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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Adsorção de oligonucleotídeos com atividade antimalárica em nanoemulsões:
validação de método analítico e caracterização físico-química
FERNANDA BRUXEL
PORTO ALEGRE, 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Adsorção de oligonucleotídeos com atividade antimalárica em nanoemulsões:
validação de método analítico e caracterização físico-química
Dissertação apresentada por Fernanda Bruxel
para obtenção do GRAU DE MESTRE em
Ciências Farmacêuticas
Orientadores:
Prof. Dr. Helder Ferreira Teixeira
Prof. Dra. Sílvia Stanisçuaski Guterres
PORTO ALEGRE, 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, em nível de Mestrado – Produção e Controle de Qualidade de
Produtos Farmacêuticos – da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul e aprovada em 26.11.2008, pela Banca Examinadora constituída
por:
Prof. Dra. Letícia Scherer Koester
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. Martin Steppe
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira
Universidade Federal de Ouro Preto
B913a Bruxel, Fernanda
Adsorção de oligonucleotídeos com atividade antimalárica em
nanoemulsões: validação de método analítico e caracterização
físico-química / Fernanda Bruxel – Porto Alegre : UFRGS, 2008. –
xx, 107 p. : il.
Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia.
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Nanoemulsões catiônicas. 2. Oligonucleotídeos. 3. Validação:
métodos analíticos. 4. Malária. I. Teixeira, Helder Ferreira. II.
Guterres, Sílvia Stanisçuaski. III. Título.
CDU: 615.4
Bibliotecária responsável:
Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira – CRB10/480
Agradecimentos à CAPES, pelo financiamento
da bolsa de estudos para o desenvolvimento
deste trabalho, e ao laboratório de Tecnologia
Farmacêutica e Farmacocinética da Faculdade
de Farmácia da UFRGS, pela disponibilização
de equipamentos e materiais necessários para
a realização dos experimentos para elaboração
da presente dissertação.
Aos meus pais Neusa e Egídio por serem responsáveis pelo meu caráter, meus
valores e minhas conquistas.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meus orientadores, Prof. Dr. Helder Teixeira e
Prof. Dra. Sílvia Stanisçuaski Guterres, pela oportunidade, confiança e paciência.
Sinto-me privilegiada por ter trabalhado com profissionais exemplares e
competentes como vocês. Ao Prof. Helder, obrigada pelo incentivo para seguimento
da vida acadêmica, pela oportunidade de continuação deste trabalho em
doutoramento e, sobretudo pela amizade. Muito obrigada.
Aos amigos e colegas do laboratório 405 e 605 desta Faculdade de Farmácia.
Em especial a minha amiga Michelle Fraga por toda contribuição e principalmente
pelo incentivo à realização do mestrado acadêmico. À Manoela Laux pelo auxílio na
realização dos experimentos. A todos os amigos do curso de pós-graduação, pelo
convívio e amizade.
A todos os professores e funcionários desta Faculdade que, de uma maneira
ou outra, contribuíram para a minha formação. Agradecimentos especiais aos
professores Dr. George G. Ortega, Dr. Edison S. Carvalho, Dra. Letícia S. Koester,
Dra. Tiana Tasca, Dra. Elfrides E. S. Schapoval e Dr. Alexandre J. Macedo pela
colaboração, e à Dra. Grace Gosmann pela orientação na iniciação científica. À
Cristiane e Moema, funcionárias do Centro de Microscopia Eletrônica, pelo auxílio na
obtenção das fotomicrografias apresentadas neste trabalho.
Aos meus pais Egídio e Neusa, e ao meu irmão Guilherme, pelo amor,
carinho, apoio e compreensão em todos os momentos. Muito obrigada pelo exemplo
de vida que são para mim. Ao Carlos, pelo incentivo, companheirismo e pelo tempo
que soube esperar. Muito obrigada. Amo vocês.
A todos meus familiares e meus amigos, pela paciência e compreensão.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. v
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ xiii
ABREVIATURAS ....................................................................................................... xv
RESUMO ................................................................................................................. xvii
ABSTRACT .............................................................................................................. xix
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 5
2.1 Objetivo geral ....................................................................................................... 7
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 7
3. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 9
3.1 Malária ................................................................................................................ 11
3.1.1 A doença ......................................................................................................... 11
3.1.2 Transmissão .................................................................................................... 12
3.1.3 Ciclo de vida do parasito e sintomatologia ...................................................... 13
3.1.4 Prevenção, profilaxia e tratamento .................................................................. 15
3.2 Oligonucleotídeos antisenso ............................................................................... 18
3.3 Nanoemulsões catiônicas ................................................................................... 23
3.3.1 Composição das nanoemulsões ...................................................................... 26
3.3.1.1 Fase oleosa .................................................................................................. 26
3.3.1.2 Interface ........................................................................................................ 27
3.3.1.3 Fase aquosa ................................................................................................. 29
3.3.2 Métodos de preparo ........................................................................................ 30
3.3.3 Propriedades das nanoemulsões .................................................................... 30
3.3.3.1 Diâmetro e morfologia de gotícula ................................................................ 31
3.3.3.2 Potencial zeta ............................................................................................... 32
3.3.3.3 pH ................................................................................................................. 33
3.3.3.4 Viscosidade .................................................................................................. 34
3.3.4 Estudos de adsorção ....................................................................................... 35
3.3.4.1 Modelos de adsorção em interface ............................................................... 37
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 39
4.1 Materiais ............................................................................................................. 41
4.1.1 Ácido Nucléico ................................................................................................. 41
4.1.2 Outras Matérias-Primas ................................................................................... 41
4.1.3 Aparelhos e Equipamentos .............................................................................. 41
4.1.4 Reagentes e Solventes.................................................................................... 42
4.2 Métodos .............................................................................................................. 43
4.2.1 Preparação das nanoemulsões ....................................................................... 43
x
4.2.2 Caracterização das nanoemulsões ................................................................. 44
4.2.2.1 Determinação do pH ..................................................................................... 44
4.2.2.2 Determinação do diâmetro de gotícula ......................................................... 44
4.2.2.3 Determinação do potencial zeta ................................................................... 44
4.2.2.4 Avaliação morfológica ................................................................................... 45
4.2.2.5 Determinação da viscosidade ....................................................................... 45
4.2.3 Determinação da densidade ótica (DO) dos ON ............................................. 46
4.2.4 Desenvolvimento e validação de método analítico para doseamento dos ON. 47
4.2.4.1 Seleção do comprimento de onda ................................................................ 48
4.2.4.2 Avaliação da especificidade ......................................................................... 48
4.2.4.3 Determinação da linearidade ........................................................................ 48
4.2.4.4 Determinação dos limites de detecção e quantificação ................................ 49
4.2.4.5 Avaliação da repetibilidade e da precisão intermediária ............................... 49
4.2.4.6 Avaliação da exatidão ................................................................................... 50
4.2.5 Associação dos ON às nanoemulsões ............................................................ 51
4.2.5.1 Determinação da taxa de recuperação das membranas .............................. 52
4.2.5.2 Determinação da taxa de associação dos ON .............................................. 52
4.2.5.3 Caracterização do sistema ON/nanoemulsão .............................................. 53
4.2.5.4 Aplicação de modelos de adsorção .............................................................. 54
4.2.6 Análise estatística ............................................................................................ 54
4.2.7 Disposição de resíduos ................................................................................... 55
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 57
5.1 Preparação e caracterização das nanoemulsões ............................................... 59
5.1.1 Propriedades físico-químicas .......................................................................... 59
5.1.2 Propriedades físico-químicas após armazenamento ....................................... 62
5.2 Validação do método analítico ............................................................................ 64
5.2.1 Determinação da DO dos ON .......................................................................... 66
5.2.2 Seleção do comprimento de onda de leitura ................................................... 67
5.2.3 Especificidade ................................................................................................. 68
5.2.4 Linearidade ...................................................................................................... 69
5.2.5 Limites de Detecção e Quantificação .............................................................. 72
5.2.6 Precisão ........................................................................................................... 73
5.2.7 Exatidão ........................................................................................................... 76
5.3 Estudo de associação dos ON às nanoemulsões .............................................. 77
5.3.1 Caracterização físico-química dos complexos ................................................. 85
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 91
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 95
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida do parasito causador da malária. ..................................... 13
Figura 2. Resistência de fármacos ao P. falciparum. Dados de 2004, provenientes
de estudos em locais sentinelas. ........................................................... 16
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo antisenso. ....................... 19
Figura 4. Estrutura química dos lipídeos catiônicos OA e DOTAP. ...................... 28
Figura 5. Fotomicrografias das nanoemulsões PC; PC/OA e PC/DT, obtidas por
MET, em aumento de 100.000X. ........................................................... 62
Figura 6. Estrutura química dos ON de série PO e PS ......................................... 65
Figura 7. Espectros de absorção de PO e PS em solução aquosa, na faixa de 200
a 400 nm................................................................................................ 67
Figura 8. Espectros de absorção dos ON (PO e PS) em solução aquosa. Espectro
de absorção de uma solução glicerinada 2,25%, e adicionada dos ON
(PO e PS). ............................................................................................. 69
Figura 9. Representação gráfica das curvas padrão obtidas para PO e PS por
espectrofotometria de absorção em UV a 262 nm. ............................... 70
Figura 10. Estudo de recuperação de soluções aquosas de PO e PS em
membranas de ultrafiltração após centrifugação a 5000 rpm por 10
minutos.. ................................................................................................ 78
Figura 11. Isotermas de adsorção para ON de série PO e PS obtidas no estudo de
associação por ultrafiltração/centrifugação............................................ 79
Figura 12. Representação linear dos modelos de adsorção de ON às
nanoemulsões catiônicas. Modelo de Langmuir para PO e PS e modelo
de Freundlich para PO e PS. ................................................................. 83
Figura 13. Diâmetro médio de gotícula dos complexos formados com as
nanoemulsões PC/OA e PC/DT após adição de quantidades crescentes
de PO ou PS. Diâmetro médio de gotícula inicial das nanoemulsões
PC/OA e PC/DT, antes da adição do ON. ............................................. 86
Figura 14. Potencial zeta dos complexos formados com as nanoemulsões PC/OA e
PC/DT após adição de quantidades crescentes de PO ou PS. Potencial
zeta inicial das nanoemulsões PC/OA e PC/DT, antes da adição do ON.
.............................................................................................................. 87
Figura 15. Fotomicrografias dos complexos de PO com as nanoemulsões PC;
PC/OA e PC/DT, e de PS com as nanoemulsões PC; PC/OA e PC/DT,
obtidas por MET, em aumento de 100.000X. ........................................ 89
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais estudos utilizando a estratégia antisenso para tratamento da
malária. .................................................................................................. 20
Tabela 2. Composição das nanoemulsões (%, m/m) sem lipídeo catiônico (PC),
com OA (PC/OA) e com DOTAP (PC/DT) em relação ao volume final
obtido após evaporação dos solventes. ................................................ 43
Tabela 3. Modo de preparo das amostras pra realização do teste de recuperação
dos ON PO e PS por espectrofotometria de absorção no UV. .............. 51
Tabela 4. Propriedades físico-químicas das nanoemulsões obtidas por
emulsificação espontânea. .................................................................... 60
Tabela 5. Propriedades físico-químicas das nanoemulsões após armazenamento a
4
o
C por 90 dias. ..................................................................................... 63
Tabela 6. Cálculo da quantidade de PO e PS, em nmol e µg de ON, através de
resultados provenientes da determinação da DO dos mesmos. ........... 66
Tabela 7. ANOVA dos resultados experimentais obtidos através do ensaio de
linearidade para PO e PS por espectrofotometria de absorção em UV a
262 nm................................................................................................... 71
Tabela 8. Dados do estudo de linearidade do método para PO e PS, considerando
três dias diferentes de experimentos. .................................................... 71
Tabela 9. Limites de detecção e quantificação determinados matematicamente a
partir dos valores obtidos pelas curvas padrão. .................................... 72
Tabela 10. Precisão do método de determinação de ON de série PO por
espectrofotometria de absorção em UV, com base nos resultados
obtidos no estudo de linearidade. .......................................................... 74
Tabela 11. Precisão do método de determinação de ON de série PS por
espectrofotometria de absorção em UV, com base nos resultados
obtidos no estudo de linearidade. .......................................................... 74
Tabela 12. Precisão do método por espectrofotometria de absorção em UV, com
base nas análises de PO e PS em solução glicerinada. ....................... 75
Tabela 13. Resultados obtidos no teste de recuperação (exatidão) por
espectrofotometria de absorção em UV para PO. ................................. 76
Tabela 14. Resultados obtidos no teste de recuperação (exatidão) por
espectrofotometria de absorção em UV para PS. ................................. 77
Tabela 15. Coeficientes de determinação (R
2
) obtidos por regressão linear,
baseados nos modelos de Langmuir e Freundlich, para adsorção de PO
e PS a nanoemulsões catiônicas. .......................................................... 83
Tabela 16. Constantes calculadas através das equações das retas, obtidas
experimentalmente na análise de regressão linear, e da equação
proposta pelo modelo de adsorção de Langmuir. .................................. 84
ABREVIATURAS
[+/-] - relação de cargas positivas (lipídeo catiônico) e negativas (ON)
ANOVA - análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATP - adenosina trifosfato
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
COSAT - Comissão de Saúde e Ambiente de Trabalho
DHFR - diidrofolato redutase
DNA - ácido desoxirribonucléico
DO - densidade ótica
DOTAP - 1,2-dioleoil-3-trimetil amônio propano
DPR - desvio padrão relativo
EHL - equilíbrio hidrófilo/lipófilo
FDA - Food and Drug Administration
HCl - ácido clorídrico
ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human Use
LD - limite de detecção
LQ - limite de quantificação
MET - microscopia eletrônica de transmissão
NaCl - cloreto de sódio
NaOH - hidróxido de sódio
O/A - óleo/água
OA - oleilamina
ON - oligonucleotídeo
P. falciparum - Plasmodium falciparum
P. malariae - Plasmodium malariae
P. ovale - Plasmodium ovale
P. vivax - Plasmodium vivax
PC - lecitina
PC/DT - lecitina/DOTAP
PC/OA - lecitina/oleilamina
xvi
PEG - polietilenoglicol
PO - oligonucleotídeo fosfodiéster
PS - oligonucleotídeo fosforotioato
RBMP - Roll Back Malaria Partnership
RNA - ácido ribonucléico
TCL - triglicerídeos de cadeia longa
TCM - triglicerídeos de cadeia média
TS - timidilato sintetase
USP - The United States Pharmacopoeia
UV - ultravioleta
RESUMO
Nanoemulsões catiônicas têm sido consideradas como potenciais sistemas
carreadores para oligonucleotídeos (ON) antisenso. O objetivo do presente trabalho
foi desenvolver nanoemulsões catiônicas como um sistema de liberação para ON
anti-topoisomerase II de Plasmodium falciparum. Primeiramente, nanoemulsões
constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol e
água contendo os lipídeos catiônicos oleilamina ou DOTAP (2 mM) foram obtidas
através do procedimento de emulsificação espontânea. Este procedimento resultou
em formulações monodispersas com diâmetro de gotícula de 200-260 nm e
potencial zeta de +50 e +55 mV. Após, um método espectrofotométrico no UV para
quantificação dos ON em série fosfodiéster (PO) ou fosforotioato (PS) foi validado. O
método mostrou-se linear, específico, preciso e exato para a determinação de PO e
PS, sem diferenças significativas entre os ON. Nas condições validadas, as
isotermas de adsorção dos ON às nanoemulsões foram obtidas através da
determinação dos ON na fase aquosa externa das nanoemulsões, após
ultrafiltração/centrifugação dos complexos. A taxa de recuperação através das
membranas de ultrafiltração de celulose regenerada (30 kDa) foi superior a 92%. Os
resultados indicam a adsorção progressiva dos ON com as nanoemulsões, até cerca
de 60 mg/g de fase interna para o complexo DOTAP-PS. Finalmente, evidências
adicionais da adsorção de PO e PS às nanoemulsões foram detectadas pelo
aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das
gotículas avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. O conjunto dos
resultados obtidos demonstra que ON de série PO e PS anti-topoisomerase II de P.
falciparum podem ser adsorvidos eficientemente às nanoemulsões catiônicas.
Palavras-Chave: malária, oligonucleotídeos, nanoemulsões catiônicas, validação,
caracterização físico-química.
ABSTRACT
Cationic nanoemulsions have been recently considered as a potential delivery
system for antisense oligonucleotides (ON). The aim of the present work was to
evaluate cationic nanoemulsions as a delivery system for ON against the
Plasmodium falciparum topoisomerase II gene. Firstly, nanoemulsions composed of
medium chain triglycerides, egg yolk lecithin, glycerol and water, containing the
cationic lipids oleylamine or DOTAP (2 mM) were obtained through spontaneous
emulsification process. This procedure resulted in monodisperse formulations with
droplet size of 200-260 nm and zeta potential of +50 and +55mV. After that, an UV
spectrophotometric method for the quantification of either phosphodiester (PO) or
phosphorothioate (PS) ON was validated. The method was linear, specific, precise,
and accurate for the determination of PO and PS, without significant differences
between both ON. In the validated conditions, ON adsorption isotherms with
nanoemulsions were obtained through the ON determination in the external phase of
nanoemulsions, after ultrafiltration/centrifugation of complexes. The recovery through
regenerated cellulose membranes (30kDa) was higher than 92%. The results
showed a progressive ON adsorption to the nanoemulsions up to approximately
60mg/g of internal phase for DOTAP-PS complexes. Finally, additional evidences of
PO and PS adsorption to nanoemulsions could also be detected by the increase of
the mean droplet size, the inversion of the zeta potential and the morphology of the
oil droplets obtained by transmission electron microscopy. The overall results
showed that PO and PS ON against P. falciparum anti-topoisomerase II gene can be
efficiently adsorbed to the cationic nanoemulsions.
Keywords: malaria, oligonucleotides, cationic nanoemulsions, validation,
physicochemical characterization
1. INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
3
A malária ou paludismo é uma doença que atinge hoje mais de 100 países,
levando mais de um milhão de pessoas à morte anualmente (BRAGA e FONTES,
2005; OMS, 2008). A malária é uma infecção causada pelo parasito intracelular do
gênero Plasmodium, que se desenvolve principalmente em regiões tropicais e
subtropicais do mundo, sendo o continente africano o principal atingido (RBMP,
2008).
A situação da malária agravou-se com o surgimento da farmacorresistência
dos parasitos aos principais antimaláricos (OMS, 2005). Plasmodium falciparum, o
principal causador da malária severa e fatal, tem demonstrado resistência a diversos
antimaláricos utilizados (TRACY e WEBSTER, 2003; OMS, 2006; EKLAND e
FIDOCK, 2008). Assim, há uma necessidade primordial para o desenvolvimento de
novos fármacos para o combate desta doença.
Neste contexto, diversos pesquisadores têm investigado as potencialidades
do uso de ácidos nucléicos no tratamento da malária. Estudos relativos ao emprego
de fragmentos de ácidos nucléicos em fita simples, denominados oligonucleotídeos
(ON) antisenso, têm sido particularmente descritos por serem capazes de interferir
de maneira específica na expressão gênica, inibindo o crescimento dos parasitos
(RAPAPORT et al., 1992; BARKER et al., 1996; KANAGARATNAM et al., 1998;
WANIDWORANUN et al., 1999; NOONPAKDEE et al., 2003; FÖGER et al., 2006).
Os melhores resultados in vitro foram obtidos com ON direcionados a inibição
específica da enzima topoisomerase II de P. falciparum (NOONPAKDEE et al., 2003;
FÖGER et al., 2006). Apesar de promissores, esses resultados são ainda muito
modestos na inibição do crescimento do parasito.
Apesar do potencial terapêutico dos ON antisenso, sua aplicação é limitada
por fatores como a reduzida penetração intracelular e a instabilidade frente a
enzimas celulares. O transporte para o interior das células é limitado pelo elevado
peso molecular e pelo caráter polianiônico dos ON, que ocasiona a repulsão
eletrostática das membranas celulares (JAASKELAINEN e URTTI, 2002). A
estabilidade dos ON é limitada pela rápida degradação pelas nucleases, presentes
em fluídos biológicos, limitando suas aplicações in vivo (MÖNKKÖNEN e URTTI,
1998; OPALINSKA e GEWIRTZ, 2002).
4
INTRODUÇÃO
Visando contornar esses inconvenientes, nanoemulsões catiônicas têm sido
propostas como carreadores para ON. Esses sistemas são constituídos por um
núcleo oleoso estabilizado por uma mistura binária de fosfolipídeos e lipídeos
catiônicos. A presença do lipídeo catiônico é fundamental na associação dos ON a
estrutura coloidal através de interações eletrostáticas, entre os ON carregados
negativamente e os lipídeos carregados positivamente (TEIXEIRA et al., 1999, 2003;
TRIMAILLE et al., 2003; MARTINI et al., 2007). A capacidade desses nanossistemas
em aumentar a penetração de ON em células tumorais, após a administração local
em camundongos, e protegê-los da degradação enzimática pelas nucleases, através
de um ensaio de hibridação competitiva, foi previamente demonstrada (TEIXEIRA et
al., 2001a, 2003).
Estudos recentes, em nosso grupo de trabalho, demonstram a possibilidade
de modular a eficiência de associação e a cinética de liberação de ácidos nucléicos
(ON e plasmídeos) a partir de nanoemulsões, em especial, através da seleção do
tipo de lipídeo catiônico e/ou fosfolipídeo empregado e da relação de cargas [+/-]
(MARTINI, 2005; SILVA et al., 2006; FRAGA, 2007; MARTINI et al., 2007). Desta
forma, considerando-se as potencialidades dos ON no tratamento da malária e das
nanoemulsões como carreadores para esses fragmentos de ácidos nucléicos, a
presente dissertação visa avaliar a adsorção de ON em série fosfodiéster (PO) e
fosforotioato (PS), com potencial atividade antimalárica, às nanoemulsões catiônicas
otimizadas por MARTINI (2005).
2. OBJETIVOS
OBJETIVOS
7
2.1 Objetivo geral
Caracterização da adsorção de oligonucleotídeos anti-topoisomerase II de P.
falciparum em nanoemulsões catiônicas.
2.2 Objetivos específicos
• Preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas de nanoemulsões
catiônicas obtidas por emulsificação espontânea.
• Validar método analítico para quantificação dos oligonucleotídeos em série PO e
PS por espectrofotometria no ultravioleta.
• Avaliar a adsorção e caracterizar as propriedades físico-químicas dos complexos
formados entre nanoemulsões e ON.
3. REVISÃO DA LITERATURA
REVISÃO DA LITERATURA
11
3.1 Malária
3.1.1 A doença
A malária (ou paludismo) é um problema de saúde pública mundial, que afeta
cerca de 300 milhões de pessoas, resultando em mais de um milhão de mortes por
ano. A doença atinge principalmente mulheres, crianças e imunodeprimidos (BRAGA
e FONTES, 2005; OMS, 2008). Na África, 3 mil crianças morrem por dia devido à
doença, onde se localizam 90% dos casos de malária (RUXIN et al., 2005; OMS,
2008; RBMP, 2008). A situação da malária começou a agravar-se a partir dos anos
80, devido à resistência dos parasitos aos principais antimaláricos utilizados para o
tratamento da doença, bem como dos próprios mosquitos aos inseticidas. Além
disso, a instabilidade econômica, as guerras e as diversas situações de emergência
limitaram o sucesso dos programas de combate contra a enfermidade, que até então
vinham sendo efetivos (OMS, 2006).
Atualmente, a malária está presente em 109 países, embora com prevalência
diferente, visto que é tipicamente uma doença de países em desenvolvimento. As
regiões atingidas pela doença encontram-se principalmente nas áreas tropicais e
subtropicais do globo terrestre, devido ao calor e umidade característicos do clima
da região, ideais para o desenvolvimento do mosquito Anopheles, transmissor da
doença (CDC, 2005; RBMP, 2008).
No Brasil, a cada ano surgem cerca de 500 mil novos casos. No final do
século XIX, a malária estava presente em todo o território nacional. O maior número
de casos ocorreu em 2000, quando o país contava com mais de 610 mil casos, 99%
na região amazônica. Estes números representavam 40% do total de casos de
malária das Américas (CAMARGO, 2003; OMS, 2005). Assim, foram criados em
2000, o Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária na Região
Amazônica, e em 2001, o projeto da Rede Amazônica de Vigilância da Resistência
às Drogas Antimaláricas, em conjunto com a Organização Pan-Americana de
Saúde. Em 2003, a Secretaria de Vigilância em Saúde implantou o Sistema de
Informação de Vigilância Epidemiológica da Malária na Região Amazônica e o
Programa Nacional de Prevenção e Controle da Malária (BRASIL, 2003b; 2005).
12
REVISÃO DA LITERATURA
Esforços também têm sido dedicados ao combate à doença em nível mundial.
Em 2008, um plano de ação global contra a malária, o Global Malaria Action Plan,
que engloba mais de 65 instituições internacionais, foi criado pela Roll Back Malaria
Partnership (RBMP), uma parceria a nível mundial. Este plano tem como objetivo
reduzir o número de casos de malária existentes no ano de 2000 para 75% em
2015, além de reduzir a mortalidade para praticamente zero, erradicando a doença a
longo prazo. Os custos previstos para investimento em novas ferramentas para o
controle da doença giram em torno de 750 a 900 milhões de dólares por ano, o que
engloba a pesquisa e desenvolvimento de novas intervenções antimaláricas e
prevenção do aumento da resistência, incluindo ferramentas para controle de
vetores, diagnóstico, vacinas e novos fármacos (RBMP, 2008).
3.1.2 Transmissão
A transmissão da malária se dá pela picada da fêmea infectada do mosquito
Anopheles, que através de suas glândulas salivares, inoculam as formas infectantes
do parasito durante o repasto sangüíneo (BRAGA e FONTES, 2005; OMS, 2007). O
desenvolvimento do parasito no mosquito depende de inúmeros fatores, sendo o
calor e a umidade os principais, pois permitem que o mosquito sobreviva o tempo
suficiente para o desenvolvimento completo do ciclo do parasito no hospedeiro (10 a
18 dias, de gametócito a esporozoíto). O mosquito atua apenas como um vetor, pois
não sofre a presença do parasito em seu organismo (CDC, 2005).
De mais de cem espécies de do gênero Plasmodium existentes, apenas
quatro podem infectar os seres humanos causando a doença, P. vivax, P. ovale, P.
malariae e P. falciparum (OMS, 2007). Os dois primeiros possuem estágios
dormentes no fígado (hipnozoítos), que podem reativar a doença muitos meses após
o contágio. A infecção por qualquer um destes parasitos pode causar sintomas
graves, contudo, infecções por P. falciparum são consideradas as mais severas,
podendo ser fatais (CDC, 2005). No Brasil, metade dos casos de malária são
causados pelo P. vivax ou P. malariae e outra metade pelo P. falciparum (BRAGA E
FONTES, 2005), sendo que a proporção de malária por esta última espécie tem
aumentado de 2000 a 2006, principalmente na região amazônica (OMS, 2007).
REVISÃO DA LITERATURA
13
3.1.3 Ciclo de vida do parasito e sintomatologia
A malária é uma doença infecciosa sistêmica, na qual vários órgãos podem
ser atingidos isolada ou conjuntamente, ocorrendo desde casos benignos e crônicos
até formas agudas ou fatais. O ciclo da doença se processa em dois hospedeiros: no
mosquito e no homem, conforme pode ser observado na figura 1. No homem
ocorrem duas fases distintas, a exoeritrocítica (nos hepatócitos) e a eritrocítica
(BRAGA e FONTES, 2005; CDC, 2005).
Figura 1. Ciclo de vida do parasito causador da malária (adaptado de
http://www.fda.gov).
Após a picada pelo vetor, os esporozoítos presentes na saliva do mosquito
Anopheles atingem a corrente sangüínea e dirigem-se para o fígado. Invadem então
os hepatócitos e produzem milhares de merozoítos. Estes podem romper os
hepatócitos e se deslocar para a corrente sangüínea para posterior invasão de
hemácias, ou invadir novos hepatócitos e permanecer em estado dormente no
fígado (ciclo tissular, exoeritrocítico) (BRAGA e FONTES, 2005; OMS, 2007).
14
REVISÃO DA LITERATURA
O ciclo eritrocítico inicia-se quando os merozoítos tissulares invadem os
eritrócitos. Os merozoítos se desenvolvem e invadem novos eritrócitos por diversas
vezes, até o momento que se diferenciam a gametócitos, por estágios sexuados. Os
gametócitos por sua vez, serão ingeridos pelo mosquito vetor durante a picada e
seguirão nele um novo ciclo (CDC, 2005).
Os sintomas ocorrem durante o ciclo eritrocítico. O paciente apresenta
sintomas iniciais como mal-estar, dores de cabeça, cansaço, mialgia e indisposição
geral. Após, acentua-se a febre e dentro de alguns dias o paciente entra no acesso
malárico, que ocorre em intervalos periódicos regulares, característicos para cada
espécie. Estes intervalos correspondem ao tempo de processamento da
esquizogonia sangüínea: 48 horas para P. falciparum (terçã maligna), P. vivax e P.
ovale (terçã benigna) e 72 horas para P. malariae (quartã benigna) (BRAGA e
FONTES, 2005; GRIFFITH et al., 2007).
O acesso malárico caracteriza-se por calafrios, sensação de calor e sudorese
intensa. Consiste de três fases distintas, que podem durar de 6 a 10 horas.
Primeiramente, o paciente apresenta calafrios, tremores intensos e elevação da
temperatura, que dura de 20 a 60 minutos. Em um segundo momento, tem uma forte
sensação de calor, rosto avermelhado, fortes dores de cabeça, pulsação elevada e
febre. O paciente permanece neste quadro por 2 a 3 horas, quando inicia a fase de
sudorese intensa, acompanhadas de sensação de alívio (CDC, 2005; OMS, 2007).
A anemia ocorre devido à destruição geral dos eritrócitos pelos macrófagos,
não apenas dos eritrócitos infectados, sendo freqüentemente mais problemática em
crianças e gestantes infectadas por P. falciparum ou P. vivax, podendo levar a
discrasias e desenvolvimento anormal da medula óssea (CDC, 2005). A malária
severa (causada pelo P. falciparum) é caracterizada por sintomas mais graves,
como problemas respiratórios, convulsões múltiplas, choque, edema pulmonar,
anemia severa, falência renal aguda, acidose, hemoglobinúria e parasitemia maior
que 5 % (CDC, 2005; GRIFFITH et al., 2007). Além disso, os eritrócitos infectados
aderem às paredes dos vasos sangüíneos, impedindo a livre circulação. Quando isto
ocorre no cérebro, pode ser um fator causador da denominada malária cerebral
(CDC, 2005; OMS, 2006).
REVISÃO DA LITERATURA
15
Após muitos anos de exposição continua a malária, algumas pessoas podem
desenvolver imunidade, que limita o desenvolvimento de parasitemias graves.
Fatores genéticos também estão envolvidos, protegendo relativamente contra os
sintomas severos e a morte causada por P. falciparum (CDC, 2005).
3.1.4 Prevenção, profilaxia e tratamento
Diversas maneiras de prevenção têm sido utilizadas na luta contra o
paludismo, entre as quais o combate ao mosquito, correto diagnóstico e tratamento
de pacientes infectados, administração de antimaláricos de forma profilática,
especialmente a grupos mais vulneráveis, como gestantes e crianças. O controle do
vetor através de medidas de saneamento básico, ou ações destinadas a eliminar
criadouros de mosquitos não gera os melhores resultados. Dedetizar ou telar casas,
utilizar mosquiteiros e repelentes acaba sendo pouco útil, visto que o mosquito
permanece do lado de fora a qualquer horário do dia (CAMARGO, 2003; OMS,
2006). O correto diagnóstico muitas vezes tem sido prejudicado em países onde a
doença é infreqüente (CDC, 2005).
Entretanto, a principal dificuldade na luta mundial contra a malária reside
principalmente na farmacorresistência. A complexidade de ciclo de vida do parasito
e a versatilidade biológica do mesmo lhe permitem adquirir resistência às inúmeras
estratégias quimioterapêuticas (VALE et al., 2005).
Na literatura encontram-se relatos de resistência a maioria dos fármacos
utilizados no tratamento da malária (figura 2). Em 1910, surgia o primeiro relato de
resistência a quinina (WONGSRICHANALAI et al., 2002). A cloroquina, que é o
antimalárico mais utilizado e mais barato, já perdeu sua eficácia na maior parte do
mundo. Outras terapias de primeira linha, como sulfadoxina/pirimetamina, já
atingiram altos níveis de resistência ao P. falciparum em muitas regiões endêmicas.
As formas resistentes podem não responder adequadamente até mesmo a doses
tóxicas de mefloquina ou quinina (OMS, 2006; GRIFFITH et al., 2007; EKLAND e
FIDOCK, 2008). No Brasil, tem sido registrada, em diferentes níveis, a resistência do
P. falciparum à cloroquina, à amodiaquina, à quinina e à mefloquina (BRASIL, 2005).
16
REVISÃO DA LITERATURA
Áreas ondeocorre transmissão
Resistência à Cloroquina
Resistência à Sulfadoxina/Pirimetamina
Resistência à Mefloquina
Áreas livres de Malária
Figura 2. Resistência de fármacos ao P. falciparum. Dados de 2004, provenientes de
estudos em locais sentinelas, da Organização Mundial da Saúde (adaptado de OMS,
2005).
O surgimento de resistência aos diversos fármacos está condicionado a
diversos fatores, relacionados ao parasito, ao fármaco, ao paciente e ao vetor. Os
casos mais graves estão relacionados ao parasito P. falciparum, apesar de que
cepas de P. vivax também já desenvolveram resistência. P. malariae ou P. ovale não
têm causado preocupações até o momento. Apesar de existirem áreas onde a
resistência ainda é mínima (América Central), há regiões da Ásia e Amazônia onde o
parasito se tornou resistente a múltiplos fármacos (WONGSRICHANALAI, et al.,
2002). Parasitos que já desenvolveram resistência podem ter maior tendência a
adquirir resistência a novos fármacos, não relacionados com os que originaram a
resistência inicial. Por isso, geralmente são indicadas terapias combinadas,
utilizando-se dois ou mais agentes antimaláricos complementares (TRACY e
WEBSTER, 2003).
Visando contornar o problema da resistência, terapias combinadas com
artemisinina têm sido utilizadas com sucesso. Estas terapias possuem alto custo,
REVISÃO DA LITERATURA
17
além de não estarem disponíveis em todos os países (OMS, 2005; GRIFFITH et al.,
2007). Mesmo assim, elas têm sido cada vez mais utilizadas, o que acaba
aumentando ainda mais a pressão para a seleção de cepas resistentes (OMS,
2007). As sulfonamidas também demonstraram ser eficazes na associação com a
pirimetamina contra cepas resistentes de P. falciparum. Entretanto, a cloroquina
somente ainda é utilizada devido à sua eficácia contra P. ovale, P. malariae, P.
vivax, além de algumas cepas de P. falciparum sensíveis (TRACY e WEBSTER,
2003).
No Brasil, o esquema recomendado para tratamento das infecções por P.
falciparum baseia-se na combinação de quinina, doxiciclina e primaquina, ou
alternativamente, quinina somente, ou mefloquina combinada a primaquina, que
também são utilizados em infecções mistas com P. vivax. Para a malária grave, a
primeira escolha envolve os derivados da artemisinina (BRASIL, 2001; RBMP,
2005).
Para profilaxia, a política adotada atualmente no país baseia-se apenas nas
medidas de proteção individual para evitar o contato com o mosquito, sendo a
quimioprofilaxia recomendada somente a mefloquina, utilizada apenas para viajantes
internacionais e grupos especiais (BRASIL, 2001; BRAGA e FONTES, 2005; OMS,
2005). O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) recomenda ainda:
atovaquona/proguanil, doxiciclina, mefloquina ou primaquina (em situações
especiais) (CDC, 2005). A quimioprofilaxia não tem sido adotada nas áreas
endêmicas do mundo devido ao padrão heterogêneo de resistência do P. falciparum,
do alto custo e toxicidade dos novos medicamentos (BRASIL, 2001). Além disso,
nenhum fármaco pode garantir proteção total contra a doença (OMS, 2007).
Infecção por malária em mulheres grávidas envolve altos riscos de morbidade
e mortalidade materna e fetal, incluindo anemia, retardo no crescimento, aborto
espontâneo, prematuridade, recém-nascidos de baixo peso, infecção congênita e
morte do feto. Estima-se que 60% dos casos de malária durante a gravidez resultem
em perda do feto, além de 10% de morte materna (CDC, 2005; OMS, 2007).
Entretanto, os medicamentos disponíveis para tratamento e prevenção não são
considerados seguros (CDC, 2005; GRIFFITH et al., 2007).
18
REVISÃO DA LITERATURA
Com a progressiva extensão da resistência e o potencial de toxicidade dos
antimaláricos disponíveis, a quimioprofilaxia e o tratamento da malária passou a
representar um tema polêmico nos últimos anos. O desenvolvimento de novas
estratégias torna-se indispensável, sendo primordial a necessidade de pesquisa e
desenvolvimento de novos fármacos para o combate da doença.
3.2 Oligonucleotídeos antisenso
Neste contexto, estudos relativos ao emprego de oligonucleotídeos (ON) têm
sido correntemente descritos na literatura para diversas aplicações, incluindo
doenças parasitárias (COUVREUR e MALVY, 2000). Os ON são constituídos de 12
a 40 nucleotídeos em fita simples, organizados em uma seqüência estabelecida para
se hibridar de maneira específica com um determinado gene, um RNA mensageiro
ou ainda uma proteína. Estes fragmentos de ácidos nucléicos são capazes de
interferir na expressão gênica, caracterizando a base da terapia com ON, a qual se
constitui de três diferentes estratégias: (i) Estratégia anti-gênica: o processo de
transcrição do DNA em fita dupla para RNA mensageiro em fita simples é inibido
pelos ON, através do pareamento de bases do tipo Hoogsteen; (ii) Estratégia
antisenso: o processo de tradução é restringido pelos ON complementares ao RNA
mensageiro, através de pontes de Hidrogênio do tipo Watson e Crick; (iii) Estratégia
aptâmeros: os ON interagem com proteínas, interferindo nas suas atividades, via
pontes de hidrogênio (LIANG et al., 1999).
A estratégia antisenso (figura 3) permite a inibição da biossíntese de uma
proteína basicamente por dois mecanismos principais: a enzima RNase H reconhece
o duplex formado entre o ON antisenso e o RNA mensageiro e realiza a quebra
deste RNA, ou o duplex formado bloqueia o maquinário da tradução por inibição
estérica (FICHOU e FÉREC, 2006). Atualmente, diversos estudos clínicos baseados
na terapia antisenso encontram-se em andamento, em especial, na terapia do
câncer e nas infecções bacterianas e virais (OPALINSKA e GEWIRTZ, 2002;
STAHEL e ZANGEMEISTER-WITTKE, 2003). Em 1998, a comercialização de uma
seqüência de ON contendo ligações fosforotioato para o tratamento local de retinite
REVISÃO DA LITERATURA
19
induzida por citomegalovírus (VITRAVENE
®
, Isis Pharmaceutical Inc.) foi autorizada
(FICHOU e FÉREC, 2006).
Transcrição
Tradução
Oligonucleotídeo
ANTISENSO
DNA
mRNA
PROTEÍNA
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo antisenso.
Entretanto, apesar das reconhecidas potencialidades terapêuticas dos ON,
diversas aplicações permanecem limitadas, principalmente para ON contendo em
sua estrutura as ligações fosfodiéster naturais. Primeiramente, o elevado peso
molecular e o caráter polianiônico dos ON limitam o seu transporte intracelular, em
decorrência da repulsão eletrostática com as membranas celulares
(JAASKELAINEN e URTTI, 2002). Além disso, a instabilidade dos ON em fluídos
biológicos, devido à rápida degradação frente ao ataque das endo e exonucleases,
limita o uso destas moléculas in vivo (MÖNKKÖNEN e URTTI, 1998; OPALINSKA e
GEWIRTZ, 2002). E ainda, os ON podem apresentar efeitos inibitórios não
relacionados ao seu efeito antisenso, ao se ligar a receptores, enzimas e proteínas,
alterando suas funções (LAMBERT et al., 2001; TOUB et al., 2006).
A fim de contornar esses inconvenientes, a modificação química dos ON tem
sido estudada, seja através de alterações da natureza das ligações inter-
nucleosídeos, da estrutura dos açúcares, ou das bases (COUVREUR e MALVY,
2000). Algumas destas modificações, entretanto, podem levar a uma redução da
habilidade de pareamento dos ON (URBAN e NOE, 2003).
A substituição de um oxigênio não ligante da ligação fosfodiéster por um
enxofre constitui a classe dos fosforotioatos, sendo esta correntemente utilizada
devido a sua estabilidade em fluídos biológicos (HUGHES et al., 2001; STAHEL e
ZANGEMEISTER-WITTKE, 2003). Contudo, o uso de ON fosforotioatos por via
20
REVISÃO DA LITERATURA
sistêmica pode ser limitado devido à toxicidade decorrente da interação não
específica com algumas proteínas e perturbação de suas funções, como por
exemplo, as polimerases, certas proteínas membranares e a albumina (KRIEG e
STEIN, 1995; LIANG et al., 1999; OPALINSKA e GEWIRTZ, 2002; TOUB et al.,
2006). Ainda apresentando as limitações mencionadas, a maioria dos estudos utiliza
ON modificados na forma de fosforotioato.
Diversos estudos descrevem o efeito de ON antisenso sobre a inibição do
crescimento de P. falciparum in vitro, com seqüências complementares a diversos
alvos (tabela 1). Uma vez que os parasitos se multiplicam rapidamente após a
infecção dos eritrócitos, as enzimas de replicação e os genes envolvidos têm
merecido considerável atenção por parte dos pesquisadores como potenciais alvos
para terapia antisenso. Pode-se citar a diidrofolato redutase (DHFR) - timidilato
sintetase (TS), aldolase e topoisomerase II (SARTORIUS e FRANKLIN, 1991;
RAPAPORT et al., 1992; BARKER et al., 1996; RAMASAMY et al., 1996;
WANIDWORANUN et al., 1999; NOONPAKDEE et al., 2003; FÖGER et al., 2006).
Tabela 1. Principais estudos utilizando a estratégia antisenso para tratamento da
malária.
Alvo Referência
Dihidrofolato-redutase-timidilato-sintetase
Sartorius e Franklin, 1991; Rapaport et al.,
1992; Barker et al., 1996; Ramasamy et al.,
1996.
Proteína de superfície do merozoíto P195 Rapaport et al., 1992.
Dihidropteroato sintetase Barker et al., 1996.
Ribonucleotídeo redutase Barker et al., 1996.
DNA polimerase Barker et al., 1996.
Triose fosfato isomerase Barker et al., 1996.
Multigene da família esquizonte Barker et al., 1996.
Proteína de superfície do merozoíto EBA175 Barker et al., 1996.
Proteína de superfície do merozoíto MSA-2 Kanagaratnam et al., 1998.
Aldolase Wanidworanun et al., 1999.
Topoisomerase II Noonpakdee et al., 2003; Föger et al., 2006.
REVISÃO DA LITERATURA
21
Inicialmente, o gene da enzima DHFR-TS se mostrava um alvo de interesse
devido à incapacidade dos parasitos P. falciparum realizarem a síntese de novo de
purinas. Inclusive, o antimalárico pirimetamina, um fármaco antifolato, atua através
deste mecanismo. Hoje, entretanto, já é inefetivo devido ao surgimento de
resistência (SARTORIUS e FRANKLIN, 1991; RAPAPORT et al., 1992; BARKER et
al., 1996; RAMASAMY et al., 1996; COUVREUR e MALVY, 2000). Dentre os
primeiros estudos, SARTORIUS e FRANKLIN (1991) verificaram que somente
seqüências longas de oligonucleotídeos fosfodiéster (maiores que 30 bases) eram
eficientes contra o RNA mensageiro da enzima DHFR-TS, tanto para a região do
sítio de iniciação da tradução como para a região codificante da TS.
Em continuidade, RAPAPORT e colaboradores (1992) testaram diversas
seqüências, com diferentes modificações químicas, direcionadas a dois diferentes
alvos: um antígeno de superfície do merozoíto e a enzima DHFR-TS. Esta última
mostrou-se melhor alvo, para o qual os autores demonstraram a inibição do
crescimento de cepas de P. falciparum, resistentes ou sensíveis à cloroquina. Mais
tarde, o mesmo grupo descreveu a inibição de crescimento de P. falciparum frente a
diversos outros alvos, comparando seqüências antisenso a seqüências controles
embaralhadas. Os autores concluíram que genes da DNA polimerase e triose fosfato
isomerase (enzima da via glicolítica) foram os menos sensíveis à ação dos ON
(BARKER et al., 1996). O conjunto de resultados indicou ainda que, em
concentrações inferiores a 0,5 µM, os ON antisenso direcionados a vários genes
inibem de modo seqüência-dependente o crescimento dos parasitos, enquanto em
concentração superiores (1,0 µM), a inibição é seqüência-independente. Os autores
relacionam essa inespecificidade de ação ao caráter polianiônico dos ON,
principalmente para ON de série fosforotioato. Além disso, observaram que além de
seqüência-dependente, a inibição do crescimento do parasito poderia ser também
dependente da dose de ON (RAPAPORT et al., 1992; BARKER et al., 1996).
Na mesma linha, RAMASAMY e colaboradores (1996) observaram a inibição
do crescimento de P. falciparum de modo inespecífico, através da comparação de
uma seqüência de ON senso a outra antisenso, em concentrações de 0,1 µM, 1,0
µM e 10 µM.
22
REVISÃO DA LITERATURA
Devido aos resultados conflitantes quanto à especificidade de ação de ON
fosforotioatos sobre a atividade antimalárica, relatada pelos autores mencionados,
KANAGARATNAM e colaboradores (1998) investigaram comparativamente o efeito
de diversas seqüências de ON senso e antisenso sobre a inibição do crescimento de
P. falciparum. Os autores utilizaram como alvo uma proteína de superfície do
merozoíto, presente somente em determinado período do ciclo celular do parasito, o
que identificaram como uma vantagem em relação à enzima DHFR-TS, até então
estudada. A redução da invasão das células vermelhas pelo merozoíto mostrou-se
dose-dependente, mas foi atribuída ao caráter polianiônico dos ON, uma vez que os
resultados foram equivalentes para ambas às seqüências senso e antisenso. O
mecanismo da ação envolveria a interferência do caráter polianiônico dos ON na
ligação dos merozoítos aos receptores localizados nas células vermelhas do
sangue, inibindo uma nova invasão da célula pelo P. falciparum. Ainda, os autores
consideram que as hemácias não podem internalizar ON por endocitose, e assim, a
entrada dos mesmos deveria ocorrer provavelmente por ductos das células
infectadas pelo plasmódio, permitindo o acesso dos ON à membrana do parasito.
Em 1999, WANIDWORANUN e colaboradores avaliaram in vitro a
possibilidade de ação de ON fosforotioatos antisenso, comparados a seqüências
senso e controle, sobre o RNA mensageiro da enzima aldolase de P. falciparum.
Este alvo foi escolhido porque na fase sangüínea da doença existe uma grande
produção anaeróbica de energia pelo parasito e as enzimas glicolíticas estão cerca
de 11 a 18 vezes mais expressadas, sendo o consumo de glicose pelas hemácias
infectadas quase 100 vezes superior ao das hemácias não infectadas. Além disso,
sabe-se que a aldolase do parasito é diferente de todas as isozimas da aldolase
humana. Os autores observaram uma inibição inespecífica dos ON senso e dos ON
de seqüências obtidas ao acaso (embaralhadas), enquanto seqüências antisenso
apresentaram uma inibição específica nas concentrações compreendidas entre 3 a
33 nM. Uma redução significativa na parasitemia (em cerca de 50%) foi observada
para os ON antisenso na concentração de 11 nM. Este efeito de redução da
parasitemia foi confirmado pela redução nos níveis da aldolase, através da
verificação da redução dos níveis de ATP produzidos pelo parasito e pela técnica de
Northern Blot.
REVISÃO DA LITERATURA
23
Mais recentemente, foram testadas várias seqüências de ON fosforotioatos
direcionadas a diferentes regiões do gene da enzima topoisomerase II do P.
falciparum resistente à cloroquina e pirimetamina. Concentrações de 0,01 a 0,50 µM
de seqüências senso e antisenso foram comparadas, permitindo aos autores
concluir que a inibição do crescimento do parasito se mostrava seqüência e dose-
específica, durante os estágios de maturação do parasito. O maior efeito foi
detectado após 36 horas de incubação com os ON. Os autores também testaram
concentrações maiores de ácidos nucléicos e observaram um efeito inespecífico,
independente da seqüência dos ON, sobre o desenvolvimento do parasito. Os
resultados de inibição do crescimento do P. falciparum encontrados estão entre
cerca de 30 a 47% para seqüências antisenso nas concentrações de 0,5 µM e de
até cerca de 60 a 65% para maiores concentrações testadas, independente da
seqüência (NOONPAKDEE et al., 2003).
Esses resultados promissores conduziram FÖGER e colaboradores (2006) a
associar esses ON a nanopartículas revestidas com quitosana, um polímero
catiônico. A inibição do crescimento do parasito observada mostrou-se superior,
compreendida entre 74 e 87%, para seqüências antisenso, dependendo do tipo de
formulação. As nanopartículas também apresentaram efetiva proteção dos ON
contra a degradação por nucleases. Os resultados deste estudo demonstraram um
aumento da especificidade do efeito antisenso observado para os ON associado às
nanoestruturas, em relação aos ON em solução aquosa. Os autores relacionaram
esse efeito à liberação sustentada dos ON a partir das nanopartículas. Outros
autores também já haviam sugerido a associação dos ácidos nucléicos a
carreadores, visando reduzir também seu efeito inespecífico ou aptamérico
(COUVREUR e MALVY, 2000; LAMBERT et al., 2001; TOUB et al., 2006).
3.3 Nanoemulsões catiônicas
Na última década, pesquisas têm sido amplamente desenvolvidas para a
utilização de sistemas coloidais no direcionamento e liberação controlada de
fármacos (CONSTANTINIDES et al., 2008; DATE e NAGARSENKER, 2008).
Diversos nanossistemas já demonstraram eficácia na otimização de vacinas e
24
REVISÃO DA LITERATURA
quimioterápicos destinados ao controle da malária, como lipossomas, nanopartículas
e nanoemulsões (DIERLING e CUI, 2005; PIMENTEL et al., 2007).
Formulações parenterais do tipo nanoemulsões O/A têm merecido
considerável atenção por parte dos pesquisadores por já serem amplamente
utilizadas pela indústria farmacêutica na nutrição parenteral (FLOYD, 1999). As
nanoemulsões de uso parenteral têm sido estudadas como sistemas de liberação de
fármacos, incluindo os altamente lipofílicos, para redução de irritação, dor ou
toxicidade durante administração por via endovenosa, direcionamento ao alvo de
ação, estabilização e prevenção de fenômenos de interação com os equipamentos
de infusão (KLANG e BENITA, 1998; CONSTANTINIDES et al., 2008). Após
administração parenteral, este tipo de formulação é rapidamente capturada pelo
sistema retículo endotelial (SER), em órgãos como o fígado e baço, o que é uma
vantagem para direcionamento de fármacos para estes locais (KLANG et al., 1998).
Paralelamente à modificação química, a associação de ácidos nucléicos a
carreadores coloidais catiônicos tem sido proposta para contornar as limitações do
seu uso. Uma vasta literatura descreve a associação de ON a carreadores de
natureza lipídica e/ou polimérica como lipossomas (SENIOR et al., 1991;
LAPPALAINEN et al., 1994; ZELPHATI e SZOKA, 1996; KANAGARATNAM et al.,
1998; MÖNKKÖNEN e URTTI, 1998; JURKIEWICZ et al., 2003) ou nanopartículas
(LAMBERT et al., 2001; FÖGER et al., 2006; KABANOV, 2006; TOUB et al., 2006;
MEDINA et al., 2007). O uso de lipídeos catiônicos na composição de vetores não
virais de natureza polimérica e/ou lipídica na forma de agregados supramoleculares,
nanopartículas e lipossomas tem se mostrado uma estratégia útil e segura para a
transferência intracelular dos ácidos nucléicos (FATTAL et al., 1998, 2001;
LAMBERT et al., 2001; JURKIEWICZ et al., 2003).
O mecanismo de associação deste tipo de sistema, contendo lipídeos e/ou
polímeros carregados positivamente e ON carregados negativamente, parece
ocorrer através da formação de um complexo eletrostático em meio aquoso
(TEIXEIRA et al., 2001a; TRIMAILLE et al., 2001). O efeito da associação (adsorção
e/ou encapsulamento) dos ácidos nucléicos com o sistema coloidal carregado
positivamente tem se mostrado benéfico tanto em termos de transferência
intracelular de ON ou DNA (in vitro, ex vivo e in vivo), como na redução da cinética
REVISÃO DA LITERATURA
25
de degradação dos ácidos nucléicos veiculados (ZELPHATI e SZOKA, 1996;
BROWN et al., 2001; CAMPBELL et al., 2001). A formação do par iônico
compromete os grupamentos fosfato dos ON, limitando a atividade das nucleases e
reduzindo assim a cinética de degradação dos ON (LAPPALAINEN et al., 1994).
Além disso, o sistema pode assegurar uma liberação intracelular dos ON devido a
seu efeito sobre membranas, encontrando-se os ácidos nucléicos principalmente no
núcleo, enquanto os lipídeos catiônicos permanecem na região citoplasmática e
perinuclear (ZELPHATI e SZOKA, 1996).
A associação de ON por forças eletrostáticas também parece tornar
improvável a hibridização de ON com proteínas do meio biológico de forma
inespecífica, visto que sua conformação é alterada para interagir eletrostaticamente
com o sistema catiônico (LAMBERT et al., 2001). Assim, o efeito aptamérico
inespecífico do ON antisenso deve ser reduzido ou inexistente, evitando-se efeitos
secundários à administração da terapia.
Neste contexto, nanoemulsões catiônicas O/A como veículos para formação
de complexos com polinucleotídeos têm sido propostas e amplamente estudadas
(TEIXEIRA et al., 2001a, 2003; TRIMAILLE et al., 2003; FRAGA, 2007; HAGIGIT et
al., 2008; MARTINI et al., 2008). Estudos que avaliam a integridade dos ON após
liberação do complexo nanoemulsão catiônica-ON mostram existência do par iônico
que os protege contra a ação das nucleases (TEIXEIRA et al., 2001b). Para estes
sistemas, interações hidrofóbicas, juntamente com as eletrostáticas, parecem ter um
papel importante na associação de ON (TEIXEIRA et al., 2001a; TRIMAILLE et al.,
2001). Também há relatos indicando que o complexo formado entre nanoemulsões e
ácidos nucléicos apresenta estabilidade adequada em fluídos biológicos,
diferentemente de complexos formados com estruturas do tipo lipossomas (YI et al.,
2000; KIM et al., 2003). E ainda, a atividade de transfecção in vitro e in vivo, em
alguns casos, mostrou-se superior aos lipossomas catiônicos (CHOI et al., 2004;
MIN et al., 2005).
26
REVISÃO DA LITERATURA
3.3.1 Composição das nanoemulsões
A influência de diferentes parâmetros como a composição quali e quantitativa
das nanoemulsões (núcleo oleoso, lipídeos catiônicos e co-tensoativos) no perfil de
associação e/ou liberação dos ON a partir de nanoemulsões catiônicas, bem como
em suas propriedades físico-químicas, têm sido investigada por diversos autores
(TEIXEIRA et al., 2001b; TRIMAILLE et al., 2003; MARTINI, 2005; FRAGA, 2007;
HAGIGIT et al., 2008). Dessa forma, é de extrema importância a seleção cuidadosa
dos excipientes (KLANG e BENITA, 1998; DATE e NAGARSENKER, 2008).
3.3.1.1 Fase oleosa
O núcleo oleoso das nanoemulsões utilizadas para a preparação de sistemas
para a administração de ácidos nucléicos é constituído por triglicerídeos de cadeia
longa (TCL), derivados dos óleos de soja, rícino ou açafrão, ou ainda, de
triglicerídeos de cadeia média (TCM), obtidos da reesterificação de ácidos graxos
fracionados de óleo de coco com glicerina (FLOYD, 1999). Ambos possuem ampla
aceitabilidade e são encontrados em uma diversidade de produtos parenterais,
inclusive em combinação, como nas preparações lipídicas para nutrição parenteral
(KLANG e BENITA, 1998; DRISCOLL, 2006; DATE e NAGARSENKER, 2008). A
utilização de TCM na obtenção de sistemas de liberação de ON tem sido
freqüentemente descrita na literatura (TEIXEIRA et al., 1999, 2003; TRIMAILLE et
al., 2001), principalmente pelo fato dos TCM serem cerca de 100 vezes mais
solúveis em água que os TCL (FLOYD, 1999).
No que se refere à composição quantitativa, o núcleo oleoso das
nanoemulsões catiônicas em sistemas de liberação de ON representa 5 a 35% da
composição final das formulações (MARTINI, 2005). Estudos relativos à comparação
e seleção da fase oleosa têm sido realizados visando principalmente à otimização
dos sistemas, geralmente com base em estudos de eficiência de transferência
gênica (CHUNG et al., 2001; FRAGA, 2007). No caso específico de ON, TEIXEIRA e
colaboradores (2001b) demonstraram, através de estudos de partição óleo/água,
que apenas óleos de elevados valores de equilíbrio hidrófilo/lipófilo (EHL) seriam
REVISÃO DA LITERATURA
27
capazes de solubilizar os complexos formados entre ON e lipídeos catiônicos
utilizados na preparação das nanoemulsões.
A adição de antioxidantes em nanoemulsões lipídicas tem sido descrita, para
prevenir a peroxidação dos ácidos graxos insaturados (TEIXEIRA et al., 1999). A
ação do oxigênio durante o processamento e armazenamento pode influenciar de
maneira decisiva a estabilidade do sistema (BENITA e LEVY, 1993). Nanoemulsões
comerciais contêm α-tocoferol, um antioxidante comumente utilizado (BENITA e
LEVY, 1993; FLOYD, 1999). Para evitar a oxidação, outros procedimentos como
evitar armazenamento em recipientes plásticos permeáveis ao oxigênio e manter a
temperatura de armazenamento controlada
devem ser considerados (FLOYD, 1999).
3.3.1.2 Interface
Em relação à interface, nanoemulsões são geralmente estabilizadas por
misturas de tensoativos catiônicos, anfotéricos e/ou não iônicos. Os emulsificantes
são utilizados para formação do filme interfacial e reduzir a tensão superficial,
impedindo a floculação e coalescência da fase dispersa. Os emulsificantes mais
utilizados em emulsões parenterais são os fosfolipídeos (fosfatídeos naturais
derivados de óleo de soja ou da gema do ovo) e poloxâmeros, sendo que os ésteres
de sorbitano (Tween) e os polioxietilenos derivados do óleo de rícino (Cremophor)
também são aprovados para este fim (KLANG e BENITA, 1998; JUMAA e MULLER,
1999; KIM et al., 2001; CHOI et al., 2004; MIN et al., 2005; DATE e NAGASENKER,
2008; HAGIGIT et al., 2008). O uso dos fosfolipídeos ou lecitinas predomina, apesar
destes compostos serem passíveis de hidrólise e gerarem compostos hemolíticos
em condições inadequadas, sendo necessário um rigoroso controle do processo de
produção (FLOYD, 1999). Os fosfolipídeos mais freqüentemente descritos são os de
gema de ovo, compostos principalmente por fosfolipídeos neutros (fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina) e negativamente carregados em pH fisiológico (fosfatidilserina
e fosfatidilglicerol). Para a associação de ácidos nucléicos (igualmente dispondo de
cargas negativas) às nanoemulsões, a carga negativa dos fosfolipídeos é
inadequada, sendo necessária a adição de um lipídeo catiônico à formulação
(KLANG e BENITA, 1998; ROLAND et al., 2003).
28
REVISÃO DA LITERATURA
Os lipídeos catiônicos são formados por uma âncora hidrofóbica, uma cabeça
polar e um linker, que corresponde à ligação entre a cabeça polar e a cauda apolar.
A âncora hidrofóbica pode ser uma cadeia carbonada apolar simples, como no caso
dos tensoativos, ou dupla. A cabeça polar pode ser mono- ou multivalente, sendo
que a monovalente pode ser constituída por grupamentos amina terciários ou
quaternários (CHESNOY e HUANG, 2000). Dentre os lipídeos catiônicos mais
utilizados, estão a estearilamina, oleilamina (OA) e 1,2-dioleoil-3-trimetil amônio
propano (DOTAP) (KLANG e BENITA, 1998; MARTINI et al., 2008). Apesar de
relatos de formulações catiônicas contendo apenas o lipídeo catiônico como
emulsificante (KIM et al., 2003), eles geralmente são utilizados em combinação com
os fosfolipídeos (MARTINI, 2005). Alguns exemplos das estruturas destes lipídeos
podem ser visualizadas na figura 4.
Figura 4. Estrutura química dos lipídeos catiônicos OA e DOTAP.
O uso do lipídeo catiônico que apresenta duas cadeias hidrofóbicas (DOTAP)
parece ser a estratégia mais eficaz na associação e controle da liberação dos ON a
partir das nanoemulsões catiônicas (KIM et al., 2001; TEIXEIRA et al., 2001b, 2003;
HAGIGIT et al., 2008; MARTINI et al., 2008). Para lipídeos como o DOTAP, além
das interações de natureza eletrostática, interações hidrofóbicas com os ON foram
identificadas, devido à presença de dupla cadeia carbônica hidrofóbica, o que não
ocorre com moléculas de estearilamina, por exemplo, compostas por apenas uma
cadeia carbonada saturada (TEIXEIRA et al., 2001b; HAGIGIT et al., 2008).
NH
3
+
O
O
H
O
O
N
+
NH
3
+
O
O
H
O
O
N
+
OA
DOTAP
REVISÃO DA LITERATURA
29
Outra abordagem para gerar carga positiva foi descrita por TRIMAILLE e
colaboradores (2001) através da funcionalização da interface das nanoemulsões
através do uso de polímeros de diferentes domínios hidrofóbicos e de grupamentos
produtores de cargas catiônicas. A funcionalização das emulsões com tais polímeros
fornece uma maneira conveniente de modificar a interface das gotículas e possibilita
a adsorção dos ON sobre a mesma (TRIMAILLE et al., 2003).
Ainda em relação à modificação da interface, TEIXEIRA e colaboradores
(2001a) avaliaram a influência da adição de lipídeo contendo cadeias
polietilenoglicol (PEG) sobre as propriedades físico-químicas de nanoemulsões
carreadoras de ON. Os resultados de transferência de energia de fluorescência
demonstraram a possível interação dos ON com as cadeias de PEG, conduzindo a
um afastamento dos ON da interface O/A e uma liberação mais rápida dos mesmos.
3.3.1.3 Fase aquosa
Em relação à fase aquosa da emulsão, são incorporados os agentes de
tonicidade, antioxidantes, tampões, ou ainda, agentes conservantes. Para ajuste de
tonicidade os fabricantes de emulsões parenterais têm preferido o glicerol, apesar da
sua atividade hemolítica in vitro ser superior a de outros agentes isotonizantes, como
o sorbitol e xilitol, que também são freqüentemente utilizados (FLOYD, 1999;
JUMAA e MÜLLER, 1999). As substâncias ácido p-hidroxibenzóico e compostos de
amônio quaternário estão entre os conservantes mais empregados, principalmente
devido à alta solubilidade em água e baixa tendência a particionar para a fase
oleosa (FLOYD, 1999). Os conservantes, assim como diversos outros componentes,
podem alterar o pH das formulações (HAN e WASHINGTON, 2005). Nanoemulsões
para uso parenteral devem ter seu pH normalmente ajustado para valores próximos
de 7,4, com auxílio de NaOH ou HCl, a fim de manter a compatibilidade fisiológica e
reduzir a formação de ácidos graxos livres provenientes da hidrólise dos
componentes do núcleo oleoso (KLANG e BENITA, 1998).
30
REVISÃO DA LITERATURA
3.3.2 Métodos de preparo
Diversos métodos têm sido empregados na obtenção de nanoemulsões como
sistemas de liberação de ácidos nucléicos, incluindo a homogeneização à alta
pressão (BIVAS-BENITA et al., 2004), a microfluidização (TEIXEIRA et al., 1999,
2001a, 2001b, 2003) e a ultrassonicação (KIM et al., 2001; 2003).
Mais recentemente, o procedimento de preparação de nanoemulsões por
emulsificação espontânea tem sido utilizado para a obtenção de nanoemulsões
(SILVA et al., 2006; TRIMAILLE et al., 2003; MARTINI et al., 2007; FRAGA et al.,
2008). Esse procedimento baseia-se na emulsificação espontânea dos constituintes
da fase interna (previamente solubilizados em um solvente orgânico) em água,
seguido da retirada do solvente geralmente por destilação sob pressão reduzida. A
formação das gotículas ocorre quando a fase orgânica é vertida na fase aquosa,
provocando uma turbulência interfacial que ocorre durante a difusão do solvente
orgânico na água, observando-se rápido espalhamento da interface, como resultado
da difusão mútua entre os solventes, o que fornece energia suficiente para a
formação das gotículas (MOSQUEIRA et al., 2000; BOUCHEMAL et al., 2004;
KELMANN et al., 2007; MARTINI et al., 2007; FRAGA et al., 2008). Diversos
parâmetros podem influenciar as propriedades físico-químicas das nanoemulsões
obtidas, entre eles, as condições de emulsificação empregadas e a composição
quali e quantitativa das formulações. Como um exemplo recente, FRAGA e
colaboradores (2008) demonstraram a redução progressiva do diâmetro de gotícula
de nanoemulsões lipídicas com o aumento crescente da quantidade de solventes
(etanol/água), até uma determinada proporção (1:2), a partir da qual o diâmetro
permanece inalterado.
3.3.3 Propriedades das nanoemulsões
A caracterização das propriedades físico-químicas de nanoemulsões é de
extrema importância, visto que estas podem influenciar desde a estabilidade dos
sistemas até diversos aspectos biofarmacêuticos (RABINOVICH-GUILATT et al.,
2004; DRISCOLL, 2006). Para uso parenteral, estas formas farmacêuticas devem
apresentar algumas propriedades físico-químicas definidas, como reduzido diâmetro
REVISÃO DA LITERATURA
31
de gotícula, isotonia, pH próximo ao fisiológico, baixa viscosidade, esterilidade e
apirogenicidade (WASHINGTON, 1996; ROLAND et al., 2003; DRISCOLL, 2006).
3.3.3.1 Diâmetro e morfologia de gotícula
A avaliação do diâmetro e a distribuição de gotículas da fase interna são de
grande importância no desenvolvimento de nanoemulsões de uso parenteral
(DRISCOLL, 2006). Esses sistemas apresentam normalmente uma distribuição
unimodal e diâmetro médio inferior a 500 nm (HASKELL, 1998; DRISCOLL, 2006).
Entretanto, estes parâmetros podem ser influenciados por diversos fatores,
principalmente pela composição quali e quantitativa das formulações (JUMAA e
MÜLLER, 1998; MARTINI et al., 2008) e a metodologia de preparo (ROLAND et al.,
2003; MARTINI et al., 2007; FRAGA et al., 2008).
A concentração e as propriedades físico-químicas do núcleo oleoso, como a
viscosidade e a tensão superficial também podem influenciar o diâmetro médio das
nanoestruturas, dependendo do método de preparação. Óleos de maior tensão
interfacial ou de menor viscosidade, por exemplo, conduzem à obtenção de
formulações de menores diâmetros de gotícula (JUMAA e MÜLLER, 1998; CHUNG
et al., 2001).
Ainda, constituintes da interface, como tensoativos não iônicos e lipídeos
catiônicos, também têm demonstrado influenciar no diâmetro de gotícula das
formulações (KIM et al., 2003; SILVA et al., 2006; MARTINI et al., 2008). A adição de
quantidades crescentes de lipídeos catiônicos OA e DOTAP conduziu a uma
redução no diâmetro de gotícula de nanoemulsões catiônicas, sendo que o menor
tamanho observado foi para lipídeos catiônicos na concentração de 2 mM (MARTINI
et al., 2008). Concentrações crescentes de lipídeo estearilamina e a presença de um
tensoativo não iônico, Poloxâmero 188, também reduziram o diâmetro médio das
gotículas das formulações (SILVA et al., 2006). Outros autores não verificaram
alterações significativas com adição de maiores concentrações de estearilamina
(FRAGA et al., 2008) ou de um lipídeo contendo dois grupamentos amina catiônicos
(HAGIGIT et al., 2008).
32
REVISÃO DA LITERATURA
Além da espectroscopia de correlação de fótons, também denominada de
espalhamento de luz dinâmico, técnicas microscópicas têm sido empregadas para a
avaliação do diâmetro de gotícula de nanoemulsões, como transmissão, varredura e
criofratura (BENITA e LEVY, 1993; HASKELL, 1998; TIAN e LI, 1998). O uso da
microscopia visa verificar, além do diâmetro de gotícula, a morfologia das mesmas.
Estas normalmente apresentam-se esféricas com bordas definidas, após o uso de
reagentes de contraste negativo, como o acetato de uranila (MARTINI, 2005). Além
destas estruturas ditas clássicas, a microscopia eletrônica de transmissão permite a
visualização da coexistência de organizações em multicamada, estruturas em forma
de bolsa de mão, ou ainda, do tipo cromatina (TEIXEIRA et al., 2001a; KIM et al.,
2003). A agregação das gotículas de nanoemulsões induzida pela adsorção de
ácidos nucléicos também pode ser observada microscopicamente como no caso de
formulações contendo lipídeos policatiônicos (TEIXEIRA et al., 2001a).
3.3.3.2 Potencial zeta
A determinação do potencial zeta é geralmente realizada através de técnicas
eletroforéticas específicas. Este parâmetro é um fator crítico na caracterização de
nanoemulsões, uma vez que reflete a composição da interface do sistema, em
relação aos tensoativos formadores do filme interfacial ou em relação à presença de
moléculas com carga, localizadas na interface. Além disso, é importante para a
avaliação da estabilidade físico-química das emulsões. Se o potencial for
relativamente elevado em módulo (maior de 25 mV) as forças repulsivas do sistema
superam as forças de London que atraem as gotículas entre si, caracterizando um
sistema defloculado (KLANG e BENITA, 1998; ROLAND et al., 2003).
Conforme mencionado anteriormente, as lecitinas são misturas heterogêneas
de fosfolipídeos neutros e negativamente carregados em pH fisiológico. Com essa
carga global negativa, conduzem a valores de potencial zeta de -40 a -50 mV em
sistemas coloidais compostos por elas (BENITA e LEVY, 1993). Este potencial
contribui para a repulsão entre as gotículas e conseqüente estabilidade do sistema
(ROLAND et al., 2003). Com a adição de lipídeos catiônicos na formulação, visando
à associação de ácidos nucléicos, origina-se uma interface carregada positivamente
REVISÃO DA LITERATURA
33
(ζ=30-55 mV) (TEIXEIRA et al., 1999). Esta carga será dependente da concentração
e do grau de ionização dos grupamentos de carga positiva dos lipídeos catiônicos.
Diversos estudos avaliam a influência do tipo e da concentração dos lipídeos
catiônicos sobre o potencial zeta de nanoemulsões (KIM et al., 2003; RABINOVICH-
GUILATT et al., 2004; SILVA et al., 2006; HAGIGIT et al., 2008; MARTINI et al.,
2008). A adição de quantidades crescentes de lipídeos catiônicos conduz a um
aumento progressivo do potencial zeta até uma determinada concentração, a partir
da qual a carga de superfície permanece inalterada, sendo esta relacionada com a
saturação da interface (KIM et al., 2003; FRAGA et al., 2008; MARTINI et al., 2008).
No caso específico de lipídeos catiônicos contendo grupamentos amina primária,
RABINOVICH-GUILATT e colaboradores (2004) descreveram fenômenos similares
de manutenção de potencial zeta constante, entretanto, neste caso, sendo
associado à redução da ionização dos lipídeos devido ao elevado pH da interface.
Alguns autores também têm avaliado o potencial zeta em função da
concentração de ácido nucléico utilizado (TEIXEIRA et al., 2001a; MIN et al., 2005;
MARTINI et al., 2007; 2008; HAGIGIT et al., 2008). A associação de ON ou DNA
pode conduzir a formação de agregados e desestabilização do sistema. Para evitar
este fenômeno, utiliza-se normalmente uma relação de cargas [+/-] positiva, ou seja,
um excesso de carga positiva (aportada pelos lipídeos catiônicos) em relação ao
número de grupamentos fosfato dos ácidos nucléicos (TEIXEIRA et al., 2001a; KIM
et al., 2002; MARTINI et al., 2007). Ou então, pode-se utilizar relação [+/-] negativa,
desde que se situe após a zona de potencial zeta nulo (zona de agregação das
gotículas da fase interna), de forma que a estabilidade das nanoemulsões seria
assegurada pela repulsão eletrostática dos ácidos nucléicos adsorvidos na interface
O/A (TRIMAILLE et al., 2003).
3.3.3.3 pH
Nanoemulsões de uso parenteral devem apresentar um pH na faixa da
neutralidade, próximo ao pH fisiológico de 7,4 (DRISCOLL, 2006). O controle do pH
também tem importância na estabilidade destes sistemas, pois o pH inicial de uma
emulsão tende a diminuir progressivamente com o tempo. Este fenômeno ocorre
34
REVISÃO DA LITERATURA
devido à hidrólise dos triglicerídeos e fosfolipídeos do núcleo oleoso, que liberam
ácidos graxos livres, os quais reduzem o pH das formulações (KLANG e BENITA,
1998).
A adição de lipídeos catiônicos às formulações pode conduzir a valores de pH
alcalinos, em virtude da presença de grupamentos amina primárias, como no caso
da estearilamina e OA (TEIXEIRA et al., 1999, 2001a, 2001b). O ajuste do pH de
nanoemulsões catiônicas com ácidos diluídos tem sido descrito principalmente para
formulações contendo estes lipídeos (TEIXEIRA et al., 1999, 2001a, 2003;
RABINOVICH-GUILATT et al., 2004; MARTINI et al., 2008), visando obter em teoria,
uma interface completamente ionizada para a adsorção dos ácidos nucléicos
(RABINOVICH-GUILATT et al., 2004).
3.3.3.4 Viscosidade
A avaliação das propriedades reológicas de nanoemulsões de uso parenteral
é de grande importância, uma vez que formulações demasiadamente viscosas
podem representar uma limitação no momento da administração intravenosa
(JUMAA e MÜLLER, 1998). Estas formulações apresentam um comportamento
reológico do tipo newtoniano, sendo que a viscosidade é principalmente influenciada
pela concentração de óleo da fase interna e pelo diâmetro de gotícula (JUMAA e
MÜLLER, 1998; ROLAND et al., 2003; SILVANDER et al., 2003). Um menor
diâmetro pode conduzir a uma maior superfície específica, o que resultaria em um
aumento das interações interparticulares e, conseqüentemente, uma maior
viscosidade (ISHII et al., 1990; SILVA et al., 2006). Contudo, MARTINI (2005) e
FRAGA (2007) não detectaram modificações expressivas na viscosidade com a
variação do diâmetro de gotícula de cerca de 200 a 350 nm.
Entretanto, os mesmos autores relatam uma tendência significativa (p<0,05)
ao aumento da viscosidade até cerca de 2,0 cP para elevadas concentrações dos
lipídeos catiônicos OA e estearilamina (20 mM). Outros autores também têm
relacionado um aumento na viscosidade de sistemas submicrométricos lipídicos com
a presença de elevadas concentrações de tensoativos nas formulações (ISHII et al.,
1990; JUMAA e MULLER, 1998). Concentrações crescentes de estearilamina, ou a
REVISÃO DA LITERATURA
35
presença de poloxâmero 188 disperso na fase aquosa externa das nanoemulsões,
podem influenciar as propriedades reológicas destes sistemas através de um
aumento na viscosidade (SILVA et al., 2006).
A viscosidade de nanoemulsões, assim como os parâmetros mencionados
anteriormente, também fornece dados sobre a estabilidade dos sistemas. A máxima
viscosidade encontrada por SILVANDER e colaboradores (2003) para emulsões de
uso parenteral, coincidiu com regiões de potencial zeta muito baixo (em módulo), o
que indica uma relação com o processo de instabilidade do sistema (floculação).
3.3.4 Estudos de adsorção
Diversos métodos têm sido empregados na avaliação da associação dos
ácidos nucléicos com nanoemulsões catiônicas. Alguns deles baseiam-se na
determinação qualitativa e/ou semiquantitativa da associação, através das
modificações das propriedades físico-químicas das nanoemulsões ou dos ensaios
de retardamento em gel de eletroforese (KIM et al., 2002; BARUT et al., 2005;
FRAGA, 2007; HAGIGIT et al., 2008). Em relação à técnica de retardamento em gel
de eletroforese, a avaliação da associação do ácido nucléico com as nanoemulsões
ocorre quando não se detecta banda característica de migração de ácido nucléico
livre no gel (KIM et al., 2002; HAGIGIT et al., 2008).
Os métodos baseados na avaliação quantitativa são muitas vezes de
determinação indireta da associação, através da diferença entre a quantidade de
ácido nucléico adicionada às nanoemulsões e a quantidade determinada na fase
aquosa externa da nanoestrutura (não associada). A centrifugação em altas
velocidades permite a separação das fases oleosas e aquosas, para posterior
determinação dos ácidos nucléicos livres na fase aquosa (OTT et al., 2002). Já a
técnica de ultrafiltração/centrifugação, amplamente utilizada, envolve a separação de
uma pequena porção da fase aquosa externa, de forma a não interferir com o
equilíbrio do sistema (TEIXEIRA et al., 1999; TRIMAILLE et al., 2003; HAGIGIT et
al., 2008; MARTINI et al., 2008; OEHLKE et al., 2008).
36
REVISÃO DA LITERATURA
Diversos estudos têm determinado a capacidade de associação de ácidos
nucléicos a nanoemulsões catiônicas. TEIXEIRA e colaboradores (1999) avaliaram a
taxa de associação de uma série de ON politimidilatos contendo de 16 até 50
nucleotídeos com nanoemulsões adicionadas do lipídeo catiônico estearilamina.
Uma eficiência de associação de cerca de 100% foi obtida para ON contendo 16
nucleotídeos, enquanto fragmentos maiores mostraram uma redução progressiva da
taxa de associação, até um mínimo de 50% para o ON contendo 50 nucleotídeos.
Recentemente, outros autores avaliaram a influência de diferentes lipídeos
catiônicos sobre a capacidade de associação de fragmentos de ácidos nucléicos
(MARTINI, 2005; SILVA et al., 2006; FRAGA, 2007; HAGIGIT et al., 2008). De
acordo com SILVA e colaboradores (2006), formulações contendo estearilamina
mostraram eficácia de associação superior (90%) em relação a formulações
contendo apenas lecitina, evidenciando o efeito do lipídeo catiônico na formulação.
HAGIGIT e colaboradores (2008) compararam formulações para uso oftálmico
contendo ON de 17 bases complexados a nanoemulsões contendo três diferentes
lipídeos catiônicos: OA, DOTAP e um lipídeo catiônico sintético contendo dois
grupamentos amina. A taxa de complexação foi elevada para a concentração de 10
µM de ON, chegando a valores de 96% para DOTAP. Essa formulação mostrou-se
fisicamente mais estável e apresentou a maior capacidade de retenção dos ON em
estudo de liberação in vitro.
Ainda comparando diferentes lipídeos catiônicos, MARTINI e colaboradores
(2008) prepararam diversas nanoemulsões contendo OA e DOTAP para associação
de um ON modelo (pdT
16
). Independente do lipídeo utilizado, os autores
demonstraram um perfil de adsorção caracterizado por duas etapas distintas: um
aumento progressivo da quantidade de ON associado até um máximo característico
para cada lipídeo catiônico (até cerca de 70 mg/g para DOTAP e 40 mg/g para OA),
seguido de uma etapa na qual a adição suplementar de ON não altera a quantidade
adsorvida, provavelmente relacionado com a saturação dos sítios de interação dos
lipídeos catiônicos.
No estudo de FRAGA e colaboradores (2008), a complexação de ON e de
DNA a nanoemulsões catiônicas contendo estearilamina também foi elevada (95%)
em relação a formulações contendo apenas lecitina. Esta elevada taxa de
REVISÃO DA LITERATURA
37
associação obtida nos estudos mencionados (FRAGA et al., 2008; MARTINI et al.,
2008) foi atribuída ao excesso de moléculas de lipídeos catiônicos presente na
interface das gotículas, disponível para interagir com o DNA. De maneira geral,
essas interações eletrostáticas governam as interações entre os ON e os lipídeos
catiônicos, sendo a relação de cargas o principal fator que influencia a taxa de
associação com as nanoemulsões (TEIXEIRA et al., 2001a, 2001b).
3.3.4.1 Modelos de adsorção em interface
Estudos do mecanismo de adsorção de moléculas são de extrema
importância no desenvolvimento de formulações. Um processo de adsorção
favorável de uma determinada molécula, provavelmente será relacionado a um
processo de eluição ou liberação desfavorável (PERRY e CHILTON, 1986). O
fenômeno de adsorção pode ser classificado em físico ou químico. Quando o
adsorvato se liga a superfície apenas por forças de van der Waals, com baixos
calores de adsorção, de forma não-específica e reversível, denomina-se adsorção
física. A adsorção química é específica e irreversível, geralmente envolvendo a
formação de uma única camada sobre o adsorvente (SINKO, 2006). Algumas vezes,
uma etapa preliminar de adsorção física precede a adsorção química (NETZ e
GONZÁLEZ ORTEGA, 2002).
As isotermas de adsorção se caracterizam por uma relação entre a
quantidade adsorvida e a concentração do adsorvato, a uma temperatura constante
(PERRY e CHILTON, 1986). Sua representação gráfica tem sido utilizada em alguns
trabalhos para demonstrar a adsorção de moléculas de ácidos nucléicos sobre a
interface de nanoemulsões (TRIMAILLE et al., 2003; MARTINI et al., 2007; 2008).
Existem vários modelos de adsorção baseados em diversas equações
destinadas a estimar o adsorvato presente, a uma dada temperatura. Um dos
modelos teóricos mais simples é o de Langmuir, que é utilizado para representar
sistemas com adsorção em monocamadas homogêneas, assumindo que todos os
sítios de adsorção são equivalentes, finitos, bem definidos e localizados, sendo que
cada sítio pode acomodar somente uma entidade adsorvida. Além disso, assume
que o processo ocorre com interações laterais desprezíveis entre as moléculas do
38
REVISÃO DA LITERATURA
adsorvato (PERRY e CHILTON, 1986; NETZ e GONZÁLEZ ORTEGA, 2002; PINO,
2005; GUO e GEMEINHART, 2008).
Em outros casos o sistema pode ser descrito pela Isoterma de Freundlich,
que é um dos modelos mais utilizados em adsorção não linear, pois além de
aplicável a superfícies muito heterogêneas, pode ser considerado também para
superfícies homogêneas (PINO, 2005; GUO e GEMEINHART, 2008). As isotermas
de Freundlich correspondem a uma distribuição exponencial dos calores de
adsorção, indicando uma adsorção em multicamada (PERRY e CHILTON, 1986).
Este modelo, entretanto, falha quando a concentração de adsorvato é muito elevada
(NETZ e GONZÁLEZ ORTEGA, 2002).
Os modelos de Langmuir e Freundlich são importantes na descrição da
adsorção química, embora sejam igualmente importantes para a descrição da
adsorção física, juntamente com outros modelos (BANSAL e GOYAL, 2005). Os
modelos de Langmuir e Freundlich são os mais simples e mais utilizados para
descrever sistemas de adsorção, apesar de terem sido inicialmente propostos para
sistemas sólido-vapor. Eles descrevem isotermas do tipo I, favoráveis,
representadas por curvaturas convexas para cima nos gráficos das isotermas de
adsorção, conforme classificação de Brunauer e colaboradores. As curvas côncavas
para cima (tipo III) são as ditas desfavoráveis ao processo de adsorção. As
isotermas podem ainda possuir um ou mais pontos de inflexão em suas curvaturas
(tipos II, IV ou V) (PERRY e CHILTON, 1986; SINKO, 2006).
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