a putative

tumor suppressor gene involved in cell cycle regulation and apoptosis following DNA

damage.

High frequencies of promoter methylation of RARB,

RASSF1A,

11, 12

and SFN

were detected in prostate tumors. Furthermore, hypermethylation of RARB

10, 14

and RASSF1A

11, 12, 14

were associated with poor prognosis in PCa patients.

To our knowledge, there is a paucity of studies addressing the association between

hypermethylation of RARB,

RASSF1A and SFN genes

and transcript or protein expression

levels in prostate carcinomas and their association with clinical outcome. In this context, the

current study aimed to determine if the presence of promoter DNA hypermethylation could

alter mRNA and protein expression levels in prostate cancer. For this proposal, we firstly

detected the prevalence of hypermethylation of RARB, RASSF1A and SFN genes in prostate

carcinomas and then selected the informative candidate genes to evaluate the correlation of

methylation patterns with transcript levels. To validate these data, protein analysis was

conducted in prostate samples from an independent cohort of PCa patients and the findings

were associated with clinicopathological parameters and with disease recurrence.

MATERIAL AND METHODS

Patients

The study included 250 prostate cancer patients followed prospectively at the Clinical

Hospital, Medical School, São Paulo State University (2001 to 2007) and at the AC Camargo

Cancer Hospital (1993 to 2002). All the patients were advised of the procedures and provided

written informed consent. The Human Research Ethics Committee approved this study

(CONEP # 304/2000).

Methylation analysis was evaluated in 68 PCa samples and 27 histopathologically

confirmed non-neoplastic prostate (NNP) tissues. The NNP samples were obtained from

patients that undergoing ultrasound-guided needle biopsies due to abnormal PSA levels and/or

suspected PCa after digital rectal exams. These individuals not show any evidence of prostate

lesions during the follow-up period (median=63 months, Table 1).

Fresh PCa samples (n=73) and adjacent non-neoplastic prostate (AdjP) tissues (n=15)

from PCa patients were evaluated for transcript expression analysis. Two normal prostate

tissues (with histopathologically confirmed absence of PCa, intra-epithelial neoplasia, benign

prostate hyperplasia-BPH, or prostatitis) from necropsies were considered as controls. These

individuals were 40 and 49 years of age, respectively. A subset of these samples was

evaluated by methylation pattern and transcript expression (30 PCa, 10 AdjN, and two normal

prostate tissues). One hundred forty one PCa and 40 AdjP formalin-fixed paraffin embedded

(FFPE) tissue specimens were evaluated by immunohistochemistry assays.

All samples evaluated were from untreated patients. Radical retropubic prostatectomy

(RRP) was the primary treatment in 215 patients. Twenty-nine PCa patients received hormone

therapy before RRP. In these cases, biopsy samples were taken before neoadjuvant treatment.

Six cases did not undergoing PPR due to advanced age or metastasis at diagnosis; the biopsy

samples collected from these patients were evaluated in methylation analysis. Table 1

summarizes the clinicopathological features of patients and controls.

Methylation Analysis

Genomic DNA was obtained by sodium dodecyl sulfate/proteinase K digestion,

followed by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation. The Methylation

Specific- Polymerase Chain Reaction (MSP) was performed using genomic DNA (2 µg)

treated with sodium bisulfite as previously described.

For each gene, specific primers for

methylated and unmethylated sequences, CpGs island locations and PCR conditions were

described elsewhere.

Gene Expression analysis by Real-Time RT-PCR

Hematoxylin-eosin (HE) stained slides were used as a guide to histological evaluation

and to select the representative tumor areas for microdissection. Total RNA was extracted

from pulverized fresh frozen tissue using an RNeasy mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden,

Germany) according to the manufacturer's instructions. The RNA extraction and cDNA

synthesis were performed as previously described (Rosa et al, 2008). Primers for RARB and

RASSF1A and HPRT (reference gene) were designed using Primer Expression software

(Applied Biosystems, Foster City, CA) and sequences were: for RARB (F)5’-

TCTGTGGAGACCGCCAGG-3’ and (R)5’-GGGTCGTCTTTTTCTGATATAAATTTTT-3’; for

RASSF1A (F)5’-TGGATGATGAGCAGCCCC-3’ and (R)5’-TCCCAGTTCACCTCCCCAG-3’; and for

HPRT (F)5’-TCATTATGCTGAGGATTTGGAAAG-3’ and (R)5’-GGCCTCCCATCTCCTTCATC-3’.

Assays were run in duplicate on an ABI Prism® 7000 in a total volume of 10µl containing

5µl Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1 µl

cDNA (1:5) and 200nM of each primer set. The reactions were incubated in a 96-well optical

plate at 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s. Gene

relative quantification (RQ) was calculated by ∆∆Ct method.

The transcript levels were

considered up-regulated (RQ≥2.0) or down-regulated (RQ≤0.5).

Protein Analysis

For immunohistochemistry analysis, FFPE samples were displayed into a tissue

microarray (TMA). The TMA construction was described in details in Yoshimoto et al

(2008).

Anti-RAR-β MS-1342-P1 monoclonal antibody diluted 1:400 (Lab Vision,

Fremont, CA, USA) and anti-RASSF1A monoclonal antibody diluted 1:20 (ab23950; Abcam,

Cambridge, UK) were used to IHC reactions. The sections were washed in PBS, incubated for

30 min with secondary biotinylated antibody, followed by 30 min incubation with streptavidin

peroxidase complex (LSAB, DAKO, Carpinteria, CA, USA). The immunostaining was

performed by incubating slides with 3,3'-diaminobenzidine (DAB) and counterstained with

hematoxylin. Normal colon was used as positive control in each assay. Two normal prostate

specimens were also included as controls. For RARβ protein analysis, the final scores were

negative and positive according to the absence or presence of nuclear or cytoplasmic

immunostaining. The final scores for RASSF1A were weak and moderate expression

according to cytoplasmic immunostaining intensity. The IHC scoring was blinded to the

outcome and clinical aspects of each tumor specimen.

Data Analysis

Chi-square or Fisher exact test were applied to determine the strength of association

between the categorical variables. Comparisons of transcript levels in different groups were

done by Mann-Whitney test. Biochemical recurrence-free survival (BRFS) probabilities

according to proteins expression were calculated based on the Kaplan-Meier method. The

end-point was calculated by the time from RRP until the biochemical recurrence (defined as

the data of the first PSA>0.2 ng/mL confirmed in two consecutive tests). Clinical stage IV

patients were excluded from the analyses. Multivariate analysis was performed using Cox

proportional hazards in a model that included all variables presenting P-value<0.20 on the

univariate analysis. The statistical analyses were performed using GraphPad Prism3 (San

Diego, CA, USA) and SPSS version 15.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) for Windows.

RESULTS

Hypermethylation of RARB and RASSF1A genes were significantly associated with

PCa compared with age-matched NNP tissues (P<0.0001 and P=0.0017, respectively), but no

difference was found for SFN gene (Table 2). SFN, RARB and RASSF1A hypermethylation in

PCa was age-independent and no association with family history of cancer and other

clinicopathological parameters were observed (data not shown). Nonetheless, it was detected

that 79% of PCa cases showed hypermethylation for both genes, RARB and RASSF1A. The

three genes evaluated presented concurrent hypermethylation in 53% of the cases (21 out of

39 samples). The significant association found in DNA methylation involving RARB and

RASSF1 genes was the criteria to select these genes for further analysis (qRT-PCR and IHC).

The transcript expression analysis revealed RARB down-expression in PCa samples

(P=0.001, Fig 1A). In 30 PCa and 10 AdjP cases, paired methylation and mRNA analysis was

evaluated. RARB gene hypermethylation was detected in 30 out of 30 PCa and in 5 out of 10

AdjP samples. Seventy percent (21/30) of PCa samples showed concurrent hypermethylation

and mRNA down-expression. In 7 out of 9 PCa that presented RARB hypermethylation, it was

observed lower mRNA levels. In AdjP samples, 40% (2/5) showed hypermethylation and

transcript down-expression, and in one case with RARB gene hypermethylation it was

detected lower expression level (RQ=0.65).

The RARβ protein analysis showed predominantly nuclear immunostaining in prostate

tissues; however, in a subset of AdjP and tumor samples was observed cytoplasmic

immunostaining (Fig 1 B-F). In agreement with mRNA results, down-regulation of nuclear

RARβ immunostaining was observed in tumor samples (P=0.0007, Table 3). Cytoplasmic

RARβ immunostaining was more frequently detected in PCa (21%) compared with AdjP

(9%), although with no statistical significance (Table 3). Among the PCa cases with

cytoplasmic RARβ (n=28), only six samples (21%) showed concomitant nuclear RARβ

immunostaining (Fig 1E). Interestingly, cytoplasmic RARβ protein expression was found in

one case showing vascular invasion by tumor cells (Fig 1F).

RASSF1A gene expression analysis revealed no significant differences in the

comparison between PCa and AdjP tissues (Fig 1G). Paired methylation and gene expression

analyses in 30 PCa and 10 AdjP revealed no correlation between RASSF1A hypermethylation

and mRNA down-expression. Among the 28 hypermethylated PCa, only one sample (4%)

showed lower transcript levels. In addition, 9 out of 10 AdjP samples were hypermethylated

and none of them showed mRNA down-expression. The RASSF1A protein analysis exhibited

cytoplasmic immunostaining (Fig H-J). Heterogeneous protein expression pattern was

observed in normal prostate samples. Weak immunostaining was predominantly detected in

normal prostate tissues (60% of the tissue), with moderate expression in some areas (Fig 1H).

Similarly to mRNA results, no difference in RASSF1A protein levels was detected between

PCa and AdjP samples (Table 3). Prostate tumors showed predominantly weak protein

expression levels (Fig 1 I-J).

The RARβ and RASSF1A mRNA and protein levels were evaluated according to the

clinicopathological features in PCa cases. Lower transcript levels of RARB were marginally

associated with higher preoperative PSA values (PSA>4.0 ng/mL versus PSA≤4.0ng/ml; n =

69, P =0.043, data not shown), but it was not confirmed by protein analysis. Positive tumors

for cytoplasmic RARβ was statistically associated with biochemical recurrence in PCa cases

(P=0.037). In this study, 75 patients presented biochemical recurrence, 27% of them showed

positive cytoplasmic RARβ tumors compared with 73% with negative cytoplasmic

immunostaining. In PCa patients without biochemical recurrence during the follow-up period

(n=58), 12% and 88% were positive and negative for cytoplasmic RARβ, respectively. None

association was detected for RARβ and RASSF1A expression levels and any other

clinicopathological variables evaluated.

Survival analysis was conducted to determine the prognostic value of tumor

cytoplasmic RARβ expression in a cohort of 128 patients (Table 4). In agreement with our

previous results, the biochemical recurrence was not influenced by nuclear RARβ expression

(Fig 2A and Table 4). However, patients with positive cytoplasmic RARβ tumors exhibited a

statistically higher probability of biochemical-recurrence (P=0.002, Fig 2B and Table 4). The

5-year biochemical-recurrence probabilities were 29% and 58% for positive and negative

cytoplasmic tumors, respectively. Five-year BRFS was also influenced by the following

parameters: preoperative PSA level, pathological staging, Gleason score, surgical margins,

seminal vesicle invasion and neoadjuvant treatment (Table 4).

Multivariate analysis was performed to determine whether the presence of cytoplasmic

RARβ was an independent factor in predicting biochemical-recurrence. The positive

cytoplasmic RARβ, preoperative PSA level and seminal vesicule invasion were found as

independent prognostic factors for BRFS (Table 5). Patients with positive cytoplasmic RARβ

tumors showed higher risk for biochemical-recurrence than patients with negative tumors

(HR=1.891; CI

95%

=1.112- 3.216; P=0.019). Interestingly, five patients died due to prostate

cancer and only one case was negative for cytoplasmic RARβ.

DISCUSSION

Hypermethylation of SFN, RARB, and RASSF1A genes have been proposed as

potential biomarkers in prostate carcinomas.

2, 5, 6

However, there is paucity of studies

addressing if these epigenetic alterations are correlated with transcriptional and protein

expression levels and with clinicopathological parameters in prostate tumors.

In this study, in agreement with previous reports, high frequencies of RARB, RASSF1A

and SFN genes hypermethylation were detected in prostate tumors.

12, 13

DNA

hypermethylation in PCa cases was an age-independent event. This finding in association with

high frequency of cases showing at least two genes hypermethylated suggests the occurrence

of the deregulation of the methyltransferase activity during tumor progression.

Disruption

of the maintenance mechanism of methylation could lead to a genomic wide effect with

several CGis showing abnormal methylation patterns; however, this event is considered

nonrandom in tumor cells, as suggested by abnormal tumor specific methylation profiles.

Statistically significant differences in methylation patterns between PCa and age-

matched NNP tissues obtained from men who experienced prostate biopsies for PCa

screening were observed only for the RARB and RASSF1A genes. High hypermethylation

frequencies of both genes (52 and 57%, respectively) were detected in NNP samples. Kwabi-

Addo et al (2007)

also detected hypermethylation of these genes in pathologically normal

human prostate as a function of age, but higher frequencies in PCa samples were observed in

comparison with matched benign prostate tissues. The authors found that the average of

RARB gene methylation seen in cancer samples was at least 2.7-fold higher when compared

with the normal prostate tissues. Similarly, for the RASSF1A gene, the average methylation

level in prostate cancer tissues was at least 2-fold higher compared with that in normal

prostate tissues. In the present study, it was detected 1.7 and 1.5-fold higher PCa

hypermethylation in RARB and RASSF1, respectively, in comparison with NPP cases.

RASSF1A hypermethylation has already been detected in adjacent non-neoplastic prostatic

tissues from PCa

and in prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) patients,

whereas the

methylation levels detected were dependent on the CpG site interrogated and the methodology

employed to assess DNA methylation. Although it has been evaluated a small number of

adjacent non-neoplastic prostate tissues, these results suggest that RASSF1A methylation is

also altered in histopathologically normal prostate tissues from PCa patients.

In the subgroup of 30 PCa samples simultaneously evaluated by MSP and qRT-PCR,

RASSF1A hypermethylation was not associated with mRNA expression. In matched cases (30

PCa and 10AdjP) evaluated by methylation pattern and transcript expression, only one PCa

sample showed concordant RASSF1A hypermethylation and lower level of mRNA; 28 PCa

cases hypermethylated presented normal transcript expression. Moreover, although the

hypermethylation has been detected in 88% of the tumors, only 5 out of 73 (7%) PCa samples

showed transcripts down-expression (RQ≤0.5) compared with the controls (two normal

prostates tissues).These discrepant data may be explained by the fact that tiny amounts of

cells showing DNA hypermethylation are promptly detected in a background of

heterogeneous cancer cells. Alternatively, there are evidences that methylation of a relative

small ‘core’ region covering the transcription start site is associated with gene silencing, while

methylation outside of the core region, but still within a promoter CGi, does not necessarily

lead to transcriptional inactivation.

However, in the present study, the primers sequences

selected for MSP approach was specifically designed to interrogate the CpG dinucleotides

into the core region and thus should correlate with the gene expression status. This hypothesis

is supported by the RASSF1A protein expression pattern predominantly classified as week or

moderate in PCa samples (n=141) as well as in AdjP tissues (n=40). In summary, these data

suggest that aberrant methylation patterns might reflect a pre-malignant characteristic,

supporting the hypothesis that epigenetic alterations in cancer may preexist in

morphologically normal cells.

In contrast, RARB hypermethylation was associated with transcription repression in

prostate samples as demonstrated by lower levels of mRNA detected in matched-

hypermethylated samples. In addition, significant mRNA down-expression was detected in

PCa compared with AdjP samples. Lower RARB mRNA levels were detected in 58% (41 out

of 71) PCa samples compared with normal controls. The protein analysis confirmed the

significant down-regulation of nuclear RARβ in tumor samples. In agreement with our

findings, down-regulation of RARβ in transcript

and protein levels

were previously

described in prostate tumors, but in these studies the RARB methylation profiles were not

simultaneously investigated. To our knowledge, only one study evaluated the RARB

methylation and mRNA expression by qualitative RT-PCR in PCa tissues.

Besides the

small number of patients evaluated and low sensitivity of the RT-PCR method used to detect

the transcript, the authors found an association between hypermethylation and mRNA down-

expression in five out of eight PCa samples analyzed. Taken all together, our data highly

indicate that the CpG island examined here (positions 111; 113; 117; 122; 231; 236; 249 of

interrogated CpGs in relation to transcription start site) is located in the CGi ‘core’ region and

is essential to the gene transcription regulation in prostate tissues. Nevertheless, our data do

not exclude other mechanisms involved in RARB gene silencing, such as decreased levels of

co-activators, the presence of co-repressors or histone deacetylation.

In conclusion, we

demonstrated that the RARB hypermethylation is a biomarker in prostate cancer directly

related with gene silencing and this information can contribute to the prostate cancer biology

knowledge.

Surprisingly, cytoplasmic RARβ staining was observed in a subset of tumor samples

(21%) and AdjP (9%) tissues, but not in normal prostate tissues. Cytoplasmic RARβ

immunostaining was previously described in epithelial cells from BPH samples but not in

normal glands.

Different RARβ protein isoforms have been described in different tumor

cell types. In special, high levels of RARβ4 isoform was previously detected in human breast

tumor cells with nuclear and cytoplasmic localization.

RARβ2 is the most abundant and the

major RAR (retinoic acid receptor) inducible isoform.

There are some evidences that

RARβ4 is the product of alternative splicing from the RARB2 transcripts and is initiated by

the CUG codon.

Retinoic acid receptors (RARs) present six distinct domains (A–F) that

contain functional units of the transcription factor.

26, 27

The RARβ2 and RARβ4 isoforms

differ only in the N-terminal A region of the protein. The RARB4 mRNA lacks 357

nucleosides that are present in the RARB2 mRNA.

It has been suggested that, in contrast of

tumor suppression activity of RARβ2, RARβ4 may be an oncogene by acting as dominant-

negative form of RARβ2.

Xu et al (2005)

showed that RARB2 mRNA was reduced in

esophageal cancer cases compared with normal samples. The RARB4 mRNA levels were

detected in normal samples, but were marginally increased in tumors. Moreover, the negative

correlation of RARB2 and RARB4 transcript levels were observed in tumor samples. Khuri et

al, (2000)

showed an unexpected worse outcome in a subset of non–small-cell lung cancer

patients presenting high levels of RARB assessed by in situ mRNA hybridization. The authors

suggested that one possible explanation for their findings was the detection of RARB4 mRNA

isoform in a subset of tumor samples.

In the present study, cytoplasmic RARβ, but not nuclear staining, was statistically

associated with disease recurrence in prostate cancer patients. In addition, patients with

positive tumors for cytoplasmic RARβ showed statistically higher probability of biochemical-

recurrence as demonstrated in survival analysis. Further multivariate analysis pointed out

cytoplasmic RARβ, besides the high levels of PSA and seminal vesicle invasion (two well

established markers for worse prognosis), as an independent prognostic marker associated

with disease recurrence. As the RARβ2 and RARβ4 isoforms differ only in the N-terminal

portion, it is reasonable to suggest that the monoclonal antibody used in IHC reactions

recognizes a common epitope from the two proteins. Therefore, it suggests that cytoplasmic

RARβ protein detected in prostate tumors may actually refer to RARβ4 isoform.

Another isoform named RARβ5 that lacks the A, B and part of C- domains of RARβ2

was also described.

The mRNA of RARB5 isoform was detected in normal, pre-malign and

malign breast cancer cell lines, but the protein assessed by Western blot was mostly expressed

in ER-negative breast cell lines.

In addition, there is a report of RARB5 mRNA expression

in prostate cell lines (PC-3 and LNCaP).

It has been suggested that RARβ5 isoform can

compete with other retinoic acid receptors, such as RARβ2, and then modulate the gene

transcription and signaling mediated by RARs. In addition, up-regulation of RARβ5

expression may occur in the early stages of carcinogenesis, as demonstrated in mammary

carcinogenesis, and may correlate with suppression of RARβ2 expression.

Cumulative evidences have suggested that the RARβ4 isoform, located in cytoplasmic

and nuclear compartments, either may be an oncogene or may have oncogenic effects.

The

current knowledge about the RARβ isoforms indicates that the present results are better

explained by the presence of RARβ4 isoform.

CONCLUSIONS

This study demonstrated the RARB promoter hypermethylation was associated with

gene silencing in prostate carcinomas. Unexpectedly, it was detected cytoplasmic RARβ

protein expression in tumor samples associated with worse outcome, which in light of the

current knowledge can be the RARβ4 isoform. Further studies might to contribute to better

understand the complex role of retinoic acid pathway in prostate carcinogenesis and

ultimately may have clinical relevance in selecting patients that may benefit from treatment

with retinoids in clinical trials.

ABBREVIATIONS AND ACRONYMS

PCa – Prostate Carcinoma

NNP - Non-neoplastic prostate tissue

AdjP - Adjacent non-neoplastic prostate tissue

RRP - Radical retropubic prostatectomy

PSA – prostate specific antigen

MSP - Methylation Specific- Polymerase Chain Reaction

qRT-PCR – quantitative Real-Time reverse transcription- polymerase chain reaction

mRNA – RNA messenger

TMA - Tissue microarray

IHC – immunohistochemistry

BRFS - Biochemical recurrence-free survival

RAR - Retinoic acid receptor

HPRT - Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase

PC-3 – prostate cancer cell line

LNCaP - Human prostate adenocarcinoma cell line

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP), Brazil. The authors would like to thank Greicy Helen Ribeiro Gambarani

and Shadia Muhammad Ihlaseh, for their expert technical assistance.

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Table 1. Clinicopathological features of the prostate carcinoma (PCa) patients, non-neoplastic prostate tissue (NNP) and adjacent non-neoplastic

prostate tissue (AdjP) groups evaluated by MSP approach, quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry (IHC)

analyses.

Variable

DNA Methylation Analysis - MSP

Gene Expression - qRT-PCR

Protein Expression - IHC

PCa NNP

PCa AdjP

(n=68)

(n=27) (n=73)

(n=15)

(n=141) (n=40)

Age (years)

Median (range) 65 (50 - 84) 66 (47-85)

62 (43 - 79) 65 (52 - 75)

63 (41 -75) 63 (44 - 75)

Follow-up (months)

Median (range) 41 (4 - 81) 63 (11 – 81)

31 (1 - 93) 13 (1- 46)

87 (27- 161) 118 (21 - 162)

PSA (ng/mL)

Median (range)

8.1 (0.2

987)

5.30 (0.58

18.59)

7.5 (1.8

–

37.95)

8.1 (3.97

28.64)

9.2 (1.20

–

310)

9.8 (2.1

–

36.4)

Gleason score

2 - 4 3 -

- -

5 -

5 -7 55 -

66 -

129 -

8 - 10 10 -

7 -

Pathological staging

I - -

- -

II 32 -

34 -

67 -

III 25 -

34 -

66 -

IV 4 -

5 -

8 -

ND (biopsies)

Lymph node metastasis

Absent 58 -

72 -

136 -

Present 2 -

1 -

5 -

ND (biopsies)

Recurrence risk

Low 5 -

5 -

8 -

Moderate 23 -

26 -

58 -

High 32 -

42 -

75 -

ND (biopsies)

Metastasis at diagnosis

Absent 67 - 73 - 141 -

Present

In 30 PCa cases, methylation and q-RTPCR analysis were done in matched samples.

In 10 cases of Adj group, methylation and q-RTPCR analysis were done in matched samples.

The PSA values in PCa and AdjP groups refer to the last preoperative and last results, respectively.

According to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology TM: Prostate Cancer, Version 2. 2007

ND - not determined.

Table 2. SFN, RARB and RASSF1A methylation patterns in prostate carcinoma (PCa) and

non-neoplastic prostate (NNP) tissues.

Genes

Methylation

P value* OR (CI

95%

)

Positive (%) Negative (%)

SFN

0.75 0.67 (0.18 - 2.51)

PCa (n=39) 31 (79) 8 (21)

NNP (n=27) 23 (85) 4 (15)

RARB

< 0.0001

8.09 ( 2.72 – 24.00)

PCa (n=68) 61 (90) 7 (10)

NNP (n=27) 14 (52) 13 (48)

RASSF1A

0.0017

5.53 (1.77 - 17.24)

PCa (n=67) 59 (88) 8 (12)

NNP (n=21) 12 (57) 9 (43)

* Fisher exact test; OR – odds ratio; CI

95%

- confidence interval of 95%.

Table 3. RARβ (nuclear and cytoplasmic) and RASSF1A protein expression detected by immunohistochemistry (IHC) in prostate carcinoma

(PCa) and adjacent non-neoplastic prostate (AdjP) tissues.

Samples

RARβ (nuclear)

P value

RARβ (cytoplasmic)

P value

RASSF1A

P value

n (%) n (%)

n (%)

Positive Negative Positive Negative Moderate

Weak

PCa 46 (34) 88 (66)

0.0007

28 (21) 106 (79) 0.118 4 (3) 137 (97)

0.577

AdjP 22 (67) 11(33) 3 (9) 30 (91) 0 40 (100)

Chi-square test;

Fisher exact test

Table 4. Univariate analysis of biochemical recurrence-free survival (BRFS) in prostate

cancer patients.

Variable N 5 years BRFS (%) P value

RARβ (cytoplasmic)

0.002

Negative

100 58

Positive 28 29

RARβ (nuclear) 0.363

Negative 84 43

Positive 44 59

Age (years)

0.757

<55

101

≥55 27 56

Preoperative PSA (ng/mL)

<0.001

<20.0 108 59

≥20.0 17 6

Pathological staging

0.059

II 67 62

III 61 39

Gleason score

0.006

<7(3+4) 113 55

≥7(4+3) 15 27

Recurrence risk

0.059

Low/moderate

67 62

High 61 39

Angiolymphatic invasion

0.224

Negative 104 52

Positive 24 46

Capsular invasion

0.075

Negative 60 61

Positive 68 42

Margins

0.007

Negative 91 60

Positive 37 29

Seminal vesicle invasion

<0.001

Negative 118 55

Positive 10 10

Neoadjuvant treatment

<0.001

Negative 107 57

Positive 21 24

Log-rank test.

According to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology TM: Prostate

Cancer, Version 2. 2007

Table 5. Multivariate analysis for biochemical recurrence-free survival in prostate cancer

patients (n=128)

Variable P value

HR (CI

95%

)

Cytoplasmic RARβ (positive versus negative)

0.019

1.891 (1.112- 3.216)

Preoperative PSA (≥20ng/ml versus <20ng/ml)

<0.001

3.877 (2.077- 7.236)

Seminal vesicle invasion (positive versus negative)

0.005

3.126 (1.398- 6.988)

Cox regression model adjusted for neoadjuvant treatment; HR – hazard ratio; CI

95%

–

confidence interval of 95%.

LEGENDS

Figure 1. RARβ (A-F) and RASSF1A (G-J) transcript and protein expression in prostate

carcinomas (PCa) and in adjacent non-neoplastic prostate (AdjP) tissues. The mRNA relative

quantification values for RARB (A) and RASSF1A (G) genes are shown in log scale. RARβ

IHC results: nuclear immunostaining in normal prostate tissue (B); negative PCa sample (C);

positive cytoplasmic PCa sample (D); concurrent cytoplasmic and nuclear positive staining in

PCa tissue (E); vascular invasion by tumor cells showing cytoplasmic RARβ protein

expression (F). RASSF1A IHC results: heterogeneous protein expression in normal prostate

tissue showing areas with weak and moderate cytoplasmic immunostaining (H); weak (I) and

moderate (J) protein expression in PCa tissues.

Figure 2. Biochemical recurrence-free survival (BRFS) curves according to (A) nuclear

(P=0.363) and (B) cytoplasmic (P=0.002) RARβ immunostaining in prostate cancer samples.

P values were determined by Log-rank test.

ARTIGO 2

ARTIGO 2ARTIGO 2

ARTIGO 2

CDH1 METHYLATION PATTERN AND HETEROGENEOUS E-CADHERIN

EXPRESSION IN PROSTATE CANCER

Flávia Cilene Maciel da Cruz Alves

a,b

, Sandra Aparecida Drigo

, Cláudia Aparecida Rainho

Fabíola Encinas Rosa

, João Lauro Viana de Camargo

, Francisco Paulo de Fonseca

, Fernando

Augusto Soares

, José Carlos Souza Trindade Filho

, Maria Aparecida Custódio Domingues

Silvia Regina Rogatto

Department of Pathology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao Paulo, Brazil

NeoGene Laboratory, Department of Urology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao

Paulo, and AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao Paulo, Brazil

Department of Genetics, Biosciences Institute, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao

Paulo, Brazil

Department of Pelvic Surgery, AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao

Paulo, Brazil,

Department of Pathology, AC Camargo Cancer Treatment and Research Center, Sao Paulo,

Brazil

Department of Urology, Sao Paulo State University, Botucatu, Sao Paulo, Brazil

*Corresponding author:

Silvia Regina Rogatto, PhD

NeoGene Laboratory, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo

Rua Professor Antonio Prudente, 211, Liberdade, São Paulo, Brazil

CEP: 01509-010

Phone: 55 11 21895163 Fax: 55 11 21895163

e-mail: [email protected]p.br and silvia.rogatto@hcancer.org.br

Supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brazil.

Running title: CDH1 methylation and E-cadherin expression in prostate cancer.

Keywords: CDH1, methylation, prostate cancer, E-cadherin expression.

BMC Cancer (IF: 2.71)

ABSTRACT

Background: DNA methylation is one of the epigenetic mechanisms that can underlie the

disruption of cellular signaling pathways in prostate cancer (PCa). The CDH1 gene, encodes

the protein E-cadherin, involved in the cell adhesion and responsible for the preservation of

normal tissue architecture. In human carcinomas, including prostate cancer, the

hypermethylation and loss of expression of E-cadherin has been correlated with worse

prognosis parameters. The aim of this study was to investigate if the CDH1 methylation status

could predict the presence of cancer in prostate biopsies by comparing PCa and non-

neoplastic prostate (NNP) tissues from cancer-free patients. In addition, the associations of

methylation pattern and protein expression and comparison with clinicopathological features

were also evaluated.

Methods: DNA methylation pattern was assessed by Methylation-Specific Polymerase Chain

Reaction (MSP), and protein expression by immunohistochemistry (IHC) in a series of 39

PCa and 27 non-neoplastic prostate tissues (NNP) and in 147 samples (121 PCa and 26

adjacent non-neoplastic prostate tissues -AdjP) in a tissue microarray platform. The data were

correlated with clinicopathological features.

Results: There was no significant differences between the CDH1 promoter hypermethylation

in PCa (56%) and age-matched NNP (56%) samples. Furthermore, none association was

found between hypermethylation and protein expression in matched PCa and NNP samples.

Absence of association between methylation status of the CpG dinucleotides interrogated by

the MSP approach and protein expression was confirmed in further MSP analysis in distinct

tumor cells isolated by laser microdissection capture (LMC) according to protein expression

patterns. Heterogeneous protein expression patterns were detected in a subset of tumor

samples (7 out of 33), in which weak and moderate expression was concomitantly detected in

different tumoral areas. In six out of these seven cases it was detected high Gleason score and

three of them presented worse outcome (biochemical recurrence). Protein analysis in a large

number of patients (TMA) showed no association with any prognostic clinicopathological

parameter.

Conclusion: The absence of association between the methylation and protein expression

detected in this study suggests that the CDH1 promoter hypermethylation is not an exclusive

mechanism for E-cadherin silencing. Heterogeneous protein expression patterns were detected

in a subset of samples probably due the epigenetic plasticity that occurs during the

carcinogenesis process.

BACKGROUND

Prostate cancer (PCa) is one of the leading causes of morbidity and mortalilty from cancer

among men in Western countries [1, 2]. The molecular mechanisms underlying its

development and progression remain poorly understood. It has become evident that both

genetic and epigenetic changes play a role in the development and progression of human

prostate cancer [3, 4].

Epigenetic modifications, defined as heritable changes in gene expression that are not

attributable to changes in the primary DNA sequence, conventionally includes DNA

methylation, post-translational histone modifications (as acetylation, methylation,

phosphorilation) as well post-transcriptional control by small RNAs [4]. The most studied

epigenetic modification is the cytosine methylation of DNA within the CpG island. DNA

hypermethylation has been consistently associated with many tumor types since dense

methylation in CpG dinucleotídes located at promoter regions can lead to the silencing of

critical genes involved in several cellular pathways, such as hormonal responses, tumor-cell

invasion, cell cycle control and DNA damage repair [4].

In prostate cancer, inappropriate epigenetic silencing of specific genes can contribute to tumor

initiation, progression, invasion, and metastasis [3, 4, 5, 6]. It has been shown that

hypermethylated genes can be associated with higher pathological grade and clinical stage

and androgen independence [4, 7].

E-cadherin, one of the major intercellular epithelial cell adhesion protein, mediates the

epithelial cell-cell interactions through calcium-dependent hemophilic interaction of its

extracellular domain [8]. Moreover, E-cadherin maintains the epithelial cellular adhesion and

integrity [9]. There is cumulative evidence that E-cadherin down-regulation correlates with a

strong invasive potential, resulting in poor prognosis in human carcinomas [10, 11, 12]. In

addition, it has been suggested that CDH1 (cadherin 1, type 1, E-cadherin, epithelial) is a

tumor suppressor gene showing negative regulation during the course of cellular invasion

[13].

Several mechanisms have been suggested for the repression of E-cadherin function during

carcinogenesis that include promoter methylation, mutations, transcriptional repression by

snail and slug, ubiquitination, and protein degradation [14, 15, 16, 17, 18]. Allelic loss has

also been reported as a mechanism contributing to reduction or loss of E-cadherin expression

in prostate carcinomas [19, 20]. However, the epigenetic silencing of CHD1 gene has been

found to be the most common event related to E-cadherin down-regulation in epithelial

carcinomas, including prostate cancer [21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

In prostate carcinomas, the hypermethylation frequencies of the CDH1 gene have been

reported as elevated [24, 25] as well as in low frequencies [26, 27]. DNA hypermethylation

and E-cadherin protein down-expression has been associated with adverse clinicopathological

features, such as tumor size, pathological stage, and PSA levels [25, 26, 27, 29, 30, 31].

Taken into account that hypermethylation is an important mechanism involved in gene

silencing and the dynamic nature of these epigenetic alterations which promote tumoral

heterogeneity, we first evaluated the methylation status and protein expression level of CDH1

gene in prostate carcinomas and non-neoplastic prostate tissues. Further, protein analysis was

conducted in prostate samples from a large and independent cohort of PCa patients and the

findings were associated with clinicopathological parameters and with disease recurrence.

METHODS

Patients

The study included 160 prostate carcinomas and 53 non-neoplastic prostate samples obtained

from patients followed prospectively at the Clinical Hospital, Medical School, Sao Paulo

State University (2001 to 2007), Botucatu, Sao Paulo, and at the AC Camargo Cancer

Hospital (1993 to 2002), Sao Paulo, Brazil. All patients were advised of the procedures and

provided written informed consent. The Human Research Ethics Committee approved this

study (CONEP # 304/2000).

Sixty-six men (Group I) were assembled consecutively because of abnormal PSA values

and/or suspected PCa after digital rectal exams. Systematic ultrasound-guided needle biopsies

obtaining 3-10 cores (median of 6 cores) were done by using an 18-gauge, spring-loaded

biopsy device. After histopathological evaluation, the subjects were divided into two groups

according to the presence of PCa (n=39) or absence of neoplasia (Non-Neoplastic Prostate,

NNP, n=27) (Table 1). There were no evidences of prostate malignancies in NNP patients

during the follow-up period (median=63 months, Table 1). Methylation analysis was

conducted in all PCa and NNP samples. Matched formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE)

prostate tissues blocks from 28 PCa and 20 NNP cases were obtained for protein analysis.

An independent cohort of PCa patients was evaluated for protein expression (Group II). FFPE

tissue blocks retrieved from the archives of the Department of Pathology of AC Camargo

Hospital (Sao Paulo, Brazil) from 121 PCa patients and 26 adjacent non-neoplastic tissues

(AdjP) from PCa patients were arranged in a tissue microarray (TMA). Two normal (N)

prostate tissues (histopathologically confirmed with absence of PCa, intra-epithelial neoplasia,

benign prostate hyperplasia, or prostatitis) from necropsies were also obtained. The ages were

40 and 49 years old for N1 and N2 patients, respectively (Table 1).

All samples evaluated were from untreated patients. Radical retropubic prostatectomy (RRP)

was the primary treatment in 154 patients. Six cases did not undergoing RRP due to advanced

age or metastasis at diagnosis; the biopsy samples collected from these patients were

evaluated by MSP (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction). Four out of six

patients were treated with radiotherapy and/or hormone blocked. Twenty-one PCa patients

received radiotherapy and/or hormone therapy before RRP. In these cases, biopsies samples

evaluated were taken before neoadjuvant treatment. Tumor histological grading was

performed according to Gleason scores [32] and stage according to TNM [33, 34]. Recurrence

risk (low, moderate and high) was estimated for PCa patients according to NCCN Clinical

Practice Guidelines in Oncology TM: Prostate Cancer.

DNA extraction

The genomic DNA from prostate tissues was obtained by standard sodium dodecyl

sulfate/proteinase K digestion, followed by phenol/chloroform extraction and ethanol

precipitation. DNA samples were quantified using the NanoDrop® ND-1000

Spectrophotometer v.3.0.1 (Labtrade, Wilmington, USA).

Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction (MSP) Analysis

Genomic DNA (2 µg) were treated with sodium bisulfite using an established protocol. The

methylation pattern within the CpG island of the CDH1 gene (sequence -126 bp to +144 bp

relative to transcription start, GenBank accession number D49685) was determined using a

nested-PCR approach. Specific primers for methylated and unmethylated sequences of CDH1

gene and PCR conditions were previously described [35].

To determine the specificity of the MSP primers for methylated and unmethylated amplicons,

DNA from lymphocytes of healthy volunteers treated with SssI methyltransferase (New

England Biolabs, Beverly, MA, USA) was used as positive controls for methylated alleles.

The reaction was performed in a total volume of 50µl containing 10µg of genomic DNA, 10U

of SssI methylase, 160mM of S-adenosyl-metionina, 50mM of NaCl, 10mM of Tris-HCl,

10mM of MgCl

1mM of DTT pH 7.9, during 18 hours at 37ºC. Whole genome amplification

of the same DNA samples obtained from lymphocytes was used as unmethylated allele

control, as described by Umetani et al. (2005) [36]. Methylated and unmethylated controls

were then subjected to bisulfite modification and MSP analysis.

Immunohistochemistry (IHC) analysis

Archival FFPE prostate tissues obtained from RRP (PCa and adjacent non-neoplastic

samples) were retrieved from the AC Camargo Cancer Hospital. The PCa cohort and AdjP

specimens were sampled using a 0.6-mm diameter tissue core distributed on tissue microarray

slide. Adjacent hematoxylin and eosin (H&E) stained section was reviewed by two

pathologists to determine the presence and extent of morphologically representative areas of

the original tumors in each tissue core. Reassessment of Gleason grading in a contiguous

H&E stained tissue microarray section assured the presence of prostate adenocarcinoma and

the fidelity of the intended tissue microarray core. Core biopsies were extracted from the

defined areas using a Tissue Microarrayer (Beecher Instruments®, Silver Springs, USA).

Tissue cores from each specimen were punched and arrayed on a recipient paraffin block.

Each core was spaced 0.2mm apart. After cutting sections from the recipient block and

transferring these with adhesive tape to coated slides for subsequent UV crosslinkage

(Instrumedics Inc®, Hackensack, NJ), the slides were dipped in a layer of paraffin to prevent

oxidation and stored in a freezer at -20

C. For conventional slides, FFPE tissue blocks from

33 PCa, 20 NNP and two normal prostate samples were freshly cut (3µm) and the sections

were mounted on slides with organosilane (3-aminopropyl triethoxy-silane) (Sigma-Aldrich

Co. St. Louis, MO, USA).

Conventional and TMA sections were deparaffinized in xylene, rehydrated in graded ethanol

solutions. Briefly, the sections were deparaffinized, rehydrated in graded ethanol solutions.

Thereafter, sections were treated with endogenous peroxidase quenching (0.3% H2O2 for

15min) and blocked for avidin/biotin (DAKO Biotin Blocking System® Dako Corporation,

Carpinteria, CA) and protein (DAKO Protein Block Serum-Free® Dako Corporation), 20min

each prior to primary antibody incubation. Incubation with the primary antibody diluted in

PBS (phosphate-buffered saline) was conducted overnight at 4oC for anti E-cadherin (Dako,

Carpinteria, CA; dilution 1:400). The sections were washed and incubated with secondary

antibody (Post Primary Block-Novocastra), for 30min followed by the polymer detection

system (NovoLink Polymer- Novocastra) for 30min at room temperature. Reactions were

developed with a solution containing 0.6mg/ml of 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride

(DAB, Sigma, St Louis, MO) and 0.01% H

and then counter-stained with Mayer’s

hematoxylin, dehydrated and mounted with a glass coverslip. Positive (breast tissue) and

negative controls were included in all reactions. Two normal prostate specimens were also

included as controls. Tumors were classified in four-step scale (scores 0 to 3) based on

intensity of staining and the membrane pattern, as follows: score 3: high intensity (4+) and

continuous staining of membrane; score 2: high to moderate intensity (3+) and focal or

discontinuous membrane staining; score 1: moderate intensity (2+) and focal or

discontinuous membrane staining; score 0: low intensity (1+) and focal or discontinuous

membrane staining. The analysis was done by one observer (MACD) and the samples were

blindly scored with respect to outcome and clinical patient data.

MSP analysis on Laser Capture Microdissected (LCM) cells

Seven cases that presented heterogeneous E-cadherin staining patterns were chosen to LCM

procedure according to the E-cadherin scores and further MSP analysis. In one case, the

tissue block was exhausted. Two cases with different E-cadherin protein expression scores in

tumor cells and adjacent non-neoplastic tissue was also included.

Specific tumor areas and adjacent non-tumoral tissue according to E-cadherin

immunostaining were laser capture microdissected using the PixCell® II Laser Capture

Microdissection (LCM) System (Arcturus Engineering, Mountain View, CA). In order to

obtain a pure and homogeneous sample preparation of each area, serial sections with 5-10

µm were performed from archival paraffin embedded tissue and were mounted on

microscope slides. According to E-cadherin status, regions were identified and marked under

light microscopy. Using this section as a template, the remaining slides were laser-capture

microdissected (LCM), as described above. Approximately 9,000 cells for each marked area

were captured and further processed to DNA extraction and MSP analysis as described

previously.

Data Analysis

Chi-square or Fisher exact test were applied to determine the strength of association between

the categorical variables with 5% of significance. Clinical stage IV patients or patients with

distant metastasis at diagnosis were excluded from the analyses related with recurrence risk or

biochemical-recurrence. For E-cadherin IHC analysis, the dichotomous variables were

defined prior to any analysis based on the weak (scores 0 and 1) or moderate/high (scores 2-3)

expression levels. The statistical analyses were performed using GraphPad Prism3 (San

Diego, CA, USA) and SPSS version 15.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) for Windows.

RESULTS

This study was conducted in two parts. Firstly, to determine if the methylation of the promoter

region of the CDH1 gene could predict the presence of cancer at prostate biopsies. The

presence of methylated alleles was compared between PCa and non-neoplastic prostate (NNP)

tissues obtained from men paired by age (group I). The median age of the PCa and NNP

patients was 67 and 66 years old, respectively (Table 1). No significant differences were

observed for CDH1 promoter methylation status in PCa and NNP samples. The CDH1

promoter hypermethylation were detected in 22 out of 39 (56%) PCa samples and in 15 out of

27 (56%) NNP tissues (P=0.95). The normal prostate samples showed unmethylated CDH1

status for N1 and methylated for N2 sample (data not shown).

The E-cadherin protein expression was assessed in 35 PCa and 20 NNP samples (Group I).

Twenty eight out of 35 PCa cases showed homogeneous immunostaining patterns. The

comparison between these tumor (n=28) and NNP samples (n=20) showed statistically higher

levels of E-cadherin expression in PCa samples (P<0.001, Table 2, Group I). Exclusively in

PCa samples was observed markedly increased E-cadherin immunostaing (score 3) and in

high frequency (93%). Reduced (score 0-1) protein expression was detected in all NNP

tissues and in 7% of PCa samples evaluated. The two normal prostate samples (N1 and N2)

showed reduced E-cadherin expression (score 1, Figure 1). Adjacent non-neoplastic prostate

tissues were also evaluated for protein expression in three cases (cases 1, 2 and 7), and in all

of them it was observed score 0 for E-cadherin expression. No significant association was

observed between protein expression and methylation status in PCa and NNP tissue samples

(Figure 2).

Distinct protein expression scores were detected in two tumor areas in seven out of 35 tumor

samples (Table 3, Figure 1E). These cells from different areas showing distinct

immunostaining patterns were microdissected and evaluated by DNA methylation status. In

two cases (cases 2 and 4), it was observed immunostaining scores 3 and 1 and methylation

status was negative and positive, respectively. Case 5 showed score 3 and score 0 in different

100

areas, and negative CDH1 methylation status. Table 3 shows the details of comparison

between IHC and DNA methylation status.

Due to this intra-tumoral heterogeneity of E-cadherin staining and the discrepancies between

protein expression and DNA methylation, a subgroup of tumors and adjacent non-neoplastic

prostate tissues were laser-capture microdissected according to the E-cadherin expression

scores. These cells were then analyzed for MSP in order to investigate if the absence of

correlation was due to contamination of DNA sampled with stromal cells or due to

hypermethylation mosaicism. The Figure 3 shows an illustrative case with tumoral areas

presenting distinct protein expression levels and adjacent non-neoplastic tissue before and

after the microdissection.

CDH1 gene methylation status evaluated in LCM samples was not associated with E-cadherin

protein expression (Table 4). All cases microdissected that presented score 3 immunostaining

areas showed methylated CDH1 gene. However, two microdissected adjacent non-neoplastic

tissues showed concordant results with protein expression score 0 and CDH1 gene

methylation. In addition, cases 2, 5 and 6 showed different methylation status in the prostate

specimens sampled before and after the microdissection. In these cases, absence of

methylation was primarily observed in the prostate tissue samples (before LCM); but, CDH1

gene methylation was observed in all of LCM tissues from these cases (all of them presenting

protein expression score 3). Interestingly, case 5 showed methylated alleles in two different

tumor areas with different IHC scores (area 1: score 3 and area 2: score 0).

Among the PCa group, clinical and pathological characteristics, such as age, family history of

cancer, PSA levels, Gleason score, pathological stage, lymph nodes metastasis, risk of

recurrence, surgical margins, extra-prostatic extension, vesicular invasion, lymphovascular

invasion, seminal vesicle invasion, and biochemical recurrence were compared with CDH1

methylation status and E-cadherin protein expression (Group I). No statistically significant

association was observed between CDH1 hypermethylation and protein expression and all

these parameters in Group I cases (data not shown). It was also observed that nine out of 39

PCa patients showed biochemical recurrence (BC) after radical prostatectomy, and in three of

them (cases 1, 2 and 7), the tumors presented heterogeneous E-cadherin protein expression

(Table 3). In addition, six out of seven cases (86%) with heterogeneous pattern showed high

Gleason scores [≥7 (4+3)] compared with nine out of 28 (32%) tumors with homogeneous

pattern samples (P= 0.0274, Fisher exact test, data not shown). Possibly due to small number

of cases, it was not possible to detect significant association between protein expression

101

patterns and other clinical and pathological parameters (data not shown). With the aim to test

this hypothesis, E-cadherin protein expression was evaluated in an independent group of

patients (Group II) in TMA slide composed by 121 PCa and 26 adjacent non-neoplastic

prostate tissues. None significant difference in protein expression was observed between PCa

and AdjP tissues (Table 2, Group II). However, it was detected differences in protein

expression patterns in Group II and Group I cases. First, PCa samples with lower E-cadherin

expression (score 0-1) were more frequently detected in Group II than in PCa samples from

Group I (31% and 7%, respectively). Also, the E-cadherin protein expression in AdjP tissues

was similar to PCa samples (group II), but was different from the NNP tissues evaluated in

Group I. In 54% of AdjP tissues were observed high protein levels (score 2-3), but none NNP

sample showed this protein expression pattern. Importantly, normal prostate tissue samples

were included as controls in both group of samples (I and II), and it was observed similar

protein expression patterns. The normal prostate tissues showed weak expression of E-

cadherin (score 1, Figure 1A). The E-cadherin protein expression patterns in PCa samples

from group II showed no association with clinical and histopathological parameters evaluated

(Table 5).

DISCUSSION

E-cadherin, the protein codified by CDH1 gene, is involved in cadherin-catenin cell adhesion

system, responsible for maintaining the normal architecture of tissues [37]. Some mechanisms

have been implicated in E-cadherin inactivation in cancer cells, including the transcriptional

silencing by CpG-island-promoter hypermethylation. Decreased E-cadherin expression is

involved in loss of cellular adhesion leading to tumor invasion and mestastasis [38].

In the present study, based on a nested MSP approach, equal frequencies of CDH1 gene

hypermethylation were detected in PCa and NNP samples (56%). Normal prostate samples

obtained from 40- and 49-year-old men after necropsy, presented an unmethylated and

methylated CDH1 pattern, respectively. Varying frequencies of CDH1 gene promoter

methylation have been detected in prostate tumors [reviewed in 39]. In agreement with the

findings described in this study, lack of association of CDH1 hypermethylation between

prostate cancer and non-neoplastic tissues have been published [30, 40, 41, 42, 43]. These

findings indicate that CDH1methylation is not a specific event in prostate tumor phenotype

[43]. Hypermethylation in normal tissue as detected in the present study are in agreement with

results previously reported by Bornman et al. (2001) [44]. The authors detected a similar

102

pattern for CDH1 hypermethylation in normal bladder tissue from patients older than 70

years.

Conversely, other studies showed that CDH1 hypermethylation was correlated with prostate

carcinomas compared with non-malignant prostate samples [24, 26, 45]. Conflicting data

regarding the CDH1 methylation patterns in prostate tumors can be explained in part by the

different CpG sequences evaluated, with preferential methylation at some CpG sites and not

at others, and also due to different methodologies applied, considering the choice of primers

and PCR conditions [45, reviewed in 46]. The nested MSP used in the present study is a high-

sensitivity method that is able to detect methylated DNA molecules in less than 5% of total

DNA [47] or one methylated allele in the presence of 1000-2000 unmethylated alleles [48].

Theoretically, tiny amounts of DNA from epigenetically altered cells can be detected in a

background of hundreds of normal cells. The fact that epigenetic changes are found so early

in tumorigenesis, and even in normal tissues before tumors arise, indicates that these changes

could be used to monitoring the risk to cancer development. It has been proposed an

epigenetic progenitor model for cancer origin, in part based on the fact that global epigenetic

changes precede the initial mutations in cancer [49]. Epigenetic changes must precede the

earliest genetic alterations since they are always found, even in benign neoplasm.

Some groups have reported the association of higher CDH1 methylation frequencies in

prostate tumors with more aggressive characteristics, such as tumor grade [25, 27], and high

levels of PSA [26, 30]. In the present study, no association was found between CDH1

methylation status and clinicopathological parameters. Accordingly, other studies found

absence of correlation between CDH1 hypermethylation and age, tumor grade, stage or

Gleason score [24, 43, 45].

Interestingly, when E-cadherin protein expression was assessed, a significant difference was

detected between tumor and non-neoplastic tissues from cancer-free patients; with higher

expression detected in PCa (P<0.0001). However, in TMA analysis none difference was

detected between tumor tissues and adjacent non-neoplastic prostate tissues from PCa

patients. Moreover, E-cadherin protein expression patterns were different between AdjP and

NNP tissues. These data suggest that E-cadherin protein expression can be altered in pre-

malignant tissues, supporting the hypothesis that morphologically normal cells in the context

of tumoral tissue may present altered gene regulation. Heterogeneous E-cadherin expression

pattern have been previously reported [24, 29, 50]. In agreement with our data, Rubin et al.

(2001) [29] analyzed benign prostate tumors and clinically localized metastatic hormone

103

refractory PCa by immunohistochemistry in a TMA platform. The authors found a high (82%)

frequency of E-cadherin intensity staining, (defined as 70% or greater membranous staining)

in prostate carcinoma. However, several studies have associated negative E-cadherin

immunostaining with prostate tumors, and have reported reduced E-cadherin expression in

high grade, Gleason score, pathological stage, and overall survival [24, 25, 50, 51, 52, 53]. In

the current study, no statistically significant correlation was observed between protein

expression and clinicopathological data. According to Rubin et al (2001) [29], heterogeneous

staining probably represents a common artifact seen in immunostaining of standard slides.

The authors observed aberrant E-cadherin protein expression in the range of 10% to 20% for

both clinically localized and advanced prostate cancer, and concluded that differences in E-

cadherin protein expression in prostate cancer may be attributable to tissues used for

evaluation (frozen versus formalin fixed), types of cases used, and patient treatment.

In this study, heterogeneous staining patterns of E-cadherin were observed in 20% of the PCa

samples from Group I. Umbas et al. (1992) [54] evaluated prostate tumors by IHC and

detected three staining patterns: uniformly positive; uniformly negative; and heterogeneous

staining composed by a mixed population of E-cadherin positive and negative cells. The

authors noted that for the most differentiated cancers (Gleason scores 4-5), E-cadherin was

strongly and uniformly positive. However, in less well differentiated to poorly differentiated

tumors (Gleason scores 6-10), they observed a trend of increasing percentage of tumors with

heterogeneous or absent staining for E-cadherin. The authors concluded that these data

indicate that a mixed or heterogeneously composed tumor may have increased invasive

potential. Similar results were found in the current study. Heterogeneous pattern was

associated with poorly differentiated tumors (Gleason scores 8 and 9) in comparison with

homogeneous pattern samples found in poorly differentiated tumors (P=0.0041, Chi Square

test, data not shown). Nevertheless, in TMA analysis, none association was detected between

Gleason score and E-cadherin protein expression. A plausible explanation for these data is

that the heterogeneity of E-cadherin expression cannot be assessed in small cores of tumor

tissues. Although the valuable contribution of TMA in large-scale protein expression analysis,

for certain proteins that exhibit heterogeneous expression patterns different approaches should

be employed.

CDH1 gene hypermethylation and protein expression were not correlated in tumor samples

and in NNP tissues. Hypotheses to explain discordant results between both methodologies

include the effect of normal cells that may have influenced the amplification and the

104

intratumoral heterogeneity or variation in tumor content when it was fixed and processed for

histological examination. In addition, the sensitivity of MSP technique to detect gene

silencing is higher when compared to the ability of immunohistochemistry to show significant

loss of protein expression. This could explain the presence of CDH1 hypermethylation in

tumor with strongly positive expression of E-cadherin. Even in the subgroup of carcinomas

and adjacent non-neoplastic prostate tissues that were laser microdissected and analyzed once

more by MSP, the results were still discrepant. Conflicting results regarding correlation of

CDH1 hypermethylation and decreased E-cadherin protein expression have been published.

Li et al. (2001) [25] showed higher frequency of CDH1 methylation associated with absence

or reduced E-cadherin immunostaining. Kallakury et al. (2001) [24] showed loss of E-

cadherin immunostaining in five out eight cases (68%) with CDH1 methylation; however it

was not statistically significant. Graziano et al. (2004) [55] compared methylation and protein

expression of CDH1 gene and observed genotype–phenotype discordance in 8.5% of cases.

They explained their results based on the fact that hypermethylation can occur in a CDH1

allele carrying an inactivating somatic mutation, while the function of the remaining CDH1

allele is preserved; in this case, E-cadherin protein expression is maintained despite a positive

methylation analysis. On the other hand, if somatic mutations inactivate both CDH1 alleles,

and/or alternative molecular mechanisms knock out CDH1, loss of E-cadherin expression can

be found even in unmethylated tumors. Several studies have shown that the expression of E-

cadherin can be controlled by mechanisms other than methylation, such as loss of alleles,

gene mutation, and changes in the structure of chromatin and alterations of specific

transcription pathways regulating the expression of this gene [56, 57].

Aberrant DNA methylation has been considered a frequent and early event in prostate

carcinogenesis. The dynamic nature of epigenetic regulation, leading to intra-tumoral

heterogeneity of gene-specific DNA methylation patterns, varying from allele to allele and

shifting in relation to the tumoral microenvironment, could explain the lack of concordance

between CDH1 methylation status and immunohistochemical scores of E-cadherin

expression. Furthermore, a subset of samples with a heterogeneous protein expression pattern

also demonstrated higher Gleason scores, giving an additional evidence of a more aggressive

behavior. In summary, the DNA methylation analysis of different tumoral areas coupled with

protein expression suggests that methylation associated with loss of E-cadherin expression in

human prostate cancer is heterogeneous, and probably unstable, but reflects the dynamic

phenotypic changes that drives the carcinogenesis process.

105

AUTHORS' CONTRIBUTIONS

SRR, SAD, and CAR conceived of the study, participated in its design, performed the

statistical analysis, and helped to draft the manuscript. FCMCA carried out the molecular

genetic studies, and drafted the manuscript.FPF and JCSTF participated in defining the

casuistic used and helped to draft the manuscript. JLVC, FAS, and MACD carried out the

immunohistochemistry analysis. All authors read and approved the final manuscript.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP), Brazil. The authors would like to thank Greicy Helen Ribeiro Gambarani

and Shadia Muhammad Ihlaseh for their expert technical assistance.

106

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Table 1. Clinicopathological features of the prostate carcinoma (PCa) and non-neoplastic

prostate (NNP) patients from Group I evaluated by DNA methylation and protein expression

(IHC) analyses; and PCa and adjacent non-neoplastic prostate tissues (AdjP) from Group II

evaluated by protein expression.

Clinical variable

Group I

DNA methylation and IHC

analysis*

Group II

IHC analysis

PCa NNP

PCa AdjP

n=39 n=27

n=121 n =26

Age (years)

Median (range) 67 (52 - 84) 66 (47-85)

63 (41 -75) 63 (50 - 72)

Follow-up (months)

Median (range) 57 (4 - 81) 63 (11 – 95)

87 (21- 159.5) 121 (13.8 – 161.7)

PSA (ng/mL)**

Median (range)

7.29 (0.2 –

987.2)

5.30 (0.58-

18.59)

9.2 (1.20 – 310.0)

10.6 (4.4 – 36.4)

Gleason score

2 - 4 3 -

7 -

5 -7 26 -

106 -

8 - 10 10 -

8 -

Pathological staging

I - -

- -

II 20 -

55 -

III 10 -

60 -

IV 2 -

6 -

Unknown 7 -

- -

Lymph node

metastasis

Present 2 -

3 -

Absent 30 -

118 -

Unknown 7 -

- -

Metastasis in

diagnosis

Present 1 -

0 -

Absent

121

* DNA methylation and protein expression analysis in matched samples were done in 33

PCa and 20 NNP patients. ** The PSA values refer to the last preoperative test from PCa

patients and the last PSA test for NNP group.

Table 2. E-cadherin protein expression detected by immunohistochemistry (IHC) in patients

and controls from Group I and Group II.

Group Analysis N

E-cadherin

IHC scores (%)

0 - 1 2-3

Group I

PCa 28 2 (7) 26 (93)

<0.0001

NNP 20 20 (100) 0

Group II

PCa 121 37 (31) 84 (69) 0.168

AdjP 26 12 (46) 14 (54)

Group I - prostate carcinoma (PCa) and non-neoplastic prostate (NNP) samples.

Group II – Pca and adjacent non-neoplastic prostate (AdjP) samples in TMA

* Fisher exact test

Table 3. Prostate carcinomas (Group I) with heterogeneous E-cadherin protein expression detected by immunohistochemistry (IHC): CDH1

gene methylation status; IHC scores in distinct tumor areas and adjacent non-neoplastic tissues (AdjP); and comparison with clinicopathological

parameters.

Cases

CDH1

methylation

status

E-Cadherin IHC score

Clinicopathological Data

Tumor tissue

AdjP tissue

PSA

(ng/mL)

Gleason

score

Stage BCR

BCR

free-survival

(months)

area 1 area 2

1 + 3 2 0 10.5 7 (3+4) II Yes 13

12.1

8 (4+4)

III

Yes

39.3

9 (4+5)

4 + 3 1 NA 12.5 8 (4+4) II No 58

5 - 3 0 NA 7.3 7 (4+3) III No 70

6 - 3 2 NA 6.8 8 (4+4) II No 52

7 + 3 2 0 15.0 9 (4+5) II Yes 19

(+): methylated; (-): unmethylated; NA: not available in the tumor tissue block; BCR: biochemical recurrence.

Table 4. CDH1 methylation status in evaluated in cells obtained by laser-capture microdissection (LCM) according to their respective E-

cadherin expression in prostate carcinomas (PCa) and adjacent non-neoplastic tissues (Group I).

Cases

CDH1 methylation

status in tumor tissues

before LCM

Tumor area 1

Tumor area 2

Adjacent non-neoplastic

tissue

IHC score

CDH1 status in

LCM tissue

IHC score

CDH1 status in

LCM tissue

IHC score

CDH1 status in

LCM tissue

2 - 3 + 1

0 +

4 + 3 + 1

NA NA

5 - 3 + 0 +

NA NA

6 - 3 + 2

NA NA

7 + 3 + 2

0 +

(+): methylated; (-): unmethylated; ND: not determined due to MS reaction failure or exhausted tissue block; NA – not available in the

tumor tissue block.

CDH1 methylation results obtained from tumor tissues before and after laser-capture microdissection (LCM) in distinct tumor areas (1 and

2) according to their IHC scores. CDH1 methylation results from microdissected adjacent non-neoplastic tissues and the respective IHC

score are also showed.

Discordant methylation results between tumor samples before and after laser microdissection (LCM) are highlighted in grey.

Table 5. E-cadherin protein expression pattern and the clinicopathological characteristics in

prostate carcinoma (PCa) patients (n=121) from Group II.

Variables

E-cadherin

P IHC scores (%)

0-1 2-3

PSA (ng/mL)*

0.45

≤ 4.0 4 (3) 5 (4)

> 4.0 33 (27) 77 (64)

ND - 2 (2)

Gleason score

0.63

< 7 (3+4) 23 (19) 56 (46)

≥ 7 (4+3) 14 (12) 28 (23)

Pathological staging

0.18

II 15 (12) 40 (33)

III 21 (17) 39 (33)

IV 1 (1) 5 (4)

Lymph node metastasis

1.00

Negative 36 (29) 80 (66)

Positive 1 (1) 2 (2)

ND - 2 (2)

Recurrence risk

0.47

High 22 (18) 44 (36)

Low/moderate 15 (13) 40 (33)

Margins

0.83

Negative

25 (20) 59 (49)

Positive

12 (10) 25 (21)

Capsular invasion

0.16

Negative

20 (17) 33 (27)

Positive

17 (14) 51 (42)

Angiolymphatic invasion

0.86

Negative

30 (25) 67 (55)

Positive

7 (6) 17 (14)

Seminal Vesicle invasion

0.17

Negative

32 (27) 79 (65)

Positive

5 (4) 5 (4)

Biochemical recurrence

0.67

Negative 17 (15) 34 (29)

Positive 19 (17) 45 (39)

* The PSA values refer to the last preoperative results.

Legends

Figure 1. E-cadherin immunostaining detected in prostate tissues. (A) Normal prostate

sample with score 1 detected in epithelial cells; (B) adjacent non-neoplastic prostate (Adj)

tissue with score 1; (C) prostate carcinoma (PCa) presenting score 2; (D) PCa sample with

score 3; and (E) tumor tissue with heterogeneous protein expression pattern. Detailed distinct

tumor areas, with score 3 (up picture) and score 2 (box followed by bigger arrow).

Figure 2. Distribution of CDH1 gene methylation according to E-cadherin protein expression

in (A) prostate carcinoma and (B) non-neoplasic prostate tissues (Group I).

Figure 3. Laser-capture microdissection (LCM) was performed in prostate samples according

to the E-cadherin protein expression detected by immunohistochemistry (IHC). Illustrative

case (case 2) presenting adjacent non-neoplastic tissue with IHC score 0 (A) and tumor areas

with (B) weak reactivity (score 1) and (C) strong staining (score 3). A1 - B1 - C1:

photomicrography of histological sections before microdissection; A2 - B2 - C2: after

microdissection; A3 - B3 - C3: microdissected cells in the CaPSure that were further

analyzed for CDH1 methylation by MS- PCR

A B

100

0 1 2 3

Frequency (%)

IHC score

CDH1 Methylated

CDH1 Unmethylated

100

0 1 2 3

Frequency (%)

IHC score

CDH1 Methylated

CDH1 Unmethylated

CONCLUSÕES

CONCLUSÕES CONCLUSÕES

CONCLUSÕES

FINAIS

FINAISFINAIS

FINAIS

Alves, Flávia Cilene Maciel da Cruz

Conclusões

• A hipermetilação dos genes RARB e RASSF1A, mas não de SFN e CDH1, se mostrou

significativamente associada aos carcinomas de próstata (CaP) comparados aos tecidos

prostáticos não neoplásicos (PNN), sugerindo que estes genes podem ser considerados como

potenciais marcadores no câncer de próstata.

• Os resultados de amostras pareadas para análise de metilação dos genes RARB e

RASSF1A e de seus transcritos demonstrou que a hipermetilação de RARB, mas não de

RASSF1A, está associada ao silenciamento gênico, com conseqüente diminuição de expressão

dos seus transcritos. Estes resultados foram validados pela análise protéica num grupo

independente de amostras que confirmou a diminuição de RARβ nuclear nos tumores em

relação aos controles. A marcação citplasmática num subgrupo de pacientes, considerada

como um marcador prognóstico nos tumores prostáticos, foi associada com maior risco de

recorrência da doença. É possível que esta marcação citoplasmática se refira a isoforma

RARβ4, que ao contrário de RARβ2 (um supressor tumoral), parece agir como um oncogene.

• A análise pareada entre casos avaliados por metilação do gene CDH1 e expressão

protéica nas amostras de CAP e PNN não mostrou qualquer associação, mesmo após análise

de alelos metilados em células isoladas por microdissecção a laser. Estes dados sugerem que a

metilação do gene CDH1 não é o único ou mais importante mecanismo de silenciamento do

gene.

ANEXOS

ANEXOSANEXOS

ANEXOS

Pesquisador responsável: Silvia Regina RogattoPós graduanda: Flávia Cilene Alves

Fone: (14) 38116436 Fone: (14) 38116436

(14) 38157854 (14) 38145030

[email protected] [email protected]

unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Artigo I. Campus- Botucatu/ Faculdade de Medicina

Departamento de Urologia

Rubião Júnior, s/n - CEP 18618-000 - FONE (014) 3811-6436

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

O NeoGene Laboratório - Departamento de Urologia/UNESP- Botucatu-SP e o Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Unesp de Botucatu-SP (pesquisadores e médicos) desenvolvem pesquisas para

obter um maior conhecimento dos tumores de próstata. Pedimos autorização do paciente na participação do

projeto “Alterações Epigenéticas em Adenocarcinomas de Próstata”. Por meio desta pesquisa é possível

conhecer melhor a doença e, desta forma, oferecer novas possibilidades de diagnóstico e tratamento.

Estas pesquisas exigem materiais a fresco, proveniente das lesões estudadas obtidas no momento da cirurgia,

para que seja possível a análise destas células em laboratório, assim como uma amostra de 5mL de sangue.

Após a obtenção do material, por meio de cirurgia, o material será processado, sendo que um dos fragmentos

será utilizado para diagnóstico histopatológico e outro para a pesquisa, que poderá ser armazenado em freezer

–70

C para continuidade de projeto proposto.

A obtenção deste fragmento não implicará em riscos adicionais à sua saúde ou na extensão do procedimento

cirúrgico. O fragmento de tecido será utilizado no laboratório por códigos de números, preservando assim a

identidade dos pacientes. A inclusão dos resultados em publicação científica será feita de forma a preservar o

anonimato do paciente.

O projeto de pesquisa proposto será previamente apresentado para avaliação pelo Comitê de Ética em

Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Unesp de Botucatu-SP.

Concordando com o uso deste fragmento do modo descrito acima, é necessário esclarecer que o paciente não

terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros, entretanto, você terá sigilo, garantia e direito de acesso

sobre os eventuais resultados desta pesquisa. Esclarecemos que não havendo concordância para a coleta, esta

decisão não influenciará, de modo algum, no tratamento. Caso seja necessária a utilização do material do

paciente em pesquisas futuras, pediremos novamente o termo de consentimento.

No caso de autorização, o documento será feito em duas vias, uma para o paciente e outra para o pesquisador.

________________________________________ _____________________

Nome do paciente ou representante legal Assinatura

Número de Registro (RG) no Hospital:______________________________

Médico responsável:____________________________________________

Botucatu, ________ de ____________________ de 200__.

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