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Miguel Bentes Mocherniuk
Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio
ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água
fortemente salina
Orientador: Prof. Dr. Aderval
Severino Luna (PPGEQ/IQ/UERJ)
Rio de J
aneiro
2008
Dissertação apresentada, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre,
ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química, da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro. Área de
concentração: Bioprocessos e Tecnologia
Ambiental.
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CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/NPROTEC
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total desta tese.
_____________________________________________ ________________
Assinatura Data
M688 Mocherniuk, Miguel Bentes.
Aplicações da eletroforese capilar na determinação de
princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras
de água fortemente salina / Miguel Bentes Mocherniuk. –
2008.
94 f.
Orientador : Aderval Severino Luna.
Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio
de Janeiro, Instituto de Química.
1. Eletroforese capilar – Teses. 2. Produtos farmacêuticos
– Teses. 3. Ácidos orgânicos – Teses. I. Luna, Aderval
Severino. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Instituto de Química. III. Título.
CDU 543.545.2
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3
Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio
ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água
fortemente salina
Aprovado em
__________________________________________________
Banca Examinadora:___________________________________________
______________________________________________________
Prof. Dr Aderval Severino Luna (Orientador)
PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ
__________________________________________________________
Prof. Dr Antonio Carlos Augusto da Costa
PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ
___________________________________________________________
Prof . Dr. Ayres Guimarães Dias
Instituto de Química da UERJ
___________________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
Fátima Maria Zanon Zotin
PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ
Rio de Janeiro
2008
Dissertação apresentada, como requisito
para obtenção do título de Mestre, ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química, da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro. Área de
concentração: Bioprocessos e Tecnologia
Ambiental.
4
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, irmão e minha noiva que sempre me apoiaram e me deram força nas horas
difíceis quando pensei em desistir;
Ao Prof. Dr. Aderval Severino Luna, pela competência, dedicação e paciência na orientação
deste trabalho e pelo conhecimento transmitido;
Ao Corpo Docente do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro;
Aos amigos do laboratório da UERJ, Jéssica Pinho, Diego Barros, Fernanda Almeida,
Arnaldo Peixoto, Igor Lima, André Matassoli, Thaís Malcher, Marcelo Reis e Otavio
Bernardes pelo apoio e colaboração no laboratório;
A todos os colegas da turma do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro;
Ao Instituto de Química da UERJ, por ter fornecido toda a estrutura para realização deste
trabalho;
Enfim, todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para realização
deste trabalho.
5
RESUMO
MOCHERNIUK, Miguel Bentes Aplicações de eletroforese capilar na determinação de
princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina,
Brasil, 2008. 91f.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Instituto de Química, Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
RESUMO
Desde as duas últimas décadas, a eletroforese capilar emergiu como um método
alternativo para separação e quantificação de uma variedade de analitos de importância
industrial, clínica, biomédica e ambiental. Aspectos relevantes desta técnica, como alta
eficiência, alto poder de resolução, maior rapidez, total automação e uma diversidade de
esquemas de injeção e detecção foram discutidos intensamente na literatura. Neste trabalho,
dois métodos diferentes foram desenvolvidos por eletroforese capilar.
O primeiro método foi desenvolvido para determinação simultânea de ácido
acetilsalicílico (AAS) e paracetamol (PAR) em comprimidos por eletroforese capilar por zona
(CZE). Uma solução de 25 mmol/L de tetraborato de sódio (BGE) foi a mais adequada para a
separação dos analitos. Um capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm,
diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Os os
analitos foram completamente separados em 8 min com um potencial aplicado de 25 kV, e a
detecção foi feita em 226 nm com detector UV. Usou-se ácido benzóico como padrão interno
(HBz) para a quantificação das drogas. A validação do método foi feita em termos de
linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A
linearidade das curvas de calibração para o AAS e PAR foram 100 – 500 mg/L (R
2
ajustado
=
0,9904), 50 – 300 mg/L (R
2
ajustado
= 0,9906), respectivamente. O método proposto é simples e
adequado para a análise simultânea dos princípios ativos dos comprimidos.
O segundo método foi desenvolvido para a determinação simultânea dos ácidos
fórmico, acético e propiônico em água natural fortemente salina por cromatografia
eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar. Um eletrólito de fundo composto por
solução de 5 mL de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de brometo de cetiltrimetil amônio
(CTAB) 0,5 mmol/L, 0,1 mL de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3.5
mL de água, e 0,9 mL dietanolamina (DEA) 9 mmol/L foi o mais adequado para a separação
de todos os analitos. Um tubo capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm,
diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Todos
6
analitos foram completamente separados em 10 min com a diferença de potencial de -20 kV, e
a detecção indireta foi feita em 229 nm com detector UV. A validação do método foi feita em
termos de linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A
linearidade das curvas de calibração para os ácidos fórmico, acético e propiônico foram 10 –
100 mg/L (R
2
adjustado
> 0,992), para todos eles. Portanto, o método proposto é simples e
adequado para análise simultânea de ácidos orgânicos de baixo peso molecular em água
natural fortemente salina.
7
ABSTRACT
Over the past two decades, capillary electrophoresis has emerged as a very resourceful
alternative method for the separation and quantification of a variety of solutes of industrial,
clinical, biomedical and environmental importance. Relevant aspects of the technique such as
high efficiency, high resolving power, high speed, full automation, and a diversity of injection
and detection schemes have been extensively discussed in the literature. In this work, two
different methods were developed by capillary electrophoresis.
The first method has been developed for the simultaneous determination of
acetylsalicylic acid (AAS) and paracetamol (PAR) in tablets by capillary zone eletrophoresis
(CZE). A 25 mmol/L sodium tetraborate background electrolyte (BGE) solution was found to
be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total length
50 cm (effective length 40 cm) with internal diameter of 50 µm was used for separation. All
the analytes were completely separated within 8 min at the applied voltage of 25 kV, and
detection was performed at 226 nm with an UV detector. Benzoic acid was used as internal
standard (I. S.) for the quantification of the drugs. Validation of the method was performed in
terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ).
The linearity of the calibration curves for AAS, and PAR were 100 – 500 mg/L (R
2
adjusted
=
0,9904), 50 – 300 mg/L (R
2
adjusted
= 0,9906), respectively. Thus, the proposed method is
simple and suitable for the simultaneous analysis of active ingredients in tablets dosage forms.
The second method has been developed for the simultaneous determination of formic,
acetic, and propionic acids in highly saline natural water by micelar electrokinetic capillary
chromatography (MEKC or MECC). An background electrolyte composed of 5 mL of
benzoic acid 10 mmol/L, 0.5 mL of cetyltrimethylammonium bromide 0.5 mmol/L, 0.1 mL of
EDTA 0.1 mmol/L, 3.5 mL water, and 0.9 mL diethanolamine 9 mmol/L solution was found
to be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total
length 50 cm (effective length 40 cm) was used for separation. All the analytes were
completely separated within 10 min at the applied voltage of - 20 kV, and indirect detection
was performed at 229 nm with an UV detector. Validation of the method was performed in
terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ).
The linearity of the calibration curves for formic, acetic and propionic acids were 10 – 100
mg/L (R
2
adjusted
> 0.992), for all of them. Therefore, the proposed method is simple and
8
suitable for the simultaneous analysis of low-molecular mass organic acids in highly saline
natural water.
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Soluções tamponadas para eletroforese capilar.............................................34
Tabela 2 - Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar....................................35
Tabela 3 - Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)........................................37
Tabela 4 - Tipos e propriedades dos agentes tensoativos................................................39
Tabela 5 - Aplicações da cromatografia eletrocinética micelar (MECC)........................42
Tabela 6 – Seleção do modo de eletroforese capilar.......................................................42
Tabela 7 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos fármacos............64
Tabela 8 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos ácidos
orgânicos..........................................................................................................................65
Tabela 9 - Parâmetros da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.........................71
Tabela 10 - Análise estatística da curva de calibração do AAS e PAR por
CZE..................................................................................................................................71
Tabela 11 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS..................71
Tabela 12 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do PAR..................71
Tabela 13 - Estudo da precisão intra-corridas do método desenvolvido para determinar AAS e
PAR por CZE.......................................................................................................73
Tabela 14 - Parâmetros da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE..........79
Tabela 15 - Análise estatística da curva de calibração dos ácidos orgânicos por
MKCE..............................................................................................................................79
Tabela 16 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido
fórmico.............................................................................................................................79
Tabela 17 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido acético.....79
Tabela 18 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido
propiônico........................................................................................................................80
Tabela 19 – Resultados da medida da precisão ..............................................................82
Tabela 20 - Figuras analíticas de mérito .........................................................................83
10
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 - Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.......................18
Figura 2 - Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia...........19
Figura 3 - Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia
modelo.............................................................................................................................19
Figura 4 - Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da
eletroforese......................................................................................................................22
Figura 5 - Efeito de pH no fluxo eletroosmótico.............................................................25
Figura 6 - Perfis de fluxos capilares................................................................................26
Figura 7 - Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade
eletroforética....................................................................................................................29
Figura 8 - Eletroforese capilar por zona..........................................................................31
Figura 9 - Cromatografia eletrocinética micelar..............................................................38
Figura 10 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH =
8,0....................................................................................................................................66
Figura 11 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH =
9,2....................................................................................................................................66
Figura 12 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH =
10,4..................................................................................................................................67
Figura 13 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH =
9,2....................................................................................................................................68
Figura 14 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 50 mmol/L, pH =
9,2....................................................................................................................................68
Figura 15 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial
aplicado = 15 kV………………………………………………………..........69
Figura 16 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial
aplicado = 20 kV..............................................................................................69
Figura 17 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial
aplicado = 25 kV..............................................................................................70
Figura 18 – Curva de calibração do AAS por eletroforese capilar por zona...................72
Figura 19 – Curva de calibração do PAR por eletroforese capilar por zona...................72
11
Figura 20 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico
10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL
de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água
purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH =
4,8.................................................................................................................................75
Figura 21 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico
10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL
de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água
purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH =
5,3.................................................................................................................................76
Figura 22 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico
10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL
de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água
purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH =
5,8.................................................................................................................................76
Figura 23 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico
10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL
de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água
purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial
aplicado = -15 kV...................................................................................77
Figura 24 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico
10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL
de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água
purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial
aplicado = -20 kV...................................................................................78
Figura 25 – Curva de calibração do ácido fórmico por eletroforese capilar por
MECK..............................................................................................................................80
Figura 26 – Curva de calibração do ácido acético por eletroforese capilar por
MECK..............................................................................................................................80
Figura 27 – Curva de calibração do ácido propiônico por eletroforese capilar por
MECK..............................................................................................................................81
12
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA Albumina de soro bovina
CAPS Ácido 3-(ciclohexilamino)-1- propanosulfônico
CE Eletroforese capilar
CGE Eletroforese capilar em gel
CIEF Eletroforese capilar por focalização isoelétrica
CITP Isotacoforese capilar
CMC Concentração micelar crítica
CTAB Brometo de cetiltrimetil amônio
CZE Eletroforese capilar por zona
DMF Dimetilformamida
DMSO Sulfóxido de dimetila
E Força do campo elétrico
EDTA Ácido etilenodiaminetetraacético
EOF Fluxo electroosmótico
EPF Fluxo eletroforético
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
LC Cromatografia líquida
L
d
Comprimento do tubo capilar até o detector
L
t
Comprimento capilar total
MECC/MEKC Cromatografia eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar
MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico
µ
ep
Mobilidade eletroforética
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
PCR Reação da polimerase em cadeia
pI Ponto isoelétrico
SDS Dodecilsulfato de sódio
THF Tetrahidrofurano
Tris Tris(hidroximetil) amino metano
UV Ultravioleta
V volt
V Potencial elétrico
V
eo
Velocidade do fluxo electroosmótico
V
ep
Velocidade eletroforética
13
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.............................................................................................................16
1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................17
1.1 - Eletroforese capilar...............................................................................................17
1.1.1 Modos de injeção da amostra…………………………………………………….19
1.1.2 Sistemas de detecção……………………………………………………………..20
1.1.3 Modos de separação por eletroforese…………………………………………….21
1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar……………………………………………..22
1.1.5 Eletroosmose……………………………………………………………………..23
1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução……………………………………….25
1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule……………………………………….28
1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura…………………………………….30
1.1.9 Modos de eletroforese capilar…………………………………………………….30
1.1.10 Eletroforese capilar de zona…………………………………………………….31
1.1.10.1 Tubos capilares………………………………………………………………..31
1.1.10.2 Efeito do pH…………………………………………………………………...32
1.1.10.3 Solução tampão………………………………………………………………..33
1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar……………………..35
1.1.10.5 Revestimento do capilar………………………………………………………36
1.1.10.6 Aplicações da CZE……………………………………………………………36
1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)……………………...37
1.1.11.1 Micelas………………………………………………………………………..38
1.1.11.2 Mecanismo de separação……………………………………………………...40
1.1.11.3 Ordem de migração...........................................................................................41
1.1.11.4 Uso de modificadores orgânicos……………………………………………...41
1.1.11.5 Aplicações da MECC........................................................................................42
1.1.12 Selecão do tipo de eletroforese capilar………………………………………….42
1.2 Métodos de determinação de ácido acetilsalicílico (AAS)…...………………….43
1.3 Métodos de determinação do paracetamol (PAR)………………………………43
1.4 Métodos de determinação de ácidos orgânicos………………………………….44
1.5 Validação de métodos analíticos univariados …………………………………...46
1.5.1 Linearidade: o ajuste da curva de calibração
……………………………………..47
1.5.1.1 A qualidade do ajuste da curva de calibração…………………………………. 47
14
1.5.2 Teste de linearidade………………………………………………………………48
1.5.3 Sensibilidade do método: o limite de detecção e o limite de quantificação ……..49
1.5.3.1 Limite de detecção: método visual……………………………………………..49
1.5.3.2 Limite de detecção: método da razão sinal-ruído………………………………50
1.5.3.3 Limite de detecção: método baseado em parâmetros da curva analítica……….50
1.5.4.1 Limite de quantificação: método visual...............................................................51
1.5.4.2 Limite de quantificação: método da razão sinal-ruído…………………………51
1.5.4.3 Limite de quantificação: método baseado em parâmetros da curva analítica….51
1.5.5 Precisão …………………………………………………………………………..51
1.5.6 Exatidão …………………………………………………………………………..52
1.5.7 Robustez………………………………………………………………………….53
1.6 Validação de métodos eletroforéticos para análise de produtos farmacêuticos
………………………………………………………………………………………….53
1.6.1 Especificidade.........................................................................................................53
1.6.2 Linearidade e faixa da curva analítica……………………………………………55
1.6.3 Exatidão e estudo de recuperação………………………………………………...55
1.6.4 Precisão…………………………………………………………………………...56
1.6.4.1 Repetibilidade …………………………………………………………………..56
1.6.4.2 Precisão intermediária………………………………………………………….57
1.6.4.3 Reprodutibilidade………………………………………………………………57
1.6.5 Estabilidade das soluções………………………………………………………...57
1.6.6 Robustez………………………………………………………………………….58
1.6.7 Limites de detecção e quantificação……………………………………………...58
2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL……………………………………………60
2.1 Instrumentação……………………………………………………………………60
2.2 Soluções, reagentes e materiais …………………………………………………..60
2.2.1 Solução estoque de ácido acetilsalicílico 1000 mg/L…………………………….61
2.2.2 Solução estoque de paracetamol 1000 mg/L……………………………………..61
2.2.3 Solução estoque de ácido benzóico 500 mg/L …………………………………..61
2.2.4 Solução tampão de borato 25 mmol/L (pH = 9,20)………………………………61
2.2.5 Solução tampão de borato 50 mmol/L (pH = 9,20)………………………………61
2.2.6 Solução estoque de aspirina 5000 mg/L………………………………………….61
2.2.7 Solução estoque de paracetamol 7500 mg/L
……………………………………..63
2.2.8 Solução estoque de ácido fórmico 1000 mg/L …………………………………...63
15
2.2.9 Solução estoque de ácido acético 1000 mg/L…………………………………….63
2.2.10 Solução estoque de ácido propiônico 1000 mg/L……………………………….63
2.2.11 Solução tampão pH = 5,3……………………………………………………….63
2.3 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por CZE...63
2.4 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por MECC
………………………………………………………………………………………….64
2.5 Curvas de calibração dos fármacos para a determinação por CZE...................64
2.6 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos para a determinação por
MEKC.............................................................................................................................65
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO …………………………………………………..66
3.1 Estudo univariado do método de determinação de AAS e PAR por CZE…….66
3.1.1 Efeito do pH da solução tampão…...……………………………………………..66
3.1.2 Efeito da concentração do eletrólito suporte……………………………………..67
3.1.3 Efeito do potencial aplicado……………………………………………………...69
3.1.4 Robustez………………………………………………………………………….70
3.1.5 Curvas de calibração……………………………………………………………...70
3.1.6 Precisão…………………………………………………………………………...72
3.1.7 Limites de detecção e quantificação……………………………………………...73
3.1.8 Calibração pelo método do padrão interno……………………………………….73
3.2 Estudo univariado do método de determinação de ácidos orgânicos por
MEKC………………………………………………………………………………….74
3.2.1 Efeito do pH da solução tampão………………………………………………….74
3.2.2 Efeito do potencial aplicado……………………………………………………...77
3.2.3 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos………………………………………78
3.2.4 Precisão…………………………………………………………………………...81
3.2.5 Limites de detecção e quantificação……………………………………………...82
4. CONCLUSÕES……………………………………………………………………..84
5. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS.........................................................85
6. REFERÊNCIAS…………………………………………………………………….86
16
INTRODUÇÃO
A química exerce um papel preponderante no meio ambiente. É comum o
público atribuir às substâncias químicas sintéticas os principais problemas de poluição,
responsabilizando seus criadores por isso. Porém, passam despercebido, especialmente
para o grande público, que muitos dos problemas ambientais somente foram resolvidos
quando utilizados os conhecimentos da ciência, em particular da química (LUNA,
2003).
Quando o meio ambiente é abordado, torna-se cada vez mais claro a necessidade
de se aprofundar os estudos nessa área. Interdisciplinar por excelência, esse campo
demanda conhecimentos e técnicas de diferentes fontes, entre as quais se destaca a
química analítica. Neste contexto, a química analítica exerce um papel fundamental,
pois oferece uma pletora de métodos e técnicas para identificação e quantificação de
analitos em uma gama imensa de matrizes (LUNA, 2003).
Acontece que nem sempre os conteúdos mais refinados dessa área do
conhecimento são disponibilizados. Além disso, os profissionais das ciências ambientais
provêm de diversas áreas, portanto costumam ter familiaridade com laboratório
analítico, mas não detêm necessariamente uma formação que lhes possibilite atentar
para as particularidades deste campo (LUNA, 2003).
Mesmo o químico precisa receber uma preparação adequada nesse domínio. A
importância de se empenhar nesse sentido fica patente quando pensamos que, a despeito
de todo o desenvolvimento instrumental, o fator determinante da confiabilidade dos
dados levantados continua sendo a formação do pesquisador (LUNA, 2003).
Para a separação de misturas e quantificação dos componentes são empregadas
técnicas clássicas de separação, tais como: cromatografia em suas diversas modalidades
e a eletroforese. Neste contexto, a eletroforese capilar surge como um técnica alternativa
promissora, esta pode ser empregada como substituinte de cromatografia líquida e, em
muitos casos, como a única alternativa possível (LUNA, 2003).
Neste trabalho, utilizaram-se duas técnicas da família eletroforese capilar:
eletroforese capilar por zona (CZE) e cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) ou
eletrocromatografia micelar como técnicas de quantificação de princípios ativos de
preparações farmacêuticas, e ácidos orgânicos de massa molecular baixa em amostras
de águas naturais fortemente salinas. A literatura relata a cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) como uma técnica de grande aceitação na indústria farmacêutica,
porém somente recentemente a eletroforese capilar foi introduzida nas farmacopéias
17
americana (USP, 2000), francesa (PHARMACOPÉE EUROPÉENNE, 2001) e japonesa
(JP FORUM 1999). Esta técnica surgiu como uma técnica alternativa ou complementar
para aplicação na área de insumos e preparações farmacêuticas. Portanto, o uso de
eletroforese capilar na indústria farmacêutica surgiu a menos uma década, o que
significa uma nova área de pesquisa e desenvolvimento. A determinação de ácidos
orgânicos de massa molar baixa é usualmente feita por cromatografia gasosa (GC),
porém o fato destes analitos se encontrarem em meio aquoso fortemente salino,
inviabiliza a sua determinação direta por esta técnica. Tal surgiu, a oportunidade de se
explorar a cromatografia eletrocinética micelar para esta finalidade.
Portanto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método de análise para a
quantificação dos princípios ativos de fármacos (ácido acetilsalicílico e paracetamol)
por CZE e outro método de análise para a quantificação dos ácidos: fórmico, acético e
propiônico por MEKC em amostras de águas naturais fortemente salinas.
18
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Eletroforese capilar
A eletroforese capilar (CE) é uma família de técnicas relacionadas que
empregam tubos capilares finos (d.i. = 20-200 µm) para realizar separações de
moléculas grandes e pequenas com elevada eficiência. Nestas separações são
empregados potenciais elétricos elevados que podem gerar fluxos eletroosmótico e
eletroforético de soluções tamponadas e de espécies iônicas, respectivamente, dentro do
tubo capilar (BAKER, 1995).
As propriedades da separação e o eletroferograma resultante têm características
que se assemelham a um cruzamento da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
tradicional com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (BAKER, 1995).
A CE oferece um formato inovador para as técnicas de separação, pois:
• emprega tubos capilares onde ocorre a separação eletroforética;
• utiliza um campo elétrico muito alto, freqüentemente mais alto que 500 V/cm;
• usa a tecnologia de um detector moderno e faz com que o eletroferograma seja
semelhante ao de um cromatograma;
• tem eficiência igual ou superior ao da cromatografia em fase gasosa capilar;
• requer uma quantidade mínima de amostra;
• é facilmente automatizado para uma análise quantitativa precisa e tem facilidade de
uso;
• consume uma quantidade limitada de reagentes, com volumes tipicamente da ordem
de 1 a 10 nL;
• é aplicável para uma seleção ampla de analitos quando comparada com outras técnicas
analíticas de separação (TAVARES, 1997).
A configuração instrumental básica para CE consiste de um tubo de sílica
fundida com uma janela óptica, uma fonte controlada com potencial elevado, dois
elétrodos, dois reservatórios com solução tampão e um detector que pode ser:
ultravioleta, fluorescência, quimiluminescência, espectrometria de massas ou
eletroquímico (BAKER, 1995).
As extremidades do tubo capilar são colocadas em dois reservatórios, um
contendo a solução tampão com a janela óptica alinhada com o detector e o outro
contendo a amostra. Depois de encher o tubo capilar com a solução tampão, a amostra
pode ser introduzida imergindo a extremidade do tubo capilar no recipiente da solução
19
amostra e elevando o tubo capilar submerso cerca de 30 cm acima do reservatório da
solução tampão colocado do lado do detector. Virtualmente todo o trabalho antes de
1988 em CE era executado em instrumentos com esta configuração básica. Apesar de
relativamente fáceis de usar, estes primeiros sistemas eram inconvenientes para análise
de rotina e muito imprecisos para análise quantitativa (BAKER, 1995).
Um diagrama de um instrumento moderno, o sistema de eletroforese capilar,
modelo Capel 105M (Lumex, Rússia), é ilustrado na Figura 1.
Figura 1 – Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.
Quando comparados aos primeiros instrumentos desenvolvidos, este instrumento
é completamente automatizado, pois oferece o controle computadorizado de todas as
operações como a injeção hidrodinâmica da amostra, o uso de um amostrador
automático e de um coletor de fração, o controle preciso da temperatura e um sistema de
dissipação de calor avançado. A automatização é crítica para CE, pois uma operação
repetível é exigida para uma análise quantitativa precisa (BAKER, 1995).
As figuras 2 e 3 mostram o sistema de eletroforese capilar empregado e a janela
ótica do sistema de detecção, respectivamente.
20
Figura 2 – Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.
Figura 3 – Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia
modelo Capel 105 M, em destaque a janela de detecção.
1.1.1 Modos de injeção da amostra
Os resultados das análises podem ser diretamente influenciados pelo tipo de
injeção realizada na eletroforese capilar. Existem duas maneiras de se introduzir
amostras do CE no tubo capilar: injeção eletrocinética (onde um gradiente de potencial
é estabelecido ao longo do capilar) ou injeção hidrodinâmica (no qual utiliza-se um
gradiente de pressão).
Durante a injeção eletrocinética o potencial é aplicado por um tempo já
estipulado anteriormente, sendo a amostra introduzida a partir do resultado da
combinação da velocidade eletroosmótica e eletroforética. No método hidrodinâmico a
pressão pode ser através de pressurização ou vácuo em um dos reservatórios de solução,
21
ou por gravidade onde se eleva um dos reservatórios de amostras em relação ao outro e
é introduzido por sifonagem. Neste caso o volume da amostra irá depender de vários
fatores tais como: tempo de injeção, viscosidade da solução tampão, diferença da
pressão estabelecida etc.
Comparando-se os dois tipos de injeção a hidrodinâmica é mais precisa que a
eletrocinética, porém um aumento significativo pode ocorrer na zona da amostra
resultando um perfil parabólico o qual é característico em casos de fluxos induzidos por
pressão (TAVARES, 1996).
1.1.2 Sistemas de detecção
Existem diversos tipos de detectores utilizados em eletroforese capilar. Um dos
mais comuns é o espectrofotométrico de absorção no UV/Vis que permitem seleção do
comprimento de onda na faixa de 190 a 700 nm (QUEIROZ & JARDIM, 2001). Vários
critérios devem ser observados na escolha de um detector adequado para que um
experimento tenha êxito, tais como: versatilidade, alta sensibilidade, baixo nível de
ruído, vasta linearidade de respostas, linha de base estável, insensibildade ao fluxo e
mudanças de temperatura e respostas a todo o tipo de substâncias utilizando um
pequeno volume de amostra. Para que não se tenha dúvida em relação aos resultados,
procura-se utilizar um detector com uma relação conhecida e reprodutível garantindo
assim uma análise mais precisa dos resultados (WESTON & BROWN, 1997).
Basicamente os detectores podem ser classificados em dois tipos: universais e
específicos. O modo de funcionamento dos detectores universais é feito através da
medição entre a diferença de alguma propriedade do soluto em relação à solução. A
desvantagem desse tipo de detector em relação ao específico é apresentar menor
sensibilidade e intervalo dinâmico.
No caso dos detectores específicos a medição é realizada através de alguma
propriedade específica do soluto, estando incluídos como exemplos os fotodetectores
(baseados na absorção do UV/Vis), os espectrômetros de massa, os detectores
amperométricos e radiométricos, etc.
A grande vantagem do uso desse tipo de detector ocorre quando a matriz da
amostra é complexa e principalmente quando se deseja minimizar algum tipo de
interferência do fundo. Além disso é mais sensível do que os detectores universais,
fornece intervalos mais amplos de resposta linear e melhor relação sinal/ruído
(TAVARES, 1996).
22
Dentre os diversos tipos de detectores em CE, estão incluídos os de fluorescência,
espectrômetro de massa, fluorescência por laser-induzido, condutividade,
amperométrico, radiométrico, refratométrico, etc. (BAKER, 1995). Na figura 3 pode-se
observar um cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia
modelo Capel 105 M.
1.1.3 Modos de separação por eletroforese
Os modos de separação por eletroforese são classificados como: fronteira móvel,
zona, isotacoforese e focalização isoelétrica.
Na eletroforese por fronteira móvel, uma quantidade razoável da amostra é
colocada em um tubo, preenchido com uma solução tampão. Após a aplicação do
campo elétrico, os componentes da amostra migram em determinada direção com uma
velocidade característica que depende da mobilidade do componente. A separação
completa nunca é atingida, pois apenas os componentes de maior mobilidade podem ser
parcialmente purificados, enquanto que as bandas dos outros componentes sofrem
diversos graus de sobreposição (TAVARES, 1996).
A eletroforese de zona é também uma técnica de fronteira móvel, pois a amostra
é introduzida no meio tamponado, como uma banda de espessura pequena. Quando o
campo elétrico é aplicado, cada zona migra de forma independente, com velocidade
constante, mas diferenciada em função de sua própria mobilidade. As modalidades da
eletroforese em solução livre, gel e micelar pertencem a essa categoria (TAVARES,
1996).
Em isatocoforese, a amostra é inserida entre soluções, o eletrólito líder e o
eletrólito terminador. Ambos, cátions e ânions podem ser determinados por esse modo,
entretanto em misturas distintas. A Figura 4 ilustra a separação isotacoforética de uma
mistura de cátions. Nesse exemplo, o eletrólito líder deve conter um cátion cuja
mobilidade é maior que a mobilidade de qualquer componente catiônico da amostra. Por
outro lado, o eletrólito terminador deve conter o cátion de menor mobilidade. Quando o
campo elétrico é estabelecido, gradientes diferentes de potencial evolvem cada banda,
de tal forma que todos os cátions migram com velocidade constante e única. Em regiões
onde cátions de menor mobilidade estão presentes, o campo elétrico é mais intenso.
Entretanto, estes solutos movem-se com a mesma velocidade que os solutos de maior
mobilidade, estes últimos submetidos a campo elétrico mais fraco. Consequentemente,
as velocidades das bandas individuais são auto-normalizadas (TAVARES, 1996).
23
A focalização isoelétrica envolve a separação de solutos anfotéricos em um
gradiente de pH. Sob a influência do campo elétrico, um soluto carregado
negativamente migra em direção ao anodo. Durante a migração, o soluto atravessa
regiões de pH progressivamente menor. Assim, uma fração cada vez maior do maior do
soluto torna-se protonada, e dessa forma, a carga elétrica é alterada durante a migração.
Naturalmente, a carga total do soluto é nula e sua migração é interrompida. Cada
componente da amostra migra para uma região de pH igual ao seu ponto isoelétrico e
permanece nessa posição enquanto o campo elétrico estiver atuando (TAVARES,
1996).
Figura 4 – Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da
eletroforese. Adaptado de TAVARES,1996.
1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar
Existem algumas diferenças significantes entre a nomenclatura usada na
cromatografia e na eletroforese capilar. Por exemplo, um termo fundamental na
cromatografia é o tempo de retenção. Em eletroforese, em condições ideais quando nada
é retido, o termo análogo se torna tempo de migração. O tempo de migração (t
m
) é o
tempo que um soluto leva para se mover do início do tubo capilar até a janela de
24
detecção. Outros termos fundamentais são definidos a seguir, nos quais se incluem a
mobilidade eletroforética, µ
ep
(cm
2
/Vs), a velocidade eletroforética, V
ep
(cm/s), e a força
de campo elétrico, E (V/cm) (TAVARES, 1996). As relações entre estes fatores são
mostradas na Equação 1.
t
md
ep
ep
LV
tL
E
V
==
µ
(1)
Várias características importantes podem ser retiradas desta equação:
1) A velocidade eletroforética é calculada dividindo-se o comprimento do tubo capilar
até o detector (L
d
) pelo tempo de migração, t
m
.
2) A mobilidade eletroforética é obtida pela divisão da velocidade eletroforética pela
força do campo elétrico aplicado. A mobilidade é independente do potencial aplicado e
do comprimento do tubo capilar, mas é altamente dependente no tipo de tampão usado,
do pH, assim como da temperatura.
3) Dois comprimentos capilares são importantes: O comprimento do tubo capilar para o
detector, Ld, e o comprimento total, L
T
. Enquanto a separação mensurável ocorre no
segmento capilar, L
d
, a força de campo elétrico é calculada dividindo o potencial
elétrico pelo comprimento do tubo capilar inteiro, L
t
. O comprimento do tubo em
excesso, Lt - Ld, é exigido para fazer a conexão com o reservatório da solução tampão.
A Equação 1 só é útil na determinação da mobilidade aparente. Para calcular a
mobilidade real, o fenômeno do fluxo electroosmótico deve ser levado em consideração.
Para apresentar um eletroferograma reprodutível, o fluxo electroosmótico deve estar
cuidadosamente controlado (TAVARES, 1996).
1.1.5 Eletroosmose
Um dos fundamentais processos que dirigem a CE é a eletroosmose. Este
fenômeno é uma conseqüência da carga superficial na parede do tubo capilar. Os tubos
de sílica fundidos, que são tipicamente usados nas separações eletroforéticas, têm
grupos silanóis ionizáveis em contato com a solução tampão contida dentro do tubo
capilar. O pI da sílica fundida é aproximadamente 1,5. O grau de ionização é controlado
principalmente pelo pH da solução tampão (BAKER, 1995).
O fluxo eletroosmótico (EOF) é definido pela Equação (2):
25
EV
ep
πη
εξ
4
=
(2)
onde ∈ é a constante dielétrica, η é a viscosidade do tampão, e ξ é o potencial zeta
medido na camada plana próximo da interface líquido-sólido. A parede do tubo capilar
carregada negativamente atrai íons positivos do tampão, criando-se assim uma dupla
camada elétrica. Quando um potencial é aplicado no tubo capilar, os cátions da porção
difusa da camada dupla migram na direção do cátodo, carreando água. O resultado
desse processo é um fluxo líquido da solução tampão na direção do elétrodo negativo.
Esse fluxo eletroosmótico (EOF) pode ser bastante robusto, com uma velocidade linear
ao redor de 2 mm/s em pH = 9 em tampão de borato 20 mM. Para um tubo capilar de 50
µm de diâmetro interno, isto se traduz em uma vazão de cerca de 4 nL/s. Em pH = 3, o
EOF é muito menor, cerca de 0,5 nL/s. O potencial zeta é relacionado ao inverso da
carga por unidade da área da superfície do tubo capilar, do número de elétrons de
valência e da raiz quadrada da concentração do eletrólito. Como isto é uma relação
inversa, aumentando-se a concentração do eletrólito diminui-se o EOF. Como será
mostrado posteriormente, o fluxo eletroosmótico deve ser controlado ou até suprimido
para viabilizar certos modos de eletroforese capilar. Por outro lado, o EOF torna
possível uma determinação simultânea de cátions, ânions e espécies neutras em uma
única corrida. Em pH neutro ou alcalino, o EOF suficientemente é mais forte que a
migração eletroforética fazendo com que todas as espécies migrem para o elétrodo
negativo. A ordem de migração processa-se na seguinte ordem: cátions, espécies neutras
e ânions (TAVARES, 1996).
O efeito do pH no EOF é ilustrado na Figura 5. Imagine que um sal interno
como um peptídeo está sendo separado nas condições descritas na Figura 5. Em pH alto,
EOF é grande e o peptídeo está negativamente carregado. Apesar da migração
eletroforética do peptídeo para o elétrodo positivo (anodo), o EOF é superior, fazendo
com que o peptídeo migre para o elétrodo negativo (cátodo). Em pH baixo, o peptídeo
está positivamente carregado e EOF é muito pequeno. Deste modo, a migração
eletroforética do peptídeo e do EOF são para o elétrodo negativo. Em tubos capilares
não tratados, a maioria dos solutos migra para o elétrodo negativo não importando a
carga quando a solução tampão tiver um pH acima de 7,0. Em tampão de pH ácido, a
26
maioria dos sais internos e cátions também migrarão para o eletrodo negativo (BAKER,
1995).
Figura 5. Efeito do pH no fluxo eletroosmótico. Adaptado de QUEIROZ, 2007.
Para assegurar que um sistema está corretamente controlado, é freqüentemente
necessário medir o EOF. Isto é feito injetando-se um soluto neutro e medindo-se o
tempo que leva para alcançar o detector. Solutos como o metanol, acetona, e óxido de
mesitila são freqüentemente empregados. Na cromatografia eletrocinética micelar
(MECC) técnica que será discutida posteriormente, um requisito adicional imposto é
que o soluto marcador não se particione na micela. Para técnicas como eletroforese
capilar por focalização isoelétrica (CIEF) ou isotacoforese capilar (CITP), o EOF deve
ser suprimido. Isto é possível recobrindo-se o tubo capilar com teflon. Aditivos como a
metilcelulose também são efetivos na supressão do EOF (BAKER, 1995).
1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução
Quando se emprega um sistema pressurizado como na cromatografia líquida, as
forças de fricção na interface sólido-líquido nas paredes da coluna provocam uma queda
de pressão substancial. Até em sistemas abertos, as forças de fricção, mesmo com vazão
baixa, são severas o suficiente para resultar em perfis de fluxo laminar ou parabólico.
Como conseqüência do fluxo parabólico, a seção transversal do fluxo, vista na Figura 6,
mostra o que ocorre no tubo capilar, o que provoca um fluxo mais alto no meio e
próximo à zero na parede de tubo capilar. Este variação no fluxo resulta em um
significativo alargamento do pico (BAKER, 1995).
27
Figure 6. Perfis de fluxos capilares.
Em sistemas eletricamente dirigidos, a força motriz do EOF é uniformemente
distribuída ao longo do comprimento inteiro do tubo capilar. Como resultado, não existe
queda de pressão e o fluxo é uniforme através do tubo capilar, exceto muito perto da
parede onde a velocidade novamente se aproxima de zero (BAKER, 1995).
A eficiência de um sistema pode ser derivada dos princípios fundamentais
(TAVARES, 1995).
A velocidade de migração, v
ep
, é simplesmente definida por:
L
V
EV
epepep
µµ
==
(3)
O tempo de migração, t
m
, é definido como:
V
L
V
L
t
epep
m
µ
2
==
(4)
Durante a migração pelo tubo capilar, ocorre uma difusão molecular levando a
dispersão do pico, σ
2
:
V
LD
tD
ep
m
mm
µ
σ
2
2
2
2 ==
(5)
onde D
m
é o coeficiente de difusão do soluto cm
2
/s. O número de pratos teóricos é dado
pela expressão seguinte:
2
2
σ
L
N =
(6)
Seção transversal de um fluxo eletroosmótico
Seção transversal de um fluxo hidrodinâmico
28
Substituindo-se a Equação (5) na Equação (6):
m
ep
D
V
N
2
µ
=
(7)
A dispersão do pico, σ
2
, neste sistema simples é assumida ser uma difusão
relacionada com o tempo. A equação (7) indica que macromoléculas de proteínas e
DNA, que possuem coeficientes de difusão pequenos, D
m
, fornecem um número de
pratos teóricos elevados. Além de com o uso de potenciais elevados promove-se uma
maior eficiência e diminui-se o tempo de separação. O limite de potencial aplicado com
a tecnologia existente é próximo a 30 kV. O limite prático da força do campo (pode-se
usar tubos capilares muito pequenos para gerar uma força de campo alto) é o
aquecimento Joule. Esse aquecimento é uma conseqüência da resistência do tampão
para seguir o fluxo de corrente. Pode-se estimar o número de pratos teóricos, tomando-
se como exemplo a proteína do coração do cavalo, a mioglobina (massa molar = 13.900
g/mol) como ilustração, onde µ
ep
= 0.65 x 10
-4
cm
2
/Vs (tampão de bicina/TEA 20 mM,
pH = 8,5) e D
m
= 1 x 10
-6
cm
2
/s com 30 KV, obtém-se um número de pratos teóricos
igual a 975.000 (BAKER, 1995).
O conceito de pratos teóricos pode ser melhor compreendido adotando-se o
seguinte modelo: em uma coluna cromatográfica contendo finas secções ou pratos, irá
ocorrer um equilíbrio do soluto entre a fase móvel e a estacionária. Com o movimento
do soluto através da coluna (de um prato teórico a outro), a eficiência vai aumentando,
com isso, quanto maior for o número de pratos teóricos maior será a eficiência da
coluna (Weston, Brown, 1997).
Apesar da limitação difusional, a CE é ainda útil para moléculas pequenas
porque nas separações µ
ep
é uma função da relação carga/íon. As moléculas pequenas
tendem a ser mais móveis. Por exemplo, a mobilidade do sulfato de quinina é 4 x 10
-4
cm
2
/Vs. Apesar do coeficiente de difusão deste analito ser alto, D
m
= 0.7 x 10
-5
cm
2
/s, o
número de pratos teóricos é igual a 857.000 quando o potencial aplicado é de 15 KV
(BAKER, 1995).
A resolução, R
s
, entre duas espécies é dada pela expressão:
NR
ep
ep
s
µ
µ
∆
=
4
1
(8)
29
onde ∆µ
ep
é a diferença em mobilidade eletroforética entre as duas espécies,
ep
µ
é a
mobilidade eletroforética média das duas espécies e N é o número de pratos teóricos.
Substituindo-se o número de pratos teóricos na Equação (8):
( )
mep
ep
s
D
V
R
µ
µ
177,0=
(9)
A Equação (9) indica que se pode melhorar a resolução aumentando-se o potencial
aplicado. Para duplicar a resolução, o potencial aplicado deve ser quadruplicado. A
chave para se melhorar a resolução é aumentar a ∆µ
ep
. O controle da mobilidade é
realizado pela seleção do tipo adequado de eletroforese capilar concomitante com a
seleção do tampão mais conveniente (TAVARES, 1996).
1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule
A produção de calor em CE é o resultado inevitável da aplicação de um campo
de força alto. Dois problemas importantes surgem da produção de calor: gradientes de
temperatura através do tubo capilar e mudanças de temperatura com o tempo devido à
dissipação de calor ineficaz. A taxa de geração de calor em um tubo capilar pode ser
expressa como:
LA
iV
dt
dH
=
(10)
onde L é o comprimento do tubo capilar e A é área da seção transversal. Como i = V/R
e R = L/kA onde k é a condutividade térmica.
2
2
L
kV
dt
dH
=
(11)
A quantidade de calor gerado é proporcional ao quadrado da força do campo
elétrico. Assim, a diminuição do potencial aplicado e o aumento do comprimento do
tubo capilar provocam um efeito dramático no calor gerado. O uso de solução tampão
com baixa condutividade é útil, porém o carregamento da amostra pode ser prejudicado.
Gradientes de temperatura dentro do tubo capilar são conseqüência da dissipação de
calor. Como o calor é dissipado por difusão, a temperatura no centro é superior à das
paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).
30
Figura 7 – Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade
eletroforética.
Como a viscosidade é mais baixa em temperaturas mais altas, isto ocasiona um
aumento no EOF, assim como na mobilidade eletroforética. A mobilidade eletroforética,
para a maioria dos íons, aumenta cerca de 2% por grau Kelvin. A resultante deste fato é
um perfil de fluxo que se assemelha a um fluxo hidrodinâmico, como o conseqüente
alargamento do pico. Trabalhando-se com tubos capilares de diâmetro pequeno
melhora-se a situação por duas razões: a corrente que passa pelo tubo capilar é reduzida
pelo quadrado do raio do tubo capilar e o calor é mais prontamente dissipado através do
percurso radial mais estreito (BAKER, 1995). O gradiente térmico resultante é
proporcional ao quadrado do diâmetro do tubo capilar, o qual pode ser obtido da
seguinte equação abaixo:
K
Wr
T
4
24,0
2
=∆
(12)
onde W é a potência, r é o raio do tubo capilar, e K, a condutividade térmica.
O segundo problema é dissipação de calor ineficaz. Se calor não é removido em
uma taxa equiparada à sua produção, um gradual aumento de temperatura irá ocorrer até
que o equilíbrio seja alcançado. Dependendo das condições específicas experimentais,
uma flutuação no tempo de migração resultará em variações no EOF e na velocidade
eletroforética. Os tubos capilares, com diâmetro estreito, ajudam na dissipação de calor,
mas sistemas de refrigeração efetivos são necessários. Líquidos são usados na remoção
de calor e no controle de temperatura do tubo capilar. O diâmetro interno do tubo
capilar varia de 20-200 µm. Do ponto de vista de resolução, o tubo capilar com menor
diâmetro interno produz a melhor a separação, porém reduz drasticamente o limite de
detecção em virtude da pequena quantidade de amostra introduzida e do estreito
caminho ótico (TAVARES, 1996).
Os tubos capilares estreitos são também os mais propensos a entupir. Como as
soluções são filtradas com filtros de porosidade pequena (<0,45 µm), o entupimento
31
raramente ocorre na faixa mencionada. Quando a filtração for impraticável para
amostras com partículas em suspensão, recomenda-se fazer uma centrifugação com
6000 rpm por 5 minutos (BAKER, 1995).
1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura
As velocidades electroosmótica e eletroforética são diretamente proporcionais à
força do campo, portanto o uso de um potencial mais alto permite uma redução nos
tempo de separação. A teoria prediz que tempos de separação pequenos darão as
eficiências mais altas, pois a difusão é a característica mais importante que contribui
para o alargamento dos picos. O fator limitante é o aquecimento Joule.
Experimentalmente, o potencial elétrico mais favorável é determinado fazendo-se
corridas com potenciais crescentes até que a deterioração na resolução seja observada.
As expressões da mobilidade eletroforética (Eq. 13) e do fluxo electroosmótico (eq. 2)
contêm um termo de viscosidade no denominador. A viscosidade é uma função de
temperatura; portanto torna-se necessário um controle eficiente da temperatura. Com o
aumento da temperatura, a viscosidade diminui; deste modo a mobilidade eletroforética
aumenta também. Algumas soluções tampão, como Tris tem o pH fortemente
dependente da temperatura. A maioria de separações são realizadas à 25°C (temperatura
ambiente). Com um líquido refrigerante no tubo capilar é possível manter excelente
controle de temperatura, até com solução tampão de concentração alta e tubos capilares
com diâmetros maiores. Sempre que o controle de temperatura começa a se tornar um
problema, a estratégia habitual é para usar um tubo capilar com diâmetro menor (menor
corrente reduz o aquecimento produzido) ou um tubo capilar mais longo (maior área de
superfície para dissipar o calor gerado). O controle de temperatura é a razão principal
para usar uma concentração baixa (por exemplo, 20 mM) da solução tampão ou
trabalhar em temperaturas elevadas (BAKER, 1995).
1.1.9 Modos de eletroforese capilar
A eletroforese capilar (CE) inclui uma família de técnicas que têm operações
consideravelmente diferentes e separações características. Nesta revisão, somente serão
discutidas as seguintes técnicas:
• Eletroforese capilar de zona (CZE)
• Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)
32
1.1.10 Eletroforese capilar de zona
A eletroforese capilar de zona (CZE), também conhecida como eletroforese
capilar em solução livre é a forma mais simples de CE. O mecanismo de separação é
baseado nas diferenças da razão de massa/carga. A homogeneidade da solução tampão e
a força de campo constante ao longo do comprimento do tubo capilar são fundamentais
para a CZE (BAKER, 1995).
Após a injeção e a aplicação do potencial elétrico, os componentes da mistura se
separam em zonas discretas como mostradas na Figura 8.
Figura 8 – Eletroforese capilar por zona
O parâmetro fundamental, a mobilidade eletroforética, µ
ep
, pode ser obtida da
teoria de Debye-Hückel-Henry
R
q
ep
πη
µ
6
=
(13)
onde q é a carga líquida, R é o raio de Stokes e η é a viscosidade. A carga líquida é
normalmente dependente do pH. Por exemplo, dentro do faixa de pH de 4-10, a carga
líquida do sódio é constante, assim como a sua mobilidade. Outras espécies como o
acetato ou o glutamato estão negativamente carregados dentro daquela faixa de pH e
deste modo têm mobilidades negativas (eles migram para o eletrodo positivo). Em pH
alcalino, sua migração ainda será para o eletrodo negativo por causa do EOF. “sais
internos” de aminoácidos, proteínas e peptídeos exibem cargas inversas ao do seu pI e,
igualmente, migram na direção da mobilidade eletroforética. As separações de
moléculas grandes e pequenas podem ser realizadas por CZE. Até moléculas pequenas,
onde as diferenças na razão carga/massa não são grandes, podem ainda ser separáveis
(BAKER, 1995).
33
1.1.10.1 Tubos capilares.
Os tubos capilares com um diâmetro interno de 25-75 µm são normalmente
empregados. Sílica fundida é o material de escolha devido à sua transparência no UV,
durabilidade (quando recoberto com poliimida) e o potencial zeta. Um tubo capilar novo
deve ser condicionado antes de poder ser usado. O pré-tratamento do tubo capilar
consiste na passagem de uma solução de NaOH 0,1 mol/L por 10 minutos, 5 minutos
com a água e 10 minutos com a solução tampão de corrida. Este procedimento de
condicionamento é importante para assegurar que a superfície do tubo capilar esteja
completamente e uniformemente carregada. Para alguns métodos é necessário regenerar
a superfície do tubo capilar entre corridas com a solução de NaOH 0,1 mol/L, e em
casos extremos, com uma solução de NaOH 1 M. O procedimento de regeneração é
freqüentemente necessário se ocorre mudanças nos tempos de migração de uma corrida
para outra. Isto é mais comum quando se usa solução tampão na faixa de pH = 2-6. A
regeneração é raramente necessária quando se trabalha em pH>9. Deve-se fazer esse
procedimento de descontaminação diariamente no início dos experimentos a menos que
a amostra ou os componentes de matriz estejam aderindo nas paredes do tubo capilar.
Enquanto isso não é muito sério com tubos capilares de sílica, prejuízos podem ser
significativos quando se faz a descontaminação de tubos capilares quimicamente
modificados (BAKER, 1995).
O procedimento seguinte maximizará as chances de sucesso ao armazenar um
tubo capilar.
1) Enxagüar o tubo capilar com solução de NaOH 0,1 mol/L por alguns minutos.
(Não faça esse tratamento com tubos capilares quimicamente modificados)
2) Enxagüar por 5 minutos com a água destilada e deionizada.
3) Colocar um frasco vazio sem tampa, na saída e introduza N
2
pelo tubo capilar por 5
minutos.
4) Remover o cartucho capilar do instrumento (BAKER, 1995).
1.1.10.2 Efeito do pH.
Em um pH elevado onde o EOF é significativo, a ordem de migração das
espécies é dada por cátions, espécies neutras e ânions. Nenhumas das espécies neutras
serão separadas, pois a carga líquida é zero. Os ânions ainda migrarão em direção ao
cátodo porque o EOF é maior que a migração eletroforética. Em pH mais baixo, onde o
EOF é muito reduzido, os cátions e ânions podem ser medidos, embora não seja
34
possível em uma única corrida. Para medir ânions, o ânodo deve estar além da janela de
detecção. Igualmente, para medir os cátions, o cátodo deve estar além da janela de
detecção. A configuração adequada é obtida simplesmente invertendo a polaridade dos
elétrodos. O impacto do pH no analito também pode ser significativo, particularmente
para sais internos complexos como os peptídeos. A carga nestas combinações é
dependente do pH e a seletividade da separação é afetada substancialmente pelo pH.
Como uma regra geral, selecione um pH que seja pelo menos duas unidades acima do
pK
a
do analito para assegurar uma ionização completa. Em pH altamente alcalino, o
EOF pode ser tão rápido que separações incompletas podem ocorrer. Certas separações
de proteína podem ocorrer em pH ácido. Nessas condições, a parede do tubo capilar está
descarregada. As proteínas nessas condições estarão positivamente carregadas e não
irâo interagir eletrostaticamente com a parede do tubo capilar, embora uma interação
hidrofóbica possa ainda acontecer. A limitação desta técnica é a precipitação da
proteína. No pI da proteína, a simetria do pico tende a ser pobre (BAKER, 1995).
1.1.10.3 Solução tampão.
Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade
eletroforética do soluto depende do pH do eletrólito. Nesse caso, emprega-se o termo
mobilidade efetiva a qual incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das
espécies em equilíbrio e a distribuição das concentrações relativas de cada espécie no
pH considerado (TAVARES, 1997).
Uma variedade grande de soluções tampão pode ser empregada em CZE. Um
tampão é mais efetivo na faixa de uma ou duas unidades de pH do seu pK
a
. Por
exemplo, o fosfato é usado ao redor pH = 2,5 e pH = 7, e borato ao redor pH = 9,O. A
concentração de tampão típica é de 50-100 mM. Soluções tamponadas de sais internos
como bicina, tricina, CAPS, MES e Tris são comuns na separação de proteínas e
peptídeos. A vantagem do tampão de sal interno é sua condutividade baixa quando este
for empregado em torno do pI. A vantagem nisso é a baixa corrente líquida e a redução
do aquecimento Joule. Em certas soluções tamponadas, particularmente aquelas
direcionadas para separações de proteína, sais como cloreto, fosfato, e sulfato são
adicionados ao meio do tampão. Esses sais adicionados afetam a conformação da
proteína, que por sua vez impactam na separação. A concentração do sal também
pressiona o EOF devido em parte ao rompimento da dupla camada elétrica nas camadas
35
próximas das paredes do tubo capilar. Uma limitação importante na quantidade de sal
adicionado na preparação do tampão é o aquecimento Joule (BAKER, 1995).
Tabela 1. Soluções tamponadas para eletroforese capilar (TAVARES, 1997).
Solução tampão Faixa de pH útil
Fosfato 1,14 – 3,14
Acetato 3,76 – 5,76
Fosfato 6,20 – 8,20
Borato 8,14 – 10,14
Soluções tamponadas de sais internos
MES 5,15 – 7,15
PIPES 5,80 – 7,80
HEPES 6,55 – 8,55
TRICINA 7,15 – 9,15
TRIS 7,30 – 9,30
Vários aditivos de solução tampão podem ser empregados para mudar a
seletividade da separação. O uso de aditivos é indicado em quatro situações: para alterar
a mobilidade do soluto, modificar o fluxo eletroosmótico, solubilizar os solutos ou
componentes da matriz da amostra e reduzir a interação de certos solutos com a parede
do capilar, ou minimizar a adsorção. Ou seja, os aditivos de tampão alteram, entre
outras coisas, as mobilidades eletroforéticas. Em outras palavras, duas combinações que
têm as mobilidades idênticas em um sistema de tampão simples podem ser
diferenciadas com aditivos. Outros aditivos, como agentes tensoativos ou
ciclodextrinas, formam um ambiente heterogêneo que define uma nova classe de CE
que será visto posteriormente. Todas as soluções tamponadas devem ser filtradas através
de uma membrana filtrante de 0,45 µm antes do uso (BAKER, 1995).
36
Tabela 2 – Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar (BAKER, 1995).
Aditivo Função e/ou Efeito
Ácidos sulfônicos Agente formador de pares iônicos e modificadores da carga
superficial
Aminas Bloqueiam os sítios ativos na superfície do capilar,
recobrindo os grupos silanóis livres. Reduzem adsorção e
assimetria do pico.
Anfólitos Reduzem a interação soluto-capilar, melhoram a resolução e
simetria do pico.
Ciclodextrinas Usados nas separações quirais e como complexantes
auxiliares na separação de espécies neutras.
Éter de coroa Usados nas separações quirais e como complexantes
auxiliares na separação de íons metálicos.
Glicóis Reduzem a interação soluto-capilar, auxiliam na solubilidade
de solutos orgânicos e reduzem o EOF.
Íons de metais de
transição
Modificam a mobilidade de certos solutos e afetam a
resolução.
Polímeros de celulose Agentes modificadores de EOF
Sais inorgânicos Reduzem o EOF, alteram a conformação da proteína e
previnem a adsorção soluto-capilar.
Solventes orgânicos Aumentam a solubilidade de solutos orgânicos. Reduzem a
interação soluto-capilar. Agentes modificadores do EOF.
Agentes tensoativos
catiônicos
Revertem a carga da parede do tubo capilar. Revertem o fluxo
EOF.
Uréia Solubiliza proteína e desnatura oligonucleotídeos
1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar
Um problema na CZE é de natureza eletrostática, o qual permite a ligação de
espécies catiônicas nas paredes do tubo capilar. Este efeito é observado com proteínas
quando se trabalha em um tampão que tem um pH abaixo do pK
a
do analito. Esse
problema pode ser superado trabalhando-se com, pelo menos duas pH unidades acima
do pK
a
da proteína, mas em alguns casos, o pH mais alto pode não pode ser favorável
37
para a separação. Apesar destes problemas, proteínas, especialmente aquelas de
tamanho semelhante, podem ser melhor separadas em solução livre. O uso de tubos
capilares quimicamente modificados é um de vários modos que podem servir para
reduzir a ligação nas paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).
1.1.10.5 Revestimento do capilar.
A redução ou eliminação de EOF pode ser útil nas separações eletroforéticas. No
entanto, o fato mais interessante é a habilidade para eliminar a adsorção do soluto. Uma
grande variedade de revestimentos é possível, inclusive com o uso de algumas fases
usadas na cromatografia em fase gasosa capilar. O uso de camadas hidrofílicas tem
grande utilidade na supressão da adsorção de substâncias hidrofóbicas. Ligações
eletrostáticas também podem ser suprimidas. O revestimento hidrofóbico e o uso de
tensoativos não-iônicos como os aditivos de tampão surgem também como iniciativas
promissoras. Muitas companhias estão começando a introduzir tubos capilares de fase
ligada. Esses tubos capilares devem estender a faixa de substâncias capazes de serem
separadas por CZE (BAKER, 1995).
1.1.10.6 Aplicações da CZE
CZE é muito útil na separação de proteínas e peptídeos onde a resolução
completa pode ser freqüentemente obtida para analitos que diferem por um aminoácido
substituinte. Outras aplicações, onde o CZE pode ser útil inclui a determinação de
ânions inorgânicos e cátions como aqueles tipicamente separados por cromatografia de
troca iônica. Moléculas pequenas de insumos e produtos farmacêuticos podem ser
freqüentemente separadas desde que elas possuam cargas. Na maioria dos casos, a
técnica de cromatografia eletrocinética micelar dá resultados superiores para espécies
carregadas como também para moléculas pequenas neutras. Este modo de CE será
discutido mais tarde. Um resumo de aplicações, inclusive com indicativo da solução
tampão usada, é dado na Tabela 3.
38
Tabela 3 – Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)
Analito Tampão Referência
Dipeptídeos/proteínas H
3
PO
4
150 mM, pH = 1,5
MCCORMICK
(1988)
β – Lactoglobulinas Borato 50 mM, KCl 50
mM
DONALD &. JORGENSON
(1988)
Endorfinas Citrato 20 mM, pH = 2,5
GROSSMAN, COLBURN,
LAUER et al. (1989)
Ribonucleases CAPS 20 mM, pH = 11,0
GROSSMAN, COLBURN,
LAUER et al. (1989)
Hormônios de crescimento
humano
Fosfato 100 mM, pH =
2,6 e pH = 8,0
FRENS,WU E HANCOCK,
(1989)
Ânions Salicilato 25 mM, pH = 4 GROSS & YEUNG (1989)
Fármacos (paracetamol et
all.)
Borato 10 mM, pH = 9 AZHAGVUEL & SEKAR
(2007)
Fármacos (paracetamol et
all.)
Borato 40 mM SDS 0,5
mM, pH = 6.2
MARÍN & BARBAS (2004)
Ânions BTA 3 mM, TEPA 1,5
mM e Tris 15 mM, pH =
8,4
YING & KAP (2003)
1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)
A limitação primária da eletroforese capilar em solução livre é a impossibilidade
de separar espécies neutras a menos que existam diferenças significativas de massa
molar. Geralmente, as espécies neutras migram no capilar por ação exclusiva do EOF,
não havendo discriminação espacial e/ou temporal dos solutos na chegada ao detector
(TAVARES, 1997). No entanto, Terabe e colaboradores introduziram uma versão
modificada da eletroforese capilar, a eletrocromatografia micelar ou cromatografia
eletrocinética micelar (MECC). Nesta técnica, adicionam-se agentes tensoativos ao
eletrólito de corrida, em condições adequadas para a formação de micelas, formando
assim um sistema cromatográfico de duas fases. O eletrólito representa a fase primária,
a qual é transportada eletroosmoticamente sob ação do campo elétrico, enquanto que as
micelas representam a fase secundária, ou pseudo-estacionária, a qual é transportada por
uma combinação de eletroforese e eletroosmose. A partição diferenciada de solutos
39
neutros entre estas duas fases é responsável pela seletividade da separação. A adição de
um complexante auxiliar minimiza os problemas de co-eluição em MECC (TAVARES,
1997; TERABE et all., 1984).
1.1.11.1 Micelas.
As micelas são agregados anfifílicos (compostos que se caracterizam por possuir
em sua estrutura uma região polar iônica ou não, e uma região apolar a qual pode ser
representada por uma ou mais cadeias hidrocarbônicas), conhecidos como agentes
tensoativos. Essas substâncias são moléculas de cadeia longa (10 – 50 unidades de
carbono) e se caracterizam por ter uma cauda hidrofóbica longa e um grupo hidrófilo na
cabeça. As micelas normais são formadas em solução aquosa com a cauda hidrofóbica,
com a cauda apontando para dentro e a cabeça hidrófila apontando para fora da solução
aquosa. Um desenho esquemático é mostrado na Figura 9. As micelas são formadas
como uma conseqüência do efeito hidrofóbico, isto é, elas se formam para reduzir a
energia livre do sistema. A cauda hidrofóbica do tensoativo não pode ser solvatada em
solução aquosa. Acima da concentração do tensoativo conhecida como concentração
micelar crítica (CMC), o agregado está completamente formado. Mudanças físicas na
tensão da superfície, viscosidade e na capacidade de espalhamento de luz acompanham
a formação da micela. Micelas reversas, que se formam em solventes orgânicos, ainda
não foram estudadas em MECC (BAKER, 1995).
Figura 9. Cromatografia eletrocinética micelar
40
Existem quatro tipos importantes de agentes tensoativos: aniônico, catiônico,
anfotérico e neutro. Na Tabela 4 são mostrados alguns exemplos destes tipos de
substâncias e alguns tipos de agentes tensoativos empregados. Destes tipos, os dois
primeiro dois são mais úteis em MECC. Os agentes tensoativos sintéticos e naturais têm
sido empregados em MECC. Dentre os tensoativos sintéticos, destacam-se o SDS e o
CTAB na cromatografia eletrocinética micelar (MECC).
Tabela 4 – Tipos e propriedades dos agentes tensoativos (BAKER, 1995)
Tensoativo Tipo CMC (mol/L) Agregação
SDS
(1)
Aniônico 8,1 x 10
-3
62
CTAB
(2)
Catiônico 9,2 x 10
-4
170
Brj-35
(3)
Neutro 1,0 x 10
-4
40
Sulfobetaína
(4)
Anfotérico 3,3 x 10
-3
55
Obs.
(1)
SDS = dodecil sulfato de sódio;
(2)
CTAB = brometo de cetiltrimetil amônio;
(3)
Brj-35 = éter de polioxietileno-23-laurila;
(4)
Sulfobetaína = ácido N-dodecil-N,N-
dimetilamônio-3-propano-1-sulfônico.
O SDS é um tensoativo extensamente usado em MECC. Encontra-se disponível
no mercado e tem preço relativamente baixo. Sua massa molar é igual a 288 g/mol, a
concentração molar crítica é aproximadamente 8 mM e seu número de agregação é 62
(número de moléculas/micela). As micelas têm a capacidade de organizar os analitos,
em nível molecular, em virtude das interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Mesmo as
moléculas neutras podem se ligar às micelas, pois estas micelas possuem um alta
capacidade de solubilização. Soluções de agentes tensoativos têm sido empregadas em
espectroscopia e cromatografia em virtude das propriedades micelares. Por exemplo, a
fosforescência à temperatura ambiente é facilmente observável em meio micelar, pois
reduz o mecanismo de supressão fosforescente. Mais especificamente relacionado à
MECC, estas soluções de tensoativos podem servir como modificadores da fase móvel.
Estes modificadores de fase móvel da MECC assemelham-se àqueles empregados na
cromatografia líquida de fase reversa, pois um incremento na concentração do
tensoativo provoca um aumento na capacidade de eluição da fase móvel. O analito é
particionado entre a micela e a fase móvel (meio da solução), ou entre a micela e a fase
estacionária ou entre a fase móvel (meio da solução) e a fase estacionária. Deste modo,
41
a pseudo-fase ou LC micelar é um equilíbrio mais complexo que a LC convencional.
Em muitos aspectos, este equilíbrio de três fases pode ser comparado ao da
cromatografia líquida de troca iônica. O mecanismo da MECC, por causa de um
equilíbrio de duas fases, é mais simples que o da cromatografia micelar. O fator que
dificulta a MECC é a mobilidade eletroforética do analito que contribui fortemente para
a separação global (BAKER, 1995).
1.1.11.2 Mecanismo de separação
Em pH neutro ou alcalino, o EOF tem um movimento forte na direção do
cátodo. Se o SDS for empregado como tensoativo, a migração eletroforética da micela
aniônica é na direção do ânodo (Figura 9). Como resultado global, a velocidade de
migração da micela é menor que a velocidade de migração do solvente. Quando um
analito sem carga está no meio da fase móvel, sua velocidade de migração é igual ao do
EOF. Portanto, quando um analito tem uma grande afinidade com a micela, sua
velocidade de migração é inferior à do analito que se encontra no meio da fase móvel.
Examinando-se as Equações (14 e 15) que descrevem os fundamentos da MECC,
observe que k´ (fator de capacidade) e Rs (resolução) são formas simplificadas da
cromatografia líquida para uma concentração micelar tendendo ao infinito. A MECC é
um processo cromatográfico ou pseudo-cromatográfico.
−
−
=
m
R
R
t
t
t
tt
k
1
´
0
0
(14)
+
−
+
−
=
1
0
0
2
2
1
1
1
1
4
kt
t
t
t
k
k
N
R
mc
m
s
α
α
(15)
Agentes tensoativos catiônicos e aniônicos podem ser empregados em MECC.
Quando se usa o primeiro tipo, o EOF é invertido, portanto a polaridade do eletrodo
deve ser invertida para se detectar o analito.
42
1.1.11.3 Ordem de migração
Quando se empregam micelas de SDS, a ordem de migração deve ser: ânions,
espécies neutras e cátions. Os ânions levam mais tempo no meio da solução devido a
repulsão eletrostática da micela. Quanto maior for a carga iônica, mais rápida será a
eluição. As espécies neutras são separadas exclusivamente pelo caráter hidrofílico. Os
cátions são eluídos posteriormente devido a forte atração eletrostática através da
formação de pares iônicos com a micela. Apesar disto ser uma generalização útil, a forte
interação hidrofóbica pode superar as atrações e repulsões eletrostáticas. De forma
similar, a migração eletroforética do analito pode afetar a ordem de eluição. A
separação de espécies neutras é um exemplo de aplicações da técnica de MECC
(BAKER, 1995).
1.1.11.4 Uso de modificadores orgânicos.
Enquanto modificadores orgânicos foram usados livremente nas separações para
superar problemas de solubilidade, seu uso em MECC deve ser investigado com
profundidade, pois o modificador orgânico reduz EOF e aumenta a capacidade de
separação dos picos devido a maior diferença entre t
o
e t
mc
. O papel mais importante do
modificador é o impacto no coeficiente de partição de soluto entre a micela e o meio da
fase móvel. De forma clara, o modificador torna o meio da fase móvel favorável para
analitos hidrofóbicos. Sem o modificador, o soluto hidrofóbico elui em um tempo igual
ou próximo a t
mc
. A adição do modificador geralmente aumenta a velocidade de
migração de espécies hidrofóbicas, pois elas ficam mais tempo no meio da fase móvel.
Muitos modificadores orgânicos são úteis em MECC. Metanol e acetonitrila são os
modificadores mais empregados em concentrações de 5 – 25%. Metanol e outros
álcoois tendem a apresentar um EOF mais lento que a acetonitrila. Para certas
separações, solventes apróticos como tetrahidrofurano (THF), sulfóxido de dimetila
(DMSO) e dimetilformamida (DMF) podem ser úteis. O DMF é um bom solvente para
MECC, porque seu ponto de ebulição é alto, assim minimizando emissão de vapor do
solvente, um problema comum quando temperaturas elevadas são empregadas. A
porcentagem do modificador orgânico é limitada pelo efeito do solvente no número de
agregação e o número de ionização da micela (BAKER, 1995).
43
1.1.11.5 Aplicações da MECC
A Tabela 5 apresenta algumas aplicações da MECC e demonstra a enorme
capacidade desta técnica na resolução de problemas de separação e quantificação
envolvendo espécies neutras.
Tabela 5 – Aplicações da cromatografia eletrocinética micelar (MECC)
Analito Tampão Referência
Vitaminas Borato 50 mM, NaCl 20
mM e SDS 50 mM, pH =
9,1
Applied Biosystems Divison, Perkin-
Elmer, Application note CEPH14
Corticoesteróides Borato 100 mM, Sal de
bile (colato) 100 mM, pH =
8,45
WEINBERGER (1993)
Pesticidas Fosfato 12 mM, Borato 8
mM e SDS 100 mM, pH =
8,9
HEIGER,HEROLD, GRIMM.
(1994)
Hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos
(HPA)
Borato 100 mM, Uréia 20
mM, γ-Ciclodextrina 20
mM e SDS 100 mM, pH =
9
TERABE, MIYASHITA, ISHIHAM
A,
et al. (1993)
1.1.12 Seleção do tipo de eletroforese capilar
A Tabela 6 pode auxiliar na seleção do modo de eletroforese capilar como uma
etapa de partida no desenvolvimento de um método.
Tabela 6 – Seleção do modo de eletroforese capilar
Íons
pequenos
Moléculas
pequenas
Peptídeos Proteínas Oligonucleotídeos
DNA
CZE MEKC CZE CZE CGE CGE
CITP CZE MECC CGE MECC
CITP CIEF CIEF
CGE CITP
CITP
44
1.2 Métodos de determinação de ácido acetilsalicílico (AAS)
O ácido acetilsalicílico foi sintetizado pela primeira vez em 1893, a partir do
ácido salicílico, um analgésico extraído da casca do salgueiro, pelo químico alemão
Felix Hoffman que buscava um remédio alternativo para seu pai que sofria de
reumatismo (LUCAS, 2000).
Quando Hoffman iniciou suas pesquisas, já era conhecido que o princípio ativo
das folhas do salgueiro era a salicina, a qual ao entrar no corpo humano converte-se no
ácido salicílico. O problema em questão era a minimização dos efeitos colaterais
causados por este ácido, inicialmente usado para aliviar dores e edemas de doenças
como artrite. Um dos efeitos indesejáveis eram as dores estomacais, podendo inclusive
ocorrer sangramentos no trato digestivo (LUCAS, 2000).
Pensando nisso, Hoffman buscou uma maneira de contornar esse problema
utilizando uma substância capaz de inibir a ação do ácido salicílico e descobriu que o
grupo acetil anulava um sítio ácido, convertendo-o em ácido acetilsalicílico (AAS)
(LUCAS, 2000).
O ácido acetilsalicílico (AAS) pertence à classe das drogas anti-inflamatórias
não esteroidais. O AAS é uma droga valiosa no tratamento da dor, inflamação e febre.
Dentre os NSAIDs, o ácido acetilsalicílico é a droga mais largamente empregada, em
função do custo, ampla disponibilidade e por ser a mais indicada para dores de cabeça e
resfriados comuns (KARIM et all., 2006).
Os métodos de determinação do ácido acetilsalicílico (AAS) podem ser
classificados em: métodos óticos (RAMOS MARTOS et all., 2001; JOVICIC et all,
1995; STN et all., 1992); métodos cromatográficos (BLONDINO & BYRON,
1995; SHERMA et all., 1985; ALTUN et all., 2001; DI PIETRA et all., 1996; RAMOS
MARTOS et all., 2001) e métodos eletroforéticos (ALTRIA et all., 1998; MARDONES
et all., 2001).
1.3 Métodos de determinação do paracetamol (PAR)
Paracetamol (PAR) é uma amida aromática acilada, que inicialmente foi
introduzida na medicina como antipirético/analgésico em 1948. Ela tem sido usada
como analgésico na medicação caseira por mais de 30 anos, sendo aceita como uma
droga eficiente no tratamento das dores e febre em adultos e crianças. Ela é a segunda
droga mais usada como uma alternativa a aspirina e a fenacetina. PAR é conhecida
como acetaminofen (N-acetil-p-aminofenol, 4-acetamidofenol); ela é o princípio ativo
45
de inúmeros fármacos usados nas prescrições para gripes e resfriados, e como
analgésicos. Esta droga é excepcionalmente segura nas doses recomendadas, mas em
função de sua grande disponibilidade casos de doses excessivas, acidentais ou
deliberadas são comuns. PAR diferentemente da aspirina e do ibuprofeno não tem
propriedades anti-inflamatórias. Em doses normais, o PAR não irrita as paredes do
estômago, não afeta a coagulação do sangue ou ataca os rins (ESPINOSA BOSCH, M.
et al., 2006).
No entanto, estudos recentes mostram que o PAR está associado com a toxidez
hepática e falha renal apesar do seu caráter aparentemente inócuo. A toxidez hepática
inicia-se com níveis no plasma sangüíneo de 120 µg/L após 4 horas de ingestão,
levando-se a um dano agudo se o nível atingir 200 µg/L após o mesmo período de
ingestão. Em doses terapêuticas normais, o PAR é metabolisado muito rapidamente e
produz metabólitos inativos que são eliminados na urina. Se o PAR for administrado em
altas doses, ele produz uma acumulação de metabólitos tóxicos que causam a falência
hepática, este fato é freqüente na Europa e nos Estados Unidos da América (ESPINOSA
BOSCH, M. et al., 2006).
Diversos métodos têm sido utilizados na determinação de paracetamol quer seja
na forma pura, em formulação ou em combinação com outras substâncias. De acordo
com os trabalhos publicados na literatura podemos classificá-los em quatro principais
categorias: (1) métodos óticos (British Pharmacopoeia, 1998; European Pharmacopoeia,
1997; United States Pharmacopeia, 2000) (2) métodos eletroanalíticos (ALKAYER et
al. 1981; WALASH et all. 1994; NAVARRO et all. 1988; CRUZ VIEIRA et all. 2003;
LAU et all. 1989; CHRISTIE et all. 1993); (3) métodos cromatográficos (MAMOLO et
all. 1985; SISCO et all. 1986; RAVISANKAR et all. 1998; PATIL et all,. 1999); (4)
métodos eletroforéticos (STEINMANN & THORMANN, 1996; KUNKEL et all., 1997;
BOHNENSTENGEL et all. 1999; SCHEWITZ & LINDON, 1998; HEITMEIER &
BLASCHKE, 1999; ZHANG et all., 2000).
1.4 Métodos de determinação de ácidos orgânicos
Os ácidos orgânicos de cadeia curta pequena são metabólitos intermediários ou
finais de vários ciclos bioquímicos de organismos vivos, tais como o ciclo do ácido
cítrico, a fermentação dos polissacarídeos, a oxidação do etanol, assim como produtos
de certas indústrias e sua medida pode servir de subsídio de um indicador da extensão
de inúmeros processos e controle da qualidade. Em outras palavras, os ácidos orgânicos
46
de cadeia curta são intermediários ou produtos finais de processos metabólitos de
degradação de aminoácidos, de lipídeos e polissacarídeos (LEHOTAY, 1991). Diversas
doenças em seres humanos, especialmente aquelas relacionadas com as desordens
metabólicas podem levar à acumulação destes componentes nos fluidos corporais, os
quais incluem os esteróides, os polissacarídeos, os aminoácidos, as bases como purina e
pirimidinas, e ácidos orgânicos (PRESTO ELGSTOEN et all. 2001). Nas desordens
metabólicas, a identificação e quantificação deste metabólitos combinadas com a
informação clínica podem auxiliar no diagnóstico da doença. Os ácidos orgânicos têm
sido determinados em urina e no soro sangüíneo para o diagnóstico de um distúrbio no
metabolismo conhecido como acidúria orgânica. Doenças no sistema nervoso central e
outras patologias como neuroblastoma estão relacionadas com o aumento de ácidos
orgânicos nos fluídos corporais (GALLI et all. 2003).
Os métodos usuais para a determinação de ácidos orgânicos incluem a
cromatografia capilar em fase gasosa com ou sem a espectrometria de massas, após a
extração com solvente e derivatização. GC-MS tem sido usada como técnica de rotina
na determinação destes analitos em pacientes com desordens metabólitas. Apesar de sua
inquestionável sensibilidade, seletividade e capacidade de identificação, a GC-MS
apresenta duas grandes desvantagens: o longo tempo de preparação da amostra e a
necessidade de pessoal altamente especializado (SEYMOUR et all. 1997).
Outras técnicas de análise de rotina dos ácidos orgânicos de cadeia curta é a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os ácidos orgânicos têm sido
analisados por esta técnica sem derivatização ou com derivatização em fase reversa. A
cromatografia líquida de troca iônica com detector de condutividade é uma técnica
estabelecida para a determinação destes componentes em várias matrizes. No entanto,
em muitos casos torna-se necessário a preparação da amostra e certos ácidos
carboxílicos podem ser co-eluídos (GALLI et all. 2003).
Entretanto, existe uma diferença considerável entre as matrizes biológicas e as
de águas fortemente salinas em virtude do seu alto teor de salinidade e os níveis
díspares entre os íons cloreto, sódio, etc. e os componentes menores. Por exemplo, na
água do mar a concentração de cloreto é aproximadamente 0,5 mol/L, o que significa
que este teor é, no mínimo, mil vezes superior aos dos componentes menores
(TIMERBAEV & FUKUSHI, 2003). Portanto, o desenvolvimento de um método
analítico rápido e robusto para a quantificação de ácidos orgânicos de cadeia curta em
amostras fortemente salinas tornou-se uma tarefa de rara complexidade analítica.
47
1.5 Validação de métodos analíticos univariados
Os resultados analíticos dependem fundamentalmente de dois parâmetros: a
qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos
envolvidos no seu processamento. Para assegurar a aplicabilidade e o alcance de um
método estabelecem-se os limites destes parâmetros através da estimativa das figuras de
mérito, numa etapa denominada de validação.
As figuras de mérito representam os indicadores quantitativos do escopo e do
bom desempenho das técnicas, e são descritas na literatura como: seletividade, ajuste da
curva analítica e determinação da sua faixa de linearidade, sensibilidade do método,
representada pelos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão, exatidão e
robustez (ANVISA, 2003; ICH, 1995; ICH 1996; Danzer, K.; Currie, L. A., 1998;
INMETRO, 2003)..
A estimativa destes parâmetros pode variar de acordo com a técnica analítica
empregada, ou com o protocolo de validação a ser seguido. Com a finalidade de
padronizar estes procedimentos, a IUPAC (“International Union of Pure and Applied
Chemistry”) publicou no final da década de 90 um guia para calibração em Química
Analítica. Em 1990, as agências de regulamentação dos Estados Unidos (“Food and
Drug Agency”), Japão (“Ministry of Health, Labour and Welfare”) e União Européia
(“European Medicine Agency”) passaram a organizar a Conferência Internacional sobre
Harmonização (“International Conference on Harmonisation”), para estabelecer padrões
para os procedimentos de pesquisa e desenvolvimento na área de fármacos. Para isto, o
ICH elaborou um guia sobre validação de métodos que tem sido utilizado também em
outras áreas de estudo além da farmacêutica. Na área de Química Ambiental, os
métodos padrões para análise de contaminantes publicados pela Agência de Proteção
Ambiental Americana (“Environmental Protection Agency”) contêm orientações a
respeito da validação destes métodos. No Brasil, os dois órgãos que regulamentam a
validação de métodos analíticos são: a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Instrumental (INMETRO).
Validar um método é um procedimento lento, pois requer um grande número de
experimentos analíticos e cálculos estatísticos. Estabelecer um procedimento de
validação requer um compromisso entre validar rápido, e com um número adequado de
análises, sem perder a qualidade das estimativas, o que é um desafio na rotina de um
48
laboratório devido às restrições de tempo, custo e potencial instrumental (RIBEIRO et
all. 2008).
1.5.1 Linearidade: o ajuste da curva de calibração
A linearidade de um método expressa a faixa na qual o sinal analítico,
denominado variável dependente y
i
, é linearmente proporcional à sua concentração,
denominada variável independente x
i
, e a equação matemática que descreve esta
dependência é conhecida como curva analítica ou curva de calibração. O ajuste do
modelo é feito pelo método dos mínimos quadrados, no qual a melhor curva será aquela
que fornecerá o menor valor para a soma quadrática dos resíduos (Q) obtidos entre o
sinal analítico medido (y
i
) e o sinal analítico predito, para um conjunto de N pontos
experimentais (CUSTÓDIO et all., 1997; DRAPER & SMITH, 1981). O ajuste da curva
pelo método dos quadrados mínimos fornecerá os regressores, que no caso de um ajuste
linear (y
i
= a
0
+ a
1
x
i
) são os coeficientes linear ( xaya
10
−= ) e angular
(
(
)
(
)
[
]
(
)
∑
∑
−−−=
2
1
/ xxyyxxa
iii
), em que
x
é o valor médio (
∑
=
=
n
i
i
N
x
x
1
) da
concentração (x
i
) para o número total de amostras (N) utilizadas como padrões de
calibração.
A análise do gráfico dos resíduos permitirá detectar problemas no ajuste da
curva como, por exemplo, desvios da linearidade, presença de amostras atípicas,
heterocedasticidade e dependência entre os erros. Uma curva bem ajustada deverá
apresentar erros com distribuição uniforme, média zero e variância constante
(homocedasticidade), e ausência de amostras atípicas (DANKER & CURRIE, 1998;
PIMENTEL & BARROS NETO, 1996; MILLER, 1991).
1.5.1.1 A qualidade do ajuste da curva de calibração
O método mais empregado para se avaliar numericamente a qualidade do ajuste
de um modelo é a ANOVA (Análise da Variância). Inicialmente deve-se fazer uma
decomposição algébrica dos desvios das respostas observadas em relação à resposta
média global representado pela equação
(
)
(
)
(
)
iiii
yyyyyy
ˆˆˆ
−+−=−
(16)
onde a primeira parcela representa o desvio da precisão em relação à média global. A
segunda parcela é a diferença entre o valor observado e o valor predito. Elevando-se a
49
expressão ao quadrado e fazendo-se o somatório de todos os pontos obtém-se a soma
quadrática SQ
T
.
22
)]
ˆ
()
ˆ
[()(
iiii
yyyyyy −+−=−
∑∑
(17)
222
)
ˆ
()
ˆ
)(
ˆ
(2)
ˆ
()(
iiiiiii
yyyyyyyyyy −+−−+−=−
∑∑∑∑
(18)
Do lado direito temos as somas quadráticas da regressão e dos resíduos, pois o
somatório dos termos cruzados se anula, com isso pode-se escrever a seguinte equação:
222
)
ˆ
()
ˆ
()(
iiii
yyyyyy −+−=−
∑∑∑
(19)
A equação (19) pode ser reescrita de uma forma mais simples, como mostrado
abaixo:
SQ
Total
= SQ
Regressão
+ SQ
resíduos
(20)
A montagem da tabela da ANOVA é sumarizada a seguir:
Modelo Soma
Quadrática
Graus de
liberdade
Média
Quadrática
Teste F
Regressão SQ
Regressão
p - 1 MQ
Regressão
=
SQ
Reg.
/(p – 1)
F =
MQ
Reg
/MQ
res
Resíduos SQ
resíduos
n - p MQ
resíduos
=
SQ
resíduos
/(n –
p)
Total SQ
Total
n-1
onde n é o número de soluções padrão e p é o número de regressores ou de parâmetros
da curva de calibração. No caso de uma equação linear, o valor de p = 2 (coeficientes
linear e angular). A análise da variância (ANOVA) foi realizada para se testar a
significância da regressão utilizando o teste F e comparando-se o valor obtido com o
valor de F
crítico
.
1.5.2 Teste de linearidade
As fontes de variação são caracterizadas pela soma quadrática dos resíduos e o
melhor modelo de regressão será aquele que minimiza esta soma quadrática. O teste de
linearidade proposto é feito pela comparação dos resíduos do ajuste linear
50
( xaay
10
ˆ
+= ) e do ajuste quadrático (
2
210
ˆ
xaxaay ++= ) utilizando-se um teste F de
significância.
Esta comparação é feita estimando-se as somas quadráticas dos resíduos no sinal
analítico a partir dos desvios padrões obtidos em cada ajuste. Considerando-se que o
desvio padrão do modelo linear (S
y1
) e o desvio padrão do modelo quadrático (S
y2
) são
dados pelas equações abaixo:
( )
2
ˆ
2
1
−
−
=
∑
N
yy
S
ii
y
( )
3
ˆ
2
2
−
−
=
∑
N
yy
S
ii
y
A partir destes desvios estima-se a diferença entre as somas quadráticas dos dois
ajustes (∆S
2
), em que N é o número de padrões de calibração utilizados na construção da
curva e estima-se a significância desta diferença em relação à
2
2y
S
com o auxílio do
teste F:
(
)
(
)
2
2
2
1
2
32
yy
SNSNS −−−=∆
3,1
2
2
2
−
≤
∆
n
y
F
S
S
(21)
Portanto, se a razão
3,1
2
2
2
)(
−
≤∆
ny
FSS
, o ajuste linear é o mais adequado ou se
3,1
2
2
2
)(
−
>∆
ny
FSS
, considera-se que o ajuste quadrático é o mais apropriado (FUNK et
all., 1985).
1.5.3 Sensibilidade do método: o limite de detecção e o limite de quantificação
A sensibilidade de um método é definida pelos limites de detecção (LD) e de
quantificação (LQ). O limite de detecção é a menor concentração da espécie de interesse
que pode ser detectada pela técnica instrumental, enquanto que o limite de quantificação
é a mais baixa concentração do analito que pode ser quantificada dentro dos limites de
precisão e exatidão do método durante as operações de rotina do laboratório (ANVISA,
2003). Há três formas de estimar os limites de detecção e quantificação, e a escolha de
uma delas deve levar em consideração a técnica analítica utilizada e o grau de
confiabilidade estatística necessária: método visual, método da razão sinal-ruído, e
método baseado em parâmetros da curva analítica (ICH, 1996; DANKER & CURRIE,
1998).
1.5.3.1 Limite de detecção: método visual
Nesse método, realiza-se a análise de amostras contendo baixas concentrações
conhecidas da espécie de interesse. Considera-se o LD como sendo a menor
51
concentração que pode ser detectada e que seja diferente do sinal analítico do ruído
(ICH, 1996).
1.5.3.2 Limite de detecção: método da razão sinal-ruído
Este método pode ser aplicado em metodologias analíticas que apresentam ruído
da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma
amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma
amostra do branco. Considera-se aceitável uma relação sinal-ruído de 3:1 (ICH, 1995).
1.5.3.3 Limite de detecção: método baseado em parâmetros da curva analítica
Os métodos descritos anteriormente são muito utilizados pela sua rapidez, mas
apresentam como desvantagem o fato de se basearem em parâmetros qualitativos. O
método de estimativa do limite de detecção baseando-se em parâmetros da curva
analítica apresenta maior confiabilidade estatística, pois leva em consideração o
intervalo de confiança da regressão. O LD neste caso é definido como a concentração
mínima que pode ser medida e informada com 99% ou 95% de confiança (ICH, 1996;
BACCAN et all., 1998). No entanto, devido à complexidade dos cálculos envolvidos
nesta estimativa, este método tem sido menos utilizado que os anteriores.
A estimativa do sinal analítico a partir da equação de regressão apresenta um
erro padrão, e o produto deste erro pelo valor apropriado de t da distribuição de Student
permite calcular o intervalo de confiança da curva analítica que tem a forma de duas
curvas hiperbólicas ao redor da curva. O intercepto do limite superior do intervalo de
confiança é conhecido como y crítico (y
c
) e a sua projeção no limite inferior é uma
estimativa da concentração mínima que pode ser medida com um grau de confiança
comprovado estatisticamente, ou seja, o limite de detecção do método (LD). As
equações, abaixo relacionadas, descrevem o y
c
e o LD (ICH, 1996; DANKER &
CURRIE, 1998; FUNK et all., 1985).
( )
∑
=
−
++
+=
n
i
i
yc
xx
x
N
tsay
1
2
2
0
1
1
(22)
( )
( )
∑
=
−
−
++
=
n
i
i
c
y
xxa
yy
Na
ts
LD
1
2
2
1
2
1
1
1
2
(23)
52
1.5.4.1 Limite de quantificação: método visual
O LQ é determinado pela análise de amostra com concentrações conhecidas da
espécie de interesse, e corresponde à menor concentração que pode ser quantificada
dentro dos limites de exatidão e precisão do método (ANVISA, 2003; ICH, 1996).
1.5.4.2 Limite de quantificação: método da razão sinal-ruído
Este método pode ser aplicado em metodologias analíticas que apresentam ruído
da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma
amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma
amostra do branco e estabelecendo a concentração mínima em que a espécie de
interesse pode ser quantificada com confiabilidade. Considera-se aceitável uma relação
sinal-ruído de 10:1 (ICH, 1995; ICH, 1996).
1.5.4.3 Limite de quantificação: método baseado em parâmetros da curva analítica
O LQ é calculado a partir do intervalo de confiança da curva analítica e sua
estimativa pode ser obtida no ponto em que x
c
é o valor da concentração (x) no ponto
em que o valor de a
0
intercepta a reta de regressão, e y
h
é o valor de y para a projeção de
x
c
no limite de controle superior. As estimativas de y
h
, x
c
e LQ podem ser realizadas pela
utilização das equações abaixo.
( )
( )
∑
=
−
−
++
+=
n
i
i
c
yh
xx
xx
N
tsay
1
2
2
0
1
1
2
(24)
( )
∑
=
−
++
=
n
i
i
y
c
xx
x
Na
ts
x
1
2
2
1
1
1
(25)
( )
( )
∑
−
−
++
+
−
=
2
2
1
2
11
0
1
1
xxa
yy
Na
ts
a
ay
LQ
i
h
y
h
(26)
1.5.5 Precisão
A precisão fornece a dispersão dos valores medidos em torno de um valor médio
e seu valor numérico é estimado pelo desvio padrão relativo, DPR, para análises de
amostras contendo a mesma quantidade das espécies de interesse (ANVISA 2003; ICH
53
1995; ICH 1996). O DPR é ainda conhecido como coeficiente de variação (CV) e seu
cálculo é descrito pela equação abaixo:
( )
1
1
2
−
−
=
∑
=
N
xx
s
n
i
i
x
s
DPR
100
=
onde s é o desvio padrão,
x
é o valor médio e N é o número total de medidas.
A precisão pode ser estimada em três níveis: repetibilidade, precisão
intermediária e reprodutibilidade. O termo repetibilidade ou precisão intra-corridas
define a precisão dos resultados obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo
analista e com a mesma instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH
recomenda que sejam realizadas nove determinações contemplando toda a faixa de
calibração, ou seja, três concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata,
ou um mínimo de seis determinações em amostras contendo uma concentração
equivalente à média da faixa de calibração (ICH 1996). A resolução 899 da ANVISA
segue o guia ICH e determina que sejam realizadas nove determinações contemplando
toda a faixa de calibração (ANVISA 2003). O INMETRO recomenda que sejam
realizadas de sete a nove replicatas para o cálculo do DPR (INMETRO 2003).
Deve-se ressaltar que o termo utilizado em inglês é “repeatability”. No Brasil, o
INMETRO adota o termo repetitividade e a ANVISA adota o termo repetibilidade.
A precisão intermediária define a precisão dentro de um mesmo laboratório para
medidas obtidas por analistas diferentes, ou em dias diferentes, ou por equipamentos
diferentes. A ANVISA recomenda um mínimo de dois dias distintos com analistas
diferentes e o ICH incentiva o uso de técnicas de planejamento fatorial para este teste
(ICH 1995; ICH 1996).
A reprodutibilidade define a precisão dos resultados obtidos para uma
determinada análise realizada por laboratórios diferentes, mas seguindo a mesma
metodologia (ANVISA 2003, INMETRO 2003).
1.5.6 Exatidão
A exatidão reflete a proximidade entre o valor medido e o valor de referência
considerado verdadeiro. Este termo está relacionado com o erro absoluto da medida e
pode ser estimado de duas formas: aplicando-se a metodologia proposta em uma
substância de pureza conhecida, como por exemplo, padrões certificados; ou pela
comparação com os resultados obtidos utilizando-se uma segunda metodologia, que seja
54
bem estabelecida e com exatidão e precisão conhecidas. A “Environmental Protection
Agency” recomenda que a exatidão seja fornecida como a diferença entre o valor
predito e o valor considerado verdadeiro, enquanto que a ANVISA recomenda que este
parâmetro seja estimado como a razão destas duas concentrações.
100
x
x
xx
Exatidão
v
vi
−
=
100
x
x
x
Exatidão
v
i
=
O guia ICH recomenda que a exatidão deverá ser estabelecida ao longo de toda a
faixa de calibração especificada para o procedimento analítico somente após a precisão
e a linearidade terem sido estimadas (ICH 1996). A ANVISA estabelece que a exatidão
deve ser verificada em três níveis de concentração, alta, intermediária e baixa, e no
mínimo com determinação em triplicata (ANVISA 2003).
1.5.7 Robustez
A robustez de um método é a sua capacidade de resistir a pequenas mudanças
dos parâmetros analíticos sem alterar de forma significativa sua exatidão e precisão,
sendo portanto uma medida da quantidade de variabilidade que o método pode suportar,
sem perder a confiabilidade, e sua estimativa depende do tipo de metodologia analítica
utilizada (ANVISA 2003; ICH 1996).
A robustez de um método pode ser estimada, variando-se os parâmetros
analíticos e comparando a precisão obtida em cada determinação. A ANVISA e o ICH
indicam uma lista de parâmetros a serem avaliados nos testes de robustez de
metodologias analíticas para as técnicas de preparo de amostras, espectrofotometria,
cromatografia líquida e cromatografia gasosa (ANVISA 2003). O INMETRO indica o
teste de Youden (INMETRO 2003).
1.6 Validação de métodos eletroforéticos para análise de produtos farmacêuticos
A eletroforese capilar tornou-se uma das técnicas mais avançadas para a análise
farmacêutica. Ela tem demonstrado ser uma técnica útil e uma alternativa confiável
quando comparada com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em várias
áreas incluindo na determinação dos componentes principais, das impurezas e mesmo
na separação de enantiômeros. A determinação dos resíduos nos processos de validação
de limpeza e nos testes de dissolução dos comprimidos por eletroforese capilar são as
outras áreas de interesse da indústria farmacêutica (FABRE & ALTRIA, 2001).
55
O principal avanço da eletroforese capilar foi o reconhecimento pelas agências
reguladoras. Uma monografia sobre eletroforese capilar foi incluída na farmacopéia
americana (USP, 2000), sendo também publicada nas farmacopéias européia
(PHARMACOPÉE EUROPÉENNE, 2001) e japonesa (JP FORUM 1999). A
eletroforese capilar surgiu na farmacopéia européia com a determinação das impurezas
do cloridrato de levocabastina e uma monografia da aplicação da eletroforese capilar na
análise da solução concentrada de eritropoietina foi apresentada na Pharmeuropa
(1999).
Neste item, serão enfatizados os principais parâmetros de mérito da validação
analítica dos métodos de análise de moléculas pequenas por eletroforese capilar no
contexto da indústria farmacêutica. O principal guia para a validação de métodos em
química analítica é o Eurachem Guide(1998), que discute quando e porque os métodos
analíticos devem ser validados. No entanto, na indústria farmacêutica a principal fonte
de referência é o International Conference on Harmonization (ICH) Guidelines (1996),
que fornece as recomendações para as várias características a serem testadas nos
procedimentos analíticos desenvolvidos nos laboratórios farmacêuticos, a saber: teste de
identificação, testes quantitativos para o controle da quiralidade e impurezas não-
quirais, ensaio para o componente principal de uma droga, ou produto retirado de uma
solução obtida em um banho para dissolução (FABRE & ALTRIA, 2001).
Nesta revisão serão examinadas as características específicas a serem testadas
(especifidade, linearidade, exatidão, precisão, estabilidade da solução, limites de
detecção e quantificação e robustez) e outros aspectos específicos que devem ser
considerados para a metodologia por eletroforese capilar.
1.6.1 Especificidade
A especificidade é descrito como a capacidade de um método analítico de
discriminar o analito de outras substâncias potencialmente interferentes. Este parâmetro
confirma que o sinal analítico medido é causado somente pelo analito (FABRE &
ALTRIA, 2001).
Para um teste de identificação, a especificidade é geralmente obtida
comparando-se a resposta de amostras de referência contendo somente o analito com a
resposta de amostras enriquecidas com substâncias potencialmente interferentes. È
possível também comparar os resultados obtidos por CE com aqueles obtidos por outros
56
métodos/técnicas independentes, preferencialmente naqueles baseados nos princípios de
separação diferentes (FABRE & ALTRIA, 2001).
1.6.2 Linearidade e faixa da curva analítica
A linearidade da resposta como uma função da concentração do analito deve ser
assegurada na faixa de interesse da determinação analítica. Para um princípio ativo em
uma formulação, a linearidade deve ser assegurada na faixa de 50 – 150%, 80 – 120%
ou ainda 60 – 140% da concentração do analito em questão (BENNANI & FABRE,
2001).
Para uma impureza, a linearidade deve ser testada na presença do principal
componente até o máximo do nível de tolerância da impureza (por exemplo, do limite
de quantificação até 200% do nível de tolerância máximo da impureza). Para os testes
de dissolução, a faixa deve cobrir ± 20% da faixa especificada para a batelada. A
linearidade, os resíduos do modelo e o coeficiente linear devem ser avaliados pela
análise da variância (ANOVA). Um gráfico dos resíduos versus valores preditos ou
valores experimentais pode indicar alguma curvatura do modelo, assim como a
tendência dos dados (BLANCHIN, M. D. et all, 2000).
Tipicamente, a linearidade é assegurada pela injeção de um mesmo volume de
soluções padrão com concentrações diferentes (usualmente cinco concentrações). A
faixa linear dos detectores de UV-Vis é mais restrita do que daqueles usados em HPLC
em função da geometria circular do tubo capilar, o que aumenta a quantidade de
radiação eletromagnética espalhada, entretanto a faixa linear é ainda suficientemente
extensa para muitas aplicações (FABRE & ALTRIA, 2001).
A resposta em CE é usualmente expressa em área do pico ao invés da altura do
pico, pois este último é afetado pela distorção que ocorre em concentrações elevadas do
analito. Adicionalmente, a área do pico pode ser corrigida dividindo-a pelo seu tempo
de migração respectivo, o que pode minimizar qualquer deriva do tempo de migração
(FABRE & ALTRIA, 2001).
1.6.3 Exatidão e estudo de recuperação
A exatidão expressa a proximidade entre o valor encontrado e o valor aceito
como referência. A exatidão mede os erros sistemáticos e aleatórios do procedimento
analítico, entretanto ela depende do número de determinações (FABRE & ALTRIA,
2001).
57
É muito comum quando se analisa uma formulação avaliar a exatidão com um
estudo de recuperação. Esse estudo é realizado enriquecendo-se um placebo com uma
quantidade conhecida do analito na faixa de interesse. A exatidão é útil nas medidas de
perdas causadas por ligação do soluto com os excipientes da formulação e da
solubilidade em concentrações elevadas. Os resultados são comparados com as
concentrações adicionadas e a recuperação é calculada, sendo expressa na forma
percentual (FABRE & ALTRIA, 2001).
A faixa de enriquecimento do analito pode ser, por exemplo, de 80 – 120%, de
50 – 150% ou 60 – 140% da concentração alvo e do limite de quantificação até 150%
ou 200% do nível máximo tolerado da impureza. Recomenda-se fazer três
determinações independentes com níveis distintos do analito (BENNANI & FABRE,
2001; FABRE et all., 1999).
A exatidão pode ser feita pela comparação dos resultados de um mesmo
conjunto de amostras testadas pelo método em validação com um método considerado
como referência. Quando possível, métodos com diferentes princípios de separação
devem ser usados na determinação deste parâmetro (FABRE & ALTRIA, 2001).
1.6.4 Precisão
A precisão expressa o grau de espalhamento das medidas e pode ser expressa de
três modos: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade.
1.6.4.1 Repetibilidade
A repetibilidade refere-se à variabilidade das medidas quando o método é
realizado pelo mesmo analista, no mesmo equipamento durante um pequeno intervalo
de tempo. A repetibilidade de um sistema de eletroforese capilar deve ser assegurada em
um ou mais níveis de concentração do analito. Fatores importantes devem ser
considerados na otimização de um método analítico, mas o fato mais relevante consiste
no emprego do padrão interno para a redução da variabilidade. O desvio padrão relativo
do tempo de migração é inferior a 1% quando a composição do eletrólito e as etapas de
lavagens forem cuidadosamente otimizadas (FABRE & ALTRIA, 2001).
A repetibilidade do procedimento analítico deve ser realizada com
determinações independentes (n = 10) de amostras reais ou, no mínimo, com a
concentração alvo da determinação ou ainda em diferentes níveis do analito dependendo
do uso do método (BLANCHIN, M. D. et all, 2000).
58
1.6.4.2 Precisão intermediária
Esse parâmetro relaciona-se com a precisão quando um ou vários fatores são
mudados no método analítico dentro de um mesmo laboratório. Os fatores que podem
ser mudados incluem:
a) o tubo capilar: a separação pode ser repetida em tubos capilares de bateladas
diferentes e de fornecedores distintos em um mesmo dia;
b) o dia da medição: eletrólito recentemente preparado amostra
e soluções padrão
devem
ser avaliados nos diferentes dias de operação;
c) o analista: analistas diferentes devem preparar amostra e soluções padrão próprias e
devem ter seu tubo capilar e eletrólito de corrida.
d) as fontes dos reagentes (soluções padrão e eletrólito de corrida): é importante se
assegurar que o método desenvolvido possa ser transferido para outro equipamento
(transferência de calibração) (FABRE & ALTRIA, 2001).
Os fatores mudados devem ser analisados simultaneamente, isto é o estudo de
recuperação pode ser realizado em três dias diferentes por três analistas, onde cada um
prepara as soluções de forma independente. As variações entre os dias e os fornecedores
de consumíveis podem ser testadas juntas. A análise da variância (ANOVA) deve ser
usada para determinar se o fabricante ou a variabilidade entre os dias podem influenciar
no ensaio realizado (BENNANI & FABRE, 2001).
1.6.4.3 Reprodutibilidade
A reprodutibilidade refere-se à precisão inter-laboratorial e ocorre quando a
mesma amostra é analisada por diferentes laboratórios para fins de comparação, isto é
chamado de exercício inter-laboratorial. Ela é recomendada para os métodos oficiais
(FABRE & ALTRIA, 2001).
1.6.5 Estabilidade das soluções
Esse critério não está listado no ICH Guidelines (1996), mas ele é incluído nos
testes de robustez. É importante notificar no protocolo de operação (POP) o tempo de
vida útil da solução. É de grande interesse na eletroforese capilar testar a estabilidade da
solução do eletrólito, pois diferentemente da HPLC onde um grande volume de solução
da fase móvel é preparado diariamente, na CE ocorre um pequeno consumo de solução
do eletrólito, cerca de 10 – 20 mL/dia. Entretanto, o tempo de vida útil da solução do
59
eletrólito é muito variável, por exemplo, uma solução tampão de fosfato pode ser
armazenada em recipiente plástico por, no mínimo, três meses, enquanto que o eletrólito
de cromato e bromato de tetradeciltrimetilamônio usados na determinações de ânions
devem ser preparados diariamente (ALTRIA & BRYANT, 1997).
1.6.6 Robustez
A robustez está relacionada com a capacidade do método de permanecer
inalterado quando pequenas variações são introduzidas de forma deliberada nos
parâmetros de análise. A robustez não está listada no ICH Guidelines (1996) como um
critério de validação analítica, no entanto é mencionado que ele deve ser testado no
desenvolvimento de um método analítico para demonstrar a confiabilidade/durabilidade
do método. A robustez testada na eletroforese capilar é feita de forma a detectar os
fatores que podem influenciar o ensaio, a sensibilidade ou a seletividade.
Os fatores mais importantes que devem ser investigados na eletroforese capilar
com detecção UV/Vis são: a composição do eletrólito, o volume injetado, o
comprimento de onda de detecção, a temperatura de separação, o tempo de lavagem,
etc. Esses fatores são estudados próximos aos valores otimizados para o método e
devem refletir as modificações em diferentes ambientes. O planejamento fatorial
fracionário ou o planejamento Plackett-Burmann podem ser usados na identificação dos
fatores mais críticos do método (FABRE & MESPLET, 2000).
1.6.7 Limites de detecção e quantificação
O limite de detecção (LD) corresponde a mais baixa concentração ou quantidade
do analito que pode ser detectada pelo método. O limite de quantificação (LQ)
corresponde a mais baixa concentração ou quantidade do analito que pode ser
determinada com exatidão e precisão adequadas (ALTRIA et all. 1998).
Existem duas abordagens para se avaliar LD e LQ. A mais largamente
empregada é baseada na razão sinal/ruído (S/N) obtida da amostra enriquecida com o
analito. Uma razão (S/N) igual a três é considerada, do ponto de vista estatístico,
aceitável para o LD. O LQ pode ser avaliado através de injeções sucessivas de uma
solução padrão no nível baixo de concentração (aquela que forneça uma razão S/N igual
a 10 pode ser útil). Baseando-se no desvio padrão relativo, o LQ é validado por análise
de réplicas autênticas (n ≥ 6) de amostras preparadas próximas a esta concentração. Um
60
erro relativo de ± 10% e uma repetibilidade próxima a 10% são aceitáveis para
concentrações próximas do LQ (FABRE & ALTRIA, 2001).
Na eletroforese capilar com detector UV/Vis, os LD e LQ são geralmente
superiores (em concentração) do que em HPLC em função do pequeno percurso ótico
(50 – 100 µm) usado na detecção e do reduzido volume injetado (2 – 20 nL). No
entanto, vários fatores podem ser otimizados para melhorar os limites de detecção e
quantificação:
a) o solvente da amostra: o uso de um solvente com baixa condutividade em relação ao
eletrólito produz um efeito de empacotamento e aumenta o sinal analítico;
b) o percurso ótico: o aumento do percurso ótico produz uma célula de alta
sensibilidade;
c) o diâmetro do capilar: aumentando-se o diâmetro do capilar resulta no aumento do
percurso ótico e do volume de amostra injetado provoca um incremento da intensidade
de corrente e do efeito Joule, o que causa um alargamento indesejável da banda
eletroforética;
d) o volume de injeção: aumentando-se o volume injetado de amostra resulta no
aumento do sinal analítico, mas pode haver um efeito deletério na resolução;
e) o comprimento de onda de detecção: a detecção em baixo comprimento de onda (λ ≤
200 nm) é muito comum em eletroforese capilar em virtude da transparência do
eletrólito, o que pode ser usada para melhorar o LD.
61
2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
2.1 Instrumentação
Os experimentos foram realizados em um sistema de eletroforese capilar,
modelo Capel 105M, Lumex, Rússia com detector UV/Vis. Foram utilizados dois
cassetes contendo tubos capilares de sílica fundida com as seguintes dimensões: o
primeiro com 50 µm de
diâmetro interno, 50 cm de de comprimento total e
40
cm de
comprimento efetivo, e o segundo com 75 µm de diâmetro interno, 60 cm de
comprimento total e 50 cm de comprimento efetivo. O instrumento é totalmente
controlado por um micro computador tipo IBM e opera com um software Elforun
desenvolvido pelo fabricante.
Antes de cada determinação, todas as soluções foram centrifugadas em tubos
Eppendorf, de 1,5 a 2 mL de capacidade, a 6000 rpm (Centrífuga MCD 2000, HT,
China) durante três minutos. Esse procedimento é necessário para evitar a formação de
microbolhas ou entupimento do tubo capilar, o que pode acarretar resultados erráticos
nas determinações.
Os valores dos pHs das soluções foram obtidos no medidor de pH, modelo 300,
Analyser, Brasil após calibração prévia do instrumento com soluções tamponadas em
pH = 4,0 e pH = 7,0. Esse acompanhamento é de extrema importância em virtude da
influência do pH da solução tampão na resposta da determinação eletroforética.
2.2 Soluções, reagentes e materiais
A pesagem dos sólidos foram realizadas em balança analítica elétrica, Bioprecisa
modelo FA2104 N, Itália, e a água (18 MΩ x cm) utilizada na preparação das soluções
foi destilada e purificada em um sistema de troca iônica e osmose reversa
(Ultrapurificador, modelo Master System, Gehaka, Brasil). Toda a vidraria e utensílios
laboratoriais foram imersos em solução de Extran neutro (Merck, Darmsdadt,
Alemanha) por, no mínimo, 24 horas, seguido da imersão em solução de HNO
3
10% v/v
por igual período. Em seguida, todo o material foi lavado com água destilada e
deionizada, em abundância, seguido de secagem em estufa elétrica (Icamo, modelo 4
São Paulo, Brasil) a 60
0
C.
Na preparação das soluções, quando necessário, utilizou-se uma placa de
aquecimento (Quimis Aparelhos Científicos, Brasil) e um aparelho de ultra-som
(Ultrasonic Cleaner, modelo Branson 200, Taiwan) na dissolução dos sólidos.
62
Todas as soluções foram filtradas com membrana de acetato de celulose (Toyo
Roshi Kaisha, Japão) com diâmetro de poro 0,2 µm e diâmetro externo de 25 mm.
2.2.1 Solução estoque de ácido acetilsalicílico 1000 mg/L
Pesou-se 100,0 mg do sólido acetilsalicílico (Merck, Darmstadt, Alemanha),
dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico.
2.2.2 Solução estoque de paracetamol 1000 mg/L
Pesou-se 100,0 mg do sólido paracetamol (Merck, Darmstadt, Alemanha),
dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico.
2.2.3 Solução estoque de ácido benzóico 500 mg/L
Pesou-se 50,0 mg do sólido benzóico (Merck, Darmstadt, Alemanha), dissolveu-
se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico. Esta solução foi usada
como padrão interno na determinação dos fármacos.
2.2.4 Solução tampão de borato 25 mmol/L (pH = 9,20)
Pesou-se 95,3 mg do tetraborato de sódio decahidratado (Vetec Química Fina
Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 10 mL em balão
volumétrico. Adicionou-se solução de HCl 0,1 mol/L ou NaOH 0,1 mol/L para ajuste
do pH quando necessário. Esta solução foi preparada diariamente.
2.2.5 Solução tampão de borato 50 mmol/L (pH = 9,20)
Pesou-se 190,6 mg do tetraborato de sódio decahidratado (Vetec Química Fina
Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 10 mL em balão
volumétrico. Adicionou-se solução de HCl 0,1 mol/L ou NaOH 0,1 mol/L para ajuste
do pH quando necessário. Esta solução foi preparada diariamente.
2.2.6 Solução estoque de aspirina 5000 mg/L
Foram triturados quatro comprimidos de aspirina (AAS 500 mg, Bayer, Brasil) e
retirados uma massa equivalente a um comprimido para a preparação da solução
estoque. Dissolveu-se em água em seguida foram filtradas e avolumadas para 100 mL
em balão volumétrico. A trituração dos comprimidos foi realizada para homogeneizar o
processo de amostragem.
63
2.2.7 Solução estoque de paracetamol 7500 mg/L
Foram triturados quatro comprimidos de paracetamol (Tylenol 750 mg, Janssen-
Cilag Pharmaceutica, Brasil) e retirada a massa equivalente a um comprimido para a
preparação da solução estoque. Dissolveu-se em água e em seguida foram filtradas e
avolumadas para100 mL em balão volumétrico. Mais uma vez, a trituração dos
comprimidos foi realizada para homogeneizar o processo de amostragem.
2.2.8 Solução estoque de ácido fórmico 1000 mg/L
Pesou-se 102,0 mg da solução de ácido fórmico 98%m/v (Vetec Química Fina
Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em
balão volumétrico.
2.2.9 Solução estoque de ácido acético 1000 mg/L
Pesou-se 100,3 mg da solução de ácido acético 99,7%m/v (Vetec Química Fina
Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em
balão volumétrico.
2.2.10 Solução estoque de ácido propiônico 1000 mg/L
Pesou-se 100,5 mg da solução de ácido propiônico 99,5%m/v (Vetec Química
Fina Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em
balão volumétrico.
2.2.11 Solução tampão pH = 5,3
Foram misturados 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de
solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM,
0,1 mL de solução de
ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9
mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L. Na preparação da solução de DEA,
recomenda-se que o reagente seja mantido sob refrigeração.
2.3 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por CZE
O condicionamento do tubo capilar foi realizado, no início de cada semana, e
consistiu incialmente de sua percolação com uma solução de NaOH
1 mol/L durante 10
minutos, seguido da imersão das extremidades do tubo capilar na solução por 30
64
minutos. Uma segunda etapa de lavagem do tubo capilar era realizada, percolando o
tubo com uma solução de NaOH 0,1 mol/L, seguido da imersão das extremidades do
tubo capilar por 60 minutos. Finalmente, deixava-se o tubo capilar ser percolado por
água purificada por 20 minutos.
Após cada determinação, foram realizadas três operações de lavagens: a primeira
com solução de NaOH 0,1 mol/L por 2 minutos; a segunda com água purificada por 1
minuto e, finalmente a última com a solução do tampão usada no método por 2 minutos.
2.4 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por MEKC
O procedimento do condicionamento do tubo capilar é semelhante àquele usado
na CZE, porém a lavagem com a solução de NaOH 1 mol/L é realizada somente uma
vez, pois a repetição desse procedimento influencia de forma significativa a superfície
do tubo capilar, podendo alterar o fluxo eletroosmótico.
Para ambas as técnicas, ao término das determinações realizadas durante o dia
realizava-se o procedimento recomendado no protocolo do fabricante (Lumex, Rússia):
deixava-se percolar uma solução de NaOH 0,1 mol/L através do tubo capilar, seguido
de água purificada por 5 minutos.
Para se evitar entupimento é recomendado manter as extremidades do tubo
capilar imerso em água.
2.5 Curvas de calibração dos fármacos para a determinação por CZE
Foram feitas diluições adequadas das soluções estoque de ácido acetilsalicílico e
paracetamol para a preparação das seguintes misturas descritas na Tabela 7:
Tabela 7 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos fármacos
Misturas AAS (mg/L) PAR (mg/L) HBz (mg/L)
A 50 25 100
B 100 50 100
C 200 100 100
D 300 200 100
E 500 300 100
65
As condições operacionais para a obtenção dos eletroferogramas estão descritas
a seguir. Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2; potencial
aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo
capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm), diâmetro interno do
tubo capilar = 50 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura =
20
0
C.
2.6 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos para a determinação por MEKC
Foram feitas diluições adequadas das soluções estoque dos ácidos fórmico,
acético e propiônico para a preparação das seguintes misturas descritas na Tabela 8:
Tabela 8 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos ácidos orgânicos
Ácido fórmico (mg/L) Ácido acético (mg/L) Ácido propiônico (mg/L)
10 10 10
20 20 20
50 50 50
80 80 80
100 100 100
As condições operacionais para a obtenção dos eletroferogramas estão descritas a
seguir. Eletrólito de corrida: solução tampão constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 5,3; potencial aplicado = - 20 kV, injeção hidrodinâmica = 150 mbar x s;
comprimento total do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40
cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50 µm; comprimento de onda de detecção = 229
nm e temperatura = 20
0
C.
66
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Estudo univariado do método de determinação de AAS e PAR por CZE
3.1.1 Efeito do pH da solução tampão
O pH da solução tampão tem um efeito significante no fluxo eletroosmótico
porque ele muda o potencial zeta. Quando o pH aumenta, ocorre um incremento no
fluxo eletroosmótico, porque aumenta a dissociação do grupo Si-OH na parede interna
do tubo capilar. O potencial zeta é proporcional à carga na superfície da parede do tubo
capilar e isto provoca um aumento na velocidade eletroosmótica. O pH da solução
tampão influencia também o grau de ionização dos solutos e, portanto as suas
mobilidades eletroosmóticas. Em geral, a solução tampão escolhida é aquela que
fornece a melhor separação e não necessariamente uma velocidade eletroosmótica ótima
(BAKER, 1995). As figuras 10 - 12 mostram os eletroferogramas da mistura dos
fármacos no intervalo de pH de 8,0 a 10,4.
Figura 10 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 8,0
Figura 11 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2
67
Figura 12 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 10,4
Legenda das Figuras 10, 11 e 12 – Eletroferogramas da mistura de paracetamol 50
mg/L, ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno).
Potencial aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total
do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm), diâmetro
interno do tubo capilar = 50 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e
temperatura = 20
0
C.
Como esperado, não houve uma diferença significativa nos tempos de migração
dos analitos em virtude do pH das soluções tamponadas (eletrólito de corrida) estar
contido no intervalo de mais ou menos uma unidade de pH do pK
a
da solução tampão, o
que garante uma eficiência elevada do índice tamponante (β = dC/dpH). Por
conveniência, manteve-se o pH da solução tampão igual a 9,2 (pK
a
ácido bórico = 9,2).
3.1.2 Efeito da concentração do eletrólito suporte
Quando a temperatura é mantida sob controle, o aumento da concentração da
solução tampão ou da força iônica irá diminuir o fluxo eletroosmótico, porque ocorre
uma redução no potencial zeta. Enquanto o uso de uma solução tampão diluída reduz o
tempo de análise, uma concentração excessivamente baixa deve ser evitada porque ela
causa a forma de picos assimétricos e largos. Como uma regra geral, a concentração da
solução tampão (eletrólito de corrida) deve ser, no mínimo, cem vezes superior à do
analito. Uma faixa típica de concentração da solução tampão é de 10 – 100 mmol/L
(BAKER, 1995). As figuras 13 e 14 mostram o efeito da concentração do eletrólito
suporte nos eletroferogramas dos fármacos.
68
Figura 13 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2
Figura 14 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 50 mmol/L, pH = 9,2
Legenda das Figuras 13 e 14 – Eletroferograma da mistura de paracetamol 50 mg/L,
ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno). Potencial
aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo
capilar = 60 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 50 cm), diâmetro interno do
tubo capilar = 75 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura =
20
0
C.
Nesta etapa dos experimentos, o sistema eletroforético usado deixou-se
reconhecer o cassete anterior e para não interromper o trabalho, optamos por usar o
cassete com tubo capilar maior. Avaliando-se os eletroferogramas obtidos (Figuras 13 e
14), observa-se claramente o aparecimento de picos fantasmas, a que atribuímos a uma
possível contaminação da solução tampão. Deste modo, escolheu-se a concentração da
solução tampão borato 25 mmol/L para a continuação dos experimentos.
69
3.1.3 Efeito do potencial aplicado
Como o campo elétrico (E) é dado pela razão potencial/comprimento do tubo
capilar, uma mudança no potencial aplicado é uma maneira fácil de modificar o fluxo
eletroosmótico. Portanto, um aumento no potencial aplicado produz um incremento no
fluxo eletroosmótico e uma redução no tempo de migração e, consequentemente no
tempo de análise. No entanto, o emprego de potencial aplicado muito elevado provoca
aumento na intensidade de corrente e no aquecimento pelo efeito Joule. Caso o
instrumento usado não possua um sistema de dissipação de calor eficiente, a
temperatura dentro do tubo capilar aumenta causando um decréscimo na viscosidade da
solução tampão, o que provoca um alargamento dos picos e tempos de migração
erráticos (BAKER, 1995). As figuras 15 a 17 mostram o efeito do potencial aplicado
nos eletroferogramas dos fármacos.
Figura 15 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2,
potencial aplicado = 15 kV
Figura 16 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2,
potencial aplicado = 20 kV
70
Figura 17 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2,
potencial aplicado = 25 kV
Legenda das figuras 15, 16 e 17 – Eletroferograma da mistura de paracetamol 50 mg/L,
ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno). Injeção
hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo capilar = 60 cm
(comprimento efetivo do tubo capilar = 50 cm), diâmetro interno do tubo capilar = 75
µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura = 20
0
C.
Como discutido anteriormente, o potencial aplicado de 25 kV reduziu de
maneira significativa o tempo de análise sem provocar os efeitos deletérios de distorção
dos picos. Portanto, este foi o potencial aplicado escolhido para a otimização dos
experimentos.
3.1.4 Robustez
Foram feitas várias mudanças nos parâmetros otimizados para se avaliar a
robustez da metodologia desenvolvida, porém estas modificações se mostraram críticas
alterando de forma significativa a eficiência da separação eletroforética, a precisão e
exatidão dos resultados. Portanto, recomenda-se aplicar exatamente os valores
encontrados nesta otimização univariada para a determinação dos fármacos em questão.
3.1.5 Curvas de calibração
De cada solução mistura foram obtidos cinco eletroferogramas para a construção
da curva de calibração dos analitos e posterior análise estatística.
71
As Tabelas 9 - 12 mostram de forma resumida os parâmetros, a análise
estatística e análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS e PAR por
CZE. As figuras 18 e 19 mostram as curvas de calibração para os dois analitos.
Tabela 9 - Parâmetros da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.
AAS PAR Variável
dependente
Parâmetro
Valor Erro padrão Valor Erro padrão
Coef. linear - 0,109 2,534 16,98 4,64 Área do
pico
Coef. angular 0,379 0,008 1,366 0,028
Tabela 10 – Análise estatística da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.
AAS PAR
Número de pontos 20 24
Graus de liberdade 18 22
Soma quadrática dos resíduos 832,2 4302,8
Coeficiente de determinação ajustado
0,99045 0,99065
Tabela 11 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS
Graus de
liberdade
Soma
quadrática
Média
quadrática
Teste F p-Valor
Modelo 1 91195,7
91195,7
1972,5 0
Erro 18 832,2
46,2
Total 19 92027,9
Tabela 12 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do PAR
Graus de
liberdade
Soma
quadrática
Média
quadrática
Teste F p-Valor
Modelo 1 477044,7
477044,7
2439,1 0
Erro 22 4302,8
195,6
Total 23 481347,5
72
0 100 200 300 400 500 600
0
50
100
150
200
Área do pico (u. a.)
AAS (mg/L)
Figura 18 – Curva de calibração do AAS por eletroforese capilar por zona.
0 100 200 300 400
0
100
200
300
400
500
Área do pico (u. a.)
PAR (mg/L)
Figura 19 – Curva de calibração do PAR por eletroforese capilar por zona.
3.1.6 Precisão
A repetibilidade ou precisão intra-corridas definem a precisão dos resultados
obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo analista e com a mesma
instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH recomenda que sejam realizadas
)64,498,16()028,0366,1(
ˆ
±+±=
PAR
Cy
AAS
Cy )008,0379,0(
ˆ
±=
73
nove determinações contemplando toda a faixa de calibração, ou seja, três
concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata, ou um mínimo de seis
determinações em amostras contendo uma concentração equivalente à média da faixa de
calibração (ICH 1996). Neste experimento, foram realizadas cinco replicatas de cada
solução abrangendo toda a faixa de calibração do analito, inclusive com medida de
concentração de solução padrão abaixo do limite de detecção, o que pode explicar
porque a solução de AAS tenha apresentado um desvio padrão relativo, DPR (%) bem
superior aos demais.
Tabela 13 – Estudo da precisão intra-corridas do método desenvolvido para determinar
AAS e PAR por CZE.
AAS (mg/L) DPR (%) PAR (mg/L) DPR (%)
50 8,0 25 1,4
100 1,6 50 1,7
200 1,5 100 1,5
300 1,5 200 0,8
500 0,9 300 0,4
3.1.7 Limites de detecção e quantificação
O LD neste caso é definido como a concentração mínima que pode ser medida e
informada com 95% de confiança (ICH, 1996; BACCAN et all., 1998). O limite de
quantificação é a mais baixa concentração do analito que pode ser quantificada dentro
dos limites de precisão e exatidão do método durante as operações de rotina do
laboratório (ANVISA, 2003). O método de estimativa dos limites de detecção e
quantificação utilizado foi baseado nos parâmetros da curva analítica, pois este
apresenta maior confiabilidade estatística e leva em consideração o intervalo de
confiança da regressão. Os valores obtidos dos limites de detecção e quantificação
foram 79 e 118 mg/L para o ácido acetilsalicílico e 36 e 53 mg/L para o paracetamol,
respectivamente, com um nível de confiança de 95%.
3.1.8 Calibração pelo método do padrão interno
Utilizou-se uma solução de ácido benzóico 100 mg/L como padrão interno. A
escolha desta substância deve-se ao fato de que a mesma não se encontra presente nas
74
formulações farmacêuticas disponíveis no mercado. No entanto, os resultados
encontrados para esta metodologia foram sempre inferiores aos da curva analítica para
os dois analitos. Portanto, desaconselha-se o emprego do padrão interno para esta
determinação.
Método de determinação de AAS e PAR por CZE
Eletrólito de corrida
Solução tampão de borato 25 mmol/L,
pH = 9,2
Potencial aplicado 25 Kv
Injeção hidrodinâmica 250 mbar x s
Tubos capilar
•
comprimento total
•
comprimento efetivo
•
diâmetro interno
•
50 cm
•
40 cm
•
50 µm
Comprimento de onde (detecção direta) 226 nm
Temperatura 20ºC
Figuras analíticas de mérito
AAS PAR
Faixa de calibração (mg/L) 100-500 50-300
LD (mg/L) 79 36
LQ (mg/L) 118 53
Coeficiente linear -0,109 ± 2,534 16,98 ± 4,64
Coeficiente angular 0,379 ± 0,008 1,366 ± 0,028
Coeficiente de determinação
ajustado
0,99045 0,99065
Precisão intra-corridas ≤ 1,6 % ≤ 1,7 %
3.2 Estudo univariado do método de determinação de ácidos orgânicos por MEKC
3.2.1 Efeito do pH da solução tampão
A composição, o pH e a concentração da solução tampão são fatores importantes
na separação eletroforética. A escolha do eletrólito de corrida é dependente do tipo de
eletroforese capilar. No MEKC, um agente tensoativo é adicionado a solução tampão
em uma concentração superior à da concentração micelar crítica (CMC). O agente
tensoativo forma micelas no eletrólito de corrida e o soluto se distribui entre a fase
aquosa do tampão e as micelas. O grau de partição é dependente da hidrofobicidade do
soluto. Quando se analisa uma amostra com moléculas neutras, o pH da solução tampão
75
tem pouca influência na separação eletroforética por MEKC. A separação ocorre devido
à diferença de hidrofobicidade dos solutos e, para espécies neutras ela independe do pH.
As micelas migram no tubo capilar sob a influência da sua mobilidade eletroforética,
enquanto que o pH do eletrólito de corrida deve ser controlado para permitir a ionização
das micelas (BAKER, 1995).
No MEKC, os solutos iônicos ou ionizáveis migram no tubo capilar devido à sua
mobilidade eletroforética tal como na eletroforese capilar por zona. Para solutos
ionizados, o pH da solução tampão associado com a micela afeta a retenção e a
seletividade porque ele muda o grau de ionização e, consequentemente a
hidrofobicidade do soluto (BAKER, 1995).
As figuras 20-22 mostram o efeito do pH da solução tampão nos
eletroferogramas dos ácidos orgânicos.
Figura 20 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 4,8
76
Figura 21 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 5,3
Figura 22 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 5,8
Legenda das figuras 20, 21 e 22 – Eletroferograma da mistura de ácido fórmico 50 mg/L
ácido acético 50 mg/L e ácido propiônico 50 mg/L. Potencial aplicado = - 20 kV,
injeção hidrodinâmica = 150 mbar x s; comprimento total do tubo capilar = 50 cm
(comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50
µm; comprimento de onda de detecção = 229 nm e temperatura = 20
0
C.
77
Foi observado que é possível a determinação dos ácidos orgânicos no intervalo
de pH entre 4,8 e 5,8. No entanto, quando se utilizou o eletrólito de corrida com pH
igual a 5,3 o tempo de análise foi inferior a 4 minutos. Consequentemente, este valor de
pH foi mantido nos estudos posteriores.
3.2.2 Efeito do potencial aplicado
Quando se utiliza um potencial aplicado elevado, a separação é mais eficiente e
reduz-se o tempo de análise. No entanto, ocorre um aumento no aquecimento Joule em
função do calor gerado no tubo capilar, o que provoca efeitos danosos na separação e
pode causar um alargamento dos picos. Existe ainda a possibilidade da decomposição
da amostra, da formação de bolhas no tubo capilar que resulta na descontinuidade
elétrica causando a interrupção da análise, pois o instrumento se desliga. Caso o
instrumento tenha um bom sistema de refrigeração, pode-se optar por trabalhar com
potenciais elevados (BAKER, 1995).
As figuras 23 e 24 mostram o efeito do potencial aplicado nos eletroferogramas
dos ácidos orgânicos por MEKC.
Figura 23 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 5,3.Potencial aplicado = -15 kV
78
Figura 24 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido
benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)
0,5 mM,
0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,
3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH
= 5,3.Potencial aplicado = -20 kV
Legenda das figuras 23 e 24 – Eletroferograma da mistura de ácido fórmico 50 mg/L,
ácido acético 50 mg/L e ácido propiônico 50 mg/L. Injeção hidrodinâmica = 150 mbar x
s; comprimento total do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40
cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50 µm; comprimento de onda de detecção = 229
nm e temperatura = 20
0
C.
Quando se utilizou um potencial de – 20 kV, a corrida eletroforética se realizou
em menos de 4 minutos, porém o sistema eletroforético não permitiu a análise com
potencial de – 25 kV. Portanto, utilizou-se doravante um potencial aplicado de – 20 kV.
3.2.3 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos
De cada solução mistura foram obtidos três eletroferogramas para a construção
da curva de calibração dos analitos e posterior análise estatística.
As Tabelas 14 - 18 mostram de forma resumida os parâmetros, a análise
estatística e análise da variância dos dados da curva de calibração dos ácidos orgânicos
por MEKC. As figuras 25-27 mostram as curvas de calibração para os analitos.
79
Tabela 14 - Parâmetros da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE.
Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico Parâmetro
Valor Erro
padrão
Valor Erro
padrão
Valor Erro
padrão
Coef.
Linear
- 0,214 0,900 1,869 0,435 0,616 0,591
Coef.
Angular
0,710 0,019 0,849 0,009 0,920 0,012
Tabela 15 - Análise estatística da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE.
Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico
Número de pontos 12 12 11
Graus de liberdade 10 10 9
Soma quadrática
dos resíduos
31,003 7,251 11,98
Coeficiente de
determinação
ajustado
0,9925 0,9988 0,9982
Tabela 16 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido fórmico
Graus de
liberdade
Soma
quadrática
Média
quadrática
Teste F p-Valor
Modelo 1 4536,7
4536,7
1463,3 3,6 x 10
-12
Erro 10 31,0
3,10
Total 11 4767,7
Tabela 17 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido acético
Graus de
liberdade
Soma
quadrática
Média
quadrática
Teste F p-Valor
Modelo 1 6479,7
6479,7
8936,4 4,4 x 10
-16
Erro 10 7,3
0,73
Total 11 6487,0
80
Tabela 18 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido propiônico
Graus de
liberdade
Soma
quadrática
Média
quadrática
Teste F p-Valor
Modelo 1 7532,3
7532,3
5658,8 6,6 x 10
-14
Erro 9 12,0
1,3
Total 10 7544,3
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
Área do pico (u. a.)
Ácido fórmico (mg/L)
Figura 25 – Curva de calibração do ácido fórmico por eletroforese capilar por MECK.
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
Área do pico (u.a.)
Ácido acético (mg/L)
Figura 26 – Curva de calibração do ácido acético por eletroforese capilar por MECK.
fórmicoác
Cy
.
)019,0710,0(
ˆ
±=
acéticoác
Cy
.
)435,0869,1()009,0849,0(
ˆ
±+±=
81
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
Área do pico (u. a.)
Ácido propiônico (mg/L)
Figura 27 – Curva de calibração do ácido propiônico por eletroforese capilar por
MEKC.
3.2.4 Precisão
A repetibilidade ou precisão intra-corridas define a precisão dos resultados
obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo analista e com a mesma
instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH recomenda que sejam realizadas
nove determinações contemplando toda a faixa de calibração, ou seja, três
concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata (ICH 1996). Neste
experimento, foram realizadas três replicatas de cada solução abrangendo toda a faixa
de calibração do analito, inclusive com medidas abaixo do limite de detecção para os
ácidos fórmico e propiônico, o que pode justificar um desvio padrão relativo superior
nesta região de concentração.
propiônicoác
Cy
.
)591,0616,0()012,0920,0(
ˆ
±+±=
82
Tabela 19 – Resultados da medida da precisão
DPR (%) C (mg/L)
Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico
10 3,4 2,8 1,8
20 2,6 2,2 2,7
50 2,3 2,2 1,7
80 0,9 0,8 0,9
100 1,1 1,3 1,9
3.2.5 Limites de detecção e quantificação
Mais uma vez, foi usado o método de estimativa dos limites de detecção e
quantificação que se baseia nos parâmetros da curva analítica, pois este apresenta maior
confiabilidade estatística e leva em consideração o intervalo de confiança da regressão.
Os valores obtidos dos limites de detecção e quantificação foram 12,2 e 17,9 mg/L para
o ácido fórmico, 5,0 e 7,3 mg/L para o ácido acético e 19,2 e 28,4 mg/L para o ácido
propiônico, respectivamente, com um nível de confiança de 95%.
Método de determinação dos ácidos fórmico, acético e propiônico por MEKC
Eletrólito de corrida Solução tampão constituída de 5 mL de
sol. de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL
de sol. de brometo de cetiltrimetil amônio
(CTAB) 0,5 mM,
0,1 mL de sol. de ácido
etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1
mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9
mL de sol. de dietanolamina (DEA) 9
mmol/L
Potencial aplicado -20 kV
Injeção hidrodinâmica 150 mbar x s
Tubos capilar
•
comprimento total
•
comprimento efetivo
•
diâmetro interno
•
50 cm
•
40 cm
•
50 µm
Comprimento de onda (detecção direta) 229 nm
Temperatura 20ºC
83
Tabela 20 - Figuras analíticas de mérito
Parâmetro Ác. Fórmico Ác.acético Ác. Propiônico
Faixa de calibração
(mg/L)
LD (mg/L) 12,2 5,0 19,2
LQ (mg/L) 17,9 7,3 28,4
Coeficiente linear -0,214 ± 0,900 1,896 ± 0,435 0,616 ± 0,591
Coeficiente angular 0,710 ± 0,019 0,849 ± 0,009 0,920 ± 0,012
Coeficiente de
determinação ajustado
0,9925 0,9988 0,9982
Precisão intra-corridas ≤ 3,4 % ≤ 2,8 % ≤ 2,7 %
84
4. CONCLUSÕES
As análises por eletroforese capilar estão fundamentadas em mecanismos
diversos de separação. A implicação direta desta versatilidade define o aspecto mais
impressionante desta técnica: a possibilidade de analisar ácidos orgânicos de massa
molar pequena em águas naturais fortemente salinas até princípios ativos utilizados nas
formulações farmacêuticas, em uma única coluna, desde que o eletrólito de corrida seja
cuidadosamente escolhido. O sucesso desta técnica advém da sua simplicidade, da
eficiência, do baixo custo na separação e do pequeno consumo de reagentes.
Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia analítica rápida, simples e
confiável na determinação dos princípios ativos (ácido acetilsalicílico e paracetamol)
em formulações farmacêuticas por eletroforese capilar por zona (CZE). Utilizou-se um
eletrólito de corrida de borato 25 mmol/L (pH = 9,2) e detecção direta em 226 nm. O
tempo de análise da mistura contendo os fármacos foi inferior a 6 minutos. Nas
condições otimizadas, obteve-se uma faixa linear de 100 – 500 mg/L para o AAS e de
50 – 300 mg/L para o PAR, com uma precisão intra-corridas inferior a 2% para os dois
analitos investigados.
Posteriormente, foi utilizado um novo eletrólito de corrida constituído de 5 mL
de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de CTAB 0,5 mM,
0,1 mL
de solução EDTA 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de DEA
9 mmol/L com pH = 5,3 na determinação de ácidos orgânicos de massa molar baixa em
amostras de água natural fortemente salina por cromatografia eletrocinética micelar ou
eletrocromatografia micelar (MEKC / MECC). A quantificação foi feita com medidas
de área do pico, o ácido benzóico foi usado como cromóforo aniônico, o CTAB como
agente tensoativo, o DEA para ajuste do pH e o EDTA como modificador do fluxo
eletroosmótico para permitir uma separação adequada em menos de 4 minutos com
detecção indireta em 229 nm. Problemas de co-migração puderam ser evitados com o
emprego do EDTA como aditivo, pois é conhecido o forte efeito que o mesmo produz
na mobilidade eletroforética dos ácidos orgânicos. Nas condições otimizadas, obteve-se
uma faixa linear de 20 – 100 mg/L com uma precisão intra-corridas inferior a 3% para
os três analitos investigados.
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram a exeqüibilidade e as
vantagens do emprego da eletroforese capilar nas análises de ácidos orgânicos em águas
naturais salinas e na determinação de princípios ativos em formulações farmacêuticas.
85
5. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS
A eletroforese capilar com detecção por UV/Vis não é muito sensível em função
da pequena amostra no feixe ótico e da própria espessura do capilar. O uso de janela de
detecção com maior percurso ótico poderia aumentar a sensibilidade do método, mas ela
produz um espalhamento, o que deteriora a precisão das medidas.
Os limites de detecção e quantificação podem ser melhorados com o emprego de
agentes de derivação, portadores de grupos cromóforos com elevada absortividade
molar. Adicionalmente, sugere-se o uso da técnica de empilhamento no próprio tubo
capilar como uma forma de pré-concentração em linha dos analitos.
Sugere-se ainda o emprego desta técnica na análise de amostras de fluídos
biológicos como uma maneira de auxiliar o diagnóstico clínico de várias doenças
provocadas por distúrbios metabólicos.
86
6. REFERÊNCIAS
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2003 – Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos.
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