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FRAGA, SN
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Nutrição
SIMONE DO NASCIMENTO FRAGA
REPARO ÓS
SEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS
TRONCO EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO
NEONATAL
ORIENTADORA: Profa. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Sílvia Regina Arruda de Moraes
Recife
2009
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FRAGA, SN
Simone do Nascimento Fraga
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS
TRONCO EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO
NEONATAL
ORIENTADORA: Profa. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Sílvia Regina Arruda de Moraes
Recife
2009
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Nutrição do Centro de Ciências da
Saúde, da Universidade Federal de
Pernambuco, para obtenção do
título de Mestre em Nutrição.
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Fraga, Simone do Nascimento
Reparo ósseo com a utilização de células tr
onco
em ratos submetidos à desnutrição neonatal /
Simone
do Nascimento Fraga . – Recife: O Autor, 2009.
82
folhas: il.,
fig.,
tab.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Nutrição, 2009.
Inclui bibliografia, anexos e apêndices.
1.
Desnutrição neonatal
–
Células tronco
.
I.Título.
613.221 CDU (2.ed.) UFPE
574.876 1
CDD (22.ed.)
C
CS200
9
-
0
45
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Simone do Nascimento Fraga
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO
EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NEONATAL
Dissertação aprovada em: 18 de fevereiro de 2009 pela banca examinadora
composta por:
Recife
2009
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Aos que vêem neste estudo uma
esperança de vida!
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FRAGA, SN
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora/ professora Célia Maria Machado Barbosa de Castro, que
me acolheu no laboratório, lutou por mim e me ensinou cada detalhe da pesquisa. É
impossível expressar a admiração que lhe tenho!
Ao colegiado da Pós-graduação em Nutrição da Universidade Federal de
Pernambuco, que apostou na minha capacidade e me acolheu no programa.
À minha família (mainha, painho, Mana e Bal), que sempre me incentivaram e
me apoiaram em todos os momentos da minha vida e que, mesmo com todas as
dificuldades, estiveram sempre ao meu lado me dando força e conselhos para que eu
pudesse seguir.
A Maurício Pimenta, presente em minha vida desde o início da pesquisa, mas de
forma muito especial nos últimos meses, enchendo a minha vida de alegria!
Às amigas Patrícia Brazil, Magdala Azevedo, Denise Sandrelly, Janaína
Almeida e Flávia Salviano, que dividiram comigo cada momento difícil da nossa Pós.
Aos companheiros Maiara Severo, Glívia Barros e Rodrigo Fragoso que
puderam compartilhar comigo muitas experiências adquiridas ao longo do mestrado.
Ao meu amigo Bruno Henrique Galvão, que me ajudou a tomar várias decisões
nesse árduo caminho e com o qual nunca deixo de aprender. A cada conversa que eu
tenho com você, Bruninho, eu aprendo um pouquinho a ser pesquisadora... Obrigada!
À Fátima (Dakotinha), pelos conselhos e apoio que recebi o tempo inteiro. Você
é como uma irmã pra mim!
À amiga Ana Carolina da Cruz, que sempre cuidou de mim nos momentos de
sufoco da pesquisa como se eu fosse sua filha.
Às amigas e amigos do LIKA: Alice, Isabella, Natália, Thacianna, Judith,
Bruno, Rafael, Thaís, Diogo e, especialmente, Ketlin, Dany Cantarelly e Renata, que
assumiram parte desse trabalho como se fosse seus. Obrigada pelos grandes momentos
de descontração e alegria em nossos trabalhos!
À Gabi, Paul e Marvis. Cada conversa que eu tenho com vocês é como se fosse
um aula. Obrigada pelos ensinamentos!
Aos grandes amigos, aliás, aos anjos Ribas e Marcos! Às vezes as pessoas
aparecem em nossas vidas do nada e ficam pra sempre... Muito obrigada por tudo!
Ao professor Nicodemos Teles. Professor, seguirei os seus conselhos e serei
feliz!
Ao colegiado de Nutrição, importantíssimos para nossa formação como mestres.
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À Dr. França e Sr. Paulino, pela disponibilidade dos mesmos para a realização
deste trabalho.
À Dona Neci. Obrigada pela paciência!
À Paloma Lys, Ana Paula Sobral, Mário Melo e Luciano Carvalho, pelos
ensinamentos e amizade.
À Sílvia Arruda de Moraes, pelo apoio no decorrer da pesquisa.
Às amigas Misha, Luciana, Shirley, Candice, Vanessa, Kelly, Taciana, Márcia,
Carol, Sílvia e ao amigo Humberto, por compartilharem comigo muitos bons momentos
da minha caminhada.
À Universidade Federal de Pernambuco, ao Laboratório de Imunopatologia
Keizo Asami e a Capes pelo apoio físico e financeiro para o desenvolvimento desta
pesquisa.
A Deus por permitir a realização deste trabalho.
Aos demais que participaram direta ou indiretamente para a concretização deste
sonho. Muito obrigada!
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FRAGA, SN
Pouca coisa é necessária para
transformar inteiramente uma vida:
amor no coração e sorriso nos lábios.
Martin Luther King
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RESUMO
A desnutrição constitui um problema de saúde pública caracterizado pela baixa ingestão
de nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento do organismo. Pesquisas
que envolvem desnutrição e a sua repercussão na vida adulta relevam que ela é capaz de
provocar alterações na programação metabólica que repercutem ao longo da vida. No
entanto, ainda pouco se conhece sobre as seqüelas envolvendo as células tronco adultas
de medula óssea (CTAMO), especialmente sobre as células tronco mesenquimais em
relação à quantidade e sua capacidade de diferenciação em tecido ósseo. O objetivo
deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o número de células
tronco, bem como avaliar o reparo ósseo com essas células em lesões ósseas de animais
desnutridos. Para isso, utilizou-se 64 ratos machos Wistar, dos quais 32 receberam dieta
padrão (nutridos-N), com 23% de proteínas, e o restante recebeu Dieta Básica Regional
(DBR) (desnutridos-D) com 7,87% de proteínas no período de aleitamento. O peso dos
ratos foi aferido até completarem a idade adulta, quando eles foram subdivididos em 4
grupos (n=8): 1. N que receberam células tronco de N (G1); 2. D que receberam células
tronco de D (G2); 3. N que receberam células tronco de D (G3) e 4. D que receberam
células tronco de N (G4). Os outros ratos (N e D) foram usados como doadores de
CTAMO que foram cultivadas por 12 dias e diferenciadas, in vitro, em osteoblastos que,
por sua vez, foram implantados em defeitos críticos confeccionados nos ossos parietais
dos ratos. Após 60 dias, estes foram eutanasiados e as calotas cranianas processadas
para microscopia óptica. A leitura foi realizada por três patologistas e o índice Kappa
foi utilizado para avaliar o grau de concordância entre eles. Para a análise dos pesos e
do número de células tronco, utilizou-se o teste t-Student (p< 0,05). O teste de Mann-
Whitney foi aplicado quando os resultados não passaram no teste de normalidade. Os
ratos desnutridos tiveram redução do ganho de peso desde o segundo dia de vida,
enquanto que o número de CTAMO não apresentou diferença entre N e D. As células
tronco mesenquimais de D, entretanto, apresentaram-se em maior quantidade.
Observou-se um pequeno grau de reparo ósseo entre os grupos, principalmente entre G2
e G4. Com esses dados, pode-se sugerir que a desnutrição neonatal interfere de forma
permanente na vida adulta, sobre o número e a capacidade regenerativa tecidual das
células tronco mesenquimais de medula óssea. Embora essas células tenham um grande
potencial de diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de
tecidos, a desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu
potencial terapêutico no tecido ósseo.
Palavras-chaves: células tronco, células tronco mesenquimais, desnutrição neonatal,
evolução ponderal, reparo ósseo.
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ABSTRACT
Malnutrition is a public health problem characterized by low intake of essential
nutrients for growth and development of the body. Researches involving malnutrition
and its consequences in adult life shows that it is capable to change the metabolic
programming that impact throughout life. However, little is known about the sequels
involving adult stem cells from bone marrow (ASCBM), especially on the mesenchymal
stem cells for the quantity and its ability to differ into bone tissue. This study aimed to
evaluate the effect of neonatal malnutrition on the number of stem cells and evaluate the
bone repair with these cells in bone lesions of malnourished animals. For that, it was
used 64 Wistar males rats, which 32 received standard diet (nourished-N), with 23%
protein, and the remainder received Basic Diet Regional (BDR) (malnourished-D) with
7.87% of protein in the period of lactation. The weight of the rats was measured by until
adult life, when they were divided into 4 groups (n = 8): 1. N who received stem cells
from N (G1), 2. D who received stem cells from D (G2), 3. N who received stem cells
from D (G3) and 4. D who received stem cells from N (G4). Other rats (N and D) were
used as donors of ASCBM that were cultured for 12 days and differentiated in vitro
into osteoblasts, which were implanted in critical defects up in the parietal bones of rats.
After 60 days, the animals were euthanized and the skull was processed for optical
microscopy. The reading was performed by three pathologists and the Kappa index was
used to rank the degree of agreement between them. For the analysis of the weights and
the number of stem cells, using the Student t-test (p <0.05). The Mann-Whitney test was
applied when the results didn’t pass the test of normality. The malnourished rats were
reduction of weight gain since the second day of life, while the number of ASCBM
showed no difference between N and D. However, the mesenchymal stem cells of D
showed up in greater quantity. There was a small degree of bone repair between the
groups, principaly between G2 and G4. With these data, we can suggest that neonatal
malnutrition interferes in adult life on the number and tissue regenerative capacity of
mesenchymal stem cells from bone marrow in permanent way. Although these cells
have great potential for differentiation, which allows its use for studies of regeneration
of tissues, malnutrition in the critical period is an aggression to reduce its therapeutic
potential in bone tissue.
Key-words: stem cell, mesenchymal stem cell, neonatal malnutrition, ponderal
evolution, bone repair.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Divisão dos grupos experimentais....................................................
35
Figura 2
Procedimentos de coleta de medula óssea........................................
38
Figura 3
Cultura confluente de células tronco mesenquimais........................ 39
Figura 4
Células tronco mesenquimais diferenciadas em osteoblastos.......... 39
Figura 5
Defeitos críticos bilaterais................................................................ 42
Figura 6
Implante dos osteoblasto incorporados ao hidroxiepatita em um
dos defeitos críticos ........................................................................
42
Figura 7
Periósteo reposicionado e suturado.................................................. 42
Figura 8
Sutura dos planos superficiais.......................................................... 42
ILUSTRAÇÕES DO ARTIGO
Figura 1
Evolução ponderal dos grupos N e D durante o período de
aleitamento.........................................................................................
65
Figura 2
Evolução ponderal dos grupo N e D durante o período de reposição
nutricional...........................................................................................
65
Figura 3
Quantidade de CTAMO de ratos dos grupos N e D.......................... 66
Figura 4
Quantidade de CTAM, diferenciadas em osteoblastos, de ratos dos
grupos N e D......................................................................................
66
Figura 5
Defeitos críticos corados em Tricrômico de Masson......................... 68
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Composição centesimal da Dieta Básica Regional (DBR).................... 34
Tabela 2
Composição da dieta padrão utilizada no biotério (LABINA -
Purina®, Agribrands do Brasil Ltda). Valores de enriquecimento por
Kg de ração............................................................................................
34
Tabela 3
Ocorrência de inflamção, tecido ósseo e reparo/fibroplasia ................. 45
Tabela 4
Classificação das características histopatológicas................................. 45
Tabela 5
Coincidência da Kappa.......................................................................... 45
TABELAS DO ARTIGO
Tabela 1
Índice de coincidência entre os avaliadores A x B................................ 67
Tabela 2
Freqüência de parâmetros histológicos por animal segundo o grupo e
os avaliadores.........................................................................................
67
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CO
2
Dióxido de Carbono
CTAMO Células tronco adultas de medula óssea
CTAM Células tronco adultas mesenquimais
D Desnutrido
DMEM Meio de cultura de Dulbecco modificado por Eagle
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
FOP Faculdade de Odontologia de Pernambuco
G1 Grupo 1
G2 Grupo 2
G3 Grupo 3
G4 Grupo 4
C Cavidade Controle
° C Grau centígrado
HE Hematoxilina-eosina
IM Intra-muscular
LIKA Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
MO Medula óssea
N Nutrido
NaCl Cloreto de sódio
PBS Tampão salina fosfato
PVP-I Polivinil-iodopovidona
rpm Rotações por minuto
T Cavidade Teste
TM Tricômico de Masson
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 14
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................... 17
2.1 Células tronco................................................................................................ 17
2.1.1 Definições e propriedades …………………………………………………. 17
2.1.2 Diferentes tipos de células tronco………………………………………….. 18
Embrionárias………………………………………………………………...
18
Adultas……………………………………………………………………....
18
2.2 Tecido ósseo................................................................................................... 19
2.2.1 Composição inorgânica e orgânica do tecido ósseo....................................... 22
Células Osteoprogrenitoras………………………………………………… 22
Osteoblastos…………………………………………………………………
22
Osteócitos…………………………………………………………………... 23
Osteoclastos………………………………………………………………… 22
2.2.2 Mecanismos da formação óssea……………………………………………. 24
Intramembranosa…………………………………………………………… 24
Endocondral…………………………………………………………………
25
2.2.3 Osteogênese, osteoindução e osteocondução………………………………. 25
Osteogênese.................................................................................................... 26
Osteoindução.................................................................................................. 26
Osteocondução............................................................................................... 26
2.3 Terapia celular e Reparo ósseo...................................................................... 26
2.4 Período crítico e desnutrição neonatal.......................................................... 28
2.5 Terapia celular e desnutrição........................................................................ 30
3 MÉTODOS....................................................................................................
33
3.1 Desenho do Estudo......................................................................................... 33
3.2 Seleção da Amostra........................................................................................ 33
3.3 Divisão dos Grupos........................................................................................ 33
3.4 Acompanhamento da evolução ponderal....................................................... 35
3.5 Acondicionamento dos Animais..................................................................... 35
3.6 Coleta de medula óssea, cultura de células tronco e diferenciação em
osteoblastos....................................................................................................
36
3.6.1 Coleta de medula óssea.................................................................................. 36
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3.6.2 Cultura de células tronco e diferenciação em osteoblastos............................ 39
3.7 Anestesia geral............................................................................................... 39
3.8 Procedimentos pré-cirúrgicos........................................................................ 40
3.9 Procedimento cirúrgico.................................................................................. 40
3.10 Defeitos críticos e determinação das cavidades............................................ 40
3.11 Técnica cirúrgica............................................................................................
41
3.11.1
Implante dos osteoblastos............................................................................... 42
3.12 Etapa final da cirurgia................................................................................... 42
3.13
Cuidados pós
-operatórios………………………………………………….......... 43
3.14
Eutanásia dos animais
………………………………………………………........
43
3.15 Obtenção do material para análise histológica............................................. 43
3.16 Processamento do material para análise histológica.................................... 44
3.17 Análise histológica......................................................................................... 44
3.18 Análise estatística........................................................................................... 45
3.19 Considerações bioéticas................................................................................. 46
4 RESULTADOS............................................................................................. 47
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................
69
6 REFERÊNCIAS........................................................................................... 71
7 APÊNDICES................................................................................................. 79
ANEXOS....................................................................................................... 82
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14
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, uma especial atenção tem sido dada ao processo de transição
nutricional, caracterizada pelo aumento da prevalência do sobrepeso e da obesidade, e
pela diminuição da prevalência da desnutrição (KAC & VELÁSQUEZ-MELÉNDEZ,
2003). No entanto, a desnutrição ainda é uma realidade bastante persistente,
principalmente em países em desenvolvimento.
Estudos que envolvem as conseqüências da desnutrição têm mostrado que ela é
capaz de provocar uma série de alterações morfológicas e funcionais que podem
repercutir por toda a vida do indivíduo afetado (HALES & OZANNE, 2003; BARKER,
ERIKSSON, OSMOND, 2002). Estas alterações podem ocorrer em sistemas
fisiológicos, como sistema nervoso, muscular e imunológico.
Diversos estudos têm revelado as agressões sofridas pelo sistema nervoso
periférico, quando submetido a um processo de desnutrição protéica. Além de alterações
estruturais como a diminuição na espessura e na organização da bainha de mielina,
podem ser identificadas também alterações na velocidade de condução nervosa
(OLDFORS, 1982; OLDFORS, 1980).
Em outros estudos, onde foram abordados o binômio sistema imune e
desnutrição, observou-se que a deficiência nutricional está comumente associada com o
dano a respostas imunológicas, particularmente a imunidade mediada por células,
função fagocitária, produção de citocinas, secreção de anticorpos e afinidade dos
anticorpos ao sistema complemento (CHANDRA & NEWBERNE, 1977; GERSHWIN
ET AL, 1984; BENDICH & CHANDRA, 1990; CHANDRA, 1992b).
Além de outros sistemas fisiológicos que são afetados pela desnutrição, merece
destaque o sistema ósseo (CAMPOS, 2001). A baixa ingestão de proteínas e
carboidratos, de acordo com o Mardon et al. (2008) contribui para o aumento da
incidência da osteoporose em idosos. Embora existam vários estudos sobre a
desnutrição e a osteoporose, pouco se conhece sobre o impacto da desnutrição sobre os
mecanismos de reconstituição óssea diante do trauma na idade adulta.
A reconstituição do trauma ósseo tem sido bem estudada nas últimas décadas.
Para tal, muitas tecnologias vêm sendo testadas em cirurgias de reconstituição óssea,
tais como: resinas poliuretanas vegetais (PURICCELLI et al., 1999), plasma rico em
plaquetas (AGHALOO, MOY, FREYMILLER, 2002) e mais recentemente ultra-som
(SCHORTINGHUIS et al., 2004), porém, a maioria dessas técnicas além de serem
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15
onerosas, não reduz a morbidade clínica particularmente, em pacientes que tiveram
história prévia de desnutrição.
A terapia celular, especialmente a terapia com células tronco, é uma alternativa
terapêutica que vem tomando muito espaço no mundo científico. Estas células, que
podem ser encontradas no músculo, na placenta, no cordão umbilical, na medula óssea e
até mesmo em embriões em suas primeiras fases de desenvolvimento, têm um grande
potencial de se diferenciar de forma funcional em várias células e, dessa forma,
recuperar tecidos lesionados.
As células tronco adultas de medula óssea (CTAMO) são células multipotentes
(KUMAR, CHANDA, PONNAZHAGAN, 2008) e constituem-se de três tipos
celulares: células tronco hematopoiéticas, responsáveis pela produção de células
sanguíneas; células tronco endoteliais e, por último, células tronco adultas
mesenquimais (CTAM) (KREBSBACH et al., 1999), sendo estas correspondendo à
cerca de 0,001% - 0,01% das células da medula óssea humana (PITTENGER et al.,
1999). As CTAM são capazes de se multiplicar e se diferenciar nos diversos tipos de
tecidos do corpo e a sua manipulação experimental é possível devido à sua fácil
separação in vitro.
A pluripotencialidade das células tronco induz a hipótese de que a quantidade de
células tronco em organismos que passaram por privação nutricional no período de
aleitamento sofre interferência negativa. Ainda, o reparo ósseo com o uso dessas células
não tem a mesma eficácia que as células de organismos normais, já que a desnutrição
neonatal é capaz de alterar várias funções fisiológicas. Com base em recentes trabalhos
sobre regeneração tecidual com células tronco, acredita-se na possibilidade de que as
essas células possam ser usadas como uma alternativa terapêutica para consolidar
fraturas ósseas, mesmo que o organismo tenha passado por um processo de privação
nutricional no período crítico de crescimento e desenvolvimento.
Pretende-se, com este estudo, consolidar as hipóteses propostas tomando como
base as informações mais recentes que se dispõem na literatura. Assim, o objetivo deste
trabalho foi avaliar a evolução ponderal de animais nutridos (N) e desnutridos (D) e o
número de CTAMO, particularmente as CTAM, entre os dois grupos. Através de
análises histológicas, pretende-se ainda, avaliar o potencial das CTAM de medula óssea,
diferenciadas in vitro em osteoblastos, no reparo do tecido ósseo em animais
desnutridos.
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16
Este trabalho resultou na confecção de um artigo que será submetido a uma
revista internacional. O trabalho envolverá apenas parte dos resultados obtidos, como a
associação da desnutrição com a quantidade de células tronco, bem como as análises
histológicas do reparo ósseo em cada grupo proposto.
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17
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Células tronco
2.1.1 Definições e propriedades
Células tronco são células progenitoras indiferenciadas que têm a capacidade de
se transformar numa grande variedade de células diferenciadas funcionais, tais como
osteoblastos, condrócitos, adipócitos, células musculares e outras células do corpo
(MUGURUMA et al, 2008; CAPLAN, 2005; FUKUCHI et al., 2004; SUN et al., 2003;
REYES et al., 2001; LIECHT et al., 2000). Elas podem ser encontradas no músculo, na
placenta, no cordão umbilical, na medula óssea e até mesmo em embriões nas suas
primeiras fases de desenvolvimento.
As células tronco e as células progenitoras, que são células com um pequeno
grau de diferenciação, estão presentes em praticamente todos os tecidos humanos
normais e são fundamentais para sua saúde, manutenção e resposta a lesões ou doenças
durante a vida. Estas células são a fonte de todos os tecidos novos formados pelos
sistemas de reparo e remodelação e são moduladas por sinais químicos e físicos que
controlam sua ativação, proliferação, migração, diferenciação e sobrevida (BIANCO et
al., 2001).
De acordo com Beresford (1989), a célula tronco é um tipo especial de célula
que tem a capacidade única de se auto-renovar e dar origem a células especializadas.
Embora a maioria das células do corpo, como as células cardíacas e da pele, estejam
destinadas a realizar funções específicas, a célula tronco é indiferenciada e permanece
neste estado até que receba um sinal para se transformar em uma célula especializada
(CAPLAN, 2005).
Muschler & Midura (2002) destacam que as células tronco são células em
repouso que apresentam as propriedades de divisão celular assimétrica e a de auto-
renovação. Nestes processos, estas células são ativadas por algum sinal ou evento para
deixar seu estado de repouso e se dividir. No entanto, o resultado desta divisão celular
resulta em duas células filhas que não são idênticas. Uma célula filha prolifera
simetricamente, geralmente por muitas divisões, originando um grande número de
células, cada uma denominada célula progenitora. Estas células progenitoras
posteriormente se diferenciam para formar os tecidos maduros. Em contraste, a outra
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18
célula filha retorna ao estado original de repouso da célula mãe, até que um novo sinal
ou evento ocorra, e possui o mesmo fenótipo e todas as propriedades da célula tronco
original, que caracteriza o processo de auto-renovação.
O processo de auto-renovação, de acordo com os estudos de Lin (1998), tem
grande relevância já que, se todas as células filhas se tornassem células progenitoras, a
população de células tronco diminuiria progressivamente a partir de cada evento de
ativação. Este fenômeno resultaria em uma depleção rápida da população destas células
de todos os tecidos normais, resultando em um número insuficiente para suportar os
processos de remodelação e reparo necessários para a manutenção, em longo prazo, da
saúde do organismo.
2.1.2 Diferentes tipos de células tronco
As células tronco são classificadas de acordo com sua plasticidade, isto é, seu
potencial de diferenciação nos diversos tecidos (PERES & CURI, 2005). Desta forma,
elas podem ser do tipo:
Embrionárias
São células totipotentes, ou seja, têm uma grande capacidade de diferenciação e
de divisão. Este tipo de célula pode se diferenciar em todos os tipos de tecidos do corpo.
Adultas
São células pluripotentes que têm a capacidade de se diferenciar em muitos
tecidos, porém não em todos. Seu potencial de replicação, diferentemente das
embrionárias, é limitado. As células tronco adultas podem ser encontradas em diversos
tecidos do corpo: reservas endógenas teciduais, sangue periférico, placenta e sangue do
cordão umbilical, células perivasculares e medula óssea, sendo esta a que mais se
destaca devido a sua disponibilidade imediata e reserva praticamente ilimitada
(MUSCHLER et al., 2004).
A medula óssea tem uma população de células tronco adultas constituída de
células da linhagem hematopoiética e da linhagem mesenquimal (KREBSBACH et al.,
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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19
1999), sendo estas correspondendo à cerca de 0,001% - 0,01% das células da medula
óssea humana (PITTENGER et al., 1999) e sendo ainda capazes de se multiplicarem e
se diferenciarem nos mais diversos tipos de tecidos do corpo. De acordo com Slack
(2000), as células tronco adultas humanas são capazes de manter, gerar e substituir
células terminalmente diferenciadas em seus tecidos específicos como uma
conseqüência de turnover celular fisiológico ou regeneração tecidual devido à injúria.
As células tronco mesenquimais (CTAM) da medula óssea são células adultas e
multipotentes (KUMAR, CHANDA, PONNAZHAGAN, 2008) que têm algumas
características que as distinguem das células tronco hematopoiéticas, e esses dois tipos
celulares são de fácil separação in vitro. Quando a medula óssea é dissociada e o
material é coletado em um gradiente de concentração, as células tronco mesenquimais,
quando dispensadas em frascos próprios para cultivo, aderem-se à superfície destes
frascos, enquanto as células tronco hematopoiéticas não possuem essa capacidade de
adesão (JAVAZON et al. & KIRSCHSTEIN, 2001).
Apesar das células tronco embrionárias terem um grande potencial formador de
órgãos e tecidos, a alta demanda técnica para sua obtenção e cultura, o difícil controle
da sua proliferação (podendo resultar em neoplasias), os problemas de
histocompatibilidade e os aspectos éticos e religiosos de sua utilização fizeram o
interesse dos pesquisadores se dirigirem às células tronco pluripotentes adultas
(GRIFFITH; NAUGHTON, 2002).
2.2 Tecido ósseo
O osso é uma forma especializada do tecido conjuntivo que, assim como outros
tecidos conjuntivos, é constituído por células e matriz extracelular. O íon responsável
por manter esta matriz rígida é o cálcio, na forma de cristais de hidroxiapatita
[Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
]. O osso funciona como depósito de cálcio, fosfato e outros íons,
armazenando-os e liberando-os de maneira controlada, mantendo constante a
concentração destes nos líquidos corporais (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
O osso é um tecido de suporte que se caracteriza por representar o tecido de
maior diferenciação na evolução dos tecidos. A elaboração de fibras colágenas no tecido
conjuntivo e a mineralização no tecido ósseo representam os passos mais importantes
nesta evolução. Além do seu excelente comportamento biomecânico, o tecido ósseo
revela um potencial único para regeneração, pois é capaz de curar fraturas ou defeitos
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20
locais com tecido regenerado de igual organização estrutural sem deixar cicatriz. De
acordo com Schenk (1994), o mecanismo deste padrão de reparação é muitas vezes
considerado uma recapitulação da osteogênese embrionária e do crescimento.
A estrutura rígida do osso permite-lhe suportar forças de tensão e de compressão
intensas e, desta forma, apresentar um comportamento marcadamente dinâmico. Ele
confere proteção para órgãos vitais e frágeis, como aqueles contidos nas cavidades
craniana, torácica e no canal raquidiano. Além disso, forma um arcabouço de suporte
para a posição ortostática e para a locomoção e aloja e protege a medula óssea,
produtora das células sanguíneas e mesenquimais (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004,
KESSEL, 2001).
A observação macroscópica da superfície de um osso seccionado de forma
transversal revela que, estruturalmente, ele é composto por dois tipos de tecidos: o
compacto (cortical) e o esponjoso. O tecido compacto situa-se na superfície externa e o
tecido esponjoso, que é trabeculado, situa-se na porção interna dos ossos. A diferença
entre os dois tecidos se dá pelo tamanho e pelo número de espaços em seu interior
(VIEIRA, 1999; SCHENK, 1994).
Já microscopicamente, dois tipos de tecido ósseo são observados: o tecido ósseo
primário, imaturo ou trabecular, e o tecido ósseo secundário, maduro ou lamelar. O
tecido ósseo primário é uma forma imatura de osso, visto que é o primeiro osso a se
formar durante o desenvolvimento fetal e durante a reparação óssea, sendo muito pouco
freqüente no indivíduo adulto, no qual persiste apenas próximo às suturas dos ossos do
crânio, nos alvéolos dentários e em alguns pontos de inserção dos tendões. Ele possui
abundantes osteócitos e feixes de colágeno sem direção definida. Seu conteúdo mineral
é muito menor que o do tecido ósseo secundário (GARTNER; HIATT, 1999).
O tecido ósseo secundário é o tipo freqüentemente encontrado nos adultos.
Possui fibras colágenas organizadas em lamelas de 3 a 7 µm de espessura, dispostas
paralelas umas às outras ou em camadas concêntricas ao redor de canais com vasos,
formando o sistema de Havers ou ósteons. Cada sistema de Havers corresponde a um
cilindro longo, às vezes bifurcado, orientado paralelamente à diáfise e formado por um
número variável de lamelas ósseas concêntricas. No centro deste cilindro ósseo, existe
um canal revestido de endósteo, denominado canal de Havers, que contém vasos e
nervos. Os canais de Havers comunicam-se entre si, com a cavidade medular e com a
superfície externa dos ossos por meio de canais transversais ou oblíquos, denominados
canais de Volkmann, que se distinguem dos anteriores por não apresentarem lamelas
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21
ósseas concêntricas e atravessarem as lamelas ósseas. Todos os canais vasculares
existentes no tecido ósseo originam-se quando a matriz óssea se forma ao redor dos
vasos pré-existentes (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
As lacunas contendo os osteócitos estão, em geral, situadas entre as lamelas
ósseas, porém algumas vezes estão dentro delas. Separando grupos de lamelas, existe
um acúmulo de substância cimentante que consiste em matriz mineralizada, porém com
muito pouco colágeno. Na diáfise dos ossos longos, as lamelas ósseas se organizam em
arranjos típicos, constituindo além dos sistemas de Havers, os sistemas circunferenciais
externos, internos e intermediários. O sistema circunferencial externo situa-se logo
abaixo do periósteo e forma a região mais externa da diáfise, contendo fibras de
Sharpey que ligam o periósteo ao osso (CILLINAME, 2002).
O sistema circunferencial interno, análogo ao externo, mas não tão extenso
quanto ele, circunda completamente a cavidade medular. Trabéculas de osso esponjoso
se estendem do sistema circunferencial interno até a cavidade medular, interrompendo o
revestimento de endósteo do sistema circunferencial interno (GARTNER; HIATT,
1999). Entre os dois sistemas circunferenciais encontram-se inúmeros sistemas de
Havers e grupos irregulares de lamelas, geralmente de forma triangular, denominadas
lamelas intersticiais ou sistema intermediário, que provêm de restos de sistemas de
Havers que foram destruídos durante o crescimento do osso. O tecido ósseo secundário
que contém sistemas de Havers é característico da diáfise de ossos longos, embora
sistemas de Havers pequenos possam ser encontrados em osso compacto de outros
locais (KATCHBURIAN & ARANA, 1999).
O osso é circundado, exceto nas superfícies articulares, por uma membrana
fibrosa denominada periósteo, através da qual vasos sanguíneos, linfáticos e fibras
nervosas penetram no tecido ósseo. O periósteo é composto de duas camadas, sendo a
externa constituída principalmente de tecido conjuntivo rico em colágeno e fibroblastos
e a interna, mais delgada, composta principalmente por fibras elásticas e células
osteoprogenitoras responsáveis pela ossificação da superfície externa do osso imaturo.
O periósteo do osso imaturo é espesso, vascularizado e muito aderente, já o do osso
maduro é fino, pouco vascularizado e contém baixa concentração de fibroblastos em sua
camada externa (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; SCHENK, 1994).
A superfície interna da camada cortical é revestida por uma fina membrana
chamada endósteo, que geralmente contém uma camada de células achatadas com
potencial osteogênico. As principais funções do endósteo e do periósteo são a nutrição
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22
do tecido ósseo e o fornecimento de novos osteoblastos para o crescimento e a
recuperação do osso (GARTNER; HIATT, 1999).
2.2.1 Composição inorgânica e orgânica do tecido ósseo
O tecido ósseo é constituído por uma porção inorgânica, cujos principais
elementos são o cálcio e sais de fósforo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004) bem
como por uma porção orgânica, que é formada basicamente por células tais como:
células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e os osteoclastos (KESSEL, 2001).
Células Osteoprogrenitoras
As células osteoprogenitoras estão localizadas na camada celular interna do
periósteo, revestindo os canais Havers e o endósteo. Estas células são derivadas do
mesênquima embrionário e são capazes de sofrer divisão mitótica e de se diferenciar em
osteoblastos. Morfologicamente, são células fusiformes que possuem núcleo oval e
citoplasma escasso com retículos endoplasmáticos rugosos esparsos e um complexo de
Golgi pouco desenvolvido. Quando impostas a condições de baixa oxigenação, estas
células podem se diferenciar em células condrogênicas. Períodos de intenso crescimento
ósseo são capazes de provocar uma maior ativação das mesmas (HENG et al, 2004;
GARTNER; HIATT, 1999).
Osteoblastos
Os osteoblastos são células ósseas imaturas derivadas das células
osteoprogenitoras e apresentam grande potencial osteogênico. São células
mononucleares derivadas do mesênquima (CILLINAME, 2002).
Eles sintetizam a parte orgânica da matriz óssea (colágeno tipo I, proteoglicanos
e glicoproteínas) e são capazes de concentrar fosfato de cálcio, participando, desta
forma, da mineralização da matriz. A matriz óssea recém-formada, adjacente aos
osteoblastos ativos, e que ainda não está calcificada, recebe o nome de osteóide
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 1999; ROSS; ROMRELL,
1993).
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Os osteoblastos dispõem-se na superfície óssea lado a lado, num arranjo que
lembra um epitélio simples. Quando em intensa atividade sintética, se apresentam
cubóides com o citoplasma muito basófilo; porém, em estado pouco ativo, tornam-se
achatados e a basofilia citoplasmática diminui (KESSEL, 2001).
Estas células exibem aparelhos de Golgi e retículo endoplasmático rugoso bem
desenvolvido, organelas que caracterizam sua atividade secretora (GARTNER; HIATT,
1999).
Osteócitos
Os osteócitos são osteoblastos maduros. São células encontradas no interior da
matriz óssea, ocupando as lacunas. Das lacunas partem canalículos dentro dos quais os
prolongamentos dos osteócitos estabelecem contatos através de junções comunicantes, o
que permite a passagem de pequenas moléculas e íons de um osteócito para outro. Cada
lacuna contém apenas um osteócito de morfologia achatada, que exibe reduzido
citoplasma perinuclear com pequena quantidade de retículo endoplasmático rugoso e
aparelho de Golgi pouco desenvolvido. Os osteócitos são essenciais para a manutenção
da matriz óssea e sua morte é seguida por reabsorção da matriz. Já que os osteócitos são
osteoblastos maduros, pode-se afirmar que eles são células mononucleares derivadas do
mesênquima (CILLINAME, 2002).
Osteoclastos
Os osteoclastos são originados de macrófagos (células do sistema fagocítico
mononuclear) que estão presentes no tecido ósseo (ABBAS & LICHTMAN, 2005). São
células móveis, gigantes e multinucleadas que se localizam, principalmente, sobre a
superfície endóstica do córtex e, às vezes, ao redor das trabéculas, sendo encarregadas
da absorção óssea. Os osteoclastos são ricos em fosfatase ácida, colagenase,
desidrogenase, protease e anidrase carbônica e são derivados das células precursoras
mononucleadas provenientes da medula óssea. Freqüentemente, nas áreas de reabsorção
de tecido ósseo encontram-se porções dilatadas dos osteoclastos, situadas em depressões
da matriz escavada por sua atividade, as quais são conhecidas como lacunas de
Howship. Os osteoclastos apresentam citoplasma granuloso, algumas vezes com
vacúolos, fracamente basófilo nos osteoclastos jovens e acidófilo nos maduros. A
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24
superfície do osteoclasto que está em contato com o osso apresenta uma borda-em-
escova e, logo abaixo desta estrutura, ele apresenta um citoplasma com aspecto
espumoso (GARTNER; HIATT, 1999). A atividade dos osteoclastos é coordenada por
citocinas e por hormônios como a calcitonina e o paratormônio (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 1999; ROSS; ROMRELL, 1993).
2.2.2 Mecanismos da formação óssea
Embriologicamente, o tecido ósseo é derivado do mesênquima e sua formação se
inicia como condensações de células mesenquimais que podem sofrer basicamente dois
tipos de ossificação: intramembranosa e endocondral.
Intramembranosa
É a formação do tecido ósseo através da diferenciação das células mesenquimais
em osteoblastos. Em humanos, a primeira evidência de ossificação intramembranosa
ocorre por volta da oitava semana de gestação. As células mesenquimais alongadas
situadas no mesênquima frouxo migram e se agregam em áreas específicas, onde o osso
será formado. Esta condensação de células no interior do tecido mesenquimal é a
“membrana”, a qual a denominação ossificação intramembranosa se refere. O local da
membrana conjuntiva, onde ocorre o início da ossificação é denominado centro de
ossificação primária (ROSS; ROMRELL, 1993).
O processo continua com a diferenciação das células mesenquimais em
osteoblastos que sintetizam o osteóide (matriz óssea não mineralizada composta de
colágeno e proteoglicanos) que logo se mineraliza e aprisiona alguns osteoblastos que
irão se diferenciar em osteócitos. Como vários destes grupos surgem simultaneamente
no centro de ossificação, há confluência das traves ósseas formadas, dando ao osso um
aspecto esponjoso. Entre as traves, formam-se cavidades que são penetradas por vasos
sanguíneos e células mesenquimais indiferenciadas que originarão a medula óssea
(KESSEL, 2001).
Concomitantemente, as células primitivas circundantes situadas na “membrana”
proliferam, dando origem a uma população de células denominadas osteoprogenitoras.
Estas células se mantêm em número através de atividade mitótica contínua e, portanto,
constituem uma fonte constante de osteoblastos para o crescimento das espículas ósseas.
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Os osteoblastos, entretanto, são células diferenciadas que não se dividem (ROSS;
ROMRELL, 1993).
Nos ossos chatos do crânio verifica-se um predomínio acentuado da formação
sobre a reabsorção de tecido ósseo nas superfícies internas e externas, assim formam-se
duas tábuas de osso compacto (cortical), enquanto o centro permanece esponjoso. A
parte da membrana que não sofre ossificação passa a constituir o endósteo e o periósteo.
Este processo de ossificação é o responsável pela formação dos ossos frontal, parietal e
de partes do occipital, do temporal, da maxila e da mandíbula (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2004).
Endocondral
Inicia-se com a proliferação e a agregação de células mesenquimais no local de
formação do futuro osso. Estas células se diferenciam em condroblastos que produzem
matriz cartilaginosa do tipo hialina. Esta cartilagem, produzida neste estágio inicial,
possui forma e a aparência do osso que será formado. Os eventos posteriores à formação
da cartilagem seguem com hipertrofia dos condrócitos, redução de sua matriz a finos
tabiques, mineralização da matriz e, por fim, morte dos condrócitos por apoptose. As
lacunas que eram previamente ocupadas pelos condrócitos são invadidas por capilares
sangüíneos que trazem células osteogênicas provenientes do conjuntivo adjacente. Estas
células diferenciam-se em osteoblastos que depositam matriz óssea sobre os tabiques de
cartilagem calcificada, formando tecido ósseo onde antes havia tecido cartilaginoso.
Este tipo de ossificação é o principal responsável pela formação dos ossos curtos e
longos (ROSS; ROMRELL, 1993).
2.2.3 Osteogênese, osteoindução e osteocondução
Três diferentes mecanismos biológicos podem levar ao processo de neoformação
óssea, porém cada um destes mecanismos apresenta características específicas. Entre
estes, encontram-se a osteogênese, a osteoindução e a osteocondução (LEVIN et al.,
1995).
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Osteogênese
Osteogênese é a capacidade de produção direta de tecido ósseo pelas células
vivas presentes no osso. O osso esponjoso, que possui maior superfície coberta por
células, tem um maior potencial de osteogênese que o osso cortical (GOLDBERG;
STEVENSON, 1993).
Osteoindução
Processo através do qual um tecido atua sobre o outro para induzir a
diferenciação celular (URIST et al., 1967). O osso possui esta propriedade graças a uma
série de proteínas conhecidas como Bone Morphogenic Proteins (BMPs), ou proteínas
morfogenéticas óssea. Elas desempenham a função de estimular as células
mesenquimais indiferenciadas a se tornarem células osteoprogenitoras que,
eventualmente, formarão novo osso (CLOKIE et al., 2002).
Osteocondução
O termo osteocondução aplica-se ao processo tridimensional observado quando
estruturas porosas são implantadas no osso ou adjacências. O processo é caracterizado
por um crescimento inicial de tecido fibrovascular que invade a estrutura e é seguido
por deposição de osso novo diretamente sobre ela (CORNELL & LANE, 1998).
2.3 Terapia celular e Reparo ósseo
A engenharia de tecidos, que se baseia no uso de células para cura de doenças, é
uma área interdisciplinar que combina e aplica princípios da engenharia e das ciências
biológicas para o desenvolvimento de substitutos biológicos na reposição, manutenção e
melhoramento da função tecidual. Atualmente, as pesquisas nesta área estão voltadas
para o desenvolvimento na produção de estruturas e de órgãos para implantação, no
intuito de eliminar a morbidade decorrente do sítio doador.
As células do estroma da medula óssea recriam um meio embrionário em tecidos
adultos lesados, pois segundo os estudos de Petite et al. (2000), elas estão
comprometidas com a regeneração tecidual. Tais células têm propensão a se aderir em
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27
cultura, permitindo-se serem isoladas de outras células medulares, sendo possível
verificar a sua proliferação e diferenciação em osteoblastos, condroblastos, mioblastos e
adipócitos.
Okubo et al. (2000) descreveram que os osteoblastos, condrócitos, miócitos, e
adipócitos derivam-se de células progenitoras oriundas das células mesenquimais
indiferenciadas. Essas células estão presentes em diversos locais, como tecido ósseo,
muscular, subcutâneo e adiposo.
Tugerman et al. (2001), buscando utilizar as células mesenquimais
indiferenciadas como uma forma de terapia gênica no tratamento de lesões ósseas,
realizaram um trabalho in vitro no qual transfectaram essas células derivadas da medula
óssea com o vetor de adenovírus recombinante contendo a BMP-2 humana. Com as
células transfectadas em cultura, observaram claramente a proliferação e a diferenciação
osteogênica das células mesenquimais, enquanto que, in vivo, tais células, depois de
transplantadas no radio de ratos, foram capazes de formar osso e cartilagem, além de
regenerar defeitos ósseos.
Atualmente, a terapia celular é uma excelente alternativa para a cura de doenças
crônico-degenerativas. As possibilidades de emprego de células tronco são inúmeras, e
envolvem modelos que permitem avançar nos conhecimentos acerca dos mecanismos de
proliferação e diferenciação celular, que são imprescindíveis para a compreensão e para
o tratamento de neoplasias e de doenças degenerativas (VOGEL, 2002).
A importância destas células para a medicina regenerativa reside no fato que,
além de seu grande potencial de diferenciação, sendo estas do próprio paciente, não
correm o risco de serem rejeitadas pelo sistema imunológico do mesmo.
Para utilização clínica, o substituto ósseo ideal deve ser biocompatível, ter boas
propriedades mecânicas e demonstrar osteoindução, ou pelo menos osteocondução
(DUPOIRIEUX et al., 1994). Independente do substituto ósseo a ser utilizado, este
deverá promover a neoformação óssea.
De acordo com Muschler et al. (1997), o aspirado de medula óssea é a fonte
mais acessível de células tronco mesenquimais pluripotentes adultas, contendo uma
média de quarenta milhões de células nucleadas por mililitro. Para Krebscach et al.
(1998) o estroma da medula óssea consiste de uma população heterogênea de células
que fornece suporte estrutural e fisiológico para as células hematopoiéticas.
Adicionalmente, esse estroma contém células com características de células tronco, as
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quais se diferenciam em osso, cartilagem, adipócitos, além de se constituírem num
suporte hematopoiético para os tecidos.
O transplante de células tronco mesenquimais tem como objetivo compensar
uma deficiência no número e/ou atividade destas células no local interessado, que pode
ocorrer por traumatismos prévios, infecção, irradiação prévia, defeitos teciduais,
cicatrizes ou deficiência vascular (MUSCHLER et al., 2004). Este transplante pode
melhorar a evolução dos enxertos osteocondutivos e osteoindutores, mesmo nos locais
envolvidos por tecidos sadios. Isto sugere que mesmo a cicatrização de tecidos normais
pode ser limitada pela deficiência das células tronco mesenquimais (MUSCHLER et al.,
2004). Diante disso, há grande importância do provimento adicional de células tronco
no local de formação óssea (CURYLO et al., 1997; WERNTZ et al., 1996; GRUNDEL
et al., 1991; LINDHOLM et al., 1988; TAKAGI et al.,1982).
A partir destas considerações biológicas, vários estudos buscaram desenvolver
técnicas para implantação direta de células tronco mesenquimais no local necessitado de
formação óssea, trazendo benefícios tanto para fraturas com dificuldade para
consolidação quanto para os pacientes experimentando um declínio na quantidade de
células osteoprogenitoras disponíveis, como nos idosos, na osteoporose e em outros
distúrbios metabólicos (PITTENGER et al., 1999; QUARTO et al., 1995; TSUJI et al.,
1990).
2.4 Período crítico e desnutrição neonatal
Durante o período crítico de crescimento e desenvolvimento, existe uma “janela
precoce de plasticidade fisiológica”, que se define como o período em que diversos
sistemas estão muito susceptíveis a estímulos ambientais (MORGANE et al, 1978;
WINICK & COOMBS, 1972), podendo estes estímulos serem originados de qualquer
tipo de situação hostil ao desenvolvimento fisiológico.
A relação entre a desnutrição precoce e a repercussão na vida adulta vem sendo
explorada há várias décadas (WEELS, 2003; BARKER, ERIKSSON, OSMOND, 2002;
OZANNE, HALES, 1999; LUCAS, FEWTRELL, COLE, 1999). Desde então,
Widdowson e McCance (1960) demonstraram que o tamanho de ratos adultos está
relacionado ao seu estado nutricional no período de lactação. Assim, desde que foram
observados os efeitos irreversíveis da desnutrição neonatal sobre o desenvolvimento do
cérebro, formulou-se a hipótese dos períodos críticos de desenvolvimento (DAVISON;
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DOBBING, 1968) em que a formação e a diferenciação dos tecidos são bastante
influenciadas por estímulos diversos. De acordo com estudos desenvolvidos por Kehoe
et al. (2001) e Medeiros (1998), a desnutrição precoce ou neonatal em animais, é o tipo
de estímulo que pode provocar a ocorrência de alterações somáticas, fisiológicas e
comportamentais.
Os efeitos da programação metabólica induzidos por experiências nutricionais
alteradas no período pós-natal imediato podem causar conseqüências em longo prazo no
contexto atual da “epidemia da obesidade” (SRINIVASAN & PATEL, 2008). De
acordo com os resultados da pesquisa de Remmers et al. (2008), que usou ratos Wistar
como modelo experimental, a restrição alimentar neonatal programa ratos machos e
fêmeas para permanecerem pequenos e magros na vida adulta. Segundo este autor, o
baixo nível de leptina neonatal pode desempenhar um importante papel neste processo.
Estes achados podem ser explicados por Lipsitt, Crook e Booth (1985), em que a
aquisição de matéria-prima essencial e de fontes de energia do meio, no início da vida, é
importante para o crescimento bem como para o desenvolvimento físico e psicológico.
Kennedy (1957) relatou que a primeira semana de vida é crítica, e o peso do
animal (rato) nesta semana, determinou a ingestão alimentar e o peso corpóreo para o
resto da vida. Da mesma forma, ratos adultos submetidos à desnutrição neonatal
apresentam uma diminuição no tamanho do cérebro e na concentração de substâncias do
hipotálamo e do hipocampo (KEHOE et al., 2001) e, mesmo depois de um período
longo de recuperação nutricional, este tipo de estímulo ambiental foi capaz de afetar o
sistema serotoninérgico de ratos adultos (MEDEIROS, 1998).
Além disso, observações clínicas e estudos epidemiológicos sustentam o
conceito de que a deficiência nutricional aumenta a freqüência e a gravidade das
infecções (LANDGRAF et al., 2005). De acordo com Peters-Golden et al. (2004), a
desnutrição é uma importante causa de imunossupressão, visto que impede o
desenvolvimento e a diferenciação do sistema imune normal (LANDGRAF et al.,
2007).
Ainda no período neonatal, as modificações nutricionais podem alterar aspectos
relacionados ao desenvolvimento dos diversos sistemas fisiológicos, uma vez que esta é
uma fase de rápida proliferação e diferenciação celular (MORGANE et al., 2002, 1978).
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30
2.5 Terapia celular e desnutrição
Estudos experimentais têm mostrado que deficiências nutricionais e outras
influências que reduzem o crescimento durante o “período crítico da vida” pode afetar
permanentemente a estrutura e fisiologia de vários órgãos e tecidos (POULTER, 2001;
GODFREY & BARKER, 2000). A desnutrição energético-protéica induzida por deitas
deficientes em proteínas, em ratos, é caracterizada por falha no crescimento, com
supressão do crescimento longitudinal do osso (PUCCIARELLI, 1981; GLICK &
ROWE, 1981; HIMES, 1978; NAKAMOTO & MILLER, 1977; LEE, 1976),
provavelmente como resultado da taxa diminuída da quantidade de osso neoformado,
bem como do índice mineral alterado. A dieta livre de proteína durante o período de
vida pós-natal produz uma redução considerável na força e na rigidez do eixo femural
(FERRETTI et al., 1988), e ainda de acordo com estudos de Nakamoto & Miller (1977),
o efeito da deficiência protéica sobre o desenvolvimento de mandíbula de rato tem sido
investigado considerando o resultado representativo de qualquer osso do organismo.
A desnutrição primária causada por suprimento inadequado de macro e
micronutrientes pode levar à deficiência imunológica clinicamente significante e a
infecções em crianças (SCRIMSHAW, 2003; KEUSCH, 2003). O desenvolvimento do
sistema imunológico normal é prejudicado pela desnutrição em períodos críticos como
gestação e maturação neonatal (KEUSCH, 2003; MCDADE et al., 2001). Além disso,
estudos comprovam que crianças desnutridas apresentam deficiências no seu sistema
imunológico e maior risco de infecções, além de maior predisposição ao atraso no
desenvolvimento neuropsicomotor (GRANTHAM-MC et al., 1982).
Dados clínicos e experimentais mostram o período neonatal como uma fase de
maior susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões. Isso ocorre devido a uma
combinação entre diversos fatores, tais como aumento da excitação e diminuição da
inibição, além de alterações inerentes ao desenvolvimento em estruturas subcorticais
(MOSHÉ, 1993).
Estudos experimentais com ratos submetidos a processo de desnutrição precoce
e posteriormente reabilitados do ponto de vista nutricional demonstram resultados
controversos quanto à ocorrência de recuperação de estruturas do SNC previamente
danificadas. O conceito de plasticidade cerebral já foi associado à recuperação do status
nutricional (SCHONEIT & HAENSEL, 1988).
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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31
Palencia et al. (1996) e Bronzino et al. (1990), em estudos experimentais,
evidenciaram que a desnutrição perinatal causa alterações permanentes, fisiológicas e
morfológicas no SNC em desenvolvimento, além de diminuir o limiar para crises
convulsivas.
O desenvolvimento pós-natal de células também tem se mostrado afetado por
desnutrição neonatal. Em estudo morfométrico de complexo de Golgi, Dı´az-Cintra et
al. (1991) mostraram uma redução significativa no tamanho e na complexidade dos
dentritos. Em estudo do desenvolvimento pós-natal, Cintra et al. (1997) observaram
plexos de fibras axonais e encontraram redução destes plexos em ratos desnutridos no
período pré-natal. No sítio de projeção axonal de células CA3 piramidais, Granados-
Rojas et al. (2002) encontraram uma redução no número de seus contatos sinápticos em
ratos desnutridos.
Ainda sobre estudos que envolvem a desnutrição protéica, Lozoff et al. (1991)
afirmaram em seu trabalho que deficiências nutricionais podem resultar numa redução
da função cognitiva, bem como da coordenação e desenvolvimento motor, estando
associada também ao aumento na morbidade e de doenças infecciosas.
O crescimento ósseo no período pós-natal depende da diferenciação das células
tronco mesenquimais da medula óssea em células osteogênica, adipogênica, fibloblastos
e linhagem reticular (BIANCO et al., 2001; TRIFFITT & OREFFO, 1998). Alterações
na regulação das células tronco mesenquimais e na atividade osteoblástica são
importantes mecanismos candidatos para a programação da trajetória do crescimento
esquelético por restrição dietética protéica durante a vida intra-uterina. Entretanto, os
efeitos da restrição dietética intra-uterina sobre os mecanismos biológicos acerca do
crescimento ósseo e da função da célula óssea, bem como os efeitos de mediadores
endócrinos sobre a função da célula óssea durante toda a vida, permanecem
desconhecidos.
De acordo com os estudos sobre as conseqüências tardias da desnutrição
neonatal, muitos dos sistemas e órgãos sofrem diversas conseqüências, mas até agora,
não há dados na literatura que mostrem que pacientes que sofreram este tipo de
desnutrição apresentam um potencial reduzido de reparo ósseo diante de um trauma na
idade adulta, bem como qualquer tipo de alteração na quantidade e/ou plasticidade das
células tronco mesenquimais.
Diante destes fatos, é de grande relevância estudar se os efeitos da desnutrição
ocorrida na fase de diferenciação e amadurecimento dos sistemas orgânicos, e seguida
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FRAGA, SN
32
de recuperação ponderal através de dieta de reposição nutricional, ao longo da vida
adulta, interferem no processo de reparo ósseo com o uso de células tronco e, desse
modo, saber se esta terapia teria a mesma eficiência que num organismo com estado
nutricional normal, sem restrição de nutrientes necessários ao desenvolvimento orgânico
durante o seu período crítico.
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33
3 MÉTODOS
3.1 Desenho do Estudo
Trata-se de um estudo experimental, do tipo prospectivo, pareado, aleatório e
duplo cego. Num mesmo rato, foi possível observar os resultados tanto da cavidade
óssea (defeito crítico) teste-T quanto da cavidade controle-C, como foram denominadas.
3.2 Seleção da Amostra
Foram utilizados 64 ratos adultos do sexo masculino (Rattus novergicus, família
Muridae, variedade Wistar), provenientes do Biotério de Criação do Departamento de
Nutrição da UFPE. O mesmo foi escolhido como modelo experimental porque são
indivíduos isogênicos e consangüíneos, o que oferece uma menor variabilidade na
população que forma a amostra. Além disso, apresentam uma alta resistência ao
manuseio, pouca propensão a doenças (HARKNESS; WAGNER, 1993) e se adéquam
bem à manipulação nutricional.
3.3 Divisão dos Grupos
Os 64 ratos que participaram do estudo foram divididos em dois grupos de
acordo com a dieta oferecida durante o período de aleitamento: grupo Nutrido - N (n =
32) e Desnutrido - D (n = 32). O grupo N recebeu dieta padrão de laboratório durante o
período de aleitamento (Labina - Purina®), enquanto que o grupo D recebeu a Dieta
Básica Regional - DBR (TEODÓSIO et al., 1990) durante este mesmo período. Após o
período de manipulação nutricional, os ratos receberam água e ração padrão ad libitum
até o fim do experimento. As tabelas 1 e 2 mostram a composição nutricional de cada
dieta.
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34
Tabela 1. Composição centesimal da Dieta Básica Regional (DBR)
Ingredientes g%
Composição Centesimal
Proteína Carboidrato Lipídeos Cinzas Fibras Kcal%
Feijão cozido e
seco
18,34 3,99 10,66 0,24 0,57 1,09 60,76
Farinha de
mandioca
64,81 0,84 48,59 0,12 0,43 5,64 198,80
Carne seca
salgada
3,74 2,74 - 0,06 0,06 - 11,50
Gordura da carne
salgada e seca
0,35 - - 0,35 - - 3,15
Batata doce 12,76 0,30 9,99 0,03 0,20 0,48 41,43
TOTAL 100,00 7,87 69,24 0,80 1,26 7,21 315,64
Fonte: Teodósio et al. (1990)
Tabela 2. Composição da dieta padrão utilizada no biotério (LABINA - Purina®,
Agribrands do Brasil Ltda). Valores de enriquecimento por Kg de ração
Enriquecimento Enriquecimento Níveis de garantia (%)
Vitamina A 20000UI Piridoxina 6mg Umidade (máx) 13
Vitamina D3 6000UI Biotina 0,1mg Proteína (min) 23
Vitamina E
30UI
Colina
2000mg
Extrato Etéreo
2,5
Vitamina K 6mg Manganês 50mg
Matéria Fibrosa
(máx)
9,0
Vitamina B12 10mg Iodo 2mg
Matéria Mineral
(máx)
8,0
Vitamina B2 8mg Ferro 65mg Cálcio (máx) 1.8
Pantetonato de
Cálcio
24 mg Zinco 35mg Fósforo (min) 0,0
Niacina
95mg
Cobre
26mg
Tiamina 4mg Antioxidante 100mg
Ácido Fólico 0,5mg
Fonte: Agribrands do Brasil Ltda.
Dos 32 ratos pertencentes a cada grupo, 16 foram sacrificados para a doação de
medula para o fornecimento das células tronco. Usou-se a proporção de 1 rato doador
para 1 rato receptor. Esta proporção foi pré-estabelecida em estudo piloto.
Os 32 animais restantes (16N e 16D) foram subdivididos, ainda, em dois grupos
cada (n = 8). Estes animais foram os receptores de células tronco mesenquimais tanto de
ratos N quanto de ratos D. A ilustração (figura 1) abaixo facilita a visualização dos
grupos em questão:
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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35
3.4 Acompanhamento da evolução ponderal
Os ratos foram pesados diariamente, numa planilha padronizada (Apêndice 1),
durante as três primeiras semanas de vida. A partir do desmame (23° dia), os mesmos
foram pesados em dias alternados até completarem a idade adulta (90° dia). O peso dos
animas foi aferido em balança digital pertencente ao Biotério do Departamento de
Nutrição – UFPE. Esperou-se a idade adulta dos animais para iniciar os experimentos
porque nesta idade o tecido ósseo dos mesmos já está completamente maturo.
3.5 Acondicionamento dos Animais
Os animais foram mantidos inicialmente no Biotério do Departamento de
Nutrição até os 90 dias de vida, a uma temperatura de 22°C ± 2, num ciclo claro-escuro
12/12h (HARKNESS; WAGNER, 1993; LUCA; ALEXANDRE; MARQUES, 1996). A
partir daí, os animais foram transferidos para o Biotério do Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami – LIKA/ UFPE, o qual manteve o mesmo sistema de
iluminação e aquecimento, e onde foram mantidos em gaiolas contendo maravalha
autoclavada de madeira macia. Como os ratos geralmente têm um comportamento
comunitário, eles foram alojados em quatro animais por gaiola.
Figura 1: Divisão dos grupos experimentais. G1 → Grupo N + células tronco de ratos N; G2 → Grupo D +
células tronco de ratos D; G3 → Grupo N + células tronco de ratos D; G4 → Grupo D + células tronco de ratos N.
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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36
Todas as gaiolas foram acondicionadas em uma sala exclusiva para esta pesquisa
e, durante um período de 15 dias, as animais foram mantidos numa sala de quarentena,
onde foi avaliado, pelo veterinário responsável, o seu estado geral de saúde. Durante o
período de quarentena, os animais foram vermifugados com Albendazol.
A limpeza das gaiolas e dos bebedouros foi efetuada duas vezes por semana,
segundo o protocolo de limpeza e desinfecção do Biotério do LIKA. A alimentação dos
animais se deu através de ração comercial sólida peletizada (Labina - Purina®), com
alto teor de protético (20 a 27%) e água destilada acidificada (HCl 0,005%) ad libitum.
3.6 Coleta de medula óssea, cultura de células tronco e diferenciação em
osteoblastos
A obtenção da medula óssea nos ratos doadores e o seu posterior processamento
laboratorial para a cultura, o isolamento das células tronco mesenquimais e a
diferenciação em células osteoprogenitoras (osteoblastos) baseou-se no protocolo
descrito por Abukawa et al. (2004), que por sua vez, baseou-se nos trabalhos de
Pittenger et al. (1999). Todos os procedimentos foram realizados no Laboratório de
Microbiologia do LIKA-UFPE.
3.6.1 Coleta de medula óssea
Os ratos foram anestesiados com Cloridrato de Xilasina e Cloridrato de
Ketamina (1:1) (Vetbrands®) e eutanasiados com 1mL, intracardíaco, de Cloreto de
Potássio (KCl) 19,1% como recomendado pela Associação Americana de Veterinária.
Em seguida, os mesmos foram desinfetados com álcool etílico a 70% e, a partir deste
momento, todas as etapas foram realizadas dentro de uma Cabine de Fluxo Laminar
Classe II B2, seguindo os protocolos de cultura celular (CURI & PERES, 2005), no
intuito de evitar contaminação das culturas.
Os fêmures e as tíbias dos ratos foram dissecados num tempo de 17,79±4,54
minutos e acondicionados em solução salina estéril até o momento da coleta da medula
óssea. Para a coleta da medula, os ossos foram cortados na altura das epífises, de modo
que as diáfises ficassem intactas para a coleta. A medula foi coletada diretamente num
tubo cônico estéril de 15 mL (Falcon®), com agulha 18G x 1
1/2”
, utilizando-se Heparina
diluída em PBS (1:10) (Invitrogen®), 0,1 M, pH 7,2. Depois de realizada a coleta, as
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
37
células tronco foram separadas num gradiente de Ficoll (Sigma®), sob centrifugação de
1200 rpm por 30 minutos.
Em seguida, a fase com células tronco que ficou acima do Ficoll foi aspirada
através de um pipetador automático e dispensada num tubo cônico estéril de 50mL
(Falcon®). Estas células foram então lavadas em PBS, sob centrifugação de 1800 rpm
por 10 minutos. Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante e obteve-se um pelet
de células que foi logo ressuspendido em 1mL de meio de cultura de Dulbecco
modificado por Eagle (DMEM) de alta glicose (Invitrogen®) suplementado com 10%
de soro fetal bovino (Invitrogen®) e antibiótico/antimicótico (Invitrogen®). Para a
contagem das células, obteve-se uma alíquota de 10µl da suspensão, a qual foi diluída
em 90µl de Trypan blue (1:10). A contagem foi realizada em câmera de Neubauer e o
resultado ajustado para 10
6
células/mL. A figura 2 ilustra todas as etapas supracitadas.
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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38
Figura 2: Procedimentos de coleta de medula óssea. A. Rato Wistar; B.
Fêmures e tíbias dissecados; C. Coleta de medula óssea; D. Células sobre
Ficoll- Sigma®; E. Separação de células após centrifugação; F. Aspiração das
células com pipetador automático; G. Células em cultura em atmosfera úmida,
37°C e 5% CO
2
; H. Troca de meio de cultura.
A
C
D
E
F
G
H
B
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39
3.6.2 Cultura de células tronco e diferenciação em osteoblastos
As células tronco foram cultivadas por 12 dias em garrafas de cultura de 25 cm
2
(Falcon) em atmosfera úmida, 5% de CO
2
, a 37° C e em condições estéreis. A
obtenção das células tronco mesenquimais se deu através a aderência destas ao fundo da
garrafa de cultura. A troca do meio de cultura foi realizada a cada três dias e, no décimo
dia, quando as culturas atingiram uma confluência de 80 a 90% (Figuras 3 e 4), as
mesmas foram induzidas a se diferenciar fenotipicamente em osteoblastos através da
adição de um meio indutor contendo 100 nmol/L Dexametasona, 10 nmol/L de β-
glicerofosfato e 50 ug/ml de Ácido ascórbico (PITTENGER et al., 1999).
Figura 3: Cultura confluente de células tronco
mesenquimais
Figura 4: Células tronco mesenquimais
diferenciadas em osteoblastos (seta)
Ao 12º dia, os osteoblastos foram retirados do frasco com 5mL de Tripsina-
EDTA (0,05%) (Invitrogen®), lavados em PBS e concentrados em cloreto de sódio
(NaCl) 0,9%, numa concentração de 10
6
células/10µl de NaCl. Estas células foram
mantidas em gelo até o momento da cirurgia e, posteriormente, foram incorporadas ao
cimento de hidroxiapatita (Bone Source®) e implantadas na cavidade óssea
experimental (defeito crítico).
3.7 Anestesia geral
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, cada rato foi pesado no dia
anterior no intuito de minimizar o estresse no momento da cirurgia. Para a anestesia
geral destes animais, foi utilizado Cloridrato de Ketamina e o Cloridrato de Xilazina
(1:1) aplicados na dosagem de 0,1mL para cada 100g de peso corpóreo por via
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
40
intramuscular (IM), com um tempo de ação de aproximadamente 5 minutos e um
período aproximado de duas horas de anestesia (FERREIRA DA SILVA, 2006).
3.8 Procedimentos pré-cirúrgicos
Enquanto o rato estava anestesiado, sob papel absorvente, foi feita a tricotomia
com navalha descartável na região craniofacial, entendendo-se da região occipital até a
região nasal. Posteriormente, realizou-se uma anti-sepsia com gaze estéril umedecida
em Polivinil-iodopovidona (PVP-I) a 10%.
Em seguida, foi colocado um campo cirúrgico estéril sob a mesa, e o rato foi
posto em decúbito dorsal. Foi colocado, ainda, um campo cirúrgico fenestrado, de modo
que só ficasse exposta a região a ser manipulada.
A anestesia local foi obtida com a infiltração de 0,1 mL de Cloridrato de
Lidocaína a 2% com adrenalina (1:200.000) com o intuito de diminuir o sangramento no
trans-operatório e promover um maior conforto no pós-operatório imediato.
3.9 Procedimento cirúrgico
Os procedimentos operatórios experimentais foram realizados na Sala de
Cirurgia do Biotério do LIKA-UFPE sob técnicas de assepsia e anti-sepsia, utilizando-
se instrumental estéril e campos descartáveis. Para esterilização destes, utilizou-se o
calor úmido (autoclave), sob a pressão de 15 libras e temperatura de 121ºC por 30
minutos.
3.10 Defeitos críticos e determinação das cavidades
Foi realizado de forma bilateral nos ossos parietais dos ratos duas cavidades
circulares de 5mm de diâmetro denominadas defeitos críticos. Tais cavidades
corresponderam à cavidade teste (T) e à cavidade controle (C). Estes defeitos foram
realizados com o auxílio de uma broca de Trefina calibrada de espessura total, com
exposição da dura-máter.
Nos ratos do estudo piloto a espessura da calota foi mesurada com um
calibrador, observando-se uma média de 0,425 0,0731mm de espessura no osso
removido para criar a cavidade do defeito, sendo este dado de utilidade para a obtenção
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
41
do “volume aproximado do defeito”. A obtenção deste dado possibilitou o cálculo do
número de células osteoprogenitoras por cm
3
implantadas na cavidade, para que o
mesmo estivesse em concordância com a literatura. Este volume aproximado do defeito
foi determinado em 0,083 cm
3
.
A cavidade teste foi determinada de forma aleatória mediante sorteio. Nos
quatro grupos, estabeleceu-se a cavidade do osso parietal direito como cavidade D e a
do osso parietal esquerdo como cavidade E.
No ato cirúrgico, a cavidade T e a cavidade C foi identificada mediante o
preenchimento prévio de uma tabela (apêndice B). A cavidade T foi preenchida com
aproximadamente 10
6
osteoblastos/10µ de NaCl, utilizando-se o cimento de
hidroxiapatita como veículo. A cavidade C foi preenchida apenas com o coágulo
sanguíneo produzido após a criação do defeito crítico.
3.11 Técnica cirúrgica
Foi realizada uma incisão paramediana na calvária do rato intermediando pele e
periósteo, estendendo-se da região fronto-nasal à protuberância occipital externa, com
lâmina n
0
15 montada num cabo de bisturi Bard-Parker Nº 3, elevado e rebatido
lateralmente mediante um perióstomo tipo Molt Nº 9, expondo os ossos parietais, parte
do occipital e do frontal.
Seguida à correta diérese dos tecidos, foram realizadas as duas cavidades ósseas
circulares na região central de cada osso parietal, de espessura total, utilizando-se a
broca Trefina calibrada com 5mm de diâmetro, acoplada numa peça reta, montada em
baixa rotação num motor elétrico. Para evitar perfurar o seio sagital e/ou a dura-máter,
evitou-se realizar pressão com os dedos sobre a calota e observou-se também o
aparecimento de uma translucidez no sulco formado no osso pela broca, sendo
finalmente removido o fragmento ósseo delicadamente com uma cureta de Lucas.
Durante a confecção dos defeitos críticos, o procedimento foi realizado sob
constante irrigação com solução fisiológica 0,9%, evitando-se assim o
superaquecimento ósseo.
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
42
3.11.1 Implante dos osteoblastos
Uma vez confeccionados os defeitos críticos, de acordo com o que havia sido
estabelecido, identificou-se a cavidade T e implantou-se as células tronco mesenquimais
diferenciadas, in vitro, em osteoblastos (Figuras 5 e 6). Como o veículo utilizado para a
fixação destas células no defeito crítico foi o cimento de hidroxiapatita, antes do
implante, as células foram misturadas a este cimento num pote Dappin e, em seguida,
postas cuidadosamente sobre a cavidade pré-determinada.
Figura 5: Defeitos críticos bilaterais. Figura 6: Implante dos osteoblastos
incorporados ao cimento de hidroxiapatita em
um dos defeitos críticos.
3.12 Etapa final da cirurgia
Após o preenchimento da cavidade teste, o periósteo foi reposicionado e
suturado junto ao plano muscular mediante pontos simples com fio de nylon número 5.0
(Sumervelle®), sendo finalmente suturados os planos superficiais e a pele com o
mesmo fio de nylon (Figuras 7 e 8).
Figura 7: Periósteo reposicionado e
suturado.
Figura 8: Sutura dos planos superficiais.
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FRAGA, SN
43
3.13 Cuidados pós-operatórios
Imediatamente após a cirurgia, foi realizada a limpeza das feridas e do corpo do
rato com PVP-I 10% para que os que despertassem primeiro da anestesia não ficassem
estimulados a praticar o canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue presente na
ferida cirúrgica.
Os ratos foram acondicionados em gaiolas limpas e com maravalha autoclavada.
O uso de almofadas, mesas aquecidas ou lâmpadas para manter os animais aquecidos
(HARKNESS; WAGNER, 1993; FLECKNELL, 1996) no período pós-operatório foi
descartado. Para isto, cobriu-se a calda de cada rato com a mesma maravalha, evitando
assim hipotermia corporal, depressão cardio-respiratória e óbito.
A fim de minimizar o risco de infecção, foi aplicado por cinco dias o antibiótico
Enrofloxacina 5% por via IM de 24/24h (0,5mL/10Kg). Para o controle da dor pós-
operatória, foi aplicado uma dose única de Dipirona Sódica por via intramuscular no
pós-operatório imediato (0,2mL/10Kg) (FERREIRA DA SILVA, 2006) e durante 3
dias, foi utilizado Ibuprofeno à 4%, diluído na mesma água do bebedouro na razão de
1:25 segundo os protocolos do Biotério do LIKA-UFPE.
Foi mantida, até o momento da eutanásia, a mesma alimentação ad libitum.
3.14 Eutanásia dos animais
Os ratos foram sacrificados 60 dias após a cirurgia. Para tal, administrou-se o
mesmo tipo e a mesma dose anestésica utilizada para a cirurgia e, em seguida, da
mesma forma que foi realizada a coleta de medula, os ratos foram eutanasiados com
KCl 19,1% intracardíaco.
3.15 Obtenção do material para análise histológica
Realizou-se, após a eutanásia, uma tricotomia na região craniofacial do rato e
uma limpeza da pele com álcool etílico a 70%. Em seguida, procedeu-se com uma
incisão trapezoidal, de espessura total, abrangendo a pele e os tecidos moles da região
parietal, de forma bilateral, com exposição da calota craniana. A ressecção do osso foi
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
44
efetuada com auxílio de uma broca n° 701 montada em peça reta e acionada por motor
elétrico a uma velocidade de 25.000 rpm.
A calota craniana foi removida em sua totalidade tendo como limites os ossos
próprios nasais na região anterior, o osso occipital na região posterior, além dos ossos
temporais nas regiões laterais do crânio do espécime.
3.16 Processamento do material para análise histológica
As peças foram fixadas em formol tamponado a 10% em temperatura ambiente
e, posteriormente, descalcificadas em solução de ácido nítrico a 0,5% por 15 dias. Após
descalcificação, as peças foram lavadas com água destilada corrente durante 2 minutos e
mediante uma navalha, divididas em duas metades simétricas na região da sutura
sagital, correspondendo cada metade a uma hemi-calota direita e uma hemi-calota
esquerda. Posteriormente, cada hemi-calota foi cortada no diâmetro do defeito, sendo
descartadas as metades anteriores de cada lado.
Cada amostra, contendo uma metade de cada defeito foi colocada num tubo
cônico contendo álcool a 70% e encaminhadas para seu processamento histológico, no
qual foram desidratadas em soluções de álcool etílico a 80, 90% e 100%, diafanizadas
em banhos de xilol e incluídas em parafina de forma padronizada, que permitisse o
posicionamento no micrótomo e o corte da amostra no sentido coronal. Posteriormente,
os espécimes foram seccionados em cortes seriados de 5m de espessura e corados por
hematoxilina-eosina (HE) e Tricrômico de Masson (TM).
3.17 Análise histológica
A análise foi realizada por 3 histopatologistas com experiência na área. Os
avaliadores tinham conhecimento limitado sobre a metodologia deste experimento e não
sabiam qual era o grupo e/ou a cavidade que estava avaliando.
As amostras foram entregues para a avaliação em caixas identificadas com
colorações em HE e TM. A avaliação foi realizada de forma que os mesmos cortes
fossem analisados pelos avaliadores, sendo um avaliador por vez. Adicionalmente foi
entregue para cada um deles uma pasta contendo uma ficha padronizada (Apêndice C).
Utilizaram-se os parâmetros da tabela 3 para a avaliação:
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
45
Tabela 3: Ocorrência de inflamação, tecido ósseo e reparo/fibroplasia
INFLAMAÇÃO TECIDO ÓSSEO REPARO/FIBROPLASIA
Infiltrado inflamatório Tecido ósseo maturo Fibras colágenas
Tecido de granulação Tecido ósseo imatudo Fibroblastos
Vasos neoformados Osteóide
Reação de corpo estranho Osteoblastos
Estas três características histopatológicas foram avaliadas e classificadas como
expresso na tabela 4.
Tabela 4: Classificação das características histopatológicas
ESCORES
Ausente -
Leve +
Moderado ++
Intenso +++
3.18 Análise estatística
Todas as análises e observações histológicas foram realizadas de forma cega,
sem o conhecimento por parte dos examinadores a respeito do lado que foi determinado
como C ou T.
Os dados foram inicialmente coletados mediante formulários padronizados com
categorização das variáveis sendo estes posteriormente afixados em tabelas
padronizadas no programa MS-Excel compatível com Windows Vista.
O teste t-Student foi utilizado para comparar ganho de peso e número de células
tronco entre os grupos de animais N e D. O teste de Mann-Whitney foi aplicado quando
os dados não passaram no teste de normalidade. O software utilizado para obtenção dos
cálculos foi o programa SigmaStat® versão 2.0. A avaliação do reparo ósseo foi
baseada no teste Kappa com capacidade para analisar o índice de coincidência da
análise dos avaliadores. Foram determinados, de acordo com as análises, 4 pontos de
corte para estes índices: > 0,80 (excelente); 0,60 - 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular);
0,20 - 0,40 (pobre).
Tabela 5: Coincidência da Kappa
PONTOS DE CORTE CONCEITOS
> 0,80 Excelente
0,60 - 0,80 Bom
0,40 - 0,60 Regular
0,20 - 0,40 Pobre
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3.19 Considerações bioéticas
Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde da UFPE, sob o Processo Nº 007091/2007-19 (Anexo
A).
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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47
4 RESULTADOS
Os resultados obtidos com a metodologia empregada encontram-se neste artigo
que será submetido à revista NUTRITION.
Association of neonatal malnutrition with bone repair stimulated with
mesenchymal stem cells in adult rats
Associação da desnutrição neonatal com o reparo ósseo induzido com
células tronco mesenquimais em ratos adultos
FRAGA, S.N.
1,2
; PORTO, G.G.
1
; MORAES, S. R. A.
4
; RIBAS, K. H. S.
2
; PONTES –
FILHO, N. T.
5
; De CASTRO, C. M. M. B.
1, 2, 3
1
Programa de Pós-graduação em Nutrição - UFPE
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA
3
Departamento de Medicina Tropical - UFPE
4
Departamento de Anatomia – UFPE
5
Departamento de Patologia - UFPE
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48
Associação da desnutrição neonatal com o reparo ósseo induzido com
células tronco mesenquimais em ratos adultos
Simone do Nascimento Fraga
1,2
, Gabriela Granja Porto
2
, Sílvia Regina Arruda de
Moraes
4
, Ketlin Helenise dos Santos Ribas
2
, Nicodemos Teles Pontes Filho
5
; Célia
Maria Machado Barbosa de Castro
1, 2,3
1
Programa de Pós-graduação em Nutrição - UFPE
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA
3
Departamento de Medicina Tropical - UFPE
4
Departamento de Anatomia – UFPE
5
Departamento de Patologia - UFPE
Avenida Vinte de Janeiro, n° 496B, apto. 304
CEP: 51030 160 Recife-PE, Brasil
E-mail: snfraga@yahoo.com.br
RESUMO
Objetivo: Avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o crescimento corporal,
número de células tronco adultas (CTAMO), número de células tronco adultas
mesenquimais (CTAM) e reparo de lesões ósseas com CTAMO.
Métodos: Ratos Wistar (n=64) foram divididos em grupos N e D de acordo com a dieta
no período de aleitamento. N recebeu dieta padrão (23% proteínas) e D recebeu a dieta
experimental (7,87% proteínas). Os ratos foram pesados diariamente até o 21° dia e em
dias alternados até a idade adulta. Utilizou-se 32 (16N e 16D) como doadores de células
tronco e os demais foram divididos em 4 grupos (n=8) para receber o implante de
células em defeitos críticos. Os animais foram eutanasiados 60 dias após a cirurgia e o
espécime foi encaminhado para análise histológica. As CTAMO e as CTAM foram
quantificadas durante os experimentos. Utilizou-se o índice de Kappa para analisar a
concordância entre os examinadores e o teste t de student (p<0,05) para comparar o
peso e o número de células tronco entre N e D.
Resultados: Os ratos D tiveram ganho de peso inferior aos N do 2° dia pós-natal até a
idade adulta e apresentaram quantidade de CTAMO semelhante aos ratos N. Entretanto,
a desnutrição aumentou o número de CTAM. O reparo ósseo em D foi insatisfatório.
Conclusão: Sugere-se que a desnutrição neonatal interfere de forma permanente na vida
adulta sobre o crescimento ponderal, o número de CTAM e sobre a capacidade da
regeneração de reparo em lesões do tecido ósseo.
Palavras-chave: célula tronco, célula tronco mesenquimal, desnutrição neonatal, reparo
ósseo, período crítico de desenvolvimento.
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FRAGA, SN
49
INTRODUÇÃO
A desnutrição neonatal é um quadro caracterizado por deficiência nutricional de
um ou de vários nutrientes no período crítico de crescimento e desenvolvimento e
constitui um tema que vem sendo explorado por diversos grupos de pesquisa
1, 2, 3, 4
principalmente, sob o ponto de vista da repercussão deste quadro na vida adulta, já que
ele ainda continua sendo um problema de saúde no mundo. No período neonatal do rato
(primeiros 21 dias pós-natais), a formação e a diferenciação dos tecidos são
influenciados por diversos estímulos, uma vez que este período é uma fase de rápida
proliferação e diferenciação celular
5
.
Pesquisas revelam que a desnutrição neonatal é capaz de repercutir de forma
irreversível sobre o desenvolvimento do cérebro
6, 7, 8, 9
, como na alteração da
concentração de substâncias do hipotálamo e do hipocampo
10
; no sistema imune, com o
aumento da freqüência e da gravidade das infecções
11
e no crescimento ósseo pós-natal,
decorrente da diferenciação das células tronco mesenquimais em células osteogênicas
12,
13
. Outros estudos mostram que a desnutrição provoca várias conseqüências nos
diversos sistemas fisiológicos
10, 14, 15
.
Pesquisas recentes sobre os efeitos da programação metabólica mostram que a
restrição alimentar neonatal programa ratos para permanecerem pequenos e magros na
vida adulta
16
e que, a indução de alterações nutricionais no período pós-natal imediato,
pode causar outras conseqüências em longo prazo
17
. Programações metabólicas
decorrentes de uma privação nutricional no período crítico de desenvolvimento podem
afetar também o sistema ósseo. Alterações na regulação de células tronco mesenquimais
e na atividade osteoblástica por restrição de proteínas durante a vida intra-uterina, são
mecanismos candidatos importantes para a programação da trajetória do crescimento
esquelético
18
. O tecido ósseo afetado pela desnutrição pode sofrer diversas
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
FRAGA, SN
50
conseqüências que vão desde problemas clássicos como a osteoporose
19,
20
até
dificuldades na consolidação de fraturas diante de um trauma extenso.
Com o intuito de sanar este problema muitas tecnologias vêm sendo testadas em
cirurgias de reconstituição óssea, tais como: resinas poliuretanas vegetais
21
, plasma rico
em plaquetas
22
e ultra-som
23
, porém, a maioria dessas técnicas além de serem bastante
onerosas, não reduz a morbidade clínica, particularmente em pacientes que tiveram
história prévia de desnutrição. Assim, o estudo com células tronco pode ser utilizado
como uma possível alternativa terapêutica para consolidar fraturas ósseas.
As células tronco são células progenitoras indiferenciadas que têm a capacidade
de se transformar numa grande variedade de células com funções distintas
24, 25, 26, 27, 28, 29
e podem ser encontradas no músculo, na placenta, no cordão umbilical, na medula óssea
e até mesmo em embriões, nas suas primeiras fases de desenvolvimento.
O uso de células tronco como terapia de trauma ósseo ainda é uma alternativa
pouco estudada no que se refere ao binômio desnutrição e programação metabólica.
Sabe-se que parte destas células é responsável pela formação de vários tecidos no
período pós-natal, inclusive, o tecido ósseo. São escassos os estudos sobre desnutrição
no período crítico e capacidade de diferenciação dessas células para uma possível
utilização em terapia de reparo ósseo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar em
ratos submetidos à desnutrição neonatal a quantificação e a utilização dessas células em
reparo ósseo.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) após a aprovação do Comitê
de Ética em Experimentação Animal da UFPE com protocolo de número: 007091/2007-
19.
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51
Animais
Foram utilizados 64 ratos machos albinos da linhagem Wistar provenientes do
Biotério do Departamento de Nutrição - UFPE. Os animais foram mantidos em
temperatura de 22 à 24°C e ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Destes, metade foi
submetida no período neonatal à dieta padrão do biotério (Labina® - Purina do Brasil)
contendo 23% de proteínas, enquanto que a outra metade recebeu dieta hipoprotéica
(7,87%)
30
. Os animais de ambos os grupos receberam ração e água ad libitum até o
final dos experimentos.
Manipulação nutricional
Para a manipulação nutricional 24 horas após o nascimento, os filhotes que
nasceram na mesma data e de mães diferentes, foram distribuídos de forma
randomizada em gaiolas contendo 6 animais por ninhada. Os grupos de animais
receberam dieta padrão e dieta experimental nos primeiros 21 dias de vida (fase de
aleitamento) e depois receberam dieta padrão do biotério até o final dos experimentos
(fase adulta).
Evolução ponderal
O peso corporal foi mensurado diariamente, durante os primeiros 21 dias de
vida. Após esse período, os animais foram pesados em dias alternados até completarem
89 dias.
Grupos experimentais
Os grupos experimentais foram designados de acordo com a dieta que receberam
durante a lactação e de acordo com cirurgia a que se submeteram para implante de
células tronco. Do total de 64 ratos, 32 receberam a dieta hipoprotéica (Desnutrido-D) e
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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52
os demais receberam dieta padrão (Nutrido-N). A metade desses 2 grupos (n=16) serviu
como doadores de células tronco adultas e os demais foram divididos em 4 grupos
(n=8). Assim, foram obtidos 4 grupos: 1. ratos nutridos que receberam células tronco de
ratos nutridos (G1); 2. ratos desnutridos que receberam células tronco de ratos
desnutridos (G2); 3. ratos nutridos que receberam células tronco de ratos desnutridos
(G3) e 4. ratos desnutridos que receberam células tronco de ratos nutridos (G4).
Coleta e cultura de células tronco
Animais com a idade adulta de 90 dias foram anestesiados com Cloridrato de
Xilasina e Cloridrato de Ketamina (0,1ml/100g peso) e eutanasiados com 1mL
intracardíaco de Cloreto de Potássio (KCl) 19,1% (Baxter). Dentro de uma Cabine de
Fluxo Laminar Classe II B2, os fêmures e as tíbias foram dissecados e acondicionados
em solução salina estéril até o momento da coleta da medula óssea. Em seguida, os
ossos foram cortados na altura da epífise, de modo que as diáfises ficassem intactas para
a coleta da medula. A coleta foi realizada diretamente num tubo cônico estéril de 15mL
(Falcon®), com agulha 18G x 1
1/2”
(Temuro corporation, Japão) utilizando-se Heparina
1:10 em PBS 0,1 M, pH 7,2 (Invitrogen®). Depois de realizada a coleta, as células
tronco foram separadas num gradiente de Ficoll (Sigma®) sob centrifugação de 1200
rpm, por 30 minutos. Após a centrifugação a camada de células tronco que ficou acima
do Ficoll foi aspirada através de um pipetador automático e acondicionadas num tubo
cônico estéril de 50mL (Falcon®). Estas células foram então lavadas em PBS sob
centrifugação de 1800 rpm, por 10 minutos. Após a centrifugação um pelet de células
foi obtido com o descarte do sobrenadante. As células tronco foram ressuspendidas em
1mL de meio de cultura de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) de alta glicose
(Invitrogen®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Invitrogen®) e
antibiótico/antimicótico (Invitrogen®). Para a contagem das células, foi obtida uma
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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alíquota de 10µL, a qual foi suspensa em 90µL de Trypan blue (1:10). A contagem foi
realizada em câmera de Neubauer e o resultado ajustado para 10
6
células/mL. Em
seguida, as células tronco foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm
2
de área
(Falcon) por 12 dias, em atmosfera úmida com 5% de CO
2
, em condições estéreis. A
obtenção das células tronco mesenquimais se deu através da aderência destas a garrafa
de cultura. A troca do meio de cultura foi realizada a cada 3 dias. No 10
o
dia, quando as
culturas atingiram confluência de 80 a 90%, as mesmas foram induzidas a diferenciação
fenotípica em osteoblastos através da adição de um meio indutor contendo 100 nmol/L
Dexametasona (Aché, Brasil), 10 nmol/L de β-glicerofosfato (Fresenius Kabi Brasil
Ltda.) e 50 ug/mL de Ácido ascórbico (Sigma®).
Ao 12º dia os osteoblastos foram retirados do frasco com 5mL de Tripsina-
EDTA (0,05%) (Sigma®), lavados em PBS 0,1M (Invitrogen®) e concentrados em
cloreto de sódio (NaCl) 0,9%, na proporção de 10
6
/10µL de NaCl. Estas células foram
mantidas a 4
o
C até o momento da cirurgia.
Cirurgia e histologia
Os procedimentos operatórios foram realizados sob condições assépticas. Após a
anestesia foi realizada tricotomia na região crânio-facial seguida de anti-sepsia com
PVP-I a 10%. A anestesia foi obtida com a infiltração local de 0,1 mL de Cloridrato de
Lidocaína com adrenalina 2% na concentração de 1:200.
Foi realizada uma incisão paramediana na calvária do rato compreendendo pele
e periósteo, indo da região fronto-nasal até a protuberância occipital externa, expondo
assim os ossos parietais. Bilateralmente, foram realizadas nos ossos parietais 2
cavidades circulares de 5mm de diâmetro (defeito crítico) com o auxílio de uma broca
trefina.
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54
As cavidades foram identificadas como T ou C e no ato cirúrgico, essas
cavidades foram identificadas mediante o preenchimento prévio de uma tabela. A
cavidade T foi determinada de forma aleatória mediante sorteio e foi preenchida com
aproximadamente 10
6
osteoblastos/10µL em NaCl, utilizando-se o cimento de
hidroxiapatita como veículo. A cavidade C foi preenchida apenas com o coágulo
sanguíneo produzido após a confecção do defeito crítico. Este procedimento foi
realizado sob constante irrigação com soro fisiológico 0,9% a fim de evitar o
superaquecimento ósseo.
Após o preenchimento de T o periósteo foi reposicionado e suturado junto ao
plano muscular mediante pontos simples, com fio de nylon número 5.0 sendo
finalmente suturados os planos superficiais e a pele, com o mesmo fio de nylon.
A fim de minimizar o risco de infecção foi aplicado durante 5 dias, o antibiótico
Enrofloxacina 5% por via intramuscular (i.m.) de 24/24h (0,5mL/10Kg). Para o controle
da dor pós-operatória foi aplicado dose única de Dipirona Sódica i.m. (pós-operatório
imediato de 0,2mL/10Kg) e durante 3 dias utilizou-se Ibuprofeno à 4% diluído na
mesma água do bebedouro.
Após 60 dias, os animais foram eutanasiados e suas calotas cranianas foram
removidas, fixadas em formol a 10% e processadas para histologia. Foram
confeccionadas lâminas de cada defeito crítico que foram coradas com a coloração
Tricrômico de Masson. As lâminas foram analisadas por 3 especialistas que avaliaram o
grau de reparo ósseo, levando em consideração os seguintes parâmetros: inflamação,
tecido ósseo e reparo/fibroplasia.
Análises estatísticas
O teste t-Student foi utilizado para comparar ganho de peso e número de células
tronco entre os grupos de animais N e D. O teste de Mann-Whitney foi aplicado quando
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55
os dados não passaram no teste de normalidade. O software utilizado para obtenção dos
cálculos foi o programa SigmaStat® versão 2.0. A avaliação do reparo ósseo foi
baseada no teste Kappa, com capacidade para analisar o índice de coincidência entre a
análise dos três avaliadores. Foram determinados, de acordo com as análises, 4 pontos
de corte para este índice: > 0,80 (excelente); 0,60 - 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular);
0,20 - 0,40 (pobre).
RESULTADOS
Evolução ponderal
Os pesos foram referidos em grama de peso corporal e expressos em média ±
desvio-padrão (figura 1). Os animais submetidos à desnutrição neonatal apresentaram
durante o período de aleitamento redução dos seus pesos quando comparados aos
animais N (α=<0,001) e a diferença pode ser identificada já a partir do 2° dia de vida
(GN: 8,46 ± 1,01 e GD: 7,42 ± 1,52). No 21° dia de vida, que corresponde ao final do
período de lactação, D se manteve com pesos corporais menores (19,10±11,77) que os
encontrados para N (49,39±10,24) (α=<0,001).
A figura 2 mostra valores dos pesos (g), expressos em média ± desvio-padrão de
ambos os grupos do período pós-desmame até 89 dias. No 23° dia, os valores de D
(21,63±3,45) foram menores em relação aos apresentados por N (58,02±12,29)
(α=<0,001). No 89° dia de vida, D ainda apresentaram valores de pesos corporais
(271,51±23,19) inferiores quando comparados aos pesos de N (346,55±35,82)
(α=<0,001).
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56
Quantidade de CTAMO e de CTAM
A contagem total de CTAMO (valores expressos em média x 10
6
células/mL ±
desvio-padrão) não mostrou diferença quando foram comparados os valores de N (20,94
± 10,82) com D (24,60 ± 18,07) (α=<0,05) (figura 3).
A quantidade de CTAM (valores expressos em média x10
6
células/mL ± desvio-
padrão) foi diferente entre os grupos. Os valores da contagem de D (1,82±1,17) foram
maiores do que os valores de N (0,73±0,55) como demonstrado na figura 4 (α=<0,05).
Reparo ósseo
Para a avaliação do reparo ósseo considerou-se o resultado de apenas dois
avaliadores, já que a análise do terceiro, de acordo com os escores estabelecidos, foi
discordante dos demais. O índice de coincidência encontrado entre os dois avaliadores
estão expressos na tabela 1. De acordo com os pontos de corte estabelecidos, houve
coincidência de boa a excelente, na maioria dos casos. A tabela 2 mostra a freqüência
dos parâmetros histológicos encontrados nos animais por grupo. Para melhor
compreensão dos resultados resolveu-se agrupar os conceitos Ausente e Leve no mesmo
parâmetro (Aus-Leve).
Considerando o número de animais que tiveram o grau de inflamação Aus-Leve,
o G1 (N + células tronco N) apresentou pouco infiltrado inflamatório em T, sendo 8
animais para o primeiro avaliador e 7 para o segundo. O parâmetro tecido ósseo
neoformado, segundo os 2 avaliadores, também foi considerado Aus-Leve em todos os
animais. O parâmetro reparo/fibroplasia apresentou grau Aus-Leve, sendo 8 casos
considerados por um avaliador e 7 casos considerado pelo outro.
O G2 (D + células tronco D) apresentou grau de inflamação Aus-Leve, sendo
considerado 8 casos por um avaliador e 6 por outro. O tecido ósseo neoformado também
se apresentou Aus-Leve, porém, em menor grau que o G1 (todos os casos para ambos os
REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...
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57
avaliadores). O parâmetro reparo/fibroplasia, considerado Aus-Leve pelos 2
avaliadores, foi observado em todos os casos e ainda em menor grau que o G1.
No G3 (N + células tronco D) houve mais inflamação que os 2 grupos anteriores
por parte dos avaliadores, 8 e 3 casos, respectivamente. Praticamente não houve tecido
ósseo neoformado, pois os avaliadores encontraram para este parâmetro grau Aus-Leve
em todos os casos. O parâmetro reparo/fibroplasia foi considerado Aus-Leve na maioria
dos casos pelos avaliadores (8 e 6). O reparo foi considerado ainda menor que o G1.
O G4 (D + células tronco N) apresentou quase ausência de inflamação (7 casos
Aus-Leve), pouco tecido ósseo neoformado e pouco reparo/fibroplasia. Este grupo
apresentou um menor grau de reparo/fibroplasia que o grupo G3.
Houve ausência de inflamação no C em quase todos os animais dos grupos G1 e
G3. Entretanto, G2 e G4 apresentaram segundo a análise dos examinadores, diferentes
graus de inflamação. Um considerou ausência de resposta inflamatória ou grau leve de
inflamação e o outro considerou grau inflamatório moderado. Esses grupos
apresentaram ausência completa de tecido ósseo neoformado e de reparo/fibroplasia.
A figura 5 A-D mostra os reparos encontrados em cavidades T dos grupos G1 ao
G4. Nessa figura, é possível observar o reparo ósseo. A figura 5-E mostra a ausência de
neoformação óssea na cavidade C.
DISCUSSÃO
Neste estudo foi possível observar que durante o período de aleitamento o ganho
de peso corporal dos animais do grupo D foi menor que o do grupo N e este resultado
foi significativo desde o segundo dia de vida pós-natal. Isso sugere que a dieta
hipoprotéica utilizada interferiu negativamente sobre o ganho de peso dos animais. Este
achado é concordante com outros dados da literatura, como por exemplo, estudo recente
utilizando a mesma dieta hipoprotéica
31
.
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58
Sabe-se que a desnutrição energético-protéica pode causar diminuição da
quantidade de proteínas e da produção de leite, bem como, da redução no tamanho das
glândulas mamárias em mães lactantes
32, 33
. Estes dados poderiam justificar, em parte,
os dados relativos ao déficit ponderal encontrado nos grupos de ratos desnutridos.
Nos animais D, do período pós-natal até a idade adulta, não houve recuperação
do ganho de peso corporal. Pode-se sugerir que mesmo após reposição nutricional, os
efeitos negativos da desnutrição neonatal podem ainda repercutir sobre o crescimento
corporal do animal na idade adulta.
Deficiências de proteínas, carboidratos e gorduras que, são fontes de energia,
bem como deficiência de micronutrientes, são seguidas de alterações fisiopatológicas e
danos físico e bioquímico para o organismo. Inicialmente, essas deficiências expressam-
se na perda de peso e, quando se tornam crônicas, na diminuição do crescimento
34
.
Esses desequilíbrios nutricionais durante estágios iniciais da vida podem causar
impactos no desenvolvimento tardio do organismo
35
e quando essas agressões
nutricionais ocorrem no período de lactação, podem resultar em retardo do crescimento
em neonatos
30
.
Estudos envolvendo programação metabólica explicam diversos
comportamentos fisiológicos na vida adulta de animais expostos a situações hostis,
como por exemplo, a privação nutricional no período neonatal. Com base neste fato, um
estudo mostrou que a desnutrição energético-protéica causa seqüelas na estrutura morfo-
funcional do intestino de ratos por meio do enfraquecimento das forças de ruptura e
resistência resultante de uma diminuição na funcionalidade de células produtoras de
colágeno da parede intestinal
36
. Isso remete à idéia da programação e seria uma
justificativa admissível para explicar o porquê do permanente déficit ponderal
observado em ratos adultos do grupo D, mesmo após reposição nutricional.
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59
Além de interferir no crescimento, a desnutrição neonatal foi capaz de alterar a
quantidade da população de CTAMO. No presente estudo, o número de CTAMO foi
semelhante nos dois grupos (N e D), em contrapartida, o número de CTAM
diferenciadas em osteoblastos foi maior em ratos adultos do grupo D quando comparado
ao do grupo N. Este outro achado nos remete novamente à idéia de programação.
Talvez, essa seja uma forma de recompensa metabólica encontrada pelo organismo
animal para suprir uma eventual situação de privação nutricional, já que essas células
mesenquimais participam ativamente do turnover celular fisiológico
37
e assim são
fundamentais para a manutenção e regeneração tecidual.
O presente estudo corrobora com uma pesquisa desenvolvida sobre a avaliação
de retinóides e a taxa de proliferação celular, no qual examinaram o papel de derivados
dos retinóides sobre as taxas de proliferação celular em ratos submetidos à dieta
deficiente em vitamina A. Os ratos deficientes desta vitamina exibiram aumento
dramático do número de células mielóides na medula óssea, no baço e no sangue
periférico. Porém, esta anormalidade de proliferação celular foi revertida após adição de
ácido retinóico na dieta, indicando que, a presença ou ausência desse ácido interfere
diretamente na proliferação de células mielóides. Os autores realizaram ainda, a
quantificação da expressão de receptores celulares para atividades biológicas de
retinóides em granulócitos e observaram aumento desordenado da população de
granulócitos por bloqueio no mecanismo fisiológico de apoptose. Provavelmente a
expressão desses receptores inibida em ratos com esta deficiência nutricional, poderia
estar relacionado a um processo apoptótico deficiente
38
. Em nosso estudo, essa poderia
ser uma justificativa plausível para explicar o aumento do número de CTAM dos ratos
desnutridos analisados.
Embora as CTAM encontradas na medula óssea dos ratos desnutridos estejam
em maior quantidade que nos nutridos, isso não significa afirmar que essas células
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60
tenham o mesmo potencial funcional que o das células de animais que receberam aporte
nutricional adequado durante o período crítico de crescimento e desenvolvimento.
Na última década, houve uma intensificação dos estudos empregando o uso das
células tronco como alternativa para terapia celular em tecidos não sangüíneos, devido à
capacidade dessas células em se diferenciar em linhagens celulares que incluem
miócitos, hepatócitos e neurônios, dentre outros tecidos
39, 40
. Estudos recentes sobre
terapia celular vêm utilizando células tronco para: reconstituição das células beta das
ilhotas pancreáticas em pacientes diabéticos
41
; reconstituição da musculatura cardíaca
em paciente com insuficiência cardíaca avançada
42
e em lesões do sistema nervoso
43, 44
.
Esses estudos constituem exemplos que mostram a versatilidade dessas células o que
nos leva a crer que elas poderão ser a solução para o tratamento de lesões ósseas. A
avaliação do grau de reparo ósseo com esse tipo de célula, em nosso estudo, revelou
resultados interessantes no que se refere aos grupos propostos.
Os grupos G1 (animais nutridos com células tronco de animais nutridos) e G2
(animais desnutridos com células tronco de animais desnutridos) apresentaram uma
resposta semelhante para todos os parâmetros avaliados. Entretanto, o G2 apresentou
menos tecido ósseo neoformado e menor grau de reparo/fibroplasia que o G1. Este
resultado pode ser explicado pelo fato de que a desnutrição no período crítico pode ter
causado seqüela funcional permanente nos animais adultos. Estudo de desnutrição
utilizando o modelo da presente pesquisa, empregou macrófagos de animais desnutridos
e nessa situação, esses macrófagos não responderam com a mesma intensidade a
estímulos inflamatórios que os macrófagos dos animais nutridos
45
, associando mais uma
vez à idéia de programação metabólica.
O grupo G3 (animais nutridos com células tronco de animais desnutridos)
apresentou pouca neoformação óssea e grau de reparo/fibroplasia inferior ao encontrado
no grupo G1, isso pode significar que mesmo que o animal tenha tido um aporte
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nutricional satisfatório, durante toda a vida, esse aporte não foi suficiente para recuperar
a capacidade regenerativa das células tronco dos animais submetidos à dieta
hipoprotéica no período crítico. Assim, há possibilidade de ter ocorrido um defeito
genético que alterou a funcionalidade de tais células.
O grupo G4 (animais desnutridos com células tronco de animais nutridos), por
sua vez, apesar de ter apresentado o mesmo perfil de resposta inflamatória e de tecido
ósseo neoformado que os demais, apresentou um grau menor de reparo/fibroplasia que o
grupo G3. Isso demonstra que há necessidade permanente de macronutrientes como
carboidratos, proteínas e lipídios para as células como um todo. Nessa situação, apesar
dos animais desse grupo terem adquirido células de animais nutridos, essas podem ser
influenciadas constantemente pela conseqüência metabólica da privação nutricional
destes animais no período crítico de crescimento e desenvolvimento.
A literatura expõe de forma bem clara o alto potencial terapêutico dessas células
em organismos normais. Os resultados encontrados neste estudo foram satisfatórios e,
embora a desnutrição seja capaz de estabelecer um mecanismo compensatório
quantitativo e não qualitativo sobre as CTAMO, ela pode interferir de forma
significativa sobre a capacidade terapêutica dessas para reparo de lesão em tecido ósseo.
Talvez a utilização de fatores de crescimento, como a proteína morfogenética óssea, no
meio indutor
46
, devolva a essas células o potencial terapêutico esperado ou ainda, o
estudo do reparo ósseo com células tronco embrionárias promova resultados melhores.
Contudo, ainda são necessárias pesquisas que envolvam desnutrição, células tronco
mesenquimais e reconstituição óssea para que essa terapia possa ser uma escolha ideal
de reparo ósseo.
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FRAGA, SN
62
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos com este trabalho permitem concluir que a desnutrição
neonatal seguida de reposição nutricional interfere de forma permanente na vida adulta
do animal sobre o crescimento ponderal, o número de CTAM e a capacidade de
regeneração de reparo ósseo. Embora essas células tenham um grande potencial de
diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de tecidos, a
desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu potencial
terapêutico para reparo em lesões do tecido ósseo.
REFERÊNCIAS
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FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Evolução ponderal dos grupos N e D durante o período de aleitamento. *
α<0,05.
Figura 2. Evolução ponderal dos grupo N e D durante o período de reposição
nutricional. α<0,05.
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Figura 3. Quantidade de CTAMO de ratos dos grupos N e D. *α<0,05.
Figura 4. Quantidade de CTAM, diferenciadas em osteoblastos, de ratos dos grupos N e
D. *=α<0,05.
*
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Tabela 1: Índice de coincidência entre os avaliadores A x B
Grupos Parâmetros
Controle-C Teste-T
G1
(N + CT N)
Inflamação 0,9 1
Tecido ósseo 1 1
Reparo/Fibroplasia 0,9 0,6
G2
(D + CT D)
Inflamação 0,9 0,9
Tecido ósseo 1 0,9
Reparo/Fibroplasia
0,9
0,9
G3
(N + CT D)
Inflamação 1 1
Tecido ósseo 1 1
Reparo/Fibroplasia
0,6
0,8
G4
(D + CT N)
Inflamação 0,9 1
Tecido ósseo 1 1
Reparo/Fibroplasia
1
1
Índice Kappa: > 0,80 (excelente); 0,60 – 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular); 0,20 - 0,40
(pobre).
Tabela 2: Freqüência de parâmetros histológicos por animal segundo o grupo e os
avaliadores
Controle-C Teste-T
Grupos Escores Inflamação
(A/B)*
Tecido
ósseo
(A/B)*
Reparo/
Fibroplasia
(A/B)*
Inflamação
(A/B)*
Tecido
ósseo
(A/B)*
Reparo/
Fibroplasia
(A/B)*
G1
(N + CT N)
Aus-Leve 8/7 8/8 8/7 5/8 2/4 8/6
Moderado 0/1 0/0 0/1 3/0 6/4 0/2
Intenso
0/0 0/0 0/0
0/0
0/0 0/0
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
G2
(D + CT D)
Aus-Leve 4/3 8/8 8/7 8/6 8/8 8/7
Moderado 4/5 0/0 0/1 0/2 0/0 0/1
Intenso
0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8
G3
(N + CT D)
Aus-Leve 7/7 4/4 8/5 8/3 8/8 8/6
Moderado 1/ 1 4/4 0/3 0/5 0/0 0/2
Intenso 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8
G4
(D + CT N)
Aus-Leve 6/6 8/8 8/8 7/7 8/8 8/8
Moderado 2/1
0/0 0/0
1/1
0/0 0/0
Intenso 0/1
0/0 0/0
0/0
0/0 0/0
n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8
(A/B)*: número de casos encontrados pelos avaliadores A e B; Aus-Leve: escores 1 e 2;
Moderado: escore 3; Intenso: escore 4.
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B
Figura 5: Defeitos críticos
corados em Tricrômico de
Masson. A (G1); B (G2); C (G3);
D (G4); E (controle). As setas
indicam as extremidades dos
defeitos.
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5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Submetendo organismos a privações nutricionais no período crítico de
crescimento e desenvolvimento, foram observadas alterações funcionais nos sistemas
fisiológicos em questão. O início das observações desse estudo se deu através da
comparação da evolução ponderal, entre os grupos N e D, através da qual se pôde notar
redução no ganho de peso dos animais D desde 2° dia pós natal até a idade adulta. Esses
resultados corroboram com estudo recente de Barros et al. (2006), que usou o mesmo
modelo de dieta (DBR) e também encontrou efeito negativo sobre a evolução ponderal,
o que sugere que a dieta utilizada interferiu negativamente sobre o ganho de peso dos
animais.
Estudos que envolvem programação metabólica estão sendo a saída para
explicar diversos comportamentos fisiológicos na vida adulta de animais expostos a
situações hostis. Assim, observou-se que a desnutrição neonatal também foi capaz de
alterar a quantidade da população de CTAMO. Embora elas tenham se mostrado
inicialmente semelhante nos dois grupos (N e D), o número de CTAM diferenciadas em
osteoblastos foi maior em animais adultos do grupo D, achado que nos remete à idéia de
programação. Talvez essa seja uma forma de recompensa metabólica encontrada pelo
organismo animal para suprir uma eventual situação de privação nutricional já que estas
células mesenquimais participam ativamente do turnover celular fisiológico (SLACK,
2000) e assim são fundamentais para a manutenção e regeneração tecidual.
Quando as CTAM foram implantadas nos ossos parietais dos animais na
tentativa de reparar o defeito crítico, foi possível observar que os grupos propostos
tiveram respostas diferentes e, como se esperava, essa diferença ocorreu em função das
dietas oferecidas aos animais em seus períodos de aleitamento. Os grupos G1 e G2
apresentaram uma resposta semelhante para todos os parâmetros avaliados. Entretanto,
o G2 apresentou menos tecido ósseo neoformado e menor grau de reparo/fibroplasia que
o G1, sugerindo, dessa forma, que a desnutrição no período crítico pode ter causado
seqüela funcional permanente nos animais adultos.
O grupo G3 apresentou pouca neoformação óssea e grau de reparo/fibroplasia
inferior ao encontrado no grupo G1. Tais dados podem significar que a capacidade
regenerativa das células tronco de animais submetidos à desnutrição no período crítico
foi prejudicada, mesmo havendo reposição nutricional. Talvez, a alteração da
funcionalidade dessas células seja devido a uma alteração genética na tentativa de
reprogramar sua função.
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O grupo G4 apesar de ter apresentado o mesmo perfil de resposta inflamatória e
de tecido ósseo neoformado que os demais, mostrou um menor grau de
reparo/fibroplasia que o grupo G3. A necessidade de suprir o organismo com
macronutrientes como carboidratos, proteínas e lipídeos é imprescindível para a
manutenção das funções celulares, caso contrário, provavelmente haverá deficiência
funcional das mesmas. Nesse caso, apesar de se tratar de um grupo de animais
desnutridos que adquiriu células de animais nutridos, houve influencia dessa condição
de privação nutricional multicarencial, levando como conseqüência uma resposta
tecidual deficiente.
Os resultados encontrados neste estudo foram satisfatórios, porém, esperava-se
que os mesmo fossem ainda melhor, já que a literatura expõe de forma bem clara o alto
potencial terapêutico das células tronco em organismos normais. Embora a desnutrição
seja capaz de estabelecer um mecanismo compensatório quantitativo sobre as CTAM,
ela pode interferir de forma significativa sobre a capacidade terapêutica dessas células
na terapia celular óssea. Talvez o uso de citocinas, fatores de crescimento teciduais,
como a proteína morfogenética óssea no meio indutor (CHEN et al., 2002), devolva
para essas células o potencial terapêutico esperado. É possível que o uso de células
tronco embrionárias possa promover resultados melhores em reparo ósseo, uma vez que
estas células apresentam uma potencialidade maior em comparação as CTAMO.
Estudos sobre a biologia das células tronco adultas de medula óssea para melhor
caracterização fenotípica e genotípica, tais como expressão e liberação de fatores de
crescimento tecidual por essas células para o meio extracelular, expressão de moléculas
na superfície celular, captação de glicose marcada para avaliar o metabolismo celular,
ainda são necessários, em especial, em situações de agravo nutricional. Esse estudo é
pioneiro, pois, avaliação de reparo ósseo, desnutrição neonatal e reposição nutricional
com células tronco adultas de medula óssea não existem na literatura até os dias atuais e
abre assim, uma linha de pesquisa bastante promissora sobre um tema de grande
interesse à comunidade científica.
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7 APÊNDICES
APÊNDICE A – Planilha de evolução ponderal
PLANILHA DE EVOLUÇÃO PONDERAL
Projeto de Mestrado: Simone Fraga
GRUPO: ______________________ GAIOLA:_________ D.N.: ______/_____/______
OBSERVAÇÕES:
GRUPO EXPERIMENTAL (desnutrição neonatal)
Até o 21º dia, as mães serão alimentadas com DBR e os filhotes serão pesados diariamente.
Serão 6 filhotes por mãe.
A partir do 22º dia, os filhotes passarão a ser alimentados com Labina®. A partir de agora, os
filhotes serão pesados em dias alternados.
GRUPO CONTROLE (Labina®)
A alimentação será sempre Labina®, desde o período de aleitamento até o final do experimento.
Também serão 6 filhotes por mãe.
O acompanhamento da evolução ponderal será igual a do grupo experimental.
DATAS PESO DOS ANIMAIS (g)
PAD - 1 PAE - 2 DM - 3 DP - 4 PPD - 5 PPE - 6
1º dia
2º dia
3º dia
4º dia
5º dia
6º dia
7º dia
8º dia
9º dia
10º dia
11º dia
12º dia
13º dia
14º dia
15º dia
16º dia
17º dia
18º dia
19º dia
20º dia
21º dia
Desmame ------------ ------------ ------------ ------------ ----------- ------------ ------------
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APÊNDICE B – Tabela de coleta de dados usada nas cirurgias
Grupo Rato nº ___ Início da Data cirurgia Data Eutanásia
D.N.:___/___/___ Cirurgia ___/___/___ ___/___/___
Gaiola nº ___ _______h
Fim da Cavidade Peso pré-eutanásia
Peso pré-operatório Cirurgia ________g
________g _______h 1-D ( ) ou 2-E ( )
Lesão óssea ( ) Patologia óssea ( ) Lesão dura-máter ( )
Intercorrências no trans-operatório Intercorrências no pós-operatório
Observações:
Grupo Rato nº ___ Início da Data cirurgia Data Eutanásia
D.N.:___/___/___ Cirurgia ___/___/___ ___/___/___
Gaiola nº ___ _______h
Fim da Cavidade Peso pré-eutanásia
Peso pré-operatório Cirurgia ________g
________g _______h 1-D ( ) ou 2-E ( )
Lesão óssea ( ) Patologia óssea ( ) Lesão dura-máter ( )
Intercorrências no trans-operatório Intercorrências no pós-operatório
Observações:
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APÊNDICE C – Planilha de avaliação histológica
Avaliação Histológica
Avaliador:
Lâminas HE Lâminas TM
N° lâmina Inflamação
Tecido
ósseo
Reparo/
Fibroplasia Inflamação
Tecido
ósseo
Reparo/
Fibroplasia
Critérios de avaliação relacionados aos três parâmetros:
Inflamação: Infiltrado inflamatório, tecido de granulação, vasos, reação de corpo estranho
Tecido ósseo: tecido ósseo maturo, tecido ósseo imaturo, osteóide, osteoblastos
Reparo/ Fibroplasia: fibras colágenas e fibroblastos
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ANEXOS
ANEXO A – Parecer de aprovação do estudo emitido pela Comissão de Ética em
Experimentação animal (CEEA) da UFPE
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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