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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Análise comparativa da diversidade genética em duas
espécies de faveiro: Dimorphandra wilsonii, ameaçada de
extinção, e D. mollis. Implicações para conservação e
manejo.
ORIENTANDA: Helena Augusta Viana e Souza
ORIENTADORA: Maria Bernadete Lovato
BELO HORIZONTE
Março - 2008
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Milhares de livros grátis para download.
Helena Augusta Viana e Souza
Análise comparativa da diversidade genética em duas espécies
de faveiro: Dimorphandra wilsonii, ameaçada de extinção, e D.
mollis. Implicações para conservação e manejo.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Genética do Departamento de Biologia Geral do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Genética.
Orientadora: Prof
a
Maria Bernadete Lovato.
Belo Horizonte
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
2008
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iii
iv
“Sejamos simples e calmos,
Como os regatos e as árvores,
E Deus amar-nos-á fazendo de nós
Belos como as árvores e os regatos,
E dar-nos-á verdor na sua primavera,
E um rio aonde ir ter quando acabemos!...”
Alberto Caeiro
v
“A persistência é o caminho do êxito”
Charles Chaplin
vi
Aos meus pais, José Augusto e Sueli.
Minhas irmãs, Davi e Hélio, com amor.
vii
AGRADECIMENTOS
À Deus por estar ao meu lado em todos os momentos e me dar força e coragem para
encarar novos desafios;
Aos meus pais pelo exemplo, dedicação e incentivo na busca dos meus ideais e
objetivos, me estimulando a superar os obstáculos que surgem ao longo do caminho.
Às minhas irmãs Luiza e Ana e meu cunhado Afonso pela amizade e apoio. À vó
Grece, pelo imenso carinho. Ao Davizinho, que chegou enchendo a nossa casa de
alegria. A todos os meus familiares e amigos que torceram por mim. Amo vocês!
Ao Hélio, que desde o início sempre acreditou que poderia dar certo e nunca me
deixou desistir. Obrigado por estar sempre comigo, pelo carinho, dedicação e por me
mostrar que o querer pode se tornar poder (só depende de nós).
À minha orientadora Maria Bernadete pelos ensinamentos e por me dar a
oportunidade de realizar esse trabalho;
Ao Prof. José Pires pela contribuição nos trabalhos de coleta;
À Daniela Lacerda, a quem tive o privilégio de ter como professora na graduação, por
ter me trazido para o laboratório e por estar sempre disposta a ajudar;
À Renata, que sempre esteve por perto zelando pelo laboratório e pela realização dos
nossos experimentos, sempre tão atenciosa e preocupada. Muito obrigada por toda
ajuda na bancada, nas análises estatísticas, no dia-a-dia;
Ao Reinaldo que me ensinou os primeiros passos da Extração de DNA e da PCR com
tanta paciência e disponibilidade, mesmo depois de defender seu mestrado sempre se
mostrou pronto a ajudar;
À Maíra, pela amizade, pela empolgação que contagia as pessoas que tem a
oportunidade de conviver com ela. Obrigada por ter me apresentado às
“Dimorphandras”, pelo incentivo, pelas boas conversas e ensinamentos;
Ao pessoal do Laboratório de Genética de Populações: Carol, Renan, Danielle, Júnia,
Lu, Marcelo, Juliano, Bruno, Daniel, sou muito grata a vocês! E também aos novos
colegas do LDGH: Fernanda, Lu W., Maria Clara, Wagner, Moara.
Às pessoas que me ajudaram nas análises estatísticas: Renata, Renan, Paula,
Rodrigo (Lbem);
À Marlene que desde o início me acolheu no laboratório e tantas vezes me hospedou
em sua casa. Muito obrigada pela atenção, pela amizade e pela paciência ao me
ensinar os primeiros passos no laboratório;
viii
Às pessoas que me hospedaram durante a realização do meu estágio no laboratório
(Tina, Eduardo, Lázaro);
À Fernanda Lyon, Juliano Leal e Ana pelas correções no inglês;
À Sabrina (UEFS) e ao Prof. Eduardo B. pelas contribuições com relação à técnica e
aos primers;
À FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais) pela bolsa
de estudo concedida e pelo financiamento do trabalho;
À Marina, por sempre nos atender tão bem na Secretaria de Pós-graduação;
Aos professores e aos colegas do curso de Pós-Graduação pela convivência e
ensinamentos;
Ao pessoal da Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte, em especial ao Fernando
Fernandes, pela amizade, atenção e por sua imensa contribuição para a realização
desse trabalho, pelo seu incentivo e disponibilidade. Gostaria de agradecer também ao
Vítor e a Andréia que durante o período que trabalhamos juntos sempre estiveram
dispostos a ajudar no que fosse necessário.
ix
SUMÁRIO
RESUMO…………………………………………………………………………………… 1
INTRODUÇÃO…………………………………………………………………………….. 2
ARTIGO: Conservation genetics of the critically endangered Dimorphandra
wilsonii and the widespread D. mollis from the Brazilian Cerrado……………………
7
Abstract……………………………………………………………………………………... 8
Introduction…………………………………………………………………………………. 9
Materials and Methods……………………………………………………………………. 11
Plant material………………………………………………………………………………. 11
DNA isolation………………………………………………………………………………. 12
ISSR-PCR………………………………………………………………………………….. 13
Data analysis………………………………………………………………………………..
13
Results…………………………………………………………………………………….... 14
Discussion………………………………………………………………………………….. 16
Implications for conservation…………………………………………………………...... 17
Acknowledgements………………………………………………………………………... 20
References…………………………………………………………………………………. 21
Tables and Figures………………………………………………………………………... 26
CONCLUSÕES……………………………………………………………………………..
34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………...
35
1
RESUMO
O Cerrado, o segundo maior bioma brasileiro vem sendo extremamente ameaçado
pela ação do homem, comprometendo assim a existência de inúmeras espécies. Nesse
estudo, a diversidade e a estrutura genética de duas espécies arbóreas congenéricas
endêmicas do Cerrado, uma rara e extremamente ameaçada, Dimorphandra wilsonii, e a
outra amplamente distribuída, D. mollis foram comparadas para sugerir medidas de
conservação e manejo. Oito populações de D. mollis e todos os 14 indivíduos conhecidos de
D. wilsonii, distribuídos em duas áreas, foram analisados utilizando 12 iniciadores para ISSR
(inter simple sequence repeats). Os índices de diversidade genética e distribuição dessa
diversidade dentro e entre populações foram calculados utilizando Índice de Shannon,
porcentagem de locos polimórficos e Análise de Variância Molecular (AMOVA). Os valores
para porcentagem de locos polimórficos e índice de Shannon, foram consideravelmente
menores em D. wilsonii (P = 35.6 %, H
sp
= 0.168) comparados a congenérica D. mollis (P =
70.4 % and H
sp
= 0.297). A divergência genética entre populações de D. wilsonii foi alta (φ
ST
= 0.509) enquanto para D. mollis a diversidade genética foi maior dentro de populações do
que entre populações (φ
ST
= 0.393). O número reduzido de indivíduos e a baixa diversidade
genética tornam D. wilsonii altamente susceptível a extinção e ações para conservação
devem ser imediatamente implementadas, com a proteção de todos os indivíduos das duas
populações de D. wilsonii. Baseando-se nos dados genéticos e no conhecimento de
atributos biológicos da espécie, algumas medidas para conservação foram sugeridas,
incluindo a coleta de sementes para conservação ex situ e para a produção de mudas em
viveiros para posterior reintrodução nas áreas de ocorrência como também para a fundação
de novas populações em áreas de reserva próximas às populações existentes, e ainda o
cruzamento controlado entre indivíduos.
2
INTRODUÇÃO
O gênero Dimorphandra Schott (Leguminosae, Caesalpinoideae) subdividi-se em
três subgêneros: (1) Dimorphandra com onze espécies; (2) Phaneropsia com cinco espécies
e (3) Pocillum com dez espécies e quatro subespécies. As espécies do subgênero
Dimorphandra estão distribuídas desde a região Norte da América do Sul, atingindo a região
Sudeste e o Brasil Central (Santos et al., 1977).
Dimorphandra mollis Benth. (Fig. 1), popularmente conhecida como faveiro e fava
d’anta, é uma arbórea de ampla distribuição, sendo encontrada em quase todo o cerrado do
Brasil Central (Lorenzi, 1992). A espécie ocorre nos estados do Pará, Goiás, Mato Grosso,
Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e São Paulo (Silva, 1986) e ainda há relatos de sua
ocorrência nos estados do Maranhão, Amazonas e Piauí (http://www.ibama.gov.br). A fava
d’anta é uma espécie medicinal de alto potencial econômico devido ao fato de conter o
flavonóide rutina em suas vagens. A rutina possui várias propriedades farmacológicas, tais
como aumentar a absorção de vitamina C pelo organismo, atuar como anti-oxidante na
prevenção de radicais livres, auxiliar no controle da hipertensão arterial, aumentar a
resistência dos vasos capilares, auxiliar na prevenção de hemorróidas, dentre outras (Paula
et al., 2007). Além disso, a casca da árvore é rica em taninos, bastante utilizado para curtir
couro (Lorenzi, 1992). O mercado da rutina tende a expandir, pois a produção atual da
matéria prima só atende 60% da demanda mundial. A fava d’anta é responsável por cerca
de 50% da produção mundial de rutina, cabendo o restante à espécie chinesa Sophora
japonica (Gomes e Gomes, 2000). Estudos indicam que a espécie apresenta também
potencial para utilização na indústria alimentícia, por apresentar em suas sementes um alto
teor de galactomanano que pode ser usado como espessante, estabilizante e geleificante
em alimentos (Panegassi et al., 2000). Considerando ainda a crescente destruição do
cerrado para atividades agropecuárias, D. mollis pode estar sendo ameaçada, de maneira
que são necessários conhecimentos científicos para orientar a sua conservação e utilização
racional a fim de não comprometer a sua diversidade.
A espécie congenérica, Dimorphandra wilsonii Rizzini (Fig. 2) (faveiro de Wilson),
descrita em 1969 é uma arbórea endêmica do cerrado mineiro (Rizzini, 1969; Silva, 1986). A
espécie está em processo avançado de extinção, sendo atualmente conhecidos somente 21
indivíduos adultos, 11 destes indivíduos distribuídos em três fazendas, Tabuleiro Grande,
São Bento e Pires, localizadas em Paraopeba e Caetanópolis, dois na cidade de Pequi e
oito indivíduos recentemente encontrados na região de Lagoa Santa (Victor Giorni e
Fernando M. Fernandes, comunicação pessoal). Santos et al. (1977) citam a presença da
espécie na região de Frutal, no triângulo mineiro. Entretanto, excursão a essa região
realizada por técnicos do Jardim Botânico da Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte e
3
por participante do grupo de Genética de Populações da UFMG com a finalidade de
amostrar indivíduos dessa espécie não obteve sucesso em encontrar nenhum indivíduo. A
espécie consta na “Red List of Threatened Plants 2006” da IUCN, na categoria criticamente
em perigo (http://www.iucnredlist.org), e na “Lista Vermelha das Espécies Ameaçadas de
Extinção da Flora de Minas Gerais” (Mendonça e Lins, 2000). Dimorphandra wilsonii
apresenta algumas características bem distintas de D. mollis. Ao contrário de D. mollis, cuja
altura varia de 8 a 14m (Lorenzi, 1992), D. wilsonii apresenta de 10 a 20 metros e seus
frutos são bem maiores que os de D. mollis. Um dos motivos do declínio das populações
dessa espécie é a sua eliminação pelos pecuaristas, pelo fato do flavonóide rutina, contido
nas suas vagens ser abortivo para o gado (Mendonça e Lins, 2000). Trabalhos como
prospecção de novas populações ou indivíduos, estudos de fenologia, avaliação do
potencial medicinal da espécie, propagação e delineamento de estratégias de conservação
da espécie já foram iniciados e ela vem sendo protegida por lei desde 2004 (Fernandes et
al., 2007). Os indivíduos localizados nas cidades de Paraopeba e Caetanópolis foram
cercados a fim de evitar a entrada do gado nas áreas próximas. Outra medida importante é
o controle do capim nessas áreas a fim de possibilitar a regeneração natural e o
desenvolvimento de novas plântulas, embora as áreas atualmente cercadas talvez não
sejam suficientes para garantir o estabelecimento de novas populações da espécie.
A maioria dos programas de conservação tem como objetivo a manutenção do
potencial evolucionário de uma espécie, visando assegurar sua persistência a longo prazo
(Zaghloul et al., 2004). Estudos na área de genética de populações são importantes para se
conhecer a distribuição da diversidade genética dentro e entre populações e conhecer as
forças que moldaram a estrutura atual das espécies. Uma das aplicações da genética para a
conservação é a possibilidade de identificar populações que apresentam sério risco de
extinção devido aos seus baixos níveis de diversidade genética e endogamia, o que as
tornam mais susceptíveis a riscos demográficos e ambientais (Frankham et al., 2002).
Populações pequenas sofrem aumento de endogamia, o que leva a diminuição do valor
adaptativo (fitness), fenômeno conhecido como depressão de endogamia (Hartl e Clark,
1997). A escolha de indivíduos de populações distintas geneticamente para serem
introduzidos em populações depauperadas geneticamente, entretanto, deve ser criteriosa,
uma vez que esta interferência pode levar ao fenômeno conhecido como depressão
exogâmica, que pode ocorrer nos descendentes de cruzamentos entre populações muito
diferentes geneticamente. A depressão exogâmica deve-se à combinação de alelos de
populações adaptadas a diferentes ambientes, de tal modo que a população híbrida não é
bem adaptada a nenhum dos ambientes das populações parentais (Frankham et al., 2002).
Os níveis de diversidade intra e inter-populacionais têm comumente sido
relacionados com características de história de vida e biologia das espécies. Revisões
4
baseadas em grande número de espécies com marcadores isoenzimáticos (Hamrick e Godt,
1989), bem como com marcadores RAPD (Nybom e Bartish, 2000), têm estabelecido
associações da diversidade genética com características como tipo de dispersão de
sementes e de pólens, estágio de sucessão, amplitude de distribuição geográfica e sistemas
de cruzamentos. Contudo, generalizações feitas a partir destes estudos têm sido criticadas
por alguns autores. Um dos problemas levantados é que, nessas análises, os taxa são
tratados como amostras independentes, ignorando seu parentesco filogenético
(Gitzendanner e Soltis, 2000). As análises estatísticas empregadas assumem que os dados
são independentes, o que não é o caso para organismos que dividem uma história
filogenética comum, violando as premissas dos métodos estatísticos usados para analisar
os dados (Felsenstein, 1985; Silvertown e Dodd, 1996). Gitzendanner e Soltis (2000)
fazendo comparações entre espécies raras e congenéricas de ampla distribuição
encontraram que os níveis de diversidade para todos os índices utilizados foram altamente
correlacionados. Assim, segundo estes autores, para avaliar o status genético de uma
espécie ameaçada de extinção é importante a comparação com uma espécie do mesmo
gênero, para eliminar o efeito da “herança filogenética” da diversidade genética.
O Brasil é um dos países mais megadiversos do mundo e apresenta cinco grandes
biomas sendo o Cerrado o segundo maior deles, superado apenas pela Amazônia (Klink e
Machado, 2005). Considerado atualmente como um dos hotspots de biodiversidade mundial,
o Cerrado conta hoje com apenas 20% de sua cobertura original intacta e com um grande
número de espécies endêmicas, principalmente de plantas vasculares (4.400 em 10.000)
(Scariot et al., 2005).
Com vistas a orientar a conservação e manejo de Dimorphandra wilsonii e a
exploração racional de D. mollis, o presente trabalho teve os seguintes objetivos:
• Analisar a diversidade genética dos indivíduos remanescentes de D. wilsonii e de
populações de D. mollis;
• Comparar os dados de diversidade e estrutura genética das duas espécies de
Dimorphandra para inferir sobre o “status de conservação genética” de D. wilsonii;
• Sugerir medidas de conservação e manejo de D. wilsoni, tanto in-situ como ex-situ, de
maneira a maximizar a preservação da diversidade genética da espécie.
Utilizando-se a técnica de ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), foram analisadas
as duas populações até então conhecidas de D. wilsonii (exceto Lagoa Santa) e oito
populações de D. mollis. As populações amostradas de D. mollis abrangem sua ocorrência
principalmente no estado de Minas Gerais, que está entre os que mais extraem a fava,
contribuindo com 23% da produção nacional (Gomes e Gomes, 2000). Foram amostradas
folhas jovens de todos os 14 indivíduos remanescentes de D. wilsonii e de 182 indivíduos de
D. mollis, divididos em oito populações, sendo seis com 23 indivíduos e duas com 22
5
indivíduos amostrados. Todas as amostras de DNA extraídas foram depositadas no Banco
de DNA do Laboratório de Genética de Populações do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais. Os resultados deste estudo serão apresentados a
seguir na forma de artigo científico.
6
Fig. 1. Dimorphandra wilsonii Rizzini
Fig. 2: Dimorphandra mollis Benth.
7
ARTIGO:
Conservation genetics of the critically endangered Dimorphandra wilsonii and
the widespread D. mollis from the Brazilian Cerrado.
8
Abstract.
Background and Aims The Brazilian Cerrado (a savannah biome), the second largest
ecosystem in Brazil, has been extremely threatened by anthropogenic action. In this study
the genetic diversity and structure of two congeneric tree species endemic to the Cerrado,
one rare and extremely endangered, Dimorphandra wilsonii, and another widely distributed,
D. mollis were compared in order to understand their evolution, present status and suggest
management and conservation measures.
Methods Eight populations of D. mollis (n=182) and all 14 known trees of D. wilsonii, from
two populations, were screened for variability with 12 inter simple sequence repeats (ISSR)
primers. Parameters of genetic variation and partitioning of genetic diversity between and
within-populations were calculated using analysis of molecular variance (AMOVA) and
Shannon’s index.
Key Results Values for both genetic diversity measures, percentage of polymorphic bands
and Shannon’s index, were considerably lower in D. wilsonii (P = 35.6 %, H
sp
= 0.168)
compared to the congeneric D. mollis (P = 70.4 % and H
sp
= 0.297). The genetic divergence
between populations of D. wilsonii was high (φ
ST
= 0.509) whereas for D.mollis the most of
the genetic diversity was within populations rather than between populations, (φ
ST
= 0.393).
Conclusions The reduced number of extant individuals of D. wilsonii and its low genetic
diversity make it highly susceptible to extinction and action for its conservation should be
taken immediately. The protection of all individuals from the two populations of D. wilsonii is
necessary to preserve the maximum genetic diversity. Based on genetic data and knowledge
of biological attributes of this species, several measures for its conservation were suggested:
ex situ conservation of seeds and production of seedlings in nursery, foundation of new
populations in reserve areas near the extant populations and controlled breeding among
individuals.
Key words: Dimorphandra wilsonii, D. mollis, congeneric species, conservation genetics,
management, Cerrado, genetic variation, ISSR, endangered species.
9
INTRODUCTION
Studies about conservation genetics have increased a lot in the last decades, mainly
due to the need to evaluate measures to reduce the impact of habitat destruction by
anthropogenic action. This is involving the existence of the several wild species and faced
with critical situation the maintenance of biodiversity is a global issue (Izawa et al., 2007).
The Conservation Genetics aims to identify the genetic factors that affect the extinction risk
of populations and species in order to elaborate genetic management regimes required to
minimize theses risks (Frankham et al., 2002). The genetic diversity is considered to be
highly important for adaptation to environmental pressure, as well as ability to evolve and
long-term survival of species (Frankham, 1996). Reductions in population size usually result
in loss of genetic diversity, inbreeding and consequently increased extinction risk (Frankham
et al., 2002).
Besides of demographic history, a great number of factors related to life history and
species biology can shape the levels of genetic variability (Hamrick e Godt 1989; Nybom e
Bartish 2000; Nybom, 2004). Pollen and seed dispersal, successional stages, geographic
distribution range, mating systems are some of the factors that affect patterns of genetic
variation in plants. In the last years, the recognition of the role of evolutionary history and
phylogenetical constraints on genetic diversity have lead many researchers to study
widespread congeners when investigating genetic diversity in endangered species
(Gitzendanner and Soltis, 2000; He et al., 2000; Broadhurst and Coates, 2004; Coates et al.,
2006; Silva et al., 2007). Rare species are generally known as having low genetic variability,
however there are several reports of rare taxa with levels of genetic diversity that are equal
to or greater than that of their widespread congeners (Ranker, 1994; Young and Brown,
1996; Ellis et al., 2006; Song and Olds, 2007). Comparisons between widespread and
restricted congeneric species can be helpful in the identification of historical and life-history
causes of rarity and thus can help to establish appropriate management strategies
(Gitzendanner and Soltis, 2000).
10
Here, we analysed and compared two congeneric tree species, one rare and
extremely endangered Dimorphandra wilsonii Rizzini (Leguminosae-Caesalpinioideae) and
another widely distributed, D. mollis Benth. Both are endemic from the Brazilian Cerrado (a
savannah habitat), the second largest ecosystem in Brazil, only smaller than Amazonia,
representing about one-fifth of the country’s area. Because of its high rate of destruction by
human action, high diversity of plants, with 44% of them being endemic, Brazilian Cerrado
was included among the 25 biodiversity hotspots for conservation priorities (Myers et al.
2000). In the last 35 years, more than 50% of its approximately 2 million km
2
has been
transformed into pasture and agricultural lands planted in cash crops (Klink and Machado,
2005).
Dimorphandra wilsonii is found only in a restrict area in the Minas Gerais State of
Brazil (Rizzini, 1969; Silva, 1986). Only 13 individuals are known in the wild, distributed in
four private proprieties in two cities. Because of its rarity and endangered status, D. wilsonii
was listed in the Red List of Threatened Plants 2006 of the IUCN, category critically
endangered, and also included in the Minas Gerais State Red List of Threatened Species
(Mendonça and Lins, 2000). This species has been subjected to demographic decline,
mainly due to habitat destruction by anthropogenic pressure: agricultural development, open
areas for cattle-pasture and production of charcoal (http://www.iucnredlist.org).
Dimorphandra mollis is a widespread tree species, distributed in Brazilian Cerrado
through the states of Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais and São Paulo
(Silva, 1986; http://www.ibama.gov.br), and also Pará, Mato Grosso do Sul, Amazonas,
Maranhão and Piauí (http://www.ibama.gov.br). In addition, this species also occurs in
Bolivia and Paraguay (Silva, 1986). Dimorphandra mollis has a high economic value, being
utilized in the pharmaceutical and cosmetic industries. The pharmacological activity of this
plant is mainly due to the total flavonoids content of its fruits. Rutin, the main active
component, is a flavonic heteroside showing anti-oxidant, antiviral, anti-tumoral and anti-
inflammatory activities (Féres et al., 2006). Rutin is widely used to produce medicines for
human circulatory diseases and is also extracted in Brazil from other species of the genera
11
Dimorphandra (Gomes and Gomes, 2000). Although the rutin from D. wilsonii does not
appear to have been used by local populations, it has also a good exploitation potential, but it
was never explored because of its small population size and the lack of the knowledge about
the species.
In recent years, the technique of inter-simple sequence repeats (ISSR) has been
utilized in the detection of genetic diversity and conservation of many species (Ge et al.,
2005; Péres-Collazos and Catalán, 2007; Kothera et al., 2007; Li and Jin, 2007). ISSR is a
technique that involves PCR amplifications of DNA using a single-primer composed of a
microsatellite sequence anchored at 3’ or 5’ end by 2 to 4 arbitrary, often degenerate
nucleotides (Gupta et al., 1994; Zietkiewicz et al., 1994). This method requires no prior
knowledge of the genome under investigation (Bornet and Branchard, 2001) and may reveal
a high number of polymorphic fragments per primer, since the sequences that ISSRs target
are abundant throughout the eukaryotic genome and evolve quickly (Fang and Roose, 1997;
Esselman et al., 1999). These features make the ISSR good markers to establish genetic
variation in endangered species from which little or none genetic information is available.
The objective of this study was to analyze the levels of genetic diversity and the
spatial distribution of ISSR variation in the extremely endangered D. wilsonni. We made
inferences about the genetic diversity and threat of this species comparing its genetic data
with those of the congeneric widespread D. mollis. Other fundamental objective was to use
the genetic information to suggest effective measures of management for protecting D.
wilsonii.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Fresh leaf samples from all 14 adult individuals from D. wilsonii were collected in the
two single extant populations (Paraopeba/Caetanópolis and Pequi) in Minas Gerais (Table 1
and Fig 1). The individuals of D. wilsonii are distributed in five private properties, being four
(Par
(1-9),
Par
10
, Par
11
, Par
12
) in Paraopeba and Caetanópolis and one (Peq
(1-2)
) in Pequi
12
(Table 2). In property Par
(1-9)
there was nine remaining trees, one of which died during this
study, but it continued to be analyzed because their seeds are in vitro conserved. Properties
Par
10
, Par
11
, Par
12
have only one tree each. In Pequi, property Peq
(1-2)
has two remaining
trees.
Eight natural populations of D. mollis were sampled in Minas Gerais (Frutal, Caatinga,
Patos de Minas, Papagaios, Bambuí, Paineiras), São Paulo (Paranapanema) and Goiás
(Alto Paraíso) States of Brazil (Table 1 and Fig.1). In each population, leaves were sampled
from 22 to 23 adult individuals. The samples were kept on ice in the field and then taken to
the laboratory, where they were stored at -70 ºC until DNA extraction.
DNA isolation
In D. wilsonii, approximately 200mg of frozen leaves were used for DNA extraction
according to Doyle and Doyle (1987) method, slightly modified as suggested by Ferreira and
Grattapaglia (1995). The cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) protocol uses the
following buffer: 100 mM Tris pH 8.0, 20 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 1.4 M
NaCl, 3 % CTAB, 1 % polyvinylpyrolidone (PVP) and 2 % β-mercaptoethanol. In D. mollis,
several DNA extraction protocols were tested to overcome the problems that arised when
extracting DNA, mainly caused by polysaccharides that gave a viscous consistency to DNA
in solution. The method that yielded better quality DNA was that described by Jobes et al.
(1995). This protocol uses the following buffer: 100 mM sodium acetate pH 4.8, 100 mM
EDTA pH 8.0, 500 mM sodium chloride, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2% PVP, pH adjusted to
5.5 and 100 µg/ml proteinase K added immediately prior to use. In both species, DNA was
visually quantified by comparison with standard DNA concentrations in 0.8 % agarose gels.
The DNA was diluted in double-distilled water up to a final concentration of ≅ 5 ng/µL prior to
PCR amplifications.
13
ISSR-PCR
PCR amplifications were carried out in a total volume of 19 µL, containing 20 ng of template
DNA, 2.0 µL 10x PCR buffer, 0.21 mM dNTPs, 0.32µM primer, 1 unit of Taq polymerase
(Phoneutria) and double-distilled water. The reactions were performed in a Mastercycler
thermocycler (Eppendorf). The program consisted of an initial denaturation of 94 ºC for 4 min
(initial denaturation), followed by 37 cycles of 1 min at 94 ºC, 2 min at 46.1 – 50.1 ºC
(depending on the primer), 2 min at 72 ºC and a final extension of 7 min at 72 ºC. A negative
control, in which template DNA was omitted, was included in each PCR. Amplification
products were electrophoretically separated at a constant voltage of 60 V for 4h in 1,5 %
agarose gels with 0.5X TAE buffer, stained with ethidium bromide and photographed under
UV light. A 100 bp DNA ladder was used to estimate the molecular size of the fragments.
Thirty primers were tested to identify those that produced sharp and reproducible markers.
For these tests, two individuals from two populations of each species were randomly chosen.
The twelve primers selected for this study were used to amplify all DNAs from D. wilsonii and
D. mollis (Table 3). Positive controls were carried out using DNAs from individuals of other
populations and of other species, from which amplification profiles were already known from
previous gels. This procedure allowed us to compare gel photographs, monitor the
reproducibility of the technique and easily compare the amplification profiles of the two
species.
Data analysis
The presence and absence of fragments amplified by ISSR were visually scored
assuming that amplified products of similar molecular size, scored for the same primer, were
homologous. ISSR bands were scored as 1 (presence) or 0 (absence) and a matrix of ISSR
phenotypes was assembled. Only data from intensely stained unambiguous, clear bands
were used for statistical analysis.
The software program POPGENE v. 1.32 (Yeh et al., 1997) was used to obtain the
genetic diversity parameters: percentage of polymorphic loci (P) and Shannon’s index of
14
phenotypic diversity (H
o
). This index was estimated as Ho = - ∑p
i
log
2
p
i
/ n, where p
i
is the
frequency of presence or absence of the band and n is the number of markers evaluated.
Analyses of Molecular Variance (AMOVA) were performed using Arlequin version 2.0
(Schneider et al., 2000) to estimate variance components and to partition the variation of
each species within and between populations. Statistical significance of the proportion of
variance associated with the fixation index φST was determined through permutation tests
against a null distribution generated by the data.
Nei’s unbiased genetic distances (1978) were calculated for all population pairs of D.
mollis and used to construct a phylogenetic tree (UPGMA) using MEGA 3.0 (Kumar et al.
2004). Genetic relationships among D. wilsonii individuals were estimated using similarity
coefficients and UPGMA cluster analysis with the NtSYSpc v. 2.02i (Rohlf, 2002). Genetic
similarity between individuals was estimated using the similarity coefficient of Dice (1945).
RESULTS
Among the 30 screened primers, 12 showed better resolution in the amplification
profiles and were used for the analysis of the entire dataset (Table 3). Using these primers
produced 133 bands were obtained in the two species studied, being 115 bands from D.
mollis and 104 from D. wilsonii, with 86 fragments common to both species. Each primer
yielded between five and 15 bands ranging in size from 250 to 2200 bp.
In D. wilsonii, among the 104 bands, 37 were polymorphic at the species level
(35.6%), while the percentage of polymorphic loci for each population was 25% for
Paraopeba and 10.6% for Pequi. In D. mollis, among 115 bands, 81 were polymorphic at the
species level (70.4%), while a mean of 33.1% of the loci were polymorphic in the
populations, varying from 25.2% to 43.5% (Table 4). Although the number of polymorphic
fragments was approximately two times higher in D. mollis than in D. wilsonii, there were
populations with similar levels of polymorphic loci in both species (Table 4).
Estimates of Shannon’s index are in accordance with the data of percentage of
polymorphic fragments (Table 4). In D. wilsonii the Shannon’s index was 0.065 in Pequi and
15
0.126 in Paraopeba and 0.168 considering the two populations together. In D. mollis the
Shannon´s index ranged from 0.133 to 0.240, with an average of 0.178 at the population
level, and 0.297 at the species level. Among the eight populations, Caatinga exhibited the
higher level of variability (0.240), whereas the population from Frutal showed the lower level
of variability (0.133). It is interesting to notice that populations from Frutal and Papagaios
also exhibited similar levels to Paraopeba, the larger area of D. wilsonii, both for Shannon’s
index and for the percentage of polymorphic loci.
The AMOVA allowed the partitioning of the ISSR variation between species and
within and among populations of each species. The AMOVA analysis, performed to estimate
the genetic separation of the two species, demonstrated that the difference between D.
wilsonii and D. mollis accounted for 53.8% of the total variation, indicating a considerable
genetic distance between them. The analyses also showed that the partition of variation was
different in each species. In D. wilsonii, the genetic variation was equally distributed among
and within of populations, 50.9% and 49.1%, respectively. On the other hand, D.mollis
showed that most of its genetic diversity was within (60.7%) rather than between populations
(39.3%) (Table 5).
An UPGMA dendrogram of the eight populations from D. mollis was constructed
based on the Nei’s unbiased genetic distance (Fig. 2). The greatest genetic distance values
were those between population Ap and the other populations, followed by Fru and Caa. The
matrix of pairwise genetic distances was not significantly correlated with the corresponding
matrix of geographic distances (Mantel tests; =0.456, P = 0.09). Therefore, differentiation
observed among populations did not correspond directly to the geographic distance. The
populations Bam and Pt were clustered into one group, while the populations Par, Pai and
Pa were clustered into the other group.
The dendrogram obtained for D. wilsonii using UPGMA based on the similarity
coefficient of Dice among individuals shows their separation in two groups, corresponding to
Paraopeba and Pequi populations (Fig. 3). Within Paraopeba, however there is not a
correspondence between similarity and spatial proximity. Individuals from area Par
(1-9)
16
(spatially close) cluster together with the individual Par
12
that was collected 11 Km away. On
the other hand, it is possible to observe the complete identity among four individuals from
area Par
(1-9)
(Par
3
to Par
6
), even though the genetic analysis was based on 104 markers.
DISCUSSION
This study using ISSR markers revealed low level of genetic diversity in D. wilsonii,
an endangered species with only 13 individuals in the wild, when compared with its
widespread congener D. mollis. The values for genetic diversity measures were considerably
lower in Dimorphandra wilsonii compared to D. mollis. These results reinforce the hypothesis
that endangered species with narrow distribution are genetically depauperate. Considering
that a decline in genetic variation may represent reduced ability to survive to environmental
changes and demographic fluctuations, resulting in an increased risk of extinction (Tansley
and Brown, 2000; Frankham et al., 2002), D. wilsonii is probably under severe threat. Its
habitat has been extremely threatened mainly by anthropogenic action and its distribution
has been reduced to a very restricted area. Furthermore, four individuals of D. wilsonii
showed identical ISSR phenotypes, what highlights the low genetic diversity of this species
and its risk of extinction. The presence of identical phenotypes, even though we used 104
markers, suggests that D. wilsonii can have also some type of asexual reproduction. This
can have important implications for the conservation and management of an endangered
species and we are currently verifying this hypothesis.
However, it should be noted that Paraopeba population of D. wilsonii showed similar
values of genetic variation compared to two populations of D. mollis, Frutal and Papagaios. It
is probable that the 12 individuals from Paraopeba, here grouped as a single population,
represent the remnant individuals of several populations and this would explain why the
genetic diversity of this population is comparable to other populations of D. mollis. The two
populations of D. mollis with lower levels of diversity are in regions overexploited by
agriculture and cattle activities. Although Dimorphandra mollis is widely distributed
17
throughout the Cerrado, some authors consider it is also at extinction risk based on its
severe habitat destruction (Chaves and Usberti, 2003).
Among the characteristics of plants life history, the mating system is highly related
with genetic structure. Generally, high within-population genetic diversity is found in
outcrossing rather than in selfing plant species (Hamrick and Godt, 1989; Nybom and
Bartish, 2000; Culley and Wolfe, 2001; Nybom, 2004). The value of among-population
diversity in D. mollis (39.3%) suggests that this species shows mixed breeding system,
according to the review of Nybom (2004) from RAPD, ISSR and AFLP data. Dimorphandra
mollis is pollinated by small insects and its seeds are dispersed by mammals (Gonçalves,
2006). Although not yet described, it is probable that both D. mollis, and D. wilsonii share the
same pollinators and seed dispersors, considering the morphological and ecological
similarities between them. Dimorphandra wilsonii showed higher differentiation between
populations than D. mollis. The small number of remnant individuals of D. wilsonii, that are
considerable apart from each other may have leaded to increased levels of inbreeding
through selfing or mating among closely related individuals. This process together with
increased genetic drift due to small population size, would probably lead to this high genetic
differentiation between the two D. wilsonii collection sites. In Paraopeba population, several
individuals are isolated from the remaining population and still producing seeds, suggesting
that D. wilsonii could present a reproduction strategy to allow individuals to adjust their
reproduction in response to their habitats changes. The mating systems of D. wilsonii and D.
mollis are still unknown and further studies of pollination biology are needed to elucidate this
point. The data showed here reinforce the importance of comparison among phylogenetically
related species to get insights about causes of low genetic diversity in endangered species.
Implications for conservation
The reduced number of extant individuals of D. wilsonii makes the species highly
susceptible to extinction and action for conservation should be taken immediately. The
situation is aggravated by the fact that of the 13 remaining trees, only nine genotypes for 104
18
ISSR markers were revealed. The fact that great part of the existing genetic diversity is found
among the two known populations of D. wilsonii indicates that to preserve the maximum
genetic diversity it is necessary to protect all individuals from both remaining populations.
Thus, areas pointed in this study have to be isolated and efficiently protected.
Conservation goals may be achieved by introducing individuals to new sites to
increase the number of conserved populations. Translocation and establishment of new
populations are frequently used to reduce extinction risk of rare plant species (Holl and
Hayes, 2006). Genetic analysis may help in the selection of the best genotypes and
populations for reintroduction, whereas to delineate a successful ex situ conservation
management plan for an endangered species is necessary to know the genetic diversity and
its distribution in the source population (Segarra-Moragues et al., 2005). However, due to
high levels of genetic differentiation between populations of D. wilsonii, any translocation of
seeds or seedlings among them should be avoided, to prevent possible exogamic
depression (Edmands, 2007). As extant plants of D. wilsonii produce many fruits with
several seeds in each, strategy such as ex situ preservation of seeds is recommended.
Considering the considerable genetic diversity existing in Paraopeba, we propose
reinforcement with seedlings from the same population to increase the population size,
considering that these remaining areas should be protected to prevent further death of
seedlings/saplings. The introduction of seedlings is preferable to seeds in order to decrease
the losses related to the high mortality that occurs in the establishment, since this life stage is
a especially vulnerable one in the majority of plant species. Seedlings, which grow well in
nursery, are being produced by Fundação Zoo- Botânica (Belo Horizonte). We suggest that a
bank of seeds and seedlings sampled of all known remaining plants be permanently
maintained in nursery in botanical gardens or other institutions, identified according to the
mother plant. This material should be used for reintroduction, and it is important to prevent
the loss of further genetic diversity due to death of adult plants in the wild, as we know that
occurred in 2006. We propose that a great number of individuals, with special care to first
months in farms should be planted in a continuum between the areas of this population (15
19
km) to facilitate future gene flow among these plants. We also propose that a similar number
of progenies of each one of nine genotypes characterized here should be used in an attempt
to increase the effective population size and to maximize the genetic diversity. Similar
management could be made in Pequi, although the possibility of success is probably
reduced, considering that only two plants still exist. Another measure is the foundation of
new population in preserved areas located near to the region of Paraopeba. This measure
could increase the success of seedlings/saplings and adaptation to the environment, since
ecological conditions are similar to the area occupied by the remaining individuals today.
Additionally, a third proposition is the breeding of plants within the same population. The
costs and benefits of intra-specific hybridization is a major concern for conservation
programmes, whereas little is known about its consequences in outbreeding (Edmands,
2007). We propose that manual crossing could be tested involving flowers of some branches
of the trees, and pollen of several trees with unique genotypes of Paraopeba in an attempt to
maximize the genetic recombination, increase the genetic diversity and decrease the
inbreeding degree in the progenies. Seeds of these trees should be further collected, sown in
a green house and grown until to be transplanted in Paraopeba region. An other important
measure is to carry out surveys to uncover extant individuals and populations in other
localities. Probably, considering the critical situation of D. wilsonii, the safest way to preserve
the genetic diversity of this species is the utilization of the methods mentioned above.
In relation to Dimorphandra mollis, it is necessary alert for the depletion of genetic diversity in
some populations, possibly due to habitat destruction. Additionally in some regions, as the
north of Minas Gerais state, where the exploitation of fruits for rutin extraction is high, it is
necessary the establishment of sustainable management plans and adequate collection of
the fruits. Furthermore, the conduction of new studies about the status of genetic health of
this species is necessary.
20
Acknowledgements
This study was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais (FAPEMIG/Brazil). We thank F.M. Fernandes for help in sample collection. H. A. V.
Souza received a MSc fellowship from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais (FAPEMIG/Brazil)
21
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26
T
ABLE
1. Geographical location and sample size (N) of D. mollis and D. wilsonii populations
studied
Species Populations/State Population code Coordinates N
D. mollis Bambuí/MG Bam 20º04’ S 46º02’ W 23
Caatinga/MG Caa 17º13’ S 46º03’ W 22
Frutal/MG Fru 20º00’ S 48º55’ W 23
Paineiras/MG Pai 18º54’ S 45º31’ W 23
Papagaios/MG Pap 19º26’ S 44º41’ W 23
Patos/MG Pat 18º42’ S 46º36’ W 23
Alto Paraíso/GO Alp 14º10’ S 47º49’ W 23
Paranapanema/SP Par 23º23’ S 48º43’ W 22
D. wilsonii Paraopeba/MG Pao 19º15’ S 44º25’ W 12
Pequi/MG Peq 19º38’ S 44º36’ W 2
27
T
ABLE
2. Matrix of geographic distances (in kilometers) between the areas of
Paraopeba population (Par
(1-9),
Par
10
, Par
11
and Par
12
) and Pequi population
(Peq
(1-2)
) of D. wilsonii
Par
(1-9)
Par
10
Par
11
Par
12
Peq
(1-2)
Par
(1-9)
****
Par
10
8.45 ****
Par
11
6.52 14.62 ****
Par
12
11.00 15.34 13.89 ****
Peq
(1-2)
46.85 39.95 50.69 55.23 ****
28
T
ABLE
3. ISSR primer sequences, number of polymorphic fragments, total fragments number
and percentage of polymorphic fragments (in parentheses) for D. wilsonii and D. mollis
Nº. of polymorphic fragments/
total nº. of fragments (%)
Primer code Primer sequence* ( 5' - 3' ) D. wilsonii D. mollis
UBC 827 (AC)8G 1 / 14 (07.1) 9 / 15 (60.0)
UBC 840 (GA)8YT 4 / 12 (33.3) 6 / 11 (54.5)
UBC 880 (GGAGA)3 6 / 8 (75.0) 8 / 8 (100.0)
UBC 899 (CA)6RG 4 / 10 (40.0) 12 / 13 (92.3)
Becky (CA)7YC 5 / 7 (71.4) 14 / 14 (100.0)
Chris (CA)7YG 1 / 6 (16.6) 3 / 5 (60.0)
Dat (GA)7RG 2 / 8 (25.0) 6 / 8 (75.0)
Goofy (GT)7YG 6 / 8 (75.0) 6 / 7 (85.7)
John (AG)7YC 4 / 7 (57.1) 4 / 10 (40.0)
Manny (CAC)4RC 3 / 8 (37.5) 8 / 10 (80.0)
Mao (CTC)4RC 1 / 8 (12.5) 2 / 6 (33.3)
Terry (GTG)3 GGTGRC 0 / 8 (0.00) 3 / 8 (37.5)
Total 37 / 104 (35,6) 81 / 115 (70,4)
*Nucleotide abbreviations: Y = C or T; R = A or G
29
T
ABLE
4. Parameters of genetic variability in populations of D. mollis and D. wilsonii
Population Shannon's Diversity index ( ± SD ) % Polymorphic fragments
D. mollis
Frutal 0.133 (± 0.244) 25.2
Papagaios 0.145 (± 0.254) 26.0
Patos 0.161 (± 0.260) 31.3
Alto Paraíso 0.181 (± 0.275) 33.9
Paranapanema 0.189 (± 0.280) 33.9
Paineiras 0.185 (± 0.271) 34.8
Bambuí 0.188 (± 0.267) 36.5
Caatinga 0.240 (± 0.286) 43.4
Mean 0.178 (± 0.267) 33.1
Species 0.297 (± 0.255) 70.4
D. wilsonii
Pequi 0.065 (± 0.188) 10.5
Paraopeba 0.124 (± 0.235) 24.8
Mean 0.095 (± 0.212) 14.6
Species 0.168 (± 0.246) 35.6
30
T
ABLE
5. Analysis of molecular variance (AMOVA) for D. wilsonii and D. mollis populations
Source of variation
d.f.
Sum of squares
Variance components
% of total variance
P-
value
Among species
1
335.767
11.034
53.8
< 0.05
Among populations/within species
8
659.567
3.774
18.4
< 0.001
Within populations
186
1.062.048
5.709
27.8
< 0.001
D. mollis
Among populations
7
640.520
3.767
39.3
< 0.001
Within populations
174
1.011.881
5.815
60.7
< 0.001
D. wilsonii
Among populations
1
19.048
4.336
50.9
< 0.01
Within populations
12
50.167
4.180
49.1
< 0.01
31
F
IG
. 1. Map showing the locations of the two Dimorphandra wilsonii populations (Pao
and Peq, represented by full circles) and the eight D. mollis populations (Alp, Caa,
Pat, Pai, Pap, Bam, Fru and Par, represented by squares) analyzed in this study.
See text for reference to the abbreviations.
GO
SP
MG
Peq
Pao
Pap
GO
SP
MG
Peq
Pao
Pap
32
F
IG
. 2. UPGMA dendrogram based on Nei’s (1978) unbiased genetic distance for
eight populations of Dimorphandra mollis.
Pai(MG)
Par(SP)
Pap(MG)
Bam(MG)
Pat(MG)
Caa(MG)
Fru(MG)
Alp(GO)
0.000.010.020.030.040.050.060.07
33
F
IG
. 3: UPGMA cluster analysis of Dimorphandra wilsonii individuals. Bar scale
represents coefficient of genetic similarity.
34
CONCLUSÕES
As análises genéticas de populações de Dimorphandra mollis e D. wilsonii realizadas a partir
de marcadores moleculares do tipo ISSR, permitiram chegar às seguintes conclusões:
• A distribuição da diversidade genética foi diferente em cada espécie. Em D. wilsonii,
a variação genética foi igualmente distribuída dentro e entre populações, enquanto
que em D. mollis a maior parte da diversidade genética é atribuída às diferenças
entre os indivíduos dentro das populações;
• Os níveis de variação genética intrapopulacional foram diferentes para as duas
espécies analisadas. De maneira geral, as populações de D. mollis apresentaram
maior variação do que as populações de D. wilsonii;
• A maior população de D. wilsonii, localizada em Paraopeba, pode representar
remanescentes de várias populações originalmente existentes nesse local o que
pode explicar sua diversidade comparável à outras duas populações de D. mollis;
• O fato de quatro entre 14 indivíduos de D. wilsonii apresentarem o mesmo fenótipo
para os 104 marcadores ISSR aqui analisados ressalta a baixa diversidade genética
da espécie e seu risco de extinção e sugere que essa espécie deve apresentar
algum tipo de reprodução assexuada;
• Devido à alta diferenciação entre as populações de D. wilsonii deve-se evitar
qualquer tipo de fluxo gênico entre elas para prevenir possíveis eventos de
depressão exogâmica;
• Algumas estratégias de conservação são recomendadas para D. wilsonii, tais como:
preservação ex situ das sementes; reforço das populações com a introdução de
mudas da mesma população ao longo das áreas existentes entre os indivíduos de
Paraopeba; cruzamentos controlados; fundação de novas populações em áreas de
reserva próximas aos locais onde existem as atuais populações; procura de novos
indivíduos e populações;
• Com relação a D. mollis é importante alertar para a baixa diversidade encontrada em
algumas das populações analisadas, provavelmente devido à intensa destruição de
seu habitat, sendo necessário estabelecer planos de manejo sustentável e coleta
adequada dos frutos em regiões onde a espécie é intensamente explorada.
35
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