( PDF ) Análise da coordenação motora em camundongos submetidos ao traumatismo crânio-encefálico e pré-condicionados com NMDA

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC

UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ANALISE DA COORDENAÇÃO MOTORA EM CAMUNDONGOS

SUBMETIDOS AO TRAUMATISMO CRÂNIO-ENCEFÁLICO E PRÉ-

CONDICIONADOS COM NMDA

TAYANA COSTA

CRICIÚMA, JANEIRO DE 2009

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC

UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

TAYANA COSTA

ANALISE DA COORDENAÇÃO MOTORA EM CAMUNDONGOS

SUBMETIDOS AO TRAUMATISMO CRÂNIO-ENCEFÁLICO E PRÉ-

CONDICIONADOS COM NMDA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ciências da Saúde, como

requisito parcial à obtenção do título de

mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Carina Rodrigues

Boeck

CRICIÚMA, JANEIRO DE 2009

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Bibliotecária: Flávia Caroline Cardoso – CRB 14/840

Biblioteca Central Prof. Eurico Back – UNESC

C837a Costa, Tayana.

Análise da coordenação motora em camundongos

submetidos ao traumatismo crânio-encefálico e pré-

condicionados com NMDA / Tayana Costa; orientadora:

Carina Rodrigues Boeck. – Criciúma: Ed. do autor, 2009.

84f. : il. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul

Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde, 2009.

1. Traumatismo cranioencefálico. 2. Lesão cerebral. 3. N-

metil-D-aspartato. 4. Atividade motora. I. Título.

DD. 21ª ed.

616.81

“É certo que a confiança do homem em suas

próprias forças o torna capaz de realizar coisas

materiais que não se podem fazer quando se

duvida de si mesmo...”

(Allan Kardec)

RESUMO

Tem sido descrito que danos celulares posteriores ao trauma seja mediados

pelos neurotransmissores excitatórios, glutamato e aspartato, através da

excessiva ativação dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O pré-

condicionamento com NMDA é uma estratégia de neuroproteção que previne o

dano celular induzido por eventos como a isquemia e convulsões. O objetivo deste

estudo é investigar o efeito do pré-condicionamento com NMDA em camundongos

submetidos a um modelo de traumatismo crânio-encefálico (TCE) através da

avaliação da coordenação motora e do dano celular posterior ao trauma. Para tal,

camundongos CF-1 adultos machos foram pré-tratados com solução salina ou

NMDA (75 mg/kg) 24 horas antes do trauma. Os animais foram anestesiados por

inalação com O

O (33%:66%) e em seguida submetidos ao modelo

experimental de TCE pelo impacto de um peso de 50 g no crânio. A destreza dos

animais foi avaliada pelo teste de Impressão das Pegadas (Footprint), em que os

animais têm as patas dianteiras e traseiras pintadas com tinta não-tóxica nas

cores preta e vermelha, respectivamente. Os resultados indicam que o pré-

condicionamento com NMDA previne os prejuízos motores provocados pelo TCE

nos camundongos. Neste modelo de trauma, não foi verificado dano celular, o que

pode indicar que o trauma tenha sido do tipo leve. Em resultados adicionais,

verifica-se que o pré-condicionamento com NMDA, assim como o TCE, levou a

uma diminuição dos níveis das subunidades do tipo NR1 dos receptores NMDA,

mas induziram um aumento das subunidades NR2B, sem alterar os níveis das

subunidades NR2A. Apesar de que, tanto o mecanismo de proteção (pré-

condicionamento) quanto o de dano desencadeado pelo trauma alteram

similarmente os níveis dos receptores NMDA, contudo, o papel neuroprotetor

desempenhado pelo pré-condicionamento é conhecido. Assim, é provável que

outras proteínas intracelulares determinem o destino da célula. Tendo em vista o

papel protetor do pré-condicionamento com NMDA, entende-se que este

mecanismo possa desempenhar funções preventivas ao SNC e/ou de manutenção

contra neuropatologias que envolvam o sistema glutamatérgico no TCE.

Palavras chaves: TCE; pré-condicionamento com NMDA; proteção; coordenação

motora.

ABSTRACT

Cell damage after trauma can be mediated by excitatory neurotransmitter,

glutamate and aspartate, through excessive activation of receptor N-methyl-D-

aspartate (NMDA). The NMDA preconditioning is a strategy for neuroprotection

that prevents cellular damage induced by ischemia and seizures. The aim was to

investigate the effect of NMDA preconditioning in mice subjected to a traumatic

brain injury (TBI) by evaluating the motor coordination and cellular damage. Mice

CF-1 adult male were pre-treated with saline or NMDA (75mg/kg) 24 hours before

the brain trauma. The animals ware anesthetized by inhalation with O

(33%:66%) and then subjected to experimental model of TBI by the impact of a

weight 50 grams in the skull. The coordination of the animals was evaluated by

Footprint Test in which the hind- and forefeet of the mice were coated with black

and red nontoxic paints, respectively. Results indicate that NMDA preconditioning

prevents the coordination deficit damage caused by TBI. In this trauma model,

cellular damage was not observed, suggesting that trauma was mild. Additionally,

both NMDA preconditioning and trauma induce a decrease of level on NMDA

receptor subunits NR1 and an increase on NR2B without affect NR2A levels.

Besides, even trauma and preconditioning operate at the same way with regards

NMDA receptors subunits content, the preconditioning is a well known strategy of

protection. Thus, probably other intracellular proteins contribute to opposite effect

of trauma and preconditioning. In point of view of the protective role of NMDA

preconditioning, is certain that this mechanism can prevent the central nervous

system functions and/or maintenance against neuropathology involving the

glutamatergic system in TBI.

Key words: TBI; NMDA preconditioning; protection; motor coordination.

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA - ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato

AVC - acidente vascular cerebral

iGluR - receptores ionotrópicos de glutamato

mGluR - receptores metabotrópicos de glutamato

NMDA - N-metil-D-aspartato

SNC - sistema nervoso central

TCE - traumatismo crânio encefálico

SUMÁRIO

1.Introdução................................................................................................... 14

1.1. Conseqüências fisiológicas e estruturais do TCE................................... 15

1.2. Sistema Glutamatérgico.......................................................................... 17

1.2.1. Receptores NMDA............................................................................... 18

1.2.2. Excitotoxicidade Glutamatérgica no TCE............................................. 19

1.3. Neuroproteção......................................................................................... 21

1.3.1. Pré-condicionamento com NMDA........................................................ 23

2. Objetivos.................................................................................................... 26

3. Métodos e Resultados: Capítulo 1.............................................................

3.1. Artigo: NMDA preconditioning improves short and long-term motor

deficits outcome after diffuse traumatic brain injury………………………….

3.2. Métodos e Resultados Adicionais: Capítulo 2:

3.2.1. Metodologia.................................................................................

3.2.2. Aspectos Éticos............................................................................ 54

3.2.3. Animais Experimentais................................................................ 54

3.2.4. Tratamento com NMDA............................................................... 55

3.2.5. Traumatismo Crânio Encefálico................................................... 55

3.2.6. Separação de Proteínas por Eletroforese (SDS-Page)............... 56

3.2.7. Imunodetecção de proteínas (Western Blot)................................ 57

3.2.8. Dosagem de Proteína.................................................................. 57

3.2.9. Análise Estatística........................................................................ 58

3.2.10. Resultados................................................................................ 58

4. Discussão................................................................................................... 63

5. Conclusão.................................................................................................. 73

6. Referências................................................................................................ 73

1 INTRODUÇÃO

De acordo com o National Institute of Neurological Disorders and Stroke

(NINDS, USA, 2007), o traumatismo crânio encefálico (TCE) é definido como “um

traumatismo repentino que causa dano ao cérebro”. Esta definição inclui ambas as

lesões abertas e fechadas. Segundo dados do Centro de Pesquisas em Educação

e Prevenção da Rede SARAH (CESPE, Brasília, 2008), o TCE é uma importante

causa de morte e de deficiência física e mental, sendo apenas superado pelo

acidente vascular cerebral (AVC). Na Rede SARAH de Hospitais do Aparelho

Locomotor foram atendidos, em 2001, 344 pacientes com TCE e 1419 pacientes

com AVC. A idade média dos pacientes com TCE foi 28,9 anos e 75,6 por cento

foram do sexo masculino. A idade média dos pacientes com AVC foi 60 anos e a

proporção homem/ mulher foi igual a 1:1.

Após o TCE muitos pacientes mostram uma diversidade de seqüelas

persistentes que podem incluir a dor de cabeça, a fadiga, danos na memória,

déficit de concentração e atenção, mudanças de personalidade, depressão,

irritabilidade, distúrbios do sono e disfunção sexual (Lewine et al., 2007), diversos

déficits motores, déficits na velocidade e no equilíbrio (Brink et al., 1970, Schaaf et

al., 1997), processos desencadeados por injúrias que acometem o sistema

nervoso central (SNC) (Xiong et al., 2007). Os prejuízos motores e a deficiência

cognitiva podem persistir durante anos depois do TCE moderado ou severo (Oddy

et al., 1985; Adelson et al., 1997; Lindner et al., 1998; Piot-Grosjean et al., 2001).

Pacientes podem recuperar a capacidade funcional dos danos motores e

cogitivos, porém essa recuperação dependerá de fatores múltiplos como o local da

lesão (Shelton & Reding, 2001; Morecraft al et., 2002; Wenzelburger et al., 2005;

Morecraft et al., 2007), o grau de dano infligido (Kuhtz-Buschbeck et al., 2003;

Katz et al., 2004), gênero (Niemeier et al., 2007) e a idade dos pacientes (Katz &

Alexander, 1994; Katz et al., 2004; Livingston et al., 2005).

1.1 Conseqüências fisiológicas e estruturais do TCE

Primeiramente, pacientes que sofreram TCE podem ter contusão da

superfície ou dilaceração, focais ou difusas como hemorragia intracranial, e dano

axonal. Além da destruição neuronal local resultante do insulto primário, o

ferimento mecânico induz secundariamente no cérebro uma cascata progressiva

de eventos relacionados, que geralmente induzem a uma injúria mais severa,

incluindo isquemia, o edema cerebral, ferimento difuso axonal, excitotoxidade,

disfunção mitocondrial, e desregulação da homeostase do cálcio (Yi & Ranzell,

2006; Richardson et al., 2007). Os pacientes que sobrevivem ao trauma

inicialmente são suscetíveis a estes insultos cerebrais secundários que são

iniciados pela liberação de mediadores endógenos neurotóxicos e inflamatórios

pelas células no SNC.

Estudos experimentais em animais mostraram as mudanças estruturais que

acontecem depois do TCE no sistema nervoso central (Nudo, 1999; 2006;

Carmichael, 2003; Butefisch, 2006), que envolvem tipicamente uma combinação

de mecanismos de insultos focais e difusos (Gennarelli & Graham, 2005). O TCE

pode resultar em mudanças neuropatológicas que afetam a densidade do tecido, o

fluxo cerebral de sangue e a integridade da massa branca e cinzenta do cérebro

(Mcallister et al., 2001). Outro dano comum no caso do TCE é a contusão cortical

focal e um dano axonal difuso (Gentry et al., 1988). Embora a contusão cortical

focal seja uma causa importante de inabilidade relacionada ao TCE, o dano axonal

difuso contribui mais para esta inabilidade (Levine et al., 2006).

O dano axonal difuso é iniciado pelo rompimento da homeostase iônica e

da permeabilidade alterada do axolema e terminado horas mais tarde pela

desconexão do segmento axonal e consequente morte do neurônio (Povlishock &

Christman, 1995; Maxwell et al., 1997). Inicialmente, o dano axonal difuso é a

causa de confusão mental, da perda da consciência, ou do coma devido ao

rompimento das fibras ascendentes envolvidas na atenção (Gennarelli et al.,

1982).

A resposta neuroinflamatória endógena profunda após o TCE,

fisiopatologicamente ocorre para defender o SNC dos patógenos e para reparar o

tecido lesado, mas esta também é responsável pelo desenvolvimento das lesões

ao cérebro e dos resultados adversos. Dentre os potenciais promotores de dano

secundário decorrente do trauma, o neurotransmissor glutamato tem importante

função neste processo danoso (Rao et al., 2001). Após o TCE a concentração

extracelular de glutamato é aumentada imediatamente após o impacto e perdura

por até 24 horas (Faden et al., 1989; Koizumi et al., 1997), ocasionando

excitotoxidade nas células gliais (Nicholls & Attwell, 1990) e morte de neurônios

(Smith et al., 1997).

1.2 Sistema Glutamatérgico

O sistema glutamatérgico envolve uma série de receptores que são

ativados pelo aminoácido glutamato (Cotman et al., 1995). O glutamato é o

principal neurotransmissor excitatório e mais abundante no cérebro (Yi & Hazell,

2006; Bressan

& Pilowsky, 2003), participando de muitas sinalizações celulares

excitatórias e de fenômenos plásticos vinculados à aprendizagem e memória

(Fonnum, 1984; Izquierdo, 1989), além de participar do desenvolvimento do SNC,

da diferenciação e morte celular (Mcdonald & Johnston, 1990; Meldrum, 2000).

O glutamato exerce suas funções sinalizadoras sinápticas agindo em

proteínas específicas localizadas na membrana celular neural. Os receptores

glutamatérgicos são classificados de acordo com as suas propriedades

farmacológicas e funcionais, e são divididos em receptores ionotrópicos (iGluR) e

metabotrópicos (mGluR). Os receptores ionotrópicos são canais iônicos que

quando ativados tornam-se permeáveis a cátions e são divididos em: N-metil D-

aspartato (NMDA), ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato (AMPA)

e cainato (Mori & Mishima, 1995). A estimulação de qualquer destes receptores

ionotrópicos leva ao influxo de cálcio (Ca

) e/ou sódio (Na

) resultando na

despolarização da membrana, ativando assim, indiretamente os canais de cálcio

dependentes de voltagem. Os oito tipos de receptores metabotrópicos são

associados a sistemas transmembrana acoplados a proteínas-G divididos em três

grandes famílias de receptores de acordo com as suas seqüências homólogas e

com a modulação de efetores intracelulares. O Grupo I inclui os receptores mGluR

1 e 5, estão associados a ativação da fosfolipase C (PLC); o Grupo II (mGluR 2 e

3) e o Grupo III (mGluR 4, 6, 7 e 8) estão associados negativamente a adenilato

ciclase (Conn & Pin, 1997).

A extensão da estimulação dos receptores glutamatérgicos é determinada

pela concentração do glutamato no espaço extracelular. É de grande importância

para as células que o glutamato seja mantido em baixas concentrações, pois a

excessiva liberação e o conseqüente aumento nos seus níveis extracelulares o

tornam tóxico em decorrência da excessiva estimulação de seus receptores (Lipton

& Rosenberg, 1994). O sistema de transporte de glutamato é a via mais rápida de

remoção do glutamato extracelular, interrompendo a sua ação nos seus receptores

(Rosenberg et al., 1992). Os transportadores de glutamato estão presentes na

membrana celular de neurônios e das células da glia. Os transportadores

astrocitários são considerados mais importantes, pois além de manterem baixa a

concentração extracelular do glutamato, degradam o aminoácido à glutamina no

citoplasma, que será liberada e captada pelo neurônio para regeneração de

glutamato (Schousboe, 1981; Yi & Hazell, 2006)

1.2.1 Receptores NMDA

O receptor NMDA quando ativado torna-se altamente permeável a íons

sódio (Na

) e principalmente cálcio (Ca

) (Kandel et al., 2001) e seu potencial

excitatório são mais duradouros (Dale & Roberts, 1985), tendo um papel

importante na regulação das sinapses no SNC (Carroll & Zukin, 2002).

A excessiva ativação dos receptores NMDA, porém, está envolvida na

epilepsia e em danos cerebrais associados à isquemia/hipoglicemia (Olney, 1994)

e também com o TCE (Clausen & Bullock, 2001). Pois a excessiva ativação dos

canais-receptores NMDA desfaz a homeostase celular dos íons Ca2+, levando a

excitotoxicidade e a lesão no neurônio provocado pelo aumento do influxo do íon,

além de danificar as funções mitocondriais (Clausen & Bullock, 2001) e

subseqüente morte por necrose e/ou apoptose que ocorrem como resultado deste

acúmulo intracelular de Ca

(Arundine & Tymianski, 2003). O receptor NMDA é

formado pela composição de quatro de subunidades, formando uma proteína

heteromérica constituída por NR1, NR2 (A-D) e NR3. Diferentes combinações

destas subunidades determinam especificidades na capacidade funcional de cada

receptor, como, por exemplo, afinidade do NR1 pela glicina que é um co-agonista

obrigatório (GAGLIARD, 2000) e do NR2 pelo glutamato e limiar para abertura do

canal iônico (SHULER et al., 2008).

1.2.2 Excitotoxicidade Glutamatergica no TCE

O conceito de excitotoxicidade foi introduzido por Olney (1969) para

descrever a neurotoxicidade associada com a administração exógena de altas

concentrações glutamato, ou de compostos que agem como agonistas em

receptores glutamatérgicos. Alterações bioquímicas foram identificadas através

dos modelos experimentais de trauma; estes incluem mudanças na homeostase

iônica (cálcio, potássio, sódio, magnésio), indução de radicais livres, mudanças

imunes inflamatórias e alterações de sistemas múltiplos do neurotransmissores,

inclusive no sistema glutamatérgico (Panter & Faden, 1992; Mcintosh, 1994). A

excitotoxicidade glutamatérgica não é o único fator desencadeante de

neuropatologias, mas tanto pode ser um evento primário, como uma conseqüência

de um evento danoso já ocorrido.

Em várias condições neuropatológicas crônicas ou agudas em que o

glutamato participa, pode haver alterações na sua captação e/ou liberação,

exacerbando a injúria desencadeada por doenças como: a isquemia, a

hipoglicemia, o edema cerebral, a lesão por trauma mecânico, a epilepsia, a

demência de Alzheimer, a enfermidade de Huntington e doenças neurológicas

relacionadas à SIDA (Obrenovitch et al., 2000). O aumento no nível de glutamato

extracelular após o TCE (ou demais doenças citadas acima), causa um aumento

na ativação dos receptores de glutamato, desencadeando assim os eventos

secundários do trauma como a morte neural, aumento do tempo da

despolarização da célula, desequilíbrio iônico, diminuição dos níveis intracelulares

de ATP, aumentos nos níveis intracelulares de Ca

o que favorece ao edema

cerebral e pressão intracranial elevada (Yi & Ranzell, 006)

Em um modelo de trauma em ratos verificou-se que a injúria celular pós-

TCE é mediada pelos neurotransmissores excitotóxicos endógenos (glutamato e

aspartato) por ativação dos receptores NMDA (Ikonomidou et al., 1999), pois um

tratamento prévio com antagonistas de receptor NMDA foi capaz de diminuir a

morte celular. O glutamato parece ser destrutivo na fase aguda, imediatamente

após o ferimento traumático ou isquêmico, mas após este período, assume suas

funções fisiológicas normais, que incluem a promoção da sobrevivência neuronal

(Ikonomidou & Turski, 2002).

Estudos demonstraram também uma diminuição nos níveis dos

transportadores gliais para glutamato, GLT-1 e GLAST, do córtex cerebral

ipsilateral e contralateral ao trauma, associado ao aumento nos níveis

extracelulares do glutamato observados 48 horas após o trauma (Van Landeghem

et al., 2001). Esta alteração na quantidade de transportadores gliais para

glutamato também é observada após a isquemia cerebral (Rao et al., 2000).

Enquanto o TCE conduz a uma hipoperfusão sangüínea, ao mesmo tempo

o glutamato e os distúrbios iônicos produzem demanda metabólica aumentada no

tecido afetado produzindo o aumento na taxa metabólica cerebral local para a

glicose (Mendelow & Crawford, 1997) que poderia estar relacionado a

excitotoxidade glutamatérgica.

1.3 Neuroproteção

A neuroproteção é um processo que interrompe e/ou previne uma cascata

patológica que ocorre durante um processo de dano tóxico (Mcintosh, 1993;

Gagliard, 2000). Em muitos modelos de excitotoxicidade em que os níveis

extracelulares de glutamato estão elevados, antagonistas dos receptores

glutamatérgicos são utilizados como neuroprotetores. Os antagonistas dos

receptores NMDA, AP-5 (antagonista do tipo competitivo, bloqueia o sítio de

ligação de NMDA ao receptor) e MK-801 (antagonista do tipo não-competitivo,

bloqueia o canal iônico no receptor) (Monaghan et al., 1989) fazem parte do grupo

de antagonistas utilizados para bloquear respostas neurotóxicas desencadeadas

pela ativação dos canais-receptores NMDA, devido a liberação de aminoácidos

durante um dano isquêmico ou convulsivo (Olney et al., 1987; Novelli et al., 1988;

Breukel et al., 1998; Sierra-Paredes et al., 2000; Meloni et al., 2002).

A neuroproteção pode ser induzida por baixas doses de NMDA, que ativam

os receptores sinápticos e extrasinápticos de NMDA (Francesc et al., 2006). A

atividade sináptica do receptor de NMDA promove a neuroproteção pela ativação

pró-sobrevida contra os sinais patológicos, incluindo a ativação do fator nuclear

CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc) e expressão gênica

(Lee et al., 2005; Papadia et al., 2005).

Alguns estudos com modelos animais de trauma mostraram efeitos

benéficos dos antagonistas do receptor NMDA como por exemplo MK-801,

fenciclidina, D-CPP-ene, Pfizer PC 101-606 (Hamm et al., 1993) e o íon magnésio

(Mg

) (Heath & Vink, 1999).

Outra substância que age de modo antagônico nos receptores NMDA está

sendo investigado como um neuroprotetor contra os eventos secundários

resultantes do aumento de glutamato pós-TCE (Alves et al., 2003). Em um modelo

animal de TCE foi demonstrado que após o tratamento com topiramato houve uma

recuperação neurológica mais rápida em relação ao desempenho da memória e

motor (O'Dell & Hamm, 1995).

O TCE induzido por percussão em ratos causou uma elevação na

marcação do glutamato e do aspartato extracelular junto ao local do traumatismo.

Este aumento dos aminoácidos excitatórios é relacionado à severidade do dano e

associado a uma redução no estado bioenergético celular e do Mg

livre

intracelular, condições essas recuperadas após tratamento com um antagonista

não–competitivo (dextrofan) ou competitivo (CPP) do receptor NMDA, atuando

benéficamente pós-TCE (Faden et al, 1989).

Apesar de evidências indicarem que os antagonistas de NMDA possuem

melhores propriedades neuroprotetoras em processos excitotóxicos provocados

por ferimentos decorrentes do trauma no cérebro de ratos jovens quando

comparados a ratos adultos, pouco ainda se sabe sobre os mecanismos celulares

envolvidos no dano celular pelo TCE (Bernert & Turski, 1995).

1.3.1 Pré-condicionamento com NMDA

O TCE também pode induzi a morte apoptótica assim como a morte

necrótica da célula, e ambos os tipos de morte podem ser modulados

farmacologicamente. Estas modulações farmacológicas conduzem à avaliação de

numerosas estratégias para a neuroproteção cerebral, incluindo inibidores de

canais ionicos, corticosteróides, antioxidantes, antagonistas dos receptores do

glutamato, antagonistas dos receptores opióides, assim como vários moduladores

antiinflamatórios. Recentemente foi demostrado que a apoptose foi reduzida

usando um inibidor da caspase-3, levando assim a uma melhora e prevenção dos

déficits neurológica após o TCE (Yakovlev, et al., 1997), fornecendo bases para o

desenvolvimento de estratégias para neuroproteção no TCE. Há outras estratégias

farmacológicas que contribuem para o entendimento dos mecanismos celulares

envolvidos no dano desencadeado pelo TCE. Algumas destas estratégias de

neuroproteção utilizam antagonistas de receptores NMDA contra os danos

causados pelo TCE (Faden et al., 1989; Temple et al., 2001).

Outra linha de evidência demonstra que o uso de agonistas em baixíssimas

doses, em que a toxicidade estaria bem abaixo do limiar de dano, pode induzir

tolerância nas células contra danos glutamatérgicos. O NMDA e o glutamato

podem atuar como agentes de pré-condicionamento químicos para melhorar

significativamente o dano isquêmico (Schurr et al., 2001) em fatias de hipocampo,

como em cultura de células (Xu et al., 2002) e in vivo (Boeck et al., 2004). Assim a

administração de doses sub-convulsivas de NMDA via intraperitoneal tem sido

utilizada como modelo de pré-condicionamento químico in vivo frente a diversos

insultos letais posteriores (Ogita et al., 2003; Boeck et al., 2004).

O pré-condicionamento diminui a prevalência de morte celular decorrente

de alguma lesão (Murry et al., 1990). Estudos estratégicos de pré-

condicionamento como isquemia (Chen & Simon, 1997), hipóxia (Pugliese et al.,

2003) e hipotermia (Nisho et al., 2000) resultaram em proteção contra o dano

isquêmico subseqüente.

Vários dados experimentais demonstram que o aumento extracelular de

glutamato aumenta a atividade do receptor NMDA tornando-o um importante

mediador da excitotoxidade após o trauma. As doenças que acometem o SNC

apresentam em comum uma exacerbação na transmissão mediada pelo

neurotransmissor glutamato, que está associado à gênese de quadros patológicos

agudos (TCE, isquemia cerebral e convulsões) e crônico-degenerativos (doenças

de Alzheimer, Huntington, escleroses). O estudo de vias celulares que possam

modular a transmissão glutamatérgica é de fundamental importância para a

compreensão do desenvolvimento de mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos

no SNC. Tendo em vista o papel protetor do pré-condicionamento com NMDA,

entende-se que este mecanismo possua funções preventivas ao SNC e/ou de

manutenção contra neuropatologias, neste estudo o TCE, que envolvam o sistema

glutamatérgico.

2. O

BJETIVOS

2.1. Geral:

Verificar a presença de dano celular no cérebro de camundongos submetidos ao

modelo de traumatismo crânio encefálico com ou sem o pré-tratamento com

NMDA, e os efeitos sobre a atividade locomotora.

2.2. Específicos:

2.2.1 Verificar possíveis alterações de dano celular no córtex frontal e cerebelo

dos animais pré-condicionados com NMDA e submetidos ao TCE.

2.2.2 Verificar a coordenação motora em camundongos pré-condicionados ou não

com NMDA e expostos ao traumatismo crânio encefálico.

2.2.3 Avaliar o conteúdo das subunidades NMDA (NR1, NR2a, NR2b) em cerebelo

de camundongos submetidos ao TCE e pré-condicionados com NMDA.

CAPITULO 1

3 METODOS E RESULTADOS

3.1 Artigo

Conforme resolução 01/2007 do PPGCS, parte dos resultados está apresentada

na forma de artigo cientifico, submetido para publicação no periódico Journal of

Neurotrauma.

NMDA preconditioning improves short and long-term motor deficits outcome

after diffuse traumatic brain injury

Tayana Costa, Leandra C. Constantino, Bruna M. Pescador, Bruno Herculano,

Carla I. Tasca, Carina R. Boeck

Laboratório de Neurociências, Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul

Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brasil;

Corresponding author: Prof. Carina R. Boeck, M.Sc., Ph. D – Laboratório de

Neurociências, PPGCS, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000

Criciúma, SC, Brasil. Phone: #55 48 3431 2759. E- mail: [email protected]

Abstract

Traumatic brain injury (TBI) causes impairment of fine motor functions in humans

and non-human mammalians that often persists for months after the injury occurs.

Neuroprotective strategies for prevention of the sequelae of TBI and understanding

the molecular mechanisms and cellular pathways are related to the glutamatergic

system. It has been suggested that cellular damage subsequent to TBI is mediated

by the excitatory neurotransmitters, glutamate, and aspartate, through the

excessive activation of the N-methyl D-aspartate (NMDA) receptors. Thus,

preconditioning with low dose of NMDA was used as a strategy for protection

against locomotor deficits observed following TBI in mice. Male adult mice CF-1

were preconditioned with NMDA (75 mg/kg) 24 hours before the TBI induction.

Under anesthesia with O

O (33%: 66%) inhalation, the animals were submitted

to the experimental model of trauma that occurs by the impact of a 50g weight on

the skull. Sensorimotor gating was evaluated using fore- and hindlimb footprints

and rotarod at 1.5, 6, or 24 hours following TBI. Cellular damage also was

assessed 24 hours after cortical trauma. Mice preconditioned with NMDA were

protected against all motor deficits revealed by footprint tests, but not those

observed in rotarod tasks. Although mice showed motor deficits after TBI, no

cellular damage was observed after TBI. These data corroborate the hypothesis

that glutamatergic excitotoxicity, especially via NMDA receptors, contributes to

severity of trauma. They also point to a putative neuroprotective mechanism

induced by a sub-lethal dose of NMDA to improve motor behavioral deficits after

TBI.

Key-words: NMDA preconditioning; neuroprotection; trauma brain injury; motor

behavior.

Introduction

The cellular damage following trauma brain injury (TBI) constitutes a

dynamic pathophysiologic process of the brain because of the combination of

primary (unavoidable damage, occurs at the time of injury) with secondary damage

(avoidable damage, occurs at variable times after injury). The severity of

secondary injury level over time depends on the degree of mechanical impact

(Katz et al., 2004; Ucar et al., 2006) which can be classified as mild, moderate or

severe (Fujimoto et al., 2004; Ucar et al., 2006). The cascade of events

subsequent to the acute brain injury includes glutamatergic excitotoxicity (Bernert

and Turski, 1996) leading to impairment of synaptic plasticity, modulation of N-

methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity and contents (Miller et al., 1990;

Schumann et al., 2008), and persistent cognitive-, sensory-, and motor dysfunction

(Fujimoto et al., 2004). Excitotoxicity induced by glutamates involves at least in part

intracellular Ca

level elevation through excessive activation of NMDA receptors

(Choi, 1988). NMDA receptor antagonists have been used as neuroprotective

agents in TBI in clinical trials (Willis et al., 2004) and animal models (Bernert and

Turski, 1996; Pohl et al., 1999; Kuo et al., 2007). However, human trials of NMDA

receptor antagonists have no shown positive effect on clinical outcomes or

intolerance side effects, because a persistent blockade of glutamate receptors

impairs trophic effects of glutamate, which are responsible for the reorganization of

neural cells after occurrence of the brain injury (Muir and Lees, 1995).

Despite the well-known neurotoxic mechanisms blocked by NMDA receptor

antagonists, NMDA agonists can evoke a neuroprotective action (Sei et al., 1998;

Damschroder-Williams et al., 1995; Jonas et al., 2001). Several studies have

shown that preconditioning evokes protection against brain damage induced by

ischemia (Kitagawa et al., 1991; Pagliaro et al., 2001; Ferguson et al., 2008),

seizures (Sasahira et al., 1995), and closed head injury (Shein et al., 2005). NMDA

preconditioning is a “chemical preconditioning” state evoked by sub-toxic

concentrations of NMDA that induces a tolerance state to a subsequent lethal

event (Rejdak et al., 2001). NMDA preconditioning is protective against injury

induced by kainate (Ogita et al., 2003) and seizures (Boeck et al., 2004;

Vandresen-Filho et al., 2007) in vivo; also by glutamates (Chuang et al., 1992;

Marini et al., 1998; Boeck et al., 2005) or oxygen- and glucose-deprivation (Grabb

et al., 1999) or both stimuli (Lin et al., 2008) in vitro. Cellular damage and long-term

behavior deficits associated with TBI can be activated by an excitotoxic mechanism

triggered by secondary hypoxia (Saatman et al., 2008). NMDA receptors

participate in neuroprotection evoked by hypoxia preconditioning (Tauskela et al.,

2003), but only a few studies have analyzed behavioral parameters after

preconditioning (Boeck et al., 2005; Rybnikova et al., 2005). Thus, the aim of the

present study is investigate NMDA preconditioning as a strategy against

sensorimotor deficits after TBI caused by diffuse trauma in an animal model.

Methodology

Animals: Male CF-1 mice (2-3 months, 30-35 g) were obtained from our breeding

colony (UNESC). The animals were housed six to cage with food and water

available ad libitum and were maintained on a 12-h light/dark cycle (lights on at

7:00 a.m.). All experimental procedures involving animals were performed in

accordance with the National Institute of Heath’s Guide for the Care and Use of

Laboratory Animals and the recommendations of the Brazilian Society for

Neuroscience and Behavior (SBNeC) for animal care, designed to minimize

suffering and limit the number of animals used. Animals were used only once and

to avoid circadian variations all experiments were carried out between 8:00 a.m.

and 4:00 p.m. This study was approved by the local ethics committee (Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade do Extremo Sul Catarinense, n° 776/2007).

Treatment with NMDA: Animals were pretreated intraperitoneally (i.p.) with NMDA

with a low nonconvulsant dose (75 mg/kg, 10 mL/kg) or vehicle (saline, 0.9% NaCl,

w/v) 24 hours before cortical trauma injury induction (Ferre et al., 1994). NMDA

was dissolved in saline and pH adjusted to 7.4 with NaOH. Mice were housed in

acrylic boxes (25x25x25 cm) and were observed for 30 min immediately after

NMDA administration for occurrence of behavioral alterations (Boeck et al., 2004).

Diffuse Traumatic Brain Injury: A diffuse TBI was produced using the closed

head weight-drop method previously described (Adelson et al., 1996) with minor

modifications. The trauma apparatus consists of a metal tube, 1 m length and 10

mm inner diameter, attached to a ring stand. The mice, anesthetized by inhalation

with a mixture of O

O (33%:66%) led through a mask, were placed on a loosely

fixed foam bed with their heads slightly elevated to avoid spinal cord damage.

A brass weight of 50 g with concentric grooves on its face fell downward freely

from a cm height of 80. Just after impact, the foam bed with the animal was slid out

from under the tube to prevent a second impact to it on recoil. After trauma, the

mice received supporting oxygenation with 100% O2 until they were fully awake

(approximately one minute) and were then brought back to their cages. The extent

of posttraumatic sensorimotor impairment was assessed at defined time intervals

after trauma (t = 1.5h, 6h, and 24h), as described below. At corresponding time-

points mice were euthanized for subsequent analysis of extracted brain

hemispheres.

Sensorimotor Evaluation: Two tests of fore- and hind limb coordination, balance,

and sensorimotor gating are reported here in accordance with previous studies; the

performance of the animals was analyzed 1.5h, 6h, and 24h had lapsed after the

TBI occurred (Bristow, et al., 1996). All animals were trained immediately before

NMDA administration, and each mouse was evaluated individually for one period of

analysis after TBI for two tests: first, the animal was submitted to a footprint test

and later to rotarod test. The animals were divided into groups in accordance with

the treatments that were to be administered (5-9 mice per group per time = total of

93 animals): SAL = saline i.p. + anesthesia (control); NMDA = NMDA i.p. +

anesthesia; TBI = saline i.p. + trauma; NMDA + TBI = NMDA i.p. + trauma.

Footprint: To assess the motor coordination and gaiting (instability of posture,

incoordination, tremor, dysmetria, and impairment of fine control of movements) we

used a footprint test as previously described (Carter et al., 1999). To obtain

footprints, the hind- and forefeet of the mice were coated with black and red

nontoxic paints, respectively. The animals were then allowed to walk along a 40-

cm-long, 8-cm-wide runway into an enclosed box with 20-cm-high walls on either

side (Dietrich et al., 2005). All mice had three training runs and a fresh sheet of

white paper was placed on the floor of the runway for each run. The footprint

patterns were analyzed for four-step parameters (all measured in centimeters).

Stride length = the average distance measured of forward movement between

each stride; forelimb width = the average distance measured between left- and

right front footprints; hind limb width = the average distance measured between

left- and right hind footprints. These values were determined by measuring the

perpendicular distance from a given step to a line connecting its opposite

preceding- and succeeding steps. Step alternation = the average distance

measured from left- or right front footprint/hind footprint overlap. When the center

of the hind footprint fell on top of the center of the preceding front footprint, a value

of zero was recorded. When the footprints did not overlap, the distance between

the center points of the footprints was recorded. For each step parameter, three

values were measured from each run, excluding footprints made at the beginning-

and end of the run where the animal was initiating- and finishing movement,

respectively. The mean value of each set of three values was used. Total time and

velocity of movements in three trials of maximum 2 min each were recorded by

blind observer 24h after TBI.

Rotarod: In the rotarod apparatus (Insight Equipments, Ribeirão Preto, Brazil) all

mice were habituated to running (3.7 cm in diameter, 12 rpm) until they could

remain there for up to 60 s without falling for 8 trials with intervals of 10 min. In

tests during daytime/periods the mouse was provoked to run in a rotarod for up to

60 s without falling for 3 trials (Dunham and Miya, 1957). The mean latency to fall

off the rotarod and the number of falls was recorded.

Cellular damage evaluation: Immediately after sensorimotor performance, mice

were sacrificed by decapitation; their cerebral cortices and cerebellum were

dissected, rapidly frozen, and stored at −80 °C unt il measurement of the DNA

damage, or were immediately prepared for cellular viability assessment by MTT

reduction assay.

Cellular viability: Cell survival following TBI was measured by dehydrogenase

activities to reduce MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide] (Mosmann, 1983; Liu et al., 1997). The tetrazolium ring of MTT was

cleaved by various dehydrogenase enzymes into viable cells, and then precipitated

as a blue formazan product. The cerebral cortex and cerebellum were cut into 400

µm thick transversal slices with a McIlwain tissue chopper, followed by transfer of

the sections to phosphate-buffered saline supplemented with 0.6% glucose (pH

7.4), and were separated into individual slices. Two slices from each cerebral

structure were incubated with MTT (0.5 mg/mL) in PBS buffer for 20 min at 37 °C.

The medium was aspirated, the precipitated formazan solubilized with dimethyl

sulfoxide, and the viable cells quantified spectrophotometrically at a wavelength of

550 nm. Variability due to differences in slice size was found minimal.

DNA fragmentation: DNA fragmentations were evaluated 24 h after TBI induction

in mice with- or without preconditioning treatment. Ten to 20 mg of cerebral cortex

or cerebellum tissue was used for DNA extraction. The tissue was homogenized in

a lysis buffer (GenomicPrep™, GE Healthcare) followed by incubation for 1 h at 65

°C. Proteins and RNA were digested with proteinase K (Sigma, 100 µg/ml) and

RNAse (Sigma, 20 µg/ml), at 55 °C for 12 h and at 37 °C for 1 h, resp ectively.

Proteins and RNA were then precipitated by centrifugation of the samples at

16,000g for 15min at 4 °C. DNA was precipitated for 12 h with 100% isopropanol at

4 °C and 70% ethanol. Centrifuged samples (correspo nding to 40 µg DNA) were

then submitted to a 2% agarose gel electrophoresis with ethidium bromide (100

µg/ml) and visualized in UV light (Yang and Paul, 1997).

Statistical analysis: Results were analyzed with STATISTICA version 7.0

software (StatSoft, Inc., USA). All data are presented as mean values ± SEM

(standard error of the mean), and the parameter of the normality was fulfilled by

Shapiro-Wilk test. Each value reflects the mean of 6 to 9 animals per group for

behavioral parameters or the mean of 3 to 6 animals per group for cellular viability

analysis. In all cases, statistical analyses were analyzed employing two-way

analysis of variance (ANOVA) with NMDA pre-treatment and TBI as the main

factors, followed by the Fisher LSD test for behavioral analysis. The level of

significant difference was accepted at P < 0.05.

Results

All parameters were analyzed at 1.5h, 6h, or 24h following TBI, with the

exception of cellular viability assays, which were analyzed only after 24h of TBI.

The brain samples from mice submitted to TBI presented no signs of external

damage to the cerebral cortex 24h after trauma, no hemorrhages in the

periventricular white matter below the cortex, and no apparent distortion of the

inner structures. All mice that suffered trauma survived the procedure. In all groups

of animals, the impact did not induce any DNA damage in the cerebral cortex

(impact area) or in the cerebellum (distant area) (Fig. 1). Besides, pretreatment

with NMDA or TBI did not alter the cellular viability as measured by MTT assay 24

h after trauma (Table 1, P>0.05 in all cases).

Assessment of motor coordination was performed to evaluate motor

damage caused by TBI. All mice were trained immediately before pretreatment

with NMDA for analysis of gait performance in the footprint test and were tested at

1.5h, 6h, or 24h after TBI. Sensorimotor behavioral tests revealed uncoordinated

movements in traumatic mice when compared to control mice (SAL); however,

preconditioning with NMDA prevented the distortion of gait for all parameters of

mice showed deficits. The irregular stride length (SL) and hind limb stride (HLS)

observed in mice at 1.5h after TBI were prevented in preconditioned mice

(1,27)

=1.662, P<0.001, and F

(1,28)

=3.323, P<0.05; respectively) (Fig. 2A and C).

Qualitatively, the generated patterns clearly differed showing that TBI mice display

irregularly spaced shorter strides as compared with evenly spaced and accurately

positioned footprints of SAL mice (Fig. 2E). The measure of percentage of

movements in relation of SAL mice demonstrated clearly the significant preventive

effect of preconditioning in the coordination deficit displayed by traumatic mice

(1,27)

=1.797, P<0.001 for SL; F

(1,28)

=2.468, P<0.05 for HLS) (Fig 5A). The

distortion of gait appearing in stride length (SL) defects was observed up to 6h

following traumatic injury to the cortex demonstrated in the mean of individual

measures (F

(1,28)

=5.698, P<0.05) (Fig. 3A) and in percentage of SAL group (Fig. 5)

with significant amelioration in mice preconditioned with NMDA (F

(1,28)

=5.986;

P<0.05). In the same period, mice revealed loss of rhythm coordination after TBI in

the form of deficits in step alternation (SA) (Fig. 3C and 5C) that were prevented by

NMDA treatment (F

(1,30)

=11.643; P<0.001). Long-term sensorimotor coordination

deficits were observed 24h after TBI in mice, who showed defects in forelimb stride

(FLS) (F

(1,26)

=0.153; P<0.05), hind limb stride (HLS) (F

(1,26)

=1.173; P<0.05), and

step alternation (SA) (F

(1,26)

=2.872; P<0.05) (Fig. 4 and 5). Animals preconditioned

with NMDA and submitted to TBI did not display forelimb or hind limb stride

defects. Twenty four hours after TBI all mice spent the same time for run in the

runway and also, the velocity to cover was the same among the groups (Table 2;

P>0.05 in all cases).

The mice were tested on rotarod at 1.5h, 6h, or 24h following traumatic

injury with or without treatment with NMDA (Fig. 6). The TBI mice were not able to

stay on the rotarod as evaluated 1.5h after TBI, independent of treatment with

NMDA when compared to the SAL group (F

(3,24)

=4.940; P<0.001 for 1.5h) (Fig.

6A). Interestingly, while SAL mice showed an improvement in rotarod performance

after 6h, all traumatic animals entirely failed to show motor learning and falling

more than SAL mice did (F

(1,22)

=0.113; P<0,05) with a nonsignificant tendency to

stay less time on rotarod (F

1,22)

=0.084; P=0.057). When 24h had lapsed after TBI,

rotarod performance was found not altered in all groups of animals.

Discussion

The present study reports a neuroprotective effect of NMDA preconditioning

against sensorimotor deficits in traumatic injury to the cortex of mice. Some

preliminary conclusions about severity of trauma can be drawn from the lack of

cellular damage and the absence of focal lesions of TBI mice. It is clear that

trauma to the cortex did not induce cellular damage or animal death after lapse of

24h, which could indicate a mild brain trauma, such as previously reported for

diffuse brain injury (Foda and Marmarou, 1994). However, mild trauma motor and

learning deficits, such as those observed in this study, are also observed in

humans (Kashluba et al., 2008) and in animal models (Milman et al., 2005).

Glutamatergic excitotoxicity is involved in several injuries related to the

brain including TBI. NMDA receptor antagonists have been used with significant

success against Alzheimer dementia (Farlow et al., 2008), but against trauma

injury its use is still being discussed (Muir, 2006). NMDA preconditioning is an

experimental strategy to evaluate a mechanism of protection that activates

expressive protective signaling pathways in the cells (Jiang et al., 2003; Soriano et

al., 2006). TBI can induce necrotic- and apoptotic cellular death (Raghupathi, 2004;

Wong et al., 2005) following primary- or secondary damage with participation of

glutamatergic excitotoxicity (Faden et al., 1989), a mechanism of neural death

which can be prevented by NMDA preconditioning (Ogita et al., 2003; Boeck et al.,

2004). Preventive intervention could be an important protective strategy against

unavoidable injury induced by brain surgery (Jadhav et al., 2007), but the present

study also explores a method to contribute to the overall functional improvement

over TBI. In ischemia, studies of preconditioning have contributed to knowledge of

the disease and perspectives of treatment (Billinger et al., 1999; Vohra and

Galiñanes, 2006).

The present data showed that the neuroprotection evoked by low activation

of glutamatergic system through NMDA preconditioning was efficient against

sensorimotor deficits displayed by traumatic mice in a model of diffuse trauma.

These data are in accordance with the clinical observations that show motor

deficiencies after moderate TBI (Adelson et al., 1997; Piot-Grosjean et al., 2001).

The TBI in mice evoked a synchronous bilateral contraction of both fore- and hind

limb extensors since the distance measured between left/right and right/left hind

footprints were prevented by NMDA preconditioning. Cerebellar ataxia is

characterized by instability of posture and gait, incoordination, tremor, dysmetria,

muscular hypotonia, and impairment of fine control of movements (Grusser-

Cornehls and Baurle, 2001). The lack of balance and deficits in movements involve

many areas of the brain that may have suffered injury following TBI, such as the

motor association cortex and the cerebellum. This latter observation is particularly

interesting, since the impact on the brain of the animal probably led to functional

cortical- and cerebellar deficits without affecting its viability, which could contribute

to their recovery verified by the rotarod test.

NMDA preconditioning induces pro-survival signaling and provides

protection against cellular damage after brain injuries such as seizures and

ischemia (Boeck et al., 2004; Saleh et al., 2009). Recently, a study showed that

controlled closed head injury (CHI) changes the content of NMDA receptor

subunits in the cortex and hippocampus (Schumann et al., 2008). The authors

suggest that the decrease in NR1, NR2A, and NR2B observed in the cortex (local

impact) could be due to neuronal death, since they observed an increased

phosphorylation of NR2B on Y1472, which stabilizes the receptors on the cell

surface (Roche et al., 2001). If our results were due to the same alteration on

NMDA receptors after TBI, probably NMDA preconditioning was preventing it.

However, is important to note that the mechanisms triggered by NMDA

preconditioning involve other intracellular proteins beyond NMDA receptors. In

cultured neurons, NMDA preconditioning has been shown to result in no alteration

in specific [

H]MK-801 binding (Damschroder-Williams et al., 1995), and its

protective effects are blocked in presence of the protein synthesis inhibitor

cyclohexamide (Marini et al., 1992) showing the dependence on new proteins to

the neuroprotective effects of preconditioning.

Altogether, NMDA preconditioning leads to tolerance against functional

sensorimotor deficits induced by TBI in mice. This apart, it is probable that the

trauma subjected was mild because cellular damage was not observed and mice

recovered motor uncoordination when evaluated after 24h in rotarod. NMDA

preconditioning is a chemical mechanism leading to cell resistance that could be

investigated to point to new strategies to protect the brain from trauma injury.

Acknowledgements: This work was supported by funds from the Brazilian

National Council Research (CNPq grants, n° 478249/2 006-3 and FAPESC grants,

n° 12348/2007-0 to CRB) and UNESC.

References

Adelson PD, Dixon CE, Robichaud P and Kochanek PM. (1997). Motor and cognitive

functional deficits following diffuse traumatic brain injury in the immature rat. J

Neurotrauma. 14:99-108.

Adelson PD, Robichaud P, Hamilton RL and Kochanek PM. (1996). A model of diffuse

traumatic brain injury in the immature rat. J Neurosurg. 85:877-884.

Bernert H and Turski L. (1996). Traumatic brain damage prevented by the non-N-

methyl-D-aspartate antagonist 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo[f]

quinoxaline. Proc Natl Acad Sci U S A. 93:5235-5240.

Billinger M, Fleisch M, Eberli FR, Garachemani A, Meier B and Seiler C. (1999). Is the

development of myocardial tolerance to repeated ischemia in humans due to

preconditioning or to collateral recruitment? J Am Coll Cardiol. 33:1027-1035.

Boeck CR, Ganzella M, Lottermann A and Vendite D. (2004). NMDA preconditioning

protects against seizures and hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic

acid in mice. Epilepsia. 45:745-750.

Boeck CR, Kroth EH, Bronzatto MJ and Vendite D. (2005). Adenosine receptors co-

operate with NMDA preconditioning to protect cerebellar granule cells against

glutamate neurotoxicity. Neuropharmacology. 49:17-24.

Bristow LJ, Flatman KL, Hutson PH, Kulagowski JJ, Leeson PD, Young L and

Tricklebank MD. (1996). The atypical neuroleptic profile of the glycine/N-methyl-

D-aspartate receptor antagonist, L-701,324, in rodents. J Pharmacol Exp Ther.

277:578-585.

Carter RJ, Lione LA, Humby T, Mangiarini L, Mahal A, Bates GP, Dunnett SB and

Morton AJ. (1999). Characterization of progressive motor deficits in mice

transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19:3248-

3257.

Choi DW. (1988). Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron.

1:623-634.

Chuang DM, Gao XM and Paul SM. (1992). N-methyl-D-aspartate exposure blocks

glutamate toxicity in cultured cerebellar granule cells. Mol Pharmacol. 42:210-

216.

Damschroder-Williams P, Irwin RP, Lin SZ and Paul SM. (1995). Characterization of the

excitoprotective actions of N-methyl-D-aspartate in cultured cerebellar granule

neurons. J Neurochem. 65:1069-1076.

Dietrich MO, Mantese CE, Anjos G, Souza DO and Farina M. (2005). Motor impairment

induced by oral exposure to methylmercury in adult mice. Environ. Toxicol.

Pharmacol. 19(1), 169-175.

Dunham NW and Miya TS. (1957). A note on a simple apparatus for detecting

neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Assoc Am Pharm Assoc

(Baltim). 46:208-209.

Faden AI, Demediuk P, Panter SS and Vink R. (1989). The role of excitatory amino

acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science. 244:798-800.

Farlow MR, Graham SM and Alva G. (2008). Memantine for the treatment of Alzheimer's

disease: tolerability and safety data from clinical trials. Drug Saf. 31:577-585.

Ferguson AL and Stone TW. (2008). Adenosine preconditions against ouabain but not

against glutamate on CA1-evoked potentials in rat hippocampal slices. Eur J

Neurosci. 28:2084-2098.

Ferre S, Gimenez-Llort L, Artigas F and Martinez E. (1994). Motor activation in short-

and long-term reserpinized mice: role of N-methyl-D-aspartate, dopamine D1 and

dopamine D2 receptors. Eur J Pharmacol. 255:203-213.

Foda MA and Marmarou A. (1994). A new model of diffuse brain injury in rats. Part II:

Morphological characterization. J Neurosurg. 80:301-313.

Fujimoto ST, Longhi L, Saatman KE, Conte V, Stocchetti N and McIntosh TK. (2004).

Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain

injury. Neurosci Biobehav Rev. 28:365-378.

Grabb MC and Choi DW. (1999). Ischemic tolerance in murine cortical cell culture:

critical role for NMDA receptors. J Neurosci. 19:1657-1662.

Grusser-Cornehls U and Baurle J. (2001). Mutant mice as a model for cerebellar ataxia.

Prog Neurobiol. 63:489-540.

Jadhav V, Solaroglu I, Obenaus A and Zhang JH. (2007). Neuroprotection against

surgically induced brain injury. Surg Neurol. 67:15-20; discussion 20.

Jiang X, Zhu D, Okagaki P, Lipsky R, Wu X, Banaudha K, Mearow K, Strauss KI and

Marini AM. (2003). N-methyl-D-aspartate and TrkB receptor activation in

cerebellar granule cells: an in vitro model of preconditioning to stimulate intrinsic

survival pathways in neurons. Ann N Y Acad Sci. 993:134-145; discussion 159-

160.

Jonas W, Lin Y and Tortella F. (2001). Neuroprotection from glutamate toxicity with ultra-

low dose glutamate. Neuroreport. 12:335-339.

Kashluba S, Hanks RA, Casey JE and Millis SR. (2008). Neuropsychologic and

functional outcome after complicated mild traumatic brain injury. Arch Phys Med

Rehabil. 89:904-911.

Katz DI, White DK, Alexander MP and Klein RB. (2004). Recovery of ambulation after

traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 85:865-869.

Kitagawa K, Matsumoto M, Kuwabara K, Tagaya M, Ohtsuki T, Hata R, Ueda H, Handa

N, Kimura K and Kamada T. (1991). 'Ischemic tolerance' phenomenon detected

in various brain regions. Brain Res. 561:203-211.

Kuo JR, Lo CJ, Chio CC, Chang CP and Lin MT. (2007). Resuscitation from

experimental traumatic brain injury by agmatine therapy. Resuscitation. 75:506-

514.

Lin CH, Chen PS and Gean PW. (2008). Glutamate preconditioning prevents neuronal

death induced by combined oxygen-glucose deprivation in cultured cortical

neurons. Eur J Pharmacol. 589:85-93.

Liu Y, Peterson DA, Kimura H and Schubert D. (1997). Mechanism of cellular 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J

Neurochem. 69:581-593.

Marini AM and Paul SM. (1992). N-methyl-D-aspartate receptor-mediated

neuroprotection in cerebellar granule cells requires new RNA and protein

synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 89:6555-6559.

Marini AM, Rabin SJ, Lipsky RH and Mocchetti I. (1998). Activity-dependent release of

brain-derived neurotrophic factor underlies the neuroprotective effect of N-methyl-

D-aspartate. J Biol Chem. 273:29394-29399.

Miller LP, Lyeth BG, Jenkins LW, Oleniak L, Panchision D, Hamm RJ, Phillips LL, Dixon

CE, Clifton GL and Hayes RL. (1990). Excitatory amino acid receptor subtype

binding following traumatic brain injury. Brain Res. 526:103-107.

Milman A, Rosenberg A, Weizman R and Pick CG. (2005). Mild traumatic brain injury

induces persistent cognitive deficits and behavioral disturbances in mice. J

Neurotrauma. 22:1003-1010.

Mosmann T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65:55-63.

Muir KW. (2006). Glutamate-based therapeutic approaches: clinical trials with NMDA

antagonists. Curr Opin Pharmacol. 6:53-60.

Muir KW and Lees KR. (1995). Clinical experience with excitatory amino acid antagonist

drugs. Stroke. 26:503-513.

Ogita K, Okuda H, Yamamoto Y, Nishiyama N and Yoneda Y. (2003). In vivo

neuroprotective role of NMDA receptors against kainate-induced excitotoxicity in

murine hippocampal pyramidal neurons. J Neurochem. 85:1336-1346.

Pagliaro P, Gattullo D, Rastaldo R and Losano G. (2001). Ischemic preconditioning:

from the first to the second window of protection. Life Sci. 69:1-15.

Piot-Grosjean O, Wahl F, Gobbo O and Stutzmann JM. (2001). Assessment of

sensorimotor and cognitive deficits induced by a moderate traumatic injury in the

right parietal cortex of the rat. Neurobiol Dis. 8:1082-1093.

Pohl D, Bittigau P, Ishimaru MJ, Stadthaus D, Hubner C, Olney JW, Turski L and

Ikonomidou C. (1999). N-Methyl-D-aspartate antagonists and apoptotic cell death

triggered by head trauma in developing rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A.

96:2508-2513.

Raghupathi R. (2004). Cell death mechanisms following traumatic brain injury. Brain

Pathol. 14:215-222.

Rejdak R, Rejdak K, Sieklucka-Dziuba M, Stelmasiak Z and Grieb P. (2001). Brain

tolerance and preconditioning. Pol J Pharmacol. 53:73-79.

Roche KW, Standley S, McCallum J, Dune Ly C, Ehlers MD and Wenthold RJ. (2001).

Molecular determinants of NMDA receptor internalization. Nat Neurosci. 4:794-

802.

Rybnikova E, Vataeva L, Tyulkova E, Gluschenko T, Otellin V, Pelto-Huikko M and

Samoilov MO. (2005). Mild hypoxia preconditioning prevents impairment of

passive avoidance learning and suppression of brain NGFI-A expression induced

by severe hypoxia. Behav Brain Res. 160:107-114.

Saatman KE, Duhaime AC, Bullock R, Maas AI, Valadka A and Manley GT. (2008).

Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. J Neurotrauma.

25:719-738.

Saleh MC, Connell BJ and Saleh TM. (2009). Ischemic tolerance following low dose

NMDA involves modulation of cellular stress proteins. Brain Res. 1247:212-220.

Sasahira M, Lowry T, Simon RP and Greenberg DA. (1995). Epileptic tolerance: prior

seizures protect against seizure-induced neuronal injury. Neurosci Lett. 185:95-

98.

Schumann J, Alexandrovich GA, Biegon A and Yaka R. (2008). Inhibition of NR2B

phosphorylation restores alterations in NMDA receptor expression and improves

functional recovery following traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma.

25:945-957.

Sei Y, Fossom L, Goping G, Skolnick P and Basile AS. (1998). Quinolinic acid protects

rat cerebellar granule cells from glutamate-induced apoptosis. Neurosci Lett.

241:180-184.

Shein NA, Horowitz M and Shohami E. (2007). Heat acclimation: a unique model of

physiologically mediated global preconditioning against traumatic brain injury.

Prog Brain Res. 161:353-363.

Soriano FX, Papadia S, Hofmann F, Hardingham NR, Bading H and Hardingham GE.

(2006). Preconditioning doses of NMDA promote neuroprotection by enhancing

neuronal excitability. J Neurosci. 26:4509-4518.

Tauskela JS, Brunette E, Monette R, Comas T and Morley P. (2003). Preconditioning of

cortical neurons by oxygen-glucose deprivation: tolerance induction through

abbreviated neurotoxic signaling. Am J Physiol Cell Physiol. 285:C899-911.

Ucar T, Tanriover G, Gurer I, Onal MZ and Kazan S. (2006). Modified experimental mild

traumatic brain injury model. J Trauma. 60:558-565.

Vandresen-Filho S, de Araujo Herculano B, Franco JL, Boeck CR, Dafre AL and Tasca

CI. (2007). Evaluation of glutathione metabolism in NMDA preconditioning against

quinolinic acid-induced seizures in mice cerebral cortex and hippocampus. Brain

Res. 1184:38-45.

Vohra HA and Galinanes M. (2006). Myocardial preconditioning against ischemia-

induced apoptosis and necrosis in man. J Surg Res. 134:138-144.

Willis C, Lybrand S and Bellamy N. (2004). Excitatory amino acid inhibitors for traumatic

brain injury. Cochrane Database Syst Rev.CD003986.

Wong J, Hoe NW, Zhiwei F and Ng I. (2005). Apoptosis and traumatic brain injury.

Neurocrit Care. 3:177-182.

Yang GM, Paul SM. (1997). Cultured cerebellar granule neurons as a model of neuronal

apoptosis. In: Neuromethods. Poirier, J. (ed.). Humana Press Inc. 29, pps. 47–

66.

Figure 1. Evaluation of DNA fragmentation in internucleosomal fractions in brain 24h

after TBI in mice with- or without preconditioning with NMDA. (A) Cerebral cortex and (B)

cerebellum from mice were dissected 24h after TBI and DNA was extracted and DNA

“laddering” visualized in agarose gel electrophoresis with ethidium bromide. The lanes in

the gel are groups of treatments. These gel results are representative of three individual

electrophoresis observations.

Table 1. Percent cellular survival measured 24h after TBI using MTT assay.

SAL NMDA TBI NMDA+TBI P

Cortex 100 ± 25.4 102.6 ± 26 70.1 ± 31.3 69.5 ± 40.5 > 0.05

Cerebellum 100 ± 22 92.5 ± 49 87.5 ± 12.2 87.9 ± 18.3 > 0.05

NMDA was administrated 24h before cortical impact and after 24h the cerebral cortex

and cerebellum from mice were prepared to MTT assay accord to Material and Methods.

Data are presented as mean of percent control

± SD.

Figure 2. Motor performance evaluated in footprint test 1.5h after TBI in mice with- or

without preconditioning with NMDA. Mice received NMDA (75mg/kg) 24 before TBI and

footprint test was assessed 1.5h after trauma. Figures show individual values of mice for

(A) strides length (SL), (B) forelimb strides (FLS), (C) hind limb strides (HLS), (D) step

alternation (SA). (E) The representative walking footprint patterns of mice 1.5h after TBI.

The stride pattern of mice treated with NMDA was omitted because it was similar to that

of the SAL group (control). The line between symbols represents a mean value for each

animal.

P<0.05 compared to SAL group;

P<0.05 compared to NMDA group;

P<0.05

compared to TBI group; two-way ANOVA and post hoc Fisher LSD.

Figure 3. Motor performance evaluated in footprint test 6h after TBI in mice with- or

without preconditioning with NMDA. Mice received NMDA (75mg/kg) 24 before TBI and

footprint test was assessed 6h after trauma. Figures show individual values of mice for

(A) stride length (SL), (B) forelimb strides (FLS), (C) hind limb strides (HLS), (D) step

alternation (SA). The line between symbols represents a mean value for each animal.

P<0.05 compared to SAL group;

P<0.05 compared to NMDA group;

P<0.05

compared to TBI group; two-way ANOVA and post hoc Fisher LSD.

Figure 4. Motor performance evaluated in footprint test 24h after TBI in mice with or

without preconditioning with NMDA. Mice received NMDA (75mg/kg) 24 before TBI and

footprint test was assessed 24h after trauma. Figures show individual values of mice for

(A) strides length (SL), (B) forelimb strides (FLS), (C) hind limb strides (HLS), (D) step

alternation (SA). The line between symbols represents a mean value for each animal.

P<0.05 compared to SAL group;

P<0.05 compared to NMDA group;

P<0.05

compared to TBI group; two-way ANOVA and post hoc Fisher LSD.

Figure 5. Percentage of motor performance evaluated in footprint test after TBI in mice

with- or without preconditioning with NMDA. Mice received NMDA (75mg/kg) 24 before

TBI and footprint test was assessed 1.5h (A), 6h (B), or 24h (C) after trauma. Data are

shown as mean of percent of control ± S.E.M. (7-9 mice/group).

P<0.05 compared to

SAL group;

P<0.05 compared to NMDA group;

P<0.05 compared to TBI group; two-

way ANOVA and post hoc Fisher LSD. SL = strides length; FLS = forelimb strides; HLS

= hind limb strides; SA = step alternation.

Table 2. Performance of mice on runway 24h after TBI.

SAL NMDA TBI NMDA+TBI P

trials 5.0 ± 4.2 10.1 ± 9.9 8.7 ± 3 4.5 ± 2.5

Spent time, s

test 4.5 ± 1.8 16.2 ± 11.8 15.3 ± 13.3 8.9 ± 8.6

> 0.05

trials 14.7 ± 10.6 11.0 ± 7.6 11.4 ± 7.7 13.1 ± 5.2

Velocity,

cm/s test 12.0 ± 2.5 7.9 ± 5.8 7.3 ± 5 12.0 ± 9.6

> 0.05

Mice were trained in three subsequent trails before NMDA administration and were

tested 24h after cortical accord to Material and Methods. Data are presented as mean ±

SD of 6-10 mice.

Figure 6. Motor- and balance performance evaluated in rotarod task after TBI in mice

with- or without preconditioning with NMDA. Mice received NMDA (75mg/kg) 24 before

TBI and (A) latency for the first fall and (B) on the number of falls from the rotarod was

assessed 1.5h (A), 6h (B), or 24h, (C) after trauma. Data are shown as mean of percent

of control ± S.E.M. (7-9 mice/group).

P<0.05 compared to SAL group; two-way ANOVA

and post hoc Fisher LSD.

CAPITULO 2

3.2 METODOS E RESULTADOS ADICIONAIS

3.2.1 Materiais:

Os materiais utilizados incluem o N-metil-D-aspartato (NMDA) adquirido do

laboratório Sigma; anticorpos primários anti-NR1, anti-NR2A e anti-NR2B obtidos do

laboratório Upstate; anticorpos secundários anti-imunoglobulina de camundongo ou

coelho adquiridos do laboratório Sigma. Os demais reagentes utilizados foram obtidos

dos laboratórios Sigma, Amresco e Invitrogen.

3.2.2 Aspéctos Éticos

Todos os procedimentos experimentais foram feitos de acordo com as

recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento

(SBNeC). O Projeto já está aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC; prot. 776/2007).

3.2.3 Animais Experimentais

Os camundos albinos CF1 machos (30-40g) foram mantidos em ambiente

climatizado com água e comida disponíveis. Os nossos protocolos para experimentos

com animais são projetados de maneira que o animal tenha o mínimo de sofrimento

possível e com limite de animais sacrificados.

3.2.4 Tratamento com NMDA

Os animais foram divididos em grupos de pré-tratamento com NMDA (pré-

condicionados) e tratados com solução fisiológica (animais controle de pré-tratamento).

Ainda, os animais que receberam solução fisiológica (NaCl 0,9 g%) ou NMDA

intraperitonialmente (i.p.) foram divididos em grupos de dano cerebral por TCE, como

segue: 1) Salina (salina i.p. + anestesia); 2) NMDA (NMDA i.p. + anestesia); 3) TCE

(salina i.p. + trauma); 4) NMDA + TCE (NMDA i.p. + trauma). Após a administração i.p.

NMDA (75 mg/kg de animal) os animais foram colocados individualmente em caixas de

acrílico (25 x 25 x 25 cm) e foram observados por 30 minutos para a ocorrência de

mudanças comportamentais.

3.2.5 Traumatismo Crânio-Encefálico (TCE)

Vinte e quatro horas após a administração de NMDA os camundongos foram

submetidos ao modelo experimental de TCE em um aparato de queda de peso em

formato de bala, como previamente descrito (Adelson et al., 1996). Os animais foram

anestesiados por inalação com uma mistura de O

O (33%:66%) através de uma

máscara. O animal foi posicionado abaixo de um tubo de acrílico de 80 m fixado a um

suporte de metal com circunferência de 1cm e o dano cerebral pelo impacto foi induzido

pela queda do peso de 50g que corresponde ao trauma moderado. O animal foi fixado a

uma espuma para permitir a deflexão da cabeça após o impacto, pois após o impacto

do peso na cabeça do animal, a espuma foi retirada imediatamente para evitar um

segundo impacto no recuo do peso. Após o trauma cada animal recebeu um suporte de

oxigenação com 100% de O

até estar totalmente desperto. Apesar do elevado risco de

mortalidade decorrente do traumatismo, no presente estudo não houve morte dos

animais pelo TCE. Assim, foram utilizados 24 animais divididos em quatro grupos com

um número de seis animais por grupo.

3.2.6 Separação de Proteínas Por Eletroforese (SDS-PAGE)

Seis horas após o TCE os animais foram mortos por deslocamento cervical para

a retirada do cerebelo. As amostras de cerebelo foram solubilizadas em tampão de

amostra composto por 4% de duodecil sulfato de sódio (SDS), 50 mM de Tris-HCl, 5

mM de EDTA e 8 % de β-mercaptoetanol, pH 6,8; e diluídas em solução de diluição

com 40 % de glicerol, 25 mM de Tris-HCl e azul de bromofenol pH 6,8. As proteínas

foram separadas por SDS-PAGE [eletroforese por gel de poliacrilamida-SDS (sodium

dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)] usando gel de separação com

gradiente de acrilamida (Laemmli, 1970). A concentração da acrilamida no gel de

separação é de 7,5%. O gel de entrada será de 4 % de acrilamida. A amostras foram

aplicadas na quantidade de 30 µg de proteína/poço. A eletroforese foi realizada com

corrente fixa de 40 mA e voltagem máxima de 140 mV (para 2 géis), por

aproximadamente 2 horas. Após a corrida, os géis foram submetidos à

eletrotransferência em tampão 50 Mm de Tris-HCl, 140 mM de glicina e 10 % de

metanol por 1 hora, em corrente de no máximo 100 mA e voltagem de 350 mV a 4 °C,

para transferência das proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose de 0,4 µm

de porosidade (GE Life Science).

3.2.7 Imunodetecção de Proteínas (WESTERN BLOT)

Após a eletrotransferência, as membranas foram bloqueadas por 1 hora com

albumina bovina, em 5 % de TBS (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5) e em

seguida lavadas com TBS-T (0,05 % de Tween-20, 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl,

pH 7,5). As membranas foram incubadas com anticorpos primários contra os receptores

NR1A (1:450), NR2A (1:500) ou NR2B (1:500) por 14-16 horas (overnight). Para a

detecção dos complexos imunes, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T

e os anticorpos secundários (conjugado a peroxidase) anti-mouse (para NR1) e anti-

rabbit (para NR2A e NR2B) foram incubados por 1 hora (1:8000). Após lavagens com

TBS-T a imunodetecção foi revelada por emissão de quimiluminescência com

reagentes luminescentes (GE Life Science), seguindo as recomendações do fabricante,

e impressão de imagem em filme auto-radiográfico. As imagens foram visualizadas em

software para quantificação densitométrica das bandas protéicas (Scion Image, Beta

4.0.2; Scion Corporation, Frederick, MD).

3.2.8 Dosagem de Proteína

As proteínas foram dosadas através do método de Peterson, (1977) descrito

brevemente a seguir. Sobre alíquotas de 2 µl das amostras foram adicionados 398 mL

de água e 400 mL do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH; 2,5% de SDS; 5% de

; 0,2% de CuSO

e 0,1% de tartarato duplo de Na

). As amostras foram

homogeneizadas imediatamente e deixadas para reagir por dez minutos. Em seguida

foi adicionado 200 mL do reagente de Folin 0,4 N seguido de homogeinização e

incubação por 30 minutos. A leitura do complexo de cor foi realizada em

espectrofotômetro (comprimento de onda de 750 nm) e as concentrações protéicas

foram obtidas a partir uma curva-padrão utilizando albumina de soro bovino (BSA; 0,1

mg/mL).

3.2.9 Análise Estatística

Os resultados foram analisados por Two-way ANOVA usando como fatores o

tratamento e o TCE (software STATISTICA 7.0; StatSoft, Inc., USA). Quando o valor de

P foi menor que 0,05 o teste post-hoc Duncan foi utilizado para avaliação das medidas

bioquímicas e moleculares. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da

média da densidade óptica das bandas protéicas.

3.2.10. Resultados

Os camundongos foram pré-condicionados com NMDA e submetidos ao TCE

para avaliação das subunidades do receptor NMDA em amostras de cerebelo seis

horas após o TCE, pois se sabe que o dano secundário já possa estar ocorrendo,

preparadas para identificação das subunidades a partir do Western blot.

Na figura 1 está representada a quantificação da subunidade NR1. Observa-se

uma diminuição do conteúdo da subunidade NR1 no cerebelo dos animais pré-

condicionados com NMDA assim como daqueles submetidos ao TCE, com ou sem pré-

tratamento com NMDA, quando comparado ao grupo controle. Entretanto não houve

nenhuma mudança significativa na subunidade NR2A do receptor NMDA, nos grupos

investigados como representa a figura 2.

Na figura 3 está representada a quantificação da subunidade NR2B. Observa-se

um aumento do conteúdo da subunidade NR2B no cerebelo dos animais pré-

condicionados com NMDA assim como daqueles submetidos ao TCE (com ou sem pré-

tratamento com NMDA) quando comparado ao grupo controle.

Figura 1: Efeito do pré-condicionamento com NMDA e do TCE no conteúdo da

subunidade NR1 do receptor NMDA. As amostras de cerebelo dos camundongos foram

dissecadas 6 horas após o TCE. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e a

imunodetecção dos complexos foi realizada pela técnica de Western blot. Painel

superior: autoradiograma representativo da detecção da subunidade NR1. Painel

inferior: quantificação da imunoreatividade como valores arbitrários de densidade óptica

pelo software Scion Image e estatisticamente comparados com two-way ANOVA, post

hoc Duncan. Os dados expressos como média ± erro padrão da média (n = 5). *P <

0,05, comparado ao grupo controle. CRL = salina i.p. + anestesia; NMDA = NMDA i.p. +

anestesia; TCE = salina i.p. + trauma; NMDA+TCE = NMDA i.p. + trauma.

Figura 2: Efeito do pré-condicionamento com NMDA e do TCE no conteúdo da

subunidade NR2A do receptor NMDA. As amostras de cerebelo dos camundongos

foram dissecadas 6 horas após o TCE. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e

a imunodetecção dos complexos foi realizada pela técnica de Western blot. Painel

superior: autoradiograma representativo da detecção da subunidade NR2A. Painel

inferior: quantificação da imunoreatividade como valores arbitrários de densidade óptica

pelo software Scion Image e estatisticamente comparados com two-way ANOVA, post

hoc Duncan. Os dados expressos como média ± erro padrão da média (n = 5). *P <

0,05, comparado ao grupo controle. CRL = salina i.p. + anestesia; NMDA = NMDA i.p. +

anestesia; TCE = salina i.p. + trauma; NMDA+TCE = NMDA i.p. + trauma.

Figura 3: Efeito do pré-condicionamento com NMDA e do TCE no conteúdo da

subunidade NR2B do receptor NMDA. As amostras de cerebelo dos camundongos

foram dissecadas 6 horas após o TCE. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e

a imunodetecção dos complexos foi realizada pela técnica de Western blot. Painel

superior: autoradiograma representativo da detecção da subunidade NR2B. Painel

inferior: quantificação da imunoreatividade como valores arbitrários de densidade óptica

pelo software Scion Image e estatisticamente comparados com two-way ANOVA, post

hoc Duncan. Os dados expressos como média ± erro padrão da média (n = 5). *P <

0,05, comparado ao grupo controle. CRL = salina i.p. + anestesia; NMDA = NMDA i.p. +

anestesia; TCE = salina i.p. + trauma; NMDA+TCE = NMDA i.p. + trauma.

4 DISCUSSÃO

O glutamato tem um importante papel no mecanismo de excitotoxicidade,

responsável por danos ao cérebro. A carga intracelular de cálcio na excitotoxidade é

ocasionada pela ativação excessiva de receptores NMDA pelo glutamato (Clausen &

Bullock, 2001). Diversos estudos clínicos frente ao monitoramento desses eventos vêm

sendo realizados e poucos com sucesso em relação à neuroproteção e TCE.

De acordo com pesquisas de Gagliard, (2000) doses subtóxicas de NMDA

fornecem um pré-condicionamento químico ao cérebro, que conduz a tolerância celular

a doses tóxicas subseqüentes de agonistas de receptores glutamatérgicos; e que o

objetivo da neuroproteção é fazer com que a cascata patológica se interrompa.

Neste estudo com relação a análise de DNA e MTT não se observou diferenças

significativa entre os grupos Sal; TCE+Sal; NMDA; TCE+NMDA. Talvez esses

resultados possam ser devido ao peso de 50g utilizado refira-se ao trauma moderado a

leve quando comparado com outros modelos de trauma moderado (Leinhase et al.,

2006). Ou devido a indução de neurogenese cerebral após o TCE (Richardson et al.,

2007) ou porque a morte pode ser necrótica e talvez nenhuma das técnicas permita a

avaliação exata.

Nos resultados adicionais deste estudo se observa que o pré-condicionamento

com NMDA 24h antes do trauma proporcionou modificações nas subunidades protéicas

do receptor NMDA. Apesar de a maioria dos estudos sobre essas subunidades NR1,

NR2A e NR2B ainda estarem em andamento sabe-se que essas proteínas estão

envolvidas em processos de neuroproteção por sua especificidade de agonistas e

antagonistas que bloqueiam tais subunidades (LIU et al., 2007).

Neste trabalho observa-se uma diminuição do conteúdo da subunidade NR1 no

cerebelo dos grupos de animais pré-condicionados com NMDA sem trauma, pré-

condicionados com NMDA+TCE e submetidos ao TCE sem pré-condicionamento

quando comparados ao grupo controle. Giza (2006) não observou no córtex, após o

trauma, mudanças nos níveis de NR1 e NR2B. Kreutz et al. (1998) descobriram que a

sobrevivência seguida do trauma axonal do nervo ópico é altamente dependente do

aumento da expressão do NR1. Baseado nestas observações sugere-se que a

subunidade NR1 pode levar a uma diferente composição do receptor NMDA nativo e

diferente resposta na ativação ao glutamato dependendo da sua localização. O NR1 é

uma proteína essencial para a atividade do canal do receptor de NMDA incluindo

agonistas e antagonista, permeabilidade de Ca

, bloqueiam Mg

, modulam a glicina,

ativam a poliamina e inibem Zn

. E são expressas em quase todas as células neurais

(Nakanishi, 1992).

Com relação ao NR2A observa-se neste estudo que não houve nenhuma

mudança significativa nesta subunidade do receptor NMDA no cerebelo 6h após o TCE.

BESSHO et al., (1994) mostraram que a as células cerebelares tornam-se muito

vulneráveis à toxicidade mediada pelo NMDA quando há o aumento dos níveis do

NR2A, reforçada pelo influxo de Ca

mediada pelo receptor. Em contrapartida Lio et

al., (2007) refere que a ativação dos receptores sinápticos ou extrasinápticos de NR2A

promove a sobrevivência neuronal e exerce uma ação neuroprotetora e de encontro a

dano neuronal mediado pelo receptor NMDA observadas igualmente in vivo e in vitro.

Os dados da pesquisa de Giza et al., (2006) sugerem que a redução na expressão de

NR2A no trauma induzido seja um mecanismo provável para a neuroplasticidade.

Estudos de Horak et al., (2008) mostram que a expressão de NR2A é a resonsável pelo

aumento da toxicidade, aumentando a entrada de cálcio então reduzir NR1 e não

alterar NR2A possa estar relacionado com neuroproteção.

Para finalizar, os achados adicionais deste estudo, observa-se nesta pesquisa

que a subunidade NR2B teve um aumento no seu conteúdo em todos os grupos

tratados quando comparado ao grupo controle. Schumann (2008) observou que após o

trauma em ratos a subunidade NR2B estava aumentada no hipocampo, mas no córtex

estava diminuída, associando isto a um aumento na fosforilação da tirosina de NR2B.

Mas as causas do aumento do NR2B ou a diminuição do NR1 no cerebelo ainda não

são conhecidas. A mudança desenvolvida nas subunidades NR2A e NR2B, na

superfície sináptica, foi correlacionada com a mudança no tempo passado por essas

subunidades dentro da superfície sináptica (Grog et al., 2006). Nosso tempo estudado

foi de 6h após o TCE e suas diferentes quantificações de proteínas nesse tempo,

localização cerebral e funções no cerebelo ainda não são sabidas com exatidão.

Apesar das limitações em relação ao tempo da pesquisa e disponibilidades de animais

não se verificou córtex frontal. Mas devido aos resultados encontrados estima-se que

no córtex frontal também possa ter alguma altercação nessas subunidades

considerando que o fármaco NMDA foi sistêmico e que o TCE não foi focal,

necessitando de estudos mais específicos e detalhados sobre o tema complementar.

Para que assim se possam compreender melhor os mecanismos envolvidos nos

prejuízos motores em camundongos expostos ao TCE.

O cerebelo é uma estrutura que esta ligada ao aprendizado motor (Boyden et al.,

2004), regula o sincronismo dos movimentos instruídos (Buonomano & Mauk, 2004) e

equilíbrio dinâmico. Lesão pós trauma no córtex cerebelar interrompe primeiramente a

resposta aos movimentos instruídos (Perrett et al., 1993), podendo levar ao

desequilíbrio e prejuízo motor em diversos tempos. No aprendizado, de seres humanos,

para alcançar a memória motora e executar os movimentos corretos em um campo de

força, deve-se realizar o movimento diversas vezes e em tempos diversos. Tudo isso

antes de se alterar o campo de força para que a memória motora não se torne

resistente à supressão pela aprendizagem de um campo de força novo (Brashers-Krug

et al., 1996; Shadmehr & Brashers-Krug, 1997) ou no caso desta pesquisa o campo

novo estudado seria a avaliação motora após o TCE no rotarod e footprint.

Para esta tarefa, a execução dos movimentos imediatamente depois da

aprendizagem conduz à ativação do córtex frontal, mas nas horas depois que o

treinamento está completo, o cerebelo torna-se ativo durante o desempenho da tarefa

(Shadmehr & Holcomb 1997). Assim o papel do cerebelo pode mudar com o tempo

após a aquisição da aprendizagem, o que é consistente com a noção geral que a

consolidação pode envolver a redistribuição da informação entre partes diferentes do

cérebro, das áreas a curto prazo às áreas a longo prazo (Marr, 1971, Junque, 1999).

Como neste estudo os tempos de verificação da coordenação motora foram de

1h e 30 min e 6h podendo estar estimulando áreas de curto prazo, como o córtex frontal

e 24h ativando o cerebelo, mas essa hipótese não descarta o fato de ambas as

estruturas estarem em constante e incessante atividade.

O córtex frontal agrupa funções motoras, de expressão lingüística, memória e

funções de planejamento mental do comportamento (Lent, 2001). Lesões no córtex

frontal podem levar o individuo a ter crises tônicas, clônicas e espasmos (Manrezza,

2003), assim como déficits cognitivos específicos, como na memória (Schlindwein-

Zanini et al., 2007). Pode-se sugerir que os resultados deste estudo são mediados por

danos em córtex frontal e cerebelo. Onde nessas áreas, a parte relacionada a motora

foi comprometida. Não se descarta também que outras áreas cerebrais tenham sido

afetadas, o fato é que o estudo foi focado na área motora com relação ao cerebelo e

córtex frontal. Não se pode justificar como fato a perda de memória, pois nem um teste

relacionado foi realizado. Mas pode-se pensar que a memória e funções relacionadas

ao planejamento motor e cognitivo tenham sido também afetadas após o trauma.

Mesmo porque o córtex frontal e o cerebelo também podem estar relacionados ao

aprendizado e a memória.

O trauma moderado através de um aparato de queda de peso em formato de um

projétil produziu neste estudo déficit motor nos camundongos. Estes dados estão de

acordo com as observações clínicas que mostram o prejuízo motor do TCE moderado

(Adelson et al., 1997; Piot-Grosjean et al., 2001).

Os resultados desta pesquisa comprovam com o footprint que após o trauma

moderado os prejuízos motores são significativos e que o uso do fármaco NMDA

causou o pré-condicionamento esperado em relação à coordenação motora. Observou-

se diminuição na largura do passo traseiro e no comprimento do passo no grupo TCE

quando comparado com o controle e com o grupo NMDA+TCE. Carter et al. (1999)

observaram em estudos que a largura do passo também estava diminuída em

camundongos transgênicos. Camundongos expostos ao metilmercúrio (MeHg) tiveram

prejuízo motor com relação o footprint devido ao dano cerebelar (Dietrich, et al., (2005).

O comportamento funcional motor, tanto na coordenação, velocidade ou tempo de um

determinado movimento, é afetado nas crianças após TBI moderado ou severo (Kuhtz-

Buschbeck, et al., 2003).

Observou-se que o pré-condicionamento com NMDA foi eficaz e preveniu os

prejuízos motores contra o TCE no footprint. Algumas destas estratégias de

neuroproteção se aproximam com o uso de antagonistas de receptores NMDA (Faden

et al., 1989; Temple et al., 2001). A administração de dose subconvulsivante de NMDA

via intraperitoneal tem sido utilizada como modelo de pré-condicionamento químico

frente a insultos no cerebro (Boeck et al., 2004). Resultados de pesquisas de Bernert &

Turski (1995) indicam que os antagonistas de NMDA possuem melhores propriedades

neuroprotetoras em processos excitotóxicos provocados por ferimentos devido a

traumas no cérebro em ratos jovens quando comparados a ratos adultos. Alguns

estudos em modelo animais de trauma mostraram efeitos benéficos dos antagonistas

do receptor NMDA como por exemplo MK-801, fenilciclidina, dextrometorfan, D-CPP-

ene, Pfizer PC 101-606 (Hamm et al., 1993) e magnésio (Heath & Vink, 1999). Outra

substância antagonista de receptores do glutamato, topiramate, estão sendo estudadas

como agente neuroprotetor do cérebro de eventos secundários resultantes do TCE. Foi

demonstrado em um modelo animal de TCE que após o tratamento com topiramate

houve uma recuperação neurológica mais rápida em relação ao desempenho motor e

da memória (O'Dell & Hamm, 1995).

Observamos também que com relação ainda ao footprint a largura do passo e o

comprimento do passo são os mais afetados após o trauma e estão diminuídos, isto

pode-se justificar de acordo com a área atingida. As sequelas neurofisiológicas do TCE

são consequência da combinação de lesões cerebrais focais e difusas. Os focos do

abalo envolvem geralmente os lóbulos frontais.

As lesões Fronto-basais produzem mudanças importantes como na

personalidade e no comportamento e o prejuízo dorsolateral das lesões das funções de

execução (falta do planejamento, da flexibilidade e do uso de estratégias).

O dano axonal difuso é relacionado ao prejuízo da atenção, à velocidade do

processamento mental e às funções do lóbulo frontal (Junque, 1999). E as lesões no

cérebro e focais, devido ao TCE, conduzem não somente aos déficits funcionais na

área da lesão, mas igualmente perturbam a rede neuronal estrutural intacta que está

conectada ao local da lesão (Wiese et al., 2004). Em muitos casos como sequela

motora do TCE tem-se espasticidade em membros inferiores (MMII), isso pode justificar

o fato de o comprimento da passada estar alterado assim como a diminuição da

passada traseira. Pois se sabe que além do córtex frontal o cerebelo também está

envolvido na coordenação dos movimentos voluntários, manter o equilíbrio, na

regulação do tônus muscular e no aprender das habilidades motoras (Veiga Neto &

Segura, 2002).

Os resultados obtidos neste trabalho com o rotarod demonstram que após o

trauma moderado os prejuízos motores são significativos. Mas que o uso do fármaco

NMDA não causou o pré-condicionamento esperado em relação ao equilíbrio motor no

rotarod. Com relação aos achados desta pesquisa os estudos de Clark al de et., (2000)

que utilizaram o fármaco z-DEVD-fmk como neuroprotetor cerebral, observando que

este fármaco protegeu as células do cérebro, mas que em relação ao prejuízo motor

não se observou melhora. Outros estudos relatam que após o TCE pode-se haver

amnésia pós-traumática (Dixon et al., 1996), ou déficits de memória por ate 30 dias

(Hamm et al., 1993). Considerando que os déficits motores são evidentes nos tempo

01h30minh, 6h e que não houve a neuroproteção esperada pelo NMDA no rotarod e

que 24 horas após o trauma não houve diferença entre o controle e os grupos TCE e

NMDA+TCE sugere-se que este déficit motor possa estar associado à memória,

necessitando de uma análise clínica e comportamental mais detalhada. A

aprendizagem, a memória e o desenvolvimento do cérebro são associados com as

modificações duradouras das sinapses e essas modificações incluem a plasticidade. A

plasticidade é uma propriedade intrínseca do cérebro humano e representa uma

estratégia da evolução para capacitar o sistema nervoso para resistir as restrições de

seu próprio genoma e assim adaptar-se às pressões ambientais, mudanças fisiológicas

e experiências. Flutuações dinâmicas na potência de conexões pré-existentes através

de redes neurais distribuídas, modificações na coerência córtico-cortical e córtico-

subcortical relacionada a tarefas e modificações na correspondência referente ao

comportamento e à atividade neural ocorrem em resposta a modificações do input

aferente ou da demanda eferente. Tais modificações rápidas e contínuas podem ser

seguidas pelo estabelecimento de novas conexões através do crescimento e da

arborização dendríticos. Entretanto, elas trazem o perigo de que o padrão evolutivo da

ativação neural possa por si mesmo levar a um comportamento anormal (Pascual-

Leone et al., 2005).

Diversas outras mudanças celulares e moleculares estão implicadas na

homeostase sináptica, mas uma característica comum de muitos estudos é na

plasticidade homeostática onde existe uma alteração no número ou no complemento de

receptores NMDA (Watt et al., 2000; Pérez-Otaño & Ehlers, 2005). Embora esse

mecanismo ainda seja mal compreendido, esses resultados podem estar também

relacionados com a ativação ou inibição dessa plasticidade pelos receptores NMDA

após o TCE. E ainda segundo Pascual-Leone et al., (2005) as modificações plásticas

procuram minimizar o dano cerebral e que circuitos motores paralelos podem ser

ativados para estabelecer algum input alternativo para os neurônios motores. Sendo

que a recuperação do equilíbrio e a destreza motora fina dos camundongos após 24h

do trauma estejam relacionadas não necessariamente no local da lesão, mas

paralelamente a ela e mais se a regulação dessa homeostase, que é desestabilizada

após o TCE, pode ser mantida ou reorganizada devido ao pré-condicionamento com

NMDA.

Pode-se concluir que o pré-condicionamento com NMDA é eficaz quando

relacionado ao footprint e que o pré-condicionamento não foi eficaz quando relacionado

ao rotarod.

Ainda não se sabe o porquê e como os mecanismos que estão envolvidos no

trauma dão tais respostas e são poucos os estudos com fármacos para pré-condicionar

o cérebro contra o TCE. As variáveis genéticas podem explicar em diferenças

individuais da parte no grau de prejuízo motor ou memória e no relacionamento do TCE

com a doença de Alzheimer (Junque, 1999). Mas podemos perceber que o NMDA

causou um pré-condicionamento no cérebro contra o TCE, mas como os mecanismos

envolvidos respondem a essa atividade ainda não se sabe. O modelo de TCE

moderado executado em camundongos permite o estudo da interdependência entre

dano estrutural, mudanças da memória e motora, fatores genéticos, e os efeitos do

tratamento farmacológico utilizado.

Este estudo teve como objetivo verificar as possíveis alterações de dano celular

no córtex frontal e cerebelo e avaliar o conteúdo das subunidades NMDA (NR1, NR2a,

NR2b) em cerebelo de camundongos submetidos ao TCE e pré-condicionados com

NMDA. Pode-se concluir que a única alteração observada e pesquisada foi em NR1a,

NR2a e NR2b no cerebelo, não ocorrendo alterações em DNA e MTT no córtex e

cerebelo após o trauma. Outro objetivo verificado foi quanto à coordenação motora em

camundongos pré-condicionados ou não com NMDA e expostos ao TCE e observou-se

que o trauma causa alteração na coordenação motora.

Este estudo proporciona assim mais referências com informações relevantes

sobre o TCE e o pré-condicionamento com NMDA e dispõe a estudos diversos

questionamentos frente a neuroproteção cerebral e os mecanismos envolvidos no TCE

tendo como perspectivas realizar a detecção de imunoproteinas para córtex frontal em

6h; cerebelo e córtex frontal em 24h como também a verificação da memória após o

TCE em diversos tempos.

5. CONCLUSÃO

Observou-se que o trauma causa alterações na coordenação motora que foi

prevenida pelo pré-condicionamento com NMDA nas avaliações realizadas no teste

footprint.

As alterações observadas no conteúdo das subunidades NR1, NR2A e NR2B no

cerebelo após o TCE foram mantidas nos animais pré-condicionados.

O pré-condicionamento com NMDA levou a mesma modificação observada pelo

TCE, porém as vias celulares envolvidas provavelmente são diferentes;

O estudo de vias celulares que possam modular a transmissão glutamatérgica é

de fundamental importância para a compreensão do desenvolvimento de mecanismos

fisiológicos e fisiopatológicos no SNC.

Tendo em vista o papel protetor do pré-condicionamento com NMDA, entende-se

que este mecanismo possua funções preventivas ao SNC e/ou de manutenção contra

danos causados pelo TCE, que envolvam o sistema glutamatérgico.

6. REFERÊNCIAS

ADAMS JH; DOYLE D; FORD I; GENNARELLI TA; GRAHAM DI; MCLELLAN DR.

Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading.

Histopathology 15: 49–59. 1989.

ADELSON PD; DIXON CE; ROBICHAUD P; KOCHANEK, P. M. Motor and cognitive

functional deficits following diffuse traumatic brain injury in the immature rat. Journal

of Neurotrauma 14: 99–108. 1997.

ADELSON PD; ROBICHAUD P; HAMILTON RL; KOCHANEK PM. A model of diffuse

traumatic brain injury in the immature rat. Journal of Neurosurgery 85: 877–884.

1996.

ALVES CM; MARZOCCHI-MACHADO CM; CARVALHO IF; LUCISANO VALIM YM.

Application of the chemiluminescence systems to evaluate the role of Fcgamma and

complement receptors in stimulating the oxidative burst in neutrophils. Talanta 60(2-

3): 601-608. 2003.

ARUNDINE M; TYMIANSKI M. Molecular mechanisms of calcium-dependent

neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium 34: 325-337. 2003.

BERNERT H; TURSKI L. Traumatic brain damage prevented by the non-N-methyl-D-

aspartate antagonist 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo[f] quinoxaline.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 93(11): 5235-5240. 1996.

BESSHO Y; NAWA H; NAKANISHI S. Selective up-regulation of an NMDA receptor

subunit mRNA in culture cerebellar granule cells by K(+)-induced depolarization an

NMDA treatment. Neuron 12(1): 87-95. 1994.

BLISS TVP; COLLINGRIDGE GL. A synaptic model of memory; long-term potentiation

in the hippocampus. Nature 361: 31-39. 1993.

BOECK C; GANZELLA M; LOTTERMANN A; VENDITE D. NMDA preconditioning

protects against seizures and hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic acid in

mice. Epilepsia 45: 745-750. 2004.

.BOYDEN ES; KATOH A; RAYMOND JL. Cerebellum-Dependent Learning: The Role Of

Multiple Plasticity Mechanisms. Annual Review of Neuroscience 27: 581–609.

2004.

BRASHERS-KRUG T; SHADMEHR R; BIZZI E. Consolidation in human motor memory.

Nature 382: 252–255. 1996.

BRESSAN RA; PILOWSKY LS. Hipótese glutamatérgica da esquizofrenia. Revista

Brasileira de Psiquiatria 25 (3 ): 177-183. 2003.

BRINK JD; GARRETT AL; HALE WR; NICKEL VL; WOO–SAM J. Recovery of motor

and intellectual function in children sustaining severe head injuries. Developmental

Medicine & Child Neurology 12: 565–571. 1970.

BUONOMANO D; MAUK M. The neural basis of temporal processing. Annual Review

of Neuroscience 27: 307–340. 2004.

BUTEFISCH CM. Neurobiological bases of rehabilitation. Neurological Sciences 27:

18-23. 2006.

CARLOS TM. Expression of endothelial adhesion molecules and recruitment of

neutrophils after traumatic brain injury in rats. In:. Administration of adenosine

receptor agonists or antagonists after controlled cortical impact in mice: effects on

function and histopathology. (Varma, MR. Dixon CE, Jackson EK, Peters GW, Melick

JA, Griffith RP, Vagni VA, Clark RSB, Jenkins LW, Kochanek PM, eds.). Brain

Research 951: 191-201. 2002.

CARMICHAEL ST. Plasticity of cortical projections after stroke. Neuroscientist 9: 64–

75. 2003.

CARTER RJ; LIONE LA; HUMBY T; MANGIARINI L; MAHAL A; BATES GP; CLARK

RS; KOCHANEK PM; WATKINS SC; CHEN M; DIXON CE; SEIDBERG NA; MELICK

J; LOEFFERT JE; NATHANIEL PD; JIN KL; GRAHAM SH. Caspase-3 mediated

neuronal death after traumatic brain injury in rats. Journal of Neurochemistry 74:

740-753. 2000.

CENTRO DE PESQUISAS EM EDUCAÇÃO E PREVENÇÃO DA REDE SARAH.

Traumatismo crânio encefálico. Disponível em: <http://www.sarah.br/>. Acesso

em: 10 nov. 2008.

CLAUSEN T; BULLOCK R. Medical Treatment and Neuroprotection in Traumatic Brain

Injury. Current Pharmaceutical Design 7: 1517-1532. 2001.

COTMAN, C.W., KAHLE, J.S., MILLER, S.E., ULAS, J., BRIDGES, R.J. Excitatory

amino acid neurotransmission. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation

of Progress. (Floyd, E., Bloom, F.E., Kupfer, D.J. eds.). Raven Press, New York, pp.

75-85. 1995.

DALE N; ROBERTS A. Dual- component amino-acid-mediated synaptic potentiais:

excitatory drive for awimming in Xenopus embryos. Journal of Physiology 363: 35-

59. 1985.

DEBERNARDI R; MAGISTRETTI PJ; PELLERIN L. Trans-innibition of glutamate

transport prevents excitatory amino acid-induced glycolysis in astrocytes. Brain

Research 850: 39-46. 1999.

DIETRICH MO; MANTESE CE; ANJOS G; SOUZA DO; FARINA M. Motor impairment

induced by oral exposure to methylmercury in adult mice. Environmental

Toxicology and Pharmacology 19: 169–175. 2005.

DIXON CE; BAO J; LONG DA; HAYES RL. Reduced evoked release of acetylcholine in

the rodent hippocampus following traumatic brain injury. Pharmacology,

Biochemistry, Behavior 53(3): 679-86. 1996.

DUNNETT SB; MORTON AJ. Characterization of Progressive Motor Deficits in Mice

Transgenic for the Human Huntington’s Disease Mutation. The Journal of

Neuroscience 19(8): 3248–3257. 1999.

FADEN AI; DEMEDIUK P; PANTER SS; VINK R. The role of excitatory amino acids and

NMDA receptors in traumatic brain injury. Science 244: 798–800. 1989.

FAIRMAN WA; VANDENBERG RJ; ARRIZA JL. An excitatory amino-acid transporter

with properties of a ligand-gated chloride channel. Nature 375: 599-603. 1995.

FEI Z; ZHANG X; BAI H; JIANG X; LI X; ZHANG W; HU W. Posttraumatic secondary

brain insults exacerbates neuronal injury by altering Metabotropic Glutamate

Receptors. Neuroscience 8: 1471-2202. 2007.

FLECK MW; BARRIONUEVO G; PALMER AM. Synaptosomal and vesicular

accumulation of L- glutamate, L-aspartate and D- aspartate. Neurochemistry

International 39: 217-225. 2001.

FRANCESC X; PAPADIA SS; HOFMANN F; NEIL R; BADING HH; HARDINGHAM GE.

Preconditioning Doses of NMDA Promote Neuroprotection by Enhancing Neuronal

Excitability. The Journal of Neuroscience 26(17): 4509–4518. 2006.

GAGLIARD RJ. Neuroprotection, excitotoxicity and NMDA antagonists. Arquivos de

Neuropsiquiartria. 58(2B): 583-588. 2000.

GENNARELLI GA; GRAHAM DI. Neuropathology. In Textbook Of Traumatic Brain

Injury (Silver JM; Mcallister TW; Yudofsky SC, eds.). American Psychiatric

Association, Washington, pp. 27-34. 2005.

GENNARELLI TA; THIBAULT LE; ADAMS JH; GRAHAM DI; THOMPSON CJ;

MARCINCIN RP. Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate. Annals of

Neurology 12(6): 564–572. 1982.

GENTRY LR; GODERSKY JC; THOMPSON BH. Traumatic. brain stem injury: MR

imaging. Radiology 171: 177-87. 1989.

GIZA CC; MARIA NSS; HOVDA DA. N-Methyl-D-Aspartate Receptor Subunit Changes

after Traumatic Injury to the Developing Brain. Journal of Neurotrauma 23(6): 950–

961. 2006.

GOLDMAN-RAKIC PS; PORRINO, LJ. The primate mediodorsal (MD) nucleus and its

projection to the frontal lobe. Journal of Comparative Neurology 242: 535–560.

1985.

GROG L; HEINE M; COUSINS SL; STEPHENSON FA; LOUNIS B; COGNET L;

CHOQUET D. NMDA receptor surface mobility depends on NR2A-2B subunits.

Neuroscience 103(49): 18769–18774. 2006.

GUYER B; ELLERS B. Childhood injuries in the United States: mortality, morbidity, and

cost. American Journal of Diseases of Children 144: 649–652. 1990.

HAMM RJ; O'DELL DM; PIKE BR; LYETH B. Cognitive impairment following traumatic

brain injury: the effect of pre- and post-injury administration of scopolamine and MK-

801. Brain Research 1(4): 223-226. 1993.

HARDINGHAM GE; BADING H. Coupling of extrasynapticNMDAreceptors to a CREB

shut-off pathway is developmentally regulated. Biochimica et biophysica acta

1600: 148 –153. 2002.

HARDINGHAM GE, BADING H. The yin and yang of NMDA receptor signaling. Trends

in Neurosciences 26: 81– 89. 2003.

HARDINGHAM GE; FUKUNAGA Y; BADING H. Extrasynaptic NMDARs oppose

synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell death pathways. Nature

Neuroscience 5: 405– 414. 2002.

HEATH DL; VINK R. Concentration of brain free magnesium following severe brain

injury correlates with neurologic motor outcome. Journal of Neurosurgery 6(6):

504-509. 1999.

HOLMIN S. Intracerebral inflammation after human brain contusion. Journal

Neurosurgery. Brain Research 951: 191-201. 2002.

HORAK M; CHANG K; WENTHOLD RJ. Masking of the endoplasmic reticulum retention

signals during assembly of the NMDA receptor. The Journal of Neuroscience

28(13): 3500-3509. 2008.

IKONOMIDOU C; TURSKI L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for

stroke and traumatic brain injury? Lancet Neurology 1: 383–386. 2002.

JENSEN JB; PICKERING DS; SCHOUSBOE A. Depolarization-induced realese of 3 H

D- aspartate from GABAergic neurons caused by reversal of glutamate transporters.

International Journal of Developmental Neuroscience 18: 309-315. 2000.

JUNQUE C. Neuropsychological sequelae of head injury. Revista de Neurologia

28(4): 423-9. 1999.

KANAI Y; HEDIGER MA. Primary structure and functional characterization of a high-

affinity glutamate transporter. Nature 360: 467-471. 1992.

KATZ DI; WHITE DK; ALEXANDER MP; KLEIN RB. Recovery of ambulation after

traumatic brain injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 85: 865–

869. 2004.

KATZ DI; ALEXANDER MP. Traumatic brain injury: Predicting course of recovery and

outcome for patients admitted to rehabilitation. Archives of Neurology 51: 661–670.

1994.

KIM J; AVANTS B; PATEL S; WHYTE J; COSLETT BH; PLUTA J; DETRE, JA; GEE

JC. Structural consequences of diffuse traumatic brain injury: A large deformation

tensor-based morphometry study. Neuroimage 39: 1014-1026. 2008.

KREUTZ MR; BÖCKERS TM; BOCKMANN J; SEIDENBECHER CI; KRACHT B;

VORWERK CK; WEISE J; SABEL BA. Axonal injury alters alternative splicing of the

retinal NR1 receptor: the preferential expression of the NR1b isoforms is crucial for

retinal ganglion cell survival. The Journal of Neuroscience 18(20): 8278-8291.

1998.

KUHTZ-BUSCHBECK JP; HOPPE B; GOLGE M; DREESMANN M; DAMM-STUNITZ U;

RITZ A. Sensorimotor recovery in children after traumatic brain injury: analyses of

gait, gross motor, and fine motor skills. Developmental Medicine and Child

Neurology 45: 821–828. 2003.

KUHTZ-BUSCHBECK JP; STOLZE H; GÖLGE M; RITZ A. Analyses of Gait, Reaching,

and Grasping in Children After Traumatic Brain Injury. Archives of Physical

Medicine and Rehabilitation 84: 424-430. 2003.

LENT R. Cem bilhões de neurônios. São Paulo: Atheneu, 226-246 pp., 2001.

LAEMMLI UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature Neuroscience 227(5259): 680-685. 1970

LAPIN LP. Stimulant and convulsant effects of Kynurenines injected into brain ventricles

in mice. Journal of Neural Transmission 42: 37-43. 1978.

LEE B; BUTCHER GQ; HOYT KR; IMPEY S; OBRIETAN K; Activitydependent

neuroprotection and cAMP response element-binding protein (CREB): kinase

coupling, stimulus intensity, and temporal regulation of CREB phosphorylation at

serine 133. Journal of Neuroscience 25: 1137–1148. 2005.

LEINHASE I; HOLERS M; THURMAN JM; HARHAUSEN D; SCHMIDT OI; PIETZCKER

M; TAHA ME; RITTIRSCH D; HUBER-LANG M; SMITH WR; WARD PA; STAHEL

PF. Reduced neuronal cell death after experimental brain injury in mice lacking a

functional alternative pathway of complement activation. Neuroscience 7(55): 1471-

2207. 2006.

LEVINE B; FUJIWARA E; O’CONNOR C. In Vivo Characterization of Traumatic Brain

Injury Neuropathology with Structural and Functional Neuroimaging. Journal of

Neurotrauma 23: 1396–1411. 2006.

LEWINE JD; DAVIS JT; BIGLER ED; THOMA R; HILL D; FUNKE M; SLOAN JH; HALL

S; ORRISON WW. Objective documentation of traumatic brain injury subsequent to

mild head with MEG. SPECT and MRI. The Journal of Head Trauma

Rehabilitation 22 (3): 141-155. 2007.

LEWIN L; MATTSON MO; SELLSTROM A. Differences in the release of L- glutamate

and D- aspartate from primary neuronal chick cultures. Neurochemical Research

21: 79-85. 1996.

LINDNER MD; PLONE MA; CAIN CK; FRYDEL B; FRANCIS JM; EMERICH DF;

SUTTON RL. Dissociable long-term cognitive deficits after frontal versus

sensorimotor cortical contusions. Journal of Neurotrauma 15: 199–216. 1998.

LIPTON SA; ROSENBERG MD. Excitatory amino acids as a final common pathway for

neurologic disorders. The New England Journal of Medicine 330: 613-622. 1994.

LIU Y; WONG TP; AARTS M. ROOYAKKERS A, LIU L; LAI T WU DC; LU J;

TYMIANSKI M; CRAIG AM; WANG YT. NMDAReceptor Subunits Have Differential

Roles in Mediating Excitotoxic Neuronal Death Both In Vitro and In Viv. The Journal

of Neuroscience 27(11): 2846 –2857. 2007.

LIVINGSTON DH; LAVERY RF; MOSENTHAL AC. Recovery at one year following

isolated traumatic brain injury: a Western Trauma Association prospective

multicenter trial. Journal of Trauma 59: 1298–1304. 2005.

LONGUEMARE MC; SWANSON RA. Excitatory amino acid release from astrocytes

during energy failure by reversal of sodium-dependent uptake. Journal of

Neuroscience Research 40: 379-386. 1995.

MANREZA LA. Traumatismo cranioencefálico. In: Tratado das doenças neurológicas

(Melo-souza SE, ed.). Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp. 509-511. 2000.

MANREZA, MLG. Epilepsia na infância e na adolescência. São Paulo: Lemos, 211

p., 2003.

MAXWELL WL; POVLISHOCK JT; GRAHAM DL. A mechanistic analysis of

nondisruptive axonal injury: a review. Journal of Neurotrauma 14: 419–440. 1997.

MARR D. Simple memory: a theory for archicortex. Philos. Philosophical transactions

of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences 262: 23–81. 1971.

MCALLISTER TW; SPARLING MB; FLASHMAN LA; SAYKIN AJ. Neuroimaging findings

in mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research 23: 775–791.

2001.

MCINTOSH TK. Neurochemical sequelae of traumatic brain injury: therapeutic

implications. Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews 6: 109-162. 1994.

MORECRAFT RJ; HERRICK JL; STILWELL-MORECRAFT KS. Localization of arm

representation in the corona radiata and internal capsule in the non-human primate.

Brain Research 125: 176–198. 2002.

MUIZELAAR JP; MARMAROU AAF. Cerebral blood flow and metabolism in severely

head injured children. Journal of Neurosurgery 71: 63-71. 1989.

MUÑOZ-CÉSPEDES JM; PÁUL-LAPEDRIZA N; PELEGRÍN-VALERO C;TIRAPU-

USTARROZ J. Factores de prognóstico em los traumatismos craneoencefalicos.

Revista de Neurologia 32(4): 351-364. 2001.

MUNSON S; SCHROTH E; ERNST M. The Role of Functional Neuroimaging in

Pediatric Brain Injury. Pediatrics 117: 1372-1381. 2006.

MUSCARA F; CATROPPA C; EREN S; ANDERSON V. The impact of injury severity on

long-term social outcome following paediatric traumatic brain injury.

Neuropsychological Rehabilitation 1: 1. 2008.

MITCHELL HL; FRISELLA WA; BROOKER RW; YOON KW. Attenuation of traumatic

cell death by an adenosine. A¹ agonist in rat hippocampal cells. Neurosurgery 36(5):

1003-1007. 1995.

NAKANISHI S. Molecular Diversity of Glutamate Receptors and Implications for Brain

Function. Science 258: 597-603. 1992.

NIEMEIER JP; MARWITZ JH; LESHER K; WALKER WC; BUSHNIK T. Gender

differences in executive functions following traumatic brain injury.

Neuropsychological Rehabilitation 17: 293–313. 2007.

NOVELLI A; REILLY JA; LYSKO PG. Glutamate becomes neurotoxic via the N-methyl-

D- aspartate receptor when intracellular energy levels are reduced. Brain Research

451: 205-212. 1988.

NUDO RJ. Recovery after damage to motor cortical areas. Current Opinion in

Neurobiology 9: 740–747. 1999.

NUDO RJ. Plasticity. NeuroRx: the journal of the American Society for

Experimental NeuroTherapeutics 3: 420–427. 2006.

OBRENOVITCH TP; URENJAK J; ZILKHA E. Excitotoxicity in neurological disordens-

the glutamate paradox. International journal of developmental neuroscience :

the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience

18: 281-287. 2000.

OBRIST WD; LANGFITT TW; JAGGI JL; CRUZ J; GENNARELLI TA. Cerebral blood

flow and metabolism in comatose patients with acute head injury. Journal of

Neurosurgery 61(22): 241-253. 1984.

ODDY M; COUGHLAN T; TYERMAN A; JENKINS D. Social adjustement after closed

head injury: A further follow-up seven years after injury. Journal of neurology,

Neurosurgery and Psychiatry 48: 564–568. 1985.

O'DELL DM; HAMM RJ. Chronic postinjury administration of MDL 26,479 (Suritozole), a

negative modulator at the GABAA receptor, and cognitive impairment in rats

following traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery 83(5): 878-83. 1995.

OLNEY JW; HO OL. Brain damage in infant mice following oral intake of glutamate,

aspatate or cysteine. Nature 227: 609-611. 1969.

OLVERMAN HJ; JONES AW; MEWETT KN. Structure/activity relations of N-methyl-D-

aspartate receptor ligands as studied by their innibition of 3H D-amino-5-

phosphopentanoic acid binding in rat brain membranes. Neuroscience 26: 17-31.

1998.

PANTER S; FADEN A. Pretreatment with NMDA antagonists limits release of excitatory

amino acids following traumatic brain injury. Neuroscience Letters 136(2): 165-8.

1992.

PAPADIA S; STEVENSON P; HARDINGHAM NR; BADING H; HARDINGHAM GE;

Nuclear Ca2_ and the cAMP response element-binding protein family mediate a late

phase of activity-dependent neuroprotection. Journal of Neuroscience 25: 4279–

4287. 2005

PASCUAL-LEONE A; AMEDI A; FREGNI F; MERABET LB. The plastic human brain

cortex. Neuroscience 28: 377-401. 2005.

PÉREZ-OTAÑO I; EHLERS MD. Homeostatic plasticity and NMDA receptor trafficking.

Neurosciences 28(5): 229-238. 2005.

PERRETT SP; RUIZ BP; MAUK MD. Cerebellar cortex lesions disrupt learning-

dependent timing of conditioned eyelid responses. The Journal of Neuroscience

13: 1708–1718. 1993.

PETERSON GL. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is

more generally applicable. Analytical Biochemistry 83(2): 346-356. 1977.

PIOT-GROSJEAN O; WAHL F; GOBBO O; STUTZMANN JM. Assessment of

Sensorimotor and Cognitive Deficits Induced by a Moderate Traumatic Injury in the

Right Parietal Cortex of the Rat. Neurobiology of Disease 8: 1082-1093. 2001.

POVLISHOCK JT; CHRISTMAN CW. The pathobiology of traumatically induced axonal

injury in animals and humans: a review of current thoughts. Journal of

Neurotrauma 12: 555–564. 1995.

RABACCHI S; BAILLY Y; DELHAYE- BOUCHAUD N. Involvement of the N- methyl- D

aspartate (NMDA) receptor in synapse elimination during cerebellar development.

Science 256: 1823-1825. 1992.

RAO VLR; DOGAN A; TODD KG; BOWER KK; DEMPSEY RJ. Neuroprotection by

memantine, a non-competitive NMDA receptor antagonist after traumatic brain injury

in rats. Brain Research 911: 96-100. 2001.

RAO VLR; RAO AM; DOGAN A; BOWEN KK; HATCHER J; ROTHSTEIN JD;

DEMPSEY RJ. Glial glutamate transporter GLT-1 down-regulation precedes delayed

neuronal death in gerbil hippocampus following transient global cerebral ischemia.

Neurochemistry 36(6): 531-537. 2000.

REES PM. Contemporary issues in mild traumatic brain injury. Review article. Archives

of physical medicine and rehabilitation 84: 1885-1894. 2003.

RICHARDSON MR; SUN D; BULLOCK RM. Neurogenesis After Traumatic Brain Injury.

Neurosurgery Clinics 18: 169-181. 2007.

ROMANSKI LM; GIGUERE M; BATES JF; GOLDMAN-RAKIC PS. Topographic

organization of medial pulvinar connections with the prefrontal cortex in the rhesus

monkey. The Journal of Comparative Neurology 379: 313–332. 1997.

SAKAI K; HOMMA H; LEE JA. Emergence of D- aspartic acid en the differentiating

neurons of the rat central nervous system. Brain Research 808: 65-71. 1998.

SCHELL MJ; COOPER OB; SNYDER SH. D- aspaartate localizations imply neuronal

and neuroendocrine roles. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America 94: 2013-2018. 1997.

SCHUMANN ; ALEXANDROVICH GA; BIEGON A; YAKA R. Inhibition of NR2B

Phosphorylation Restores Alterations in NMDA Receptor Expression and Improves

Functional Recovery following Traumatic Brain Injury in Mice. Journal of

Neurotrauma 25: 945–957. 2008.

SCHURR A; PAYNE RS; TSENG MT; GOZAL E; GOZAL D. Excitotoxic preconditioning

elicited by both glutamate and hypoxia and abolished by lactate transport inhibition in

rat hippocampal slices. Neuroscience 307: 151–154. 2001.

SHADMEHR R; BRASHERS-KRUG T. Functional stages in the formation of human

long-term motor memory. The Journal of Neuroscience 17: 409–419. 1997.

SHADMEHR R; HOLCOMB HH. Neural correlates of motor memory consolidation.

Science 277: 821–825. 1997.

SHELTON FN; REDING MJ. Effect of lesion location on upper limb motor recovery after

stroke. Stroke 32: 107–112. 2001.

STORK T; SCHLTE S; HOFMANN K. Structure, expression, and functional analysis of a

Na dependent glutamate/aspartate transporter from rat brain. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of América 89: 10955-

10959. 1992.

TEMPLE M; O’LEARY D; FADEN A. The role of glutamate receptors in the

pathophysiology of traumatic brain injury. John Wiley & Sons 1: 87-113. 2001.

VEIGA NETO ER; SEGURA DCA. O cerebelo e as aferências da propiocepção

inconsciente/ The cerebellum and the unconscious proprioception inputs. Arquivos

Ciências Saúde UNIPAR 6(3): 145-149. 2002.

XIONG Y; MAHMOOD A; LU D; QU C; GOUSSEV A; SCHALLERT T; CHOPP M. Role

of gender in outcome after traumatic brain injury and therapeutic effect of

erythropoietin in mice. Brain Research 1185: 301-312. 2007.

XU GP; DAVE KR; VIVERO R; SCHMIDT-KASTNER R; SICK TJ; PEREZ-PINZON MA.

Improvement in neuronal survival after ischemic preconditioning in hippocampal slice

cultures. Brain Research 952: 153–158. 2002

YAKOVLEV AG; KNOBLACH SM; FAN L; FOX GB; GOODNIGHT R; FADEN AI.

Activation of CPP32-like caspases contributes to neuronal apoptosis and

neurological dysfunction after traumatic brain injury. Journal Neuroscience 17:

7415-7424. 1997.

WANG GJ; CHUNG HJ; SCNUER J. Dihydrokainate-sensitive neuronal glutamate

transport is required for protection of rat cortical neurons in culture against

synaptically release glutamate. The European Journal of Neuroscience 10: 2523-

2531. 1998.

WATT AJ; VAN ROSSUM MC; MACLEOD KM; NELSON SB; TURRIGIANO GG.

Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses.

Neuron 26: 659–670. 2000.

WIESE H; STUDE P; NEBEL K; OSENBERG D; VOLZKE V; ISCHEBECK W; STOLKE

D; DIENER HC; KEIDEL M. Impaired movement-related potentials in acute frontal

traumatic brain injury. Clinical Neurophysiology 115(2): 289-98. 2004.

WOLOSKER H; D’ANIELLO A; SNYDER SH. D-aspartate disposition in neuronal and

endocrine tissues: ontogeny, biosynthesis and release. Neurocience 100: 183-189.

2000.

ZOHAR O; SCHREIBER C; GETSLEV V; SCHWARTZ JP; MULLINS PG; PICK CG.

Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in

mice. Neuroscience 118: 949-955. 2003.

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