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Ana Terezinha Tavechio
Comparação fenotípica e genotípica entre cepas de
Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:- e
de Salmonella Typhimurium
São Paulo
2006
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Ana Terezinha Tavechio
Comparação fenotípica e genotípica entre cepas de
Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:- e
de Salmonella Typhimurium
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças
da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em
Saúde Pública
Orientador: Prof. Dr. Carmo Elias Andrade Melles
Co-orientadora: Dra. Sueli Aparecida Fernandes
São Paulo
2006
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DEDICATÓRIA
À minha querida família,
Pais: Antonio e Teresinha
Irmãos: Cida, João, Regina e Jorge
Cunhada: Valquíria
Sobrinhos: Vinícius e Guilherme
Pelo amor, carinho e atenção em todas as
horas.
Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para
todo propósito debaixo do céu:
Há tempo de nascer e tempo de morrer; tempo de
plantar, e tempo de arrancar o que se plantou; ... tempo
de chorar, e tempo de rir; tempo de prantear, e tempo de
saltar de alegria; ... tempo de estar calado, e tempo de
falar; tempo de amar, e tempo de aborrecer; ...
(Eclesiastes 3:1-8)
E APRENDER EM TODO TEMPO É PRIVILÉGIO ...
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Ao Deus Soberano, por ter me agraciado com o dom da vida, com uma família,
com vários amigos e com oportunidades ímpares, tudo isso contribuindo para a realização
deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Carmo Elias Andrade Melles, pelo apoio, incentivo e orientação
transmitidos durante este projeto;
À Dra. Sueli Aparecida Fernandes, pela cooperação, incentivo e sugestões
constantes, desde o começo de minha carreira profissional no setor de Enterobactérias-IAL;
À Dra. Ângela Cristina Rodrigues Ghilardi, pela cooperação, incentivo e
sugestões presentes em todo o tempo;
À Dra. Lucilaine Ferrazolli, pela amizade, incentivo, sugestões, e em especial,
pela cooperação na utilização do programa GelCompar II;
À amiga Célia Rodrigues Gonçalves Cunha, pela amizade apesar da distância;
À amiga Daniela Leite, pelo bom humor e alegria sempre contagiantes;
A todos os colegas e amigos do Setor de Enterobactérias, aqui representados pela
Encarregada do Setor, Dra. Tânia Mara Ibelli Vaz, pelo apoio, amizade e cooperação;
A todos os demais colegas e amigos da Seção de Bacteriologia, aqui representados
pela Chefe da Seção, Dra. Vera Simonsen, pela amizade, atenção e cooperação;
Aos profissionais dos laboratórios regionais do Instituto Adolfo Lutz, pela
cooperação constante;
À Dra. Tânia A. T. Gomes, pelo exemplo profissional e em especial, pela
cooperação na doação de cepas padrões;
À Dra. Chifumi Takeuchi Calzada, pelo grande incentivo, confiança e
ensinamentos no início da minha carreira profissional no setor de Enterobactérias;
À Dra. Daisy N. Sato, Dra. Lilian R.M.Marques e Melissa Curcio, ausentes da
equipe no Instituto Adolfo Lutz-SP, porém presentes na amizade;
À Ruth de Abreu, Elena Kano, Ethel Sandoval Peixoto, colegas de trabalho
exemplares, pelos ensinamentos, amizade e carinho apesar da distância;
À estagiária-FUNDAP Ana Lívia Geremias, pela cooperação durante a
preparação dos “plugs” de agarose para a realização do PFGE;
Aos demais estagiários/bolsistas da FUNDAP ou estagiários voluntários que
estiveram no Setor durante o período da realização deste trabalho, pela cooperação e
incentivos constantes;
Aos professores e alunos do curso de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde-SP, pelos valiosos
ensinamentos, amizade, incentivo e apoio;
Aos profissionais da Secretaria da área de concentração – Pesquisas
Laboratoriais em Saúde Pública, do curso de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria
de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde-SP, pela paciência, atenção e
préstimos em todos os momentos;
Aos profissionais da Secretaria Geral do curso de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde-SP, pela paciência,
atenção e préstimos em todos os momentos;
A todos que participaram diretamente ou indiretamente deste trabalho e/ou da
minha formação profissional, O MEU MUITO OBRIGADA!
Este trabalho, em sua quase totalidade, foi desenvolvido no Setor de
Enterobactérias, Seção de Bacteriologia, Divisão de Biologia Médica, do Instituto
Adolfo Lutz, São Paulo, SP, Brasil.
A fagotipagem das cepas de Salmonella foi realizada, como treinamento,
no laboratório da “Public Health Agency of Canada, National Microbiology
Laboratory, Phage Typing, R-typing and Surveillance, Winnipeg, Manitoba, Canada”,
sendo o mesmo, o laboratório de referência para fagotipagem de Salmonella na
América do Norte, devidamente treinado e suprido com cepas bacterianas e fagos
pelo “Laboratory of Enteric Pathogens, Health Protection Agency, Colindale”,
Londres. Este treinamento foi oferecido pelo “Global Infectious Diseases Research
Training Program”, University of Pittsburgh – Instituto Adolfo Lutz, sob a direção do
Prof. Lee H. Harrison, com o financiamento de FOGARTY International Center; the
National Institute of Health.
(Anexo 2)
RESUMO
A salmonelose é uma zoonose mundialmente distribuída e transmitida por alimentos
contaminados. O gênero Salmonella é subdividido em sorotipos (sorovares) de acordo com
os antígenos somáticos (O) e flagelares (H), e a grande maioria apresenta o fenômeno da
variação de fase com expressão alternada de duas fases flagelares. Salmonella
Typhimurium é um dos principais sorotipos associados com infecções humanas e apresenta
uma considerável multirresistência (MR) aos antimicrobianos. S. enterica subsp. enterica
sorotipo 1,4,[5],12:i:- é um sorotipo monofásico antigenicamente relacionado com S.
Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) e que apresentou uma freqüência de isolamento significativa
na década de 90, no Estado de São Paulo. O objetivo deste trabalho foi caracterizar cepas
destes dois sorotipos, por métodos fenotípicos e genotípicos, e verificar sua similaridade.
Das 517 cepas monofásicas, isoladas de humanos e não humanos no período de 1991 a
2000, no Estado de São Paulo, e analisadas quanto à presença de fljB por PCR, 148
(28,6%) amplificaram o fragmento correspondente ao gene fljB-H:1,2, sendo assim,
classificadas como S. Typhimurium. Entre as 369 cepas fljB-negativas, submetidas aos
testes de suscetibilidade aos antimicrobianos, 44 (12%) apresentaram MR para 2-13
antimicrobianos. Um total de 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- (42 MR e 11 sensíveis) e 45 de S.
Typhimurium (35 MR para 2-7 antimicrobianos e 10 sensíveis) foram analisadas por
fagotipagem, perfil plasmideal e PFGE. As cepas monofásicas apresentaram sensibilidade
variada aos fagos do esquema de fagotipagem específico para S. Typhimurium, sendo
distribuídas em 14 fagotipos, quatro dos quais estavam entre os 22 detectados em S.
Typhimurium. Foram identificados 14 perfis plasmideais entre as cepas monofásicas e 10
entre as de S. Typhimurium, com a prevalência do plasmídeo de 60 MDa, respectivamente,
em 94% e 84% das cepas. A análise por PFGE, após digestão das cepas com a enzima
XbaI, identificou 33 e 32 perfis, respectivamente, em S. I 1,4,[5],12:i:- e em S. Typhimurium,
com padrão de restrição muito semelhante e similaridade acima de 70%. Os resultados
demonstraram diversidade entre as cepas, porém, grande similaridade entre os dois
sorotipos, indicando que, as cepas monofásicas S. I 1,4,[5],12:i:-, caracterizadas neste
estudo, podem ser consideradas como S. Typhimurium.
Palavras-chave: Salmonella, sorotipagem, resistência microbiana a drogas, bacteriófagos,
plasmídeos, eletroforese em gel de agarose de campo pulsado.
ABSTRACT
Salmonellosis is a zoonosis worldwide distributed and transmitted by contaminated
foodstuffs. Salmonella genus is subdivided in serotypes (serovars) according to the somatic
(O) and flagellar antigens (H), and the great majority presents the phase variation
phenomenon with alternate expression of two flagellar phases. S. Typhimurium is one of the
main serotypes associated with human infections presenting a considerable multi-resistance
(MR) to the antimicrobials. S. enterica subsp. enterica serotype 1,4,[5],12:i:- is a monophasic
serotype antigenically related to S. Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) that presented a significant
isolation frequency in the 90’s, in São Paulo State. The purpose of this study was to
characterize strains of these two serotypes, by phenotypic and genotypic methods, and to
verify their similarity. Among the 517 isolates from human and non human sources, isolated
during 1991-2000, in São Paulo State, and analyzed for presence of fljB by PCR, 148
(28.6%) amplified the fragment corresponding to the gene fljB-H:1,2, being assigned as S.
Typhimurium. All 369 fljB-negative strains were submitted to the antimicrobial susceptibility
tests and 44 (12%) were MR to 2-13 antimicrobials. A total of 53 S. I 1,4,[5],12:i:- strains (42
MR and 11 sensible) and 45 S. Typhimurium strains (35 MR to 2-7 antimicrobials and 10
sensible) were analyzed by phage typing, plasmid profile, and PFGE. Monophasic strains
presented variable susceptibility to the phages of the specific phage typing scheme for S.
Typhimurium, being distributed in 14 phage types, four of which were also among the 22
detected in S. Typhimurium. It was identified 14 plasmid profiles among monophasic strains
and 10 in S. Typhimurium, with the prevalence of a 60-MDa plasmid, respectively, in 94%
and 84% strains. PFGE analysis, after XbaI digestion of strains, identified 33 and 32 profiles,
respectively, in S. I 1,4,[5],12:i:- and S. Typhimurium, with a very similar restriction pattern
with more than 70% similarity. The results demonstrated diversity among strains, however, a
high similarity between the two serotypes, indicating that, the monophasic S. I 1,4,[5],12:i:-
strains, herein characterized, should be considered as S. Typhimurium.
Key-words: Salmonella, serotyping, antimicrobial resistance, phage types, plasmids, PFGE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AT “atypical”
CLSI “Clinical Laboratory Standard Institutes”
DNA “deoxyribonucleic acid”
dNTP “Deoxynucleotide triphosphate”
DT “Definitive Type”
DTA Doença transmitida por alimentos
EDTA “ethylenediaminetetracetic acid”
ESBL “extended-spectrum beta-lactamase”
H Antígeno flagelar
IAL Instituto Adolfo Lutz
MDa Megadaltons
NCCLS “National Committee of Clinical Laboratory Standards”
O Antígeno somático
PCR “Polymerase Chain Reaction”
PFGE “Pulsed-Field Gel Electrophoresis”
UPGMA
“unweighted pair group method with arithmetic averages”
PT “Phage type”
RDNC “reaction does not conform”
SDS “sodium dodecyl sulphate”
TBE Tris-Borato EDTA
TE Tris EDTA
TSA “Tryptic Soy Agar”
TSB “Tryptic Soy Broth”
UT “untypeable”
LISTA DE QUADROS
Quadro
Título
Pág.
1 Características fenotípicas diferenciais de espécies e
subespécies de Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2
Distribuição das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- fljB negativas,
de acordo com a fonte humana e não humana de
isolamento, no Estado de São Paulo, 1991-2000 . . . . . . . .
44
3
Número de cepas de S. I 1
S. Typhimurium, de origem humana e não-humana, 1991-
2000, Estado de São Paulo, caracterizadas segundo cada
método . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
4 Seqüência de nucleotídeos dos “primers” e tamanho do
fragmento amplificado por PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
LISTA DE TABELAS
Tabela
Título Pág.
1 Suscetibilidade antimicrobiana das 369 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
fljB-negativas, isoladas de humanos e não humanos, no Estado de
São Paulo, 1991-2000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
2
Perfis de resistência antimicrobiana das 45 cepas de
S. Typhimurium, isoladas de humanos e não humanos, no Estado de
São Paulo, 1991-2000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
3 Fagotipos das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas de humanos e
não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000. . . . . . . . . . . . . .
60
4 Fagotipos das 45 cepas de S. Typhimurium isoladas de humanos e
não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000. . . . . . . . . . . . . .
61
5 Perfis plasmideais de 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, isoladas de
humanos e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000. . . . .
62
6 Perfis plasmideais de 45 cepas de S. Typhimurium, isoladas de
humanos e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000 . . . .
63
7 Perfis de restrição obtidos com a enzima XbaI, por PFGE, das 53
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas de humanos e não humanos, no
Estado de São Paulo, 1991-2000. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
8 Perfis de restrição obtidos com a enzima XbaI, por PFGE, das 45
cepas de S. Typhimurium, isoladas de humanos e não humanos, no
Estado de São Paulo, 1991-2000. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
9 Perfis das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- de origem humana e não
humana, de acordo com a suscetibilidade aos antimicrobianos, a
fagotipagem, o perfil plasmideal e o PFGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
10 Perfis das 45 cepas de S. Typhimurium de origem humana e não
humana, de acordo com a suscetibilidade aos antimicrobianos, a
fagotipagem, o perfil plasmideal e o PFGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
LISTA DE FIGURAS
Fig.
Título Pág.
1 Esquema com os principais genes envolvidos na variação de
fase flagelar em cepas de Salmonella spp. . . . . . . . . . . . . . . . .
22
2 Eletroforese em gel de agarose a 1,5% do produto amplificado
em PCR utilizando os “primers” para a fase H:1,2 . . . . . . .
55
3
Perfil plasmideal de algumas cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- . . . . . .
64
4
Perfil plasmideal de algumas cepas de S. Typhimurium . . . . . .
64
5
PFGE representativo de perfis genéticos das cepas de
S. I 1,4,[5],12:i:-, após digestão com XbaI . . . . . . . . . . . . . . . .
68
6
PFGE representativo de perfis genéticos das cepas de
S. Typhimurium, após digestão com XbaI . . . . . . . . . . . . . . . .
68
7 Dendrograma obtido pela análise por PFGE dos fragmentos
obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
70
8 Dendrograma obtido pela análise por PFGE dos fragmentos
obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. Typhimurium
71
9 Dendrograma comparativo obtido pela análise por PFGE dos
fragmentos obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. I
1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
ÍNDICE*
Pág.
1 INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1 Características morfológicas e bioquímicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Taxonomia e Nomenclatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Características antigênicas do gênero Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Antígeno Somático (O) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2 Antígeno Flagelar (H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.3 Esquema de Kauffmann-White . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Aspectos clínicos e epidemiológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Métodos de tipagem de cepas de Salmonella. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5.1 Métodos para caracterização fenotípica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5.2 Métodos para caracterização genotípica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6 Salmonella Typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7 Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:- . . . . . . . . .
2 OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 MATERIAL E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1 Cepas bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Identificação bioquímica e sorológica de Salmonella spp. . . . . . . . . .
3.3 Análise das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- quanto à presença de fljB . . .
3.4 Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Fagotipagem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Análise do perfil plasmideal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 “Pulsed-Field Gel Electrophoresis” - PFGE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Análise dos perfis genéticos - Dendrogramas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
17
17
20
20
21
23
24
27
27
30
33
37
41
43
43
45
45
47
48
49
51
53
4 RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1 Análise das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- quanto à presença de fljB . . .
4.2 Testes de suscetibilidade aos antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Análise das cepas pela Fagotipagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Fagotipagem das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.2 Fagotipagem das cepas de S. Typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4 Análise das cepas quanto ao perfil plasmideal . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.5 Análise das cepas por “PFGE” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.5.1 Perfil de macro-restrição das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- . . . . . . .
4.5.2 Perfil de macro-restrição das cepas de S. Typhimurium . . . . . . .
4.6 Perfis genéticos - Dendrogramas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6.1 Análise do perfil de “PFGE” das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- . . . .
4.6.2 Análise do perfil de “PFGE” das cepas de S. Typhimurium . . . .
4.6.3 Análise comparativa dos dois sorotipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.7 Comparação fenotípica e genotípica entre os dois sorotipos . . . . . .
4.8 Perfil geral obtido pelos métodos fenotípicos e genotípicos . . . . . . .
4.8.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.8.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ANEXOS
55
55
56
56
58
59
59
59
62
62
63
65
65
65
69
69
69
69
73
74
74
74
80
96
98
* Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) NBR 6027. Sumário. Rio de
Janeiro, 1989. (Melo et al., 2005)
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 Características morfológicas e bioquímicas
As salmonelas, bactérias pertencentes ao gênero Salmonella da
família Enterobacteriaceae, morfologicamente se apresentam como bacilos
Gram-negativos aeróbio-anaeróbios facultativos e são móveis por flagelos
peritríquios. As características bioquímicas comumente apresentadas por
esses bacilos entéricos são: fermentação da glicose com produção de ácido
e gás, redução de nitrato a nitrito, reação de oxidase negativa, produção de
sulfeto de hidrogênio, não fermentação da sacarose, descarboxilação da
lisina e da ornitina, dehidrólise variável da arginina, não hidrólise da uréia,
não desaminação do triptofano e da fenilalanina, não produção de indol e
utilização do citrato de Simmons como única fonte de carbono, pela maioria
das cepas. Algumas destas características podem ser alteradas por
aquisição de plasmídeos ou por mutações. Determinados sorotipos
(sorovares) de Salmonella apresentam exceções para algumas
características comuns do gênero (Popoff, Le Minor, 2005).
1.2 Taxonomia e Nomenclatura
A taxonomia de Salmonella é complexa e diferentes sistemas são
utilizados para definir este gênero. Com a utilização de taxonomia baseada
na clínica, os primeiros isolados de Salmonella eram considerados como
diferentes espécies, de acordo com os sintomas clínicos dos hospedeiros.
Com a observação de que algumas dessas “espécies” não eram específicas
para determinados hospedeiros, mas sim, ubiqüitárias, infectando tanto o
homem como os animais, adotou-se a taxonomia baseada em
especificidades antigênicas. A análise sorológica de antígenos somáticos (O)
e flagelares (H), iniciada nos anos 20 por White e, posteriormente,
INTRODUÇÃO
18
expandida por Kauffmann, definia os diferentes sorotipos como espécies (Le
Minor, 1982; Popoff, Le Minor, 2005).
Os vários estudos fenotípicos e genotípicos, realizados a partir
dos anos 70, resultaram em diferentes propostas taxonômicas, visando,
principalmente, a redução do crescente número de espécies (Crosa et
al.,1973; Le Minor, Popoff, 1987; Reeves et al.,1989). Das diferentes
sugestões para denominar espécies, subespécies e espécie-tipo, propôs-se
que o gênero Salmonella fosse composto por duas espécies: S. enterica e S.
bongori. A espécie enterica seria subdividida em seis subespécies, referidas
por algarismos romanos e nomes: I, enterica; II, salamae; IIIa, arizonae
(monofásica); IIIb, diarizonae (bifásica); IV, houtenae e VI, indica. Todos os
sorotipos estariam distribuídos nestas espécies e subespécies. Esta
nomenclatura tem sido adotada por vários centros de referência
internacional para sorotipagem de Salmonella (Brenner et al., 2000; Popoff,
Le Minor, 2005), bem como, no Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil.
As duas espécies de Salmonella e as seis subespécies de
S. enterica são diferenciadas bioquimicamente (Quadro 1). Todos os
sorotipos da subespécie I (enterica), compreendendo a grande maioria das
cepas de Salmonella isoladas no mundo, possuem nomes. Os nomes dos
sorotipos eram, inicialmente, relacionados às síndromes causadas pela cepa
em questão (ex.: S. Choleraesuis e S. Typhimurium). Posteriormente, a
denominação passou a ser de acordo com a região geográfica onde ocorreu
o primeiro isolamento do novo sorotipo (ex.: S. London e S. Panama).
Atualmente, como não são mais considerados espécies, os sorotipos são
grafados com a primeira letra maiúscula e não em itálico. Portanto, o nome
completo de um sorotipo da subespécie enterica pode ser indicado como: S.
enterica subsp. enterica sorotipo Typhimurium ou, simplesmente, S.
Typhimurium. Todos os sorotipos das demais subespécies são descritos
por sua composição antigênica, como exemplo, S. enterica subsp. salamae
sorotipo 13,23:d:e,n,x ou, simplesmente, S. II 13,23:d:e,n,x (Brenner et
al., 2000; Popoff, 2001; Popoff, Le Minor, 2005).
INTRODUÇÃO
19
Quadro 1. Características fenotípicas diferenciais de espécies e subespécies de Salmonella
Espécies
S. enterica
S. bongori (V)
Subespécies enterica (I) salamae (II)
arizonae (IIIa)
diarizonae (IIIb) houtenae (IV) indica (VI)
Características*
Dulcita + + - - - d +
ONPG (2 h) - - + + - d +
Malonato - + + + - - -
Gelatinase - + + + + + -
Sorbitol + + + + + - +
Cultura com KCN - - - - + - +
L(+)/d-tartarato
+ - - - - - -
Galactorunato - + - + + + +
γ-glutamiltransferase
+ + - + + + +
β-glucuronidase
d D - + - d -
Mucato + + + -(70%) - + +
Salicina - - - - + - -
Lactose - - -(75%) +(75%) - d -
Lise por fago 01 + + - + - + d
Habitat usual
Animais de
sangue quente
Animais
de sangue frio e ambiente
N
o
de sorotipos
1478
498 94 327 71 12 21
* ONPG, orto-nitro fenil galactopiranosideo; KCN, cianeto de potássio; +, 90% ou mais de reações positivas; -, 90% ou mais de reações negativas; d, diferentes
reações em diferentes sorotipos. Esquema de Kauffmann-White (Popoff, 2001).
INTRODUÇÃO
20
1.3 Características antigênicas do gênero Salmonella
O gênero Salmonella tem sido subdividido em sorotipos de acordo
com a constituição antigênica com base nos antígenos somáticos (O), nos
antígenos flagelares (H) e, eventualmente, no antígeno capsular Vi (S. Typhi,
S. Paratyphi C e S. Dublin).
1.3.1 Antígeno somático (O)
O lipopolissacáride (LPS), ou endotoxina, é o principal
componente da membrana externa das bactérias Gram-negativas (Rick,
1987). Caracterizado como um antígeno extremamente potente, o LPS
desencadeia resposta imune específica no hospedeiro, tanto humoral
(produção de anticorpos) como celular (fagocitose e destruição das
bactérias) (Morrison, Ryan, 1979). Portanto, é considerado um dos principais
fatores de virulência das bactérias Gram-negativas (Chedid, Parant, 1982).
O LPS consiste de três partes: Lípide A, core e cadeias laterais
polissacarídicas. O Lípide A, constituído por lipídio, está inserido na
membrana e é praticamente constante na família Enterobacteriaceae.
Diretamente aderido ao Lípide A está o core, o qual consiste em uma
pequena cadeia polissacáride, sendo comum a todos os membros de um
determinado gênero. Ligado ao core está o antígeno somático (O)
constituído por unidades oligossacarídicas repetitivas, as cadeias laterais. A
variação em número, tipo e/ou ligação entre os diferentes açúcares das
cadeias laterais determina a especificidade do antígeno somático (Lindberg,
Le Minor, 1984; Rick, 1987).
Aproximadamente, 60 antígenos somáticos diferentes são
conhecidos, e a maioria deles, denominada de antígenos principais,
classifica as salmonelas em 46 sorogrupos, de acordo com a 8
a
edição do
esquema de Kauffmann-White (Popoff, 2001). Os demais, denominados de
INTRODUÇÃO
21
antígenos secundários, não têm valor discriminatório, porém, complementam
o estudo epidemiológico e resultam de modificações químicas nos antígenos
principais, devido à ação de enzimas ou à conversão lisogênica (Le Minor,
1982; Rick, 1987).
1.3.2 Antígeno flagelar (H)
O flagelo bacteriano é uma organela constituída, basicamente, por
3 partes: o filamento helical externo que realiza o trabalho hidrodinâmico em
meio aquoso, o gancho conector e, o corpo basal constituído de anéis e
inserido na membrana celular (Lindberg, Le Minor, 1984). O número de
flagelos por célula, em cepas de Salmonella, varia de 0 a 15, sendo em
média 8, distribuídos de forma peritríquia na superfície celular (Macnab,
1987b). Além da mobilidade conferida às bactérias, os filamentos flagelares
se constituem em potentes antígenos que estimulam a produção de
anticorpos no hospedeiro (Macnab, 1987a).
O filamento flagelar helical é constituído por milhares de cópias,
ou subunidades, de uma única proteína, a flagelina. A flagelina de
Salmonella consiste de regiões terminais, extremamente conservadas,
compreendendo os primeiros 71 aminoácidos e os 46 últimos, e uma região
central variável (Iino, 1977). A especificidade antigênica do antígeno H se
localiza nessa região central da molécula protéica, com superfície exposta
na conformação tri-dimensional (Lindberg, Le Minor, 1984). A seqüência de
diferentes aminoácidos determina a especificidade do antígeno flagelar,
sendo conhecidos aproximadamente 60 diferentes fatores antigênicos
(Popoff, 2001).
Uma característica importante presente na maioria das cepas de
Salmonella é o fenômeno da variação de fase flagelar. Trata-se de um
mecanismo molecular que permite a expressão alternada de duas proteínas
do filamento flagelar, a flagelina FliC e a flagelina FljB, que constituem a fase
flagelar 1 (H1) e a fase flagelar 2 (H2), respectivamente (Macnab, 1987a;
INTRODUÇÃO
22
Iino et al., 1988). Os dois genes que codificam estas duas proteínas são
homólogos, mas não idênticos, e assim, seus produtos são antigenicamente
distintos. O gene fliC, que codifica a flagelina da fase H1, está localizado na
posição 40’ do mapa cromossômico de S. Typhimurium, também presente
em cepas móveis de E. coli (Macnab, 1987b). Em outra localização, na
posição 56’, encontra-se o operon fljBA, composto por dois genes
adjacentes, fljB que codifica a flagelina de fase H2, e o fljA que codifica uma
proteína repressora do gene fliC. O promotor (P) do operon fljBA está
localizado no segmento contendo o gene hin que codifica uma recombinase
(Hin) responsável pelo mecanismo de inversão (Figura 1) (Silverman et al.,
1979; Lindberg, Le Minor, 1984).
Figura 1. Esquema com os principais genes envolvidos na variação
de fase flagelar em cepas de Salmonella spp.
(adaptado de Bonifield,
Hughes, 2003).
Uma reação de recombinação reversível de DNA, do tipo sítio-
específica, mediada pela recombinase Hin juntamente com outras proteínas
estimuladoras de recombinação, resulta na inversão do segmento de DNA
contendo o promotor fljBA. Em uma orientação, o promotor fljBA direciona a
transcrição do operon fljBA (forma ativa do operon – “ON”) e a flagelina FljB
Fase H2
Fase H1
Hin
hin
FljA
FljB
FliC
INTRODUÇÃO
23
é produzida. O gene fljA é co-transcrito com fljB, produzindo a proteína
inibidora de fliC. Nesta orientação, apenas a fase flagelar 2 será expressa.
Na orientação alternativa, o operon fljBA não é expresso (forma inativa do
operon – “OFF”) e a transcrição do gene fliC ocorre, uma vez que o mesmo
não está bloqueado pela FljA. Assim, apenas a flagelina na fase 1 é
expressa (Figura 1). Em nível celular, apenas uma fase flagelar é expressa
de cada vez e, portanto, uma célula bacteriana possui filamentos
homogêneos com uma única especificidade antigênica (Zieg et al., 1977;
Zieg, Simon, 1980; Lindberg, Le Minor, 1984).
A expressão alternada das duas flagelinas ocorre em uma
freqüência de 10
3
a 10
5
gerações bacterianas (Macnab, 1987a). A maioria
dos sorotipos de Salmonella expressa alternadamente as duas fases
flagelares, sendo denominados bifásicos. Aqueles que expressam apenas
uma das fases são denominados monofásicos. A maioria dos sorotipos
monofásicos não expressa o antígeno flagelar da fase 2 (Popoff 2001).
Esses sorotipos monofásicos, teoricamente, não adquiriram um dos genes
ou o mecanismo de inversão durante sua evolução, ou então, seriam
mutantes das cepas bifásicas que perderam a capacidade de expressar uma
das duas fases flagelares.
1.3.3 Esquema de Kauffmann-White
A sorotipagem de Salmonella, realizada por reação antígeno-
anticorpo, com base na variabilidade antigênica dos dois antígenos de
superfície, somático e flagelar, subdivide o gênero Salmonella em sorotipos
ou sorovares. A identificação do sorotipo é realizada pela associação dos
fatores somáticos com os fatores flagelares. Na sorotipagem, utiliza-se um
grande número de anti-soros específicos para a detecção dos diferentes
fatores antigênicos e, portanto, apenas Centros de Referências
especializados realizam a sorotipagem completa de Salmonella.
INTRODUÇÃO
24
O esquema de Kauffmann-White, re-editado a cada cinco anos,
lista todos os fatores antigênicos de cada sorotipo conhecido. A combinação
de aproximadamente 60 antígenos somáticos e 60 antígenos flagelares
determina os 2501 sorotipos atualmente descritos na 8
a
edição desse
esquema (Popoff, 2001). Novos sorotipos são identificados a cada ano, os
quais são descritos em suplementos anuais (Popoff et al., 2003) e
incorporados ao esquema a cada nova edição. O Anexo 3 apresenta alguns
exemplos de sorotipos conforme sua descrição no esquema de Kauffmann-
White.
1.4 Aspectos clínicos e epidemiológicos
A salmonelose é considerada uma das mais importantes
zoonoses e uma das principais doenças transmitidas por alimentos (DTAs)
(Altekruse et al., 1997; Mead et al., 1999; Popoff, Le Minor, 2005).
Embora todos os sorotipos de Salmonella devam ser
considerados como potenciais patógenos, apenas um número limitado deles
é responsável por infecção em humanos e animais. Alguns poucos sorotipos
são adaptados a determinados hospedeiros, causando síndromes
específicas nos mesmos, e os estritamente adaptados ao homem são S.
Typhi, S. Paratyphi A e S. Sendai, responsáveis pela febre entérica ou febre
tifóide. Os demais, denominados de ubiqüitários por infectarem tanto o
homem como os animais, são comumente referidos como não-tifóides e
causam, principalmente, a gastrenterite (Popoff, Le Minor, 2005).
A febre tifóide humana é uma infecção sistêmica severa que
ocorre, freqüentemente, em áreas com saneamento básico precário, sendo
encontrada de forma altamente endêmica nos países asiáticos (Threlfall,
2002) e, com casos mais esporádicos em outros países em
desenvolvimento, incluindo o Brasil (Taunay et al., 1996; Tavechio et al.,
1996; CCD, 2005). Após a colonização intestinal (geralmente, sem o
INTRODUÇÃO
25
desenvolvimento de diarréia), a bactéria atinge a circulação sanguínea
desencadeando o quadro típico da doença, caracterizado por febre, torpor,
cefaléia, esplenomegalia, entre outros sintomas que aparecem entre 8-28
dias após a infecção com os sorotipos tifóides altamente virulentos e
invasivos. Antibioticoterapia, particularmente com cloranfenicol, é necessária
para os pacientes acometidos com febre entérica. O diagnóstico laboratorial
da febre tifóide é realizado, principalmente, pela hemocultura, na fase aguda
da doença, com o isolamento da bactéria (Le Minor, 1982; Popoff, Le Minor,
2005).
Gastrenterite (enterocolite) é a manifestação clínica da
salmonelose causada por sorotipos não tifóides e ubiqüitários que,
essencialmente, se traduz por uma resposta inflamatória dependente de
leucócitos polimorfonucleares na lâmina própria da mucosa intestinal. A ação
da bactéria nas microvilosidades intestinais estimula a ação da adenilato
ciclase provocando perda de fluidos e eletrólitos, caracterizada por diarréia
aquosa. Outros sintomas clínicos da doença incluem dor abdominal, mialgia,
náuseas, vômito e febre, em 8-72 h após a ingestão do alimento
contaminado. A maioria dos sorotipos é, potencialmente, capaz de
desencadear esta doença, levando-se em consideração a dose infectante, o
poder patogênico da cepa bacteriana, os fatores predisponentes do
hospedeiro etc. A doença é, geralmente, auto-limitante e sua duração varia
de 4 a 10 dias. Geralmente, a re-hidratação oral ou endovenosa é suficiente
para a recuperação do doente mais grave. Os pacientes apresentam cultura
de fezes positiva para Salmonella spp. na fase aguda da doença (Le Minor,
1982; Popoff, Le Minor, 2005).
Após a cura de caso clínico de salmonelose e, principalmente, de
febre tifóide, alguns pacientes tornam-se portadores assintomáticos e
continuam a eliminar salmonelas nas fezes por semanas, meses ou anos. A
investigação do estado de portador é importante para impedir a
disseminação da doença por esta via (Popoff, Le Minor, 2005).
INTRODUÇÃO
26
Quadros graves com desidratação e disseminação sistêmica
podem ocorrer e qualquer sorotipo, dependendo de seus fatores de
virulência (endotoxina, exotoxinas, enterotoxinas, plasmídeos, adesinas) e
dos fatores do hospedeiro, pode alcançar a corrente sanguínea
desencadeando bacteremia e/ou septicemia, ou desenvolver infecções
focais. Uma antibioticoterapia adequada é necessária para a completa cura
do doente nestas condições (Le Minor, 1982).
As crianças e os idosos, com seu sistema imune ainda em
desenvolvimento ou em progressiva degeneração, respectivamente, bem
como pacientes imunocomprometidos, seja pela terapia antimicrobiana
intensiva, por falhas no sistema imune ou pela presença de uma doença de
base, são os alvos mais suscetíveis de infecções extra-intestinais por
salmonelas, principalmente por S. Enteritidis e S. Typhimurium (Fernandez
Guerrero et al., 1997; Rodriguez et al., 1998; Fernandes et al., 1999;
Sirinavin et al., 1999; Shimoni et al., 1999; Owusu-Ofori, Scheld, 2003;
Varma et al., 2005).
Nos Estados Unidos da América, a salmonelose é uma das
principais causas de DTAs de etiologia bacteriana conhecida (CDC, 1999;
CDC, 2005), com um número estimado em 1,4 milhões de doentes por ano,
mais de 16.000 hospitalizações e, aproximadamente, 580 mortes (Mead et
al., 1999).
Na Europa, durante o período de 1998-2003, foram reportados
142.891 casos de salmonelose humana, pelos diferentes países
participantes do programa Enter-net. Mesmo havendo um certo declínio na
incidência da salmonelose humana, a doença permanece como a principal
causa de morbidade, e os sorotipos mais freqüentemente isolados são S.
Enteritidis e S. Typhimurium (Fisher et al., 2004).
No Brasil, de acordo com os dados reportados pela Secretaria de
Estado da Saúde de São Paulo, no período de 1999 a 2004, as bactérias
foram responsáveis por cerca de 30% dos surtos de DTA, sendo a grande
maioria por Salmonella, em especial S. Enteritidis (17,4%) (Eduardo, 2005).
INTRODUÇÃO
27
Nos animais, além das manifestações clínicas humanas como
diarréia e septicemia, causadas por sorotipos ubiqüitários, em particular S.
Typhimurium, também podem ocorrer abortos em bovinos e eqüinos,
pulorose em aves e outras manifestações, devido aos sorotipos adaptados a
hospedeiros específicos (Ekperigin, Nagaraja, 1998).
1.5 Métodos de tipagem de cepas de Salmonella
Diferentes métodos são utilizados para a caracterização das
cepas do gênero Salmonella. Os métodos fenotípicos são aqueles que se
baseiam nas características expressas pelas bactérias, e os genotípicos têm
como princípio a análise do genoma bacteriano.
1.5.1 Métodos para caracterização fenotípica
Entre os métodos fenotípicos classicamente utilizados na tipagem
de cepas de Salmonella estão a biotipagem, a sorotipagem, a fagotipagem e
a suscetibilidade aos antimicrobianos.
A biotipagem, a qual se baseia na utilização de propriedades
bioquímicas, tem um papel importante na identificação até o nível de espécie
e subespécie. Uma limitação desta tipagem é a habilidade com que as
bactérias apresentam alterações na expressão de determinados genes,
principalmente, por mutações ou aquisição de plasmídeos, modificando o
fenótipo. Dentro do perfil bioquímico clássico para o gênero Salmonella, a
identificação de alguns biotipos atípicos é de importância primária no
diagnóstico laboratorial (Pessoa et al., 1978a; Pessoa et al., 1983;
Fernandes et al., 1992; Fernandes et al., 1997).
A sorotipagem de cepas de Salmonella é largamente utilizada e
considerada como um método “Padrão-Ouro” na primeira etapa de tipagem
INTRODUÇÃO
28
epidemiológica deste gênero bacteriano. A sorotipagem, realizada somente
após a determinação, por caracterização bioquímica, do gênero, espécies e
subespécies de Salmonella, identifica o principal marcador epidemiológico
destas cepas, o sorotipo.
O conhecimento da distribuição dos sorotipos apresenta as
seguintes contribuições epidemiológicas: detecção de novos sorotipos,
verificação de alteração na freqüência dos já existentes e a distribuição
geográfica e temporal dos mesmos. Embora sejam conhecidos mais de
2.500 sorotipos, apenas cerca de uma centena deles é detectada
anualmente e atribuída como causa de infecção em humanos e animais.
Além disso, alguns clones específicos de S. enterica têm sido muito
dominantes em uma ou mais espécies hospedeiras e têm se disseminado
mundialmente. O estabelecimento de tais sorotipos em uma determinada
região pode levar à ocorrência de numerosos surtos de DTAs, bem como, de
infecções extra-intestinais por longos períodos de tempo. Pode, também,
ocorrer substituição de um sorotipo prevalente por outro que, por sua vez, se
estabelecerá e se disseminará.
Dois grandes exemplos dessa predominância clonal são as
infecções por S. Enteritidis dos fagotipos PT8 e PT4 transmitidas por aves,
respectivamente, nos EUA e Europa, nas décadas de 70 a 90 (Rodrigue et
al., 1990), e por cepas multirresistentes de S. Typhimurium fagotipo DT104,
no Reino Unido, nos anos 90 (Threlfall, 2000). No Brasil, a alternância na
prevalência de sorotipos é exemplificada por S. Typhimurium e S. Agona
predominantes até o início dos anos 90 (Taunay et al., 1996) e, a partir de
1993, a prevalência de S. Enteritidis PT4 (Irino et al., 1996; Tavechio et al.,
1996).
Após a sorotipagem de Salmonella, cepas de determinado
sorotipo podem ser subtipadas por outras técnicas fenotípicas ou
genotípicas. Entre os métodos fenotípicos mais comumente utilizados para
esta subtipagem está a determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos
e a fagotipagem.
INTRODUÇÃO
29
A determinação do perfil de Suscetibilidade aos
Antimicrobianos tem sido utilizada para monitorar o surgimento de cepas
bacterianas resistentes a esses agentes, favorecendo uma antibioticoterapia
mais eficaz, além da subtipagem dessas cepas.
A emergência de resistência para substâncias antimicrobianas no
gênero Salmonella é um problema para humanos e animais em todo o
mundo. O uso extensivo de antimicrobianos em medicina veterinária e
humana tem levado ao aumento de cepas resistentes a múltiplos
antimicrobianos (Cruchaga et al., 2001; Threlfall, 2002; Su et al., 2004).
Em um estudo, recentemente descrito por Varma et al. (2005),
nos Estados Unidos, foi constatado que a resistência antimicrobiana em
cepas de Salmonella não tifoídicas (particularmente S. Enteritidis e S.
Typhimurium) estava associada com um aumento na freqüência de
bacteremias e hospitalização entre os pacientes analisados.
Na Fagotipagem determina-se a reatividade das culturas de um
determinado sorotipo de Salmonella a um conjunto de fagos líticos
(bacteriófagos) selecionados e em diluições apropriadas. Os bacteriófagos
são vírus que infectam bactérias hospedeiras sensíveis, se replicam dentro
das mesmas e provocam sua lise. O padrão de tipagem produzido divide as
cepas do sorotipo em questão em variantes resistentes ou sensíveis aos
fagos (Popoff, Le Minor, 2005). Alguns dos principais sorotipos de
Salmonella possuem seu esquema específico de fagotipagem, tais como,
S. Typhimurium (Anderson et al., 1977), S. Enteritidis (Ward et al., 1987),
S. Heidelberg (Demczuk et al., 2003), S. Typhi e outros sorotipos (Guiné,
van Leeuwen, 1978).
Pela fagotipagem é possível fazer um estudo epidemiológico mais
preciso, com relação às cepas envolvidas em um mesmo surto de DTA, e,
também, evidenciar quais os fagotipos circulantes em determinada região.
No entanto, devido à predominância de alguns fagotipos em certas áreas
geográficas, o método de fagotipagem pode não ser suficientemente
INTRODUÇÃO
30
discriminatório, sendo necessária a utilização de vários métodos para uma
maior discriminação destas cepas (Jeoffreys et al., 2001; Liebana et al.,
2002; Fernandes, 2004).
1.5.2 Métodos para caracterização genotípica
Os métodos de tipagem genotípica (molecular), os quais
envolvem a análise direta do DNA de elementos genéticos cromossômicos
ou extra-cromossômicos, permitem a diferenciação clonal de cepas. Um
clone bacteriano pode ser definido como uma população de células
apresentando muitas características idênticas, cuja explicação para esta
identidade seria que todas as cepas se originam de um ancestral comum. Os
métodos moleculares têm sido utilizados, principalmente, em combinação
com métodos padrões bem estabelecidos (como a sorotipagem e a
fagotipagem) para finalidades epidemiológicas, permitindo a diferenciação
de cepas epidêmicas das não epidêmicas e a construção de dendrogramas
de similaridade.
Tem sido verificada a importância do desenvolvimento de
marcadores moleculares para caracterizar cepas de Salmonella e relacionar
os surtos com suas fontes de origem, em razão da prevalência de
determinados fenótipos. Entre os muitos métodos utilizados para determinar
estes marcadores estão: a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR
– “Polymerase Chain Reaction”), a análise do perfil plasmideal e o estudo
genômico por eletroforese em campo pulsado (PFGE – “Pulsed-field gel
electrophoresis”).
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),
reprodução em tubo de ensaio do processo natural de replicação do DNA,
consiste da amplificação cíclica e exponencial “in vitro” de um dado
fragmento de DNA, a partir de iniciadores (“primers”) específicos. (Rolfs et
al., 1992).
INTRODUÇÃO
31
PCR é uma técnica com alta sensibilidade e diversas variações
têm sido descritas, tornando cada vez mais ampla a aplicabilidade da
mesma. Uma variação largamente utilizada em estudos de cepas de
Salmonella é conhecida por Multiplex-PCR, a qual consiste na utilização de
vários pares de “primers”, para diferentes genes, em uma única reação,
gerando fragmentos de DNA de diferentes tamanhos. A amplificação
simultânea de mais de uma região de DNA de interesse em uma reação
reduz o trabalho, o tempo, o custo e o risco de contaminação cruzada.
Multiplex-PCR tem sido utilizada em estudos sobre a detecção de
genes flagelares de Salmonella, possibilitando a identificação de cepas
monofásicas e a detecção rápida de sorotipos prevalentes (Echeita, Usera,
1998; Echeita et al., 2002; Alvarez et al., 2004;), bem como, em estudos
para a identificação de genes de resistência aos antimicrobianos e de
virulência (Sandvang et al., 1998; Briggs, Fratamico, 1999; NG et al., 1999;
Khan et al., 2000).
A Análise do perfil Plasmideal envolve, inicialmente, a extração
dos plasmídeos, moléculas circulares de DNA dupla-fita que se replicam
autonomamente em uma célula bacteriana hospedeira. Eles variam em
tamanho desde poucos até centenas de kilo-pares de bases e contem genes
úteis para si mesmos, bem como, para sua célula hospedeira, como os
genes que codificam resistência aos antimicrobianos e fatores de virulência.
Após a extração, os eventuais diferentes plasmídeos, presentes em cada
amostra bacteriana, são separados por eletroforese em gel de agarose,
determinando-se o número e o tamanho dos plasmídeos. Informação
adicional pode ser obtida pela digestão do DNA plasmideal com uma enzima
de restrição e posterior comparação do número e tamanho de fragmentos
resultantes, ou seja, análise do perfil de restrição plasmideal (Hardy, 1986).
Cepas de Salmonella podem albergar plasmídeos de diferentes
tamanhos moleculares, variando de 1 a 200 kb. Alguns destes plasmídeos
têm sido considerados como plasmídeos de virulência sorotipo-específico
(Helmuth et al., 1985). Fernandes et al. (1997) relataram a caracterização de
INTRODUÇÃO
32
cepas de S. Agona albergando plasmídeos de aproximadamente 90 MDa,
responsáveis pelo fenótipo lactose-positiva e multirresistência
antimicrobiana. Em outro estudo realizado por Fernandes et al. (2003b), a
maioria das cepas de S. Enteritidis (93%) albergavam um plasmídeo de 36
MDa, porém, seu papel na virulência dessas cepas não está bem
estabelecido.
O método “Pulsed-Field Gel Electrophoresis” (PFGE) consiste
na análise do DNA cromossômico bacteriano por eletroforese em gel de
agarose em campo pulsado. O DNA bacteriano é digerido com enzimas de
restrição que reconhecem poucos sítios ao longo do DNA cromossômico,
cortando-o aleatoriamente e gerando fragmentos grandes (10 – 800 kb), os
quais não poderiam ser separados eficientemente por eletroforese
convencional. Assim, a separação destes fragmentos grandes de DNA se dá
por procedimentos de eletroforese especiais. A orientação do campo elétrico
através do gel é modificada periodicamente, permitindo que fragmentos de
até duas megabases sejam separados efetivamente por diferença de
tamanho (Tenover et al., 1995; Gautom, 1997).
Devido ao seu grande valor na análise epidemiológica para
diferenciação de cepas patogênicas e no monitoramento de sua distribuição
na comunidade (Gautom, 1997), o PFGE tem sido considerado o método
“Padrão-Ouro” entre os diferentes métodos de tipagem molecular de várias
espécies bacterianas (Olive, Bean, 1999). O PFGE tornou-se um método
padrão entre laboratórios de saúde pública, devido à sua acurácia e
reprodutibilidade entre os diferentes laboratórios (Gautom, 1997). Este
método permite, também, a diferenciação de isolados caracterizados como
idênticos por outras análises como sorotipagem, fagotipagem, ribotipagem,
análise de plasmídeos etc.
Assim, PFGE foi o método escolhido para subtipar cepas de
diferentes enteropatógenos, incluindo Salmonella spp. (Swaminathan et al.,
2001), em dois grandes programas de vigilância das DTAs envolvendo
vários países, PulseNet nos Estados Unidos, onde o Brasil está incluído
INTRODUÇÃO
33
(CDC, 2004b), e Salm-gene/Enter-net na Europa (Peters et al., 2003; Fisher
et al., 2004).
A análise de características fenotípicas e genotípicas pode ser
realizada pela construção de dendrogramas de similaridade. O
dendrograma agrupa as cepas de acordo com a percentagem de
similaridade entre os perfis obtidos com os diferentes métodos de tipagem.
Muitos autores têm comparado, simultaneamente, vários
marcadores tais como fagotipos, perfil plasmideal, perfil de sensibilidade
antimicrobiana, perfil de PFGE, entre outros, e geralmente concluído que
uma combinação de vários marcadores é a melhor forma de análise de
similaridade entre cepas de um mesmo sorotipo ou mesma espécie
bacteriana. Estudos combinando estes vários métodos para caracterizar
cepas de Salmonella, particularmente, as provenientes de surtos ou de
regiões diferentes, com a finalidade de detectar o grau de similaridade entre
as mesmas, têm sido largamente descritos (Baggesen et al., 2000; Liebana
et al., 2001; Murphy et al., 2001; Lawson et al., 2002; Liebana et al., 2002;
Lindsay et al., 2002; Thong et al., 2002; Fernandes, 2004).
1.6 Salmonella Typhimurium
Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium (S.
Typhimurium) é um sorotipo bifásico que expressa alternadamente as duas
flagelinas, ou seja, FliC = i (fase flagelar 1) e FljB = 1,2 (fase flagelar 2). A
composição antigênica completa, reportada no esquema de Kauffmann-
White é 1,4,[5],12:i:1,2. S. Typhimurium é um sorotipo ubiqüitário
amplamente disseminado na natureza e de grande importância em saúde
pública. O termo “typhimurium” é decorrente do isolamento das primeiras
cepas a partir de ratos doentes com síndrome tifoídica (Le Minor, 1982).
INTRODUÇÃO
34
A grande maioria dos casos de infecções humanas por
S. Typhimurium deve-se aos surtos de DTAs, causados pela ingestão de
diversos alimentos contaminados (Villar et al., 1999; de Valk, 2000; CDC,
2003; Horby, 2003; CDC, 2004a; CDC, 2006). Nos Estados Unidos,
S. Typhimurium é o sorotipo de Salmonella mais freqüentemente associado
com doença diarréica, sendo que, em 1998, correspondeu a 30% de todas
as salmonelas isoladas e reportadas ao CDC (CDC, 1999), e em 2004,
declinou para 20% das cepas de Salmonella isoladas dos casos notificados
(CDC, 2005). No Canadá, correspondeu a 22% dos sorotipos isolados em
2000 (Martin et al., 2004).
S. Typhimurium também é um dos sorotipos de Salmonella mais
freqüentemente isolados de infecções humanas em outras regiões. Em
países Europeus, foi o segundo sorotipo mais freqüentemente isolado no
período 1998-2003 (Fisher et al., 2004), sendo que, individualmente na
França, este sorotipo correspondeu a 32,5% de todas as salmonelas
isoladas no período 1993-2003 (Weill et al., 2006). Na Austrália, a
percentagem de isolamento de S. Typhimurium foi de 40-70% nos casos de
salmonelose humana, segundo relato de Jeoffreys et al. (2001).
No Brasil, mais especificamente no Estado de São Paulo, desde o
final dos anos 60 até o início da década de 90, S. Typhimurium
correspondeu ao sorotipo de Salmonella mais freqüentemente isolado em
infecções humanas (Taunay et al., 1996). O aumento na freqüência de
isolamento de S. Typhimurium, a partir de 1968 com 48% e em 1969 com
85%, deveu-se à ocorrência de surtos em três hospitais pediátricos do
município de São Paulo, atingindo crianças em berçários (Taunay et al.,
1971). Em 1971, foi detectada a presença de cepas de S. Typhimurium
fermentadoras rápidas da lactose (Pessoa, 1973), biotipo este conferido por
plasmídeos (Le Minor et al., 1974) e responsável por até 88% das cepas de
S. Typhimurium isoladas no período de 1971 a 1975 (Pessoa et al., 1978b).
Esse sorotipo correspondeu a 86% do total de cepas de Salmonella isoladas
no período 1970-1976 (Pessoa et al., 1978a). Ainda nos anos 70, o biotipo
de fermentação rápida da lactose foi substituído pelo biotipo de fermentação
INTRODUÇÃO
35
tardia (Pessoa et al., 1983). Posteriormente, no relato sobre os sorotipos de
Salmonella identificados no período 1977-1982 (Calzada et al., 1984),
S. Typhimurium correspondeu a 69% das cepas de Salmonella. No período
subseqüente, 1983-1990, relatado por Taunay et al. (1996), embora ainda
sendo o sorotipo predominante, houve um declínio considerável de
S. Typhimurium (36%) associado com o aumento de S. Agona (21%).
Na avaliação reportada por Taunay et al. (1996), sobre os 40 anos
(1950-1990) de vigilância laboratorial da salmonelose realizada no Instituto
Adolfo Lutz e compreendendo os dados citados acima, verificou-se a alta
freqüência de S. Typhimurium em infecções extra-intestinais, principalmente
pelos isolados de sangue com 0, 24%, 67% e 45%, e pelos de líquido
cefalorraquidiano com 35%, 93%, 86% e 64%, respectivamente nas 4
décadas, em relação aos demais sorotipos isolados dessas amostras
biológicas.
A partir de 1993, a freqüência de isolamento de S. Enteritidis
aumentou significativamente, tornando-se o sorotipo prevalente nos anos
subseqüentes (42 a 83%), tanto em materiais de origem humana como nos
de não humana, principalmente em produtos aviários, no Estado de São
Paulo (Tavechio et al., 1996; Tavechio et al., 2002; Fernandes et al., 2006).
Porém, S. Typhimurium continuou entre os três sorotipos mais freqüentes
em infecções humanas, correspondendo a 7% dos sorotipos isolados na
década de 90 (Anexo 4), sendo regularmente associado a surtos de DTAs,
como o que recentemente ocorreu em um evento científico, na cidade de
São Paulo (SES-SP, 2005).
Cepas de S. Typhimurium, isoladas de humanos e não humanos,
têm apresentado uma maior multirresistência (MR) aos antimicrobianos,
quando comparadas às cepas de outros sorotipos de Salmonella (Cruchaga
et al., 2001; van Duijkeren et al., 2003; Su et al., 2004). Martin et al. (2004)
reportaram que a maioria das hospitalizações ocorria quando os pacientes
eram infectados por S. Typhimurium MR, em especial a ampicilina,
canamicina, cloranfenicol, sulfonamidas, estreptomicina e tetraciclina.
INTRODUÇÃO
36
A determinação do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos,
realizada no setor de Enterobactérias IAL-SP, com os sorotipos mais
prevalentes de Salmonella, tem demonstrado uma considerável maior
multirresistência em cepas de S. Typhimurium em comparação aos demais
sorotipos identificados no Estado de São Paulo (Fernandes et al., 2003a). A
subtipagem molecular destas cepas multirresistentes foi recentemente
reportada (Ghilardi et al., 2006).
O desenvolvimento do esquema de fagotipagem para as cepas de
S. Typhimurium foi iniciado em 1943 por B. R. Callow, que o expandiu em
1959 (Callow, 1959). Posteriormente, Anderson et al (1977) publicou uma
nova expansão deste esquema pela utilização de 34 fagos distinguindo 207
tipos de S. Typhimurium. Atualmente, expandido pelo Laboratório de
Patógenos Entéricos, de Referência Internacional, em Colindale, Londres, a
utilização de 38 fagos permite a discriminação de mais de 300 tipos, a
maioria formada por tipos reconhecidos como “Definitive Types” (DT) e
alguns atípicos (AT ou RDNC “reaction does not conform”) (Gudmundsdottir
et al., 2003; Rafiq Ahmed, comunicação pessoal em 2004).
A fagotipagem permitiu a detecção, no Reino Unido, nos anos 80,
do clone S. Typhimurium DT104 MR para ampicilina, cloranfenicol,
sulfonamidas, estreptomicina e tetraciclina, conhecido como penta-resistente
ou como R-tipo ACSSuT, resistência essa codificada por genes
cromossômicos (Threlfall et al., 1994). A partir de 1991, este clone tornou-se
o segundo mais freqüente na Grã-Bretanha (Threlfall, 2000) e logo adquiriu
uma característica “pandêmica” devido à sua disseminação em diversos
outros países (Glynn et al., 1998; Metzer et al., 1998; Poppe et al., 1998;
Ribot et al., 2002; Helms et al., 2005).
A utilização de PCR tem permitido a identificação de cepas
monofásicas de Salmonella enterica (Echeita et al., 1999), a detecção rápida
de diferentes genes flagelares (Alvarez et al, 2004), a identificação de
fagotipos DT104/U302 de S. Typhimurium (Pritchett et al., 2000; Amavisit et
al., 2005), bem como, a detecção de genes de resistência antimicrobiana,
INTRODUÇÃO
37
em particular, em cepas de S. Typhimurium DT104 (Sandvang et al., 1998;
Briggs, Fratamico, 1999; NG et al., 1999; Khan et al., 2000).
O perfil plasmideal tem sido utilizado para diferenciar cepas de
S. Typhimurium, porém, a grande maioria apresenta um plasmídeo de 60
MDa (ou 100 Kb), conhecido como plasmídeo de virulência específico deste
sorotipo (Helmuth et al., 1985; Threlfall et al., 1994; Baggesen et al., 2000).
A prevalente presença deste plasmídeo de 60 MDa, associado ou não a
outros menores, faz com que este método não tenha grande poder
discriminatório, sendo comumente utilizado em associação com outros
métodos fenotípicos ou genotípicos (Liebana et al., 2002; Lawson et al.,
2004).
Diferentes autores reportaram que a utilização do PFGE para
subtipar as cepas de S. Typhimurium, principalmente aquelas associadas a
surtos, apresenta um grande poder discriminatório evidenciando clonalidade
entre cepas isoladas de alimentos, pacientes ou animais (Corbett-Feeney,
Riain, 1998; Bender et al., 2001; Murphy et al, 2001; Wright et al., 2005).
1.7 Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:-
Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:-
(S. I 1,4,[5],12:i:-) é um sorotipo monofásico atípico e desprovido da fase
flagelar dois (FljB), o qual pertence ao mesmo grupo antigênico do sorotipo
Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) e do sorotipo Lagos (4,[5],12:i:1,5), podendo
ser uma variante monofásica de um desses dois sorotipos ou um novo
sorotipo, pela perda do mecanismo de inversão ou da habilidade em
expressar a fase flagelar 2. S. I 1,4,[5],12:i:- também tem sido associado
com salmonelose humana e sua detecção tem sido descrita em diferentes
países.
Na Tailândia, em 1993 (Boonmar et al., 1998), S. I 4,5,12:i:- já se
encontrava entre os cinco sorotipos de Salmonella mais freqüentes de fontes
INTRODUÇÃO
38
humanas e não humanas. Mais recentemente, nos dados reportados por
Bangtrakulnonth et al. (2004), verifica-se a mesma freqüência deste sorotipo
no período subseqüente, 1993-2002.
Na Espanha, Echeita et al. (1999) descreveram a detecção do
sorotipo monofásico S. I 4,5,12:i:-, em 1997, o qual rapidamente tornou-se o
4
o
mais freqüente entre as cepas isoladas de origem humana e o 9
o
entre as
de alimento, nos dois anos posteriores, tendo como possível fonte de
transmissão, os porcos. Essas cepas foram analisadas pelo método do
Multiplex-PCR, publicado por Echeita e Usera (1998), o qual identifica a
segunda fase flagelar de cepas de Salmonella possuindo o complexo
antigênico H:1 (1,2; 1,5; 1,6; 1,7), codificado por fljB, e foram confirmadas
como monofásicas, ou seja, desprovidas do gene codificador da fase H2. A
maioria das cepas de S. I 4,5,12:i:-, apresentou multirresistência aos
antimicrobianos, principalmente o perfil ACSSuT, e pertenceu ao fagotipo
DTU302. Posteriormente, Echeita et al. (2005) relataram a permanência
deste sorotipo em 4
o
lugar até 2001.
Nos Estados Unidos, Agasan et al. (2002) descreveram que
S. I 4,5,12:i:- apresentou um gradual aumento na freqüência de isolamento
no período de 1998 a 2000, aparecendo entre os 10 sorotipos mais
freqüentes em 2000 e sendo associado a surto de DTA. O isolamento de
S. I 4,5,12:i:- também tem sido reportado no Canadá, cuja prevalência
apresentou um aumento significativo em 1999, quando comparada à dos
anos anteriores (Clark et al., 2005)
No Estado de São Paulo, Brasil, o sorotipo S. I 1,4,[5],12:i:- tem
sido detectado em amostras de origem humana e não humanas pelo menos
desde os anos 70. Até 1990, a percentagem de isolamento destas cepas em
relação aos demais sorotipos de Salmonella, isolados de amostras humanas
e não humanas, era de 2,0 e 0,3%, respectivamente (Taunay et al., 1996).
Na década de 90, ocorreu um aumento para 9,0% e 1,6%, no mesmo tipo de
amostras (Tavechio et al., 1996; Tavechio et al., 2002; Anexos 4 e 5). Nas
infecções humanas, o sorotipo S. I 1,4,[5],12:i:- tem sido associado,
INTRODUÇÃO
39
principalmente, com as gastrenterites nos surtos de DTAs, porém, a sua
presença em infecções extra-intestinais também tem sido verificada. Além
disso, S. I 1,4,[5],12:i:- encontra-se entre os dez sorotipos de Salmonella
mais freqüentemente isolados em infecções humanas, juntamente com o
sorotipo S. Typhimurium, na última década nessa região. Os Anexos 4 e 5
apresentam a posição relativa e freqüência destes dois sorotipos entre os 15
mais freqüentemente isolados no período 1991-2000, de fontes humanas e
não humanas, respectivamente, em um total de mais de 150 diferentes
sorotipos.
Este estudo foi desenvolvido com a finalidade de caracterizar as
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, por métodos fenotípicos e moleculares, e,
comparar o perfil destas com o das S. Typhimurium, também caracterizadas
com os mesmos métodos, visando uma implementação do conhecimento da
epidemiologia da salmonelose em nossa região.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
41
2 OBJETIVOS
2. 1 Objetivo Geral
Caracterizar as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas de fontes humanas
e não humanas, no Estado de São Paulo, no decênio 1991-2000, por
métodos fenotípicos e genotípicos, e comparar com o perfil das cepas de S.
Typhimurium, obtido pelos mesmos métodos.
2. 2 Objetivos específicos
Caracterizar as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- quanto à presença do gene
fljB (H:1,2) por PCR.
Caracterizar as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium por
métodos fenotípicos (suscetibilidade a antimicrobianos e
fagotipagem).
Caracterizar as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium por
métodos moleculares (perfil plasmideal e “PFGE”)
Verificar a similaridade genética entre as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-.
Verificar a similaridade genética entre as cepas de S. Typhimurium.
Verificar a similaridade fenotípica e genotípica entre os sorotipos S. I
1,4,[5],12:i:- e S. Typhimurium.
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS
43
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os meios de cultura, reagentes e soluções utilizados neste estudo
estão descritos no Anexo 6.
3.1 Cepas bacterianas
As cepas de Salmonella, de origem humana e não humana,
isoladas nos vários laboratórios regionais da Rede do Instituto Adolfo Lutz,
no Estado de São Paulo, e associadas principalmente com DTAs, bem
como, as isoladas em hospitais da cidade de São Paulo, em Universidades
Públicas ou em laboratórios particulares, foram enviadas ao Setor de
Enterobactérias, Seção Bacteriologia, do Instituto Adolfo Lutz Central-SP
para serem sorotipadas.
No período de janeiro de 1991 a dezembro de 2000, foram
sorotipadas 4.426 cepas de Salmonella isoladas de amostras de origem
humana e 8.021 cepas de origem não-humana (Anexos 4 e 5). Um total de
403 (9,1%) cepas de fontes humanas e 128 (1,6%) de não humanas foram
identificadas, por soro-aglutinação em lâmina, como S. I 1,4,[5],12:i:-. Destas
cepas, 517 foram, primeiramente, caracterizadas quanto à presença de fljB-
H:1,2 por PCR e, posteriormente, das 369 cepas fljB-negativas submetidas
aos testes de suscetibilidade aos antimicrobianos (Quadro 2), foi
selecionada uma amostragem para os outros testes. Foram também
incluídas neste estudo, 45 cepas de S. Typhimurium identificadas no mesmo
período. O número de cepas, de acordo com os métodos utilizados, está
descrito no Quadro 3.
Todas as cepas foram mantidas em ágar conservação em
temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
As cepas padrões utilizadas nas diferentes metodologias estão
descritas nos respectivos itens.
MATERIAL E MÉTODOS
44
Quadro 2. Distribuição das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- fljB negativas, de
acordo com a fonte humana e não humana de isolamento, no Estado de São
Paulo, 1991-2000
ORIGEM N
O
DE ISOLADOS
Fezes 190
Sangue 64
Urina 14
Secreções
1
14
LCR
2
7
Subtotal
289
Animais
3
45
Alimento
4
25
Ambiente
5
7
Outros 3
Subtotal
80
Não Humana Humana
TOTAL 369
1
secreções e outros fluidos corpóreos;
2
liquido cefalorraquidiano;
3
camundongo (27),
cobaia (8), eqüino (2), coelho (2), cão (2), ave (1), bovino (1), lobo guará (1), cascavel (1);
4
carcaça de frango (7), farinha (7), carne bovina (3), maionese (2), outros alimentos (2),
doce (1), mariscos (1), queijo (1), lingüiça (1);
5
ambiente indeterminado (3), esgoto (2),
água de “chiller” (1), cama de ave (1)
Quadro 3. Número de cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium, de
origem humana e não-humana, 1991-2000, Estado de São Paulo,
caracterizadas segundo cada método
Método S. I 1,4,[5],12:i:- S. Typhimurium
H* NH* TOTAL H* NH* TOTAL
PCR 389 128
517
- -
-
Suscetibilidade antimicrobiana 289 80
369
37 8
45
Fagotipagem 42 11
53
37 8
45
Perfil plasmideal 42 11
53
37 8
45
PFGE 42 11
53
37 8
45
* H, origem humana; NH, origem não humana
MATERIAL E MÉTODOS
45
3.2 Identificação Bioquímica e Sorológica de Salmonella spp.
Os isolados de Salmonella foram reativados em caldo nutriente
(Difco) e semeados em placas de Tryptic Soy Agar (TSA - Difco) (incubação
a 37
o
C por 18 horas), e a seguir, uma colônia isolada foi inoculada em tubo
de TSA inclinado, em tubo de meio presuntivo IAL (Pessoa, Silva, 1974) e
em placa de meio semi-sólido SvenGard (Institut Pasteur Production, 1978)
(incubação a 37
o
C por 18 horas). A confirmação bioquímica dos isolados em
nível de gênero foi realizada de acordo com Ewing (1986). A determinação
das espécies e subespécies foi realizada bioquimicamente conforme Quadro
1 (Popoff, 2001).
A sorotipagem, a partir da cultura em tubo de TSA inclinado
(determinação do antígeno somático) e em placa de meio semi-sólido
SvenGard (determinação do antígeno flagelar), foi realizada pela técnica de
macro-aglutinação em placa de vidro, de acordo com Popoff (2001). Todos
os anti-soros somáticos e flagelares utilizados na sorotipagem foram
produzidos no setor de Enterobactérias-IAL/SP, de acordo com protocolo
elaborado pelo Instituto Pasteur (Le Minor, Rhode, 1989).
3.3 Análise das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- quanto à presença de fljB
As 517 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- foram submetidas à análise por
PCR quanto à presença de fljB-H:1,2, segundo a técnica descrita por Echeita
e Usera (1998), realizada conforme as condições citadas a seguir. Uma
pequena alíquota do crescimento bacteriano de 18-24 horas em TSA, a
37
o
C, foi suspensa em 1 mL de água destilada esterilizada. A suspensão foi
aquecida a 100
o
C por 10 minutos, centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos
a 4
o
C (microcentrífuga Marathon 26KMR, Fisher Scientific) e os
sobrenadantes foram usados como DNA “template”. As reações de PCR
foram realizadas em um volume total de 50 µL contendo: 5 µL do DNA
“template”, 1,5 mM de MgCl
2
, 200 µM de cada dNTP, 0,1 µg de cada
MATERIAL E MÉTODOS
46
“primer” e 2,5 U da Taq DNA polimerase. As etapas da amplificação foram:
desnaturação inicial a 95
o
C por 4 minutos; 25 ciclos de: desnaturação a
95
o
C por 40 segundos, anelamento a 56
o
C por 20 segundos e extensão a
72
o
C por 30 segundos; extensão final a 72
o
C por 10 minutos. O controle
branco da reação continha todos os reagentes exceto o DNA “template”.
Alíquotas de 10 µL dos produtos amplificados, adicionadas de 5 µL de água
destilada e 5 µL de corante de arraste, foram aplicadas em gel de agarose
tipo II (Sigma) a 2,0% em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X. Após
eletroforese a 110V 25mA por 1 hora, com TEB 0,5X em cuba horizontal, o
gel foi corado com brometo de etídio. A visualização dos fragmentos
amplificados foi realizada em transiluminador de luz ultravioleta 254 nm
(Pharmacia Biotech), e o gel foi fotografado por câmera Polaroid modelo
MP4 Land (Polaroid Co., Cambridge, EUA), contendo filme de alta
sensibilidade (Polaroid 667) e através de filtro laranja (Kodak Eastman
Chemical, New Haven, EUA).
O Quadro 4 apresenta as seqüências de nucleotídeos dos
“primers” (Gibco BRL, Life Technologies) e o tamanho do fragmento
amplificado, utilizados para a amplificação específica do alelo da segunda
fase flagelar H:1,2 (Echeita, Usera, 1998). Uma cepa conhecida de S.
Typhimurium (H:1,2) e de S. I 1,4,[5],12:i:- (H:-) foram utilizadas como
controles.
Quadro 4. Seqüência de nucleotídeos dos “primers” e tamanho do
fragmento amplificado por PCR
“Primer” Seqüência (5’ – 3’)* Alelos pb**
Sense-F1 CGCAAAGATACAGCAGTAACAACGA
Antisense-R1 CATTTTGACCAAYKYMGCGSCAT H:1,2 394
* Y = C+T , K = G+T , M = A+C , S = G+C.
** Tamanho do fragmento amplificado em pares de bases.
MATERIAL E MÉTODOS
47
3.4 Perfil de Suscetibilidade aos Antimicrobianos
Todas as 369 cepas de S. I 4,[5],12:i:- fljB negativas, ou seja, que
não amplificaram o fragmento específico da segunda fase flagelar, e as 45
cepas de S. Typhimurium (selecionadas a partir de uma amostragem
previamente caracterizada por Ghilardi et al., 2006), foram submetidas aos
testes de suscetibilidade antimicrobiana, pelo método de difusão de disco
em ágar (Bauer et al, 1966), de acordo com as normas do “National
Committee of Clinical and Laboratory Standards” (NCCLS, 2003), atualmente
denominado de “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI). Os
agentes antimicrobianos (CECON) utilizados, suas siglas e concentrações
foram: ácido nalidíxico (NA, 30 µg), amicacina (AMK, 30 µg),
amoxicilina/ácido clavulânico (AMC, 30 µg), ampicilina (AMP, 10 µg),
aztreonam (ATM, 30 µg), cefalotina (CF, 30 µg), cefepime (CPM, 30 µg),
ceftazidima (CAZ, 30 µg), ceftriaxona (CRO, 30 µg), ciprofloxacina (CIP, 5
µg), cloranfenicol (C, 30 µg), estreptomicina (S, 10 µg), gentamicina (GEN,
10 µg), imipenem (IPM, 10 µg), canamicina (K, 30 µg), netilmicina (NET, 30
µg), nitrofurantoina (NI, 300 µg), sulfazotrim (SXT, 25 µg), sulfonamidas
(SSS, 300 µg), tetraciclina (TET, 30 µg). As cepas Escherichia coli (ATCC
25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) foram utilizadas como
controles.
Cada cepa foi reativada em placas de TSA com incubação a 37
o
C
por 18 horas, e então, 3 a 5 colônias, morfologicamente semelhantes, foram
inoculadas em caldo Mueller-Hinton e incubadas a 37
o
C por no mínimo 2
horas, até a obtenção de turvação equivalente à escala 0,5 de McFarland
(1,5 X 10
8
UFC/mL). Com auxílio de “swab” estéril, cada cultura foi semeada
de forma homogênea em placas de ágar Mueller-Hinton, para obtenção de
crescimento confluente, e os discos embebidos em antibióticos foram
manualmente aplicados na superfície do meio de cultura seco. As placas
foram incubadas a 37
o
C por 16-18 horas, quando se fez a leitura dos halos
de sensibilidade. A determinação de sensibilidade (S), sensibilidade
MATERIAL E MÉTODOS
48
diminuída ou resistência intermediária (I) e resistência (R) foi realizada
segundo as recomendações do NCCLS (2003).
3.5 Fagotipagem
Foram selecionadas 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, 44
apresentando multirresistência aos antimicrobianos e 09 sensíveis, para
serem caracterizadas pela fagotipagem. Das 45 cepas de S. Typhimurium,
35 eram multirresistentes e 10 eram sensíveis.
Todas as 98 cepas foram fagotipadas no laboratório de
Patógenos Entéricos da Agência de Saúde Pública do Canadá, em
Winnipeg. Foi utilizado o esquema de fagotipagem de Salmonella
Typhimurium inicialmente descrito por Callow (1959), posteriormente
desenvolvido por Anderson et al (1977), e em contínuo desenvolvimento
pelo Laboratório de Patógenos Entéricos em Colindale.
Tubos contendo 4 mL de caldo para fagos (Difco Phage Broth)
foram inoculados com 3 colônias lisas e morfologicamente semelhantes de
cada uma das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium, re-ativadas
em placas de TSA (incubação a 37
o
C por 18 horas). Os tubos foram
incubados a 37
o
C por, aproximadamente, 1 hora e 15 minutos (na posição
inclinada, em banho-maria com agitação), para obtenção de turvação
equivalente à escala 0,5 de McFarland (1,5 x 10
8
UFC/mL). Em cabine de
segurança biológica e com o auxílio de pipeta Pasteur, 2 mL do caldo de
cada cultura foram usados para inundar placas quadradas (Fisher Integrid
Petri, com 36 quadrados de 13 x 13 mm cada) contendo ágar para fagos
(Difco Phage Agar), previamente secas por 1 hora e 30 minutos a 37
o
C. O
excesso de caldo foi removido e as placas ficaram abertas dentro da cabine
de segurança biológica por 15 minutos para secagem. Aproximadamente 15
µL de cada fago, de um conjunto de 30 fagos de tipagem e mais um “pool”
específico para Salmonella spp., mantidos a 4
o
C na devida diluição, foram
aplicados na superfície do meio, de acordo com um molde definido e com a
utilização de multi-inoculador manual. As placas foram incubadas a 37
o
C por
MATERIAL E MÉTODOS
49
18 horas e o padrão de lise produzido pelos 31 fagos foi lido e interpretado
por comparação com o esquema padrão. Até essa etapa, a grande maioria
das cepas apresentando fagotipos referidos como Definitive Types (DTs)
foram identificadas. Todas as amostras negativas para os 30 fagos, e
aquelas lisadas apenas pelo fago 18, foram testadas com 10 fagos
adicionais experimentais, possibilitando a caracterização de outros DTs, bem
como, fagotipos atípicos (AT “atypical” ou RDNC, “reaction does not
conform”) ou cepas não tipáveis (UT, “untypeable”). Atualmente, um total de
mais de 300 fagotipos (PTs) pode ser identificado por este esquema.
A leitura do padrão de lise produzido pelos diferentes fagos foi
realizada de acordo com a legenda padronizada (Callow, 1959). A ação do
bacteriófago sobre a camada de células bacterianas (crescimento confluente
em meio de cultura), produz uma zona de lise (placa de lise), vista como
uma área clara no crescimento bacteriano. Isso corresponde a reações
positivas para diferentes fagos. Quando o receptor do fago não reconhece
qualquer constituinte da superfície bacteriana em teste, nenhuma placa é
formada e é definido como reação negativa.
3.6 Análise do perfil plasmideal
A extração do DNA plasmideal das células das 53 cepas de S. I
1,4,[5],12:i:- e das 45 de S. Typhimurium foi realizada de acordo com o
método de extração alcalina, para volumes pequenos de culturas
bacterianas, descrito por Birnboim, Doly (1979). As cepas foram semeadas
em 3 mL de caldo Tryptic Soy Broth (TSB) e incubadas a 37
o
C por 16-18
horas, com agitação de 110 rpm (C25 Incubator shaker, New Brunswick
Scientific, Edison, NJ, USA). Um volume de 1,3 mL de cada cultura foi
transferido para tubo tipo eppendorf estéril e centrifugado por 15 minutos, a
4
o
C e 10.000 rpm (microcentrifuga Marathon 26KMR, Fisher Scientific). O
sobrenadante foi desprezado e foram adicionados 100 µL da solução lítica
para extração de DNA plasmideal (solução I). Após completa
MATERIAL E MÉTODOS
50
homogeneização, com palito estéril, a preparação foi mantida em banho de
gelo por 30 minutos. Foram, então, adicionados 200 µL da solução alcalina
com dodecil sulfato de sódio (solução II) e, após homogeneização por
inversões lentas, a preparação foi mantida em banho de gelo por
exatamente 5 minutos. Foram, então, adicionados 150 µL da solução de
acetato de sódio 3 M, pH 8,0 (solução III) e, após lenta homogeneização, a
preparação foi mantida em banho de gelo por mais 15 a 30 minutos. Após
centrifugação por 15 minutos a 4
o
C e 10.000 rpm, um volume de 400 µL,
contendo o DNA total, foi transferido para um novo tubo tipo eppendorf
estéril. A precipitação do DNA foi realizada pela adição de 1 mL de etanol
puro (95%), mantido a –20
o
C, seguida de homogeneização por inversão
lenta e incubação a –70
o
C por 15 minutos (ou 18-24 horas a –20
o
C). A
preparação foi, então, centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos, a 4
o
C. O
sedimento foi re-suspenso em 100 µL da solução Tris-acetato de sódio, pH
8,0 (solução IV), ao qual foram adicionados 250 µL de etanol puro (95%)
mantido a –20
o
C. A preparação foi homogeneizada, por inversões lentas, e
incubada a –70
o
C por 15 minutos (ou 18-24 horas a –20
o
C). Após a
centrifugação por 5 minutos a 10.000 rpm, a 4
o
C, os sobrenadantes foram
desprezados e um volume de 1 mL de etanol 80%, mantido a –20
o
C, foi
cuidadosamente adicionado, sem homogeneização do sedimento. Os tubos
foram mantidos em temperatura ambiente, por 2 minutos e, então,
novamente centrifugados a 10.000 rpm por 2 minutos a 4
o
C. O sobrenadante
foi desprezado, e após secagem em cabine de segurança biológica por 15
minutos, o sedimento foi re-suspenso em 15 µL de tampão Tris-EDTA (TE).
A separação dos eventuais plasmídeos presentes nas amostras
bacterianas foi realizada por eletroforese em gel de agarose. As preparações
contendo o DNA plasmideal em TE foram acrescidas de 5 µL de mistura
corante de arraste e aplicadas no gel de agarose a 0,8%, preparado em TBE
0,5X. A eletroforese foi realizada a 100 V/cm
3
, 20 mA, por aproximadamente
2 horas. O gel foi submetido à coloração do DNA plasmideal com brometo
de etídio por 15 minutos e, após descoloração por mais 15 minutos em água
destilada, foi visualizado em transiluminador de luz ultravioleta 254 nm
MATERIAL E MÉTODOS
51
(Pharmacia Biotech). O gel foi, então, fotografado com câmera Polaroid
modelo MP-4 Land (Polaroid Co., Cambridge, EUA), contendo filme de alta
sensibilidade (Polaroid 667) e através de filtro laranja (Kodak Eastman
Chemical, New Haven, EUA).
As seguintes cepas padrões, contendo plasmídeos de peso
molecular conhecido, foram adicionadas como controles nas extrações: E.
coli HB101 Tetraciclina
R
e Ampicilina
R
pRP4 (34 MDa); E. coli HB101
Tetraciclina
R
pR27 (110 MDa) e S. Typhimurium C5 (60 MDa). Tetraciclina a
12,5 µg/mL foi adicionada ao caldo TSB para ativar as cepas padrões com
esta marca de resistência. Um padrão de peso molecular Lambda HindIII
(Biolabs) foi, também, incluído nos géis para auxiliar no cálculo aproximado
do peso molecular de outros plasmídeos menores.
3.7
“Pulsed-Field Gel Electrophoresis” - PFGE
A análise do perfil de restrição com XbaI das 53 cepas de S. I
1,4,[5],12:i:- e das 45 de S. Typhimurium pelo método de eletroforese em gel
de agarose em campo elétrico pulsado, PFGE, foi realizada segundo a
metodologia padronizada pelo CDC no programa PulseNet (Gautom, 1997;
CDC, 2004b; Hunter et al., 2005), conforme descrição a seguir.
As amostras a serem testadas foram re-isoladas em placas de
TSA e incubadas a 37
o
C por 18 horas. Uma colônia bem isolada e típica foi
re-inoculada em uma placa de TSA, com auxílio de “swab” estéril, para a
obtenção de crescimento bacteriano confluente (incubação a 37
o
C por 18
horas). Cada amostra bacteriana foi re-suspensa em 2,5 mL de tampão para
suspensão celular, com auxílio de “swab” estéril, até a obtenção de uma
suspensão com transmitância de aproximadamente 14-15% (colorímetro
Vitek da BioMerieux). Um volume de 300 µL de cada suspensão bacteriana
foi transferido para tubos tipo eppendorf estéreis, aos quais foi adicionada
Proteinase K (Promega Co., Madison, WI, EUA) na concentração final de 0,5
MATERIAL E MÉTODOS
52
mg/mL. Separadamente, a uma amostra de cada vez, foram acrescentados
300 µL de agarose Seakem Gold 1%:SDS 1% em tampão TE, mantida a
50
o
C, e, imediatamente após ligeira homogeneização, a mistura foi
dispensada em moldes re-utilizáveis, devidamente montados e identificados,
para obtenção de pequenos blocos de gel de agarose contendo o DNA
cromossômico (“plugs” de agarose), sendo 3 “plugs” por amostra. Após
solidificação em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, o excesso da
agarose na parte superior do molde foi retirado com auxílio de estilete e os
“plugs” foram dispensados em tubos cônicos (50 mL) contendo 5 mL da
solução tampão de lise celular, acrescida de proteinase K (0,1 mg/mL). O
DNA bacteriano contido nos “plugs” foi lisado por 2 horas a 54
o
C, com
agitação de 125 rpm. Duas lavagens seriadas dos “plugs” foram realizadas
com 10 mL de água MilliQ pré-aquecida a 50
o
C, com incubação a 50
o
C e
agitação de 125 rpm por 15 minutos em cada lavagem. Seis lavagens
subseqüentes, com tampão TE pré-aquecido a 50
o
C, foram realizadas nas
mesmas condições descritas acima. Após a última lavagem, os “plugs” foram
imersos em 5 mL de TE em temperatura ambiente e, então, mantidos a 4
o
C
ou submetidos à digestão enzimática, conforme descrito a seguir.
Um corte de aproximadamente 2 mm de um “plug” de cada
amostra foi colocado em tubo tipo eppendorf estéril contendo a solução para
digestão enzimática com 30 U da enzima de restrição XbaI (Promega Co.,
Madison, WI, EUA) e, em seguida, os tubos foram incubados em banho-
maria a 37
o
C por 18 horas. A reação de digestão foi, então, interrompida
pela troca da mistura de digestão por 200 µL de TBE 0,5X. Após a
montagem adequada dos “plugs” digeridos no pente, a agarose Seakem
Gold a 1% foi colocada no suporte para gel horizontal, onde permaneceu por
30 minutos em temperatura ambiente para solidificação. O gel foi, então,
submetido à eletroforese de campo pulsado no equipamento CHEF-DR II
(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA), com TBE 0,5X a 14
o
C, com pulso
inicial de 2,2 e pulso final de 63,8, a 6 V/cm
3
por 20 horas. Após o final da
eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio por 30 minutos e
descorado em água destilada por uma hora, com trocas da água a cada 20
MATERIAL E MÉTODOS
53
minutos. Os fragmentos gerados pela restrição enzimática foram
visualizados em luz UV no equipamento GEL DOC EQ system (Quantity One
version 4.5 - Universal Hood II, Bio-Rad Laboratories, Inc., Milão, Itália)
acoplado ao computador contendo o “hardware” Gel Doc EQ, onde foi
realizada a foto-documentação para posterior análise.
Uma amostra de S. Braenderup H9812, considerada o padrão
universal para o PulseNet (Hunter et al., 2005), foi utilizada como padrão
para os fragmentos de restrição obtidos após a digestão, sendo dois “plugs”
aplicados nas laterais e um no centro de cada gel.
3.8
Análise dos perfis genéticos - Dendrogramas
Os diferentes perfis genéticos, obtidos com a digestão do DNA
cromossômico pela enzima de restrição XbaI e separação por PFGE, foram
determinados considerando-se o número e tamanho aparente dos
fragmentos e denominados de X1 a X
n
para a análise das cepas de S. I
1,4,[5],12:i:- e Xt 1 a Xt
n
, para as cepas de S. Typhimurium.
A obtenção de dendrogramas para a análise da similaridade
genética entre as cepas foi realizada por “unweighted pair group method with
arithmetic averages” (UPGMA), utilizando-se o coeficiente de Dice com
tolerância de 1,5%, seguindo as instruções do manual do Programa Gel
Compar II, versão 2,0 (Applied Maths). Esta análise foi feita com base na
cópia das fotos obtida no equipamento GEL DOC EQ system programado
para 75 DPI e pelo alinhamento dos fragmentos de DNA das amostras com
os fragmentos do padrão de tamanho molecular (S. Braenderup H9812).
RESULTADOS
RESULTADOS
55
4 RESULTADOS
4.1 Análise das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- quanto à presença de fljB
Das 517 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- identificadas pela sorotipagem,
148 (28,6%) amplificaram o fragmento de 394 pb correspondente ao gene
codificador da fase flagelar dois, H:1,2, sendo assim, classificadas como S.
Typhimurium. As 369 cepas que não amplificaram o fragmento foram
consideradas monofásicas, ou seja, desprovidas do gene da segunda fase
flagelar, fljB-negativas. A Figura 2 apresenta o resultado de PCR de algumas
cepas que amplificaram o fragmento específico para H:1,2 e outras que não
amplificaram.
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% do
produto amplificado em PCR utilizando os “primers” para
a fase H:1,2. Linhas 1 e 21, padrão de tamanho
molecular (1,0 Kb); 18 e 34, controle positivo (H:1,2); 19
e 35, controle negativo (branco); 3, 4, 14, 16, 17, 20, 25,
28, 30, 32, 33, cepas S. I 1,4,5,12:i:- fljB H:1,2 positivas;
2, 5-13, 15, 22-24, 26, 27, 29, 31, cepas S. I 1,4,[5],12:i:-
fljB-negativas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
pb
1000
500
394
RESULTADOS
56
4.2 Testes de suscetibilidade aos antimicrobianos
4.2.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
A Tabela 1 apresenta os resultados dos testes de suscetibilidade
antimicrobiana das 369 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- fljB-negativas, sendo que,
27 (7,3%) foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Todas as
cepas foram sensíveis a aztreonam, cefepime, ceftazidima, ceftriaxona,
ciprofloxacina e imipenem. Um total de 208 (56,4%) cepas apresentou
sensibilidade diminuída aos antimicrobianos (resistência intermediária). As
134 (36,3%) cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, apresentando resistência para um
até 13 antimicrobianos, foram distribuídas em 30 perfis diferentes. A
tetraciclina compreendeu um maior número de cepas resistentes (68%),
seguida pela nitrofurantoina (25%), sulfonamidas (22,4%) e estreptomicina
(22%).
Das 44 (12%) cepas (35 de origem humana e 9 de não humana)
apresentando múltipla resistência para dois a 13 antimicrobianos, 5 cepas
eram resistentes para ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamidas
e tetraciclina (denominadas de penta-resistentes) e quatro outras cepas
apresentaram este perfil, com exceção de uma das marcas. A penta-
resistência estava associada com outras marcas de resistência, tais como,
canamicina, gentamicina, ácido nalidíxico. Multirresistência para quatro ou
mais antimicrobianos foi detectada em níveis semelhantes (5%) tanto nas
cepas de origem humana como nas de não humana.
Além da multirresistência, foi observada resistência intermediária
para um a quatro antimicrobianos, principalmente para estreptomicina e
tetraciclina, em 31 (70,4%) das 44 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- (Tabela 1).
RESULTADOS
57
Tabela 1 - Suscetibilidade antimicrobiana das 369 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
fljB-negativas, isoladas de humanos e não humanos, no Estado de São
Paulo, 1991-2000
Suscetibilidade aos antimicrobianos N
o
(%) de cepas
H* (n=289)
NH* (n=80)
Total (n=369)
Sensível 23 (8,0) 4 (5,0) 27 (7,3)
Resistência Intermediária 158 (55,0)
50 (62,5) 208 (56,4)
Resistente 108 (37,0)
26 (32,5) 134 (36,3)
Perfis de Resistência**
(Resistência intermediária)
TET
53 (18,5) 11 (13,6) 64 (17,3)
NI
13 (4,5) 5 (6,0) 18 (4,8)
SSS
- 1 (1,3) 1 (0,3)
S
6 (2,1) - 6 (1,6)
NA
1 (0,3) - 1 (0,3)
CF, NI (TET, NA)
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, NI 2(S) 2(S,NA) (S,NA,SSS,K)
3 (1,1) 2 (2,5) 5 (1,4)
TET, CF (S,C,AMP,NA)
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, K (S) (S,NA) (S,SXT)
3 (1,1) - 3 (0,8)
SSS, NI 3(S,TET)
(S,TET,K,NA)
3 (1,1) 1 (1,3) 4 (1,0)
NI, S (TET,K)
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, NA (S)
2 (0,7) - 2 (0,5)
TET, SSS, NI (S,K) 2(S,NA)
2 (0,7) 1 (1,3) 3 (0,8)
TET, C, CF (S,NA,AMP)
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, SSS, S
1 (0,3) - 1 (0,3)
SSS, SXT, S 2(TET)
1 (0,3) 1 (1,3) 2 (0,5)
AMP, SSS, S (TET)
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, SSS, SXT, S 3(TET) (TET,CF)
3 (1,1) 1 (1,3) 4 (1,0)
TET, SSS, SXT, S
1 (0,3) 1 (1,3) 2 (0,5)
C, S, SSS, SXT (TET)
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, K, S, SSS, SXT
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, S, SSS, TET, K ***
1 (0,3) - 1 (0,3)
TET, C, AMP, CF, NI (S,NA)
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, AMC, CF, S, SSS, SXT (TET)
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, S, SSS, TET, K, SXT ***
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, C, S, SSS, TET, SXT ****
1 (0,3) 1 (1,3) 2 (0,5)
AMP, C, S, SSS, TET, SXT, NI, NA ****
- 1 (1,3) 1 (0,3)
AMP, C, S, SSS, NET, GEN, K, CF, SXT, AMC *** (TET)
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, C, S, SSS, NET, GEN, K, CF, SXT, AMK ***
1 (0,3) - 1 (0,3)
AMP, C, S, SSS, TET, NET, GEN, K, CF, SXT, AMC, AMK, NA ****
2 (0,7) - 2 (0,5)
* H, origem humana; NH, origem não humana
** AMK, amicacina; AMC, amoxicilina/ácido clavulânico; AMP, ampicilina; CF, cefalotina; C,
cloranfenicol; GEN, gentamicina; K, canamicina; NA, ácido nalidíxico; NET, netilmicina; NI,
nitrofurantoína; SSS, sulfonamidas; S, estreptomicina; SXT, sulfametoxazol-trimetoprim; TET,
tetraciclina.
*** Cepas apresentando multirresistência para 4 dos 5 antibióticos incluídos na penta-resistência
**** Cinco cepas apresentando penta-resistência
RESULTADOS
58
4.2.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium
Das 45 cepas de S. Typhimurium, 35 eram multirresistentes a dois
a sete antimicrobianos e 10 sensíveis (Tabela 2). Sete cepas apresentavam
o perfil penta-resistente e outras nove, este perfil com exceção de uma das
marcas.
Tabela 2. Perfis de resistência antimicrobiana das 45 cepas de
S. Typhimurium, isoladas de humanos e não humanos, no Estado de São
Paulo, 1991-2000
Perfis de Resistência* N
o
de cepas
Humanos (n=37) Não Humanos (n=8)
S, SSS
1
2
S, SSS, SXT
2
1
AMP, S, SSS
1
1
AMP, SSS, NA
1
-
TET, C, S
1
-
TET, S, SSS
1
-
TET, SSS, SXT
1
-
TET, NI, S
1
-
AMP, S, SSS, NI
1
-
AMP, K, S, SSS
1
-
TET, S, SSS, SXT 2
-
TET, S, SSS, NI - 1
C, S, SSS, TET ***
1
-
AMP, C, S, SSS ***
1
-
C, S, SSS, TET, SXT ***
2
1
AMP, S, SSS, TET, KN ***
1
-
AMP, S, SSS, TET, KN, SXT ***
2
-
KN, A, S, Su, SXT 1 -
AMP, C, S, SSS, TET **
1
-
AMP, C, S, SSS, TET, SXT **
2
-
AMP, C, S, TET, KN, SXT, NA ***
1
-
AMP, C, S, SSS, TET, KN, SXT **
4
-
Sensível 8 2
* AMP, ampicilina; C, cloranfenicol; K, kanamicina; NA, ácido nalidíxico; NI, nitrofurantoína; SSS, sulfonamidas; S,
estreptomicina; SXT, sulfametoxazol-trimetoprim; TET, tetraciclina.
** cepas penta-resistentes
*** cepas com perfil de penta-resistência, com ausência de uma das marcas
RESULTADOS
59
4.3 Análise das cepas pela fagotipagem
4.3.1 Fagotipagem das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
O resultado da fagotipagem das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12;i:- está
demonstrado na Tabela 3. Todas as cepas foram lisadas por pelo menos um
dos fagos pertencentes ao esquema de fagotipagem padronizado para S.
Typhimurium.
Foram identificados 14 diferentes fagotipos, sendo que sete
corresponderam a DT (“Definitive Type”) com 36 cepas (68%) e sete foram
AT (“Atypical” ou RDNC de “reaction does not conform”) com 15 cepas
(28%). Duas cepas (4%) foram identificadas como não tipáveis (UT de
“untypeable”). O fagotipo DT41 foi o prevalente com 22,6%. Foram
detectadas seis cepas apresentando o perfil do fagotipo DT104b e duas do
DTU302.
4.3.2 Fagotipagem das cepas de S. Typhimurium
Os fagotipos identificados entre as cepas de S. Typhimurium,
selecionadas para este estudo, estão demonstrados na Tabela 4. Foram
detectados 13 DTs, sendo DT193 o prevalente com 18%, 07 atípicos com a
predominância de AT04-2406 (24,5%) e 2 não tipáveis.
RESULTADOS
60
Tabela 3. Fagotipos das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas de humanos
e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000
Fagotipo * S. I 1,4,[5],12:i:-
H** (n=42 )
NH** (n=11) TOTAL (%) (n=53)
DT41 12 - 12 (22,6)
DT193 5 1 6 (11,3)
DT104b 3 3 6 (11,3)
DT120 3 2 5 (9,3)
DT180 3 - 3 (5,7)
DTU302 1 1 2 (3,8)
DT208 2 - 2 (3,8)
AT 00-0677 7 - 7 (13,2)
AT 04-6814 - 3 3 (5,7)
AT 04-6788 - 1 1 (1,9)
AT 04-6811 1 - 1 (1,9)
AT 00-3219 1 - 1 (1,9)
AT 04-6828 1 - 1 (1,9)
AT 04-6839 1 - 1 (1,9)
UT 2 - 2 (3,8)
* DT, “definitive type”; AT, atípicos com reação não conforme (“Atypical” ou RDNC –
“reaction does not conform”); UT, “untypeable” não tipáveis
** H, humana; NH, não humana
RESULTADOS
61
Tabela 4. Fagotipos das 45 cepas de S. Typhimurium isoladas de humanos
e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000
Fagotipo * S. Typhimurium
H** (n=37) NH** (n=8) TOTAL (%) (n=45)
DT193 5 3 8 (18,0)
DT49 6 - 6 (13,5)
DT135 1 1 2 (4,4)
DT110b 1 - 1 (2,2)
DT27 1 - 1 (2,2)
DT99 - 1 1 (2,2)
DT120 1 - 1 (2,2)
DT104 1 - 1 (2,2)
DT104b 1 - 1 (2,2)
DTU302 1 - 1 (2,2)
DT4 - 1 1 (2,2)
DT10 1 - 1 (2,2)
DT153 1 - 1 (2,2)
AT 04-2406 10 1 11 (24,5)
AT 97-6274 1 - 1 (2,2)
AT 97-6276 - 1 1 (2,2)
AT 04-4538 1 - 1 (2,2)
AT 04-6871 1 - 1 (2,2)
AT 04-6884 1 - 1 (2,2)
AT 04-6846 1 - 1 (2,2)
UT 7 1 - 1 (2,2)
UT 8 1 - 1 (2,2)
* DT, “definitive type”; AT, atípicos com reação não conforme (“Atypical” ou RDNC –
“reaction does not conform”); UT, “untypeable” não tipáveis
** H, humana; NH, não humana
RESULTADOS
62
4.4 Análise das cepas quanto ao perfil plasmideal
4.4.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
Os resultados obtidos pela análise plasmideal das 53 cepas de
S. I 1,4,[5],12:i:- estão demonstrados na Tabela 5. Foram determinados 14
perfis plasmideais, sendo o perfil 1, caracterizado por apenas um plasmídeo
de 60 MDa (ou aproximadamente 100 Kb), o prevalente com 62,3%. Foi
verificada a presença desse plasmídeo de 60 MDa, o qual é conhecido como
sendo o plasmídeo de virulência de S. Typhimurium, na maioria das cepas
de S. I 1,4,[5],12:i:- analisadas, ou seja, em 94% (50/53).
Tabela 5. Perfis plasmideais de 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, isoladas de
humanos e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000
Perfil Tamanho em MDa S. I 1,4,[5],12:i:-
H* (n=42 ) NH* (n=11) TOTAL (%) (n = 53)
P1 60 25 8 33 (62,3)
P2 60 / >60 2 1 3 (5,7)
P3 60 / <60 1 - 1 (1,9)
P4 60 / <60 / 2,5 / 1,5 2 - 2 (3,7)
P5 60 / 40 1 - 1 (1,9)
P6 60 / >60 / 110 1 - 1 (1,9)
P7 60 / 4,5 / 2,8 / 1,5 - 2 2 (3,7)
P8 60 / 2,8 / 1,5 2 - 2 (3,7)
P9 60 / 3 / 2 1 - 1 (1,9)
P10 60 / 4 / 2,5 / 2 / 1,5 / 1,3
1 - 1 (1,9)
P11 60 / 4 1 - 1 (1,9)
P12 60 / 5 1 - 1 (1,9)
P13 60 / 6,5 / 4 1 - 1 (1,9)
P14 110 3 - 3 (5,7)
* H, origem humana; NH, origem não humana
RESULTADOS
63
4.4.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium
A análise do perfil plasmideal
d
as 45 cepas de S. Typhimurium,
demonstrada na Tabela 6, apresentou 10 perfis diferentes com a prevalência
do perfil 1 (64,5%), caracterizado pela presença de um único plasmídeo de
60 MDa. A maioria das cepas (84,4%) continha este plasmídeo, só ou
associado com outros maiores ou menores. Foi verificada a ausência de
plasmídeos em 4 (8,8%) das cepas analisadas.
Tabela 6. Perfis plasmideais de 45 cepas de S. Typhimurium, isoladas de
humanos e não humanos, no Estado de São Paulo, 1991-2000
Perfil
Tamanho em MDa S. Typhimurium
H* (n=37 ) NH* (n=8) TOTAL (%) (n = 45)
P1 60 24 5 29 (64,5)
P2 60 / >60 2 1 3 (6,7)
P3 60 / <60 2 - 2 (4,5)
P4 >60 - 2 2 (4,5)
P5 60 / 40 1 - 1 (2,2)
P6 60 / 30 / 28 / 1,5 1 - 1 (2,2)
P7 60 / 4 / 2,8 1 - 1 (2,2)
P8 60 / 4,5 1 - 1 (2,2)
P9 >60 / 4,5 1 - 1 (2,2)
P10 nenhum 4 - 4 (8,8)
* H, origem humana; NH, origem não humana
RESULTADOS
64
As Figuras 3 e 4 apresentam, respectivamente, o perfil
plasmideal em gel de agarose de algumas cepas de S. 1,4,[5],12:i:- e de S.
Typhimurium.
Figura 3. Perfil plasmideal de algumas cepas de S. I
1,4,[5],12:i:-. Linha 1, E. coli HB101 (34 MDa); Linha 2,
S. Typhimurium C5 (60 MDa); Linha 3, E. coli HB101
(110 MDa); Linhas 4 a 8, cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-.
Figura 4. Perfil plasmideal de algumas cepas de S.
Typhimurium. Linha 1, E. coli HB101 (34 MDa); Linha 2,
E. coli HB101 (110 MDa); Linha 3, S. Typhimurium C5 (60
MDa); Linhas 4-8, cepas de S. Typhimurium.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
Mda
110
60
34
MDa
110
60
34
RESULTADOS
65
4.5 Análise das cepas por “PFGE”
A macro-restrição do DNA cromossômico, obtida com a enzima
XbaI e analisada por PFGE, das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S.
Typhimurium gerou de 10 a 18 fragmentos (bandas) com tamanhos entre
33,3 e 1135 Kb. Os diferentes perfis genéticos foram determinados pela
diferença em apenas uma banda ou mesmo número de bandas, porém, com
tamanhos diferentes.
4.5.1 Perfil de macro-restrição das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
A distribuição dos perfis por PFGE das 53 cepas de S. I
1,4,[5],12:i:-, de origem humana e não humana, está apresentada na Tabela
7. Foram determinados 33 perfis, X1 a X33, sendo que X1 e X2
compreenderam 6 cepas cada (11,3%) e o perfil X3, 5 cepas (9,4%),
considerados os três mais prevalentes.
4.5.2 Perfil de macro-restrição das cepas de S. Typhimurium
As 45 cepas de S. Typhimurium foram subdivididas em 32 perfis
por PFGE, Xt 1 a Xt 32, com prevalência do Xt 1 detectado em 8 cepas
(18%). A distribuição dos perfis entre as cepas de origem humana e não
humana está apresentada na Tabela 8.
RESULTADOS
66
Tabela 7. Perfis de restrição obtidos com a enzima XbaI, por PFGE, das 53
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas de humanos e não humanos, no Estado
de São Paulo, 1991-2000
Perfil
S. I 1,4,[5],12:i:- Perfil S. I 1,4,[5],12:i:-
H *
(n=42 )
NH **
(n=11)
TOTAL(%)
(n = 53)
H *
(n=42 )
NH **
(n=11)
TOTAL(%)
(n = 53)
X1 6 - 6 (11,3)
X18 1 - 1 (1,9)
X2 4 2 6 (11,3) X19 1 - 1 (1,9)
X3 5 - 5 (9,4) X20 1 - 1 (1,9)
X4 2 1 3 (5,7) X21 1 - 1 (1,9)
X5 - 2 2 (3,7) X22 - 1 1 (1,9)
X6 2 - 2 (3,7) X23 1 - 1 (1,9)
X7 1 1 2 (3,7) X24 1 - 1 (1,9)
X8 2 - 2 (3,7)
X25 1 - 1 (1,9)
X9 - 1 1 (1,9) X26 1 - 1 (1,9)
X10 - 1 1 (1,9) X27 - 1 1 (1,9)
X11 1 - 1 (1,9) X28 1 - 1 (1,9)
X12 1 - 1 (1,9) X29 - 1 1 (1,9)
X13 1 - 1 (1,9) X30 1 - 1 (1,9)
X14 1 - 1 (1,9) X31 1 - 1 (1,9)
X15 1 - 1 (1,9) X32 1 - 1 (1,9)
X16 1 - 1 (1,9) X33 1 - 1 (1,9)
X17 1 - 1 (1,9)
* H, origem humana,
** NH, origem não humana
RESULTADOS
67
Tabela 8. Perfis de restrição obtidos com a enzima XbaI, por PFGE, das 45
cepas de S. Typhimurium, isoladas de humanos e não humanos, no Estado
de São Paulo, 1991-2000
Perfil S. Typhimurium Perfil S. Typhimurium
H *
(n=37)
NH **
(n=8)
Total(%)
(n=45)
H *
(n=37)
NH **
(n=8)
Total(%)
(n=45)
Xt 1 6 2 8 (18,0) Xt 17 1 - 1 (2,2)
Xt 2 2 1 3 (6,8) Xt 18 1 - 1 (2,2)
Xt 3 2 - 2 (4,5) Xt 19 1 - 1 (2,2)
Xt 4 2 - 2 (4,5) Xt 20 1 - 1 (2,2)
Xt 5 1 1 2 (4,5) Xt 21 1 - 1 (2,2)
Xt 6 2 - 2 (4,5) Xt 22 1 - 1 (2,2)
Xt 7 1 - 1 (2,2) Xt 23 1 - 1 (2,2)
Xt 8 - 1 1 (2,2) Xt 24 - 1 1 (2,2)
Xt 9 1 - 1 (2,2) Xt 25 1 - 1 (2,2)
Xt 10 1 - 1 (2,2) Xt 26 1 - 1 (2,2)
Xt 11 - 1 1 (2,2) Xt 27 1 - 1 (2,2)
Xt 12 1 - 1 (2,2) Xt 28 1 - 1 (2,2)
Xt 13 1 - 1 (2,2) Xt 29 1 - 1 (2,2)
Xt 14 1 - 1 (2,2) Xt 30 1 - 1 (2,2)
Xt 15 1 - 1 (2,2) Xt 31 1 - 1 (2,2)
Xt 16 1 - 1 (2,2) Xt 32 - 1 1 (2,2)
* H, origem humana;
** NH, origem não humana
RESULTADOS
68
As Figuras 5 e 6, respectivamente, apresentam o padrão de
restrição obtido com a digestão com XbaI das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de
S. Typhimurium, submetidas ao PFGE.
Figura 5. PFGE representativo de perfis genéticos das cepas de S. I
1,4,[5],12:i:-, após digestão com XbaI. Linhas 1, 8 e 15, S. Braenderup
H9812; linhas 2-7, X2, X19, X18, X33, X1 e X31; linhas 9-14, X23, X3, X8,
X28, X17 e X16.
Figura 6. PFGE representativo de perfis genéticos das cepas de S.
Typhimurium, após digestão com XbaI. Linhas 1, 8 e 15, S. Braenderup
H9812; linhas 2-7, Xt 16, Xt 20, Xt 1, Xt 18, Xt 1 e Xt 3; linhas 9-10, Xt 5;
linhas 11-14, Xt 2, Xt 14, Xt 6 e Xt 27.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1135
668,9
452,7
398,4
336,5
310,1
244,4
216,9
138,9
104,5
78,2
54,7
33,3
1135
668,9
452,7
398,4
336,5
310,1
244,4
216,9
138,9
104,5
78,2
54,7
33,3
Kb
Kb
RESULTADOS
69
4.6 Perfis genéticos - Dendrogramas
4.6.1 Análise do perfil de “PFGE” das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
A porcentagem de similaridade entre as 53 cepas de
S. 1,4,[5],12:i:-, obtida pela análise do dendrograma com uma tolerância
Dice de 1,5%, variou em até aproximadamente 58%, sendo que a grande
maioria (94%) apresentou uma similaridade maior que 74% (Figura 7).
Alguns fagotipos foram diferenciados em distintos perfis genéticos com base
em apenas um ou dois fragmentos de diferença. Foram observados 3
subgrupos, com 6 a 8 cepas em cada um, apresentando similaridade acima
de 81%.
4.6.2 Análise do perfil de “PFGE” das cepas de S. Typhimurium
As 45 cepas de S. Typhimurium apresentaram uma similaridade
acima de 64%, porém, a maioria delas (75%) apresentou uma similaridade
acima de 73% (Figura 8). Foram observados 4 subgrupos, contendo quatro
ou cinco cepas cada um, apresentando acima de 81% de similaridade.
4.6.3 Análise comparativa dos dois sorotipos
A similaridade obtida pelo dendrograma combinando os perfis
genéticos obtidos com os dois sorotipos, S. 1,4,[5],12:i:- e S. Typhimurium,
foi maior que 60%, sendo que a grande maioria das cepas (90%) apresentou
uma similaridade acima de 70% (Figura 9). Foram obtidos 65 perfis com a
somatória dos 33 e 32 dos dois sorotipos, respectivamente.
RESULTADOS
70
Figura 7. Dendrograma obtido pela análise por PFGE dos fragmentos
obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-. Foi utilizado o
coeficiente de Dice com tolerância de 1,5% e UPGMA em GelCompar II.
Estão indicados o número da cepa analisada, o perfil obtido pelo PFGE e o
fagotipo (PT). Entre parênteses está indicado o número de cepas, quando
detectada mais de uma, em cada subtipo.
Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE
100
90
80
70
60
PFGE
48/91
1093/93
809/93
385/91
586/98
139/94
166/92
803/93
548/91
1052/94
70/94
629/92
295/91
596/92
466/91
786/93
430/92
763/99
406/91
407/91
611/91
669/91
512/92
54/94
200/91
994/00
572/99
647/93
1148/98
427/94
791/93
548/96
1014/93
X9
X10
X5 (2)
X11
X12
X13
X14
X15
X3 (5)
X16
X17
X18
X1 (6)
X19
X20
X21
X6 (2)
X22
X23
X24
X25
X26
X27
X28
X2 (6)
X29
X30
X31
X32
X4 (3)
X7 (2)
X33
X8 (2)
04-6788
04-6814
04-6814 (2)
193
04-6839
00-3219
41
41
00-0677 (5)
00-0677
00-0677
41
41 (6)
U302
41
04-6811
193 (2)
104b
193
193
41
41
193
180
120 (4) 180 (2)
U302
120
208
208
104b (3)
104b (2)
04-6828
UT (2)
1135 Kb 33,3 Kb
N
o
PFGE PT
RESULTADOS
71
* 04-2406 (4); 49 (3); 135 (fagotipos detectados neste perfil genético)
Figura 8. Dendrograma obtido pela análise por PFGE dos fragmentos
obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. Typhimurium. Foi utilizado o
coeficiente de Dice com tolerância de 1,5% e UPGMA em GelCompar II.
Estão indicados o número da cepa analisada, o perfil obtido pelo PFGE e o
fagotipo (PT). Entre parênteses está indicado o número de cepas, quando
detectada mais de uma, em cada subtipo.
Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE
100
90
80
70
PFGE
1189/95
69/91
169/98
1237/95
561/98
1249/99
277/96
1188/95
503/91
1037/98
43/91
890/00
660/92
722/94
217/94
186/92
491/98
132/92
177/92
80/92
497/98
225/95
127/96
159/95
447/92
1187/95
982/93
628/92
327/99
85/99
1076/99
1240/00
Xt 7
Xt 8
Xt 5 (2)
Xt 9
Xt 3 (2)
Xt 10
Xt 11
Xt 12
Xt 13
Xt 14
Xt 15
Xt 16
Xt 17
Xt 18
Xt 19
Xt 1 (8)
Xt 20
Xt 21
Xt 2 (3)
Xt 22
Xt 23
Xt 24
Xt 25
Xt 26
Xt 27
Xt 28
Xt 29
Xt 30
Xt 31
Xt 4 (2)
Xt 32
Xt 6 (2)
04-2406
97-6276
193 (2)
97-6274
104 104b
10
99
04-2406
110b
04-2406
04-6846
04-2406
135
04-2406
04-2406
04-2406 *
49
04-4538
193 (3)
193
153
4
49
04-2406
UT8
49
193
U302
120
04-6871 04-6884
193
UT7 27
1135 Kb
33,3 Kb
N
o
PFGE PT
RESULTADOS
72
Figura 9. Dendrograma comparativo obtido pela análise por PFGE dos fragmentos
obtidos pela digestão com XbaI das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium.
Foi utilizado o coeficiente de Dice com tolerância de 1,5% e UPGMA em
GelCompar II. Estão indicados o número da cepa analisada, o perfil obtido pelo
PFGE e o fagotipo (PT). Entre parênteses está indicado o número de cepas,
quando detectada mais de uma, em cada subtipo.
Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE
100
90
80
70
PFGE
430/92
69/91
1189/95
169/98
132/92
177/92
80/92
497/98
890/00
503/91
1188/95
1037/98
660/92
722/94
217/94
186/92
491/98
611/91
669/91
225/95
127/96
407/91
406/91
48/91
1093/93
548/91
809/93
385/91
586/98
139/94
803/93
166/92
70/94
1052/94
629/92
295/91
596/92
1237/95
1249/99
561/98
277/96
786/93
43/91
466/91
200/91
54/94
512/92
994/00
647/93
572/99
1148/98
791/93
427/94
327/99
1076/99
763/99
85/99
548/96
982/93
1187/95
628/92
447/92
159/95
1014/93
1240/00
X6 (2)
Xt 8
Xt 7
Xt 5 (2)
Xt 21
Xt 2 (3)
Xt 22
Xt 23
Xt 16
Xt 13
Xt 12
Xt 14
Xt 17
Xt 18
Xt 19
Xt 1 (8)
Xt 20
X25
X26
Xt 24
Xt 25
X24
X23
X9
X10
X3 (5)
X5 (2)
X11
X12
X13
X15
X14
X17
X16
X18
X1 (6)
X19
Xt 9
Xt 10
Xt 3 (2)
Xt 11
X21
Xt 15
X20
X2 (6)
X28
X27
X29
X31
X30
X32
X7 (2)
X4 (3)
Xt 31
Xt 32
X22
Xt 4 (2)
X33
Xt 29
Xt 28
Xt 30
Xt 27
Xt 26
X8 (2)
Xt 6 (2)
193 (2)
97-6276
04-2406
193 (2)
04-4538
193 (3)
193
153
04-2406
110b
04-2406
04-2406
135
04-2406
04-2406
04-2406 *
49
41
41
4
49
193
193
04-6788
04-6814
00-0677 (5)
04-6814 (2)
193
04-6839
00-3219
41
41
00-0677
00-0677
41
41 (6)
U302
97-6274
10
104 104b
99
04-6811
04-6846
41
120 (4) 180 (2)
180
193
U302
208
120
208
104b (2)
104b (3)
120
193
104b
04-6871 04-6884
04-6828
193
49
U302
UT8
04-2406
UT (2)
UT7 27
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33,3 Kb
N
o
PFGE PT
* 04-2406 (4); 49(3); 135 (1) [fagotipos em Xt 1]
RESULTADOS
73
4.7 Comparação fenotípica e genotípica entre os dois sorotipos
Antigenicamente, os dois sorotipos diferem apenas na segunda
fase flagelar, sendo S. I 1,4,[5],12:i:- e S. Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2).
Quanto à suscetibilidade aos antimicrobianos, foi verificado que
as cepas monofásicas apresentaram multirresistência para vários
antimicrobianos, característica esta também observada nas cepas de S.
Typhimurium, incluindo a penta-resistência (ampicilina, cloranfenicol,
sulfonamidas, estreptomicina e tetraciclina).
O esquema de fagotipagem específico para cepas de S.
Typhimurium foi utilizado com as cepas monofásicas, as quais foram lisadas
por pelo menos um dos fagos. Foram detectados 04 fagotipos, DT193,
DT104b, DT120 e DTU302, em comum às cepas dos dois sorotipos,
isoladas no Estado de São Paulo, 1991-2000.
O perfil plasmideal demonstrou similaridade entre os dois
sorotipos, uma vez que, 94% de S. I 1,4,[5],12:i:- e 84% de S. Typhimurium
albergaram o plasmídeo de 60 MDa, plasmídeo sorotipo-específico de S.
Typhimurium.
O PFGE identificou diferentes perfis genéticos, porém, um padrão
característico de sorotipo foi apresentado pela grande maioria das cepas dos
dois sorotipos, com uma similaridade acima de 70% e poucos fragmentos de
diferença.
RESULTADOS
74
4.8 Perfil geral obtido pelos métodos fenotípicos e genotípicos
4.8.1 Perfil das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
Na Tabela 9 estão apresentados todos os resultados obtidos pela
caracterização das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, de origem humana e não
humana, pelos métodos fenotípicos e genotípicos utilizados neste estudo.
Todas as cepas apresentaram perfis diferentes com a combinação de todos
os resultados obtidos. Algumas cepas foram diferenciadas apenas pela
análise com o PFGE, e outras, pela suscetibilidade aos antimicrobianos.
4.8.2 Perfil das cepas de S. Typhimurium
Na Tabela 10 estão apresentados todos os resultados obtidos
pela caracterização das 45 cepas de S. Typhimurium, de origem humana e
não humana, com os métodos fenotípicos e genotípicos utilizados neste
estudo. Apenas duas cepas sensíveis aos antimicrobianos foram idênticas
por todos os métodos utilizados. As demais foram diferenciadas por pelo
menos uma das subtipagens.
RESULTADOS
75
TABELA 9. Perfis das 53 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- de origem humana e
não humana, de acordo com a suscetibilidade aos antimicrobianos, a
fagotipagem, o perfil plasmideal e o PFGE
Cepa
1
Origem
2
Resistência
3
Fagotipos
4
Plasmídeo
5
PFGE
Humana
617/93 LCR
SSS, NI
DT 41 60 X1
215/91 Fezes
TET, NI
DT 41 60 X1
166/92 Fezes
TET, NI
DT 41 60 X14
295/91 Sangue
TET, SSS, NI
DT 41 60; 2,8; 1,5 X1
803/93 Fezes
TET, SSS, NI
DT 41 60; 2,8; 1,5 X15
406/91* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, NET, GEN, K, AMC,
CF, SXT, AMK, NA
DT 193 60; <60;
2,5; 1,5
X23
407/91* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, NET, GEN, K, AMC,
CF, SXT, AMK, NA
DT 193 60; <60;
2,5; 1,5
X24
542/91 Fezes
AMP, C, TET, CF, NI
AT 00-0677 60 X3
548/91 Fezes
CF, NI
AT 00-0677 60 X3
549/91 L. P.
TET, CF, C
AT 00-0677 60 X3
427/94 Fezes
Sensível
DT 104b 60 X4
744/93 Fezes
S, NI
DT 104b 60 X4
791/93 Sangue
SSS, NI
DT 104b 60 X7
1275/99 Sangue
Sensível
DT 41 60; 3; 2 X1
610/91 Sangue
AMP, S, SSS
DT 41 60, 6,5; 4 X1
985/93 Sangue
S, SSS, TET
DT 41 60; 5 X1
466/91 Fezes
TET, S, SSS, SXT
DT 41 60; 40 X20
611/91 Sangue
AMP, S, SSS, SXT
DT 41 110 X25
669/91 LCR
TET, K
DT 41 110 X26
629/92 Urina
TET, NA
DT 41 110 X18
107/91 Sangue
Sensível
DT 193 60 X6
430/92 Fezes
TET, NI
DT 193 60 X6
385/91 Sangue
TET, CF
DT 193 60 X11
596/92** Fezes
AMP, C, S, SSS, NET, K, GEN, CF, SXT,AMK
DT U302 60; <60 X19
647/93 Fezes
C, S, SSS, SXT
DT 208 >60; 60 X31
1148/98* Sangue
AMP, C, S, SSS, TET, SXT
DT 208 60 X32
424/91 Secreção
AMP, AMC, CF, S, SSS, SXT
DT 120 60 X2
13/96 Fezes
Sensível
DT 120 60 X2
572/99 Fezes
Sensível
DT 120 60 X30
623/94** Sangue
AMP, S, SSS, TET, KN, SXT
DT 180 60 X2
638/94 Urina
TET, K, S, SSS, SXT
DT 180 60 X2
54/94 Fezes
AMP, S, SSS, SXT
DT 180 60 X28
Continua
na página 76
RESULTADOS
76
Cont.
da página 75
Cepa
1
Origem
2
Resistência
3
Fagotipos
4
Plasmídeo
5
PFGE
51/94 Urina
TET, NA
AT 00-0677 60 X3
647/96 Fezes
Sensível
AT 00-0677 60; 4 X3
1052/94**
Fezes
AMP, S, SSS, TET, K
AT 00-0677 >60; 60 X16
70/94 Fezes
S, SSS, SXT
AT 00-0677 60 X17
139/94 Fezes
AMP, S, SSS, SXT
AT 00-3219
>60; 60;
110
X13
786/93 Fezes
SSS, NI
AT 04-6811 60 X21
548/96** Fezes
AMP, C, S, SSS, NET, GEN, K, CF, SXT,AMC
AT 04-6828 60; 4; 2,5;
2; 1,5
X33
586/98 Fezes
Sensível
AT 04-6839 60 X12
981/93 Urina
TET, K
UT 60 X8
1014/93 Urina
TET, NA
UT 60 X8
Não
Humana
199/91 Carne
S, SSS, SXT
DT 120 60; 4,5;
2,8;1,5
X2
200/91 Carne
TET, S, SSS, SXT
DT 120 60; 4,5;
2,8;1,5
X2
810/93 Cobaia
TET, SSS, NI
DT 104b 60 X7
813/93 Cobaia
SSS, NI
DT 104b 60 X4
763/99* Carne
AMP, C, S, SSS, TET, SXT, NI, NA
DT 104b 60 X22
1093/93 CA
TET, NI
AT 04-6814 60 X10
809/93 CA
TET, NI
AT 04-6814 60 X5
1087/93 CA
Sensível
AT 04-6814 60 X5
48/91 Doce
AMP, S, SSS, SXT
AT 04-6788 >60; 60 X9
994/00* Ambiente
AMP, C, S, SSS, TET, SXT
DT U302 60 X29
512/92 CA
Sensível
DT 193 60 X27
1
As cepas 406/91, 407/91, 430/92, 139/94, 199/91, 200/91 e 512/92 não expressaram o antígeno
somático O:5.
2
L. P., líquido pleural, LCR, líquido cefalorraquidiano, CA, camundongo
3
AMK, amicacina; AMC, amoxicilina/ácido clavulânico; AMP, ampicilina; CF, cefalotina; C,
cloranfenicol; GEN, gentamicina; K, kanamicina; NA, ácido nalidíxico; NET, netilmicina; NI,
nitrofurantoína; SSS, sulfonamidas; S, estreptomicina; SXT, sulfametoxazol-trimetoprim; TET,
tetraciclina.
4
DT, “Definitive type”; AT, “atypical”; UT, “untypeable”
5
peso molecular em MDa
* cepas apresentando penta-resistência
** cepas semelhantes às penta-resistentes, com exceção de uma marca
RESULTADOS
77
Tabela 10. Perfis das 45 cepas de S. Typhimurium de origem humana e não
humana, de acordo com a suscetibilidade aos antimicrobianos, a
fagotipagem, o perfil plasmideal e o PFGE
Cepa Origem
1
Resistência
2
Fagotipos
3
Plasmídeo
4
PFGE
Humana
982/93** Urina
AMP, C, S, SSS
DT 193 60 Xt 29
169/98** Fezes
C, S, SSS, TET, SXT
DT 193 60 Xt 5
151/94 Sangue
S, SSS, SXT
DT 193 60 Xt 2
177/92 Sangue
S, SSS, TET, SXT
DT 193 60 Xt 2
80/92 Fezes
S, SSS, SXT
DT 193 60; >60 Xt 22
186/92 Fezes Sensível AT 04-2406 60 Xt 1
778/93 LCR Sensível AT 04-2406 60 Xt 1
457/94 LCR Sensível AT 04-2406 60; 4,5 Xt 1
217/94* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, KN, SXT
AT 04-2406 60 Xt 19
890/00 Fezes
S, SSS
AT 04-2406 60 Xt 16
1037/98 Fezes
SSS, TET, SXT
AT 04-2406 60 Xt 14
1188/95** Sangue
AMP, S, SSS, TET, K, SXT
AT 04-2406 60 Xt 12
722/94* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, K, SXT
AT 04-2406 Nenhum Xt 18
159/95 Urina
AMP, S, SSS, K
AT 04-2406 Nenhum Xt 26
324/96 Fezes
AMP, S, SSS, K, SXT
DT 49 60 Xt 1
326/96** Fezes
AMP, S, SSS, TET, K, SXT
DT 49 60 Xt 1
491/98 Fezes
S, SSS, TET, SXT
DT 49 60 Xt 20
561/96 Fezes
AMP, S, SSS
DT 49 >60; 4,5 Xt 1
1187/95* Sangue
AMP, C, S, SSS, TET, K, SXT
DT 49 60 Xt 28
127/96** Sangue
AMP, S, SSS, TET, KN
DT 49 60 Xt 25
553/98* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, SXT
DT 104b 60 Xt 3
561/98 Fezes
AMP, S, SSS, NI
DT 104 60 Xt 3
628/92** Fezes
AMP, C, SSS, TET, K, SXT, NA
DT U302 60; <60 Xt 30
1249/99 Fezes Sensível DT 10 60 Xt 10
1244/00** Fezes
C, S, SSS, TET, SXT
DT 27 60; 40 Xt 6
503/91 Fezes Sensível DT 110b 60 Xt 13
327/99 Fezes
S, TET, NI
DT 120 Nenhum Xt 31
660/92* Sangue
AMP, C, S, SSS, TET
DT 135 60 Xt 17
497/98 Fezes Sensível DT 153 60; 4; 2,8 Xt 23
43/91* Fezes
AMP, C, S, SSS, TET, K, SXT
AT 04-6846 60; <60 Xt 15
132/92 Sangue
S, SSS, TET
AT 04-4538 60; >60 Xt 21
1189/95* Sangue
AMP, C, S, SSS, TET, SXT
AT 04-2606 60 Xt 7
337/99 Fezes
C, S, TET
AT 04-6884 Nenhum Xt 4
85/99** Fezes
C, S, SSS, TET
AT 04-6871 60 Xt 4
1237/95 LCR Sensível AT 97-6274 60 Xt 9
1240/00 Sangue Sensível UT 7 60 Xt 6
447/92 Fezes
AMP, SSS, NA
UT 8 60; 30; 28; 1,5 Xt 27
Continua
na página 78
RESULTADOS
78
Continuação
da página 77
Cepa Origem
1
Resistência
2
Fagotipos
3
Plasmídeo
4
PFGE
Não
humana
69/91 Queijo
AMP, S, SSS
AT 97-6276 60 Xt 8
91/93 Chiller
S, SSS
DT 135 >60 Xt 1
225/95 Linguiça
S, SSS, SXT
DT 4 60; >60 Xt 24
987/97 Ave
S, SSS
PT 193 60 Xt 2
352/99 Alimento
S, SSS, TET, NI
PT 193 >60 Xt 5
1076/99** Alimento
C, S, SSS, TET, SXT
DT 193 60 Xt 32
277/96 Ambiente Sensível PT 99 60 Xt 11
815/97 Cobaia Sensível AT 04-2406 60 Xt 1
1
LCR, líquido cefalorraquidiano
2
AMP, ampicilina; C, cloranfenicol; K, kanamicina; NA, ácido nalidíxico; NI, nitrofurantoína; SSS, sulfonamidas; S,
estreptomicina; SXT, sulfametoxazol-trimetoprim; TET, tetraciclina.
3
DT, “definitive type”; AT, “atypical”; UT, “untypeable”
4
peso molecular em MDa
* cepas penta-resistentes
** cepas penta-resistentes ACSSuT, com ausência de uma das marcas
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
80
5 DISCUSSÃO
A distribuição ubiqüitária de Salmonella na natureza e sua
prevalência na cadeia alimentar global, a adaptabilidade e a virulência deste
importante patógeno bacteriano em humanos, o contínuo aumento de casos
de salmonelose humana com a prevalência de cepas resistentes aos
antibióticos e o impacto econômico adverso na saúde pública e na indústria
alimentar, claramente identificam a necessidade para uma contínua
vigilância e implementação de medidas de controle efetivas em níveis de
cadeia alimentar internacional.
A vigilância laboratorial das infecções humanas e animais é a
primeira etapa necessária para qualquer estratégia de prevenção das
salmoneloses. Os principais objetivos dessa vigilância são: a) documentar a
ocorrência e tendência de sorotipos através do tempo e espaço; b) detectar
surtos locais, regionais e nacionais; c) sugerir ações preventivas; d) avaliar o
impacto das ações preventivas, e, e) estar atenta a qualquer resistência
antimicrobiana.
No Estado de São Paulo, a vigilância laboratorial das
salmoneloses tem sido realizada, desde a década de 50, pelo setor de
Enterobactérias da Seção de Bacteriologia, Instituto Adolfo Lutz/SP –
IAL/Central (Pessoa et al., 1978a; Calzada et al., 1984; Taunay et al., 1996;
Tavechio et al., 1996; Tavechio et al., 2002; Fernandes et al., 2006),
possibilitando a verificação da tendência e prevalência dos diferentes
sorotipos no decorrer dos anos. Na década de 90, com a sorotipagem das
cepas de Salmonella, isoladas principalmente nos diferentes laboratórios
regionais do IAL e em hospitais, observou-se o aumento na freqüência de
isolamento do sorotipo monofásico e atípico S. I 1,4,[5],12:i:-. Este estudo foi
realizado com o objetivo de caracterizar as cepas deste sorotipo e comparar
o perfil das mesmas com o perfil das cepas de S. Typhimurium, todas
isoladas de humanos e não humanos no período de 1991-2000.
DISCUSSÃO
81
A caracterização, iniciada pela análise das cepas monofásicas S. I
1,4,[5],12:i:- quanto à presença do gene codificador da fase H:2 (1,2) por
PCR, demonstrou que as 148 (28,6%) cepas albergando o gene H:1,2 (fljB
+
)
pertenciam ao sorotipo Typhimurium. Echeita e Usera (1998) também
relataram a identificação da fase flagelar 2 de algumas cepas monofásicas,
quando da padronização do Multiplex-PCR para o complexo antigênico H:1.
Esses resultados indicaram que, a não detecção da fase flagelar 2 durante a
sorotipagem, provavelmente, deveu-se ao fato de que as células bacterianas
estariam expressando esse antígeno em baixos níveis. Tem sido reportado
por alguns autores que, a freqüência de inversão de fase na direção FljB
(fase 2) para FliC (fase 1) é maior do que FliC para FljB, o que poderia
produzir uma população composta, principalmente, por células bacterianas
expressando FliC, após várias gerações de crescimento (Ikeda et al., 2001).
Entre as 369 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- fljB-negativas, ou seja,
que não albergaram o gene da fase flagelar 2, 26 (7%) não expressaram o
antígeno somático O:5, um antígeno secundário bastante comum em cepas
de S. Typhimurium. No entanto, na maioria dos estudos relatados sobre a
caracterização dessas cepas monofásicas, são descritas apenas cepas
S. I 4,5,12:i:-, ou seja, expressando o antígeno O:5 (Echeita et al., 1999;
Guerra et al., 2000; Guerra et al., 2001; Agasan et al., 2002).
A análise quanto à suscetibilidade aos antimicrobianos das 369
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- fljB-negativas demonstrou que 44 (12%) delas
apresentaram multirresistência (MR) para dois ou mais antimicrobianos,
percentagem essa, menor quando comparada com dados reportados na
Espanha (Guerra et al., 2000) e nos Estados Unidos (Agasan et al., 2002).
Essa diferença pode estar relacionada ao fato de que alguns autores
incluem as cepas com resistência intermediária como já resistentes. Se
fizermos tal inclusão, a percentagem de cepas MR será mais de 60%, devido
em sua grande maioria à resistência intermediária para tetraciclina e
estreptomicina.
DISCUSSÃO
82
Além disso, a multirresistência para ampicilina, cloranfenicol,
estreptomicina, sulfonamidas e tetraciclina (penta-resistência comumente
descrita como R-tipo ACSSuT), detectada na maioria das cepas
monofásicas S. I 4,5,12:i:- (Echeita et al., 1999; Agasan et al., 2002), foi
observada em apenas cinco das cepas analisadas neste estudo. Quatro
outras cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- apresentaram um perfil semelhante, com
exceção de uma das marcas (Tabela 1). No entanto, ao considerarmos o
padrão intermediário como resistente, teremos seis cepas penta-resistentes
e mais doze apresentando 4 dessas marcas. Apesar da percentagem baixa,
este é um dado preocupante, indicando a circulação deste clone
multirresistente em nosso meio.
A grande maioria das cepas isoladas de sangue era proveniente
de hospitais, e aproximadamente 90% delas apresentaram resistência
(incluindo uma penta-resistente) ou sensibilidade diminuída aos
antimicrobianos testados (dados não demonstrados). Este dado sugere uma
atenção especial para com tais cepas, uma vez que, Varma et al. (2005)
relataram uma maior freqüência de cepas multirresistentes em pacientes
hospitalizados com septicemias. Por outro lado, não foi observado um
aumento progressivo na resistência antimicrobiana entre as cepas de
S. I 1,4,[5],12:i:- no decorrer do período 1991-2000, em nossa região (dados
não demonstrados).
Antimicrobianos, tais como, fluorquinolonas e cefalosporinas de
terceira geração (por ex. ciprofloxacina e ceftriaxona) são, comumente,
utilizados no tratamento de infecções graves por Salmonella em humanos.
Cepas de Salmonella apresentando multirresistência ou sensibilidade
diminuída a estes e vários outros antimicrobianos têm aumentado nas
últimas décadas (Threlfall, 2000; Threlfall, 2002; Wright et al., 2005; Weill et
al., 2006). No entanto, todas as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- analisadas neste
estudo, bem como, as de S. Typhimurium (Ghilardi et al., 2006),
apresentaram sensibilidade a esses antimicrobianos.
DISCUSSÃO
83
Embora nenhuma cepa de S. I 1,4,[5],12:i:- tenha apresentado
resistência à ciprofloxacina, seis cepas foram resistentes e onze
apresentaram suscetibilidade diminuída (resistência intermediária) ao ácido
nalidíxico. Este resultado deve ser levado em consideração, uma vez que a
resistência ao ácido nalidíxico tem sido utilizada como uma triagem para a
resistência à ciprofloxacina (Hakanen et al., 1999). Além disso, Helms et al.
(2004) reportaram que a resistência às quinolonas de primeira geração
estava associada ao aumento de risco de doença invasiva e morte durante
infecção com S. Typhimurium.
A enzima beta-lactamase de espectro ampliado (ESBL –
“extended-spectrum beta-lactamase”) tem sido detectada em muitos
patógenos, conferindo aos mesmos uma resistência aos beta-lactâmicos.
Em S. Typhimurium, a presença desta enzima já foi relatada em diferentes
países (Mhand et al., 1999; Otkun et al., 2001; Mulvey et al., 2003). No
presente estudo, não foi detectada qualquer cepa produtora de ESBL.
O fato de S. Typhimurium ser um dos sorotipos de Salmonella
mais prevalentes em todo o mundo, a caracterização dessas cepas com
outros marcadores epidemiológicos, além do sorotipo, particularmente o
perfil de resistência aos antimicrobianos e a determinação dos fagotipos, tem
sido muito utilizada. Com essa caracterização, foi possível detectar a
distribuição mundial das cepas multirresistentes de S. Typhimurium DT104,
correspondendo ao segundo sorotipo prevalente entre as cepas de
Salmonella isoladas de humanos, depois de S. Enteritidis PT4, no Reino
Unido. Além da penta-resistência codificada por genes cromossômicos,
foram detectadas, posteriormente, cepas com resistência adicional para
trimetoprim, codificada por plasmídeos, e suscetibilidade diminuída para
ciprofloxacina, codificada no cromossomo (Threlfall, 2000).
Tem sido verificado, também, que as cepas de S. Typhimurium,
independente do fagotipo, se apresentam com maior multirresistência em
comparação com outros sorotipos de Salmonella (Cruchaga et al., 2001;
Fernandes et al., 2003a). As 45 cepas de S. Typhimurium multirresistentes,
DISCUSSÃO
84
utilizadas neste estudo, correspondiam a 16% de um total de 283 cepas
analisadas quanto ao perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos (Ghilardi
et al., 2006). Entre as 45 cepas, sete apresentaram o perfil penta-resistente
e nove, este perfil com exceção de uma das marcas, ambos associados ou
não com outras resistências (Tabela 2).
As cepas de S. Typhimurium isoladas de crianças, na década de
70, já apresentavam elevada resistência para ampicilina, cloranfenicol,
tetraciclina e estreptomicina, porém, não existe informação se essa
resistência era isolada ou em forma de multirresistência (Pessoa et al.,
1978b). Por outro lado, Fernandes et al. (1992) relataram que, entre as 734
cepas de S. Typhimurium, aleatoriamente selecionadas entre as cepas
isoladas no período 1971-1987, 146 (20%) apresentavam multirresistência
para 3 a 16 antimicrobianos, e a grande maioria destas era resistente para
sulfonamidas. Estes dados indicam a necessidade do contínuo
monitoramento da multirresistência aos antimicrobianos em S. Typhimurium,
a fim de se verificar a presença e prevalência de clones “epidêmicos”.
A análise pela fagotipagem, além de demonstrar que todas as 53
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- apresentaram sensibilidade aos fagos do
esquema específico para S. Typhimurium, indicando assim a similaridade
entre os dois sorotipos, também possibilitou a detecção de 14 diferentes
fagotipos nestas cepas. Apenas duas cepas corresponderam ao fagotipo
DTU302 (Tabela 3), diferentemente de outros relatos, cujas cepas
monofásicas pertenciam quase que exclusivamente ao fagotipo DTU302
(Echeita et al., 1999; de la Torre et al., 2003).
Uma diversidade maior de fagotipos foi detectada entre as 56
cepas de S. Typhimurium (Ghilardi et al., 2006), as quais foram distribuídas
em 24 fagotipos diferentes. Aproximadamente 27% (15⁄ 56) e 36% (19⁄ 53)
cepas de S. Typhimurium e de S. I 1,4,[5],12:i:-, respectivamente,
compartilharam os mesmos fagotipos, DT193, DT104b, DT120, DTU302. Foi
detectada apenas uma cepa de S. Typhimurium DT104 com resistência para
ampicilina, sulfonamidas, estreptomicina e nitrofurantoina, ou seja, não
DISCUSSÃO
85
propriamente uma penta-resistente. No entanto, a cepa DT104b,
estreitamente relacionada à DT104, apresentou o perfil de penta-resistência
(ampicilina, sulfonamidas, estreptomicina, cloranfenicol e tetraciclina)
(Tabela 2).
Embora o clone de S. Typhimurium DT104 MR-ACSSuT não
tenha sido detectado em nosso meio, a identificação de cepas pertencentes
aos fagotipos DT104 (1), DT104b (1) e DTU302 (1), conhecidos como
complexo DT104 (Pritchett et al., 2000), com diferentes perfis de
multirresistência, sugere a necessidade de uma vigilância cuidadosa das
cepas de S. Typhimurium, bem como, de S. I 1,4,[5],12:i:-.
Os resultados obtidos com a fagotipagem das cepas de
S. I 1,4,[5],12:i:-, e de S. Typhimurium, não indicaram uma predominância
elevada e significante de qualquer um dos fagotipos (Tabelas 3 e 4). Além
disso, não houve associação entre qualquer fagotipo e fenótipo de
multirresistência (Tabelas 9 e 10). Estes dados estão em concordância com
os relatos de Kariuki et al. (1999) sobre a caracterização de cepas de S.
Typhimurium isoladas em Nairobi, Quênia. A penta-resistência detectada em
cinco cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, pertencentes aos fagotipos DT193 (2),
DT208, DT104b e DTU302, no presente estudo, indica a disseminação deste
perfil MR entre outros fagotipos, e não apenas em DT104 e DTU302.
Os dados reportados sobre o surto epidêmico por S. Typhimurium
na cidade de São Paulo, nos anos 70 (Pessoa et al., 1978b), incluem a
fagotipagem de 319 cepas de S. Typhimurium (87 com biotipo lactose
negativa e 232 com biotipo lactose positiva) pelo sistema Internacional de
Anderson, realizada no Instituto Pasteur em Paris, das quais, apenas 86
(27%) foram sensíveis aos fagos pertencentes ao esquema. Destas, 30
(35%) apresentaram padrão atípico (RDNC) aos fagos utilizados naquele
momento.
Asensi et al. (1995) relataram a presença de seis diferentes
fagotipos, com a predominância de DT193 (47,7%), entre cepas de
S. Typhimurium isoladas de crianças do Rio de Janeiro e de Salvador, bem
DISCUSSÃO
86
como, uma grande percentagem (31,0%) de cepas não tipáveis e 2%
consideradas RDNC. O fagotipo DT193 também foi um dos prevalentes
entre as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- (11,3%) e de S. Typhimurium (18,0%) no
presente estudo.
Na fagotipagem recentemente realizada com as cepas de
S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium (Ghilardi et al., 2006), 28% e 32% das
cepas, respectivamente, também apresentaram padrões atípicos, com
padrões de lise diferentes entre os dois sorotipos (Anexos 7.A e 7.D), o que
pode estar relacionado com uma diversidade nos receptores dessas cepas
para os diferentes bacteriófagos (Lawson et al., 2002). Uma interessante
diferença entre esses padrões de lise atípicos foi a sensibilidade ao fago 7
por todos os tipos encontrados em S. I 1,4,[5],12:i:-, o que não ocorreu com
S. Typhimurium.
Classicamente, S. enterica subsp. enterica (S. I) é dulcitol-positiva
(96%) e inositol-negativa (35%) (Ewing, 1986; Popoff, Le Minor, 2005). No
estudo realizado por Agasan et al. (2002) com cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
isoladas no período 1996-2000 na cidade de Nova York, verificou-se por
biotipagem que 87% e 96% das cepas eram dulcitol-negativas e inositol-
positivas, respectivamente. Diferentemente, as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-,
caracterizadas neste estudo, apresentaram fermentação de dulcitol e inositol
típica da subespécie, sem a presença de biotipos atípicos (dados não
demonstrados).
A subtipagem das cepas de Salmonella pela análise do perfil
plasmideal, após sorotipagem e fagotipagem, tem sido utilizada, porém, com
restrições. A reprodutibilidade dos perfis plasmideais bacterianos é variável
devido às três diferentes conformações espaciais (super-espiralado,
relaxado e linear) dos plasmídeos, que possuem diferentes velocidades de
migração quando submetidos à eletroforese em gel de agarose (Hardy,
1986). Liebana et al. (2002) detectaram cepas de S. Typhimurium com perfil
genético idêntico, porém, com diferentes perfis plasmideais, indicando que
esta tipagem não identifica clones, especialmente, em longos períodos de
DISCUSSÃO
87
tempo. No entanto, a presença de determinados plasmídeos considerados
sorotipo-específicos (Helmuth et al, 1985) pode auxiliar na caracterização
das cepas, quando em associação com outros métodos. Neste estudo, a
detecção do plasmídeo de 60 MDa, sorotipo-específico de S. Typhimurium,
em 94% das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e em 84% nas de S. Typhimurium foi
importante para indicar a similaridade entre os dois sorotipos por esta
caracterização.
O perfil de restrição determinado para alguns plasmídeos pode
ser uma ferramenta adicional na caracterização de cepas bacterianas.
Geralmente, cepas com similaridade genética apresentam um mesmo perfil
de restrição obtido com uma enzima de escolha (Helmuth et al., 1985;
Hardy, 1986; Threlfall et al., 1994). Os plasmídeos de 60 MDa de duas
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e duas de S. Typhimurium foram submetidos à
digestão enzimática com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII, e os perfis
de restrição foram idênticos para as cepas dos dois sorotipos (dados não
demonstrados).
Alguns pesquisadores sugerem que plasmídeos menores (2
MDa), associados ou não aos plasmídeos de 60 MDa em S. Typhimurium,
são geralmente detectados em cepas isoladas em surtos de DTAs,
possibilitando uma diferenciação clonal de tais cepas e justificando a
utilização desta metodologia (Lawson et al., 2004). No presente estudo,
foram detectados plasmídeos entre 1,5 e 6 MDa, juntamente com o de 60
MDa, nas cepas dos dois sorotipos, porém, estudos adicionais são
necessários para a caracterização dos mesmos.
O PFGE, um dos melhores métodos moleculares para a
diferenciação de cepas bacterianas (Olive, Bean, 1999), tem sido utilizado
para caracterizar diferentes sorotipos de Salmonella. A diferenciação inter-
sorotipos é evidenciada por padrões de restrições semelhantes entre as
diferentes cepas de um mesmo sorotipo, tal como verificado para S. Typhi
(Hampton et al., 1998; Thong et al., 2002), S. Enteritidis (Ahmed et al., 2000;
Fernandes, 2004), S. Typhimurium (Corbett-Feeney, Riain, 1998; Jeoffreys
DISCUSSÃO
88
et al., 2001; Murphy et al., 2001; Ribot et al., 2002; Wright et al., 2005), S.
Agona (Threlfall et al., 1996), S. Heidelberg (Demczuk et al., 2003) e vários
outros sorotipos (Liebana et al., 2001; Peters et al., 2003). Assim, cada
sorotipo de Salmonella possui um padrão de restrição próprio e
relativamente uniforme.
O poder discriminatório do PFGE intra-sorotipo em Salmonella
tem sido verificado, com uma importância relevante na diferenciação de
cepas de um mesmo sorotipo implicadas em surtos de DTAs em relação
àquelas associadas com infecções esporádicas. Geralmente, todas as cepas
epidemiologicamente relacionadas, ou seja, isoladas de diferentes fontes
(pacientes, alimentos, animais), porém, no mesmo período de tempo e local,
apresentam um perfil de restrição idêntico, refletindo clonalidade das cepas,
independente da enzima de restrição utilizada na digestão do DNA
cromossômico.
Nos dados reportados por Bender et al. (2001), com cepas de
S. Typhimurium isoladas em diferentes surtos e/ou com diferentes perfis de
resistência aos antimicrobianos, e analisadas por PFGE após digestão com
XbaI, foi possível observar o padrão de restrição característico de sorotipo,
bem como, pequenas diferenças indicando estreita relação, porém, não
clonalidade entre as cepas, segundo os critérios de interpretação de Tenover
et al. (1995).
No estudo descrito por Lindsay et al. (2002), incluindo cepas de
S. Typhimurium DT204b MR isoladas em diferentes países europeus, foi
verificada uma total identidade entre os isolados, detectando-se um surto
internacional. Esta análise foi facilitada pela troca eletrônica de informação
entre laboratórios que utilizam métodos fenotípicos e genotípicos
internacionalmente padronizados.
Wright et al. (2005) publicaram uma ótima ilustração da identidade
clonal por PFGE em cepas de S. Typhimurium isoladas de humanos e
felinos, no mesmo surto de DTA, e digeridas por duas enzimas, XbaI e BlnI.
DISCUSSÃO
89
Os perfis determinados por ambas enzimas nas cepas de ambas origens
foram totalmente idênticos.
Pela representação dos perfis de macro-restrição obtidos por
PFGE, após digestão com XbaI das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de
S. Typhimurium, e da somatória dos resultados destes dois sorotipos,
demonstrada, respectivamente, nas Figuras 7, 8 e 9, foi possível verificar um
padrão específico de sorotipo concordante com a literatura citada acima,
com alta similaridade entre os perfis.
Além dessa similaridade, a análise por PFGE permitiu a
discriminação das cepas pertencentes a um mesmo fagotipo, tanto nas de S.
I 1,4,[5],12:i:- como nas de S. Typhimurium, comprovando o alto poder
discriminatório dessa metodologia, também com as cepas isoladas em
nossa região, ainda que com poucos fragmentos (1-4) de diferença (Figura
9). Assim, os dois fagotipos prevalentes entre as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-,
DT41 e AT00-0677, foram subdivididos em 7 e 3 diferentes perfis,
respectivamente. Das 12 cepas DT41, seis apresentaram o perfil X1 e das 7
cepas AT00-0677, cinco apresentaram o X3. Similarmente, os fagotipos
prevalentes entre as cepas de S. Typhimurium, AT04-2406 e DT193, com 11
e 8 cepas, respectivamente, foram subdivididos em 8 e 5 diferentes perfis
genéticos. As cepas DT104 e DT104b apresentaram o mesmo perfil. Esta
não associação entre qualquer fagotipo e perfil genético foi igualmente
descrita por Kariuki et al. (1999) em cepas de S. Typhimurium no Quênia.
Em países onde há predominância de determinados fagotipos
(DT104) de S. Typhimurium ocorre uma menor discriminação das cepas por
PFGE, como por exemplo, no Reino Unido (Threlfall, 2000), na Islândia
(Gudmundsdottir et al., 2003) e na França (Weill et al., 2006). Além disso,
Lawson et al. (2002) relataram que cepas MR de S. Typhimurium DT12 e
DT120, com o perfil de penta-resistência, apresentaram perfis genéticos
distintos em relação às cepas dos mesmos fagotipos, porém sem a penta-
resistência. Estes dados sugerem uma clonalidade maior entre àquelas
cepas, quando comparados com nossos resultados. Além do número de
DISCUSSÃO
90
subtipos determinados com as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de
S. Typhimurium ser maior, não houve qualquer correlação entre
multirresistência e perfil genético. Não foi observada, também, qualquer
correlação entre os diferentes fenótipos e genótipos, detectados nas cepas
de S. I 1,4,[5],12:i:- sensíveis a todos os antimicrobianos testados (Tabela 9).
Por outro lado, duas cepas de S. Typhimurium sensíveis apresentaram todos
os perfis idênticos (Tabela 10).
Outros estudos para caracterizar e determinar a similaridade
genética entre os sorotipos S. Typhimurium e S. I 1,4,[5],12:i:- têm sido
descritos e dados similares têm sido reportados em diferentes países.
Guerra et al. (2000) estudaram 16 cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- isoladas entre
1997-1998 na região das Astúrias, Espanha, bem como várias outras cepas
controles. Diferentes métodos foram utilizados, tais como, detecção de
diferentes genes de virulência por PCR, perfil plasmideal, perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos, análise do DNA genômico por
ribotipagem e por PFGE. Foi observada uma alta homologia sugerindo uma
linhagem clonal estreitamente relacionada com S. Typhimurium.
Pritchett et al. (2000) desenvolveram “primers” específicos para a
detecção de cepas de S. Typhimurium DT104 e/ou U302 (segmento
amplificado de 162 pb), em associação com “primers” que amplificam o gene
invA de Salmonella (segmento amplificado de 243 pb), utilizado como
controle positivo da reação. Estes “primers”, bem como outros para a
detecção do fragmento de inserção IS200 sorotipo-específico de
S. Typhimurium, foram utilizados por Echeita et al. (2001) em cepas de
S. I 4,5,12:i:- isoladas na Espanha. Os resultados obtidos sugeriram que
estas cepas poderiam ser variantes monofásicas de S. Typhimurium O5+.
No estudo realizado por de la Torre et al. (2003), cepas de
S. I 4,5,12:i:- isoladas de suínos foram caracterizadas por fagotipagem, perfil
plasmideal e PFGE, e os resultados demonstraram que os dois sorotipos,
S. I 4,5,12:i:- e S. Typhimurium, são estreitamente relacionados. Estes
autores sugeriram ainda que, as cepas monofásicas devem ter sido
DISCUSSÃO
91
originadas de S. Typhimurium DTU302, independente de seu fagotipo ou
perfil de resistência aos antimicrobianos.
Alguns destes autores espanhóis (Echeita et al., 1999; de la Torre
et al., 2003) têm relatado que a fonte de contaminação, ou reservatório
animal, das cepas monofásicas S. I 4,5,12:i:- na Espanha, são os suínos.
Não foi possível detectar entre as cepas do Estado de São Paulo uma fonte
específica, uma vez que as mesmas foram isoladas de diferentes materiais
de origem não humana (Quadro 2).
Na Tailândia, Bangtrakulmonth et al. (2004) reportaram que, dos
30 isolados S. I 1,4,[5],12:i:- submetidos à fagotipagem e a testes de
sensibilidade aos antimicrobianos, 17% apresentaram fagotipos e padrão de
resistência concordantes com S. Typhimurium DTU302. Como a grande
maioria (67%) de S. I 1,4,[5],12:i:- não reagiu com os fagos do esquema de
fagotipagem para S. Typhimurium, os autores discutem a possibilidade
destas amostras pertencerem a outros sorotipos diferentes de
S. Typhimurium.
A hipótese de que o sorotipo Lagos (1,4,[5],12:i:1,5), com sua
constituição antigênica semelhante à de S. Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2),
pudesse ser um ancestral para o sorotipo monofásico e atípico,
S. I 1,4,[5],12:i:-, é pouco provável. Uma justificativa seria a sua inexistência
ou baixíssima freqüência de isolamento, tanto no Brasil, como em outros
países (Echeita et al., 2001).
Burnens et al. (1996) estudaram a origem evolucionária de cepas
monofásicas de S. enterica subsp. enterica 9,12:l,v:-, pela detecção do
elemento de inserção IS200, específico para o grupo D de Salmonella, e
análise dos fragmentos de restrição do gene da fase flagelar 2. Estes
autores concluíram que a perda da expressão do antígeno da fase 2 ocorreu
por deleção do gene hin e DNA adjacente, bloqueando o gene da fase 2 na
posição “off”, ou seja, expressando apenas a fase 1. Cepas monofásicas
mutantes de sorotipos aparentemente bifásicos, são detectadas com relativa
freqüência entre as cepas de Salmonella identificadas no Instituto Adolfo
DISCUSSÃO
92
Lutz-SP, sendo também descritas por outros autores (Echeita et al., 1998).
No entanto, não há dados se houve perda do mecanismo de inversão ou da
habilidade em expressar o antígeno da fase 2, ou se, coincidentemente, a
população bacteriana analisada está expressando a fase flagelar 1 por mais
tempo (Ikeda et al., 2001).
Diferentemente, as cepas monofásicas S. I 1,4,[5],12:i:- sofreram
uma deleção simples do operon fljBA, de acordo com os resultados obtidos
por Garaizar et al. (2002). Estes autores descreveram a utilização do método
molecular “DNA Microarray”, consistindo de PCR, hibridação e
seqüenciamento, para avaliar a similaridade entre cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-
e de S. Typhimurium. Além da deleção simples do operon fljBA, muito
provavelmente associada com o elemento de inserção IS26, presente no
sítio da deleção nas cepas monofásicas, estas albergavam quase todos os
genes presentes na cepa protótipo S. Typhimurium LT2 analisada, incluindo
2 de 4 fagos conhecidos. Com a obtenção destes resultados sugeriu-se que
o sorotipo monofásico seria uma variante de S. Typhimurium.
A compilação comparativa de todos os resultados fenotípicos e
genotípicos, obtidos pela caracterização das cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de
S. Typhimurium (Tabelas 9 e 10), no presente estudo, indica uma
diversidade entre estas cepas, porém, uma grande similaridade entre os dois
sorotipos. Portanto, estes resultados, aliados aos vários dados publicados,
indicam que muito provavelmente S. I 1,4,[5],12:i:- seja uma variante
monofásica de S. Typhimurium, independente da presença do antígeno O:5,
do fagotipo, do perfil de resistência aos antimicrobianos e da fonte de
isolamento.
Ao considerarmos S. I 1,4,[5],12:i:- como uma variante
monofásica do sorotipo S. Typhimurium, a prevalência deste, na década de
90, passaria de 7% para 16%, ocupando o segundo lugar entre os sorotipos
isolados de infecções humanas, e de 3% para 5%, ficando em quarto lugar
entre os de origem não humana, no Estado de São Paulo. Apesar de
também ser o primeiro ou segundo sorotipo de Salmonella mais freqüente
DISCUSSÃO
93
em países da América do Norte e Europa, respectivamente, a porcentagem
de isolamento de S. Typhimurium em infecções humanas, em relação aos
demais sorotipos, variou de 20 a 30% no período de 1998 a 2004 (CDC
1999; Fisher et al., 2004; CDC 2005). Esta diferença deve refletir uma maior
notificação dos casos de DTAs nos países desenvolvidos, principalmente
pela adesão de muitos laboratórios aos programas PulseNet e Salm-
gene/Enter-net.
De acordo com os dados reportados no programa Enter-Net na
Europa (Fisher et al., 2004) e individualmente na França (Weill et al., 2006),
embora a incidência de casos de salmonelose em infecções humanas tenha
apresentado um leve declínio durante o período de 1997-2003 (de 220.698
para 142.891 e de 19.174 para 10.472 casos, respectivamente), esta DTA
permanece como uma importante causa de morbidade em humanos. Dessa
forma, esforços para entender e controlar a salmonelose, tanto na prevenção
quanto na redução durante o processamento dos alimentos de origem
animal, bem como, na educação sanitária dos consumidores, devem ser
constantes. Isto é facilitado quando há conhecimento das espécies animais
que são reservatórios de salmonelas e, conseqüentemente, transmissores
na cadeia alimentar. S. Typhimurium, potencialmente, pode infectar uma
grande variedade de espécies animais, e portanto, diversos tipos de
alimentos podem ser contaminados com estas bactérias, dificultando o
controle e prevenção desta salmonelose.
A principal importância da vigilância laboratorial com a
caracterização de cepas de Salmonella utilizando várias metodologias é a de
implementar a vigilância epidemiológica de rotina para identificar e monitorar
novas cepas epidêmicas. A disseminação mundial de S. Enteritidis iniciou
com a prevalência de PT4 na Europa e com PT8 nos EUA, nas décadas de
70 a 90 (Rodrigue et al., 1990). No Brasil, a disseminação de S. Enteritidis
PT4, provavelmente por aves matrizes provenientes da Europa, ocorreu na
década de 90 (Irino et al., 1996).
DISCUSSÃO
94
Dessa forma, existe uma possibilidade de que cepas de
S. Typhimurium DT104 R-tipo ACSSuT possam predominar entre os
isolados de S. Typhimurium no Brasil, nos próximos anos. O mesmo poderá
ocorrer com as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- DTU302 multirresistentes. Uma
vez que, o contínuo monitoramento epidemiológico laboratorial das cepas
isoladas permite o acompanhamento da tendência dos sorotipos de
Salmonella, a alternância de fenótipos e genótipos entre os sorotipos
prevalentes de Salmonella, em uma dada região, só pode ser verificada com
a caracterização periódica das cepas, tal como a realizada neste estudo.
Além da identificação de cepas de S. Typhimurium, após a
detecção da fase flagelar H:2 (1,2) por PCR, como a obtida neste estudo,
cepas monofásicas de outros sorotipos poderão ser completamente
identificadas com a utilização de “primers” específicos para diferentes genes
da fase flagelar 2 por Multiplex-PCR. Assim, essa metodologia consiste em
uma importante ferramenta que complementa a sorotipagem clássica.
Outro dado importante e apresentado neste estudo foi a
distribuição dos diferentes fagotipos dos sorotipos estudados. Como a
fagotipagem está entre os métodos fenotípicos comumente utilizados em
investigações epidemiológicas, a implantação e a utilização da fagotipagem
de S. Typhimurium é de relevância para uma monitoração da tendência e
freqüência dos fagotipos presentes em nossa região.
CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
96
6 CONCLUSÕES
6.1 A detecção da fase flagelar 2 (H:1,2) por PCR, utilizada neste estudo,
mostrou-se como uma importante ferramenta, em adição à clássica
sorotipagem, na identificação dos sorotipos de Salmonella,
particularmente de S. Typhimurium e do sorotipo monofásico S. I
1,4,[5],12:i:-;
6.2 As cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- apresentaram multirresistência
antimicrobiana semelhante às apresentadas por cepas de
S. Typhimurium, incluindo o perfil penta-resistente;
6.3 As cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- podem ser caracterizadas pelo esquema
de fagotipagem de S. Typhimurium, indicando a similaridade entre os
dois sorotipos;
6.4 Apesar da detecção dos fagotipos DT104 e DTU302, respectivamente,
em cepas de S. Typhimurium e S. I 1,4,[5],12:i:-, não houve
predominância dos mesmos em nossa região;
6.5 A análise do perfil plasmideal demonstrou uma similaridade entre as
cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium, particularmente, pela
presença do plasmídeo de 60 MDa;
6.6 O método de PFGE, o mais discriminatório neste estudo, permitiu a
verificação de similaridade genética acima de 70% entre as cepas de S. I
1,4,[5],12:i:- e de S. Typhimurium;
6.7 A grande similaridade obtida pela utilização de métodos fenotípicos e
genotípicos, na caracterização das cepas dos dois sorotipos, indicou que
S. I 1,4,[5],12:i:- é uma variante monofásica de S. Typhimurium.
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ANEXOS
ANEXO 1
ANEXO 1
Comprovante do comitê de ética
ANEXO 1
ANEXO 2
ANEXO 2
Certificado do CANADA
ANEXO 3
ANEXO 3 Exemplos de alguns sorotipos de Salmonella conforme sua
descrição no Esquema de Kauffmann-White (Popoff, 2001)
Sorotipo Antígeno somático Antígeno
Fase 1
flagelar
Fase 2
Grupo
O:2 (A)
Paratyphi A 1,2,12 a [1,5]
Grupo
O:4 (B)
Sandiego 4,[5],12 e,h e,n,z
15
Agona 1,4,[5],12 f,g [1,2]
Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2
Bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7
Grupo
O:7 (C1)
Infantis 6,7,14 r 1,5
Grupo
O:8 (C2-C3)
Albany 8,20 z
4
,z
24
-
Grupo
0:9 (D1)
Typhi 9,12[Vi] d -
Enteritidis 1,9,12 g,m -
Dublin 1,9,12[Vi] g,p -
Grupo
0:3,10 (E1)
Lexington 3,10[15][15,34] z
10
1,5
Grupo
0:1,3,19 (E4)
Senftenberg 1,3,19 g,[s],t -
Grupo
0:16 (I)
II 16 d e,n,x
IIIb 16 l,v 1,5,7
ANEXO 4
Anexo 4. Posição relativa dos sorotipos S. I 1,4,[5],12:i:- e S. Typhimurium entre os 15 sorotipos de Salmonella isolados de
materiais de origem humana no período 1991–2000, no Estado de São Paulo
Sorotipo 1991 1992
1993 1994 1995 1996 1997
1998 1999 2000 TOTAL (%)
Enteritidis 6 6 33 227 396 352 262 268 331 309 2190 (49,5)
S. I 1,4,[5],12:i:- 92 55 68 37 28 55 5 31 25 7 403 (9,1)
Typhimurium 54 40 36 41 29 17 3 35 24 22 301 (6,8)
Agona 78 38 28 19 22 13 2 4 4 6 214 (4,8)
Infantis 84 11 9 23 17 17 - 11 1 2 175 (4,0)
Typhi 10 12 10 8 17 31 12 20 27 12 159 (3,6)
Dublin 30 15 23 7 11 7 8 19 5 9 134 (3,0)
Hadar 32 17 38 10 5 3 3 2 - 3 113 (2,6)
Schwarzengrund - 2 2 52 1 2 - 5 2 - 66 (1,5)
Panama 13 11 7 7 7 3 1 1 7 1 58 (1,3)
Saintpaul 5 31 4 4 3 - - 1 - 1 49 (1,1)
Newport 5 4 5 7 2 8 - 2 3 2 38 (0,9)
Oranienburg 4 5 4 1 6 4 1 5 3 2 35 (0,8)
Javiana - - 4 11 1 5 1 3 2 2 29 (0,6)
Mbandaka 4 6 7 4 3 1 - 1 1 - 27 (0,6)
Salmonella Rugosa 5 1 2 2 6 4 5 3 5 3 36 (0,8)
Outros 81 sorotipos 66 51 47 64 56 34 19 27 21 14 399 (9,0)
TOTAL 488 305 327 524 610 556 322 438 461 395 4426 (100,0)
ANEXO 5
Anexo 5. Posição relativa dos sorotipos S. I 1,4,[5],12:i:- e S. Typhimurium entre os 15 sorotipos de Salmonella isolados de
materiais de origem não humana no período 1991–2000, no Estado de São Paulo
Sorotipo 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 TOTAL (%)
Enteritidis - - 16 116 414 384 422 427 210 255 2244 (28,0)
Senftenberg 12 9 55 19 15 14 7 24 273 152 580 (7,2)
Hadar 8 34 23 14 37 2 5 144 140 22 429 (5,3)
Agona 20 17 33 23 12 125 23 50 5 30 338 (4,2)
Typhimurium 31 23 53 23 21 17 28 14 28 24 262 (3,3)
Infantis 9 35 9 26 41 21 26 8 13 24 212 (2,6)
Mbandaka 3 18 48 10 31 43 24 9 2 9 197 (2,4)
Havana 1 3 136 7 7 12 2 1 1 2 172 (2,1)
Schwarzengrund 3 4 44 2 29 26 20 9 - 2 139 (1,7)
Anatum 18 31 27 11 15 17 10 5 1 - 135 (1,7)
Ohio 2 8 34 1 4 60 10 12 1 - 132 (1,7)
S. I 1,4,[5],12:i:- 3 4 56 3 2 16 4 16 19 5 128 (1,6)
Heidelberg 33 2 6 30 27 11 1 1 9 7 127 (1,6)
Oranienburg 5 35 2 3 4 54 6 11 3 2 125 (1,5)
Rissen 17 - 31 7 9 21 - 10 14 6 115 (1,4)
Salmonella Rugosa 2 5 47 31 27 74 48 23 14 67 338 (4,2)
Outros 169 sorotipos 145 234 296 202 323 336 330 193 122 167 2348 (29,5)
TOTAL 312 462 916 528 1018 1233 966 957 855 774 8021 (100,0)
ANEXO 6
ANEXO 6. Meios de cultura, Reagentes e Soluções
Exceto quando especificado, os meios de cultura utilizados foram
de procedência Difco (Becton Dickinson, EUA), os sais, de procedência
Merck (Merck S.A., Rio de Janeiro, RJ) ou Synth (Labsynth Produtos para
Laboratórios Ltda, Diadema, SP) e os demais reagentes, de procedência
Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Caldo Mueller-Hinton
O meio de cultura foi dissolvido em água destilada e autoclavado,
conforme especificações do fabricante, e mantido a 4
o
C.
Agar Mueller-Hinton
O meio de cultura foi dissolvido em água destilada e autoclavado,
conforme especificações do fabricante. Após resfriamento a 50
o
C, foi
distribuído em placas de Petri, formando uma espessura de 3 mm de meio, e
as placas foram mantidas a 4
o
C.
Caldo para fagos (Difco Phage Broth – DPB)
O meio de cultura foi dissolvido em água destilada e autoclavado,
conforme especificações do fabricante, e mantido a 4
o
C.
Ágar para fagos (Difco Phage Agar – DPA)
O meio de cultura foi dissolvido em água destilada e autoclavado,
conforme especificações do fabricante. Após resfriamento a 50
o
C, foi
distribuído em placas quadradas (30 mL/placa) e as mesmas foram mantidas
a 4
o
C.
Solução de tetraciclina a 12,5 µ
µµ
µg/mL
Uma solução do antibiótico a 250 µg/mL de água destilada,
mantida a –20
o
C, foi diluída 20X, no momento do uso, para atingir a
concentração final de 12,5 µg/mL.
ANEXO 6
Solução de lisozima a 100 mg/mL
A lisozima foi dissolvida em tampão Tris-HCl 0,25 M, pH 8,0,
estéril, e estocada a –20
o
C.
Solução de glicose a 20%
O açúcar foi dissolvido em água destilada e a solução foi
esterilizada por filtração e mantida a 4
o
C.
Solução de HCl 10 N
O ácido clorídrico foi adicionado à água destilada, por
gotejamento lento, e a solução foi mantida à temperatura ambiente.
Solução NaOH a 10 N
O hidróxido de sódio foi dissolvido em água destilada e a solução
foi mantida à temperatura ambiente.
Solução SDS a 20%
O dodecil sulfato de sódio foi cuidadosamente adicionado à água,
em recipiente estéril, dissolvido por aquecimento a 35-45
o
C e a solução foi
mantida à temperatura ambiente.
Sarcosyl (N-lauroilsarcosina, sal dissódico) a 10%
O Sarcosyl foi cuidadosamente adicionado à água, em recipiente
estéril, dissolvido suavemente por aquecimento a 50-60
o
C e mantido à
temperatura ambiente.
Solução Tris-HCl 1 M, pH 8,0
O sal Tris-HCl foi dissolvido em 800 mL de H
2
O MilliQ, a solução
foi esfriada em temperatura ambiente e o pH ajustado com ± 50 mL de
NaOH 10 N. O volume foi completado para 1000 mL com H
2
O MilliQ e, após
ANEXO 6
autoclavação a 121
o
C por 15 minutos, a solução foi mantida à temperatura
ambiente.
Solução de Na
2
EDTA 0,5 M, pH 8,0
O sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (Na
2
EDTA) foi
dissolvido a quente e o pH ajustado com NaOH 10 N. A solução foi
autoclavada a 121
o
C por 15 minutos e armazenada à temperatura ambiente.
Solução I (Solução lítica para extração de DNA plasmideal)
Lisozima 4 mg/mL; Glicose 50 mM; EDTA 10 mM; Tris 25 mM,
pH 8,0
A solução foi preparada em gelo, no momento do uso, com adição
final da lisozima mantida a –20
o
C, e a partir das soluções concentradas,
anteriormente preparadas e mantidas em temperatura ambiente.
Solução II (Solução alcalina com dodecil sulfato de sódio)
NaOH 0,2 N; SDS 1%
A solução foi preparada, no momento do uso, a partir das
soluções concentradas, anteriormente preparadas e mantidas em
temperatura ambiente.
Solução III (Solução de acetato de sódio 3 M, pH 4,8)
O acetato de sódio (NaAc) foi dissolvido em uma alíquota de água
destilada, o pH ajustado com ácido acético glacial e o volume final
completado. Após autoclavação a 121
o
C por 15 minutos, a solução foi
mantida à temperatura ambiente.
Solução de acetato de sódio 3 M, pH 8,0
O acetato de sódio (NaAc) foi dissolvido em uma alíquota de água
destilada, o pH ajustado com ácido acético glacial e o volume final
completado. Após autoclavação a 121
o
C por 15 minutos, a solução foi
mantida à temperatura ambiente.
ANEXO 6
Solução IV (Solução Tris-acetato de sódio pH 8,0)
NaAc 100 mM pH 8,0; Tris 50 mM pH 8,0
A solução foi preparada, no momento do uso, a partir das
soluções concentradas, anteriormente preparadas e mantidas à temperatura
ambiente.
Solução tampão Tris-EDTA – TE, pH 8,0
Trizma base 10 mM pH 8,0; Na
2
EDTA 1 mM pH 8,0
A solução foi preparada, no momento do uso, a partir das
soluções concentradas, anteriormente preparadas e mantidas à temperatura
ambiente.
Solução tampão Tris-Borato-EDTA, pH 8,0 – TBE 5X
Trizma base 445 mM; H
3
BO
3
445 mM; Na
2
EDTA 12,5 mM
O sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (Na
2
EDTA) foi
dissolvido a quente e os outros componentes foram adicionados. A solução
foi autoclavada a 121
o
C por 15 minutos e mantida à temperatura ambiente.
No momento do uso, foi diluída 10X para a obtenção de uma solução 0,5X.
Solução tampão para suspensão celular
Tris 100 mM pH 8,0; EDTA 100 mM pH 8,0
A solução foi preparada, no momento do uso, a partir das
soluções concentradas, anteriormente preparadas e mantidas à temperatura
ambiente.
Solução tampão de lise celular
Tris 50 mM pH 8,0; EDTA 50 mM pH 8,0; Sarcosyl 1%; Proteinase
K 0,1 mg/mL
A Proteinase K foi adicionada para cada 5 mL de tampão de lise
celular, no momento do uso.
ANEXO 6
Solução de brometo de etídio (10 mg/mL)
O brometo de etídio foi dissolvido em solução tampão Tris a 0,05
M (pH 8,5) e armazenado em frasco escuro à temperatura ambiente. No
momento do uso, foi diluído em água destilada na concentração final de 0,5
µg/mL.
Gel de agarose (0,8% ou 2,0%)
Agarose tipo II foi dissolvida a quente em solução tampão TBE
0,5X (TBE 5X diluída 10 vezes), resfriada a aproximadamente 50
o
C e vertida
no suporte para gel em cuba de eletroforese horizontal.
Gel de agarose Seakem Gold 1%:SDS 1% em TE (“plugs”)
Agarose Seakem Gold 1% em TE foi dissolvida a quente e
mantida em banho-maria a 55-60
o
C por 5 minutos antes da adição de 1% de
SDS pré-aquecido a 50
o
C, permanecendo a 55-60
o
C até o momento do uso.
Gel de agarose Seakem Gold 1% (para o gel de PFGE)
Agarose Seakem Gold 1% em TBE 0,5X foi dissolvida a quente e
mantida em banho-maria a 55-60
o
C até o momento do uso.
Proteinase K (20 mg/mL)
A Proteinase K foi dissolvida em água destilada, distribuída em
tubos tipo eppendorf (300 a 400 µL por tubo) e armazenada a –20
o
C.
Solução para digestão enzimática
Tampão 1X; XbaI 30 U; BSA 1X
A solução foi preparada no momento do uso.
Corante de arraste
Azul de bromofenol 0,07%; SDS 7%; Ficoll 400 20%
ANEXO 6
A solução de uso foi preparada pela adição de 360 µL de tampão
TAE 50X em 1,8 mL desta solução, a qual foi mantida à temperatura
ambiente.
Solução Tris acetato-EDTA (TAE) 1X
Tris base 2 M; Na
2
EDTA 0,05 M; ácido acético glacial 1 M
A solução foi ajustada para pH 8,0, esterilizada em autoclave a
121
o
C por 15 minutos e conservada à temperatura ambiente.
ANEXO 7
ANEXO 7
O ANEXO 7.A refere-se aos padrões de lise apresentados
pelos diferentes fagotipos detectados entre as cepas de S. I 1,4,[5],12:i:-, de
acordo com o conjunto de 31 fagos padrões do esquema de fagotipagem de
S. Typhimurium.
O ANEXO 7.B refere-se aos padrões de lise apresentados
pelos fagotipos que necessitam de tipagem com os 10 fagos adicionais.
O ANEXO 7.C apresenta o padrão de lise das cepas que não
puderam ser tipadas por nenhum dos fagos anteriores, sendo assim
identificadas como não tipáveis ou UT (“untypeable”).
O ANEXO 7.D refere-se aos padrões de lise apresentados
pelos diferentes fagotipos detectados entre as cepas de S. Typhimurium, de
acordo com o conjunto de 31 fagos padrões do esquema de fagotipagem de
S. Typhimurium.
ANEXO 7
Anexo 7.A – Perfil dos Fagotipos identificados em cepas de S. I 1,4,[5],12:i:- (1991-2000) de acordo com o conjunto de 31 fagos do Esquema de
Fagotipagem de Salmonella Typhimurium e com o conjunto de 10 fagos adicionais
Tipo 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 32 35 O
DT 41
CL CL CL CL CL CL CL - CL CL - - CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL - CL CL CL CL
DT 104b*
- - - - - - - - - - - - - - - - CL - - - - - - - - - - - - - CL
DT 120*
- - - - - - - - - - - - - - - - CL - - - - - - - - - - - - - CL
DT 180
- - - - - - - - - - - - - - - - SCL - - - +++ - - - - - - - - - +
DT 193*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
DT 208*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
DT U302*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
AT 00-0677
- OL - - - - - - - - - - - - - SCL - - - SCL SCL - - - - SCL
- - - OL CL
AT 04-6814
SCL - SCL SCL SCL CL SCL - SCL SCL - - SCL CL CL - SCL SCL - - SCL SCL SCL SCL SCL CL - CL - OL CL
AT 04-6788
- - - - - - OL - - - - - - +++ +++ - SCL - SCL - - - - - - - - - SCL - CL
AT 04-6811
SCL OL - - - - SCL - SCL SCL - - SCL OL OL SCL - - SCL OL OL SCL SCL - SCL - - - - - CL
AT 00-3219
CL - CL - - - CL - - - - - CL - - - - - - - OL - CL - OL - - - - - CL
AT 04-6828
- OL - - - SCL SCL - CL +++ - - - SCL SCL SCL SCL - SCL OL OL SCL +++ +++ +++ OL OL SCL ++ OL CL
AT 04-6839
SCL SCL SCL SCL SCL - CL - CL SCL - - SCL CL CL SCL - - SCL OL OL SCL SCL SCL SCL - - - - - CL
UT*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
Anexo 7.B – Perfil dos Fagotipos identificados nas amostras*
testadas com os 10 fagos adicionais
Anexo 7.C – Perfil de 7 tipos não tipáveis após
testes com todos os fagos
Fagotipo P12 P13 P18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tipo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DT 104
CL CL SCL - - - OL - UT 1 - OL - - OL
DT 104b
- - + / +++ - - - OL - UT 2 SCL - - - OL
DT 120
- - CL +++ +++ +++ OL -/OL UT 3 SCL - SCL
- -
DT 193
- - - / +++ +++ +++ +++ - - UT 4 - - - SCL CL
DT 208
- - - -/++ -/++ -/++ -/OL OL UT 5 - - - - OL
DT U302
- - - - - - OL - UT 6 SCL - - - -
UT
- - - - - - - - UT 7** SCL OL - - OL
UT 8** - - SCL
- -
DT, “definitive type”; AT, “atypical”; UT, “untypeable”; CL, “confluent lysis”; SCL, “semi-confluent lysis”; OL, “opaque lysis”; +++, > 100 placas; ++, 40-100 placas; + ,20-40 placas.
ANEXO 7
Anexo 7.D - Perfil dos Fagotipos identificados em cepas de S. Typhimurium (1991-2000) de acordo com o conjunto de 31 fagos do Esquema de
Fagotipagem de Salmonella Typhimurium e com o conjunto de 10 fagos adicionais
Tipo 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 32 35 O
DT 4
- - - CL CL CL - - SCL OL - - - CL CL - - CL CL - CL CL - SCL - CL - CL CL CL CL
DT 10
- - - - - - - - SCL CL CL CL - - - - - - CL - CL CL - - - - - CL CL - CL
DT 27
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SCL
- - - SCL
CL
DT 49
- OL - - - SCL - - SCL SCL - - - OL OL - - - SCL OL OL SCL SCL - - CL - CL SCL
OL CL
DT 99
- - - - - - - - - OL - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
DT 104*
- - - - - - - - - - CL CL - - - - SCL - - - - - - - - - - - - - CL
DT 104b*
- - - - - - - - - - - - - - - - CL - - - - - - - - - - - - - CL
DT 110b
- - - - - - - - - - - SCL - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
DT 120*
- - - - - - - - - - - - - - - - CL - - - - - - - - - - - - - CL
DT 135
- CL OL SCL SCL SCL - - SCL SCL - - SCL SCL SCL SCL - - SCL OL OL SCL SCL - SCL
OL - OL SCL
OL CL
DT 153
- - - - - - - - SCL - - - - - SCL - - - SCL - - SCL - - - - - CL - - CL
DT 193*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
DT U302*
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
AT 97-6274
- - - - - - - - - SCL - OL - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
AT 97-6276
- OL - - SCL SCL - - SCL OL OL OL SCL CL CL SCL - - SCL OL OL SCL SCL - SCL
CL - CL SCL
OL CL
AT 04-2406
- OL OL - - - - - OL 0L - - OL OL OL OL - - SCL OL OL OL OL - OL CL - CL SCL
OL SCL
AT 04-4538
- - - - - SCL - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CL
AT 04-6846
- OL - - - - - - OL OL - - - OL OL OL - - OL OL OL OL OL - OL OL OL OL OL OL CL
AT 04-6871
- SCL - - - - - - SCL - - - - SCL SCL SCL SCL - SCL SCL CL SCL - - - CL - SCL - CL -
AT 04-6884
- - - - - - - - SCL - - - - - - - SCL - - OL OL - - - - CL - - - SCL
-
UT7**
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
UT8**
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
DT, “definitive type”; AT, “atypical”; UT, “untypeable”; CL, “confluent lysis”; SCL, “semi-confluent lysis”; OL, “opaque lysis”; +++, > 100 placas; ++, 40-100 placas; + ,20-40 placas.
* Amostras com perfis demonstrados no Anexo 7.B;
**
Amostras com perfis demonstrados no Anexo 7.C
ANEXO 8
ANEXO 8. APRESENTAÇÃO EM CONGRESSOS
II ENCONTRO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INFECÇÕES E
SAÚDE PÚBLICA, realizado de 13 a 15 de agosto de 2003, com
apresentação do trabalho em forma de pôster:
“Identificação por Multiplex-PCR do atípico e emergente sorotipo monofásico
Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:-, no Estado de São
Paulo, Brasil: freqüência e resistência antimicrobiana”. Tavechio AT, Ghilardi
ACR, Fernandes SA, Melles CEA.
XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, realizado de 22 a
25 de novembro de 2005 em Santos, SP, com apresentação do trabalho em
forma de pôster:
“Fagotipagem e perfil plasmideal de cepas de Salmonella enterica subsp.
enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:-, isoladas de origem humana e não humana, no
decênio 1991-2000, no Estado de São Paulo”. Tavechio AT, Fernandes SA,
Ghilardi ACR, Melles CEA.
ANEXO 9
ANEXO 9. TRABALHO PUBLICADO
ANEXO 9
ANEXO 9
ANEXO 10
ANEXO 10. TRABALHO A SER PUBLICADO
De acordo com as normas para publicação no “Journal of Clinical
Microbiology”
ANEXO 10
Phenotypic and Genotypic Comparison among Salmonella enterica 1,4,[5],12:i:- and
Salmonella Typhimurium Strains Isolated in São Paulo State, Brazil
Ana T. Tavechio
1*
, Sueli A. Fernandes
1
, Ângela C. R. Ghilardi
1
, Geoff Soule
2
, Rafiq
Ahmed
2
, Carmo E. A. Melles
1
State Laboratory for Bacterial Pathogens, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo-SP,
Brazil
1
; National Laboratory for Enteric Pathogens, National Microbiology
Laboratory, Health Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada
2
*Corresponding author: Mailing address: Instituto Adolfo Lutz, Av. Dr. Arnaldo, 355, 9
o
andar, Cerqueira César, São Paulo, SP, Brasil, CEP 01246.902.
E-mail: atav[email protected].gov.br
ANEXO 10
INTRODUCTION
Salmonellosis has been a public health concern all over the world due to the zoonotic
feature of most Salmonella serotypes (serovars). Ingestion of foodstuffs, mainly from animal origin,
contaminated with Salmonella strains is the main cause of foodborne disease in humans (26).
Although there are more than 2500 serotypes already identified (25), only a select number of about
100 serotypes is involved in human infections in a specific geographic area annually. Usually, 10 of
such serotypes account for approximately 60-80% of all isolated strains during a period of time, and
there is a variation on these serotypes from region to region. Laboratorial salmonellosis routine
surveillance is responsible for the identification and monitoring of Salmonella serotype trends
throughout the years. Such surveillance has been done at the Adolfo Lutz Institute in São Paulo
State, Brazil, since the 40’s (14, 28, 29, 31). During the 90’s (30), it was observed an increasing of
up to five times in the frequency of Salmonella enterica subsp. enterica serotype 1,4,[5],12:i:- (S. I
1,4,[5],12:i:-), although it was first isolated in the late 70’s (8). S. I 1,4,[5],12:i:- is an atypical
monophasic serotype, which serologically could be serotype Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) or
serotype Lagos (1,4,[5],12:i:1,5) without the second-phase H antigen, or still could be a new
monophasic Salmonella serotype. S. I 1,4,[5],12:i:- has been found among the top five Salmonella
serotypes isolated from human and non human infections in our area, being associated with human
foodborne outbreaks or sporadic cases of gastroenteritis, as well as, extraintestinal infections. This
monophasic serotype has also been detected in several other countries such as in Thailand (5, 7),
in Spain (11, 12), in the USA (1), and in Canada (10).
Due to the close antigenic similarity between S. I 1,4,[5],12:i:- and S. Typhimurium, and to
the epidemiological evidence that it would seldom be serotype Lagos, characterization of those
monophasic strains and comparison of their profile with the S. Typhimurium ones has been carried
out by some researchers (1, 2, 11, 13, 15, 18), resulting in a significant similarity among those
strains.
The main purpose of this study was to characterize, with concomitantly comparison, S. I
1,4,[5],12:i:- and S. Typhimurium strains isolated from human and nonhuman sources, during 1991-
2000, in São Paulo State, Brazil, through phenotypic and genotypic methods.
MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains. A total of 53 S. I 1,4,[5],12:i:- strains (44 multiresistant to 2-13 antimicrobials and
9 susceptible), previously confirmed as fljB-negative (30), were characterized by phage typing,
plasmid profile analysis, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) macro-restriction analysis. For
ANEXO 10
comparison purposes, 45 S. Typhimurium strains (35 multiresistant to 2-7 antimicrobials and 10
susceptible), previously characterized by antimicrobial susceptibility and phage typing (17), were
also included in this study. Those strains, isolated from human e nonhuman sources, during 1991-
2000, and belonging to the Salmonella collection of Instituto Adolfo Lutz - the Central Public Health
Laboratory of São Paulo State, were referred to this laboratory for serotyping from different
laboratories of different geographic areas in São Paulo State. All isolates, maintained on nutrient
agar at room temperature, were identified at species, subspecies and serotype levels according to
the standard international scheme for Salmonella serotyping (25). All Salmonella antisera used
were produced and maintained in our laboratory, according to standard guidelines (22).
Phage typing. All 98 Salmonella strains were submitted to phage typing by using the Salmonella
Typhimurium Phage-typing scheme (3), which
was performed at the National Laboratory for Enteric
Pathogens, National Microbiology Laboratory, Health Canada, Winnipeg, Manitoba, CA, in
accordance with the methodology of the International Reference Laboratory for Salmonella
Typhimurium Phage Typing, Health Public Agency, Colindale, London, UK. This current
standardized phage-typing protocol is composed of a set containing 30 S. Typhimurium specific
phages plus a pool for Salmonella spp. Untypeable strains through these phages were subtyped
with 10 additional experimental phages. All strains displaying lysis patterns that did not match to the
standard ones were assigned as atypical (AT) or RDNC (reaction does not conform). Such
expanded scheme is able to type over than 300 different phage types.
Plasmid profile analysis. Plasmid DNA was extracted from the 98 lysed Salmonella cells
according to the alkaline extraction method, for small volumes of cell cultures, described by
Birnboim and Doly (6). Extracted plasmids were electrophoresed on a 0.7% agarose gel, stained
with ethidium bromide, and photographed under UV illumination. The approximate molecular mass
of plasmids was determined by comparison with plasmids of known molecular mass, e.g., E. coli
HB101 pRP4 (34 MDa), E. coli HB101 pR27 (110 MDa), S. Typhimurium C5 strain (60 MDa), and
a HindIII λ-DNA molecular mass pattern.
PFGE. Macro-restriction analysis of genome, from 98 Salmonella strains, was performed by
pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) carried out according to the “CDC PulseNet Protocols” (9),
based on previous methodology described by Gautom (16). Bacterial genomic DNA plugs were
digested with 30U-XbaI restriction enzyme (Promega) and electrophoresis was done at 14
o
C and 6
V/cm
3
, for 20 hours, with pulse times of 2.2 to 63.8 seconds, in 2 L of 0.5X TBE buffer (45 mM
Trizma base, 45 mM boric acid, and 1 mM Na
2
EDTA) by using a CHEF-DR II system (BioRad
Laboratories, Hercules, California). An XbaI digestion of the S. Braenderup H9812 control strain
ANEXO 10
(20) was used as DNA size markers. The PFGE gel was stained with ethidium bromide and the gel
image was captured on GEL DOC EQ system (Quantity One version 4.5 – Universal Hood II, Bio-
Rad Laboratories, Milan, Italy) and analyzed by GelCompar II version 4.0 software program for
Windows (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) to generate a dendrogram. Clustering analysis was
performed by using the Dice coefficient 1.5% tolerance and the unweighted pair group method with
arithmetic averages (UPGMA). Each PFGE profile that differed at least by one fragment was
assigned a type number, being X1 to X
n
for S. I 1,4,[5],12:i:- and Xt 1 to Xt
n
for S. Typhimurium.
RESULTS AND DISCUSSION
In order to assess the possible phenotypic and genotypic similarities among S. I 1,4,[5],12:i:-
and S. Typhimurium strains isolated in São Paulo State, this study encompassed the phage typing,
plasmid profile, and PFGE analysis of 53 S. I 1,4,[5],12:i:- strains, as well as, the plasmid profile
and PFGE analysis of 45 S. Typhimurium strains. Table 1 and Table 2 show all phenotypic and
genotypic profiles of S. I 1,4,[5],12:i:- and of S. Typhimurium strains, respectively. It was found 07
monophasic strains not expressing the secondary somatic antigen O:5 in our study, differing from
other results where all monophasic strains were O:5+.
Phage typing. All 53 S. I 1,4,[5],12:i:- strains were lysed at least by one of the phages
composing the S. Typhimurium phage typing scheme. It was identified 15 different types of phage
lysis patterns, being seven Definitive Types (DT) accounting for 68% of total strains, seven (28%)
Atypicals (AT) or RDNC (reaction does not conform), and two (4%) Untypeable (UT). DT41 was the
most prevalent phage type accounting for 22.6%.
Phage types of each one of the 45 S. Typhimurium strains are shown in Table 2. Those
strains were selected in order to represent at least one of each phage type identified among the 56
S. Typhimurium strains, previously reported (17). Those 56 S. Typhimurium strains displayed 24
different phage lysis patterns with 14 Definitive Types (DT) representing 63% of total strains, seven
(32%) Atypicals (AT) or RDNC (reaction does not conform), and three (5%) untypeables (UT).
DT193 and AT04-2406 were the most prevalent phage types accounting for 19.6% each one.
Comparing these results with the ones obtained for S. I 1,4,[5],12:i:- strains there was a great
similarity between their percentages, and 15 S. Typhimurium and 19 S. I 1,4,[5],12:i:- strains were
distributed in 4 common phage types (DT193, DT104b, DT120, and DTU302).
Whereas our results are in agreement with some reports (11, 12) concerning to the similarity
on phage typing detected for both serotypes, S. I 1
,4,[5],12:i:- and S. Typhimurium,
ANEXO 10
Bangtrakulnonth et al. (5), reported that thirty S. I 4,5,12:i:- isolates, which were phage typed and
analysed by susceptibility testing, showed a variable resistance pattern and phage reaction in
agreement with S. Typhimurium DTU302, leading to the conclusion that the strains not reacting
with any phages might belong to other serotypes in Thailand.
On the other hand, whereas the majority of S. I 4,5,12:i:- strains characterized in Spain
belong to phage type DTU302 and present multidrug resistance (MR) to ampicillin,
chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides, and tetracycline (pentaresistant or R-type ACSSuT)
(12), it was found in our study only two strains DTU302, being one pentaresistant and the other one
MR to 10 antimicrobials (Table 1). Besides, no monophasic strain was DT104 and only one S.
Typhimurium DT104 strain, multiresistant to ASSuN, was detected in our studies.
Plasmid profile analysis. Fourteen different plasmid profiles were detected among the S. I
1,4,[5],12:i:- strains, and the great majority of them (94.3%) carried a 60-MDa plasmid, alone
(62.3%) or combined with other ones of different sizes (32.1%). The three remaining strains (5.6%)
carried only a 110-MDa plasmid. A plasmid of 60-MDa size is known as the S. Typhimurium
serotype-associated plasmid (19), and a plasmid profile consisting of this plasmid is dominant in S.
Typhimurium strains (4, 21, 23, 27, 33). Among our 45 S. Typhimurium strains, there were 10
different plasmid profiles, and 38 (84.4%) strains carried the 60-MDa plasmid. In addittion, the 60-
MDa plasmid of two strains of S. I 1,4,[5],12:i:- and two of S. Typhimurium, which were submitted to
plasmid restriction analysis with EcoRI and HindIII restriction enzymes, displayed the same
restriction pattern (data not shown). The results obtained by this characterization also suggest a
great similarity among strains of these two serotypes.
PFGE. Pulsed-Field gel electrophoresis macro-restriction analysis of S. I 1,4,[5],12:i:- and S.
Typhimurium strains, after digestion with XbaI, generated 09 to 18 fragments, with sizes between
33,3 and 1135 kb, per strain. It was detected 33 different profiles (X1-X33) among the 53 S. I
1,4,[5],12:i:- strains with similarity above 60%. Most strains (90%) presented more than 70% of
similarity, and the prevalent profile was X1 and X2 (11.3%). Among the S. Typhimurium, there were
32 profiles (Xt 1-Xt 32), being Xt 1 the most prevalent (18.0%). A dendrogram (Figure) combining
the results of the two serotypes resulted in 65 different PFGE profiles with similarity above 60%.
Some phage types were distributed into different profiles, although there were only 1-4 band
differences, being considered as closely or possibly related to each other (32). These results show
the similar PFGE patterns displayed by both serotypes, suggesting that they are the same
serotype, since there has been reported that each Salmonella serotype display a specific PFGE
pattern (23, 24). A high similarity percentage through PFGE analysis among S. I 4,5,12:i:- strains
was also observed by other authors (1, 2, 11), associated with other profiles commonly found in S.
Typhimurium.
ANEXO 10
Whereas swines have been reported to be reservoirs for S. I 4,5,12:i:- in Spain (11, 12),
such a potential source was not identified among the strains herein studied, since a variety of
nonhuman samples was found to yield these bacteria.
Comparison analysis obtained in the present study had shown a remarkable degree of
similarity at phenotypic and molecular levels among strains of the two serotypes, S. I 1,4,[5],12:i:-
and S. Typhimurium, isolated from human and nonhuman sources, during 1991-2000, in São Paulo
State, Brazil. Therefore, as already reported by some researchers (11, 13, 15, 18), it is likely to say
that S. I 1,4,[5],12:i:- is a monophasic variant of S. Typhimurium serotype, regardless the phage
type or antibiotic resistance profile. Considering that, the frequency of this worldwide spread
serotype, S. Typhimurium, would change from 7% to 16% in human and from 3% to 5% in
nonhuman Salmonella isolates, in São Paulo State, Brazil, ranking second and fourth place,
respectively.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank the staff of the Global Infectious Diseases Research Training Program (GIDRTP),
Pittsburgh, USA and of the Pitt/IAL GIDRTP Training Advisory Group whom kindly approved a
training on S. Typhimurium phage typing in Winnipeg, Canada, to Ana Terezinha Tavechio. The
financial support for this training was by a grant/fellowship from FOGARTY International Center; the
National Institute of Health (D43 TW006592).
We are also grateful to Ana L. Geremias for helping us during the PFGE agarose plugs
preparation.
This article is part of the Doctor level thesis presented to the “Programa de Pós Graduação
em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças, área de concentração: Pesquisas
Laboratoriais em Saúde Pública” by Ana Terezinha Tavechio in 2006.
ANEXO 10
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ANEXO 10
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ANEXO 10
TABLE 1. Phenotypic and genotypic profiles of 53 S. I 1,4,[5],12:i:- strains isolated from
human and nonhuman sources, during 1991-2000, in São Paulo State, Brazil
N
o
Source
1
Resistance
2
Phage Type
3
Plasmid (MDa) PFGE
HUMAN
215/91 Stool
T, N
DT 41 60 X1
295/91 Blood
Su,T,N
DT 41 60; 2.8; 1.5 X1
466/91 Stool
S, Su, T, SXT
DT 41 60; 40 X20
610/91 Blood
A, S, Su
DT 41 60; 6.5; 4 X1
611/91 Blood
A, S, Su, SXT
DT 41 110 X25
669/91 CSF
T, KN
DT 41 110 X26
629/92 Urine
T, KN
DT 41 110 X18
166/92 Stool
T, N
DT 41 60 X14
617/93 CSF
Su, N
DT 41 60 X1
803/93 Stool
Su, T, N
DT 41 60; 2.8; 1.5 X15
985/93 Blood
S, Su, T
DT 41 60; 5 X1
1275/99 Blood Susceptible DT 41 60; 3; 2 X1
791/93 Blood
Su, N
DT 104b 60 X7
744/93 Stool
S, N
DT 104b 60 X4
427/94 Stool Susceptible DT 104b 60 X4
596/92 Stool
A,C,S,Su,NET,KN,GN,CF,SXT,AM
DT U302 60; <60 X19
430/92* Stool
T, N
DT 193 60 X6
385/91 Blood
T, CF
DT 193 60 X11
406/91* Stool
A,C,S,Su,T,NET,GN,KN,AMC,CF,SXT,AM,NA **
DT 193 60; <60; 2.5; 1.5 X23
407/91* Stool
A,C,S,Su,T,NET,GN,KN,AMC,CF,SXT,AM,NA **
DT 193 60; <60; 2.5; 1.5 X24
107/91 Blood Susceptible DT 193 60 X6
424/91 M. S.
A, S, Su, AMC, CF, SXT
DT 120 60 X2
13/96 Stool Susceptible DT 120 60 X2
572/99 Stool Susceptible DT 120 60 X30
54/94 Stool
A, S, Su, SXT
DT 180 60 X28
623/94 Blood
A, S, Su, T, KN, SXT
DT 180 60 X2
638/94 Urine
S, Su, T, KN, SXT
DT 180 60 X2
647/93 Stool
C, S, Su, SXT
DT 208 60; >60 X31
1148/98 Blood
A, C, S, Su, T, SXT **
DT 208 60 X32
542/91 Stool
A, C, T, CF, N
AT 00-0677 60 X3
548/91 Stool
CF, N
AT 00-0677 60 X3
549/91 Pleural liquid
T, CF, C
AT 00-0677 60 X3
51/94 Urine
T, NA
AT 00-0677 60 X3
70/94 Stool
S, Su, SXT
AT 00-0677 60 X17
1052/94 Stool
A, S, Su, T, KN
AT 00-0677 60; >60 X16
647/96 Stool Susceptible AT 00-0677 60; 4 X3
786/93 Stool
Su, N
AT 04-6811 60 X21
139/94* Stool
A, S, Su, SXT
AT 00-3219 60; >60; 110 X13
548/96 Stool
A, C, S, Su, NET, GN, KN, CF, SXT, AMC
AT 04-6828 60;4;2.5;2;1.5;1.3 X33
586/98 Stool Susceptible AT 04-6839 60 X12
981/93 Urine
T, KN
UT 60 X8
1014/93 Urine
T, NA
UT 60 X8
NON HUMAN
810/93 Guinea pig
Su, T, N
DT 104b 60 X7
813/93 Guinea pig
Su, N
DT 104b 60 X4
763/99 Meat
A, C, S, Su, T, SXT, N, NA **
DT 104b 60 X22
994/00 Environment
A, C, S, Su, T, SXT **
DT U302 60 X29
199/91* Meat
S, Su, SXT
DT 120 60; 4.5; 2.8; 1.5 X2
200/91* Meat
S, Su, T, SXT
DT 120 60; 4.5; 2.8; 1.5 X2
512/92* Mouse Susceptible DT 193 60 X27
1093/93 Mouse
T, N
AT 04-6814 60 X10
809/93 Mouse
T, N
AT 04-6814 60 X5
1087/93 Mouse Susceptible AT 04-6814 60 X5
48/91 Dessert
A, S, Su, SXT
AT 04-6788 60; >60 X9
1
CSF, cerebrospinal fluid; M. S., mamma secretion;
2
A, ampicillin; C, chloramphenicol; S, streptomycin; Su, sulfonamides; T, tetracycline; AMC, amoxicilin-clavulanic acid; CF, cephalotin;
GN, gentamicin; KN, kanamycin; N, nitrofurantoin; NA, nalidixic acid; NET, netilmicin; SXT, sulfazotrim;
3
DT, definitive type; AT, atypical; UT, untypeable
*, O:5-negative strains; **, pentaresistant strains
ANEXO 10
TABLE 2. Phenotypic and genotypic profiles of 45 S. Typhimurium strains isolated from
human and non human sources, during 1991-2000, in São Paulo State, Brazil
No Source
1
Resistance
2
Phage type
3
Plasmid (Mda) PFGE
HUMAN
982/93** Urine
A, C, S, Su
DT 193 60 Xt 29
169/98** Stool
C, S, Su, T, SXT
DT 193 60 Xt 5
151/94 Blood
S, Su, SXT
DT 193 60 Xt 2
177/92 Bood
S, Su, T, SXT
DT 193 60 Xt 2
80/92 Stool
S, Su, SXT
DT 193 60; >60 Xt 22
778/93 CSF Susceptible AT 04-2406 60 Xt 1
457/94 CSF Susceptible AT 04-2406 60; 4.5 Xt 1
186/92 Stool Susceptible AT 04-2406 60 Xt 1
217/94* Stool
A, C, S, Su, T, SXT, KN
AT 04-2406 60 Xt 19
890/00 Stool
S, Su
AT 04-2406 60 Xt 16
1037/98 Stool
Su, T, SXT
AT 04-2406 60 Xt 14
1188/95** Blood
A, S, Su, T, SXT, KN
AT 04-2406 60 Xt 12
722/94* Stool
A, C, S, Su, T, SXT, KN
AT 04-2406 None Xt 18
159/95 Urine
A, S, Su, KN
AT 04-2406 None Xt 26
324/96 Stool
A, S, Su, SXT, KN
DT 49 60 Xt 1
326/96** Stool
A, S, Su, T, SXT, KN
DT 49 60 Xt 1
491/98 Stool
S, Su, T, SXT
DT 49 60 Xt 20
561/96 Stool
A, S, Su
DT 49 >60; 4.5 Xt 1
1187/95* Blood
A, C, S, Su, T, SXT, KN
DT 49 60 Xt 28
127/96** Blood
A, S, Su, T, KN
DT 49 60 Xt 25
553/98* Stool
A, C, S, Su, T, SXT
DT 104b 60 Xt 3
561/98 Stool
A, S, Su, N
DT 104 60 Xt 3
628/92** Stool
A, C, Su, T, SXT, NA, KN
DT U302 60; <60 Xt 30
1249/99 Stool Susceptible DT 10 60 Xt 10
1244/00** Stool
C, S, Su, T, SXT
DT 27 60; 40 Xt 6
503/91 Stool Susceptible DT 110b 60 Xt 13
327/99 Stool
S, T, NIT
DT 120 None Xt 31
660/92* Blood
A, C, S, Su, T
DT 135 60 Xt 17
497/98 Stool Susceptible DT 153 60; 4; 2.8 Xt 23
43/91* Stool
A, C, S, Su, T, SXT, KN
AT 04-6846 60; <60 Xt 15
132/92 Blood
S, Su, T
AT 04-4538 60; >60 Xt 21
1189/95* Blood
A, C, S, Su, T, SXT
AT 04-2606 60 Xt 7
337/99 Stool
C, S, T
AT 04-6884 None Xt 4
85/99** Stool
C, S, Su, T
AT 04-6871 60 Xt 4
1237/95 CSF Susceptible AT 97-6274 60 Xt 9
1240/00 Blood Susceptible UT 7 60 Xt 6
447/92 Stool
A, Su, NA
UT 8 60; 30; 28; 1.5 Xt 27
NON HUMAN
69/91 Cheese
A, S, Su
AT 97-6276 60 Xt 8
91/93 Chiller water
S, Su
DT 135 >60 Xt 1
225/95 Sausage
S, Su, SXT
DT 4 60; >60 Xt 24
987/97 Poultry
S, Su
PT 193 60 Xt 2
352/99 Food
T, S, Su, N
PT 193 >60 Xt 5
1076/99** Food
C, S, Su, T, SXT
DT 193 60 Xt 32
277/96 Environment Susceptible PT 99 60 Xt 11
815/97 Guinea pig Susceptible AT 04-2406 60 Xt 1
1
CSF, cerebrospinal fluid;
2
A, ampicillin; C, chloramphenicol; S, streptomycin; Su, sulfonamides; T, tetracycline; KN, kanamycin; N, nitrofurantoin; NA, nalidixic
acid; SXT, sulfazotrim;
3
DT, definitive type; AT, atypical; UT, untypeable
ANEXO 10
Figure. Dendrogram generated by GelCompar II software showing the relationships of 65
representative fingerprints (XbaI-PFGE or X and Xt types) for S. I 1,4,[5],12:i:- and S. Typhimurium
strains. Strain No., PFGE pattern and Phage type (PT) are indicated. Number of strains displaying
each PFGE or phage type is between parenthesis.
Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE
100
90
80
70
PFGE
430/92
69/91
1189/95
169/98
132/92
177/92
80/92
497/98
890/00
503/91
1188/95
1037/98
660/92
722/94
217/94
186/92
491/98
611/91
669/91
225/95
127/96
407/91
406/91
48/91
1093/93
548/91
809/93
385/91
586/98
139/94
803/93
166/92
70/94
1052/94
629/92
295/91
596/92
1237/95
1249/99
561/98
277/96
786/93
43/91
466/91
200/91
54/94
512/92
994/00
647/93
572/99
1148/98
791/93
427/94
327/99
1076/99
763/99
85/99
548/96
982/93
1187/95
628/92
447/92
159/95
1014/93
1240/00
X6 (2)
Xt 8
Xt 7
Xt 5 (2)
Xt 21
Xt 2 (3)
Xt 22
Xt 23
Xt 16
Xt 13
Xt 12
Xt 14
Xt 17
Xt 18
Xt 19
Xt 1 (8)
Xt 20
X25
X26
Xt 24
Xt 25
X24
X23
X9
X10
X3 (5)
X5 (2)
X11
X12
X13
X15
X14
X17
X16
X18
X1 (6)
X19
Xt 9
Xt 10
Xt 3 (2)
Xt 11
X21
Xt 15
X20
X2 (6)
X28
X27
X29
X31
X30
X32
X7 (2)
X4 (3)
Xt 31
Xt 32
X22
Xt 4 (2)
X33
Xt 29
Xt 28
Xt 30
Xt 27
Xt 26
X8 (2)
Xt 6 (2)
193 (2)
97-6276
04-2406
193 (2)
04-4538
193 (3)
193
153
04-2406
110b
04-2406
04-2406
135
04-2406
04-2406
04-2406 *
49
41
41
4
49
193
193
04-6788
04-6814
00-0677 (5)
04-6814 (2)
193
04-6839
00-3219
41
41
00-0677
00-0677
41
41 (6)
U302
97-6274
10
104 104b
99
04-6811
04-6846
41
120 (4) 180 (2)
180
193
U302
208
120
208
104b (2)
104b (3)
120
193
104b
04-6871 04-6884
04-6828
193
49
U302
UT8
04-2406
UT (2)
UT7 27
1135 Kb 33,3 Kb
N
o
PFGE PT
* 04-2406 (4); 49 (3); 135 (PTs detected in Xt 1 pattern)
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