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THAÍS NICHIKUMA HARADA
CORRELAÇÃO ENTRE OS ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE EM
ARTEMIA SALINA LEACH E ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA SOBRE
LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS PARA ALGUMAS CLASSES
DE PRODUTOS NATURAIS
CAMPO GRANDE
2009
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THAÍS NICHIKUMA HARADA
CORRELAÇÃO ENTRE OS ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE EM
ARTEMIA SALINA LEACH E ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA SOBRE
LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS PARA ALGUMAS CLASSES
DE PRODUTOS NATURAIS
CAMPO GRANDE
2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde e Desenvolvimento na
Região Centro-Oeste da Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, para obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof. Dr. João Máximo de Siqueira
Co-
orientador: Prof. Dr. Carlos Alexandre
Carollo
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais, pelo amor, pelo exemplo de luta, por me guiarem, me apoiarem e vibrarem
comigo a cada conquista.
AGRADECIMENTOS
- A Deus, por todos os dias.
-
Ao orientador, Prof. Dr. João Máximo de Siqueira.
- Ao co-orientador, Prof. Dr. Carlos Alexandre Carollo, por sua crença na realização do que
parecia perdido, pela ajuda, conhecimento técnico e perseverança.
- À Profª Dra. Maria de Fátima Cepa Matos, pelos ensinamentos das técnicas de cultura de
células e colaboração.
- À CAPES/Fundect, pela bolsa de Mestrado.
- À Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, através do Programa de Pós-Graduação em
Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste.
- Ao aluno de Iniciação Científica Luiz Fabrício Gardini Brandão, pelo companheirismo,
ajuda e interesse.
- Às alunas do Laboratório de Cultura de Células da Universidade Federal de Mato Grosso do
Sul, em especial à farmacêutica Danielle Bogo, pelos ensinamentos e pela amizade.
- Aos técnicos de laboratório que contribuíram e me incentivaram.
- À minha família pelo apoio e compreensão incondicionais.
- Aos amigos que torceram, incentivaram e me acompanharam.
- Ao meu namorado, pela paciência e companhia.
- A todos, que de alguma forma deixaram suas marcas.
“Uma vida transcorrida cometendo erros
não só é mais honrada, mas também
mais útil do que uma vida sem fazer
nada.”
(George Bernard Shaw)
RESUMO
Harada TN. Correlação entre os ensaios de citotoxicidade em Artemia salina Leach e
atividade antineoplásica sobre linhagens de células tumorais para algumas classes de
produtos naturais. Campo Grande; 2009. [Dissertação – Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul].
O objetivo deste estudo foi correlacionar qualitativa e quantitativamente a concentração letal
necessária para o teste citotóxico em A. salina com a concentração inibitória para o
crescimento de linhagens celulares tumorais, utilizando dez substâncias puras previamente
conhecidas. Estimativas para o ano de 2008 e válidas também para o ano de 2009, no Brasil,
apontam a ocorrência de 466.730 casos novos de câncer, perfazendo o cenário indicativo da
necessidade de descoberta de compostos que visem o tratamento dessa doença. A
biodiversidade brasileira contribui para a identificação de produtos com utilização econômica,
sendo as plantas fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos. Dentre os
bioensaios simples e rápidos para avaliar a toxicidade de produtos e extratos vegetais está o
do microcrustáceo marinho Artemia salina Leach, considerado um bioensaio preliminar no
estudo de citotoxicidade e indicativo para testes mais específicos, como o teste em linhagens
celulares de mamíferos (antitumoral). Substâncias oriundas de vegetais e pertencentes às
seguintes classes de produtos naturais foram avaliadas quanto à sua atividade citotóxica:
alcalóides, flavonóides e quinonas. Os ovos de A. salina são eclodidos em solução salina e as
larvas utilizadas em estágio náuplio nas concentrações de 250; 125; 61,5 e 31,3 µg/mL para as
dez substâncias testadas: boldina, duguetina, aloina, emodina, rutina, quercetina, lapachol, β-
lapachona, N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina. Células das linhagens Hep
2
(carcinoma de
laringe) e B16-F10 (células de melanoma) são cultivadas em placas de micropoços e a
viabilidade avaliada pelo método da coloração com sulforrodamina B após 48h de exposição
às substâncias-teste. Dentre as três classes de produtos naturais avaliadas, as quinonas
mostraram-se as mais ativas frente aos dois bioensaios, sendo a β-lapachona a substância com
a menor CI
50
para ambas as linhagens tumorais e a duguetina, um alcalóide, a mais citotóxica
em A. salina. Os resultados confirmam o bioensaio da A. salina como indicativo da atividade
antitumoral, porém não é possível estabelecer uma correlação quantitativa segura entre a DE
50
e a CI
50
dos testes.
PALAVRAS-CHAVE: atividade citotóxica, Artemia salina, ensaio antitumoral SRB,
alcalóides, flavonóides, quinonas
ABSTRACT
Harada TN. Correlation between the citotoxicity assays in Artemia salina Leach and
antineoplasic activity on tumoral cell lines for some natural products groups. Campo
Grande; 2009. [Dissertation – Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul].
The aim of this study was to correlate qualitative and quantitatively the lethal concentration
needed for the citotoxic test on Artemia salina with the inhibitory concentration for the
growth of tumoral cell lines using ten pure substances already known. Estimates for the year
2008 and also valid for the year 2009, in Brazil, show the occurrence of 466.730 new cases of
cancer. It makes necessary the development of compounds that aim the treatment of this
disease. The Brazilian biodiversity contributes with the identification of products with
economic uses and plants are the important sources of biologically active natural products.
The A. salina Leach brine shrimp assay is among the simple and fast bioassays used to
evaluate the toxicity of products and plant extracts. It is considered a preliminary bioassay in
citotoxicity studies and an indicative test for more specific ones like the bioassay with
mammalian cell lines (antitumoral). Substances extracted from plants and belonging to the
following groups of natural products were evaluated for their citotoxic activity: alkaloids,
flavonoids and quinones. The A. salina eggs are hatched in artificial seawater and used in the
nauplii stage to test ten substances in concentrations of 250, 125, 61.5 and 31.3 µg/mL:
Boldine, Duguetine, Aloin, Emodin, Rutin, Quercetin, Lapachol, β-Lapachone, N-
Nitrosoanonaine e N-Nitrosoxylopine. Hep
2
(larynx carcinom) and B16-F10 (murine
melanoma) cell lines are cultivated in 96-well plates and the viability evaluated with the
sulforhodamine B stain method after 48 hours of exposure to the tested substances. The
quinones were the most active among the three natural products classes evaluated in both
bioassays, A. salina and antitumoral. β-Lapachone was the substance with lower IC
50
for both
tumoral cell lines and Duguetine, an alkaloid, the most citotoxic to A. salina. The results
confirm the A. salina bioassay as an indicative of antitumoral activity although it is not
possible to establish a secure quantitative correlation between ED
50
and IC
50
from these tests.
KEY WORDS: citotoxic activity, Artemia salina, SRB assay, alkaloids, flavonoids, quinones
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dose efetiva (DE
50
) de dez substâncias e dos controles positivos em ensaio de
toxicidade em A. salina com intervalo de confiança de 95% determinado pelo
programa Probitos .............................................................................................. 51
Tabela 2 - Concentração inibitória (CI
50
) de dez substâncias e do controle positivo em células
humanas neoplásicas, linhagens B16-F10 e Hep
2
em período de incubação de 48h,
e intervalos de confiança ........................................................................................55
Tabela 3 - Alcalóides e atividades em A. salina, após 24h de exposição, e em linhagens de
células tumorais B16-F10 e Hep
2
,
em período de incubação de 48h, respectivos
controles positivos de cada bioensaio e intervalos de confiança .......................... 57
Tabela 4 - Flavonóides e atividades em A. salina, após 24h de exposição, e em linhagens de
células tumorais B16-F10 e Hep
2
,
em período de incubação de 48h, respectivos
controles positivos de cada bioensaio e intervalos de confiança .......................... 59
Tabela 5 - Quinonas e atividades em A. salina, após 24h de exposição, e em linhagens de
células tumorais B16-F10 e Hep
2
,
em período de incubação 48h, e seus respectivos
controles positivos de cada bionensaio e intervalos de confiança ........................ 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da duguetina .............................................................................. 28
Figura 2 - Estrutura química da boldina .................................................................................. 29
Figura 3 - Estrutura química da N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina ................................ 30
Figura 4 - Estrutura química da rutina .................................................................................... 33
Figura 5 - Estrutura química da quercetina ............................................................................. 33
Figura 6 - Estrutura química da aloina .................................................................................... 37
Figura 7 - Estrutura química da emodina ................................................................................ 39
Figura 8 - Estrutura química do lapachol ................................................................................ 40
Figura 9 - Estrutura química da β-lapachona .......................................................................... 42
Figura 10 - Esquema do ensaio de citotoxidade em A. salina ................................................ 48
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A549 linhagem celular tumoral de mama ou de adenocarcinoma de pulmão
B16 e B16BL6 linhagem celular de melanoma murino
B16-F10 linhagem celular de melanoma
BEL-7402 linhagem celular de carcinoma hepatocelular
Calu-1 linhagem celular de carcinoma de pulmão humano
CH27 linhagem celular de câncer de células escamosas de pulmão humano
CI
50
concentração inibitória necessária para inibir o crescimento de 50% dos
organismos-teste
CI
k50
concentração necessária pra diminuir a constante de crescimento em 50%
CL
90
concentração inibitória necessária para
inibir o crescimento de 90% dos
organismos-teste
CL5 linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar humano
Col115 linhagem celular de adenoma de cólon humano
DE
50
dose efetiva necessária para provocar a morte de 50% dos organismos-teste
DMEM meio de cultura celular Dulbecco’s Modified Eagle’s
DMSO dimetilsulfóxido
EC/CUHK1 linhagem celular de carcinoma esofágico
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
FDA United States Food and Drug Administration
H460 linhagem celular de carcinoma de pulmão
HCT-15 linhagem celular de câncer de cólon
HCT-116 linhagem celular de câncer de cólon humano
HEK-293 linhagem celular de fígado embrionário humano
Hep2 linhagem celular de carcinoma de laringe
HepG2 linhagem celular de hepatocarcinoma
HepG2/C3A linhagem celular de hepatoma humano
HeLa linhagem celular de carcinoma cervical
HeLaS3 linhagem celular de carcinoma uterino humano
HMEC linhagem celular epitelial de mama humana
HPLC High-Performance Liquid Chromatography
HSC5 linhagem celular de carcinoma escamoso de pele
HUVE linhagem celular endotelial de veia umbilical humana
HUVEC linhagem celular endotelial da veia de cordão umbilical humano
INCA Instituto Nacional do Câncer
K562 linhagem celular de eritroleucemia
LLC linhagem celular de carcinoma Lewis de pulmão
LNCaP linhagem celular tumoral de próstata
MC3T3E1 linhagem celular de calvária osteoblástica de rato não transformada
MCF-7 linhagem celular de câncer de mama humana
MCF-10A linhagem celular epitelial imortalizada de mama humana
MDA-MB-231 linhagem celular de câncer de mama
MDA-MB-453 linhagem celular de câncer de mama humano
MIC
50
concentração inibitória mínima necessária para inibir o crescimento de 50%
dos organismos-teste
MKN-45 linhagem celular de adenocarcinoma gástrico humano
MTT brometo de difeniltetrazólio - microtetrazólio
NCI National Cancer Institute
NCI-H460 linhagem celular de câncer de pulmão humano
NO óxido nítrico
PBS tampão fosfato-salino
PC3 linhagem celular tumoral de próstata
PLC/PRF/5 linhagem celular de hepatoma humano
Raji linhagem celular de eritroleucemia
RPMI 1640 meio de cultura celular Roswell Park Memorial Institute
SF-268 linhagem celular de câncer do sistema nervoso central humano
SK-HEP-1 linhagem celular de hepatoma humano
SKMEL-2 linhagem celular de melanoma
SK-OV-3 linhagem celular de câncer de ovário
SRB sulforrodamina B
SW480 linhagem celular de adenoma de cólon humano
TCA ácido tricloroacético
TIG-1 linhagem celular de fibroblastos pulmonares de embrião humano
UMR-106 linhagem celular de osteosarcoma de camundongo
VERO linhagem celular de rim de macaco verde africano
VHSV vírus da septicemia hemorrágica viral
XF498 linhagem celular de câncer do sistema nervoso central
XTT hidróxido de tetrazólio
Walker 256 tumor sólido – carcinosarcoma
Wish linhagem celular epitelial transformada
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC graus Celsius
h hora(s)
kg quilograma
L litro
µg micrograma
µL microlitro
µM micromol
mg miligrama
mL mililitro
mM milimol
nm nanômetro
W watts
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 16
2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 18
2.1 Uso de plantas medicinais ............................................................................................... 18
2.2 Câncer .............................................................................................................................. 19
2.3 Ensaios biológicos – bioensaios ...................................................................................... 21
2.3.1 Artemia salina Leach ..................................................................................................... 21
2.3.2 Ensaio antitumoral na avaliação da atividade antineoplásica ........................................ 26
2.4 Alcalóides ......................................................................................................................... 27
2.4.1 Duguetina e boldina ....................................................................................................... 27
2.4.2 N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina .......................................................................... 30
2.5 Flavonóides ...................................................................................................................... 31
2.6 Quinonas .......................................................................................................................... 35
2.6.1 Aloina e emodina ........................................................................................................... 35
2.6.2 Lapachol e β-lapachona.................................................................................................. 39
2.7 Produtos naturais e o câncer na atualidade .................................................................. 44
3 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 46
3.1 Objetivo Geral ..................................................................................................................46
3.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................... 46
4 METODOLOGIA .............................................................................................................. 47
4.1 Drogas .............................................................................................................................. 47
4.2 Artemia salina .................................................................................................................. 47
4.3 Ensaio antitumoral .......................................................................................................... 49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 51
5.1 Artemia salina .................................................................................................................. 51
5.2 Ensaio antitumoral .......................................................................................................... 54
5.3 Atividade de substâncias da classe dos alcalóides em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral ............................................................................................................................ 57
5.4 Atividade de substâncias da classe dos flavonóides em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral ............................................................................................................................ 58
5.5 Atividade de substâncias da classe das quinonas em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral ............................................................................................................................ 61
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 69
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 71
16
1 INTRODUÇÃO
Estima-se a existência de mais de dois milhões de espécies de plantas, animais e
microorganismos ocorrentes na biodiversidade brasileira, o que contribui para o aumento das
oportunidades de identificação de produtos com possível utilização econômica. Afirma-se,
ainda, que as plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos,
constituindo-se em modelos para a síntese de um grande número de fármacos (GUERRA;
NODARI, 2007).
Estudos têm demonstrado que as áreas da botânica e da medicina estão relacionadas.
Com isso, as ações farmacológicas de flavonóides, lignanas, alcalóides, cumarinas, dentre
outras substâncias extraídas de plantas, têm sido extensivamente estudadas (NG et al., 2000)
por indústrias e grupos de pesquisa para obtenção de protótipos farmacêuticos para tratamento
de diversos males.
Houghton et al. (2007) afirmam que uma parte significativa das descobertas de drogas
nos últimos quarenta anos tem sido focada em agentes para prevenir ou tratar o câncer, já que
na maioria dos países desenvolvidos e, cada vez mais nos países em desenvolvimento, o
câncer está entre as três causas mais comuns de morte e morbidade. Como formas de
tratamento para esta doença estão a cirurgia, a radioterapia, a quimioterapia e,
freqüentemente, uma combinação de duas ou das três é empregada, fazendo com que a
descoberta de drogas eficazes diminua o tempo de tratamento e impeçam a reincidência.
Atualmente, ervas medicinais, especialmente as ditas anticâncer, têm chamado atenção
de institutos farmacêuticos à medida que cientistas percebem que elas são uma fonte quase
infinita para o desenvolvimento de drogas e que a toxicidade destas é muito baixa, sem
apresentar efeito colateral (WANG et al., 2006). Enquanto drogas sintéticas contra o câncer
causam uma morte não específica das células, alguns produtos de origem vegetal oferecem
ações protetoras e terapêuticas, com baixa citotoxicidade e benefícios para pessoas
imunocomprometidas (REDDY et al., 2003). Portanto, drogas anticâncer em amplo uso
clínico são fundamentalmente citotóxicas e agem principalmente inibindo a proliferação
celular através de diferentes mecanismos (HOUGHTON et al., 2007).
Como ferramenta útil na determinação de drogas contra o câncer, avaliações para
atividade biológica, utilizando bioensaios simples e rápidos têm sido adicionadas para
obtenção de uma melhor indicação da utilidade de plantas. Assim, separações fitoquímicas
são, hoje, rotineiramente direcionadas por bioensaios que garantem o isolamento de princípios
17
bioativos, sem determinar se eles pertencem a certa classe de compostos ou não (SAID et al.,
1998).
Os bioensaios oferecem vantagem especial na padronização e controle de qualidade de
produtos de origem vegetal (MCLAUGHLIN; ROGERS, 1998) e, de uma maneira geral,
podem envolver organismos inferiores, como microrganismos e microcrustáceos, ensaios
bioquímicos visando alvos moleculares, como enzimas e receptores e cultura de células
animais ou humanas. O que determinará o teste adequado é a doença alvo a ser estudada
(MACIEL et al., 2002).
Dentre os ensaios mais citados estão aqueles de letalidade em organismos simples,
como o microcrustáceo marinho Artemia salina Leach, que permite avaliar a toxicidade geral,
sendo considerado um bioensaio preliminar no estudo de extratos e metabólitos especiais com
potencial atividade biológica (MACIEL et al., 2002).
A. salina, comumente conhecida como o “camarão de água salgada”, é um pequeno
crustáceo que tem sido objeto de estudos fisiológicos de zoologistas por muitos anos. Devido
à sua alta sensibilidade a ampla série de compostos, a possibilidade de estocar seus ovos por
anos em temperatura ambiente e a obtenção de grande quantidade de larvas em 24-48h, seu
uso tem sido promovido como organismo teste para bioensaios (CEPLEANU, 1993).
McLaughlin e Rogers (1998) encontraram dados que mostram ser o bioensaio da A. salina tão
preciso ou até mesmo superior a ensaios em linhagens tumorais humanas, sugerindo-o como
uma pré-avaliação em detrimento de ensaios mais caros, além de ser um método de avaliação
de pesticidas.
Outro teste citotóxico, porém mais específico, é o baseado em uma ou mais linhagens
celulares de mamíferos (antitumoral), cultivadas sob condições que promovem o efetivo
crescimento e a divisão mitótica. Células são cultivadas em placas de micropoços e a taxa de
multiplicação e crescimento é medida pela formação de cor, cuja intensidade é diretamente
proporcional ao número de células presentes (HOUGHTON et al., 2007).
Assim, o estudo biomonitorado e biodirecionado contribui para a descoberta e a
análise de candidatos potenciais ao uso farmacêutico, unindo-se aos ensaios mais complexos
que indicam características a serem exploradas e/ou modificadas na elaboração de fármacos
derivados de produtos naturais da flora brasileira.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Uso de plantas medicinais
O Brasil detem aproximadamente um terço da flora mundial, considerando sua
extensão e diversidade como fatores determinantes de seu privilégio na potencialidade de
novos fitoterápicos (YUNES et al., 2001).
Os componentes da biodiversidade podem fornecer uma ampla gama de produtos de
importância econômica e representam uma vasta fonte de substâncias naturais biologicamente
ativas. Dentre eles destacam-se os fitofármacos, substâncias extraídas de plantas que
apresentam atividade(s) farmacológica(s), as quais podem ter aplicação terapêutica
(GUERRA; NODARI, 2007) e se tornarem modelos para a síntese de um grande número de
fármacos.
A utilização de matéria-prima extraída de fontes naturais para a síntese de substâncias
bioativas tem sido amplamente relatada ao longo do tempo (BARREIRO et al., 2007), porém
a ação antrópica aliada ao ritmo natural de extinção das espécies coloca em perigo a
diversidade biológica existente e ocasiona a perda de potencialidades ainda inexploradas
quanto ao seu uso benéfico para a sociedade.
Para subsidiar a exploração racional de produtos bioativos, pesquisas fitoquímicas são
vistas como um primeiro passo no descobrimento de drogas úteis em florestas tropicais, sendo
estas identificadas como fontes potenciais devido à sua flora diversificada (SAID et al.,
1998). Além disso, a tendência global de procura por fontes alternativas à industrialização e a
necessidade da preservação ambiental têm contribuído para que a floresta tropical seja alvo de
tais atividades, junto com o medo do esgotamento causado por desmatamento e pela constante
ampliação das fronteiras agrícolas.
A pesquisa por novos agentes anticâncer de fontes naturais tem obtido sucesso em
todo o mundo, onde se coloca o conhecimento etnofarmacológico como aliado na busca de
plantas com potenciais atividades citotóxicas (GÁLVEZ et al., 2003). O uso medicinal de
plantas e substâncias naturais geralmente se inicia pelo conhecimento ou crença de que seu
uso, pelo homem e por animais domésticos, está associado a efeitos benéficos à saúde.
Ozaki e Duarte (2006) enfatizaram tal importância das plantas na medicina humana e
na veterinária, pois seu uso vem se mantendo através de ensinamentos propagados pelas
gerações e podendo ser usadas simultaneamente ou em substituição a fármacos clássicos.
19
Aliado a isso, soma-se a melhoria da qualidade de vida e a eficiência na prevenção e no
tratamento de doenças.
Na América Latina, apesar do crescente acesso da população urbana a modernos
remédios alopáticos e várias terapias alternativas, ainda é massivo e fortemente enraizado em
culturas locais (SPEISKY; CASSELS, 1994) o uso de plantas medicinais, em especial em
regiões pobres e em grandes cidades brasileiras, onde são comercializadas ou encontradas em
quintais de residências (MACIEL et al., 2002).
Dentre os produtos botânicos de maior interesse e mais visados, principalmente pela
indústria farmacêutica, estão aqueles que atuam em múltiplos alvos anticâncer, uma vez que
contêm uma variedade de estruturas químicas. Uma vantagem potencial dos produtos de
origem natural é que eles podem atuar através de múltiplas vias e reduzir o desenvolvimento
de resistência pelas células cancerosas (YANCE; SAGAR, 2006).
Várias razões são colocadas para explicar o sucesso dos produtos naturais na
descoberta de drogas: sua alta diversidade química, os efeitos da pressão evolutiva em criar
moléculas biologicamente ativas e a similaridade estrutural dos alvos protéicos entre várias
espécies (HARVEY, 2007).
Assim, o uso de substâncias ou extratos obtidos de plantas, particularmente
metabólitos secundários - compostos químicos que geralmente apresentam estrutura
complexa, baixo peso molecular, marcantes atividades biológicas, encontrados em
concentrações relativamente baixas e em determinados grupos de plantas (VON POSER;
MENTZ, 2007) – tem levado ao conhecimento, descoberta e corroborado o uso de produtos
naturais de uso popular com grande potencialidade para aplicação farmacêutica. Com isso,
estudos de preservação e manejo sustentável de áreas biodiversas e ameaçadas fazem-se
necessários no âmbito da pesquisa biológica e farmacêutica.
2.2 Câncer
Existe um público considerável e um interesse científico no uso de produtos naturais
presentes na dieta para o combate de doenças humanas, especialmente as duas que
comumente mais matam em países desenvolvidos: doenças cardiovasculares e câncer
(SHARMA et al., 2005).
O câncer é definido como uma doença na qual uma desordem ocorre no processo
normal de divisão celular, controlada pelo material genético (DNA) da célula (REDDY et al.,
2003). Em complemento a tal definição, Moura et al. (2001) colocam o câncer como uma
20
coleção de doenças caracterizadas por células malignas que proliferam de maneira
incontrolada, invadem tecidos adjacentes e disseminam-se para órgãos distantes para formar
colônias-irmãs (tumores secundários ou metástase).
A maioria dos tipos de câncer humano resulta da exposição à carcinógenos ambientais,
o que inclui os produtos químicos naturais e os produzidos pelo homem, radiação e vírus,
além de outros fatores, como a predisposição genética, rearranjo cromossômico, genes
supressores de tumores e transformação espontânea (REDDY et al., 2003).
Um dos tecidos celulares que mais sofrem a ação de carcinógenos ambientais são as
células epiteliais, as quais estão naturalmente expostas a várias fontes exógenas de radicais
livres, tais como poluição e radiação UV, fatores que fazem das linhagens de melanoma um
alvo para estudos de extratos, frações e substâncias puras como possíveis agentes anticâncer.
Calliste et al. (2001) utilizaram a linhagem de melanoma (B16), derivada de células de tumor
espontâneo de pele de camundongo, para avaliar o efeito citotóxico de extratos de plantas.
Estimativas para o ano de 2008 e válidas também para o ano de 2009, no Brasil,
apontam a ocorrência de 466.730 casos novos de câncer (à exceção do câncer de pele do tipo
não melanoma, estimado em 115 mil novos casos), sendo os mais comuns o câncer de
próstata e o de pulmão, no sexo masculino, e o câncer de mama e o de colo de útero, no sexo
feminino, acompanhando o mesmo perfil observado no mundo (INCA, 2008).
Na busca pela cura dessa doença, a pesquisa por drogas anticâncer obtidas de produtos
naturais começou por volta de 1950, com a descoberta e desenvolvimento dos alcalóides da
vinca: vimblastina e vincristina (BROWER, 2008), extraídas de Catharanthus roseus
(SCHENKEL et al., 2007), bem conhecidas e com uso clínico principal em tratamento de
linfoma de Hodgkin e leucemia linfoblástica aguda infantil, respectivamente. O mecanismo de
ação dos alcalóides da vinca é através da inibição da mitose, sendo seu alvo a tubulina, uma
proteína necessária à divisão celular (ITOKAWA et al., 2008).
Outro exemplo de sucesso na
descoberta de drogas anticâncer são os taxanos paclitaxel e docetaxel, isolados de Taxus
brevifolia e que apresentam uma impressionante atividade, principalmente sobre tumores de
mama e ovário (DA ROCHA et al., 2001).
Para o estudo e desenvolvimento de drogas capazes de aumentar a cura dessa doença
de alta incidência mundial, a atividade citotóxica de extratos e frações de plantas, medida por
meio de ensaios de viabilidade celular laboratoriais em diversas linhagens tumorais humanas,
é comumente realizada para o direcionamento e descoberta de princípios ativos, como
demonstrado no trabalho de Alfonso et al. (2006).
21
2.3 Ensaios biológicos - bioensaios
O bioensaio pode ser definido como uma estimativa da concentração ou da potência de
determinada substância através de uma resposta biológica produzida pela mesma. Dentre suas
utilizações está a medição da atividade de substâncias novas ou quimicamente não definidas
(RANG et al., 2001).
Para o desenvolvimento de novas drogas, a atividade de um composto precisa ser
comparada em vários sistemas de testes, utilizando outros já conhecidos (padrão). Os testes
escolhidos devem ser simples e rápidos e também, na medida do possível, específicos para o
tipo de atividade biológica a investigar (RANG et al., 2001).
Portanto, a seguir é feita uma revisão acerca de dois bioensaios utilizados na
determinação da atividade biológica de extratos, frações e compostos extraídos de vegetais: o
bioensaio simples de letalidade da A. salina, indicativo do segundo bioensaio apresentado, o
antitumoral, este, mais específico.
2.3.1 Artemia salina Leach
O uso de invertebrados como bioindicadores ou bioacumuladores é implementado em
testes antes do uso de vertebrados, mas sua aplicação ainda é marginal e envolve, dentre os
resultados primários, a avaliação da toxicidade e genotoxicidade dos compostos testados
(KANWAR, 2007).
A letalidade in vivo de um simples organismo zoológico, pode, segundo McLaughlin e
Rogers (1998), ser usado como um instrumento conveniente de avaliação e fracionamento no
descobrimento e monitoramento de produtos naturais bioativos. O microcrustáceo A. salina
Leach (Artemiidae) é um invertebrado de ecossistemas aquáticos salinos e marinhos usado em
ensaio laboratorial de toxicidade e outras ações de estimativa da dose letal (AYO et al., 2007).
Pertence ao Filo Arthropoda, Classe Crustacea (PELKA et al., 2000). O estágio de larvas de
A. salina mais usado em testes laboratoriais compreende o período de vida de 24 a 48h depois
da eclosão. Identificação da dose efetiva para 50% de mortalidade das larvas (DE
50
) acontece
depois de seis horas de exposição, fazendo deste um teste rápido e simples (KANWAR,
2007).
O microcrustáceo adulto é um animal extremamente bem conhecido devido a sua
importância como fonte de alimento para peixes e crustáceos criados em aquários domésticos,
sistemas de aqüicultura e em laboratórios (PELKA et al., 2000). Os ovos de A. salina Leach
são comercializados em lojas de animais a um baixo custo e permanecem viáveis por anos se
22
armazenados em condições ideais. Quando colocados em água marinha, os ovos eclodem
dentro de 48h e geram um grande número de larvas (fase náuplio) para o uso experimental, o
que confere vantagens a esse tipo de ensaio biológico (MCLAUGHLIN; ROGERS, 1998),
além de poder ser utilizado como bioindicador e biomonitor da qualidade da água, como por
exemplo, na determinação da citotoxicidade de pesticidas organofosforados (VARÓ et al.,
2002).
Outra indicação do bioensaio da letalidade sobre A. salina é seu uso em avaliações de
extratos de plantas, considerado por Pimenta et al. (2003) como um teste eficiente, rápido,
barato e que requer uma quantidade pequena de amostra (2-20 mg). A DE
50
para valores
encontrados em teste com o microcrustáceo é geralmente dez vezes a concentração necessária
para inibir 50% do crescimento celular (CI
50
) em testes antitumorais (MCLAUGHLIN E
ROGERS, 1998). Parra et al. (2001) também colocam o teste da A. salina como sendo útil
para predizer a toxicidade in vivo, já que os testes de 20 extratos de plantas cubanas
apresentaram uma boa correlação entre o estudo em A. salina e em ratos. Entretanto, apesar
das vantagens apresentadas pelo primeiro método, tais como simplicidade e não utilização de
animais, este ainda não é um método laboratorial validado.
Outra vantagem oferecida por esse ensaio está relacionada à comunidade científica,
preocupada e sensível com as questões de bem-estar animal, considerando como os animais
são usados em pesquisa biomédica e em testes para avaliar o potencial toxicológico de vários
tipos de substâncias. Apesar de alternativas aos métodos baseados no uso de animais não
satisfazerem todos os requisitos e necessidades da pesquisa biomédica e de testes
toxicológicos, alternativas ao uso de vertebrados estão sendo desenvolvidas e avaliadas
quanto a sua utilidade.
Porém, o ensaio com invertebrados não é de uso exclusivo como pré-avaliação no
estudo farmacêutico e toxicológico de extratos vegetais e substâncias puras naturais e
sintéticas. Pelka et al. (2000) objetivaram ajustar o ensaio citotóxico de A. salina, em
micropoços, às demandas de testes de toxicidade de materiais dentários, pois esses ensaios são
muito baratos em comparação aos métodos de cultura de células para tal fim. A. salina foi
utilizada por Svensson et al. (2005) inclusive para testar a toxicidade de águas de chorume de
diferentes aterros municipais contendo altas concentrações de íons cloreto, uma vez que esse
microcrustáceo é um organismo tolerante a concentrações salinas. Os resultados encontrados
indicaram que amônia e íons amônio e/ou íons metálicos são responsáveis por uma grande
porção da toxicidade aguda do material testado. A. salina também mostrou ser um organismo
conveniente ao teste de metabólitos fúngicos tóxicos (HARWIG; SCOTT, 1971).
23
Uma das metodologias mais citadas e usadas originalmente e em adaptações do ensaio
para A. salina em extratos e compostos de produtos naturais é o proposto por Meyer et al.
(1982). Este trabalho pode ser considerado como uma referência na tentativa de associar a
atividade citotóxica sobre o microcrustáceo ao ensaio de atividade antitumoral. A partir de
então, outros autores usaram tal metodologia como referência para avaliação de frações,
extratos e substâncias puras de origem vegetal e testes de citotoxicidade gerais
(MCLAUGHLIN E ROGERS, 1998; MOREIRA et al., 2003; NOLDIN et al., 2003;
LHULLIER et al., 2006; STEFANELLO et al., 2006; GRAMINHA et al., 2008). Porém,
estudos específicos para uma correlação quantitativa e qualitativa entre o bioensaio da A.
salina e o bioensaio antitumoral, encontrada por Meyer et al. em 1982, não foram, desde
então, conduzidos com o objetivo específico de estabelecer e/ou reafirmar o uso seguro do
primeiro como indicativo e quantitativo da presença de atividade do segundo bioensaio.
Trabalhos partindo de resultados positivos em testes com A. salina são encontrados como
forma de triagem de substâncias candidatas a testes específicos e mais dispendiosos, como o
bioensaio antitumoral.
Uma das substâncias estudadas em nosso trabalho foi adotada por Cunha (2002) como
controle positivo em teste de extratos e frações obtidos de três espécies da família
Annonaceae em toxicidade de A. salina: o lapachol. Em tal estudo, os extratos vegetais das
espécies Rollinia laurifolia, Annona crassiflora e Annona nutans apresentaram toxicidade nos
testes com A. salina e passaram para a próxima etapa da estratégia de triagem adotada pelo
autor: a determinação da concentração inibitória sobre linhagens celulares tumorais e uma
normal. Isso mostra a importância da atividade sobre o microcrustáceo como pré-requisito
para avaliações mais dispendiosas, exemplificado pelos ensaios antitumorais.
Dentre os extratos aquosos de 118 plantas medicinais indianas testadas em A. salina
por Krishnaraju et al. (2006), dois deles, obtidos das espécies Polygonum cuspidatum e
Syzygium cumini, mostraram-se mais promissores, com valores de DE
50
de 13,5 e 20 µg/mL,
respectivamente. O grau de letalidade mostrou ser diretamente proporcional à concentração
do extrato e confirmou o uso medicinal tradicional das espécies citadas quanto à sua atividade
antitumoral.
A. salina foi utilizada na condução dos seguintes estudos biodirecionados: extrato
metanólico bruto e as substâncias puras cinaropicrina e cinarosídio obtidos da espécie Cynara
scolymus L. (alcachofra) (NOLDIN et al., 2003); extrato acetato de etila do talo da folha,
metanólico da raiz, hexânico do talo da folha e da raiz e as substâncias puras estigmast-4-en-
6
β-ol-3-ona e 3β-O-β-D-glicopiranosil sitosterol obtidas de Euterpe precatoria Mart. (açaí)
24
(GALOTTA; BOAVENTURA, 2005). Além disso, extratos de diferentes partes vegetais de
Rhizophora mucronata (Rhizophoraceae) - uma árvore de manguezal - indicados por Kabaru
e Gichia (2001) como uma fonte potencial de inseticidas botânicos foram testados em A.
salina e também a fração aquosa, a n-butanol, a acetato de etila e as substâncias puras
praeruptorinas A e B extraídas de Peucedanum praeruptorum Dunn. foram testadas por Lu et
al. (2001) tanto frente a A. salina como quanto à suas atividades antimicrobianas e toxicidade
em ratos, sendo o controle positivo usado no teste do microcrustáceo, a podofilotoxina, uma
lignana com comprovado efeito antitumoral (DAVID et al., 2001).
Na literatura, são encontrados vários exemplos de estudos que envolvem A. salina
como um pré-ensaio de substâncias isoladas de partes de plantas avaliadas para determinar
sua citotoxicidade e sugerir futuras investigações para o uso como protótipos de novos
fármacos (TIEW et al., 2002). Mojica e Micor (2007) testaram o extrato aquoso das sementes
de Barringtonia asiatica e encontraram uma relação dose dependente (atividade e
concentrações utilizadas), sugerindo uma potencial ação biológica dos compostos da espécie,
que poderiam ser usados no tratamento de câncer ou tumor. Também David et al. (2004)
usaram A. salina para avaliar a citotoxicidade tanto de extratos brutos como de substâncias
isoladas do caule de Maprounea guianensis Aublet (Euphorbiaceae) obtidas por isolamento e
posterior elucidação estrutural.
Além de extratos e produtos obtidos de plantas, A. salina foi usada para avaliação de
extratos etanólicos de 19 espécies de algas marinhas (filos Chlorophyta, Phaeophyta e
Rhodophyta) do litoral brasileiro catarinense e, como resultado, observaram que, 25 extratos
dos 26 testados apresentaram toxicidade em pelo menos uma das concentrações (200 µg/mL,
100 µg/mL e 50 µg/mL) (LHULLIER et al., 2006).
Piccardi et al. (2000) testaram cinqüenta linhagens de cianobactéria do gênero Nostoc,
obtidas de diferentes hábitats e conhecidas por produzirem uma grande variedade de
metabólitos secundários com atividade antibiótica e citotóxica. As biomassas foram
liofilizadas e extraídas de forma a obter os extratos brutos hidrofílico e lipofílico, testados
quanto às suas atividades antifúngica, antibacteriana e citotóxica. Doze linhagens mostraram
toxicidade sobre A. salina, sendo tal atividade associada aos extratos hidrofílicos avaliados,
enquanto a atividade antifúngica mostrou-se comum entre os extratos lipofílicos. Lee et al.
(1999) também avaliaram amostras de cianobactérias obtidas de tanques de aqüicultura e
reservatórios tailandeses (espécies Microcystis aeruginosa Kützing e Coelosphaerium
küetzingianum Naegeli). Microcistinas (cianotoxinas causadoras de hepatotoxicidade) foram
testadas pelos autores em A. salina como meio de comparação entre tal ensaio e o teste em
25
ratos injetados intraperitonealmente. A. salina mostrou ser um ensaio menos sensível que o
segundo, porém, mais uma vez, um ensaio mais simples por requerer menos equipamentos
laboratoriais e ser menos problemático do ponto de vista ético, mostrando ser conveniente na
detecção da toxicidade de microcistinas (LEE et al., 1999). Tal alternativa é confirmada em
teste com o alcalóide cilindrospermopsina obtido de seis linhagens de Cylindrospermopsis
raciborskii em comparação com a atividade da microcistina obtida de Microcystis sp
(METCALF et al., 2002).
Peróxido de hidrogênio produzido pela alga Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae),
um organismo ictiotóxico responsável pela maré vermelha e associado à mortalidade de
peixes na indústria de aqüicultura, foi avaliado sobre A. salina e sobre duas linhagens de
células de vertebrados: HEK-293 (fígado embrionário humano) e UMR-106 (osteosarcoma de
camundongo) (TWINER et al., 2001), reafirmando a utilidade desses ensaios nos variados
grupos de organismos e espécies.
A. salina é utilizada para testes de toxicidade de compostos sintéticos, como por
exemplo, de 1,3,5-triazinas substituídas, compostos sintéticos heterocíclicos (N), os quais
possuem várias atividades biológicas, incluída dentre estas, a anticâncer (CAVALCANTE et
al., 2000) e em testes de toxicidade e antimicrobiano de derivados de 1,2,4 oxadiazóis
contendo substituintes fenilclorados (MACHADO et al., 2005).
Complexos de ferro (III) com tiosemicarbazona piridinoformamida e seus derivados
foram obtidos e analisados por Graminha et al. (2008) sendo que as tiosemicarbazonas e seus
complexos [Fe(2Am4DH)
2
]Cl e [Fe(2Am4Me)
2
]Cl apresentaram toxicidade sobre A. salina
em baixas concentrações, sugerindo a presença de propriedades antineoplásicas, já que esse
bioensaio possui uma boa correlação com a atividade citotóxica em tumores sólidos humanos.
Um dos aspectos levados em conta por alguns autores em seus trabalhos foi a idade
das larvas de A. salina. Esse fator influenciou diretamente a toxicidade atribuída aos quatro
carbamatos testados por Barahona e Sánchez-Fortún (1999). Os microcrustáceos com 72h de
vida foram mais sensíveis aos pesticidas do que aqueles testados com 24h, o que, segundo os
autores, ocorre usualmente. Portanto, larvas com 48h de vida, já em estágio náuplio, são as
mais utilizadas nos ensaios.
De acordo com David et al. (2001) a classificação de substâncias puras obtidas de
extratos de plantas, quanto à sua atividade citotóxica em A. salina pode ser assim atribuída:
substâncias que apresentam DE
50
>1000 µg/mL são consideradas inativas e aquelas com
DE
50
<100 µg/mL são muito ativas, comparáveis à camptotecina e ao sulfato de vincristina,
substância usada no tratamento de leucemia (SCHRIPSEMA et al., 2007). Substâncias
26
medianamente ativas, comparáveis ao ácido hipúrico, apresentam DE
50
≥100 µg/mL e ≤1000
µg/mL.
O ensaio da A. salina é, portanto, uma ferramenta útil na avaliação e fracionamento
monitorado para bioatividades, levando ao isolamento de diversos produtos naturais,
incluindo membros de várias classes, tais como flavonóides, triterpenos, esteróis e compostos
aromáticos simples, poupando a necessidade de ensaios antitumorais mais caros ou em
animais (CEPLEANU, 1993). Encontra-se ainda, na literatura, A. salina sendo usada em
várias outras avaliações biológicas, confirmando sua sensibilidade e versatilidade como
elemento em estudos de toxicidade.
2.3.2 Ensaio antitumoral na avaliação da atividade antineoplásica
Testes de quimiosensibilidade em células aderentes a microplacas têm sido
amplamente utilizados para avaliação de drogas anticâncer (PAPAZISIS et al., 1997),
consistindo em um teste mais específico, porém, também mais complexo e com maiores
gastos.
Existem diferentes tipos de ensaios colorimétricos disponíveis comercialmente
(HENRIKSSON et al., 2006). Os ensaios mais citados nos artigos encontrados para a revisão
bibliográfica deste trabalho foram o MTT (microtetrazólio) e o SRB (sulforrodamina B). O
método MTT quantifica a habilidade de células viáveis reduzirem o sal de tetrazólio, de
coloração amarela, em cristais púrpuras, através da atividade metabólica mitocondrial. Já o
ensaio SRB cora as proteínas das células, ou seja, após a fixação daquelas que se mantiveram
aderidas depois da adição e incubação com as drogas testadas, o corante SRB é adicionado e a
lise das células é provocada, o que possibilita a quantificação do corante liberado, detectado
pela leitura da absorbância de acordo com a intensidade da cor.
Segundo Itharat et al. (2004), o método SRB é utilizado em ensaios citotóxicos de
extratos aquosos e etanólicos de plantas tradicionalmente usadas em preparações medicinais,
oferecendo um suporte científico ao uso de tais plantas contra o câncer. O mesmo método é
tido como prático, pois após a fixação da monocamada de células com TCA, coloração pelo
SRB e secagem, as placas podem ser armazenadas indefinidamente. Além disso, pelo seu alto
grau de sensibilidade, adaptabilidade ao formato de placas de 96 poços e estabilidade
indefinida, o ensaio SRB é adequado às avaliações em larga escala e à pesquisa (VICHAI;
KIRTIKARA, 2006). Tais vantagens e o fato de ser a metodologia utilizada em testes
realizados pelo programa de descobrimento de drogas anticâncer do Instituto Nacional do
27
Câncer dos Estados Unidos, subsidiam a utilização do ensaio SRB na avaliação da atividade
antineoplásica.
Para realização deste trabalho de correlação de ensaios biológicos foram selecionadas
dez substâncias pertencentes a três classes químicas diferentes: alcalóides, flavonóides e
quinonas. A seguir, é apresentada uma revisão das substâncias avaliadas, referenciando suas
potencialidades em bioensaios e atividades já conhecidas.
2.4 Alcalóides
2.4.1 Duguetina e boldina
Alcalóides formam um vasto grupo de metabólitos com enorme diversidade estrutural,
representando cerca de 20% das substâncias naturais descritas (HENRIQUES et al., 2007).
O termo alcalóide é considerado por Robbers et al. (1997) como de difícil definição,
sendo comumente aplicado a compostos nitrogenados básicos de origem vegetal que tenham
atividade fisiológica sobre o organismo e os sistemas de mamíferos, constituindo importantes
agentes terapêuticos usados para tratar doenças que vão desde a malária até o câncer.
Segundo descrição de Stévigny et al. (2005), alcalóides são metabólitos secundários
abundantes em plantas e com registros de múltiplas e variadas propriedades farmacológicas.
Em seu trabalho de revisão de potencialidades citotóxicas e antitumorais de alcalóides
aporfínicos, a família Annonaceae e a boldina são citadas como fortes candidatas a agentes
anticâncer. Os autores ainda propõem que aporfínicos com pouca ou nenhuma atividade
citotóxica poderiam ser usados como agentes adjuvantes em tratamentos anticâncer ou como
agentes quimiopreventivos contra compostos indutores de tumores.
Extratos e frações de uma espécie da família Annonaceae foram testadas por Pimenta
et al. (2003) que concluíram, através do bioensaio da A. salina e de análise cromatográfica,
que as acetogeninas dessa espécie são potenciais agentes pesticidas e antitumorais.
Acetogeninas obtidas da família Annonaceae foram isoladas por fracionamento
biodirecionado pelo ensaio de letalidade da A. salina e posteriormente avaliados quanto à
citotoxicidade em linhagens celulares tumorais humanas (YE et al., 1996).
A fração alcaloídica de Duguetia furfuracea obtida por Fischer et al. (2004) mostrou
atividade sobre a linhagem Palo Alto cloroquina-sensível de Plasmodium falciparum,
indicando que plantas contendo alcalóides isoquinolínicos poderiam ser avaliadas quanto à
atividade antimalárica.
28
De acordo com Silva et al. (2007), espécies do gênero Duguetia, pertencente à família
Annonaceae são invasoras de pastagens e prejudicam a economia regional baseada no
agronegócio praticado no Centro-Oeste, possuidor do bioma predominante Cerrado. Em
estudo fitoquímico da casca do caule e madeira de D. furfuracea foram obtidos o óleo volátil,
extratos éter de petróleo e alcaloídico que, quando avaliados quanto à sua citotoxicidade,
mostraram letalidade sobre larvas de A. salina (valores de DE
50
:
2,6; 6,1 e 36,9 µg/mL,
respectivamente). Tal atividade foi atribuída à presença de alcalóides e substâncias
previamente estudadas por Carollo et al. (2006).
Duguetina também foi encontrada em folhas e casca do caule secos de Duguetia
flagellaris Huber (Annonaceae) em seu extrato etanólico (FECHINE et al., 2002).
Duguetina possui a fórmula C
20
H
21
O
5
N e a seguinte estrutura química:
Figura 1 – Estrutura química da duguetina.
Poucos dados acerca dessa substância são encontrados na literatura, o que reforça a
necessidade de estudos quanto às suas possíveis atividades biológicas in vitro e in vivo,
principalmente devido aos seus resultados promissores e pela característica do grupo
fitoquímico ao qual pertence.
Um exemplo de planta nativa e tradicionalmente usada por seu efeito terapêutico é
citado por Speisky e Cassels (1994): boldo (Peumus boldus Mol.), que tem despertado
interesse devido ao acúmulo de ampla base de conhecimento químico de seus constituintes
alcaloídicos e a percepção cultural como planta medicinal eficaz para o tratamento de
desordens digestivas e hepatobiliares. De acordo com os autores, alcalóides foram
reconhecidos como compostos ativos do boldo e a boldina (C
19
H
21
NO
4
), seu princípio ativo,
tem atraído atenção dentre os vários metabólitos secundários identificados na espécie. Boldina
é o alcalóide majoritário nas folhas e caule do arbusto de boldo chileno, encontrado
N
O
O
OH
O
O
H
29
abundantemente nos ecossistemas mais úmidos da região de clima Mediterrâneo do Chile
central e porção norte do distrito chuvoso do lago Chileno (O’BRIEN et al., 2006).
Guinaudeau et al. (1988) em ampla revisão acerca dos alcalóides, citam como fontes
da boldina, as famílias botânicas: Annonaceae, Hernandiaceae, Lauraceae, Monimiaceae.
Figura 2 - Estrutura química da boldina.
Aterosclerose, hepatotoxicidade induzida por drogas, doenças autoimunes e
inflamatórias, algumas formas de câncer e doenças neurodegenerativas estão entre as
mencionadas por Speisky e Cassels (1994) como alvo para intervenção com antioxidantes
como a boldina. A propriedade antioxidante, mais citada entre os artigos sobre a boldina, foi
demonstrada por Loghin et al. (2003) em ensaio in vitro, onde a boldina mostrou uma CI
50
de
4,35±0,16 µg/mL, enquanto Trolox
®
- antioxidante de referência, análogo da vitamina E -
apresentou CI
50
>8,18 µg/mL. Segundo Speisky e Cassels (1994), evidências sugerem que
alcalóides aporfínicos possuem atividade antioxidante devido ao átomo de hidrogênio ligado
ao carbono benzílico perto do átomo básico de nitrogênio, além da contribuição das funções
fenólicas à habilidade varredora de radicais.
De acordo com O’Brien et al. (2006) e Youn et al. (2002), atividades farmacológicas,
tais como: citoprotetora, antitumoral, antiinflamatória, antipirética e antiplaquetária têm sido
associadas à habilidade da boldina em varrer radicais livres reativos. Além dessas, boldina
mostra um efeito insignificante em teste in vitro sobre o vírus da poliomielite humana e em
células VERO hospedeiras (BOUSTIE et al., 1998), esta, uma linhagem estabelecida a partir
de células do rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops) (ESTACIA et al., 2004)
e, portanto, indicativo da ausência de toxicidade em células normais.
N
HO
O
H
O
O
H
30
O interesse em tal substância é gerado pelo fato de chás e ervas contendo boldina
serem amplamente consumidos na América do Sul e folhas de boldo serem continuamente
exportadas para alguns países europeus para posterior processamento farmacológico e
produção de fitoterápicos contendo a substância (O’BRIEN et al., 2006). Além disso, o
conhecimento, a cultura popular e a comercialização disseminada do boldo proporcionam à
espécie um fácil acesso e o uso indiscriminado como “remédio caseiro” para diversos males,
alguns sem comprovação científica. É interessante observar, portanto, que estudos
toxicológicos sugerem uma moderação e cuidado no consumo de chá de boldo,
principalmente no primeiro trimestre da gravidez e no uso por tempo prolongado, uma vez
que há grandes indícios de teratogenia e hepatotoxicidade (RUIZ et al., 2008).
2.4.2 N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina
Figura 3 – Estrutura química da N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina.
N-nitrosanonaina (C
17
H
14
N
2
O
3
) e N-nitrosoxilopina (C
18
H
16
N
2
O
4
) foram obtidos, pela
primeira vez por Carollo et al. (2006) como dois novos alcalóides da espécie Duguetia
furfuracea contendo uma funcionalidade N-nitroso (NO). Tais substâncias não possuem testes
biológicos relatados na literatura e suas características físico-químicas são pouco conhecidas.
Porém, a identificação de atividade fisiológica de óxido nítrico (NO) tem gerado
interesse devido à sua capacidade de regulação de várias funções fisiológicas importantes em
organismos vivos e como um sistema de carreamento de fármacos. Portanto, para fins
medicinais, é desejável a descoberta de compostos doadores de NO com liberação controlada
(OWHADA et al., 2001).
31
Óxido nítrico é uma molécula reativa - um radical livre - com atividades em vários
processos fisiológicos no organismo, incluindo a inibição da proliferação celular tumoral
(TARAPHDAR, 2001). É sintetizado pela oxidação da L-arginina por uma família de óxido
nítrico sintases, um potente mediador biológico envolvido nos processos fisiológicos de
vasorelaxamento, neurotransmissão e defesa imunológica (LEPILLER et al., 2007;
SCHARSACK et al., 2003).
Alcalóides, uma classe de compostos naturais com atividade antitumoral de ocorrência
em plantas encontradas no bioma Cerrado e da qual fazem parte a N-nitrosoanonaina e a N-
nitrosoxilopina, com sua função NO, despertam interesse na descoberta de atividades
biológicas.
2.5 Flavonóides
Flavonóides constituem, de acordo com Santos (2007), um grupo de pigmentos
vegetais de ampla distribuição na natureza, sendo que sua presença nos vegetais parece
relacionar-se às funções de defesa (proteção contra raios ultravioleta, ações antifúngica e
antibacteriana) e atração de polinizadores.
A atividade protetora de frutas e vegetais contra câncer e doenças cardiovasculares
tem sido atribuída a vários antioxidantes, dentre eles os flavonóides contidos nesses alimentos
(CAO et al., 1997). Existe ampla evidência que uma dieta rica em flavonóides pode promover
boa saúde e prover proteção contra doenças relacionadas à idade, porém permanecem incertas
as condições e os níveis de ingestão necessários para produzir um dano potencial à saúde.
Dadas a ampla e a variada distribuição dos flavonóides na dieta humana, suas bioatividades
potenciais podem ser subestimadas, particularmente no seu uso como suplementos
alimentares (SKIBOLA; SMITH, 2000).
Várias plantas que contêm flavonóides são conhecidas por possuírem altas atividades
antioxidantes em comparação com moléculas de referência, tais como a vitamina E e seu
derivado hidrossolúvel, Trolox
®
(TROUILLAS et al., 2003). Além de frutas e vegetais,
bebidas populares, tais como vinho, chá e café são as principais fontes de flavonóides
incluídos na dieta, contribuindo para a existência de relatos de tais compostos agindo como
antioxidantes e protetores de vários tipos de células contra estresse oxidativo mediado por
lesão celular (MATSUO et al., 2005).
Os flavonóides exibem atividades antioxidante e varredora de radicais livres (NG et
al., 2000) - radicais livres oxigenados estão envolvidos com a fisiopatologia de várias
32
doenças, tais como inflamação, doenças cardíacas isquêmicas, câncer e várias outras
(TROUILLAS et al., 2003). São conhecidos por atuarem na captura e neutralização de
espécies oxidantes, como por exemplo, o ânion superóxido O
2-
, radical hidroxila ou radical
peróxido. Outros flavonóides conseguem se ligar a íons metálicos, impedindo-os de atuar na
produção de radicais livres (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007).
Os flavonóides de origem natural são, frequentemente, oxigenados e com uma grande
parte ocorrendo conjugados com açúcares (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007). Rutina é a
forma glicosídea (3-O-ramnoglicosídeo) principal da quercetina, o flavonol mais abundante
em vegetais e frutas (MANACH et al., 1995). A glicosilação do grupo hidroxil, como o
presente na rutina, reduz consideravelmente a capacidade varredora de radicais (PIETTA,
2000).
A fração flavonol obtida de Beta vulgaris foi separada em coluna HPLC e, de uma de
suas frações obtida em menor quantidade, foi extraída a mistura de cinco compostos: rutina,
quercetina 7-glucuronida, isorhamnetina, apigenina 7-rutinosida e um flavonol-glicosídeo
desconhecido. Esse conjunto mostrou uma atividade antimitótica sobre células cancerígenas
de mama (linhagem MCF-7), segundo metodologia de incorporação de timidina, nove vezes
maior do que a molécula predominante, vitexina-2”-O-ramnosídeo, obtida como um dos
componentes da fração fenólica da espécie (NINFALI et al., 2007).
Cunha (2002) adotou a rutina como controle negativo em teste de extratos e frações
obtidos de espécies da família Annonaceae em A. salina, mostrando ser esta, uma substância
inativa. Tal resultado pode ser atribuído ao caráter hidrofílico da substância (MATSUO et al.,
2005). Por outro lado, Cepleanu (1993) testou alguns compostos puros para validar o método
por ele modificado de teste de citotoxicidade em A. salina e elegeu, dentre outras substâncias
já de uso e/ou citotoxicidade conhecidas, a rutina, cisplatina, taxol e vimblastina, todas
citotóxicas. Porém, o autor alerta que a atividade no homem não necessariamente indica uma
atividade no microcrustáceo e vice-versa, já que os dois organismos são fisiologicamente e
farmacologicamente diferentes.
Em trabalho de Ng et al. (2000), rutina apresentou uma ação antioxidante equipotente
ao controle positivo em ensaio de peroxidação lipídica in vitro usando tecido cerebral
homogeneizado de rato. O potencial protetor contra danos ao DNA celular parece depender da
lipofilicidade da substância em conjunto com a sua atividade antioxidante (LIMA et al.,
2006). Tal ação protetora da rutina contra danos peroxidativos é corroborada por Calabrò et
al. (2005).
33
Além das atividades citadas, à rutina é atribuída a ação tônico-venosa, já que essa
substância é empregada no tratamento de enfermidades caracterizadas por hemorragias e
fragilidade capilar e comercializada no Brasil e em países europeus, como medicação para o
tratamento de alguns distúrbios circulatórios (ZUANAZZI E MONTANHA, 2007).
A rutina (C
27
H
30
O
16
)
possui a seguinte estrutura molecular:
Figura 4 – Estrutura química da rutina.
A quercetina (C
15
H
10
O
7
) corresponde à parte aglicona da rutina, possuindo a seguinte
estrutura química:
Figura 5 - Estrutura química da quercetina.
Harwood et al. (2007) realizaram revisão bibliográfica acerca da segurança da
quercetina na dieta humana, já que, devido ao amplo interesse no seu efeito antioxidante, ao
consumo diário em produtos tradicionais e à permissão de uso como aditivo alimentar, tal
substância tem sido de grande interesse quanto ao seu mecanismo de ação, metabolização,
34
genotoxicidade, mutagenicidade, toxicidade e carcinogenicidade, sendo uma das várias
substâncias que ocorrem naturalmente e constantemente como flanovol na dieta humana.
Diversas espécies são possuidoras de flavonóides e sua descoberta é efetuada através
de estudos fitoquímicos clássicos. Folhas secas de Helenium atacamense Cabr., uma espécie
encontrada no norte do Chile, foram examinadas usando o bioensaio da letalidade da A. salina
e o teste antitumoral (ensaio MTT) como guias para o fracionamento do seu extrato etanólico
(MORALES et al., 2006), levando ao isolamento da quercetina e outros dois compostos.
Quercetina suprime o crescimento tumoral in vitro e in vivo, com várias características
que a tornam um composto anticâncer potencial (TAN et al., 2003). Tais estudos demonstram
que o seu uso oral parece ser seguro e possivelmente útil no tratamento do câncer, o que é
visto no estudo dos autores e reforçado em revisão de Yance e Sagar (2006), enfatizando o
caráter antiangiogênico da substância.
Os efeitos de extratos hidro-alcóolicos de 16 plantas encontradas em território francês
e possuidoras de substâncias fenólicas e flavonóides foram avaliados com relação à ação
antioxidante, antiinflamatória e citotóxica. Dois extratos tiveram resultados comparáveis à
quercetina, usada como controle quanto à ação antioxidante. No ensaio citotóxico utilizando
células de melanoma de camundongo, linhagem B16, e a metodologia azul de tripan, seis
extratos mostraram um efeito anti-proliferativo significativo quando utilizados em altas
concentrações (> 0,5 mg/mL) (TROUILLAS et al., 2003).
Os resultados obtidos por Saija et al. (1995) mostram a quercetina, dentre quatro
flavonóides estudados, como possuidora da mais alta propriedade antiradicalar, fato atribuído
às suas características estruturais. A rutina, por sua vez, apresentou um efeito antioxidante
comparável ao da quercetina. Por outro lado, em condições experimentais com grandes
quantidades de íons metálicos, a mesma pareceu não interagir com membranas, o oposto da
quercetina e da naringenina, ambas com forte interação com a bicamada lipídica celular.
Outros resultados reforçam a quercetina como agente antitumoral, mostrando seu
efeito inibitório, avaliado em células derivadas de osteosarcoma de camundongo (UMR106) e
de calvária osteoblástica de rato não transformada (MC3T3E1) com ajuda do corante cristal
violeta (FERRER et al., 2006). Além disso, ensaio antitumoral SRB mostrou uma
sensibilidade de células humanas normais à quercetina, o que aconteceu em menor
intensidade no teste com linhagens tumorais gástrica, pulmonar e hepática (TAN et al., 2003).
Dentre as diferentes fontes de obtenção da quercetina, uma delas foi avaliada por
Hakimuddin et al. (2004). O efeito de três diferentes flavonóides extraídos de frações obtidas
de vinho tinto foram avaliados quanto ao seu efeito antiproliferativo celular na linhagem
35
MCF-7, MCF-10A (linhagem de células epiteliais imortalizadas de mama humana) e HMEC
(linhagem de células epiteliais de mama humana) através de ensaio SRB. Na presença dos
flavonóides, as linhagens de células normais cresceram normalmente, enquanto que a
linhagem cancerígena sofreu uma mudança em sua morfologia e se tornou apoptótica.
Quercetina suprime a síntese de DNA de uma maneira dose-dependente e, 48h após a
adição da substância in vitro, o crescimento das células de câncer gástrico decaiu para
aproximadamente 70%, 23% e 10% do nível do controle em tratamento com 3,0; 9,0 e 21,16
µg/mL da substância, respectivamente (YOSHIDA et al., 1990).
Além da atividade contra linhagens tumorais, a atividade antioxidante in vitro e efeitos
hepatoprotetores da quercetina foram analisados, por Lima et al. (2006), usando a linhagem
celular HepG2 (hepatocarcinoma) e o t-BHP, um hidroperóxido orgânico tóxico, e o ensaio
MTT para determinar a viabilidade celular.
Para reafirmar o uso da quercetina em diversas atividades biológicas, os resultados
obtidos por Willain Filho (2005) mostram que ela apresenta uma importante ação
antinociceptiva quando administrada via intraperitoneal e oral em camundongos, destacando-
se sua marcada e prolongada ação contra a dor induzida por ácido acético, quando
administrada intraperitonealmente. Em comparação com analgésicos tradicionais, a quercetina
mostrou ser de três a quatro vezes mais potente do que a aspirina e o paracetamol em mesmo
modelo de dor.
2.6 Quinonas
2.6.1 Aloina e emodina
As quinonas naturais são de vital importância para vegetais superiores, artrópodes,
fungos, liquens, bactérias, algas e vírus. Devido a essa distribuição em variados organismos,
suas funções biológicas são múltiplas, agindo de forma notável em seus diversos ciclos
bioquímicos (SILVA et al., 2003).
Em estudos farmacológicos, as quinonas mostram variadas atividades, dentre elas as
propriedades microbicidas, tripanossomicidas, viruscidas, antitumorais e inibidoras de
sistemas celulares reparadores, processos nos quais atuam de diferentes formas. Uma
atividade marcante é a inibição do complexo das topoisomerases, o que provoca o início da
apoptose celular e, consequentemente, tem despertado a atenção na criação de estratégias para
o combate de neoplasias, principalmente relacionadas ao câncer de próstata (SILVA et al.,
2003).
36
Baseado na estrutura molecular, as quinonas são divididas em diferentes grupos,
utilizando-se como critério o tipo de sistema aromático que sustenta o anel quinonoídico:
benzoquinonas – um anel benzênico; naftoquinonas - um anel naftalênico; antraquinonas - um
anel antracênico linear ou angular (SILVA et al., 2003).
De acordo com Cichewicz et al. (2004), numerosas antraquinonas têm sido relatadas
como inibidoras de células tumorais e têm sido usadas clinicamente como agentes anticâncer.
Plantas do gênero Aloe têm sido tradicionalmente aplicadas na prática medicinal por
milhares de anos em várias culturas do mundo e fazem parte do uso popular como tratamento
cosmético e fitoterapêutico, sendo conhecida, nesse gênero, a classe de compostos ativos
antraquinona, da qual fazem parte aloina e emodina.
Devido ao fato de plantas e ingredientes botânicos contendo aloina serem amplamente
utilizados na medicina tradicional e em produtos vendidos no varejo (suplementos alimentares
e cosméticos), suas propriedades toxicológicas têm sido amplamente estudadas (WAMER et
al., 2003).
Aloina é identificada como um dos principais compostos do gênero Aloe, exibindo
efeito antioxidante significativo em concentrações de 0,38 a 0,92 µg/mL, através de ensaio de
quimioluminescência (TIAN; HUA, 2005).
Resultados obtidos na avaliação de sucos de folhas das espécies Aloe ferox Miller e
Aloe arborescens Miller mostraram ser estas capazes de acelerar a progressão do fechamento
de ferimentos provocados experimentalmente em ratos e coelhos. A administração tópica das
mesmas preparações, possuidoras de aloina, dentre outras substâncias, inibiu o crescimento
das quatro linhagens de bactérias testadas, além de mostrarem ser fungitóxicas à espécie
Cryptococcus neoformans (JIA et al., 2008).
Aloina extraída de Aloe excelsa, planta usada no tratamento de vários males cutâneos,
estomacais e usada como laxativa, mostrou atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, podendo ser comparada a espécies já comercialmente exploradas
(COOPOOSAMY; MAGWA, 2006).
Aloina (C
21
H
22
O
9
) foi testada em linhagens tumorais humanas e mostrou possuir efeito
antiproliferativo (NIĆIFOROVIĆ et al., 2007), citotóxico em linhagens de câncer de mama
humanas (ESMAT et al., 2006), porém, em células leucêmicas, aloina mostrou ser destituída
de atividade antitumoral (GRIMAUDO et al., 1991).
Larvas de Artemia franciscana foram expostas ao extrato obtido de gel de Aloe vera,
contendo aloina e outras antraquinonas e resultou em uma DE
50
de 1,44 µg/mL após
exposição por 24h (COCK; RUEBHART, 2008).
37
Figura 6 – Estrutura química da aloina.
Emodina (C
15
H
10
O
5
) é uma substância ativa de várias drogas oriundas de ervas
laxativas, tais como aloe, senna e ruibarbo (raiz e rizoma de Rheum palmatum L.) (WANG et
al., 2001), além de ser um corante amplamente distribuído entre fungos e liquens (TEICH et
al., 2004). Hidroxiantraquinonas possuem, segundo Wang et al. (2001), várias atividades, tais
como: antiviral, anticâncer e vasorelaxante.
Yang et al. (2003) sugeriram a utilização da emodina como novo agente larvicida de
ocorrência natural e ativo sobre larvas dos mosquitos Aedes aegypti, Aedes togoi e Culex
pipiens pallens, pois em seu experimento, a substância extraída de Cassia obtusifolia
apresentou DE
50
de aproximadamente 1,9; 2,2 e 1,4 mg/L, respectivamente para as espécies
citadas. Além disso, um outro resultado encontrado foi que a emodina possui uma potente
atividade antimutagênica e uma atividade antigenotóxica muito eficaz (LEE et al., 2005).
A habilidade da emodina se incorporar e atravessar bicamadas fosfolipídicas foi
testada por Alves et al. (2004) para determinar o coeficiente de partição fosfolipídeo-água
usando modelos de membranas. Foi estudada também a eficácia da emodina como
antibacteriana e/ou antiviral quando incorporada em membranas fosfolipídicas comparada
com a observada na forma livre. A capacidade bacteriostática da emodina em inibir o
crescimento de Escherichia coli (DH5a) - MIC
50
- foi de 0,59 µg/mL quando incorporada a
lipossomos, enquanto que emodina completamente solubilizada em soluções aquosas em
concentração de 4 µg/mL não mostrou atividade, provavelmente devido a sua baixa
solubilidade. Emodina pode, ainda, ser considerada um agente viruscida, pois mostrou
inibição total sobre vírus VHSV (vírus da septicemia hemorrágica viral) quando adicionado
8h após a infecção (ALVES et al., 2004).
38
Devido à importância da interrupção no processo de adesão celular na metástase,
Huang et al. (2006) examinaram o efeito da emodina, mostrando ser a substância uma forte
inibidora da adesão nas linhagens humanas: MDA-MB-231 (câncer de mama), HeLa
(carcinoma cervical humano), HepG2 (hepatocarcinoma) e HSC5 (carcinoma escamoso de
pele), sugerindo que tal efeito não é tipo celular-dependente.
Outro fator importante no desenvolvimento tumoral é a apoptose celular. De acordo
com Lee (2001b), a emodina causa morte de células CH27 (linhagem de células cancerígenas
escamosas de pulmão) através de apoptose química e receptor-induzida. Em seu trabalho, as
alterações morfológicas causadas pela substância foram identificadas em tal linhagem celular:
em tratamento de 4h com 13,51 µg/mL de emodina apareceram vesículas nas células e, em
16h, houve um arredondamento e eventual desprendimento das células do substrato.
A citotoxicidade após tratamento das linhagens celulares tumorais humanas: A549
(pulmão), SK-OV-3 (ovário), SKMEL-2 (melanoma), XF498 (sistema nervoso central) e
HCT-15 (cólon) foi determinada in vitro pelo método SRB através da estimativa da taxa de
inibição da proliferação celular depois de contínua exposição, por 48h, à emodina e outras
substâncias testadas em triplicata, com cisplatina como controle positivo (LEE et al., 2005).
Porém, o mecanismo molecular do efeito quimioterapêutico pronunciado da emodina
permanece sem explicação. A determinação do seu modo de ação pode ser importante para o
desenvolvimento de sua aplicação (SU et al., 2005).
A emodina e uma série de derivados foram avaliados quanto à atividade antitumoral e
afinidade óssea para pesquisa de compostos mais eficientes e menos tóxicos. Todos
mostraram afinidades em diferentes graus e, em ensaio MTT, emodina apresentou uma taxa
de inibição celular in vitro, em células de osteosarcoma, de 24,9x10
-5
mol/L (CHEN et al.,
2007).
De forma a corroborar a atividade antitumoral encontrada in vitro, Yang et al. (2004),
em dose de 30 mg/kg/dia, mostraram que a emodina, injetada intraperitonealmente durante 18
dias, possui atividade em camundongo inoculado subcutaneamente com células EC/CUHK1
(linhagem derivada de carcinoma esofágico).
Além disso, dentre quatro antraquinonas, emodina apresentou a atividade supressora
mais alta na proliferação celular de seis linhagens de células tumorais (linhagens K562 e Raji
– eritroleucemias; VERO; Calu-1 – carcinoma de pulmão humano; HeLa; Wish – linhagem
epitelial transformada) testadas por Kuo et al. (1997). Tal atividade inibidora no crescimento
de células tumorais foi relatada para os compostos presentes na espécie testada: Polygonum
hypoleucum Owhi, tradicionalmente usada na medicina chinesa.
39
Outras linhagens susceptíveis à ação da emodina foram mostradas na inibição da
proliferação de três linhagens celulares de hepatoma humano, avaliadas pelo ensaio de
redução do sal XTT-tetrazólio: HepG2/C3A, PLC/PRF/5 e SK-HEP-1 e que uma alta dose da
substância, 16,21 µg/mL, resulta na indução de apoptose em células HepG2/C3A (SHIEH et
al., 2004).
Lee (2001b) investigou os mecanismos pelos quais aloe-emodina e emodina induzem
citotoxicidade em linhagens celulares de carcinoma de pulmão (CH27 e H460) e confirmaram
que a atividade antitumoral da emodina é baseada na morte celular por apoptose. A exclusão
pelo corante azul de tripan mostrou que a morte celular é significativa na concentração de
13,51 µg/mL e considerada tempo e dose-dependente (0 a 72h de exposição e 0,27 a 13,51
µg/mL de emodina).
Por fim, emodina apresentou uma das características necessárias à função
antiangiogênica, inibindo a proliferação de células endoteliais da veia de cordão umbilical
humano (HUVECs) (KANESHIRO et al., 2006). Em concentração de 5,4 µg/mL de emodina,
houve inibição de 50% do crescimento celular, o que, juntamente com outros estágios
angiogênicos principais, incluindo proliferação, migração e formação do tubo, mostraram que
a emodina é capaz de inibir tal atividade in vitro e também suprimi-la in vivo.
Figura 7 – Estrutura química da emodina.
2.6.2 Lapachol e β-lapachona
Dentre as naftoquinonas naturais destaca-se o lapachol que pode ser considerado um
dos principais representantes do grupo das quinonas das Tabebuias (SILVA et al., 2003),
planta usada como diurética, adstringente e também como remédio popular na prevenção e
tratamento de câncer (FUJIMOTO et al., 1991).
O lapachol (C
15
H
14
O
3
) possui a seguinte estrutura química:
40
Figura 8 - Estrutura química do lapachol.
De uma maneira geral, lapachol possui uma extensa lista de atividades biológicas:
antitumorais, anti-metastática, antimicrobiana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, anti-
parasítica, leishmanicida e moluscicida, segundo revisão recente de Hussain et al. (2007).
A atividade citotóxica in vitro do lapachol contra o carcinoma Ehrlich é reportada por
Esteves-Souza et al. (2007), através do ensaio da viabilidade celular (MTT), inibindo 30% do
crescimento celular a uma concentração de 12,11 µg/mL. Em mesmo estudo, derivados da
substância comprovaram ser inibidores de crescimento, dose-dependente, de células
leucêmicas K562. Em tumor sólido Walker 256 (carcinosarcoma), lapachol mostrou uma
redução de 92% no crescimento do tumor quando administrado oralmente em ratos em dose
diária de 150 mg/kg (LINARDI et al., 1975).
O sal de potássio de lapachol é um moluscicida ativo sobre massas de ovos de
Biomphalaria glabrata (caramujo que participa do ciclo de vida do parasita transmissor da
esquistossomose), porém, consideravelmente menos tóxico a Tilapia nilotica, em ensaio
piscicida. Também, lapachol mostrou ser um ativo cercaricida (concentração de 2 µg/mL)
sobre Schistosoma mansoni, matando 90% das cercárias de ratos infectados
intraperitonealmente (LIMA et al., 2002).
Derivados nitrogenados sintéticos do lapachol tiveram suas ações sobre larvas de
Aedes aegypti, A. salina e células tumorais de mama (linhagem A549) comparados por
Oliveira et al. (2002). Este trabalho mostrou ser o lapachol o mais ativo larvicida de Aedes
aegypti e sobre larvas de A. salina.
Lima et al. (2004) conduziram um estudo para avaliar a atividade in vitro do lapachol
e análogos sobre duas espécies de Leishmania: L. amazonensis e L. braziliensis. Tais
substâncias apresentaram CI
50
variando entre 1,6±0,0 a 7,8±0,3 µg/mL para a primeira espécie
e 3,4±0,5 a 54,0±9,0 µg/mL para a segunda. O derivado acetilisolapachol mostrou ser o mais
ativo in vivo em camundongos suíços infectados com a forma promastigota de L. amazonensis
41
e in vitro sobre L. braziliensis e não ser prejudicial à célula hospedeira, em concentração
equivalente à CI
50
para a espécie.
Lapachol mostrou, ainda, um efeito citotóxico significativo como um potencial
herbicida, causando um efeito fitotóxico sobre o sistema radicular de plantas de Hyptis
suaveolens (71,43%) em bioensaios em vasos (FERREIRA et al., 2000).
Devido a sua atividade antitumoral, o lapachol é um candidato ideal a modificações
sistemáticas para um melhor entendimento da sua relação estrutura-atividade e,
eventualmente, desenvolvimento de análogos com melhor atividade biológica (HUSSAIN et
al., 2007).
Estudos conjuntos de lapachol e β-lapachona podem ser encontrados na literatura,
como o de Salas et al. (2008), no qual as duas substâncias, em conjunto com alguns
derivados, foram avaliadas quanto à inibição de crescimento de formas epimastigotas (formas
replicativas presentes no tubo digestivo do inseto vetor) de Trypanosoma cruzi, apresentando
CI
k50
(concentração necessária para diminuir a constante de crescimento em 50%) de
7,6±2,42x10
-3
e 5,1x10
-2
±2,42x10
-3
µg/mL, respectivamente. A viabilidade de formas
tripomastigotas (formas encontradas no sangue de mamíferos e que são, portanto, alvo de
drogas anti-chagásicas) foi expressa em porcentagem de viabilidade em relação ao controle
(100% de tripomastigotas viáveis) e foram: 41,7% em tratamento com lapachol e 4,8% com
β-lapachona em concentrações equivalentes às encontradas para CI
k50
.
O efeito do lapachol em metástase experimental de células de melanoma murino
B16BL6 no pulmão de ratos sugere que altas doses da substância (80 e 100 mg/kg)
promovem metástase. Porém, baixas doses de lapachol (0,5; 5; 10 e 20 mg/kg) administrado
oralmente inibiram de maneira fraca, mas ainda significativamente a metástase, sugerindo um
possível uso como agente anti-metastásico (MAEDA et al., 2008).
De acordo com Silva et al. (2003), em seu trabalho de revisão, as quinonas estão
distribuídas em vários organismos, o que poderia explicar as múltiplas funções biológicas e a
ação em diversos ciclos bioquímicos. Algumas quinonas possuem atividade antibiótica e
antitumoral já usadas clinicamente, sendo citada como exemplo de formas isoméricas que
diferem quanto às propriedades físicas, químicas e atuação biológica, uma outra naftoquinona,
a β-lapachona, a qual possui atividade pronunciada sobre Trypanosoma cruzi, contrariamente
ao seu isômero natural, a α-lapachona.
A β-lapachona é uma orto-naftoquinona obtida do ipê (Tabebuia sp.), nativa da
América Central e do Sul (HUSSAIN et al., 2007). Possui a fórmula química C
15
H
14
O
3
e a
seguinte estrutura química:
42
Figura 9 - Estrutura química da β-lapachona.
Em seu trabalho de revisão sobre as atividades biológicas de lapachol e β-lapachona,
Hussain et al. (2007) relatam suas atividades antiangiogência, antiinflamatória e antitumoral.
β-lapachona tem demonstrado atividade antineoplásica significativa sobre linhagens
celulares de câncer humano, em concentrações na faixa de 0,24 a 2,42 µg/mL (valores de
CI
50
) quando utilizada isoladamente (ABREU et al., 2007). Tal atividade pode ser atribuída
ao seu caráter lipofílico (SCHAFFNER-SABBA et al., 1984), um facilitador da passagem
através da membrana celular.
O alto grau de seletividade da β-lapachona, a qual induz apoptose em células
transformadas, mas não interfere na proliferação de células normais (linfócitos estudados), é
reportado por Li et al. (2003), mostrando não ser esta um agente antiproliferativo geral, uma
propriedade não compartilhada por agentes quimioterápicos convencionais. A β-lapachona
induz também apoptose em células MCF-7 (WUERZBERGER et al., 1998).
O efeito citotóxico da β-lapachona no crescimento de células de hepatocarcinoma
(linhagens HepG2 e Hep3B) foi determinado através do ensaio MTT. Tal estudo identificou
ser a β-lapachona forte inibidora da proliferação celular, de maneira dose-dependente e, ainda,
numa concentração de 0,85 µg/mL, retardatária da motilidade celular nas linhagens estudadas,
demonstrado em experimento de cicatrização de ferimento in vitro, indicando um potencial
supressor de metástase e divisão celular (KIM et al., 2007).
A forma de atuação in vitro da β-lapachona no ciclo celular foi evidenciada por Kumi-
Diaka (2002) através da ação sinergética de 0,6 µg/mL da substância com uma concentração
de genisteína (isoflavona) variando entre 0 e 70 µg/mL em linhagens tumorais de próstata
(PC3 e LNCaP).
β-lapachona age nos pontos de checagem G1 e S do ciclo celular. Tanto em
tratamento isolado ou combinado, β-lapachona inibiu o crescimento e diminuiu a
43
sobrevivência das linhagens celulares, determinado por ensaio MTT após 48h de incubação
com a substância em atmosfera de 5% de CO
2
a 37ºC. A porcentagem de células mortas
atingiu seu ápice numa concentração de 0,73 µg/mL.
β-lapachona foi utilizada em frangos infectados intraperitonealmente com vírus do
sarcoma de Rous (31,3 ou 15,6 mg/kg, via oral) e mostrou-se que houve um prolongamento
significativo do tempo de sobrevivência dos animais, bem como com a administração da β-
lapachona (125 mg/kg, via oral, por cinco dias por semana durante quatro semanas) em ratos
Balb/c infectados com vírus da leucemia Rauscher. Entretanto, uma dose mais elevada de 250
mg/kg via oral causou encurtamento do tempo de sobrevivência e aumento no número de
células sanguíneas leucêmicas (SCHAFFNER-SABBA et al., 1984).
Rinacantona, uma 1,2-piranonaftoquinona e um derivado de 1,4-furanonaftoquinona
mostraram-se ativas frente a linhagem celular Hela (carcinoma cervical humano). A β-
lapachona é uma 1,2-naftoquinona estruturalmente relacionada à rinacantona, o que explicaria
a atividade antitumoral dessas substâncias e seus derivados pelos mesmos mecanismos de
ação (apoptose por inibição da DNA topoisomerase I e II) (KONGKATHIP et al., 2003).
No estudo de Gupta et al. (2002), foi demonstrado, através de ensaio MTT, que a β-
lapachona (concentração 2,4 µg/mL) possui uma atividade antitumoral significativa (CI
50
=
0,97-1,94 µg/mL) em linhagens quimiosensíveis a dexametasona, quimioresistentes e de
pacientes primários de melanoma múltiplo. Essa forte atividade elege a β-lapachona como
controle positivo em ensaios com linhagens cancerígenas (HAYASHI et al., 2004).
A CI
50
da β-lapachona (controle positivo) em formas epimastigotas de Trypanosoma
cruzi e a concentração citotóxica que levou à morte de 50% das células VERO (linhagem
celular de mamífero) foram estudadas para comparar os valores com os encontrados para
derivados da substância. Os parasitas e as células foram incubados com os compostos
variando em concentrações de 12,11 a 7,3x10
-2
µg/mL e os valores experimentais encontrados
foram: CI
50
igual a 0,22 µg/mL para a atividade tripanocida e < 0,75 µg/mL para a atividade
citotóxica celular, corados com cristal violeta (FERREIRA et al., 2006).
De acordo com os dados observados durante o levantamento bibliográfico, os produtos
naturais perfazem uma fonte promissora de novos compostos antitumorais, sendo alvo de
diversas pesquisas quanto a outras diversas formas de atividades biológicas. Uma
contextualização da atual situação destas pesquisas é apresentada a seguir.
44
2.7 Produtos naturais e o câncer na atualidade
Nas últimas décadas ocorreu um aumento significativo da expectativa de vida
mundial, principalmente de países desenvolvidos, o que resulta em um aumento da população
idosa. Este fenômeno, considerado um dos responsáveis pela maior ocorrência de diversos
tipos de câncer, como observado por Jemal et al. (2006), coloca a doença como a causa
principal das mortes entre mulheres de 40 a 79 anos de idade e entre homens de 60 a 79 anos.
Os fármacos existentes para o tratamento do câncer ainda apresentam efeitos
farmacológicos moderados e um alto índice de efeitos colaterais, o que é um reflexo do baixo
índice terapêutico observado para esta classe de compostos. Além disso, de acordo com a
Agência Reguladora Americana - FDA, para alguns tipos de câncer existe apenas uma opção
terapêutica disponível, como no caso do câncer de rim, que é tratado classicamente com
doxorubicina, e de melanoma, tratado com Interferon alfa-2b adjuvante ao tratamento
cirúrgico (US Food and Drug Administration, 2008), acarretando, em caso de insucesso do
tratamento ou rejeição por parte do paciente, na morte deste. Assim, a necessidade pela busca
de novos compostos com atividade antineoplásica torna-se uma necessidade premente.
Em uma revisão realizada por Newman e Cragg (2007), reafirmada por Brower (2008)
e Gordaliza (2007) foi observado que entre os fármacos para o tratamento do câncer,
aproximadamente 60% são derivados de produtos naturais, sendo que mais de cem compostos
obtidos a partir destes, estão, atualmente, em ensaios clínicos e pelo menos cem projetos
similares estão em desenvolvimento pré-clínico (HARVEY, 2008), mostrando a importância
desta classe de compostos na busca de outros para o tratamento de câncer. Neste contexto, o
Brasil apresenta-se como um importante celeiro para busca de novos fármacos, pois se
encontra entre os países de maior biodiversidade mundial. Porém, este potencial ainda não é
totalmente explorado devido ao fato de diversos grupos de pesquisa que trabalham com
produtos naturais, não possuírem infra-estrutura para realizar ensaios citotóxicos clássicos
utilizando a avaliação em cultura de células. Assim, o estabelecimento de uma correlação
mais clara entre a atividade citotóxica em A. salina e o ensaio com células tumorais para
substâncias puras naturais, visa fornecer uma maior segurança na busca de novos protótipos
para o tratamento do câncer. Por ser o primeiro um ensaio simples, de baixo custo, de fácil
implementação e com uso de um organismo vivo e o segundo de caráter complexo, com
técnicas dispendiosas que exigem treinamento para manuseio de equipamentos e execução de
metodologia detalhada, uma avaliação aprofundada desta correlação possibilita uma economia
de tempo, material utilizado e quantidade de substância necessária. Além disso, torna possível
a execução deste screening inicial por diversos grupos de pesquisa brasileiros, os quais se
45
encontram distribuídos por todo o território nacional e exploram diferentes biomas que
compõe nossa flora, aumentando consideravelmente a possibilidade de descoberta de novos
fármacos com potentes atividades antineoplásicas e gerando divisas para o país através da
exploração racional da biodiversidade brasileira.
46
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Correlacionar qualitativa e quantitativamente a concentração letal necessária no teste
citotóxico em A. salina e a concentração inibitória para o crescimento de linhagens celulares
tumorais, utilizando dez substâncias puras previamente conhecidas, pertencentes a três classes
diferentes de produtos naturais.
3.2 Objetivos Específicos
Confirmar o ensaio da A. salina como indicador da existência de atividade
antitumoral.
Determinar a DE
50
de dez substâncias em ensaio com A. salina e a CI
50
para duas
linhagens celulares tumorais em ensaio antitumoral através do método da sulforrodamina B.
Determinar a existência de uma correlação qualitativa e quantitativa entre o bioensaio
de A. salina e o ensaio biológico antitumoral.
Estabelecer a relação qualitativa e quantitava da DE
50
para as larvas de A. salina e a
CI
50
para o crescimento das duas linhagens de células tumorais testadas.
47
4 METODOLOGIA
4.1 Drogas
Duguetina foi obtida através da extração alcaloídica da casca do caule subterrâneo de
Duguetia furfuracea (Annonaceae) conforme metodologia descrita em Silva et al. (2007).
Boldina, aloina, emodina, quercetina e rutina foram adquiridas comercialmente como
padrões Sigma-Aldrich.
Lapachol e β-lapachona foram extraídos da espécie Tabebuia serratifolia e
gentilmente cedidos pelo Laboratório do professor Dr. Delio Soares Raslan, Departamento de
Química - ICEX - da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, sendo a β-lapachona
obtida por síntese a partir do lapachol.
Os dois alcalóides N-nitrosos (N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina) avaliados foram
obtidos segundo metodologia descrita em Carollo et al. (2006).
4.2 Artemia salina
O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina foi conduzido segundo metodologia
descrita por Siqueira (1999), adaptada quanto à quantidade de ovos de A. salina para cada
litro de solução salina e quanto às concentrações testadas.
A solução marinha foi preparada utilizando-se sal marinho sintético (Marinemix –
Marine Enterprises International Inc.) e água destilada (38 g de sal/litro de água), sendo esta
dividida em duas partes, uma para a eclosão dos ovos e a outra para a preparação das
diluições das substâncias-teste, com pH variando entre 8-9. Em um litro de solução salina
acondicionado em uma cuba de vidro foi adicionado aproximadamente 80 mg de ovos
comerciais de A. salina (Maramar), submetidos a um choque de luz com lâmpada de 100 W,
por duas horas. O sistema foi mantido em temperatura ambiente por mais 46h, protegido de
poeira e insetos e aerado com uso de aerador comercial para aquário. O restante da solução
salina foi acondicionado em outro recipiente e também submetido às mesmas condições de
iluminação, temperatura e aeração (Figura 10).
48
Figura 10 – Esquema do ensaio de citotoxidade em A. salina
Sulfato de quinidina (controle positivo) - DE
50
= 215 µg/mL (MEYER et al., 1982) e
as substâncias avaliadas foram solubilizadas em DMSO 1% e acrescentada a solução salina
aerada de forma a obter as seguintes concentrações: 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL e
31,25 µg/mL. Tais concentrações foram inferidas pelos experimentos de Siqueira (1999) em
estudo com extratos, óleo volátil e substâncias puras obtidas de Duguetia glabriuscula e
Unonopsis lindmanii. O controle negativo foi feito com solução salina e DMSO 1%.
Substâncias com baixa solubilidade foram levadas ao banho-maria e ultrassom.
Para cada diluição foram montadas triplicatas, sendo em cada frasco transparente de
10 ml adicionadas, com auxílio de uma pipeta Pasteur, dez larvas de A. salina em sua fase
náuplio e 3 ml da diluição a ser testada. Um foco de luz produzido por lâmpada de 100 W
(devido ao fototropismo positivo do microcrustáceo) e fundo escuro para contraste foram
utilizados na transferência das larvas para o frasco-teste. Os frascos foram distribuídos
aleatoriamente em uma bandeja e mantidos por 24h em temperatura e iluminação ambientes e
protegidos de poeira e insetos.
Após tal período foi realizada a leitura com auxílio de lupa, foco de luz e fundo escuro
de contraste, considerando-se mortos aqueles microcrustáceos que não se movimentaram
durante a observação e nem com a leve agitação do frasco.
Todo o experimento foi conduzido no laboratório de Farmacognosia da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul – UFMS.
Os resultados foram analisados através do programa Probitos para determinação da
dose efetiva para matar 50% das larvas, com intervalo de confiança de 95%.
49
4.3 Ensaio antitumoral
O ensaio SRB é adotado pelo National Cancer Institute para avaliações em larga
escala e descoberta de novas drogas antitumorais (NCI, 2008).
A inibição do crescimento celular, um indicador da citotoxicidade, causada pelos
compostos que estão sendo avaliados quanto à atividade antineoplásica, foram visualizados
em células Hep
2
(ATCC-CCL-23, de carcinoma de laringe) adquirida do Instituto Adolpho
Lutz (São Paulo, SP), e B16-F10 (ATCC-CRL-6322, de células de melanoma) doada pelo Dr.
Auro Nomizo, Prof. Dr. da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -
Universidade de São Paulo. As células foram cultivadas em frascos estéreis de 25 cm
2
na
presença de meio de cultura, DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s) para a linhagem Hep
2
e
RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)
para B16-F10, ambos contendo 10% de soro
fetal bovino, 100 U/mL de penicilina; 0,1 mg/mL de estreptomicina e 0,25 µg/mL de
anfotericina (meio completo) e mantidas a 37
0
C em atmosfera úmida com CO
2
(5%). Foi
utilizado microscópio invertido da ZEISS (Modelo Axiovert 25) em aumento de 400x para a
observação do crescimento das células.
Uma vez que estas células são aderentes, é necessário fazer a remoção das mesmas
com a solução de tripsina (0,25% + EDTA
1 mM) em tampão PBS, pH 7,4. Em seguida,
foram transferidas para tubos cônicos de 15 ou 50 mL contendo respectivos meios de cultura
completo, de acordo com a linhagem testada. Após centrifugação a baixa rotação, o meio e
tripsina foram desprezados e as células ressuspendidas em pequeno volume de meio
completo. Foi feita a contagem com uma alíquota dessas células em uma câmara de Neubauer
para que em cada cavidade da placa de 96 poços fosse depositado um volume de 100 µL de
meio contendo 10.000 ou 12.000 células, respectivamente para Hep
2
e B16 (100.000/mL ou
120.000/mL).
Após 20h, para permitir a fixação das células semeadas, o meio foi aspirado para a
adição dos compostos a serem avaliados. Uma alíquota destes compostos, previamente
dissolvidos em DMSO, foi diluída em meio de cultura, de tal forma que a concentração final
do solvente (DMSO), não excedesse 0,5%. Foram utilizadas quatro concentrações de cada
composto (entre 0,25 e 50 µg/mL), sendo cada concentração adicionada em três cavidades
(triplicata). Para o controle negativo, as células cresceram na ausência de qualquer composto e
contendo somente meio de cultura com DMSO 0,5% (o solvente utilizado para dissolver os
compostos-teste). Em todos os testes foi utilizado um controle positivo, Cisplatina [cis-
diclorodiamino-platinum (II)] da Sigma.
50
Todas as placas foram novamente mantidas na mesma incubadora a 37
0
C e CO
2
5%,
até o final do período de exposição das células aos compostos-teste (48h).
O teste de citotoxicidade adotado baseia-se na coloração das proteínas, pelo corante
SRB (Sigma). Este corante possui dois grupos sulfônicos e liga-se às proteínas das células
fixadas na placa, que são precipitadas pelo ácido tricloroacético (TCA – Sigma). Após 48h, o
meio foi removido e substituído por 100 µL de TCA 20%. As placas foram incubadas por
meia hora a 4
0
C, em geladeira e, posteriormente, o TCA foi removido e as placas lavadas
cinco vezes com água corrente. Após secagem ambiente, adicionou-se 50 µL de SRB 0,1%
(diluído em ácido acético 1%) e novamente incubadas por meia hora em temperatura
ambiente. Em seguida, foi feita a remoção da solução de SRB, as placas foram lavadas quatro
vezes com ácido acético 1%, secas e foi adicionada Tris Base 10mM (Sigma). Em seguida,
foram submetidas a uma agitação de dez minutos para a dissolução das proteínas coradas e a
absorbância medida a 540 nm em leitor de microplacas.
A absorbância encontrada para o controle negativo correspondeu ao valor de 100% de
sobrevivência. Como parâmetro para a citotoxicidade, foi utilizado o valor da CI
50
, que
representa a atividade antineoplásica das substâncias testadas. A CI
50
e o limite de confiança
de 95% foram determinados em programa PROBITOS (FINNEY, 1971), a partir das
diferenças de leituras de absorbância entre o controle negativo (sem tratamento) e o
composto-teste (com tratamento). Os resultados expressos como média, resultam de dois ou
três experimentos independentes.
Todo o experimento foi conduzido no Laboratório de Biologia Molecular e Cultura
Celular da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul – UFMS.
51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Artemia salina
A dose efetiva para matar 50% das larvas de A. salina destaca quatro, das dez
substâncias testadas, como tóxicas à A. salina (Tabela 1), sendo três pertencentes à classe das
quinonas e a de melhor atividade à classe dos alcalóides.
Tabela 1 – Dose efetiva (DE
50
) de dez substâncias e dos controles positivos em ensaio de
toxicidade em A. salina com intervalo de confiança de 95% determinado pelo
programa Probitos.
Substância DE
50
(µg/mL)
*
Intervalo de confiança 95% (µg/mL)
duguetina 20,8 9,80 – 44,09
boldina >250 -
N-nitrosoanonaina >250 -
N-nitrosoxilopina >250 -
rutina >250 -
quercetina >250 -
aloina >250 -
emodina 25,1 17,85 – 35,27
lapachol 137,8 113,07 – 167,97
β-lapachona 72,7 62,42 – 84,67
cisplatina 110,5 87,2 – 140,0
sulfato de quinidina 169,8 109,79 – 262,65
*
DE
50
: Dose efetiva para matar 50% das larvas de A. salina (µg/mL)
O ensaio da A. salina é comumente utilizado para avaliação da atividade de extratos
vegetais (clorofórmico, metanólico, dentre outros) e substâncias puras, como verificado em
Moreira et al. (2003). Já em 1982, Meyer et al. procuravam um teste geral que detectasse um
largo espectro de atividades farmacológicas em plantas superiores e que pudesse ser aplicado
por químicos de produtos naturais a um preço baixo, de forma simples e que guiasse
screenings fitoquímicos e fracionamento de extratos. Assim, começaram a usar o
microcrustáceo A. salina como um instrumento de bioensaio geral em sistema zoológico e
indicativo de atividades farmacológicas específicas, fato este demonstrado pelos resultados
encontrados nas Tabelas 1 e 2.
Tal ensaio da letalidade do microcrustáceo continuou a ser empregado em screenings e
é considerado, hoje, como uma ferramenta útil na avaliação preliminar da citotoxicidade
(MOJICA E MICOR, 2007). Além do seu uso na detecção da poluição aquática e em
52
micologia experimental e aplicada, seu uso é difundido na avaliação de extratos brutos,
isolamento de compostos ativos, testes de toxicidade geral de compostos naturais puros e
fracionamentos sem bioatividade guiada ou usando outro organismo-teste (CEPLEANU,
1993).
Para os testes biológicos em ratos, A. salina e antimicrobiano, as duas substâncias
puras avaliadas por Lu et al. (2001) - praeruptorinas A e B - foram dissolvidas em DMSO a
5%, já que DMSO não interferiu nas respostas biológicas em testes preliminares. Porém, em
nossos testes optamos pela concentração máxima de 1% de DMSO para dissolução das
substâncias, evitando um possível resultado falso positivo.
Em trabalho de Siqueira et al. (1998) foi observada a validade e confiabilidade do
bioensaio da A. salina, onde a toxicidade de frações de Unonopsis lindmanii, acusada por tal
teste, convergiu para aquelas que continham substância reconhecidamente ativa sobre células
tumorais in vitro. O ensaio da A. salina não é específico como indicativo antitumoral ou para
qualquer ação fisiológica em particular, mas pode ser usado no monitoramento do
fracionamento de extratos, como citado por Meyer et al. (1982), os quais mostraram que 18
extratos de sementes de 41 espécies de plantas da família Euphorbiaceae apresentaram
citotoxicidade sobre as larvas do microcrustáceo. Porém, apenas seis espécies foram ativas
sobre linhagem tumoral e, destas, somente duas mostraram atividade significativa. Portanto,
as substâncias com DE
50
≤ 250 µg/mL calculadas em nosso experimento podem indicar a
existência de outras atividades biológicas.
Dentre as dez substâncias testadas, cinco apresentaram DE
50
maior que 250 µg/mL:
boldina, N-nitrosoanonaina, N-nitrosoxilopina, rutina e aloina. Dentre as três substâncias já
conhecidas e estudadas na literatura, a boldina, tida como antioxidante (SPEISKY;
CASSELS, 1994), é encontrada nas folhas de boldo, usado segundo o conhecimento popular
contra males de estômago, fígado e como diurético. A ausência de citotoxicidade em um
sistema biológico mostra a tolerância do organismo ao princípio ativo encontrado nas folhas
da espécie.
Rutina é um flavonóide glicosilado com dois açúcares em sua estrutura molecular, o
que a torna mais solúvel em água. Isso leva a uma característica de alta hidrofilicidade e uma
fraca incorporação nas membranas celulares dos organismos testados (MATSUO et al.,
2005). Como possuidor de atividade antioxidante (NG et al., 2000), sendo encontrado em
frutas e verduras, como a maioria dos flavonóides, e sendo comercializado para o tratamento
de distúrbios circulatórios (ZUANAZZI; MONTANHA 2007), é esperado que seu efeito
tóxico aconteça em concentrações muito elevadas de administração da substância.
53
Como observado por estudos científicos e pela medicina popular, plantas do gênero
Aloe são muito exploradas quanto aos seus aspectos farmacológicos, cosméticos e venda
como suplemento alimentar (WAMER et al., 2003). Isso faz da ausência da atividade em A.
salina, uma característica desejável para assegurar o seu uso em doses moderadas em sistemas
biológicos mais complexos.
N-nitrosoxilopina e N-nitrosoanonaina foram isoladas das partes aéreas de Duguetia
furfuracea por Carollo et al. (2006) e suas características biológicas necessitam de maiores
estudos para que se possa afirmar se sua ausência de atividade em A. salina é desejável para a
aplicação dessas substâncias em outros tipos de atividades.
A ausência de atividade das cinco substâncias nas concentrações testadas (DE
50
> 250
µg/mL) mostram uma inviabilidade no uso destas como agente tóxico em determinadas
atividades biológicas, como por exemplo, como uma potencial substância larvicida, já que sua
eficiência fica muito abaixo do controle positivo. Porém, tal inatividade sugere uma boa
tolerância in vivo, possibilitando sua exploração em outras atividades e mostrando uma
segurança na sua administração. Stefanello et al. (2006) encontraram uma ausência de
citotoxicidade de extratos brutos das folhas, cascas do caule e ramos de Gochnatia
polymorpha ssp. floccosa em éter de petróleo, diclorometano e etanol frente a A. salina. Tal
ausência é, segundo os autores, um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao
sistema biológico e que a espécie avaliada, usada tradicionalmente contra doenças
respiratórias é uma planta não tóxica.
Quatro substâncias apresentaram uma DE
50
mais baixa que o controle positivo –
sulfato de quinidina (169,8 µg/mL): duguetina, emodina, β-lapachona e lapachol. Dentre
estas, destaca-se a duguetina, obtida de uma planta típica da região do Cerrado, a espécie
Duguetia furfuracea e, portanto, forte candidata a estudos mais detalhados de suas atividades
biológicas. Sua dose efetiva mostrou ser cerca de oito vezes menor que o sulfato de quinidina
para matar 50% dos microcrustáceos. Dada a sua importância como invasora de pastagens
(SILVA et al., 2007) e interesse de plantas da família a qual ela pertence (família
Annonaceae), fonte de acetogeninas e outros alcalóides, sua atividade em A. salina em
concentrações baixas oferece subsídio à execução de ensaios biológicos mais específicos.
A segunda substância mais ativa foi emodina, possuidora de atividade larvicida sobre
Aedes sp. e Culex sp. (YANG et al., 2003) dentre outras já relatadas na literatura. Já para
lapachol e β-lapachona, suas atividades frente ao microcrustáceo eram esperadas, pois ambas
possuem relatos de variadas atividades biológicas, dentre elas a antitumoral (ESTEVES-
54
SOUZA et al., 2007; MAEDA et al., 2008; KUMI-DIAKA et al., 2002; ABREU et al., 2007;
KIM et al., 2007).
Como forma de comprovar a correlação de atividade em ambos os testes, a cisplatina
(controle positivo do ensaio antitumoral) foi utilizada em ensaio em A. salina. O resultado
encontrado para a substância (DE
50
= 110,5 µg/mL) indicou uma melhor atividade desta do
que o controle positivo tradicionalmente usado frente ao microcrustáceo – sulfato de
quinidina – que apresentou DE
50
= 169,8 µg/mL, conforme dados da Tabela 1. Quando
comparada quantitativamente aos resultados da substância como controle positivo nas duas
linhagens avaliadas no ensaio antitumoral, cisplatina apresentou uma DE
50
de
aproximadamente dez vezes e meia a setenta e nove vezes maior em A. salina do que sua CI
50
em Hep
2
e B16-F10, respectivamente (Tabela 2, p. 55). Tais comparações afirmam a
existência de uma correlação qualitativa entre os testes, porém não estabelece um padrão de
correlação quantitativa entre ambos, o que dificulta uma possível previsão da dose necessária
para atividade em linhagens de células tumorais partindo-se de doses efetivas encontradas
para A. salina e vice-versa.
A possibilidade de se prever uma atividade específica de uma determinada substância
a partir de um bioensaio geral facilita o direcionamento de estudos de prospecção de novas
drogas. Portanto, a existência de uma correlação positiva entre um ensaio simples e de baixos
custos e um segundo, mais complexo, dispendioso e específico permite uma avaliação prévia
daquelas substâncias que devem ou não seguir em estudos mais aprofundados, fazendo com
que os que apresentarem uma atividade detectável pelo primeiro sejam alvo de um segundo
bioensaio. Além dessa correlação qualitativa, a existência de uma correlação quantitativa
levaria a uma economia de material, tempo e uma maior praticidade na previsão de
concentrações efetivas/inibitórias a serem testadas.
Em nosso trabalho, para comprovação da existência de uma correlação qualitativa
entre o teste de A. salina com um outro ensaio biológico, procedeu-se ao teste antitumoral
SRB, mais específico e tido como uma técnica mais cara e complexa (MEYER et al., 1982).
5.2 Ensaio antitumoral
De acordo com Henriksson et al. (2006), cisplatina é uma droga quimioterápica
alquilante usada contra vários tipos de câncer e, especificamente contra tumores de cabeça e
pescoço. Pode ser usada em combinação com outras drogas ou com a radioterapia para atingir
55
o tratamento curativo, sendo por esses motivos eleita controle positivo neste ensaio
antitumoral.
As concentrações inibitórias de cada substância testada variaram de acordo com a
linhagem de células tumorais, não sendo possível afirmar que uma maior concentração é
necessária para inibir o crescimento da linhagem B16-F10 ou de Hep
2
, levando-se em conta a
diferença de CI
50
encontrada para o controle positivo (Tabela 2) em B16 (1,4 µg/mL) e Hep
2
(10,5 µg/mL).
Tabela 2 - Concentração inibitória (CI
50
) de dez substâncias e do controle positivo em células
humanas neoplásicas, linhagens B16-F10 e Hep
2
em período de incubação de 48h,
e intervalos de confiança.
Substância CI
50
(µg/mL)
**
Atividade em B16-F10 Atividade em Hep
2
duguetina 10,7 (10,2 - 11,1) 7,1 (6,6 - 7,7)
boldina >50 >50
N-nitrosoanonaina >50 >50
N-nitrosoxilopina 31,9 (28,7 - 36,2) 36,1 (33,1 - 39,3)
rutina 47,0 (44,6 - 49,6) 38,7 (37,0 - 40,3)
quercetina 6,5 (6,3 - 6,9) 18,9 (17,4 - 20,6)
aloina 45,6 (36,7 - 56,7) 38,4 (37,1 - 39,9)
emodina 2,2 (1,9 - 2,5) 1,7 (1,5 - 1,8)
lapachol 9,5 (8,7 - 10,5) 10,5 (9,6 - 11,5)
β-lapachona 0,7 (0,65 - 0,75) 0,3 (0,29 - 0,32)
cisplatina 1,4 (1,3 - 1,5) 10,5 (9,4 - 11,7)
**
CI
50
: Concentração que inibe 50% do crescimento celular (µg/mL)
β-lapachona possui comprovada atividade antitumoral (WUERZBERGER et al., 1998;
GUPTA et al., 2002; ABREU et al., 2007; KIM et al., 2007). Dentre as dez substâncias
testadas pode-se atribuir a melhor atividade antitumoral à β-lapachona, mostrando ser esta a
única com melhor atividade que a cisplatina - duas vezes superior à ela - em linhagem B16-
F10. Em linhagem Hep
2
, quatro substâncias mostraram-se tão ou mais eficazes que o controle
positivo, destacando-se, mais uma vez, a β-lapachona, com uma CI
50
trinta e cinco vezes
menor que o mesmo.
Duguetina, que apresentou a melhor atividade em A. salina destacou-se, desta vez, em
atividade sobre Hep
2
, com uma CI
50
quase uma vez e meia menor que cisplatina. Sua
atividade foi, ainda, superior à do lapachol, relatado na literatura como citotóxico sobre
carcinoma (ESTEVES-SOUZA et al., 2007), redutor do crescimento de tumor sólido
(LINARDI et al., 1975) e possível agente antimetastásico (MAEDA et al., 2008).
56
A atividade citotóxica in vitro do lapachol sobre o carcinoma Ehrlich é reportada por
(ESTEVES-SOUZA et al., 2007), através do ensaio da viabilidade celular MTT, inibindo
30% do crescimento celular a uma concentração de 12,11 µg/mL. Em mesmo estudo,
derivados da substância comprovaram ser inibidores de crescimento, dose-dependente, de
células leucêmicas K562 e também de carcinoma Ehrlich. Em tumor sólido Walker 256
(carcinosarcoma), lapachol mostrou uma redução de 92% no crescimento do tumor quando
administrado oralmente em ratos em dose diária de 150 mg/kg (LINARDI et al., 1975).
Algumas drogas podem alterar a adesão celular, mas sem, no entanto, matar as células
(PAPAZISIS et al, 1997). Emodina mostrou que seu efeito inibidor da adesão celular de
linhagens tumorais não é tipo-dependente (HUANG et al., 2006), além de ser indutora de
apoptose (LEE, 2001a) e citotóxica (LEE et al., 2005) sob condições semelhantes às aplicadas
em nosso experimento. Sua concentração inibitória neste trabalho foi cerca de seis vezes
menor que cisplatina, em linhagem Hep
2
.
N-nitrosoanonaina juntamente com boldina apresentaram CI
50
maior que 50 µg/mL,
mostrando ser a última uma substância inativa tanto nas linhagens tumorais por nós testadas
como em células VERO usadas por Boustie et al., 1998. Assim, boldina, considerada o
principal alcalóide das folhas do boldo (Peumus boldus) (Ruiz et al., 2008) não oferece riscos
às células sadias em doses terapêuticas e não possui atividade antitumoral.
Produtos naturais contêm uma variedade de substâncias químicas orgânicas complexas
que podem ter uma atividade sinergística, interagindo com múltiplas vias, bem como
possuindo atividades que interagem com a sinalização celular, a via apoptótica e na interação
das células cancerígenas com o sistema imunológico. Por isso, uma alternativa seria avaliar
substâncias naturais e alguns derivados químicos animais que poderiam influenciar nessas
vias. Existem poucas pesquisas clínicas que avaliam o uso dessas substâncias como terapias
adjuvantes no tratamento convencional com drogas citotóxicas e radioterapia (YANCE;
SAGAR, 2006). N-nitrosoanonaina, por ser uma substância ainda pouco conhecida, pode ser
citotóxica em outras linhagens tumorais e até mesmo um potencial adjuvante ou coadjuvante
no tratamento do câncer. Outro fator relevante é que os dois testes utilizados neste trabalho,
aos quais os compostos foram submetidos, não conseguem detectar atividades de pró-
farmacos, o que pode ser o caso das substâncias avaliadas. Em tal situação, a substância
perderia seu grupo NO in vivo, tornando-se ativa ou, ainda, liberaria este grupo no sítio de
ação, causando um dano celular.
N-nitrosoxilopina, rutina, quercetina e aloina, as quais não mostraram atividade
superior ao controle positivo em nenhuma das linhagens tumorais, porém não necessitam de
57
concentrações muito elevadas para detecção de atividade inibitória, sugerem que
modificações estruturais e/ou uma possível combinação de drogas, como praticado na
quimioterapia para o tratamento de câncer podem fazer destas substâncias um alvo de estudos
e potenciais drogas antitumorais.
5.3 Atividade de substâncias da classe dos alcalóides em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral
Alcalóides estão entre o vasto grupo de metabólitos secundários de plantas
(STÉVIGNY et al., 2005), com grande diversidade estrutural (HENRIQUES et al., 2007) e,
conseqüentemente, importantes atividades fisiológicas sobre organismos de vários grupos
biológicos (ROBBERS et al., 1997).
Porém, em nosso trabalho, como mostrado pelos dados da Tabela 3, a classe dos
alcalóides foi a que apresentou maiores DE
50
e CI
50
dentre as três testadas, sugerindo que a
citotoxicidade em A. salina e a atividade antitumoral não se encontram dentre aquelas de
destaque para a classe. Entretanto, é de grande importância e interesse o destaque exercido
pela duguetina.
Tabela 3 – Alcalóides e atividades em A. salina, após 24h de exposição, e em linhagens de
células tumorais B16-F10 e Hep
2
em período de incubação de 48h, respectivos
controles positivos de cada bioensaio e intervalos de confiança.
Substância Artemia salina
DE
50
(µg/mL)
*
B16-F10
CI
50
(µg/mL)
**
Hep
2
CI
50
(µg/mL)
**
duguetina 20,8 (9,80 - 44,09) 10,7 (10,2 - 11,1) 7,1 (6,6 - 7,7)
boldina >250 >50 >50
N-nitrosoanonaina >250 >50 >50
N-nitrosoxilopina >250 31,9 (28,7 - 36,2) 36,1 (33,1 - 39,3)
sulfato de quinidina 169,8 (109,79 - 262,65)
- -
cisplatina 110,5 (87,2 - 140,0) 1,4 (1,3 - 1,5) 10,5 (9,4 -
11,7)
*
DE
50
: Dose efetiva para matar 50% das larvas de A. salina (µg/mL)
**
CI
50
: Concentração que inibe 50% do crescimento celular (µg/mL)
Duguetina, estruturalmente semelhante à boldina, porém pouco estudada e de grande
interesse ao Cerrado devido à sua ocorrência em plantas dessa região, mostrou-se muito ativa
em todos os ensaios em relação aos outros alcalóides avaliados. Sua concentração para
inibição de 50% do crescimento da linhagem B16-F10 mostrou ser aproximadamente duas
vezes menor que a dose efetiva necessária para matar 50% das larvas do microcrustáceo. Já
58
para linhagem Hep
2
foi necessário uma quantidade quase três vezes menor que a DE
50
para
alcançar o mesmo efeito inibitório que para a linhagem B16-F10. Em experimentos com
extrato alcaloídico obtido de D. furfuracea, o valor de DE
50
foi de 36,9 µg/mL (SILVA et al.,
2007), podendo tal efeito ser atribuído à presença de duguetina e outros alcalóides agindo
conjuntamente. Tais resultados fazem da duguetina um alvo para comprovação de sua
atividade larvicida e inibição de crescimento de outras linhagens celulares tumorais.
A boldina é um alcalóide encontrado em folhas e tronco do boldo e possui atividade
antiinflamatória, efeitos antipiréticos e habilidade antioxidante (YOUN et al., 2002). Porém,
apresentou fraca atividade citotóxica contra A. salina e fraca inibição do crescimento das
linhagens B16-F10 e Hep
2
, características importantes para um uso seguro dessa substância
como princípio ativo presente no chá de boldo.
N-nitrosoanonaina e N-nitrosoxilopina, dois N-nitrosos isolados de D. furfuracea
diferenciam-se por seus substituintes, sendo que N-nitrosoxilopina possui um grupo metoxil
na posição nove. Ambos mostraram ser inativos nas concentrações testadas para A. salina. N-
nitrosoxilopina apresentou uma CI
50
semelhante nas duas linhagens tumorais. Porém,
levando-se em conta a maior sensibilidade da linhagem B16-F10 ao controle positivo, a CI
50
encontrada para Hep
2
mostra uma maior eficiência na inibição do crescimento celular
comparado à CI
50
da cisplatina para essa linhagem.
Dentre as quatro substâncias reunidas no grupo dos alcalóides, três delas são pouco
estudadas quanto às suas potencialidade como fármacos de origem natural e dentre elas, uma
apresenta um bom potencial para exploração de atividades biológicas específicas – duguetina
- partindo-se do princípio de que a atividade em A. salina é um indicativo de atividade
antitumoral (SIQUEIRA, 1999; CEPLEANU, 1993; MEYER et al., 1982), porém não
específica de nenhuma atividade biológica (MEYER et al., 1982).
5.4 Atividade de substâncias da classe dos flavonóides em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral
Flavonóides são amplamente encontrados em frutas e vegetais, despertando interesse
devido à sua comprovada atividade antioxidante, protetora contra males cardiovasculares
(CAO et al., 1997), além de resultados efetivos encontrados na literatura a respeito de
atividade antitumoral (FERRER et al., 2006).
59
Concentrações encontradas para a quercetina colocam-na como a melhor dentre os
dois flavonóides testados em células tumorais, onde suas atividades para as linhagens Hep
2
e
B16-F10 variaram de aproximadamente duas a sete vezes as da rutina (Tabela 4).
Tabela 4 - Flavonóides e atividades em A. salina, após 24h de exposição, e em linhagens de
células tumorais B16-F10 e Hep
2
,
em período de incubação de 48h, respectivos
controles positivos de cada bioensaio e intervalos de confiança.
Substância Artemia salina
DE
50
(µg/mL)
*
B16-F10
CI
50
(µg/mL)
**
Hep
2
CI
50
(µg/mL)
**
rutina >250 47,0 (44,6 - 49,6) 38,7 (37,0 -
40,3)
quercetina >250 6,5 (6,3 - 6,9) 18,9 (17,4 -
20,6)
sulfato de quinidina 169,8 (109,79 - 262,65)
- -
cisplatina 110,5 (87,2 - 140,0) 1,4 (1,3 - 1,5) 10,5 (9,4 -
11,7)
*
DE
50
: Dose efetiva para matar 50% das larvas de A. salina (µg/mL)
**
CI
50
: Concentração que inibe 50% do crescimento celular (µg/mL)
Rutina apresentou uma DE
50
maior que 250 µg/mL de acordo com dados de
mortalidade das larvas de A. salina, resultado já esperado, pois tal substância apresentou uma
DE
50
maior que 500 µg/mL em teste de toxicidade realizado por Cepleanu (1993). Em mesmo
trabalho, quercetina, sob mesmas condições de incubação de rutina: escuro, DMSO 1%,
larvas em estágio náuplio e 25ºC apresentou DE
50
igual a 126 µg/mL (94-170 µg/mL), com
intervalo de confiança de 95%. Em nossos estudos, porém, quercetina apresentou uma DE
50
elevada em A. salina e atividade inferior à cisplatina em células tumorais. Com isso, ambos
flavonóides mostram-se fracamente ativos frente a sistemas biológicos complexos, podendo,
inclusive, oferecer uma proteção ao organismo, devido a sua conhecida atividade
antioxidante.
Rutina mostrou-se fracamente ativa sobre as duas linhagens tumorais testadas, com
CI
50
igual a 47,0 µg/mL e 38,7 µg/mL para B16-F10 e Hep
2
, respectivamente. Tais
concentrações são muito superiores às encontradas para o controle positivo, porém, de acordo
com dados encontrados por Matsuo et al. (2005), os quais utilizaram fibroblastos pulmonares
de embrião humano (TIG-1) e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVE) para
teste de citotoxicidade de flavonóides em linhagens celulares normais. Os autores
encontraram que rutina não apresenta toxicidade nas duas linhagens, corroborando a ausência
de atividade frente a A. salina. A não toxicidade da rutina é justificada pelos autores devido a
sua alta hidrofilicidade e, com isso, fraca incorporação na membrana celular lipídica.
Quercetina apresentou uma alta DE
50
: > 250 µg/mL, mostrando ser fracamente ativa
ao microcrustáceo. Em contraposição, em ensaio com células tumorais, mostrou uma boa
60
atividade inibitória de crescimento, com CI
50
de 6,5 µg/mL em B16-F10, fazendo desta, a
quarta melhor substância dentre as testadas nessa linhagem. Sua CI
50
de 18,9 µg/mL em Hep
2
é menos de duas vezes a CI
50
da cisplatina, podendo ser considerada, ainda, um bom agente
antitumoral, motivo pelo qual a quercetina é usada como controle positivo em ensaios MTT
de viabilidade celular contra carcinoma Ehrlich, com CI
50
de 13,3 µg/mL, ao lado da
vincristina, alcalóide tradicionalmente usado no tratamento de leucemia linfoblástica aguda
(SCHRIPSEMA et al., 2007), em células leucêmicas K562 (ESTEVES-SOUZA et al., 2007).
Porém, em células normais de fibroblastos pulmonares de embrião humano (TIG-1) e células
endoteliais de veia umbilical humana (HUVE), os autores observaram que quercetina exibiu
uma CI
50
de 91,6 µg/mL
em TIG-1 e CI
50
de 18,4 µg/mL
em HUVE avaliadas depois de 24h
de exposição às substâncias e contagem celular por exclusão pelo corante azul de tripan.
Assim, apesar de uma maior concentração ser necessária para matar 50% das células normais,
sua citotoxicidade não é exclusiva de linhagens tumorais. Outros relatos na literatura
procuram fazer uma correlação da atividade de flavonóides em células tumorais e células
normais. Quercetina mostrou propriedades antitumorais potenciais, inibindo a proliferação de
células da linhagem URM106 (osteosarcoma de rato) e praticamente não causou nenhum
efeito em osteoblastos, medida pelo corante cristal violeta em concentração de 30,22 µg/mL
(FERRER et al., 2006).
Generalidades dessa baixa sensibilidade de células normais não podem ser admitidas
para todos os tipos celulares em relação às concentrações necessárias para atividade positiva,
como mostra o trabalho de Tan et al. (2003), onde valores de CI
50
encontrados através de
ensaio SRB por exposição de quercetina por 72h em células endoteliais dermais
microvasculares humanas e para células endoteliais da veia umbilical humana foram iguais a
8,8 e 7,7 µg/mL
, respectivamente. Já linhagens tumorais MKN-45 (adenocarcinoma gástrico
humano), A549 (adenocarcinoma de pulmão), BEL-7402 (carcinoma hepatocelular)
apresentaram os seguintes valores de CI
50
: 53,8; 12; 14,6 µg/mL, respectivamente, o que
corrobora a maior sensibilidade de linhagens de células normais do que células tumorais.
Como mostram os resultados encontrados por Hakimuddin et al. (2004) a quercetina é
um flavonol com forte efeito inibitório, sendo tal resultado obtido de maneira dose-
dependente, com CI
50
igual a 5 µg/mL para linhagem HMEC; MCF-7 igual a 13 µg/mL e
MCF-10A sendo a mais tolerante, com CI
50
igual a 32 µg/mL em ensaios in vitro com
exposição de 48h à substância analisada.
Para as quatro linhagens de células de câncer gástrico testadas por Yoshida et al.
(1990), a CI
50
variou de 9,7 a 16,6 µg/mL
para quercetina aplicada em cultura celular
61
contínua por quatro dias após a inoculação e simultânea adição da substância, avaliada pela
exclusão pelo corante azul de tripan. Assim, as concentrações que inibem o crescimento das
diversas linhagens tumorais variam muito conforme o tipo celular testado, tornando-se difícil
prever uma CI
50
geral.
Fatores como a presença constante de flavonóides na dieta alimentar e o crescente
interesse em suas propriedades antioxidantes, além de resultados de uma boa atividade
antitumoral em linhagens celulares acrescentariam outras propriedades biológicas e
possibilitariam o uso terapêutico dessa classe de compostos na medicina. Devido à
semelhança estrutural entre as duas moléculas flavônicas estudadas, o fator diferencial entre a
alta concentração necessária para o efeito positivo de uma e a menor concentração para a
outra é a presença de dois açúcares na estrutura química da rutina, solubilizando-a na água e
deixando-a menos disponível para a interação com a membrana celular. Isso se deve ao fato
de fármacos e compostos de origem vegetal não serem, em sua maioria, estruturalmente
semelhantes aos metabólitos celulares, fazendo com que sua velocidade de passagem através
das membranas celulares, de natureza lipídica e protéica, seja determinada pela sua
lipossolubilidade. Substâncias hidrofílicas, como o caso da rutina, têm mais dificuldade em
atravessar a barreira imposta pela membrana celular, ao contrário de substâncias lipofílicas,
que são mais facilmente incorporadas por ela (KOROLKOVAS, 1977).
5.5 Atividade de substâncias da classe das quinonas em ensaio de A. salina e ensaio
antitumoral
As quinonas podem ser encontradas em várias classes de organismos vivos, gerando
uma multiplicidade de funções biológicas e agindo de forma notável em seus diversos ciclos
bioquímicos. Estudos farmacológicos de quinonas evidenciam variadas atividades, dentre
elas: tripanossomicidas, viruscidas, inibidoras de sistemas celulares reparadores e, aquela de
interesse em nosso trabalho, antitumorais (SILVA et al., 2003).
Algumas quinonas estão presentes nas plantas e células animais, exercendo funções na
respiração, fotossíntese, toxinas defensivas, e como elementos essenciais no processo de
acoplamento energético (FERREIRA et al., 2000).
Tabebuia impetiginosa (Bignoniaceae), popularmente conhecida como “ipê roxo”, está
amplamente distribuída pelo Brasil e outros países sul-americanos, usada como diurético,
adstringente e também como remédio caseiro na prevenção e tratamento do câncer
62
(FUJIMOTO et al., 1991; SCHAFFNER-SABBA et al., 1984), sendo de plantas desse gênero
extraído o lapachol, usado em nossos testes.
Resultados apresentados na Tabela 5 evidenciam a classe das quinonas como a melhor
dentre as três avaliadas em nossos experimentos.
Tabela 5 - Quinonas e controles positivos testados em relação à atividade em A. salina, após
24h de exposição, e em linhagens de células tumorais B16-F10 e Hep
2
,
em período
de incubação 48h, e seus respectivos intervalos de confiança.
Substância Artemia salina
DE
50
(µg/mL)
*
B16-F10
CI
50
(µg/mL)
**
Hep
2
CI
50
(µg/mL)
**
aloina >250 45,6 (36,7 - 56,7) 38,4 (37,1 -
39,9)
emodina 25,1 (17,85 - 35,27) 2,2 (1,9 - 2,5) 1,7 (1,5 - 1,8)
lapachol 137,8 (113,07 - 167,97) 9,5 (8,7 - 10,5) 10,5 (9,6 -
11,5)
β-lapachona 72,7 (62,42 - 84,67) 0,7 (0,65 - 0,75) 0,3 (0,29 -
0,32)
sulfato de quinidina 169,8 (109,79 - 262,65)
- -
cisplatina 110,5 (87,2 - 140,0) 1,4 (1,3 - 1,5) 10,5 (9,4 -
11,7)
*
DE
50
: Dose efetiva para matar 50% das larvas de A. salina (microgramas/mL)
**
CI
50
: Concentração que inibe 50% do crescimento celular (microgramas/mL)
Lapachol apresentou DE
50
de 137,8 µg/mL, muito superior ao encontrado em teste de
letalidade de Khan e Mlungwana (1999) - DE
50
de 5 µg/mL - empregado como pré-ensaio
antitumoral pelos autores. Foi encontrado uma CI
50
de 9,5 µg/mL para linhagem B16-F10,
muito superior ao valor de CI
50
da cisplatina. Com uma CI
50
de 10,5 µg/mL, lapachol teve
atividade igual ao controle positivo em Hep
2
, mostrando possuir uma boa ação inibitória nessa
linhagem, com uma equivalência de atividade entre as duas substâncias.
Outros dados da literatura mostram o uso do lapachol como controle positivo em
mesmo teste inibitório tumoral, com uma CI
50
de 68,09 µg/mL (PIMENTA et al., 2003).
Cepleanu (1993) também testou a substância quanto à sua citotoxicidade frente a A. salina e
encontrou uma DE
50
igual a 68 µg/mL (56-81) – intervalo de confiança de 95%, sob
condições de incubação no escuro, DMSO 1%, estágio náuplio, 25ºC, concentração menor
que a obtida para a vimblastina, com conhecida atividade citotóxica e antitumoral, com DE
50
igual a 101 µg/mL (119-87). Em ensaio antitumoral com método MTT, houve comprovação
de atividade tóxica, antitumoral, com o lapachol exibindo uma CI
50
igual a 2,7 µg/mL em
linhagem Col115 e 1,7 µg/mL em linhagem SW480, ambas de células de adenoma de cólon
humano.
Lapachol se mostrou ativo sobre larvas de A.salina apresentando DL
50
de 12,75 µg/mL
– metodologia de McLaughlin (1991) - com uma concentração mais de dez vezes menor do
63
que a encontrada em nossas condições de experimento. Em mesmo estudo, Oliveira et al.
(2002), através de ensaio MTT mostrou que o lapachol possui atividade sobre células
tumorais de mama, linhagem A549, sob condições aeróbias e hipóxicas, com CI
50
de 0,783
mM e 1,0 mM, respectivamente.
Ao contrário da DE
50
encontrada para o lapachol, mais baixa que o sulfato de
quinidina, portanto, duas substâncias ativas, o mesmo foi considerado, por Lima et al. (2002),
não tóxico frente a A. salina (DE
90
= 176,3 µg/mL). Porém, lapachol, comparado à cisplatina,
mostrou ser menos ativo em B16-F10. Além disso, presume-se que a atividade antitumoral do
lapachol, quando existente, pode não ser tipo-celular dependente, já que as concentrações
inibitórias encontradas foram semelhantes para as duas linhagens celulares, mesmo com
ambas apresentando sensibilidades diferentes para o controle positivo.
β-lapachona é uma orto-naftoquinona, derivada do lapachol e amplamente estudada
por sua atividade antitumoral. Apresentou DE
50
mais de duas vezes menor que o controle
positivo em A. salina - sulfato de quinidina - um indicativo de uma ótima atividade da
substância contra as duas linhagens de células tumorais, confirmada por sua relação
qualitativa com a CI
50
: cerca de cem vezes menor em linhagem B16-F10 e cerca de duzentas e
quarenta vezes em Hep
2
. Apesar da maior resistência das células de carcinoma de laringe,
mostrado pela CI
50
de cisplatina em Hep
2
cerca de sete vezes e meia maior que em B16-F10,
β-lapachona mostrou uma concentração inibitória mais baixa naquela linhagem. Dentre as
quinonas avaliadas, essa foi a de maior destaque no ensaio antitumoral.
De acordo com dados de Kumi-Diaka (2002), estudos preliminares com β-lapachona
mostram a sua CI
50
variando entre 0,44-0,51 µg/mL para linhagem PC3 e entre 0,47-0,67
µg/mL para LNCaP, ambas de câncer de próstata, evidenciando sua boa atividade antitumoral
e confirmando a β-lapachona como a melhor dentre as substâncias testadas em células de
câncer (Tabela 2, p. 55).
β-lapachona usada como controle positivo por Hayashi et al. (2004) em fracionamento
biodirecionado de extrato clorofórmico de Lantana sp. mostrou a atividade antitumoral da
substância em linhagens tumorais de nasofaringe, pulmão, mama (CI
50
igual a 0,19 µg/mL)
osso e gliobastoma numa concentração de 2,40 µg/mL, em absorbância de 562 nm em método
SRB.
Wuerzberger et al. (1998) encontraram uma CI
50
igual a 0,6 µg/mL para β-lapachona
em linhagem MCF-7 tratada em concentrações que variavam de 0,06 a 2,40 µg/mL por 4h e
avaliadas conforme habilidade de formação de colônia, sugerindo o uso da substância como
agente terapêutico direto ou complementar à radioterapia contra o câncer mamário. Dados de
64
Hayashi et al. (2004) e Wuerzberger et al. (1998) mostram que a concentração determinante
da letalidade em mesma linhagem de células tumorais pode variar de acordo com as
condições de experimento, metodologia de contagem, avaliação da mortalidade celular, bem
como a origem das linhagens utilizadas.
Uma possível explicação para a boa atividade de β-lapachona, seria seu caráter
lipofílico (SCHAFFNER-SABBA et al., 1984), o que facilitaria sua interação com a
bicamada lipídica da membrana das células. Já seu mecanismo de ação nas células tumorais e
uma das características das naftoquinonas, especialmente lapachol e β-lapachona, é que ambas
interferem no metabolismo do oxigênio da célula tumoral, bloqueando a respiração celular e
gerando radicais livres oxigenados (HUSSAIN et al., 2007).
Uma outra classe de quinonas avaliadas engloba as antraquinonas emodina e aloina.
Antraquinonas isoladas de Hemerocallis spp. por Cichewicz et al. (2004) mostraram efeitos
antitumorais in vitro sobre quatro linhagens de células tumorais humanas: mama (MCF-7),
sistema nervoso central (SF-268), pulmão (NCI-H460) e cólon (HCT-116) usando o ensaio
SRB e adriamicina como controle positivo.
Das quatro quinonas avaliadas, emodina, com atividade inibitória do crescimento de
células tumorais amplamente relatado na literatura, apresentou o melhor efeito em A. salina,
(DE
50
=
25,1 µg/mL), refletindo-se em uma segunda melhor atividade em B16-F10 e Hep
2
,
com uma CI
50
quase seis vezes menor que a concentração inibitória da cisplatina na segunda
linhagem. A CI
50
da emodina para B16-F10 e Hep
2
foi, respectivamente para as linhagens, de
onze a quatorze vezes menor que a DE
50
encontrada para A. salina, mostrando existir uma
correlação qualitativa entre os ensaios, mas não uma correlação quantitativa segura e
padronizada entre DE
50
e CI
50
.
Ayo et al. (2007) isolaram emodina das folhas de Cassia nigricans, usada
tradicionalmente como erva medicinal no tratamento de algumas doenças de pele e desordens
gastrointestinais. Foi considerada um componente altamente citotóxico através dos dados
obtidos pelos autores em teste de citotoxicidade contra A. salina. Nas concentrações de 1000;
500; 250; 125 e 62,5 µg/mL, emodina matou 100; 93,3; 86,7; 76,7 e 60%, respectivamente,
das larvas do microcrustáceo. Em nossa concentração mais alta testada (250 µg/mL), emodina
matou 100% das larvas de A. salina. Cepleanu (1993) obteve DE
50
igual a 18 µg/mL (21-16)
para a substância testada – intervalo de confiança de 95% - em teste com o microcrustáceo,
atividade superior à encontrada para a vimblastina. Em comparação entre a mortalidade do
microcrustáceo com sua atividade frente as duas linhagens celulares de adenoma de cólon
humano, emodina apresentou uma associação significativa entre ambas, exibindo uma CI
50
de
65
2,3 µg/mL para linhagem Col115 e 3,3 µg/mL para SW480 com o método MTT
(CEPLEANU, 1993), a mesma correlação qualitativa positiva encontrada para os nossos
testes.
Outros estudos procuram mostrar a redução da viabilidade e a morte celular ao longo
do tempo de exposição à droga testada. Lee (2001b) determinou o efeito da emodina na
viabilidade celular através da exclusão pelo corante azul de tripan. Células cancerosas CH27
expostas a várias concentrações por 72h mostraram um decréscimo tempo e dose-dependente
no número de células, porém, após 16h de tratamento, a fração de células viáveis já havia
decaído para 8% comparado às não tratadas. Resultados semelhantes foram encontrados
através da viabilidade celular pelo método MTT, o qual indicou que a parada da atividade
metabólica celular é irreversível após o tratamento por 8h. A morte celular induzida pela
substância foi mais pronunciada na dose de 13,5 µg/mL. A capacidade de adesão celular é
determinante para o sucesso de uma cultura celular in vitro e sua utilização em ensaios
antitumorais, bem como no crescimento da massa tumoral no organismo. Em mesmo estudo
de Lee (2001b), após 24h de tratamento, houve uma extensa fragmentação celular e poucas
células permaneceram aderidas. Como prova da morte das células desprendidas foi feita a
inoculação em meio de cultura fresco, na ausência de emodina, por 24h, resultando em uma
não fixação das células na placa de Petri.
Cha et al. (2005) encontraram dados, através do ensaio MTT e incorporação da
timidina [H
3
], que a emodina extraída de Rheum palmatum possui um efeito antiproliferativo
em cultura de células, mesmo em baixas doses: 2,7x10
-3
µg/mL, mais significante que
genisteína e curcumina, duas substâncias fitoquímicas com atividade anticâncer.
Lee et al. (2005) isolaram da fração metileno-clorida de Rumex acetosa L. quatro
antraquinonas conhecidas e sintetizaram dois derivados para avaliar e correlacionar suas
estruturas-atividade quanto às ações antimutagênica e citotóxica. Dentre as antraquinonas
obtidas, emodina mostrou ser o componente mais ativo, com uma CI
50
= 2,9 a 3,6 µg/mL
frente as linhagens tumorais de pulmão, ovário, melanoma, sistema nervoso central e cólon
através do método SRB, em triplicata, dados de CI
50
superiores aos encontrados para as
linhagens testadas neste trabalho.
Baixas concentrações (0,27-2,7 µg/mL) de emodina resultam em efeito citostático,
mas não citotóxico em três linhagens de câncer de pulmão: A549, H460, CH27 em 48h.
Tratamento com 6,7 µg/mL
de emodina por 72h, lavagem e cultura por 14 dias em meio sem
droga mostraram a redução na formação de colônias, quando comparado com controles não
66
tratados, através de ensaio clonogênico e colônias coradas com cristal violeta (SU et al.,
2005).
Kuo et al. (1997) fizeram estudo comparativo de quatro antraquinonas extraídas de
Polygonum hypoleucum Ohwi em seis linhagens de células tumorais avaliadas pelo corante
azul de tripan. Emodina apresentou CI
50
variando de 1,5±0,2 µg/mL para a linhagem de
eritroleucemia a 8,9±1,0 µg/mL, em linhagem de carcinoma de pulmão.
O tratamento de células CL5, adenocarcinoma pulmonar humano, com concentrações
de 1,35 a 5,4 µg/mL
de emodina por 12 a 48h mostrou nenhum ou mínimo efeito na
viabilidade celular avaliada pelo método MTT. Já o tratamento com 13,5 µg/mL
por 48h ou
na concentração máxima do experimento: 27 µg/mL
da substância, por 24 e 48h causou 19,
15 e 46% de diminuição na viabilidade celular, respectivamente. Tais diminuições podem
refletir, segundo Wang et al. (2001), um efeito citostático da emodina.
A linhagem celular de hepatoma humano HepG2/C3A apresentou CI
50
mais baixa em
teste de citotoxicidade induzida por emodina: 11,5 µg/mL
.
As demais linhagens de hepatoma
humano testadas por Shieh et al. (2004) foram PLC/PRF/5 e SK-HEP-1, com CI
50
= 12,6
µg/mL
e 14,3 µg/mL
, respectivamente. O controle positivo utilizado foi o 5-fluorouracil, o
método de avaliação da proliferação celular foi o XTT e as concentrações de emodina foram
5,4; 10,8 e 16,21 µg/mL, por 48h.
Já Tan et al. (2006) classificaram emodina, comparada com seus derivados, como
possuidora de citotoxicidade baixa ou insignificante, com CI
50
igual a 14,9 µg/mL
em
linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e maior que 27 µg/mL
em
linhagem de melanoma de camundongo (B16) e de carcinoma Lewis, de pulmão (LLC).
Além da inviabilização do crescimento das células, a morte celular é necessária para
impedir uma volta da atividade de proliferação descontrolada depois de cessada a
administração da droga. Zhang et al. (1998) mostraram que o efeito inibitório da emodina em
células MDA-MB-453 (câncer de mama humano) é reversível. Tal linhagem celular foi
tratada com 10,8 µg/mL
da substância por três dias e, a fração de células viáveis decaiu para
38% comparado com células não tratadas. Após os três dias, a emodina foi retirada e as
células recomeçaram a crescer em uma taxa similar às não tratadas por um mesmo período.
Células tratadas com emodina por mais cinco dias mantiveram a inibição do crescimento.
Wang et al. (2006), em seu estudo eletroquímico do modo de ação da emodina
mostraram que a substância pode impedir células cancerosas de se dividir e produzir mais
células cancerígenas através da inibição da reprodução do DNA e simultaneamente exibir
67
efeito tóxico. Os resultados obtidos pelos autores indicam que a interação da substância com o
DNA acontece por meio de intercalamento na dupla hélice.
Uma maior citotoxicidade dose-dependente de derivados da emodina em linhagem de
HepG2 sugere que um entendimento da relação estrutura-atividade e modificação de
compostos ativos levariam a uma maior atividade antitumoral da substância (WANG et al.
2007), o que poderia ser aplicado às demais substâncias que exibem um mínimo efeito
inibitório do crescimento.
Outra antraquinona amplamente estudada e de grande interesse fitoquímico é derivada
de plantas do gênero Aloe. O potencial antiproliferativo e citotóxico de aloina extraída de Aloe
vera foi testada por Nićiforović et al. (2007) em células HeLaS3 (carcinoma uterino humano)
e mostrou um pronunciado efeito antiproliferativo: CI
50
= 40,6 µg/mL
e aumentou a apoptose
celular para 24%. Aloina, inativa ou fracamente ativa frente a A. salina apresentou a CI
50
mais
alta dentre as quinonas: 45,6 µg/mL e 38,4 µg/mL para B16-F10 e Hep
2
, respectivamente.
Caso a CI
50
para o controle positivo - cisplatina - seja levada em consideração, aloina é mais
ativa em Hep
2
, porém com uma concentração cerca de três vezes e meia maior que cisplatina.
Em outro estudo relatado na literatura, dentre duas linhagens de câncer de mama
humanos, MCF-7 mostrou ser a mais sensível à aloina, demonstrado pelos ensaios MTT e
clonogênico, no qual o valor da CI
50
foi relatada como sendo 60 µg/mL (ESMAT et al.,
2006), ainda muito alta se comparada à atividade das demais antraquinonas.
De acordo com Houghton et al. (2007), a maioria das avaliações citotóxicas usam
extratos de plantas sem levar em conta o fato que os componentes que ocorrem naturalmente
podem não ser, por si só, ativos, e sim necessitarem de uma transformação para substâncias
ativas através do sistema metabólico do corpo, o que explicaria seu uso tradicional. Isso tem
se mostrado com diversas plantas medicinais, sendo citada como exemplo, a droga laxativa
obtida de Senna, na qual os glicosídeos são hidrolisados pela flora intestinal para liberar as
agliconas, que são compostos que causam alterações na permeabilidade à água na parede do
intestino e aumentam o peristaltismo.
A atividade encontrada para as substâncias avaliadas é um forte indicativo de suas
propriedades biológicas tanto in vitro como in vivo, colocando-as como candidatas potenciais
a estudos mais aprofundados e/ou a modificações estruturais. A indicação de inatividade, bem
como a baixa atividade não significam, necessariamente, uma ausência total de uso como um
possível fármaco, mas colocam tais substâncias como alvo de estudos para descoberta de pró-
fármacos, onde sua ação estaria condicionada a uma ativação/transformação dentro do corpo.
Como método simples, rápido e de baixo custo, o teste da A. salina cumpre seu papel de
68
indicação de atividade biológica, podendo seus resultados positivos para determinada
substância serem extrapolados para a existência de outras atividades (neste estudo
comprovado pela correlação qualitativa com a atividade antitumoral). Porém, para que exista
e seja segura uma previsão da concentração necessária em um ensaio biológico para um
determinado efeito inibitório ou eficaz na morte do objeto-teste – correlação quantitativa entre
um ou mais bioensaios - são necessários maiores estudos e testes biológicos que envolvam as
particularidades de cada sistema biológico testado, interações e características moleculares.
69
6 CONCLUSÕES
O teste em A. salina, um ensaio biológico mais simples, rápido e de baixo custo pode
ser considerado como uma pré-avaliação para indicação de substâncias com potenciais
atividades biológicas específicas.
Para as substâncias de origem vegetal pertencentes a diferentes classes de produtos
naturais avaliadas neste trabalho, o bioensaio da A. salina e o bioensaio antitumoral
mostraram correlacionar-se positivamente. Tal correlação, proposta por vários autores, foi
confirmada através da atividade positiva de quatro substâncias - β-lapachona, emodina,
duguetina e lapachol - testadas em A. salina, sendo que as mesmas foram as que apresentaram
as mais baixas CI
50
dentre as substâncias testadas nas duas linhagens de células tumorais.
Podem, portanto, serem consideradas indicativas da atividade antitumoral. Além destas,
boldina e N-nitrosoanonaina mostraram-se inativas nos dois bioensaios, acompanhadas de
rutina e aloina que foram inativas frente ao microcrustáceo e fracamente ativas como
inibidoras do crescimento das duas linhagens celulares tumorais, quando comparadas à
cisplatina. A ausência e/ou baixa atividade das substâncias em ambos os bioensaios,
corrobora, portanto, a correlação entre eles.
Porém, a determinação da correlação quantitativa, proposta neste trabalho, não pôde
ser estabelecida para as substâncias testadas, pois as diferentes linhagens de células tumorais
apresentaram sensibilidades diferentes frente ao controle positivo, mostrando que cada
linhagem celular se comporta de maneira distinta frente às substâncias-teste. Além disso, as
DE
50
para as substâncias com atividade positiva não seguiram um padrão de correlação com
suas respectivas CI
50
. As doses necessárias para a atividade biológica não seguem a
correlação quantitativa proposta pela literatura, porém cisplatina, testada nos dois bioensaios,
foi a única com resultado próximo a essa correlação, com uma DE
50
igual a aproximadamente
dez vezes e meia a CI
50
(para Hep
2
). Quando avaliadas isoladamente, as classes de produtos
naturais comportaram-se de maneira distinta umas das outras, porém de acordo com o
esperado, baseado em atividades biológicas positivas ou negativas já relatadas na literatura e
nos seus usos populares descritos.
Apesar de ser uma das mais numerosas neste trabalho, a classe dos alcalóides
apresentou as atividades mais fracas em A. salina e linhagens celulares tumorais, exceto a
duguetina, a mais citotóxica frente à A. salina.
70
A quercetina, pertencente à classe dos flavonóides, apesar de ter se mostrado inativa
em A. salina, mostrou boa atividade inibitória do crescimento das linhagens de células
tumorais, confirmando seu papel como controle positivo de ensaios biológicos descritos.
A classe das quinonas, com amplos relatos na literatura a respeito de atividades
positivas em bioensaios, foi a que apresentou mais substâncias ativas frente a A. salina e
sobre as duas linhagens celulares tumorais. Como destaques, β-lapachona e emodina,
substâncias com as menores CI
50
(mais forte inibidora que a cisplatina) e a segunda melhor
citotoxicidade em A. salina, respectivamente.
Portanto, a atividade citotóxica positiva encontrada in vitro em teste em A. salina
funciona como uma pré-avaliação de substâncias com potenciais farmacológicos a serem
avaliados por outros bioensaios específicos. Além disso, tais produtos naturais e outros que
porventura revelem baixa citotoxicidade podem subsidiar estudos de modificação estrutural
e/ou serem, ainda, pró-fármacos.
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