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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIA
CULTURA DE TECIDOS EM GERBERA
RITA DE CÁSSIA ALVES NUNES
Presidente Prudente – SP
2008
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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIA
CULTURA DE TECIDOS EM GERBERA
RITA DE CÁSSIA ALVES NUNES
Dissertação apresentada a Pró Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade o
Oeste Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Agronomia.
Área de concentração: Produção Vegetal.
Orientador:
Prof. Nelson Barbosa Machado Neto, Dr.
Presidente Prudente – SP
2008
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660.6 Nunes, Rita Cássia Alves
N972c Cultura de tecido em Gérbera / Rita Cássia
Alves Nunes - Presidente Prudente: [s.n.], 2008.
58 f.
Dissertação (Mestrado em Agronomia) –
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE:
Presidente Prudente – SP, 2008.
Bibliografia
1. Cultura de tecidos. 2. Biotecnologia. 3.
Gerbera. I. Título.
RITA DE CÁSSIA ALVES NUNES
CULTURA DE TECIDOS EM GERBERA
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Agronomia.
Presidente Prudente, 25 de Abril de 2008.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Prof. Dr. Nelson Barbosa Machado Neto
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE
Presidente Prudente - SP
_______________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Ana Claudia Pacheco Santos
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE
Presidente Prudente - SP
________________________________________
Prof. Dr. Marcilio de Almeida
Universidade de São Paulo – ESALQ/USP
Piracicaba - SP
À minha família, tão importante
em todos os momentos da minha
vida. Minha querida mãe Santina
Bernava, a Tina e meus irmãos
Ricardo e Renato.
Ofereço
Ao soberano
D
D
E
E
U
U
S
S pela vida.
Dedico
“...sevimaislonge,foiporestarsobreombrosdegigantes”
SirIsaacNewton(1643‐1727)
AGRADECIMENTOS
Minha gratidão e admiração ao professor Dr. Nelson Barbosa Machado Neto, pela
orientação e amizade durante todo o período de elaboração e de execução deste trabalho;
Aos professores do programa de pós-graduação em Agronomia pelos ensinamentos e pela
oportunidade de realização do curso;
Aos funcionários dos laboratórios do bloco Q (3° piso) da Unoeste – Eliséia de Paulo,
Vânia, Cirlene, Edna, Luciana e em especial a Márcia Guaberto, pela amizade e serviços
prestados;
À Universidade do Oeste Paulista – Unoeste, pela oportunidade de aperfeiçoamento;
Ao professor Dr. Osimar de Carvalho Sanches e a técnica Cleo Trevisan do laboratório de
patologia, pelo ensinamento das técnicas histológicas;
Aos meus amigos Miléia Ricci Pícolo, Leila Pavanelli, Daniel Santa Cruz Damineli, Maria
Teresa Portes (Maitê), Brigiane Longui, Diego Minuando, Renato Tadeu Guerreiro e
Agnaldo Masao Sato (Satinho) pela troca de experiências e amizade durante esta jornada;
A Professora Ms. Daniela Ramos Rodrigues, amiga querida de todas as horas, pelo apoio
fundamental no percurso deste desafio;
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma e em qualquer etapa, para a realização
deste trabalho.
RESUMO GERAL
Cultura de tecidos em Gerbera
As Gerberas são oriundas da África do Sul, pertencem à família Asteraceae e são
herbáceas dotadas de flores em capítulos. São muito populares e utilizadas como
planta decorativa de exterior, flores de corte e como organismo de experimentos. O
estado de São Paulo lidera o mercado de flores ornamentais no Brasil. Dentre as
várias espécies produzidas pelas empresas brasileiras, a Gerbera está inclusa com
boa aceitação no mercado. No início do século XX a micropropagação chama a
atenção de estudiosos, o pioneiro nesta área foi Haberlandt em 1902 com células de
tecidos somáticos. No Brasil os estudos sobre cultura de tecidos começam na
década de 50 em São Paulo no Instituto Biológico. O controle químico da
diferenciação da parte aérea foi observado em cultura de calo de tabaco. Esta foi à
constatação de que o processo de organogênese in vitro é controlado por
substâncias hormonais sendo que o desenvolvimento de parte aérea, raiz ou calo é
determinado pelo balanço entre auxinas e citocininas. Existem substâncias que,
quando presentes em pequenas quantidades, retardam ou inibem a oxidação de
substratos e podem agir em diferentes níveis da seqüência oxidativa, estas
substâncias são denominadas antioxidantes. Os organismos vivos possuem
mecanismos naturais de eliminação de radicais livres por intermédio de enzimas ou
não, impedindo sua transformação em produtos mais tóxicos para as células. A
enzima denominada superóxido dismutase, junto com outras são as principais
defesas antioxidantes que atuam nos organismos superiores.
Palavras chave: Cultura de tecido; Biotecnologia; Gerbera
ABSTRACT GERAL
Gerbera Tissue culture
Gerbera, from South Africa, belongs to Asteraceae family. They are herbaceous with
flowers grouped in a head inflorescence. They are very popular and used as
decorative garden plant, cut flowers and as experimental organism. São Paulo state
leads the market of Brazilian ornamental flowers. Among the species produced by
Brazilian companies, Gerbera is one of the very well accepted into the market. In the
beginning XX
th
century micro propagation calls the attention of scientists; the pioneer
was Haberlandt in 1902 with somatic cells. The studies on tissue culture, in Brazil,
started at the 50´s in São Paulo Biological Institute. The chemical control of the
differentiation of the aerial part was observed in culture of tobacco callus. This was
the observation that the in vitro organogenesis process is controlled by hormonal
substances that control the development in canopy, root or callus depending on the
balance between auxins and cytokines. Some substances, even when in small
amounts, delay or inhibit the substratum oxidation and can act at different levels on
the oxidative sequence, these substances are called antioxidants. The living
organisms possess natural scavenging mechanisms, enzymatically or not, of free
radicals, not allowing their transformation in more toxic products for the cells. The
enzyme superoxide dismutase, together with others is the main antioxidant defences
that act in eukaryotic organisms.
Key words: Tissue culture; Biotechnology; Gerbera
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANA ácido naftaleno acético
NOA ácido β naphtoxy-acético
O
2•-
ânion ou radical superóxido
atm atmosfera
BAP benzilaminopurina
EDTA etilenodiamino tetraacetato
g grama
g/L grama por litro
°C grau Celsius
HO
•
hidroxila
µL microlitro
µM micromolar
mg/L miligrama por litro
mM milimolar
M molar
MS Murashige e Skoog
ηm
nanômetro
NBT nitro blue tetrazólium
H2O2 peróxido de Hidrogênio
pH potencial de Hidrogênio
Mn SOD superóxido dimutase dependente de manganês
SOD superóxido dismutase
CuZn SOD superóxido dismutase dependente de cobre e zinco
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL 11
1.1 Histórico 11
1.2 Produção e Comercialização de Flores 13
1.3 Cultura de Tecidos 14
1.4 Reguladores do Crescimento Vegetal 17
1.5 Embriogênese Somática 18
1.5.1 Enbriogênese direta 19
1.5.2 Enbriogênese indireta 19
1.6 Antioxidantes 19
1.6.1 Superóxido dismutase 20
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 22
2 ARTIGO I: CALOGÊNESE EM EXPLANTES FOLIARES DE GÉRBERA
DE VASO ((Gerbera Jamesonii) 25
RESUMO 25
ABSTRACT 25
2.1 Introdução 26
2.2 Material e Métodos 31
2.3 Resultados e Discussão 32
2.4 Conclusão 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40
3 ARTIGO II: AVALIAÇÃO DO ÁCIDO β NAPHYTOX-ACÉTICO NA
FORMAÇÃO DE CALOS EM SEGMENTOS FOLIARES DE GERBERA
(Gérbera Jamesoni)i
45
RESUMO
45
ABSTRACT
45
3.1 Introdução
46
3.2 Material e Métodos 48
3.3 Resultados e Discussão
49
3.4 Conclusão
55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56
11
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Histórico
A Gerbera ocorre naturalmente na América do Sul, África, Madagascar
e na Ásia tropical. A primeira descrição botânica foi publicada por Joseph Dalton
Hooker no Curtis Botanical Magazine de 1889, descrevendo a Gerbera jamesonii,
uma espécie sul-africana hoje conhecida por margarida-do-Transvaal.
Em 1737 o naturalista holandês Jan Frederic Gronovius atribuiu o
nome Gerbera ao gênero, em homenagem a Traugott Gerber, um médico e
naturalista alemão que trabalhou na Rússia. O nome vulgar Gerbera, é aplicado
indistintamente às espécies do gênero e às suas flores (figura 1), as quais são em
geral comercializadas sob aquela designação, muitas vezes seguidas de uma
indicação específica ou varietal como, por exemplo, gerbera-do-Transvaal, ou
gerbera-púrpura.
FIGURA 1 - Gerbera jamesonii
O gênero Gerbera inclui cerca de 30 espécies de plantas herbáceas
semiperenes da família das Asteraceae, dotadas de folhas basais, e flores reunidas
em capítulos solitários e multifloros com aproximadamente de 10 cm de diâmetro,
intensamente coloridos.
12
As espécies de Gerbera apresentam um grande capítulo, com floretas
bi-labíadas de cores variadas. O capítulo, que aparenta ser uma única flor, é na
realidade composto por centenas de flores individuais, cuja morfologia varia de
acordo com a sua posição no conjunto (figura 2)
FIGURA 2 – Compositae: 10-capítulo cortado lingitudinalmente (Senecio); 11-flor
lingulada do raio; 12-flor tubular do disco; 13-capítulo cortado
longitudinalmente (Helianthus); 15-flor tubular do disco
Fonte: BRANDÃO, A. (1983)
As espécies deste gênero são também utilizadas como organismos
experimentais em estudos de floração e de desenvolvimento meristemático da flor.
As Gerberas contêm derivados naturais da cumarina com interesse fitoquímico e de
controle biológico.
São muito populares e muito utilizadas como plantas decorativas de
exterior e para a produção de flores de corte. Os cultivares mais comuns, são os
resultantes da hibridização entre a Gerbera jamesonii e a Gerbera viridifolia, outra
13
espécie sul-africana. O híbrido é conhecido por Gerbera hybrida e dele existem
alguns milhares de cultivares com grande variabilidade nas características florais,
com diferentes tamanhos e formas da flor e com cores que vão do branco ao
amarelo, laranja, vermelho, rosa e púrpura. Existe cultivares que produzem flores
com o centro negro e com pétalas variegadas.
1.2 Produção e Comercialização de Flores
A produção de flores e plantas ornamentais no Brasil está concentrada
no Estado de São Paulo. De acordo com Florabrasilis
∗
(2002), o faturamento mensal
do varejo foi na ordem de R$ 13,8 milhões, valor obtido a partir de levantamento
realizado em 12 estados brasileiros, em 53 de suas principais cidades, entre abril e
outubro de 2002. Neste ramo, nota-se um desempenho e um papel relevante em
termos de volume comercializado, e São Paulo destaca-se em relação aos demais
estados com R$ 5,8 milhões de vendas mensalmente, correspondendo a 42,50% do
valor total adquirido pelo varejo no Brasil. A exportação de flores e plantas foi de
US$ 13 milhões em 1999, US$ 11,9 milhões em 2000 e US$ 13,3 milhões em 2001
(BRASIL, 2004).
Algumas empresas produzem no Brasil, cerca de 40 mil mudas por
mês para venda aos floricultores. São várias orquídeas – dos gêneros Phalaenopsis,
Dendrobium, Oncidium, a chuva de ouro, e Paphiopedilum, mais conhecida como
sapatinho, Catleya e Laelia, além de incontáveis híbridos. A produção abrange
outras plantas de boa aceitação comercial como Gerbera (Gerbera), Kalanchoe,
samambaias (Dicksonia e Polypodim) e filodendros (Philodendron).
Segundo Fáril e Melo (1996), a micropropagação de espécies de
importância agrícola tem grande aplicabilidade no processo de produção industrial. A
clonagem in vitro é um procedimento significante, na multiplicação de espécies
ornamentais, frutíferas e essências florestais, tanto em países desenvolvidos quanto
∗
Programa Brasileiro de Exportação de Flores e Plantas Ornamentais – Florabrasilis.
14
em desenvolvimento. Atualmente, milhares de pequenas, médias e grandes
empresas produzem de 10.000 a mais de 1.000.000 e espécimes de plantas in vitro
por ano.
Os problemas principais neste tipo de empreendimento são: (1) o
investimento na produção é relativamente alto, e; (2) o valor biológico das mudas
micropropagadas é em certas condições instável (AITKEN-CHRISTIE, 1992).
Conforme Blanco (2001), a propagação da Gerbera é realizada por
meio de sementes ou divisão de touceiras. Como há grande amplitude de cores,
com mais de 20 tonalidades, e florescem praticamente o ano todo, são muito
requisitadas para arranjos florais. De acordo com informações do setor de comércio
de flores, em 2002, havia 68 variedades distintas de Gerberas sendo cultivadas no
Brasil.
No verão as flores têm maior produtividade, implicando menor tempo
de produção. No inverno a sua formação é melhor, porém seu ciclo é mais longo. No
entanto, Kessler Junior (1999), cita que o período de produção pode variar de
quatorze a dezoito semanas, a partir do plantio das sementes.
1.3 Cultura de Tecidos
Desde o início do século XX que a propagação de plantas in vitro tem
chamado à atenção de estudiosos. Segundo Krikorian e Berquam (1969) o pioneiro
no cultivo de células de tecidos somáticos foi Haberlandt, que em 1902 cultivou
várias espécies de plantas em solução nutritiva. Seus trabalhos tiveram base na
totipotêncialidade das células, teoria proposta por Schleiden, em 1838, e Schwann,
1839 (GAUTHERET, 1983). Não houve sucesso em seus ensaios, pois não ocorreu
divisão celular, possivelmente por falta de reguladores vegetais no meio nutritivo. Até
então estes compostos não eram conhecidos bem como a utilização de espécies
inadequadas e a baixa densidade de inoculo e explante de tecidos maduros.
Torres et al. (1998) citam em seu trabalho que Hannig em 1904 cultivou
pela primeira vez in vitro, embriões imaturos de crucíferas. Em suas observações viu
a necessidade de suplementar o meio mineral com sacarose para germinação dos
embriões, e demonstrou também o efeito de diferentes fontes de nitrogênio sobre a
15
morfologia. A partir destes eventos, as pesquisas nesta área têm contribuído muito
para o entendimento dos processos fisiológicos relacionados com a germinação.
Embriões de orquídeas cultivadas in vitro na ausência de micorrizas
foram obtidos por Knudson em 1922, e destacaram a importância da sacarose para
o crescimento e desenvolvimento destes embriões e ainda Dieterich no ano de 1924,
observou que embriões cultivados não apresentavam dormência. O primeiro a
destacar a prática da cultura de embriões no melhoramento genético foi Laibach em
1925, recuperando plantas híbridas de cruzamentos incompatíveis (TORRES et al.,
1998).
Morel e Martin (1952) conseguiram recuperar plantas de dália livres do
vírus do mosaico a partir da cultura de ápices caulinares, deste então, a cultura de
tecidos teve início marcante em suas aplicações práticas. Utilizando-se desta
mesma metodologia posteriormente estes pesquisadores obtiveram plantas de
orquídeas isentas de vírus. A formação de embriões somáticos foi observada pela
primeira vez por Steward et al. (1958) e Reinert (1959) em calos de cenoura. Esta
técnica tem grande importância para a propagação de plantas em grande escala,
lançando mão de um pequeno espaço para instalação do laboratório.
Murashigue e Skoog (1962), obtiveram crescimento de 4 a 5 vezes
maior em cultura de calo quando adicionado extrato de folhas de fumo ao meio.
Esse foi o ponto inicial para a elaboração do meio MS, o mais utilizado atualmente
em trabalhos de cultura de tecidos.
No Brasil, os trabalhos realizados sobre cultura de tecidos, foram feitos
pioneiramente no Instituto Biológico de São Paulo na década de 50. Atualmente,
existem dezenas de laboratórios utilizando metodologias diversificadas de
manipulação de plantas in vitro, desenvolvendo trabalhos no campo da engenharia
genética de plantas e obtendo cultivares de plantas transgênicas, como exemplo,
cultivares de plantas de batata resistentes ao vírus PVY (TORRES et al., 1998).
A idéia da clonagem vegetal, cultivando-se células isoladas de planta
estudada por Haberlandt, remetia para a questão de como fazer uma célula
especializada, que estava programada para desempenhar determinadas funções
dentro do organismo, voltar a ter características embrionárias e a capacidade de
produzir um novo ser. Mesmo estando à ciência em pleno século XXI, a cultura de
tecidos vegetais a partir da desdiferenciação celular, torna-se um desafio para
16
muitos pesquisadores que buscam nesta linha de pesquisa chegar a descobertas
importantes.
Pode-se estabelecer um sistema de cultura de células somáticas,
através de uma ordem: a) Tecido diferenciado; b) Massa de células indiferenciadas;
c) Órgão, tecido, organismo. Conforme Murashige (1974), a cultura de tecidos
vegetais abrange três fases básicas:
Fase I) seleção dos exemplares, limpeza e cultura em meio nutritivo
sob condições assépticas. Entretanto, Deberg e Read (1991) citam que um “estádio
zero” poderia ser acrescentado, como forma de contornar os graves problemas de
contaminação relacionados com explantes oriundos de casa de vegetação ou do
campo. Todavia, procurar-se-ia cultivar as plantas matrizes em condições
controladas garantindo um bom estado fitossanitário, resultando em baixos índices
de contaminação quando do cultivo in vitro;
Fase II) multiplicação dos propágulos através de sucessivos
subcultivos em meio apropriado para a multiplicação;
Fase III) transferência dos brotos produzidos para meio de
enraizamento e transplantio subseqüente das plantas obtidas, para um substrato
adequado. A planta passa de uma situação de reduzido fluxo transpiratório, devido à
baixa irradiância e a elevada umidade relativa, para um ambiente que demanda um
incremento na taxa de transpiração, ficando muito suscetível ao estresse hídrico.
Ainda, a planta passa de uma existência heterotrófica, na qual depende do
suprimento exógeno de energia (fonte de açúcar no meio) e da alta disponibilidade
de nutrientes, para um estado autotrófico, no qual precisa realizar fotossíntese e
incrementar rapidamente a absorção de nutrientes para sobreviver
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990).
Técnicas de cultura de tecidos vegetais, podem se transformar em
ferramentas auxiliares eficazes para o melhoramento de plantas. A seguir algumas
vantagens:
a) Como a multiplicação massal de um genótipo superior é possível em
qualquer estágio de um programa de melhoramento, a micropropagação tem o
potencial de promover o aumento de ganhos genéticos em apenas uma geração;
b) A propagação massal pela clonagem de genótipos superiores
captura os componentes aditivos e não aditivos da variância genética;
17
c) Genes desejáveis de clones selecionados podem ser mantidos em
um banco genético na forma de pomares clonais, onde podem ser recombinados
através de cruzamentos dirigidos;
d) Interações genótipo-ambiente podem ser estudadas com mais
critério em populações clonais;
e) A seleção clonal in vitro e a micropropagação pode ser utilizada para
a produção de genótipos superiores e o tempo necessário para produzir grandes
quantidades de plantas é menor no programa clonal do que em um programa
baseado nos pomares clonais;
f) Técnica de cultura de tecidos possibilita a produção de um grande
número de progenitores geneticamente uniformes para a produção de sementes
híbridas.
Desta forma, surgiu o evento da biotecnologia celular de plantas, que
utiliza e integra processos tecnológicos e bioquímicos, empregando-se células,
tecidos e órgãos de plantas superiores, visando à geração de produtos e serviços.
1.4 Reguladores do Crescimento Vegetal
O controle químico da diferenciação da parte aérea foi primeiramente
observado em cultura de calo de tabaco. Foi observada inibição na formação de
gemas por auxinas, e reversão deste efeito estimulando brotações utilizando-se
adenina bem como o fosfato inorgânico. Esta foi à constatação de que o processo
de organogênese in vitro é controlado por substâncias hormonais sendo que o
desenvolvimento de parte aérea, raiz ou calo é determinado pelo balanço entre
auxinas e citocininas
O balanço de auxinas e citocininas em alto/baixo favorece o
enraizamento e o balanço inverso promove a formação de parte aérea.
Concentrações iguais promovem a produção de calos. As auxinas mais usadas são:
AIA (ácido indol-3-acético), AIB (ácido indol-3-butírico), ANA (ácido naftaleno
acético), NOA (ácido β naphtoxy-acético) e 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético). As
auxinas 2,4-D e ANA são sintéticas e têm efeitos semelhantes às auxinas de
ocorrências naturais, sendo mais estáveis à degradação (AMMIRATO, 1983).
18
As citocininas de ocorrência natural são encontradas como moléculas
livres, não ligadas a nenhuma macromolécula. A síntese de citocinina ocorre em
raízes, em embriões em desenvolvimento e em tecidos de galhas da coroa
(RODRIGUES; LEITE, 2004).
Muitos compostos químicos com atividade de citocinina têm sido
sintetizados e testados. A maioria dos compostos com atividade de citocinina possui
uma substituição do N
6
da aminopurina.
As citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um papel
fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na maioria das espécies.
Induzem a divisão celular, proliferação e morfogênese da parte aérea. As citocininas
mais usadas em cultura de tecidos são a cinetina (KIN), benzilaminopurina (BAP),
zeatina (Zea) e thidiazuron (TDZ) (SANTIAGO et al., 2001).
1.5 Embriogênese Somática
O processo de indução de embriões somáticos a partir de tecidos
vegetais ou, mais usualmente, de calos derivados de explantes, em geral
embrionários; foi descrito pela primeira vez por Levine, em 1947, em culturas de
calos de cenoura. A formação de embriões somáticos se dá a partir de tecidos
somáticos, com constituição idêntica à da planta-mãe, a não ser nos casos em que
ocorre a embriogênese por via indireta, ou seja, passando pela formação de calos.
Para que ocorra embriogênese somática, as células diferenciadas devem ser
primeiro desdiferenciadas para serem consideradas como células embriogênicas
após a divisão celular (PASQUAL et al., 1997).
Esta técnica se fundamenta na totipotêncialidade das células vegetais,
por meio da regeneração in vitro, via organogênica ou embriogênica somática.
19
1.5.1 Embriogênese direta
De acordo com Bajaj (1992), os embriões somáticos são originados
diretamente do explante. A ocorrência de embriogênese direta tem sido registrada
em tecidos gametofíticos, esporofíticos e em tecidos que se originaram em função
da fertilização dos gametas. Este fenômeno ocorre com maior probabilidade em
micrósporos dentro da antera e tecidos de partes do ovário, incluindo as paredes do
ovário ou carpelos, óvulo, embrião zigótico ou plântulas jovens.
5.1.2 Embriogênese indireta
A embriogênese indireta requer que as células diferenciadas de um
explante sejam induzidas a formar calos não-diferenciados. Reinert (1959) cita que
na embriogênese somática indireta as células se apresentam em diferentes estágios
de diferenciação, com vários graus de determinação, e esta por sua vez podem
adquirir novas competências, mediadas por mensageiros químicos específicos.
Bajaj (1992) cita em seu trabalho que gemas axilares ou adventícias
podem induzir a formação de condutos procambiais no tecido maternal, esses
condutos na planta intacta estabelecem uma conexão entre broto novo e o sistema
vascular da planta-mãe, de modo contrário dos meristemas, que originam brotos e
raízes separadamente, esses embriões quase sempre se originam superficialmente
sobre calos e se desprendem com facilidade.
1.6 Antioxidantes
São quaisquer substâncias que, quando presentes em pequenas
concentrações, comparadas com aqueles substratos oxidáveis, significativamente
retardam ou inibem a oxidação deste substrato e podem agir em diferentes níveis da
seqüência oxidativa.
20
O organismo possui sistemas naturais de eliminação de radical livre por
intermédio de enzimas ou não, impedindo sua transformação em produtos mais
tóxicos para as células. O efeito prejudicial dos radicais livres ocorre quando eles
estão em quantidade excessiva no organismo, ultrapassando a capacidade do
organismo de neutralizá-los com os seus sistemas naturais. Esses sistemas
enzimáticos de defesa são compostos por diversas enzimas, dentre elas o
Superóxido-Dismutase os quais combatem no organismo os seguintes radicais
livres: Peróxido de Hidrogênio, Superóxido, Oxigênio Single, Íon Hidroxila, Óxido
Nítrico e Óxido Nitroso. Os antioxidantes destroem os radicais livres como o radical
superóxido e a hidroxila.
A enzima denominada superóxido dismutase, juntamente com a
catalase e glutationa peroxidase são as principais defesas antioxidantes que atuam
nos organismos superiores (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).
Conforme Halliwell e Gutteridge (1989), a superóxido dismutase (SOD)
tem papel fundamental na defesa do organismo contra as espécies reativas de
oxigênio, pois atua na remoção do radical superóxido. Antes da sua descoberta, a
SOD já havia sido descrita por alguns autores como uma proteína que contém cobre,
mas nenhuma atividade catalítica lhe havia sido atribuída.
Após o trabalho de McCord (1969), entretanto, com a determinação de
sua função na dismutação do radical superóxido seu papel foi estabelecido, e até
hoje, apesar de inúmeras pesquisas realizadas com esta enzima, nenhum outro
substrato foi descrito, mostrando a sua especificidade para o superóxido
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).
1.6.1 Superóxido dismutase
As moléculas de oxigênio diatômico na atmosfera terrestre são as
maiores promotoras de reações nas células vivas.
Segundo Halliwell e Gutteridge (1989), 95 a 98% do oxigênio absorvido
pelos organismos aeróbicos são reduzidos, formando-se água na cadeia respiratória
através do transporte de elétrons na mitocôndria e retículo endoplasmático, onde o
sistema enzimático citocromo, no processo de fosforilação oxidativa, procede à
21
redução tetravalente do O
2
pelo sistema citocromo-oxidase, fornecendo
simultaneamente quatro elétrons para o oxigênio.
(O
2
+ 4H + 4e
-
→ 2H
2
O)
Entretanto, de 2 a 5% do O
2
é reduzido univalentemente, processo em
que uma molécula recebe apenas um elétron, o qual vai ocupar um dos orbitais
externos, ao mesmo tempo em que o outro continua não pareado, produzindo
intermediários altamente reativos, denominados espécies reativas de oxigênio, que
algumas vezes constituem os radicais livres. Forma-se então a primeira espécie
tóxica reativa de oxigênio, o superóxido.
(O
2
+ e
-
→ O
2• -
)
A formação das espécies reativas de oxigênio se dá primeiramente
pelo o radical superóxido (O
2•-
), que pode ser dismutado em peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) ou mesmo através de ação catalítica, pela atuação da enzima superóxido
dismutase (SOD). No organismo existem duas SODs principais, uma citoplasmática,
que é a CuZnSOD e outra, mitocondrial, que é a MnSOD, esta contendo Manganês
e aquela contendo Cobre-Zinco na mesma molécula. A importância da SOD pode
ser demonstrada pelo fato de ser a enzima mais abundante do organismo, ao
mesmo tempo em que também é a quinta proteína mais abundante neste mesmo
organismo (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).
22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AITKEN-CHRISTIE, J. et al. Effect nutrient media composition on sugar-free growth
and chlorophyll fluorescence of Pinus radiata shoots in vitro. Acta Hort., v. 319, p.
125-130, 1992.
AMMIRATO, P. G. V. Embryogenesis. In: EVANS, D. A. et al. Handbook of plant
cell culture. , v.1. New York: MacMilam Publischer Company, 1993. 123p
BAJAJ, Y. P. S. Biotechnology in agriculture and forestry 19: High-tech and
Micropropagation Plant III. Berlin: Springer-Verlag, 1992.
BLANCO, R. A. Jardim das flores: Gerbera, 12 set. 2001. Disponível em:
<http://www.jardimdasflores.com.br/floresefolhas/A08gerbera.htm>. Acesso em: 28
ago 2006.
BRASIL. Secretaria de Comércio Exterior (SECEX). Exportação e importação
brasileira de plantas vivas e produtos de floricultura: 1989-2003. Brasília, 2004.
Disponível em:
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25
2 ARTIGO I: CALOGÊNESE EM EXPLANTES FOLIARES DE GÉRBERA DE
VASO (Gerbera Jamensonii)
RESUMO
As flores do gênero Gerbera apresentam boa durabilidade e uma
grande variedade de cores podendo satisfazer os mercados mais exigentes. Na área
de plantas ornamentais a propagação in vitro de matrizes selecionadas tem
oferecido uma padronização para época de floração, coloração e tamanho das flores
e, a embriogênese somática pode ser uma opção para a multiplicação destas
plantas. O objetivo deste estudo foi avaliar as melhores concentrações de
reguladores de crescimento na obtenção de calos friáveis, utilizando-se a enzima
SOD como marcador bioquímico na seleção dos calos. Folhas completamente
expandidas de plantas comerciais foram desinfectadas, seccionadas em fragmentos
de aproximadamente 1cm
2
e inoculadas em meio de cultura MS em combinação
fatorial 5x5 de reguladores de crescimento: benzilaminopurina (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e
4,0 mg.L
-1
) e ácido naftalenoacético (0,0; 0,25; 0,50; 1,0 e 2,0 mg.L
-1
). Os calos
foram avaliados em dois períodos, observando-se o crescimento, coloração e
friabilidade. A melhor combinação de regulador de crescimento para obtenção de
calos friáveis é 0,5/0,5 mg L
-1
de BAP/ANA respectivamente. Houve correlação da
atividade de superóxido dismutase com as variáveis morfológicas dos calos.
Palavras-chave: cultura de tecidos, embriogênese somática, planta ornamental,
fitorreguladores.
ABSTRACT
Gerbera exhibited good flower durability and a wide range of colours
that can satisfy the most serious markets. In the area of ornamental plants the in vitro
propagation of selected plants offered a chance of standardization in some
characteristics as flowering synchronization, coloration and size of flowers. So,
26
somatic embryogenesis can be an option for multiplication of these plants. The
objective of this study was to evaluate the best concentrations of plant growth
regulators for growing of friable calluses, using SOD enzyme as biochemical marker
in the calluses selection. Fully expanded leaves of commercial plants were submitted
to the disinfection, cut in fragments (1cm
2
) and inoculated in MS media in a factorial
plant growth regulators combination (5x5): benzilaminopurine (0; 0.5; 1.0; 2.0 and 4.0
mg.L
-1
) and naphthaleneacetic acid (0; 0.25; 0.50; 1.0 and 2.0 mg.L
-1
). The obtained
calluses were evaluated in two periods for growth, coloration and friability. The best
combination of plant growth regulators for friable calluses was 0,5/0,5 mg L
-1
de
BAP/ANA respectively. There was correlation of superoxide dismutase activity with
the morphologic variables of the calluses.
Key words: tissue culture, somatic embryogenesis, ornamental plant, plant growth
regulators.
2.1 Introdução
A gérbera (Gerbera jamensonii) é uma Asteraceae semiperene, nativa
da África do Sul e Ásia e que, nos últimos anos, teve um crescente interesse pelos
tipos de corte, pois suas flores apresentam boa durabilidade e uma variação de
cores que satisfaz os mercados mais exigentes.
Existem dois métodos para a propagação da gérbera: sexual e
vegetativo. Por ser uma planta de polinização cruzada, a propagação via semente
não é muito interessante comercialmente, pelo fato de haver segregação na
progênie o que torna a produção desta pouco interessante dada à variação
produzida. O outro método é a propagação vegetativa, a qual possui a desvantagem
de acumular patogenias durante as gerações. A propagação por divisão de touceiras
ou por corte de rizomas é ineficiente, produzindo em média cinco mudas por divisão
de touceira e quarenta mudas por corte de rizoma ao ano (CHU; HUANG, 1983).
Particularmente na área de plantas ornamentais, onde predominam
plantas híbridas (gérbera, cravo, tulipa, orquídeas e outras), a clonagem in vitro de
27
matrizes selecionadas tem permitido a uniformização de características, época de
floração, coloração, diâmetro e formas das flores, dentre outras.
Na França, dentre as plantas ornamentais produzidas por cultura de
tecidos, a violeta e a gérbera representam mais de 70% do volume de produção
(BOUZIGUES, 1987). A propagação vegetativa in vitro de determinada espécie pode
ser conduzida através da multiplicação de brotação por sucessivas subculturas, ou
seja, partes vegetativas da planta são estimuladas a crescerem formando tufos de
brotos, os quais são subdivididos dando origem a novos explantes que, por sua vez,
repetem o mesmo processo.
A micropropagação é uma das principais aplicações da cultura de
tecidos, especialmente para plantas de difícil propagação pelos métodos
convencionais, como é o caso da Gerbera. O emprego de cultura de tecidos têm
sido crescente para esta, tornando-se uma alternativa bastante viável para sua
propagação. As primeiras tentativas neste sentido foram feitas por Pierik e Segers
(1973) na Holanda, que empregaram a indução em gemas adventícias.
Dois métodos promissores para a propagação in vitro desta espécie
ornamental são citados: 1) a formação de brotações a partir de capítulos excisados
(LALIBERTÉ et al., 1985) e 2) a propagação clonal através de ápices de brotos
(MURASHIGE et al., 1974).
A vantagem do método no qual se utilizam capítulos excisados está no
emprego do tratamento fitossanitário, a qual é mais eficiente e menos prejudicial ao
explante, quando comparado ao método que utiliza ápices de brotos. Outra
vantagem a ser citada é que o primeiro método não destrói a planta para a obtenção
dos explantes, visto que apenas as inflorescências são retiradas da planta mãe. Em
contra partida, o segundo método é mais indicado para uma propagação massal
mais rápida, não obstante as vantagens citadas anteriormente.
De acordo com Arello et al. (1991) as brotações obtidas, pelo método
dos capítulos, podem facilmente ser utilizadas como material estéril inicial para
outras subculturas e experimentos onde se desejam brotações axilares. Ambos os
métodos empregam concentrações adequadas de citocininas e auxinas buscando
um melhor balanço de reguladores vegetais, anteriormente estudado por Skoog e
Miller (1957).
A organogênese é controlada pela concentração e pelo balanço
citocinina/auxina existentes em meio de cultura. Handro e Floh (1990) relatam que
28
as citocininas são muito ativas na indução e regeneração de parte aérea das
plântulas inibindo a formação de raízes, por outro lado, formação de raízes e a
inibição do crescimento de parte aérea estimulando a formação de gemas axilares, o
que leva a formação de calos, são comandadas pelas auxinas. O tipo e a
concentração dos reguladores vegetais influenciam na multiplicação in vitro, onde
normalmente a melhor faixa está entre 0,5 e 5,0 mg.L
-1
para ambos.
O cultivo de calos tem sido utilizado para estudos sobre o
desenvolvimento celular, obtenção de suspensão celular e embriões somáticos
(LANDA et al., 2000), sendo considerado uma forma potencial indireta de
propagação em massa.
Guerra et al. (1999) e Jiménez (2001) citam que a embriogênese
somática pode ser descrita como o processo pelo qual células somáticas
desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma
seqüência ordenada de estádios embriogênicos característicos, sem ocorrência de
fusão dos gametas, como a estrutura bipolar sem nenhuma conexão vascular com o
tecido materno (DURZAN, 1988; VICIENT; MARTINEZ, 1998).
Dentre os processos de propagação clonal, segundo Barros (1999), a
embriogênese somática é, teoricamente, a melhor opção para a propagação in vitro
por apresentar algumas vantagens, por exemplo: a alta taxa de multiplicação
comparada a qualquer outro processo de propagação; o escalonamento da
produção pela manutenção da cultura em meio líquido; o plantio direto da muda
obtida via embriogênese somática sem necessidade de enxertia, com menor custo
de produção, além de a planta ser geneticamente igual à planta mãe, o que não
acontece com plantas obtidas por métodos de propagação vegetativa convencionais.
Hirokazu et al. (1998) realizaram estudos pioneiros obtendo
embriogênese somática a partir de tecidos de caquizeiro, trabalhando com
segmentos foliares provenientes de plantas obtidas de ápices meristemáticos
cultivados in vitro, em meio MS ½NO
3
suplementado com BAP e ANA, em diferentes
concentrações.
Um dos aspectos mais sérios relacionados com a cultura de tecidos de
algumas espécies de plantas é a oxidação do explante. Preece e Compton (1991)
caracterizaram as substâncias encontradas em meio de cultura e as identificaram
como sendo fenóis, flavonóides e taninos, e responsáveis pela oxidação.
29
A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à ação dos radicais
livres no organismo. Estas moléculas têm um elétron desempareado, livre para se
ligar a qualquer outro elétron e por isso, são extremamente reativas (SOARES,
2002).
Radicais livres são formados sob condições de estresse oxidativo bem
como pelas reações normais da cadeia de transporte de elétrons, mas que são
altamente reguladas (CHAOUI et al., 1997; MAZHOUDI et al., 1997; GREGGAINS et
al., 2000), todavia esta regulação pode ser perdida se o estresse for mais severo
aumentando consideravelmente a produção de radicais livres que podem levar a
uma cascata de eventos que, começando com a peroxidação de lipídeos, avançam
para degradação de membranas e para morte celular (GREGGAINS et al., 2000). De
acordo com Foyer et al. (1997) o aumento nos oxidantes celulares pode levar a
super expressão de genes de enzimas de desintoxicação como as superóxido
dismutases (SOD) (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977), catalase (CAT), peroxidase
(PRX) e enzimas do ciclo ascorbato-glutationa (SUNG; JENG, 1994; BAILLY et al,
1998) como parte de uma estratégia requerida para superar o estresse oxidativo
(FOYER et al., 1997).
Uma destas moléculas é o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) que possui
diversas funções dentro da célula, desde a produção de radicais livres até
lignificação e produção de compostos fenólicos, bem como atuando como gatilho
para as respostas SAR (HAMMERSCHMIDT; KUC, 1982; SIEGEL, 1993;
HAMMERSCHMIDT; KUC, 1995; BENHAMOU; NICOLE, 1999; JUNG et al., 2000;
McCUE et al., 2000) onde o ácido salicílico pode ser responsável por disparar a
resposta SAR inibindo peroxidases específicas.
Uma ampla gama de compostos, incluindo oligossacarídeos,
glicoproteínas e peptídeos, pode mediar a indução das reações de defesa nas
plantas (JUNG et al., 2000, KÚC, 2000; BENHAMOU; NICOLE, 1999). De forma
análoga, a resistência ao frio ou aos choques de calor pode ser aumentada por
elevação na concentração de compostos fenólicos (RIVERO et al., 2001) ou por
alguns aminoácidos envolvidos na síntese de fenólicos (MACHADO NETO et al.,
2004).
Certas enzimas associadas ao estresse causado por excesso de
oxidantes são importantes no mecanismo de defesa de plantas. A superóxido-
dismutase (SOD) ajuda a eliminar os radicais livres. Como o peróxido de hidrogênio
30
é altamente tóxico para as células, os organismos aeróbios criaram meios de
proteção contra seus efeitos utilizando enzimas para removê-los, tais como a
catalase, peroxidase dentre outras.
Os antioxidantes destroem os radicais livres como o radical superóxido
e a hidroxila. Em 1969, ficou evidenciado que a enzima superóxido-dismutase,
presente em quase todas as células, catalisa a conversão do oxigênio reativo em
peróxido de hidrogênio.
Altas atividades de SOD estão relacionadas a uma maior produção de
peróxido de hidrogênio que é molécula chave para vários processos metabólicos
(SIEGEL, 1993) dentro da célula desde a produção de radicais livres até lignificação
e produção de compostos fenólicos, bem como atuando como gatilho para as
respostas SAR (HAMMERSCHMIDT; KUC, 1982; SIEGEL, 1993;
HAMMERSCHMIDT; KUC, 1995; JUNG et al., 2000; McCUE et al., 2000).
Assim, a SOD é considerada a primeira linha de defesa contra
espécies reativas de oxigênio (VOET et al. 2000) e por ser formadora de moléculas
de peróxido pode estar relacionada com uma maior produção de fenóis e ligninas
nos tecidos vegetais.
De acordo com Foyer et al. (1997) o aumento nos oxidantes celulares,
como no caso de estresses, pode levar a super expressão de genes de enzimas de
desintoxicação como as superóxido dismutases (SOD) (GIANNOPOLITIS; RIES,
1977), catalase (CAT), peroxidase (PRX) e enzimas do ciclo ascorbato-glutationa
(SUNG; JENG, 1994; BAILLY et al, 1998) como parte de uma estratégia requerida
para superar o estresse oxidativo (FOYER et al., 1997). Uma ampla gama de
compostos, incluindo oligossacarídeos, glicoproteínas e peptídeos, pode mediar a
indução das reações de defesa nas plantas (JUNG et al., 2000, KÚC, 2000).
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os melhores calos para formação de
embriões de somáticos de gérbera de vaso (Gerbera jamensonii), com a utilização
da SOD como marcador bioquímico na avaliação para seleção dos calos.
31
2.2 Material e Métodos
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da
UNOESTE Universidade do Oeste Paulista – Presidente Prudente/SP. O material
vegetal utilizado, como matriz, foi obtido de plantas comerciais de vaso, no Ceasa da
cidade de Presidente Prudente - SP.
Foram selecionadas folhas jovens completamente expandidas com
aparência saudável, sem manchas e pragas. Ao serem retiradas, as folhas foram
lavadas em água corrente com detergente neutro, transferidas para câmara de fluxo
laminar e submetidas à desinfecção com hipoclorito de sódio comercial (40% v/v) e
100μL de Tween 80 durante 30 minutos. As folhas foram enxaguadas duas vezes
em água destilada e cortadas em peças de 1cm
2
em solução estéril de cisteína
(500mg L
-1
): ácido ascórbico, na dose de (500mg L
-1
), misturados na hora do uso,
para evitar a oxidação dos tecidos.
Os fragmentos foram incubados, em placas de Petri de 10 cm de
diâmetro, contendo meio MS sem adição de reguladores de crescimento vegetal
para seleção de explantes. Os fragmentos não contaminados ou oxidados foram
utilizados para a incubação nos meios de cultura contendo reguladores de
crescimento vegetal em diferentes concentrações nos diversos tratamentos.
O meio de cultura utilizado foi MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962)
modificado, suplementado com 20g L
-1
de sacarose, solidificado com 2,0g L
-1
de
Phytagel
®
e pH 5,8. Os frascos, potes 269, contendo 50 mL de meio, foram
autoclavados por 20 minutos a 121°C e 1 atm de pressão. Os tratamentos foram
delineados como um fatorial 5x5 de benzilaminopurina (BAP; 0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e
4,0mg /L
-1
) e ácido naftalenoacético (ANA; 0,0; 0,25; 0,50; 1,0 e 2,0mg L
-1
) com dez
repetições de dois explantes por frasco. Os frascos permaneceram em sala de
crescimento com fotoperíodo de 16 horas, e temperatura 25± 2°C. Após 30 dias os
calos obtidos foram medidos, classificados por cor e aspecto e transferidos para
meio de cultura novo por mais 30 dias ao final dos quais refizeram-se as medidas.
Os calos receberam notas quanto a coloração (1 - branco, 2 - amarelo, 3 - verde e 4
- marrom) e friabilidade (1 - vítreo, 2 - intermediário e 3 - friável).
Após 60 dias parte dos calos foi fixada em Carnoy acético, emblocada
em parafina e submetida a cortes histológicos com aproximadamente 3μm de
32
espessura, para verificação da indução de embriogênese nos diferentes tipos de
calos. Os cortes foram desparafinados e submetidos a coloração com hematoxilina:
eosina ou azul de toluidina a 1%. As lâminas foram observadas e as imagens
capturadas digitalmente por câmara CCD Alpha-Inmotech.
Parte das amostras de calos foram homogeneizadas em tampão
fosfato 0,1M (pH 7,8) gelado, composto de 0,4 g de polivinilpolipirrolidona, 2mM
dithiothreitol, 0,1mM EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), centrifugado a 1200g
durante 20 minutos. O sobrenadante estocado em freezer -80°C e utilizado para
análise enzimática de SOD.
Para determinação da atividade de SOD adicionou-se 50 µL de extrato
ao tampão fosfato 0,1M (pH 7,8) contendo 1,3µM riboflavina, 13mM metionina e
63µM nitro blue tretrazolium. Os tubos foram incubados a 25°C por 15 minutos sob
iluminação de lâmpadas fluorescentes e a leitura foi feita em espectrofotômetro a
560nm. Tubos contendo o mesmo meio, não foram submetidos à luz e utilizados
como branco. A atividade do SOD foi definida como a atividade de enzima capaz de
inibir a fotorredução do NBT (Nitro Blue Tetrazolium) a formazan azul em 50% e foi
expressa em unidades de SOD.(mg proteína)
-1
.
As variáveis analisadas foram a coloração, o tamanho (cm) em seu
maior diâmetro, o tipo formado, a Histologia e a atividade de superóxido dismutase
nos calos formados. A avaliação foi feita aos 30 e 60 dias. Os dados de coloração e
friabilidade foram transformados em (X + 0.5)
-½
, os dados de comprimento e
atividade de SOD não foram transformados, e todos foram avaliados pelo teste F e
quando este foi significativo pelo teste de Scott-Knott (1974).
2.3 Resultados e Discussão
Não houve desenvolvimento, nem sobrevivência, de calos em meio
não suplementado com ANA. Resultados semelhantes foram obtidos por Silva et al.
(2003) onde calos de carqueja (Baccharis sp., Asteraceae) só cresceram quando
cultivados em meio de cultura contendo ANA conjuntamente com BAP ou CIN.
33
O maior desenvolvimento de calo (Tabela 1) obtido na avaliação A, foi
com a combinação do tratamento 14 (1,0/2,0 mg L
-1
de BAP/ANA); na avaliação B, o
crescimento pelo tratamento 8 (0,5/0,5mg L
-1
de BAP/ANA).
Cerqueira et al. (2002) observaram que a coloração e a consistência de
calos de erva-de-touro (Tridax procumbens L., Asteraceae), cultivados in vitro,
dependeram tanto da concentração como do tipo de regulador de crescimento
utilizado no meio de cultura, sendo a cor verde a mais predominante, e está
relacionada aos reguladores ANA e BAP. Fato semelhante aconteceu com gérbera
(ARELLO et al., 1991) os quais observaram diferentes níveis de coloração em quatro
cultivares, bem como Pierik et al. (1982) que constataram esses efeitos de genótipo
no comportamento de plantas in vitro.
Os calos formados apresentaram variação de cores (Tabela 1); os
calos mais claros, brancos até amarelos ou verdes claros foram mais friáveis, ou
seja, com maior potencialidade para embriogênese (Figura 1). Os calos, marrons e
verdes escuros, tendem a ser mais duros, se mostrando menos friáveis. Neste
estudo observou-se a formação de calos em 100% dos explantes submetidos aos
tratamentos com BAP/ANA, porém em 24% houve morte por oxidação.
A formação de calos em explantes cultivados é induzida em altas
concentrações de citocinina/auxina (LITZ; JARRET, 1991). Para o tamanho de calos
(Tabela 1), os tratamentos apresentaram diferenças, devido ao tempo de contato
com os meios de cultura contendo combinações diferentes dos reguladores, sendo
que os tratamentos cuja concentração citocinina/auxina foi relativamente alta
apresentaram maior crescimento que os demais. Segundo Huetteman e Preece
(1993) e Laszloffy et al. (1992) a alta concentração de citocininas no meio induz a
formação excessiva de calos.
A formação de calos em discos foliares como vista neste trabalho é
fato bem documentado em cultura de tecidos sendo comum em várias espécies
como Smilax japecanga (Smilacaceae) e Coffea arabica (SANTOS et al., 2005,
Rubiaceae) e Passiflora suberosa (Monteiro et al., 2000, Passifloraceae).
A análise de variância do efeito dos tratamentos com diferentes
concentrações e combinações de benzilaminopurina (BAP) e ácido naftaleno acético
(ANA) revelou significância estatística para as variáveis analisadas (Tabela 1).
34
TABELA 1 – Tratamentos com BAP/ANA na primeira época de avaliação (A) aos 30
dias e segunda época de avaliação (B) aos 60 dias, Médias seguidas
da mesma letra não diferem entre si pelo de Teste de Scott-Knott
(1974)
Tamanho Coloração Friabilidade
Tratamento BAP ANA
(cm)
(mg L
-1
) A B A B A B
1 0 0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
2 0 0,25 1,13c 0,49c 1,66d 3,49a 0,49c 1,82b
3 0 0,5 1,31c 1,50b 1,69d 3,49a 0,49c 1,50b
4 0 1,0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
5 0 2,0 1,13c 2,13a 2,61c 3,49a 0,49c 0,49c
6 0,5 0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
7 0,5 0,25 0,64d 1,50b 3,33b 3,49a 1,62b 1,50b
8 0,5 0,5 1,31c 2,13a 3,49b 3,49a 2,31a 2,50a
9 0,5 1,0 1,13c 2,50a 3,49b 2,50b 2,31a 1,50b
10 0,5 2,0 1,50b 2,50a 3,49b 2,50b 2,31a 1,50b
11 1,0 0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
12 1,0 0,25 0,49d 1,50b 3,33b 2,50b 2,31a 1,50b
13 1,0 0,5 0,80d 1,79b 3,33b 2,50b 2,50a 1,50b
14 1,0 1,0 2,13a 2,50a 3,80a 2,50b 2,31a 1,50b
15 1,0 2,0 1,50b 2,50a 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
16 2,0 0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
17 2,0 0,25 0,96c 1,79b 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
18 2,0 0,5 1,13c 1,50b 2,65c 3,49a 2,50a 1,50b
19 2,0 1,0 1,50b 1,50b 2,50c 3,49a 2,50a 0,49c
20 2,0 2,0 0,49d 0,49c 3,97a 3,49a 2,31a 1,50b
21 4,0 0 0e 0d 0e 0c 0d 0d
22 4,0 0,25 0,49d 0,49c 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
23 4,0 0,5 0,49d 0,49c 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
24 4,0 1,0 0,64d 1,50b 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
25 4,0 2,0 0,96c 2,50a 3,49b 3,49a 2,31a 1,50b
Média 1,16 1,66 2,80 2,84 1,52 1,56
CV 19,84 7.32
As médias de coloração e friabilidade foram atribuídas Notas segundo os seguintes critérios.
Coloração, 1 branco, 2 amarelo, 3 verde e 4 marrom. Friabilidade, 1 vitreo, 2 intermediário e 3 friável.
(* tratamento perdido devido contaminação).
Observou-se que em quase todos os explantes foliares de gérbera
sofreram formação de calos, friáveis ou vitrificados, tratamentos sem auxina não
induziram calos. Utilizando-se 2,0 mg L
-1
de ANA e 1,0 mg L
-1
de BAP. Landa et al.
(2000) induziram a calogênese em explantes foliares de pequizeiro. Observações
semelhantes foram feitas em moreira (Maclura tinctoria; Moraceae), uma espécie
35
que apresenta dificuldades de propagação sexuada, onde se obteve a indução de
calos em segmentos foliares (GOMES, 1999) de maneira análoga.
A ocorrência de calos friáveis, segundo Cid (1998), pode ser devida a
relações mais elevadas auxina/citocinina, ou de acordo com França (1999), pelo fato
de os calos terem sido cultivados em presença de luz, conferindo, geralmente, maior
friabilidade que os cultivados em ausência de luz. Resultados semelhantes foram
observados por vários autores para outras espécies de plantas, como Ambrosia
tenuifolia Spreng (GOLENIOWSKI et al., 1992; Asteraceae), Artemisia absinthium
(NIN et al., 1996; Asteraceae) e para quatro espécies do gênero Baccharis (B.
cordifolia DC., B. halimifolia L., B. megapotamica Spreng. e B. neglecta Britton & A.
Brown; Asteraceae), nas quais praticamente não se obtiveram sobrevivência dos
explantes e formação de calo em ausência de reguladores de crescimento vegetal
(KUTI; JARVIS, 1992).
Os melhores calos de gérbera foram formados em dose de 0,5/0,5mg
L
-1
de BAP/ANA, apresentando o melhor crescimento inclusive em subculturas,
aparenta-se com um calo claro (verde amarronzado claro) e bastante friável. Tais
calos apresentaram embriões em diversos estágios de maturação inicial com células
com divisão assimétrica, embriões em estágios iniciais multicelulares e embriões
somáticos cordiformes (Figura 1).
De acordo com Bered et al. (1998), a regeneração de plantas através
de embriogênese somática é preferível, pois os embriões somáticos produzidos
através desta técnica têm crescimento mais rápido e altos níveis de regeneração.
36
A
B
C
D
E
FIGURA 1 - Embriogênese somática de Gerbera em meio de cultura. A e B - Pró embriões com
divisão celular assimátrica. C - Pró embriões multicelulares (Setas). D - Embrião
somático em estágios iniciais. E - Embrião somático cordiforme. Presidente Prudente,
2007
37
Na Figura 2, estão os resultados obtidos com a atividade da SOD em
calos de gérbera. A superóxido dismutase (SOD) é uma enzima envolvida
diretamente na desintoxicação celular, transformando o radical superóxido em
oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio, e indiretamente envolvidos na síntese
de fenóis e ligninas, compostos que atuam na defesa de células e tecidos.
A
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425
Tratamentos
Atividade de SOD (mg prot)-1
FIGURA 2 – Atividade de SOD em calos de Gerbera nas diferentes combinações de
BAP/ANA. Presidente Prudente, 2007. Barras nas colunas desvio
padrão
Sob condições de estresse, as plantas tendem a aumentar a atividade
das peroxidases e é o primeiro grupo de enzimas a ter atividade alterada,
independentemente do substrato utilizado ou do estresse aplicado. As peroxidases
podem ser tomadas como um marcador bioquímico de estresse resultante tanto de
fatores bióticos como abióticos e ainda parecem ser as moléculas chaves de
adaptação das plantas, ou de algum de seus órgãos separadamente, às mudanças
do meio ambiente (ROSSI et al., 2001).
38
TABELA 2 - Análise de correlação simples entre as variáveis Atividades de SOD,
Tamanho, tipo e cor de calo de explantes foliares de Gerbera
jamensonii, obtidos em diferentes tratamentos com fitorreguladores.
Presidente Prudente, 2007. Valores de correlação (r) seguidos de **
são significativos ao nível de 1%
SOD Tamanho Tipo Cor
SOD 1 - - -
Tamanho 0,8180** 1 - -
Tipo 0,6141** 0,7747** 1 -
Cor 0,7052** 0,7961** 0,8989** 1
A análise de correlação (Tabela 2) mostra que houve correlação
positiva entre todas as variáveis analisadas. Assim alta atividade de SOD está ligada
ao crescimento, tamanho e coloração do calo. Quanto maior a atividade da enzima,
maior o calo tendendo a ser mais escuro e mais friável. Tamanho, tipo e cor também
estão positivamente correlacionados indicando que calos maiores são mais escuros
e mais friáveis e calos menores apesar de serem mais claros tendem a ser mais
duros. O crescimento de células e calos em cultura de tecidos ocorre em ritmo
acelerado, o que geraria uma maior concentração de radicais livres estimulando a
síntese de enzimas antioxidantes, os quais teriam então dupla finalidade, a de
desintoxicação e a de fornecer moléculas para biossíntese celular. Todavia, isto
poderia levar a um desequilíbrio celular favorecendo o escurecimento dos calos pela
formação e ação dos compostos fenólicos, ou tornando os calos extremamente
duros (vítreos) pelo possível aumento de lignina como sugerido por Hammerschmidt
e Kuc (1982; 1995); Siegel, (1993) e Foyer et al. (1997) como formas de resistência
aos estresses impostos.
2.4 Conclusão
Os segmentos foliares de gérbera representam uma ótima fonte para
indução de calogênese e são dependentes de ANA para a formação de calos. A
enzima Superóxido Dismutase, pode ser usada como ferramenta para medir o
39
desenvolvimento de calos; e a melhor combinação de BAP/ANA para formação e
subcultivo de calos, de Gérbera embriogênicos é de 0,5/0,5 mg L
-1
.
40
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45
3 ARTIGO II: AVALIAÇÃO DO ÁCIDO β NAPHYTOX-ACÉTICO NA FORMAÇÃO
DE CALOS EM SEGMENTOS FOLIARES DE GERBERA (Gerbera jamesonii)
RESUMO
A Gerbera possui características de grande interesse comercial, como
produtividade, coloração vibrante e durabilidade floral. Folhas completamente
expandidas de plantas comerciais foram submetidas à desinfecção, seccionadas em
fragmentos de aproximadamente 1 cm
2
e incubadas em meio de cultura MS em
combinação fatorial 5x5 de reguladores de crescimento: (BAP) benzilaminopurina
(0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L
-1
) e (NOA) ácido β naphtoxy-acético (0,0; 0,25; 0,50; 1,0
e 2,0 mg.L
-1
). Os calos obtidos foram avaliados em dois períodos, observando-se o
crescimento, coloração e friabilidade. A melhor combinação de reguladores de
crescimento vegetal para obtenção de calos friáveis foram as seguintes: 4,0/0,25 mg
L
-1
e 4,0/0,5 mg L
-1
de BAP/NOA respectivamente. Utilizou-se a enzima superóxido
dismutase (SOD) como marcador bioquímico para avaliação e seleção dos calos,
havendo correlação positiva entre a atividade da enzima e as variáveis morfológicas
dos calos.
Palavras-chave: cultura de tecidos, embriogênese somática, ácido naphytox acético,
superóxido dismutase.
ABSTRACT
Gerbera possess characteristics of great commercial interest, as productivity,
vibrant coloration and flower longevity. Completely expanded leaves of commercial
plants were disinfected, cut in 1cm
2
fragments and incubated in MS culture media in
a 5x5 factorial combination of (BAP) benzilaminopurine (0; 0.5; 1.0; 2.0 and 4.0 mg.L
-
1
) and (NOA) acid β naphtoxy-acetic (0; 0.25; 0.50; 1.0 and 2.0 mg.L
-1
) as growth
regulators. The obtained calluses were evaluated twice by size, coloration and
46
friability. The best combination of plant growth regulators for friable calluses
formation was the following ones: 4.0/0.25 mg L
-1
and 4.0/0.5 mg L
-1
of BAP/NOA
respectively. Superoxide dismutase (SOD) was used as biochemical marker for
evaluation and selection of the calluses and there was a positive correlation of the
activity of the enzyme with the morphologic variables of the calluses.
Key word: tissue culture, somatic embryogenesis, naphtoxy acetic acid, superoxide
dismutase.
3.1 Introdução
Desde a década de 90 o mercado de flores, tanto de corte como de
vaso, vem crescendo vertiginosamente, juntamente com plantas frutíferas ou não,
plantas ornamentais até produção de bulbos e sementes; fatores esses de
relevância para o agro negócio brasileiro.
Nativa da África e Ásia, as Gerberas apresentam características
agronômicas de interesse comercial, como por exemplo, a durabilidade de suas
flores, diversas nuance de cores e a forma das flores, dentre outros.
Segundo Severin et al. (2000), existem métodos naturais de
propagação para esta herbácea, como a propagação sexual e vegetativa, ocorre
que, na propagação via sementes as conseqüências são manifestações de uma
grande variabilidade em suas características fenotípicas e genotípicas, já que se
trata de uma planta alógama. O método de propagação vegetativa possui a
desvantagem de acumular doenças durante as gerações em que é propagada e os
métodos de propagação por divisão de touceira e por corte do rizoma são
ineficientes, e produzem poucas mudas durante o ano. (CHU; HUANG, 1983).
Estudos feitos com Gerbera apontam várias possibilidades de
formação de plantas a partir de ápices (HUANG; CHU, 1985), capítulos (LALIBERTÉ
et al., 1985) e óvulos (MIYOSKI; ASAKURA, 1996). Em todos os métodos de
multiplicação in vitro, tem sido imprescindível o uso de reguladores de crescimento
vegetal.
47
A cultura de tecidos é uma técnica importante, especialmente para
plantas de difícil propagação pelos métodos convencionais, como o caso da Gerbera
(BARBOSA et. al., 1993).
A propagação através de cultura de tecidos pode ser feita direta ou
indiretamente, sendo esta ultima pela formação de calos que é considerada uma
forma potencial de propagação em massa. O cultivo de calos tem sido utilizado para
estudos sobre o desenvolvimento celular, obtenção de suspensão celular e embriões
somáticos Landa et al. (2000).
As citocininas e auxinas são os reguladores de crescimento mais
utilizados na cultura de tecidos (CALDAS et al., 1990). Os reguladores de
crescimento são substâncias que produzidas por um tecido e transportadas para
outro, desempenham efeitos muito específicos.
Pessarakli e Dris (2003) citam que várias auxinas são utilizadas em
estudos para melhoramento genético de plantas de berinjela e dentre elas o ácido
naphtoxy acético.
Guerra et al. (1999) e Jiménez (2001), citam que a embriogênese
somática pode ser descrita como o processo pelo quais as células somáticas
desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma
seqüência ordenada de estádios embriogênicos característicos, sem ocorrência de
fusão dos gametas.
Dentre os processos de propagação clonal, a embriogênese somática
é, teoricamente, a melhor opção para a propagação in vitro por apresentar algumas
vantagens, por exemplo: a alta taxa de multiplicação comparada a qualquer outro
processo de propagação; o escalonamento da produção pela manutenção da cultura
em meio líquido; o plantio direto da muda obtida via embriogênese somática sem
necessidade de enxertia, com menor custo de produção, além de a planta ser
geneticamente igual à planta mãe, o que não acontece com plantas obtidas por
métodos convencionais de propagação vegetativa (BARROS, 1999).
Certas enzimas associadas ao estresse causado por excesso de
oxidantes são importantes no mecanismo de defesa de plantas. A superóxido-
dismutase (SOD) ajuda a eliminar os radicais livres. Como o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) é altamente tóxico para as células, os organismos aeróbios criaram meios de
proteção contra seus efeitos utilizando enzimas para removê-los, tais como a
catalase, peroxidase dentre outras.
48
A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à ação dos radicais
livres no organismo. Estas moléculas têm um elétron desempareado, livre para se
ligar a qualquer outro elétron e por isso, são extremamente reativas (SOARES,
2002).
Os antioxidantes destroem os radicais livres como o O
2
-
e OH. Em
1969, ficou evidenciado que a enzima superóxido-dismutase, presente em quase
todas as células, catalisa a conversão do O
2
em H
2
O
2
, sendo que a SOD é
considerada a primeira linha de defesa contra espécies reativas de oxigênio (VOET
et al. 2000).
O objetivo deste trabalho foi a avaliar o efeito da auxina acido β
naphtoxy acético (NOA) na obtenção de calos para fins de propagação clonal.
3.2 Material e Métodos
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da
UNOESTE Universidade do Oeste Paulista – Presidente Prudente/SP.
O material vegetal utilizado como matriz foi obtida no Ceasa da cidade
de Presidente Prudente - SP. Foram selecionadas folhas jovens com aparência
saudável, sem manchas e pragas.
Ao serem retiradas, as folhas foram lavadas em água corrente com
detergente neutro e em seguida foram transferidas para câmara der fluxo laminar e
submetidas à desinfecção com solução de hipoclorito de sódio (40% v/v) e 100µl de
Tween 80 durante 30 minutos, sendo enxaguados por duas vezes em água destilada
e cortados em solução estéril de cisteína 500mg L
-1
. Em seguida foram seccionados
em fragmentos de 1cm
2
e incubados em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962)
sem adição de hormônios para seleção de explantes. |Apenas os fragmentos não
contaminados ou oxidados foram utilizados para a incubação nos meios de cultura
com reguladores de crescimento em diferentes concentrações nos diversos
tratamentos.
Ao final de 30 e 60 dias, os explantes foram transferidos para meio de
cultura novo, sendo medidos com uma régua. Os calos receberam notas quanto a
49
coloração (1 - branco, 2 - amarelo, 3 - verde e 4 - marrom) e friabilidade (1 - vítreo, 2
- intermediário e 3 - friável).
O meio de cultura utilizado foi MS, acrescido de 1mg/L
-1
de tiamina, 20
g/L
-1
de sacarose e 100 mg/L
-1
de inositol, sendo solidificado com 2,0 g/L
-1
de
Phytagel
®
e o pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. Os tratamentos foram
delineados em um fatorial 5x5 de BAP (benzilaminopurina; 0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg
L
-1
) e NOA (ácido β naphtoxy-acético; 0,0; 0,25; 0,50; 1,0 e 2,0 mg L
-1
) com dez
repetições de dois explantes por frasco. Os frascos foram esterilizados por
autoclavagem durante 20 minutos a 121°C e 1 atm de pressão. Os frascos
permaneceram em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, e temperatura
25± 2°C.
As variáveis analisadas foram o tamanho no seu maior diâmetro, a cor,
a friabilidade e a atividade de Superóxido Dismutase. A avaliação foi realizada com
30 e 60 dias. Os dados foram transformados em (X + 0.5)
-½
e avaliados pelo teste F
e quando este foi significativo pelo teste de Scott-Knott (1974).
Para a analise da atividade de SOD as amostras foram
homogeneizadas em tampão fosfato 0,1M (pH 7,8) gelado, composto de 0,4 g de
polivinilpirrolidona, 2 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, centrifugado a 1200 rpm
durante 20 minutos. O sobrenadante estocado em freezer -80°C e utilizado para
análise enzimática.
Foi adicionado 50 µL de extrato ao tampão fosfato 0,1M (pH 7,8)
contendo 1,3 µM riboflavina, 13 mM metionina e 63 µM nitro blue tretrazolium. Os
tubos foram incubados a 25°C por 15 minutos sob iluminação de lâmpadas
fluorescentes, a leitura foi de absorbância a 560ηm. Tubos contendo o mesmo meio,
não foram submetidos a luz e utilizados como branco. A atividade do SOD foi
definida como a atividade de enzima capaz de inibir a fotorredução do NBT a
formazan azul em 50% e será expressa em unidades de SOD.(mg proteína)
-1
.
3.3 Resultados e Discussão
Ao final de 30 dias, os explantes formaram calos, e esses foram
medidos (cm) e imediatamente depositados em um novo frasco contendo o meio de
50
cultura com as mesmas características que se iniciou o ensaio; e assim também na
segunda avaliação com 60 dias.
Foram observados calos em alguns dos tratamentos contendo
diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP) e ácido β naphtoxy-acético
(NOA) (Tabela 1). Notou-se que a combinação desta auxina, com o BAP, teve efeito
positivo na indução e crescimento de calos em segmentos foliares de Gerbera. As
melhores combinações com êxito no crescimento em quatro semanas foram 0 1,0
mg L
-1
;
0,5 2,0mg L
-1
e 1,0 0,25 mg L
-1
de BAP NOA; porém quando avaliados com
oito semanas, houve superação em outras combinações 0,5/2,0 mg L
-1
; 1,0/0,25 mg
L
-1
; 2,0/0,5 mg L
-1
; 2,0/2,0 mg L
-1
; 4,0/1,0 mg L
-1
e 4,0/2,0 mg L
-1
de BAP NOA,
sendo as combinações mais destacadas 0,5/2,0 mg L
-1
; 1,0/0,25 mg L
-1
de
BAP/NOA.
51
TABELA 1 – Tratamentos com BAP/NOA na primeira avaliação (A) aos 30 dias e
segunda avaliação (B) aos 60 dias, Médias seguidas da mesma letra
não diferem entre si pelo de Teste de Scott-Knott (1974).
Tamanho Coloração Friabilidade
Tratamento BAP NOA
(cm)
(mg L
-1
) A B A B A B
1 0 0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
2 0 0,25 0e 0e 0f 0f 0d 0d
3 0 0,5 1,17c 1,0c 3,83c 3,5d 2,0a 1,0c
4 0 1,0 2,0a 2,0b 3,0b 1,5b 1,0c 1,0c
5 0 2,0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
6 0,5 0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
7 0,5 0,25 0e 0e 0f 0f 0d 0d
8 0,5 0,5 0e 0e 0f 0f 0d 0d
9 0,5 1,0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
10 0,5 2,0 1,83b 3,0a 3,0b 4,0e 2,0b 2,0b
11 1,0 0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
12 1,0 0,25 2,0a 3,0b 3,0b 1,0a 3,0a 2,0b
13 1,0 0,5 0e 0e 0f 0f 0d 0d
14 1,0 1,0 1,0d 2,0b 4,0d 3,5d 3,0a 2,0b
15 1,0 2,0 2,0a 2,0b 3,1b 1,0a 3,0a 2,0b
16 2,0 0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
17 2,0 0,25 0e 0e 0f 0f 0d 0d
18 2,0 0,5 1,0d 2,0b 3,0b 3,5d 3,0a 2,0b
19 2,0 1,0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
20 2,0 2,0 1,0d 2,0b 2,5a 2,5c 3,0a 2,0b
21 4,0 0 0e 0e 0f 0f 0d 0d
22 4,0 0,25 1,0d 1,0c 4,0d 1,0a 3,0a 3,0a
23 4,0 0,5 1,0d 1,0c 4,0d 1,0a 3,0a 3,0a
24 4,0 1,0 1,0d 2,0b 3,0b 1,0a 3,0a 2,0b
25 4,0 2,0 1,0d 2,0b 3,0b 1,0a 3,0a 2,0b
Média 0,64 0,92 1,58 1,0 1,28 0,96
CV 9,96 2,43 1,62
As médias de coloração e friabilidade foram atribuídas Notas segundo os seguintes critérios.
Coloração, 1 branco, 2 amarelo, 3 verde e 4 marrom. Friabilidade, 1 vitreo, 2 intermediário e 3 friável.
Silva et al. (2003) relataram o crescimento de calos de carqueja
(Baccharis - Asteraceae) na presença de auxina (ANA – ácido naftaleno acético)
individualizada, bem como em interação com a citocinina (BAP – benzilaminopurina).
Por outro lado, Kielse et al. (2007) utilizando 2,4 D na indução de calos de
Parapiptadenia rigida conseguiu calos em segmentos foliares, ao passo que Pierik et
al. (1982) tiveram limitações no uso desta auxina como, por exemplo, o
aparecimento de mutações e inibição da fotossíntese, o que não foi descrito em
outras auxinas.
52
Foi observada formação de calos em Tridax procumbens L.,
Asteraceae conhecida como erva-de-touro, quando utilizado segmentos foliares em
presença das auxinas 2,4 D, AIB e ANA em conjunto com BAP (CERQUEIRA et al.,
2002).
Esses dados mostram que diversos tipos de auxina são capazes de
promover a indução e crescimento de calos em segmentos foliares, assim, da
mesma forma que a auxina NOA foi capaz de induzir calos em segmentos foliares de
Gerbera sp. combinada com BAP, o que está demonstrando a Tabela 1.
De acordo com Cid (1998) calos friáveis podem ocorrer em decorrência
das relações mais elevadas de auxina/citocinina. Monteiro et al. (2000) obtiveram
calos de Passiflora suberosa, apresentando aspecto embriogênico, com coloração
amarela esverdeada e textura friável.
Calos mais claros, brancos até amarelos ou verdes claros, costumam
ter maior potencialidade embriogênica que calos verdes escuros e marrons, os quais
tendem a serem mais duros e menos friáveis.
Os calos formados a partir dos segmentos foliares de Gerbera
apresentaram colorações variando do branco ao marrom, passando pelo verde.
Essa variação de cores também foi observada por Landa et al. (2000) em Caryocar
brasiliense Camb., por Kielse et al. (2007) em com angico-vermelho e por Cerqueira
et al. (2002) em calos de erva-de-touro. Naseen e Jha (1994) notaram, em seus
estudos, uma coloração verde escura em Cleome viscosa L. em meio contendo ANA
e BAP.
O ácido naftoxiacético (NOA), tanto sozinho, como em conjunto com
BAP, mostrou resultados semelhantes a outros estudos em relação à coloração dos
calos de Gerbera sp., especialmente nas doses de 4mg L
-1
de BAP e 0,25 ou 0,5
mg.L
-1
de NOA.
53
A
0
1
2
3
4
5
6
7
12345678910111213141516171819202122232425
Tratamentos
Atividade de SOD (mg prot)-1
FIGURA 1 – Atividade de SOD em calos de Gerbera nas diferentes combinações de
BAP/NOA. Presidente Prudente, 2007.
Sob condições de estresse, as plantas tendem a aumentar a atividade
das peroxidases e às vezes, este é o primeiro grupo de enzimas a ter atividade
alterada, independentemente do substrato utilizado ou do estresse aplicado. As
peroxidases podem ser tomadas como um marcador bioquímico de estresse
resultante tanto de fatores bióticos como abióticos e ainda parecem ser as moléculas
chaves de adaptação das plantas, ou de algum de seus órgãos separadamente, às
mudanças do meio ambiente (ROSSI et al., 2001).
A superóxido dismutase (SOD) é uma enzima envolvida diretamente na
desintoxicação celular, transformando o radical superóxido em oxigênio molecular e
peróxido de hidrogênio, e indiretamente envolvidos na síntese de fenóis e ligninas,
compostos que atuam na defesa de células e tecidos. Na Figura 2, estão os
resultados obtidos com a atividade da SOD em calos de Gerbera.
54
TABELA 2 - Análise de correlação simples entre as variáveis Atividade de SOD,
Tamanho, tipo e cor de calo de explantes foliares de Gerbera
jamensonii, obtidos em diferentes tratamentos com fitorreguladores.
Presidente Prudente, 2007. Valores de correlação (r) seguidos de **
são significativos ao nível de 1%
SOD Tamanho Tipo Cor
SOD 1 - - -
Tamanho 0,9250** 1 - -
Tipo 0,9450** 0,9271** 1 -
Cor 0,9587** 0,8910** 0,8917** 1
Alta atividade de SOD está ligada ao crescimento, tamanho e
coloração do calo dados os altos valores de correlação entre as variáveis. Assim,
altas atividades enzimáticas levam a um maior crescimento do calo tendendo,
tendendo este a ser mais escuro e mais friável.
Tamanho, tipo e cor também estão positivamente correlacionados
indicando que calos maiores são mais escuros e mais friáveis e calos menores
apesar de serem mais claros tendem a ser mais duros. O crescimento celular em
cultura de tecidos ocorre em ritmo acelerado, gerando uma maior concentração de
radicais livres e estimulando a síntese de enzimas antioxidantes, as quais teriam
então dupla finalidade, a de desintoxicação e a de fornecer moléculas para
biossíntese celular. Todavia, isto poderia levar a um desequilíbrio celular
favorecendo o escurecimento dos calos pela formação e ação dos compostos
fenólicos, ou tornando os calos extremamente duros (vítreos) pelo possível aumento
de lignina como sugerido por Hammerschmidt e Kuc (1982; 1995); Siegel, (1993) e
Foyer et al. (1997) como formas de resistência aos estresses impostos. Neste
trabalho, todavia, a resposta foi exatamente no sentido oposto onde os calos mais
claros eram mais duros e menos friáveis.
55
3.4 Conclusão
Os segmentos foliares de Gerbera responderam a diversas doses de
auxina (NOA - ácido β naphytox-acético) combinada com citocinina (BAP -
benzilaminopurina). Os melhores calos foram obtidos com as combinações nas
doses de 4,0/0,25 mg/L
-1
e 4,0/0,5 mg/L
-1
, BAP/NOA respectivamente. A atividade
da enzima Superóxido dismutase apresenta alta correlação com as variáveis
mensuradas.
56
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