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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS
INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO
Aspergillus phoenicis.
Cynthia Barbosa Rustiguel
Ribeirão Preto – SP
2009
Dissertação apresentada á Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
USP, como parte das exigências para a obtenção
do título de Mestre em Ciências, Área: Biologia
Comparada.
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS
INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO
Aspergillus phoenicis.
Cynthia Barbosa Rustiguel
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Henrique S. Guimarães
Ribeirão Preto – SP
2009
Dissertação apresentada á Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da USP, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em
Ciências, Área: Biologia Comparada.
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Rustiguel, Cynthia Barbosa
PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO
BIOQUÍMICA DAS INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO
Aspergillus phoenicis.
Ribeirão Preto, 2009
133 p.il.; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada á Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto/ USP –Área de concentração:
Biologia Comparada.
Orientador: Guimarães, Luis Henrique Sousa.
1. Invertase – 2. β-D-frutofuranosidases – 3. Aspergillus
phoenicis – 4. Purificação de enzimas.
FICHA CATALOGRÁFICA
Os benefícios a longo prazo do uso de filtro solar estão
provados e
comprovados pela ciência;
Já o resto dos meus conselhos não tem outra base confiável além
de minha
própria existência errante.
Mas agora eu vou compartilhar esses conselhos com vocês.
Aproveite bem, o máximo que puder, o poder e a beleza da
juventude.
Ou, então, esquece... Você nunca vai entender mesmo o poder e a
beleza da juventude
até que tenham se apagado.
Mas, pode crer, daqui a 20 anos, você vai evocar as suas fotos e
perceber de um jeito - que você nem desconfia hoje em dia - quantas
tantas alternativas se lhe escancaravam à sua frente,
e como você realmente estava com tudo em cima.
Você não está gordo! Ou gorda...
Não se preocupe com o futuro.
Ou então preocupe-se, se quiser, mas saiba que
pré-ocupação é tão eficaz quanto mascar chiclete para tentar
resolver uma
equação de álgebra
As encrencas de verdade de sua vida tendem vir de coisas que
nunca
passaram pela sua cabeça preocupada, e te pegam no ponto fraco
às 4 da tarde
de uma terça feira modorrenta
Todo dia, enfrente pelo menos uma coisa que te meta medo mesmo.
Não seja leviano com o coração dos outros.
Não ature gente de coração leviano.
Use o fio dental.
Não perca tempo com inveja.
Às vezes se está por cima,
às vezes por baixo.
A peleja é longa e, no fim,
é só você contra você mesmo.
Não esqueça os elogios que receber.
Esqueça as ofenças.
Se conseguir isso, me ensine.
Guarde as antigas cartas de amor.
Jogue fora os extratos bancários velhos.
Estique-se.
Não se sinta culpado por não saber o que fazer da vida
As pessoas mais interessantes que eu conheço não sabiam, aos
vinte e dois
o que queriam fazer da vida.
Alguns dos quarentões mais interessantes que eu conheço ainda
não sabem.
Tome bastante cálcio.
Seja cuidadoso com os joelhos.
Você vai sentir falta deles.
Talvez você case, talvez não.
Talvez tenha filhos, talvez não.
Talvez se divorcie aos quarenta, talvez dance ciranda em suas
bodas de diamante.
Faça o que fizer, não se auto-congratule demais,
nem seja severo demais com você.
As suas escolhas tem sempre metade da chance de dar certo.
É assim pra todo mundo.
Desfrute do seu corpo.
Use-o de toda a maneira que puder, mesmo.
Não tenha medo de seu corpo ou do que as outras pessoas possam
achar dele.
É o mais incrível instrumento que você jamais vai possuir.
Dance.
Mesmo que não tenha aonde além do seu próprio quarto.
Leia as instruções, mesmo que não vá segui-las depois.
Não leia revistas de beleza. Elas só vão fazer você se achar
feio.
Dedique-se a conhecer seus pais. É impossível prever quando eles
terão ido embora, de vez.
Seja legal com seus irmãos. Eles são a melhor ponte com o seu
passado e
possivelmente quem vai sempre mesmo te apoiar no futuro.
Entenda que os amigos vão e vem, mas nunca abra mão de uns
poucos e bons.
Esforce-se de verdade para diminuir as distâncias geográficas e
de
estilos de vida, porque quanto mais velho você ficar, mais você
vai precisar
das pessoas que conheceu quando era jovem.
More uma vez em Nova York, mas vá embora antes de endurecer.
More uma vez no Havaí, mas se mande antes de amolecer.
Viaje.
Aceite certas verdades inescapáveis:
Os preços vão subir. Os políticos vão saracotear.
Você, também, vai envelhecer.
Respeite os mais velhos.
E não espere que ninguém segure a sua barra.
Cuidado com os conselhos que comprar,
mas seja paciente com aqueles que os oferecem.
Conselho é uma forma de nostalgia.
Compartilhar conselhos é um jeito de pescar o passado do lixo,
esfregá-lo,
repintar as partes feias e reciclar tudo por mais do que vale.
Mas, no filtro solar, acredite.
Letra de Pedro Bial
Dedico:
Aos meus Pais, Wanderley Rustiguel e Laúren Ap. Barbosa
Rustiguel, por estarem sempre comigo, pelo apoio, amor,
carinho, amizade.
A minha avó Therezinha e meu Irmão Wanderley Sammer
pelo amor e carinho.
Ao Luís Fernando. A. de Sousa pelo amor, respeito,
cumplicidade e dedicação.
Agradecimentos:
À Deus por estar sempre ao meu lado e por guiar meus
passos.
Ao orientador, Professor Luis Henrique, por acreditar em
mim, pelo apoio, e pelo conhecimento transmitido. Muito obrigada !
Ao Luís Fernando A. de Sousa, pela paciência, além de estar
sempre ao meu lado me apoiando e me incentivando nos momentos
difíceis.
À família Ozório por ter me auxiliado no início desta
jornada e à família Casa 13 -Pós-Graduação USP pelos momentos
de alegria, solidariedade e harmonia.
As minhas amigas de infância e todos os amigos que fiz
durante minha caminhada, agradeço pelo apoio e incentivo.
Aos amigos do Laboratório os quais foram, por todo o tempo
de desenvolvimento deste trabalho, companheiros, professores e
conselheiros.
Aos alunos de iniciação científica pelos momentos de
diversão.
À Simone por me transmitir paixão pela pesquisa e pelos
conselhos. Muito Obrigada!
À Marita por todas as palavras generosas e comidinhas
deliciosas !!
À Tatiane Beltramine (Taty Mel ) rsrsr!! Por compartilhar
comigo vários momentos. Muito obrigada principalmente pel0
companheirismo.
Aos técnicos Ricardo e Maurício pelo auxílio técnico e pela
amizade.
Aos professores da FFCL de Ituverava, pelos ensinamentos e
incentivos.
Aos professores Maria de Lourdes T. M. Polizeli, João Atílio
Jorge e Héctor Francisco Terenzi por todo o apoio e amizade.
À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
local onde foi desenvolvido este trabalho.
À FAPESP pelo apoio financeiro.
À Todos aqueles que direta e indiretamente colaboram com a
realização deste trabalho.
Muito Obrigada !!!!!!!
xi
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... xv
ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................... xix
ABREVITURAS .................................................................................................................... xxi
RESUMO .............................................................................................................................. xxiii
ABSTRACT .......................................................................................................................... xxv
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 29
1.1. FUNGOS FILAMENTOSOS ........................................................................................ 29
1.2 ENZIMAS ...................................................................................................................... 33
1.2.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS .............................................................................. 34
1.3 INVERTASES ............................................................................................................... 36
1.3.1 INVERTASES EM MICRORGANISMOS ....................................................... 39
1.3.1.1 INVERTSESE EM BACTÉRIAS ............................................................ 39
1.3.1.2 INVERTASE EM FUNGOS E LEVEDURAS ......................................... 40
1.4 APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA .................................................................................... 43
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 47
2.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 47
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 47
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 51
3.1 MICRORGANISMO ESTUDADO ............................................................................... 51
3.2 MANUTENÇÃO DA CEPA EM LABORATÓRIO .................................................... 51
3.3 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ....................... 52
3.3.1 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO .................................................... 52
3.3.1.1 MEIO SR ................................................................................................... 52
3.3.1.1.1 SOLUÇÕES DE SAIS DE SR [20X] .............................................. 52
3.3.1.2 MEIO ADAMS .......................................................................................... 53
3.3.1.3 MEIO KHANNA ....................................................................................... 53
3.3.1.3.1 SOLUÇÃO DE SAIS DE KHANNA .............................................. 53
xii
3.3.1.4 MEIO MÍNIMO DE VOGEL ................................................................... 54
3.3.1.4.1 SOLUÇÃO DE BIOTINA ............................................................... 54
3.3.1.4.2 SOLUÇÃO DE SAIS DE VOGEL .................................................. 54
3.4 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO
SÓLIDO ................................................................................................................................ 54
3.5 INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE COMPOSTOS NA PRODUÇÃO DE
INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ......................................................... 55
3.6 OBTENÇÃO DAS ENZIMAS INTRACELULARES E EXTRACELULARES .......... 55
3.6.1 FERMENTAÇÃO SUBMERSA (FSbm) ............................................................ 55
3.6.2 FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO (FSS) ...................................... 56
3.7 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ............................................................. 56
3.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS E CARBOIDRATOS .................................................... 57
3.9 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMOS DE ATIVIDADE E
TERMOESTABILIDADES E ESTABILIDADES AO pH ................................................. 57
3.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
INVERTÁSICA .................................................................................................................... 58
3.11 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR ........................ 58
3.12 ELETROFORESE EM CONDIÇÕES NÃO DESNATURANTES ............................. 59
3.13 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR ....................................................... 59
3.14 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS ........................................................ 60
3.15 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE POR TLC E HPLC .......................... 60
3.16 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (K
d
e Vmax) .................... 61
3.17 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO ....................................................... 61
3.18 ANÁLISE PROTÉICA POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ............................... 62
4. RESULTADOS .................................................................................................................. 65
4.1 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ...................... 65
4.1.1 INFLUÊNCIA DA FONTE DE CARBONO NA PRODUÇÃO
INVERTÁSICA ............................................................................................................ 66
4.1.2 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO ..... 68
4.1.3 INFLUÊNCIA DA GLICOSE ADICIONADA AO MEIO DE CULTIVO
NA PRODUÇÃO DE INVERTASES .......................................................................... 68
4.1.4 EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO E FOSFATO
ADICIONADAS A FSbm NA PRODUÇÃO DE INVERTASES ............................... 70
4.2 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBSTRATO SÓLIDO ..... 72
4.2.1 EFEITO DE FONTES DE CARBONO / SUBSTRATO NA PRODUÇÃO
DE INVERTASES EM FSS ........................................................................................ 72
xiii
4.2.2 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE
INVERTASES .............................................................................................................. 73
4.2.3 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO
EM FSS ......................................................................................................................... 75
4.3 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES PRODUZIDAS EM FSbm ............................... 76
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ................................................ 79
4.5 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR ......................................................... 81
4.6 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E pH ÓTIMO APARENTE DE
ATIVIDADE PARA INVERTASES PRODUZIDAS POR A. phoenicis ........................... 83
4.7 ESTABILIDADE AO pH ............................................................................................... 85
4.8 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE .................................................................... 86
4.9 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
INVERTÁSICA .................................................................................................................... 88
4.10 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS ....................................................... 91
4.11 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE DA SACAROSE, INULINA E
RAFINOSE ........................................................................................................................... 93
4.12 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Kd E Vmax ........................ 98
4.13 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO .................................................... 100
4.14 ANÁLISE DOS FRAGMENTOS TRIPÍCOS DA INVERTASE
EXTRACELULAR ............................................................................................................ 100
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ....................................................................................... 109
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 125
xiv
xv
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA.1 REPRESENTAÇÃO FILOGENÉTICA DO REINO FUNGI ....................................31
FIGURA.2 DIAGRAMA FILOGENÉTICO DE ASCOMICETOS ...............................................31
FIGURA 3. CICLO DE VIDA DE Aspergillus nidulans COM AS FASES SEXUAL,
ASSEXUAL E PARASSEXUAL ............................................................................................ 33
FIGURA 4. O MECANISMO DE REAÇÃO CATALISADA PELA INVERTASE ............. 37
FIGURA 5. MICROGRAFIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO CONIDIÓFORO
DO A. phoenicis CONTENDO OS CONIDIÓSPOROS ......................................................... 51
FIGURA 6. CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E
EXTRACELULAR PELO A. phoenicis EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO ...............68
FIGURA 7. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PEPTONA
SULFATO DE AMÔNIO E FOSFATO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRA E
EXTRACELULAR POR A. phoenicis EM FSbm ................................................................... 71
FIGURA 8. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE CULTIVO EM FSS NA SECREÇÃO DE
PROTEÍNAS E NA PRODUÇÃO DE INVERTASE POR A. phoenicis ................................ 76
FIGURA 9. PERFIS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA DE TROCA IÔNICA
DEAE-CELULOSE PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR
PRODUZIDAS EM FSbm POR A. phoenicis .......................................................................... 77
FIGURA 10. PERFIS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA DE EXCLUSÃO
MOLECULAR SEPHACRYL S-200 PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E
EXTRACELULAR PRODUZIDAS EM FSbm POR A. phoenicis ......................................... 78
FIGURA 11. PERFIL ELETROFORÉTICO EM CONDIÇÕES NÃO
DESNATURANTES (PAGE 7%) PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E
EXTRACELULAR CORADAS POR PRATA E PARA ATIVIDADE INVERTÁSICA ...... 80
FIGURA 12. DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR NATIVA DAS
INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR PRODUZIDAS POR A. phoenicis ................ 81
xvi
FIGURA 13. PERFIL ELETROFORÉTICO EM CONDIÇÕES DESNATURANTES
(SDS-PAGE 7%) PARA AS INVERTASES INTRACELULAR (raia 2) E
EXTRACELULAR (raia 3) ...................................................................................................... 82
FIGURA 14. DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA APARENTE DE
ENSAIO E pH ÓTIMO APARENTE PARA AS INVERTASES PRODUZIDAS EM
FSbm E EM FSS ....................................................................................................................... 84
FIGURA 15. ESTABILIDADE AO pH DAS INVERTASES INTRACELULAR E
EXTRACELULAR PRODUZIDA EM FSbm E FSS ............................................................. 85
FIGURA 16. ESTABILIDADE TÉRMICA DAS INVERTASES INTRACELULAR E
EXTRACELULAR POR A. phoenicis ..................................................................................... 87
FIGURA 17. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES AgNO
3
SOBRE A
ATIVIDADE INVERTÁSICA INTRACELULAR E EXTRACELULAR PRODUZIDA
EM FSbm E EXTRACELULAR PRODUZIDA POR A. phoenicis ........................................ 90
FIGURA 18. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DOS PRODUTOS DE
HIDRÓLISE DA SACAROSE E DA RAFINOSE MEDIANTE AÇÃ ENZIMÁTICA DA
INVERTASE INTRACELULAR E EXTRACELULAR ........................................................ 94
FIGURA 19. PERFIL CROMATOGRÁFICO EM HPLC DOS PRODUTOS DE
HIDRÓLISE DA SACAROSE OBTIDOS PELA AÇÃO ENZIMÁTICA DA FORMA
EXTRACELULAR ................................................................................................................... 96
FIGURA 20. PERFIL CROMATOGRÁFICO EM HPLC DOS PRODUTOS DE
HIDRÓLISE DA RAFINOSE PELA AÇÃO DAS INVERTASES PURIFICADAS ............. 97
FIGURA 21. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA SIGMOIDAL PARA A INVERTASE
INTRACELULAR E EXTRACELULAR NA AUSÊNCIA E NA PRESENÇA DE
AgNO
3
....................................................................................................................................... 99
FIGURA 22. DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DAS INVERTASES
INTRACELULAR E EXTRACELULAR PRODUZIDA POR A. phoenicis ........................ 100
FIGURA 23. FINGERPRINT DE MASSA DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS DA
INVERTASE EXTRACELULAR PURIFICADA DE A. phoenicis ...................................... 101
xvii
FIGURA 24. DETERMINAÇÃO DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA DE UM DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS (P1)
OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis ............................ 102
FIGURA 25. DETERMINAÇÃO DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA DE UM DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS (P2)
OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis ............................ 103
FIGURA 26. DETERMINAÇÃO DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA DE UM DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS (P3)
OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis ............................ 104
FIGURA 27. ALINHAMENTOS COM INVERTASE EXTRACELULAR DE A. niger E
OS FRAGMENTOS P1, P2 E P3 OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR
DE A. niger ............................................................................................................................. 105
xviii
xix
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1. DADOS BIOQUÍMICOS COMPARATIVOS DE INVERTASES
PRODUZIDAS POR FUNGOS E LEVEDURAS ................................................................... 43
TABELA 2. DADOS CINÉTICOS COMPARATIVOS DE INVERTASES
PRODUZIDAS POR FUNGOS E LEVEDURAS ................................................................... 43
TABELA 3. PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR
PELO FUNGO A. phoenicis EM DIFERRENTES MEIOS DE CULTIVO EM
CONDIÇÃO ESTACIONÁRIA OU SOB AGITAÇÃO ......................................................... 66
TABELA 4. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO NA
PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ............................ 67
TABELA 5. INFLUÊNICA DA ADIÇÃO DE GLICOSE E SACAROSE NA
PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR POR A.
phoenicis EM FSbm ................................................................................................................. 69
TABELA 6. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SUBSTRATOS/ FONTES DE
CARBONO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis EM FES .... 73
TABELA 7. INFLÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES, ÁGUA DE TORNEIRA E
ÁGUA DESTILADA NA PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis
FSS ........................................................................................................................................... 74
TABELA 8. EFEITO DE DIFERENTES PROPORÇÕES DE ÁGUA DE TORNEIRA
NA PRODUÇÃO DE INVERTASE POR A. phoenicis EM FSS ........................................... 75
TABELA 9. PURIFICAÇÃO DA INVERTASE INTRACELULAR PRODUZIDAS
PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ................................................................................... 79
TABELA 10. PURIFICAÇÃO DA INVERTASE EXTRACELULAR PRODUZIDAS
PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ................................................................................... 79
TABELA 11. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
INVERTÁSICA INTRACELULAR E EXTRACELULAR DE A. phoenicis......................... 89
xx
TABELA 12. HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS PELAS INVERTASES
PRODUZIDAS POR A. phoenicis EM FSbm .......................................................................... 92
TABELA 13. PARÂMETROS CINÉTICOS DAS INVERTASES PRODUZIDAS POR
A. phoenicis ............................................................................................................................... 98
TABELA 14. HOMOLOGIA ENTRE INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis
E OUTRAS ENZIMAS MICROBIANAS ............................................................................. 106
xxi
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Atm.........................................................................Atmosfera
ºC............................................................................Graus Celsius
cm...........................................................................Centímetros
Da...........................................................................Dalton
DEAE.....................................................................Dietilaminoetil
DNS........................................................................Ácido 3’, 5’dinitrosalicílico
EDTA.....................................................................Ácido etilrnodiaminotetracético
FSbm......................................................................Fermentação submersa
FES.........................................................................Fermantação em extrato sólido
g..............................................................................Grama
g..............................................................................Aceleração da gravidade
h..............................................................................Hora
HPLC......................................................................Hight Performance Liquid Chromatography
kDa…......................................................................Kilo Dalton
Km...........................................................................Constante de Michaelis-Menten
L...............................................................................Litro
mg ...........................................................................Miligrama
min...........................................................................Minutos
mL............................................................................Mililitro
mM...........................................................................Milimolar
N...............................................................................Normal
nm.............................................................................Nanômetros
PAGE........................................................................Eletroforese em gel de poliacrilamida
PI...............................................................................Ponto isoelétrico
xxii
p/v.............................................................................Peso por volume
qsp.............................................................................Quantidade suficiente para
SDS...........................................................................Dodecil sulfato de sódio
U...............................................................................Unidade enzimática
µL.............................................................................Microlitro
µmols........................................................................Micromols
Vmáx .......................................................................Velocidade máxima
V/V...........................................................................Volume por volume
xxiii
RESUMO
Os microrganismos são importantes decompositores de matéria orgânica e por isso
reciclam elementos vitais através do uso de enzimas extracelulares, como celulases,
pectinases e invertases, entre outras. Neste contexto, os fungos filamentosos vêm atraindo
grande interesse como produtores de enzimas com potencial biotecnológico, destacando–se o
gênero Aspergillus. Este gênero pertence aos ascomicetos, que têm sido alvo de muitas
pesquisas para produção de diferentes enzimas, incluindo-se invertases.
Invertases (EC 3.2.1.26), também conhecidas como β-D-frutofuranosidases, tem
atraído grande interesse industrial. Esta enzima hidrolisa a sacarose levando a produção de
uma mistura de D-glicose e D-frutose, conhecida como açúcar invertido. A frutose é um
açúcar de interesse para a indústria de confeitaria, uma vez que apresenta uma constituição
líquida não cristalizável, podendo ainda ser utilizada como adoçante para diabéticos. Neste
contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a produção de invertases por
Aspergillus phoenicis, purificando e caracterizando-as bioquimicamente. A purificação das
invertases do fungo Aspergillus phoenicis e a caracterização bioquímica forneceram dados
adicionais importantes para o entendimento da diversidade das propriedades destas enzimas,
para uma provável aplicação biotecnológica.
Entre os diferentes meios de cultura submersos testados, a maior produção invertásica
intracelular foi obtida em meio Vogel mantido em condição estacionária e a extracelular em
meio Khanna mantido sob agitação (100 rpm), ambos por 72h.
Uma vez que o meio Khanna foi selecionado para continuidade dos estudos, os
maiores níveis enzimáticos intra e extracelulares foram obtidos quando o meio foi adicionado
de rafinose e farelo de trigo como fonte de carbono, respectivamente. Adição suplementar de
nitrogênio favoreceu a atividade enzimática, ao passo que a adição de fosfato levou a uma
xxiv
diminuição. Quando adicionado 5% de glicose em meio submerso a produção invertásica foi
diminuída. Já para fermentação em substrato sólido a adição de solução de sais de Khanna
favoreceu a produção de invertases, mas a adição de água da torneira na proporção 1:0,5
(m\v) foi mais significativa com produção máxima em 72 horas usando farelo de soja como
fonte de carbono. A temperatura ótima de ensaio foi de 60-65°C para as invertases obtidas
em fermentação submersa e 55ºC para a obtida em fermentação em substrato sólido. Contudo,
a 65ºC as invertases intracelular e extracelular produzidas em FSbm tiveram uma meia vida
(t
50
) de 9 minutos e a forma extracelular produzida em FSS uma meia vida (t
50
) de 13
minutos. Quando armazenadas a 4ºC e -20ºC, ambas as formas enzimáticas mantiveram-se
estáveis por longos períodos. Já o pH ótimo de atividade foi 4,5 para ambas as formas intra e
extracelular, as quais mantiveram–se estáveis na faixa de pH de 4,5 a 7,0 por 1 hora.
As invertases intra e extracelular foram purificadas 18,19 vezes e 59,62 vezes,
respectivamente com recuperação de 24,36% e 7,46%. Ambas as enzimas são glicoproteínas com
massa molecular nativa de 131kDa e 158kDa respectivamente e pontos isoelétricos na faixa de
4,33 e 4,40. As atividades invertásicas intra e extracelular foram aumentadas na presença de Mn
2+
e Na
+
, e Ag
+
. As invertases hidrolisaram sacarose, rafinose e inulina. Os valores de Vmax e Kd
com sacarose como substrato foram 124,9 U/mg e 22,55 mM para a forma intracelular e 954,6
U/mg e 59,89 mM para a extracelular, na ausência de AgNO
3
. Na presença de AgNO
3
, as
enzimas intra e extracelular tiveram Vmax de 152 U/mg e 1.234 U/mg, e Kd de 70,80 mM e
29,21 mM, respectivamente. Através de análise dos 3 fragmentos e comparação com as dados
disponíveis no banco de dados podemos afirmar que a enzima extracelular de A. phoenicis faz
parte da grande família das β-Fructosidades com certo grau de homologia com a invertase
extracelular de A. niger. Portanto A. phoenicis foi um bom produtor de invertases com elevada
temperatura de atividade e boa estabilidade térmica além de outras características distintivas como
ativação por prata, não observada anteriormente na literatura.
xxv
ABSTRACT
Microorganisms are important decompositors of organic compounds recycling vital
elements using extracellular enzymes as invertases, celulases and pectinases, among others. In
this context, the filamentous fungi have attracted great interest as producers of enzymes with
biotechnological potential, as for instance the genera Aspergillus. This genera belongs to the
Ascomycetes, that it has been objective of many studies of production of different enzymes,
including invertases.
Invertases (EC 3.2.1.26), also know as β-D-frutofuranosidases, have attracted great industrial
interest. This enzyme hydrolyzes the sucrose and produces a mixture of D-glucose and D-
frutose, known as inverted sugar. The fructose is a sugar of interest for the sweetener industry,
because it has a non liquid constitution crystallizable and can still be used as sweetener for
diabetic people. In this context, the aim of the present work was to investigate the invertases
production by Aspergillus phoenicis, purify and characterize these enzymes. The biochemical
characterization of the invertases from Aspergillus phoenicis can supply important additional
data for the understanding of the diversity of the properties of these enzymes. Among the all
submerged culture media tested, the highest production of intracellular invertase was obtained
in Vogel medium maintained in stationary condition and for the extracellular in Khanna
medium under orbital agitation (100 rpm), both for 72 hours. In addition, the highest levels of
intracellular enzyme were obtained with raffinose as carbon source and the extracellular form
with wheat bran, both in SbmF. The invertase production was favored by additional nitrogen
source, while the addition of phosphate source decreased the production. When 5% of glucose
was added in SbmF, the invertase production decreased. The invertase production in Solid-
State Fermentation was increased with Khanna salt solution, but the addition of faucet water
1:0.5; (w\v) was more significant with maximum production in 72 hours using soy bran as
xxvi
carbon source. The optima temperature of activity was 60-65°C for the invertases obtained in
SbmF and 55ºC for the extracellular form obtained it in SSF. However, the intracellular and
extracellular invertases produced in SbmF were stable at 60 ºC with half life (t
50
) of 9
minutes, while the extracellular form produced in SSF had half life (t
50
) of 13 minutes. The
invertases from A. phoenicis maintained their activities when storaged at 4 ºC and -20ºC for
long periods. The optimum pH of activity was 4.5 for both, intra and extracellular enzymes,
that stayed stable in a range of pH from 4.5 to 7.0 for 1 hour.
The invertases were purified 18.19 fold and 59.62 fold, with recuperation of 24,36%
and 7,46% for intra and extracellular enzymes, respectively. Both enzymes are glycoproteins
with native molecular mass of 131kDa and 158kDa, respectively and isoeletric point in range
of 4.40-4.33. The intra and extracellular invertase activities were increased in the presence of
Mn
2+
, Na
+
and Ag
+
. The invertases hidrolyzed sucrose, raffinose and inulin. The Vmax and
Kd values with sucrose as substrate were 124.9 U/mg prot and 22.55mM for intracellular
form and 954.6 U/mg, and 59.89mM for extracellular enzyme, both without AgNO
3
.
However, in the presence of AgNO
3
the intra and extracellular enzymes had Vmax of 152
U/mg and 1,234.0 U/mg, and Kd of 70.8 mM and 29,21 mM. The analyzes of the 3 peptides
and comparison with others data in the database we can affirm that the enzyme extracellular
of A. phoenicis is part of the great family of the β-Fructosidades with certain homology
degree with the extracellular invertase of A. niger. Henceforth, A. phoenicis was a good
producer of invertases with high temperature of activity, good thermal stability and other
important characteristics as activation by silver that was the first description in the literature.
27
29
1. INTRODUÇÃO
1.1 FUNGOS FILAMENTOSOS
Acredita-se que os primeiros fungos pertencentes ao reino Fungi tiveram sua origem no
período Pré–Cambriano. Atualmente de acordo com Raven et al.(2007) , estes organismos
podem ser divididos em quatro filos: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e
Basidiomycota, sendo os dois últimos abrigados pelo subreino Dikarya (Figura 1), os quais
em geral, produzem dikarions (crozier), estruturas homólogas que permitem a troca de
núcleos. Tal característica permite visualizar estes dois filos como grupos irmãos, ambos
monofiléticos. É extremamente interessante a diversidade de ambos os filos, sendo que
existem aproximadamente 30.000 espécies descritas de basidiomicetos, o que equivale a 37%
das espécies conhecidas de fungos. Já os ascomicetos compreendem cerca de 32.300 espécies
descritas representando a maior parte do reino Fungi. Representantes de ambos os filos podem
ser encontrados em todos os continentes e em diversos ambientes, além de apresentar
importância econômica (BLACKWELL et al., 2008).
Entretanto, segundo Blackwell et al. (2008) os fungos podem ser separados em 10
filos os quais não possuem indícios de monofiletismo.
Os fungos conhecidos popularmente como quitrídeos parecem ser um grupo
parafilético baseado em fungos que retiveram o caráter de esporos flagelados. Neste caso são
propostos três filos de fungos flagelados (Blastocladiomycota, Chytridiomycota, e
Neocallimastigomycota) e dois gêneros de quitrídeos: Olpidium e Rozella, ambos com
posição filogenética incerta, sendo estes dois endoparasitas. Rozella aparece em uma posição
isolada na filogenia de fungos, pois é uma linhagem que divergiu muito antes do que as
outras. Em contraste, Olpidium brassicae parece ter divergido depois da maioria de quitrídeos
e está mais próximo de alguns fungos zigomicetos.
30
Já os fungos com hifas não septadas, ou hifas septadas irregularmente e esporos de
parede celular densa foram agrupados no filo Zygomycota, sendo subdividido em quatro
subfilos: Entomophthoromycotina, Kickxellomycotina, Mucoromycotina e Zoopagomycotina.
A separação dos fungos micorrízicos arbusculares no filo Glomeromycota foi proposta
anteriormente e este filo está mais próximo de Ascomycota e Basidiomycota do que de
Zigomycota (Figura 1) (BLACKWELL et al., 2008).
A classificação dos fungos vem sofrendo grandes alterações nos últimos anos como
por exemplo, os tricomicetos, habitantes de artrópodes que compartilham semelhanças com
zicomicetos. Entretanto estudos de filogenia molecular têm demonstrado que duas das quatro
ordens de tricomicetos são realmente membros do grupo protista Mesomycetozoea. Outros
organismos que eram anteriormente considerados fungos são atualmente classificados como
estraminófilos (Oomycota, Hyphochytriomycota, e Labyrinthulomycota) ou fungos limosos
(Myxomycota, Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota).
Por outro lado espécies anteriormente consideradas como protozoários, atualmente são
efetivamente classificadas como fungos. Por exemplo, a espécie Hyaloraphidium curvatum
foi considerada como sendo uma alga verde e agora no entanto é conhecida por ser um fungo
quitridiomiceto relacionado à Monoblephariomycetes.
Adicionalmente, uma das indagações mais interessantes dos estudos filogenéticos
aponta que os protozoários conhecidos como microsporídeos estão intimamente relacionados
com fungos e que possivelmente são derivados de Zygomycota. Microsporídeos são parasitas
intracelulares altamente especializados (principalmente de animais) que não têm
mitocôndrias, mas têm quitina e trealose em seus esporos (semelhantes aos fungos). Todos os
estudos moleculares têm demonstrado que os microsporídeos evoluíram em ritmo acelerado,
dificultando a sua colocação em uma árvore filogenética.
31
FIGURA 1. Representação filogenética do reino Fungi (Blackwell et al., 2008).
Entre todos os grupos fúngicos existentes, o filo Ascomycota tem chamado atenção
sob vários aspectos inclusive quanto à produção de biomoléculas como as enzimas.
Atualmente o filo Ascomicota está dividido em 6 subfilos os quais podem ser observados na
figura 2. Entre eles, Taphrinomycotina, Saccharomycotina e Pezizomycotina são provenientes
do período Pré-Devoniano, um pouco mais de 400 milhões de anos atrás. Algumas
estimativas porém, sugerem uma origem de Ascomycota de aproximadamente 727 milhões de
anos (Taylor et al.,2006).
FIGURA 2. Diagrama filogenético de Ascomicetos (TAYLOR et al., 2006).
Os ascomicetos são fungos filamentosos que atuam como decompositores de matéria
orgânica, reciclando elementos vitais através do uso de enzimas extracelulares, como
celulases (BAYER et al., 1998), pectinases (POLIZELI et al., 1991) e invertases (MONTIEL-
32
GONZALES et al., 2002). Eles são químio-heterotróficos, necessitando de componentes
orgânicos para energia e fonte de carbono.
Apresentam estruturas como o talo (corpo de um fungo filamentoso), que consiste de
hifas cenocíticas que podem ser apresentadas como células longas e contínuas, com muitos
núcleos ou apresentarem paredes cruzadas por septos os quais dividem as hifas em células
uninucleadas. Entretanto, existe um poro em cada septo que permite que o citoplasma e os
núcleos migrem entre as células. As hifas crescem por alongamentos das extremidades e cada
filamento que contém núcleos é capaz de crescer ou regenerar de algum dano. Em condições
favoráveis as hifas se desenvolvem originando uma massa filamentosa que recebe o nome de
micélio, visível a olho nú. As hifas podem ser vegetativas, as quais obtêm nutrientes ou
reprodutivas (aéreas), que produzem esporos (MICHAEL et al., 1996).
Os fungos filamentosos podem se reproduzir assexuadamente e sexuadamente
desenvolvendo sempre esporos. Estes podem ser sexuais ou assexuais, sendo que na Figura 3
está representado o ciclo de vida de Aspegillus nidulans, um ascomiceto.
Nos ascomicetos ocorre a presença de uma estrutura reprodutiva característica, o asco,
no qual são formados os ascósporos, geralmente em número de oito em cada asco. A
produção de esporos sexuais passa por três processos:
1. Um núcleo haplóide de uma célula doadora (+) penetra no citoplasma da célula
receptora (-);
2. Os núcleos (+) e (–) se fundem formando o núcleo zigoto diplóide;
3. Por meiose o núcleo diplóide origina um núcleo haplóide que é o esporo sexual.
33
FIGURA 3. Ciclo de vida de Aspergillus nidulans com as fases sexual (
←), assexual (←) e
parassexual (
←). Modificado de CASSELTON & ZOLAN, 2002.
1.2 ENZIMAS
Enzimas são macromoléculas importantes a qualquer ser vivo, pois tornam as reações
químicas mais rápidas mantendo e regulando os processos vitais. Elas atuam como
catalisadores biológicos de alta especificidade convertendo moléculas complexas em
moléculas simples sob condições favoráveis de pH, temperatura e concentração do substrato.
Em meados do século XX, com desenvolvimento tecnológico e científico na área da
Ascósporos
meiose
conidiósporos
Ascos
fusão
Hifa
Haplóide
homozigose
Haplóide
homozigose
cleistotecio
Ascósporos
divisão
mitótica
instável
heterozigose
fusão
Diplóide homorozigose
Haplóide
homozigose
Ascósporos
Ascos
conidiósporos
Haplóide
homozigose
Hifa ascógena
Meiose
34
bioquímica, iniciaram-se os processos de extração das enzimas a partir de células produtoras,
como de microrganismos, que têm a capacidade de produzir diversas enzimas que podem ser
aplicadas à vários processos industriais. Assim, as enzimas ganharam grande importância,
sendo comercializadas atualmente em escala industrial. No século 21 os catalisadores
biológicos têm alterado vários setores industriais, gerando melhorias e benefícios para a
humanidade, de tal forma que catalisadores químicos vêm sendo trocados por enzimas em
processos industriais, tendo em vista que elas desempenham as mesmas funções, mas com
várias vantagens, como por exemplo, não poluir o ambiente, além de reduzir gastos com
energia e tempo de produção (SAID & PIETRO, 2004).
As enzimas microbianas divergem das enzimas vegetais e animais, pois não dependem
diretamente do clima, já que podem ser produzidas em laboratório ou em indústrias onde se
controla todos os fatores que podem interferir na produção (SAID & PIETRO, 2004).
Assim como os extratos enzimáticos extraídos de vegetais, bactérias e animais, os de
fungos vêm sendo utilizados em diferentes processos industriais como fermentação,
panificação e elaboração de alimentos, remédios, bebidas alcoólicas e desenvolvimento de
rações. Antigas referências sobre a aplicação de enzimas nos processos industriais foram
encontradas em poemas épicos gregos de “A Ilíada” e “A Odisséia”, que datam do ano de IX
a.C (http://fomento.ugr.es/bioaset/segundodoc.htm). A escolha das enzimas a serem utilizadas
vai depender das necessidades da indústria e do tipo de produto que se quer produzir.
1.2.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS
A produção de enzimas por microrganismos pode ser realizada em fermentação
submersa (FSbm) ou em fermentação em substrato sólido (FSS), sendo que este último vêm
sendo utilizado amplamente para a obtenção de outros produtos como desentoxicadores
biológicos para resíduos agro-industriais, ácidos orgânicos, alcalóides, antibióticos, fatores de
35
crescimento para plantas, enriquecimento nutricional e produtos biofarmacêuticos. Este tipo
de fermentação tem chamado a atenção como uma nova opção para processos fermentativos
que não a fermentação submersa comum (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).
Por definição, a fermentação em substrato sólido (FSS) é definida como o conjunto de
processos que permitem “o desenvolvimento de microorganismos (principalmente fungos) em
materiais sólidos úmidos na ausência de água livre”. Este processo tem sido aplicado na
produção de fármacos, alimentos e ração animal. Vários produtos agrícolas, tais como arroz,
trigo, cevada moída, grãos, feijão, milho, soja, bagaço de cana e centeio são utilizados como
substratos para a catálise das enzimas (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).
Outra perspectiva é o de se utilizar o bagaço de cana, o resíduo agro-industrial mais
produzido no país, para produção enzimática (ORLANDO et al., 1994). Para cada tonelada de
cana-de-açúcar processada são gerados em média 230 Kg de bagaço. O baixo custo do bagaço
torna atrativo o uso desse material para produção de invertases, especialmente em processos
de conversão da sacarose quando conduzido em elevada pressão osmótica. Deve-se aproveitar
este resíduo agro-industrial para produzir invertases já que o país importa esta enzima
(SANTANA & SOUZA, 1984).
Pérez-Guerra et al. (2003), comparando resultados obtidos em fermentação submersa
(FSbm) e com fermentação em substrato sólido (FSS) mostraram que:
* Os rendimentos são semelhantes ou mais altos que os obtidos nas culturas submersas
correspondentes;
* A baixa disponibilidade de água reduz as possibilidades de contaminação por
bactérias e leveduras. Isto permite o trabalho em condições assépticas em alguns casos;
* As condições ambientais são semelhantes ao hábitat natural para os fungos, que
constituem o grupo principal de microorganismos usados em FSS;
36
* Os meios de cultura são freqüentemente bastante simples. O substrato normalmente
contém todos os nutrientes necessários para crescimento.
Entretanto, a FSS apresenta algumas desvantagens quando comparado a FSbm:
* Só podem ser utilizados microrganismos que conseguem crescer em níveis de baixa
umidade;
* Normalmente os substratos exigem pré-tratamento como redução de tamanho ou
mudança física, substância química e cozimento;
* Os substratos sólidos causam problemas no monitoramento de alguns parâmetros
físico-químicos como pH, umidade, oxigênio e concentração da biomassa, além de serem
difíceis de se determinar a biomassa.
Os microrganismos mais adaptados para FSS são os fungos filamentosos devido a sua
fisiologia e as propriedades bioquímicas. As hifas dos fungos filamentosos têm a capacidade
de penetrar nos substratos sólidos. Isto lhe proporciona vantagens sobre os microrganismos
unicelulares na colonização do substrato e no aproveitamento dos nutrientes disponíveis,
destacando sua capacidade de crescer sob baixo nível de umidade e em alta pressão osmótica
devido à grande concentração de nutrientes e a sua capacidade de aderência e percepção das
misturas de polissacarídeos diferentes (PÉREZ-GUERRA et al., 2003). Geralmente a FSS é
um processo mais barato e possui vantagens específicas sob a FSbm para a produção em larga
escala de bioprodutos (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).
1.3 INVERTASES
Uma das primeiras carboidrases a ser estudada na história de enzimonologia foi à
invertase. Em 1828, identificou–se pela primeira vez sua atividade observando-se que a
levedura de panificação fermentava a sacarose em meio aquoso. A partir daí, a grande
quantidade de experimentos realizados sobre a invertase favoreceu seu uso como enzima
37
modelo para estudos de catálise enzimática. No século XX teve início a sua comercialização,
sendo uma enzima versátil que pode ser utilizada em diversos processos industriais (VITOLO
et al., 2004).
Também conhecida como β–D frutofuranosidase, a invertase hidrolisa a ligação
osídica (tipo α-β) de carboidratos possuidores de um radical β-fructofuranosil não substituído,
sendo a sacarose o substrato preferencial. O mecanismo de reação é baseado no esquema
abaixo (Figura 4).
FIGURA 4. Mecanismo de reação catalisada pela invertase.
Esta reação catalítica, geralmente ocorre em pH entre 4,6 e 5,0 e temperatura entre
35ºC e 50ºC, com concentração de substrato da ordem de 120g/l. Acima desta concentração a
solução de sacarose tem a viscosidade aumentada reduzindo a atividade enzimática na
presença de água (VITOLO et al., 2004). O produto final da hidrólise da sacarose são os
monossacarídeos glicose e frutose, onde a frutose pode ser utilizada como adoçante para
diabéticos, além da sua constituição líquida não cristalizável muito importante para
confeitarias.
Existem diferentes isoformas de invertases que diferem quanto ao seu pH ótimo de
atividade, podendo ser ácidas, neutras e alcalinas. As formas ácidas têm sido encontradas no
vacúolo, ao passo que as neutras e alcalinas no citoplasma. Estas diferenças não estão
sacarose glicose frutose
38
esclarecidas, mas parecem estar relacionadas com a entrada da sacarose em diferentes vias de
utilização (STURM & TANG 1999).
Atualmente as invertases estão incluídas na família GH32 das glicosidases, na qual são
encontrados 370 membros de origem vegetal, fúngica e bacteriana. Resíduos como aspartato
localizado na região N-terminal têm sido responsabilizados pelo mecanismo de
reconhecimento específico das glicosidases (ALBERTO et al., 2004).
Entre os vegetais as invertases têm sido encontradas em diversos representantes
atuando em diversos processos metabólicos podendo estar presente algumas isoformas. Sturm
& Tang (1999) conseguiram identificar três tipos de invertases: invertase ácida solúvel,
invertase I e invertase II, sendo que somente a primeira é de origem vacuolar (localização
simplástica), enquanto que as demais são apoplásticas, porém apresentando interações com a
parede celular em diferentes graus.
A invertase também influência no transporte do floema, pois ele transporta grande
quantidade de sacarose que é um ótimo substrato para invertase. Em órgãos com
descarregamento apoplástico, é necessário que a sacarose seja mantida em baixas
concentrações para que ocorra uma chegada contínua desses nutrientes às células receptoras.
As invertases e os carreadores de açúcares também podem funcionar como mecanismos de
recuperação de açúcares que se perdem para o apoplasto (PATRICK, 1997). O
descarregamento apoplástico é o acúmulo de açúcares solúveis reservado para situações
especiais, sendo comum em monocotiledôneas, órgãos de reserva que acumulam mono e
dissacarídeos ao invés de polímeros, frutos e em sementes em desenvolvimento (PERES,
2006).
39
1.3.1 INVERTASES EM MICRORGANISMOS
1.3.1.1 INVERTASE EM BACTÉRIAS
A atividade invertásica vem sendo estudada em procariotos como, por exemplo, em
cianobactéria, o que permitiu a descrição do primeiro isolamento e caracterização de
invertases (alcalina e neutra) neste grupo de organismos. Dois genes (invA e invB) foram
identificados em Anabaena sp. PCC 7120 e os produtos protéicos a partir desses genes foram
identificados e confirmados por estudos bioquímicos e imunológicos com proteínas
recombinantes (VARGAS et al., 2003).
A produção de invertases por bactérias tem sido também investigada. A β-
fructofuranosidase purificada de Lactobacillus reuteri CRL 1100, por exemplo, é composta
por uma única subunidade com massa molecular de 58 kDa sendo estável a temperaturas
menores que 45ºC. Possui pH ótimo de atividade entre 4,5 e 7,5, e atividade máxima a 37ºC
(GINÉS et al. 2000).
Já a linhagem de bacilos denominada YF43 estuda por Oda & Ito (2000), foi capaz de
se desenvolver em sacarose tão rapidamente quanto em glicose, sendo esta linhagem isolada
por mutação de Lactobacillus amylovorus JCM 1126, uma linhagem impermeável na
utilização de sacarose. A sacarose estimulou a produção de invertases pela linhagem YF43 e
JCM 1126 simultaneamente. Em meio contendo exclusivamente frutooligossacarídeos como
fonte de carbono, as células da linhagem YF43 mostraram alta atividade invertásica apesar de
um crescimento reduzido. As duas invertases produzidas nas células crescidas em sacarose e
frutooligossacarídeos eram β-D-fructofuranosidases idênticas (ODA & ITO, 2000).
Para Bifidobacterium infantis ATCC 15697 foi observada a presença de uma exo-
inulinase com atividade invertásica. Esta enzima monomérica possui massa molecular de 70
40
kDa com sua atividade ótima em pH 6,0, a 37ºC, sendo estável em temperaturas inferiores
55ºC (WARCHOL et al., 2002).
1.3.1.2 INVERTASE EM FUNGOS E LEVEDURAS
Desde sua descoberta em 1828, as invertases vêm sendo alvo de intensas investigações
principalmente aquelas obtidas a partir de microrganismos como a levedura Saccharomyces
cerevisiae (SHAFIQ et al., 2002), que é o microorganismo mais bem caracterizado quanto à
produção de invertase. Para esta levedura em especial, a invertase apresentou pH ótimo de
atividade entre 3,5 e 6,0, dependendo da concentração do substrato e dos tampões utilizados
(SIMIONESCU et al., 1987; WISEMAN & WOODWARD, 1975). De forma geral, a síntese
de invertases em leveduras é controlada por uma família de genes SUC os quais quando
expressos levam a síntese de invertases para a hidrólise da sacarose (PARRIZZI, 2006).
Segundo os trabalhos de Vitollo et al. (1989) e Perlman et al. (1981) as leveduras apresentam
duas formas enzimáticas, a forma localizada na parede celular e associada a manana
(carboidrato polimérico), e a forma intracelular localizada no citoplasma e não associada a
carboidrato polimérico. Porém, a enzima destinada a parede celular, apresenta uma sequência
de aminoácidos que as encaminha para o retículo endoplasmático, onde ocorre a glicosilação.
Após a invertase extracelular ser glicosilada ela é armazenada em vesículas no Complexo de
Golgi sendo finalmente liberada no espaço periplásmico durante a gemulação (reprodução
assexuada da levedura) (PERLMAN et al., 1981). Com relação a massa molecular destas
enzimas produzidas por leveduras foi descrito para Cândida utilis uma invertase composta
por duas subunidades com massa molecular de 150 kDa, sendo encontradas intra e
extracelularmente (BELCARZ et al., 2002).
Entre os microrganismos os fungos filamentosos têm se destacado quanto à produção
de enzimas de interesse industrial. Enzimas que possuam alta especificidade e que possam ser
41
usadas em pequenas quantidades são extremamente interessantes sob o ponto de vista
biotecnológico. Desta forma, a produção de invertases por fungos filamentosos também tem
sido investigada como, por exemplo, em Aspergillus niger (RASHID et al., 1998),
Aspergillus japonicus (CHENG et al., 2005), Aspergillus ochraceus (GUIMARÃES et al.,
2007), Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002) e Thermomyces lanuginosus
(CHAUDHURI et al., 1999).
Em cada microrganismo a produção da invertase apresenta suas particularidades, com
pequenas alterações na temperatura de incubação, pH do meio de cultivo, fonte de carbono,
influência de íons e curva de crescimento. Considerando as condições de cultivo, Chaudhuri
et al. (1999) observaram que a utilização de sacarose como fonte de carbono promoveu um
bom desenvolvimento do fungo T. lanuginosus e consequente aumento da produção
invertásica, chegando ao nível máximo entre 6 e 12 horas. Em A. japonicus, a invertase
estudada, apresentou pH ótimo e temperatura ótima de ensaio igual a 5,0 e 50ºC,
respectivamente (SU et al., 1991), diferindo do encontrado para a atividade invertásica em
Aspegillus sp. 27H, com pH ótimo de 4,0 e temperatura ótima de 55ºC (FERNÁNDEZ et al.,
2004). Resultados semelhantes foram encontrados por L´Hocine et al. (2000) para a enzima
de A. niger AS0023. Já para R. glutinis a atividade invertásica máxima foi em pH 4,5
mantendo-se estável nos pH 2,6 e 5,5, e em temperaturas entre 20ºC e 60ºC, sendo ativada
por Fe
2+
, K
+
, Co
2+
, Na
+
e Cu
2+
(RUBIO et al., 2002). Nos trabalhos de Guimarães et al.
(2007); (GUIMARÃES et al.,2009) a atividade invertásica máxima foi em pH 4,5 e na
temperatura de 60ºC, sendo ativada por Mn
2+
, Mg
2+
, Ba
2+
, Na
+
e Cu
2+
. O fungo Alternaria sp.
(SANGALETTI et al., 2003) produziu invertase quando cultivado em meio semi-sólido.
Nestas condições o extrato enzimático bruto apresentou maior atividade em pH 5,0.
Segundo o trabalho de Rubio et al. (2006) o mecanismo de indução da síntese de
invertase em Aspergillus niger depende da interação da molécula de sacarose com o
42
respectivo receptor na membrana celular. Este contato geraria um sinal químico intracelular
amplificado via AMPc o qual dispararia a nível nuclear a síntese de RNAm a partir do DNA.
O RNAm formado seria então traduzido em invertase pela atividade dos ribossomos. A
invertase produzida é então secretada mais tarde para o espaço periplasmático, podendo ainda
ser detida na parede celular.
Com o fungo Cladosporium cladosporioides foram realizados estudos sobre auto-
imobilização da invertase, verificando-se que o valor de Km obtido para a enzima auto-
imobilizada é maior. Fato este que pode estar relacionado com a resistência ao transporte de
massa imposta pela estrutura celular, o que não ocorre com a invertase solúvel. Apesar das
limitações estruturais das células, esta atua como suporte de imobilização da enzima, que
parece melhorar a estabilidade operacional da invertase (SANGALETTI et al., 2003).
Para uma melhor visão do panorama atual do conhecimento sobre a produção e a
caracterização de invertases de fungos e leveduras, algumas propriedades bioquímicas foram
sumarizadas na tabela 1, assim como alguns parâmetros cinéticos na tabela 2.
43
TABELA 1. Dados bioquímicos comparativos de invertases produzidas por fungos e
leveduras.
Microrganismos Temperatura ºC pH Referência
Aspergillus japonicus
50 5 SU et al., 1991
Aspegillus sp 27H 55 4 FERNÁDEZ et al., 2004
Aspergillus niger AS0023 55 4 L´HOCINE et al., 2000
Rhodotorula glutinis
60 4,5 RUBIO et al., 2002
Saccharomyces cerevisiae
30 3,5 e 6,0 SHAFIQ et al, 2002
Aspergillus ficuum
30 5 ETTALIBI et al., 1987
Thermomyces lanuginosus
50 6,5 CHAUDHURI et al., 1999
Aspergillus niveus
60 4,5 GUIMARÃES et al.,2009
Aureobasidium pullulans
30 5 YOSHIKAWA et al., 2007
Schwanniomyces occidentalis
45-55 5,5 A´LVARO-BENITO et al., 2007
Aspergillus ochraceus
60 4,5 GUIMARÃES et al., 2007
Rhodotorula glutinis
20-60 4,5 RUBIO et al., 2002
Aspergillus niger IMI 303386 50 6,5 NGUYEN et al., 1999
Candida utilis
60-65 3,5 e 7 CHÁVEZ et al., 1997
TABELA 2. Dados cinéticos comparativos de invertases produzidas por fungos e leveduras.
Microrganismos
Parâmetros Cinéticos
Referência Km (mM) Vmax (U/mg protein)
Aspergillus niveus
5.78 30.46 GUIMARÃES et al., 2009
Schwanniomyces occidentalis
4.9 * ÁLVARO-BENITO et al., 2007
Aspergillus ochraceus
7.37 22.39 GUIMARÃES et al., 2007
Rhodotorula glutinis
0.227 0.096 umol/min RUBIO et al., 2002
Aspergillus niger IMI 303386 * * NGUYEN et al., 1999
Candida utilis
11 * CHÁVEZ et al., 1997
1.4 APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA
Industrialmente as enzimas podem ter várias aplicações como, por exemplo, o uso de
amilases (PEIXOTO et al., 2003), para diminuir a turbidez e clarificar sucos de frutas ou
produção de educorantes, a partir do amido e as proteases usadas como princípio ativo de
medicamentos digestivos e na fabricação de queijos (SAID & PIETRO, 2004). No caso das
invertases, grandes confeitarias utilizam-nas para hidrolisar a sacarose produzindo moléculas
44
de glicose e frutose (MONTIEL-GONZALES et al., 2002). A frutose é muito mais atrativa
para propósitos industriais que a sacarose, destacando-se sua constituição líquida e não
cristalizável. Também tem sido empregada no processo de fermentação do melaço da cana
para produção de etanol (SHAFIQ et al., 2002; ALBERTO et al., 2004).
As invertases podem ainda ser utilizadas para a produção de frutooligossacarídeos
(FOS) que são açúcares não metabolizados pelo organismo humano, não apresentando valor
calórico (MOLIS et al., 1996). São considerados prebióticos promovendo vários benefícios à
saúde humana, desde a redução de colesterol sérico até o auxílio na prevenção de alguns tipos
de câncer. Os FOS, principalmente de origem microbiana da fermentação de sacarose, têm
atraído atenção especial e são importantes principalmente por suas propriedades funcionais,
mais do que pela sua doçura (FERNÁNDEZ et al., 2004).
Bouhnik et al. (1996) demonstraram que a ingestão de FOS, em doses de 12,5g ao dia
por 3 dias (doses clinicamente toleradas), produziram efeitos significativos de queda na
contagem de anaeróbios totais nas fezes, queda de pH, atividade de nitroredutases,
azoredutases e beta glucoronidases, queda nas concentrações de bile ácida e esterol neutro,
levando ao aumento da colonização de bifidobactérias no trato digestivo. Além disso,
reduzem os níveis séricos de colesterol total e lipídeos (YAMASHITA et al., 1984;
MODLER et al., 1990; MODLER, 1994).
45
47
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar a produção de invertases por Aspergillus
phoenicis em fermentação submersa e fermentação em substrato sólido, purificando e
caracterizando-as bioquimicamente.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Foram objetivos específicos deste trabalho:
Determinar e padronizar as melhores condições físico-químicas para a produção de
invertases;
Estabelecer as melhores condições de ensaio para atividade enzimática;
Comparar a produção invertásica em fermentação submersa e em fermentação em
substrato sólido;
Purificar e caracterizar bioquimicamente as invertases;
Determinar os parâmetros cinéticos, tais como Kd e Vmax para as enzimas
purificadas;
Analisar os produtos de hidrólise da sacarose, rafinose e inulina pela ação da
invertase;
Analisar comparativamente as propriedades bioquímicas das invertases purificadas
com as descritas na literatura;
Analisar os fragmentos tripíticos das invertases, comparando os com seqüências
disponíveis em bancos de dados, buscando-se uma provável homologia com enzimas
de outros microrganismos.
48
49
51
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MICRORGANISMO ESTUDADO
O fungo utilizado foi o Aspergillus phoenicis, obtido a partir de material em
decomposição, na região de Ribeirão Preto – São Paulo, sendo este identificado segundo a
descrição de RAPER & FENNELL (1965) e KLICH & PITT (1988). Na Figura 5 pode – se
observar os conidiósporos de A. phoenicis em microscopia eletrônica.
FIGURA 5. Micrografia eletrônica de varredura do conidióforo do Aspergillus phoenicis
contendo os conidiósporos. Fonte: RIZZATTI et al., 2004.
3.2 MANUTENÇÃO DA CEPA EM LABORATÓRIO
A cepa foi mantida no laboratório em meio sólido de aveia (4% aveia, 2% ágar), em
tubos de ensaios mantidos inclinados, previamente autoclavados por 15 minutos a 1,5 atm. Os
repiques foram realizados periodicamente de 20 a 30 dias, sendo mantidos em estufa à
temperatura de 30ºC durante uma semana, e posteriormente armazenados em geladeira a 4°C.
52
3.3 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
As culturas em fermentação submersa foram obtidas a partir do inóculo de uma
suspensão de esporos (10
5
esporos/ml) obtida a partir da raspagem da cultura de Aspergillus
phoenicis em meio de aveia com o auxílio de uma alça de platina, sendo os esporos
ressuspensos em água destilada esterilizada. Foi inoculado 1 mL da suspensão em quatro
diferentes meios de cultivo, sendo eles: SR (RIZZATTI et al., 2001), Adams (ADAMS,
1990), Khanna (KHANNA et al., 1995) e Vogel (VOGEL, 1964), suplementados com
diferentes fontes de carbono (1% para fontes complexas e 2% para monossacarídeos).
Foram preparados 25mL de cada meio em frascos Erlenmeyer de 125mL sendo o pH
ajustado para 6,0. Os meios líquidos foram autoclavados durante 20 minutos a uma pressão de
1,5 atm e temperatura de 120ºC.
3.3.1 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO
3.3.1.1 MEIO SR
Soluções de sais de SR [20x]..........................................................................................5,0mL
Peptona............................................................................................................................0,02g
Extrato de levedura..........................................................................................................0,45g
Fonte de carbono
Água destilada qsp...........................................................................................................100mL
3.3.1.1.1 SOLUÇÕES DE SAIS DE SR [20X]
MgSO
4
. 7 H
2
O ................................................................................................................0,24g
KH
2
PO
4
.............................................................................................................................0,3g
NH
4
H
2
PO
4.
........................................................................................................................1,0g
Água destilada qsp............................................................................................................100mL
53
3.3.1.2 MEIO ADAMS
MgSO
4
. 7 H
2
O...................................................................................................................0,05g
Extrato de levedura............................................................................................................0,2g
KH
2
PO
4
..............................................................................................................................0,1g
Fonte de carbono
Água destilada qsp.............................................................................................................100mL
3.3.1.3 MEIO KHANNA
Solução de sais de Khanna [20x].......................................................................................5,0mL
Extrato de levedura............................................................................................................0,1g
Fonte de carbono
Água destilada qsp.............................................................................................................100mL
3.3.1.3.1 SOLUÇÃO DE SAIS DE KHANNA [20X]
NH
4
NO
3.
.................................................................................................................................2,0g
KH
2
PO
4
.................................................................................................................................1,3g
MgSO
4.
7 H
2
O ....................................................................................................................0,362g
KCl ....................................................................................................................................0,098g
ZnSO
4.
H
2
O.........................................................................................................................0,007g
MnSO
4
. H
2
O.....................................................................................................................0,0138g
FeCl
3 .
6H
2
O......................................................................................................................0,0066g
CuSO
4.
5H
2
O ...................................................................................................................0,0062g
Água destilada qsp.............................................................................................................100mL
54
3.3.1.4 MEIO MÍNIMO DE VOGEL
Solução de biotina ............................................................................................................50,0µL
Soluções de Sais de Vogel [50x].......................................................................................2,0mL
Fonte de carbono
Água destilada qsp.............................................................................................................100mL
3.3.1.4.1 SOLUÇÃO DE BIOTINA
Biotina................................................................................................................................5mg
Etanol ( 50%).....................................................................................................................100mL
3.3.1.4.2 SOLUÇÃO DE SAIS DE VOGEL [50X]
Na
3
C
6
H
5
0
7
. 5H
2
O................................................................................................................150g
NH
4
NO
3
................................................................................................................................100g
KH
2
PO
4
.................................................................................................................................250g
MgSO
4
7 H
2
O........................................................................................................................10g
3.4 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO
As culturas em FSS foram obtidas mediante inóculo de uma solução de esporos (10
5
esporos/mL) em diferentes substratos / fontes de carbono (bagaço de cana, farelo de trigo,
farelo de soja, farinha de aveia, milho moído, farinha de centeio e palha de arroz) umedecidos
com diferentes soluções salinas (sais SR, sais de Khanna e sais de Vogel, como descrito
anteriormente), água destilada e água de torneira em diferentes proporções (0,5% a 5% p/v).
As culturas foram incubadas a 40ºC durante 72 horas, em estufa com umidade relativa ao
redor de 76%.
55
3.5 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA PRODUÇÃO DE
INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
Os meios de cultivo foram suplementados com diferentes concentrações (0,5% a
5,0%) de uma fonte adicional de nitrogênio (peptona e sulfato de amônia), bem como uma
fonte adicional de fosfato (KH
2
PO
4
). Como controle foi usado meio de cultivo sem a adição
destes compostos.
Com o objetivo de se verificar a ocorrência ou não da repressão pela presença de
glicose no meio, o microrganismo em estudo foi inoculado em meio Khanna com farelo de
trigo como fonte de carbono (FSbm), acrescido de diferentes concentrações de glicose (0 a
5,0%; p/v), sendo incubados a 40ºC durante 72 horas.
3.6 OBTENÇÃO DAS ENZIMAS INTRACELULARES E EXTRACELULARES
3.6.1 FERMENTAÇÃO SUBMERSA (FSbm)
Após incubação as culturas foram filtradas a vácuo, obtendo–se um filtrado livre de
células chamado extrato bruto extracelular e a massa micelial, a qual foi lavada com dois
volumes de água destilada, prensada entre folhas de papel filtro, macerada e ressuspensa em
10mL de solução tampão acetato de sódio 50mM, pH 4,5. Essa suspensão foi centrifugada a
12.000g por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante contendo as enzimas intracelulares foi
separado e chamado de extrato bruto intracelular. Os extratos brutos contendo as enzimas
intracelulares e extracelulares foram dialisados em água destilada, durante 24 horas, a 4°C e
posteriormente utilizados no ensaio enzimático.
56
3.6.2 FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO (FSS)
As culturas obtidas em FSS foram adicionadas de 50 mL de água destilada gelada,
sendo esta mistura mantida sob agitação com uma barra magnética por 30 minutos, a 4
0
C.
Posteriormente, foram filtradas a vácuo em funil de Buchner, obtendo-se um filtrado livre de
células. O micélio com os resíduos utilizados como fontes de carbono foram descartados. O
filtrado foi dialisado em água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente, utilizado para a
determinação da atividade invertásica.
3.7 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
A determinação da atividade enzimática sobre sacarose foi realizada através da
quantificação dos açúcares redutores formados durante a incubação da enzima com o
substrato (sacarose 1% em tampão acetato de sódio 100mM, pH 4,5). O reagente utilizado foi
o DNS (ácido 3’,5’-dinitrosalicílico) (MILLER, 1959).
A mistura de reação foi constituída de 200µL de uma solução de substrato e 200µL de
amostra enzimática. Após incubação da mistura de reação a 60°C, alíquotas de 100µL foram
retiradas nos tempos desejados e adicionadas em tubos contendo 100µL de DNS.
Posteriormente à coleta de todos os pontos, estes foram aquecidos em banho-maria
fervente por 5 minutos e após o resfriamento, adicionou-se 1mL de água destilada por tubo. O
branco consistiu de uma alíquota de 100µL da mistura de reação adicionada imediatamente a
100µL de DNS. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
O método foi previamente padronizado por uma curva de calibração de glicose (0,1 a
1,0 mg/mL) (
ε = 0,018µmol mL
-1
cm
-1
). As leituras foram realizadas a 540nm em
espectrofotômetro. Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima
que hidrolisa um µmol de substrato, por minuto, nas condições de ensaio. Para FSbm tem-se
U/mL e para a FSS, U/g de substrato. A atividade específica foi expressa em U / mg proteína.
57
3.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS E CARBOIDRATOS
As proteínas foram estimadas pelo método descrito por Lowry et al. (1951),
utilizando-se albumina de soro bovino como padrão (BSA).
A dosagem foi realizada com 50µL e 100µL da amostra enzimática, acrescida de
150µL e 100µL de água destilada, respectivamente, totalizando-se 200µL de solução final.
Posteriormente, acrescentou-se 1mL de uma solução, preparada no momento do uso,
composta de carbonato de sódio 2% (p/v) em NaOH 0,1N, sulfato de cobre 1% (p/v) e
tartarato de sódio e potássio 1% (p/v), na proporção de 100:1:1. Após 15 minutos,
acrescentou-se 100µL de Folin Ciocalteau em água destilada (1:1). Após 30 minutos foi feita
a leitura no espectrofotômetro a 660nm, sendo os resultados obtidos expressos em mg
proteína/mL.
O conteúdo de carboidratos das invertases purificadas intracelular e extracelular foi
estimado através da metodologia do fenol-sulfúrico de Dubbois et al. (1956), utilizando- se
manose como padrão. As amostras foram adicionadas de 10µL de fenol 80% e logo após de
1mL de ácido sulfúrico concentrado. Essa mistura foi deixada em repouso por 10 minutos em
gelo. Após este período, a reação foi colocada em banho maria em temperatura de 30ºC, por
um período de 15 minutos, em seguida foi feita a leitura da absorbância em 490nm.
3.9 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMOS DE ATIVIDADE E
TERMOESTABILIDADES E ESTABILIDADES AO pH
Foram realizados ensaios em diferentes temperaturas (20ºC a 80ºC) e diferentes pH
(3,0 a 8,0) para definição da temperatura ótima e do melhor pH para a atividade invertásica,
respectivamente. Inicialmente utilizou-se tampão Mc Ilvaine, e posteriormente o tampão
específico acetato de sódio 100mM, pH 4,5.
58
Amostras enzimáticas foram previamente incubadas em diferentes temperaturas (50ºC,
60ºC, 65ºC e 70ºC) e diferentes pH (acetato de sódio 100mM, pH 3,5 e 4,5; tampão Mes 50
mM, pH 6,0; tampão Tris HCl 50mM, pH 7,0 e 8,0 e tampão CAPS 50 mM, pH 9,0 e 10,0)
por 1 hora e posteriormente utilizadas na reação enzimática para se avaliar a estabilidade
térmica e ao pH. Já para a escolha da melhor temperatura de armazenamento os extratos
enzimáticos foram mantidos em diferentes temperaturas (27ºC, 4ºC e – 20ºC) por até 200
horas, sendo retiradas alíquotas para dosagem enzimática por todo o período de análise.
3.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
INVERTÁSICA
A mistura de reação foi adicionada de diferentes compostos (HgCl
2
, NH
4
Cl, CaCl
2
,
BaCl
2
, AgNO
3
, AlCl
3
, CoCl
2
, FeSO
4
, KCl, KNO
3
, ZnCl
2
, Zn(NO
3
)
2
, EDTA, CuSO
4
, CuCl
2
,
NaCl, NaNO
3
, MgSO
4
, MnCl
2
e MgCl
2
) em diferentes concentrações, sendo estas de 1 mM e
10 mM, a partir de uma solução estoque 100mM.
3.11 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR
Os procedimentos de purificação das invertases intracelular e extracelular produzidas por
A. phoenicis em FSbm foram similares iniciando-se pela precipitação do extrato bruto com sulfato
de amônio 45%. O precipitado foi ressuspenso em água destilada, dialisado contra tampão Tris-
HCl 10mM, pH 7,5, por 24 horas a 4ºC e posteriormente aplicado em coluna cromatográfica de
troca iônica DEAE-Celulose (10,0 x 2,0 cm) previamente equilibrada em tampão Tris-HCl
10mM, pH 7,5, sendo eluída pela aplicação de um gradiente contínuo de NaCl (0-1M) no mesmo
tampão. A coluna foi mantida a 28ºC e frações de 3mL foram coletadas, sendo a vazão mantida
em 1,9 mL/min. As frações que apresentaram atividade foram reunidas em um único pool o qual
foi dialisado contra água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente liofilizado. O conteúdo foi
59
então ressuspenso em solução tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 + NaCl 50 mM, e aplicado em
uma coluna cromatográfica de exclusão molecular Sephacryl S-200 (80,0 x 2,0 cm) previamente
equilibrada com tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 + NaCl 50 mM, sendo eluída neste mesmo
tampão. A coluna foi mantida a 4ºC e frações de 1mL foram coletadas, sendo a vazão mantida
em 0,38 mL/min. As frações que apresentaram atividade foram reunidas em único pool, o qual
foi dialisado contra água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente aplicado em eletroforese em
condições não desnaturantes e desnaturantes.
3.12 ELETROFORESE EM CONDIÇÕES NÃO DESNATURANTES
Amostras invertásicas intracelular e extracelular purificadas foram submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE 7%) de acordo com Davis (1964). A corrida
eletroforética foi realizada em tampão Tris-HCl 50mM, pH 8,9 + glicina 36mM, sendo a fonte
ajustada para 120V e 40mA, por um período de 2 horas. Após a corrida eletroforética o gel foi
retirado das placas e colocado em solução fixadora para revelação por prata segundo o
método descrito por Blum (Blum et al., 1987) ou então utilizado para determinação da
atividade invertásica em gel. Para determinação da atividade em gel, logo após a corrida o gel
foi lavado com tampão acetato de sódio 0,5M, pH 4,5 por 30 minutos e posteriormente lavado
mais 3 vezes tampão acetato de sódio 0,1M, pH 4,5 por 20 minutos cada vez. Após as
lavagens o gel foi incubado em banho-maria a 37ºC no escuro com uma solução contendo
0,2mg/mL de metil sulfato de fenazina, 0,4mg/mL de nitroblue tretazolium, 30 unidades/gel
de glicose oxidase e 1% de sacarose pelo tempo necessário para o surgimento da banda.
3.13 DETERMINÇÃO DA MASSA MOLECULAR
As massas moleculares nativas para as invertases intracelular e extracelular foram
estimadas por filtração em coluna cromatográfica Sephacryl-S200, utilizando-se como
60
padrões moleculares para cálculo da massa molecular: Álcool desidrogenase (150 kDa), BSA
(66 kDa), Ovoalbumina (43 kDa) e Anidrase carbônica (29 kDa).
As amostras invertásicas intracelular e extracelular purificadas foram submetida à
eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS-PAGE 7%) de acordo
com Laemmli (1970). A corrida eletroforética foi realizada em tampão Tris-HCl 25mM, pH
8,9 + glicina 192mM + 0,1% SDS , sendo a fonte ajustada para 120V e 40 mA, por um
período de 2 horas. Foram utilizados os seguintes padrões moleculares para cálculo da massa
molecular: α 2-Macroglobulina (168 kDa), β-Galactosidase (112 kDa), Lactoferrina (91 kDa),
Piruvato quinase (67 kDa) e Dehidrogenase latica (36 kDa). Após a corrida eletroforética o
gel foi retirado das placas e colocado em solução fixadora para revelação por prata segundo o
método descrito por Blum (Blum et al., 1987).
3.14 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS
A atividade hidrolítica das invertases intracelular e extracelular sobre inulina, rafinose
e sacarose foi determinada. As dosagens foram realizadas conforme descrito no item 3.8. Os
substratos utilizados estavam na concentração de 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 100
mM, pH 4,5.
3.15 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE POR TLC E HPLC
Os produtos de hidrólise da sacarose, rafinose e inulina obtidos pela ação das
invertases, foram submetidos à cromatografia em placa delgada de sílica, cujas medidas
foram: 20x10cm. Utilizou-se como padrão sacarose, glicose, frutose, rafinose, inulina,
kestose, nistose, galactose e lactose a 1%. A solução para o desenvolvimento da
cromatografia continha butanol, etanol e água destilada na proporção de 5:3:2 (v/v/v). Após a
corrida e secagem completa das placas delgadas, revelou-se o cromatograma com solução
61
contendo orcinol 0,2% em ácido sulfúrico e metanol na proporção de 1:9(v/v), incubando-se
posteriormente a 100ºC para visualização dos “spots”.
Os produtos de hidrólise da sacarose e da rafinose obtidos pelas ações das invertases
foram submetidos a análise por HPLC equipado com uma coluna Shimadzu EC250/4.6
nucleosil-100.5 NH2 (30x0,75 cm) mantida a 60ºC. Soluções de sacarose, glicose, frutose,
kestose, nistose, rafinose, galactose e lactose foram utilizadas como padrões. Para
desenvolvimento da cromatografia utilizou uma solução de acetonitrila 82%.
3.16 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (K
d
e Vmax)
A determinação dos parâmetros cinéticos K
d
e Vmax para as enzimas purificadas foi
realizado utilizando-se sacarose (0,5mM- 300mM) como substrato na ausência ou na presença
de 1mM AgNO
3
. Os valores de Kd e Vmax foram calculados com o auxílio do programa
Computacional Sigraf (Leone et al., 1992).
3.17 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO
Os pontos isoelétricos das invertases purificadas foram determinados em géis de
poliacrilamida de disco (0,5cm x 12 cm) de acordo com o método descrito por O´Farrel et al.
(1977) usando anfólitos com uma faixa de pH de 3 a 8 com concentração dos géis em 5%.
Foram preparados dois géis, sendo que em um a amostra purificada estava presente e em
outro tubo apenas água (controle). Após a focalização por 6 horas a 500V, o gel controle foi
fatiado em porções de 0,5cm, e cada porção foi imersa em 2,5mL de KCl (25mM), por uma
noite. Para determinação do gradiente de pH formado, foi feita a leitura do pH do anfólito
eluído de cada porção do gel controle em um potenciômetro.
Após a corrida os géis contendo as enzimas purificadas foram cortados em porções de
0,5cm, e cada porção foi imersa em 0,4 mL de solução tampão acetato de sódio 100 mM pH
62
4,5 adicionado de 1% de sacarose mantida por uma noite em banho Maria a 60ºC e
posteriormente quantificado os açúcares redutores formados.
3.18 ANÁLISE PROTÉICA POR ESPECTROMETRIA DE MASSA
Amostras purificadas das enzimas de interesse foram submetidas a eletroforese
conforme descrito no item 3.12. Após corrida eletroforética, o gel foi corado por Comassie
Brilliant Blue R-250. A banda protéica correspondente para cada enzima de interesse foi
recortada e submetida ao processo digestão “in situ” com tripsina, modificado a partir de
Shevchenko et al. (1996).
As bandas recortadas a partir dos géis obtidos foram lavadas com uma solução de
NH
4
HCO
3
50mM contendo acetonitrila (ACN) 50% (1:1; v/v) até a remoção do corante,
sendo a primeira lavagem realizada “overnight”, a 4ºC e as demais em intervalos de 15
minutos em temperatura ambiente, intercalando-se agitação em “vortex”. Após total
descoloramento, os géis foram incubados com 100µl de ACN 100% por 20 minutos e
completamente secos em Speedvac (Savant Instrument, Farmingdale, NY). Em seguida, os
cristais obtidos foram rehidratados com aproximadamente 10µl de NH
4
HCO
3
50mM
contendo 4µg de tripsina (Promega, Madison, WI). Após a rehidratação os géis foram
adicionados de 50-100µl de NH
4
HCO
3
50mM, volume suficiente para cobrir o gel. A reação
foi mantida a 37ºC durante uma noite e interrompida pela adição de 10µl de ácido fórmico.
Os fragmentos polipeptídicos obtidos por digestão com a tripsina foram analisados por
espectrômetro de massa modelo Q-TOF (Quadrupole – Time of Flight) (Micromass,
Manchester, UK) de alta resolução com fonte de ionização eletrospray (ESI) operando em
modo positivo.
63
65
4. RESULTADOS
4.1 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
Para determinar as melhores condições de cultivo para a produção de invertases pelo
fungo A. phoenicis em fermentação submersa diversos meios de cultivo foram testados, tais
como SR, Adams, Khanna e Vogel, suplementados com farelo de trigo (1%) como fonte de
carbono, mantidos sob agitação ou em condição estacionária a 40ºC, por 72 horas.
Em todos os meios e condições analisados o fungo cresceu satisfatoriamente, sendo
que a maior produção invertásica total (intra + extracelular), foi obtida em meio Vogel e em
meio Khanna, em condição estacionária e agitação, respectivamente (Tabela 3). O maior nível
de atividade enzimática extracelular foi obtido em meio Khanna (9,61 U/mL) mantido sob
agitação, sendo seguido do meio SR (5,07 U/mL), na mesma condição. Quanto à atividade
invertásica intracelular esta foi maior quando o fungo foi crescido em meio Vogel (10,57
U/mL) mantido em condição estacionária, seguido pelo meio Adams (8,38 U/mL) na mesma
condição. Contudo, quando mantido sob agitação, o meio SR proporcionou uma maior
produção invertásica intracelular (8,98 U/mL) se comparada a condição estacionária (Tabela
3). Considerando-se o nível de atividade extracelular, o meio Khanna mantido sob agitação
foi selecionado para continuidade dos estudos.
66
TABELA 3. Produção de invertases intracelular e extracelular pelo fungo A. phoenicis em
diferentes meios de cultivo em condição estacionária ou sob agitação.
Atividade Invertásica (U/mL)
Meio de Estacionária Agitação
Cultivo Intra Extra Intra Extra
Adams 8,38 ± 4,61 3,40 ± 0,13 5,54 ± 0,98 2,92 ± 0,19
Khanna 4,96 ± 2,78 2,14 ± 0,03 7,93 ± 0,13 9,61 ± 0,27
SR 3,75 ± 2,07 1,33 ± 0,00 8,98 ± 0,33 5,07 ± 0,19
Vogel 10,57 ± 6,09 3,66 ± 0,41 3,61 ± 0,17 4,29 ± 0,39
As culturas foram mantidas à 40ºC por um período de 72 horas.
4.1.1 INFLUÊNCIA DA FONTE DE CARBONO NA PRODUÇÃO INVERTÁSICA
Na tabela 4 podemos observar a influência de diferentes fontes de carbono adicionadas
ao meio de cultivo na produção de invertases por A. phoenicis em fermentação submersa.
Considerando-se as diferentes fontes analisadas, o crescimento do fungo variou entre 0,02 e
0,49 mg de proteínas utilizando-se palha de arroz e aveia como fontes de carbono,
respectivamente. Quando crescido em meio suplementado com aveia, sacarose e amido foram
obtidos os maiores crescimentos (em média 0,41mg /mL) ao se comparar com o meio sem
fonte de carbono (0,13 mg/ mL). Já quando o meio foi adicionado de palha de arroz, farelo de
trigo e bagaço de cana, valores obtidos em relação ao controle foram menores.
Com relação à atividade invertásica total (intra + extracelular), pode-se afirmar que as
fontes de carbono que mais favoreceram a produção enzimática em relação ao controle foram
farelo de trigo (17,27 U/mL), rafinose (11,35 U/mL), bagaço de cana (9,48 U/mL) e aveia (9,05
U/mL) (Tabela 4). Na presença de glicose, palha de arroz, farinha de madioca, sacarose e amido
as atividades foram menores. Entretanto quando consideradas as atividades intracelular e
67
extracelular separadamente, rafinose e farelo de trigo foram as melhores fontes de carbono,
respectivamente. A atividade extracelular obtida em farelo de trigo foi aproximadamente 77 vezes
superior que na ausência de fonte de carbono e cerca de 10 vezes superior a obtida na presença de
sacarose. Quanto ao valor do pH final do cultivo, houve uma redução na presença de sacarídeos
como o amido, rafinose e glicose, variando entre 3,0 e 4,38. Para todas as outras fontes de
carbono testadas, houve aumento dos valores de pH final variando de 6,58 a 7,42 (Tabela 4).
Considerando-se a produção da forma extracelular, optamos por continuar nossos experimentos
utilizando-se farelo de trigo como fonte de carbono para FSbm.
TABELA 4. Influência de diferentes fontes de carbono na produção de invertases pelo fungo
A. phoenicis em FSbm.
Atividade Invertásica (U/mL)
Proteína pH
Fonte de Intracelular Extracelular (mg /mL)
Carbono
Amido 2,29 ± 0,31 2,88 ± 0,59 0,32 4,30
Aveia 3,35 ± 0,31 5,70 ± 0,51 0,49 6,98
Bagaço de cana 5,16 ± 0,88 4,32 ± 1,00 0,09 6,95
Farelo de trigo 8,79 ± 1,14 8,48 ± 0,98 0,08 6,88
Farinha de mandioca 2,50 ± 0,35 1,07 ± 0,49 0,29 7,42
Glicose 0,11 ± 0,00 0,18 ± 0,08 0,27 4,38
Palha de arroz 1,07 ± 0,37 0,40 ± 0,00 0,02 6,96
Rafinose 10,37 ±0,26 0,98 ± 0,22 0,12 3,01
Sabugo 1,38 ± 0,18 3,87 ± 2,32 0,20 7,06
Sacarose 2,76 ± 0,45 0,81 ± 0,27 0,44 6,58
S / fonte de carbono 2,18 ± 0,20 0,11 ± 0,00 0,13 7,13
O microrganismo foi crescido em meio Khanna, mantido sob agitação (100rpm) durante
72 h, à 40ºC.
68
20 30 40 50 60 70 80 90 100
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
A
Proteina (mg/mL)
Tempo ( horas)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
B
Atividade invertásica (U/mL)
Tempo (horas)
4.1.2 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO
Considerando-se o cultivo do microrganismo em meio Khanna com farelo de trigo como
fonte de carbono em diferentes períodos (24 – 96 h) e mantidos sob agitação orbital (100rpm) a 40
ºC, o crescimento máximo foi observado em 24h, diminuindo a seguir devido provavelmente, à
autólise das células fúngicas ou a exaustão dos nutrientes (Figura 6A). Quanto à atividade
invertásica, verificou-se que os níveis intracelulares foram máximos em 24 horas e os
extracelulares em 72 horas (Figura 6B) em FSbm. Assim sendo, de acordo com o resultado obtido
para a forma extracelular, foi padronizado o tempo de 72 horas para os cultivos subseqüentes.
FIGURA 6. Crescimento (A) e produção de invertases (B) intracelular (●) e extracelular (▄)
pelo A. phoenicis em função do tempo de cultivo.
4.1.3 INFLUÊNCIA DA GLICOSE ADICIONADA AO MEIO DE CULTIVO NA
PRODUÇÃO DE INVERTASES
Para verificar se a produção de invertases por A. phoenicis sofria repressão (regulação
negativa) ou não devido à presença de glicose, o fungo foi crescido em meio Khanna com
farelo de trigo como fonte de carbono principal e adicionado de glicose ou não.
69
A atividade invertásica intracelular não foi estimulada pela presença de glicose no
meio de cultura nas diferentes concentrações testadas, porém a suplementação com 1% de
sacarose elevou a atividade invertásica cerca de 27% quando comparada ao controle (Tabela
5). Na concentração de 2% de glicose a produção enzimática intracelular foi reprimida cerca
de 48,7% quando comparada ao valor obtido para o controle.
Resultados semelhantes foram obtidos para a invertase extracelular, que não foi
estimulada pela presença de glicose no meio de cultura. Com o aumento da concentração de
glicose utilizada, houve redução da produção e conseqüentemente da secreção da enzima,
sendo 51% do observado para o controle quando na concentração de 2%. No entanto a
produção enzimática com a suplementação do meio com 1% de sacarose foi semelhante ao
observado para o controle (farelo de trigo sem adição de glicose ou sacarose) (Tabela 5).
TABELA 5. Influência da adição de glicose e sacarose na produção de invertases intracelular
e extracelular por A. phoenicis em FSbm.
Fonte de Carbono Atividade Invertásica (U/mL)
Intra Extra
farelo de trigo 1% 4,19 ± 0,26 5,92 ±0,55
farelo de trigo 0,1% + 0,1% de glicose 3,55 ±0,31 6,56 ±1,23
farelo de trigo 0,1% + 0,2% de glicose 2,22 ±0,08 3,16 ±0,05
farelo de trigo 0,1% + 0,5% de glicose 3,95 ± 0,42 4,27 ±0,68
farelo de trigo 0,1% + 0,75% de glicose 2,44 ±0,81 2,49 ±0,60
farelo de trigo 0,1% + 1% de glicose 3,2 ±0,05 3,01 ±0,26
farelo de trigo 0,1% + 2% de glicose 2,04 ±0,34 3,01 ±0,37
farelo de trigo 0,1% + 5% de glicose 3,03 ±0,31 3,33 ±0,71
farelo de trigo 0,1% + 1% sacarose 5,33 ±0,24 5,7 ±0,71
O fungo foi crescido em meio Khanna, sob agitação orbital (100 rpm), a 40ºC, por
72h.
70
4.1.4 EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO E FOSFATO
ADICIONADAS A FSBM NA PRODUÇÃO DE INVERTASES
Ao suplementar o meio de cultivo com diferentes fontes de nitrogênio (peptona e
sulfato de amônio), em diferentes concentrações observou–se um aumento significativo das
atividades invertásicas intra e extracelular, quando comparado ao controle, considerando-se
principalmente o uso de uma fonte orgânica (peptona) (Figura 7A). Neste caso os maiores
níveis enzimáticos foram obtidos com a adição de 5% (m/v) de peptona sendo
aproximadamente 4,6 vezes e 2,2 vezes maior para a forma intracelular e extracelular,
respectivamente, se comparado ao controle. Quando utilizado sulfato de amônio, na
concentração de 0,5% (m/v), obtiveram-se os maiores níveis enzimáticos, diminuindo em
concentrações superiores (Figura 7B). Na figura 7C podemos observar a influência de
diferentes concentrações de fosfato (KH
2
PO
4
) na produção de invertases por A. phoenicis. A
medida que se aumenta a concentração de KH
2
PO
4
ocorre um declínio significativo das
atividades invertásicas intracelular e extracelular, quando comparada ao controle, ressaltando–
se que a produção da forma extracelular, na concentração 5% de fosfato, teve uma diminuição
de 62% e a intracelular 43%.
71
FIGURA 7. Influência de diferentes concentrações de peptona (A) sulfato de amônio (B) e
fosfato (C) na produção de invertases intracelular (▄) e extracelular ( ▄ ) por A. phoenicis em
FSbm.
00,511,52 5
0
5
10
15
20
B
Atividade invertásica (U/mL)
Sulfato de amônio (%)
00,511,52 5
0
5
10
15
C
Atividade invertásica (U/mL)
KH
2
PO
4
(%)
0 0,5 1 1,5 2 5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
A
Atividade invertásica (U/mL)
Peptona (%)
72
4.2 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO
SÓLIDO
4.2.1 EFEITO DE FONTES DE CARBONO/ SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE
INVERTASES EM FSS
Na tabela 6 podemos observar que a produção de invertases foi dependente do
substrato/ fonte de carbono empregada, sendo encontrada uma variação na quantidade de
proteínas secretadas na ordem de 2,30 a 12,76 mg/g de substrato.
Com relação à atividade invertásica extracelular, pode-se afirmar que os maiores
níveis enzimáticos foram obtidos com a utilização de misturas de duas fontes como a de
farelo de soja com farelo de trigo (566,43 U/g). Já quando consideramos uma única fonte, os
melhores resultados foram obtidos com farelo de soja (470,54 U/g). Na presença de milho
moído, farinha de centeio e bagaço de cana de açúcar as atividades foram cerca de 121, 29 e
26 vezes menores, respectivamente, se comparada ao farelo de soja (Tabela 6).
Para a continuidade dos estudos foi padronizada a utilização de farelo de soja como
substrato/ fonte de carbono, considerando-se não somente o nível enzimático, mas também a
maior facilidade para se purificar se comparada a condição em que o substratos são
misturados.
73
TABELA 6. Influência de diferentes substratos/ fontes de carbono na produção de invertases
pelo fungo A. phoenicis em FSS.
Atividade Invertásica
Tipos de Substrato Extracelular (U/g) Proteína (mg/g)
bagaço de cana de açúcar 18,00 ±0,00 4,95
farelo de aveia 21,34 ±0,03 2,37
farelo de soja 470,54 ±1,42 12,76
farelo de trigo 35,27 ±1,02 6,11
farinha de centeio 16,19 ±0,00 2,30
milho moído 3,88 ±0,08 6,19
palha de arroz 78,18 ±0,73 2,73
bagaço de cana de açúcar + farelo de soja 27,26 ±0,23 10,25
centeio + milho moído 79,70 ±1,13 4,75
farelo de soja+ farelo de trigo 566,43 ±2,72 11,41
milho moído + farelo de soja 456,43 ±1,36 10,75
palha de arroz + farelo de soja 64,79 ±1,02 10,49
As culturas foram mantidas em estufa à 40ºC com umidade relativa ao redor de 76% por
um período de 72 horas.
4.2.2 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE INVERTASES
Na tabela 7 pode se verificar a influência das diferentes soluções (sais SR, sais de
Khanna e sais de Vogel), água de torneira e água destilada utilizadas para umedecer o
substrato previamente sobre a produção enzimática. O fungo cresceu satisfatoriamente em
todas as condições analisadas. Porém a maior produtividade foi observada na presença de
água de torneira (207,19 U/g), sendo seguida pela solução de sais de Khanna (188,55 U/g) e
74
de sais SR (182,52 U/g). Padronizou-se, portanto, a utilização de água de torneira para
seqüência dos experimentos.
TABELA 7. Influência de diferentes soluções água de torneira e água destilada na produção
de invertases pelo fungo A. phoenicis FSS.
Tipos de
Soluções (1:1 m/v)
Atividade Invertásica Proteína
(U/g) (mg/g)
Água de torneira 207,19 ±0,24 10,15
Água destilada 79,47 ±1,74 9,25
Khanna 188,55 ±0,41 8,55
SR 182,52 ±0,41 7,20
Vogel 23,63 ±0,24 7,58
As culturas foram mantidas em estufa à 40ºC com umidade relativa ao
redor de 76% por um período de 72 horas.
Considerando que a maior produção enzimática foi obtida em farelo de soja
umedecido com água de torneira, a melhor proporção (m/v) entre material sólido e líquido foi
definida. Na tabela 8 podemos verificar que os maiores níveis enzimáticos foram obtidos nas
culturas umedecidas na proporção de 1:0,5 (m/v), com 184,14 U/g. Também é notável que
quanto maior a umidade do meio de cultivo, menor a atividade enzimática, representando uma
queda de 14,31% na proporção 1:4 (m/v).
Para continuidade do estudo padronizou-se o cultivo em estado sólido com farelo de
soja umedecido com água de torneira (1:0,5; m/v), mantido em estufa a 40ºC, com umidade
relativa ao redor de 76%.
75
TABELA 8. Efeito de diferentes proporções de água de torneira na produção de invertases
por A. phoenicis em FSS.
Proporção
(m/v)
Atividade
(U/g)
AE
mg/g
1:0,5 184,14 ±0,24 20,39
1:1 89,74 ±4,32 3,76
1:2 25,76 ±0,08 0,64
1:3 27,42 ±0,83 0,85
1:4 26,39 ±0,41 0,68
As culturas foram incubadas a 40ºC durante 72 horas, em
estufa com umidade relativa ao redor de 76%, AE=
atividade específica.
4.2.3 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO EM FSS
Em FSS o microrganismo foi cultivado em farelo de soja umedecido com água de
torneira (1:0,5; m/v) por diferentes períodos (24 – 96 h) em estufa à 40 ºC com umidade
relativa ao redor de 76%.
Nota - se que a produção invertásica pelo fungo estudado foi ascendente até 72h,
sendo que após este período ocorreu uma queda da atividade ao redor de 29% (Figura 8B). No
entanto, nessa condição, o maior nível de secreção protéica foi observado em 48h, diminuindo
a seguir, devido possivelmente a ação de proteases também secretadas (Figura 8A).
76
FIGURA 8. Influência do tempo de cultivo em FSS na secreção de proteínas (A) e na
produção de invertase (B) por A. phoenicis.
4.3 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES PRODUZIDAS EM FSbm
Na figura 9 podemos observar o perfil cromatográfico em DEAE-Celulose para
invertase intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm. As formas intra e
extracelular interagiram com a resina, sendo eluídas como única forma com 205 mM e 90
mM de NaCl, respectivamente.
Para cada procedimento realizado separadamente, as frações que apresentaram atividade
invertásica foram reunidas em um único pool, o qual foi dialisado “overnight” contra água
destilada a 4ºC, liofilizado e posteriormente aplicado em coluna de exclusão molecular Sephacryl
S-200. Cada uma das formas enzimáticas foi eluída, com o mesmo tampão, como um único pico
de atividade como pode ser observado nos perfis cromatográficos mostrados na figura 10 para a
forma intra (A) e extracelular (B). Para cada procedimento as frações com atividade invertásica
foram reunidas em um único “pool” o qual foi dialisado contra água destilada “overnight” e
posteriormente empregado para estudos de caracterização bioquímica.
20 30 40 50 60 70 80 90 100
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
A
Proteína (mg/g)
Tempo (horas)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
100
200
300
400
500
B
Atividade invertásica( U/g)
Tempo ( horas)
77
FIGURA 9. Perfis cromatográficos em coluna de troca iônica DEAE-Celulose para as
invertases intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm por A. phoenicis.
0 50 100 150
0, 0
0, 5
1, 0
1, 5
2, 0
B
Fração nº
Abs. 280 nm
0
10
20
30
40
NaCl (0-1M)
Atividade invertásica (U/mL)
0 50 100 150 200 250
0, 0
0, 5
1, 0
1, 5
2, 0
Fração nº
Abs. 280 nm
0
10
20
30
40
50
A
NaCl (0-1M)
Atividade invertásica (U/mL)
78
FIGURA 10. Perfis cromatográficos em coluna de exclusão molecular Sephacryl S-200 para
as invertases intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm por A. phoenicis.
0 50 100 150 200 25 0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
A
Fração nº
Abs. 280 nm
0
5
10
15
20
25
Atividade invertásica (U/mL)
050100 150200250
0, 00
0, 05
0, 10
0, 15
0, 20
B
Fração n°
Abs. 280 nm
0
5
10
15
20
25
Atividade invertásica ( U/mL)
79
Nestas condições a invertase intracelular foi purificada 18,19 vezes com recuperação
de 24,36% (Tabela 9) e a extracelular 59,62 vezes com recuperação de 7,46% (Tabela 10).
TABELA 9. Purificação da invertase intracelular produzida pelo fungo A. phoenicis em
FSbm.
Volume
(mL)
Proteína
(mg Totais)
Atividade
(U Totais)
AE
(U/mg prot)
Rendimento
(%)
Fator de
Purificação (X)
Extrato bruto 224 24,64 806,4 32,72 100 1
Deae-Celulose 26 8,58 872,56 101,69 108,20 3,1
Sephacryl S200 8,7 0,33 196,44 595,27 24,36 18,19
TABELA 10. Purificação da invertase extracelular produzida pelo fungo A. phoenicis em
FSbm.
Volume
(mL)
Proteína
(mg Totais)
Atividade
(U Totais)
AE
(U/mg prot)
Rendimento
(%)
Fator de
Purificação
(X)
Extrato bruto 170 117,30 1.705,10 14,53 100 1
Deae – Celulose 67 31,49 1.271,66 40,38 74,57 2,78
Sephacryl S200 17 0,714 127,26 866,42 7,46 59,62
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
Na figura 11 podemos observar o perfil eletroforético em condições não desnaturantes
(PAGE 7%) para as invertases intracelular (A) e extracelular (B) purificadas reveladas por
prata (raia 1) e para atividade invertásica (raia 2). Em todos os perfis obtidos pode-se notar
uma única banda protéica para a qual corresponde uma única banda de atividade com
migração eletroforética semelhante.
80
FIGURA 11. Perfil eletroforético em condições não desnaturantes (PAGE 7%) para as
invertases intracelular (A) e extracelular (B) coradas por prata (raia 1) e para atividade
invertásica (raia 2).
1 2
1 2
A B
81
4.5 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR
A massa molecular nativa para as enzimas intracelular e extracelular foi determinada em
coluna cromatográfica de exclusão molecular Sephacryl-S200 como descrito anteriormente.
Ambas as enzimas são glicoproteínas, sendo que a invertase intracelular apresentou massa
molecular de 131kDa e a extracelular de 155kDa (Figura12), com conteúdo de carboidratos
de 2,14% e 1,64%, respectivamente. Em adição, o perfil eletroforético em condições
desnaturantes (SDS-PAGE 7%) para ambas as formas enzimáticas purificadas pode ser
visualizado na figura 13. Neste caso, obteve-se uma única banda protéica para as formas intra
e extracelular com massa molecular aproximadamente de 70 kDa e 79 kDa, respectivamente,
o que nos leva a inferir estruturas homodiméricas para ambas as formas enzimáticas.
FIGURA 12. Determinação da massa molecular nativa das invertases intra e extracelular
produzidas por A. phoenicis. Marcadores: anidrase carbônica (29kDa), ovolabumina (43 kDa),
BSA (66kDa) e álcool desidrogenase (150kDA).
1,15 1,20 1,25 1,30 1,35 1,40 1,45
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
Inv Intra 131kDa
Inv Extra155kDa
Log PM
Ve/Vo
150kDa
66kDa
43kDa
29kDa
82
FIGURA 13.
Perfil eletroforético em condições desnaturantes (SDS-PAGE 7%) para as
invertases intracelular (raia 2) e extracelular (raia3). Marcadores (raia 1).
168 kDa α 2-Macroglobulina
Inv Extra79 kDa
67 kDa Piruvato quinase
91 kDa Lactoferrin
a
112 kDa β-Galactosidase
Inv Intra 70 kDa
1 2
3
36 kDa Dehidrogenase latica
83
4.6 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E pH ÓTIMO APARENTE DE
ATIVIDADE PARA INVERTASES PRODUZIDAS POR A. phoenicis
Na figura 14 podemos observar que a temperatura ótima de atividade (A) para a
invertase intracelular foi de 65ºC e para a forma extracelular de 60ºC, assim como pH ótimo
de atividade (B), sendo este igual a 4,5 para ambas as formas enzimáticas. Valores de
temperatura e pH inferiores ou superiores levam as decréscimo da atividade invertásica de
ambas as formas.
Já a atividade invertásica extracelular obtida em FSS (extrato bruto) foi maior à
temperatura de 55ºC, verificando-se um decréscimo significativo da atividade enzimática à
60ºC (Figura 14C). Como ilustrado na figura 14B, esta forma enzimática apresentou pH ótimo
aparente de atividade igual a 4,5, sendo que em pH superiores, estas diminuem
gradativamente chegando praticamente a zero quando em pH 8,0.
As enzimas produzidas tanto em FSbm quanto em FSS apresentaram uma faixa de
temperatura ótima de ensaio entre 55ºC e 65Cº, no entanto o pH ótimo de ensaio foi o mesmo
para as 3 formas invertásicas.
84
FIGURA 14. Determinação da temperatura ótima aparente de ensaio (A e C) e pH ótimo
aparente (B e D) para as invertases produzidas em FSbm (A e B) e em FSS (C e D). símbolos
intracelular ( ▄ ) e extracelular ( ▄ ).
20 30 40 50 60 70 80
0
20
40
60
80
100
A
Atividade invertásica relativa (%)
Temperatura (ºC)
345678
0
20
40
60
80
100
B
Atividade invertásica relativa (%)
pH
30 40 50 60 70 80
20
40
60
80
100
C
Atividade invertásica relativa (%)
Temperatura (°C)
345678
0
20
40
60
80
100
D
atividade invertásica relativa (%)
pH
85
4.7 ESTABILIDADE AO pH
Na figura 15 podemos observar que a invertase intracelular manteve-se estável por
uma hora quando mantida em uma faixa de pH de 3,5 a 7,0. Já as formas extracelulares
(FSbm e FSS) mantiveram-se estáveis na faixa de pH de 4,5 a 8,0 durante 1 hora. Em pHs
superiores as enzimas perderam parcialmente suas atividades.
FIGURA 15. Estabilidade ao pH das invertases intracelular (█) e extracelulares produzidas
em FSbm (●) e FSS (▲).
34567891011
10
100
Log Atividade invertásica residual(%)
pH
86
4.8 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TÉRMICA
Analisando-se a figura 16A podemos observar que a invertase intracelular de A.
phoenicis manteve-se relativamente estável a 50ºC, por 60 minutos, ao passo que a 60ºC
ocorre uma pequena redução desta estabilidade, com t
50
de aproximadamente 9 minutos a
65ºC e 3,5 minutos a 70ºC. A estabilidade à temperatura da forma extracelular foi similar a
intracelular, inclusive no que se refere ao tempo de meia vida nas temperaturas de 65ºC e
70ºC (Figura 16 B). Estes resultados são bastante satisfatórios, pois ambas as invertases
testadas nas temperaturas de 50ºC e 60ºC foram termoestáveis.
Em adição a forma intracelular (Figura 16 C) manteve-se ativa quando armazenada a
4ºC e a -20ºC, durante um período de até 175 horas, contudo quando mantida a 27ºC
permaneceu ativa por um período de no máximo 50 horas. Quanto à atividade invertásica
extracelular (Figura 16 D), a enzima também se manteve ativa quando armazenada em baixas
temperaturas (4ºC e -20ºC), por todo o período analisado, sendo que a 27ºC a enzima não
suportou mais que 45 horas.
87
FIGURA 16. Estabilidade térmica das invertases intracelular (A e C) e extracelular (B e D)
por A. phoenicis. Símbolos: -20ºC (▄), 4ºC (▄), 27ºC (▄), 50ºC (○), 60ºC (●), 65ºC (●) e
70ºC (○).
0 102030405060
0
20
40
60
80
100
A
Atividade invertásica relativa (%)
Tempo (minutos)
0 102030405060
0
20
40
60
80
100
120
B
Atividade invertásica relativa (%)
Tempo (minutos)
0 50 100 150 200
0
20
40
60
80
100
120
140
C
Atividade invertásica redusidual(%)
Tempo (horas)
0 50 100 150 200
0
20
40
60
80
100
120
D
Atividade invertásica residual(%)
Tempo (horas)
88
4.9 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE INVERTÁSICA
Na tabela 11 podemos observar a influência de diferentes compostos sobre a atividade
invertásica intracelular e extracelular de A. phoenicis. Quando considerada a atividade
invertásica intracelular, Mn
2+
e Cu
2+
promoveram os maiores aumentos da mesma, na ordem
de 177,83 à 104,54%, quando usados em baixas concentrações (1mM). A atividade
enzimática também foi incrementada pela presença de Ca
2+
, Mg
2+
e Na
+
, bem
como por
EDTA.
Em altas concentrações (10mM) apenas Ag
+
promoveu aumento de atividade
significativo.
Quanto à atividade invertásica extracelular (FSbm), pode-se observar que apenas Ag
+
e K
+
promoveram aumento significativo tanto em baixas como em altas concentrações. De
modo geral as maiores inibições foram observadas na presença de Hg
2+
e Fe
+
. Considerando-
se a ativação obtida na presença de Ag
+
, na figura 17 podemos observar a influência de
diferentes concentrações deste íon sobre a atividade invertásica intra e extracelular produzidas
por A. phoenicis. Os maiores níveis de atividade para ambas as formas enzimáticas foram
obtidos nas concentrações de 40 mM.
89
TABELA 11. Influência de diferentes compostos na atividade invertásica intracelular e
extracelular de A. phoenicis.
Atividade Invertásica Relativa (%)
Compostos Intracelular Extracelular
1mM 10mM 1mM 10mM
AgNO
3
94,28 ±4,31 191,56 ±5,35 118,68 ±1,07 196,26 ±1,02
AlCl
3
97,26 ±5,27 78,17 ±0,66 86,43 ±5,49 109,34 ± 3,25
BaCl
2
51,05 ±3,53 48,94 ±7,25 48,94 ±1,08 41,01 ±1,11
CaCl
2
186,09 ±2,15 37,60 ±1,28 37,60 ±2,78 30,31 ±4,83
CoCl
2
82,13 ±6,10 83,39 ±2,05 104,13 ±1,79 94,78 ±0,68
CuCl
2
204,54 ±7,83 26,20 ±4,23 26,20 ±0,55 13,88 ±3,52
CuSO
4
200,57 ±8,19 60,85 ±0,02 60,85 ±0,56 22,80 ±6,20
EDTA 189,81 ±6,10 78,02 ±0,51 78,02 ±1,15 78,98 ±1,84
FeSO
4
37,45 ±2,68 18,60 ±3,23 0,00 ±0,00 60,37 ±1,01
HgCl
2
63,61 ±5,79 4,61 ±1,95 57,96 ±5,77 0,00 ±0,00
KCl 92,80 ±0,24 86,60 ±3,79 140,58 ±4,24 132,25 ±1,46
KNO
3
103,00 ±0,01 103,00 ±0,80 108,00 ±1,22 95,00 ± 0,75
MgCl
2
193,20 ±2,97 87,25 ±5,47 87,25 ±2,18 64,84 ±1,21
MgSO
4
200,12 ± 6,46 34,40 ±6,84 34,40 ±0,94 28,91 ±6,29
MnCl
2
277,83 ±7,42 82,31 ±1,79 82,31 ±1,39 41,28 ±1,48
NaCl 200,96 ±7,80 84,68 ±6,73 84,68 ±2,24 43,82 ±5,73
NaNO
3
104,00 ±0,05 91,91 ±0,21 102,00 ±0,20 100,00 ±0,10
NH
4
Cl 85,39 ±2,23 30,10 ±1,55 30,10 ±1,17 23,56 ±0,52
ZnCl
2
86,49 ±4,24 82,38 ±1,79 99,64 ±2,00 99,34 ±0,23
Zn(No
3
)
2
83,00 ±7,64 56,00 ±4,77 85,00 ±4,80 79,00 ±2,28
ausente 100,00 ±2,18 100,00 ±2,18 100,00 ±0,08 100,00 ±0,08
O fungo foi crescido em meio Khanna com farelo de trigo como fonte de carbono, sob agitação orbital
(100 rpm) a 40ºC, por 72 horas.
90
FIGURA 17. Influência de diferentes concentrações AgNO
3
sobre a atividade invertásica
intracelular (A) e extracelular (B) produzida por A. phoenicis.
0 102030405060
100
150
200
250
300
350
A
Atividade Realativa (%)
AgNo
3
(mM)
10 20 30 40 50 60
50
75
100
125
150
B
Atividade Relativa (%)
AgNo
3
(mM)
91
4.10 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS
Na tabela 12 podemos observar que as invertases produzidas por A. phoenicis foram
capazes de hidrolisar tanto sacarose quanto inulina e rafinose.
A enzima intracelular apresentou maior atividade na hidrólise da sacarose com 34,19
U/mL, sendo que as hidrólises da inulina e rafinose foram equivalentes a 16,49% e 30,27%,
respectivamente, se comparadas à taxa de hidrólise da sacarose. A invertase extracelular
proveniente da FSbm apresentou maior atividade quando utilizada sacarose como substrato
(24,31 U/mL). Contudo, também hidrolisou os substratos inulina e rafinose, apresentando
19,66% e 32,58% da atividade observada para a hidrólise da sacarose. As enzimas também
foram capazes de hidrolisar as diferentes misturas entre os substratos. Entretanto, nenhum dos
valores encontrados nesta situação superou os valores observados para a sacarose em
separado. Adicionalmente, os valores obtidos para a razão entre a hidrólise da sacarose sobre
a hidrólise da inulina (S/I) foram de 6,17 U/mL e 5,08 U/mL para as formas intra e
extracelular.
92
TABELA 12. Hidrólise de diferentes substratos pelas invertases produzidas por A. phoenicis
em FSbm
Atividade invertásica (U/mL)
Substratos Intracelular Extracelular
Sacarose 34,19±1,66 24,31±3,66
Inulina 5,64±0,00 4,78 ±0,67
Rafinose 10,35±2,00 7,92 ± 3,66
Sacarose + Inulina 23,21±2,33 17,01±0,67
Sacarose + Rafinose 21,64±0,00 5,56±0,92
Inulina + Rafinose 9,09±1,33 7,84±0,58
Sacarose + Inulina + Rafinose 19,76±0,00 15,68±1,41
O fungo foi crescido em meio Khanna com farelo de trigo como fonte de carbono,
sob agitação orbital (100rpm) a 40ºC, por 72h.
93
4.11 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE
A análise dos produtos de hidrólise da sacarose, inulina e rafinose pela ação das
invertases intracelular e extracelular foi realizada em cromatografia de placa delgada (TLC) e
também por cromatografia líquida de alta afinidade (HPLC). Como podemos verificar na
figura 18, glicose e frutose foram obtidas como produtos de hidrólise da sacarose, mediante
análise em TLC, tanto para a ação da enzima intracelular como para a extracelular, não sendo
observada nenhuma atividade de transfructosilação uma vez que “spots” corresponde a
frutooligossacarídeos não foram observados.
Já Na figura 18 C, podemos observar claramente a formação de lactose no período de
24h de reação mediante ação enzimática da forma intracelular sobre rafinose. Já para a forma
extracelular (figura 18 D), no mesmo período de reação, verificamos “spots” correspondentes
aos produtos glicose e frutose. Entretanto, placas cromatográficas para os produtos de
hidrólise da inulina não foram obtidas satisfatoriamente.
94
FIGURA 18. Cromatografia em camada delgada dos produtos de hidrólise da sacarose (A e
B) e da rafinose (C e D) mediante ação enzimática da invertase intracelular (A e C),
extracelular (B e D). A reação foi conduzida a 60°C por diferentes períodos. Siglas: rafinose
(R), sacarose (S), glicose (G), frutose (F), galactose (Ga) e lactose (La).
A
B
4 16 24h
0
GF S
4
16
0 GF S
24h
D
R Ga La G F 0h 5h 24h R Ga La S G F 0h 5h 24h
C
0
95
Em análise feita por HPLC, os produtos de hidrólise da sacarose encontrados pela ação
da invertase extracelular bruta, como podemos observar na figura 19, foram glicose e frutose.
Entretanto, a presença de nistose também foi detectada, assinalando uma possível atividade de
transfructosilação. Contudo ao realizamos uma a mesma análise para uma reação conduzida
com a enzima purificada, apenas picos correspondentes a glicose e frutose foram obtidos, não
havendo nenhum sinal correspondente ao oligossacarídeo.
Na análise feita por HPLC, os produtos de hidrólise da rafinose encontrados pela ação
catalítica da invertase intracelular foram frutose, galactose e lactose como podemos observar
na figura 20 B. Contudo, ao realizar uma a mesma análise para uma reação utilizando a forma
extracelular, os produtos formados foram frutose, galactose, lactose e sacarose (Figura 20 C).
96
02468101214
0,0
0,1
0,2
0,3
s
ac
a
rose
Volts
Tempo de retenção(Minutos)
02468101214
0,0
0,1
0,2
0,3
frutose
glicose
Volts
Tempo de retenção (Minutos)
02468101214
0,0
0,1
0,2
0,3
nisto
s
e
sac
a
rose
f
r
utos
e
g
l
i
co
s
e
Volts
Tempo de retençao (Minutos)
FIGURA 19. Perfil cromatográfico em HPLC dos produtos de hidrólise da sacarose (20%)
obtidos pela ação enzimática da forma extracelular. A reação foi conduzida a 60ºC por 24
horas. (A) mistura de reação adicionada de enzima inativa, (B) e (C) mistura de reação com
enzima ativa bruta e purificada, respectivamente.
A
C
B
97
0 2 4 6 8 10 12 14
0,00
0,01
0,02
0,03
rafinose
Volts
Tempo de rentenção (Minutos)
02468101214
0,00
0,01
0,02
0,03
rafinose
lactose
sacarose
glicose
galactose
frutose
Volts
Tempo de retenção (Minutos)
02468101214
0,00
0,01
0,02
0,03
rafinose
lactose
galactose
frutose
Volts
Tempo de renteção (Minutos)
FIGURA 20. Perfil cromatográfico em HPLC dos produtos de hidrólise da rafinose (1%) pela
ação das invertases purificadas. A reação foi conduzida por 24 horas a 60°C. Controle (A),
intracelular (B) e extracelular (C).
A
B
C
98
4.12 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Kd E Vmax
A determinação dos parâmetros cinéticos das invertases produzidas em FSbm e
purificadas foram realizadas utilizando sacarose (0,1mM a 300mM) como substrato e
adicionadas de 1mM de AgNO
3
, ou não. Ambas as formas enzimáticas apresentaram
comportamento alostérico como pode ser visualizado através das representações gráficas
sigmoidais (Figuras 21). Como pode ser observado na tabela 13, a invertase intracelular teve
Vmax= 124,90 U/mg e Kd= 22,55 mM ao passo que a invertase extracelular teve Vmax=
954,60 U/mg e Kd= 59,89 mM, ambas na ausência de Ag
+
. Quando utilizado 1mM de
AgNO
3
na reação os valores de Vmax e Kd para a forma intra e extracelular foram de 152,00
U/mg e Kd = 70,80 mM e 1.234,00 U/mg e Kd = 29,21 mM, respectivamente.
TABELA 13. Parâmetros cinéticos das invertases produzidas por A. phoenicis.
Intracelular Extracelular
Parâmetros -Ag
+
Ag
+
-Ag
+
Ag
+
Vmax (U/mg) 124,90 152,00 954,60 1.234,0
Kd (mM) 22,55 70,80 59,89 29,21
Vmax/Kd (U/mg mM
-1
) 5,00 2,00 16,00 42,00
n 0,69 0,87 0,86 1,10
Os valores expressos referen-se as médias de 3 experimentos independestes
99
FIGURA 21. Representação gráfica sigmoidal para invertase intracelular (A e C) e
extracelular (B e D) na ausência (A e B) e na presença de AgNO
3
(C e D).
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0, 0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1, 0
D
V/Vmax
Log sacarose (mM)
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0, 0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
A
V / Vmax
Log sacarose ( mM )
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0, 0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1, 0
B
V / Vmax
Log sacarose (mM)
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
-0,1
0, 0
0, 1
0, 2
0, 3
0, 4
0, 5
0, 6
0, 7
0, 8
C
V/Vmax
Log sacarose (mM)
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
2
4
6
8
A
Frações do gel (0,5 cm)
pH
0, 0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1, 0
1, 2
1, 4
1, 6
1, 8
2, 0
DO 540 nm
0 2 4 6 8 1012141618202224
4
6
8
Frações do gel (0,5cm)
pH
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
B
DO 540 nM
4.13 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO
O ponto isoelétrico das invertases intra e extracelular foi determinado por focalização
isoelétrica em gel de poliacrilamida, conforme descrito no item 3.19.
Na figura 22, podemos observar que o ponto isoelétrico para as formas intracelular e
extracelular foram 4,40 e 4,33, respectivamente.
FIGURA 22. Determinação do ponto isoelétrico das invertases intracelular (A) e extracelular
(B) produzidas por A. phoenicis.
4.14 ANÁLISE DOS FRAGMENTOS TRIPÍCOS DA INVERTASE EXTRACELULAR
A análise dos fragmentos peptídicos da invertase extracelular produzida por A. phoenicis
gerados pela digestão com tripsina foi realizada por espectrometria de massa, como pode ser
verificado na figura 23, obtendo-se desta forma 6 peptídeos, dos quais foi possível a dedução
em composição de aminoácidos de apenas 3 peptídeos (P1,P2 e P3), para os quais são
apresentados os fingerprints e os respectivos resíduos de aminoácidos (figuras 24, 25 e 26).
As sequências de aminoácidos obtidos para os fragmentos foram comparadas com sequências
101
disponíveis em banco de dados. De forma geral, os fragmentos analisados foram homólogos a
β-xylanases e glucoamilases de diferentes fungos, como Aspergillus e Penicillium como
observado na tabela 14.
FIGURA 23. Fingerprint de massa dos peptídeos tripíticos da invertase extracelular
purificada de A. phoenicis.
102
FIGURA 24. Determinação dos resíduos de aminoácidos por espectrometria de massa de um
dos peptídeos tripíticos (P1) obtidos para a invertase extracelular de A. phoenicis.
103
FIGURA 25. Determinação dos resíduos de aminoácidos por espectrometria de massa de um
dos peptídeos tripíticos (P2) obtidos para a invertase extracelular de A. phoenicis.
104
FIGURA 26. Determinação dos resíduos de aminoácidos por espectrometria de massa de um
dos peptídeos tripíticos (P3) obtidos para a invertase extracelular de A. phoenicis.
105
Contudo, um alinhamento parcial foi obtido também entre os peptídeos obtidos para a
enzima de A. phoenicis e a invertase extracelular de A. niger (Figura 27).
(ATLDSWLSNEATVAR)
MKLQTASVLLGSAAAASPSMQTRASVVIDYNVAPPNLSTLPNGSLFETWRPRAHVLPPNG
-------------------------------------------ATLDSW------LSNEA 11
: :::* *. :.
QIGDPCLHYTDPSTGLFHVGFLHDGSGISSATTDDLATYKDLNQGNQVIVPGGINDPVAV
TVAR--------------------------------------------------------
:.
(AWFAVDGYGDVPSK)
YWEFLGQWWHEPTNSTWGNGTWAGRWAFNFETGNVFSLDEYGYNPHGQIFSTIGTEGSDQ 300
---------------AW------------------FAVDGYG----------------D- 10
:* *::* ** *
PVVPQLTSIHDMLWVSGNVSRNGSVSFTPNMAGFLDWGFSSYAAAGKVLPSTSLPSTKSG 360
--VP---------------SK--------------------------------------- 14
** *:
( LYINDYNLDSASYAK)
SAEAGKLRLFDVLNGGEQAIETLDLTLVVDNSVLEIYANGRFALSTWVRSWYANSTNISF 600
-----------------------------------LYIN-DYNLDS---ASYAK------ 15
:* * : *.: : **:
FQNGVGGVAFSNVTVSEGLYDAWPDRQS 628
----------------------------
FIGURA 27. Alinhamentos com invertase extracelular de A. niger e os fragmentos P1, P2 e
P3 obtidos para a invertase extracelular de A. niger.
15
60
120
106
TABELA 14. Homologia entre invertase extracelular de A. phoenicis e outras enzimas
microbianas.
Obs: abreviações (DB:ID) identificação das enzimas em banco de dados, (Tam.)
tamanho, (Ident.) identidade, (Simil.) similaridade.
DB:ID
Fonte Tam.
Ident. Simil.
107
109
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Os fungos, de um modo especial têm se tornado muito interessantes como fontes de
biomoléculas para os processos biotecnológicos, pois têm grande capacidade de produzir
enzimas, além de servir de modelo para estudo do metabolismo em eucariotos. Sabe-se que
são poucos os estudos e registros na literatura referentes aos fungos do Estado de São Paulo.
Aproveitando a diversidade de fungos filamentosos que nosso laboratório coletou em várias
regiões deste Estado, o fungo termotolerante A. phoenicis, selecionado entre outros, foi um
bom produtor de invertases. A maior atividade invertásica intracelular foi obtida quando o
fungo foi crescido em meio Vogel a 40ºC mantido em condição estacionária, em comparação
com a extracelular, para a qual os melhores resultados foram obtidos em meio Khanna,
mantido em agitação a 40ºC ambos por 72h. Considerando a produção enzimática total
(intracelular e extracelular) em condição estacionária e sob agitação, as maiores atividades
invertásicas foram obtidas nos meios Vogel e Khanna, respectivamente. Silva & Peralta
(1988), o meio Khanna também favoreceu a produção de invertase para A. ochraceus
(GUIMARÃES et al., 2007) e A. niveus (GUIMARÃES et al., 2009). Observaram que o meio
Vogel favoreceu a produção de amilases por A. fumigatus (SILVA et al., 1988). Entretanto,
considerando – se a produção invertásica extracelular, foi padronizada a utilização do meio
Khanna sob agitação para continuidade dos estudos, uma vez que este favoreceu a secreção da
invertase para o meio de cultivo. Já para fermentação em substrato sólido a maior atividade
invertásica foi obtida quando utilizado farelo de soja como substrato umedecido com água de
torneira (1:0,5 m/v) e crescido em estufa a 40º C, com umidade relativa ao redor de 76%, por
72h. Água de torneira provavelmente apresenta alguns compostos que supriram alguma
necessidade nutricional do microrganismo favorecendo seu metabolismo e conseqüentemente
a produção enzimática.
110
Muitos elementos e fatores afetam o desenvolvimento do microrganismo e
consequentemente a produção de uma determinada enzima. Alguns parâmetros poderiam ser
citados como a composição do meio de cultivo, o pH, a temperatura, as fontes de carbono,
nitrogênio e fósforo, entre outros. Foi relatado que as fontes de carbono e de nitrogênio
interferem na produção e na secreção de amilases (CEREIA et al., 2000), invertases (SHAFIQ
et al.,2002) e de outras enzimas. Desta forma, considerando-se a fonte de carbono utilizada os
maiores níveis de atividade invertásica intracelular foram encontrados para o meio contendo
rafinose sendo seguido pelo meio com farelo de trigo. A atividade invertásica extracelular em
FSbm foi maior quando o meio foi suplementado com farelo de trigo como fonte de carbono,
diferindo do verificado para a invertase extracelular produzida em FSS, com maior atividade
obtida em uma mistura de farelo de soja e farelo de trigo. Para o fungo Alternaria sp. a
melhor condição para produção de invertase foi obtida quando utilizada a FSS com farelo de
trigo como fonte de carbono (SANGALETTI et al., 2003). Algumas fontes de carbono
utilizadas são resíduos agroindustriais e estes vem recebendo grande atenção no meio
científico e industrial. Estes resíduos geralmente não têm destino certo para serem
desprezados e acabam poluindo o meio ambiente, já que pode apresentar metais pesados.
Interessantemente alguns destes resíduos, principalmente os proveniente de vegetais,
apresentam grandes vantagens quando utilizados para o cultivo de microrganismos como por
exemplo: reduzir os custos de produção, favorecer o crescimento do microrganismo e a
produção de enzimas. Os resíduos são constituídos de vários nutrientes importantes como
carboidratos, lipídios, alguns minerais e vitaminas. A farinha de mandioca, soro de queijo,
melaço de cana, farinha de trigo e palha de milho são exemplos de resíduos agroindustriais ou
subprodutos facilmente disponíveis no Brasil favorecendo o seu uso (NITSCHKE et al.,
2004).
111
Entre os diferentes açúcares adicionados ao meio de cultivo para o crescimento de
Rhodotorula glutinis sacarose e a rafinose favoreceram a produção de invertases (RUBIO et
al., 2002). Resultados semelhantes foram obtidos com A. niger (RUBIO et al., 1997) e para a
produção de invertases por A. phoenicis. Ao se cultivar o microrganismo T. lanuginosus em
meio adicionado de sacarose como fonte de carbono, Chaudhuri et al. (1999) observaram um
crescimento mediano diferindo do observado por nós para A. phoenicis, para o qual o
crescimento foi considerado alto.
Organismos vivos, em presença de glicose, podem sofrer repressão catabólica da
síntese de enzimas (regulação negativa) (LEHNINGER et al., 2000). Verificamos que a
produção invertásica intracelular e extracelular não foi estimulada pela presença de glicose
adicionada ao meio de cultura e sim inibida à medida que se aumentou a concentração de
glicose adicionada. O mesmo fenômeno de repressão ocorreu para as invertases de R. glutinis
(Rubio et al., 2002) e A. ochraceus (Guimarães et al., 2007).
Considerando os cultivos microbianos, cada microrganismo apresenta seu melhor
tempo de crescimento e produção enzimática como, por exemplo, T. lanuginosus, com
produção invertásica máxima no período de 6 a 12 horas (CHAUDHURI et al., 1999). Já A.
phoenicis apresentou maior produtividade invertásica intracelular em 24 horas, sendo o
mesmo também observado para A. niger AS0023 (L’ HOCINE et al., 2000) e diferindo de R.
glutinis, com produção máxima em 36 horas (RUBIO et al., 2002). A maior produção da
forma extracelular em FSbm e FSS foi obtida em 72 horas, padronizando-se este tempo para
os demais experimentos. O tempo de incubação de um microrganismo influência muito a
produção enzimática, uma vez que a incubação por um período breve pode não resultar na
produção máxima da enzima, já que o microrganismo encontra-se na fase de crescimento
vegetativo. Em adição, o crescimento da cultura por um período longo pode levar a exaustão
112
dos nutrientes, conduzindo a um declínio no crescimento e na produção enzimática
(PELCZAR et al., 1996).
O crescimento microbiano divide-se em quatro fases, sendo elas, a fase de adaptação
do microrganismo ao meio de cultivo (fase LAG), uma fase caracterizada por um crescimento
rápido e uniforme (fase LOG), a qual o microrganismo já adaptado ao meio utiliza-se de todos
os recursos oferecidos por este para o seu desenvolvimento, uma fase estacionária na qual o
crescimento do microrganismo é interrompido pela escassez nutricional do meio e uma fase
de declínio, onde o meio não tem mais nutrientes e também apresenta uma série de compostos
do metabolismo do próprio microrganismo, os quais são responsáveis pela lise das hifas e
conseqüentemente mortes celulares (ESPOSITO et al., 2004).
A adição de compostos nitrogenados bem como os ricos em fosfato pode influenciar a
produção enzimática e o crescimento, como observada por Shafiq et al., (2002) em estudos
realizados com Saccharomyces ceresiae GCB-K5, para a qual o meio de cultivo
suplementado com peptona em
concentrações de 0,3 a 0,6 % favoreceu uma maior produção
de invertase. Resultado semelhante foi por nós obtido com A. phoenicis, sendo que neste caso
a produção foi também favorecida por sulfato de amônio. Ainda no mesmo estudo realizado
por Shafiq et al. (2002), foi relatado que a utilização de KH
2
PO
4
em
concentrações crescentes
promove o declínio da produção de invertases por Saccharomyces ceresiae GCB-K5. Esta
resposta também foi por nós observada para a produção desta enzima por A. phoenicis.
Quando cultivos em substrato sólido são analisados, a disponibilidades de água no
meio exerce grande influência no desenvolvimento microbiano e consequentemente na
produção enzimática. Neste caso, constatamos que quanto maior a umidade do meio, menor é
a produção invertásica, sendo que à proporção que mais favoreceu a produção da enzima foi
1:0,5 (m/v). Segundo Pérez-Guerra et al. (2003) a produção de algumas enzimas é favorecida
com a baixa umidade do meio, considerando-se que a FSS com baixa umidade se assemelha
113
muito às condições reais encontradas pelos microrganismos quando expostos ao meio
ambiente natural. Em adição meios de cultivo com baixa umidade dificilmente são
contaminados por bactérias, além dos rendimentos serem semelhantes ou mais altos que os
obtidos em FSbm, geralmente os meios são simples e o substrato utilizado normalmente
contém todos os nutrientes necessários para crescimento do microrganismo e estas vantagens
têm chamado a atenção, sendo uma outra opção para processos fermentativos que não a
FSbm. Porém, algumas desvantagens devem ser consideradas quando comparada a FSbm,
como por exemplo, a utilização somente de microrganismos que conseguem crescer em meios
com baixa umidade, bem como o pré-tratamento dos substratos como a redução de tamanho
ou mudança física . Além disso problemas para monitoramento de alguns parâmetros físico-
químicos podem ocorrer, além da dificuldade de se determinar a biomassa (PÉREZ-
GUERRA et al., 2003).
Tendo-se otimizado as condições ideais para a produção de invertases por A.
phoenicis, as enzimas intra e extracelular obtidas de FSbm foram purificadas até a
homogeneidade eletroforética evidenciado pela análise do perfil eletroforético (PAGE 7%),
no qual mobilidades relativamente semelhantes foram observadas tanto para o gel corado por
prata como para atividade invertásica, para ambas as formas enzimáticas, ou seja, para cada
banda protéica revelada por prata correspondeu uma única banda de atividade.
Os processos utilizados neste trabalho foram semelhantes aos empregados por Ettalibi
et al. (1987), Liu et al. (2006) e Álvaro-Benito et al. (2007). Ambas as formas enzimáticas
intra e extracelular, são glicoproteínas com massa molecular nativa de 131 kDa e a 155 kDa,
respectivamente, estimada por filtração em gel e subunidades de 70 kDa e 79 kDa, estimada
por SDS-PAGE 7%. Desta forma, podemos dizer que ambas as enzimas são homodímeros
semelhantes a β-D-frutofuranosidases homodiméricas observadas para A. ochaceus, com
massa molecular de 135 kDa e subunidades de 79 kDa (GUIMARÃES et al., 2007), bem
114
como descrito por Rubio et al. (2002) para a invertase produzida por R. glutinis com massa
molecular de 100 kDa e subunidade de 47 kDa. Já para a invertase produzida por A. ficuum a
massa molecular foi de 80 kDa (ETTALIBI et al., 1987), semelhante a massa molecular
relatada para a enzima obtida de pêra que foi de 80 kDa, sendo ambas monoméricas
(Hashizume et al.,2003).
O conteúdo de carboidratos foi de 2,14% e 1,64%, para as invertases intra e
extracelular produzidas por A. phoenicis. Porém, tais valores obtidos foram menores do que
os obtidos para as invertases produzidas por Aspegillus niger (NGUYEN et al., 2005),
Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Aspergillus ficuum (ETTALIBI et al., 1987) e A.
niveus (GUIMARÃES et al., 2009). Já a temperatura ótima de atividade obtida para a
invertase extracelular produzida em FSS por A. phoenicis foi igual às temperaturas
observadas para Aspegillus sp. 27H (SU et al., 1991) e Aspergillus niger AS0023
(L´HOCINE et al., 2000), que apresentaram temperatura ótima de 55°C. Já as invertases
produzidas por A. phoenicis em FSbm apresentaram temperaturas de atividade superiores a
citada anteriormente e semelhante a observada para a invertase de R. glutinis (RUBIO et al.,
2002) que foi de 60°C. Já as enzimas dos microrganismos Saccharomyces ceresiae GCB-K5
(SHAFIQ et al., 2002) e Cyanobacteria (VARGAS et al., 2003) apresentaram temperaturas
ótimas inferiores as observadas por nós para as invertases produzidas por A. phoenicis.
Em adição, a invertase intracelular produzida por A. phoenicis em FSbm foi estável a
50ºC e a 60ºC por uma hora com meia vida de 9 minutos a 65ºC. O mesmo foi verificado para
a forma extracelular. No entanto, comparando a forma extracelular produzida em FSS com as
obtidas em FSbm, observou-se menor estabilidade na temperatura de 60ºC. Segundo
Sangaletti et al. (2003), a invertase produzida por Alternaria sp. quando incubada a 50ºC
reteve 50% de sua atividade após 120 minutos de tratamento. Yoshikawa et al. (2007)
relataram que a invertase produzida por Aureobasidium pullulans DSM 2404, se manteve
115
estável por uma hora na temperatura de 45ºC. Já a invertase produzida por Rhodotorula
glutinis apresentou meia vida de 3 minutos quando incubada a 60ºC (DELAVEGA et al.,
1991). Desta forma as enzimas produzidas por A. phoenicis foram mais termoestáveis que as
citadas anteriormente. Estes resultados por nós obtidos são relevantes mostrando que as
invertases produzidas por A. phoenicis têm grande potencial para análises bioquímicas
comparativas, estudos fisiológicos e também aplicação biotecnológica.
Dentro de um processo biotecnológico empregando-se enzimas muitos cuidados
devem ser tomados para se obter o melhor resultado no final do processo. Cuidados estes que
vão desde a escolha do fermentador para a produção da enzima até a melhor forma de
armazenamento. Neste contexto, as enzimas intracelular e extracelular produzidas por A.
phoenicis mantiveram-se ativas por longos períodos quando armazenadas a 4ºC e -20ºC.
Entretanto quando mantidas a 27ºC permaneceram ativas por um período de 45-50 horas.
Somente ressaltando-se a importância da temperatura na conservação estrutural da enzima,
segundo Lehninger et al. (2000), alterações bruscas na temperatura interferem nas interações
fracas das enzimas gerando um processo de desnovelamento, ocorrendo perda da capacidade
de hidrolisar o substrato. Desta forma as baixas temperaturas podem previnir a alteração
estrutural da enzima, a qual levaria a perda da atividade. Portanto, recomendamos para
transporte ou armazenamento que as invertases de A. phoenicis sejam mantidas em baixas
temperaturas, preservando-se assim sua viabilidade por mais tempo.
Os valores de pH ótimo de atividade para as invertases produzidas por A. phoenicis
foram coincidentes com aqueles relatados na literatura para outros microrganismos. Em A.
niger AS0023 a atividade invertásica máxima ocorreu em pH 4,4, diminuindo bruscamente
acima do pH 5,0, chegando praticamente a zero em pH 7,0 (L’ HOCINE et al., 2000), sendo o
mesmo observado para as enzimas de A. phoenicis. As enzimas dos microrganismos
Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Saccharomyces ceresiae GCB-K5 (SHAFIQ et
116
al., 2002) e Cyanobacteria (VARGAS et al., 2003) apresentaram uma faixa de pH ótimo que
variou de 4,0 a 6,0. Já a invertase secretada por Aureobasidium pullulans DSM 2404
apresentou pH ótimo de 5,0, diferindo do resultado encontrado por L’Hocine et al. (2000).
Chavéz et al. (1997) obtiveram resultados parecidos ao do nosso trabalho, onde a invertase de
Candida utilis apresentou pH ótimo de 5,5. Wallis et al. (1997), observaram a atividade
invertásica em uma grande faixa de pH que compreende do pH 4,5 ao 9,0, com máxima
atividade em pH 6,0, para a enzima de Aspergillus niger.
No que se refere à estabilidade ao pH a forma intracelular manteve-se estável por uma
hora em uma faixa de pH de 3,5 a 7,0, ao passo que a invertase extracelular, na faixa de pH
3,5 a 8,0. Comportamento semelhante ao da invertase extracelular produzida em FSbm foi
observado para a invertase extracelular obtida em FSS. Rubio et al. (2002), obtiveram
resultados semelhantes para as invertases produzidas por Rhodotorula glutinis, a qual
manteve 90% de sua atividade em pH 6,0 por 30 minutos. Porém à invertase secretada por
Aureobasidium pullulans DSM 2404, foi estável em uma faixa de pH 6,0 a 10,0 por até 1
hora, sendo o mesmo observado para a invertase de Aspergillus niger ATCC 20611
(YOSHIKAWA et al., 2007). Já a invertase de Candida utilis foi estável em uma faixa que
compreende do pH 3,0 ao pH 6,0 (CHAVÉZ et al., 1997). A estabilidade máxima para
invertase de Alternaria sp. foi em pH 6,0 após 3 horas de tratamento a 50 ºC. Em pH 5,0 a
enzima manteve 81% de sua atividade. Em pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0 a enzima não foi
estável (SANGALETTI et al., 2003).
Ao longo da história os íons são onipresentes. Eles desempenham um importante papel
nas propriedades da água do mar, formam sais sólido, que estão presentes em todos os
organismos vivos, influenciam os processos industriais e a sua presença em soluções tem
grande efeito sobre as propriedades dos sistemas biológicos, como em células vivas ou tecidos
biológicos, para se ter uma idéia de tal envolvimento, a adição de uma pequena quantidade de
117
íons em água aumenta sua condutividade por várias ordens de grandeza. Para as enzimas uma
pequena mudança no pH do meio onde se encontram adição de íons que gera alterações
cinéticas, além de alterar sua estrutura terciária para uma forma mais ativa ou inativa. Ainda
podem interferir na solubilidade levando a precipitação da enzima, podendo inclusive
modificar a carga elétrica global desta molécula. (KUNZ 2006). Assim as invertases
produzidas por A. phoenicis foram ativadas, de forma geral por Ag
+
e
Mn
2+
e inibidas
severamente pelo íon Hg
2+
. A inibição por Hg
+
sugere a presença de grupos thiol no sítio
catalítico os quais são importantes para a atividade da invertase, como citado no trabalho de
Guimarães et al. (2009). Entretanto, Hg
2+
não afetou a atividade invertásica em R. glutinis,
diferindo do resultado encontrado por nós para A. phoenicis.
Rubio et al. (2002) ao testar a influência de íons metálicos na atividade invertásica de
Rhodotorula glutinis, verificaram um aumento da atividade enzimática na presença de Ca
2+
,
Mg
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Na
+
, Cu
2+
e K
+
. Guimarães et al. (2007), verificaram que os íons Mn
2+
,
Mg
2+
e Na
+
, elevaram a atividade invertásica da enzima produzida por Aspergillus ochraceus.
Invertases de Fusarium solani (BHATTI et al.,2006), R. glutinis (RUBIO et al., 2002), A.
niger (RUBIO & MALDONADO, 1995) e S. cerevisiae (HOSHINO & MAMOSE, 1966)
também foram ativadas por Mg
+2
e Na
+
. A inibição da atividade invertásica por íons metálicos
foi relatada para as enzimas de A. japonicus (HAYASHI et al., 1992) e de A. chroococcum
(DELAVEGA et al., 1991). Já o EDTA que é um agente quelante, não exerceu nenhuma
influência na atividade invertásica mostrando que os íons metálicos não são essenciais para
atividade enzimática segundo trabalho de Guimarães et al. (2009).
Geralmente os íons prata se ligam em grupos SH levando a uma alteração
conformacional da enzima ou alterando sua carga elétrica total, o que na maioria das vezes
leva a inibição da atividade enzimática, o que não aconteceu com as enzimas de A. phoenicis
estudadas. De forma geral os íons ou compostos podem afetar alguns resíduos de aminoácidos
118
localizados no sítio ativo da enzima ou na superfície externa da enzima alterando o sítio
catalítico ou distorcendo sua estrutura. Porém os efeitos de íons metálicos na atividade
enzimática podem ser pertinentes ao considerarmos o uso de matéria-prima com alto conteúdo
de sal (BHATTI et al., 2006). Pelo verificado até o momento na literatura, as invertases de A.
phoenicis parecem ser as únicas ativadas por Ag
+
, o que nos leva a sugerir um novo grupo de
invertases.
No que se refere à especificidade ao substrato as invertases produzidas por A.
phoenicis foram capazes de hidrolisar sacarose, inulina e rafinose, apresentando
provavelmente o mesmo sítio catalítico para todos os três substratos, uma vez que os valores
de atividade encontrados para a associação de substratos dois a dois foram intermediários aos
dos valores encontrados para a hidrólise dos substratos em separado, além de não
corresponder aos valores hipotéticos da soma destas hidrólises. Contudo as enzimas
apresentaram maior atividade na hidrólise da sacarose. Atualmente há uma discussão no que
se refere a definição de uma invertase e uma inulinase, de forma que há na literatura uma
relação entre especificidade para os substratos que ajuda a diferenciar tais enzimas. A relação
é definida como o quociente S/I, ou seja hidrólise da sacarose sobre a da inulina. Se o
resultado desta relação for maior que 50 tem-se invertase (ROUWENHORST et al., 1988).
Segundo Rouwenhorst et al. (1988) apesar da relação S/I ser utilizada para diferenciar
invertase e inulinase, ela deve ser analisada com cuidado, pois esta relação é influenciada pela
origem da inulina utilizada e pela concentração do substrato. Também deve ser considerado a
dependência da atividade que está diretamente relacionada com o pH e a temperatura. O valor
da relação encontrada para invertases produzida por A. phoenicis foi em média 5,6. Para um
melhor esclarecimento deste aspecto, a análise da eficiência catalítica para ambos as
substratos seria fundamental. No entanto dados cinéticos para a hidrólise da inulina não foram
obtidos satisfatoriamente.
119
Segundo Sturm et al., (1999) a invertases ácidas de plantas hidrolisaram sacarose e
outros oligossacarídeos constituídos de resíduos β–frutose, como rafinose e estaquiose. Rubio
et al. (2002) mostraram que a enzima de R. glutinis hidrolisou sacarose e rafinose, mas não
inulina. É interessante relatar que a capacidade que as invertases apresentam ao hidrolisar os
substratos sacarose e rafinose indica que esta enzima atua-nos β-D- fructofuranosídeos
terminais da frutose (GUIMARÃES et al., 2007). Os trabalhos de Guimarães et al. (2007),
Guimarães et al. (2009) e Ettalibi & Baratti (1987) relatam que as invertases produzidas pelos
microrganismos Aspergillus ochraceus, Aspergillus niveus e Aspergillus ficuum também
hidrolisaram o substrato inulina, como também observado por nós para a enzima produzida
por A. phoenicis.
A cromatografia de placa delgada e em HPLC foram utilizados para analisar os
produtos de hidrólise da sacarose, inulina e rafinose pela ação das invertases produzidas por
A. phoenicis. Glicose e frutose foram observadas como produtos de hidrólise da sacarose pela
ação das enzimas purificadas mediante análise em TLC e em HPLC não caracterizando-se
nenhuma atividade de transfructosilação. Entratanto, quando utilizada amostra enzimática
extracelular bruta, o frutooligossacarídeo nistose, foi também detectado.
Resultados semelhantes foram encontrados nos trabalhos de Nguyen et al.(1999) para
A. niger IMI 303386 e por Fernández et al. (2004) para Aspergillus sp. 27H. Já ao realizar o
mesmo experimento utilizando amostra enzimática pura, observamos apenas a presença de
glicose e frutose. Desta forma, podemos considerar algumas possibilidades: i) possivelmente
na amostra bruta extracelular tenha outra enzima com atividade de transfructosilação ou, ii) a
presença de cofatores que permitem a atividade de transfructosilação pela própria invertase
perdidos durante o processo de purificação e iii) a presença do frutoologossacarídeos no
extrato bruto empregado, o qual foi detectado.
120
Já para análise dos produtos de hidrólise da rafinose podemos observar claramente a
presença de galactose, lactose, glicose e frutose, confirmando que as invertases produzidas
por A. phoenicis realmente hidrolisam estes substratos como já foi relatado nos trabalhos de
Nguyen et al.(1999) para a invertase de A. Niger IMI 303386, de Rubio et al. (2002) para a
enzima de R. glutinis e de Guimarães et al. (2007) para a invertase de Aspergillus ochraceus.
No entanto, resultados satisfatórios pra a hidrólise da inulina não foram obtidos.
A análise dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da sacarose na presença e ausência
Ag
+
apresentou características interessantes. Os valores de Vmax na ausência de Ag
+
(124,90
U/mg e 954,6 U/mg, intra e extracelular, respectivamente ) foram menores do que os valores
obtidos na presença de Ag
+
, com Vmax de 152,00 U/mg prot e 1.234 U/mg prot. Quanto ao
valor de Kd, este foi maior para a enzima intra e menor para extracelular na presença de Ag
+
,
(70,80 mM e 29,21 mM). Desta forma, a adição de prata além de promover o aumento da
Vmax também aumentou a afinidade pelo substrato para a forma extracelular. Em adição os
valores do coeficiente de Hill obtidos ficaram entre 0,69 e 1,1. Quando o valor deste
coeficiente é superior a 1,0 tem-se cooperatividade positiva e para valores inferiores,
cooperativade negativa. A afinidade de invertases produzidas por diferentes fontes pelo
substrato é muito diversificada, sendo que os valore de Kd encontrados para as invertases
produzidas por A. phoenicis quando usado sacarose como substrato, foram maiores que os
encontrados para a invertase de Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Saccharomyces
cerevisiae (TUBITAK et al., 2004), Schwanniomyces occidentalis (ÁLVARO-BEMITO et
al., 2007), Aspergillus ochraceus (GUIMARÃES et al., 2007), A. niveus (GUIMARÃES et
al., 2009), e Bambusa edulis (LIU et al., 2006). Porém, os valores por nós encontrados foram
menores que os observados para as invertases produzidas por A. niger (RUBIO &
MALDONADO et al., 1995) e por Aureobasidium pullulans (YOSHIKAWA et al., 2006),
tendo assim maior afinidade pelo substrato que os dois últimos trabalhos citados.
121
Um parâmetro bioquímico muito importante ivestigado foi a focalisação isolétrica que
para a invertase intracelular e extracelular foi de 4,40 e 4,33, respectivamente. Valores
próximos a estes foram relatados no trabalho Nguyen et al. (2005) para β-fructofuranosidase
produzida por A. niger IMI303386. Porém o pI da invertase ácida produzida por Bambusa
edulis (LIU et al., 2006) foi de 7,4. Segundo Spencer et al. (1988), a maioria das invertases
ácida apresenta pI na faixa de 3,2 a 8,7. Logo as invertase produzidas por A. phoenicis
apresentam pI nesta faixa.
Segundo o trabalho de Naumoff (2001), as invertases fazem parte da superfamília das
β-Fructosidades e esta apresenta homologia com β-xylosidades e α-L- Arabinases. Estas
enzimas pertencem às famílias GH 32, GH 43 e GH 62, respectivamente, sendo consideradas
homólogas, pois apresentam diversas regiões comuns conservadas. Todas as três famílias têm
o mesmo mecanismo molecular de reação de hidrólise que é um duplo deslocamento com
retenção completa da configuração anomérica do resíduo β-D-fructofuranosyl no caos das
invertases. Proteínas de diferentes famílias foram estudadas considerando um agrupamento
hidrofóbico com resíduos de aminoácidos conservados (V, I, L, F, M, W, e Y), revelando 3
cadeias β homólogas em todas as famílias (GH32, GH43, GH62, GH68 e ORFS). Além
disso, todas as proteínas desta superfamília têm um trio de ácido carboxílico no sítio ativo
(NAUMOFF, 2001).
Desta forma, até o presente momento com base nos resultados obtidos para os 3
fragmentos peptídicos analisados, em comparação com as dados disponíveis no banco de
dados podemos afirmar que a enzima extracelular de A. phoenicis faz parte da grande família
das β-Fructosidades homólogas com β-xilosidades e α-L- Arabinases, com certo grau de
homologia com a invertase extracelular de A. niger. Contudo, para uma conclusão definitiva,
novas análises serão necessárias.
122
Assim sendo, podemos concluir que o fungo filamentoso A. phoenicis foi um bom
produtor de invertases termoestáveis com elevada temperatura de atividade que apresentam
características bioquímicas diferentes das observadas para as enzimas de outros organismos,
como por exemplo, ativação por Ag
+
.
Tal característica associada ao aumento da afinidade
por sacarose
na presença de Ag
+
nos permite supor a existência de um novo grupo de
invertases, o que de certaforma, é reforçado pelos dados de alinhamento, uma vez que
nenhuma homologia significativa com outras invertase foi obtida. No entanto com relação a
outros parâmetros bioquímicos como pH e temperatura ótima, ponto isoelétrico e hidrólise de
substrato, as invertases A. phoenicis se assemelham a outras invertases já descritas em
alguns aspectos, suplantando as em outros, o que nos permite especular um possível potencial
biotecnológico.
123
125
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