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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
Análise comparativa entre populações costeiras e continentais do camarão
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Crustacea, Palaemonidae) por meio de
dados morfológicos e moleculares
Fernanda Gamper Vergamini
Orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte
das exigências para a obtenção do título de Mestre em
Ciências, Área: Biologia Comparada.
RIBEIRÃO PRETO - SP
2009
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Vergamini, Fernanda Gamper.
Análise comparativa entre populações costeiras e continentais do
camarão Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Crustacea,
Palaemonidae) por meio de dados morfológicos e moleculares / Fernanda
Gamper Vergamini; orientador Fernando Luis Medina Mantelatto.
-- Ribeirão Preto, 2009.
91 f.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências.
Área de concentração: Biologia Comparada) – Faculdade de Filosofia, Ciências
e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
1. Caridea. 2. Revisão taxonômica. 3. COI e 16S mtDNA. 4. Filogenia.
5. Distância genética. 6. Variabilidade populacional.
Aos meus pais, Paulo e Isabelle.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto, pela orientação durante os quase cinco
anos em que fui sua aluna, e principalmente, por ter me confiado a execução de um estudo de
tamanha importância.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão da minha bolsa de mestrado (processo n° 134460/07-3), e pelo apoio financeiro
concedido ao Prof. Dr. Fernando Mantelatto (processos n° 471794/2006-6 e 473050/2007-2),
essenciais para a realização dessa pesquisa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio
financeiro concedido ao Prof. Dr. Fernando Mantelatto (processo n° 0208178-9), também
fundamental para a realização dessa pesquisa.
Ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP-USP), por todo apoio logístico.
Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Comparada (FFCLRP/USP), em especial à
coordenadora Profa. Dra. Márcia Maria Gentile Bitondi, pela concessão do auxílio financeiro para
o custeio da visita à coleção de crustáceos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
(INPA).
A todos aqueles que contribuíram com empréstimo, coleta e/ou doação de exemplares de
Macrobrachium amazonicum, ajuda sem a qual esse trabalho não poderia ter siso realizado:
Álvaro Costa, Dr. Emerson Mossolin, Prof. Dr. Fernando Mantelatto, Hertz Santos, doutorando
Rogério Faleiros (FFCLRP/USP); Profa. Dra. Andrea Bialetzki e Tiago Piassa (UEM); Prof. Dra.
Célia Sampaio (UECE); Prof. Dr. Célio Magalhães (INPA); Profa. Dra. Cristiana Maciel (UFPA);
Prof. Dr. Fernando D’Incao (FURG); Profa. Dra. Liliam Hayd (UEMS); Prof. Dr. Rogério Costa
(UNESP); Profa. Dra. Rossineide Rocha e Mirna Lima (UFPA); Prof. Dr. Sérgio Rocha (UFRB);
Prof. Dr. Wagner Valenti (CAUNESP); e aos curadores da coleção da UFPB.
Ao doutorando Leonardo Antonio Gomes Pileggi (Laboratório de Bioecologia e
Sistemática de Crustáceos, LBSC/FFCLRP/USP), por ter me auxiliado e acompanhado em todas
as etapas dessa pesquisa.
Aos curadores Prof. Dr. Marcos Domingos Siqueira Tavares (MZUSP) e Prof. Dr. Célio
Ubirajara Magalhães Filho (INPA), pela permissão ao acesso do material das coleções das
respectivas instituições.
À Prof. Dra. Maria Helena de Souza Goldman (Laboratório de Biologia Molecular de
Plantas, FFCLRP/USP), e em especial à doutoranda Andréa Carla Quiapim, pela execução dos
passos referentes à precipitação e sequenciamento dos fragmentos moleculares.
À Profa. Dra. Maura Helena Manfrin (Laboratório de Genética Evolutiva/ FFCLRP/USP),
em especial aos doutorandos Érica Cristina de Carvalho Silva Bernardi e Fernando de Faria
Franco, pelo auxílio com as análises populacionais.
Ao Prof. Dr. Christoph D. Schubart (Institut für Zoologie, Universität Regensburg,
Germany), pelo auxílio complementar com os protocolos de extração e amplificação dos
fragmentos moleculares, e pela ajuda com as análises populacionais.
Ao Prof. Dr. David Véliz (Instituto de Ecología y Biodiversidad, Facultad de Ciencias,
Universidad de Chile), pela ajuda com análises populacionais.
Ao Prof. Dr. Marcos Domingos Siqueira Tavares (MZUSP), pelas discussões sobre
sistemática e taxonomia e ajuda com as sinonímias.
Ao mestrando Lucas Simon Torati (LBSC/FFCLRP/USP), pelo auxílio com a obtenção e
edição das imagens e desenhos, diafanizaçao de estruturas morfológicas, discussões sobre
sistemática e taxonomia e revisão do texto.
À Dra. Fabíola Cristina Ribeiro de Faria (MZUSP), pelas discussões sobre métodos de
análises moleculares.
Às doutorandas Mariana Terossi Rodrigues e Ivana Miranda da Silva
(LBSC/FFCLRP/USP), pelas discussões gerais sobre essa pesquisa, ajuda no delineamento dos
objetivos/hipótese e revisão do texto.
Ao Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto e ao doutorando Leonardo Antonio
Gomes Pileggi (LBSC/FFCLRP/USP), pela análise do material tipo de M. amazonicum.
Ao Prof. Dr. Luis Miguel Pardo (Laboratorio Costero Calfuco, Instituto de Biologia
Marina, Universidad Austral de Chile), pelas discussões sobre a hipótese deste trabalho.
Às Profa. Dra. Márcia Maria Gentile Bitondi (FFCLRP/USP), Profa. Dra. Maura Helena
Manfrin (Laboratório de Genética Evolutiva/ FFCLRP/USP) e Dra. Patrícia Maria Contente
Moraes Valenti (CAUNESP), pelas contribuições como membros da banca de qualificação de
mestrado.
Ao Dr. Peter C. Dworschak (Institute of Zoology, University of Vienna, Áustria), pelo
envio da cópia do artigo contendo a descrição original de M. amazonicum (Heller, 1862), e à
Veronique Gamper Schoch, pela tradução deste.
Ao Prof. Dr. Wagner Ferreira do Santos (Laboratório de neurobiologia de Peçonhas/
FFCLRP/USP), por permitir o uso do microscópio com sistema de captura de imagem, em
especial à Dra. Alexandra Olimpio Siqueira Cunha e ao Msc. José Luiz Liberato, pelo auxílio com
o manuseio do equipamento e do programa computacional.
À Profa. Dra. Vera Lucia Imperatriz-Fonseca (FFCLRP/USP), por permitir o uso do
estereomicroscópio com sistema de captura de imagem, em especial ao Dr. Sidnei Mateus, pelo
auxílio com o manuseio do equipamento e do programa computacional.
À Msc. Juliana Massimino Feres (FMRP/USP), pelas discussões sobre genética de
populações e ajuda com a formatação desta dissertação.
Ao amigo Marcelo Ducatti, pelo design da capa.
A todos os integrantes e ex-integrantes do LBSC: Ana F. Gomes, Andréa L. Meireles,
Caio A. M. Pavanelli, Douglas F. Peiró, Emerson C. Mossolin, Fabíola C. R. Faria, Fernanda L.
Vasconcelos, Ivana M. Silva, Jully Iguchi, Leonardo A. G. Pileggi, Lígia M. Amadio, Lucas S.
Torati, Mariana T. Rodrigues, Mariana V. Capparelli, Marina Z. Fantucci, Tatiana Magalhães,
Nathália M. Santos, e Vanessa A. M. Silva, por todo apoio durante a realização desse trabalho,
além da amizade e maravilhosa convivência diária.
Finalmente, e não menos importante, à minha família, em especial aos meus pais, e a
todos meus amigos, pelo apoio, torcida, confiança e cumplicidade.
“No one definition has as yet satisfied all naturalists; yet every naturalist knows vaguely what
he means when he speaks of a species”
CHARLES DARWIN (1859)
RESUMO
VERGAMINI, F. G. Análise comparativa entre populações costeiras e continentais do
camarão Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Crustacea, Palaemonidae) por meio de
dados morfológicos e moleculares. 2009. 91 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
Macrobrachium amazonicum, camarão endêmico da América do Sul com ampla distribuição
geográfica, é encontrado em ambientes com distintos gradientes de salinidade. Existe grande
variabilidade entre as diferentes populações da espécie, porém o conhecimento sobre a história de
vida recente destas permanece fragmentado e incompleto. Assim, este estudo objetivou comparar
e caracterizar populações costeiras e continentais de M. amazonicum do Brasil, por meio de dados
morfológicos e moleculares (16S rRNA e COI mtDNA), a fim de descrever o grau de
variabilidade, estruturação e relações de parentesco entre elas. Os padrões morfológicos, definidos
com base nos caracteres de maior variação (rostro, telso, tamanho corpóreo e morfotipos),
separaram as populações em dois grupos: populações costeiras e continentais do norte e nordeste
do Brasil; e populações continentais das bacias do Paraná e Paraguai. A possível plasticidade
desses caracteres parece ser uma resposta adaptativa aos diferentes ambientes em que M.
amazonicum ocorre ao longo de sua distribuição natural. Taxas de divergência genética entre as
populações indicaram variabilidade no nível intraespecífico. Redes de haplótipos, análises
filogenéticas (otimização direta e parcimônia), de distância (Neighbor Joining) e de variância
molecular evidenciaram divergência genética significativa entre as populações, estruturando-as
em três grupos: I – continental da Amazônia (AM); II – bacias do Paraná e Paraguai (MS); III-
sistemas costeiros do norte e nordeste (AP, PA e CE). Reconstruções filogenéticas revelaram que
as populações constituíram um único clado monofilético, podendo ser consideradas uma única
espécie. O grupo I constituiu um clado irmão ao formado pelos grupos II e III, que, por sua vez,
constituíram clados irmãos entre si. As populações de Sertãozinho e Miguelópolis; e Avaré;
introduzidas em São Paulo, parecem ser originárias de populações naturais do Mato Grosso do Sul
e Pará, respectivamente. M. amazonicum apresentou uma variabilidade intraespecífica
significativa, que, provavelmente, é decorrente do isolamento geográfico existente entre os grupos
analisados. Se este isolamento se mantiver, a espécie poderá passar por um processo de
especiação dentro da sua ampla distribuição geográfica.
Palavras-chave: 1. Caridea. 2. Revisão taxonômica. 3. COI e 16S mtDNA. 4. Filogenia. 5.
Distância genética. 6. Variabilidade populacional.
ABSTRACT
VERGAMINI, F. G. Comparative analysis between inland and coastal populations of the
prawn Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Crustacea, Palaemonidae) using
morphological and molecular data. 2009. 91 p. Thesis (Master Science) – Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
Macrobrachium amazonicum, a freshwater prawn that is widely distributed within South
America, occupies habitats with a wide range of salinities. There is a great deal of intraspecific
variability among different populations of this species, however the knowledge of their early life
history has remained fragmentary and incomplete. Thus, this study aimed to compare and
characterize inland and coastal populations of M. amazonicum from Brazil using morphological
and molecular (16S rRNA and COI mtDNA) data, in the way to describe the variability degree,
structure and relashionship among them. Morphological patterns, defined considering the most
variable traits (rostrum, telson, body size and morphotypes), divided populations in two groups:
coastal and inland populations from northern and northeastern of Brazil; and inland populations
from Paraná and Paraguai basins. These traits plasticity may be an adaptive response to the variety
of different freshwater environments M. amazonicum encounters across its natural range. Genetic
divergence rates among populations shows variability in the intraspecific level. Haplotype
networks, phylogenetic (direct optimization and parsimony), distance (Neighbor Joining) and
molecular variance analyses evidenced significant genetic divergence among populations,
structuring them in three groups: I- inland from Amazonia (AM); II- Paraná and Paraguai basins
(MS) and III- coastal systems from northern and northeastern (AP, PA e CE). Phylogenetic
reconstructions revealed that the populations form a unique monophyletic clade, what support
them as a single species. Group I was a sister clade of the one formed by groups II and III, which
formed sisters clades themselves. Populations from Sertãozinho and Miguelópolis; and Avaré, all
introduced in São Paulo, may have been originated from natural populations of Mato Grosso do
Sul and Pará, respectively. M. amazonicum showed a significant intraspecific variation, which is
probable due to the geographic isolation between the analyzed groups. If this isolation remains,
the species may possibly face a speciation process within its large range of geographic
distribution.
Keywords: 1. Caridea. 2. Taxonomic review. 3. COI and 16S mtDNA. 4. Phylogeny. 5. Genetic
distance. 6. Population variability.
LISTA DE FIGURAS
F
IGURA
1.
M
ORFOLOGIA EXTERNA DE UM CAMARÃO DA FAMÍLIA
P
ALAEMONIDAE
,
COM
DESTAQUE PARA AS ESTRUTURAS COMUMENTE UTILIZADAS NA IDENTIFICAÇÃO DE
ESPÉCIES DO GÊNERO
M
ACROBRACHIUM
(
MODIFICADO DE
GOMES-CORRÊA,
1977). ....23
F
IGURA
2.
V
ARIAÇÕES NO NÚMERO DE DENTES NA MARGEM INFERIOR E NO COMPRIMENTO DO
ROSTRO ENTRE POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM DO
B
RASIL
.
A,
C
ORUMBÁ
,
MS
(
C
-04).
B,
A
QUIDAUANA
,
MS
(
C
-01).
C,
M
IRANDA
,
MS
(
C
-02).
D,
A
VARÉ
,
SP
(
I
-03).
E,
A
QUIRAZ
,
CE
(C-03).
F,
I
RANDUBA
,
AM
(A-01).
G,
I
TACOATIARA
,
AM
(A-02).
H,
R
IO
B
RANCO
,
AC
(A-04).
I,
M
OSQUEIRO
,
PA
(C-08).
J,
R
IO
P
ARAGUAÇU
,
BA
(C-10).
A
BARRA
DE ESCALA EQUIVALE A
1
MM
.
P
ARA DETALHES DAS POPULAÇÕES VER
T
ABELA
1............46
F
IGURA
3.
V
ARIAÇÕES NO FORMATO DO TELSO E NO COMPRIMENTO DOS ESPINHOS POSTERIORES
INTERNOS EM RELAÇÃO À EXTREMIDADE DO TELSO ENTRE POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM DO
B
RASIL
.
A,
C
ORUMBÁ
,
MS
(
C
-04).
B,
A
QUIDAUANA
,
MS
(
C
-01).
C,
M
IRANDA
,
MS
(
C
-02).
D,
A
VARÉ
,
SP
(
I
-03).
E,
A
QUIRAZ
,
CE
(C-03).
F,
I
TACOATIARA
,
AM
(A-02).
G,
M
OSQUEIRO
,
PA
(C-08).
H,
R
IO
P
ARAGUAÇU
,
BA
(C-10).
A
BARRA DE ESCALA EQUIVALE A
200
µM
.
P
ARA DETALHES DAS POPULAÇÕES VER
T
ABELA
1.
..........................................................................................................................................47
F
IGURA
4.
V
ARIAÇÕES NO FORMATO DO TELSO E COMPRIMENTO DOS ESPINHOS POSTERIORES
INTERNOS EM RELAÇÃO À EXTREMIDADE DO TELSO ENTRE INDIVÍDUOS ADULTOS
(A)
E
JUVENIS
(B)
DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM
.
A
BARRA DE ESCALA EQUIVALE A
200
µM
.
O
S EXEMPLARES PERTENCEM À POPULAÇÃO DO
R
IO
P
URUS
,
AM
(A-03),
E AMBOS SÃO
MACHOS
.............................................................................................................................47
F
IGURA
5.
Á
RVORE FILOGENÉTICA PARA DIVERSAS POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM
AMAZONICUM DO
B
RASIL
,
OBTIDO POR OTIMIZAÇÃO DIRETA DA SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO
GENE MITOCONDRIAL
16S
R
RNA,
COM PARCIMÔNIA COMO O CRITÉRIO DE OTIMIZAÇÃO
.
(O
QUADRADO NO LADO ESQUERDO INFERIOR INDICA OS PARÂMETROS DE CUSTO UTILIZADOS
NA ANÁLISE DE SENSIBILIDADE
.
Q
UADRADOS PINTADOS CORRESPONDEM AOS PARÂMETROS
SOB OS QUAIS O CLADO SE MANTEVE ESTÁVEL
.
ARG,
A
RGENTINA
.
CR,
C
OSTA
R
ICA
.
VZ,
V
ENEZUELA
.
E
STADOS BRASILEIROS
:
AM,
A
MAZONAS
;
AP,
A
MAPÁ
;
CE,
C
EARÁ
;
MS,
M
ATO
G
ROSSO DO
S
UL
;
PA,
P
ARÁ
;
SP,
S
ÃO
P
AULO
)........................................................50
F
IGURA
6.
Á
RVORE FILOGENÉTICA PARA DIVERSAS POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM
AMAZONICUM DO
B
RASIL
,
OBTIDO POR OTIMIZAÇÃO DIRETA DA SEQUÊNCIAS PARCIAIS DE
COI,
COM PARCIMÔNIA COMO O CRITÉRIO DE OTIMIZAÇÃO
.
(
QUADRADO AO LADO
ESQUERDO INFERIOR INDICA OS PARÂMETROS DE CUSTO UTILIZADOS NA ANÁLISE DE
SENSIBILIDADE
.
Q
UADRADOS PINTADOS CORRESPONDEM AOS PARÂMETROS SOB OS QUAIS
O CLADO SE MANTEVE ESTÁVEL
.
ARG,
A
RGENTINA
.
CR,
C
OSTA
R
ICA
.
VZ,
V
ENEZUELA
.
E
STADOS BRASILEIROS
:
AM,
A
MAZONAS
;
AP,
A
MAPÁ
;
CE,
C
EARÁ
;
MS,
M
ATO
G
ROSSO
DO
S
UL
;
PA,
P
ARÁ
;
SP,
S
ÃO
P
AULO
.
G
RUPO
I:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA
A
MAZÔNICA
;
GRUPO
II:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA DO
P
ARANÁ E DO
P
ARAGUAI
;
E GRUPO
III:
INDIVÍDUOS PROVENIENTES DE POPULACÕES COSTEIRAS
)...........51
F
IGURA
7.
D
ENDROGRAMA PARA DIVERSAS POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM DO
B
RASIL
,
OBTIDO POR
N
EIGHBOR
J
OINING COM SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE
MITOCONDRIAL
16S
R
RNA.
(N
ÚMEROS CORRESPONDEM A VALORES DE BOOTSTRAPS
;
VALORES
≤
50%
NÃO APRESENTADOS
.
ARG,
A
RGENTINA
.
CR,
C
OSTA
R
ICA
.
VZ,
V
ENEZUELA
.
E
STADOS BRASILEIROS
:
AM,
A
MAZONAS
;
AP,
A
MAPÁ
;
CE,
C
EARÁ
;
MS,
M
ATO
G
ROSSO DO
S
UL
;
PA,
P
ARÁ
;
SP,
S
ÃO
P
AULO
)........................................................53
F
IGURA
8.
D
ENDROGRAMA PARA DIVERSAS POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM DO
B
RASIL
,
OBTIDO POR
N
EIGHBOR
J
OINING COM SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE
MITOCONDRIAL
COI.
(N
ÚMEROS CORRESPONDEM A VALORES DE BOOTSTRAPS
;
VALORES
≤
50%
NÃO APRESENTADOS
.
ARG,
A
RGENTINA
.
CR,
C
OSTA
R
ICA
.
VZ,
V
ENEZUELA
.
E
STADOS BRASILEIROS
:
AM,
A
MAZONAS
;
AP,
A
MAPÁ
;
CE,
C
EARÁ
;
MS,
M
ATO
G
ROSSO
DO
S
UL
;
PA,
P
ARÁ
;
SP,
S
ÃO
P
AULO
.
G
RUPO
I:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA
A
MAZÔNICA
;
GRUPO
II:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA DO
P
ARANÁ E DO
P
ARAGUAI
;
E GRUPO
III:
INDIVÍDUOS PROVENIENTES DE POPULAÇÕES COSTEIRAS
)...........55
F
IGURA
9.
R
EDES DE HAPLÓTIPOS CONSTRUÍDAS PELO MÉTODO DE PARCIMÔNIA ESTATÍSTICA
,
INDICANDO A DISTRIBUIÇÃO DOS HAPLÓTIPOS IDENTIFICADOS NOS EXEMPLARES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM
.
(A
A
C,
REDES RESULTANTES DAS ANÁLISES
DESCONSIDERANDO AS POPULAÇÕES INTRODUZIDAS EM
S
ÃO
P
AULO
.
D
A
F,
REDES
RESULTANTES DAS ANÁLISES CONSIDERANDO TODAS AS POPULAÇÕES
.
O
NÚMERO DENTRO
DO CÍRCULO CORRESPONDE AO NÚMERO DO HAPLÓTIPO
(H).
O
TAMANHO DO CÍRCULO É
PROPORCIONAL À FREQUÊNCIA DO HAPLÓTIPO
.
H
APLÓTIPOS NÃO IDENTIFICADOS NA
AMOSTRA FORAM INDICADOS COMO UM PEQUENO CÍRCULO VAZIO
.
C
ADA LINHA
CORRESPONDE A UM PASSO MUTACIONAL
). .......................................................................58
F
IGURA
10.
R
EDE DE HAPLÓTIPOS CONSTRUÍDA PELO MÉTODO DE
M
EDIAN
-J
OINNG
,
INDICANDO
A DISTRIBUIÇÃO DOS
13
HAPLÓTIPOS IDENTIFICADOS NOS
81
EXEMPLARES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM ESTUDADOS
.
(O
NÚMERO ABAIXO DO CÍRCULO
CORRESPONDE AO NÚMERO DO HAPLÓTIPO
(H).
O
TAMANHO DO CÍRCULO É PROPORCIONAL
À FREQUÊNCIA DO HAPLÓTIPO
.
C
ADA PEQUENO TRAÇO REPRESENTA UM PASSO
MUTACIONAL
;
VM
,
VETOR MÉDIO
.
G
RUPO
I:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA
A
MAZÔNICA
;
GRUPO
II:
INDIVÍDUOS PROVENIENTES DE POPULAÇÕES COSTEIRAS
;
E GRUPO
III:
INDIVÍDUOS DA
R
EGIÃO
H
IDROGRÁFICA DO
P
ARANÁ E DO
P
ARAGUAI
).......................60
LISTA DE TABELAS
T
ABELA
1
-
R
ELAÇÃO DAS POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM ANALISADAS
DURANTES ESTE ESTUDO
.
(C
OLEÇÃO
,
NÚMERO DE CATÁLOGO
.
N
T
/N
A
,
NÚMERO DE
EXEMPLARES TOTAL
/
NÚMERO DE EXEMPLARES ANALISADOS DURANTE A REVISÃO
TAXONÔMICA
;
?,
NÚMERO TOTAL DE EXEMPLARES DESCONHECIDO
.
C
OLABORADORES
,
PESQUISADORES QUE CONTRIBUÍRAM COM COLETA
,
DOAÇÃO
,
EMPRÉSTIMO E ANÁLISE DO
MATERIAL
). .......................................................................................................................20
T
ABELA
2
-
L
ISTA DE CARACTERES UTILIZADOS DURANTE A REVISÃO TAXONÔMICA DOS
EXEMPLARES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM PROVENIENTES DE DIVERSAS
LOCALIDADES DO
B
RASIL
..................................................................................................23
T
ABELA
3
-
R
ELAÇÃO DAS ESPÉCIES UTILIZADAS NAS ANÁLISES MOLECULARES
.
(C
OLEÇÃO
,
NÚMERO DE CATÁLOGO
.
N,
NÚMERO DE EXEMPLARES UTILIZADOS COM CADA MARCADOR
MOLECULAR
.
*,
P
OPULAÇÕES UTILIZADAS NAS ANÁLISES POPULACIONAIS
)......................30
T
ABELA
4
–
N
ÚMERO DE PASSOS
/
CUSTO
(N
O
PASSOS
)
E NÚMERO DE ÁRVORES IGUALMENTE
PARCIMONIOSAS
(N
O
ÁRVORES
)
RESULTANTES DAS ANÁLISES FILOGENÉTICAS COM
SEQUÊNCIAS PARCIAIS DOS GENES
16S
E
COI,
SOB
10
PARÂMETROS DIFERENTES DE CUSTOS
PARA INDELS
/
TRANSIÇÃO
/
TRANSVERSÃO
. .........................................................................49
T
ABELA
5
–
D
ISTRIBUIÇÃO DOS HAPLÓTIPOS IDENTIFICADOS NAS
11
POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM ESTUDADAS
,
CONSIDERANDO AS POPULAÇÕES
INTRODUZIDAS NO ESTADO DE
S
ÃO
P
AULO
.
(N,
NÚMERO DE INDIVÍDUOS ANALISADOS EM
CADA POPULAÇÃO
.
D
H
,
DIVERSIDADE HAPLOTÍPICA
.
D
N
+
DV
,
DIVERSIDADE NUCLEOTÍDICA
E DESVIO PADRÃO
).............................................................................................................56
T
ABELA
6
–
D
ISTRIBUIÇÃO DOS HAPLÓTIPOS IDENTIFICADOS NAS OITO POPULAÇÕES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM ESTUDADAS
,
DESCONSIDERANDO AS POPULAÇÕES
INTRODUZIDAS NO ESTADO DE
S
ÃO
P
AULO
.
(N,
NÚMERO DE INDIVÍDUOS ANALISADOS EM
CADA POPULAÇÃO
)............................................................................................................57
T
ABELA
7
–
R
ESULTADOS DAS ANÁLISES DE VARIÂNCIA MOLECULAR
(AMOVA)
REALIZADAS
COM EXEMPLARES DE
M
ACROBRACHIUM AMAZONICUM PROVENIENTES DE DIVERSAS
POPULAÇÕES DO
B
RASIL
....................................................................................................61
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................12
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................18
3. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................19
3.1. Coleção dos exemplares ................................................................................................19
3.2.
Dados morfológicos.......................................................................................................22
3.3.
Dados moleculares.........................................................................................................25
3.3.1. Escolha dos marcadores .........................................................................................25
3.3.2. Obtenção dos dados................................................................................................26
3.3.3. Análise dos dados...................................................................................................29
4. RESULTADOS...................................................................................................................34
4.1.
Dados morfológicos.......................................................................................................34
4.2.
Dados moleculares.........................................................................................................48
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................................62
5.
1.
Considerações taxonômicas..........................................................................................62
5.2.
Variações morfológicas em Macrobrachium amazonicum...........................................64
5.3. Variabilidade genética em Macrobrachium amazonicum.............................................69
6. CONCLUSÃO.....................................................................................................................77
REFERÊNCIAS .....................................................................................................................78
APÊNDICE.............................................................................................................................91
1
INTRODUÇÃO
Introdução
12
Na recente classificação dos crustáceos (MARTIN & DAVIS, 2001), a infraordem
Caridea Dana, 1852 é constituída por 36 famílias, dentre as quais está a família Palaemonidae
Rafinesque, 1815. A subfamília Palaemoninae Rafinesque, 1815 é composta por
aproximadamente 279 espécies (PEREIRA, 1997), e contém o gênero Macrobrachium Bate,
1868, com 210 espécies reconhecidas atualmente (SHORT, 2004).
Os representantes desse gênero são importantes e conspícuos componentes de
ecossistemas de água doce e estuarinos com ampla distribuição nas áreas tropicais e
subtropicais de todo o mundo (PEREIRA et al., 2002; SHORT, 2004). Além disso, despertam
grande interesse comercial devido ao tamanho atingido por alguns deles, sendo assim,
bastante utilizados para o consumo humano (PINHEIRO & HEBLING, 1998). Até o
momento, 33 espécies do gênero são reportadas para o continente americano (PINHEIRO &
HEBLING, 1998), das quais 20 apresentam registros de ocorrência para o Brasil (MELO,
2003; MANTELATTO & BARBOSA, 2005; MANTELATTO et al., 2008; L. PILEGGI & F.
MANTELATTO, comunicação pessoal).
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) é popularmente conhecido como
camarão-canela, camarão-sossego (BIALETZKI et al., 1997) e camarão-cascudo (ESPÍRITO-
SANTO & ISAAC, 2005), e atualmente vem sendo chamado de camarão-da-amazônia
(MORAES-RIODADES, 2005).
A espécie é endêmica da América do Sul e apresenta uma ampla distribuição
geográfica, habitando águas interiores nas bacias dos rios Amazonas e Orinoco (HOLTHUIS,
1952; ODINETZ-COLLART & RABELO, 1996), assim como rios e estuários das costas
norte e nordeste do Brasil, as Guianas, Suriname, e costas caribenhas da Venezuela e
Colômbia (HOLTHUIS, 1952; MELO, 2003; VALENCIA & CAMPOS, 2007). Populações
interiores isoladas foram recentemente reportadas no alto das bacias dos rios Paraná e
Paraguai no Brasil; na Bolívia, Paraguai e norte da Argentina (PETTOVELLO, 1996;
Introdução
13
BIALETZKI et al., 1997; MAGALHÃES, 2000; HAYD & NAKAGAKI, 2002; MELO,
2003; MAGALHÃES et al., 2005).
A localidade tipo de M. amazonicum é a bacia central do rio Amazonas (KENSLEY &
WALKER, 1982), na região de Manaus (AM), onde é muito abundante nas águas brancas
ricas em sedimentos e sais dissolvidos, representando cerca de 80% da biomassa de
macrocrustáceos nos lagos de várzea (ODINETZ-COLLART & MOREIRA, 1993).
Apesar das espécies de Macrobrachium serem comumente referidas como camarões
de água doce, muitas requerem influência marinha durante o desenvolvimento larval
(SHORT, 2004). De tal modo, as espécies do gênero podem ser divididas em três grupos de
acordo com suas estratégias reprodutivas: espécies com desenvolvimento larval completo e
dependentes da influência marinha; espécies com desenvolvimento larval abreviado,
independentes da influência marinha e exclusivos de ambientes interiores; e espécies com
desenvolvimento mais ou menos completo cuja distribuição se estende de regiões costeiras a
continentais (WILLIAMSON, 1973; MAGALHÃES & WALKER, 1988; BUENO &
RODRIGUES, 1995).
Macrobrachium amazonicum habita ambientes com diferentes gradientes de
salinidade, incluindo ambientes inteiramente dulcícolas (GAMBA, 1984; MAGALHÃES,
1985; BIALETZKI et al., 1997; PORTO, 1998; HAYD & NAKAGAKI, 2002;
MAGALHÃES, 2000; MAGALHÃES et al., 2005) até águas estuarinas (BARRETO &
SOARES, 1982; VEGA-PÉREZ, 1984; LOBÃO et al., 1986; ODINETZ-COLLART &
RABELO, 1996; PEIXOTO, 2002; SILVA et al, 2007). Portanto, pode-se categorizar a
espécie alvo deste estudo no terceiro grupo (MAGALHÃES, 1985; MAGALÃES &
WALKER, 1988) descrito anteriormente.
As informações disponíveis sobre M. amazonicum revelam uma grande variabilidade
intraespecífica de características reprodutivas, morfológicas, fisiológicas, entre outras, o que
Introdução
14
pode ser devido ao isolamento genético de diferentes populações e, possivelmente, a um
processo incipiente de especiação (ANGER et al., 2009).
Como exemplo dessa variabilidade, pode-se citar o tamanho dos ovos aumentando
conforme a distância entre o local de coleta e o oceano se torna maior (ODINETZ-COLLART
& RABELO, 1996); a morfologia das larvas que parece variar entre populações estuarinas e
totalmente de água doce (VEGA PÉREZ, 1984; MAGALHÃES, 1985); populações interiores
com estratégias reprodutivas diferentes das costeiras (A. MEIRELES, comunicação pessoal);
diferentes populações com variações fisiológicas na capacidade de sobrevivência e de
osmorregulação de estágios larvais e adultos (AUGUSTO et al., 2007); tamanho máximo
atingido pelos adultos diferindo entre populações coletadas em rios e aquelas de ambientes
lacustres (ODINETZ-COLLART, 1987; ODINETZ-COLLART & MOREIRA, 1993);
algumas populações costeiras e continentais do norte do Brasil constituindo grupos
geneticamente distintos (PEIXOTO, 2002); e análises morfométricas revelando diferenças
morfológicas suficientes para separar as populações brasileiras em dois grupos distintos
(PORTO, 2004).
Apesar de serem muitos os estudos relacionados à biologia geral, sistemática e
taxonomia, biologia pesqueira e cultivo de M. amazonicum, dentre outros assuntos (ver
Holonímia apresentada no item 4.1 para referências), poucos (ODINETZ-COLLART &
MAGALHÃES, 1994; ODINETZ-COLLART & RABELO, 1996; PEIXOTO, 2002; PORTO,
2004; A. MEIRELES, comunicação pessoal) foram os que enfocaram diretamente a
comparação e a caracterização das populações costeiras e continentais distribuídas ao longo
do território brasileiro.
De tal modo, sabendo-se que o conhecimento sobre a história de vida das diferentes
populações de M. amazonicum permanece fragmentado (ANGER et al., 2009) e incompleto,
e, levando-se em consideração o notável potencial e interesse econômico desta espécie no
Introdução
15
cenário da carcinicultura de água doce brasileira (MORAES-RIODADES et al., 1999;
MORAES-RIODADES & VALENTI, 2004), torna-se evidente e fundamental a realização de
estudos complementares, principalmente, no que diz respeito à estruturação genética e
caracterização morfológica das diferentes populações da espécie.
PORTO (2004), analisando variações morfológicas e merísticas de populações
oriundas de diferentes bacias hidrográficas, concluiu que as populações das bacias dos rios
Paraguai e Paraná deveriam ser consideradas como uma espécie distinta da encontrada nas
bacias das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Diante disso, é essencial a revisão taxonômica
das diferentes populações, incluindo informações sobre o material tipo e sobre os quatro
morfotipos descritos para a espécie (MORAES-RIODADES & VALENTI, 2004), não
incluídas no trabalho de PORTO (2004). Assim, a existência de duas espécies distintas no
complexo M. amazonicum pode ser questionável, e necessita reavaliação.
A taxonomia constitui uma ciência de base e de fundamental importância para as
demais vertentes da biologia, visto que problemas taxonômicos triviais afetam hipóteses e
idéias, e muitas vezes acarretam em problemas práticos maiores que afetam o nosso
conhecimento sobre a natureza, estrutura e funcionamento dos ecossistemas (BORTOLUS,
2008).
Estudos taxonômicos com o gênero Macrobrachium são dificultados pelo restrito
número de caracteres disponíveis para a identificação das espécies, uma vez que estas são
bastante similares quanto à forma geral do corpo. Os melhores caracteres para a identificação
das espécies são os formatos do rostro e do segundo par de pereiópodos. Outras partes do
corpo até apresentam algumas diferenças, porém, muitas vezes são vezes variáveis e de difícil
definição. Além disso, grande parte dos caracteres é variável dentro da mesma espécie,
especialmente durante o desenvolvimento do animal (HOLTHUIS, 1952).
Introdução
16
Estudos sugerem que somente o uso dos caracteres morfológicos tradicionais têm sido
insuficiente na diagnose precisa de espécies do gênero Macrobrachium (LIU et al., 2007).
Deste modo, sabendo-se que o fenótipo externo pode ser afetado pelo meio, o uso apenas de
delineações taxonômicas baseadas na morfologia externa precisa ser feito com cautela.
No entanto, com os avanços metodológicos em biologia molecular, a obtenção de
dados moleculares vem se tornando uma importante ferramenta para resolução de relações
filogenéticas complexas, em que apenas o uso de dados morfológicos não é suficiente. Além
disso, tais metodologias podem ser bastante úteis para delinear efetivamente limites entre
linhagens e/ou espécies, assim como no estudo de relações intra e interespecíficas (MEYER,
1997; LIU et al., 2007; BAKER et al., 2008).
Considerando-se o gênero Macrobrachium, alguns estudos foram realizados a partir de
dados moleculares (MURPHY & AUSTIN, 2002, 2004a, 2005; PEREIRA et al., 2002;
MILLER et al., 2005, LIU et al., 2007; MASHIKO & SHY, 2008). Entretanto, praticamente
todos os estudos populacionais restringiram-se às espécies do Indo-Pacífico (MASHIKO &
NUMACHI, 2000; COOK et al., 2002; MATHER & DE BRUYN, 2003; DE BRUYN et al.,
2004; CARINI & HUGHES, 2004; MURPHY & AUSTIN, 2004b; CHAREONTAWEE et
al., 2007).
Mais especificamente sobre M. amazonicum, apenas um único estudo foi realizado
com dados moleculares (PEIXOTO, 2002). Neste, foram evidenciados com o marcador
mitocondrial citocromo oxidase I (COI), três grupos distintos que parecem não apresentar
fluxo gênico entre si: populações provenientes das bacias continentais de Goiânia (GO), de
Santarém (PA), e de bacias costeiras do Pará. Todavia, este estudo não foi publicado, e
incluiu, principalmente, populações da região norte do país.
Considerando que em ambientes heterogêneos ou isolados geograficamente, uma
única espécie pode apresentar populações geneticamente distintas, devido à ausência de fluxo
Introdução
17
gênico ente elas (ODINETZ-COLLART & RABELO, 1996), é essencial a realização de
estudos adicionais com uma maior representatividade das populações de M. amazonicum,
devido a sua ampla distribuição geográfica no Brasil. Além disso, também se fazem
necessárias a utilização de outros marcadores moleculares e a inclusão de análises mais
específicas e embasadas, de forma a gerar dados mais consistentes sobre a estruturação
genética e relação de parentesco entre as populações da espécie.
A estrutura populacional, verificada a partir da descrição do nível e da distribuição da
variabilidade genética de uma espécie, é observada em praticamente todos os grupos de
organismos, sendo determinada por diversos fatores geográficos e ecológicos, assim como
pelas potencialidades da espécie e por sua história evolutiva (MAYR, 1977).
O estudo dessa estruturação pode contribuir para o entendimento dos processos de
diferenciação populacional e especiação, assim como para o estabelecimento de estratégias de
manejo e conservação da biodiversidade (MAYR, 1977). A inferência de eventos
responsáveis pela fragmentação de populações de uma determinada espécie, e,
consequentemente, pela eventual aquisição de estrutura populacional, é fundamental para o
entendimento da diversificação de um determinado táxon (AVISE, 2000).
Em síntese, fica evidente a necessidade da realização de estudos complementares que
visem comparar e caracterizar, por meio de dados morfológicos e moleculares, as populações
costeiras e continentais de M. amazonicum ao longo de sua distribuição geográfica, o que
certamente contribuiria para uma melhor compreensão do grau de variabilidade e estruturação
genética, relações de parentesco e variabilidade morfológica entre as populações, essenciais
para o entendimento da história evolutiva dessa espécie.
2
OBJETIVOS
Objetivos
18
Fundamentados nas informações apresentadas anteriormente, os objetivos desta
dissertação foram:
1.
Comparar e caracterizar populações costeiras e continentais de Macrobrachium
amazonicum oriundas de diversas localidades do Brasil, por meio de uma revisão
taxonômica, determinando o grau de variação dos caracteres morfológicos
analisados;
2.
Elaborar uma coletânea, reunindo todas as informações taxonômicas e sistemáticas
sobre M. amazonicum disponíveis na literatura, acrescida de dados inéditos obtidos
nesse estudo;
3.
Descrever o grau de variabilidade e estruturação genética das populações costeiras
e continentais de M. amazonicum;
4.
Verificar as relações de parentesco entre as populações de M. amazonicum e se
estas constituem um clado monofilético.
Os objetivos acima listados foram utilizados para testar a seguinte hipótese: “Existe
variação na morfologia externa e estruturação genética nas populações costeiras e continentais
de M. amazonicum”.
3
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
19
3.1. Coleção dos exemplares
Diferentes populações de Macrobrachium amazonicum foram analisadas ao longo do
território brasileiro. Alguns dos exemplares, coletados com licença e permissão do IBAMA
(autorização n° 126/2005-DIFAP/IBAMA), já se encontravam depositados na Coleção de
Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) do Laboratório de Bioecologia e
Sistemática de Crustáceos (LBSC), Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP). Outros, foram obtidos por doação ou
empréstimo de coleções científicas, ou coletados e enviados por pesquisadores de diversas
instituições. O material obtido por doação foi devidamente etiquetado, conservado em álcool
etílico 80% e incorporado à CCDB/FFCLRP/USP (Tabela 1).
Foram realizadas visitas às coleções carcinológicas do Museu de Zoologia da
Universidade de São Paulo (MZUSP) e do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
(INPA). Além disso, contou-se com informações essenciais a respeito dos síntipos de M.
amazonicum, depositados no Naturhistorisches Museum in Wien (Museu de História Natural
de Viena, na Áustria), cuja análise foi realizada pelo Prof. Dr. Fernando Mantelatto e
Leonardo Pileggi, ambos pertencentes ao LBSC/FFCLRP/USP (Tabela 1).
Previamente às análises, a identificação dos exemplares foi confirmada com base nas
características morfológicas diagnósticas da espécie (HELLER, 1862; HOLTHUIS, 1952;
GOMES-CORRÊA, 1977; MELO, 2003).
Material e Métodos
20
Tabela 1 - Continua. Relação das populações de Macrobrachium amazonicum analisadas
durantes este estudo. (Coleção, número de catálogo. Nt/Na, número de exemplares
total/número de exemplares analisados durante a revisão taxonômica; ?, número total de
exemplares desconhecido. Colaboradores, pesquisadores que contribuíram com coleta, doação,
empréstimo e análise do material).
População Local e ano de coleta Coleção Nt/Na Colaboradores
i-01
Represa da Usina Santa Elisa, Sertãozinho, SP (21
o
06'46,7''S;
48
o
03'18,2''W), 2006
CCDB 1953 8/8
Emerson Mossolin, Álvaro Costa,
Rogério Faleiros (FFCLRP/USP)
i-02 Rio Grande, Miguelópolis, SP, 2007 CCDB 2015 5/5 Hertz dos Santos (FFCLRP/USP)
i-03 Avaré, SP, 2006 CCDB 2081 44/10 Rogério Costa (UNESP)
i-04
Córrego do veado, Presidente Epitácio, SP (21°43'16''S;
52°02'11''W), 2002
MZUSP 15603 21/5
i-05 Rio Paraná, SP (21°31'35''S; 52°00'33''W), 2002 MZUSP 15573 13/6
i-06 Rio Paranapanema, SP (22°33'78''S; 51°54'69''W), 2000 MZUSP 13916 23/6
i-07
Ribeirão Lajado, Rodovia Assis Chateaubriand, km 247,
Penápolis, SP, 2006
MZUSP 17210 17/4
Marcos Tavares (MZUSP)
C-01 Igarapé Fortaleza, Santana, AP, 2005 CCDB 1965 6/6 Fernando Mantelatto (FFCLRP/USP)
C-02* Viveiros de produção, CAUNESP, Jaboticabal, SP, 2005 CCDB 1955-62
25/25 Wagner Valenti (CAUNESP)
C-03 Lagoa do Catu, Aquiraz, CE, 2007 CCDB 1973 18/18 Célia Sampaio (UECE)
C-04 Rio Amazonas, Ilha de Marajó, PA, 1986 CCDB 2014 2/2 Fernando D’Incao (FURG)
C-05 Belém, PA, 2005 CCDB 1963 3/3 Fernando Mantelatto (FFCLRP/USP)
C-06 Belém, PA, 1970 CCDB 1864 4/4 Doação coleção UFPB
C-07 Abaetetuba, PA, 2007 CCDB 2084 17/10 Fernando Mantelatto (FFCLRP/USP)
C-08 Furo das Marinhas, Mosqueiro, PA, 2008 CCDB 2385 30/8 Rossineide Rocha/Mirna Lima (UFPA)
C-09
Rio Paricatuba, Santa Bárbara, PA (01
o
14'30'S; 48
o
19'52''W),
2008
CCDB 2119 8/8 Cristiana Maciel (UFPA)
C-10
Rio Paraguaçu, Reservatório de Pedra do Cavalo, BA
(12
o
30'33,9''S; 39
o
06'13,7''W), 2008
CCDB 2384 8/8 Sérgio Rocha (UFRB)
C-11
Rio Araguari, Vista Alegre, Reserva Biológica do Lago
Piratuba, AP, 1992
INPA-CR 1059
?/4 Célio Magalhães (INPA)
C-12 Igarapé da Bocaina, Vitória do Mearim, MA, 1988 MZUSP 9576 7/7 Marcos Tavares (MZUSP)
c-01 Aquidauana, MS, 2007 CCDB 1970 27/13
c-02 Miranda, MS, 2007 CCDB 1971 21/21
Liliam Hayd (UEMS)
c-03
Lagoa do Finado Raimundo, Rio Ivinheima, MS (22°47’57”S;
53°29’21”W), 2007/08
CCDB 2120 50/6 Andrea Bialetzki/Tiago Piassa (UEM)
c-04
Corumbá, distrito de Nhecolândia, Pantanal do Abobral, MS,
1990
INPA nc 10/10 Célio Magalhães (INPA)
c-05 Campo Jofre, Poconé, MT, 1985 INPA-CR 324 ?/4 Célio Magalhães (INPA)
c-06 Barão de Melgaço, MT, 1984 MZUSP 6408 18/6
c-07 Rio Miranda, MS, 1979 MZUSP 8092 56/8
Marcos Tavares (MZUSP)
c-08 Rio Piquiri, Pantanal do Taquari, Itiquira MS, 1993 MZUSP 11535 31/6 Marcos Tavares (MZUSP)
A-01 Lago Pirapora, Costa do Catalão, Iranduba, AM, 2006 CCDB 2082 4/4 Célio Magalhães (INPA)
A-02 Rio Amazonas, próximo à Itacoatiara, AM, 2007 CCDB 2085 42/11 Gustavo Hattori (UFAM)
A-03
Lago Cauá Grande, Rio Purus, AM (4
o
12,231'S; 61
o
50,398'W),
2006
CCDB 2083 7/7 Célio Magalhães (INPA)
Material e Métodos
21
Tabela 1 - Conclusão.
População Local e ano de coleta Coleção Nt/Na Colaboradores
A-04
Lago Amapá (meandro do Rio Acre), Rio Branco, AC
(10
o
03'01,8''S; 67
o
50'52,8''W), 2001
UFRGS 3180 50/10 Georgina Bond-Buckup (UFRGS)
A-05 Tapauá, AM (04
o
30'19''S; 62
o
03'19''W), 2007 INPA nc 10/10
A-06 Rio Amazonas, Ilha do Careiro, AM, 1981 INPA-CR 108 ?/5
A-07 Rio Guaporé, RO, 1985 INPA-CR 327 ?/5
A-08 Rio Madeira, Calama, RO, 1980 INPA-CR 081 ?/4
A-09 Rio Branco, Marará Paraná Fechada, RR, 1979 INPA-CR 199 2/2
A-10 Paraná do Amanã, lago Amanã, AM, 1984 INPA-CR 086 ?/4
A-11 Rio Tocantins, PA, 1987 INPA-CR 1233
?/3
Célio Magalhães (INPA)
A-12 Rio Tocantins, Tucuruí, PA, 2000 MZUSP 13293 2/2
A-13 Jutaí, AM, 1968 MZUSP 7370 3/3
A-14 Rio Amazonas, AM, 1996 MZUSP 12698 6/6
A-15 Rio Amazonas, PA, 1994 MZUSP 12706 16/8
Marcos Tavares (MZUSP)
A-16 Rio Amazonas, Gurupa, 1829 (síntipos) NHMW 562 4/4
A-17 Pará, 1829 NHMW 563 4/4
Leonardo Pileggi e Fernando
Mantelatto (FFCLRP/USP)
i, população continental introduzida; C, costeira; c, continental da Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai; e A, continental da Região
Hidrográfica Amazônica e do Tocantins-Araguaia. *, População em cultivo cuja matriz tem origem costeira (PA). CAUNESP, Centro de
Aquicultura da Universidade Estadual Paulista. CCDB, Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia. FFCLRP/USP, Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. FURG, Fundação Universidade Federal do Rio Grande. INPA-CR,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coleção de Crustáceos. INPA nc, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, material não
catalogado. MZUSP, Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo. NHMW, Naturhistorisches Museum in Wien. UECE, Universidade
Estadual do Ceará. UEM, Universidade Estadual de Maringá. UEMS, Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul. UFAM, Universidade
Federal do Amazonas. UFPA, Universidade Federal do Pará. UFPB, Universidade Federal da Paraíba. UFRB, Universidade Federal do
Recôncavo Baiano. UFRGS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. UNESP, Universidade Estadual Paulista.
As populações estudadas foram classificadas de acordo com a Divisão Hidrográfica
Nacional (BRASIL, 2003) e com a influência da água salobra (costeiras: restritas aos cursos
de água próximos à região litorânea com influência da água salobra; e continentais:
encontradas em cursos de água interiores sem conexão próxima à região litorânea).
Populações continentais coletadas no estado de São Paulo (i-01 a 07) e costeiras do
nordeste brasileiro (C-03 e 10) foram classificadas como introduzidas devido à dispersão não
natural (MAGALHÃES et al., 2005).
Material e Métodos
22
A população de Jaboticabal, SP (C-02) é cultivada no CAUNESP, sendo sua matriz
estuarina, situada próxima à cidade de Belém (PA) (W. VALENTI, comunicação pessoal). De
tal modo, a classificação desta população foi baseada na sua origem, e não na sua localização
atual.
As populações costeiras abrangeram as seguintes Regiões Hidrográficas: Amazônica
(C-01, C-04, C-11); do Tocantins-Araguaia (C-02, C-05 a 09); do Atlântico Nordeste Oriental
(C-03); do Atlântico Nordeste Ocidental (C-12), e do Atlântico Leste (C-10). As populações
continentais foram divididas em dois grupos: Região Hidrográfica Amazônica e do Tocantins-
Araguaia (A-01 a 17) e Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (c-01 a 08).
3.2. Dados morfológicos
A partir de informações contidas nos principais trabalhos referentes à taxonomia e
sistemática de M. amazonicum (HELLER, 1862; HOLTHUIS, 1952, GOMES-CORRÊA,
1977; MELO, 2003), foram selecionados os caracteres de maior variabilidade no gênero
Macrobrachium (rostro, telso e pereiópodos) e os utilizados na diagnose da espécie (Figura
1). Todos esses caracteres, além de outros levantados durante esse trabalho, foram reunidos e
organizados sob a forma de uma lista (Tabela 2), que serviu de guia durante a revisão
taxonômica.
Uma parcela representativa de cada lote de M. amazonicum (exemplares adultos –
machos, fêmeas ovígeras e não ovígeras – e juvenis) (Tabela 1) foi estudada de acordo com os
caracteres presentes na lista (Tabela 2). Após o término da revisão de todos os exemplares, foi
realizada uma análise comparativa dos caracteres, em que se identificaram aqueles de maior
variação entre as populações.
Material e Métodos
23
Figura 1. Morfologia externa de um camarão da família Palaemonidae, com destaque para as
estruturas comumente utilizadas na identificação de espécies do gênero Macrobrachium
(modificado de GOMES-CORRÊA, 1977).
Tabela 2 - Lista de caracteres utilizados durante a revisão taxonômica dos exemplares de
Macrobrachium amazonicum provenientes de diversas localidades do Brasil.
Lista de caracteres
Rostro:
formato, comprimento em relação ao escafocerito, número de dentes e sua
distribuição na borda superior e inferior
Carapaça: comprimento e presença de cerdas/espinhos
Primeiro par de pereiópodos:
forma e tamanho, proporção dos artículos, presença de
cerdas/espinhos
Segundo par de pereiópodos:
forma e tamanho; proporção dos artículos; fórmula de dentes
dos dedos da quela, presença de cerdas/espinhos
Terceiro, quarto e quinto pares de pereiópodos:
forma e tamanho; proporção dos artículos,
presença de cerdas/espinhos
Abdome:
formato da pleura do quinto somito; tamanho do sexto somito em relação ao
quinto; presença de cerdas/espinhos
Segundo par de pleópodos: tamanho do apêndice interno em relação ao masculino
Telso:
formato da extremidade; presença e distribuição dos espinhos dorsais; posicionamento
dos espinhos posteriores em relação à extremidade; presença de espinhos
Urópodos: presença e tamanho do espinho móvel em relação à margem externa
Morfotipos*:
identificação de acordo com o formato e tamanho do segundo par de
pereiópodos
*A identificação dos morfotipos foi realizada de acordo com o proposto por MORAES-RIODADES & VALENTI (2004).
Pereiópodos
Urópodos
Telso
Escafocerito
Abdome Carapaça
Ísquio
Rostro
Dátilo
Própodo
Carpo
Mero
Pleópodos
Material e Métodos
24
Além desta análise comparativa, foi elaborada uma coletânea taxonômica e sistemática
sobre M. amazonicum, reunindo todas as informações disponíveis na literatura (HELLER,
1862; HOLTHUIS, 1952, 1959, 1966; GOMES-CORRÊA, 1977; GARCÍA-DÁVILA &
MAGALHAES, 2003; MELO, 2003; PORTO, 2004; VALENCIA & CAMPOS, 2007),
adicionada de dados inéditos obtidos nesse estudo. As informações sobre os morfotipos da
espécie foram extraídas de MORAES-RIODADES & VALENTI (2004).
A coletânea constituiu-se de uma holonímia (DOBUIS, 2000); uma descrição
detalhada da morfologia externa, com informações sobre os morfotipos, juvenis, fêmeas e as
variações entre as populações de diversas localidades do Brasil; uma diagnose, resumindo os
caracteres diagnósticos da espécie; informações sobre cor, tamanho, localidade tipo; e
listagem do material analisado.
Alguns exemplares tiveram seus apêndices (telso, urópodos, primeiro e segundo pares
de pereiópodos, e segundo par de pleópodos) dissecados e diafanizadas com KOH a fim de
permitir melhor detalhamento e visualização em microscópio óptico do formato, cerdas e
espinhos. O padrão de classificação de cerdas, espinhos e dentes seguiu o proposto por
SHORT (2004).
As análises morfológicas realizadas no LBSC/FFCLRP/USP foram feitas sob
estereomicroscópio MZ6 LEICA
®
. Os animais foram mensurados (comprimento da carapaça)
com paquímetro digital STARRETT
®
727 (0,01 mm). Fotografias dos caracteres de maior
variação entre as populações foram obtidas com câmera digital colorida LEICA
®
DFC300 FX
acoplada a um microscópio óptico LEICA
®
DM5000 B, e com câmera digital colorida
LEICA
®
DFC500 acoplada a um estereomicroscópio LEICA
®
MZ16, ambos sistemas
pertencentes ao Departamento de Biologia da FFCLRP/USP.
As estruturas foram fotografadas em vários planos e posteriormente organizadas em
uma única imagem por meio do programa computacional Auto-Montage 5.03 (S). Os
Material e Métodos
25
desenhos foram realizados com auxílio do programa Adobe Illustrator 10.0.3 a partir de
esquemas realizados sob estereomicroscópio Stemi SV6 ZEISS
®
provido de câmara clara, e
das imagens.
3.3. Dados moleculares
3.3.1. Escolha dos marcadores
O DNA mitocondrial (mtDNA) é uma escolha frequente em estudos populacionais e
filogenéticos por ser composto de um único filamento duplo de DNA circular com genes de
cópia única, sendo caracterizado por ausência de combinação gênica, ineficiência nos
mecanismos de reparo de mutações, regiões não codificadoras raras ou ausentes, mutações
pontuais constituindo a principal fonte de variação e herança geralmente uniparental. A
presença de múltiplas cópias na maioria das células facilita seu isolamento, amplificação e
análises (AVISE, 2004 para revisão). Além disso, as diferente classes de genes mitocondriais
apresentam padrões de evolução distintos, permitindo que o mtDNA seja utilizada em estudos
com diferentes níveis de divergência (SIMON et al., 1994).
O gene 16S rRNA (small subunit ribosomal RNA) é um gene estrutural não
codificante, cuja combinação de regiões variáveis e conservadas é provavelmente uma das
razões de ter se tornado o gene mais popular para a reconstrução de filogenias animais. Se
devidamente utilizado, permite estudo de relações filogenéticas antigas assim como eventos
recentes (SCHUBART et al., 2000). A popularidade desse gene se deve também ao sucesso
de seu uso em estudos filogenéticos em decápodos, em que sua porção conservada mostrou-se
um eficaz marcador interespecífico (MANTELATTO et al., 2007 para revisão). Além disso, o
grande número de primers disponíveis para as análises moleculares em invertebrados também
são atrativos para o uso deste gene (SCHUBART et al., 2000).
Material e Métodos
26
O gene citocromo oxidase I (COI) sintetiza proteína de mesmo nome, localizada na
membrana interna das mitocôndrias, que participa da sequência final da cadeia respiratória
(NELSON & COX, 2006). Em diversos trabalhos com crustáceos decápodos, a taxa de
divergência das sequências de COI se mostrou relativamente maior que a de 16S (DANIELS,
2003; HARRISON, 2004; FRANCISCO & GALETTI JUNIOR, 2005; LIU et al., 2007;
PILEGGI & MANTELATTO, submetido), sendo assim, mais adequado em estudos
populacionais.
Diante disso, a porção conservada do gene 16S foi utilizada por ser um marcador
capaz de distinguir variações no âmbito específico, e assim possibilitar uma contextualização
das populações de M. amazonicum dentro do gênero Macrobrachium, enquanto sequências
parciais do gene COI foram escolhidas por serem menos conservadas e permitir o acesso à
estrutura e variabilidade genética das populações.
3.3.2. Obtenção dos dados
Todos os procedimentos seguiram os protocolos de MANTELATTO et al. (2006,
2007 e 2009) com alguns ajustes necessários à adequação do tipo de material.
Extração do DNA
Foram selecionados de cada lote, sempre que possível, os espécimes de maior
tamanho, machos e adultos, cujas características morfológicas não levantaram dúvidas quanto
à identificação da espécie. Os testemunhos genéticos, dos quais foram obtidas amostras de
tecido para as análises, foram depositados na CCDB/FFCLRP/USP (Tabela 3).
O DNA genômico foi extraído do tecido muscular abdominal (em espécimes de
pequeno porte) ou dos pereiópodos (em espécimes de médio a grande porte). O tecido foi
incubado por 24 h em tampão de lise a 65°C, posteriormente macerado e as proteínas foram
Material e Métodos
27
separadas pela adição de acetato de amônio (7,5 M) anteriormente à centrifugação. O DNA
foi precipitado pela adição de isopropanol resfriado seguido de centrifugação. O resíduo
(pellet) resultante (após 24 h de descanso a -20°C) foi lavado com etanol 70%, liofilizado e
ressuspendido em tampão TE.
A concentração do DNA extraído foi avaliada por espectrofotômetro SP-220
Biospectro
®
. Soluções contendo DNA extraído e água destilada e deionizada foram
submetidas às medições de absorbância com 260 ηm de comprimento de onda. Além disso, a
concentração e a qualidade do DNA extraído também foram observadas em eletroforese com
gel de agarose 1% e fotografada com câmera digital C-7070 Olimpus
®
em um transiluminador
UV M20 UVP
®
. Esses procedimentos permitiram adequar a concentração do DNA extraído à
concentração necessária (cerca de 200-300 ηg) para a realização da amplificação dos genes de
interesse pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) (SAMBROOK et al., 1989).
Amplificação do DNA
A região de interesse (fragmentos dos genes mitocondriais 16S e COI) foi amplificada
por meio da técnica de PCR utilizando-se iniciadores (primers) universais 16Sar (5’-
CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) e 16Sbr (5’-CCGGTC TGAACTCAGATCACG T-3’)
(PALUMBI et al., 1991), e COIa (5’-AGTATAAGCTGG GTAGTC-3’) e COIf (5’-
CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3’) (PALUMBI & BENZIE, 1991). Os produtos de PCR
foram obtidos em reação contendo água destilada e deionizada, PCR Buffer (10X), MgCl
2
25
mM, betaína (5 M), DNTPs (10 mM), primers (10 ρmol), Thermus aquaticus (Taq)
polimerase (5 U/µl) e DNA previamente extraído.
A amplificação do DNA foi realizada no PxE 0.2 Thermal Cycler Thermo® com os
seguintes ciclos termais: 16S - desnaturação inicial por 5 min a 95°C; anelamento por 35
ciclos (45s a 95°C; 30s a 48-50°C e 1 min a 72°C); extensão final por 3 min a 72°C; COI -
Material e Métodos
28
desnaturação inicial por 2 min a 94°C; anelamento por 35 ciclos (30s a 94°C; 30s a 48-50°C e
1 min a 72°C); extensão final por 2 min a 72°C. Os resultados dos PCRs foram observados
em eletroforese com gel de agarose 1% e fotografados com câmera digital C-7070 Olimpus
®
em um transiluminador UV M20 UVP
®
.
Purificação e amplificação dos produtos do PCR
A purificação foi realizada por meio de filtros Microcon 100 da Millipore
®
e do kit
SureClean Plus. Utilizou-se para a reação de sequenciamento água destilada e deionizada, Big
Dye
®
Terminator Sequencing Buffer (2,5x), Big Dye
®
Terminator Cycle Sequencing (Applied
Biosystems), primer (10 ρmol) e produto do PCR previamente purificado. O PCR de
sequenciamento foi realizado com o seguinte ciclo termal: desnaturação inicial por 2 min a
96°C; anelamento por 35 ciclos (45s a 96°C; 30s a 48-50°C e 4 min a 60°C).
Precipitação e sequenciamento do DNA
O produto das reações de PCR foi precipitado pela adição de isopropanol 75%,
seguido de leve agitação no vórtex e incubação à temperatura ambiente. Após centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e secado à temperatura ambiente. O precipitado foi lavado com
etanol 70% e centrifugado novamente. Após purificação e precipitação, os produtos das
reações de PCR foram sequenciados em sequenciador automatizado ABI 3100 Genetic
Analyzer
®
do Departamento de Biologia da FFCLRP/USP.
Edição das sequências
Todas as sequências foram confirmadas pelo sequenciamento de ambas as fitas e
comparadas com sequências depositadas no GenBank. A edição das sequências e o consenso
das fitas foram realizados no programa computacional BioEdit 7.0.7.1 (HALL, 1999).
Material e Métodos
29
3.3.3. Análise dos dados
Por ter sido utilizada a porção mais conservada do gene 16S, foi obtida sequência
deste marcador de apenas um indivíduo de cada população de M. amazonicum. Entretanto,
foram obtidas sequências parciais do gene COI de 3 a 10 indivíduos de cada população,
dependendo da disponibilidade de material (Tabela 3).
Análises filogenéticas
Os exemplares de M. amazonicum utilizados representaram populações costeiras e
continentais de diversas localidades do Brasil, incluindo a localidade tipo da espécie (Tabela
3). Com base na filogenia proposta para o gênero Macrobrachium (PILEGGI &
MANTELATTO, submetido), foi possível identificar as espécies do gênero mais relacionadas
e seguramente distantes à M. amazonicum, a fim destas serem utilizadas como grupo externo.
Além disso, foram incluídas nas análises a espécie tipo do gênero (M. americanum Bate,
1868) e outras espécies com ocorrência na América do Sul (Tabela 3). As espécies de
Macrobrachium selecionadas foram incluídas nas análises com a intenção de contextualizar as
populações de M. amazonicum dentro do gênero, verificar se as mesmas constituem um clado
monofilético, e ainda, estabelecer as relações de parentesco entre elas.
Material e Métodos
30
Tabela 3 - Relação das espécies utilizadas nas análises moleculares. (Coleção, número de
catálogo. N, número de exemplares utilizados com cada marcador molecular. *, Populações
utilizadas nas análises populacionais).
N
Espécie Local e ano de coleta Distribuição Coleção Fonte
16S COI
Represa da Usina Santa Elisa, Sertãozinho,
SP, Brasil (21
o
06'46,7''S; 48
o
03'18,2''W),
2006
*
(i-01)
CCDB 1953 1 10
Rio Grande, Miguelópolis, SP, Brasil,
2007
*
(i-02)
CCDB 2015 1 4
Avaré, SP, Brasil, 2006
*
(i-03)
CCDB 2081 1 6
Igarapé Fortaleza, Santana, AP, Brasil,
2005
*
(C-01)
CCDB 1965 1 5
Lagoa do Catu, Aquiraz, CE, Brasil, 2007
*
(C-03)
CCDB 1973 1 10
Belém, PA, Brasil, 2005
*
(C-05)
CCDB 1963 1 3
Abaetetuba, PA, Brasil, 2007
*
(C-07)
CCDB 2084 1 8
Rio Paricatuba, Santa Bárbara, PA Brasil
(01
o
14'30'S; 48
o
19'52''W), 2008
*
(C-09)
CCDB 2119 1 8
Aquidauana, MS, Brasil, 2007
*
(c-01)
CCDB 1970 1 9
Miranda, MS, Brasil, 2007
*
(c-02)
CCDB 1971 1 8
Corumbá, distrito de Nhecolândia, Pantanal
do Abobral, MS, Brasil, 1990 (c-04)
CCDB 2313 1 -
Rio Amazonas, próximo à Itacoatiara, AM,
Brasil, 2007 (localidade tipo)
*
(A-02)
CCDB 2085 1 10
Macrobrachium
amazonicum
Tapauá, AM, Brasil (04
o
30'19''S;
62
o
03'19''W), 2007 (A-04)
América do Sul
CCDB 2312
Presente estudo
1 -
Grupo externo
M. acanthurus
Rio da Praia da Siriuba, Ilha de São
Sebastião, SP, Brasil, 2006
CCDB 2134 1 1
M. americanum Costa Rica, Pacífico Sul, 2005
América Central e
do Sul
CCDB 1731 1 1
M. brasiliense Rio Claro, Serra Azul SP, Brasil, 2006 CCDB 2135 1 1
M. borellii
San Antonio de Areco, Buenos Aires,
Argentina, 2003
América do Sul
UFRGS 3669 1 1
M. carcinus Santana, AP, Brasil, 2005 CCDB 2122 1 1
M. crenulatum
Cerro Copei, Isla Margarita, Venezuela,
2006
América Central e
do Sul
CCDB 2124 1 1
M. ferreirai Lago Tupé, Manaus, AM, Brasil, 2005 CCDB 2125
1 -
M. jelskii Rio Tietê, Pereira Barreto, SP, Brasil, 2006
América do Sul
CCDB 2129 1 1
M. olfersi
Rio do Curral, Ilha de São Sebastião, SP,
Brasil, 2006
América Central e
do Sul
CCDB 2138
PILEGGI &
MANTELATTO
(submetido)
1 1
i, população continental introduzida; C, costeira; c, continental da Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai; e A, continental da Região Hidrográfica
Amazônica. CCDB, Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade
de São Paulo. UFRGS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Recomenda-se que primeiro sejam resolvidas, ao menos de modo preliminar, as
relações de parentesco em um nível mais abrangente, delimitando um grupo que seja
monofilético, para depois iniciar uma análise apenas com os elementos que fazem parte desse
grupo (AMORIM, 2002). Assim, sendo o gênero Macrobrachium um grupo natural
Material e Métodos
31
(MURPHY & AUSTIN, 2005; LUI et al., 2007; PILEGGI & MANTELATTO, submetido), a
avaliação do status taxonômico de M. amazonicum, conforme descrito no parágrafo anterior,
constituiu uma análise fundamentada e pertinente.
As sequências obtidas de fragmentos dos genes mitocondriais 16S e COI foram
previamente editadas e alinhadas no programa Clustal W (THOMPSON et al., 1994), com
interface no BioEdit, para a eliminação de possíveis ruídos que pudessem interferir no
resultado das análises. Posteriormente, os gaps foram removidos, de maneira a se obter
sequências não alinhadas. Estas foram analisadas no programa POY 4.0 (VARÓN et al.,
2007) usando o método de otimização direta (cada alinhamento gerado é seguido pela procura
da respectiva topologia), com parcimônia como o critério de otimização (WHEELER, 1996).
Árvores foram construídas através da adição randômica de sequências seguida pela
combinação de diversos comandos de refinamento, utilizados para aumentar a eficiência da
busca pela árvore mais parcimoniosa (“perturb”, “ratchet”, “branch swapping”: “subtree
pruning and regrafting” e “tree bisection and reconnection”). Análises de sensibilidade
(WHELER, 1995) foram realizadas sob 10 parâmetros diferentes de custo para transição,
transversão e indels (deleção ou inserção) (APÊNDICE).
Análises de distância
Análises de distância foram realizadas a partir de um único alinhamento estático com
sequências de ambos os genes (Tabela 3). As sequências foram alinhadas com parâmetros
predefinidos no programa Clustal W. Regiões ambíguas do alinhamento foram removidas. Os
modelos de substituição empregados nos cálculos das matrizes de distância foram
selecionados, segundo o critério Akaike Information (AIC) (POSADA & BUCKLEY, 2004),
dentre as 56 alternativas disponíveis pelo programa ModelTest 3.7 (POSADA &
CRANDALL, 1998). Os dados das matrizes foram agrupados pelo método de Neighbor
Material e Métodos
32
Joining (NJ) (SAITOU & NEI, 1987) no programa PAUP 4.0 beta10 (SWOFFORD, 2003),
usando máxima verossimilhança como fator de correção. A consistência das topologias foi
mensurada pelo método de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985), com 1000 réplicas, e apenas
valores de confiança acima de 50% foram apresentados.
A fim de avaliar a taxa de variação intra e interespecífica, distâncias genéticas foram
calculadas por distância p usando o PAUP. Todas as posições nucleotídicas, uma a cada vez,
foram comparadas diretamente para cada par de sequências.
Análises populacionais
Diversas populações de M. amazonicum foram utilizadas nas análises, incluindo a
localidade tipo da espécie (Tabela 3). As sequências de COI foram alinhadas com parâmetros
predefinidos no programa ClustalW, com interface no BioEdit.
O número de haplótipos foi calculado no programa DnaSP 4.10.9 (ROZAS & ROZAS,
1999), e a diversidade haplotípica e diversidade nucleotídica foram calculados para cada
população usando o programa computacional Arlequin 3.1 (EXCOFFIER et al., 2005). Redes
de haplótipos foram construídas pelo método de parcimônia estatística (com 95% de nível de
confiança), no programa TCS 1.21 (CLEMENT et al., 2000); e pelo método de Median-
Joining, no programa Network (BANDELT et al., 1999), com preparação dos dados no
programa DnaSP.
As redes foram construídas em dois momentos. Primeiramente, desconsideraram-se as
populações introduzidas no estado de São Paulo, pois a origem destas não é sabida, e os
resultados poderiam ser enviesados ou mascarados pela presença das mesmas durante as
análises. A população do Ceará (C-03), assim como outras do nordeste brasileiro (COELHO,
1963; PINTO, 1977; BRAGAGNOLI & GROTTA, 1995), foi provavelmente introduzida a
partir de matrizes costeiras de distribuição natural, e por isso foi agrupada juntamente com as
Material e Métodos
33
estas nas análises. Num segundo momento, uma vez que já se conhece a variabilidade
genética entre as populações naturais, uma análise incluindo as populações introduzidas
permitiu um estudo mais completo, com informações sobre a possível origem dessas
populações introduzidas.
A diferenciação e a estrutura genética das populações foram acessadas por meio da
Análise de Variância Molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al., 1992), considerando a
variação em cada sítio nucleotídico separadamente, utilizando o programa Arlequin. Esta
análise permitiu estimar o nível de subdivisão genética intra-específica, considerando a
variação das frequências gênicas em três níveis hierárquicos: variação entre indivíduos, entre
indivíduos da mesma população e entre populações.
Inicialmente, como controle, foi realizada uma análise com estrutura hierárquica
simples (ausência de estrutura), na qual as 11 populações foram estruturadas em um único
grupo. Este teste proporcionou uma estimativa geral da diferenciação das populações
analisadas (M. MANFRIN, comunicação pessoal). Posteriormente, estas foram estruturadas
de acordo com os grupos visualizados pelas redes de haplótipos, com e sem as populações
introduzidas em São Paulo.
4
RESULTADOS
Resultados
34
4.1. Dados morfológicos
Durante a revisão taxonômica foram analisados 313 exemplares de M. amazonicum
(154 machos e 159 fêmeas, das quais 25 eram ovígeras) oriundos de 44 populações
distribuídas ao longo do território brasileiro (Tabela 1).
Abaixo, seguem sintetizados os resultados obtidos durante a revisão taxonômica e a
análise comparativa dos caracteres estudados, além da coletânea taxonômica e sistemática,
que reuniu todas as informações disponíveis na literatura incluindo os dados obtidos nesse
estudo.
Holonímia
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862)
Palaemon Lamarrei [non Palaemon Lamarrei H. Milne Edwards, 1837] – WHITE,
1847; DE HAAN, 1849; SMITH, 1869; DE MAN, 1879; NOBILI, 1897.
Palaemon lamarrei: ORTMANN, 1891.
Palaemon lamarrei – ORTMANN, 1893; DE MAN, 1897; THOMPSON, 1901.
Bithynis lamarrei: YOUNG, 1900.
Palaemon amazonicus Heller, 1862.
Palaemon amazonicus – THALLWITZ, 1892; ORTMANN, 1897; MOREIRA, 1901;
JENTINK, 1912; SUNIER, 1925; GORDON, 1935.
Palaemon amazonicus [non Palaemon amazonicus Heller, 1862] – PESTA, 1931.
Palaemon Amazonicus: NOBILI, 1896.
Palaemon (Eupalaemon) Amazonicus [non Palaemon amazonicus Heller, 1862]: NOBILI,
1901.
Bithynis amazonicus: MOREIRA, 1912.
Bithynis amazonicus – MOREIRA, 1913.
Macrobrachium amazonicus [non Palaemon amazonicus Heller, 1862]: SCHMITT, 1936.
Macrobrachium amazonicum: HOLTHUIS, 1950a
Macrobrachium amazonicum – HOLTHUIS, 1950b, 1952, 1959; COELHO, 1963;
HOLTHUIS, 1966; GONZALES, 1975; FAVARETTO et al., 1976; GOMES-
CORRÊA, 1977; PINTO, 1977; VARGAS & PATERNINA, 1977; RAMOS-
PORTO et al., 1978; ROJAS et al., 1978; GUEST, 1979; GUEST &
Resultados
35
DUROCHER, 1979; HOLTHUIS, 1980; RODRÍGUEZ, 1980; ROMERO, 1980;
VÁSQUEZ LÉON, 1980; BARRETO & SOARES, 1982; COELHO et al., 1982;
KENSLEY & WALKER, 1982; RODRÍGUEZ, 1982; McNAMARA et al.,
1983; GAMBA, 1984; VEGA-PÉREZ, 1984; COELHO & RAMOS-PORTO,
1985; MAGALHÃES, 1985; ALVES, 1986; LAWRENCE et al., 1986; LOBÃO
et al., 1986; MOREIRA et al., 1986; LOBÃO et al., 1987; ODINETZ-
COLLART, 1987; MAGALHÃES & WALKER, 1988; ODINETZ-COLLART,
1988; COELHO et al., 1989; COELHO et al., 1990; ODINETZ-COLLART,
1990; RAMOS-PORTO & COELHO, 1990; ROJAS et al., 1990; ROVERSO et
al., 1990; ODINETZ-COLLART, 1991a e b; SCAICO, 1992; WALKER, 1992;
ZANDERS & RODRÍGUEZ, 1992; CHAVES & MAGALHÃES, 1993;
MOREIRA & ODINETZ-COLLART, 1993; ODINETZ-COLLART, 1993;
ODINETZ-COLLART & MOREIRA, 1993; ARRAES & RAMOS-PORTO,
1994; LOBÃO et al., 1994; ODINETZ-COLLART & MAGALHÃES, 1994;
PAIVA & CAMPOS, 1995; BRAGAGNOLI & GROTTA, 1995; LOBÃO et al.,
1996; LÓPEZ & PEREIRA, 1996; ODINETZ-COLLART & RABELO, 1996;
PETTOVELLO, 1996; BARROS & BRAUN, 1997; BIALETZKI et al., 1997;
PEREIRA, 1997; ARAGÃO et al., 1998; PORTO, 1998; RAMOS-PORTO &
COELHO, 1998; COLER et al., 1999; MAGALHÃES, 1999; MORAES-
RIODADES et al., 1999; KUTTY et al., 2000; MAGALHÃES, 2000;
ALEKHNOVICH & KULESH, 2001; MORAES-RIODADES & VALENTI,
2001; HAYD & NAKAGAKI, 2002; PEIXOTO, 2002; VALENTI &
MORAES-RIODADES, 2002; GARCIA-DÁVILA & MAGALHÃES, 2003;
MELO, 2003; MONTOYA, 2003; PEZZATO et al., 2003; DA SILVA et al.,
2004; MORAES-RIODADES & VALENTI, 2004; PAPA et al., 2004; PORTO,
2004; ARAUJO & VALENTI, 2005; ESPÍRITO-SANTO & ISAAC, 2005;
MAGALHÃES et al., 2005; KEPPELER & VALENTI, 2006; KIYOHARA,
2006; MORAES-RIODADES et al., 2006; SANTOS et al., 2006; ARAUJO &
VALENTI, 2007; AUGUSTO et al., 2007; HAYD, 2007; MACIEL, 2007;
MAGALHÃES & PEREIRA, 2007; SAMPAIO et al., 2007; SANTOS et al.,
2007; SILVA et al., 2007; MORAES-VALENTI & VALENTI, 2007;
VALENCIA & CAMPOS, 2007; HAYD et al., 2008; PRETO et al., 2008;
ANGER et al., 2009.
Palaemon ensiculus Smith, 1869.
Bithynis ensiculus: YOUNG, 1900.
“Palaemon Dieperinkii” [anoplonímia]: DE HANN – Nome não publicado, porém, mencionado por
DE MAN (1879).
Resultados
36
Descrição
Rostro. Longo, delgado e convexo na região orbital, alcançando distintamente (com no
mínimo 1/4 do seu comprimento, mas geralmente com 2/5 ou mais) além do escafocerito.
Metade anterior dirigida obliquamente para cima. Margem superior provida de 6 a 14 dentes,
sendo o primeiro situado atrás da órbita. Crista basal na metade proximal do rostro formada
pelos primeiros dentes (5 a 9), aproximados entre si. Últimos dentes mais espaçados,
normalmente com um espaço vazio entre o penúltimo e o antepenúltimo dente, sendo o último
próximo à extremidade. Margem inferior com 5 a 13 dentes, sendo os distais mais largamente
espaçados que os proximais. Numerosas cerdas plumosas presentes entre os dentes de ambas
as margens do rostro. Escafocerito 2,5 a 3 vezes tão longo quanto largo, com margem externa
reta ou ligeiramente convexa na porção proximal e ligeiramente côncava na parte distal.
Carapaça. Lisa. Espinho hepático com base mais larga ou igual a do antenal, ambos
com aproximadamente o mesmo comprimento.
Abdome. Liso. Extremidade da pleura do quinto somito levemente pontiaguda, com
um pequeno, mas distinto espinho. Apêndice interno do segundo par de pleópodos com
metade ou pouco mais da metade do comprimento do apêndice masculino. Sexto segmento
abdominal 1,5 a 2 vezes o comprimento do quinto.
Primeiro par de pereiópodos. Delgados, iguais na forma e no tamanho, alcançando até
ou ligeiramente além do escafocerito. Dedos ligeiramente maiores que a palma. Carpo 2,5
vezes o comprimento da quela e 4/3 o do mero. Mero 2 vezes o comprimento do ísquio.
Artículos cobertos por poucas e esparsas cerdas simples, sendo estas mais concentradas na
quela, principalmente nos dedos (tufos de cerdas).
Segundo par de pereiópodos. Mais robustos que o primeiro par. Iguais na forma e
tamanho, alcançando com a quela, carpo ou mero além do escafocerito. Espinhos e cerdas
simples na maioria artículos. Ísquio pouco menor que o mero. Mero 2/3 o comprimento do
Resultados
37
carpo. Carpo quase tão longo ou ligeiramente maior que a quela; alargado distalmente.
Própodo 2 vezes ou pouco mais que o comprimento do dátilo. Quela e palma alongadas.
Dedos com 3/4 do comprimento da palma, cobertos por cerdas. Margens cortantes de ambos
os dedos providas, nas partes proximais, de um dente, atrás do qual se encontram alguns
dentículos.
Terceiro a quinto par de pereiópodos. Delgados, iguais na forma e no tamanho.
Artículos cobertos por espínulos e cerdas simples esparsas. Terceiro par quase alcança o final
do escafocerito com o dátilo ou ultrapassa com metade deste; própodo 2,5 a 3 vezes o dátilo;
carpo metade do comprimento do própodo; mero pouco menor que o própodo. Quarto par
alcança o final do escafocerito com extremidade distal ou todo dátilo; própodo 3 a 3,5 vezes o
dátilo; carpo metade ou pouco mais que metade do própodo; mero tão longo quanto o
própodo. Quinto par mais delgado que os demais, alcançando com todo dátilo ou com
extremidade distal do própodo o final do escafocerito; própodo 3,5 a 4 vezes o dátilo; carpo
pouco mais que metade do própodo; mero pouco maior que o própodo.
Telso. Estreito, quase 1,5 vezes o comprimento do sexto segmento abdominal.
Superfície dorsal provida de 2 pares de espínulos dispostos na metade e até 3/4 de seu
comprimento. Margem posterior terminada em um ponto mediano agudo e com 2 pares de
espinhos subiguais no tamanho; par interno podendo ou não alcançar a extremidade do telso, e
em alguns casos ultrapassando esta. Um par de cerdas plumosas ocasionalmente presente
entre os espinhos internos. Exopodito dos urópodos com espinho móvel do mesmo tamanho
ou pouco mais longo que a projeção espiniforme da margem externa.
Morfotipos. Machos TC (translucent claw) com quelípodos curtos (20,0 a 54,3 mm de
comprimento), ultrapassando com a quela o final do escafocerito; ísquio e mero ausentes de
espinhos; carpo com poucas cerdas simples e pequenos tubérculos, alguns com pequenos
espinhos com inclinação entre 7 e 15° em relação à cutícula; própodo com poucas cerdas e
Resultados
38
nenhum espinho, frequentemente poucos tubérculos presentes, dátilo com cerdas simples
ocasionalmente presentes. Machos CC (cinnamon claw) com quelípodos curtos (24,7 a 54,8
mm), ultrapassando com o carpo o final do escafocerito, com poucos e reduzidos espinhos;
todas articulações com cerdas simples e pequenos tubérculos, exceto no dátilo; ísquio
frequentemente com espinhos; mero com pequenos espinhos; carpo coberto com pequenos
tubérculos e espinhos com angulação entre 8 e 36°; própodo com muitas cerdas simples (mais
que nos TC) e poucos espinhos com inclinação semelhante a do carpo; dátilo com tufos de
cerdas simples, sem formar cobertura aveludada. Machos GC1 (green claw 1) com quelípodos
longos (56,2 a 98,8 mm, nunca maior que o comprimento pós-orbital – distância entre a
margem posterior do olho direito e a extremidade distal do telso), ultrapassando o escafocerito
com a extremidade distal ou com metade do carpo; articulações com cerdas simples mais
abundantes que em TC e CC; ísquio com pequenos tubérculos e espinhos; mero com poucos e
pequenos tubérculos e espinhos curtos e robustos; carpo coberto de espinhos robustos
(algumas vezes longos e finos) com ângulo de 34 a 65° com a cutícula; própodo com muitos
pequenos e robustos espinhos, com inclinação semelhante a do carpo; dedos distintamente
pubescentes, com cerdas paposas. Machos GC2 (green claw 2) com quelípodos maiores que
em GC1 (71,9a 175,6 mm, sempre maior que o comprimento pós-orbital), ultrapassando o
escafocerito com a extremidade proximal do carpo ou com o mero; padrão de cerdas/espinhos
semelhantes ao de GC1; angulação dos espinhos do carpo e própodo mais aberta que nos
demais morfotipos (51 a 92°); dedos mais pubescentes que em CG1.
Fêmeas. Segundo par de pereiópodos mais delgados que nos machos, alcançando com
metade do carpo ou menos o escafocerito. Espínulos presentes na palma, carpo e mero, porém
menos distintos que nos machos. Dedos quase tão longos quanto o própodo, com diversas
cerdas simples, mas desprovidos de pubescência aveludada. Carpo distintamente maior que o
própodo.
Resultados
39
Juvenis. Rostro alcança com 1/3 do comprimento do além do escafocerito. Longo
espaço entre os penúltimos e antepenúltimos dentes da margem superior do rostro não tão
evidente em alguns. Pereiópodos com espinhos menos distintos ou ausentes. Primeiro par de
pereiópodos não alcança o final do escafocerito. Segundo par de pereiópodos menos robustos
que nos adultos. Par interno alcança ou ultrapassa a extremidade do telso, com um par de
cerdas plumosas.
Diagnose
Rostro longo, delgado, alcançando distintamente além do escafocerito; metade anterior
dirigida obliquamente para cima; margem superior com 6 a 14 dentes, sendo os primeiros (5 a
9) aproximados formando uma crista basal; último dente próximo à extremidade, com espaço
vazio entre o penúltimo e o antepenúltimo dente; margem inferior provida de 5 a 13 dentes,
sendo os distais mais largamente espaçados que os proximais. Carapaça e abdome lisos.
Primeiro par de pereiópodos delgados, iguais na forma e no tamanho, alcançando até ou
ligeiramente além do escafocerito. Segundo par de pereiópodos alcançando com no mínimo
todo quelípodo além do escafocerito, iguais na forma e tamanho, com espinhos e cerdas
simples na maioria dos artículos; dedos com 3/4 do comprimento da palma com margens
cortantes providas, nas partes proximais, de um dente, atrás do qual se encontram alguns
dentículos. Terceiro a quinto par de pereiópodos delgados com espínulos e cerdas simples
esparsas. Margem posterior do telso terminando em um ponto mediano agudo, com 2 pares de
espinhos subiguais no tamanho; par interno podendo ou não alcançar a extremidade do telso.
Resultados
40
Tamanho
Comprimento total: 12 a 150 mm em machos; 34 a 95 mm em fêmeas não ovígeras, e
44 a 110 mm fêmeas ovígeras. Comprimento da carapaça: 4,5 a 52,0 mm em machos; 4,8 a
25,8 mm em fêmeas não ovígeras, e 7,9 a 26,0 mm em fêmeas ovígeras.
Morfotipos. Comprimento pós-orbital (distância entre a margem posterior do olho
direito e a extremidade distal do telso): machos TC com pequeno porte (43,2 a 73,0 mm);
machos CC pouco maiores que os TC (49,9 a 73,6 mm); machos GC1 com grande porte (67,7
a 105,8 mm); machos GC2 também com grande porte (65,4 a 104,0 mm). Machos TC e CC
diferem em tamanho; GC1 e GC2 similares entre si e maiores que estes.
Cor
Quando vivos, corpo transparente parecendo ser cinza. Linhas longitudinais escuras ao
longo do rostro; na carapaça, atrás do espinho antenal, e ao longo de cada margem lateral do
telso. Pedúnculo ocular com pontos formados por cromatóforos vermelhos e amarelos.
Pedúnculo antenular com coloração escura em toda margem interna e externa do segmento
basal. Flagelo interno da antênula com coloração escura, e flagelo externo com coloração
pálida. Exopodito do urópodo com linha escura ao longo da margem externa e um evidente
ponto escuro na parte distal. Metade externa do endopodito do urópodo com linha
longitudinal escura.
Morfotipos. Machos TC com quelípodos translúcidos; ísquio translúcido, incolor,
esporadicamente com alguns pigmentos marrons na parte distal; mero translúcido com,
algumas vezes, coloração esverdeada; carpo e própodo marrons semi-translúcidos; dátilo
opaco, levemente esverdeado. Machos CC com quelípodos de coloração canela; ísquio
esverdeado e translúcido, com pigmentos marrons distalmente e ocasionalmente com
pigmentos verdes; mero esverdeado e translúcido; carpo verde claro com diversas manchas
Resultados
41
marrons; própodo bege-esverdeado com faixa marrom presente, contínua ou não, da porção
mediana até a articulação com o dátilo; dátilo bege com porções esverdeadas e manchas
marrons e verde-azuladas na articulação com o própodo. Machos GC1 e GC2 com quelípodos
de coloração verde-musgo; ísquio opaco, esverdeado ou esbranquiçado; mero verde com
espinhos esverdeados; carpo verde-musgo coberto de espinhos verdes; própodo verde-musgo
com muitos espinhos verdes, algumas vezes marrons e longa faixa verde-azulada presente da
porção mediana até a articulação com o dátilo; dátilo marrom com porções verde-musgo e
manchas verde-azuladas na articulação com o própodo. Todos grupos com grande quantidade
de pigmentos marrons nas articulações (com exceção do ísquio em TC).
Material examinado
Abreviações: CAUNESP, Centro de Aquicultura da Universidade Estadual Paulista. CCDB, Coleção de
Crustáceos do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo. INPA-CR, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coleção de Crustáceos.
INPA nc, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, material não catalogado. MZUSP, Museu de Zoologia da
Universidade de São Paulo. NHMW, Naturhistorisches Museum in Wien. UFRGS, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
Brasil, Acre: ― Lago Amapá (meandro do Rio Acre), Rio Branco; 10°03'01,8''S,
67°50'52,8''W; 09/08/2001; L. R. Malabarba; W. M. Aiache; C. Malabarba & D. P. Silva: 4
♂, 5 ♀ e 1 ♀♀ (UFRGS 3180).
Brasil, Amapá: ― Rio Araguari, Reserva Biológica do Lago Piratuba, Vista Alegre;
15/08/1992; 1 ♂ e 3 ♀ (INPA-CR 1059). ― Igarapé Fortaleza, Santana; 04/05/2005; F. L.
Mantelatto: 5 ♂ e 1 ♀ (CCDB 1965).
Brasil, Amazonas: ― Rio Amazonas, próximo à Itacoatiara; 09/2007; G. Y. Hattori: 6
♂ e 5 ♀ (CCDB 2085). ― Lago Pirapora, Costa do Catalão, Iranduba, próximo à Manaus;
11/04/2006; C. P. de Deus: 1 ♂ e 3 ♀ (CCDB 2082). ― Lago Cauá Grande, Rio Purus;
4°12,231'S, 61°50,398'W; 9/11/2006; L. R. py-Daniel: 5
♂ e 2 ♀ (CCDB 2083). ― Tapauá;
04°30'19''S e 62°03'19''W; 03/11/2007; D. M. Pimpão et al.: 7 ♂ e 3 ♀ (INPA nc). ― Rio
Resultados
42
Amazonas, Ilha do Careiro (quase em frente ao encontro das águas); 27/10/1981; 2 ♂, 2 ♀ e 1
♀♀ (INPA-CR 108). ― Paraná do Amanã, lago Amaná; 01/12/1984; 1 ♂ e 3 ♀ (INPA-CR
086). ― Jutaí; 15/10/1968; EPA: 1 ♂ e 2 ♀ (MZUSP 7370). ― Rio Amazonas; 22/7/1996; A.
M. Zanata et al.: 2 ♂, 2 ♀ e 2 ♀♀ (MZUSP 12698).
Brasil, Bahia: ― Rio Paraguaçu, Reservatório de Pedra do Cavalo; 12°30'33,9''S,
39°06'13,7''W; 12/6/2008; 5 ♂, 2 ♀ e 1 ♀♀ (CCDB 2384).
Brasil, Ceará: ― Lagoa do Catu, Aquiraz; 21/3/2007; 14 ♂, 13 ♀ e 1 ♀♀ (CCDB
1973).
Brasil, Maranhão: ― Igarapé da Bocaina, Vitória do Mearim; 09/08/1988; A. A.
Rocha: 2 ♂ e 5 ♀ (MZUSP 9576).
Brasil, Mato Grosso: ― Campo Jofre, Município de Poconé; 28/04/1985; V. A.
Araújo: 1 ♂ e 3 ♀ (INPA-CR 324). ― Barão de Melgaço; 17/10/1984; Lepipan: 4 ♂, 1 ♀ e 1
♀♀ (MZUSP 6408).
Brasil, Mato Grosso do Sul: ― Aquidauana; 24/04/2007; 3 ♂ e 10 ♀ (CCDB 1970).
― Miranda; 10/5/2007; 10 ♂ e 11 ♀ (CCDB 1971). ― Lagoa do Finado Raimundo, Rio
Ivinheima; 22°47’57”S, 53°29’21”W; 10/2007 e 01/2008; A. Bialetzki & T. Piassa: 1 ♂, 2 ♀
e 3 ♀♀ (CCDB 2120). ― Rio Piquiri, Pantanal do Taquari, Itiquira; 18/7/1993; 3 ♂, 2 ♀ e 1
♀♀ (MZUSP 11535). ― Corumbá, distrito de Nhecolândia, Pantanal do Abobral, lagoa
marginal à rodovia MS-184, a 11,4 km da BEP; 15/07/1990; A. C. Marini: 3 ♂, 6 ♀ e 1 ♀♀
(INPA nc). ― Rio Miranda; 09/1979; J. C. Garavelho: 4 ♂ e 4 ♀ (MZUSP 8092).
Brasil, Pará: ― Síntipos. Rio Amazonas, Gurupa; 04/1829; J. Natterer: 1 ♂ e 3 ♀
(NHMW 562). ― 04/1829; 1 ♂ e 3 ♀ (NHMW 563). ― Abaetetuba; 21/09/2007; F. L.
Mantelatto; 4 ♂, 5 ♀ e 1 ♀♀ (CCDB 2084). ― Belém (mercado de peixe); 29/07/2005; F. L.
Mantelatto: 3 ♂ (CCDB 1963). ― Belém; 15/03/1970; Dias & Golveia: 1 ♂ e 3 ♀ (CCDB
1864).
― Rio Amazonas, Ilha de Marajó; 07/1986; 2 ♂ (CCDB 2014). ― Rio Tocantins,
Resultados
43
Tucuruí (do reservatório até cerca de 2 km a jusante); 18/05/2000; Equipe CPA Eletronorte: 2
♀ (MZUSP 13293). ― Rio Amazonas; 23/10/1994; F. Langeani et al.: 4 ♂ e 4 ♀ (MZUSP
12706). ― Rio Tocantins; 16/07/1987; 2 ♀ e 1 ♀♀ (INPA-CR 1233). ― Rio Paricatuba,
Santa Bárbara, PA (mercado de peixe); 01°14'30'S, 48°19'52''W; 02/2008; C. Maciel: 5 ♂, 2
♀ e 1 ♀♀ (CCDB 2119). ― Furo das Marinhas, Mosqueiro, 56 km de Belém; 03/2001 e
02/04/2008; R. M. da Rocha & M. Lima: 5 ♂, 2 ♀ e 1 ♀♀ (CCDB 2385).
Brasil, Rondônia: ― Rio Guaporé; 01/10/1985; 2 ♂, 2 ♀ e 1 ♀♀ (INPA-CR 327). ―
Rio Madeira, Calama; 13/12/1980; 3 ♂ e 1 ♀ ((INPA-CR 081).
Brasil, Roraima: ― Rio Branco, Marará Paraná Fechada; 28/10/1979; M. Goulding: 2
♀ (INPA-CR 199).
Brasil, São Paulo: ― Viveiros de criação, CAUNESP, Jaboticabal; 11/08/2005; 19 ♂,
3 ♀ e 3 ♀♀ (CCDB 1955-62). ― Avaré; 02/04/2006; R. C. Costa: 6 ♂ e 4 ♀ (CCDB 2081).
― Represa da Usina Santa Elisa, Sertãozinho; 16/5/2006; E. C. Mossolin; A. S. Costa & R.
Faleiros: 4 ♂, 3 ♀ e 1 ♀♀ (CCDB 1953). ― Rio Grande, Miguelópolis; 08/2007; 2 ♂, 2 ♀ e
1 ♀♀ (CCDB 2015). ― Córrego do Veado, Presidente Epitácio; 21°43'16''S, 52°02'11''W;
15/10/2002; E. C. Mossolin & S. S. Rocha: 3 ♂, 1 ♀ e 1 ♀♀ (MZUSP 15603). ― Rio Paraná;
21°31'35''S, 52°00'33''W; 15/10/2002; E. C. Mossolin: 3 ♂, 2 ♀ e 1 ♀♀ (MZUSP 15573). ―
Rio Paranapanema; 22°33'78'' S, 51°54'69''W; 26/08/2000; 3 ♂ e 3 ♀ (MZUSP 13916). ―
Ribeirão Lajado, Rodovia Assis Chateaubriand, km 247, Penápolis; 12/01/2006; A. M. Juares:
1 ♂ e 3 ♀ (MZUSP 17210).
Tipo
“Wurde von Natterer im Amazonenstrome gefunden - Encontrado por Natterer nas
correntezas do Amazonas” (HELLER, 1862, p. 419). Johann Natterer realizou coletas no
Brasil para o Museu de Viena de 1817 a 1835, viajando do Rio de Janeiro ao Mato Grosso até
Resultados
44
o Rio Negro, onde acompanhou todo o rio Amazonas (HOLTHUIS, 1959). Assim, a
localidade tipo é Rio Amazonas, próximo à Manaus, no Brasil. Os síntipos encontram-se
depositados no Naturhistorisches Museum in Wien (Museu de História Natural de Viena,
Áustria) sob numeração de catálogo NHMW 562, tendo sido analisados em outubro de 2008
por F. L. Mantelatto & L. Pileggi, membros do LBSC/FFCLRP/USP.
Variações em M. amazonicum
O número de dentes na margem superior do rostro variou de 6 a 13entre os exemplares
oriundos de diversas localidades do Brasil analisados no presente trabalho, no entanto, a
grande maioria dos espécimes apresentou entre 8 e 12 dentes. Dentre os 313 animais
analisados, apenas dois (0,6%) apresentaram mais de 13 dentes, podendo assim, ser
considerados exceções do padrão descrito para a espécie. O mesmo foi observado para
número de dentes na margem inferior do rostro, em que a variação foi de 5 a 13 dentes, mas,
na grande maioria (98,4%) dos indivíduos, verificou-se a presença de 5 a 10.
Os caracteres de maior variação entre os exemplares analisados foram o rostro, telso,
tamanho dos indivíduos e presença dos morfotipos descritos para a espécie (MORAES-
RIODADES & VALENTI, 2004). Com base na variação desses caracteres, os exemplares
analisados puderam ser divididos em dois grupos: 1 - populações costeiras (C-01 a 12); das
Regiões Hidrográficas Amazônica e do Tocantins-Araguaia (A-01 a 17) e introduzidas no
estado de São Paulo (i-01 e 02); e 2 - populações das Regiões Hidrográficas do Paraná e
Paraguai (c-01 a 08) e introduzidas em São Paulo (i-03 a 07).
Indivíduos do grupo 1 apresentaram rostro com comprimento alcançando
distintamente além do escafocerito (com 2/5 ou mais), com a metade anterior nitidamente
curvada para cima, além de 8 a 10 dentes na margem inferior; enquanto a maioria dos
indivíduos do grupo 2 apresentou rostro um pouco mais curto, alcançando com 1/4 de seu
Resultados
45
comprimento além do escafocerito, com a metade anterior levemente curvada para cima, com
5 a 7 dentes na margem inferior (Figura 2).
A situação da porção distal da margem superior do rostro também foi variável, sendo
que alguns indivíduos podem não apresentar o longo espaço entre o penúltimo e o
antepenúltimo dente. No entanto, nenhum padrão de variação pode ser definido.
Com relação ao telso, verificou-se que indivíduos do grupo 1 apresentaram
extremidade posterior do telso terminando numa ponta cônica, com espinhos posteriores
internos nunca maiores que esta extremidade em indivíduos adultos. Já nas populações do
grupo 2, os exemplares apresentaram extremidade posterior do telso com uma margem suave
terminando numa ponta fina, com espinhos posteriores alcançando, em adultos, no mínimo até
a metade do comprimento da extremidade do telso, chegando a ultrapassar a mesma em
alguns casos (Figura 3).
Foram observadas diferenças na relação entre o tamanho dos espinhos posteriores
internos e a extremidade distal do telso. Nos juvenis, os espinhos internos alcançaram ou
ultrapassaram nitidamente a extremidade distal do telso, com um par de cerdas plumosas
sempre presente entre os espinhos internos. Nos indivíduos de maiores tamanhos, a
extremidade distal do telso ultrapassou os espinhos internos, alcançando a forma definitiva em
espécimes adultos, com par de cerdas plumosas esteve ou não presente entre os espinhos
internos (Figura 4). No entanto, foram encontradas exceções a este padrão em alguns
exemplares do grupo 2, em que os espinhos internos ultrapassaram a extremidade mesmo em
indivíduos adultos.
Os exemplares provenientes de populações do grupo 1 atingiram tamanhos maiores
(6,2 a 31,1 mm de CC) que os do grupo 2 (4,5 a 11,6 mm de CC). Apenas machos CC e TC
nas populações do grupo II, enquanto no grupo I foram identificados os quatro morfotipos
descritos para a espécie.
Resultados
46
Figura 2. Variações no número de dentes na margem inferior e no comprimento do rostro
entre populações de Macrobrachium amazonicum do Brasil. A, Corumbá, MS (c-04). B,
Aquidauana, MS (c-01). C, Miranda, MS (c-02). D, Avaré, SP (i-03). E, Aquiraz, CE (C-03).
F, Iranduba, AM (A-01). G, Itacoatiara, AM (A-02). H, Rio Branco, AC (A-04). I, Mosqueiro,
PA (C-08). J, Rio Paraguaçu, BA (C-10). A barra de escala equivale a 1 mm. Para detalhes
das populações ver Tabela 1.
Resultados
47
Figura 3. Variações no formato do telso e no comprimento dos espinhos posteriores internos
em relação à extremidade do telso entre populações de Macrobrachium amazonicum do
Brasil. A, Corumbá, MS (c-04). B, Aquidauana, MS (c-01). C, Miranda, MS (c-02). D, Avaré,
SP (i-03). E, Aquiraz, CE (C-03). F, Itacoatiara, AM (A-02). G, Mosqueiro, PA (C-08). H,
Rio Paraguaçu, BA (C-10). A barra de escala equivale a 200 µm. Para detalhes das
populações ver Tabela 1.
Figura 4. Variações no formato do telso e comprimento dos espinhos posteriores internos em
relação à extremidade do telso entre indivíduos adultos (A) e juvenis (B) de Macrobrachium
amazonicum. A barra de escala equivale a 200 µm. Os exemplares pertencem à população do
Rio Purus, AM (A-03), e ambos são machos.
Resultados
48
4.2. Dados moleculares
Foram obtidas sequências parciais do gene mitocondrial 16S com 530 pares de bases
(pb) provenientes de 22 indivíduos, sendo 13 exemplares de M. amazonicum, cada um
representando uma população diferente, e nove espécies do gênero Macrobrachium (grupo
externo) (Tabela 3). Para o gene COI, foram obtidas sequências com 569 pb para 89
indivíduos, sendo 81 exemplares de M. amazonicum, provenientes de 11 populações distintas,
e oito espécies do gênero Macrobrachium (grupo externo) (Tabela 3).
Não foi possível amplificar fragmentos de COI dos indivíduos provenientes das
populações de Tapauá, AM (A-05) e Corumbá, MS (c-04), excluindo-se assim essas das
análises feitas com esse gene. Da mesma forma, apenas a sequência de 16S encontrava-se
disponível para M. ferrerai (Tabela 3).
Análises filogenéticas
Dos 10 parâmetros de custos utilizados nas análises de otimização direta, o que
produziu a árvore mais parcimoniosa (menor custo/número de passos) foi aquele com a razão
1:1:1 entre os valores de indels/transição/transversão (Matriz 111, APÊNDICE), tanto para as
sequências parciais do gene 16S, quanto para as de COI (Tabela 4).
Resultados
49
Tabela 4 – Número de passos/custo
(
N
o
passos) e número de árvores igualmente
parcimoniosas
(
N
o
árvores) resultantes das análises filogenéticas com sequências parciais dos
genes 16S e COI, sob 10 parâmetros diferentes de custos para indels/transição/transversão.
N
o
passos N
o
árvores
Parâmetros
16S COI 16S COI
111 270 485 2 4
112 336 616 1 4
113 335 634 1 1
211 280 487 2 4
212 362 627 1 3
221 447 809 1 2
411 294 487 2 4
412 376 628 1 3
812 404 628 1 3
821 497 827 1 3
Nas análises de parcimônia, com ambos os marcadores, M. amazonicum constituiu um
clado monofilético em todas as árvores geradas durante as análises de sensibilidade (Figura 5
e 6).
A filogenia baseada em sequências de 16S revelou que os indivíduos de Itacoatiara,
AM (A-02) constituíram grupo irmão dos de Tapauá, AM (A-05), assim como os de
Aquidauana (c-01) e Corumbá (c-04), ambos provenientes do Mato Grosso do Sul. No
entanto, não foi possível identificar as relações entre as populações de uma maneira geral,
pois foi alto o número de passos não resolvidos dentro do clado M. amazonicum (Figura 5).
Por outro lado, a filogenia baseada nas sequências de COI revelou claramente a
presença de três grupos (Figura 6): I – formado pelos indivíduos provenientes da Região
Hidrográfica Amazônica (Itacoatiara, AM, A-02); II - formado pelos indivíduos provenientes
da Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (c-01 e 02) e de uma população introduzida em
São Paulo (i-03); e III - formado pelos indivíduos provenientes das populações costeiras (C-
01, 03, 05, 07 e 09) e introduzidas no estado de São Paulo (i-01 e 02). O grupo I constituiu um
clado irmão ao formado pelos grupos II e III, que, por sua vez, constituíram clados irmãos
Resultados
50
entre si. Não foi possível estabelecer as relações de parentesco dentro dos grupos, uma vez
que essa relação não se mostrou bem resolvida na filogenia.
Figura 5. Árvore filogenética para diversas populações de Macrobrachium amazonicum do
Brasil, obtido por otimização direta da sequências parciais do gene mitocondrial 16S rRNA,
com parcimônia como o critério de otimização. (O quadrado no lado esquerdo inferior indica
os parâmetros de custo utilizados na análise de sensibilidade. Quadrados pintados
correspondem aos parâmetros sob os quais o clado se manteve estável. ARG, Argentina. CR,
Costa Rica. VZ, Venezuela. Estados brasileiros: AM, Amazonas; AP, Amapá; CE, Ceará;
MS, Mato Grosso do Sul; PA, Pará; SP, São Paulo).
Resultados
51
Figura 6. Árvore filogenética para
diversas populações de Macrobrachium
amazonicum do Brasil, obtido por
otimização direta das sequências
parciais de COI, com parcimônia como
o critério de otimização. (Quadrado ao
lado esquerdo inferior indica os
parâmetros de custo utilizados na
análise de sensibilidade. Quadrados
pintados correspondem aos parâmetros
sob os quais o clado se manteve estável.
ARG, Argentina. CR, Costa Rica. VZ,
Venezuela. Estados brasileiros: AM,
Amazonas; AP, Amapá; CE, Ceará; MS,
Mato Grosso do Sul; PA, Pará; SP, São
Paulo. Grupo I: indivíduos da Região
Hidrográfica Amazônica; grupo II:
indivíduos da Região Hidrográfica do
Paraná e do Paraguai; e grupo III:
indivíduos provenientes de populações
costeiras).
Grupo III
Grupo II
Grupo I
Resultados
52
Análises de distância
O modelo de substituição que melhor se adequou às sequências de 16S, segundo o
critério AIC, foi o modelo transversional acrescido de distribuição gama da taxa de
heterogeneidade (TVM+G), com os seguintes parâmetros: frequência das bases, A = 0,3038,
C = 0,1142, G = 0,2205, T = 0,3616; proporção de sítios invariáveis = 0 e sítios variáveis
seguindo distribuição gama com parâmetro = 0,1593. Já para as sequências de COI, o modelo
escolhido foi o de Hasegawa, Kishino, Yano 85 (HASEGAWA et al., 1985) acrescido de
distribuição gama da taxa de heterogeneidade e significativa proporção de sítios invariáveis
(HKY+I+G) (POSADA & CRANDALL, 1998), com os seguintes parâmetros: frequência das
bases, A = 0,2463, C = 0,1256, G = 0,3036, T = 0,3245; proporção de sítios invariáveis =
0,5410 e sítios variáveis seguindo distribuição gama com parâmetro = 0,4135.
Assim como as análises de parcimônia, os dendrogramas obtidos por NJ com
sequências parciais de 16S e COI, revelaram a organização dos exemplares das populações de
M. amazonicum em um único grupo (Figura 7 e 8).
Dentro deste grupo, considerando as sequências de 16S, foi possível identificar três
pequenos subgrupos, sendo seus constituintes geneticamente próximos entre si: indivíduos
oriundos da Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (c-01, 02 e 04) e de Avaré, SP (i-03);
indivíduos da Região Hidrográfica Amazônica (A-02 e 05); e indivíduos provenientes de
populações costeiras (C-03 e 09) e introduzidas (i-01 e 02). No entanto, não foi possível
acessar a distância destes grupos com os demais exemplares de M. amazonicum analisados,
devido à grande similaridade genética entres as sequências que, consequentemente, refletiram
na não resolução dos passos no dendrograma (Figura 7).
Resultados
53
0.1
Macrobrachium borellii ARG
Macrobrachium brasiliense BRA
Macrobrachium ferreirai BRA
Macrobrachium jelskii BRA
Macrobrachium acanthurus BRA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Tapauá, AM
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Corumbá, MS
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
Macrobrachium americanum CR
Macrobrachium carcinus BRA
Macrobrachium crenulatum VZ
Macrobrachium olfersi BRA
98
83
94
100
100
83
64
95
64
82
0.1
Macrobrachium borellii ARG
Macrobrachium brasiliense BRA
Macrobrachium ferreirai BRA
Macrobrachium jelskii BRA
Macrobrachium acanthurus BRA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Tapauá, AM
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Corumbá, MS
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
Macrobrachium americanum CR
Macrobrachium carcinus BRA
Macrobrachium crenulatum VZ
Macrobrachium olfersi BRA
98
83
94
100
100
83
64
95
64
82
Figura 7. Dendrograma para diversas populações de Macrobrachium amazonicum do Brasil,
obtido por Neighbor Joining com sequências parciais do gene mitocondrial 16S rRNA.
(Números correspondem a valores de bootstraps; valores ≤ 50% não apresentados. ARG,
Argentina. CR, Costa Rica. VZ, Venezuela. Estados brasileiros: AM, Amazonas; AP, Amapá;
CE, Ceará; MS, Mato Grosso do Sul; PA, Pará; SP, São Paulo).
Resultados
54
Análises de distância com o gene COI (Figura 8) distinguiram os exemplares de M.
amazonicum nos mesmos três grupos (I, II e III) revelados pelas análises de parcimônia, e
estes foram suportados por altos valores de bootstrap. Os indivíduos pertencentes aos grupos
II e III formaram um agrupamento maior, sugerindo proximidade genética. A distância
verificada entre estes e o grupo I constituiu indicativo de uma maior separação genética. Não
foi possível estabelecer as relações de distância dentro dos grupos, uma vez que estas não se
mostraram bem resolvidas no dendrograma (Figura 8).
As taxas de divergência estimadas pelas matrizes de distância variaram entre 0,0 e
14,7% para 16S e 0,0 a 19,9% para COI. Considerando as sequências de 16S, indivíduos de
espécies diferentes apresentaram distância genética entre 4,8 e 14,7%, enquanto a distância
intraespecífica (entre os exemplares de M. amazonicum provenientes das 13 populações
diferentes) variou de 0,0 a 1,1%. As sequências de COI revelaram distância interespecífica
entre 13,2 e 19,9%, enquanto a distância intraespecífica (entre os exemplares de M.
amazonicum provenientes das 11 populações diferentes) variou de 0,0 a 3,3%.
Resultados
55
Figura 8. Dendrograma para diversas populações de Macrobrachium amazonicum do Brasil,
obtido por Neighbor Joining com sequências parciais do gene mitocondrial COI. (Números
correspondem a valores de bootstraps; valores ≤ 50% não apresentados. ARG, Argentina. CR,
Costa Rica. VZ, Venezuela. Estados brasileiros: AM, Amazonas; AP, Amapá; CE, Ceará;
MS, Mato Grosso do Sul; PA, Pará; SP, São Paulo. Grupo I: indivíduos da Região
Hidrográfica Amazônica; grupo II: indivíduos da Região Hidrográfica do Paraná e do
Paraguai; e grupo III: indivíduos provenientes de populações costeiras).
0.1
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Itacoatiara, AM
Macrobrachium acanthurus BRA
Macrobrachium jelskii BRA
Macrobrachium americanum CR
Macrobrachium carcinus BRA
Macrobrachium crenulatum VZ
Macrobrachium olfersi BRA
Macrobrachium borellii ARG
Macrobrachium brasiliense BRA
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
76
100
99
64
100
54
65
100
63
100
64
64
Grupo III
Grupo II
Grupo I
55
65
65
90
65
66
0.1
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Miguelópolis, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Sertãozinho, SP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Aquiraz, CE
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Abaetetuba, PA
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Belém, PA
M. amazonicum Santana, AP
M. amazonicum Santa Bárbara, PA
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Aquidauana, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Miranda, MS
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Avaré, SP
M. amazonicum Itacoatiara, AM
Macrobrachium acanthurus BRA
Macrobrachium jelskii BRA
Macrobrachium americanum CR
Macrobrachium carcinus BRA
Macrobrachium crenulatum VZ
Macrobrachium olfersi BRA
Macrobrachium borellii ARG
Macrobrachium brasiliense BRA
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
M. amazonicum Itacoatiara, AM
76
100
99
64
100
54
65
100
63
100
64
64
Grupo III
Grupo II
Grupo I
55
65
65
90
65
66
Resultados
56
Análises populacionais
Fragmentos parciais com 569 pb do gene mitocondrial COI foram sequenciados a
partir de 81 exemplares de M. amazonicum, provenientes de 11 populações (Tabela 3).
Baseado nesses fragmentos, foram definidos 13 haplótipos (H), dos quais quatro (30,8%)
representaram haplótipos individuais, ou seja, encontrados em apenas um indivíduo.
Dentre os haplótipos compartilhados por mais de um indivíduo, o H3 foi o mais
frequente, tendo sido compartilhado por 23 indivíduos provenientes de quatro populações. O
segundo mais frequente, foi o H1, compartilhado por 17 indivíduos provenientes de cinco
populações. Apenas os indivíduos das populações costeiras (C-01, 03, 05, 07 e 09) e
introduzidas (i-01 e 02) compartilharam haplótipos. Verificou-se uma diversidade haplotípica
total relativamente alta (0,8488), entretanto, quatro populações (c-01 e 02, i-01 e 02)
apresentaram diversidade nucleotídica e haplotípica nulas, com todos os indivíduos
compartilhando o mesmo haplótipo (Tabela 5).
Tabela 5 – Distribuição dos haplótipos identificados nas 11 populações de Macrobrachium
amazonicum estudadas, considerando as populações introduzidas no estado de São Paulo. (N,
número de indivíduos analisados em cada população. Dh, diversidade haplotípica. Dn + dv,
diversidade nucleotídica e desvio padrão).
Haplótipos (H)
Populações
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
N Dh Dn + dv
Santana, AP (C-01) 4
1
5
0,4000
0,000703 ± 0,000894
Aquiraz, CE (C-03) 1
7
2
10
0,5111
0,000976 ± 0,000982
Belém, PA (C-05) 1
2
3
0,6667
0,001172 ± 0,001461
Abaetetuba, PA (C-07) 6
2
8
0,4286
0,000753 ± 0,000858
Sta. Bárbara, PA (C-09)
5
2
1
8
0,6071
0,001632 ± 0,001422
Sertãozinho, SP (i- 01)
10
10
0,0000
0,000000 ± 0,000000
Miguelópolis, SP (i-02)
4
4
0,0000
0,000000 ± 0,000000
Avaré, SP (i-03)
1
5
6
0,3333
0,000586 ± 0,000771
Aquidauana, MS (c-01)
9
9
0,0000
0,000000 ± 0,000000
Miranda, MS (c-02)
8
8
0,0000
0,000000 ± 0,000000
Itacoatiara, AM (A-02)
2
1
1
6
10
0,6444
0,002421 ± 0,001836
Total 17
5
23
2
1
9
8
1
5
2
1
1
6
81
0,8488
0,016969 ± 0,008707
Resultados
57
Desconsiderando as populações introduzidas no estado de São Paulo, ou seja,
considerando apenas 61 exemplares de M. amazonicum provenientes de oito populações,
foram identificados 11 haplótipos, dos quais três (27,3%) representaram haplótipos
individuais. Dentre os haplótipos compartilhados por mais de um indivíduo, o H1 foi o mais
frequente, tendo sido compartilhado por 17 indivíduos provenientes de cinco populações.
Apenas os indivíduos das populações costeiras (C-01, 03, 05, 07 e 09) compartilharam
haplótipos entre si (Tabela 6).
Tabela 6 – Distribuição dos haplótipos identificados nas oito populações de Macrobrachium
amazonicum estudadas, desconsiderando as populações introduzidas no estado de São Paulo.
(N, número de indivíduos analisados em cada população).
Haplótipos (H)
Populações
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
N
Santana, AP (C-01) 4
1
5
Aquiraz, CE (C-03) 1
7
2
10
Belém, PA (C-05) 1
2
3
Abaetetuba, PA (C-07) 6
2
8
Sta. Bárbara, PA (C-09) 5
2
1
8
Aquidauana, MS (c-01)
9
9
Miranda, MS (c-02)
8
8
Itacoatiara, AM (A-02)
2
1
1
6
10
Total 17
5
9
2
1
9
8
2
1
1
6
61
Dos 569 pb sequenciados, 29 (5,1%) sítios foram polimórficos. Os padrões de
substituição favoreceram as transições sobre as transversões, sendo a alta razão transição:
transversão encontrada (28:1).
A rede de haplótipos, construída pelos métodos de parcimônia estatística e Median-
Joining, desconsiderando as populações introduzidas em São Paulo (i-01 a 03), foi claramente
dividida em três grupos que não compartilharam haplótipos entre si: populações costeiras (C-
01, 03, 05, 07 e 09) (Figura 9 - A), populações continentais da Região Hidrográfica do Paraná
Resultados
58
e Paraguai (c-01 e 02) (Figura 9 - B) e população continental Região Hidrográfica Amazônica
(A-02) (Figura 9 - C).
Figura 9. Redes de haplótipos construídas pelo método de parcimônia estatística, indicando a
distribuição dos haplótipos identificados nos exemplares de Macrobrachium amazonicum. (A
a C, redes resultantes das análises desconsiderando as populações introduzidas em São Paulo.
D a F, redes resultantes das análises considerando todas as populações. O número dentro do
círculo corresponde ao número do haplótipo (H). O tamanho do círculo é proporcional à
frequência do haplótipo. Haplótipos não identificados na amostra foram indicados como um
pequeno círculo vazio. Cada linha corresponde a um passo mutacional).
A
B
C
A
B
C
D
E
F
D
E
F
Resultados
59
A construção da rede de haplótipos considerando todas as populações de M.
amazonicum, com ambos os métodos, evidenciou os mesmos três grupos descritos no
parágrafo anterior (Figura 9 – D a F) e possibilitou a inferência sobre a possível origem das
populações introduzidas em São Paulo a partir da análise dos haplótipos compartilhados.
Indivíduos provenientes das populações i-01 e 02 compartilharam haplótipos com o
grupo das populações costeiras, mais especificamente com indivíduos das populações C-03 e
C-09, enquanto os indivíduos da população i-03 apresentaram haplótipos muito semelhantes
aos das populações da Região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (c-01 e 02) (Figura 10).
Assim, as populações de M. amazonicum de São Paulo analisadas neste estudo provavelmente
são originárias de populações do Ceará, Mato Grosso do Sul e Pará.
Os indivíduos da população do Ceará (CE), cuja distribuição não é natural,
compartilharam haplótipos com indivíduos provenientes de populações costeiras do Pará (C-
05, 07 e 09), sendo assim provavelmente originários de estoques naturais desta região (Figura
10).
Resultados
60
Figura 10. Rede de haplótipos construída pelo método de Median-Joinng, indicando a
distribuição dos 13 haplótipos identificados nos 81 exemplares de Macrobrachium
amazonicum estudados. (O número abaixo do círculo corresponde ao número do haplótipo
(H). O tamanho do círculo é proporcional à frequência do haplótipo. Cada pequeno traço
representa um passo mutacional; vm, vetor médio. Grupo I: indivíduos da Região
Hidrográfica Amazônica; grupo II: indivíduos provenientes de populações costeiras; e grupo
III: indivíduos da Região Hidrográfica do Paraná e do Paraguai).
A análise de variância molecular (AMOVA) com estrutura hierárquica simples
(ausência de estrutura) detectou que a maior porcentagem da variação (95,74%) encontrou-se
entre as populações de M. amazonicum analisadas, enquanto que a variação dentro de cada
população foi considerada baixa (4,26%) (Tabela 7).
Estruturando as populações conforme os grupos (I, II e II) evidenciados pelas análises
filogenéticas, de distância e redes de haplótipos, identificou-se que a maior parte da variação
genética está entre os grupos, e está foi significativa em ambas as análises, não considerando e
considerando as populações introduzidas em São Paulo (FCT = 0,93267, P < 0,001; FCT =
0,92258; P < 0,001, respectivamente) (Tabela 7). A porcentagem de variação
intrapopulacional e entre as populações de um mesmo grupo foram bem reduzidas (Tabela 7).
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
Itacoatiara, AM (A-02)
Miguelópolis, SP (i-02)
Abaetetuba, PA (C-07)
Belém, PA (C-05)
Miranda, MS (c-02)
Sertãozinho, SP (i-01)
Aquiraz, CE (C-03)
Santana, AP (C-01)
Avaré, SP (i-03)
Aquidauana, MS (c-01)
Santa Bárbara, PA (C-09)
vm
Grupo I
Grupo III
Grupo II
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
Itacoatiara, AM (A-02)
Miguelópolis, SP (i-02)
Abaetetuba, PA (C-07)
Belém, PA (C-05)
Miranda, MS (c-02)
Sertãozinho, SP (i-01)
Aquiraz, CE (C-03)
Santana, AP (C-01)
Avaré, SP (i-03)
Aquidauana, MS (c-01)
Santa Bárbara, PA (C-09)
vm
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
Itacoatiara, AM (A-02)
Miguelópolis, SP (i-02)
Abaetetuba, PA (C-07)
Belém, PA (C-05)
Miranda, MS (c-02)
Sertãozinho, SP (i-01)
Aquiraz, CE (C-03)
Santana, AP (C-01)
Avaré, SP (i-03)
Aquidauana, MS (c-01)
Santa Bárbara, PA (C-09)
vm
Grupo I
Grupo III
Grupo II
Resultados
61
Tabela 7 – Resultados das análises de variância molecular (AMOVA) realizadas com
exemplares de Macrobrachium amazonicum provenientes de diversas populações do Brasil.
* Todos os valores foram significativos. ** As populações introduzidas foram agrupadas de acordo com os
resultados revelados pelas redes de haplótipos.
Estruturação Fonte de variação
% de
variação
Índices de
fixação
P*
Entre populações 95,74 FST: 0,95737
< 0,001
Ausente
Dentro das populações 4,26
Entre grupos 93,27 FCT: 0,93267
< 0,001
Entre populações dentro
dos grupos
3,29 FSC: 0,48856
< 0,001
Costeiras, Região Hidrográfica
Amazônica e Região
Hidrográfica do Paraná e do
Paraguai (sem populações
introduzidas)
Dentro das populações 3,44 FST: 0,96557
< 0,001
Entre grupos 92,26 FCT: 0,92258
< 0,001
Entre populações dentro
dos grupos
4,99 FSC: 0,64513
< 0,001
Costeiras, Região Hidrográfica
Amazônica e Região
Hidrográfica do Paraná e do
Paraguai **
Dentro das populações 2,75 FST: 0,97253
< 0,001
5
DISCUSSÃO
Discussão
62
5. 1. Considerações taxonômicas
Macrobrachium amazonicum se distribui amplamente no território brasileiro, com
registros de ocorrência no Acre, Amapá, Amazonas, Ceará, Goiás, Maranhão, Mato Grosso,
Mato Grosso do Sul, Pará, Paraíba, Paraná, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte e São
Paulo (GOMES-CORREA, 1977; COELHO & RAMOS-PORTO, 1985; BIALETZKI et al.,
1997; MELO, 2003; MAGALHÃES et al., 2005).
Considerando esta distribuição, os exemplares analisados neste estudo representaram
de maneira significativa e satisfatória as populações costeiras e continentais da espécie no
Brasil. Ademais, a presença de M. amazonicum na Bahia, Rondônia e Roraima nunca havia
sido reportada na literatura especificamente para essas áreas, ampliando-se assim, a
distribuição da espécie para estes estados.
De acordo com HOLTHUIS (1952), na literatura, a presente espécie foi comumente
denominada como Macrobrachium (ou Palaemon) lamarrei. Palaemon lamarrei foi descrito
por H. MILNE EDWARDS em 1837 e atualmente é reconhecida como uma espécie bem
distinta de M. amazonicum. WHITE (1847) foi o primeiro a mencionar, com algumas dúvidas,
a espécie de H. Milne Edwards para o Brasil. A confusão foi aumentada quando DE HAAN
(1849) descreveu Palaemon Lamarrei do Japão. DE MAN (1879) analisou esse material,
depositado na coleção do Museu de Leiden (Holanda), e concluiu que se tratava de uma forma
idêntica à M. amazonicum. Posteriormente, identificou-se que esses espécimes foram
equivocadamente misturados com o material do Japão enviado para análise à DE HAAN, o
que justificou o erro ocorrido (HOLTHUIS, 1952, 1959).
NOBILI (1897) mencionou Palaemon Lamarrei para o rio Lara, em Darien, Panamá,
rio este que deságua no Oceano Pacífico. Os espécimes de NOBILI, depositados na coleção
do Museu Nacional dos EUA, foram analisados por HOLTHUIS, que descobriu que não se
tratava de Macrobrachium, e sim Palaemon gracilis (Smith, 1871) (HOLTHUIS, 1952).
Discussão
63
Os espécimes reportados por NOBILI (1901) como Palaemon (Eupalaemon)
Amazonicus para três localidades no Equador foram examinados por HOLTHUIS no Museu
de Turin, que concluiu que parte dos animais pertence à outra espécie de Macrobrachium,
enquanto o restante pertence à Macrobrachium panamense Rathbun, 1912. Os espécimes de
PESTA (1931) da Costa Rica, identificados como Palaemon amazonicus, são, atualmente, M.
panamense. No mesmo sentido, os exemplares da Venezuela identificados por SCHMITT
(1936) como Macrobrachium amazonicus, comprovadamente pertencem à Macrobrachium
jelskii (Miers, 1877) (HOLTHUIS, 1952).
A partir desses relatos, nota-se que a maioria das espécies da América Ocidental
(bacias de rios que desembocam no Pacífico) é proximamente relacionada às formas da
América Oriental (bacias de rios que desembocam no Atlântico) (HOLTHUIS, 1952).
Segundo este mesmo autor, M. panamense seria a forma ocidental correspondente a de M.
amazonicum (oriental).
Diversos autores reportaram as diferenças entre essas espécies correlacionadas
(HOLTHUIS, 1952; GOMES-CORREA, 1977; VALENCIA & CAMPOS, 2007), sendo elas:
M. panamense difere de M. amazonicum por apresentar o rostro alto e levemente convexo na
região da órbita, enquanto a outra espécie apresenta rostro mais baixo, fortemente convexo e
com um comprimento um pouco maior; apenas um dente é encontrado atrás da órbita em M.
amazonicum, e em M. panamense, encontram-se dois; em machos adultos de M. amazonicum,
o carpo do segundo par de pereiópodos é tão longo ou maior que a quela, enquanto em M.
panamense, o carpo é distintamente menor.
Os caracteres diagnósticos da espécie não são tão marcados em espécimes juvenis e
imaturos. Nesta fase da vida, podem ser confundidos com espécimes de Macrobrachium
jelskii ou até com Macrobrachium acanthurus (Wiegmann, 1836), os quais apresentam
morfologia semelhante (MAGALHÃES et al., 2005).
Discussão
64
Indivíduos imaturos de M. amazonicum e adultos de M. jelskii de comprimentos
semelhantes podem ser confundidos pelo fato de ambos apresentarem os espinhos internos
mais longos do que a extremidade distal do telso. Isto pode se agravar ainda mais devido à
variação no número e disposição dos dentes na margem superior do rostro de M. amazonicum,
que muitas vezes se sobrepõe ao verificado em M. jelskii (HOLTHUIS, 1952; GARCÍA-
DÁVILA & MAGALHÃES, 2003).
As duas espécies podem ser então ser separadas a partir de exame conjunto das
seguintes características diferenciais, conforme listado por HOLTHUIS (1952) e GARCÍA-
DÁVILA & MAGALHÃES (2003): 1) M. amazonicum tem rostro maior e mais curvado para
cima que M. jelskii, com dentes proximais formando uma crista basal sobre a órbita; 2) a
margem posterior do telso de M. jelskii é claramente definida do que nos espécimes imaturos
de M. amazonicum; 3) M. amazonicum nunca apresenta mais que um par de cerdas plumosas
entre os espinhos internos do telso; 4) os pereiópodos de M. jelskii são mais estreitos que em
M. amazonicum, e a proporção dos artículos destes diferem da encontrada em M.
amazonicum; 5) o segundo par de pereiópodos de M. jelskii nunca apresenta os artículos
espinulados ou pubescentes, e os três últimos pares de pereiópodos nunca são escabrosos; 6)
as fêmeas de M. jelskii carregam ovos maiores e menos numerosos que as de M. amazonicum.
5.2. Variações morfológicas em Macrobrachium amazonicum
Durante o estudo morfométrico realizado com diversas populações de M. amazonicum
do Brasil (PORTO, 2004), as menores modas do número de dentes na margem inferior do
rostro (6 e 7) foram encontradas nas populações das bacias do Paraná e Paraguai, e as maiores
(8 e 9), nas bacias do Norte e Nordeste. Com relação ao telso, populações das bacias
hidrográficas das regiões Norte e Nordeste do Brasil apresentaram formato e tamanho dos
espinhos posteriores distintos das populações das bacias do Paraná e Paraguai, conforme
Discussão
65
descrito no item 4.1. Dessa forma, os padrões de variação evidenciados no presente estudo
corroboraram os resultados encontrados por PORTO (2004).
GARCÍA-DÁVILA et al. (2005) observaram ampla variação no número de dentes da
margem superior do rostro em Palaemonetes Heller, 1869, revelando grande plasticidade
deste caractere, que também parece ocorrer em M. amazonicum.
O maior tamanho atingido pelos exemplares das populações costeiras e das Regiões
Hidrográficas Amazônica e do Tocantins-Araguaia em relação às populações das Regiões
Hidrográficas do Paraná e Paraguai também foi reportado por PORTO (2004). O autor, assim
como ODINETZ-COLLART (1987), ODINETZ-COLLART & MOREIRA (1993) e
ODINETZ-COLLART & MAGALHÃES (1994), também mencionou que indivíduos de
ambientes lóticos apresentam tamanhos maiores que os de ambientes lênticos. Em populações
oriundas de rios ou açudes, os machos são maiores que as fêmeas. Entretanto, em populações
dos lagos das planícies de inundação nas bacias dos rios Solimões, Amazonas, Paraguai e
Paraná, as fêmeas foram maiores (PORTO, 2004).
Populações continentais e costeiras são reportadas para Macrobrachium nipponense
(De Haan, 1849) (MASHIKO, 1990, 2000; MASHIKO & NUMACHI, 1993, 2000), entre as
quais também foi observada variação de tamanho corpóreo (MASHIKO, 2000). Em geral,
fêmeas de populações de água doce atingem a maturidade sexual com um tamanho
significativamente menor que os indivíduos de ambientes estuarinos e águas salobras, o que
implica num menor crescimento dos indivíduos de ambientes dulcícolas (MASHIKO, 2000).
No entanto, estudos com esta espécie revelaram que fêmeas de populações estuarinas têm
potencial para atingir maturidade sexual com tamanhos menores que os encontrados na
natureza. Assim, a diferença de tamanho encontrada é, em grande parte, devido à plasticidade
fenotípica (MASHIKO, 2000).
Discussão
66
Estudos realizados com M. nipponense (MASHIKO, 2000 para revisão), evidenciaram
que larvas zoea tanto de populações continentais e costeiras da espécie apresentaram maior
taxa de sobrevivência em água de salinidade moderada. A baixa sobrevivência em água doce
parece ser decorrente do desenvolvimento não completo da capacidade osmorregulatória.
Assim, o retardamento no crescimento em indivíduos de M. nipponense de ambiente de água
doce, principalmente nos estágio iniciais de vida, é devido, parcialmente, ao estresse
osmorregulatório. Ademais, a temperatura da água e a disponibilidade de alimento podem
também estar relacionadas com a taxa de crescimento diferencial entre as populações
(MASHIKO, 2000).
Analogamente, o fato de as populações de M. amazonicum das bacias do Paraná e
Paraguai habitarem ambientes bem diferentes daqueles onde são encontradas as populações
das bacias do Norte e Nordeste, justificaria a plasticidade encontrada com relação ao tamanho
corpóreo dos indivíduos.
As diferenças na relação entre o tamanho dos espinhos posteriores internos e a
extremidade distal do telso também foram observadas por GARCÍA-DÁVILA &
MAGALHÃES (2003), sendo estas relacionadas à ontogenia de M. amazonicum. De acordo
com isso, o fato dos indivíduos adultos provenientes das Regiões Hidrográficas do Paraná e
Paraguai atingirem tamanhos reduzidos, quando comparados aos indivíduos das demais
populações analisadas, justificaria a condição dos espinhos posteriores alcançarem ou
ultrapassarem a extremidade do telso nesses exemplares.
PORTO (2004) encontrou diferenças entre os machos de M. amazonicum das
populações quanto ao segundo par de pereiópodos: machos das populações do norte e
nordeste do Brasil apresentaram segundo par de pereiópodos distintamente maior e mais
robusto que o primeiro, com espínulos e cerdas em todos os artículos, quela coberta por
pubescência aveludada, dedos com terço proximal das bordas cortantes providas de um dente
Discussão
67
no dátilo, outro no dedo fixo e três a quatro dentículos basais. No entanto, os machos
provenientes das Bacias do Paraná e Paraguai apresentaram o segundo par levemente maior e
mais robusto que o primeiro, sem espínulos e com poucas cerdas nos artículos, quela com
tufos de poucas cerdas dispostos em fileiras ao longo dos dedos, dedos com terço proximal
das bordas cortantes providas de três a quatro dentículos basais.
Essa diferenciação encontrada por PORTO (2004) é devida à presença diferencial dos
morfotipos de machos nas populações de M. amazonicum (MORAES-RIODADES &
VALENTI, 2004). A afirmação confirmou-se pelo fato de terem sido encontrados, no presente
estudo, apenas machos CC e TC nas populações provenientes das Regiões Hidrográficas do
Paraná e Paraguai, enquanto nas populações do norte e nordeste foram identificados os quatro
morfotipos descritos para a espécie.
Variabilidade intraespecífica entre os principais caracteres diagnósticos (rostro e telso)
de Macrobrachium também foi encontrada em outras espécies do gênero (L. PILEGGI,
comunicação pessoal), confirmando o já evidenciado por HOLTHIS (1952), que grande parte
dos caracteres taxonomicamente importantes é variável dentro da mesma espécie,
especialmente durante o desenvolvimento do animal.
Nesse sentido, análises em Macrobrachium australiense Holthuis, 1950 também
indicaram que alguns caracteres da morfologia externa são altamente variáveis entre amostras
de diversos sistemas fluviais ao longo da Austrália, e mesmo dentro de um único sistema
fluvial (DIMMOCK et al., 2004).
Com essa mesma espécie, DIMMOCK et al. (2004) objetivaram determinar se a
variação nos caracteres morfológicos entre duas populações distintas tem forte base genética
ou se é principalmente influenciada por fatores ambientais. Caracteres importantes
taxonomicamente foram altamente influenciados por condições ambientais (comprimento do
rostro e largura do abdome). A expressão fenotípica de caracteres morfológicos externos em
Discussão
68
M. australiense é altamente variável ao longo da distribuição natural da espécie. Quando
estoques morfologicamente divergentes, independentemente da origem geográfica, foram
mantidos sob condições ambientais idênticas, essa variação natural foi bastante reduzida. A
alta variabilidade pôde ser restabelecida quando o parâmetro de influência utilizado
(temperatura) foi manipulado.
Assim, os caracteres analisados no presente estudo, que apresentaram variabilidade
entre as populações ao longo da distribuição geográfica de M. amazonicum no Brasil, apesar
de não testados experimentalmente, parecem também ser altamente plásticos. Alta
plasticidade em caracteres morfológicos significa que a variação é mais relacionada às
mudanças ambientais que às genotípicas (DIMMOCK et al., 2004).
A alta variabilidade dos caracteres morfológicos encontrados poderia ser uma resposta
adaptativa aos diferentes ambientes (DIMMOCK et al., 2004) em que M. amazonicum ocorre
ao longo de sua distribuição natural. Assim, como M. australiense (DIMMOCK et al., 2004),
M. amazonicum pode ser considerado um colonizador bem sucedido de diversos ambientes
simplesmente por apresentar uma morfologia externa flexível que está bem adaptada às
diversas condições ambientais.
De tal modo, os dois padrões morfológicos encontrados em M. amazonicum poderiam
ser, provavelmente, justificados pelo fato dos ambientes habitados por estes grupos serem
ecologicamente distintos. Ambientes costeiros (salobros e dulcícolas), assim como áreas de
várzea da bacia Amazônia, onde M. amazonicum é muito abundante, são normalmente ricos
em produção primária. Entretanto, as águas interiores, geralmente são drenagens pobres em
nutrientes/plâncton (MAGALHÃES, 1985; MAGALHÃES & WALKER, 1988; ODINETZ-
COLLART & MAGALHÃES, 1994).
Discussão
69
5.3. Variabilidade genética em Macrobrachium amazonicum
As 11 populações de M. amazonicum analisadas constituíram um único clado
monofilético, podendo ser consideradas como uma única espécie, segundo o conceito
filogenético de espécie sensu MISHLER & THERIOT (2000).
Espécie é o táxon menos inclusivo reconhecido em uma classificação filogenética. Tal
como em todos os níveis hierárquicos de tal classificação, os organismos são agrupados em
espécies e não em um nível mais elevado porque eles são os menores grupos monofiléticos
dignos de tal reconhecimento ou por causa de indícios de monofilia (MISHLER & THERIOT,
2000).
A partir das análises filogenéticas realizadas com sequências parciais do gene COI, foi
possível inferir que um ancestral originou a população de M. amazonicum da região
Hidrográfica Amazônica (grupo I) e outro ancestral, que por sua vez, deu origem às
populações continentais da região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (grupo II) e às costeiras
do norte e nordeste (grupo III). As populações do grupo II e III compartilham ancestralidade
comum, sendo mais aparentadas entre si, do que com os indivíduos do grupo I. Os
dendrogramas obtidos por NJ, revelaram estruturação da espécie nos mesmos três grupos,
sendo os indivíduos dos grupos II e III geneticamente mais próximos entre si, do que com os
do grupo I, refletindo a relação de parentesco evidenciada pela análise de parcimônia.
Informações mais detalhadas sobre as relações entre as populações dentro dos grupos não
puderam ser obtidas, pois o gene COI não se mostrou variável o suficiente para tal resolução.
Uma reconstrução mais ampla sobre a história de vida da espécie e das relações de
parentesco entre as populações de M. amazonicum poderia ser alcançada com a inclusão de
exemplares de localidades brasileiras não analisadas no presente estudo, principalmente da
região Hidrográfica Amazônica, devido à sua imensa extensão geográfica. Além disso, é
Discussão
70
indispensável a utilização de exemplares oriundos de outros países da América do Sul, onde
também há registros de ocorrência dessa espécie.
Os dados morfológicos dividiram as populações em dois grandes grupos que diferiram
dos revelados pelas análises filogenéticas dos dados moleculares. No entanto, o agrupamento
das populações com base na morfologia foi feito apenas com base na semelhança (fenética)
entre os caracteres variáveis, que parecem refletir apenas a diversidade de ambientes
colonizados pela espécie ao invés de sua história evolutiva. Uma vez que foram utilizados
métodos diferentes no tratamento dos dados, não é possível discutir a fundo esses resultados.
Somente com um estudo filogenético dos dados morfológicos das diferentes populações de M.
amazonicum, com levantamento de mais caracteres, será possível saber ao certo, se a
morfologia corrobora ou não os resultados encontrados com os dados moleculares.
Análises realizadas com sequências parciais do gene mitocondrial 16S não resultaram
em relações filogenéticas e de distância informativas para as populações de M. amazonicum.
Isto foi decorrente da mínima variação encontrada entre os indivíduos (taxa de divergência
genética entre 0,0 e 1,1%). De tal modo, o gene 16S não constituiu um marcador variável o
suficiente para evidenciar qualquer estruturação ou relação de parentesco entre as populações
de M. amazonicum.
Este gene é conhecido por ser conservado e apresentar taxa de evolução lenta, ou seja,
é um marcador mais preciso para discriminar relações entre espécies do que dentro de
espécies. A variação entre as sequências desse gene normalmente é mínima ou nula entre
espécimes pertencentes à mesma espécie (FRANCISCO & GALETTI JUNIOR, 2005 para
revisão). Assim, a homogeneidade entre as populações de M. amazonicum encontrada no
presente estudo está provavelmente relacionada à natureza conservativa do 16S.
Estudos sistemáticos das espécies do gênero Macrobrachium (LIU et al., 2007;
PILEGGI & MANTELATTO, submetido) estimaram divergências interespecíficas entre 5,5 e
Discussão
71
17,5% para 16S e 15,1 e 25,54% para COI. A variação entre populações/indivíduos da mesma
espécie, porém de diferentes localidades, variou de 0,0 a 3,2% para 16S e de 0,0 a 12,63%.
Considerando as taxas de divergência apresentadas no presente estudo, os valores
máximos (1,1 % para 16S e 3,3% para COI) encontrados nas populações de M. amazonicum
se enquadraram dentro da amplitude de variação intraespecífica descrita para o gênero. A
amplitude de variação das sequências de COI está de acordo com o encontrado por PEIXOTO
(2002) entre populações de M. amazonicum provenientes de Goiás, e de ambientes costeiros e
continentais no Pará. Assim, a variabilidade genética encontrada entre as populações aqui
estudadas não parece ser indicativa de uma diferenciação a nível específico, e sim, de
variabilidade populacional.
LIU et al. (2007) revelaram várias espécies crípticas no gênero Macrobrachium, e a
delimitação destas foi possível por meio da análise de populações de diferentes localidades, o
que resultou em taxas de divergências bem acima das intraespecíficas. No entanto, o mesmo
não pôde ser verificado entre as populações de M. amazonicum analisadas.
A distribuição natural presuntiva de M. amazonicum inclui as bacias dos rios Orinoco,
Amazonas, Paraguai e baixo Paraná (MAGALHÃES et al., 2005). M. amazonicum evoluiu
em uma dessas regiões após os sistemas fluviais considerados como ancestrais dos sistemas
ocidentais paleo-Amazonas-Orinoco e Paraná estarem estabelecidos ao longo dos Andes
emergentes a partir do final do Cretáceo/início do Paleoceno (LUNDBERG et al. 1998). A
fauna de decápodos amazônica e do Paraguai/baixo Paraná compartilham diversos elementos,
e essas espécies provavelmente se dispersaram ao longo das paleobacias após eventos
geológicos subsequentes deslocarem suas fronteiras (MAGALHÃES et al., 2005 para
revisão).
Discussão
72
A presença da espécie em estados do nordeste e leste do Brasil, e no alto da bacia do
Paraná é provavelmente devido à dispersão antropogênica acidental e/ou para propósitos
relacionados à aquicultura (COELHO, 1963; PINTO, 1977; MAGALHÃES et al., 2005).
A espécie foi provavelmente introduzida no estado de São Paulo entre 1966 e 1973,
juntamente com M. jelskii nas estações de piscicultura da CESP (Companhia Energética de
São Paulo), como parte do processo de transplantação do peixe Plagioscion squamosissimus
(Heckel, 1840) dos reservatórios do nordeste do Brasil. Foi reportado que pequenos peixes
escaparam para o Rio Pardo em 1970, dispersando-se para o Rio Grande, chegando até os
reservatórios de Ilha Solteira e Jupiá, no alto do Rio Paraná em 1972 (TORLONI et al., 1993
apud MAGALHÃES et al., 2005). Deste modo, assumiu-se que os camarões seguiram os
mesmos padrões de dispersão (MAGALHÃES et al., 2005), uma vez que M. amazonicum
apresenta populações bem estabelecidas no alto do Rio Paraná (BIALETZKI et al., 1997).
Esses dados, somados aos fatos das populações de Sertãozinho e Miguelópolis (SP)
compartilharem haplótipos e padrões morfológicos com populações costeiras do norte e
nordeste do Brasil, corroboraram a inferência de que indivíduos destas regiões foram
introduzidos em São Paulo a partir de populações naturais costeiras, provavelmente do Pará.
No entanto, M. amazonicum pode também ter sido transplantado para algumas
localidades em São Paulo a partir de populações da região do Pantanal, no Mato Grosso do
Sul. Atualmente, a prática de “Pesque e Pague”, é muito comum em São Paulo e os
reservatórios e tanques utilizados nesta atividade, são muitas vezes habitados por peixes
capturados em ambientes naturais do Pantanal. No entanto, esta captura muitas vezes é feita
sem o cuidado necessário para impedir a dispersão de larvas, juvenis ou formas imaturas de
outras espécies que podem ser transportadas inadvertidamente nas raízes de macrófitas
aquáticas, por vezes utilizadas como abrigo pelos peixes dos tanques (MAGALHÃES et al.,
2005). M. amazonicum é muito abundante em ambientes formados por grandes áreas de
Discussão
73
vegetação aquática flutuante (MAGALHÃES et al., 2005), característica esta comum das
extensas planícies inundadas do Pantanal (MAGALHÃES, 2000) e Bacia do Rio Paraguai
(MAGALHÃES, 2001).
Outra razão provável para o estabelecimento de M. amazonicum no alto Paraná é a
inundação das Cataratas do Guairá após a criação do reservatório de Itaipu em 1982. A
barreira foi então deslocada 150 km rio abaixo, permitindo assim possíveis dispersões. As
condições ecológicas favoráveis fornecidas pelo ambiente lêntico do reservatório e das áreas
inundadas adjacentes do alto curso do rio teriam contribuído para a rápida colonização da
região pela espécie (MAGALHÃES et al., 2005).
Assim, há grandes possibilidades da população de Avaré (SP), analisada no presente
estudo, ter se dispersado ou sido introduzida acidentalmente no estado de São Paulo,
conforme descrito nos dois parágrafos anteriores, uma vez que esta compartilhou haplótipos e
caracteres morfológicos com as populações naturais da região Hidrográfica do Paraná e
Paraguai, mais especificamente do Mato Grosso do Sul.
Por volta de 1940, o Departamento Nacional de Obras Contra Secas (DNOCS) utilizou
M. amazonicum nos programas de piscicultura, introduzindo a espécie em inúmeros açudes do
nordeste brasileiro para alimentar peixes carnívoros neles cultivados (COELHO, 1963;
PINTO, 1977; BRAGAGNOLI & GROTTA, 1995). Assim, a população de Aquiraz (CE) foi,
provavelmente, introduzida com os mesmos propósitos, e as redes de haplótipos e caracteres
morfológicos indicaram que esta deve ter ser se originado a partir populações costeiras
naturais do Pará.
As redes de haplótipos e AMOVA evidenciaram estruturação genética entre as
populações de M. amazonicum nos mesmos três grupos (I, II e II) das análises de parcimônia
e distância. Aparentemente, a distância geográfica/fragmentação de habitat estaria se
refletindo no grau de variabilidade genética encontrada entre as populações de M.
Discussão
74
amazonicum. Esta inferência é reforçada pelo não compartilhamento de haplótipos entre os
grupos, evidenciando um isolamento genético entre estes.
O isolamento geográfico e, por conseguinte, a falta de fluxo gênico (falta de migração
e dispersão) entre os grupos, podem ser corroborados também pelos baixos níveis encontrados
de variabilidade genética intrapopulacional e entre as populações de um mesmo grupo, uma
vez que a perda de variabilidade genética em populações é na maior parte consequência dos
elevados níveis de endocruzamento (GARCÍA-DÁVILA, 2002; CARINI & HUGHES, 2004).
Deslocamento em espécies de água doce são muito limitados pela natureza física e
disposição dos sistemas fluviais e até mesmo espécies que apresentam grande capacidade de
dispersão podem apresentar níveis de subdivisão populacionais surpreendentemente altos
(CARINI & HUGHES, 2004 para revisão).
As populações de M. amazonicum foram subdividas em três grupos que correspondem
a ambientes geograficamente diferentes: I – continentais da região Hidrográfica Amazônica
(AM); II - região Hidrográfica do Paraná e Paraguai (MS); III- sistemas costeiros das regiões
norte e nordeste do Brasil (AP, PA e CE). Isolamento e subsequentemente divergência
genética podem ocorrer em populações de espécies de água doce que habitam bacias
hidrográficas separadas, uma vez que os ambientes terrestres podem representar barreiras
intransponíveis, impedindo dispersão e conectividade entre as populações (CARINI &
HUGHES, 2004).
Diversidade genética, expressa dentro e entre populações, pode melhorar a adaptação a
um determinado ambiente, e também expandir as fronteiras de colonização e de distribuição,
permitindo à espécie sobreviver em uma grande variedade de condições (CARVALHO, 1993
apud LEUZZI et al., 2004). Assim, altos valores de variabilidade genética entre populações de
uma determinada espécie podem estar relacionados à sua versatilidade ecológica (LEUZZI et
al., 2004), como parece ser o caso de M. amazonicum.
Discussão
75
A espécie pode ser encontrada em ambientes com diferentes gradientes de salinidade,
incluindo ambientes inteiramente dulcícolas até águas estuarinas (ver item 1 para referências),
revelando uma grande habilidade de colonizar diversos habitats, plasticidade reprodutiva
(ODINETZ-COLLART & RABELO, 1996; A. MEIRELES, comunicação pessoal),
fisiológica (AUGUSTO et al., 2007), e rápida adaptação ao ambiente colonizado (ODINETZ-
COLLART, 1991a e b).
O acesso à diversidade genética intraespecífica e estrutura genética de populações
fornece dados de interesse biológico e evolutivo, indispensáveis para o sucesso de estudo de
conservação e de manutenção da diversidade biológica (McMILLEN-JACKSON & BERT,
2004).
Sabendo-se que M. amazonicum constitui um recurso intensamente explorado pela
pesca artesanal brasileira, principalmente no norte do país (ODINETZ-COLLART &
MOREIRA, 1993), e é uma notável e promissora espécie para o cenário da carcinicultura de
água doce no Brasil (MORAES-RIODADES et al., 1999; MORAES-RIODADES &
VALENTI, 2004; MORAES-RIODADES, 2005), as populações costeiras do norte e nordeste;
continentais das Regiões Hidrográficas Amazônica; e continentais das Regiões Hidrográficas
do Paraná e Paraguai deverão ser tratadas como três estoques distintos e gerenciadas
separadamente no futuro para a garantia da sustentabilidade e manutenção dos recursos
genéticos da espécie no Brasil. Além disso, a existência de estruturação genética entre as
populações de M. amazonicum, deverá ser levada em consideração durante a seleção de
matrizes para a criação desses animais em cativeiro.
De acordo com PORTO (2004), as diferenças morfológicas encontradas em seu estudo
com populações de M. amazonicum de diferentes bacias hidrográficas brasileiras,
constituíram fortes indicativos de que as populações das bacias hidrográficas dos rios Paraná e
Discussão
76
Paraguai deveriam ser consideradas como uma espécie distinta daquelas das regiões norte e
nordeste do país.
No entanto, o presente estudo não corroborou a separação de M. amazonicum em duas
espécies como proposto por PORTO (2004). Os resultados obtidos revelaram variações
morfológicas e moleculares significativas entre as diversas populações analisadas da espécie.
No entanto, esta variação se encontra dentro do nível populacional. Além disso, a separação
proposta por PORTO (2004) iria criar duas novas entidades não naturais (parafiléticas),
conforme revelado pela filogenia aqui apresentada (Figura 6).
O presente trabalho baseou-se em apenas dois marcadores moleculares (16S e COI).
Estudos adicionais usando outros marcadores mitocondriais e nucleares, incluindo toda a
distribuição M. amazonicum na América do Sul, são obviamente necessários para o melhor
entendimento da história evolutiva da espécie, em particular para elucidar a ampla diversidade
no território brasileiro.
As análises populacionais aqui realizadas, entretanto, não foram suficientes para
inferir a conectividade e as taxas de fluxo gênico entre as populações. Estudos incorporando
mais análises, como a de Agrupamento de Clados não Enraizados (TEMPLETON, 1998),
permitiriam detectar e testar os mecanismos evolutivos responsáveis pela distribuição dos
padrões genéticos observados. Além disso, análises adicionais, com marcadores moleculares
mais variáveis, elucidariam a estrutura das populações em uma fina escala, além de estimar
fluxos gênicos contemporâneos entre as populações (KAWANE et al., 2008).
6
CONCLUSÃO
Conclusão
77
Todos os resultados encontrados sustentaram a hipótese inicial deste estudo. Assim,
ficou evidenciado que existe variação na morfologia externa e estruturação genética
significativa entre as populações de M. amazonicum do Brasil. Todavia, essas variações se
enquadraram dentro do nível populacional e parecem refletir a grande habilidade de colonizar
diferentes habitats e a versatilidade ecológica da espécie.
Macrobrachium amazonicum apresentou uma variabilidade intraespecífica de
características morfológicas e moleculares, além de outras já reportadas na literatura, que,
provavelmente, são decorrentes do isolamento geográfico existente entre as populações,
impedindo dispersão e conectividade entre as estas. Se este isolamento se mantiver, a espécie,
provavelmente, passará por um processo de especiação ao longo de sua ampla distribuição
geográfica.
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APÊNDICE
91
0 1 2 1 2
1 0 1 2 2
2 1 0 1 2
1 2 1 0 2
2 2 2 2 0
0 1 1 1 1
1 0 1 1 1
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2 1 2 0 2
2 2 2 2 0
0 1 1 1 4
1 0 1 1 4
1 1 0 1 4
1 1 1 0 4
4 4 4 4 0
0 2 1 2 4
2 0 2 1 4
1 2 0 2 4
2 1 2 0 4
4 4 4 4 0
0 2 1 2 8
2 0 2 1 8
1 2 0 2 8
2 1 2 0 8
8 8 8 8 0
0 1 2 1 8
1 0 1 2 8
2 1 0 1 8
1 2 1 0 8
8 8 8 8 0
APÊNDICE - Matrizes utilizadas nas análises de sensibilidade. Os dígitos das matrizes
correspondem à razão entre os valores de indels/transição/transversão.
Matrix 111
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 112
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 113
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 211
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 212
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 221
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 411
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 412
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 812
A C G T -
A
C
T
G
-
Matrix 821
A C G T -
A
C
T
G
-
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