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SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE OLIGÔMEROS DE
ACROLEÍNA PARA APLICAÇÃO NA MODIFICAÇÃO
QUÍMICA DE HEMOGLOBINA
Patricia Reis Pinto
Tese em Ciência e Tecnologia de Polímeros, submetida ao corpo docente do
Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de
Doutor em Ciências, em Ciência e Tecnologia de Polímeros, realizada sob a
orientação das Professoras Cristina Tristão de Andrade e Maria de Fátima Vieira
Marques.
Rio de Janeiro
2009
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ii
Tese de Doutorado:
Síntese e Caracterização de Oligômeros de Acroleína para Aplicação na
Modificação Química de Hemoglobina.
Autor: Patrícia Reis Pinto
Orientadoras: Cristina Tristão de Andrade
Maria de Fátima Vieira Marques
Data da defesa: 03 de março de 2009
Aprovada por:
___________________________________________
Cristina Tristão de Andrade, DSc – Orientadora
UFRJ / IMA
___________________________________________
Maria de Fátima Vieira Marques, DSc – Orientadora
UFRJ / IMA
__________________________________________
Wang Shu Hui, DSc
USP/Dpto Eng. Metalúrgica e de Material
__________________________________________
Maria Celiana Pinheiro Lima, DSc
IFRJ
__________________________________________
Marcos Antônio da Silva Costa, DSc
UERJ/IQ
___________________________________________
Ricardo Cunha Michel, DSc
UFRJ / IMA
Rio de Janeiro
2009
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Pinto, Patricia Reis.
Síntese e Caracterização de Oligômeros de Acroleína para
Aplicação na Modificação Química de Hemoglobina / Patrícia Reis
Pinto. – Rio de Janeiro, 2009.
xx, 141f.:il.
Tese (Doutorado em Ciência, em Ciência e Tecnologia de
Polímeros) – Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Instituto
de Macromoléculas Professora Eloisa Mano – IMA, 2009.
Orientadores: Cristina Tristão de Andrade e Maria de Fátima Vieira
Marques.
1. Polimerização aniônica da acroleína 2. Hemoglobina bovina
modificada 3. Carreador temporário de oxigênio I. Andrade, Cristina
Tristão; Marques, Maria de Fátima Vieira (Orient.). II. Universidade
Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Macromoléculas Professora
Eloisa Mano. III. Título.
iv
Esta Tese de Doutorado foi desenvolvida nos
Laboratórios do Instituto de Macromoléculas
Professora Eloisa Mano da Universidade Federal do
Rio Janeiro, com apoio do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), do
Conselho de Ensino para Graduados e Pesquisa
(CEPG/UFRJ) e da Fundação Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
v
Dedico este trabalho ao Senhor Jesus Cristo.
Desejo que esta Tese de Doutorado contribua de
alguma forma, para o cumprimento dos Seus
planos na Terra.
vi
AGRADECIMENTOS
● Ao Senhor JESUS CRISTO que tem cuidado de mim e me tem dado, entre
muitas outras coisas, a oportunidade de estudar e concluir este trabalho;
● Ao meu marido pelo seu amor e companheirismo que tem tornado a minha vida
mais feliz;
● As minhas orientadoras Cristina Tristão de Andrade e Maria de Fátima Vieira
Marques pela dedicação, pela perseverança, pela paciência e pela amizade;
● Aos Alunos de Iniciação científica que contribuíram efetivamente para realização
deste trabalho; Ana Luísa, Maithê Couto, Marcus Claufbruch e Diego Steffani
● A minha tia Lavínia pelo seu apoio e amor
● As amigas de todas as horas; Ana, Andréa, Clarice e Elis
● A equipe do laboratório J122; Ana Luisa, Ana Karina, Amanda, Jeferson, Juliana,
Gleice, Francisco, Lidiane, Luanda, Kamila, Michele, Mônica, Patrícia, Rafaela,
Renata, Renatinha, Renato e Sabrina
● A equipe do laboratório J123; Bianca, Felipe, Gisela, Ivan, Márcia, Natália e
Regina
● A Márcia Benzi, Léa Lopes, Bárbara, Natali e Luciana por terem me ensinado a
manusear os equipamentos FTIR, TGA e light scattering respectivamente,
● A equipe do lab da prof Elizabeth Lucas pelo uso do equipamento Zetasizer-
Nano
● Aos meus amigos de turma; André, Celiana, Paula, Tathiane, Luciana Cunha e
Luciana Portal, pela amizade e pelos momentos de alegria e descontração
vii
● Ao Prof Ricardo Michel pela elucidação da técnica de espalhamento de Luz
● A equipe da biblioteca e a Graça pela palavra amiga e pelo carinho dispensado a
mim
● Ao Sr Wilson pela atenção sempre que precisei e pelas caronas até a av. Brasil.
● As minhas queridas professoras: Penha e Maura pela amizade e pelo incentivo
na edificação da minha carreira.
viii
Resumo da Tese apresentada no Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa
Mano da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (DSc), em Ciência e
Tecnologia de Polímeros.
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE OLIGÔMEROS DE ACROLEÍNA PARA
APLICAÇÃO NA MODIFICAÇÃO QUÍMICA DE HEMOGLOBINA
Patricia Reis Pinto
Orientadoras: Cristina Tristão de Andrade e Maria de Fátima Vieira Marques
A modificação química da hemoglobina é usada para a obtenção de carreadores de
oxigênio temporários. Tal modificação tem como principal objetivo promover ligações
cruzadas entre as subunidades da hemoglobina para evitar a dissociação do
tetrâmero e, assim, a sua subsequente toxicidade. Esse trabalho teve como objetivo
preparar homopolímeros de acroleína e copolímeros de acroleína e estireno para
uso como agentes formadores de ligações cruzada em hemoglobina bovina (HbBv).
Os polímeros e oligômeros de acroleína foram obtidos por meio de polimerizações
aniônicas, em presença de sec-butil lítio e terc-butil lítio. Diferentes razões molares
monômero/iniciador foram usadas. Os produtos resultantes foram avaliados quanto
à solubilidade, à composição química e ao teor de grupamentos aldeído em suas
microestruturas. Os bioconjugados de HbBv foram avaliados quanto à capacidade
de autooxidação. Os bioconjugados que apresentaram maiores e menores
diâmetros hidrodinâmicos foram também avaliados quanto à vasoconstrição.
Rio de Janeiro – 2009
ix
Abstract of Dissertation presented to Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa
Mano of Universidade Federal do Rio de Janeiro, as partial fulfillment of the
requirement for the degree of Doctor in Science (DSc), Science and Technology of
Polymers.
SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF ACROLEIN OLYGOMERS FOR
APPLICATION IN CHEMICAL MODIFICATION OF HEMOGLOBIN
Patricia Reis Pinto
supervisors: Cristina Tristão de Andrade e Maria de Fátima Vieira Marques
The chemical modification of hemoglobin is generally used for preparation of
temporary oxygen carriers. Such a modification has as main aim to promote the
formation of covalent bonds between hemoglobin subunits, to prevent tetramer
dissociation, and thus to minimize toxicity. This work had as objective to prepare
acrolein homopolymers, and acrolein and styrene copolymers, to be used as
crosslinking agents for bovine hemoglobin (HbBv). Homopolymers and copolymers
were obtained by anionic polymerization, in presence of sec-butyl and tert-butyl
litium. Different monomer/ initiator molar ratios were used. The solubility, chemical
composition, and the aldehyde content of the resulting products were evaluated.
HbBv bioconjugates were characterized as for their autooxidation characteristics.
The ability to cause vasoconstriction was evaluated for the bioconjugates that
presented the highest and the lowest hydrodynamic diameters.
Rio de Janeiro - 2009
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................01
2. OBJETIVO..............................................................................................................03
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................04
3.1. A HEMOGLOBINA.........................................................................................04
3.1.1. Modificações Químicas em Hemoglobinas..........................................07
3.1.2. Tipos de reações na hemoglobina que levam a um carreador
de oxigênio.............................................................................................08
3.1.2.1. Reações de Piridoxilação e Agentes Promotores de
Lligações intramoleculares............................................................09
3.1.2.2. Reação para aumento de massa molar - peguilação..................10
3.1.2.3. Reações para obtenção de estruturas conjugadas (poli-Hb)...... 15
3.1.2.3.1. Glutaraldeído........................................................................15
3.1.2.3.2. Sacarídeos e polissacarídeos oxidados...............................18
3.2. POLIMERIZAÇÃO IÔNICA............................................................................24
3.2.1. Cinética da polimerização com terminação...........................................27
3.2.2. Polimerização iônica da Acroleína........................................................ 28
3.2.2.1. Mecanismo de polimerização iônica da acroleína........................30
4. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................34
4.1. MATERIAIS....................................................................................................34
4.2. METODOLOGIA.............................................................................................35
4.2.1. Obtenção de um concentrado de hemoglobina bovina purificada........35
4.2.1.1. Concentração de Hemoglobina Bovina........................................36
4.2.2. Síntese das moléculas utilizadas para promover as
ligações intermoleculares nas HbBvs....................................................37
4.2.2.1. Síntese dos homopolímeros e copolímeros de acroleína............37
4.2.2.2. Caracterização dos oligômeros de acroleína...............................37
4.2.2.2.1. Espectroscopia de absorção na região do
infravermelho (FTIR)............................................................37
4.2.2.2.2. Espectrometria de ressonância magnética de
hidrogênio (
1
H NMR)............................................................37
4.2.2.2.3. Análise termogravimétrica (TGA).........................................38
4.2.2.2.4. Cromatografia em Permeação de Gel (GPC)......................38
xi
4.2.2.2.5. Quantificação do teor de aldeído nos oligômeros
de acroleína..........................................................................38
4.2.2.2.6. Teste de solubilidade............................................................39
4.2.2.2.7. Estudo da velocidade de conversão....................................40
4.2.3. Reação para obtenção de estruturas tipo poliHb (Bioconjugados).......40
4.2.3.1. Caracterização dos Bioconjugados..............................................40
4.2.3.1.1. Concentração de HbBv nos Bioconjugados.........................40
4.2.3.1.2. Espectroscopia de absorção na região do
infravermelho (FTIR)............................................................40
4.2.3.1.3. Avaliação da HbBv modificada quanto à autooxidação.......41
4.2.3.1.4. Avaliação da HbBv modificada quanto à
natureza macromolecular.....................................................41
4.2.4. Avaliação dos bioconjugados quanto à vasoconstrição e à
interferência em testes clínicos.............................................................42
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................................44
5.1. HOMOPOLÍMEROS DE ACROLEÍNA...........................................................44
5.1.1. Análise de Cromatografia de Permeação em Gel.................................44
5.1.2. Análises de Espectrometria de Absorção no Infravermelho.................48
5.1.3. Análises de Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear
de Hidrogênio (
1
H NMR)........................................................................53
5.1.4. Análise térmica e estudo da microestrutura para as
amostras sintetizadas com o iniciador sec-BuLi...................................57
5.1.5. Avaliação da concentração de grupamentos CHO disponíveis
no oligômeros de acroleína...................................................................65
5.1.6. Análise da solubilidade dos oligômeros de acroleína em
diversos solventes.................................................................................70
5.1.7. Estudo de conversão versus tempo......................................................71
5.1.7.1. Estudo da degradação térmica e microestrutura para as
frações obtidas a diferentes tempos de polimerização................77
5.2. COPOLÍMEROS DE ACROLEÍNA E ESTIRENO..........................................82
5.2.1. Análise de Cromatografia de Permeação em Gel.................................82
5.2.2. Análise de Espectrometria de absorção no Infravermelho...................84
5.2.3. Análise Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear
de Hidrogênio (
1
H NMR)........................................................................88
xii
5.2.4. Análise de termogravimetria..................................................................93
5.2.5. Avaliação da concentração de grupamentos CHO disponíveis
nos copolímeros de acroleína e estireno..............................................98
5.2.6. Avaliação da solubilidade dos copolímeros de acroleína e estireno. .101
5.3. BIOCONJUGADOS DE HbBv E DERIVADOS DE POLIACROLEÍNA........102
5.3.1. Obtenção dos bioconjugados de HbBv e derivados de acroleína......102
5.3.2. Análise de Espectrometria de Absorção no Infravermelho.................105
5.3.3. Avaliação dos bioconjugados quanto a autooxidação........................108
5.3.4. Avaliação dos bioconjugados quanto a natureza macromolecular.....112
5.3.5. Avaliação dos bioconjugados quanto a vasoconstrição......................129
5.3.6. Avaliação dos bioconjugados quanto a interferência em testes
clínicos.................................................................................................131
6. CONCLUSÃO.......................................................................................................133
7. SUGESTÕES........................................................................................................133
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................134
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. a) Estrutura química do heme; b) Eixos das ligações de coordenação
do átomo de ferro no anel de porfirina.................................................... 04
Figura 2. Deslocamento do átomo de ferro em função de sua ligação com O
2
....05
Figura 3. Esquema das principais reações de modificação química em
hemoglobinas...........................................................................................08
Figura 4. Análise de SEC para o PHP adicionado à Hb não modificada
e modificada.............................................................................................14
Figura 5. Gráfico de saturação X tempo para Hb-PEG, Hb purificada e Hb-αα.....19
Figura 6. Análise cromatográfica para a HbBv não modificada X HbBv modificada
por 1-O-metil glicose................................................................................22
Figura 7. Estrutura química para a acroleína..........................................................28
Figura 8. Possíveis díades para a poliacroleína.....................................................29
Figura 9. Mecanismo de inserção monomérica considerando a forma enólica
deslocalizada como a extremidade em crescimento...............................31
Figura 10. Mecanismo de inserção monomérica considerando a forma oxânion
(3,4) como a extremidade em crescimento.............................................31
Figura 11. Reação por transferência de cadeia intramolecular que conduz
à formação de estruturas cíclicas............................................................32
Figura 12. Reação da carbonila aldeídica com a DNFH..........................................38
Figura 13. Massas molares (M
w
) versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas
por sec-BuLi.............................................................................................46
Figura 14. Massas molares (M
w
) versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas
por terc-BuLi............................................................................................46
Figura 15. Polidispersão versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por
sec-BuLi...................................................................................................47
Figura 16. Polidispersão versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por
terc-BuLi...................................................................................................48
Figura 17. Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidos
em diferentes razões [M]/[I] para o iniciador terc-BuLi............................49
Figura 18. Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidos a
diferentes razões [M]/[I] para o iniciador sec-BuLi..................................50
Figura 19. Variação da microestrutura com o aumento da razão [M]/[I] para
xiv
as amostras obtidas com terc-BuLi; a) [M]/[I]=10, b) [M]/[I]=40, c)
[M]/[I]=80..................................................................................................51
Figura 20. Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidas a razão
[M]/[I] igual a 10 para o iniciador sec-BuLi (PA27) e terc-BuLi (PA13)....52
Figura 21. Espectro de
1
H NMR da amostra obtida para razão molar [M]/[I] = 20
com iniciador sec-BuLi.............................................................................53
Figura 22. Espectro de
1
H NMR da amostra obtida em razão molar [M]/[I] = 20
com iniciador sec-BuLi.............................................................................55
Figura 23. Espectro de
1
H
NMR da amostra PA25...................................................55
Figura 24. Curvas de degradação térmica para os oligômeros de acroleína
obtidos em diferentes razões [M]/[I] com o iniciador sec-BuLi................58
Figura 25. Curva de degradação térmica e curva derivativa para a amostra
PA23.........................................................................................................59
Figura 26. Espectro de FTIR para as frações degradadas da amostra PA23..........59
Figura 27. Curva de degradação térmica e curva derivada para a amostra PA27. .60
Figura 28. Espectro de FTIR para as frações degradadas da amostra PA27..........61
Figura 29. Integração da curva da primeira derivada da perda de massa da
amostra PA23, considerando-se a linha de base....................................62
Figura 30. Integração da curva da primeira derivada da perda de massa da
amostra PA27, considerando-se a linha de base....................................62
Figura 31. Curvas de DTG para as amostra obtidas por terc-BuLi..........................64
Figura 32. Concentração de aldeídos em função da razão [M]/[I] para os
oligômeros obtidos por sec-BuLi.............................................................66
Figura 33. Concentração de aldeídos em função da razão [M]/[I] para os
oligômeros obtidos por terc-BuLi.............................................................67
Figura 34. Concentração de [CHO] versus [M]/[I] pelo método da DNFH
(sec-BuLi).................................................................................................67
Figura 35. Concentração de [CHO] versus [M]/[I] pelo método TGA (sec-BuLi)......68
Figura 36. Gráfico de M
w
versus a concentração de CHO para os
oligômeros obtidos com sec-BuLi............................................................69
Figura 37. Gráfico de M
w
versus a concentração de CHO para os
oligômeros obtidos com terc-BuLi...........................................................69
Figura 38. Estudos de conversão em função o tempo para razões molares
[M]/[I] = 6, 40, 500 e 1000 para as amostras obtidas com iniciador
xv
sec-BuLi...................................................................................................71
Figura 39. Estudos de conversão em função o tempo para razões molares
[M]/[I] = 6, 40, 500 e 1000 para as amostras obtidas com iniciador
terc-BuLi...................................................................................................72
Figura 40. Gráfico de conversão versus [M]/[I] para as amostras obtidas
pelo iniciador terc-BuLi............................................................................73
Figura 41. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de polimerização da acroleína PA28 obtidos na razão [M]/[I] = 6 com
o iniciador sec-BuLi..................................................................................74
Figura 42. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de reação do oligômero de acroleína PA31 obtidos na razão [M]/[I] = 6
com o iniciador terc-BuLi.........................................................................74
Figura 43. Espectro de FTIR das frações retiradas a 10 min e 50 min do
oligômero de acroleína PA31 obtidos na razão [M]/[I] = 6 com o
iniciador terc-BuLi....................................................................................75
Figura 44. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de reação do oligômero de acroleína PA23 obtidos na razão
[M]/[I] = 40 com o iniciador sec-BuLi.......................................................76
Figura 45. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de reação do oligômero de acroleína PA36 obtidos na razão [M]/[I] = 40
com o iniciador terc-BuLi.........................................................................77
Figura 46. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de
reação do oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 500 com
o iniciador sec-BuLi..................................................................................78
Figura 47. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de reação do oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 500
com o iniciador terc-BuLi.........................................................................78
Figura 48. Espectro de FTIR das frações retiradas a 10min, 35min e 85min
do oligômero de acroleína PA500 obtidos na razão [M]/[I] = 500 com
o iniciador terc-BuLi.................................................................................79
Figura 49. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
de reação do oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 1000
com o iniciador sec-BuLi..........................................................................80
Figura 50. Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos
xvi
de reação do oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 1000
com o iniciador terc-BuLi.........................................................................80
Figura 51. Espectro de FTIR das frações retiradas a 10min e 50min do oligômero
de acroleína PA1000 obtidos na razão [M]/[I] = 1000 com o iniciador
terc-BuLi...................................................................................................81
Figura 52. M
w
versus a concentração de acroleína no meio reacional....................83
Figura 53. Polidispersão versus a concentração de acroleína.................................84
Figura 54. Espectros de FTIR para o poliestireno (PS), copolímero de acroleína
e estireno (PAS) e homopolímero de acroleína......................................85
Figura 55. Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros iniciados por sec-BuLi
para as amostras preparadas em pastilha de KBr..................................86
Figura 56. Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros obtidos com o iniciador
sec-BuLi para as amostras preparadas em filme vazado sobre a célula
de KBr......................................................................................................87
Figura 57. Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros sintetizados por
terc-BuLi para as amostras preparadas em pastilha de KBr...................88
Figura 58. Espectro de NMR da amostra PAS2.......................................................89
Figura 59. Espectro de NMR da amostra PAS3.......................................................90
Figura 60. Espectro de NMR da amostra PAS4.......................................................90
Figura 61. Espectro de NMR da amostra PAS5.......................................................91
Figura 62. Espectro de NMR da amostra PAS6.......................................................91
Figura 63. Espectro de NMR da amostra PAS7.......................................................92
Figura 64. Curvas de DTG para poliestireno (PS), para a poliacroleína (PA) e
para o copolímero de acroleína e estireno..............................................94
Figura 65. Curvas de TG e DTG para o copolímero obtido na razão
[acro]/[sty] = 1:1.......................................................................................95
Figura 66. Espectros de FTIR para o copolímero obtido na razão
[acro]/[sty] = 1:1 degradado a 354ºC e 552ºC.........................................95
Figura 67. Curvas de DTG para os copolímeros de estireno e acroleína obtidos
com o iniciador por sec-BuLi...................................................................96
Figura 68. Curvas de TG e DTG para o copolímero obtido na razão
[acro]/[sty] = 9:1.......................................................................................97
Figura 69. Espectros de FTIR para o copolímero obtido na razão
[acro]/[sty] = 9:1 degradado a 112ºC, 295ºC, 367ºC, 418ºC e 524ºC....97
xvii
Figura 70. Concentração de grupos aldeído em função da razão molar
[acro]/[sty] para os copolímeros obtidos por sec-BuLi..........................100
Figura 71. Concentração de grupos aldeído em função da razão molar
[acro]/[sty] para os copolímeros obtidos por terc-BuLi..........................100
Figura 72. Gráfico de M
w
versus concentração de CHO para os oligômeros
obtidos por sec-BuLi..............................................................................101
Figura 73. Espectros de FTIR para a HbBv não modificada versus Hb-PAS12...105
Figura 74. Espectros de FTIR para o copolímero PAS12 versus HbPAS12..........106
Figura 75. Espectros de FTIR para os bioconjugados sintetizados
com homopolímeros..............................................................................107
Figura 76. Espectros de FTIR para os bioconjugados sintetizados com
copolímeros...........................................................................................107
Figura 77. Teor de metHb para as amostras obtidas com homopolímeros
sintetizadas com iniciador sec-BuLi......................................................110
Figura 78. Teor de metHb para as amostras obtidas com homopolímeros
sintetizadas com iniciador terc-BuLi......................................................110
Figura 79. Teor de metHb para as amostras obtidas com copolímeros
sintetizadas com iniciador sec-BuLi......................................................111
Figura 80. Teor de metHb para as amostras obtidas com copolímeros
sintetizadas com iniciador terc-BuLi......................................................111
Figura 81. Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados
obtidos com homopolímeros na razão molar de 1:10...........................124
Figura 82. Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados
obtidos com homopolímeros na razão molar de 1:100.........................125
Figura 83. Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados
obtidos com copolímeros na razão molar de 1:10................................126
Figura 84. Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados
obtidos com copolímeros na razão molar de 1:100..............................126
Figura 85. Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos
com homopolímeros na razão molar de 1:10........................................127
Figura 86. Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos
com homopolímeros na razão molar de 1:100......................................127
Figura 87. Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos
com copolímeros na razão molar de 1:10.............................................128
xviii
Figura 88. Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos
com copolímeros na razão molar de 1:100...........................................128
Figura 89. Fator de Reversão para as amostras HbBv não modificada................130
xix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Comparação entre as propriedades para Hbs com diferentes agentes
de ligações cruzadas...............................................................................10
Tabela 2. Efeito da concentração de glutaraldeído nas propriedades de P
50
,
n
H
e formação e metHb............................................................................17
Tabela 3. Efeito da concentração do agente redutor nas propriedades de P
50
,
n
H
e formação e MetHb............................................................................17
Tabela 4. Comparação entre os paradigmas antigo (1) e atual (2).........................19
Tabela 5. Propriedades físicas da Hb modificada com sacarídeos para razão
molar 50:1................................................................................................21
Tabela 6. Número de espécies alquil-lítio agregadas em solução e no estado
sólido........................................................................................................26
Tabela 7. Condições experimentais e resultados de GPC para a síntese
de oligômeros de acroleínas....................................................................45
Tabela 8. Assinalamentos dos núcleos de H para os oligômeros de acroleína......56
Tabela 9. Resultados obtidos para as amostras sintetizadas com o iniciador
sec-BuLi...................................................................................................57
Tabela 10. Cálculo para a estimativa do teor dos grupamentos constituintes
da microestrutura dos oligômeros de acroleína obtidos..........................63
Tabela 11. Teor de grupamentos aldeído para as amostras de homopolímeros
de acroleína.............................................................................................65
Tabela 12. Solubilidade relativa entre os oligômeros de acroleína em vários
solventes..................................................................................................70
Tabela 13. Condições experimentais e resultados de GPC para a síntese de
copolímeros de acroleína e estireno.......................................................82
Tabela 14. Teor relativo de estireno para os copolímeros de acroleína e estireno...93
Tabela 15. Teor de grupamentos aldeídos para as amostras de homopolímeros
de acroleína.............................................................................................98
Tabela 16. Solubilidade dos copolímeros de acroleína e estireno em diversos
solventes................................................................................................102
Tabela 17. Reagentes e condições reacionais para obtenção dos bioconjugados
com copolímeros...................................................................................103
Tabela 18. Reagentes e condições reacionais para a obtenção dos bioconjugados
xx
com homopolímeros..............................................................................104
Tabela 19. Valores de metHb para os produtos derivados dos homopolímeros....108
Tabela 20. Valores de metHb para os produtos derivados dos copolímeros..........109
Tabela 21. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução aquosa
avaliados em percentuais de intensidade.............................................113
Tabela 22. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução aquosa
avaliados em percentuais de volume....................................................114
Tabela 23. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
não filtrados, avaliados em percentuais de intensidade.......................115
Tabela 24. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
não filtrados, avaliados em percentuais de volume..............................116
Tabela 25. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
filtrados a 0,45μm, avaliados em percentuais de intensidade..............117
Tabela 26. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
filtrados a 0,45μm, avaliados em percentuais de volume.....................118
Tabela 27. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
centrifugados e avaliados em percentuais de intensidade...................120
Tabela 28. Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
centrifugados e avaliados em percentuais de volume..........................121
Tabela 29. Percentuais de interferência nos testes clínicos para a amostra
HbPA22 (1:100).....................................................................................131
1
1. INTRODUÇÃO
Um substituto para o sangue que seja seguro, prontamente injetável a
qualquer hora e em qualquer lugar, independentemente do grupo sangüíneo do
indivíduo, e que possa ser facilmente armazenado, ainda não é uma realidade
disponível à sociedade. O sangue artificial tem sido uma das descobertas mais
desejadas pelo homem. No entanto, o seu desenvolvimento tem sido prolongado por
mais de um século e o compromisso com esta descoberta tem-se tornado mais
complexo e árduo, do que o esperado. A história do desenvolvimento de um
substituto para o sangue confunde-se, em parte, com a história da transfusão do
sangue. Ela teve início na observação da circulação sanguínea por meio do
sangramento de animais realizada por Harvey no ano de 1628. No decorrer desta
história, muitas descobertas importantes foram realizadas, mas cabe aqui ressaltar
algumas delas. Em 1665, ocorreu a primeira transfusão de sangue entre animais;
em 1867, foram realizados métodos de esterelização para prevenir doenças
infecciosas; em 1940, foi determinado o fator Rh; em 1949, foram realizados os
primeiros testes clínicos com infusão de hemoglobina (Hb) humana (falha renal); em
1967, obteve-se a Hb humana purificada livre de material extracelular e também
foram realizadas as primeiras reações para a obtenção de ligações intramoleculares
na Hb; em 1973 ocorreu a modificação da Hb pelo glutaraldeído promovendo tanto
ligações intra como intermoleculares e mantendo a habilidade de transportar o O
2
;
em 1977 ocorreu a obtenção de vesículas de Hb (hemosomas); em 1979, a Hb foi
modificada com diaspirina; em 1980, a Hb foi modificada com o polioxietileno; e em
1987, a Hb foi encapsulada em lipossoma; em 1988, o processo de purificação da
Hb por HPLC foi realizado em grande escala; em 1990, as vesículas de lipossomas
foram modificadas com polioxietileno...Nestes últimos anos, a pesquisa em busca de
um substituto para o sangue se intensificou-se tanto, a ponto de existir grandes
expectativas decorrentes dos resultados de quatro produtos, que se encontram na
última fase dos testes clínicos, três deles baseados na modificação química de
hemoglobina e outro baseado na química dos perfluorcarbonos [1].
Muitos fatores estimulam os estudos para o desenvolvimento de um
substituto para o sangue, sendo o mais relevante deles a necessidade crescente em
casos de perda elevada de sangue devido a cirurgias ou traumas, associada ao
2
número decrescente de doações. Este fator agrava-se com o envelhecimento da
população [2]. Além disso, existe a expectativa de que tais produtos encontrem
valor terapêutico em situações onde o sangue não é capaz de distribuir O
2
para os
tecidos, como no caso de derrame ou infarto do miocárdio. Um substituto para o
sangue poderia também ser utilizado na conservação de órgãos para transplante e
para resolver alguns problemas relacionados à segurança das transfusões
sanguíneas [3].
Existem evidências crescentes que a transfusão de sangue halogênico altere
o sistema imune e reduza a imunocompetência do organismo; assim, o paciente
receptor do sangue aumenta a sua predisposição a infecções virais e bacterianas.
Resíduos de sangue halogênico promovem reações alérgicas. Estudos realizados
mostraram que 1 a cada 30 pacientes que receberam transfusão de sangue
apresentaram febres, sensação de frio, dores, desconfortos e urticárias; 1 a cada
1000 pacientes apresentaram reações hemolíticas; 1 a cada 5000 apresentaram
síndrome de dor respiratória aguda e 1 a cada 250.000 – 1.000.000 dos pacientes
apresentaram reações hemolíticas agudas que levaram ao óbito [4,5].
A transfusão de sangue carrega e sempre carregará um certo nível de risco.
Discussões têm sido geradas em torno da segurança desencadeada pela tragédia
da AIDS. Além da AIDS, a transfusão de sangue pode transmitir hepatite B que, por
sua vez, pode evoluir para um quadro de cirrose hepática e/ou câncer de fígado.
Outras doenças como malária, leishmaniose, doença de Chagas, e outras
encefalopatias degenerativas podem também ser adquiridas por meio de uma
transfusão de sangue [6]. Por estes e outros motivos, o desenvolvimento de um
substituto para o sangue é extremamente importante e possui caráter emergencial.
Grande parte dos trabalhos relatados na literatura descrevem sistemas
bastante heterogêneos. Uma das propostas do presente trabalho é minimizar o
efeito da heterogeneidade do sistema por meio da reação da Hb com polialdeídos
obtidos por via aniônica e avaliar a extensão destas cadeias quanto à habilidade de
se ligar à hemoglobina bovina verificando o tamanho do bioconjugado resultante.
3
2. OBJETIVO
A presente Tese de Doutorado, desenvolvida no Instituto de Macromoléculas
Professora Eloísa Mano (IMA-UFRJ), teve como objetivo a preparação de
homopolímeros de acroleína e copolímeros de acroleína e estireno obtidos
anionicamente e utilizando dois iniciadores diferentes (sec-butil lítio e terc- butil lítio)
a diferentes razões molares de monômero/iniciador, e investigar os produtos de
sínteses que conduziram a maiores teores de grupamentos aldeído disponíveis e
com solubilidade em água considerável para sua posterior reação com a
hemoglobina bovina, visando obter um bioconjugado com potencial aplicação na
obtenção de um carreador temporário de oxigênio e avaliá-lo quanto a
vasoconstrição.
4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. A HEMOGLOBINA
O metabolismo das células aeróbicas depende do recebimento contínuo de
oxigênio, usado na oxidação de nutrientes. O oxigênio, no entanto, é pouco solúvel
em soluções aquosas e não pode ser transportado para os tecidos em quantidades
suficientes se estiver simplesmente dissolvido no plasma sangüíneo. O transporte
ocorre em geral pelo auxílio de uma proteína - a hemoglobina. Entretanto, nenhum
dos grupamentos laterais constituintes da cadeia polipeptídica da proteína é
adequada para a ligação reversível de moléculas de O
2
. Esse papel é
desempenhado por um grupo prostético denominado heme. O heme é constituído
por uma complexa estrutura orgânica em anel, a porfirina, a qual está ligada um
único átomo de ferro em estado Fe
+2
(Figura 1). Os átomos de nitrogênio
coordenados ao ferro ajudam a impedir a conversão do Fe
+2
para o estado férrico
(Fe
+3
). No estado Fe
+2
, o ferro liga-se reversivelmente ao oxigênio. Quando ocorre a
oxidação Fe
+2
a Fe
+3
, a ligação com o O
2
não ocorre. Neste estado a Hb é
denominada metemoglobina (metHb) [7].
Figura 1: a) Estrutura química do heme; b) Eixos das ligações de coordenação do átomo de
ferro no anel de porfirina [7]
A molécula de hemoglobina (Hb) é composta por quatro cadeias de
polipeptídeos; duas cadeias α encadeadas por 141 resíduos de aminoácidos cada
uma delas, e duas cadeias β encadeadas por 146 resíduos de aminoácidos,
respectivamente. As quatro cadeias polipeptídicas associam-se para formar a
5
estrutura quaternária ativa, que se estabiliza, principalmente por ligações
hidrofóbicas com contribuições secundárias de ligações de hidrogênio, e interações
eletrostáticas. Cada subunidade está associada a um grupo prostético heme, e o
átomo de ferro de cada grupo pode ligar-se a uma molécula de oxigênio [8].
Uma molécula de hemoglobina totalmente oxigenada contém, portanto,
quatro moléculas de O
2
e é denominada oxi-hemoglobina (HbO
2
), em contraposição
à forma desprovida de oxigênio, chamada desoxi-hemoglobina (Hb). A desoxiHb
possue conformação T, enquanto a oxiHb apresenta conformação R. A transição
do estado T para o estado R é acompanhada por afinidades crescentes da molécula
de Hb pelo oxigênio, tornando mais fácil a ligação de outras moléculas de O
2
, de tal
maneira que a ligação da quarta molécula de oxigênio à Hb é 300 vezes mais fácil
do que a ligação da primeira. A esse fenômeno dá-se o nome de cooperatividade.
Na desoxi hemoglobina, o átomo de ferro está situado fora do plano do grupo heme,
mas ao ligar-se ao oxigênio, ele se desloca para aquele plano conforme a Figura 2
[7].
Figura 2: Deslocamento do átomo de ferro em função de sua ligação com O
2
[7]
O transporte de oxigênio dos pulmões aos tecidos é efetuado pela
hemoglobina situada no interior das hemácias. Nos tecidos, o CO
2
produzido pelo
metabolismo celular difunde-se até as hemácias, onde é hidratado em uma reação
6
catalisada pela anidrase carbônica e convertido a ácido carbônico, que se ioniza em
bicarbonato e H
+
. O bicarbonato é transportado pelo sangue até os pulmões, onde é
eliminado como CO
2
; os íons H
+
são removidos pela hemoglobina que além de
transportar oxigênio, exerce portanto, um efeito tampão, impedindo que os íons H
+
possam alterar o pH do sangue com conseqüências prejudiciais para o organismo.
Deste modo, embora haja grande produção de CO
2
pelos tecidos, a presença da
hemoglobina restringe as variações de pH a apenas centésimos de unidades,
mantendo o sangue e os tecidos em meio tamponado [9].
Para cada valor de concentração de oxigênio considerado (em geral medido
em pressões parciais de oxigênio) a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio varia
com o pH, mesmo dentro de estreitos limites de variação do pH. A afinidade da
hemoglobina pelo oxigênio é tanto maior quanto maior for o pH. Por outro lado,
quando há uma diminuição na concentração de O
2
, a transição de oxi-hemoglobina
para desoxi-hemoglobina é acompanhada de mudanças conformacionais; essas
alterações na molécula provocam um aumento da afinidade de alguns radicais da
proteína por H
+
. A análise deste fenômeno revela o papel fundamental da
hemoglobina na manutenção do pH plasmático pois à medida que a concentração
de O
2
diminui e a concentração de H
+
aumenta, a hemoglobina libera O
2
e capta H
+
.
Quando a concentração de O
2
aumenta e a concentração de H
+
diminui, a
hemoglobina se liga ao O
2
e libera H
+
. Essas são as condições encontradas a nível
de tecidos e alvéolos pulmonares, respectivamente. Este efeito do pH e da
concentração de CO
2
sobre a ligação e liberação do oxigênio pela hemoglobina é
chamado de efeito Bohr [7-9].
Existem quatro reguladores primários na ligação hemoglobina-oxigênio –
CO
2
, 2,3 difosforoglicerato (2,3-DPG) (Hb dos seres humanos, cães, cavalos e
ratos), HCO
3
-
(Hb dos crocodilos) e Cl
-
(Hb bovina)
.
O 2,3 DPG funciona como
regulador alostérico do complexo e estabiliza a estrutura quaternária na forma
desoxi-hemoglobina. A Hb forma um complexo com o O
2
que, embora seja reversível
é forte o suficiente para evitar a liberação de O
2
para os tecidos. A ligação reversível
do 2,3 DPG à hemoglobina produz um efeito estérico que implica na diminuição da
afinidade da Hb pelo O
2
. Por causa desse fenômeno o suprimento de O
2
nos tecidos
é garantido [6].
7
3.1.1. Modificações Químicas em Hemoglobinas
A hemoglobina é por excelência um carreador de oxigênio e soluções de
hemoglobina livre de material extracelular foram inicialmente testadas para avaliar
sua habilidade de transportar o O
2
. No entanto, a solução de Hb mostrou-se instável
no sistema circulatório e apresentou extrema toxicidade. A hemoglobina é uma
proteína tetramérica com massa molar igual a 64kDa. Quando fora da hemácia e na
corrente sanguínea, ela se dissocia facilmente em dímeros αβ com massa molar
32kDa cada um. Os dímeros são pequenos o suficiente para ser filtrados pelos rins,
o que resulta em um curto tempo de permanência em circulação no organismo. Além
disso, a filtração renal dos dímeros desenvolve nefrotoxicidade devido à obstrução
dos microcanais dos rins pelos átomos de ferro pertencentes à Hb, o que pode
resultar na perda do órgão [10-13]. Outras toxicidades também foram observadas
como perturbações hemodinâmicas, reações anafiláticas, desordens na coagulação
sangüínea, dores abdominais, hipertensão; respostas inflamatórias, rápida oxidação
da hemoglobina e peroxidação do endotélio promovida pela liberação do heme da
Hb [14].
A modificação química da hemoglobina começou com a tentativa de evitar-
se a dissociação do tetrâmero por meio de ligações cruzadas entre as subunidades
da hemoglobina. Muitas das reações de modificação da Hb são reações
nucleofílicas. Os nucleófilos mais fortes presentes na Hb são os grupos amino e
sulfidrila. Um dos sítios de modificação da proteína que é bastante visado porque
promove uma reação direta é o sítio no qual se aloja o 2,3-difosforoglicerato (2,3-
DPG) que liga os resíduos de Val-1 e Lis-82 de ambas as cadeias α e β. Outros
sítios reativos são os dois resíduos de Lis-99α, dois dos seis grupos sulfidrila do
resíduo de cisteína, os quais estão localizados no resíduo de Cis-93β que são
facilmente acessíveis e os grupamentos de ácido carboxílico terminais das quatro
cadeias de globinas (Arg-141α e His-146β). Contudo, existem ao todo 44 resíduos
de lisina com grupos ε-amino nas cadeias laterais; 28 resíduos de ácido aspártico,
24 resíduos de ácido glutâmico com grupamentos de ácidos carboxílicos nas
cadeias laterais; alguns grupos imidazóis da histidina; grupos guanino da histidina e
grupos fenólicos da tirosina que podem participar de várias reações [15].
8
3.1.2. Tipos de reações na hemoglobina que levam a um carreador de oxigênio
Em muitos casos, mais do que uma reação é necessária para obter-se o
produto capaz de cumprir a função de carrear o oxigênio. Por exemplo, a
piridoxilação e a polimerização ou a formação de ligação intramolecular e a
peguilação são usadas. No entanto, modificações sucessivas levam ao aumento da
heterogeneidade dos produtos e em alguns casos, os diversos reagentes competem
por um mesmo sítio reativo. Cada modificação pode obviamente ter conseqüências
nas propriedades da proteína. As subunidades ligadas durante os diferentes tipos de
reações de modificação estão representadas pela Figura 3.
Figura 3: Esquema das principais reações de modificação química em hemoglobinas [15]
9
3.1.2.1. Reações de Piridoxilação e Agentes Promotores de Ligações
intramoleculares
A solução de Hb fora da hemácia apresenta alta afinidade pelo oxigênio,
atribuída principalmente à perda do 2,3-DPG. Tal efeito não é desejado, pois
dificultará a liberação do oxigênio nos tecidos. Na tentativa de restaurar a P
50
,
pesquisadores adicionaram 2,3-DPG à solução de Hb com a finalidade de promover
o efeito alostérico. No entanto, esta medida não se mostrou eficaz e o 2,3-DPG foi
rapidamente eliminado da circulação. Reações de piridoxilação foram feitas em Hb
humana com o objetivo de atingir o sítio iônico que aloja o 2,3-DPG para produzir um
efeito alostérico semelhante ao gerado pelo 2,3-DPG, e diminuir a afinidade da Hb
pelo oxigênio [16]. O reagente mais empregado tem sido o 5-fosfato de piridoxila, o
produto de reação com a Hb fornece uma imida que é posteriormente reduzida por
boroidreto de sódio (NaBH
4
) ou cianoboroidreto de sódio (NaCNBH
3
) para gerar uma
amida. Os valores de P
50
dependem do reagente de piridoxilação, do agente redutor
usado, da conformação da proteína, do tempo de reação e da razão reagente/Hb
[17]. Para reações realizadas em Hb bovina, a piridoxilação é desnecessária porque
na Hb bovina o efeito alostérico é produzido por íons cloreto.
Além das reações de piridoxilação foram realizadas reações na Hb com
derivados salicílicos para promover ligações intramoleculares nas subunidades da
Hb. Os estudos avaliaram o produto quanto à pressão parcial de O
2
para obtenção
de 50% de saturação dos sítios disponíveis da Hb (P
50
), quanto ao efeito na
cooperatividade da Hb modificada (coeficiente de Hill), e quanto à pressão osmótica
(COP) para vários derivados da Hb e o resultado destes estudos está
esquematizado na Tabela 1.
Avaliando a retenção vascular, a Hb modificada com o tetrafosfato-bis-
piridoxal (bis-PL)P4 teve melhor resultados quando comparado à solução de Hb.
Estudos farmacocinéticos realizados com ratos verificaram que para uma dose de
200mg/kg, o tempo de meia vida é 3 vezes maior quando comparado à solução de
Hb – 1 hora. A formação de dímeros αβ não foi detectada na urina dos ratos após 5
horas da administração do produto enquanto que para solução de Hb após 2 horas
foi detectada a formação de 21% de dímeros αβ. A modificação com o 2-nor-2-
10
formila-5-fosfato de piridoxila (NFPLP) também aumentou a retenção vascular.
Estudos em ratos mostraram que após 5h da administração do produto, apenas 5%
da dose de Hb(NFPLP) foram detectados na urina, enquanto que para a solução de
Hb foram detectados 35% [18].
Tabela 1: Comparação entre as propriedades para Hbs com diferentes agentes de ligações
cruzadas [16]
Sigla Agente de ligação
MM
[kDa]
P
50
[mmHg]
Hill
(n)
COP
[mmHg]
HbA
o
Hemoglobina humana 64 8 – 18 2,6 – 3,0 23,3 – 45
SFHb Solução de Hb purificada 64 12 – 24 2,8 18 – 41,9
NFPLP-Hb 2-Nor-2-formilpiridoxil 5-fosfato 64 45 – 47 2,1 – 2,2 27
(bisPL)P4-Hb Tetrafosfato-bis-piridoxal 64 31 N/A
PLP-Hb 5-fosfato-piridoxal 64 11 – 30,5 1,2 – 2,3 23,3
DECHb Sebacato de bis (3,5-dibromo-salicila) N/A 34 2,2 23,7
α DBBF-Hb Fumarato de bis (3,5-dibromo-salicila) 64 – 67 26 – 33,9 2 – 2,45 23 – 35,1
β DBBF-Hb Fumarato de bis (3,5-dibromo-salicila) 64 5 N/A N/A
DCLHb Fumarato de bis (3,5-dibromo-salicila) 64,5 32 – 36 2,4 N/A
3.1.2.2. Reação para aumento de massa molar - peguilação
Grafitizações de cadeias de poli(glicol etilênico) – peguilação – tem-se
tornado uma forma comum de alterar e transformar a farmacocinética e toxicidade
de fármacos. A peguilação da Hb é um eficiente método para aumentar o tamanho
da molécula, o que é necessário para impedir a excreção renal, reduzir a toxicidade
e prolongar o tempo de vida no organismo. Alguns produtos foram obtidos para
cadeia de poli(glicol etilênico) (PEG) mono- e di- funcional e para o caso de mono-
PEG a Hb é apenas “decorada” com cadeias de PEG, o que causa um aumento
considerável no tamanho da molécula e na hidrofilicidade da superfície e
conseqüentemente mudança na difusibilidade da molécula. Quando ambos os
terminais de cadeia do PEG estão funcionalizados, numerosas possibilidades de
ligações podem ocorrer tanto intra- como intermolecularmente podendo levar à
polimerização da Hb. A extensa hidratação das cadeias de PEG pela interação com
as moléculas de água aumenta a atividade osmótica coloidal e a viscosidade, o que
causa um efeito sobre a pressão sangüínea, e limita o uso de soluções
11
concentradas de Hb peguilada para administração em pacientes. A reação de
peguilação utilizando PEG de baixa massa molar (até 5000) mostrou maior
tolerância pelo organismo.
A acilação da Hb humana com um poli(glicol etilênico)-monometoxilado
(mPEG) de massa molar 5000 funcionalizado com succinato de succinimidila ou
oxiacetato de succinimidila produziu Hb conjugada com uma massa molar média de
190000 e baixa P
50
para diferentes condições reacionais. Produto com menor
afinidade pelo oxigênio foi obtido quando a reação foi realizada na forma desoxi Hb
e na presença de hexafosfato de inositol [19]. Foram realizadas reações da Hb com
mPEG com massa molar de 1900 com objetivo de limitar o aumento da viscosidade
e a pressão oncótica e este material foi purificado por cromatografia de troca iônica e
apresentou cerca de 13 cadeias de mPEG por Hb e uma massa molar média média
de 90000. Os valores de P
50
foram menores quando comparados ao produto da
reação realizada com PEG de maiores massas molares [20]. Reação do mPEG-
carbonato de succinimidila com a Hb forneceu ligações carbonato que foram menos
vulneráveis à hidrólise do que as ligações éster e resistentes a algumas enzimas
[21]. Quando a reação ocorreu utilizando a Hb bovina, cerca de 7-8 cadeias de PEG
conjugaram-se à Hb bovina. O valor de P
50
foi equivalente ao das RBCs humana ≈
28mmHg e o tempo de meia-vida em circulação foi de 10-13h em ratos, com 70% de
material transfusado. Para maiores números de cadeias de PEG conjugada à Hb,
menores foram os valores de P
50
[22].
Reação do mPEG-amino com benzeno hexacarboxilado na presença de 1-
(3-dimetil-aminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) forneceu estruturas que reagem
com os grupos amino da Hb resultando em conjugados poli-aniônicos com cerca de
75000 de massa molar e aumento do valor de P
50.
O produto foi insensível ao
hexafosfato de inositol, o que indica que a reação de conjugação ocorreu no sítio
alostérico. Monosubstituição ocorreu principalmente nos resíduos de Val terminal
das cadeias β (65% versus 15-25% das cadeias α). Para a reação realizada na
forma oxi, o excesso de EDCI levou à diminuição de P
50
, que foi atribuído à formação
de ligação cruzada envolvendo os grupos carboxílicos. Outro reagente usado para
peguilação da Hb é o PEG-tiazolidina-2-tiona, um composto estável, que reage com
12
a Hb bovina produzindo ligações amida. O tempo de meia vida na circulação
sangüínea aumentou de 4 a 5 vezes nos testes realizados com ratos [23].
Para aumentar o número de cadeias de mPEG incorporadas à Hb, diversos
grupamentos NH
2
foram derivados em grupamentos SH com reagente de Traut e em
seguida com mPEG-maleimida. Quando cerca de seis cadeias de mPEG foram
ligadas à Hb, o raio hidrodinâmico atingiu o valor de 15 nm comparado a 3 nm da
Hb não peguilada. O valor de P
50
foi igual a 6mmHg e a cooperatividade diminuiu. A
presença de seis cadeias de PEG à Hb mostrou-se mais eficiente na redução do
efeito sobre a pressão sangüínea do que quando somente duas cadeias de PEG
estavam ligadas à Hb [24]. Teste realizado em ratos e porcos verificou resposta
hemodinânica comparável ao sangue – pressão oncótica ≈ 50 mmHg e viscosidade
3 cP. Esta tecnologia foi licenciada para a Sangart Inc. (San Diego, CA).
Grande parte das reações de peguilação mencionada na literatura para o
PEG difuncional partem do diéster do PEG. A reação da Hb piridoxilada com PEG-
Bis-(succinato de succinimidila) forneceu um produto com alta polidispersão e cujas
ligações éster entre as cadeias de PEG e o resíduo succínico não foram estáveis em
condições fisiológicas [21,25]. Compostos de PEG-benzonossulfonados foram
utilizados para promover reação de polimerização e peguilação da Hb ligada
intermolecularmente pela diaspirina [26] e um reagente di-funcionalizado com a
maleimida foi empregado para a peguilação da Hb piridoxilada [27]. Para ambos os
casos, o sítio preferencial foi o resíduo de cis-93β, mas alguns grupamentos amino
primário foram também peguilados. Os valores de P
50
e a cooperatividade
diminuíram.
Um importante produto oriundo do processo de peguilação foi obtido da
reação do bis-oxiacetato de succinimidila-PEG com a Hb humana piridoxilada. O
produto está licenciado para Apex Bioscience, Inc (Durham, NC) e encontra-se na
terceira fase dos testes clínicos. O produto tem o objetivo de promover o tratamento
para o caso de choque induzido por NO.
O produto da Hb piridoxilada conjugada ao poli(glicol etilênico) (PHP)
fornece uma complexa mistura de Hb modificada e outras proteínas do sangue, pois
tanto ligações intra quanto intermoleculares ocorrem, bem como reações para
13
obtenção de Hb decorada. A análise cromatográfica por exclusão de tamanhos
verificou grande heterogeneidade para o PHP. O perfil da curva é bimodal,
apresentando dois máximos equivalentes às massas molares 300.000 (30%) e
105.000 (70%) respectivamente. A massa molar média assumiu o valor de 187.000.
O ajuste da pressão osmótica foi realizado por meio do controle das ligações
intermoleculares. Cerca de 83% de mono-Hb, 12% de di-Hb e 4% de tri-Hb
compõem o produto. O PHP conjuga em média 5 a 6 cadeias de PEG e 3,3 resíduos
de piridoxal por unidade de Hb, possui extenso raio hidrodinâmico, com
aproximadamente 7,2 nm [28].
Como já mencionado anteriormente, a Hb - uma proteína tetramérica –
quando fora das hemácias se dissocia em par de dímeros αβ. Os dímeros e os
tetrâmeros, quando em solução, encontram-se em um equilíbrio dinâmico de
sucessivas associações e dissociações. O PHP se distingue dos outros produtos
obtidos por modificação química de Hb que se encontram em fase de testes, pelo
fato de manter a habilidade dos dímeros e tetrâmeros de permanecerem em
equilíbrio entre si, mesmo após várias cadeias de PEG estarem conjugadas à Hb na
complexa mistura. Este fenômeno foi comprovado por análise cromatográfica por
exclusão de tamanhos (SEC), e confirmada por análise de eletroforese e análise de
espectrometria de massa.
Estudos realizados por Talarico e colaboradores [29] verificaram o perfil de
eluição de amostras de PHP misturadas à Hb não modificada e a Hb modificada por
meio de ligações intermoleculares entre as subunidades α. As soluções de Hb não
modificada e modificada foram adicionadas à amostra de PHP numa proporção de
0x, 5x, 10x, e 20x. A Figura 4a apresenta o cromatograma para adição de Hb não
modificada à amostra de PHP. O perfil da curva mostra uma coeluição entre o PHP
e a Hb não modificada. Observa-se uma progressiva diminuição da altura dos 2
picos principais e um progressivo aumento no deslocamento da curva para regiões
de menor massa molar à medida que a concentração de Hb adicionada aumenta.
Este fenômeno foi atribuído à dissociação e re-associação entre os dímeros do PHP
e da Hb não modificada para gerar novas espécies de PHP com massas molares
menores. Para o caso da adição da Hb modificada, o perfil da curva sofre alteração,
pois neste caso a Hb possui ligações entre suas subunidades que impedem a
14
formação de dímeros. No gráfico da Figura 4b a coeluição não é observada e o que
se apresenta são 3 picos, sendo o de maior tempo reacional e portanto de menor
massa molar representado pela eluição da Hb modificada. A Figura 4c apresenta o
cromatograma da mistura de Hb modificada e não modificada mostrando que
ocorreu coeluição.
Figura 4: Análise de SEC para o PHP adicionado à Hb não modificada e modificada [28]
Outra característica interessante do PHP é que a rota de síntese do produto
permite ligar ao produto algumas enzimas antioxidantes encontradas nas células
vermelhas – catalase, superóxido dismutase (SOD), e anidrase carbônica (CA) – e
15
isto pode ser um fator significativo no controle da oxidação dos grupos heme e
formação de metHb [29].
No entanto, Alonsozana e colaboradores [30] realizaram testes in vitro e
verificaram que a mistura de sangue humano ao PHP, para concentração de PHP
variando de 1- 4 g/dL, induziu a agregação das células vermelhas; porém, os testes
para avaliar a compatibilidade entre o produto e o sangue mostrou níveis toleráveis.
3.1.2.3. Reações para obtenção de estruturas conjugadas (poli-Hb)
3.1.2.3.1. Glutaraldeído
O glutaraldeído é um reagente altamente reativo e portanto reage facilmente
com os grupos amino, sulfidrila, anel imidazol e outros grupamentos presentes na
Hb. Ele tem sido empregado na polimerização da Hb e tanto promove ligações intra,
quanto ligações intermoleculares que podem ocorrer em vários sítios. O
glutaraldeído é representado de maneira simplificada por um dialdeído de 5 átomos
de carbono. No entanto, em soluções aquosas ele está em equilíbrio com hemiacetal
cíclico e seu hidrato para formar oligômeros com extensões de cadeias variadas. Por
causa da variedade de espécies reativas geradas em solução o glutaraldeído reage
inespecificamente com a Hb para fornecer produtos muito heterogêneos e bastante
dependentes das condições reacionais [31].
Um grupo de pesquisadores produziu uma Hb polimerizada, por meio da
reação do glutaraldeído com solução diluída de Hb humana piridoxilada. Contudo, o
fosfato de piridoxila e o glutaraldeído competem para os mesmos sítios da Hb. O
produto consistiu em uma mistura de 24% de Hb ligada intermolecularmente, 48%
de formação di-, tri- e tetra-Hb e 28% de Hb conjugada em maior ordem. O tempo de
permanência no organismo foi de 15h para testes realizados em ratos. Não
apareceram sinais de toxicidade renal; porém, a pressão arterial aumentou
temporariamente e foi verificado prejuízo nas células endoteliais para avaliação de
choque hemorrágico realizado em ratos, coelhos e macacos. A elevação da pressão
arterial apresentou perfis semelhantes tanto para a Hb ligada intermolecularmente,
quanto para a espécie polimerizada com massa molar em torno de 124000 [15, 32].
16
Como já citado anteriormente, o efeito da modulação na Hb bovina ocorre
em função da concentração de Cl
-
, e não da concentração de 2,3DPG como no caso
da Hb humana. Como a concentração de Cl
-
no organismo humano é alta, a Hb
bovina polimerizada com glutaraldeído tem sido estudada para desempenhar o
papel de um carreador de O
2
. Um produto da Biopure encontra-se em avançada
fase dos testes clínicos. O produto obteve valores de P
50
em torno de 20 mmHg e
grande tempo de permanência no organismo. No entanto, os valores de metHb
alcançaram 33% após 24 h da administração do produto [15].
Estudos realizados por Palmer [31] avaliaram o efeito da razão molar
glutaraldeído/Hb [G]/[Hb] e do tempo reacional nas propriedades de P
50
, n
H
e
formação de metHb, variando a concentração de glutaraldeído de 10x, 20x e 30x em
relação à Hb bovina. As reações foram conduzidas a 2 h, 6 h e 24 h para cada razão
molar [G]/[Hb]. Para a razão molar [G]/[Hb] 10:1 ocorreu pouca variação nos valores
da polidispersão com o aumento do tempo reacional. Os valores de M
w
/M
n
foram
1,011; 1,010 e 1,079 para 2 h, 6 h e 24 h respectivamente. As espécies geradas a 2
h e 6 h tiveram faixa de massa molar correspondente à conjugação de 0,5-2
tetrâmeros. Após 24 h de reação, surgiram 11,5% de espécies com massa molar
superior à conjugação de 2 tetrâmeros, essas espécies apresentaram massa molar
correspondente à conjugação de 5 tetrâmeros. Para razão molar [G]/[Hb] 20:1 após
2 h e 6 h de reação obteve-se massa molar correspondente à conjugação de 3-5
tetrâmeros e após 24 h de reação 28% das espécies apresentaram uma variação de
razão molar correspondente à conjugação de 2-10 tetrâmeros. Para a razão molar
[G]/[Hb] 30:1, após 2 h de reação, 65% das espécies possuíam uma variação de
massa molar correspondente a conjugações acima de 2 tetrâmeros. As espécies
continuaram a crescer para as reações conduzidas a 6 h e 24 h até atingir valor de
massa molar correspondente à conjugação de 10 tetrâmeros. As misturas de poliHb
obtidas com a razão molar de 10:1 e 20:1 de [G]/[Hb] exibiram valores de P
50
na
faixa de 25-29 mmHg para os três tempos reacionais. Para o produto obtido a 30:1
os valores de P
50
variaram entre 18-20 mmHg para os três tempos reacionais
indicando que o aumento no tempo da polimerização não afetou a P
50
. O coeficiente
de Hill diminuiu com o aumento da concentração de glutaraldeído. Para [G]/[Hb] 10:1
a média variou entre 2,4-2,6. Para a [G]/[Hb] 20:1 a média foi de 1,6-1,7. Para a
[G]/[Hb] 30:1 o valor de 1,3 independente do tempo reacional. Os valores
17
porcentuais de MetHb foram significativamente altos para a reação conduzida a
maiores razões molares de glutaraldeído. Os resultados deste estudo estão
descritos na Tabela 2.
Tabela 2: Efeito da concentração de glutaraldeído nas propriedades de P
50
, n
H
e formação e
metHb [31]
Razão Molar
[Glutaraldeído] / [Hb]
P
50
(mmHg) n
H
MetHb (%)
2h 6h 24h 2h 6h 24h 2h 6h 24h
10 27 25 26 2,6 2,4 2,5 3 3 4
20 26 26 29 1,7 1,7 1,6 2 3 2
30 20 18 19 1,3 1,3 1,3 6 17 30
A reação entre os grupos amino da Hb e aldeído do glutaraldeído fornecem
ligações imina que são facilmente hidrolizáveis. Para estabilizar estas ligações
utiliza-se um agente redutor (o agente redutor mais empregado é o NaBH
4
) para
reduzir as ligações imina em ligações amina que são estáveis quanto à hidrólise. O
agente redutor também auxilia na redução de aldeídos residuais a álcool, para dar
um término à reação de polimerização. O estudo também avaliou o efeito da
concentração do agente terminador (NaBH
4
). Reações foram conduzidas sem e com
agente terminador, variando as concentrações de 30x, 150x e 300x em relação a Hb
bovina. A razão molar glutaraldeído Hb foi de 30:1 a pH 8. foram avaliados o perfil
das curvas de distribuição de massa molar para 1, 3, 6 e 8 dias após o término da
reação, sem e com NaBH
4
. Verificou-se que com menores concentrações de agente
redutor a reação continua para a formação de espécies de maiores massas molares.
Quanto ao efeito da concentração de agente redutor nas propriedades, não
ocorreram grandes alterações com o aumento da concentração. Os resultados deste
estudo estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3: Efeito da concentração do agente redutor nas propriedades de P
50
, n
H
e formação
e MetHb [31]
[NaBH
4
] / [Hb] P
50
(mmHg) n
H
MetHb (%)
0 13 1,9 17
30 12,1 2 15
150 12,5 1,9 19
300 14 2 14
18
3.1.2.3.2. Sacarídeos e polissacarídeos oxidados
Como já citado anteriormente, existem três produtos baseados na
modificação química da Hb que se encontram na última fase dos testes clínicos. O
produto da Northfield Laboratory (PolyHeme
®
) que consiste em uma Hb humana
piridoxilada e polimerizada com glutaraldeído, o produto da Biopure (Hemopure
®
)
que consiste em uma Hb bovina polimerizada com gluteraldeído e o produto da Apex
Bioscience (VTR-PHP
®
) que consiste em uma Hb piridoxilada conjugada com PEG
[33].
Até 2003, todos os esforços em busca de um substituto para o sangue
baseavam-se em obter um produto que apresentasse propriedades similares
àquelas das células vermelhas humanas. Esta primeira geração de produtos que se
encontram em fase de testes foi desenvolvida baseada nesses parâmetros. Tais
produtos apresentaram resposta hipertensiva, que foi inicialmente atribuída à
diminuição da concentração de NO causada pela interação com os sítios da Hb. O
NO desempenha papel importante na manutenção do calibre dos vasos sangüíneos
– vasoconstrição. Contudo trabalhos realizados por Winslow [34] utilizando
tecnologias mais modernas permitiram o estudo do transporte de O
2
através da
microcirculação e verificaram que os carreadores de oxigênio com valores de P
50
≈5-
10 mmHg e com baixa difusão macromolecular apresentaram perfis mais parecidos
aos das células vermelhas (RCB) quanto ao transporte de O
2
. A resposta
hipertensiva dos carreadores de O
2
obtida nos testes clínicos
foram atribuídas à
conseqüência da super-oxigenação dos tecidos. O estudo (Figura 5) comparou o
perfil da curva de transporte do O
2
das células vermelhas humanas com três tipos
diferentes de Hb – Hb peguilada (Hb-PEG), Hb com ligação cruzada na cadeias αα
(Hb-αα) e solução de Hb purificada. A Hb-PEG e a solução de Hb purificada
possuem valores de P
50
semelhantes (~12 mmHg). No entanto, apresentaram perfis
bastante diferentes, o que levou à conclusão de que o parâmetro P
50
não é o fator
determinante no comportamento de transporte e liberação de O
2.
No entanto, os
parâmetros reológicos mostraram-se muito importantes [34].
19
Figura 5: Gráfico de saturação X tempo para Hb-PEG, Hb purificada e Hb-αα [34]
Essa descoberta desencadeou uma revisão nos conceitos, até então, bem
estabelecidos e a introdução de novos parâmetros de avaliação para um carreador
de oxigênio. Na Tabela 4 estão listados os parâmetros utilizados para a primeira
geração de produtos e o paradigma atual.
Tabela 4: Comparação entre os paradigmas antigo (1) e atual (2) [34]
Propriedade Paradigma 1 Paradigma 2
Ligação com oxigênio Como o sangue: P
50
~ 28mmHg P
50
~ 5-10mmHg
Viscosidade Como a água ~ 1cP ~ 4cP
Pressão oncótica Como o sangue ~ 15mmHg Aumentada
Concentração de Hb Como o sangue ~ 15g/dL A menor possível
Retenção do plasma A mais longa possível A mais longa possível
Uso clínico Substituto para as células vermelhas Agente transportador de oxigênio
No passado, os sacarídeos e polissacarídeos foram estudados como
agentes promotores de ligações cruzadas na Hb, mas seus estudos foram
diminuindo ao longo do tempo porque forneciam valores de P
50
≈ 8 mmHg que não
atendiam ao paradigma da época. Hoje, pelos novos parâmetros adotados, a Hb
modificada por polissacarídeos torna-se um produto atraente e com potencial
aplicação para um substituto do sangue.
20
Os sacarídeos e polissacarídeos são compostos de função mista, poliálcool-
aldeído ou poliálcool-cetona que sofrem ciclização por reações intramoleculares.
Quando oxidados geram em suas estruturas grupamentos aldeído disponíveis, que
podem reagir com os grupos amino da hemoglobina e posteriormente formar
iminas. O agente oxidante que tem sido mais utilizado é o periodato de sódio
(NaIO
4
). A reação é altamente dependente do pH, pois podem ser hidrolisados a
sacarídeos.
Palmer e colaboradores [33] fizeram reações entre Hb bovina e dez
sacarídeos diferentes (celobiose, galactose, glucose, lactose, maltose, 1-O-metil-
glicose, rafinose, sacarose, trealose e dextrana – 15kDa e 71kDa) com o objetivo de
obter ligações cruzadas nas subunidades da Hb e a polimerização dos tetrâmeros. O
estudo foi realizado para a razão molar Hb/sacarídeo igual a 1:5 e 1:50 a diferentes
condições de pH, 6 e 8. Foram avaliadas a afinidade pelo oxigênio (P
50
), a
cooperatividade (n), o teor de metHb residual e a polidispersão para Hb bovina
polimerizada. Parte dos resultados da pesquisa está descrito na Tabela 5. O estudo
verificou que o aumento da concentração de sacarídeo promoveu o aumento no teor
de MetHb residual e o aumento no valor da polidispersão; porém, não mostrou
grande influência no valor de P
50
. A reação de polimerização entre os tetrâmeros foi
observada apenas para a razão molar 1:50. O efeito do pH foi mais proeminente
para a razão molar 1:50 do que para razão molar 1:5. A pH 8, observou-se a
formação de considerável quantidade de produtos da conjugação de 3 unidades de
Hb enquanto que a pH 6 foi observada conjugação de 2 unidades de Hb. O valor da
polidispersão foi maior a pH 8, atribuída, em parte, ao maior número de ligações
glicosídicas desfeitas por hidrólise dos sacarídeos.
A extensão da cadeia polialdeídica resultante da oxidação do sacarídeo
mostrou influenciar o teor de formação de ligações cruzadas totais. O polissacarídeo
– dextrana - apresentou 100% de formação de ligações cruzadas nas subunidades
da Hb. O trissacarídeo rafinose apresentou cerca de 45%, os dissacarídeos cerca de
35% e os monossacarídeos cerca de 30%, exceto pela 1-O-metil glicose que
apresentou os melhores resultados dentre todos os demais, pois obteve 78,3% a pH
6 e 88,5% a pH 8. Além disso, obteve-se conjugação de tetrâmero de maior ordem,
38,5% a pH 6 e 58,1% a pH 8. A Figura 6 apresenta o gráfico obtido pela análise de
21
cromatografia líquida de alta eficiência-HPLC para a amostra de Hb bovina não
modificada (---) versus Hb bovina modificada por 1-O-metil glicose (—). O pico
eluído a 10,3 min refere-se à Hb sem a formação de ligações cruzadas. O pico
eluído a 9,6 min refere-se à hemoglobina com formação de ligações cruzadas em
suas unidades. O pico eluído a 8,5 min refere-se à formação de conjugação na Hb
gerando espécies de maior ordem. A 1-O-metil glicose apresentou altos teores de
formação de ligação cruzada e baixos teores de formação de MetHb residual de 10-
11,7% quando comparado aos demais sacarídeos ~51%. No entanto, altos valores
para a polidispersão foram obtidos. Parte desses resultados foram atribuídos à
extensão da cadeia dialdeídica da 1-O-metil glicose que, quando oxidada, gerou
uma estrutura com seis átomos de carbono na cadeia, enquanto que a glicose e a
galactose geraram estruturas com quatro átomos de carbono na cadeia e altos
valores de MetHb (> 72%). Níveis acima de 10% afetam a habilidade do substituto
para o sangue de transportar O
2
para os tecidos [35].
Tabela 5: Propriedades físicas da Hb modificada com sacarídeos para razão molar 50:1
Sacarídeos
oxidados
% Lig. Inter
%
Tetrâmeros
% MM
maiores
% MetHb P
50
n
pH 6 pH 8 pH 6 pH 8 pH 6 pH 8 pH 6 pH 8 pH 6 pH 8 pH 6 pH 8
Galactose 12,5 14,2 12,5 14,2 0 0 72,2 97 * * * *
Glucose 13,6 14,2 13,6 14,2 0 0 80 100 * * * *
1-O-Metil glicose 78,3 88,5 39,7 30,4 38,5 58,1 11,7 10 6,13 14,57 1,08 2,05
Celobiose 18 26,8 18 26,8 0 0 78,1 79,4 * * * *
Lactose 18,1 28,5 18,1 28,5 0 0 53 91,1 * * * *
Maltose 42,7 29,8 42,7 15,9 0 13,9 86,3 43,3 * * * *
Sacarose 17,3 13,2 13,9 13,2 3,3 0 31,4 18 7,3 7,44 1,91 1,9
Trealose 72,1 50,3 61,2 18,4 10,9 31,9 30 51,7 7,67 * 1,89 *
Rafinose 45,2 90,6 45,2 76 0 14,6 78 13,9 * 9,09 * 2
Dextrana 15kDa 100 50,9 100 50,9 0 0 24,8 78,5 6,08 * 1,16 *
Dextrana 71kDa 100 100 100 100 0 0 10,8 23,4 8,07 11,46 2,01 1,5
* Apresentaram níveis de MetHb muito altos para determinar P
50
e n
Dellacherie e colaboradores [36] estudaram o efeito da formação da ligação
cruzada de Hb humana com a dextrana oxidada de 40 kDa. Foi verificada uma
diminuição na P
50
de 11,4 mmHg para 8 mmHg. Estudos similares realizados por
Cunnington e colaboradores [37] verificaram a diminuição do valor de P
50
quando a
22
Hb bovina foi modificada pela dextrana oxidada de massa molar 20 kDa. A redução
da P
50
foi de 23mmHg para 8mmHg, o que mostra que a massa molar da dextrana
não influenciou muito a P
50.
Figura 6: Análise cromatográfica para a HbBv não modificada X HbBv modificada por 1-O-
metil glicose
No entanto, para o desenvolvimento de uma solução de hemoglobina com
boa performance fazem-se necessárias condições diferentes do plasma sangüíneo.
Mas quais seriam estas condições? Atualmente, ainda não há uma resposta
satisfatória para esta pergunta. As soluções de Hb modificada, definitivamente, não
se comportam como as RBCs. A hemácia desempenha um papel fundamental na
preservação da proteína pois por mantê-la confinada, evita a degradação da Hb e
proteje o organismo da toxicidade induzida pelos subprodutos desta degradação,
além de evitar que a proteína extravase pelos espaços intersticiais. A superfície
glicosilada da hemácia assegura maior tempo em circulação e funcionalidade da
célula. Uma variedade de substâncias é encontrada no interior das hemácias
juntamente com a hemoglobina, entre elas está o 2,3-DPG um intermediário na
glicólise, enzimas tais como anidrase carbônica, metemoglobina redutase,
superóxido dismutase e catalase; bem como glutatione, trifosfato de adenosina
(ATP) que participa da regulação do transporte de O
2
e CO
2
, controlando as
espécies ativas, limitando o nível de metHb e prevenindo a oxidação dos resíduos
de cisteína. Na ausência desses cofatores, a liberação de O
2
para os tecidos é
dificultada e a oxidação de Hb para metHb é acelerada além de facilitar a formação
23
de espécies radicalares. Além disso, a ligeira diferença de pH do meio extra
(pH=7,4) e intracelular (pH=7,2) promove no interior das hemácias a redução da
protonação do carbono terminal dos resíduos de histidina das cadeias β que afetam
a conformação da proteína. A relação entre Hb, espécies peróxido, superóxido e NO
é substancialmente alterada quando a Hb não está confinada na hemácia [38]. Por
exemplo, a reação do NO com oxiHb no interior das hemácias está limitada pela
difusão do NO e é 650 vezes mais lenta quando comparada ao sistema fora da
célula [39].
Nas RBCs, a Hb está em uma concentração acima de 300 g/L; uma simples
diluição desta Hb para obtenção de uma solução isosmótica com o plasma humano
resultaria em uma concentração entre 60-80 g/L [15]. Em geral, as formulações de
carreadores de oxigênio consistem de soluções de Hb cujas concentrações variam
entre 4 a 14 g/dL, tais concentrações são limitadas pela viscosidade e pressão
osmótica.
A dimensão ótima para um carreador de oxigênio é um problema ainda em
debate. A Hb tetramérica apresenta 6 nm de diâmetro e extravasa rapidamente;
partículas de 20-50 nm podem difundir-se através do sistema endotelial em caso de
inflamação; partículas em torno de 150-250 nm parecem não extravasar; partículas
maiores são capturadas mais rapidamente pelo retículo endotelial; e dimensões
acima de 5 μm podem ocasionar o bloqueio do fluxo nos capilares sangüíneos [15].
Polímeros funcionalizados são bastante utilizados por sua versatilidade para
obtenção de novos sistemas. Várias classes de polímeros são empregadas para
este fim, como por exemplo, poliamidas, poliaminas, poliácidos, poliálcools,
polialdeídos, entre outros. O interesse por polímeros de cadeias lineares, solúveis e
biocompatíveis tem crescido consideravelmente para atender às necessidades
médicas, farmacêuticas e biotecnológicas. Lynn e colaboradores [40] propuseram a
síntese de 140 poli(β-aminoéster) dos quais 70 se mostraram solúveis em água e 56
se apresentaram eficientes para complexar com moléculas de DNA. Hartmann e
colaboradores [41] propuseram uma rota para sintetizar poli(amidoaminas) lineares,
monodispersas e com sequências monoméricas definidas, por meio da reação de
24
diaminas e diácidos. Vários polissacarídeos foram modificados para a obtenção de
bioconjugados [42-51].
Polímeros com grupamentos aldeído disponíveis são particularmente úteis
na modificação de proteínas e imobilização de enzimas, uma vez que a imobilização
da proteína por meio de ligação covalente pode manter sua conformação ativa [52].
O grupamento aldeído reage facilmente com os grupamentos amina primária das
proteínas, dando origem a grupamentos imina que podem ser reduzidos a amina,
que são grupamentos estáveis em meio fisiológico. Tunçel e colaboradores [53]
sintetizaram polímeros contendo grupamentos imina para serem empregados como
complexantes de metais pesados. Shiomi e colaboradores [54] imprimiram a uma
matriz de sílica o espaço conformacional da proteína hemoglobina com a finalidade
da matriz ser utilizada para purificação seletiva da hemoglobina. Eles conseguiram
tais resultados por meio da formação de ligação covalente entre os grupos aldeído
ancorados na sílica e a hemoglobina. A polimerização iônica da acroleína pode em
certas condições conduzir a estruturas com grupamentos aldeídos disponíveis.
3.2. POLIMERIZAÇÃO IÔNICA
A polimerização aniônica se propaga por meio de um carbânion no terminal
da cadeia em crescimento e é mais apropriada para casos onde o monômero
apresenta grupo substituinte aceptor de elétrons. A iniciação envolve a adição de um
íon negativo ao monômero ou a transferência de um elétron ao monômero com a
formação de pares iônicos. Na etapa de iniciação, o íon ataca a dupla ligação para
formar uma ligação covalente com uma das extremidades da molécula monomérica
e um íon com a outra extremidade. A extremidade iônica reage com outra molécula
de monômero e assim a polimerização é propagada. A propagação da cadeia cessa
quando o íon propagante reage com um contra-íon. O contra-íon pode ser
adicionado intencionalmente, pode advir de uma impureza ou de outro componente
do sistema (solvente, iniciador e até o próprio monômero). Na ausência de um íon
terminador o polímero mantém sua reatividade em tempo suficiente para continuar a
propagação e, neste caso, a polimerização iônica é também denominada por
polimerização viva [55].
25
Um dos sistemas iniciadores que é largamente empregado faz uso de uma
espécie ânion-radical. O mecanismo geral da formação desse tipo de iniciador é
uma transferência de elétrons da superfície de um metal alcalino para o
hidrocarboneto aromático deficiente de elétron. Isto gera um ânion radical, que
rapidamente sofre combinação ou dimerização para formar um di-ânion. O elétron
transferido é estabilizado por processo de solvatação do metal que é favorecido por
solventes polares. Iniciadores obtidos por transferência de elétrons trabalham
eficientemente em solventes polares, promovendo rápida geração de cadeias
crescendo bifuncionalmente. Contudo, em solventes apolares a transferência de
elétrons é muito ineficiente devido à falta de solvatação [55].
Outro sistema iniciador bastante empregado são os compostos alquil
metálicos – disponíveis comercialmente. O mecanismo consiste no ataque direto do
carbânion ao centro deficiente de elétrons do monômero. O iniciador que existe
como de um estado dinâmico associado em solventes apolares, transforma-se em
uma nova forma após a abertura da dupla ligação do monômero. No processo de
iniciação, uma nova espécie aniônica é gerada como centro propagante e seu
estado de associação intermolecular depende do tipo de monômero, da extensão da
deslocalização e da polaridade do meio. Assim, o iniciador e o ânion propagante
podem existir sob diferentes formas tais como solvatado perifericamente, par iônico
em contato, par iônico separado por solvente e íons livres em solventes polares [56].
A agregação de iniciadores em meio apolar afeta a eficiência da iniciação. A
polimerização de dienos e estireno usando o n-butil-lítio (n-BuLi) como iniciador em
meio apolar é vagarosa e a iniciação é freqüentemente incompleta devido ao alto
grau de agregação. Para a polimerização do estireno em ciclo-hexano iniciada por n-
BuLi cerca de 30-42% de espécies não reagidas do iniciador estão presente no meio
reacional após total conversão do monômero [57]. A agregação do alquil-lítio em
solução diminui com o aumento do tamanho do grupo alquila em solventes polares e
apolares. Sec-BuLi e terc-BuLi são tetraméricos em soluções hidrocarbônicas; no
entanto, o n-BuLi é hexamérico. Em geral eles estão menos agregados em solventes
polares e a extensão da agregação depende fortemente da polaridade do solvente.
O grau de agregação também depende da concentração e da temperatura. A Tabela
6 apresenta os resultados desse estudo [56].
26
Tabela 6: Número de espécies alquil-lítio agregadas em solução e no estado sólido [56]
Alquil Solvente
apolar
Solvente
polar
Estado
sólido
Metil - 4 4
Etil ~6 4 4
n-Butil ~6 ~2,5 6
sec-Butil 4 ~1 -
tert-Butil 4 ~1 4
Alquil-lítios são altamente reativos e instáveis em solventes polares e a
etapa da iniciação precisa ser realizada a baixas temperaturas (< -40ºC). No caso da
polimerização de monômeros polares tais como alquil-metacrilatos, somente ânions
menos reativos devem ser usados (freqüentemente em conjugação com ligantes
moderados) para se ter uma iniciação eficiente. A escolha do iniciador deve levar em
conta a diminuição da nucleofilicidade do iniciador para prevenir o ataque na
carbonila do grupo éster. Utiliza-se em geral compostos contendo 2 ou 3 anéis
aromáticos para distribuição da carga negativa (como por exemplo o 1,1-difenil-hexil-
lítio). No entanto, esses iniciadores nem sempre são nucleófilos o suficiente para
iniciar a polimerização de monômeros apolares. Daí, a importância da seleção de
um sistema iniciador ser bastante importante para se obter uma propagação
controlada [58].
A estrutura e a reatividade de um carbânion depende fortemente do
tamanho do seu contra-íon, uma vez que como isso determina a distância interiônica
no par iônico em contato, a extensão da solvatação e a associação intermolecular.
Além disso, os subprodutos da reação de iniciação tais como alcóoxidos, quando
associados ao iniciador podem alterar a cinética da iniciação. A complexidade da
polimerização aniônica aparece principalmente na densidade de carga do centro
aniônico no iniciador ou nos terminais de cadeia propagante. Como eles são
conhecidos para assumir múltiplas configurações e conformações, o curso da
polimerização é bastante dependente da natureza do meio reacional.
27
3.2.1. Cinética da polimerização com terminação
Para a polimerização iniciada por uma espécie alquil-lítio podemos
considerar:
A velocidade da iniciação é dada pela equação 1;
A reação de propagação se processa de acordo com;
A velocidade de propagação é dada pela equação 3;
Onde [M
-
] representa a concentração total de centros propagantes;
Considerando as reações de transferência para o solvente (THF) e o agente
terminador (ETOH), temos;
A velocidade de polimerização obtida pela combinação das equações 1, 2, 3, 4 e 5
fornece a equação 6:
28
O grau de polimerização médio é dado pela equação 7:
Onde, C
THF
é a constante de transferência para o solvente THF e C
ETOH
é a constante
de transferência para o agente terminador ETOH.
3.2.2. Polimerização iônica da Acroleína
A acroleína é um monômero muito reativo que possui um sistema de duplas
ligações conjugadas e pode ser polimerizado por via radicalar, catiônica e aniônica.
As sínteses por via radicalar e catiônica levam a polímeros insolúveis, mesmo a
baixas taxas de conversão [59]. Em contrapartida, a polimerização aniônica pode,
sob certas condições, conduzir a polímeros lineares solúveis. A acroleína pode
polimerizar pela abertura de três ligações diferentes: (1,2); (1,4); e (3,4). Desta
maneira, podem-se encontrar na microestrutura dos oligômeros de acroleína
grupamentos aldeído, ligações duplas, grupos éter vinílico e éter alifático. A Figura 7
apresenta a estrutura química para o monômero acroleína
Figura 7: estrutura química para a acroleína
Dados da literatura [60] mostraram que a velocidade de reação é de primeira
ordem tanto para a concentração de monômero quanto para a concentração de
iniciador, evidenciando que os centros ativos não se associam e são relativamente
estáveis no meio reacional. A polimerização ocorre com muita reação de
transferência de cadeia, de modo que, para tempos reacionais superiores a 6 h, há
formação de géis difíceis de analisar. A reação é bastante dependente da
temperatura e, quando conduzida a temperatura ambiente, ocorre com a formação
de estruturas gelificadas. O estudo também avaliou o efeito do tipo do íon
propagante na velocidade de polimerização e constatou que, para diferentes sítios
propagantes (oxânion ou carbânion), não houve grande efeito sobre a velocidade
global de polimerização.
29
No entanto, o efeito do contra-íon na massa molar do polímero e na
polidispersão foi mais preponderante. Para o contra-íon Li
+
a massa molar variou de
1200 a 2600 e valores de polidispersão >10 foram obtidos enquanto que para o Na
+
,
a massa molar variou de 5000 a 15000 e a polidispersão ficou entre 1,5 a >10 para
a mesma faixa de temperatura reacional (-40ºC a 5ºC). Foi verificado que a
polimerização iniciada pelo contra-íon Li
+
apresentou maior abertura da ligação (1,2)
e portanto maior teor de grupamentos aldeídicos na cadeia polimérica (teor de
unidades 1,2 – 32%), quando comparada com o contra-íon Na
+
(teor de unidades 1,2
– 12%). As polimerizações foram iniciadas pelos complexos naftaleno-Li e naftaleno-
Na, tendo empregado uma razão molar monômero/iniciador ([M]/[I]) entre 350 e
5000 e longos tempos de reação (acima de 3 h) [60,61]. A Figura 8 apresenta as
possíveis díades para a poliacroleína.
Figura 8: Possíveis díades para a poliacroleína
30
A dificuldade de se estudar a polimerização de um monômero cuja
possibilidade de encadeamento com formação de microestruturas é bastante variada
consiste em que a síntese da macromolécula desejada irá depender muito das
condições reacionais empregadas. No entanto, torna-se vantajoso ter uma molécula
com grupamentos diferenciados, pois isto pode conferir a ela um caráter anfifílico, o
que é bastante interessante do ponto de vista da biocompatibilidade. Teramura e
colaboradores [62] estudaram a interação de 5 polímeros sintéticos solúveis em
água com a superfície de células vivas e seus respectivos processos de eliminação.
Foi verificado que polímeros de caráter anfifílico apresentaram boa adesão à
membrana protéica celular e, portanto, mostraram-se bons candidatos para a terapia
de células para transplante.
3.2.2.1. Mecanismo de polimerização iônica da acroleína
Para explicar a existência de unidades estruturais (1,2),(1,4),(3,4), Pascault
e colaboradores [61] propuseram duas estruturas diferentes para as extremidades
em crescimento das poliacroleínas: uma forma enólica deslocalizada (1,4), e uma
forma oxânion (3,4).
O ataque do monômero ao átomo de oxigênio ou ao átomo de carbono
dependerá do cátion e do solvente utilizado. Quando a ligação -O
-
Mt
+
for muito forte,
o ataque ao átomo de oxigênio não será favorecido. Portanto a inserção
monomérica na cadeia em crescimento dependerá do tamanho do cátion e do poder
complexante ou dissociante do solvente.
Para as extremidades em crescimento (1,4) das poliacroleínas, o ataque no
C
3
do monômero seria mais provável quando a ligação entre o cátion Mt
+
e a
extremidade em crescimento fosse menos intensa então tem-se a formação de
unidades estruturais (1,4) e (3,4). Pelo contrário, uma interação muito forte entre as
extremidades em crescimento e o cátion provocaria ataque no C
1
e a conseqüente
formação de unidades (1,2). A Figura 9 apresenta o mecanismo de inserção
monomérica considerando a forma enólica deslocalizada como a extremidade em
crescimento.
31
Figura 9: Mecanismo de inserção monomérica considerando a forma enólica deslocalizada
como a extremidade em crescimento
Quando o ataque da cadeia em crescimento ocorre no C
3
do monômero, a
nova extremidade viva é do tipo (3,4). É uma forma não deslocalizada e, portanto, a
sua estrutura está antes da adição de uma nova molécula de monômero. O ataque
em C
1
e C
3
da acroleína deve depender da complexação da extremidade em
crescimento pelo monômero durante a sua aproximação e antes da propagação
propriamente dita. A Figura 10 apresenta o mecanismo de inserção monomérica
considerando a forma oxânion (3,4) como a extremidade em crescimento
Figura 10: Mecanismo de inserção monomérica considerando a forma oxânion (3,4) como a
extremidade em crescimento
32
Com as propostas de mecanismos apresentadas nas figuras 9 e 10, pode-se
entender o fato da polimerização conduzida na presença do cátion Li
+
produzir
polímeros com maiores teores de unidades (1,2) na microestrutura quando
comparado à reação conduzida na presença do cátion Na
+
. As características do
cátion Li
+
- pequeno tamanho e forte aceptor de elétrons- conferem forte atração do
Li
+
com a extremidade em crescimento, de maneira que não há diferenças na
microestrutura das poliacroleínas quando a reação ocorre em tolueno ou em THF,
para as mesmas condições reacionais. A evolução da microestrutura e a diminuição
da massa molar no caso da reação realizada na presença do cátion Li
+
foram
atribuídas à polaridade da cadeia em crescimento. O número de átomos de
oxigênio doadores e de estruturas acetal se multiplicam com o crescimento da
cadeia e nessas condições, o Li
+
é cada vez mais atraído por outros sítos da cadeia.
Assim, a complexação entre Li
+
e a extremidade em crescimento se enfraquecerá
com o aumento do Mn. Além disso, a ciclização de certas unidades estruturais (1,2),
durante a reação por transferência de cadeia intramolecular (Figura 11) conduz a
numerosas estruturas muito polares [61].
Figura 11: Reação por transferência de cadeia intramolecular que conduz à formação de
estruturas cíclicas
As unidades estruturais (1,2) se constituiriam apenas no início da cadeia em
crescimento, único momento onde os fenômenos de complexação possibilitariam o
ataque do monômero no C
1
da forma (1,4) deslocalizada. Este efeito de polaridade
da cadeia em crescimento foi observado de maneira progressiva apenas no caso do
Li
+
. Foi verificado também que as reações de transferência de cadeia com o
monômero, consequentemente a reiniciação de uma nova cadeia em crescimento,
são mais numerosas para o cátion Li
+
.
Muito é divulgado na literatura [63] sobre a síntese de microesferas de
acroleína, em geral obtidas por emulsão. No entanto, há poucas referências a
respeito da síntese de estruturas lineares de acroleína bem como sua respectiva
33
caracterização. As microesferas de acroleína não são favoráveis morfologicamente
para serem utilizadas como agente de ligação e também não são solúveis em água.
Um dos objetivos do presente Trabalho foi verificar quais as condições de
síntese que favoreceriam a formação de oligômeros de acroleína - e não polímeros
- e que conduzissem a estruturas de cadeias lineares, com grupamentos aldeído
disponíveis e solúveis ou parcialmente solúveis em água. Os oligômeros de
acroleína obtidos com tais características são fortes candidatos ao uso como
agentes de modificação de proteínas e podem ser utilizado como agente de ligação
da hemoglobina para a obtenção de estruturas do tipo poli-hemoglobina.
34
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. MATERIAIS
O sangue bovino foi fornecido pelo Abatedouro JN de Abreu Comércio de
Carnes SIE n° 572 sob inspeção Estadual. Os animais foram abatidos e o sangue
coletado diretamente da ferida de sangria em frasco já contendo a solução
anticoagulante (63 mL da solução CPDA-1/450 mL de sangue). Depois de coletado,
o sangue foi mantido sob refrigeração a aproximadamente 5ºC. Todos os reagentes
utilizados neste trabalho foram de grau de pureza analítica.
Cada 100 mL da solução CPDA-1 é composta de: 2,63 g de citrato de sódio
dihidratado, 0,33 g de acido cítrico, 0,22 g de fosfato de sódio monobásico
monohidratado, 3,19 g de dextrose monohidratada e 0,027 g de adenina.
Reagentes
Citrato de sódio di-hidratado, ácido cítrico, fosfato de sódio monobásico,
dextrose, NaCl, NaOH, HCl ácido lático, mono-oleato de sorbitan (Tween-80), THF,
benzofenona, 2,4-dinitro-fenil-hidrazina, CaCl
2
, metanol, NaHCO
3
, hexano, LiCl e
NaHB
4
foram comprados da Vetec Química Fina Ltda. (Rio de Janeiro,RJ, Brasil). O
reagentes Albumina bovina e o Tris-HCl foram comprados da Sigma Chemical Co.
(Saint Louis, MO, USA). Os reagentes DMSO espectrométrico e DMSO deuterado
foram comprados da Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, USA). Os reagentes
Hemoglobina padrão e Reagente de cor foram comprados da Doles Ragentes LTDA
(Goiânia, GO, Brasil). A resina utilizada na cromatografia líquida em coluna foi a Q-
Sepharose fast flow da Pharmacia Biotech (Wikströms, Suécia). A acroleína foi
comprada da Spectrum Chemical. O sec-BuLi foi adquirido da Acrós (solução 1,3M
em ciclohenano e pentano 92/8). O tert-BuLi foi adquirido da Aldrich (solução 1,7M
em hexano). O estireno foi doado pela indústria Petroflex SA e tratado em coluna de
alumina seca.
Equipamentos
Os equipamentos utizados foram Ultra-som 500 W Cole Parmer (Vernon
Hills, USA), Centrífuga refrigerada Himac CR22GII da Hitachi Koki Co., Ltd.
(Hitachinaka City, Japan), Rotavapor Buchi, rotavapor R-114 (Suíça), Analisador
35
termogravimétrico modelo TGA500 da marca TA (Norwalk, USA), Espectrofotômetro
de absorção na região do infravermelho da Perkin Elmer, modelo FTIR-1720-X
(Mugrave, Victoria, Austrália),
1
H NMR Espectrômetro Varian Mercury 300 (Palo Alto,
CA, USA), UV-VIS espectrofotômetro da Varian CARY100 (Mulgrave,Victoria,
Austrália), Sistema de GPC equipado com uma bomba da Waters 600E (Milford, MA,
USA), usando uma válvula de injeção Rheodyne 7125 (Cotati, USA), e detector
Waters 2996 photodiode (Milford, MA, USA), transdutor de força isomérica Ugo
Brasile 7011-4 (Comerio, Itália), banho termostato Ugo Brasile 4050 (Comerio, Itália)
e Analisador de partículas Zetasizer Nano-Zs, Malvern Instruments.
4.2. METODOLOGIA
O trabalho foi executado em 4 etapas; a primeira etapa consistiu na
obtenção de um concentrado de hemoglobina bovina purificada; a segunda etapa
consistiu na síntese das moléculas utilizadas para promover as ligações
intermoleculares nas HbBvs e suas respectivas caracterizações; a terceira etapa
consistiu na reação para obtenção de estruturas tipo poliHb (bioconjugados) e a
quarta etapa consistiu na avaliação dessas estruturas quanto à vasoconstrição.
4.2.1. Obtenção de um concentrado de hemoglobina bovina purificada
A obtenção de um concentrado de hemoglobina bovina purificada seguiu
metodologia já empregada e desenvolvida em pesquisas anteriores realizadas no
Instituto de Macromoléculas e está detalhadamente descrita na literatura [64].
A metodologia será descrita em linhas gerais. O sangue bovino foi
submetido a carbonilação pelo borbulhamento de CO e em seguida centrifugado a
1000x g durante 20 min. O precipitado foi lavado várias vezes com solução isotônica
de NaCl 0,9% e centrifugado nas mesmas condições até ausência total de albumina.
A hemólise foi realizada por ultra-som Processador Ultra-sônico 500W Cole Parmer
(Vernon Hills, USA) com sonda padrão de 13 mm de diâmetro e amplitude ajustada
em 40% durante 5 minutos em banho de gelo. Após a lise, as amostras sofreram
tratamento térmico a 60º C em banho d’água, na ausência de luz, durante 1h, para
desnaturar todas as proteínas hidrossolúveis, excetuando-se a HbBv-CO. Em
36
seguida, as amostras foram centrifugadas a 2000x g durante 40 min. O
sobrenadante foi filtrado primeiramente em carvão ativo sob vácuo e,
posteriormente, em membrana Milipore de 0,22 μm. Esta solução foi submetida a
cromatografia líquida em coluna. A coluna foi empacotada manualmente por
gravidade com a resina comercial Q-Sepharose Fast Flow (Q-SFF) sob fluxo de
solução tampão tris-HCl pH=7,4. As frações mais ricas em HbBv foram coletadas
para determinação da concentração de HbBv na solução.
4.2.1.1. Concentração de Hemoglobina Bovina
A concentração de Hb na solução hemolisada e nas frações coletadas após
passagem pela coluna de cromatografia foi determinada pelo método da cianomete-
hemoglobina por meio de espectrometria de absorção na região do visível. O
reagente de cor concentrado da Doles Reagentes (10 mL) foi diluído a 1000 mL com
água deionizada. Foram pipetados 20 μL de cada amostra de solução de HbBv e
adicionados 5 mL do reagente de cor diluído. A solução foi homogeneizada e
deixada em repouso por três minutos. A leitura da absorbância foi efetuada no
comprimento de onda de 540 nm. Como branco foi utilizada a água deionizada.
A curva-padrão de Hb foi obtida usando como padrão cianeto de
hemoglobina da Doles Reagentes, pois esta solução de hemoglobina possui
concentração conhecida de 14%. A partir desta solução, foram feitas diluições para
obter concentrações de 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25% e 0,1% de hemoglobina.
Para cada solução, foi lida a absorbância na proporção de 0,02 mL de solução de
Hb em 5 mL de reagente de cor. Foram realizadas cinco leituras para cada
concentração e o gráfico de absorbância versus concentração de hemoglobina foi
obtido. Através da equação da reta, foi possível determinar a concentração de Hb
nas amostras após a purificação por resina de troca iônica.
O valor da concentração de HbBv foi obtido por meio da relação c=(Abs-
0,00144)/0,02641, onde c é a concentração da HbBv e Abs é o valor da absorvância
lido a 540nm.
37
4.2.2. Síntese das moléculas utilizadas para promover as ligações
intermoleculares nas HbBvs
4.2.2.1. Síntese dos homopolímeros e copolímeros de acroleína
Em frasco Schlenck de 120 mL, flambado, seco sob nitrogênio e equipado
com barra magnética, foram recolhidos tetra-hidrofurano previamente seco e
destilado em presença de sódio. Após o banho atingir a temperatura desejada, o
estireno e/ou acroleína foram adicionados, com auxílio de uma seringa. Passado o
tempo necessário para que o sistema atingisse o equilíbrio térmico, o iniciador foi
adicionado rapidamente. Ao final de 1 h foram adicionados 0,5 mL de etanol para
término da polimerização. O produto bruto foi recuperado por meio de precipitação
em hexano e secagem em estufa a vácuo até peso constante. As quantidades
adicionadas para obtenção de cada amostra estão descritas na Tabela 7 no item de
Resultado e Discussão. Durante o tempo reacional o sistema foi mantido sob
atmosfera de nitrogênio (sem fluxo).
4.2.2.2. Caracterização dos oligômeros de acroleína
4.2.2.2.1. Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho (FTIR)
Os oligômeros de acroleína foram caracterizados por espectroscopia de
absorção na região do infravermelho, em espectrofotômetro Perkin-Elmer 1720x . A
análise foi realizada em pastilha de KBr, na faixa espectral de 4000-400 cm
-1
, com
resolução de 2 cm
-1
e 20 scan de varredura.
4.2.2.2.2. Espectrometria de ressonância magnética de hidrogênio (
1
H NMR)
Os espectros foram obtidos em espectrofotômetro Varian Mercury 300 (Palo
Alto, Ca, USA), na freqüência de 300 MHz para
1
H, sob temperatura ambiente. As
amostras foram obtidas em DMSO deuterado para concentração aproximada de 15
mg/mL.
38
4.2.2.2.3. Análise termogravimétrica (TGA)
Os oligômeros de acroleína foram analisados por termogravimetria em
aparelho TGA-500 (Norwalk, USA). Cerca de 2 mg de amostra foram analisadas. A
corrida foi obtida por aquecimento da amostra de 30 a 700°C, aplicando-se uma taxa
de aquecimento de 10°C/min.
4.2.2.2.4. Cromatografia em Permeação de Gel (GPC)
As massas molares médias (M
n
e M
w
) dos oligômeros de acroleína foram
determinadas por cromatografia de permeação em gel usando o Sistema de GPC
equipado com uma bomba da Waters 600E (Milford, MA, USA), e uma válvula de
injeção Rheodyne 7125 (Cotati, USA), e detector Waters 2996 photodiode (Milford,
MA, USA). A coluna SB804 foi calibrada com padrões de glicol etilênico. A razão de
fluxo foi mantida a 1 mL/min numa solução contendo LiCl 0,05 M em DMF:H
2
O (1:1).
4.2.2.2.5. Quantificação do teor de aldeído nos oligômeros de acroleína
A metodologia empregada para determinação de grupamentos aldeído
utiliza a reação do 2,4-dinitro fenilhidrazina (DNFH) com os grupamentos aldeídos
disponíveis dos oligômeros de acroleína. A reação da DNFH com os compostos
carbonilados fornece as hidrazonas correspondentes, que podem ser quantificadas
por espectrometria de absorção no ultravioleta. A metodologia empregada é uma
adaptação do método descrito na literatura por Lohman [65]. O método DNFH é
bastante sensível e detecta até 10
-7
mols de CHO. A Figura 12 apresenta a reação da
DNFH com compostos carbonilados para fornecer a respectiva hidrazona.
Figura 12: Reação da carbonila aldeídica com a DNFH
39
Dados da literatura [65,66] relatam que os coeficientes de absortividade
molar das hidrazonas não variam muito para diferentes tipos de aldeído sendo em
torno de 22000 L/mol.cm., de maneira que, para os resultados descritos neste
trabalho, adotou-se o valor de absortividade molar igual a 22000 L/mol.cm.
Pesou-se de 5-7,5 mg para os oligômeros de acroleína e de 6-10 mg para os
oligômeros de acroleína-co-estireno. As amostras foram diluídas em sulfóxido de
dimetila e avolumadas até 10 mL em balão volumétrico.Em erlemeyer com tampa
esmerilhada foram adicionados 5 mL de hexano, 10 mL de solução alcóolica
saturada de DNFH, 1 gota de HCl concentrado e a amostra (0,4-0,6 g da solução do
homopolímero ou 0,2-0,3 g da solução do copolímero). O sistema permaneceu no
banho a 50 ºC por 1h. Após atingir o equilíbrio térmico o conteúdo do erlemeyer foi
vertido para um funil de decantação para extração da hidrazona em hexano. Foram
acrescentado 10 mL de NaHCO
3
1%, 15 mL de metanol e 10 ml de hexano. A fração
aquosa foi extraída com 15 mL de hexano por mais 4 vezes. A fração em hexano foi
recolhida e adicionou-se CaCl
2
anidro como dessecante. O sistema foi deixado em
repouso por uma noite, vertido quantitativamente para um balão volumétrico de 100
mL e avolumado em hexano para posterior leitura no espectrômetro de ultravioleta
na faixa espectral de 250-400 nm.
4.2.2.2.6. Teste de solubilidade
Os homopolímeros e copolímeros de acroleína foram avaliados quanto a
solubilidade em água, etanol e sulfóxido de dimetila. Os homopolímeros foram
avaliados também quanto a solubilidade em dimetil formamida (DMF) e solução 1:1
de dimetil formamida e solução aquosa de LiCl 0,01M.
Cerca de 10mg do homopolímero ou copolímero foram pesados em frasco
ependorf e 1,00 mL do solvente foram adicionados as amostras. O volume do
solvente foi medido em pipeta automática. A suspensão foi mantida em repouso por
pelo menos 24h, para o inchamento do polímero e depois homogeneizada. O
sistema foi novamente mantido em repouso por pelo menos 24h e posteriormente
centrifugado. A fração solúvel foi desprezada e a fração insolúvel seca em estufa à
vácuo. Por meio da diferença dos valores da massa pesada e da fração insolúvel,
calculou-se a fração da amostra solubilizada no solvente em questão.
40
4.2.2.2.7. Estudo da velocidade de conversão
Foram estudados a velocidade de conversão para as amostras obtidas com
razões [M]/[I] iguais a 6, 40, 500 e 1000, tanto para o iniciador sec-BuLi quanto para
o iniciador terc-BuLi. Foram retiradas alíquotas de 10 mL a tempos periódicos
durante a polimerização destas amostras. O sistema foi mantido sob fluxo contínuo
de gás nitrogênio e a metodologia empregada foi análoga à descrita no item 4.2.2.1.
4.2.3. Reação para obtenção de estruturas tipo poliHb (Bioconjugados)
Em um reator deaerado com gás nitrogênio foram adicionados 2 mL de
solução de hemoglobina bovina previamente deaerada na concentração de 22,4
g/dL, e 2 mL de água MilliQ. O oligômero de acroleína foi adicionado nas
quantidades descritas no item Resultados e Discussões e deixado reagir por 18h
sob atmosfera de nitrogênio, agitação magnética e na ausência de luz. A razão
molar [Hb]:[CHO no oligômero] variou de 1:10, 1:50 e 1:100. O agente redutor
boroidreto de sódio (NaBH
4
) foi adicionado como terminador da reação na razão
molar [NaBH
4
]:[CHO no oligômero] igual a 1:5 ou 1:10 com a finalidade de levar as
ligações imina a amina. Após a reação, as amostras foram colocadas em diálise em
tampão tris HCl pH=7,4 por 24h a 4 ºC, para eliminação dos reagentes residuais.
4.2.3.1 Caracterização dos Bioconjugados
4.2.3.1.1. Concentração de HbBv nos Bioconjugados
A concentração de HbBvs nos bioconjugados foi obtida, como descrito no
item 4.2.1.1.
4.2.3.1.2. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR)
Os bioconjugados foram caracterizados por espectroscopia de absorção na
região do infravermelho, em espectrofotômetro Perkin-Elmer 1720x. A análise foi
41
realizada em pastilha de KBr, na faixa espectral de 4000-400 cm
-1
, com resolução de
2 cm
-1
e 20 scan de varredura.
4.2.3.1.3. Avaliação da HbBv modificada quanto à autooxidação
A determinação de met-Hb foi realizada por espectroscopia no UV, em
espectrofotômetro UV-VIS da Varian CARY100 (Mulgrave,Victoria, Austrália). O
método cianomete-hemoglobina foi empregado conforme descrito na literatura [67].
Em linhas gerais, a concentração de met-Hb foi avaliada pela lei de Lambert-Beer
considerando as leituras de absorção antes e após a complexação da met-Hb com
KCN.
A solução de Hb e Hb-modificada foi diluída para obtenção de valores de
absorção menores que a unidade, para o comprimento de onda igual a 630 nm.
Após a diluição, a primeira leitura (L
1
) foi realizada para verificar a absorção de oxi-
Hb, desoxi-Hb e met-Hb simultaneamente. A amostra foi adicionada à solução para
complexação da met-Hb – 1 gota por mL de amostra. A segunda leitura (L
2
)
corresponde à absorção de oxi-Hb e desoxi-Hb somente. A absorção referente ao
teor de met-Hb foi dada pela diferença das absorções de L
1
e L
2
.
A solução complexante consiste na solução 1:1 de KCN a 10% p/v e tampão
fosfato pH igual a 7,6 a 50 mM. A concentração de met-Hb foi encontrada pela
relação:
[Met−Hb]=
L
1
−L
2
ε
×D
1
Onde:
L
1
= 1ª leitura, L
2
= 2ª leitura, D
1
= fator de diluição
ε = coeficiente de absortividade molar da met-Hb a 630 nm, que equivale a 3,7
4.2.3.1.4. Avaliação da HbBv modificada quanto à natureza macromolecular
O tamanho do diâmetro hidrodinâmico dos bioconjugados foram
determinados por espalhamento de luz, em analisador de partículas Zetasizer Nano-
Malvern Instruments provido de laser a 633nm e ângulo de scattering de 173 ºC. As
amostras foram diluídas em água miliQ ou tampão Tris-HCl pH=7,40 e foram
avaliadas em percentuais de intensidade e de volume para uma média de 3 leituras
42
em cubeta de poliestireno. O modelo matemático empregado para obtenção do
coeficiente de difusão translacional foi o de Cumulants.[68-73]
4.2.4. Avaliação dos bioconjugados quanto à vasoconstrição e à interferência
em testes clínicos
Uma das limitações dos sistemas carreadores de oxigênio derivados de
hemoglobinas modificadas é que eles promovem o aumento da pressão arterial.
Parte desse fenômeno é atribuído à alta afinidade da Hb (fora da hemácia) com o
NO. O NO é responsável em parte pela manutenção do tônus dos vasos sanguíneos
atuando como vaso dilatador. Os derivados de Hb em geral capturam o NO e o
efeito da vasoconstrição é rapidamente observado após administração do produto.
Ratos wistar de ambos os sexos, pesando cerca de 200 g foram utilizadas
para o experimento. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e
posterior exsanguinação. Em seguida, suas aortas foram retiradas e mantidas sob
oxigenação e em solução fisiológica na seguinte composição; NaCl 119 mmol/L, KCl
4,7 mmol/L, KH
2
PO
4
1,2 mmol/L; MgSO
4
1,2 mmol/L, NaHCO
3
14,9 mmol/L, CaCl
2
1,6 mmol/L, glicose 11,5 mmol/L e oxigenada com mistura carbogênica (95% de O
2
e
5% de CO
2
). Os tecidos conectivo e adiposo aderido à aorta são retirados e o vaso é
cortado transversalmente para a obtenção de anéis de 2 mm de largura (cerca de 6-
8 anéis por aorta).[74]
Os anéis da aorta foram adaptados a ganchos diametralmente opostos e
mantidos no interior de uma cuba com solução fisiológica e aeração contínua com
mistura carbogênica. Uma das extremidades do gancho foi conectado a um
transdutor de força isomérica (Ugo Brasile 7011-4 – Comerio, Itália) para submeter a
tensão de 10 mN à aorta e a outra extremidade fixada no interior da cubeta. As
cubas foram mantidas em um banho termostático (Ugo Brasile 4050– Comerio,
Itália) sob temperatura constante de 37,0 ± 0,5ºC. Os anéis foram submetidos à
tensão de 10 mN. Aguardou-se aproximadamente 1h para estabilizar o sistema
realizando trocas de solução nutriente a cada 15 min. Após o equilíbrio do sistema, o
órgão (aorta) é tratado com substâncias que irão induzir contrações e relaxações –
angonistas. As contrações e relaxações serão traduzidas, amplificadas e registradas
43
em um registrador potenciométrico (Chrono-Log Corporation 21025 – Comerio,
Itália).
Para prosseguir o experimento, é necessário verificar se o endotélio está
íntegro. Para tal, a contração do músculo liso vascular é induzida com a adição de
fenilefrina a 10 µM. O gráfico registra uma curva ascendente que tende a um platô.
Quando o platô foi atingido a acetilcolina a 10 µM foi adicionada para induzir o
relaxamento do músculo. O gráfico registra uma curva descendente que tende ao
retorno da linha base. O endotélio é considerado íntegro quando o relaxamento
observado for maior que 80% e é considerado destruído quando quando o
relaxamento for menor que 10%. Após a obtenção da contração máxima e o
subseqüente relaxamento, o sistema foi lavado com solução nutriente, em intervalos
de 15 min, até que a mesma retornasse a linha base [75].
O Fator de reversão é uma medida direta que fornece a afinidade dos
bioconjugados pelo NO endógeno. Os produtos da HbBv modificada foram avaliados
para obtenção dos fatores de reversão do relaxamento. Foram contabilizados o
percentual de relaxamento induzido pela acetilcolina e o percentual de reversão
deste pela hemoglobina. O fator de reversão foi calculado seguindo a equação 8 [76]
Fator de Reversão =
% de Relaxamento x % de Reversão
100
eq. 8
Para obter-se os percentuais de interferência nos testes clínicos de rotina,
10 mL de sangue humano foram coletados em dois tubos contendo anticoagulante.
O sangue foi coletado de voluntário saudável, para o tipo sanguineo A e fator Rh
positivo. A amostra foi centrifugada por 5min a 3000g para obtenção do soro. A
amostra HbPA22 (1:100) foi adicionada ao soro na proporção de 1:3 [30]. Esta
amostra foi enviada para o laboratório de análises clínicas da Faculdade de
Farmácia da UFRJ.
44
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. HOMOPOLÍMEROS DE ACROLEÍNA
Foi estudada a influência do tipo de iniciador aniônico (terc-BuLi ou sec-
BuLi) na massa molar e polidispersão dos produtos da polimerização aniônica de
acroleína em THF, tendo-se variado a razão molar monômero/iniciador no meio
reacional (entre 10 e 100), mantendo-se constante a temperatura reacional (-90º C).
Os oligômeros obtidos foram caracterizados inicialmente através da análise de
cromatografia de permeação em gel.
5.1.1. Análise de Cromatografia de Permeação em Gel
A princípio os produtos de síntese foram analisados por cromatografia de
permeação em gel para coluna SB804 (adquirida da Shodex) utilizando como
solvente a água. Os resultados de tais análises mostraram valores de massa molar
muito altos e irreais, na ordem de 100000 g/mol. Como os polímeros mostraram-se
mais solúveis em solventes apróticos, uma solução de dimetil-formamida e água na
proporção 1:1 foi testada na mesma coluna. A análise de GPC realizada com esta
solução resultou em valores de massas molares bem menores. A adição de cloreto
de lítio diminuiu ainda mais os valores de pesos moleculares. Dados da literatura
relatam que os oligômeros interagem com os sais de lítio e minimizam as interações
polares intra e intermoleculares no oligômero, tornando as estruturas mais
desagregadas e assumindo conformações mais helicoidais, o que favorece a melhor
solvatação. Acredita-se que as moléculas de poliacroleínas obtidas, quando em
água, tornaram-se agregadas e, dependendo da conformação que assumem,
adquirem interações preferenciais tais, que não penetram nos poros da resina da
coluna cromatográfica e fornecem resultados errôneos
As condições experimentais para a obtenção dos oligômeros de acroleína,
bem como os resultados de GPC estão descritos na Tabela 7.
45
Tabela 7: Condições experimentais e resultados de GPC para a síntese de oligômeros de
acroleínas
Nome da
amostra
Acroleína
mmoles
Sistema iniciador
Tipo mmoles
Razão
[M]/[I]
MM
M
w
(g/mol) M
n
(g/mol) M
w
/M
n
PA13 89,3 terc-Buli 8,9 10 - - -
PA14 89,3 terc-Buli 4,5 20 983 358 2,7
PA15 178,6 terc-Buli 5,9 30 - - -
PA16 89,3 terc-Buli 2,2 40 650 307 2,1
PA17 178,6 terc-Buli 3,5 50 473 275 1,7
PA18 178,6 terc-Buli 2,2 80 408 310 1,5
PA28 178,6 sec-Buli 29,7 6 1481 504 2,9
PA29 178,6 sec-Buli 22,3 8 - - -
PA27 178,6 sec-Buli 17,8 10 4804 678 7,1
PA21 89,3 sec-Buli 4,5 20 1057 368 2,9
PA22 178,6 sec-Buli 5,9 30 743 334 2,2
PA23 89,3 sec-Buli 2,2 40 670 330 2,0
PA24 178,6 sec-Buli 3,0 60 605 304 2,0
PA25 178,6 sec-Buli 2,2 80 - - -
PA26 89,3 sec-Buli 0,9 100 361 196 1,8
PA31 178,6 terc-Buli 29,8 6 685 521 1,3
PA32 178,6 terc-Buli 22,3 8 1047 428 2,4
PA33 178,6 terc-Buli 17,8 10 7786 721 10,9
PA34 178,6 terc-Buli 9,0 20 876 353 2,5
PA35 178,6 terc-Buli 5,9 30 891 376 2,4
PA36 178,6 terc-Buli 4,4 40 888 374 2,4
PA37 178,6 terc-Buli 3,0 60 596 320 1,9
PA38 178,6 terc-Buli 2,2 80 582 314 1,8
PA39 178,6 terc-Buli 0,2 100 620 334 1,8
Volume de solvente (THF) = 60mL; T
reacional
= -90ºC
Ao contrário do esperado, verificou-se que as massas molares dos
oligômeros de acroleína obtidas diminuíram com o aumento da razão molar
[monômero]/[iniciador] para ambos os sistemas iniciadores utilizados, conforme pode
ser observado nas Figuras 13 e 14. A amostra obtida para a razão [M]/[I]=10
apresentou um comportamento diferenciado das demais amostras e os valores de
massa molar e de polidispersão foram os maiores. Na construção do gráfico estas
amostras foram retiradas, uma vez que se mostraram muito diferenciadas das
demais. Os gráficos apresentam a tendência do comportamento do sistema.
46
Figura 13: Massas molares (M
w
) versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por sec-BuLi
Figura 14: Massas molares (M
w
) versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por terc-BuLi
Acredita-se que o aumento da razão [M]/[I] tenha levado ao aumento das
reações de transferência de cadeia com o monômero acroleína em detrimento das
47
outras reações de transferência de cadeia com os componentes do meio reacional
(para o solvente, iniciador etc), o que provocou a queda da massa molar do
oligômero nesta faixa de razões [M]/[I] e o estreitamento da polidispersão.
As distribuições de massas molares obtidas para os oligômeros foram
relativamente estreitas comparadas às relatadas na literatura [61] e o aumento da
razão [M]/[I] promoveu a diminuição da polidispersão para os dois sistemas
iniciadores (para valores menores que 2), conforme pode ser observado nas Figuras
15 e 16. No entanto, este fenômeno ocorreu dentro de uma faixa bastante estreita,
isto é, para o sistema iniciado por sec-BuLi, a variação da polidispersão foi de 1,9 a
2,9 e para o sistema iniciado por terc-BuLi foi de 1,7 a 2,8 (PA14-PA18) e 1,3 a 2,5
(PA31 a PA39). Exceção ocorreu para as amostras PA27 e PA33, cujos valores de
polidispersão foram de 7,1 e 10,9 respectivamente.
De fato, o iniciador terc-BuLi é mais básico que o sec-BuLi e, portanto,
poderia estar mais solvatado sendo assim menos reativo para a iniciação da
polimerização aniônica da acroleína. Consequentemente, a velocidade de
polimerização para o terc-BuLi seria também menor.
Figura 15: Polidispersão versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por sec-BuLi
48
Figura 16: Polidispersão versus razão [M]/[I] das amostras iniciadas por terc-BuLi
Um comportamento diferenciado foi observado para as reações de
polimerização da acroleína conduzida na razão [M]/[I] igual a 10, Acredita-se que
nessas condições as reações de transferência de cadeia foram desfavorecidas em
detrimento da reação de propagação.
5.1.2. Análises de Espectrometria de Absorção no Infravermelho
As análises de FTIR dos oligômeros de acroleína obtidos revelaram a
presença das microestruturas correspondentes às 3 inserções monoméricas
possíveis na cadeia. As inserções monoméricas (1,2) foram confirmadas pela
presença de absorções referente à carbonila de aldeído; as inserções (3,4)
correspondem à presença do grupo vinílico monossubstituído e as inserções (1,4)
são referentes ao éter vinílico.
A presença de grupamentos aldeído nos oligômeros foi confirmada por meio
do aparecimento de absorções referentes ao estiramento da carbonila na faixa de
1740-1720 cm
-1
, absorções referentes à deformação assimétrica de CH na faixa de
1410-1380 cm
-1
e pela presença de um doublet característico na faixa de 2830-2810
49
cm
-1
e 2720-2695 cm
-1
. Em todas as amostras, foi verificada a presença do grupo
aldeído e, consequentemente, a inserção monomérica (1,2) na microestrutura dos
oligômeros, conforme pode ser observado nos espectros das Figuras 17 e 18.
Os grupamentos vinílicos monossubstituídos foram confirmados pelo
aparecimento da absorção em torno de 3080 cm
-1
,
que pode ser atribuída ao
estiramento de =CH
2
de grupos vinílicos terminais. Verifica-se a inserção
monomérica (3,4) na microestrutura para todas as amostras obtidas.
Figura 17: Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidos em diferentes razões
[M]/[I] para o iniciador terc-BuLi
Verifica-se também a presença de absorção em torno de 3400 cm
-1
em todos
os produtos obtidos, que pode ser atribuída a interações por ligações de hidrogênio
de água adsorvida no oligômero. Nota-se também que, para ambos os sistemas de
iniciadores, à medida que a razão [M]/[I] aumenta, o perfil das curvas de FTIR sofre
pequenas alterações. Tais alterações são mais perceptíveis na faixa espectral de
1400-1700 cm
-1
.
50
Nos oligômeros sintetizados com o iniciador sec-BuLi, observa-se o
aparecimento da absorção em 1588 cm
-1
e esta tende a diminuir (Figura 18) com o
aumento da razão [M]/[I]. Em contrapartida, surge nos espectros uma duplicação de
bandas na região de insaturação em torno de 1650 cm
-1
. Outra alteração importante
é que à medida que a razão [M]/[I] aumenta, a absorção em 3080 cm
-1
torna-se mais
bem definida nos espectros.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
PA26
PA25
PA24
PA23
PA21
PA27
PA29
PA28
Transmitância
Números de onda (cm
-1
)
Figura 18: Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidos a diferentes razões
[M]/[I] para o iniciador sec-BuLi
A absorção a 1588 cm
-1
poderia ser atribuída à formação de estruturas
cíclicas do tipo anéis furânicos (Figura 18). Elas foram observadas
predominantemente nas amostras obtidas para razões [M]/[I] menores, iniciadas por
sec-BuLi.
As bandas referentes aos números de onda 1670 e 1650 cm
-1
podem ser
atribuídas às absorções da insaturação de éter vinílico. A presença destas
absorções é mais evidente para as amostras PA21, PA22, PA23, PA24, PA25 e
51
PA26. No entanto, elas podem existir e estar encobertas para o caso das amostras
PA27, PA28 e PA29, uma vez que em todas as amostras a absorção em torno de
1100 cm
-1
, referente ao estiramento assimétrico de éter C-O-C, está presente. O
aumento da razão [M]/[I] diminuiu a massa molar dos oligômeros e as bandas em
torno de 1650 cm
-1
e 1680 cm
-1
, que correspondem à inserção monomérica (1,4) na
microestrutura do polímero, tornam-se mais notáveis nos espectros, tanto para as
amostras obtidas com o iniciador sec-BuLi quanto as obtidas com terc-BuLi. A
Figura 19 mostra o efeito de diminuição da massa molar no espectro de FTIR com o
aumento da razão [M]/[I] para as amostras sintetizadas com o iniciador terc-BuLi.
Figura 19: Variação da microestrutura com o aumento da razão [M]/[I] para as amostras
obtidas com terc-BuLi; a) [M]/[I]=10, b) [M]/[I]=40, c) [M]/[I]=80
Comparando-se os polímeros obtidos com sec-BuLi e terc-BuLi para a
mesma razão [M]/[I] igual a 10, verificam-se diferenças microestruturais
consideráveis, conforme mostra a Figura 20. A presença da absorção a 3080 cm
-1
é
observada para a amostra PA27 obtida com o sec-BuLi, mas não para a amostra
52
PA13 obtida com o terc-BuLi. Outro fator importante é que as absorções referentes
ao grupamento éter (em 1128 cm
-1
) são mais evidentes para a amostra PA27 do que
para a amostra PA13, indicando a presença de inserções (3,4) na primeira. A
absorção a 1580 cm
-1
aparece apenas para a amostra PA27 e indica que a formação
de estruturas cíclicas está também vinculada à natureza do iniciador e à
concentração de monômero no meio reacional.
Os oligômeros de acroleína obtidos com o iniciador sec-BuLi foram os que
apresentaram maior teor de grupamentos aldeídos na microestrutura (estes
resultados serão mostrados posteriormente). Então, neste caso, ocorre maior
probabilidade de ciclização, produzindo ligações éter cíclicos e aumentando a
absorção da banda em 1580 cm
-1
. Dessa forma, as amostras dos oligômeros obtidas
por sec-BuLi e para concentração [M]/[I] menores (6, 8, 10 e 20) apresentaram
estruturas cíclicas na microestrutura do oligômero.
Figura 20: Espectros de FTIR para os oligômeros de acroleína obtidas a razão [M]/[I] igual a
10 para o iniciador sec-BuLi (PA27) e terc-BuLi (PA13)
53
Assim, aparentemente, o aumento da velocidade de polimerização, com o
uso do iniciador terc-BuLi e altas razões [M]/[I], levou à polimerização linear da
acroleína. Por outro lado, o aumento da [M]/[I] levou à diminuição da massa molar
devido às reações de transferência de cadeia com o monômero.
5.1.3. Análises de Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio (
1
H NMR)
Os oligômeros de acroleína foram avaliados por espectrometria de
ressonância magnética nuclear para o núcleo de
1
H, sob temperatura ambiente. As
amostras foram obtidas em DMSO deuterado para concentração aproximada de 15
mg/mL. Os espectros apresentaram perfis bastante alargados em detrimento de
regiões de superposição dos núcleos pertencentes aos oligômeros. A Figura 21
apresenta o espectro de
1
H NMR para a amostra obtida na razão molar [M]/[I] = 20
com iniciador sec-BuLi.
Figura 21: Espectro de
1
H NMR da amostra obtida para razão molar [M]/[I] = 20 com
iniciador sec-BuLi
54
Foi verificada a presença do pico a 9,6 ppm referente ao hidrogênio da
carbonila aldeídica para todas as amostras, confirmando os resultados de FTIR. A
região entre 4,5 a 6,8 ppm confirma a presença de núcleos de H ligados a átomos
de carbono insaturados. No entanto, há sobreposições de picos, de modo que se
torna bastante difícil a distinção de cada núcleo de H pertencente às principais
unidades monoméricas estabelecidas nas possíveis díades para a poliacroleína.
Gulino e colaboradores [61] estudaram os assinalamentos do espectro de
NMR para poliacroleínas obtidas em razões molares [M]/[I] entre 300 a 5000 e com
iniciador do tipo complexo naftaleno-Lítio. Para o assinamento dos picos do espectro
de NMR usou as seguintes moléculas-modelo; cis e trans 1-etóxi-1propeno, 3,3
dietoxi-1 propeno, 2 metil propanal e 1,4 dimetóxi-tetra-hidrofurano. Os
pesquisadores propuseram uma divisão do espectro por regiões para, por meio
delas, associarem com a microestrurura da poliacroleína. Nem todos os núcleos de
H foram assinalados pelo método desenvolvido por Gulino, no entanto, esta foi a
referência bibliográfica mais satisfatória para elucidar os assinalamentos da
poliacroleína. O presente trabalho fará uso da mesma metodologia empregada por
Gulino.
A Figura 22 apresenta o espectro de
1
H
NMR para a amostra obtida na razão
molar [M]/[I] = 80 com o iniciador sec-BuLi, segmentado nas regiões A, B, C, D, E, F,
G, H e I descritas por Gulino. Nos espectros dos produtos de síntese obtidos neste
trabalho foram observadas outras relaxações que não foram visualizadas no estudo
descrito na literatura. Acredita-se que estas diferenças são devidas à obtenção de
produtos diferentes ocasionados pela diferença nas condições reacionais, tais como
o tipo de iniciador, a razão molar [M]/[I], a temperatura reacional, etc. O outro fato
significativo é que o estudo de Gulino foi realizado em um equipamento com
magneto de 100 MHz enquanto que os produtos deste trabalho foram caracterizados
em um equipamento de 300 MHz. As regiões do espectro, que foram destacadas em
cinza representam as regiões não descritas na literatura.
55
Figura 22: Espectro de
1
H NMR da amostra obtida em razão molar [M]/[I] = 20 com iniciador
sec-BuLi
A Figura 23 apresenta o espectro de
1
H
NMR para a amostra obtida na razão
molar [M]/[I] = 80 para o iniciador sec-BuLi com os respectivos assinalamentos.
Figura 23: Espectro de
1
H
NMR da amostra PA25
56
A Tabela 8 descreve os assinalamentos dos núcleos de H para os
oligômeros de acroleína e suas respectivas regiões no espectro de NMR bem como
os átomos de H correspondentes no modelo utilizado.
Tabela 8: Assinalamentos dos núcleos de H para os oligômeros de acroleína
Região
no espectro
Unidades
monomérica
Faixa de
deslocamento
químico (ppm)
Assinalamentos correspondentes
A (1,2) 9,6 Núcleo do H ligado à carbonila aldeídica
B (1,4) 5,7-6,8
Núcleo do H ligado ao carbono da dupla ligação e o
carbono ligado ao oxigênio
C (3,4) 4,8-5 Núcleo do H ligado ao carbono entr grupos éter
D (3,4)
5,1-5,5
5,7-6,1
Núcleo do H ligado a grupos vinilas terminais ligado
ao C entre grupos éter.
E (1,4) e (1,2)
4,6-5,0
4,7-5,0
Núcleo do H ligado ao C da dupla, ligado ao éter
alifático (trans)
Núcleo do H ligado a estrutura cíclica próximo ao
átomo de oxigênio do anel
F (1,4) 4,2-4,7
Núcleo do H ligado ao C da dupla, ligado ao éter
alifático (cis)
G - 3,0-4,0
Núcleo do H ligado a molécula de água dissolvida
em DMSO deuterado
H - 2,5 Núcleo do H ligado ao DMSO
deuterado (solvente)
I (1,2) 1,5-2,0
Núcleo do H ligado a estrutura cíclica mais distante
ao átomo de oxigênio do anel
As integrais das áreas dos espectros foram obtidas para os oligômeros de
acroleína No entanto, apenas para se ter uma estimativa da microestrutura. Este
método apresenta erros, uma vez que os assinalamentos das regiões cinzas não
foram identificados e as regiões de sobreposição também dificultaram o processo. A
Tabela 9 apresenta os resultados para as amostras sintetizadas com o iniciador sec-
BuLi.
57
Tabela 9: Resultados obtidos para as amostras sintetizadas com o iniciador sec-BuLi
Amostra Razão [M]/[I] % de unidades
(1,2)
% de unidades
(1,4)
% de unidades
(3,4)
PA21 20 21,2 38,2 40,6
PA22 30 21,1 40,0 39,9
PA23 40 21,5 35,6 42,9
PA24 60 18,9 35,9 45,3
PA25 80 21,2 36,0 42,7
5.1.4. Análise térmica e estudo da microestrutura para as amostras
sintetizadas com o iniciador sec-BuLi
A Figura 24 mostra as curvas da primeira derivada, correspondentes às
degradações térmicas das amostras de poliacroleínas obtidas com o iniciador sec-
BuLi. Verificam-se 3 degradações predominantes que ocorrem em torno de 170 ºC,
370 ºC e 430 ºC. As amostras PA27, PA28 e PA29, obtidas em razões [M]/[I]
menores, também apresentaram degradação térmica em torno de 400 ºC. A
degradação térmica em torno de 370 ºC possui o perfil bastante alargado, diferente
das demais a 170 ºC e 430 ºC, cujo perfil da curva é bem definido e bastante
acentuado.
A Figura 25 mostra a curva de degradação térmica e sua respectiva derivada
para a amostra PA23 (razão [M]/[I] = 40). Observam-se 3 degradações principais
para esta amostra, com os picos máximos de temperaturas em 170 ºC, 377 ºC e 429
ºC.
Frações da amostra PA23 foram aquecidas a 100 ºC, 260 ºC, 400 ºC, 500 ºC
e 670 ºC, respectivamente. O produto residual destas frações foi analisado por FTIR.
A Figura 26 apresenta o gráfico de FTIR para as frações degradadas da amostra
PA23. O espectro da amostra PA23 aquecida a 100ºC não sofreu alteração quando
comparado ao da amostra não aquecida. O aquecimento da amostra PA23 a 100 ºC
não conduziu à degradação da microestrutura do oligômero. O aquecimento da
amostra a 260 ºC levou principalmente à degradação de duplas ligações,
evidenciada pela mudança espectral na faixa de 1400-1600 cm
-1
, assim como a
58
absorção em 3080 cm
-1
que também sofreu alteração. O aquecimento da amostra a
400ºC induziu principalmente à degradação da ligação éter, cuja mudança espectral
está na faixa de 900-1100 cm
-1
. O perfil da degradação da ligação éter é bastante
alargado e isto pode ser atribuído às diferentes vizinhanças possíveis da ligação éter
na microestrutura dos oligômeros obtidos. O aquecimento da amostra a 500ºC
conduziu principalmente à degradação da carbonila aldeídica, que pode ser
observado pelo desaparecimento da absorção a 1700 cm
-1
e através da alteração na
região do doublet em 2800 cm
-1
. A degradação da carbonila ocorre com a formação
de novas estruturas, observadas pelo aparecimento de absorções em torno de 1500
cm
-1
e 500 cm
-1
. A análise de FTIR para a amostra PA23 aquecida a 670 ºC
apresentou um espectro com pouca correlação com o inicial, mostrando que o
processo de degradação levou à formação de novas estruturas com absorções até
então não observadas no espectro.
Figura 24: Curvas de degradação térmica para os oligômeros de acroleína obtidos em
diferentes razões [M]/[I] com o iniciador sec-BuLi
59
Figura 25: Curva de degradação térmica e curva derivativa para a amostra PA23
4000 3000 2000 1000
0
670ºC
500ºC
400ºC
260ºC
100ºC
s/ aqu
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 26: Espectro de FTIR para as frações degradadas da amostra PA23
60
Como já citado anteriormente, as amostras PA27, PA28 e PA29, obtidas
para razões [M]/[I] menores, também apresentaram degradação térmica em torno de
400 ºC. Com a finalidade de investigar a que microestrutura está relacionada esta
degradação em torno de 400 ºC, a amostra PA27 foi submetida ao mesmo
procedimento da amostra PA23. Frações da amostra PA27 foram aquecidas a 293
ºC, 370 ºC, 425 ºC, 521 ºC e 630 ºC respectivamente e os produtos residuais das
frações foi analisado por FTIR. As Figuras 27 e 28 apresentam as curvas de
degradação térmica e derivada para a amostra PA27 e as curvas de FTIR para as
frações degradadas da amostra PA27.
Figura 27: Curva de degradação térmica e curva derivada para a amostra PA27
Os eventos a 293 ºC e 370 ºC podem ser atribuídas às degradações de
duplas ligações e ligações éter de forma análoga à amostra PA23 mencionada
anteriormente. O evento a 425 ºC está relacionada à degradação da carbonila,
conforme observado pela alteração na faixa espectral em torno de 1700 cm
-1
. O
evento a 521 ºC está relacionado à degradação das estruturas cíclicas, como pode
ser observado pelo desaparecimento da absorção em torno de 1500 cm
-1
.
61
4000 3000 2000 1000
0
630ºC
521ºC
425ºC
370ºC
293ºC
não deg.
Degradação térmica da amostra PA27
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 28: Espectro de FTIR para as frações degradadas da amostra PA27
Uma vez conhecida a temperatura de degradação térmica dos grupamentos
principais que constituem a microestrutura dos oligômeros de acroleína obtidos
neste trabalho, considerando-se a linha base conforme apresentado na Figura 29 e
30 estimou-se o teor dos grupamentos constituintes da microestrutura para os
oligômeros obtidos em diferentes razão [M]/[I] e os resultados estão apresentados
na Tabela 10.
62
Figura 29: Integração da curva da primeira derivada da perda de massa da amostra PA23,
considerando-se a linha-base
Figura 30: Integração da curva da primeira derivada da perda de massa da amostra PA27,
considerando-se a linha de base
63
Tabela 10: Cálculo para a estimativa do teor dos grupamentos funcionais presentes nos
oligômeros de acroleína obtidos
Amostra Razão [M]/[I] M
w
Teor de C=C
(≈170º C) (%)
Teor de C-O-C
(≈370º C) (%)
Teor de C=O
(≈400º C) (%)
Teor de cíclicos
(≈440º C) (%)
PA28 6 1481 38,50 9,34 16,24 35,92
PA29 8 - 36,83 9,44 8,10 45,65
PA27 10 - 40,51 12,59 20,49 26,41
PA21 20 1057 40,53 22,24 37,23 -
PA22 30 743 47,92 25,54 26,55 -
PA23 40 670 51,59 23,18 25,23 -
PA24 60 605 61,13 20,83 18,04 -
PA26 100 361 64,95 20,16 14,89 -
Observa-se que o principal encadeamento é através da ligação C=O (3,4),
resultando em grupos vinila pendentes, como seria esperado para a polimerização
aniônica de acroleína. Da mesma forma, o teor de grupos aldeído pendentes,
resultante da reação (1,2), diminuiu com o aumento da [M]/[I]. Portanto,
aparentemente, quanto maior a razão [M]/[I] (velocidade de polimerização), maior a
probabilidade de a reação ocorrer através da ligação (3,4), em detrimento da (1,2),
levando ao aumento do teor de grupos C=C pendentes. O teor de unidades C-O-C
(encadeamento 1,4) não variou acentuadamente entre [M]/[I] 20 a 100,
permanecendo em torno de 20%, exceto para a faixa de baixas razões [M]/[I] 6, 8 e
10.
Embora os resultados de FTIR tenham mostrado a presença de estruturas
cíclicas para as 4 amostras (PA21, PA27, PA28 e PA29) obtidas com o uso do
iniciador sec-BuLi, somente para as amostras PA29, PA28 e PA27 foram observadas
degradações associadas às estruturas cíclicas, o que aparentemente indica que
apenas nessas amostras há quantidade suficientemente considerável dessas
estruturas para serem observadas pela análise de degradação térmica. Observa-se
que, quanto menor a razão [M]/[I], maior a inserção monomérica 1,2. No entanto, a
incorporação de grupamentos aldeído vizinhos conduzem a estruturas cíclicas e
torna os grupamentos aldeído indisponíveis para posterior reação do oligômero de
acroleína com a hemoglobina bovina. A reação de polimerização realizada na razão
64
molar [M]/[I]=20 foi a que conduziu a maiores teores de grupamentos CHO
disponíveis.
O perfil de degradação das amostras obtidas com o iniciador terc-BuLi foi
mais constante quando comparado ao sec -BuLi. A Figura 31 apresenta as curvas da
primeira derivada da degradação térmica para as amostras PA14, PA17 e PA18
obtidas por meio deste iniciador. O estudo da microestrutura utilizando as duas
técnicas simultâneas (degradação da amostra no TGA e sua subsequente análise de
FTIR) mostrou-se bastante elucidativo. No entanto, não foi possível avaliar as
amostras obtidas pelo iniciador terc-BuLi porque tais análises geram um número
grande de espectros de FTIR.
Figura 31: Curvas de DTG para as amostra obtidas por terc-BuLi
65
5.1.5. Avaliação da concentração de grupamentos CHO disponíveis no
oligômeros de acroleína
Os grupamentos aldeído foram quantificados conforme a metodologia
descrita no item 4.2.2.2.5. Como já citado anteriomente, a absortividade molar das
hidrazonas não costuma variar muito para os mais diferentes grupamentos aldeído,
de modo que, para simplificação dos cálculos foi utilizado o valor da absortividade
molar 22000 L/mol.cm para todos os homopolímeros de acroleína. Muitos ajustes de
concentração foram necessários para encontrar a massa de oligômeros que fornecia
absorbância menor que a unidade. As amostras foram analisadas em quadruplicatas
e os valores mais próximos entre si estão descritos na Tabela 11. Verifica-se que a
concentração de grupamentos aldeído disponíveis na microestrutura não apresentou
um comportamento linear com o aumento da razão molar [M]/[I].
Tabela 11: Teor de grupamentos aldeído para as amostras de homopolímeros de acroleína
Amostra [M]/[I]
Tipo de
Iniciador
λ
max
Abs
Massa de
oligômero
na solução
de DMSO(mg)
Massa da
solução em
DMSO (g)
Concentração
de aldeído
[CHO]/gPA x10
-2
Valor
médio
[CHO]/g
PA x10
-2
PA28 6 sec-BuLi
335,4 0,3193 6,6 0,0618 3,9
335,1 0,3194 6,6 0,0511 4,8
4,7 ± 0,8
PA29 8 sec-BuLi
336,2 0,0874 5,2 0,0666 1,3
335,4 0,0733 5,1 0,0624 1,1
1,2 ± 0,1
PA27 10 sec-BuLi
335,7 0,3793 6,3 0,0607 4,9
335,7 0,3658 6,6 0,0618 4,5
4,7 ± 0,3
PA21 20 sec-BuLi
335,7 0,4265 6,2 0,0524 6,6
335,7 0,4571 7,1 0,0509 6,4
5,8 ± 1,3
PA22 30 sec-BuLi
335,9 0,3306 6,1 0,0638 4,3
335,7 0,3524 7,4 0,0624 3,8
3,6 ± 0,8
PA23 40 sec-BuLi
- 0,32451 6,5 0,0656 3,8
- 0,2728 6,2 0,0524 4,2
4,0 ± 0,3
PA24 60 sec-BuLi
337,6 0,2429 6,4 0,0559 3,4
336,8 0,2653 6,.1 0,0600 3,6
3,5 ± 0,1
PA26 100 sec-BuLi
336,8 0,2096 5,4 0,0566 3,4
335,1 0,3974 5,9 0,1223 2,8
3,1 ± 0,4
PA31 6 terc-BuLi
335,1 0,2887 5,1 0,0656 4,3
337,1 0,2221 5,1 0,0508 4,3
4,6 ± 0,5
66
Amostra [M]/[I]
Tipo de
Iniciador
λ
max
Abs
Massa de
oligômero
na solução
de DMSO(mg)
Massa da
solução em
DMSO (g)
Concentração
de aldeído
[CHO]/gPA x10
-2
Valor
médio
[CHO]/g
PA x10
-2
PA32 8 terc-BuLi
336.5 0,2941 5,6 0,0709 3,8
336.0 0,2437 6,5 0,0721 2,6
3,2 ± 0,8
PA33 10 terc-BuLi
335,4 0,2720 6,4 0,0516 4,2
335,4 0,2638 6,2 0,0530 4,0
4,1 ± 0,1
PA34 20 terc-BuLi
335,7 0,2392 5,4 0,0539 4,1
335,7 0,2775 5,7 0,0757 3,2
3,7 ± 0,5
PA35 30 terc-BuLi
335,4 0,1031 5,5 0,0537 1,7
336,5 0,1139 5,7 0,0555 1,8
1,7 ± 0,1
PA36 40 terc-BuLi
336,2 0,3596 6,0 0,0657 4,5
335,7 0,3220 5,6 0,0600 4,9
4,7 ± 0,3
PA39 100 terc-BuLi
335,6 0,2310 6,0 0,0581 3,3
334,8 0,2396 5,5 0,0534 4,1
3,7 ± 0,6
As amostras 37 e 38 não foram solúveis em DMSO, não sendo possível a análise
Os oligômeros obtidos por sec-BuLi apresentaram, em média, maior
concentração de CHO que os oligômeros obtidos por terc-BuLi. Também observou-
se maior diferenciação nos valores da concentração de aldeído, variando de 1,2 a
6,6 moles de CHO/g de polímero. Cabe ressaltar que os grupos aldeído vicinais
tendem a ciclizar. Já os oligômeros obtidos por terc-BuLi apresentaram valores de
concentração de aldeído mais próximos entre si. As Figuras 32 e 33 apresentam os
gráficos de concentração de aldeído em função da razão molar [M]/[I].
0
1
2
3
4
5
6
7
PA26
PA24
PA23
PA22
PA21
PA27
PA29
PA28
100
60
40
30
10
20
8
6
Moles de CHO/g de polímero
Razão molar [M]/[I]
Figura 32: Concentração de grupos aldeído em função da razão [M]/[I] para os oligômeros
obtidos por sec-BuLi
67
0
1
2
3
4
5
6
7
40
100
30
20
10
86
PA37
PA36
PA35
PA34
PA33
PA32
PA31
Moles de CHO/g de polímero
Razão molar [M]/[I]
Figura 33: Concentração de grupos aldeído em função da razão [M]/[I] para os oligômeros
obtidos por terc-BuLi
Os resultados da concentração de aldeído foram concordantes com o estudo
avaliado por análise térmica para as amostras obtidas pelo iniciador sec-BuLi. A
amostra PA21 que obteve o maior teor de aldeído para a análise por TGA foi
também a que obteve maior concentração em moles de CHO/g de oligômero para o
método da DNFH. As Figuras 34 e 35 apresentam o gráfico de teor de grupamentos
CHO versus [M]/[I] para os dois métodos empregados. Verifica-se coerência na
tendência das curva entre os métodos empregados para a avaliação da
concentração de grupamentos CHO na microestrutura dos oligômeros de acroleína
obtidos.
0 20 40 60 80 100
3
4
5
6
7
Moles de CHO/g de polímero (x10
-2
)
[M]/[I]
Figura 34: Concentração de [CHO] versus [M]/[I] pelo método da DNFH (sec-BuLi)
68
0 20 40 60 80 100
15
20
25
30
35
40
Teor de C=O a 400 ºC (%)
[M]/[I]
Figura 35: Concentração de [CHO] versus [M]/[I] pelo método TGA (sec-BuLi)
Quando se observa a concentração de grupamentos aldeído em função da
massa molar do polímero, verifica-se que as amostras com maiores pesos
moleculares não necessariamente originaram amostras com maiores teores de
grupamentos aldeído disponíveis. As amostras obtidas nas polimerizações com
menores velocidades de reação foram as que mais favoreceram a inserção
monomérica 1,2. A Figura 36 apresenta o gráfico de M
w
versus a concentração de
grupos aldeído na microestrutura para os oligômeros obtidos por sec-BuLi. Verifica-
se que a massa molar de 1057 g/mol foi a que originou maior concentração de
grupamentos aldeído disponíveis para posterior modificação com a HbBv. Para as
amostras obtidas para o iniciador terc-BuLi (Figura 37), a massa molar foi de 888
g/mol. Tais gráficos foram traçados para avaliar qual fator terá maior efeito no
processo de modificação da proteína; se a extensão da macromolécula em si ou se
a concentração de grupamentos aldeído na macromolécula ou se os dois fatores
juntamente.
69
0 1000 2000 3000 4000 5000
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Moles de CHO/g de polímero
M
w
Figura 36: Gráfico de M
w
versus a concentração de CHO para os oligômeros obtidos com
sec-BuLi
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
2
3
4
5
6
7
Moles de CHO/g de polímero
M
w
Figura 37: Gráfico de M
w
versus a concentração de CHO para os oligômeros obtidos com
terc-BuLi
70
5.1.6. Análise da solubilidade dos oligômeros de acroleína em diversos
solventes
As solubilidades dos materiais obtidos neste trabalho foram avaliadas
qualitativamente e estão apresentadas na Tabela 12.
Tabela 12: Solubilidade relativa entre os oligômeros de acroleína em vários solventes
Amostra Iniciador [M]/[I] Mw H
2
O ETOH DMSO DMF DMF/LiCl
0,01M
PA14
PA16
PA17
PA18
Terc-BuLi
20 983 5 7 10 10 10
40 650 7 7 10 10 9
50 473 7 7 10 10 5
80 408 7 10 10 10 10
PA28
PA27
PA21
PA23
PA24
PA26
Sec-BuLi
6 1481 9 9 10 7 9
10 nd 9 9 10 10 10
20 1057 7 5 1 1 5
40 670 7 5 1 5 5
60 605 7 5 1 1 5
100 361 7 9 10 10 10
massa do oligômero = 10 mg em 1 mL do solvente; valores atribuídos de 0 a 10, onde 10 é totalmente solúvel;
M
w
foi obtido em solução de DMF/LiCl
Observa-se que as amostras obtidas com terc-BuLi foram mais solúveis em
solventes polares apróticos como DMSO e DMF que as sintetizadas com sec-BuLi,
indicando diferenças significativas na microestrutura dos oligômeros de acroleína
quando obtidos a partir de diferentes sistemas iniciadores. Este fato pode estar
relacionado com a diminuição de grupamentos polares de aldeído e aumento de
grupos apolares C=C na estrutura do oligômero, o que está de acordo com os teores
estimados para a microestrutura dos produtos sintetizados com sec-BuLi (Tabela
10).
A introdução de sal LiCl provocou aumento da solubilidade dos oligômeros
menos polares, sintetizados por sec-BuLi em DMF. Os oligômeros interagem com o
cloreto de lítio, o que minimiza as interações polares intra e intermoleculares,
favorecendo a solvatação. Efeito inverso foi observado para as amostras obtidas
com terc-BuLi, isto é, a introdução do sal diminuiu a solubilidade dos oligômeros.
Neste caso, para moléculas mais polares, a interação com o solvente já promove a
71
solubilidade do material e a adição de LiCl compete com a interação oligômero-
solvente.
A solubilidade em água é aproximadamente tão alta quanto em etanol para
todas as amostras, inclusive aquelas que possuem baixa solubilidade em DMSO e
DMF. Interações do tipo ligações hidrogênio entre grupos aldeído e solventes
próticos podem estar presentes.
5.1.7. Estudo de conversão versus tempo
Foram estudados o comportamento cinético da polimerização quanto à
conversão, microestrutura, e degradação térmica para amostras obtidas com razões
[M]/[I] iguais a 6, 40, 500 e 1000, tanto para o iniciador sec-BuLi quanto para o terc-
BuLi. Foram retiradas alíquotas de 10 mL a tempos periódicos durante a
polimerizações dessas amostras. As Figuras 38 e 39 apresentam os estudos de
conversão em função do tempo a diferentes razões molares [M]/[I] para as amostras
obtidas com sec-BuLi e terc-BuLi, respectivamente.
Figura 38: Estudos de conversão em função do tempo para razões molares [M]/[I] igual a 6,
40, 500 e 1000 para as amostras obtidas com o iniciador sec-BuLi
72
Figura 39: Estudos de conversão em função do tempo para razões molares [M]/[I] igual a 6,
40, 500 e 1000 para as amostras obtidas com o iniciador terc-BuLi
Observa-se que para razões [M]/[I] menores, ou seja, para sistemas com
maiores quantidades de iniciador, a conversão de monômero a polímero foi maior.
Os sistemas iniciados por meio de sec-BuLi apresentaram maiores valores de
conversão, exceto para a razão [M]/[I] =1000. A amostra PA28 ([M]/[I] = 6) iniciada
por sec-BuLi atingiu 65,8% de conversão, enquanto que a amostra PA31 ([M]/[I] = 6)
atingiu 51,2%. Para [M]/[I] = 40 os valores foram 33,8% para a amostra iniciada por
sec-BuLi e 27,4% para a iniciada por terc-BuLi. Para a [M]/[I] = 500, a conversão foi
praticamente a mesma obtendo-se 10,5% para a amostra iniciada por sec-BuLi e
10,3% para a iniciada por terc-BuLi. Para a razão [M]/[I] = 1000 a conversão para a
amostra iniciada por terc-BuLi atingiu 10,9%, ou seja praticamente se manteve e a
amostra iniciada por sec-BuLi apresentou valores de conversão iguais a 3,9%, ou
seja, cerca de 3 vezes menor quando comparados à iniciada pelo terc-BuLi. Verifica-
se que o aumento da concentração de monômero no meio reacional desfavorece a
formação de polímeros para o sistema em questão. Isto significa que o monômero é
um agente de terminação da reação.
73
Na Figura 40 observa-se o efeito da variação da razão [M]/[I] no rendimento
para as amostras iniciadas por terc-BuLi. O gráfico foi obtido para as razões [M]/[I]
igual a 6, 8, 10, 20, 30, 40, 60, 80 e 100. Verifica-se que o aumento da razão [M]/[I]
promove a diminuição do rendimento da reação, e que o fenômeno de terminação
com o monômero tem influência significativa para o sistema em questão.
0 20 40 60 80 100
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rendimento (g)
[M]/[I]
Figura 40: Conversão versus [M]/[I] para as amostras obtidas pelo iniciador terc-BuLi
5.1.7.1. Estudo da degradação térmica e microestrutura para as frações obtidas a
diferentes tempos de polimerização
Alíquotas das amostras PA28 e PA31 sintetizadas na razão [M]/[I]=6 e
obtidas pelo iniciador sec-BuLi e terc-BuLi, respectivamente, foram avaliadas quanto
ao perfil de degradação térmica. Para tal, foram retiradas alíquotas de 10 mL a 10
min, 15 min, 20 min, 40 min, 50 min, 60 min e 75 min. A Figura 41 apresenta as
curvas de DTG para as diversas alíquotas da amostra PA28. Observa-se que a partir
de 20 minutos de reação o comportamento de degradação das amostras se manteve
constante. Acredita-se que a partir desse ponto a microestrutura mantenha-se mais
uniforme. Já para a amostra obtida por terc-BuLi (PA31) o comportamento de
degradação térmica apresenta-se mais uniforme desde a avaliação da primeira
alíquota retirada a 10 min do início da reação de polimerização. A Figura 42
apresenta as curvas de DTG para as alíquotas retiradas a 10 min, 15 min, 20 min,
40 min, 50 min e 60 min da amostra PA31 na razão [M]/[I] igual a 6 e com o iniciador
sec-BuLi.
74
Figura 41: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de
polimerização da acroleína PA28 obtidos na razão [M]/[I] = 6 com o iniciador sec-BuLi
Figura 42: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína PA31 obtidos na razão [M]/[I] = 6 com o iniciador terc-BuLi
75
A Figura 43 apresenta o espectro de FTIR para a amostra obtida na razão
molar [M]/[I] = 6 com o iniciador terc-BuLi para a alíquota retirada a 10 min e 50 min
do início da reação. A semelhança entre os espectros de FTIR mostra que a
microestrutura é relativamente constante desde os 10 min iniciais da reação.
4000 3000 2000 1000
0
10min
50min
Transmitância (%)
Número de onda (cm
-1
)
Figura 43: Espectro de FTIR das frações retiradas a 10 min e 50 min do oligômero de
acroleína PA31 obtidos na razão [M]/[I] = 6 com o iniciador terc-BuLi
A Figura 44 apresenta as curvas da 1ª derivada da degradação térmica para
as alíquotas obtidas a 10 min, 20 min e 30 min de reação para [M]/[I] = 40 iniciada
por sec-BuLi. A principal diferença entre as curvas está no aumento de intensidade
da degradação a 600 ºC com o aumento do tempo reacional. No entanto, esta
degradação não está associada a nenhum dos encadeamentos principais – (1,2),
(3,4) e (1,4), de maneira que, o perfil de degradação é relativamente constante.
76
Figura 44: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína PA23 obtidos na razão [M]/[I] = 40 com o iniciador sec-BuLi
A Figura 45 apresenta as curvas de DTG para as alíquotas retiradas a 10
min, 25 min, 35 min, 50 min, 60 min, 75 min e 85 min para a amostra obtida na razão
[M]/[I] = 40 com o iniciador terc-BuLi. A partir de 35 min de reação, o perfil da
degradação térmica permanece constante. As principais alterações quanto à
degradação térmica ocorre após 10 min e 25 min de tempo reacional. Observa-se
que a degradação em torno de 350 ºC (10min) desaparece com o subseqüente
alargamento da degradação a 426 ºC (25min) e o surgimento da degradação a 220
ºC (35 min).
77
Figura 45: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína PA36 obtidos na razão [M]/[I] = 40 com o iniciador terc-BuLi
A Figura 46 apresenta as curvas de DTG para alíquotas retiradas a 10 min,
15 min e 20 min da amostra obtida na razão molar [M]/[I] igual a 500 com o iniciador
sec-BuLi. Observa-se que as temperaturas de degradação térmica são praticamente
as mesmas. No entanto, as curvas tornam-se mais bem definidas com aumento do
tempo reacional. Isto pode ser atribuído em parte a massa molar que tende a
aumentar e concentrar mais unidades monoméricas na estrutura com o aumento do
tempo reacional. Para a amostra obtida pelo iniciador terc-BuLi (Figura 47) verifica-
se maior uniformidade no perfil de degradação térmica, tanto nas temperaturas de
degradação, quanto nas intensidades de degradação após os 25 min de reação.
Apenas para a alíquota retirada a 10 min foi observada uma degradação a 680 ºC,
mas as degradações em altas temperaturas não tiveram associação com os
principais encadeamentos quando as amostras foram obtidas por sec-BuLi. Pode ser
que seja assim também para o caso das reações iniciadas por terc-BuLi..
78
Figura 46: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 500 com o iniciador sec-BuLi
Figura 47: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 500 com o iniciador terc-BuLi
79
A Figura 48 apresenta o espectro de FTIR para a amostra obtida na razão
molar [M]/[I] = 500 com o iniciador tert-BuLi para a alíquota retirada a 10 min e 35
min e 85 min do início da reação. Observa-se que não ocorreu alterações
significativas na microestrutura. O espectro obtido a 35 min apresenta a curva de
FTIR menos definida que as demais mas isto pode ser atribuído a diferença da
concentração da amostra na pastilha de KBr.
4000 3000 2000 1000
0
85min
35min
10min
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 48: Espectro de FTIR das frações retiradas a 10min, 35min e 85min do oligômero de
acroleína PA500 obtidos na razão [M]/[I] = 500 com o iniciador terc-BuLi
As Figuras 49 e 50 apresentam as curvas de degradação térmica para as
frações retiradas a 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 50 min e 60 min da amostra
obtida com o iniciador sec-BuLi e para as frações retiradas a 10 min, 25 min, 35 min,
50 min, 60 min e 75 min da amostra obtida com o iniciador terc-BuLi, em ambos para
a razão molar [M]/[I] igual a 1000. Verifica-se, nos dois casos, que o comportamento
da degradação térmica é bastante regular e que a composição da microestrutura
mantém-se relativamente constante desde os minutos iniciais da reação.
80
Figura 49: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 1000 com o iniciador sec-BuLi
Figura 50: Curvas de degradação térmica para as frações a diferentes tempos de reação do
oligômero de acroleína obtidos na razão [M]/[I] = 1000 com o iniciador terc-BuLi
81
Os espectros de FTIR correspondentes às curvas de degradação térmica
das alíquotas retiradas após 10 min e 75 min do oligômero de acroleína obtidos na
razão [M]/[I] = 1000 com o iniciador terc-BuLi podem ser visualizados na Figura 51.
Os espectros são bastante semelhantes indicando que a microestrutura se mantém
constante durante a reação.
4000 3000 2000 1000
0
10min
75min
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 51: Espectro de FTIR das frações retiradas a 10min e 50min do oligômero de
acroleína PA1000 obtidos na razão [M]/[I] = 1000 com o iniciador terc-BuLi
Para todos os casos apresentados anteriormente, os primeiros 10 minutos
de reação foram os mais significativos em termos de alteração no perfil da
degradação térmica. Essas alterações podem ser associadas a variação da
microestrutura da poliacroleína em função do tempo reacional.
82
5.2. COPOLÍMEROS DE ACROLEÍNA E ESTIRENO
Foi estudada a influência do tipo de iniciador aniônico (terc-BuLi ou sec-
BuLi) na massa molar e polidispersão dos produtos da copolimerização aniônica de
acroleína e estireno em THF a -90ºC, tendo-se variado a concentração de acroleína
no meio reacional mantendo-se a razão molar monômeros/iniciador igual a 10. Os
oligômeros obtidos foram caracterizados inicialmente através da análise de
cromatografia de permeação em gel.
5.2.1. Análise de Cromatografia de Permeação em Gel
As condições experimentais para obtenção dos oligômeros de acroleína,
bem como os resultados de GPC estão descritos na Tabela 13.
Tabela 13: Condições experimentais e resultados de GPC para a síntese de copolímeros de
acroleína e estireno
Amostra Razão
[acro]/[sty]
Acroleína
(mmol)
Estireno
(mmol)
Sistema iniciador Massa molar
Tipo (mmol) M
w
M
n
M
w
/M
n
PAS1 1:1 62,5 62,5
PAS2 1,5:1 80,0 53,0
PAS3 2:1 46,0 92,0
PAS4 3:1 110,0 37,0
PAS5 4:1 121,4 30,8
PAS6 5:1 131,4 25,9
PAS7 7:1 140,5 20,4
PAS8 9:1 147,5 16,9
PAS9 49:1 172,0 3,6
sec-BuLi
12,5 1229 525 2,3
13,3 3511 818 4,3
13,8 1934 622 3,1
14,7 3353 775 4,3
15,2 9890 844 11,7
15,7 729 113 6,4
16,1 3814 737 5,2
16,4 9048 843 10,7
17,6 7324 857 8,5
PAS10 1:1 62,5 62,5
PAS11 1,5:1 80,0 53,0
PAS12 2:1 46,0 92,0
PAS13 3:1 110,0 37,0
PAS14 4:1 121,4 30,8
PAS15 5:1 131,4 25,9
PAS16 7:1 140,5 20,4
terc-BuLi
12,5 1039 404 2,5
13,3 - - -
13,8 - - -
14,7 - - -
15,2 - - -
15,7 - - -
16,1 - - -
A síntese dos copolímeros foi dimensionada para a obtenção de 10g de produto final
83
Verificou-se que os valores de M
W
, bem como a polidispersão dos
oligômeros de acroleína e estireno obtidos pelo iniciador sec-BuLi tenderam
aumentar em função do aumento da razão molar acroleína/estireno. O aumento do
teor de acroleína no meio reacional não conduziu ao aumento das reações de
transferência de cadeia para o monômero, tão evidenciadas na homopolimerização
da acroleína. Na verdade, cadeias de maiores massas molares foram obtidas. É
possível que a presença do estireno no meio reacional tenha alterado a polaridade
do meio, e isto tenha afetado o curso da polimerização aniônica que é bastante
dependente da polaridade do meio. A massa molar do polímero obtido atingiu
valores próximos a 7000 g/mol, enquanto o homopolímero de acroleína para o
mesmo sistema iniciador e nas mesmas condições de síntese forneceu M
w
próximo
a 5000 g/mol. A Figura 52 apresenta o gráfico da variação de massa molar com o
aumento da concentração de acroleína no meio reacional.
0 10 20 30 40 50
0
2000
4000
6000
8000
10000
M
w
(g/mol)
[acro]/[sty]
Figura 52: M
w
versus a concentração de acroleína no meio reacional
As distribuições de massas molares obtidas para os oligômeros foram mais
largas quando comparadas àquelas dos homopolímeros e também não mostraram
uma linearidade com o aumento da concentração de acroleína no meio reacional.
Observa-se uma tendência ao aumento da polidispersão com o aumento de
84
concentração de acroleína no meio reacional. A Figura 53 apresenta o gráfico da
polidispersão versus a concentração de acroleína no meio reacional.
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
M
w
/M
n
[acro]/[sty]
Figura 53: Polidispersão versus a concentração de acroleína
5.2.2. Análise de Espectrometria de absorção no Infravermelho
As análises de FTIR dos oligômeros de acroleína-co-estireno revelaram a
presença de estireno e acroleína na composição da microestrutrura para alguns dos
produtos de síntese. No entanto, os espectros de FTIR dos copolímeros
apresentaram maior semelhança com os espectros do homopolímero de acroleína
do que com os espectros de FTIR do homopolímero de estireno mesmo para a
reação conduzida na razão molar 1:1 de cada comonômero. A Figura 54 apresenta
os espectros de FTIR para o copolímero de acroleína e estireno na razão de
monômeros no meio reacional igual a 1:1 e para os homopolímeros de estireno e
acroleína. Todos os produtos de reação foram obtidos para a razão [M]/[I] igual a 10
e com o iniciador sec-BuLi.
Observam-se as 3 inserções monoméricas da acroleína presentes no
copolímero. A inserção (1,2) foi confirmada pela presença das absorções referentes
85
à carbonila de aldeído – um doublet na faixa de 2800 cm
-1
, o estiramento da
carbonila na faixa de 1730 cm
-1
e a deformação de CH em torno de 1400 cm
-1
. A
inserção (3,4) foi confirmada pela absorção a 3080 cm
-1
referente ao estiramento de
grupos vinílicos terminais. A inserção (1,4) é confirmada pela presença das
absorções a 1650 cm
-1
e 1680 cm
-1
.
Algumas bandas são comuns tanto para o poliestireno quanto para a
poliacroleína, de maneira que a correlação de bandas para o copolímero torna-se
difícil de ser avaliada. No entanto, as absorções em torno de 700 cm
-1
e 800 cm
-1
,
que aparecem no espectro do copolímero, podem ser atribuídas à inserção de
estireno ao copolímero e são relativas a absorção dos átomos de hidrogênios do
anel aromático.
4000 3000 2000 1000
0
801
700
PA
PAS
PS
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 54: Espectros de FTIR para o poliestireno (PS), copolímero de acroleína e estireno
(PAS) e homopolímero de acroleína
As reações realizadas para a obtenção dos copolímeros de acroleína e
estireno tiveram como principal variável a concentração de acroleína no meio
reacional, mantendo-se a razão molar de monômeros e iniciador constante ([M1+M2]
/[I] =10). A razão molar de acroleína em relação a do estireno variou de 1, 1,5, 2, 3,
86
4, 5, 7, 9 e 49 e estão relacionados às amostras PAS1, PAS2, PAS3, PAS4, PAS5,
PAS6, PAS7, PAS8 e PAS9 respectivamente. Não foi possível observar a diferença
na microestrutura dos polímeros quando a preparação da amostra para a obtenção
do espectro foi por meio de pastilha de KBr. A Figura 55 apresenta os espectros de
FTIR para as amostras preparadas com KBr.
4000 3000 2000 1000
0
PAS8
PAS7
PAS6
PAS5
PAS4
PAS3
PAS2
PAS1
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 55: Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros iniciados por sec-BuLi para as
amostras preparadas em pastilha de KBr
No entanto, quando os espectros foram obtidos para a técnica de filme
vazado sobre a célula de KBr, para solução do polímero em THF destilado, foram
observadas as absorções referentes à presença de estireno na microestrutura. A
Figura 56 apresenta os espectros de FTIR para os copolímeros obtidos com sec-
BuLi. Observa-se que a partir da amostra PAS4, cuja razão molar acroleína/estireno
é igual a 3, não são mais observadas as absorções referentes ao estireno na
microestrutura do oligômero. No entanto, os espectros de ressonância magnética
nuclear de hidrogênio mostram a presença de núcleos de H aromáticos para
87
reações de copolimerização, obtidas na razões molares acroleína/estireno acima de
3. Tais resultados serão discutidos posteriormente.
4000 3000 2000 1000
0
1532
1523
1531
1537
1539
1570
702
706
PAS8
PAS6
PAS4
PAS3
PAS2
PAS1
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 56: Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros obtidos com o iniciador sec-BuLi
para as amostras preparadas em filme vazado sobre a célula de KBr
Da mesma maneira que os espectros dos homopolímeros de acroleína
apresentaram absorções em torno de 3400 cm
-1
, os espectros das amostras de
copolímero também. Tais absorções podem ser atribuídas a ligações de hidrogênio
entre o polímero e a água dessorvida, uma vez que o polímero é bastante polar e a
terminais de cadeia hidroxilados.
Os espectros de FTIR obtidos pela técnica de filme vazado mostrou-se mais
elucidativo quando comparado aos espectros obtidos por pastilha de KBr. No
entanto, os produtos de síntese são polares e absorvem água suficiente para
danificar a célula de KBr, de maneira que não foi possível prosseguir utilizando esta
técnica, e os polímeros obtidos pelo iniciador terc-BuLi não foram avaliados dessa
maneira. A Figura 57 apresenta os espectros de FTIR obtidos para os copolímeros
88
sintetizados por terc-BuLi para as amostras preparadas em pastilha de KBr. As
absorções referentes à inserção de estireno não puderam ser visualizadas para
nenhuma das amostras.
4000 3000 2000 1000
0
PAS16
PAS15
PAS14
PAS13
PAS12
PAS11
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 57: Espectros de FTIR obtidos para os copolímeros sintetizados por terc-BuLi para as
amostras preparadas em pastilha de KBr
5.2.3. Análise Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio (
1
H NMR)
Os copolímeros de acroleína e estireno obtidos pelo iniciador sec-BuLi foram
caracterizados por
1
H NMR. Os espectros dos copolímeros tiveram grandes
semelhanças aos espectros obtidos para os homopolímeros. A maior diferença entre
os espectros dos homopolímeros e copolímeros foi no perfil dos picos na faixa
espectral de 0-2 ppm e no pico em torno de 7 ppm. O pico em torno de 7 ppm é
justamente referente à absorção dos átomos de hidrogênio do anel aromático. De
acordo com a literatura [77] essa absorção pode ser observada em deslocamentos
químicos próximos a 7,2 ppm.
89
A inserção do monômero estireno na microestrutura dos polímeros foi
verificada para a razão molar de acroleína/estireno igual a 1, 1,5, 2, 3, 4 e 5. De uma
maneira geral, os espectros dos copolímeros para as razões molares citadas acima
apresentaram bastante semelhança entre si, sendo que apenas para o caso da
amostra obtida na razão [acro]/[sty]=5 foram observadas pequenas alterações na
faixa de 0-2 ppm. Todas estas amostras apresentaram o pico referente ao átomo de
H pertencente à carbonila aldeídica, com deslocamentos que variaram entre 9,52 a
9,62 ppm. Também foram observados nos espectros as absorções referentes às
estruturas cíclicas na faixa de 0-2 ppm. Isto mostra que a inserção do comonômero
estireno no meio reacional não necessariamente impediu a formação de estruturas
cíclicas. Outras relaxações visualizadas nos espectros dos homopolímeros também
se repetiram para o caso dos copolímeros. As Figuras de 58 a 63 apresentam os
espectros de H
1
NMR para os copolímeros obtidos nas reações realizadas em
presença do iniciador sec-BuLi.
Figura 58: Espectro de NMR da amostra PAS2
90
Figura 59: Espectro de NMR da amostra PAS3
Figura 60: Espectro de NMR da amostra PAS4
91
Figura 61: Espectro de NMR da amostra PAS5
Figura 62: Espectro de NMR da amostra PAS6
92
Figura 63: Espectro de NMR da amostra PAS7
Por outro lado, o espectro de
1
H NMR para a amostra obtida em razão molar
[acro]/[sty] igual a 7 apresentou o perfil bastante diferenciado. Não foi observado o
pico referente ao átomo de H da carbonila aldeídica e nem as absorções referentes
as estruturas cíclicas na faixa de 0-2 ppm. O pico em torno de 7,5 ppm apresentou
um perfil diferenciado dos demais. Não foram visualizadas as multiplicidades
referentes aos núcleos do anel aromático e surgiu um pico em 7,8 ppm até então
não observado. O perfil do espectro na faixa de 5-7 ppm sofreu alterações
significativas além do surgimento de picos em 2,4 e 2,8 ppm. Tais resultados
mostram que a microestrutura é diferenciada das demais amostras. No entanto, o
perfil de degradação foi semelhante ao do homopolímero de acroleína, resultados
que serão apresentados posteriormente.
Não se pode precisar o teor de estireno incorporado na microestrutura dos
copolímeros, uma vez que os assinalamentos não foram totalmente elucidados. No
entanto, para obter-se uma estimativa do teor de estireno incorporado à
microestrutura foi calculada a relação da integração das áreas entre a absorção
93
referente ao estireno e as absorções referentes ao polímero, considerando o número
de átomos de H que absorvem na mesma região do espectro. Os valores
encontrados estão descritos na Tabela 14. Verifica-se que o teor de estireno
incorporado foi relativamente baixo, pois os valores são comparáveis entre si para
as amostras obtidas pelo iniciador sec-BuLi.
Tabela 14: Teor relativo de estireno para os copolímeros de acroleína e estireno
Nome Razão [acro]/[sty] % Estireno
PAS2 1,5:1 2,6
PAS3 2:1 3,1
PAS4 3:1 3,1
PAS5 4:1 2,0
PAS6 5:1 2,4
5.2.4. Análise de termogravimetria
As amostras de copolímero de estireno e acroleína foram avaliadas quanto
ao perfil de degradação térmica. A Figura 64 apresenta as curvas da primeira
derivada para os homopolímeros de acroleína e de estireno e para o copolímero de
acroleína-estireno. O perfil de degradação térmica do copolímero se assemelha
bastante ao perfil de degradação do homopolímero de acroleína. Isto pode ser
atribuído à baixa inserção do monômero estireno à microestrutura dos copolímeros,
dados verificados por análise de
1
H
NMR. As principais alterações no perfil de
degradação do copolímero estão na faixa de 200-400 ºC. Surgem 2 degradações
menos intensas em comparação à mesma região do homopolímero. Esta região
corresponde à degradação dos grupos vinílicos da unidade monomérica (3,4) para o
caso do homopolímero de acroleína.
A degradação do poliestireno ocorre em 410 ºC. Para o homopolímero de
acroleína a degradação a 412 ºC é atribuída à degradação da carbonila, enquanto
que o evento a 442,5 ºC pode ser atribuído à presença de estruturas cíclicas. A
degradação da carbonila e a degradação do poliestireno ocorrem em temperaturas
muito próximas e portanto não foi possível obter o teor de estireno incorporado na
microestrutura do copolímero por meio da técnica de análise térmica, como foi feito
94
para o homopolímero de acroleína. Em torno de 390 ºC, tanto a carbonila quanto o
estireno sofrem degradação térmica.
Figura 64: Curvas de DTG para poliestireno (PS), para a poliacroleína (PA) e para o
copolímero de acroleína e estireno
A Figura 65 apresenta a curva de degradação térmica e a primeira derivada
para a amostra de copolímero obtida na razão [acro]/[sty] igual a 1:1. Foi verificada a
presença de 4 degradações principais, que finalizam em torno de 200 ºC, 300 ºC,
350 ºC e 550 ºC respectivamente. Também é observado um ombro em torno de 400
ºC com perfil não muito bem definido. Frações da amostra PAS1 foram aquecidas a
354 ºC e 552 ºC e avaliadas por FTIR. A Figura 66 apresenta os espectros de FTIR
obtidos para a amostra degradada a 354 ºC e 552 ºC e para a amostra não
degradada. Observa-se que para a amostra degradada a 354 ºC, as absorções
referentes ao estireno e à carbonila encontram-se ainda no polímero, e as principais
alterações são nas absorções referentes ao grupo éter. No entanto, quando a
amostra é aquecida a 552 ºC, o espectro de FTIR não mais apresenta as absorções
referentes à carbonila nem ao estireno, mostrando que nesta temperatura ocorre
tanto a degradação do estireno quanto a da carbonila.
95
Figura 65: Curvas de TG e DTG para o copolímero obtido na razão [acro]/[sty] = 1:1
4000 3000 2000 1000
0
s/ aqu
354ºC
552ºC
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 66: Espectros de FTIR para o copolímero obtido na razão [acro]/[sty] = 1:1 degradado
a 354ºC e 552ºC
96
A Figura 67 apresenta os gráficos de degradação térmica para todas as
amostras de copolímero obtida para o iniciador sec-BuLi. As principais alterações
estão nas curvas das amostras PAS5 e PAS6. Para estas amostras a degradação
em torno de 400ºC não apareceu no gráfico, no entanto, estas amostras mostraram
presença de estireno evidenciada pela análise de
1
HNMR e a amostra PAS5
apresentou grupamentos carbonila evidenciado pela dosagem com método 2,4
dinitro-fenil-hidrazina.
Figura 67: Curvas de DTG para os copolímeros de estireno e acroleína obtidos com o
iniciador por sec-BuLi
A partir da amostra PAS7, obtida na razão molar [acro]/[sty] igual a 7, o perfil
de degradação térmica torna-se muito semelhante ao perfil de degradação do
homopolímero. Para a amostra PAS8, obtida em razão molar [acro]/[sty] igual a 9,
não é observada a degradação mal definida em torno de 400ºC como foi para o caso
da amostra PAS1 (1:1). O que se observa é uma degradação intensa, cujo término
se sobrepõe ao início da degradação subsequente (Figura 68). Frações da amostra
PAS8 foram submetidas ao aquecimento em temperatura de 112 ºC, 295 ºC, 367 ºC,
418 ºC, e 524 ºC respectivamente e avaliadas por FTIR (Figura 69).
97
Figura 68: Curvas de TG e DTG para o copolímero obtido na razão [acro]/[sty] = 9:1
4000 3000 2000 1000
0
524ºC
418ºC
367ºC
295ºC
112ºC
s/ aqu
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 69: Espectros de FTIR para o copolímero obtido na razão [acro]/[sty] = 9:1 degradado
a 112 ºC, 295 ºC, 367 ºC, 418 ºC e 524 ºC
98
A Figura 69 apresenta os espectros de FTIR das várias frações degradadas
termicamente para a amostra PAS8. Os espectros de FTIR mostram que a
degradação que finaliza a 295 ºC está associada à degradação da ligação éter
evidenciada pela mudança no espectro de FTIR na faixa de 900-1200 cm
-1
. A
degradação que se inicia a 295 ºC e termina a 367 ºC está associada à degradação
de ligações duplas, conforme é evidenciado pela mudança espectral em torno de
1600cm
-1
Quando a temperatura de degradação é levada até 418 ºC, a mudança no
espectro ocorre em torno de 1700 cm
-1
indicando a perda da carbonila aldeídica.
Para a amostra degradada a 524 ºC observa-se o desaparecimento da absorção a
1580 cm
-1
referente a formação de estruturas cíclicas.
5.2.5. Avaliação da concentração de grupamentos CHO disponíveis nos
copolímeros de acroleína e estireno
Os grupamentos aldeído foram quantificados conforme a metodologia
descrita no item 4.2.2.2.5 e os resultados estão descritos na Tabela 15.
Tabela15: Teor de grupamentos aldeído para as amostras de homopolímeros de acroleína
Amostra [acro]/[sty]
Tipo de
Iniciador
λ
max
Abs
Massa de
oligômero
na solução
de DMSO(mg)
Massa da
solução em
DMSO (g)
[CHO]/gPA
x10
-2
[CHO]/g
PA x 10
-2
PAS1 1:1 sec-BuLi
335,4 1,2516 9,6 0,1281 5,1
335,1 1,4131 9,3 0,1274 5,9
5,5 ± 0,6
PAS2 1,5:1 sec-BuLi
- 0,2530 8,1 0,0613 2,4
- 0,2521 9,7 0,074 1,9
2,0 ± 0,3
PAS3 2:1 sec-BuLi
335,1 0,4067 9,2 0,0529 4,2
- 0,4246 8,7 0,0502 4,9
4,1 ± 0,9
PAS4 3:1 sec-BuLi
334,8 0,5130 8,7 0,0987 3,0
334,8 0,5037 9,0 0,1107 2,5
2,8 ± 0,4
PAS5 4:1 sec-BuLi
335,1 0,3622 8,0 0,0544 4,2
- 0,4492 8,0 0,0734 3,8
3,7 ± 0,5
PAS7 7:1 sec-BuLi
- 0,4950 8,4 0,0915 3,2
- 0,4950 9,5 0,0722 3,6
3,4 ± 0,3
PAS8 9:1 sec-BuLi
337,3 0,1427 9,3 0,0606 1,3
338,2 0,1260 9,3 0,0639 1,2
1,3 ± 0,1
PAS9 49:1 sec-BuLi
338,7 0,1141 9,2 0,0775 0,8
338,7 0,1125 9,2 0,0838 0,7
0,8 ± 0,1
99
Amostra [acro]/[sty]
Tipo de
Iniciador
λ
max
Abs
Massa de
oligômero
na solução
de DMSO(mg)
Massa da
solução em
DMSO (g)
[CHO]/gPA
x10
-2
[CHO]/g
PA x 10
-2
PAS11 1,5:1 terc-BuLi
335,1 0,2167 5,5 0,0613 3,3
334,6 0,2319 5,6 0,0541 3,7
3,5 ± 0,3
PAS12 2:1 terc-BuLi
335,4 0,2738 6,4 0,2112 1,0
335,7 0,2700 6,3 0,2105 1,0
1,0
PAS13 3:1 terc-BuLi
335,4 0,2814 5,3 0,0625 4,3
335,6 0,3118 6,0 0,0562 4,7
4,5 ± 0,3
PAS14 4:1 terc-BuLi
334,6 0,3042 6,0 0,0640 4,0
334,8 0,3498 6,2 0,0708 4,0
4,0
PAS15 5:1 terc-BuLi
335,4 0,3992 6,1 0,0536 6,0
335,4 0,4487 6,1 0,0557 6,5
6,5 ± 0,5
PAS16 7:1 terc-BuLi
335,1 0,4905 5,9 0,0734 5,1
335,4 0,4791 6,4 0,0690 5,9
5,5 ± 0,6
As Figuras 70 e 71 apresentam o gráfico de concentração de aldeído em
função da razão molar [acro]/[sty] para os copolímeros obtidos por sec-BuLi e terc-
BuLi, respectivamente. Observa-se que a presença de grupamentos aldeído
disponíveis tende a diminuir com o aumento da razão [acro]/[sty] para as amostras
obtidas por sec-BuLi. Efeito inverso é observado para as amostras iniciadas por terc-
BuLi, isto é, para estas amostras o aumento da razão molar [acro]/[sty] promoveu
um aumento na concentração de grupamentos CHO disponíveis. Isto comprova que
a inserção monomérica é também dependente da natureza do iniciador para a
reação de copolimerização. Como o iniciador terc-BuLi é mais básico, quando o teor
de acroleína no meio reacional aumenta, aumenta também a polaridade do meio e o
iniciador se torna mais solvatado. Neste caso, o iniciador se torna mais seletivo e o
ataque à ligação C=C da acroleína acontece em maior proporção e fornece maior
teor de grupos aldeido no copolímero. Sendo o iniciador sec-BuLi menos básico, e
portanto menos solvatado e menos seletivo que o terc-BuLi o aumento da
concentração de acroleína favorece o ataque na C=O, e diminui a concentração de
grupos aldeído na microestrutura do copolímero.
100
0
1
2
3
4
5
6
7
PAS9
PAS8
PAS7
PAS5
PAS4
PAS3
PAS2
PAS1
49:1
9:1
7:1
4:1
3:1
2:11,5:1
1:1
moles de CHO/g de polímero
Razão Molar [acro]/[sty]
Figura 70: Concentração de grupos aldeído em função da razão molar [acro]/[sty] para os
copolímeros obtidos por sec-BuLi
0
1
2
3
4
5
6
7
PAS16
PAS15
PAS14
PAS13
PAS12
PAS11
7:1
5:1
4:1
3:12:11,5:1
moles de CHO/g de polímeros
Razão molar [acro]/[sty]
Figura 71: Concentração de grupos aldeído em função da razão molar [acro]/[sty] para os
copolímeros obtidos por terc-BuLi
101
A Figura 72 apresenta o gráfico da concentração de CHO em função da
massa molar dos copolímeros de acroleína e estireno. Verifica-se que o aumento da
massa molar ocorre com uma tendência ao decréscimo do teor de grupamentos
aldeído na microestrutura do copolímero. Isto indica que com o crescimento da
cadeia polimérica, a inserção monomérica (1,2) é desfavorecida. Tal resultado
sugere que, com o crescimento da cadeia, a complexação extremidade viva-Li
+
se
enfraquece favorecendo o ataque na C=O em detrimento da C=C, segundo o
mecanismo sugerido por Gulino. Verifica-se que o fenômeno é também observado
para a reação de copolimerização.
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
1
2
3
4
5
6
Moles de CHO/g de polímero
M
w
Figura 72: M
w
versus concentração de CHO para os oligômeros obtidos por sec-BuLi
5.2.6. Avaliação da solubilidade dos copolímeros de acroleína e estireno
As solubilidades dos copolímeros de acroleína e estireno obtidos neste
trabalho foram avaliadas quanto à solubilidade em água, etanol e sulfóxido de
dimetila e estão apresentadas na Tabela 16.
102
Tabela16: Solubilidade dos copolímeros de acroleína e estireno em diversos solventes
Amostra Iniciador acro:sty M
w
H
2
O (%) ETOH (%) DMSO (%)
PAS1
PAS2
PAS3
PAS4
PAS5
PAS6
PAS7
PAS8
PAS9
sec-BuLi
1:1 1229 - 100 98
1,5:1 3511 - 84 97
2:1 1934 70 94 98
3:1 3353 76 99 99
4:1 9890 71 97 98
5:1 729 44 63 -
7:1 3814 - 96 95
9:1 9048 71 100 97
49:1 7324 74 96 96
PAS10
PAS11
PAS12
PAS13
PAS14
PAS15
PAS16
terc-BuLi
1:1 1039 78 - -
1,5:1 - 72 100 97
2:1 - - 99 99
3:1 - 81 100 100
4:1 - 82 100 100
5:1 - 80 100 99
7:1 - 74 99 96
Massa do copolímero = 10mg em 1mL do solvente
Era esperado que a inserção do monômero estireno à microestrutura do
polímero diminuísse a solubilidade das cadeias poliméricas em solventes polares.
No entanto, os copolímeros de acroleína e estireno mostraram-se mais solúveis nos
solventes polares quando comparados aos homopolímeros de acroleína. Acredita-se
que a inserção de um monômero mais rígido à cadeia promoveu a abertura dos
espaços interticiais, i.e., contribuiu para aumentar a distância intermolecular. Tal
abertura favoreceu a entrada do solvente no interior do novelo aleatório e facilitou a
reptação das cadeias do copolímero para a solução polimérica e/ou a penetração
das moléculas do solvente no espaço entre cadeias. Cabe ressaltar que a inserção
de estireno às cadeias de copolímero foi baixa, em torno de 3%.
5.3. BIOCONJUGADOS DE HbBv E DERIVADOS DE POLIACROLEÍNA
5.3.1. Obtenção dos bioconjugados de HbBv e derivados de acroleína
Os bioconjugados foram obtidos conforme a metodologia descrita no item
4.2.3. As razões molares de HbBv e grupos CHO no polímero, as quantidades do
103
agente terminador (NaBH
4
), a massa molar e o teor de aldeído do polímero utilizado
na modificação da proteína bem como a concentração final dos bioconjugados após
diálise estão descritos nas Tabelas 17 e 18.
Tabela 17: Reagentes e condições reacionais para obtenção dos bioconjugados com
copolímeros
Amostra Razão molar
[HbBv]/[CHO]
Massa do
polímero
(mg)
MM
(g/mol)
Teor de CHO
no polímero
(moles/g)
Razão molar
[CHO]/[NaBH
4
]
Massa
NaBH
4
(mg)
[Bioconj]
g/dL
HbPAS1
1:10 1,4
1:100 13,9
1:500 69,5
1191 5,5x10
-2
1:10 29 8,17
1:10 287 8,73
1:5 718 3,44
HbPAS2
1:10 4,2
1:100 41,7
3282 2,2x10
-2
1:10 28 4,60
1:10 283 4,61
HbPAS4
1:10 2,7
1:100 27,5
4548 4,6x10
-2
1:10 28 3,34
1:10 283 6,41
HbPAS7
1:10 2,4
1:100 22,1
207 2,8x10
-2
1:10 28 5,60
1:10 283 2,92
HbPAS8
1:10 6,1
1:100 62,6
9579 4,0x10
-2
1:10 28 9,52
1:10 283 5,38
HbPAS9
1:10 9,6
1:100 98,7
7784 0,8x10
-2
1:10 28 10,41
1:10 283 2,89
HbPAS11
1:10 11,0
1:100 22,0
- 3,5x10
-2
1:5 70 4,99
1:5 147 4,28
HbPAS12
1:10 38,0
1:100 77,0
- 1,0x10
-2
1:5 73 4,34
1:5 148 3,88
HbPAS13
1:10 8,5
1:100 17,0
- 4,5x10
-2
1:5 73 6,75
1:5 148 6,04
HbPAS14
1:10 9,5
1:100 19,0
- 4,0x10
-2
1:5 73 6,59
1:5 148 3,36
HbPAS15
1:10 5,9
1:100 12,0
- 6,3x10
-2
1:5 73 4,78
1:5 148 4,38
HbPAS16
1:10 7,0
1:100 14,0
- 5,5x10
-2
1:5 73 5,33
1:5 143 8,12
[bioconj]; concentração de HbBv após reação com os polímeros.
As reações para a obtenção do bioconjugado partiram da concentração da
HbBv a 11,2 g/dL, exceto para a obtenção das amostras HbPA27 e HbPA31. Para
estas amostras, a reação conduzida na razão molar 1:10 partiu de uma
104
concentração de HbBv igual a 7,5 g/dL, enquanto que para a reação conduzida na
razão molar 1:100 partiu de uma concentração de HbBv igual a 9,6 g/dL. Observa-se
que para todas as amostras ocorreu considerável diluição após a diálise, tanto para
as amostras obtidas a partir dos homopolímeros, quanto para as obtidas com os
copolímeros. A diluição era esperada, uma vez que a concentração dos
bioconjugados era superior a do tampão diluído contra o qual foi realizado a diálise.
Tabela 18: Reagentes e condições reacionais para a obtenção dos bioconjugados com
homopolímeros
Amostra Razão molar
[HbBv]/[CHO]
Massa do
polímero
(mg)
MM
(g/mol)
Teor de CHO
no polímero
(moles/g)
Razão molar
[CHO]/[NaBH
4
]
Massa
NaBH
4
(mg)
[Bioconj]
g/dL
HbPA21
1:10 1,2
1:100 12
1057 6,5x10
-2
1:10 30 6,47
1:5 147 2,71
HbPA22
1:10 1,3
1:100 14,2
743 4,1x10
-2
1:10 52 6,18
1:5 323 5,76
HbPA24
1:10 2,4
1:100 22,4
605 3,5x10
-2
1:10 32 5,31
1:5 306 5,88
HbPA27
1:10 1,6
1:100 16,0
4804 4,7x10
-2
1:10 28 3,58
1:5 142 2,30
HbPA31
1:10 1,6
1:100 16,0
685 4,3x10
-2
1:10 28 4,17
1:5 142 2,35
HbPA32
1:10 2,4
1:100 24,0
1047 3,2x10
-2
1:10 29 6,32
1:5 147 5,27
HbPA35
1:10 4,1
1:100 39,7
891 1,8x10
-2
1:10 28 4,41
1:5 136 2,71
HbPA36
1:10 1,6
1:100 16,0
888 4,7x10
-2
1:10 28 4,91
1:5 141 2,61
Dados da literatura [31] relatam que a adição de boroidreto pode ser de até
300 vezes maior que a da hemoglobina, sem que isto cause a sua desnaturação. No
entanto, a quantidade de boroidreto foi um fator limitante para o sistema em questão,
pois a reação de redução das ligações imina ocorreu com formação de espuma,
tornando-se difícil a recuperação final do produto. Embora fosse desejável adicionar
excesso de boroidreto para garantir também a redução de grupos aldeído não-
reagidos, isto não foi viável.
105
5.3.2. Análise de Espectrometria de Absorção no Infravermelho
Os produtos obtidos pela reação da HbBv com os derivados de acroleína
foram avaliadas por FTIR. Verifica-se que o espectro de FTIR do bioconjugado
assemelhasse muito ao da proteína não modificada. A Figura 73 apresenta os
espectros de FTIR para a HbBv não modificada e ela modificada pelo copolímero
PAS12 (terc-BuLi e razão acro/sty=2).
4000 3000 2000 1000
0
HbBv-não mod
HbBv-PAS12
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 73: Espectros de FTIR para a HbBv não modificada versus Hb-PAS12
Verifica-se que não há presença de novas absorções quando se compara os
espectros de FTIR das amostras não modificada e modificada com o copolímero
PAS12. No entanto, a avaliação do tamanho de partícula realizada pela técnica do
espalhamento de luz revelam a existência de estruturas modificadas. Tais resultados
serão discutidos posteriormente. O bioconjugado HbPAS12 obtido pela reação da
HbBv com o copolímero PAS12 para a razão molar [Hb]:[CHO] igual a 1:100 foi
sintetizado adicionando 77 mg do copolímero PAS12 à solução de hemoglobina.
Esta quantidade de polímero foi uma das maiores para obtenção do bioconjugado,
106
mesmo assim, não foi possível visualizar alterações no espectro de FTIR que
possam distinguir a Hb não modificada da Hb modificada.
A princípio acreditou-se que as ligações iminas e aminas do bioconjugado
pudessem ser observadas pelos espectros de FTIR. No entanto, nem mesmo as
absorções referentes ao copolímero e homopolímero puderam ser observadas. Isto
pode ser atribuído, em parte, a pouca quantidade de polímero adicionado ao sistema
para a obtenção do bioconjugado. A Figura 74 apresenta os espectros de FTIR para
o copolímero PAS12 e o produto obtido pela reação deste copolímero com a HbBv.
4000 3000 2000 1000
0
PAS12
HbPAS12
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 74: Espectros de FTIR para o copolímero PAS12 versus HbPAS12
As Figuras 75 e 76 apresentam os espectros de FTIR para os bioconjugados
obtidos com os homopolímeros de acroleína e com os copolímeros de acroleína e
estireno, respectivamente. Em ambos os casos, os espectros de FTIR dos
bioconjugados assemelham-se muito com o espectro da HbBv não modificada.
107
4000 3000 2000 1000
0
HbBv
HbPA22
HbPA27
HbPA31
HbPA36
HbPA32
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 75: Espectros de FTIR para os bioconjugados sintetizados com homopolímeros
4000 3000 2000 1000
0
HbPAS1
HbPAS9
HbPAS12
HbBv
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
Figura 76: Espectros de FTIR para os bioconjugados sintetizados com copolímeros
108
5.3.3. Avaliação dos bioconjugados quanto a autooxidação
Como já mencionado anteriormente, o termo mete-hemoglobina (metHb) se
refere a hemoglobina no estado oxidado, quando os átomos de ferro constituintes do
heme passam do estado de Fe
+2
para Fe
+3
. Neste estado a hemoglobina perde a
habilidade de se ligar reversivelmente a molécula de O
2
.
Os teores de metHb para os bioconjugados obtidos neste trabalho foram
avaliados conforme metodologia descrita no item 4.2.3.1.3. Os produtos empregados
como carreadores de O
2
temporários, em geral, possuem concentração entre 4-15
g/dL e teores de metHb de no máximo 10%. Como os produtos obtidos neste
trabalho sofreram diluições durante o processo de diálise. As medidas realizadas
para avaliar o teor de metHbBv nos bioconjugados foram calculadas para a
concentração final dos produtos a 3,0 g/dL. Os resultados dos teores de metHb para
os bioconjugados obtidos estão descritos nas Tabelas 19 e 20. Verifica-se que
grande parte dos produtos apresentaram teores de metHb abaixo de 10%. Exceção
para as amostras HbPA21 (1:10); HbPA32 (1:10); HbPAS8 (1:10) e HbPAS14 (1:50).
Tabela 19: Valores de metHb para os produtos derivados dos homopolímeros
Amostra Razão [Hb]:[CHO] Leitura1 Leitura2 % metHbBv
HbBv não mod. - 0,0683 0,01463 5,8
PA21
1:10 0,1317 0,0342 10,5
1:100 0,0683 0,0244 4,7
PA22
1:10 0,0976 0,0342 6,9
1:100 0,1024 0,0439 6,3
PA24
1:10 0,0976 0,0342 6,9
1:100 0,0732 0,0293 4,7
PA27
1:10 0,0927 0,0342 6,3
1:100 0,0536 0,0244 3,2
PA31
1:10 0,0878 0,0293 6,3
1:100 0,0781 0,0293 5,3
PA32
1:10 0,1415 0,0439 10,5
1:100 0,1220 0,0439 8,4
PA35
1:10 0,1268 0,0439 9,0
1:100 0,0829 0,0390 4,7
PA36
1:10 0,1122 0,0439 7,4
1:100 0,0927 0,0439 5,3
109
Tabela 20: Valores de metHb para os produtos derivados dos copolímeros
Amostra Razão [Hb]:[CHO] Leitura1 Leitura2 % metHbBv
HbBv não mod. - 0,0683 0,01463 5,8
PAS1
1:10 0,0878 0,0244 6,9
1:100 0,0585 0,0244 3,7
1:500 0,0634 0,0244 4,2
PAS2
1:10 0,0878 0,0390 5,3
1:100 0,0293 0,0146 1,6
PAS4
1:10 0,0929 0,0342 6,3
1:100 0,1073 0,0342 7,9
PAS7
1:10 0,0927 0,0293 6,9
1:100 0,0927 0,0293 6,9
PAS8 1:10 0,1415 0,0390 11,1
PAS9
1:10 0,1268 0,0342 10,0
1:100 0,0634 0,0244 4,2
PAS11 1:100 0,1073 0,0341 7,9
PAS12
1:50 0,1024 0,0341 7,4
1:100 0,0537 0,0195 5,7
PAS13 1:100 0,1073 0,0342 7,9
PAS14
PAS15
PAS16
1:50 0,1170 0,0390 10,6
1:100 0,0925 0,0342 6,3
1:50 0,0927 0,0342 6,3
1:100 0,0781 0,0244 5,8
1:50 0,0878 0,0342 5,8
1:100 0,0829 0,0244 7,0
Modificações química em hemoglobinas, em geral, ocorrem com a oxidação
do átomo de ferro do heme. No entanto, alguns dos bioconjugados sintetizados
neste trabalho apresentaram teores de metHb menores que o da HbBv não
modificada. E estes valores foram menores ainda para a reação conduzida na razão
molar [Hb]/[CHO] igual a 1:100. Isto pode ser atribuído a ação do agente terminador
(NaBH
4
), que foi
adicionado inicialmente para reduzir as ligações imina a amina e
pode também estar promovendo a redução dos átomos de ferro. Como nas reações
obtidas para razão molar 1:100 a quantidade de NaBH
4
é maior o efeito na
diminuição do teor de metHb também foi maior. As Figuras 77 e 78 apresentam as
variações do teor de metHb para as razões molares 1:10 e 1:100 para o caso dos
bioconjugados obtidos com homopolímeros, por sec-BuLi e terc-BuLi,
respectivamente. Observa-se que para todos os caso as amostras obtidas para
110
razão molar 1:100 apresentaram teores de metHb inferior as amostras obtidas para
razão molar 1:10. Evidenciando a direta relação dos resultados observados com a
concentração de NaBH
4
no meio reacional.
0
2
4
6
8
10
12
PA27
PA27
PA24
PA24
PA22
PA22
PA21
PA21
1:100
1:100
1:100
1:100
1:10
1:10
1:10
1:10
HbBv
Teor de metHbBv (%)
Razão molar [Hb]:[CHO]
Figura 77: Teor de metHb para as amostras obtidas com homopolímeros sintetizadas com
iniciador sec-BuLi
0
2
4
6
8
10
12
PA36
PA36
PA35
PA35
PA32
PA32
PA31
PA31
HbBv
1:100
1:100
1:100
1:100
1:10
1:10
1:10
1:10
Teor de metHb (%)
Razão molar [Hb]:[CHO]
Figura 78: Teor de metHb para as amostras obtidas com homopolímeros sintetizadas com
iniciador terc-BuLi
111
As Figuras 79 e 80 apresentam as variações do teor de metHb para as
razões molares 1:10, 1:50 e 1:100 para o caso dos bioconjugados obtidos com
copolímeros de acroleína e estireno, por sec-BuLi e terc-BuLi, respectivamente.
0
2
4
6
8
10
12
PAS9
PAS9
PAS4
PAS4
PAS2
PAS2
PAS1
PAS1
PAS1
1:500
1:100
1:100
1:100
1:100
1:10
1:10
1:10
1:10
HbBv
Teor de metHb (%)
Razão molar [Hb]:[CHO]
Figura 79:Teor de metHb para as amostras obtidas com copolímeros sintetizadas com
iniciador sec-BuLi
0
2
4
6
8
10
12
1:1001:100
1:1001:100
1:10
1:10
1:101:10
PAS16
PAS16
PAS15
PAS15
PAS14
PAS14
PAS12
PAS12
HbBv
Teor de metHb (%)
Razão molar [Hb]:[CHO]
Figura 80: Teor de metHb para as amostras obtidas com copolímeros sintetizadas com
iniciador terc-BuLi
112
Para o caso dos bioconjugados obtidos por copolímeros, os resultados
assemelham-se aos obtidos para os homopolímeros. No entanto, as amostras PAS4
e PAS16 (na proporção de 1:100) apresentaram um comportamento diferenciado
das demais. Esse resultado parece indicar que, nestes casos, a concentração de
NaBH
4
não tenha sido suficiente para reduzir os grupos imina, e também os átomos
de
ferro, ou ainda que, nestes casos, a modificação da HbBv tenha ocorrido com a
oxidação do ferro do heme.
De uma maneira geral, as reações de modificações química realizadas na
HbBv para a obtenção dos bioconjugados mantiveram a reversibilidade do átomo de
ferro de passar do estado oxidado (Fe
+3
) para o reduzido (Fe
+2
). Ou seja, as
modificações ocorreram em sítios da proteína que não o que liga à molécula de
oxigênio, o que permite com que ela mantenha a capacidade de carrear o oxigênio.
Cabe ressaltar que a preparação do PHP é realizada na presença de
maltose para diminuir os teores de metHb. Prepara-se uma solução 8 g/dL de Hb
humana piridoxilada – produto liofilizado. Adiciona-se o polioxietileno e a maltose na
concentração de 8 g/dL [30]. No caso dos produtos obtidos neste trabalho a natureza
da síntese torna esta etapa desnecessária.
5.3.4. Avaliação dos bioconjugados quanto à natureza macromolecular
Os bioconjugados derivados de hemoglobina para a obtenção de estruturas
do tipo poli-Hb são em geral caracterizados quanto à natureza macromolecular por
espalhamento de luz e cromatografia de permeação em gel. Os produtos obtidos
neste trabalho não foram avaliados por permeação em gel. A técnica de
espalhamento de luz é bastante empregada para o caso de proteínas e seus
derivados [68-73].
Os trabalhos descritos na literatura sobre estruturas tipo poli-Hb avaliam
seus tamanhos por meio da percentuais de intensidade de luz, na sua maioria. Não
foi encontrada nenhuma referência bibliográfica que avaliasse o tamanho do
bioconjugado por percentuais de volume. A diferença entre a avaliação por
intensidade ou volume é que os resultados avaliados por percentuais de volume
113
informam mais sobre o número de partículas que apresentam determinado diâmetro
hidrodinâmico, enquanto os resultados avaliados por percentuais de intensidade
informam mais sobre a diferença entre os tamanhos de partículas e fornecem a
média ponderada do espalhamento de luz dos volumes hidrodinâmicos para o
volume escaneado.
A princípio, as análises de espalhamento de luz foram realizadas em solução
aquosa dos bioconjugados, em diversas concentrações. Os resultados obtidos nesta
análise para os tamanhos avaliados em percentuais de intensidade estão descritos
na Tabela 21 e para a avaliação do tamanho em percentuais de volume estão
descritos na Tabela 22. As leituras foram obtidas em triplicata e o valor mediano para
o menor bioconjugado foi o critério de escolha para os valores mencionados neste
trabalho. Foi estabelecido como percentuais de Hb os valores de diâmetro
hidrodinâmico mais próximos de 6 nm – valor para a Hb. De 10 nm a 300 nm, a
nanopartícula foi denominada de bioconjugado 1. O valor de diâmetro hidrodinâmico
De 300 nm a 5000 nm foi designado de bioconjugado 2. Em alguns casos houve a
formação de um 3º bioconjugado mas estes não foram computados, por serem
poucas amostras (cerca de 9%). Também não foram computados os percentuais de
tamanhos de diâmetro hidrodinâmico ≤ 0,1.
Tabela 21: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução aquosa avaliados
em percentuais de intensidade
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
PA21
1:10 - - 9,1 114,6 90,9 999,5
1:100 86,3 7,283 - - 13,7 612,5
PA22
1:10 - - 18,9 119 81,1 910,4
1:100 57,7 6,530 17,8 125,4 22,8 320,3
PA24
1:10 43,2 6,441 53,9 149,9 2,9 4585
1:100 - - 33,2 112,8 66,8 849,9
PA27
1:10 67,7 7,598 23 199,9 9,3 4157
1:100 50,5 7,378 35,6 250,7 13,9 3265
PA31
1:10 87,9 7,691 - - 9,4 858,5
1:100 28,8 6,888 28,4 110 42,8 486,6
PA32
1:10 96,9 7,043 - - 3,1 4631
1:100 11,6 6,495 18,2 64,95 63,9 415,4
114
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
PA35
1:10 89,4 6,609 10,6 348,6 - -
1:100 85,3 8,406 - - 14,7 612,7
PA36
1:10 54 7,454 - - 46 786,2
1:100 84,2 7,437 10,1 289,3 5,7 4811
Neste experimento foi observado que as amostras que estavam em uma
faixa de concentração entre 2,5 g/dL e 3,5 g/dL tiveram bons fatores de correlação. A
partir desse momento, as avaliações das nanopartículas foram realizadas na
concentração de 3,0 g/dL.
Tabela 22: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução aquosa avaliados
em percentuais de volume
Amostra
PA21
Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
1:10 - - 2,9 112,3 97,1 1004
1:100 100 5,822 - - - -
PA22
1:10 - - 6,1 113,9 93,9 975,5
1:100 100 5,578 - - - -
PA24
1:10 100 5,759 - - - -
1:100 - - 14,8 106,2 85,2 866,3
PA27
1:10 99,9 6,207 - - - -
1:100 99,9 6,077 - - - -
PA31
1:10 100 6,010 - - - -
1:100 99,9 6,290 - - - -
PA32
1:10 100 5,523 - - - -
1:100 99,2 6,046 0,3 50,42 0,2 579,2
PA35
1:10 100 5,843 - - - -
1:100 100 6,510 - - - -
PA36
1:10 99,9 7,1115 - - - -
1:100 100 6,056 - - - -
Verifica-se que algumas amostras apresentaram valores de diâmetros
hidrodinâmico muito altos e portanto questionáveis para o sistema em questão. Foi o
caso das amostras PA21, PA22 e PA24 que apresentaram percentuais de grandes
partículas acima de 85%, mesmo para a avaliação em percentuais de volume. Esse
resultado fez com que se pensasse que fenômenos de agregação estivessem
115
acontecendo no sistema em grande escala. O passo subsequente foi fazer a diluição
das amostras em solução tampão Tris HCl diluído pH=7,4 para minimizar o efeito da
agregação. Os resultados obtidos nessa análise para os tamanhos avaliados em
percentuais de intensidade e volume estão apresentados na Tabela 23 e na Tabela
24, respectivamente.
Tabela 23: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão, não
filtrados, avaliados em percentuais de intensidade
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
HbBv - 9 6,097 5,7 55,49 85,3 341,1
PAS1
1:10 8,4 8,131 8,9 102,1 82,7 912
1:100 - - - - 100 2379
1:500 - - 17,2 133,9 81,7 614,4
PAS2
1:10 - - - - 100 652,5
1:100 - - 5,2 46,87 93,3 219,6
PAS4 1:100 10,1 9,1 - - 89,9 1460
PAS7 1:10 9,1 10,35 41,7 1320 49,3 4819
PAS8
1:10 5,6 10,27 19,6 131,4 69,9 929,9
1:100 - - 11,9 65,76 83,4 286,1
PAS9
1:10 8,4 7,279 21 124,5 70,6 539,7
1:100 - - 18 143,8 80,8 1238
PAS11
1:50 7,1 8,747 21,1 114,5 67,5 579,4
1:100 - - 35,9 126,4 55,7 729,8
PAS12
1:50 - - 58,1 126,9 34,5 790,3
1:100 12,2 8,641 11,9 92,45 76 506
PAS13
1:50 8,7 8,861 25,6 105,5 65,6 708,7
1:100 - - 31 126,1 61,9 780
PAS14
1:50 7,8 7,185 - - 92,2 3059
1:100 - - 15,7 161,3 84,3 1077
PAS15
1:50 6,7 6,955 - - 93,3 3079
1:100 - - 7,2 228,7 92,8 2721
PAS16
1:50 7,9 6,571 - - 92,1 1908
1:100 5 8,134 6,4 11,5 88,5 1364
A diluição das amostras em tampão aparentemente forneceu valores de
diâmetros hidrodinâmico tão grande quanto os avaliados em água miliQ, tanto para
as leituras em percentuais de intensidade quanto para as leituras em percentuais de
116
volume, mostrando que a solução tampão não foi suficiente para desfazer os
agregados. Pensou-se na adição de sal, mas seria mais um componente adicionado
ao sistema sem saber ao certo qual a extensão da influência causada pela adição
deste novo componente. Verificou-se que para os valores de HbBv não modificada
85,35% das partículas apresentaram diâmetro hidrodinâmico igual a 341,1 nm,
enquanto apenas 9% das partículas apresentaram tamanho igual a 6,097 nm. Já a
avaliação da mesma amostra por percentuais de volume forneceu o valor de 99,6%
das partículas com diâmetro de 5,827 nm. Tais resultados indicam que as leitura em
percentuais de volume apresentam resultados mais próximos da realidade para o
sistema em questão.
Tabela 24: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão, não
filtrados, avaliados em percentuais de volume
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
HbBv - 99,6 5,827 0,1 53,12 0,3 357
PAS1
1:10 98 7,746 - - 2,0 925,4
1:100 - - - - 100 2465
1:500 - - 7,1 115,2 80,7 710,1
PAS2
1:10 - - - - 100 660,9
1:100 - - 35,2 46,87 45,9 240
PAS4
1:10 - - - - - -
1:100 97,4 8,793 - - 2,6 1484
PAS7
1:10 86,5 9,807 - - 11,7 5027
1:100 - - - - - -
PAS8
1:10 94,5 9,966 0,4 116,1 3 799,8
1:100 - - 23 58,11 32,4 336,9
PAS9
1:10 99,2 6,716 0,8 603 - -
1:100 - - 4,4 136,3 86,6 1375
PAS11
1:50 97,2 8,493 0,3 105,2 1,5 659,4
1:100 - - 13,1 95,90 37,4 832,8
PAS12
1:50 - - 31,1 90,46 40,1 4498
1:100 99,1 7,870 0,1 81,78 0,7 552,9
PAS13
1:50 98,2 8,323 0,3 90,71 1,5 759,3
1:100 - - 11,7 98,91 43,7 871,3
PAS14
1:50 95,3 7,104 4,7 31,47 - -
1:100 - - 3,8 159 96,2 1132
117
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
PAS15
1:50 95 6,85 - - 5 3156
1:100 - - 0,6 233,9 66,2 2825
PAS16
1:50 98,2 6,567 - - 1,8 1959
1:100 96,1 8,048 0,1 110,2 3,8 1392
Mesmo para as leituras em percentuais de volume, alguns valores de
diâmetro hidrodinâmico dos bioconjugados estavam ainda muito altos, como por
exemplo a amostra PAS1(1:100) que apresentava 100% das partículas com
diâmetro de 2565 nm, a amostra PAS2 (1:10) que apresentava 100% das partículas
com diâmetro de 660,9 nm e a amostra PAS9, que apresentava 86,6% das
partículas com diâmetro igual a 1375 nm. Uma das possibilidades de minimizar os
erros de análise causados pelo fenômeno da agregação foi filtrar as amostras. As
amostras foram filtradas em membrana de 0,45 μm e os resultados desta análise
estão apresentados nas Tabelas 25 e 26 para os percentuais de intensidade e
volume, respectivamente.
Tabela 25: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão, filtrados a
0,45μm, avaliados em percentuais de intensidade
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
HbBv - - - 18,6 157,5 71,8 572,6
PA21
1:10 100 7,838 - - - -
1:100 100 7,734 - - - -
PA22
1:10 100 8,277 - - - -
1:100 98,4 7,753 - - 1,6 4650
PA24
1:10 90 7,148 - - 4,9 920
1:100 96,3 7,345 - - 3,7 4740
PA27
1:10 100 8,505 - - - -
1:100 97,5 8,219 - - 2,5 5017
PA31
1:10 100 7,930 - - - -
1:100 100 8,054 - - - -
PA32
1:10 96,5 7,897 - - 3,5 4300
1:100 64,9 6,935 - - 32,6 762,2
PA35
1:10 100 8,297 - - - -
1:100 100 8,812 - - - -
PA36 1:10 100 5,699 - - - -
118
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado1 Bioconjugado2
% nm % nm % nm
1:100 100 7,851 - - - -
PAS1
1:10 12,5 8,377 8,9 107,3 78,6 760,8
1:100 88,3 7,655 - - 11,7 1834
1:500 - - 15,8 143,2 82,3 1149
PAS2
1:10 61,6 7,712 - - 38,4 342,1
1:100 100 9,451 - - - -
PAS4
1:10 100 8,005 - - - -
1:100 17 8,435 - - 83 1596
PAS7
1:10 41,2 8,245 - - 58,8 460,8
1:100 0 0 0 0 0 0
PAS8
1:10 7,5 10,49 21,9 149,6 67,8 675,6
1:100 12,6 13,87 87,4 121,1 - -
PAS9 1:100 - - 16,4 173,5 63,5 1291
Os resultados desta análise apresentaram maior convergência de valores
entre a análise em percentuais de intensidade e de volume. Os valores da amostra
PAS1 (1:100), que antes da filtração apresentou 100% da partículas com diâmetro
de 2465 nm, desta vez apresentou 100% a 6,342 nm, quando avaliada por volume.
Também os valores de tamanho da amostra PAS2 (1:10) sofreram grandes
mudanças após a filtração, isto é, 96,6% das partículas apresentaram tamanho
igual a 11,52 nm mas anteriormente 100% forneceram tamanho igual a 660,9 nm.
Tabela 26: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão, filtrados a
0,45μm, avaliados em percentuais de volume
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
HbBv - 99,4 5,357 - - 0,4 637,8
PA21
1:10 100 6,282 - - - -
1:100 100 5,938 - - - -
PA22
1:10 100 6,085 - - - -
1:100 100 5,967 - - - -
PA24
1:10 100 6,049 - - - -
1:100 100 5,804 - - - -
PA27
1:10 100 6,355 - - - -
1:100 100 6,452 - - - -
PA31 1:10 100 6,132 - - - -
119
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
1:100 100 6,377 - - - -
PA32
1:10 100 6,018 - - - -
1:100 99,9 6,055 - - - -
PA35
1:10 100 6,125 - - - -
1:100 100 6,648 - - - -
PA36
1:10 100 5,272 - - - -
1:100 100 6,380 - - - -
PAS1
1:10 98,7 8,026 - - 1,2 787
1:100 100 6,342 - - - -
1:500 - - - - 82,8 1261
PAS2
1:10 96,6 11,52 3,4 790,8 - -
1:100 100 6,753 - - - -
PAS4
1:10 100 5,486 - - - -
1:100 98,8 8,083 - - 1,2 1635
PAS7
1:10 99,9 8,059 - - - -
1:100 - - - - - -
PAS8 1:100 - - 97,3 12,80 2,7 96,92*
PAS9 1:100 - - - - 67 5354
* valor abaixo de 300nm
A amostra PAS7 (1:100) apresentou valor zero para todos os diâmetro
hidrodinâmico, de maneira que um questionamento foi levantado – Será que ocorreu
um erro experimental? Ou será que durante o processo da filtração os
bioconjugados ficaram retidos na membrana e por isso não puderam ser avaliados?
Outro sistema de filtração foi realizado, desta vez com a membrana 0,8 μm. No
entanto, o manuseio deste novo sistema filtrante foi mais precário, a membrana teve
que ser cortada manualmente para adaptar-se ao funil. Com a membrana adaptada,
o funil foi fechado por meio de um sistema de rosqueamento. As filtrações ocorreram
com vazamento pelas laterais do filtro e, devido à dificuldade de manuseio, o
tratamento dado aos produtos para a avaliação por espalhamento de luz foi
substituído. Os resultados dessas amostras não serão apresentados.
O problema da agregação das partículas é da natureza do sistema em
questão. Para minimizar os erros ocasionados pelo efeito da agregação, as
amostras foram centrifugadas a 10 rpm por 10 min. A fração solúvel foi avaliada por
120
espalhamento de luz e os resultados destas análises estão apresentados nas
Tabelas 27 e 28 para os percentuais de intensidade e volume, respectivamente.
Tabela 27: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução-tampão,
centrifugados e avaliados em percentuais de intensidade
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
HbBv - 70,9 5,771 24,5 212,6 4,6 5172
PA21
1:10 81,3 7,020 - - 16,4 450,9
1:100 69,8 6,920 1,9 76,12 28,3 502,5
PA22
1:10 86,7 7,298 - - 8,7 587,4
1:100 78,8 6,824 - - 18,9 491,5
PA24
1:10 66,1 7,161 - - 29,8 508,3
1:100 44,1 7,268 8,2 91,46 44,2 404,0
PA27
1:10 57,5 7,393 - - 24,1 630
1:100 21,6 7,523 5,1 87,69 70,4 721,4
PA31
1:10 51,6 6,978 - - 43,7 431,5
1:100 25,9 7,010 5,4 246,1 63,7 947,1
PA32
1:10 73,5 7,246 - - 20,3 499,7
1:100 75 7,340 - - 19,2 461,3
PA35
1:10 77,1 7,610 - - 15,6 834,9
1:100 66,1 8,166 - - 24,7 644,7
PA36
1:10 80,7 7,594 - - 12,5 733
1:100 78,7 7,918 - - 14,6 604,9
PAS1
1:10 56 7,019 - - 39,3 428,1
1:100 66,2 7,493 - - 29,3 418,9
1:500 17,8 10,50 50,8 54,52 31,5 325,9
PAS2
1:10 100 78,31 - -
1:100 - - 100 111,8 - -
PAS4
1:10 79,2 7,895 3,9 46,65 16,9 318
1:100 90,3 7,658 7,2 4516
PAS7
1:10 98,3 7,445 - - 1,7 5380
1:100 94,6 8,416 - - 5,4 3983
PAS8 1:10 16,5 7,438 80,7 208,2 2,7 4797
PAS9
1:10 20,9 7,940 79,1 219,8 - -
1:100 - - 6,5 16,52 92,1 79,89
PAS11
1:50 16,7 7,034 80,6 194,8 3 5161
1:100 10,3 7,325 86,7 238,3 2,9 4553
PAS12
1:50 - - 100 143 - -
1:100 20,6 8,357 22,4 41,48 55,2 324,4
121
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
PAS13
1:50 21,3 7,513 78,7 300 - -
1:100 20,6 7,227 63,6 262,3 - -
PAS14
1:50 60,2 7,052 35 250,1 4,8 5130
1:100 28,9 6,995 38,8 197,2 28,3 614,8
PAS15
1:50 59,8 7,057 4,3 99,17 35,9 327
1:100 67,3 7,370 - - 24,6 311,4
PAS16
1:50 61,3 7,005 6,2 50,28 32,5 323,5
1:100 32,3 7,289 10 110,5 55,8 438,9
Verifica-se que os valores em percentuais de volume e em percentuais de
intensidade também apresentaram convergência e coerência quanto aos valores
esperados para a Hb modificada. Os valores não foram tão convergentes quanto a
amostra filtrada a 0,45 μm , mas para nenhum caso ocorreu amostras com valores
zerados.
Tabela 28: Diâmetro hidrodinâmico para os bioconjugados em solução tampão,
centrifugados e avaliados em percentuais de volume
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
HbBv - 100 4,896 - - - -
PA21
1:10 100 6,320 - - - -
1:100 100 6,169 - - - -
PA22
1:10 100 6,177 - - - -
1:100 100 5,954 - - - -
PA24
1:10 100 6,272 - - - -
1:100 99,9 6,529 - - - -
PA27
1:10 99,9 6,183 - - - -
1:100 99,5 6,622 - - 0,4 789
PA31
1:10 99,9 6,165 - - - -
1:100 99,5 6,511 - - 0,3 999,3
PA32
1:10 99,9 6,207 - - - -
1:100 100 6,289 - - - -
PA35
1:10 99,9 6,615 - - - -
1:100 99,8 6,887 - - - -
PA36
1:10 99,9 6,329 - - - -
1:100 99,9 6,635 - - - -
122
Amostra Razão
[Hb]/[CHO]
Hb Bioconjugado 1 Bioconjugado 2
% nm % nm % nm
PAS1
1:10 99,9 6,177 - - - -
1:100 99,9 6,412 - - - -
1:500 95,9 8,849 3,9 34,39 0,2 453,2
PAS2
1:10 100 6,501 - - - -
1:100 - - 100 75,37 - -
PAS4
1:10 100 6,413 - - - -
1:100 99,9 6,368 - - - -
PAS7
1:10 100 6,203 - - - -
1:100 100 6,577 - - - -
PAS8 1:10 99,5 6,572 0,3 67,41 - -
PAS9
1:10 99,6 6,966 0,3 72,09 - -
1:100 - - 98,8 23,28 1,2 4728
PAS11
1:50 99,6 6,519 0,2 99,19 0,1 412,7
1:100 99,4 6,805 0,2 107,6 0,2 375,5
PAS12
1:50 - - 100 127,7 - -
1:100 98,5 7,074 1,3 30,13 0,2 409,1
PAS13
1:50 99,6 6,748 0,3 65,06 0,1 915,1
1:100 99,6 6,571 0,3 50,89 - -
PAS14
1:50 99,9 6,106 - - - -
1:100 99,8 6,403 - - - -
PAS15
1:50 100 6,149 - - - -
1:100 99,9 6,216 - - - -
PAS16
1:50 99,9 6,180 - - - -
1:100 99,8 6,643 - - - -
Os valores de diâmetro para os bioconjugados foram em média menores
para as amostras centrifugadas, inclusive para a HbBv não modificada. Este
fenômeno pode ser atribuído à ação da força centrífuga que pode estar removendo
algum material sedimentado na superfície das partículas dos bioconjugados,
tornando-os em média menores que os diâmetros citados anteriormente.
Observa-se que para todos os bioconjugados obtidos neste trabalho, o valor
do diâmetro hidrodinâmico foi maior que o valor da HbBv não modificada. Indicando
que os derivados da acroleína mostraram-se eficientes quanto à modificação da
HbBv.
123
Considerando-se o diâmetro hidrodinâmico da Hb como igual a 6 nm (valor
da literatura), observa-se que para todas as amostras pelo menos a formação de um
tetrâmero foi obtido. Tomando-se como diâmetro hidrodinâmico o valor experimental
de 4,896 nm (Tabela 28), pode-se afirmar que estruturas maiores que um tetrâmero
foram obtidas. O tetrâmero pode ter sido obtido pela ligação química das
subunidades constituintes da Hb ou pela inserção de cadeias de polímeros na HbBv
originando estruturas tipo decoradas (Figura 3). A formação de tetrâmeros foi
observada até mesmo para as reações conduzidas com pouquíssima quantidade de
polímeros. A amostra HbPA21 na razão molar de 1:10 foi obtida por meio da reação
da HbBv com 1,2 mg do polímero. Para a obtenção da amostra HbPA22, foram
utilizados 1,3 mg e para obtenção da HbPA31 apenas 1,6 mg de polímero foram
utilizados.
Estruturas de maior ordem também foram obtidas para a HbBv modificada
pelos copolímeros PAS2, PAS9 e PAS12. O bioconjugado obtido pela reação com o
copolímero PAS2 na razão molar [Hb]:[CHO] igual a 1:100 apresentou 100% das
partículas com o diâmetro igual a 75,37 nm. Para a reação obtida com o copolímero
PAS9 na razão molar [Hb]:[CHO] igual a 1:100, 98,8% das partículas apresentaram
diâmetro igual a 23,28 nm e a para o produto obtido pela reação da Hb com o
copolímero PAS12, 100% das partículas apresentaram o diâmetro igual a 127,7 nm.
Todas as amostras foram avaliadas em percentuais de volume.
Uma das vantagens da reação da HbBv com os derivados de acroleína é
que eles levaram a obtenção de bioconjugados com diâmetros hidrodinâmicos
relativamente uniformes. Isto ocorreu mesmo para o caso de polímeros bastante
polidispersos como por exemplo o produto obtido da modificação da HbBv pelo
copolímero PAS8 (M
w
/M
n
=10,7). Para este produto, 80,7% das partículas
apresentaram diâmetro igual 208,2 nm quando avaliados por intensidade e 99,5%
das partículas apresentaram diâmetro igual 6,572 nm, quando avaliados por volume.
Ainda que os valores sejam incoerentes para o exemplo citado, o produto de síntese
apresentou um valor de tamanho predominante para as duas leituras realizadas.
Para os bioconjugados avaliados por percentuais de intensidade, 58,5% das
amostras (24/41) apresentaram um tamanho de diâmetro predominante. E este
tamanho apareceu para valores acima de 70%. Para a avaliação feita por
124
percentuais de volume os tamanhos se mostraram mais uniformes ainda, pois 100%
das amostras (41/41) avaliadas apresentaram um diâmetro predominante e para
valores acima de 95%.
Os copolímeros que conduziram aos bioconjugados de maiores tamanhos
não foram necessariamente os que obtiveram maiores teores de grupamentos
aldeído na microestrutura. Na verdade, os maiores bioconjugados foram obtidos com
os copolímeros que possuíram menores teores de grupamentos aldeído. Isto
ocorreu talvez porque, para os copolímeros que possuíram menores teores de CHO,
maiores quantidades foram adicionadas no meio reacional, o que pode ter
favorecido a reação de modificação da HbBv. As Figuras 81 a 84 apresentaram as
variações do diâmetro hidrodinâmico do bioconjugado em função do teor de CHO do
polímero usado para a modificação da HbBv.
0 1 2 3 4 5 6 7
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
Teor de CHO
Figura 81: Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados obtidos com
homopolímeros na razão molar de 1:10
A HbBv é uma molécula grande e para que sua modificação química ocorra
os grupamentos amino primário da Hb e os grupamentos CHO do polímero precisam
entrar em contato. O contato será tão mais eficiente, quanto menos impedidos
125
estiverem os sítios reativos. A inserção dos grupamentos CHO na microestrutura das
poliacroleínas obtidas por alquil lítio ocorre preferencialmente no início da cadeia.
Pode ser que para os polímeros que forneceram maiores teores de CHO na
microestrutura, os grupamentos aldeídos estejam dispostos no início da cadeia
polimérica e bem próximos uns dos outros, de maneira que estão mais impedidos
estericamente e menos disponíveis para a reação com a HbBv. Isto poderia explicar
a diminuição do diâmetro hidrodinâmico com o aumento do teor de CHO na
microestrutura do polímero. Portanto, dois fatores estariam colaborando para este
efeito. O primeiro seria a quantidade de polímero adicionado no meio reacional e o
segundo o impedimento estérico dos grupamentos CHO nos polímeros com maiores
teores de CHO.
0 1 2 3 4 5 6 7
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico (mn)
Teor de CHO
Figura 82: Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados obtidos com
homopolímeros na razão molar de 1:100
126
0 1 2 3 4 5 6 7
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
Teor de CHO
Figura 83: Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO % de volume dos bioconjugados
obtidos com copolímeros na razão molar de 1:10
0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
Teor de CHO
Figura 84: Diâmetro hidrodinâmico versus teor de CHO dos bioconjugados obtidos com
copolímeros na razão molar de 1:100
127
As Figuras 85 a 88 apresentam as variações do diâmetro hidrodinâmico do
bioconjugado em função da massa molar do polímero utilizado na modificação
química da HbBv. Observa-se que o aumento da massa molar do oligômero
promoveu o aumento do diâmetro hidrodinâmico do bioconjugado. Tal resultado era
esperado, pois a inserção de cadeias maiores à superfície da HbBv afetará o
tamanho do diâmetro hidrodinâmico do bioconjugado.
0 1000 2000 3000 4000 5000
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico
M
w
Figura 85: Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos com
homopolímeros na razão molar de 1:10
0 1000 2000 3000 4000 5000
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
M
w
Figura 86: Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos com
homopolímeros na razão molar de 1:100
128
0 2000 4000 6000 8000 10000
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
M
w
Figura 87: Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos com copolímeros
na razão molar de 1:10
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Diâmetro hidrodinâmico (nm)
M
w
Figura 88: Diâmetro hidrodinâmico versus M
W
dos bioconjugados obtidos com copolímeros
na razão molar de 1:100
129
5.3.5. Avaliação dos bioconjugados quanto a vasoconstrição
Como já citado anteriormente, uma das limitações dos sistemas carreadores
de oxigênio derivados de hemoglobinas modificadas é a alta afinidade da Hb pelo
óxido nítrico e a subsequente resposta hipertensiva.
As amostras HbPA22 (1:100); HbPAS2(1:100); HbPAS4(1:10) e HbPAS12
(1:50) foram avaliadas quanto à vaso constrição. O critério de escolha das amostras
levou em consideração dois fatores. O primeiro fator foi a homogeneidade de
tamanhos de diâmetro hidrodinânico, pois todas as amostras apresentaram 100% do
mesmo tamanho quando avaliadas por espalhamento de luz em percentuais de
volume (amostras centrifugadas). O segundo fator considerou as amostras com
maiores e menores diâmetros hidrodinâmicos. A amostra HbPA22 apresentou 100%
das partículas com tamanho de diâmetro hidrodinâmico igual a 5,954 nm. A amostra
HbPAS4 (1:10) apresentou tamanhos de 6,413 nm. Para a amostra HbPAS2 (1:100)
obteve-se tamanhos de 75,37 nm e para a amostra HbPAS12 (1:50) tamanhos de
127,7 nm.
Anéis de aorta de ratos foram pré-contraídos com fenilefrina (10 μM),
quando o platô de relaxamento foi observado foram adicionadas as amostras na
concentração de 1 μM do bioconjugado para obtenção do fator de reversão do
relaxamento. Esta medida fornece uma relação direta e proporcional da afinidade do
bioconjugado pelo óxido nítrico endógeno.
O fator de reversão do relaxamento para as amostras dos bioconjugados
foram avaliados conforme metodologia apresentada no item 4.2.4. O estudo foi
realizado para as amostras HbPA22 (1:100), HbPAS2(1:100), HbPAS4(1:10) e
HbPAS12 (1:50). Os resultados estão apresentados na Figura 89.
Os valores do fator de reversão para as amostras HbPA22, HbPAS2 e
HbPAS4 foram de 67,78% (±7,14); 52,48% (±10,05) e 51,67 (±5,81)
respectivamente. Estes valores foram comparáveis àquele obtido para a HbBv não
modificada – 60,66% (±8,40). Os resultados mostram que a afinidade dos
bioconjugados pelo NO é semelhante ou levemente menor à da HbBv não
130
modificada. Ou seja, a afinidade dos bioconjugados obtidos são suficientemente
altas para fornecerem resposta hipertensiva. Dessa maneira a administração destes
produtos segue os mesmos cuidados e as mesmas limitações dos produtos já
existentes. Para o caso da Hb humana ligada químicamente nas subunidades alfa,
sugere-se que ela seja administrada juntamente com agentes doadores de NO [76].
Outra forma de aplicação dos derivados de Hb que fornecem resposta hipertensiva é
no tratamento de hipotensão induzida por sepsia.
Figura 89: Fator de correção para as amostras HbBv não modificada
A amostra HBPAS12 apresentou afinidade por NO tão alta que a
administração desta amostra in vivo torna-se comprometedora. O fator de reversão
para esta amostra foi de 96,41% (±11,60) ou seja, 1,6 vezes maior que o da HbBv
não modificada. No entanto, o mesmo sítio de ligação do NO é também o sítio de
ligação da molécula de oxigênio na Hb. E pode ser que a afinidade pela molécula de
O
2
também tenha aumentado. Caso isto tenha acontecido, esta amostra
encapsulada pode originar um bom candidato a um carreador de O
2
temporário.
131
5.3.6. Avaliação dos bioconjugados quanto a interferência em testes clínicos
Outras aplicações desejáveis para os candidatos a carreadores de oxigênio
incluem o tratamento da anemia falciforme, o uso como fluido de ressuscitação,
preservação de órgão para transplante e tratamentos que aplicam circulação
extracorporal. Para todos estes casos o carreador de oxigênio será administrado
juntamente com o sangue humano. Para tais aplicações do carreador de O
2
é
desejável que as interferências nos testes clínicos sejam inferiores ou iguais a 10%
quando comparada ao sangue humano puro.
Já é conhecido que os derivados de Hb para obtenção de carreadores de O
2
interferem em testes laboratoriais de rotina. Para conhecer o quanto o agente
modificador (poliacroleína) interfere nos reagentes utilizados nos testes laboratoriais
afetando o resultado final dos testes clínicos, a amostra HbPA22 foi adicionada ao
sangue humano e os testes clínicos foram realizados. Para tal, 10 mL de sangue
humano foram coletados em dois tubos contendo anticoagulante. O sangue foi
coletado de voluntário saudável, para o tipo sanguineo A e fator Rh positivo. A
amostra foi centrifugada por 5min a 3000g para obtenção do soro. A amostra
HbPA22 (1:100) foi adicionada ao soro na proporção de 1:3 para concentração final
do bioconjugado de 1,4g/dL. Os resultados deste experimento estão apresentados
na Tabela 29.
Tabela 29: Percentuais de interferência nos testes clínicos para o bioconjugado obtido com o
homopolímero PA22 na razão Hb:PA22 igual a 1:100
Análise Metodologia Controle HbPA22 % de interferência
Ácido úrico Método enzimático 1,8 mg/dL 5,4 mg/dL 66
Bilirrubina total Método colorimétrico 0,2 mg/dL 1,3 mg/dL 85
Creatinina Método colorimétrico 0,9 mg/dL 0,7 mg/dL 22
Fosfatase alcalina Método cinético optimizado 49 U/L < 1 U/L > 98
Fósforo Método colorimétrico 4,3 mg/dL 2,5 mg/dL 42
Glicose Método enzimático 78 mg/dL 70 mg/dL 10
TGO Método cinético optimizado-UV 20 U/L 15 U/L 25
TGP Método cinético optimizado-UV 10 U/L 5 U/L 50
Uréia Método enzimático 30 mg/dL 32 U/L 7
132
Os resultados mostraram que apenas para os testes de glicose e uréia os
índices se mostraram dentro dos níveis desejáveis para as aplicações citadas acima.
Acredita-se que o encapsulamento da amostra HbPA22 poderia minimizar estes
efeitos. Cabe ressaltar que o PHP apresentou níveis inaceitáveis para o caso da
análise de bilirubina total e LHD. E dependendo da metodologia empregada
também mostraram índices inaceitáveis as análise de fosfatase alcalina, TGP, TGO
e creatinina. Os índices inaceitáveis não inviabiliza o uso do carreador de O
2
mas
confere a ele grandes limitações de uso.
133
6. CONCLUSÃO
Foram obtidos oligômeros de acroleína e de acroleína-estireno contendo
grupos aldeídos pendentes
A inserção de estireno na cadeia da poliacroleína aumentou a solubilidade
do material em água
Homopolímeros e copolímeros de acroleína mostraram-se reativos em relação
à HbBv, mesmo a baixas concentrações, pois aumentaram o volume hidrodinâmico
da HbBv.
Os novos bioconjugados apresentaram resposta hipertensiva in vivo e
interferência nos testes clínicos
7. SUGESTÕES
Fixar a concentração de polímero para a modificação química da
hemoglobina
Encapsular os bioconjugados obtidos e refazer os experimentos de
vasoconstrição
134
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