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UniversidadedeBrasília
FaculdadedeMedicina
ProgramadePós‐GraduaçãoemPatologiaMolecular
LaboratóriodeInteraçãoParasito‐Hospedeiro
Leucil‐aminopeptidase
recombinantedeL.interrogans
DissertaçãodeMestrado
HugodeAlmeidaSilva
Brasília–2008
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HUGO DE ALMEIDA SILVA
Leucil‐aminopeptidase
recombinantedeL.interrogans
Brasília–2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Patologia Molecular da Universidade de Brasília como
requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em
Patologia Molecular.
Orientadora: Profª Dr. Silene de Paulino Lozzi
Co-orientador: Prof. Dr. Jaime Martins de Santana
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Agradecimentos
Agradecimentos
Tenho muitas pessoas a agradecer, e me faltam palavras para conseguir fazê-lo.
Agradeço a todos os que me ajudaram, direta ou indiretamente, a chegar onde
estou.
Agradeço à professora Dra. Silene de Paulino Lozzi, pelos conselhos, paciência,
e confiança, depositada em mim desde o começo, ao aceitar me orientar.
Ao professor Dr. Jaime Santana, pela orientação, pelos debates e incentivo ao
pensamento científico.
Ao professor Dr. Carlos Roberto Felix, pelas valiosas dicas, esclarecimentos, boa
vontade e disponibilidade.
Ao professor Dr. Bergmann Morais Ribeiro, pelo treinamento científico-
intelectual provido desde a graduação, pelos conselhos e por disponibilizar a infra-
estrutura de seu grupo de pesquisa como colaborador.
Ao professor Dr. Edivaldo Ximenes, e ao professor Dr. Antônio Teixeira pelos
conselhos e colaborações.
Aos meus pais, por sempre terem me apoiado, e terem estimulado o meu
desenvolvimento acadêmico. À minha família, que me deu base e me impulsionou em
seguir em frente.
À minha esposa, Sol, que ilumina os meus dias e me apóia incondicionalmente,
me dá conselhos e contribui pro meu crescimento como indivíduo.
Aos colegas de cada um dos laboratórios: microscopia eletrônica, enzimologia,
e patologia, pela convivência harmoniosa e pacífica, além de contribuições para a vida.
Ao amigo e companheiro de bancada Thiago “Sangas”, pelo suporte integral,
pela partilha das caixas de ponteiras, idas ao RU, conversas e desabafos, e pela
consideração! Ao colega Félix Siqueira, pelas conversas, dicas e disposição para nos
acompanhar durante os ensaios.
Aos estagiários, André e Raquel, pelo apoio e interesse na pesquisa. Aos colegas
e amigos do laboratório, Flávia, Keyla, Izabela, David, Dani, Teresa, Brina e aos que
estão chegando agora.
A todos os professores da graduação e da pós-graduação, que contribuíram não
só intelectualmente, mas participaram ativamente do meu processo de formação de
identidade. Aos colegas que se distanciaram, e aos amigos que estão sempre no peito!
ListadeAbreviaturas
AMC 7-amino-4-metilcumarina
C-terminal Extremidade carboxi-terminal de cadeia poipeptídica
DFP Diisopropiluorofosfato
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP 2'-deoxinucleosideo 5'-trifosfato
E-64 L-trans-epoxisuccinilleucilamido (4-guanidino)-butano
EC Enzyme Class
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EGTA N,N,N’,N’,-etilenolenoglicol-bis[aminoetil éter] – ácido etilenodiaminotetracético
EMJH Meio de cultura Ellinghausen McCullough Johnson Harris
ET Extrato total
FPLC Cromatografia líquida e rápida de proteínas
HaLAP Leucil-aminopeptidase de Leptospirainterrogans sorovar Hardjo
HapepA Gene pepA de Leptospirainterrogans sorovar Hardjo
IgG Imunoglobulina G
IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
K
M
Constante de Michaelis-Menten
LAP Leucil-aminopeptidase
LB Meio de cultura Luria-Bertani
N-terminal Extremidade amino-terminal da cadeia polipeptídica
pCMB p-cloromercuriobenzoato
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial Hidrogênico
PMSF Fenilmetilsufonil fluoreto
PoLAP Leucil-aminopeptidase de Leptospirainterrogans sorovar Pomona
PopepA Gene pepA de Leptospirainterrogans sorovar Pomona
SDS Duodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo Duodecil Sulfato de Sódio
UV Espectro de luz ultra-violeta
V
max
Velocidade máxima
X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosídeo
°C Graus Celsius
g Grama
ng Nanograma
µg Micrograma
mg Miligrama
g Unidade de força gravitacional
kDa Kilodalton
V Volts
L Litro
µL Microlitro
mL Mililitro
pb Pares de bases
M Molar
µM Micromolar
mM Milimolar
Ala Alanina
Arg Arginina
Asn Asparagina
Asp Ácido aspártico
Cys Cisteína
Glu Ácido glutâmico
Gly Glicina
Ile Isoleucina
His Histidina
Leu Leucina
Phe Fenilalanina
Pro Prolina
Ser Serina
Tyr Tirosina
Val Valina
Resumo
Uma varredura em busca de atividades proteolíticas em bactérias patogênicas e
não-patogênicas do gênero Leptospira identificou a presença de atividade
aminopeptidolítica apenas nas primeiras. Visando a esclarecer este achado, o presente
trabalho propôs caracterizar bioquímicamente a enzima potencialmente responsável
pela atividade leucil-aminopeptidásica presente apenas em sorovares patogênicos de
Leptospira. Por meio da clonagem do gene pepA, que codifica uma provável leucil-
aminopeptidase (LAP) citossólica, obtivemos a forma recombinante ativa da enzima,
que possui características filogenética e bioquímica semelhantes àquelas enzimas da
família M17 das metalopeptidases. Assim como outras enzimas dessa família, essa LAP
recombinante demonstrou atividade catalítica sobre o substrato L-Leu-AMC, com uma
atividade ótima em pH 8,5, e termofilia com temperatura ótima de 50 °C. Além disso, a
enzima exibiu comportamento típico de cinética clássica de Michaelis-Menten. É
inibida irreversivelmente por EDTA, apesar de outras LAPs serem reativadas por co-
fatores iônicos. Aparentemente, a enzima forma um oligômero de 320 kDa,
apresentando dependência dessa forma para sua atividade sobre o substrato L-Leu-
AMC, em gel de eletroforese. Adicionalmente, foi produzido soro α-HaLAP em
camundongos isogênicos, demonstrando a antigenicidade da enzima e possibilitando a
posterior utilização de anticorpos em outros estudos sobre a expressão diferenciada
dessa peptidase durante infecções. Esse trabalho abre caminho para a elucidação de
novos mecanismos operando exclusivamente em membros patogênicos de bactérias
do gênero Leptospira.
Abstract
Screening proteolytic activities in non-pathogenic and as well in pathogenic
bacteria of the genus Leptospira, we identified the presence of aminopeptydolitic
activity in the latter only. Aiming at clarification of this finding, this work led to the
biochemical characterization of the enzyme which appears to be responsible for the
leucyl-aminopeptydase activity present in pathogenic Leptospira serotypes. By the
cloning og the pepA gene coding a putative cytosolic leucyl-aminopeptidase (LAP), we
obtained the active recombinant enzyme, showing phylogenetic and biochemical
features similar to those present in the M17 metallopeptidase enzymes family. Like
other enzymes belonging to this family, recombinant LAP revealed catalytic activity
upon L-Leu-AMC substrate, with optimal activity at pH 8.5, and a slight termophilic
behavior, with its optimal temperature at 50 °C. Besides, the enzyme presented typical
Michaelis-Menten kynetics. It is irreversibly inhibited by EDTA, although other LAPs
shows reactivation towards ionic cofactors. Apparently, the enzyme forms a 320 kDa
oligomer, structure which the activity on the L-Leu-AMC substrate in eletrophoresis
gel seems to be dependent. In adittion, the antiserum against α-HaLAP produced in
isogenic mice showed its high antigenicty. This finding suggests that the enzyme could
be employed to produce specific antibody, which could be useful in clarifying the
differential expression of the peptidase in the course of severe infections. This work
opens a new avenue that may lead to elucidation of novel mechanisms exclusively
associated with pathogenic species within the genus Leptospira.
Sumário
INTRODUÇÃO 1
¾ Leptospirose 2
Etiologia 3
Biologia Molecular 4
Epidemiologia 5
Transmissão e Patologia 6
Patogênese 9
¾ Peptidases 11
Aspártico-peptidases 12
Cisteíno-peptidases 13
Serino-peptidases 14
Metalo-peptidases 15
Amino-peptidases bacterianas 16
OBJETIVOS 18
MATERIALEMÉTODOS 20
¾ Sorovares de Leptospiraspp. e condições de cultivo 21
¾ Preparação das amostras submetidas à reação em cadeia da polimerase 21
¾ Amplificação do gene pepA de L.interrogans 21
¾ Clonagem dos genes Hardjo pepA e Pomona pepA 22
Vetor T/A 22
pET19b 23
¾ Seqüenciamento 23
¾ Análise filogenética 24
¾ Expressão das proteínas recombinantes 24
¾ Extração das proteínas recombinantes 25
BugBuster ® 25
Ciclos de congelamento e descongelamento 25
Sonicação 25
¾ Eletroforese em gel de poliacrilamida 26
Eletroforese desnaturante 26
Eletroforese não-desnaturante 26
¾ Eletroforese para determinação de atividade enzimática (enzimografia) da
HaLAP
26
¾ Purificação das enzimas recombinantes PoLAP e HaLAP 27
Cromatografia de afinidade em coluna de níquel 27
Cromatografia de exclusão de massa molecular 27
¾ Caracterização da atividade proteolítica das enzimas recombinantes 28
Influência do pH 28
Temperatura ótima 29
Influência da força iônica 29
Influência de agente redutor 29
Inibição por EDTA 29
Suplementação e/ou dependência de cátions 30
Velocidade máxima e Constante de Michaelis-Menten (K
m
) 30
¾ Produção do soro α-HaLAP em camundongos 30
¾ Imunoblot 31
RESULTADOS 32
¾ O produto amplificado tem uma massa molecular semelhante à predita 33
¾ O fragmento de 1500 pb foi clonado corretamente nos vetores 34
¾ Seqüenciamento: o gene foi inserido em fase de leitura apropriada 35
¾ O seqüenciamento parcial indica que a seqüência dos genes obtidos tem
identidade com seqüências depositadas em bancos de dados
39
¾ Análise filogenética baseada na LAP reafirma a classificação atual 39
¾ Bactérias BL21-DE3 foram transformadas eficientemente 41
¾ A proteína de 55 kDa já é expressa generosamente após 2 horas de indução 41
¾ A proteína é expressa significativamente aos 30 °C 42
¾ Concentração de IPTG maior que 0,5 mM pode induzir super-expressão da
proteína de 55 kDa
43
¾ Recuperação da fração de proteína solúvel é maior após sonicação 43
¾ O extrato solúvel de bactérias induzidas possui atividade sobre o substrato L-
Leu-AMC
44
¾ A proteína recombinante tem boa ligação com a coluna de afinidade à histidina 44
¾ A força de ligação entre proteína e a resina carregada com níquel suporta
concentrações de até 100mM de imidazol
45
¾ Frações eluídas da coluna de níquel continham uma proteína de massa
molecular superior a 250 kDa
45
¾ O imidazol presente no tampão de reação não influencia na atividade sobre o
substrato fluorogênico
46
¾ A atividade leucil-aminopeptidásica da enzima recombinante depende de sua
estrutura quaternária
46
¾ A estrutura oligomérica da leucil-aminopeptidase recombinante se desfaz
parcialmente quando submetida à migração em sistema de SDS-PAGE
47
¾ A enzima recombinante possui propriedades termofílicas 47
¾ A leucil-aminopeptidase recombinante possui atividade ótima em pH alcalino 48
¾ O aumento da força iônica no tampão de reação resulta em decréscimo da
atividade enzimática
49
¾ Influência de agente redutor 50
¾ Inibição por EDTA 51
¾ Influência de íons na atividade enzimática 51
¾ Constante de Michaelis-Menten (k
m
) e velocidade máxima (V
máx
) 53
¾ A leucil-aminopeptidase recombinante de L.interrogans é imunogênica em
camundongo
54
DISCUSSÃO 55
¾ Comparação da atividade proteolítica entre sorovares patogênicos e não-
patogênicos de bactérias do gênero Leptospira
56
¾ Implicações na detecção do gene pepA 56
¾ Inferências sobre a possível expressão diferencial da leucil-aminopeptidase de
Leptospiraspp.
57
¾ A LAP de L.interrogans faz parte da família M17 de metaloproteases 58
¾ Os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade catalítica são
conservados entre espécies representantes de Leptospira e outras
59
¾ Parâmetros de indução e expressão da enzima recombinante HaLAP 59
¾ A atividade petideolítica da leucil-aminopeptidase recombinante de L.
interrogans depende de sua estrutura oligomérica
60
¾ Parâmetros cinéticos da leucil-aminopeptidase recombinante de L.interrogans 61
O pH ótimo de atividade da enzima recombinante HaLAP é 8,5 61
A LAP de L. interrogans é termofílica 62
A leucil-aminopeptidase de L.interrogans é inibida por EDTA 63
A influência de co-fatores iônicos na atividade da enzima
recombinante
64
¾ Aspectos biológicos e funcionais de leucil-aminopeptidases 65
CONCLUSÕES 69
ANEXOS 71
REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS 74
Introdução
2
Introdução
Leptospirose
A leptospirose é uma doença infecciosa febril causada por bactérias
patogênicas do gênero Leptospira. Foi descrita primeiramente por Weil, em 1886,
como uma doença multisistêmica grave, apresentada com icterícia profunda e
comprometimento renal (Levett, 2005). Pode ser adquirida diretamente pelo contato
com animais infectados e seus fluidos corporais, ou indiretamente com solo e água
contaminados pela urina dos mesmos. Atualmente, sabe-se que existe uma grande
variedade de manifestações clínicas, desde formas assintomáticas até casos graves,
com comprometimento renal e pulmonar severo, que freqüentemente levam a morte.
Pelo fato de estar presente no mundo inteiro e infectar cerca de 160 espécies de
mamíferos (Enna e Rolando, 2007), a leptospirose é considerada uma das mais
importantes zoonoses que, como tal, atinge economicamente diversos setores da
produção. A doença representa, por exemplo, uma das causas mais comuns de surtos
de abortos em bovinos, sendo que no Brasil já foram encontrados sinais de infecção
em até 6,7% de fetos abortados, a maior taxa de abortos por causas bacterianas no
estudo (Corbellini et alii, 2006). Além disso, a leptospirose também leva a perdas na
produção de caprinos, suínos e eqüinos (Leon-Vizcaino, Hermoso de Mendoza e
Garrido, 1987; Ellis, 1994). Como se não bastassem os prejuízos causados por essas
perdas, o mal atinge também os trabalhadores envolvidos na manipulação dos animais
doentes, o que resulta em altos gastos hospitalares e perdas de dias de trabalho
(Ministério da Saúde, 2005).
Em comunidades carentes, a precariedade do sistema sanitário aumenta o
número de casos não ocupacionais, já que o lixo acumulado nas margens dos
reservatórios de água serve como habitat para roedores que albergam a Leptospira
(Bharti etalii, 2003). A excreta dos animais infectados contamina mananciais, lagoas e
poços artesianos usados por essas populações. Contudo, casos crescentes de infecções
relacionadas a atividades recreativas ou esportivas (Morgan etalii, 2002; Haake etalii,
2002, St John etalii, 2000; Bharti etalii , 2003) que dependem da água (pesca, corrida
de aventura, triátlon, etc.) fazem com que a doença deixe de ser atribuída somente a
3
classes sociais desfavorecidas, e passe também a representar riscos para indivíduos de
classe média e média-alta (Bharti etalii, 2003).
A falta de sintomas clínicos bem definidos, associada à carência de recursos nos
ambulatórios de países em desenvolvimento, muitas vezes leva à má interpretação de
diagnósticos, subestimando o número de casos de leptospirose até mesmo em áreas
endêmicas (Dall’Antônia et alii, 2008). O recente seqüenciamento dos genomas de
algumas linhagens de Leptospira (Ren etalii, 2003; Nascimento etalii, 2004) despertou
novo interesse sobre os mecanismos de patogênese da doença, e, conseqüentemente,
aumento no número de casos relatados.
Etiologia
Bactérias do gênero Leptospira são espiroquetas gram-negativas
obrigatoriamente aeróbias de aproximadamente 0,1 µm de diâmetro por 6 a 20 µm de
comprimento. São dificilmente visualizadas por técnicas de coloração convencionais,
sendo mais recomendados os métodos de iluminação de campo escuro ou microscopia
de contraste de fase (Faine, 1982). As células possuem extremidades afiladas,
geralmente curvadas em forma de gancho, característica que deu o nome da espécie
patogênica – L. interrogans – por lembrar um sinal de interrogação. Possuem dois
filamentos axiais periplasmáticos responsáveis por sua mobilidade, que partem de
extremidades opostas e se sobrepõe no centro da bactéria (Levett, 2005), as quais se
locomovem tanto por movimentos de rotação quanto por flexão.
O gênero Leptospira compreende classicamente duas espécies: L.interrogans e
L.biflexa (espécie patogênica e saprofítica, respectivamente). Estas duas espécies são
subdivididas em sorovares, de acordo com exames de aglutinação para antígenos
específicos. Sorovares antigenicamente relacionados são, por conveniência, agrupados
em sorogrupos. Estudos recentes baseados na seqüência genética de diversos
sorovares levaram a uma nova classificação taxonômica das bactérias desse gênero.
Assim, atualmente as Leptospira são divididas em 18 genomoespécies (Matthias etalii,
2008) das quais oito possuem representantes patogênicos, seis não apresentam
nenhum representante patogênico e quatro encontram-se numa posição
intermediária, consideradas oportunistas (Tabela 1). A classificação genética não se
relaciona com a sorológica, podendo haver sorovares diferentes dentro de uma
4
mesma espécie (incluindo sorovares patogênicos e não-patogênicos) e espécies
diferentes em um mesmo sorogrupo.
Tabela 1. Representantes dos atuais clados do gênero Leptospira, inferidos por
análisefilogenéticadogenedasubunidade16SdoRNAribossomal.
Classificação Genomoespécie
Patogênicas Leptospirainterrogans
Leptospirakirschneri
Leptospiranoguchii
Leptospiraalexanderi
Leptospiraweilii
Leptospira genomospecies 1
Leptospiraborgpetersenii
Leptospirasantarosai
Intermediárias ou oportunistas
Leptospirainadai
Leptospirafainei
Leptospirabroomii
Leptospiralicerasiae
Não-patogênicas
Leptospirabiflexa
Leptospirameyeri
Leptospirawolbachii
Leptospira genomospecies 3
Leptospira genomospecies 4
Leptospira genomospecies 5
BiologiaMolecular
O genoma da Leptospira é composto por dois cromossomos circulares que
juntos podem chegar a 5000 kb: o cromossomo maior tem de 3600 a 4600 kb e o
menor de 300 a 350 kb. Não foi reportada a presença de nenhum plasmídeo nos
genomas seqüenciados. O grande tamanho de seu genoma, quando comparado com o
de outras espiroquetas, é atribuído à alta capacidade do organismo em sobreviver no
ambiente e ao número de hospedeiros que pode infectar. Quatro genomas de
bactérias patogênicas do gênero Leptospira já foram seqüenciados, e o tamanho
reduzido do genoma de L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis foi relacionado à
diminuição da capacidade de transmissão dessa espécie (Dieter etalii, 2006).
Estudos com manipulação genética e transformação de Leptospira foram
dificultados por muito tempo, devido principalmente ao complexo sistema de restrição
5
destes organismos. Um vetor de entrada para L.biflexa foi construído e divulgado em
2000 (Girons etalii, 2000), e mais recentemente um grupo demonstrou a importância
de pelo menos um gene para a patogenia de L. interrogans por meio de inserções
aleatórias (Ristow etalii, 2007).
Epidemiologia
A leptospirose ocorre durante o ano todo em várias partes do mundo, mas tem
um pico de incidência nos períodos de maior precipitação. No campo de países em
desenvolvimento tem sido considerada como doença laboral, enquanto que nas
cidades aparece como surtos precedidos de enchentes (McBride et alii, 2005).
Entretanto, sua epidemiologia vem mudando cada vez mais, acompanhada pelas
constantes mudanças climáticas e sociais. Surtos foram relacionados com o fenômeno
do El niño (Storck et alii, 2007) e com atividades recreativas em reservas de água
contaminadas (Morgan et alii, 2002; Haake et alii, 2002, St John et alii, 2000). O
aumento do número de desabrigados, mesmo em países desenvolvidos, faz com que
mais pessoas estejam expostas ao contato com a urina de ratos e ratazanas. Furacões
e tornados além de causarem enxurradas e alagamentos, deixam centenas de pessoas
desabrigadas, o que favorece a contaminação. A biologia da doença é, portanto,
altamente variável e dependente de fatores abióticos (clima, topografia, e geografia),
bióticos (diversidade de hospedeiros, vetores e suas relações ecológicas) e
antropológicos (comportamento, exploração ambiental e infra-estrutura). Para
simplificar, Faine (1994) ilustrou pelo menos três situações de risco diferentes: a
primeira é relacionada aos riscos laborais, e ocorre principalmente em áreas
temperadas, onde os animais de criação são praticamente os únicos reservatórios de
Leptospira. A segunda ocorre em países de clima tropical, geralmente em
desenvolvimento, com medidas de saneamento básico precárias e um número maior
de hospedeiros de manutenção. Nesse caso, existe um aumento da probabilidade de
contato com a bactéria, independente da ocupação. A terceira situação está
relacionada às infecções ocasionadas por roedores urbanos, como os ratos de esgoto,
por exemplo. Essa última situação tem particular importância em cidades destruídas
pela guerra ou por desastres naturais (Levett, 2001).
6
Os hospedeiros podem ser classificados como de manutenção, quando
perpetuam a contaminação do meio ambiente, ou acidentais, quando apresentam a
forma aguda da infecção (como no caso dos humanos). Diversos estudos tentaram
relacionar a prevalência de alguns sorovares com hospedeiros específicos e suas
variações de acordo com a região. De um modo geral, pequenos roedores são os
principais hospedeiros de manutenção que, dependendo das espécies, podem albergar
sorovares distintos. Ratos são conhecidos por abrigar sorovares dos sorogrupos
Icterohaemorrhagiae e Ballum, já os camundongos são hospedeiros para o sorogrupo
Ballum (Levett, 2001). No Brasil, os sorovares Icterohaemorrhagiae,Canicola,Pomona,
Hardjo e Pyrogenes, compreendem os principais sorogrupos que acometem o homem,
canídeos, ovinos, bovinos e caprinos, respectivamente (Ministério da Saúde, 1995;
Favero et. alii, 2002). Conhecer os sorovares prevalentes e seus hospedeiros de
manutenção é fundamental para entendermos a epidemiologia da doença em
qualquer região do mundo (Levett, 2001).
TransmissãoePatologia
Uma vez excretadas no meio, as bactérias podem sobreviver por longos
períodos de tempo. Sua sobrevida é aumentada quando o ambiente é quente, úmido e
neutro ou ligeiramente alcalino (Enna e Rolando, 2007), condições facilmente
encontradas em países tropicais.
Entre os hospedeiros de manutenção, a infecção é passada dos indivíduos mais
antigos para os mais novos, por contato direto, durante o parto ou pela contaminação
do solo. No caso dos seres humanos, hospedeiros acidentais, a bactéria entra por
abrasões na pele, pelas mucosas ou até mesmo pela pele íntegra quando o indivíduo
se mantém imerso em água contaminada por períodos prolongados (como no caso de
trabalhadores de esgotos ou arrozais, por exemplo). Embora mais raros, existem casos
documentados de transmissão sexual, transplacentária e de infecção por ingestão de
água contaminada (Enna e Rolando, 2007). Uma vez dentro do hospedeiro, as
Leptospira são transportadas pela corrente sanguínea e invadem tecidos e órgãos. O
período de incubação varia de 2 a 20 dias, sendo mais comum de 7 dias (Ministério da
Saúde, 2005).
7
Clinicamente, a doença pode se manifestar com diversos graus de severidade. A
maioria das infecções é supostamente assintomática, com o único sinal sendo
bacteremia. Entretanto, formas graves da doença são relativamente freqüentes e
apresentam taxas de mortalidade de 10 a 50% (McBride, 2005). Vários estudos
tentaram relacionar as apresentações clínicas com sorovares específicos, mas nenhum
conseguiu resultados conclusivos. Aparentemente, o conjunto de fatores que
influencia a variação dos quadros clínicos inclui a linhagem do parasita, quantidade
inoculada, recorrência de infecção e as interações parasito-hospedeiras específicas.
Os sintomas variam muito e dependem da severidade da doença, mas os mais
comuns são a febre, mialgias intensas, cefaléia, manifestações gastrointestinais,
infecção conjuntiva e meningite. A apresentação clínica da doença é geralmente
bifásica, com a fase aguda durando cerca de uma semana, seguida pela fase imune,
caracterizada pela soroconversão e excreção de Leptospira pela urina (Levett, 2005).
A vasculite sistêmica, que facilita a migração das espiroquetas para os demais
órgãos, pode resultar em dano vascular severo, acompanhado de hemorragias e
comprometimento pulmonar, renal e hepático. Outras complicações da leptospirose
estão associadas com a localização tecidual das Leptospira durante a fase imune, e
ocorrem a partir da segunda semana da doença (Levett, 2001).
A patogenia é caracterizada pelo desenvolvimento de vasculite, dano endotelial
e infiltrados inflamatórios compostos por monócitos, células plasmáticas, macrófagos
e neutrófilos.
Nas análises histopatológicas, alterações são mais evidentes no fígado, rins,
coração e pulmões, mas outros órgãos também podem ser afetados de acordo com a
severidade da doença. O comprometimento hepático se manifesta clinicamente por
hepatomegalia e icterícia, efeitos secundários da invasão dos sinusóides, espaço de
Disse e destruição localizada de hepatócitos (Enna e Rolando, 2007). Há evidência de
hipertrofia e hiperplasia das células de Kupffer, pode haver colestase intra-hepática, e
eritrofagocitose já foi reportada (Levett, 2001).
8
Nos rins, a maior ocorrência é de nefrite intersticial, acompanhada de
infiltração celular de neutrófilos e monócitos. Pode haver também insuficiência renal
com padrões de nefrose hipoxêmica, associada a elementos que sugerem dano celular
mediado por toxinas (Enna e Rolando, 2007). Leptospira podem ser encontradas nos
túbulos renais, que apresentam depleção mitocondrial, bordas em escova desnudas, e
membranas basais espessadas. Mudanças na estrutura glomerular conferem uma base
anatômica para a proteinúria na leptospirose (Levett, 2001).
No coração, os sinais encontrados incluem miocardite intersticial, com
infiltração de linfócitos e células plasmáticas, hemorragia e infiltração mononuclear no
epicárdio, efusões pericárdicas, e arterite coronariana (Levett, 2001).
Hemorragias pulmonares relacionadas à leptospirose têm ganhado cada vez
mais atenção desde o reconhecimento da forma pulmonar severa da leptospirose
(severe pulmonary form of leptospirosis – SPFL), uma das maiores causas de morte em
pacientes que desenvolvem a forma mais grave da doença (Dolhnikoff et alii, 2007).
Taxas de incidência de envolvimento pulmonar aumentaram recentemente, e podem
variar de 20 a 70 por cento dos casos totais (Bharti et alii, 2003; Dall’Antonia et alii,
2008). Sinais clínicos envolvem congestão e hemorragia pulmonar, com infiltração dos
espaços alveolares por monócitos e neutrófilos. Pode haver formação de membrana
hialina, e Leptospira podem ser encontradas em células endoteliais dos septos inter-
alveolares e dos capilares (Levett, 2001).
Necrose focal de músculos esqueléticos (principalmente das pernas) pode
ocorrer, com infiltração de macrófagos, neutrófilos e células plasmáticas (Levett,
2005).
No cérebro, observa-se infiltração perivascular de linfócitos. Comprometimento
neurológico é observado na forma de cefaléia intensa, e raramente como alteração de
consciência. Pode-se desenvolver também meningite, geralmente durante a fase
imune da doença, o que nos leva a crer que os problemas neurológicos devem estar
associados a manifestações do sistema imune do hospedeiro (Levett, 2001).
9
O comprometimento ocular é observado por sufusão conjuntiva, que quando
acompanhada de icterícia é um indicativo da doença de Weill, uma das formas mais
graves da leptospirose. Ocasionalmente, pode-se desenvolver uveíte anterior,
manifestada por visão embaçada, fotofobia e dor (Enna e Rolando, 2007). Postulou-se
que a persistência de alguns antígenos possa provocar uma reação auto-imune
responsável por tais manifestações (Parma, Cerone e Sansinanea, 1992; Kalsow e
Dwyer, 1998; Rathinam, 2005). Leptospira podem ser encontradas no humor aquoso
em humanos e eqüinos, como demonstrado tanto por microscopia quanto por PCR
(Levett, 2001).
Infecções agudas podem afetar o curso da gravidez, tanto por efeito da febre e
alterações patológicas na mãe quanto por transmissão transplacentária ao feto. Em
pelo menos um caso bactérias do sorovar Hardjo foram transmitidas da mãe para o
bebê pela amamentação (Levett, 2001).
Patogênese
Existem basicamente dois tipos de mecanismos para a patogênese da
leptospirose: os efeitos diretos da bactéria nos tecidos e a reação imune do
hospedeiro à infecção.
Apesar dos mecanismos moleculares responsáveis pela patogenia das
Leptospira ainda não terem sido elucidados, vários fatores de virulência foram
propostos e caracterizados recentemente. Dentre eles, lipoproteínas e proteínas de
superfície, proteínas secretadas, elementos de mobilidade, quimiotaxia, adesão e
invasão, e lipopolissacarídeos (Palaniappan, Ramanujam e Chang, 2007).
Sabe-se que a lipoproteína LipL36 tem expressão diferenciada quando mantidas
em culturas invitro comparada com invivo (Barnett etalii, 1999). LigA, Qlp42, LipL42 e
Loa22 se mostraram reguladas positivamente durante infecções (Haake e Matsunaga,
2002). LipL32 dispara uma resposta inflamatória por meio de um mecanismo
envolvendo fator kappa-B nuclear e receptores do tipo Toll (TLR)2 (Yang, Hung e Wu,
2006). LfHA, LruA e LruB foram identificados e caracterizados como novas proteínas
imunogênicas (Palaniappan, Ramanujam e Chang, 2007).
10
Existem pelo menos 79 genes associados à mobilidade em todos os genomas
seqüenciados até o momento, sendo que destes, 42 se conservam entre outras
espiroquetas conhecidas, como B. burgdorferi e T. pallidum. Análise genômica indica
que o sistema de quimiotaxia de L.interrogans é muito mais sofisticado do que o deB.
burgdorferie T.pallidum. Linhagens patogênicas apresentam quimiotaxia em direção à
hemoglobina, enquanto que as saprofíticas não (Nascimento etalii, 2004).
A adesão de bactérias às células hospedeiras é o primeiro passo para se
estabelecer uma infecção. Leptospiras entram tanto em células fagocíticas quanto não-
fagocíticas, e diversos estudos com culturas de células demonstram a importância de
moléculas de superfície para adesão e invasão. Uma proteína de adesão à fibronectina
expressa na superfície de bactérias do sorovar Icterohaemorrhagiae, mas não de
linhagens não-virulentas, pode exercer papel importante no contato inicial do parasita
com o hospedeiro (Merien etalii, 2000; Lin e Chang, 2007).
O lipopolissacarídeo (LPS) leptospiral tem atividade endotóxica mais baixa em
relação ao de outras bactérias Gram-negativas, apesar de terem composições
semelhantes. Outra singularidade é que disparam o sistema inato em humanos por
receptores do tipo toll (TLR)2, ao invés de TLR4. A resistência dos camundongos à
infecção por leptospiras patogênicas ao homem foi atribuída à alta afinidade entre
essas moléculas e receptores do tipo TLR2 e TLR4, que confere uma resposta imune
inata efetiva para o sorovar em questão (Viriyakosol etalii, 2006). Mudanças no LPS de
leptospiras patogênicas afetam a letalidade da infecção. Algumas regiões dessas
moléculas são altamente variáveis em diferentes sorovares, e são responsáveis por
evocar uma imunidade sorovar-específica.
Foi reportado que os sorovares Pomona e Copenhageni produzem uma
proteína citotóxica, e o plasma de animais infectados possuía atividade citotóxica. In
vivo, essa proteína foi capaz de causar infiltrações histopatologicamente evidentes.
Outras frações com atividade citotóxica foram purificadas dos sorovares Copenhageni
e Canicola, mas também foram detectadas em sorovares não-patogênicos, sugerindo
que outros fatores de virulência podem ter papéis mais importantes. Nos genomas
anotados, existem diversas hemolisinas, esfingomielinases e fosfolipases. Uma
11
esfingomielinase apresenta atividade formadora de poros em várias células de
mamíferos, e pode contribuir para a vasculite sistêmica (Levett, 2001).
Mesmo com as recentes elucidações sobre a patogenia da doença, muitas
proteínas ainda hão de ser identificadas e caracterizadas, o que trará uma percepção
mais acurada dos processos infecciosos induzidos pelas Leptospiras.
Peptidases
Apesar de o termo “protease” ser comumente empregado, o Comitê de
Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, em
inglês) recomenda o termo “peptidase” para a classe de enzimas que catalisam a
hidrólise de ligações peptídicas. Estão amplamente difundidas na natureza, onde
diversas funções biológicas dependem de sua atividade. Atualmente, três critérios
principais são utilizados para classificar as peptidases: (1) a reação catalisada; (2) a
natureza química do sítio catalítico; e (3) a relação evolutiva entre outras proteases,
como revelada pela estrutura primária e/ou terciária da proteína.
Quanto ao tipo da reação catalisada, as peptidases podem ser divididas em
endopeptidases, quando preferencialmente clivam peptídeos de regiões internas da
proteína, longe das extremidades, ou exopeptidases, quando agem próximas às
terminações da cadeia polipeptídica. As que exibem especificidade em relação à região
n-terminal das proteínas são chamadas de aminopeptidases, enquanto que as que
clivam peptídeos da região c-terminal são conhecidas por carboxipeptidases. Existem
também as omegapeptidases, que clivam peptídeos ou dipeptídeos de ambas as
regiões, que são ligados, substituídos ou ciclizados por pontes isopeptídicas (Rawlings
etalii, 2008).
As peptidases podem ainda ser agrupadas quanto ao tipo de sítio catalítico que
possuem. Em 1960, Hartley reconheceu quatro tipos de sítios catalíticos, que mais
tarde levaram à classificação por seríno-, cisteíno-, aspártico- e metalo-peptidases
(Barrett, 1980; Barrett e McDonald, 1986). Atualmente, com o reconhecimento das
treonína e glutâmico-peptidases (respectivamente, Abadjieva etalii, 2000 e Fujinaga et
alii, 2004), somadas ao grupo de peptidases com ação catalítica desconhecida, o
12
número de tipos de peptidases de acordo com essa classificação chega a sete. Esse
sistema de agrupamento contribui para os dois sistemas atuais de nomenclatura e
classificação de peptidases, o EC e o MEROPS.
O último critério de classificação das peptidases é baseado na homologia, ou
seja, na relação evolutiva e estrutural entre as enzimas, inferida a partir da
comparação de seqüências de aminoácidos e/ou estruturas terciárias. Esse método foi
introduzido por Barret e colaboradores em 2003, e atualmente é o motor do banco de
dados MEROPS
1
(Rawlings et alii, 2008). A partir dessas comparações, a função
biológica de uma determinada enzima pode ser inferida com base apenas na
seqüência nucleotídica do gene responsável por sua codificação (Potempa e Pike,
2005). Além de o sistema MEROPS utilizar-se da homologia entre os diferentes tipos de
proteases para classificá-las em famílias, que posteriormente são agrupadas em clãs,
ele utiliza-se ainda da classificação quanto ao tipo de sítio catalítico, pois as peptidases
comuns em uma família geralmente possuem uma grande conservação na seqüência
peptídica.
O sistema EC foi introduzido pela Comissão de Enzimas, e atualmente é
mantido pelo Comitê de Nomenclatura da IUBMB
2
. Esse sistema é baseado no tipo de
ação das enzimas, sendo que as peptidases se encontram no grupo 3.4 (o número ‘3’
corresponde às hidrolases, e o ‘4’ ao tipo de ligações clivadas – no caso as peptídicas).
As propriedades das principais classes de peptidases estão descritas a seguir.
Aspárticopeptidases
Atualmente composta por 14 famílias, agrupadas em sete clãs distintos, essa
classe inclui as enzimas digestivas, como pepsina, quimiosina e renina, bem como
algumas peptidases fúngicas. Também fazem parte dessa classe de peptidases as
retropepsinas, como a protease do vírus da imunodeficiência humana. Dentre os sete
clãs definidos, dois (AC e AF) contêm enzimas presentes apenas entre as bactérias. O
clã AD possui também uma família composta apenas por peptidases bacterianas. O
sítio ativo foi inferido por estudos de modificação química (Delpierre e Fruton, 1965;
Disponível em:
1
http://merops.sanger.ac.uk/.
2
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/.
13
Hartsuk e Tang, 1972; Dunn, 2001), e é normalmente composto por um par de
resíduos de ácido aspártico (Asp-32 e Asp-215, na pepsina). A catálise da quebra das
ligações peptídicas mediada por membros dessa classe de peptidases ocorre sem o uso
de um ataque nucleofílico por um grupo funcional da enzima, ao invés disso, uma
molécula de água é fortemente ligada entre os dois resíduos catalíticos (Dunn, 2001),
que exerce a função esperada de nucleófilo. São inibidas especificamente por
pepstatina A ou por compostos de diazoacetil.
Na bactéria da praga Yersinia pestis, a aspartato-peptidase Pla converte
plasminogênio do hospedeiro em plasmina, além de desabilitar a α
2
-antiplasmina, o
que facilita a atividade dessa peptidase na degradação de fibrina e outras proteínas
não-colagenosas da matriz extracelular. Isso causa o dano local do tecido conjuntivo, e
permite a invasão eficiente da bactéria para a circulação. É também sabido que a
peptidase Pla medeia a adesão do parasita à membrana basal e a invasão de células
epiteliais em humanos. (Potempa e Pike, 2005).
Adicionalmente, várias outras aspartato-peptidases estão envolvidas no
processo de regulação de diversos fatores de virulência em outras bactérias. Na E.coli
enteropatogênica, a correta montagem do pilo formador de maços (BFP) depende da
atividade peptidásica da pré-pilina (Anantha, Stone e Donnenberg, 2000; Potempa e
Pike, 2005). O nocaute do gene responsável pela produção da pré-pilina em Legionella
pneumophila, prejudica a habilidade da bactéria de crescer em amebas ou células
macrófago-símiles de humanos (Liles, Edelstein e Cianciotto, 1999; Potempa e Pike,
2005).
Cisteínopeptidases
Essa classe é atualmente composta por 58 famílias, dispostas em nove clãs.
Apesar de duas peptidases bacterianas (estreptopaína e clostripaína) dessa classe
constarem entre as primeiras enzimas com atividade peptídeo-hidrolásica descritas, as
cisteíno-peptidases são sub-representadas em organismos procariontes (Potempa e
Pike, 2005). Em compensação, estão amplamente distribuídas nos outros reinos. A
papaína é o arquétipo membro mais estudado dessa classe de peptidases. Os
principais clãs dessa classe de peptidases são: CA, que possui todas as famílias
14
relacionadas à papaína; o CD, que contém famílias com motivos semelhantes ao da
família das caspases; e o CL, que corresponde às peptidases bacterianas que clivam e
transferem peptídeos da parede celular das bactérias (Rawlings, 2008).
O mecanismo catalítico dessa classe se baseia numa tríade catalítica, na qual
um resíduo de histidina é usado para ativar o resíduo de cisteína em um nucleófilo (no
caso, um átomo de enxofre). Em um segundo momento, a histidina funciona como
aceptor de elétrons, facilitando a transferência da região carboxiterminal do resíduo
atacado para a formação de um intermediário covalente (Dunn, 2001). Peptidases
dessa classe são inibidas por p-cloromercuriobenzoato (pCMB) e L-trans-
epoxisuccinilleucilamido (4-guanidino)-butano (E-64), e também por outros agentes
como iodoacetamida, leupeptina, cistatina e quimostatina (Bond e Butler, 1987).
Serinopeptidases
Composta por 29 famílias dispostas em 13 clãs, as serino-peptidases são as
enzimas mais estudadas no ramo das proteases, e talvez em toda a enzimologia (Dunn,
2001). É também o maior grupo de peptidases, constituindo cerca de 35% do total de
enzimas presentes no banco de dados MEROPS. Essa classe catalítica possui um
resíduo de serina agindo como nucleófilo durante o ataque. O mecanismo de ataque é
basicamente o mesmo das cisteíno-peptidases, com exceção da formação do
intermediário covalente, que no caso das serino-peptidases é um éster, ao invés de um
tiol-éster. Do ponto de vista evolutivo, o mecanismo de ataque das serino-peptidases é
considerado o mais eficiente dentre as outras peptidases, já que é o mais comum
devido ao grande número de peptidase no grupo dessas enzimas. As duas maiores
famílias dessa classe são a S1A e a S8A, representadas pela quimiotripsina e pela
subtilisina, respectivamente. Enquanto que as enzimas da família S1A são de origem
animal, as da S8A derivam de bactérias. No entanto, suas estruturas são muito
semelhantes, e postula-se que elas possuem uma origem comum a partir de uma
duplicação gênica de uma serino-peptidase ancestral, seguida de evolução divergente
(Voet e Voet, 1990). Catalíticamente, são conhecidas por terem atividade máxima em
pH ligeiramente alcalino, e são inibidas por diisopropilfluorofosfato (DFP), e muitas são
sensíveis a fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF) e aprotinina.
15
O fator de virulência bacteriano mais bem descrito dessa classe de peptidases,
provavelmente, é a C5a peptidase, dos grupos A e B de Streptococci. Como o próprio
nome sugere, trata-se de uma enzima que cliva o componente C5a do sistema
complemento, um agente quimiotáxico para os leucócitos polimorfonucleares (Hill et
alii, 1988; Potempa e Pike, 2005).
Metalopeptidases
A classe das metalopeptidases é considerada a mais primitiva, porém se
destaca das demais pela solução mais direta do efeito catalítico na ligação peptídica.
Ao contrário das outras peptidases, que se baseiam em pontes de hidrogênio em uma
fenda oxianiônica, as metalopeptidases utilizam a coordenação de um íon metálico
divalente para exercer o mesmo efeito (Dunn, 2001). São peptidases que diferem
amplamente em suas seqüências e estruturas, e a grande maioria tem um átomo de
zinco cataliticamente ativo. O zinco, em alguns casos, pode ser substituído por cálcio,
cobalto ou níquel, sem perda de atividade. O íon metálico geralmente é imobilizado
por três aminoácidos ligantes: His, Glu ou Asp. Além dos ligantes ao metal, pelo menos
mais um resíduo (geralmente um resíduo de glutamato) está envolvido na hidrólise
catalítica das ligações peptídicas, exercendo a função de uma base na polarização do
solvente catalítico (Potempa e Pike, 2005). São inibidas por agentes quelantes de íons,
como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), N,N,N’,N’,-etilenoglicol-bis[aminoetil-
éter]-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA) e 1,10-fenantrolina (Bond e Butler,
1987).
Atualmente estão divididas em 53 famílias, agrupadas em 15 clãs, que são
reconhecidos pelo tipo e número de íons metálicos necessários para a catálise e pelo
arranjo seqüencial dos ligantes metálicos e resíduos catalíticos. O clã MA é o mais
representado e divergente, abrangendo as zincínas. Ao contrário da limitada
ocorrência das aspártico- e cisteíno-peptidases entre bactérias, as metalopeptidases
são freqüentemente encontradas nesses microorganismos, e possuem representantes
bacterianos em 50 de suas 53 famílias. Três peptidases dessa classe são extremamente
importantes do ponto de vista farmacêutico. São elas as FtsH peptidases, metionil-
aminopeptidases e homólogos da sialoglicopeptidase de Pasteurella haemolytica,
únicas peptidases entre todas as classes que são completamente conservadas entre
16
diversas espécies bacterianas. Por essa razão, membros dessa classe de peptidases são
alvos perfeitos para o desenvolvimento de inibidores específicos, que, bloqueando a
ação dessas peptidases, poderiam ser utilizados para impedir o crescimento ou até
mesmo matar a maioria das bactérias (Potempa e Pike, 2005). Infelizmente,
homólogos humanos da metionil-aminopeptidase também são susceptíveis aos
inibidores enzimáticos bacterianos. É necessário, portanto, o desenvolvimento de
novos inibidores específicos baseados na estrutura tridimensional e características
bioquímicas dessas enzimas. Corroborando a idéia de tamanha importância das
metalopeptidases para as bactérias, sabe-se que elas compõem dois terços das
aminopeptidases bacterianas conhecidas (Gonzales e Robert-Baudouy, 1996).
Aminopeptidasesbacterianas
Aminopeptidases são enzimas capazes de clivar o aminoácido N-terminal de
cadeias peptídicas. Podem ser classificadas de acordo com o tipo de sítio catalítico e
especificidade aos substratos. Possuem papel importante em diversas funções
biológicas, tais como manutenção celular, crescimento, desenvolvimento e defesa.
Historicamente, eram consideradas meras coadjuvantes no processo de reciclagem de
aminoácidos, mas atualmente passaram a ser reconhecidas por diversos outros papéis.
Em bactérias, por exemplo, possuem funções secundárias de regulação gênica,
repressão transcricional, recombinação sítio-específica e de receptores virais e de
toxinas (Matsui, Fowler e Walling, 2006). Existem 219 aminopeptidases explícitas no
banco de dados MEROPS, e estão distribuídas entre os mais diversos organismos.
Foram umas das primeiras peptidases descobertas, e desde então são estudadas a
sério, devido suas importantes funções biológicas.
Como já foi dito anteriormente, a maior parte das aminopeptidases faz parte
das metalopeptidases. Nesse grupo específico, as leucil-aminopeptidases
(aminopeptidases com preferência a resíduos de leucina) merecem destaque, já que
estão envolvidas em diversos mecanismos patogênicos e possuem estrutura
tridimensional resolvida (Strater, Sherratt e Colloms, 1999). Apesar da importância
dessas peptidases nos processos patogênicos de diversos organismos, estudos
envolvendo a capacidade proteolítica em espiroquetas são raros, com exceção das
bactérias do gênero Treponema (Makinen et alii, 1988 e 1995; Ohta, Makinen e
17
Loesche, 1986). Há alguns anos, Bertin e colaboradores caracterizaram uma leucil-
aminopeptidase de Borreliaburgdorferi (Bertin, 2005). Devido ao pequeno número de
publicações sobre proteases de espiroquetas, em específico de Leptospira, o presente
trabalho visou identificar e caracterizar atividade leucil-aminopeptidásica relacionada
com essa bactéria uma vez que tal atividade somente havia sido detectada em
representantes patogênicos de L.interrogans.
Objetivos
19
Objetivos
Tendo em vista o importante papel que as peptidases exercem nos processos
de virulência e perseverança de microorganismos patogênicos, estudá-las é
fundamental, não somente para conhecer os mecanismos moleculares da fisiologia das
doenças parasitárias, mas também para encontrar possíveis alvos de quimioterapia.
Uma vez identificadas diferenças significativas na atividade peptídeolítica entre
sorovares patogênicos e não-patogênicos de bactérias do gênero Leptospira, novas
investigações devem ser feitas, de modo a desvendar se as enzimas responsáveis
constituem ou não possíveis alvos quimioterápicos.
Nesse contexto, o objetivo geral deste trabalho é caracterizar bioquimicamente
a enzima responsável pela diferença de atividade leucil-aminopeptideolítica detectada
em sorovares patogênicos de Leptospira. Para tanto, os objetivos específicos traçados
foram:
1. Obter a forma recombinante e ativa da enzima responsável pela degradação do
substrato L-Leu-AMC em sorovares patogênicos de Leptospira;
2. Caracterizar bioquimicamente sua atividade determinando os parâmetros cinéticos
da mesma;
3. Produção de soro anti-LAP de L. interrogans patogênica, com vistas a posteriores
estudos que relacionem a presença da proteína com a patogenicidade
característica de alguns sorovares.
MaterialeMétodos
21
MaterialeMétodos
Com base nas anotações genômicas dos sorotipos de Leptospira interrogans
seqüenciados, pôde-se atribuir a atividade leucil-aminopeptidásica do extrato total
bacteriano à proteína codificada pelo gene pepA (provável aminopeptidase citosólica).
O gene em questão foi, então, clonado e expresso recombinantemente em bactérias E.
coli BL21-DE3, altamente recomendadas para essa finalidade. O DNA cromossomal dos
sorovares de Leptospira spp. utilizado como molde para a reação de polimerase em
cadeia (PCR) foi gentilmente cedido pelo professor Dr. Marcos Bryan Heynemann
(Universidade Federal de Minas Gerais).
SorovaresdeLeptospiraspp.econdiçõesdecultivo
Os sorovares utilizados nesse estudo foram cultivados a 28 °C em meio EMJH
suplementado com soro de coelho inativado, como descrito por Turner e Mohun (1970
in Heinemann etalii, 2000).
Preparação das amostras de DNA submetidas à reação de
polimeraseemcadeia
Leptospiras em cultura foram coletadas por centrifugação a 13.000 g por 30
minutos, e o DNA genômico extraído como descrito por Sambrook et alii (1989 in
Heinemann etalii, 2000).
AmplificaçãodogenepepAdeLeptospirainterrogans
Os oligonucleotídeos foram desenvolvidos com base na seqüência disponível do
gene pepA (Aminopeptidase citosólica) de Leptospirainterrogans sorovar Copenhageni
linhagem Fiocruz L1-130 (número de acesso no GENBANK: NC_005823). Suas
seqüências, com os sítios de restrição já adicionados, são:
• pepALIF-NdeI: 5'-CATATGAAACTGGATAAAAATAAAATCCAAATC-3', para o
iniciador senso, com adição do sítio de restrição para a enzima NdeI (seqüência
sublinhada);
22
• pepALIR-XhoI: 5'-CTCGAGCTATTTCTTTTTGCCAATCTTTTCAAC-3', para o iniciador
anti-senso, com adição do sítio de restrição para a enzima XhoI (seqüência
sublinhada).
Cada reação de 50 μL era composta por (as quantidades ou concentrações
finais estão contidas nos parênteses): 1 μL de DNA (50 ng), 1μL de cada
oligonucleotídeo (300 nM), 1μL de dNTP MIX (10 µM), 5μL de tampão de reação 10X
(1X), 2μL de MgCl
2
(1 mM), 1μL de Taq DNA polimerase (Fermentas, 1,25u) e água
milliQ q.s.p. 50 µL. Em seguida, as amostras seguiram para um termociclador
programado com o seguinte ciclo: desnaturação inicial a 94 °C por cinco minutos,
seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por um minuto, anelamento a 54 °C por
um minuto, extensão a 72 °C por um minuto e 30 segundos, e uma etapa de extensão
final a 72 °C por cinco minutos.
ClonagemdosgenesHardjopepAePomonapepA
VetorT/A
Os produtos amplificados, de aproximadamente 1500 pares de base, foram
ligados diretamente no vetor TA pGEMT-Easy (Promega) e transformados em bactérias
competentes DH5α, RecA negativas e conseqüentemente mais apropriadas para
replicação de plasmídeos de alta fidelidade. As células submetidas ao processo de
transformação foram plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina (100 µg / mL,
concentração final), IPTG e X-Gal, e incubadas overnight em estufa a 37°C. As colônias
brancas foram coletadas e crescidas em tubos com 1 mL de meio LB líquido adicionado
de ampicilina, também overnight. Posteriormente, 100 μL das culturas crescidas foram
retirados e guardados em tubos do tipo eppendorf, a 4°C. Os 900 μL restantes foram
centrifugados por cinco minutos em uma mini-centrífuga (Eppendorf) a 7.000 rpm, e o
sobrenadante foi descartado. As células precipitadas foram ressuspendidas em 70 μL
de H
2
O milliQ, e o DNA total dos possíveis clones foi extraído adicionando-se 100μL de
fenol-clorofórmio (1:1), seguido de agitação rápida até homogeneização, e
centrifugação a 16.000 rpm, por dez minutos. Quinze microlitros da fase superior de
cada amostra foram aplicados em gel de agarose 0,8%, para avaliação da diferença de
massa molecular plasmideal. Clones que apresentaram plasmídeos com massa
23
molecular mais alta foram cultivados em 15 mL de meio LB líquido, dos quais 10 mL
foram centrifugados e submetidos à extração por lise alcalina do tipo “miniprep”
(PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit, Invitrogen). O DNA plasmideal obtido foi
submetido à análise por PCR, com condições idênticas às utilizadas para amplificação
do DNA genômico. Clones positivos foram divididos em alíquotas e armazenados em
glicerol 15% a -80 °C. Os plasmídeos foram chamados de pGEM-HapepA, obtido do
fragmento amplificado do sorovar Hardjo, e pGEM-PopepA, obtido do sorovar
Pomona.
VetorpET19b
Para clonagem no vetor de expressão, os plasmídeos pGEM-HapepA e pGEM-
PopepA foram digeridos com as enzimas XhoI e NdeI (Fermentas), como descrito pelo
fabricante. O resultado da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose
0,8% e os fragmentos de aproximadamente 1500 pb foram eluídos com o kit PureLink
GelExtraction da Invitrogen. Os fragmentos purificados foram ligados no vetor pET19b
(Novagen) previamente digerido com as mesmas enzimas, e transformados em
bactérias competentes E.coli XL1 Blue por choque térmico. As células submetidas ao
processo de transformação foram plaqueadas em meio LB sólido com ampicilina e
crescidas a 37°C por toda a noite. Colônias aleatoriamente selecionadas foram
crescidas em meio LB líquido adicionado de ampicilina (concentração final de 100 µg
por mL), e submetidas à extração do DNA total por fenol-clorofórmio, como descrito
anteriormente. Os clones que apresentaram plasmídeos com massa molecular acima
do controle (pET19b+ vazio), foram crescidos novamente em 15 mL de meio de cultura
LB com ampicilina, dos quais 10 mL destinados à extração plasmideal por “miniprep”
(PureLinkQuickPlasmidMiniprepKit, Invitrogen) e submetido à análise por PCR. Os 5
mL restantes dos clones positivos foram divididos em alíquotas e armazenados em
glicerol 40% a -80°C. Os vetores de expressão obtidos foram chamados de pET19b-
HapepA e pET19b-PopepA, para os sorovares Hardjo e Pomona, respectivamente.
Seqüenciamento
Aproximadamente 500 ng de DNA plasmidial das amostras pET19b-HapepA e
pET19b-PopepA foi enviado em tubo eppendorf para a empresa Genomic Engenharia
24
Molecular. A amplificação se deu com uso dos iniciadores para o promotor T7 (5’-
TAATACGACTCACTATAGGG-3’) e para a região terminadora T7 (5’-
TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’). A qualidade do seqüenciamento foi confirmada por
visualização do cromatograma com o auxílio do programa ChromasLite
3
.
Análisefilogenética
As seqüências parciais obtidas dos dois genes clonados foram alinhadas com as
seqüências de L.interrogans sorovar Copenhageni e Lai (nº
s
de acesso YP_000715.1 e
NP_713621.1), L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis (nº
s
de acesso YP_798593.1 e
ABJ75481.1), L. biflexa sorovar Patoc (nº
s
de acesso ABZ92974.1 e ABZ96589.1), H.
influenzae (nº de acesso AAC23351.1),E.coli (YP_001726686.1),H.pilory (nº de acesso
NP_207365.1), T. denticola (nº de acesso NP_970914.1), P. falciparum (nº de acesso
XP_001348613.1), T. cruzi (nº de acesso EAN91071.1), T. brucei (nº de acesso
AAX70152.1), L. major (nº de acesso CAJ02694.1), M. musculus (nº de acesso
AAK13495.1),H.sapiens (nº de acesso NP_056991.2), pelo programa ClustalW (Larking
et alii, 2007). Em seguida tiveram sua distância filogenética atribuída pelo programa
DNAdist, e a matriz resultante processada pelo método de Neighbor-Joining (Saitou e
Nei, 1987) com auxilio do algoritmo NEIGHBOR, ambos da suíte de aplicativos PHYLIP
4
.
O arquivo com as informações da árvore filogenética foi visualizado com o programa
TreeView
5
.
Expressãodasproteínasrecombinantes
Células BL21-(DE3) foram transformadas por choque térmico com os vetores de
expressão pET19b-HapepA e pET19b-PopepA, e em seguida plaqueadas em meio LB
sólido com ampicilina. Uma colônia de cada placa foi escolhida e testada por PCR, a fim
de comprovar a transformação. Colônias positivas foram cultivadas em meio LB com
ampicilina, divididas em alíquotas e armazenadas em glicerol 15% a -80 °C.
Disponíveis em:
3
http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.
4
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.
5
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html.
25
As condições ótimas de expressão foram obtidas por ensaios em diferentes
temperaturas (20 °C, 30 °C, 37 °C), concentrações de IPTG (1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM e
0,1 mM) e tempos de indução (2 h, 3 h, 4 h, 6 h, ou por toda a noite). Extratos totais
das bactérias induzidas em cada condição foram centrifugados e as frações solúveis e
insolúveis foram separadas em SDS-PAGE 9%. Uma grande quantidade de proteína
solúvel foi obtida induzindo culturas na fase estacionária (OD
600
~ 0,6) com 0,3 mM de
IPTG durante 16h e agitação constante de 200 rpm.
Extraçãodasproteínasrecombinantes
ReagenteBugBuster®
Culturas de células BL21-DE3 foram centrifugadas por 15 minutos a 5.000 g, e,
após o descarte do sobrenadante, ressuspendidas em reagente BugBuster® (Novagen)
na razão de cinco mL para cada grama de célula, e submetendo-as a leve agitação em
temperatura ambiente. O produto de lise obtido foi centrifugado a 16.000 g por 10
minutos, e as frações solúveis e insolúveis separadas em tubos diferentes e analisadas
em SDS-PAGE 9%.
Ciclosdecongelamentoedescongelamento
Células de culturas induzidas foram ressuspendidas em tampão de lise (Tris-HCl
25 mM, pH 8, NaCl 300 mM, lisozima 0,2%) e submetidas a cinco ciclos de
congelamento (-20 °C) e descongelamento (37°C). Após centrifugação, frações solúveis
e insolúveis foram analisadas por SDS-PAGE 8%.
Sonicação
Células provenientes de 100 mL de culturas previamente induzidas e
precipitadas foram ressuspendidas em 15 mL de tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, pH
7,9, NaCl 500 mM, lisozima 0,2%) e incubadas a 37°C por 15 minutos. Em seguida,
foram submetidas a 3 ciclos de sonicação em banho de sal e gelo com um processador
ultra-sônico Vibra-Cell VC130 (Sonics). Cada ciclo consistia da aplicação de 10 watts de
potência (marcador de amplitude apontando 40) em pulsos com sete segundos de
duração e intervalos de um segundo entre eles, num tempo total de três minutos
(aproximadamente 22 pulsos). O tempo entre os ciclos era de, no mínimo, um minuto
26
para evitar aquecimento das amostras. A intensidade, o tempo total e o tempo de
cada pulso foram determinados experimentalmente, de modo que a maior parte das
células fossem lisadas sem que houvesse degradação das proteínas recombinantes.
Eletroforeseemgeldepoliacrilamida
SDSPAGE
As análises que exigiram separação de extrato celular, estimativa de massa
molecular e monitoramento da purificação da enzima recombinante foram feitas por
sistema descontínuo de eletroforese em gel de poliacrilamida 8% contendo dodecil
sultato de sódio (SDS-PAGE), como descrito por Laemmli (1970). O tampão de amostra
utilizado era composto por 0,1% SDS e 50 µM β-mercaptoetanol. A menos que a
visualização de oligômero fosse necessária, as amostras eram previamente fervidas
por cinco minutos antes de aplicação no gel. A eletroforese ocorreu mediante
aplicação de voltagem constante (100 V durante a etapa de concentração e de 150 V
durante a separação) em sistema de eletroforese vertical MiniProtean3 (Bio-Rad) com
tampão de corrida Tris-Glicina, como descrito pelo fabricante. Para a visualização das
bandas, os géis foram corados com azul de Coomassie.
As massas moleculares foram estimadas comparando-se o padrão de migração
das amostras com os dos marcadores comerciais BenchMark Protein Ladder
(Invitrogen) ou SDS-6H (Sigma).
PAGE
Para averiguar se o padrão de migração da enzima era alterado durante a
eletroforese desnaturante, foram corridos géis sem a adição de SDS em sua
formulação nem nos tampões de amostra e de corrida, com fervura prévia ou não das
amostras, sob as mesmas condições descritas acima.
Eletroforese para determinação da atividade enzimática
(enzimografia)daHaLAP
A eletroforese de géis de atividade (enzimograma) foi realizada a 4
o
C, com
voltagem constante de 100 V e sem fervura prévia das amostras. O tampão de amostra
27
tinha um teor reduzido de SDS (0,1%) e não possuía agentes redutores. Após a corrida,
os géis foram lavados quatro vezes com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 8.0, por 15
minutos, sob agitação lenta à temperatura ambiente. A atividade enzimática foi
visualizada após incubação do gel com o substrato L-AMC, 20 µM, por até 30 minutos
em temperatura ambiente, sob incidência de luz UV (Santana et alii, 1992, com
modificações). Depois de fotodocumentados, os géis foram lavados com água
destilada e corados com azul de Coomassie.
PurificaçãodasenzimasrecombinantesPoLAPeHaLAP
Cromatografiadeafinidadeemcolunadeníquel
O extrato solúvel contendo as enzimas recombinantes foi aplicado em coluna
de níquel com afinidade por histidina (HisBindPurificationKit®, Novagen). Um mililitro
da resina em estoque (adicionada de etanol) foi utilizado para cada coluna, resultando
em um volume final de 500 µL de resina assentada. Após várias lavagens com H
2
O
milliQ, a resina foi carregada com 5 volumes de NiSO
4
400 mM (ChargeBuffer), ativada
com 3 volumes de tampão de ligação (Bind Buffer - Tris-HCl 20 mM pH 7,9, NaCl 500
mM) e só então submetida à passagem da amostra (fluxo de aproximadamente 8 mL.h
-
1
). Em seguida foram aplicados 10 volumes (10x 500 µL) de tampão de ligação, com
cuidado para não ressuspender a resina, e outros 10 volumes de tampão de lavagem
(WashBuffer – Tris-HCl 20 mM pH 7,9, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM). As amostras
foram eluídas com seis volumes de tampão de eluição (EluteBuffer – Tris-HCl 20 mM
pH 7,9, NaCl 500 mM, imidazol 300 mM). Alíquotas foram recolhidas em cada etapa da
purificação, para posterior análise em SDS-PAGE. As concentrações de imidazol dos
tampões de lavagem e de eluição foram obtidas experimentalmente, por meio de
lavagens com tampão contendo 20 mM, 40 mM, 60 mM, 100 mM, 200 mM e 400 mM
de imidazol.
Cromatografiadeexclusãodemassamolecular
Para separação da forma quaternária das enzimas recombinantes, 200 µL do
segundo volume eluído da coluna de níquel (eluato com maior concentração de
proteínas) foram aplicados em um looping no sistema de FPLC (Fast Protein Liquid
28
Chromatography, Pharmacia LCC 501 Plus) acoplado a uma coluna de filtração em gel
Superdex-200 (Sigma), previamente equilibrada com tampão (Tris-HCl 25 mM pH 8,0,
NaCl 150 mM) filtrado e degaseificado, com fluxo de 0,5 mL.min
-1
. A amostra aplicada
no looping foi injetada na coluna com o mesmo tampão e fluxo utilizados para
equilibrá-la. Das 52 frações coletadas (Pharmacia LKB SuperFrac), 26 foram testadas
(intercaladamente: amostra sim, amostra não) para atividade leucil-
aminopeptideolítica. Brevemente, 18 µL das frações foram adicionados a 2 µL de
substrato L-AMC 200 µM (concentração final 20 µM) em uma placa, e, após 15
minutos de incubação à temperatura ambiente, visualizada sob luz ultravioleta.
Frações positivas (e adjacentes) para atividade leucil-aminopeptideolítica foram
armazenadas em gelo a 4 °C até o uso.
Caracterização da atividade proteolítica das enzimas
recombinantes
Os ensaios foram lidos com o auxílio de um espectrofotômetro SpectramaxM2
e
(Molecular Devices) programado para leituras no espectro de 440 nm, com excitação
de 380 nm, em intervalos de um minuto para os testes de dez minutos de duração, ou
em intervalos de dez segundos para os testes de cinco minutos de duração. A
velocidade média da reação pôde ser calculada pela leitura do acúmulo de
fluorescência emitida decorrente do aumento do número de moléculas de AMC livres.
Todos os experimentos foram realizados em duplicatas ou triplicatas.
InfluênciadopH
Aproximadamente 1 µg de proteína obtida no primeiro passo de purificação
(coluna de níquel) foi utilizada para cada reação de 100 µL em tampão AMT + L-AMC
(ácido acético 50 mM, Mes 50 mM, Tris-HCl 100 mM, L-AMC 20 µM), para a faixa de
pH 5,0 a 10, ou Tris-CAPS + L-AMC (Tris-HCl 100 mM, CAPS 100 mM, L-AMC 20 µM),
para a faixa de pH 8,0 a 11,5. Tampão e enzima foram aplicados em uma placa de 96
poços, incubados à temperatura ambiente por dez minutos para, somente então,
adicionar-se o substrato. A placa foi lida como descrito acima e as velocidades das
reações foram calculadas e comparadas entre si para obtenção do pH ótimo de
funcionamento da enzima.
29
Temperaturaótima
A temperatura ótima foi avaliada por meio de ensaios do tipo endpoint, no qual
apenas a fluorescência total no fim da reação foi considerada. Adicionou-se L-AMC
numa concentração final de 20 μM em 50 μL de tampão de reação (Tris-CAPS 100 mM,
pH 8,5) contendo cerca de 1 µg de enzima. As reações ocorreram em um
termociclador programado com diferentes temperaturas (20 °C, 30 °C, 37 °C, 40 °C, 50
°C, 60 °C, 70 °C), por dez minutos cada, ao final dos quais foram interrompidas pela
adição de 150 µL de etanol absoluto. As amostras foram aplicadas em placa de 96
poços, lidas em leitora de placa e as taxas de fluorescência comparadas entre si.
Influênciadaforçaiônica
Para a avaliação da influência da força iônica na velocidade média da reação,
fez-se uma diluição seriada de NaCl em tampão Tris-CAPS 100 mM, pH 8,5, de modo
que o primeiro poço tivesse uma concentração de 1 M, e o último 0,016 M. Adicionou-
se aproximadamente 1 µg de enzima obtida da primeira etapa de purificação em
tampão de reação, e em seguida incubou-se à temperatura ambiente por dez minutos
antes da adição de substrato L-AMC numa concentração final de 20 µM. A placa foi
inserida na leitora de placas e a velocidade média calculada e comparada ao grupo
controle (sem adição de NaCl).
Influênciadeagenteredutor
Foi testada a influência do agente redutor DTT no tampão de reação. DTT foi
adicionado ao tampão de reação Tris-CAPS 100 mM, pH 8,5 nas concentrações finais
de 2 mM, 1 mM e 0,5 mM. Após incubação de aproximadamente 1 µg de enzima por
dez minutos nos tampões, adicionou-se o substrato numa concentração final de 20
µM. A placa foi lida e as velocidades calculadas e comparadas ao grupo controle (sem
adição de DTT).
InibiçãoporEDTA
A enzima recombinante foi incubada em tampão de reação (Tris-HCl 25 mM, pH
8,5) com 1 e 10 µM do inibidor EDTA, por 10 e 30 minutos. Passado o tempo de
incubação, adicionou-se o substrato fluorogênico L-Leu-AMC. A reação foi monitorada
por 10 minutos em leitora de placas como descrito.
30
Suplementaçãoe/oudependênciadecátions
Para avaliação da dependência de cátions nas reações, uma alíquota da enzima
obtida na purificação por coluna de níquel foi incubada com EDTA (10 mM) por 30
minutos e em seguida submetida a processo de diálise em tampão Tris-HCl pH 8,5 a 4
°C, por 16 h. A enzima inibida foi incubada em tampão de reação com 0,4 mM de
CaCl
2
, CoCl
2
,
MgCl
2
, MnCl
2
ou ZnCl
2
por meia hora antes da adição do substrato L-AMC
na concentração final de 20 µM. A velocidade da reação foi calculada e comparada
com a do grupo controle (enzima submetida a processo de diálise sem adição prévia de
EDTA). Enzima não inibida foi utilizada para averiguar a suplementação da atividade
enzimática pela incubação com cátions nas mesmas condições.
VelocidademáximaeConstantedeMichaelisMenten(K
M
)
A concentração de substrato necessária para saturar os sítios ativos da enzima
HaLAP foi extrapolada por um ensaio com diluição seriada de L-Leu-AMC em tampão
Tris-CAPS 100 mM, pH 8,5. A concentração final de L-Leu-AMC variou de 50 µM a 1,56
µM para reações de 100 µL, com 0,2 µg de enzima purificada em coluna de filtração
em gel. A reação ocorreu à temperatura ambiente (25 °C), e o ensaio foi realizado em
duplicatas.
ProduçãodesoroαHaLAPemcamundongos
A proteína purificada em coluna de níquel foi extensamente dialisada contra
solução salina 0,9% antes de submeter os camundongos isogênicos fêmeas do tipo
Swiss às aplicações intra-dérmicas. A primeira dose constituiu de 5 µg da proteína
recombinante por animal, homogeneizada com adjuvante completo de Freund quatro
vezes diluído (1:3 de proteína devidamente diluída em solução salina estéril). No
segundo desafio foi utilizada a mesma concentração de proteína, porém
homogeneizada com adjuvante incompleto de Freund, nas mesmas proporções, 15
dias após a primeira imunização. A terceira imunização foi efetuada apenas com
solução salina 0,9% estéril, com a mesma quantidade de proteína por animal (5 µg). Os
animais foram sacrificados 10 dias depois, o soro recolhido e armazenado em glicerol
50% em -20 °C. O soro pré-imune foi retirado antes do primeiro desafio, por via do
sinus orbital.
31
Imunoblot
Extrato total de E. coli BL21-DE3 foi separado em SDS-PAGE 8%. As proteínas
foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond‐C Extra, Amersham) e
bloquadas por incubação em PBS-leite 5%, por duas horas. As membranas bloqueadas
foram lavadas por duas horas com o anti-soro primário derivado de camundongo
diluído 1:100 em PBS-leite 1%. Depois de três lavagens cada de 5 minutos com PBS 1x,
a membrana foi incubada com o segundo anticorpo α-IgG de camundongo conjugado
com a fosfatase alcalina diluído 1:2000. Em seguida, as membranas foram novamente
lavadas como descrito, incubadas por 10 minutos em tampão da fosfatase alcalina e
submetidas à revelação com o substrato NBT/BCIP (Sigma).
Resultados
33
Resultados
Tendo em vista a importância das proteases no metabolismo, produção de
energia, e sobrevivência de vários microorganismos, e baseados em resultados
preliminares não publicados da identificação de atividade proteolítica do extrato de
diversos sorovares de Leptospira spp., propusemos caracterizar bioquimicamente a
enzima responsável pela atividade leucil-aminopeptidásica, tida como a principal
diferença entre os extratos de bactérias patogênicas e não-patogênicas. Para tanto, a
estratégia escolhida foi a de clonagem e expressão recombinante do gene pepA
baseado nos genomas publicados de Leptospira interrogans sorovares Copenhageni e
Lai (números de acesso no GenBank: NC_005823.1 e NC_004342.1, respectivamente).
As anotações sugerem que esse gene é responsável pela codificação de uma provável
aminopeptidase citosólica (também conhecida por leucil-aminopeptidase). Contando
com essa informação, e utilizando como molde os genomas dos sorovares Hardjo,
Icteriohaemorrhageae, Patoc e Pomona, gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Marcos
Heinemann, da Universidade Federal de Minas Gerais, pudemos dar inicio ao processo
de clonagem do gene em questão.
Oprodutoamplificadotemumamassamolecularsemelhanteà
predita.
A reação de polimerase em cadeia com os oligonucleotídeos aneladores
específicos descritos em material e métodos resultou em produtos com massa
molecular estimada de 1500 pb, tamanho coerente com aquele atribuído às
seqüências depositadas em banco de dados (GENBANK GeneID: 2771497, 1152783,
4406685 e 4409717), de aproximadamente 1488 pb. Dentre as quatro amostras
enviadas pelo prof. Dr. Marcos Heinemann, somente as provenientes dos sorovares
Hardjo e Pomona foram inicialmente amplificadas. Quanto às duas restantes, uma
amostra não gerou produto de amplificação (sorovar Patoc), e a outra (sorovar
Icteriohaemorrhageae) apenas foi amplificada quando se preparou a reação de PCR no
próprio tubo em que a amostra foi encaminhada, sugerindo se tratar de pequena
quantidade de DNA genômico extraído e/ou precipitado (figura 1).
34
Figura 1. Estimativa da massa molecular dos produtos amplificados pela reação de polimerase em
cadeia tendo como molde o material genômico de L. interrogans. (1) sorovar Hardjo, (2) sorovar
Pomona, (3) sorovar Patoc e (4) sorovar Icterohaemorrhagiae. (M) corresponde ao marcador de massa
molecular 1kb plus DNA ladder (Invitrogen). A PCR foi realizada com os oligonucleotídeos e sob as
condições descritas na seção Material e Métodos.
Ofragmentode1500pbfoiclonadocorretamentenosvetores.
Dos produtos de PCR obtidos, somente foram clonados e seqüenciados aqueles
dos sorovares Hardjo e Pomona. Esses produtos foram clonados no vetor T/ApGEM®‐T
Easy (Promega) e transformados em bactérias competentes E. coli DH5α. Colônias
brancas, com o cassete da beta-galactosidase interrompido, foram submetidas à
triagem por extração com fenol-clorofórmio (figura 2), e os clones com plasmídeos de
massas moleculares superiores aos demais foram posteriormente confirmados por PCR
para a existência do gene pepA(dados não mostrados).
Figura 2. Padrão de migração dos plasmídeosobtidos da extração por fenol‐clorofórmio de colônias
brancasselecionadasdeplacasdetransformação. (1) a (6), colônias transformadas com o vetor pGEM-
HapepA; (1’) a (6’), colônias transformadas com o vetor pGEM-PopepA. (M), marcador de peso
molecular λ-Pst I. Para confirmação, clones com massa molecular próximas a 4500 pb (pGEM-T easy +
inserto) foram submetidos à análise por PCR.
Após a digestão dos vetores de clonagem com as enzimas XhoI e NdeI, foram
obtidos fragmentos com tamanhos equivalentes ao esperado (aproximadamente
1500 pb), tanto no clone derivado do sorovar Hardjo quanto do sorovar Pomona,
1650 pb
(M) (1) (2) (3) (4)
1000 pb
~ 1500 pb
1 2 3 4 5 6 M 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ M
4507 pb
2838 pb
35
demonstrando que os sítios de restrição foram corretamente inseridos por PCR em
ambos os clones (figura 3). Ainda que o gene que codifica a leucil-aminopeptidase de
Leptospira interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae não tenha sido clonado e
seqüenciado, sua presença também foi confirmada pelo produto de amplificação na
reação da polimerase em cadeia (figura 1).
Figura3.Resultadodaeluiçãodosinsertos liberadosdadigestãodupla(XhoIeNdeI) dos vetoresde
clonagem. (1), pGEM-HapepA e (2), pGEM-PopepA. Marcador de peso molecular λ Pst I.
O fragmento da digestão eluído de gel de agarose foi corretamente ligado ao
vetor de expressão pET19b (Novagen) como indicado pela triagem de plasmídeos
extraídos por fenol-clorofórmio de colônias selecionadas ao acaso e pela confirmação
por PCR (dados não mostrados). Quando digeridos com a enzima Eco RI, verificou-se
que os vetores de expressão apresentavam massa molecular próxima de 7200 pb, o
que era previsto como resultado da ligação do vetor pET19b de 5717 pb com o inserto
de 1488 pb (dados não mostrados).
Seqüenciamento:Ogenefoiinseridoemfasedeleitura
apropriada.
O sentido e a fase de inserção foram confirmados pelo seqüenciamento parcial
dos vetores pET19b-HapepA e pET19b-PopepA com o oligonucleotídeo anelador para o
promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). A figura a seguir (figura 4) apresenta
dados da ligação in silico dos fragmentos seqüenciados no vetor pET19b (ambos
digeridos com a enzima NdeI), bem como a tradução esperada de suas fases de
abertas de leitura identificadas.
1700 pb
~ 1500 pb
1 M 2
36
Figura4. LigaçãoinsilicodoresultadodadigestãodovetorpET19beseqüenciasparciais dosvetores
deexpressãocomaenzimaNdeI. (A) seqüencia parcial do vetor pET19b-HapepA e (B) pET19b-PopepA.
As traduções esperadas para as fases abertas de leitura obtidas da ligação dos fragmentos respectivos
nos sítios de clonagem do vetor pET19b encontram-se na caixa tracejada. Indicações em magenta
apontam para sítios de anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores, e suas respectivas temperaturas
de fusão; em azul os sítios de restrição utilizados para clonagem. Análises concebidas no programa
pDRAW32 (versão 1.1.97).
Tradução parcial HapepA:
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKLDKNKIQIIGKNPS
KTFYKLQLLLKDHFPENLKTKFSFQTASGIFTGENGQIF
TDEVEKIIYLGLGETSKIKIRRVAQHFFQFGEKLKKWE
GVGLEIHLPKVLTNSLSADLVVYQIVNSLEQGVCAINVL
AKEYKENSKKIGNVSFILQDAAKLKEAEKGLKRGKIVSR
YINGVRHIAHLPANHFTPEEFVSRSKEIAKDNGLKITV
FDEPQLKKEKMGGILSVCEGSDKKAKMILLGIYSSKTNY
EEKTCRSSAKGPHLFDSGWESVAR
Tradução parcial PopepA:
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKLDKNKIQISIGKNP
SKTFYKLQLLLKDYFPENLKTKFSFQTASGIFTGENGQI
FTD?VEKIIYLGLGETSKIKTRGVAQHFFQFGEKLKKW
EGVGLEIHLPKVLTNSLSADLVVYQIVNSLEQGAYAINV
LAKEYKENSKKIGNVSFILQDAAKLKEAEKGLKRGKIVS
RYINGVRHIAHLPANHFTPDS
A
B
37
A análise dos resultados do seqüenciamento indica que a fase aberta de leitura
do gene clonado codifica uma proteína de fusão com a cauda de poli-histidina com
seqüência similar àquelas depositadas no banco de dados GENBANK como potenciais
aminopeptidases citosólicas (leucil-aminopeptidases) de L. interrogans, L.
borgpetersenii e L. biflexa (números de acesso no GENBANK: AAS69352, AAN50639,
ABJ79660, ABJ75481, ABZ92974 e ABZ96589, para os sorovares Copenhageni, Lai,
Hardjo-bovis L550, Hardjo-bovis JB197, Patoc 1 ‘Ames’ e Patoc 1 ‘Paris’,
respectivamente), como se pode perceber no alinhamento das seqüencias peptídicas
(figura 5).
38
Figura 5. Alinhamento das seqüenciaspeptídicaspreditas datradução do gene pepA das espécies L.
interrogans (sorovares Hardjo, Pomona, Lai e Copenhageni), L. borgpetersenii (sorovar Hardjo‐bovis
linhagensL550 e JB197)eL. biflexa (sorovar Patoc 1, linhagens Ames e Paris). Os resíduos essenciais
para a ligação do íon metálico (M) e para a atividade catalítica (A) estão evidenciados nas caixas. A
seqüencia consenso é gerada automaticamente pelo programa Clustal: (*) significa que os resíduos na
coluna são idênticos em todas as seqüencias; (:) significa que ocorreu substituição conservativa, de
acordo com a matriz de Dayhoff (DAYHOFF, SCHWARTZ, e ORCUTT, 1978); (.) significa que foram
observadas substituições semiconservativas.
MM A
MM A
M
39
Oseqüenciamentoparcialindicaqueaseqüênciadosgenes
obtidostemidentidadecomseqüênciasdepositadaembancosde
dados.
Quando comparado com seqüências depositadas no GENBANK pelo algoritmo blastn
6
,
os fragmentos parciais do gene da leucil-aminopeptidase (pepA) de L. interrogans
sorovar Hardjo e Pomona apresentaram 99% de identidade entre os sorovares Lai e
Copenhageni e 79% entre as linhagens de Leptospira borgpetersenii sorovar Hardjo-
bovis. A matriz de identidades obtida pelo aplicativo ClustalW se encontra na tabela 2.
Tabela 2. Matriz de distância filogenética baseada em mudanças de bases nucleotídicas, calculada
peloalgoritmoPROTDIST,dasuítedeaplicaçõesPHYLIP,apartirdeumalinhamentoexecutadopelo
programa ClustalW. Os valores representam o número esperado de substituições nucleotídicas por
sítio, ou, mais indiretamente, o tamanho dos ramos da árvore filogenética entre cada um dos
espécimes.
Sorovarou
Linhagem
JB197 L550 Hardjo Pomona Lai Copenhageni Ames Paris
JB197 0.000000
L550 0.000667 0.000000
Hardjo 0.242976 0.242976 0.000000
Pomona 0.240272 0.240272 0.010675 0.000000
Lai 0.218558 0.218558 0.003291 0.007102 0.000000
Copenhageni 0.216928 0.216928 0.004941 0.005321 0.002028 0.000000
Ames 0.620968 0.620968 0.775181 0.806945 0.612233 0.611721 0.000000
Paris 0.620923 0.620923 0.775181 0.806945 0.612202 0.611690 0.000000 0.000000
AnálisefilogenéticabaseadanaLAPreafirmaaclassificaçãoatual.
Após o seqüenciamento parcial dos genes de leucil-aminopeptidase clonados
dos sorovares Hardjo e Pomonas foi feita a comparação dos dados obtidos com
seqüências dessa enzima disponíveis em bancos de dados (GENBANK). Como
esperado, as sequências provenientes dos genes clonados dos sorovares Hardjo e
Pomona ficaram agrupados com outros sorovares de L. interrogans (Lai e
Copenhageni), enquanto as duas linhagens de L.borgpetersenii (sorovar Hardjo-bovis,
6
Acessível em:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&MEGABLAST=on&B
LAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on.
40
linhagens JB197 e L550) se agruparam em um ramo filogenético mais distante (figura
6), assim como as duas linhagens de L.biflexa (sorovar Patoc, linhagens Ames e Paris).
Figura 6. Filograma construído pelo método Neighbor‐Joining, baseado nas distâncias entre as
seqüencias parciais do genepepAde L. interroganssorovares Hardjo e Pomonacomparadas com as
de outros organismos. L. interrogans sorovar Copenhageni e Lai (nº
s
de acesso YP_000715.1 e
NP_713621.1), L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis (nº
s
de acesso YP_798593.1 e ABJ75481.1), L.
biflexa sorovar Patoc (nº
s
de acesso ABZ92974.1 e ABZ96589.1), H. influenzae (nº de acesso
AAC23351.1),E.coli (YP_001726686.1),H.pilory (nº de acesso NP_207365.1),T.denticola (nº de acesso
NP_970914.1), P. falciparum (nº de acesso XP_001348613.1), T. cruzi (nº de acesso EAN91071.1), T.
brucei (nº de acesso AAX70152.1), L. major (nº de acesso CAJ02694.1), M. musculus (nº de acesso
AAK13495.1), H. sapiens (nº de acesso NP_056991.2), conforme descrito em material e métodos. A
barra de escala corresponde ao número de substituições de resíduos de aminoácidos esperadas por
sítio.
41
BactériasBL21DE3foramtransformadaseficientemente.
Bactérias transformadas por choque térmico selecionadas com ampicilina
foram submetidas à extração plasmideal simples por fenol-clorofórmio. A presença de
plasmídeo foi observada em gel de agarose 0,8% para todos os clones escolhidos,
sugerindo o sucesso da transformação (figura 7). Para excluir a possibilidade de
contaminações com o vetor pET19b vazio, os plasmídeos foram testados por PCR, da
qual foram obtidos produtos amplificados do tamanho aproximado do gene pepA
(dados não mostrados).
Figura 7. Extração plasmídeal de bactérias transformadas com os vetores de expressão
pET19b+HapepA(poços 1 a3)epET19b+PopepA(poços4a6)visualizadaemgeldeagarose0,8%. A
presença dos plasmídeos (indicados pela seta) confirma a transformação. (M) Marcador de peso
molecular 1kb+ DNA Ladder.
Aproteínade55kDajáéexpressagenerosamenteapós2horas
deindução.
Uma vez induzidas com IPTG, culturas de bactérias BL21-DE3 que carregavam o
vetor de expressão produziram significativa quantidade da proteína de
aproximadamente 55 kDa (~ 250 µg.ml
-1
), como constatado por SDS-PAGE realizado
para análise do extrato bacteriano total (figura 8). Culturas-controle transformadas
com o vetor de expressão vazio não apresentam quantidades detectáveis dessa
mesma proteína (figura 8).
Ainda na figura 8, podemos observar que a proteína recombinante foi
detectada em quantidades crescentes no extrato total de bactérias cultivadas
induzidas com IPTG por diferentes intervalos de tempo (2, 4 e 6 horas).
1 2 3 M 4 5 6
42
Figura8. PadrãodemigraçãodoextratototaldecolôniastransformadasinduzidascomIPTG. Colônias
carregando o vetor pET19b vazio (1 a 3), o vetor pET19b-HapepA (5 a 7) e pET19b-PopepA (8 a 10) em
SDS-PAGE 10%. Culturas foram induzidas com a mesma concentração de IPTG (0,5 mM) por tempos
diferentes a 30 °C: poços 1, 5 e 8 – duas horas de indução; poços 2, 6 e 9 – quatro horas de indução, 3, 7
e 10 – seis horas de indução. Poço 4, marcador de peso molecular SDS 6H (Sigma).
Para melhor adaptarmos o protocolo de produção de proteína recombinante à
rotina do laboratório, foi necessário ajustar a temperatura e as concentrações de IPTG
utilizadas para induzir as colônias transformadas com os vetores de expressão.
Aproteínaéexpressasignificativamenteaos30°C.
A expressão de proteína recombinante de 55 kDa está diretamente associada à
temperatura de incubação das culturas, como indicado pelo acúmulo diferenciado no
extrato total de células mantidas sob 20, 30 e 37°C, na figura 9. Apesar de não
notificarmos a presença de quantidades apreciáveis de proteína ao induzirmos a
colônia a 20 °C por 4 horas, em uma indução por toda a noite essa é a temperatura
ideal, pois impede a super-expressão da proteína (fato que poderia acarretar em
precipitação indesejada).
Figura9.PerfileletroforéticoemSDS‐PAGE8%decolôniasinduzidascom0,3mMdeIPTGadiferentes
temperaturas por 4 horas. Poços (a) e (b), 20 °C; (c) e (d), 30 °C; (e) e (f), 37 °C. (b), (d) e (f): frações
insolúveis da extração. (M) – marcador de peso molecular BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen).
Nota-se um aumento de proteína recombinante expressa durante induções em temperaturas maiores.
60 kDa
50 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
66 kDa
~ 55 kDa
M (a) (b) (c) (d) (e) (f)
~ 55 kDa
43
ConcentraçãodeIPTGmaiorque0,5mMpodeinduzirsuper
expressãodaproteínade55kDa.
Culturas de bactérias transformadas induzidas com concentrações de 0,1 mM
de IPTG produzem quantidades significativas de proteína recombinante, mas um nível
mais aceitável de expressão foi obtido quando a concentração de IPTG no meio de
cultura foi de 0,3 mM. Concentrações superiores não influenciaram
proporcionalmente a expressão da proteína recombinante visualizada em SDS-PAGE
(figura 10). Pelo contrário, intrigantemente, observamos grande redução na
quantidade de proteína expressa quando a concentração de IPTG no meio chega a 1
mM.
Figura 10. Padrão de migração das bandas de culturas induzidas com diferentes concentrações de
IPTG,a20°Cpor4horas,visualizadoemSDS‐PAGE8%. (1) e (2), 0,1 mM de IPTG; (3) e (4), 0,3 mM de
IPTG; (5) e (6), 0,5 mM de IPTG; (7) e (8), 1 mM de IPTG. Poços (1), (3),(5) e (7) correspondem às frações
insolúveis das extrações. (M) BenchMark™proteinladder (Invitrogen).
A variação nas condições de indução da expressão nos possibilitou refinar o
processo de obtenção da proteína recombinante, e, sendo assim, foram adotadas
aquelas que resultaram em rendimento maior: temperatura de 20 °C, 0,3 mM de IPTG
por 16 horas.
Arecuperaçãodafraçãodeproteínasolúvelémaiorapós
sonicação;
Ciclos de congelamento e descongelamento em tampão de lise não foram
suficientes para recuperar quantidades significativas de proteína solúvel quando
comparados com os outros métodos (figura 11, poços 1 e 4). Apesar do método de
M 1 2 3 4 5 6 7 8
60 kDa
50 kDa
~ 55 kDa
44
extração com BugBuster® (Novagen) ter se mostrado eficiente, a sonicação apresentou
vantagens no que diz respeito à relação custo/benefício. Além disso, a extração por
sonicação demonstrou uma maior recuperação de proteínas de alto peso molecular
(que podem corresponder a estruturas quaternárias da enzima recombinante) do que
a extração por BugBuster® (figura 11, poço 2 e 5 versus 3 e 6).
Figura 11. Comparação entre diferentes técnicas de extração celular. Em A, os poços contêm a fase
solúvel (1, 2 e 3) e insolúvel (4, 5 e 6) das extrações por: (1) e (4), ciclos de congelamento e
descongelamento; (2) e (5), sonicação; (3) e (6), BugBuster® (Novagen). Em B, perfil de migração da
proteína purificada para comparação da massa esperada de estruturas quaternárias.
Oextratosolúveldebactériasinduzidaspossuiatividadesobreo
substratoLLeuAMC.
A fração solúvel obtida da lise celular das bactérias de culturas induzidas
apresentou atividade leucil-aminopeptidásica, fato não observado com o
sobrenadante do extrato celular de culturas transformadas com o vetor pET19b vazio
induzidas com as mesmas condições (dados não mostrados).
Aproteínarecombinantetemboaligaçãocomacolunade
afinidadeàhistidina
.
Ao passar pela coluna de níquel, parte significativa da atividade do extrato não
ligado à coluna era perdida. Ao ser visualizado em SDS-PAGE, a fração protéica não
ligado à coluna de afinidade apresentou uma diminuição expressiva de proteína com
massa de 55 kDa, quando comparado com o extrato total (figura 12).
> 200 kDa
A
B
1 2 3
4 5 6 M
200 kDa
60 kDa
50 kDa
~ 55 kDa
45
Figura 12. Visualização em SDS‐PAGE 8% das frações obtidas durante o processo de purificação em
cromatografiade afinidadeem coluna de níquel. (2) extrato total (previamente aplicação na coluna);
(1) fração não ligada; (3) fração coletada após passagem de tampão de ligação (5 mM de imidazol); (4)
fração coletada após passagem de tampão de lavagem (100 mM de imidazol); (7) a (15), frações eluídas
com tampão de eluição (300 mM de imidazol). (M) marcadores de peso molecular BenchMark™Protein
Ladder (Invitrogen) e PrecisonPlusProteinDualColorStandards (Bio-Rad), da esquerda para a direita.
Aforçadeligaçãoentreproteínaearesinacarregadacomníquel
suportaconcentraçõesdeaté100mMdeimidazol.
Apesar de parte da proteína com massa de 55 kDa se desligar da coluna com
afinidade por histidina durante a passagem do tampão de lavagem com 100 mM de
imidazol, a relação entre contaminantes e quantidade de proteína purificada mostrou-
se mais do que satisfatória para a continuidade dos experimentos (figura 12).
Concentrações de imidazol superiores a essa no tampão de lavagem aumentaram
significativamente a quantidade de proteína recombinante desligada da coluna nessa
etapa (dados não mostrados).
Fraçõeseluídasdacolunadeníquelcontinhamumaproteínade
massamolecularsuperiora250kDa.
A análise em SDS-PAGE 9% das proteínas eluídas da coluna de níquel mostrou
um padrão de migração com duas bandas principais relacionadas com a enzima
recombinante, uma de aproximadamente 55 kDa e outra com mais de 250 kDa (figura
12).
1 2 3 4 MM 7 8 9 10 11 12 13 14 15
> 250 kDa
~ 55 kDa
250 kDa
46
Oimidazolpresentenotampãodereaçãonãoinfluenciana
atividadesobreosubstratofluorogênico.
A atividade proteolítica sobre o substrato fluorogênico L-Leu-AMC foi mantida
nas frações eluídas com 300 mM de imidazol, que por sua vez não exerceu influência
na quantidade de fluorescência do AMC livre liberado pela atividade da enzima
recombinante em várias concentrações testadas (dados não mostrados). O imidazol,
quando co-incubado com o substrato L-Leu-AMC e sob excitação de luz UV a 380 nm
não apresentou fluorescência significativa e, portanto, sua presença ou ausência na
reação não parece alterar os dados obtidos pela leitora de placas (dados não
mostrados).
Aatividadeleucilaminopeptidásicadaenzimarecombinante
dependedesuaestruturaquaternária.
Quando visualizada em gel de poliacrilamida, a atividade enzimática da leucil-
aminopeptidase foi atribuída somente à banda de peso molecular superior a 250 kDa
(figura 13). Adicionalmente, isolamos a forma oligomérica da enzima por
cromatografia líquida e rápida de proteínas (FPLC: Fast Protein Liquid
Chromatography), utilizando uma coluna de filtração em gel. Como resultado, frações
com massa molecular estimada em 320 kDa possuíram atividade sobre o substrato L-
Leu-AMC (dados não mostrados), sugerindo se tratar de uma estrutura hexamérica.
Figura13.Atividadeleucil‐aminopeptidásicaemgelSDS‐PAGE. No poço (1), o gel foi corado com azul
de Coomassie. Poço (2), visualização sob incidência de luz ultra-violeta do gel, lavado e incubado em
tampão de reação previamente à adição do substrato fluorogênico L-Leu-AMC. A atividade foi atribuída
à forma oligomérica da enzima recombinante HaLAP.
> 250 kDa
~ 55 kDa
1 2
47
Aestruturaoligoméricadaleucilaminopeptidaserecombinante
sedesfazparcialmentequandosubmetidaàmigraçãoemsistema
deSDSPAGE.
Mesmo as primeiras frações que apresentam atividade ao sair da coluna de
filtração em gel se apresentam como monômeros de 55 kDa quando visualizadas em
SDS-PAGE (figura 14 A, poço 4). Entretanto, em sistema de eletroforese não-
desnaturante, as amostras parecem possuir uma massa molecular superior, quando
comparadas com o marcador BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen), sugerindo a
interferência do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) na estrutura quaternária da
proteína (figura 14).
Figura 14. Comparação entre o padrão de migração da enzima recombinante HaLAP em sistema de
eletroforese desnaturante (A) e não desnaturante (B) com 9% de acrilamida. Poços (1) e (2), enzima
purificada em coluna de níquel; poços (4) a (6), enzima purificada em coluna de filtração em gel.
Amostras (2), (5) e (7) foram previamente fervidas antes da aplicação nos géis. Em (M), marcador de
peso molecular BenchMark™ProteinLadder (Invitrogen).
Aenzimarecombinantepossuipropriedadestermofílicas.
Na caracterização da atividade enzimática da proteína recombinante, foram
investigados vários fatores, entre eles a temperatura ótima de atividade. Os resultados
obtidos apontam para maior atividade da enzima entre 50 e 60°C, como verificado
pela incubação da reação de hidrólise do substrato L-Leu-AMC em diferentes
temperaturas (figura 15).
A B
1 2 M 4 5 6 7 1 2 M 4 5 6 7
> 250 kDa
~ 55 kDa
48
Figura15.EfeitodatemperaturanaatividademédiarelativadaenzimarecombinanteHaLAP(Leucil‐
aminopeptidasedeL.interroganssorovarHardjo). O substrato fluorogênico L-Leu-AMC foi adicionado
após as amostras atingirem a temperatura indicada, e a reação interrompida após 10 minutos com a
adição de etanol absoluto, como descrito em material e métodos.
Aleucilaminopeptidaserecombinantepossuiatividadeótimaem
pHalcalino.
Um ensaio de atividade enzimática em diferentes faixas de pH pôde esclarecer
quanto ao pH de atividade ótima da enzima. Quando incubada tanto em tampão AMT
(Acetato 50 mM, MES 50 mM e TRIS 100 mM) quanto Tris-CAPS 100 mM (figura 16) a
atividade da enzima aumentou na medida em que o pH se aproximava de 8,5. Ao
estender as faixas analisadas para pHs mais básicos em tampão Tris-CAPS, a atividade
voltou a decrescer.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
20 30 40 50 60 70
AtividadeRelativa(%)
Temperaturadeincubação(°C)
49
Figura 16. Atividade média relativa da atividade da enzima recombinante HaLAP sobre o substrato
fluorogênico L‐Leu‐AMC em sistemas‐tampão com pH diferentes. Em ‘A’, atividade enzimática
mediante incubação em tampão AMT (Ácido acético 50 mM, MES 50 mM e Tris 100 mM). Em B,
atividade da enzima incubada em tampão Tris-CAPS (Tris 100 mM, CAPS 100 mM).
Oaumentodaforçaiônicanotampãodereaçãoresultaem
decréscimodaatividadeenzimática.
Uma diluição seriada de NaCl em tampão de reação Tris-CAPS com molaridade
constante permitiu a análise do papel da interação de íons livres com a proteína
recombinante na velocidade da reação enzimática. Quantidades crescentes de NaCl
perturbaram o conjunto catalítico de tal forma que a taxa de hidrólise do substrato
fluorogênico diminuiu (figura 17).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9
Atividaderelativa(%)
pH
AMT
0%
20%
40%
60%
80%
100%
8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5
Atividaderelativa(%)
pH
Tris-CAPS
A
B
50
Figura 17. Influência da força iônica na atividade média relativa da enzima recombinante HaLAP. A
enzima foi incubada por 10 minutos em tampão Tris-CAPS com diferentes concentrações de NaCl, e sua
atividade foi aferida logo após a adição do substrato fluorogênico L-Leu-AMC na reação.
Influênciadeagenteredutor.
A enzima teve sua atividade diminuída com a adição de DTT no tampão de
reação, em qualquer uma das concentrações avaliadas (2, 1 e 0,5 mM), como podemos
ver na figura 18.
Figura 18. Influência do agente redutor ditiotreitol (DTT) na atividade média relativa da enzima
recombinante HaLAP. A enzima foi incubada em tampão Tris-CAPS com concentrações diferentes de
DTT, como indicado, por 10 minutos antes da adição do substrato fluorogênico L-Leu-AMC.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 200 400 600 800 1000
Atividaderelativa(%)
[NaCl](mM)
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
00,51 2
Atividaderelativa(%)
[DTT](mM)
51
InibiçãoporEDTA.
O EDTA é um conhecido agente quelante de íons, e, portanto, é amplamente
utilizado como inibidor de metaloproteases. Em um ensaio com diferentes
concentrações de EDTA, e diferentes tempos de incubação, a enzima recombinante
teve sua atividade reduzida em mais de 50%, em ambas as concentrações testadas por
10 minutos, e atividade abolida quando o tempo de incubação foi de 30 minutos
(figura 19).
Figura19.InibiçãodaenzimarecombinanteHaLAPporEDTA. A enzima foi incubada em tampão Tris-
CAPS com diferentes concentrações de EDTA, como indicado, por 10 minutos previamente à adição do
substrato fluorogênico L-Leu-AMC.
Influênciadeíonsnaatividadeenzimática
As aminopeptidases da família M17 possuem dois sítios de ligação ao zinco, um
dos quais pode ser substituído por outros íons. Para avaliar a participação de íons
metálicos na taxa de atividade da HaLAP recombinante, foi promovido um ensaio
utilizando a enzima inibida com EDTA (apoenzima), seguida por diálise extensiva, com
a adição de cálcio, cobalto, magnésio, manganês e zinco. Também foi averiguado se os
íons poderiam alterar a atividade da enzima não-inibida (holoenzima), sem prévia
adição de EDTA. Como resultado, nenhum íon foi capaz de restabelecer ou modular ou
restaurar a atividade da enzima recombinante, com exceção do zinco, que pareceu
exercer uma leve ação inibitória (figura 20).
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
0110
Atividaderelativa(%)
[EDTA](mM)
10 min
30 min
52
Figura 20. Influência de íons metálicos na atividade da enzima recombinante HaLAP, previamente
induzidaounãoporEDTA. Em (A), enzima previamente inibida (HaLAP-) ou não (HaLAP+) e submetida a
processo de diálise intensiva por toda a noite em tampão de reação (Tris 25 mM, pH 8,5) foi pré-
incubada por 10 minutos com 0,4 mM dos íons indicados antes da adição do substrato fluorogênico L-
Leu-AMC. Em (B), os controles utilizados: Ha++, enzima não inibida e não dializada; Ha+, enzima não
inibida e dializada; Ha- enzima inibida e dializada. A leitura dos resultados se procedeu como descrita
em material e métodos.
Quando visualizadas em SDS-PAGE, amostras previamente inibidas apresentam
apenas uma banda correspondente ao monômero de 55 kDa, enquanto que as não
inibidas apresentam tanto a banda correspondente ao monômero quanto a atribuída
ao oligômero (figura 21).
Figura 21. Comparação do perfil eletroforético da enzima recombinante HaLAP inibida ou não por
EDTA. As amostras utilizadas para as reações do experimento da influência dos íons metálicos foram
aplicadas em gel SDS-PAGE 8%, sem prévia fervura, para visualização da forma oligomérica (A). Nestas
condições, apenas a amostra não inibida (poço 1) apresentou a banda de peso molecular superior a 250
kDa, enquanto que a amostra inibida (poço 2) apresentou-se apenas como monômero. Em (B), uma
aproximação da seção indicada em (A). (C) corresponde à imagem (B) com aplicação de um filtro para
melhor visualização da banda correspondente ao oligômero.
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
Ca+ Co+ Mg+ Mn+ Zn+
Atividaderelativa(%)
Íonsmetálicos
HaLAP+
HaLAP -
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ha++ Ha+ Ha-
Controles
(A) (B)
(C)
1 2
1 2
> 250 kDa
~ 55 kDa
> 250 kDa
A
B
53
ConstantedeMichaelisMenten(K
M
)evelocidademáxima(V
max
).
A incubação da enzima com um gradiente de concentrações do substrato
possibilitou a extrapolação da quantidade necessária de L-Leu-AMC para a enzima
atingir metade de sua velocidade máxima (figura 22). Valores mais precisos da
constante de Michaelis-Menten e da velocidade máxima foram obtidos por meio de
regressão linear pelos métodos de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e Woolf.
Figura22.Curva de saturação da enzima recombinanteHaLAP. A enzima foi incubada em tampão de
reação contendo Tris-HCl 25 mM, pH 8,5, por 10 minutos anteriormente a adição do substrato L-Leu-
AMC em diferentes concentrações, como descrito em material e métodos. A extrapolação da velocidade
máxima da reação possibilita a aproximação do valor da constante de Michaelis-Menten (K
m
).
As fórmulas utilizadas na regressão encontram-se a seguir:
Lineweaver-Burk: 1/V
0
= (K
M
/V
max
).(1/S) + 1/V
max
Eadie-Hofstee: V
0
= -K
M
.(V
0
/S) + V
max
Woolf: S/V
0
= (S/V
max
) + (K
M
/V
max
)
Os valores obtidos em cada regressão estão na tabela 3.
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
0 102030405060
V(mURF.min
‐1
)
[L‐AMC](mM)
54
Tabela 3. Constante de Michaelis‐Menten (K
M
) e
velocidademáxima(V
max
)daenzimarecombinante
HaLAP durante a hidrólise de L‐Leu‐AMC, de
acordo com os três métodos de regressão mais
utilizados. O valor de R² representa a confiabilidade
da regressão.
TipodeRegressão K
M
* V
max
** R²
Lineweaver‐Burk 13,9 102378,8 0,999
Eadie‐Hofstee 15,4 109727,1 0,976
Woolf 17,6 117828,1 0,992
* A unidade de K
M
é dada em µM;
** Provisoriamente, V
max
encontra-se em
miliunidades relativas de fluorescência por
minuto, até obtermos uma curva de calibração
de AMC livre adequada.
AleucilaminopeptidaserecombinantedeLeptospirainterrogans
éimunogênicaemcamundongo
Quando submetidos a desafios intra-dérmicos, camundongos fêmeas isogênicas do
tipo Swiss produziram soro α-HaLAP que reconheceram uma única banda de 55 kDa
em Western-Blot, como verificado na figura 23.
Figura 23. Imunoblot realizado com o soro anti‐HaLAP produzido em camundongo. Extrato total de
bactérias BL21 induzidas foi separado em SDS-PAGE 8% e posteriormente transferido para membrana
de nitro-celulose e revelado como descrito em material e métodos.
~ 55 kDa
Discussão
56
Discussão
Comparaçãodaatividadeproteolítica entresorovares
patogênicosenãopatogênicosdebactériasdogêneroLeptospira.
Dados não publicados obtidos em 2005 pelos professores Silene Lozzi, Marcos
Heinemann e Jaime Santana, demonstraram que extratos de sorovares de Leptospira
interrogans patogênica apresentavam, diferentemente de alguns não-patogênicos,
atividade proteolítica na hidrólise do substrato fluorogênico L-Leu-AMC. Tal substrato
é normalmente clivado por aminopeptidases capazes de reconhecer e remover
resíduos do aminoácido leucina de pequenos peptídeos. Baseados nessas informações,
e com o objetivo de identificar os genes responsáveis pela produção de proteases com
essa característica, realizamos uma busca nos genomas publicados de Leptospira
interrogans. A busca resultou em seis aminopeptidases preditas, em ambos os
sorovares (Lai e Copenhageni), das quais duas eram relacionadas com atividade leucil-
aminopeptidásicas – uma aminopeptidase N e uma leucil-aminopeptidase (LAP).
De modo a obter quantidade razoável de proteína recombinante para sua
caracterização bioquímica e molecular, optamos pela expressão heteróloga da
proteína classicamente atribuída à atividade leucil-aminopeptidásica em outros
organismos, codificada pelo gene pepA.
ImplicaçõesnadetecçãodogenepepA.
Os resultados preliminares obtidos da reação de polimerase em cadeia
utilizando como molde o material genético cedido pelo professor Dr. Marcos
Heinemann sugeriram a ausência do gene responsável pela produção da LAP nas
espécies não-patogênicas (saprofíticas) de Leptospira (L. biflexa sorovar Patoc),
quando comparada com outros sorovares (L. interrogans sorovar Hardjo, Pomona e
Icterohaemorrhagiae), como observado na Fig. 1. Contudo, o recente seqüenciamento
do genoma de L.biflexa (Picardeau etalii, 2008) identificou um gene que codifica uma
LAP com 58% de identidade e entre 75% e 76% de similaridade com as LAPs de outros
sorovares previamente seqüenciados (L.interrogans, sorovares Copenhageni e Lai e L.
57
borgpetersenii, sorovar Hardjo-bovis). Tal identidade é menor em alinhamentos
baseados na seqüencia de nucleotídeos, o que nos leva a refletir que as mutações que
resultaram na divergência evolutiva entre estas espécies talvez possam ter ocorrido de
modo a selecionar substituições redundantes para os aminoácidos mais importantes
na estrutura da enzima. Em um instante no qual a proteína não exercesse o mesmo
papel de sua ancestral, mutações subseqüentes poderiam ter levado à perda da
atividade leucil-aminopeptidásica verificada no sorovar Patoc. Por outro lado, nos
sorovares patogênicos, as mutações podem ter sido selecionadas de modo a refinar
essa atividade em um ambiente em que fosse fundamental, gerando as diferenças
observadas na seqüencia nucleotídica entre as espécies. Tal modelo é suportado por
Picardeau e colaboradores (2008), quando afirmam que, enquanto a espécie
saprofítica L. biflexa possui um genoma “mais denso”, a espécie L. borgpetersenii
apresenta regiões erodidas por elementos de inserção, levando a uma perda da
funcionalidade e conseqüentemente à restrição dessa espécie em hospedeiros
mamíferos. Já o maior tamanho do genoma na espécie L.interrogans, provavelmente
reflete a incorporação de novas informações genéticas responsáveis pela
sobrevivência dessa espécie tanto em hospedeiros mamíferos quanto em ambientes
aquáticos.
Outro fato importante a se considerar, é o de que leptospiras perdem seu
fenótipo de virulência quando submetidas a passagens seqüenciais em meios de
cultura (Haake et alii, 1991). Portanto, a falta de atividade leucil-aminopeptidásica
pode estar relacionada ao tempo de manutenção dos diferentes isolados submetidos
ao teste proteolítico, e não à ausência de uma LAP funcional. Estudos com linhagens
isoladas de tecidos, ao invés de culturas invitro, podem ajudar a elucidar essa questão.
Inferênciassobreapossívelexpressãodiferencialdaleucil
aminopeptidasedeLeptospiraspp.
Dentre dois estudos com microarranjos (Lo et alii, 2006; Matsunaga et alii,
2007), os quais avaliaram os genes de L. interrogans que sofreram regulação sob
mudanças na temperatura e na osmolaridade, respectivamente, não há referência ao
gene pepA, o que indica que provavelmente esse gene não seja regulado por nenhum
desses fatores nas condições testadas. Resta averiguar se as demais interações entre o
58
parasito e o hospedeiro são capazes de modular significativamente a expressão desse
gene, ou se o mesmo é expresso indiscriminadamente tanto em bactérias de culturas
invitro quanto nas de tecidos animais.
Nally e colaboradores (Nally et alii, 2005) detectaram mudanças na
composição do antígeno O-lipopolissacarídico (Oag) entre infecções crônicas e agudas
com o uso de anticorpos monoclonais específicos. A quantidade de Oag diminuiu em
bactérias estabelecidas na fase crônica da doença em porcos da índia em relação à de
bactérias atenuadas por múltiplas passagens in vitro. Utilizando ratos como modelos,
não foi observada tal diferença, sugerindo que a regulação da síntese de Oag por
Leptospira deve ser hospedeiro-específica. De fato, muitos outros genes devem ser
modulados pela relação íntima e específica entre a bactéria e o hospedeiro infectado,
já que os animais podem ser tanto hospedeiros de manutenção para alguns sorovares
quanto hospedeiros incidentais para outros (Levett, 2001). Assim, o anti-soro
desenvolvido contra a proteína recombinante HaLAP poderá ser utilizado para
detectar em que condições a enzima nativa é expressa em bactérias do gênero
Leptospira, ou se essa expressão decai quando as bactérias são submetidas à
passagens de culturas seqüenciais. Esse anti-soro poderá ainda ser utilizado para
ensaios de imunohistoquímica, possibilitando a avaliação da expressão da proteína de
um sorovar específico em diferentes modelos de infecção (camundongo, rato,
hamster).
ALAPdeLeptospirainterrogansfazpartedafamíliaM17de
metaloproteases.
A seqüência do gene responsável pela codificação da provável aminopeptidase
citosólica de L.interrogansdepositado no banco de dados GenBank possui uma região
com grande homologia ao domínio conservado da família M17 das metaloproteases,
como identificada no banco de dados CDD (do inglês Conserved Domain Database,
Marchler-Bauer etalii, 2007). De acordo com o banco de dados MEROPS , essa família
é conhecida por conter exopeptidases dependentes de zinco ou de manganês,
incluindo as leucil-aminopeptidases. Ainda, catalisam a remoção de aminoácidos da
região N-terminal de polipeptídeos, e se diferem das aminopeptidases da família M1
por não possuírem o motivo HEXXH no sítio de ligação ao metal. Além disso, são em
59
sua maioria hexaméricas e se ligam a dois cátions, enquanto que as da família M1 são
monoméricas e se ligam apenas a um cátion. Uma vez expressa, a existência da
proteína passa de predita para comprovada por evidências funcionais.
Osresíduosdeaminoácidosessenciaisparaaatividadecatalíticasão
conservadosentreespéciesrepresentantesdeLeptospiraeoutras.
Um alinhamento pelo algoritmo ClustalW com seqüencias do banco de dados
UniProtKB revelou grande conservação dos resíduos essenciais para a ligação dos íons
metálicos e para a atividade catalítica, tanto entre os sorovares distintos de Leptospira
quanto entre outras espécies também analisadas (todas as que compõe a análise
filogenética da figura 6, dados não mostrados). Este fato sugere que a LAP dos
sorovares Patoc pode ser ativa, embora não se possa desconsiderar que alguma
alteração na seqüência peptídica possa alterar o dobramento necessário para que os
resíduos essenciais formem o sítio ativo ou de ligação aos íons metálicos,
influenciando a atividade. Se isso for comprovado, a posterior modelagem dessas
enzimas poderá elucidar sobre quais os resíduos de aminoácidos são importantes para
a conservação da estrutura catalítica. Alternativamente, outros estudos devem ser
realizados para desvendar o motivo da ausência de atividade leucil-aminopeptidásica
nos sorovares não patogênicos de Leptospira.
ParâmetrosdeinduçãoeexpressãodaenzimarecombinanteHaLAP.
A formação de corpos de inclusão na expressão heteróloga de proteínas
recombinantes é comum, e entre os fatores que desencadeiam isso estão o mau
dobramento da proteína, causado pela exposição de resíduos hidrofóbicos ou pela
ausência de processamento pós-traducional em sistemas de expressão procariontes; a
super-expressão, que acarreta em precipitação por saturação; e outras condições,
como, por exemplo, o microambiente em que a proteína é dobrada e a velocidade da
produção da proteína, muitas vezes regulada pela taxa metabólica da bactéria
(Ventura e Villaverde, 2006). O controle das condições de expressão, portanto, pode
inibir a formação de corpos de inclusão (Strandberg e Enfors, 1991; Wang etalii, 2007).
60
Para evitar que a expressão da enzima resultasse na formação de corpos de
inclusão, a temperatura, a concentração de IPTG e o tempo de indução foram
controlados. Em todas as condições a proteína foi recuperada na forma solúvel,
provavelmente por se tratar de uma enzima de origem procarionte. No entanto,
notou-se a precipitação da proteína quando o tempo de indução foi superior a 16
horas, ou quando pouco tampão de lise era empregado durante a sonicação (numa
proporção de 1:5 mL de cultura), sugerindo que o meio pudesse estar saturado devido
à grande quantidade de proteína expressa. A enzima também se precipitou durante o
armazenamento a -20 °C, fato contornado pela adição de glicerol numa concentração
final de 15%.
Outro fato a se observar é a redução da quantidade de proteína recombinante
presente em culturas com 1 mM de IPTG. Talvez a super-expressão induzida por tal
concentração de IPTG tenha causado citotoxicidade nas bactérias BL21-DE3, o que
poderia levar a uma seleção de indivíduos que por algum motivo (plasmídeo hiper-
enovelado, por exemplo) não expressaram quantidades prejudiciais da proteína.
Aatividadepeptideolíticadaleucilaminopeptidaserecombinantede
Leptospirainterrogansdependedesuaestruturaoligomérica.
O ensaio de atividade enzimática em gel indica que a forma ativa da enzima
recombinante HaLAP se encontra como uma estrutura oligomérica assim como outras
LAPs descritas na literatura. De fato, as anotações (UniProtKB, NCBI, MEROPS)
7
sobre
a família M17 das metaloproteases a classificam como um homo-hexâmero composto
de um dímero de trímeros.
A leucil-aminopeptidase bovina, uma das primeiras caracterizadas, é
fisiologicamente ativa como um hexâmero (Burley et alii, 1990), cuja estrutura é
mantida por meio de pontes de hidrogênio e interações de Van der Walls. É provável
que a LAP recombinante de L.interrogans também seja mantida como um hexâmero
por tais interações, já que sua visualização em géis de eletroforese depende da
temperatura e da presença ou não de SDS (dados não mostrados e figura 14,
7
Acesso em: http://beta.uniprot.org/uniprot/P68767
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=48344
http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=M17
.
61
respectivamente), mas não da presença de agentes redutores como β-mercaptoetanol
ou ditiotreitol (dados não mostrados).
Igualmente, a LAP de três espécies patogênicas de Leishmania (Morty e
Morehead, 2002), a de Plasmodiumfalciparum (Stack etalii, 2007) e a de Helicobacter
pylori (Dong etalii, 2005) também têm suas atividades relacionadas à suas estruturas
hexaméricas.
Parâmetroscinéticosdaleucilaminopeptidaserecombinantede
L.interrogans.
OpHótimodeatividadedaenzimarecombinanteHaLAPé8,5.
O uso de sistemas-tampão com mais de um componente em ensaios de
atividade para averiguação do pH ótimo de atividade de enzimas é comum, tanto para
garantir que tamponem em todas as faixas desejáveis quanto para garantir a
manutenção de uma força iônica constante. Dentre os mais utilizados, está o AMT
(ácido acético 50 mM, MES 50 mM, e Tris 100 mM), com ampla faixa de
tamponamento (pHs 3 a 9, podendo se estender com alguma confiabilidade). Foi este
o sistema utilizado nos estudos com leucil-aminopeptidases de Helicobacter pylori
(Dong etalii, 2005) e Leishmania (Morty e Morehead, 2002), por exemplo.
Por ter essas qualidades, o tampão AMT foi o escolhido para os ensaios de pH
da LAP de Leptospira interrogans. No entanto, na faixa de pH testada, houve uma
aberração na qual a fluorescência emitida era muitas vezes maior em pH 10, fato que
fez com que a curva se descaracterizasse. Esse empecilho fez com que fosse adotado
um novo sistema-tampão, o Tris-CAPS (100 mM), que poderia atuar bem nas faixas de
pH mais básicas (7 a 11). O novo tampão nos permitiu avaliar que a emissão de
fluorescência fora de escala observada quando a enzima foi incubada em tampão AMT
pH 10 tratava-se, realmente, de uma anomalia. As curvas correspondiam entre si, em
termos de atividade relativa, e o pH ótimo em ambos os tampões foi 8,5.
No entanto, em termos de atividade absoluta, o rendimento observado pela
enzima em tampão AMT era muito aquém ao do Tris-CAPS, e os valores das duas
62
curvas não se sobrepunham. Pensamos tratar-se de uma diferença ocasionada pela
diferente força-iônica entre os tampões. Em busca de um novo sistema-tampão, que
abrangesse as faixas de pH 5 a 10, nos deparamos com o fato de que o MES presente
no tampão AMT é um agente quelante de Ca
++
, Mg
++
e Mn
++
, e que, portanto, não é
aconselhável para estudos com enzimas ativadas por metal (Ellis e Morrison, 1982). No
mesmo artigo, os autores fornecem duas fórmulas adaptadas para a linguagem de
programação BASIC, já ultrapassada e sem compiladores atuais, para o cálculo da força
iônica em sistemas-tampão de dois e três reagentes. Foi realizada a adaptação dos
programas para a linguagem Perl, muito mais difundida atualmente, e amplamente
utilizada em programas de bioinformática. Os códigos para os programas encontram-
se nas tabelas em anexo (tabelas 4 e 5).
O uso do aplicativo possibilitou calcular a força iônica do tampão Tris-CAPS que
vinha sendo utilizado, e, surpreendentemente, a mesma variava em até 90%.
Afortunadamente, em nenhum momento a força iônica ultrapassou 0,1 M, o que
significa que no máximo as taxas de fluorescência obtidas do ensaio enzimático foram
superestimadas em direção ao pH 9 (faixa na qual ocorre a menor força iônica), não
alterando o fato de que o pH ótimo da enzima é realmente 8,5. Os dados obtidos do
teste da influência da força iônica corroboram essa afirmação, uma vez que para se ter
uma queda de 30% da atividade (para que a mesma se equiparasse à de pH 9) seria
necessária a adição de cerca de 200 mM de NaCl à solução de reação, algo em torno
de três vezes mais do que o suficiente para normalizar a força iônica em 0,1 M. O pH
ótimo da HaLAP recombinante encontra-se na mesma faixa de pH de outras enzimas
dessa família estudadas recentemente (Stack etalii, 2007; Dong etalii, 2005; Morty e
Morehead, 2002).
ALAPdeL.interrogansétermofílica.
Quando incubada em diferentes temperaturas, a LAP recombinante de L.
interrogans sorovar Hardjo teve atividade máxima entre 50 °C e 60 °C, mantendo mais
de 50% de sua atividade quando incubada a 70 °C (figura 15). Curiosamente, bactérias
do gênero Leptospira não são termófilas. Entretanto, outras bactérias não-termófilas
também apresentam aminopeptidases termofílicas, como aminopeptidase T de
63
Borrelia burgdorferi (Bertin, 2005) e a aminopeptidase S de Bacillus subtilis
(Motoshima et alii, 1997). Em Vibrio proteolyticus (Aeromonas proteolytica), a leucil-
aminopeptidase é regulada pós-transcricionalmente pela temperatura. A 70 °C, seu
precursor de 43 kDa é processado em ambas as extremidades, conferindo uma
termoestabilidade notável à forma ativa de 32 kDa (Guenet, Lepage e Harris, 1992).
De fato, a existência de enzimas termoestáveis em bactérias não-termófilas
está de acordo com postulações sobre a origem de bactérias e de outros procariotos a
partir de organismos hipertermófilos (Achenbach-Richter etalii, 1987; Forterre, 1995;
Brown etalii, 2001). Além disso, as espiroquetas têm sido posicionadas como o grupo
bacteriano mais primitivo na árvore evolutiva universal (Brown et alii, 2001; Wolf,
2001), e, portanto, a presença de aminopeptidases termofílicas em bactérias do
gênero Leptospira e Borrelia é coerente com suas origens evolutivas. Maiores
investigações poderiam esclarecer se a existência dessas aminopeptidases termofílicas
representa alguma vantagem evolutiva.
A visualização em gel de eletroforese (desnaturante e não-desnaturante) da
forma oligomérica em algumas preparações fervidas da enzima recombinante (figura
14) sugere que a enzima possa se redobrar corretamente durante o resfriamento da
amostra. Tal redobramento não é observado quando a amostra é imediatamente
colocada em gelo após fervura, situação na qual apenas o monômero de 55 kDa é
visualizado em SDS-PAGE (dados não mostrados). Estudos de caracterização biofísica
da LAP de Leptospirainterrogans poderão ajudar a elucidar os questionamentos sobre
as características termofílicas da mesma.
AleucilaminopeptidasedeL.interroganséinibidaporEDTA.
O EDTA, ácido etilenodiamino tetra-acético, é um composto orgânico capaz de
formar complexos muito estáveis com diversos íons metálicos, em especial com Mn(II),
Cu(II), Fe(III), e Co(III) (Holleman e Wiberg, 2001). Atua como ligante hexadentado, ou
seja, possui seis posições de coordenação para ligação do íon metálico. Tais
características conferem ao EDTA uma poderosa atividade quelante.
64
Por se tratarem de metaloproteases com sítios de ligação ao zinco (Zn1 e Zn2),
as LAPs da família M17 são susceptíveis à inibição por EDTA. Supõe-se que o sítio Zn2
seja mais arraigado na estrutura da LAP, enquanto que o sítio Zn1 apresenta-se mais
acessível e esteja sujeito a trocas com outros íons, tais como Mg(II) ou Mn(II). De fato,
esses íons parecem estar presentes nas formas ativas das LAPs de diversos organismos,
tendo em vista suas potentes capacidades de ativá-las (Matsui, Fowler e Walling,
2006). A demora de até 30 minutos para a inibição total da atividade enzimática (figura
19) pode ser atribuída, portanto, à posição destes sítios de ligação ao íon metálico, e
da viabilidade do seqüestro de pelo menos um deles pelo EDTA, momento em que a
reação começaria a entrar em equilíbrio.
Ainfluênciadecofatoresiônicosnaatividadedaenzima
recombinante.
Ao contrário do que ocorre com outras leucil-aminopeptidases (Stack et alii,
2007; Bertin, 2005) uma vez inibida por EDTA, a enzima recombinante de L.
interrogans não readquire atividade mediante adição de co-fatores iônicos na
concentração testada. É importante notar que a perda da atividade observada pela
inibição com EDTA é acompanhada da perda da estrutura oligomérica, pelo menos em
níveis observáveis por SDS-PAGE (figura 21). Quando comparadas com as enzimas
nativas, proteínas recombinantes expressas heterologamente podem ter suas
estruturas mais susceptíveis a variações, provavelmente devido ao dobramento da
proteína não ser exatamente igual ao que ocorre originalmente na bactéria nativa.
Além disso, para facilitação da purificação, o vetor de expressão utilizado adiciona à
proteína uma cauda poli-histidínica e um sítio de enteropeptidase. Tais adições,
associadas ao ambiente heterólogo de expressão, podem resultar numa maior
fragilidade da estrutura quaternária da enzima. Juntos, esses fatores podem ser
responsáveis pela monomerização observada em géis de eletroforese desnaturante,
tanto pelo uso do SDS (figura 14) quanto pela retirada do co-fator iônico com o uso do
EDTA (figura 21).
O zinco, no entanto, teve um efeito levemente inibidor sobre a atividade
enzimática. De fato, outras leucil-aminopeptidases, como a de H. pilory (Dong et alii,
65
2005), também sofrem o mesmo efeito, e isso pode estar relacionado ao fato do zinco
competir pelo sítio de outros íons mais eficientes, como o Mg
++
e o Mn
++
. Pelo fato de
ser uma metalopeptidase, a enzima recombinante HaLAP está sujeita ao níquel
utilizado na coluna de afinidade, o que pode, em parte, responder a falta de resposta
aos co-fatores iônicos (a enzima pode já estar ativada pelo níquel).
Vale lembrar que o tampão AMT, utilizado em alguns dos estudos com as LAPs
que tiveram sua atividade restaurada ou modulada positivamente por co-fatores
iônicos (H.pylori e Leishmania), é um quelante de Ca
++
, Mg
++
e Mn
++
, e portanto pode
mascarar a suposta ativação por esses íons. Ao adicionar-se qualquer desses co-fatores
à reação, a capacidade quelante do MES tenderá a entrar em equilíbrio, permitindo a
ligação dos íons aos sítios de ligação ao metal da enzima. Na LAP de Leptospira
interrogans, a diferença de atividade absoluta entre o tampão AMT e Tris-CAPS no
mesmo pH (8,5), foi da ordem de 270% (dados não mostrados).
Aspectosbiológicosefuncionaisdeleucilaminopeptidases
Atualmente, o papel das aminopeptidases vem mudado de participantes no
final da jornada de degradação proteolítica intracelular para reguladores de uma vasta
gama de funções biologicamente distintas.
Em animais, a importância da LAP tem sido relacionada à inativação de
oligopeptídeos biologicamente ativos, à apresentação de antígenos pelo MHC de
classe I, e mais recentemente ao combate oxidativo por meio da regulação de
dipeptídeos Cys-Gly, e a conseqüente modulação do ciclo da glutationa (Matsui,
Fowler e Walling, 2007).
Entre os protistas, sua participação foi inferida principalmente ao suprimento
nutricional em parasitos do gênero Leishmania(Morty e Morehead, 2002), à atividade
hemolítica auxiliar em Plasmodium (Stack et alii, 2007), e à catálise de peptídeos
degradados pelo proteasoma de T. cruzi durante sua diferenciação nos diferentes
estágios de infecção (Cadavid-Restrepo, 2005).
66
As leucil-aminopeptidases de bactérias são altamente diversificadas
funcionalmente. Além de provavelmente atuar nas manutenções basais desses
organismos, garantindo uma reciclagem dos aminoácidos derivados de atividade
endopeptidásica, estão relacionadas com vários eventos que requerem interação com
o DNA, como recombinação, repressão de transcrição (Colloms, 2004), e expressão de
toxinas (Behari etalii, 2001). Dentre as espiroquetas, uma atenção específica foi dada
à detecção proteolítica em bactérias do gênero Treponema, já que essas bactérias são
capazes de causar infecções periodontais (Mäkinen e Mäkinen, 1996). Contudo, a
associação entre a atividade leucil-aminopeptidásica e a ocorrência de tais infecções
deve ser comprovada. Estudo realizado por Bertin e colaboradores (2005) sugere que
essa atividade enzimática pode ter papel fundamental na sobrevivência de Borrelia
burgdorferri, tendo em vista que bactérias desse gênero não são capazes de sintetizar
aminoácidos, os quais devem ser adquiridos de sua dieta (Bertin etalii, 2005).
Em 1983, Neill e colegas (Neill, Reid e Ellis, 1983), examinaram 15 culturas de
Leptospira spp. para atividade aminopeptidásica, e em 1987, baseados nos perfis de
especificidade aos substratos, tentaram identificar diferentes espécies de Leptospira,
e conseguiram com sucesso diferenciar o padrão entre L.interrogans e L.biflexa (Neill
etalii, 1987). Infelizmente, pela impossibilidade da obtenção, até então, dos referidos
artigos, não temos conhecimento sobre quais substratos foram utilizados, e quais
foram as diferenças observadas.
Ao contrário das bactérias do gênero Borrelia, as Leptospiras têm uma via de
sintetização de aminoácidos, inclusive para a leucina, por meio da α-isopropilmalato
sintase (Xu et alii, 2004; Zou et alii, 2007). Mesmo assim, a existência de uma via de
produção de aminoácidos não exclui a possibilidade da obtenção dos mesmos pela
alimentação, e, portanto, a leucil-aminopeptidase de Leptospira pode estar
relacionada com a aquisição de leucina pela bactéria.
Em uma recente comparação, Picardeau e colaboradores identificaram uma
expansão no número de genes que codificam proteínas ricas em repetições de leucina
(LRR) de um para 18, em L.biflexa e L.interrogans, respectivamente (Picardeau etalii,
2008). Apesar de não se saber ao certo a função dessas proteínas LRR, em T.denticola
67
a LrrA parece exercer algum papel na adesão e na invasão dos tecidos do hospedeiro
(Ikegami et alii, 2004). Picardeau sugeriu ainda que a diversidade nas LRR de L.
interrogans possa estar relacionada com a infecção bem sucedida numa grande
variedade de espécies de mamíferos. A confirmação da existência dessa correlação
justificaria nossos achados iniciais sobre a existência de atividade leucil-
aminopeptídásica em sorovares patogênicos em contraposição a não-patogênico.
Mesmo que a LAP de Leptospira não esteja envolvida na regulação direta da expressão
desses genes, ela pode fazer parte crucial no processamento e na degradação destas
proteínas.
Adicionalmente, Matsunaga e colaboradores (2007) demonstraram a
importância da diferença osmótica entre o hospedeiro e o meio ambiente na
regulação gênica em L. interrogans. Uma vez dentro do hospedeiro, os genes
necessários para a sobrevivência da bactéria em ambientes úmidos abióticos (solo ou
água contaminados, por exemplo), devem ser reprimidos, enquanto que outros genes
relacionados a fatores de virulência devem ser induzidos. A detecção da expressão
diferencial de três proteínas nessas condições confirma a importância da força
osmótica na regulação de fatores de virulência nesse organismo (Matsunaga et alii,
2007). Assim como é importante a passagem de um ambiente hipo- para hiper-
osmótico, o oposto também deve ser importante. Imagine a situação de uma infecção
crônica nos rins, condição de manutenção e dispersão das Leptospiras no meio
(Athanazio etalii , 2007), na qual as bactérias devem passar de um meio extremamente
hiper-osmótico para um hipo-osmótico. É de se esperar que a bactéria tenha meios de
reduzir a força osmótica para impedir a perda de eletrólitos e o possível rompimento
de sua parede. Nesse cenário, a leucil-aminopeptidase contribuiria para o controle da
diferença osmótica de uma maneira semelhante à predita para Plasmodium (Stack et
alii, 2007): na clivagem final de proteínas ricas em leucina (no caso do Plasmodium, a
hemoglobina), e na liberação desses aminoácidos, que uma vez livres, podem difundir
pela membrana, aliviando a pressão osmótica da entrada da água na célula.
Outro papel atribuído às leucil-aminopeptidases bacterianas é o da regulação
indireta de genes, como no caso do gene algD, de Pseudomonas aeruginosa
68
(Woolwine et alii, 2001). Apesar da inibição da enzima PhPA (uma homóloga de
Pseudomonas à PepA de E. coli) não gerar diferença no pool de aminoácidos
intracelulares, ela causa um resposta ao estresse do acúmulo de peptídeos derivados
de proteínas mal-dobradas ou agregadas, que resulta na inibição da repressão
transcricional de algD. Similarmente, a taxa da atividade da LAP de Leptospira pode
regular a expressão de outros genes.
Apesar de ainda ser um assunto controverso, as leucil-aminopeptidases
bacterianas também podem estar relacionadas ao controle do estresse oxidativo, por
meio da regulação indireta da glutationa. Peptídeos do tipo Cys-Gly, já comprovados
como substratos para a leucil-aminopeptidase de E. coli, são reativos por si só, e
também estão relacionados ao combate de espécies oxidativas, que podem ser
prejudiciais à integridade celular (Matsui, Fowler e Walling, 2006). Se comprovado que
a LAP de Leptospira cliva esse substrato, podemos inferir uma relação da mesma na
proteção contra o estresse oxidativo.
Conclusões
70
Conclusões
A caracterização bioquímica e funcional de proteases tem grande importância
científica, já que muitas vezes são alvos quimioterápicos promissores no combate a
doenças com tratamento insatisfatório. No presente trabalho, uma atividade leucil-
aminopeptideolítica presente no extrato de bactérias patogênicas do gênero
Leptospira foi atribuída à leucil-aminopeptidase da família M17, codificada pelo gene
pepA. A partir de nossos estudos, foi possível concluir que:
1. A seqüência nucleotídica do gene pepA de Leptospira interrogans codifica uma
leucil-aminopeptidase funcional;
2. A estratégia aplicada neste trabalho se demonstrou eficaz para seus fins,
demonstrando que a clonagem e expressão heteróloga de proteases pode ser de
grande ajuda no processo de caracterização de possíveis alvos quimioterápicos;
3. A enzima recombinante HaLAP possui parâmetros cinéticos característicos da
família de metalopeptidases M17;
4. Apresenta seqüência parcial altamente conservada entre as espécies patogênicas
do gênero Leptospira com genomas elucidados;
5. É uma enzima termofílica, com atividade ótima entre 50° e 60 °C;
6. Sua atividade leucil-aminopeptidásica é muitas vezes aumentada ou depende da
estrutura oligomérica;
7. Apesar de se apresentar principalmente em sua forma monomérica sua
estabilidade catalítica sugere que em solução a formação dos oligômeros possa ser
dinâmica;
8. A enzima recombinante é fortemente inibida por EDTA, de maneira irreversível nas
condições testadas;
9. Existem indícios teóricos de que possam participar de papéis biológicos relevantes
para a patogenia da doença;
10. É imunogênica em camundongos, o que abre espaço para novas perspectivas de
estudos de localização e expressão diferencial dessa enzima.
Anexos
72
Anexos
Tabela4.ProgramaemPerlparaocálculodaforçaiônicaemumasoluçãodedoistampões.
#! C:\Perl\bin\perl.exe
print "Calculation and Adjustment of Ionic Strength of a Misture of Two Buffers\n\n
z = Charge on Conjugate Base
IS = Ionic Strength with no salt add
II = Required concentration of salt
Absolute (CI) = Concentration of acid or base required
If CI is > 0, Add acid; if CI < 0, Add base\n\n";
print "Pk of buffer 1 = "; my $Pk1 = <STDIN>;
print "Pk of buffer 2 = "; my $Pk2 = <STDIN>;
print "Charge on conjugate base 1 = "; my $Ch1 = <STDIN>;
print "Charge on conjugate base 2 = ";my $Ch2 = <STDIN>;
print "Concentration of buffer 1 = "; my $Co1 = <STDIN>;
print "Concentration of buffer 2 = "; my $Co2 = <STDIN>;
print "Required Ionic Strength ="; my $I = <STDIN>;
print "First pH = "; my $pH1 = <STDIN>;
print "Final pH = "; my $pH2 = <STDIN>;
print "pH Incremet = "; my $pH3 = <STDIN>;
print "pH\tHA1\tA1\tHA2\tA2\tCI\tIS\tII\n";
my $H = 0; my $X1 = 0; my $X2 = 0; my $A1 = 0; my $A2 = 0;
my $B1 = 0; my $B2 = 0; my $U = 0; my $I1 = 0; my $I2 = 0;
for($H = $pH1; $H <= $pH2; $H+=$pH3){
$X1=exp(($H-$Pk1)*2.303); $A1=$Co1/(1+$X1); $B1=$A1*$X1;
$X2=exp(($H-$Pk2)*2.303); $A2=$Co2/(1+$X2); $B2=$A2*$X2;
$U=($Ch1+1)*$A1+$Ch1*$B1+($Ch2+1)*$A2+$Ch2*$B2;
$I1=.5*(($Ch1+1)**2*$A1+$Ch1**2*$B1+($Ch2+1)**2*$A2+$Ch2**2*$B2+(abs($U)));
$I2=$I-$I1;
printf("%.1f\t%.4f\t%.4f\t%.4f\t%.4f\t%.4f\t%.4f\t%.4f\n",
$H,$A1,$B1,$A2,$B2,$U,$I1,$I2);
}
print "\nEND OF CALCULATIONS"
Tabela5.ProgramaemPerlparaocálculodaforçaiônicaemumasoluçãodetrêstampões.
#! C:\Perl\bin\perl.exe
print "Calculation and Adjustment of Ionic Strength of a Misture of Three Buffers\n\n
z = Charge on Conjugate Base
IS = Ionic Strength with no salt add
II = Required concentration of salt
Absolute (CI) = Concentration of acid or base required
If CI is > 0, Add acid; if CI < 0, Add base\n\n";
print "Pk of buffer 1 = "; my $Pk1 = <STDIN>;
print "Pk of buffer 2 = "; my $Pk2 = <STDIN>;
print "Pk of buffer 3 = "; my $Pk3 = <STDIN>;
print "Charge on conjugate base 1 = "; my $Ch1 = <STDIN>;
print "Charge on conjugate base 2 = "; my $Ch2 = <STDIN>;
73
print "Charge on conjugate base 3 = "; my $Ch3 = <STDIN>;
print "Concentration of buffer 1 = "; my $Co1 = <STDIN>;
print "Concentration of buffer 2 = "; my $Co2 = <STDIN>;
print "Concentration of buffer 3 = "; my $Co3 = <STDIN>;
print "Required Ionic Strength ="; my $I = <STDIN>;
print "First pH = "; my $pH1 = <STDIN>;
print "Final pH = "; my $pH2 = <STDIN>;
print "pH Incremet = "; my $pH3 = <STDIN>;
print "pH\tHA1\tA1\tHA2\tA2\tHA3\tA3\tCI\tIS\tII\n";
my $H = 0; my $X1 = 0; my $X2 = 0; my $X3 = 0; my $A1 = 0; my $A2 = 0; my $A3 = 0; my $B1 =
0;
my $B2 = 0; my $B3 = 0; my $U = 0; my $I1 = 0; my $I2 = 0; my $I3 = 0; my $I4 = 0;
for($H = $pH1; $H <= $pH2; $H+=$pH3){
$X1=exp(($H-$Pk1)*2.303); $A1=$Co1/(1+$X1); $B1=$A1*$X1;
$X2=exp(($H-$Pk2)*2.303); $A2=$Co2/(1+$X2); $B2=$A2*$X2;
$X3=exp(($H-$Pk3)*2.303); $A3=$Co3/(1+$X3); $B3=$A3*$X3;
$U=($Ch1+1)*$A1+$Ch1*$B1+($Ch2+1)*$A2+$Ch2*$B2+($Ch3+1)*$A3+$Ch3*$B3;
$I1=.5*(($Ch1+1)**2*$A1+$Ch1**2*$B1+($Ch2+1)**2*$A2+$Ch2**2*$B2+(abs($U)));
$I2=.5*(($Ch3+1)**2*$A3+$Ch3**2*$B3);
$I3=$I1+$I2; $I4=$I-$I3;
printf("%.1f %.3f %.3f %.4f %.4f %.4f %.4f %.4f %.4f %.4f\n",
$H,$A1,$B1,$A2,$B2,$A3,$B3,$U,$I3,$I4);
}
print "\nEND OF CALCULATIONS"
ReferênciasBibliográficas
75
ReferênciasBibliográficas
ABADJIEVA, A.; HILVEN, P.; PAUWELS, K.; CRABEEL, M. The yeast ARG7 gene product is
autoproteolyzed to two subunit peptides, yielding active ornithine
acetyltransferase. JBiolChem. v. 275, nº 15, p. 11361-11367. 2000.
ACHENBACH-RICHTER, L.; GUPTA, R.; STETTER, K. O.; WOESE, C. R. Were the original
eubacteria thermophiles? SystApplMicrobiol. v. 9, p.34-39. 1987.
ANANTHA, R. P.; STONE, K .D.; DONNENBERG, M. S. Effects of bfp mutations on
biogenesis of functional enteropathogenic Escherichia coli type IV pili. JBacteriol.
v. 182, nº9, p. 2498-2506. 2000.
ATHANAZIO, D. A.; SILVA, E. F.; SANTOS, C. S.; M. ROCHA, G. M.; VANNIER-SANTOS, M.
A.; Mcbride, A. J. A.; KO, A. I. e REIS, M. G. Rattus norvegicus as a model for
persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. ActaTropica. v.
105, p. 176–180. 2008.
BARRETT, A. J. Fluorimetric assays for cathepsin B and cathepsin H with
methylcoumarylamide substrates. BiochemJ. v. 187, nº 3, p. 909-912. 1980.
BARRETT, A. J.; MCDONALD, J. K. Nomenclature: protease, proteinase and peptidase.
BiochemJ.v. 237, nº 3, p. 935. 1986.
BEHARI, J.; STAGON, L. e CALDERWOOD, S. B. pepA, a gene mediating pH regulation of
virulence genes in Vibrio cholerae. J.Bacteriol. 183, 178–188. 2001.
BERTIN, P. B.; LOZZI, S. P.; HOWELL, J. K.; RESTREPO-CADAVID, G.; NEVES, D.; TEIXEIRA,
A. R.; DE SOUSA, M. V.; NORRIS, S. J.; SANTANA, J. M. The thermophilic,
homohexameric aminopeptidase of Borrelia burgdorferi is a member of the M29
family of metallopeptidases. InfectImmun. v. 73, nº4, p. 2253-2261. 2005.
BOND, J. S.; BUTLER, P.E. Intracellular proteases. AnnuRevBiochem. v. 56, p. 333-364.
1987.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de vigilância
epidemiológica – 6. ed. – Brasília : Ministério da Saúde, 2005. 816 p.
BROWN, J. R.; DOUADY, C. J.; ITALIA, M. J.; MARSHALL, W. E.; STANHOPE, M. J.
Universal trees based on large combined protein sequence data sets.
NatGenet. v.
28, nº 3, p. 281-285. 2001.
BULACH, D. M.; ZUERNER, R. L.; WILSON, P.; SEEMANN, T.; MCGRATH, A.; CULLEN, P.
A.; DAVIS, J.; JOHNSON, M.; KUCZEK, E.; ALT, D. P.; PETERSON-BURCH, B.; COPPEL,
R. L.; ROOD, J. I.; DAVIES, J. K.; AND ADLER, B. Genome reduction in Leptospira
76
borgpetersenii reflects limited transmission potential. ProcNatlAcadSciUSA. v.
26, nº103, e. 39, p. 14560-14565. 2006.
BURLEY, S. K.; DAVID, P. R.; TAYLOR, A; LIPSCOMB, W. N. Molecular structure of leucine
aminopeptidase at 2.7-A resolution. ProcNatlAcadSciU SA. v. 87, nº 17, p. 6878-
6882. 1990.
CADAVID-RESTREPO, G. Caracterizacao bioquimica da catepsina b de trypanosoma
cruzi. 2001. Tese de doutorado (Patologia Molecular) – Universidade de Brasília,
Brasília.
COLLOMS, S.D. Leucyl aminopeptidase PepA. In: Handbook of Proteolytic Enzymes, 2nd
Edition, BARRETT, A. J.; RAWLINGS, N. D. e WOESSNER, J. F. (Ed). San Diego, USA:
Elsevier/ Academic Press), p. 905–908. 2004
CORBELLINIA, L. G.; PESCADORA, C. A.; FRANTZA, F.; WUNDERA, E.; STEFFENB, D.;
SMITHC, D. R. e DRIEMEIER, D. Diagnostic survey of bovine abortion with special
reference to Neospora caninum infection: Importance, repeated abortion and
concurrent infection in aborted fetuses in Southern Brazil. Vet J. v. 172, nº 1, p.
114-120. 2006.
DALL’ANTONIA, M.; SLUGA, G.; WHITFIELD, S.; TEALL, A.; WILSON, P. e KRAHÉ, D.
Leptospirosis pulmonary haemorrhage: a diagnostic challenge. Emerg. Med. J. v.
25, p. 51-52. 2008.
DAYHOFF, M. O.; SCHWARTZ, R. M. e ORCUTT, B. C. A model of evolutionary change in
proteins. AtlasProteinStruct. v. 5, p. 345–352. 1978.
DELPIERRE, G. R.; FRUTON, J. S. Inactivation of pepsin by diphenyldiazomethane. Proc
NatlAcadSci.v. 54, nº 4, p. 1161-1167. 1965.
DOLHNIKOFF, M.; MAUAD, T.; BETHLEM, E. P.; CARVALHO, C. R. Leptospiral
pneumonias. CurrOpinPulmMed. v. 13, nº 3, p. 230-235. 2007.
DONG, L.; CHENG, N.; WANG, M. W.; ZHANG, J.; SHU, C. e ZHU, D. X. The leucyl
aminopeptidase from Helicobacter pylori is an allosteric enzyme. Microbiology. v.
151, p. 2017–2023. 2005.
DUNN, B. M. Determination of protease mechanism. In: R. J. Beynon and J. S. Bond
(Ed), Proteolytic Enzymes. A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford
(2001). Cap. 4, p. 77-104.
ELLIS, K. J.; MORRISON, J. F. Buffers of constant ionic strength for studying pH-
dependent processes. MethodsEnzymol. v. 87, p. 405-426. 1982.
77
ELLIS, W. A. Leptospirosis as a cause of reproductive failure. VetClin NorthAmFood
AnimPract. v. 10, nº 3, p. 463-478. 1994.
ENNA, Z. M.; ROLANDO, P. P. Leptospirosis: Puesta al día. Rev.chil.infectol. v. 24, nº 3,
p.220-226. 2007.
FAINE, S. Leptospira and leptospirosis. 1994. CRC Press, Boca Raton, Fla.
FORTERRE, P. Looking for the most "primitive" organism(s) on Earth today: the state of
the art. PlanetSpaceSci. v. 43, nº1-2, p.167-177. 1995.
FUJINAGA, M.; CHERNEY, M. M.; OYAMA, H.; ODA, K.; JAMES, M.N. The molecular
structure and catalytic mechanism of a novel carboxyl peptidase from Scytalidium
lignicolum. ProcNatlAcadSciUSA. v. 101, p. 3364-3369. 2004.
GONZALES, T.; ROBERT-BAUDOUY, J. Bacterial aminopeptidases: properties and
functions. FEMSMicrobiolRev. v. 18, nº 4, p. 319-344. 1996.
GUENET, C.; LEPAGE, P. e HARRIS. B. A. Isolation of the Leucine aminopeptidase gene
from Aeromonasproteolytica.J.Biol.Chem. v. 267, p. 8390-8395. 1992.
HAAKE, D. A.; DUNDOO, M.; CADER, R.; KUBAK, B. M.; HARTSKEERL, R. A.; SEJVAR, J. J.
e ASHFORD, D. A. Leptospirosis, water sports, and chemoprophylaxis. Clin Infect
Dis. v. 34, p. e40–43. 2002.
HAAKE, D. A.; MATSUNAGA, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and
description of three novel leptospiral membrane proteins. InfectImmun. v. 70, p.
4936–4945. 2002.
HAAKE, D. A.; WALKER, E. M.; BLANCO, D. R.; BOLIN, C. A.; MILLER, M. N. e LOVETT, M.
A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during
in vitro cultivation. InfectImmun. v. 59, p. 1131–1140. 1991.
HARTLEY, B.S. Proteolytic enzymes. AnnuRevBiochem.v. 29, p. 45-72. 1960.
HARTSUCK, J. A.; TANG, J. The carboxylate ion in the active center of pepsin. J Biol
Chem. v. 247, n 8, p. 2575-2580. 1972.
HEINEMANN, M.B.; GARCIA, J.F.; NUNES, C. M.; GREGORI, F.; HIGA, Z. M.;
VASCONCELLOS, S. A; RICHTZENHAIN, L. J. Detection and differentiation of
Leptospira spp. serovars in bovine semen by polymerase chain reaction and
restriction fragment length polymorphism. Vet Microbiol. v. 73, nº 4, p. 261-267.
2000.
78
HILL, H. R.; BOHNSACK , J. F.; MORRIS, E. Z.; AUGUSTINE, N. H.; PARKER, C. J.; CLEARY,
P. P.; WU, J.T. Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth
component of complement. JImmunol. v. 141, nº 10, p. 3551-3556. 1988.
HOLLEMAN, A. F., WIBERG, E. (2001). Inorganic Chemistry. San Diego: Academic Press.
IKEGAMI, A.; HONMA, K.; SHARMA, A.; KURAMITSU, H. Multiple functions of the
leucine-rich repeat protein LrrA of Treponema denticola. Infect Immun. v. 72, p.
4619–4627. 2004.
KALSOW, C. M.; DWYER, A. E. Retinal Immunopathology in horses with Uveitis. Ocul
ImmunolInflammat. v. 6, p. 239-251. 1998.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. v. 227, nº 5259, p. 680-685. 1970.
LARKIN, M. A.; BLACKSHIELDS, G.; BROWN, N. P.; CHENNA, R.; MCGETTIGAN, P. A.;
MCWILLIAM, H.; VALENTIN, F.; WALLACE, I. M.; WILM, A.; LOPEZ, R.; THOMPSON,
J. D.; GIBSON, T. J.; HIGGINS, D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0.
Bioinformatics. v. 23, p. 2947-2948. 2007.
LEON-VIZCAINO, L.; HERMOSO de MENDOZA, M.; GARRIDO, F. Incidence of abortions
caused by leptospirosis in sheep and goats in Spain. Comp Immunol Microbiol
InfectDis. v. 10, nº 2, p. 149-153. 1987.
LEVETT, P. N. Leptospirosis. ClinMicrobiolRev. v. 14, nº 2, p.296-326. 2001.
LEVETT, P. N.,Leptospirosis. In: MANDELL, G. N.; BENNETT, J. E. e DOLIN, R..Principles
and Practice of Infectious Diseases, 6ª ed., Nova Iorque. Churchill Livingstone,
2005. v. 2, cap. 237, p. 2789-2795.
LILES, M. R.; EDELSTEIN, P.H.; CIANCIOTTO, N.P. The prepilin peptidase is required for
protein secretion by and the virulence of the intracellular pathogen Legionella
pneumophila. MolMicrobiol. v. 31, nº 3, p. 959-970. 1999.
LIN, Y.; CHANG, Y. A domain of the Leptospira LigB contributes to high affinity binding
of fibronectin. BiochemBiophysResCommun. v. 362, nº 2, p. 443-448. 2007.
LO, M; BULACH, D. M.; POWELL, D. R.; HAAKE, D. A.; MATSUNAGA, J.; PAUSTIAN, M. L.;
ZUERNER, R. L. e ADLER, B. Effects of Temperature on Gene Expression Patterns in
Leptospira interrogans serovar Lai as Assessed by Whole-Genome Microarrays.
InfectImmun. 74(10): 5848–5859. 2006.
MÄKINEN, K. K.; e MÄKINEN, P.-L. The peptidolytic capacity of the spirochete system.
MedMicrobiolImmunol. v. 185, nº 1, p. 1-10. 1996.
79
MÄKINEN, K. K.; SYED, S. A.; LOESCHE, W. J.; MÄKINEN, P.L. Proteolytic profile of
Treponema vincentii ATCC 35580 with special reference to collagenolytic and
arginine aminopeptidase activity. Oral Microbiol Immunol. v. 3, nº3, p. 121-128.
1988.
MARCHLER-BAUER, A.; ANDERSON, J. B.; DERBYSHIRE, M. K.; DeWEESE-SCOTT, C.;
GONZALES, N. R.; GWADZ, M.; HAO, L.; HE, S.; HURWITZ, D. I.; JACKSON, J. D.; KE,
Z., KRYLOV, D, LANCZYCKI, C. J.; LIEBERT, C. A.; LIU, C.; LU, F.; LU, S.; MARCHLER, G.
H.; MULLOKANDOV, M.; SONG, J. S.; THANKI, N.; YAMASHITA, R. A.; YIN, J. J.;
ZHANG, D; BRYANT, S. H. CDD: a conserved domain database for interactive
domain family analysis. NucleicAcidsRes. v. 35, p. D237-240. 2007.
MATSUI, M.; FOWLER, J. H. e WALLING, L. L. Leucine aminopeptidases: diversity in
structure and function. Biol.Chem. v. 387, p. 1535–1544. 2006.
MATSUI, M.; FOWLER, J. H.; WALLING, L. L. Leucine aminopeptidases: diversity in
structure and function. BiolChem. v. 387, nº 12, p. 1535-1544. 2006.
MATSUNAGA, J.; LO, M.; BULACH, D. M.; ZUERNER, R. L.; ADLER, B. e HAAKE, D. A.
Response of Leptospira interrogans to Physiologic Osmolarity: Relevance in
Signaling the Environment-to-Host Transition. Infect. Immun. 75(6): 2864-2874.
2007.
MATTHIAS, M. A.; RICALDI, J. N.; CESPEDES, M.; DIAZ, M. M.; GALLOWAY, R. L.; SAITO,
M.; STEIGERWALT, A. G.; PATRA, K. P.; ORE, C. V.; GOTUZZO, E.; GILMAN, R. H.;
LEVETT, P. N.; VINETZ, J. M. Human leptospirosis caused by a new, antigenically
unique leptospira associated with a rattus species reservoir in the peruvian
Amazon. PLoSNeglTropDis. v. 2, nº 4, p. e213. 2008.
MCBRIDE, A. J.; ATHANAZIO, D. A.; REIS, M. G.; KO, A. I. Leptospirosis. CurrOpinInfect
Dis. v. 18, nº 5, p. 376-386. 2006.
MERIEN, F.; TRUCCOLO, J.; BARANTON, G.; PEROLAT, P. Identification of a 36-kDa
fibronectin-binding protein expressed by a virulent variant of Leptospira
interrogans serovar icterohaemorrhagiae. FEMS Microbiol Lett. v. 185, p. 17–22.
2000.
MORGAN, J.; BORNSTEIN, S. L.; KARPATI, A. M.; BRUCE, M.; BOLIN, C. A.; AUSTIN, C. C.;
WOODS, C. W.; LINGAPPA, J.; LANGKOP, C.; DAVIS, B.; GRAHAM, D. R.; PROCTOR,
M.; ASHFORD, D. A.; BAJANI, M.; BRAGG, S. L.; SHUTT, K.; PERKINS, B. A.; TAPPERO,
J. W.; Leptospirosis Working Group. Outbreak of leptospirosis among triathlon
participants and community residents in Springfield, Illinois, 1998. Clin Infect Dis.
v. 34, p. 1593–1599. 2002.
80
MOTOSHIMA, H; MINAGAWA, E; TSUKASAKI, F; KAMINOGAWA, S. Cloning of genes of
the aminopeptidase T family from Thermus thermophilus HB8 and Bacillus
stearothermophilus NCIB8924: apparent similarity to the leucyl aminopeptidase
family. BiosciBiotechnolBiochem. v. 61, nº 10, p.1710-1717. 1997.
NALLY, J. E.; CHOW, E.; FISHBEIN, M. C.; BLANCO, D. R. e LOVETT, M. A. Changes in
Lipopolysaccharide O Antigen Distinguish Acute versus Chronic Leptospira
interrogans Infections. InfectImmun. v. 73, nº 6, p. 3251–3260. 2005.
NASCIMENTO, A. L. T. O.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; VAN SLUYS, M. A.; MONTEIRO-
VITORELLO, C. B.; CAMARGO, L. E. A.; DIGIAMPIETRI, L. A.; HARSTKEERL, R. A.; HO,
P. L.; MARQUES, M. V.; OLIVEIRA, M. C.; SETUBAL, J. C.; HAAKE, D. A. e MARTINS, E.
A. L. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. BrazJMed
BiolRes. v. 37, p. 459-478. 2004.
NEILL, S. D.; REID, L. R.; ELLIS, W. A. Aminopeptidase activity of Leptospira strains. J
GenMicrobiol. v. 129, nº 2, p. 395-400. 1983.
NEILL, S. D.; REID, R. L.; WEATHERUP, S. T. e ELLIS, W. A. The use of aminopeptidase
substrate specificity profiles to identify leptospires. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol
Hyg[A]. v. 264, nº 1-2, p. 137-144. 1987.
OHTA, K.; MAKINEN, K. K.; LOESCHE, W. J. Purification and characterization of an
enzyme produced by Treponema denticola capable of hydrolyzing synthetic trypsin
substrates. InfectImmun. v. 53, nº 1, p. 213-220. 1986.
PARMA, A. E.; CERONE, S. I.; SANSINANEA, S. A. Biochemical analysis by SDS-PAGE and
western blotting of the antigenic relationship between Leptospira and equine
ocular tissues. Vet ImmunolImmunopathol. v. 33, p. 179-185. 1992.
PICARDEAU, M.; BULACH, D. M.; BOUCHIER, C.; ZUERNER, R. L.; ZIDANE, N.; WILSON, P.
J.; CRENO, S.; KUCZEK, E. S.; BOMMEZZADRI, S.; DAVIS, J. C.; MCGRATH, A.;
JOHNSON, M. J.; BOURSAUX-EUDE, C.; SEEMANN, T.; ROUY, Z.; COPPEL, R. L.;
ROOD, J. I.; LAJUS, A.; DAVIES, J. K.; MÉDIGUE, C. e ADLER, B. Genome Sequence of
the Saprophyte Leptospira biflexa Provides Insights into the Evolution of Leptospira
and the Pathogenesis of Leptospirosis. PLoSONE. v. 3, nº 2, e. 1607. 2008.
POTEMPA, J.; PIKE, R. N. BACTERIAL PEPTIDASES. IN: RUSSELL W, HERWALD H (Ed):
Concepts in Bacterial Virulence. Contrib Microbiol. Basel, Karger, 2005, vol 12, p
132-180.
RAGHAVAN, U. M.; PALANIAPPAN, S. R.; YUNG-FU, C. Leptospirosis: pathogenesis,
immunity, and diagnosis. CurrOpinInfectDis.v. 20, p. 284–292. 2007.
81
RATHINAM, S. R. Ocular manifestations of leptospirosis. JPostgradMed. v. 51, p. 189-
194. 2005.
RAWLINGS, N. D.; BARRETT, A. J. Evolutionary families of peptidases. BiochemJ, v. 290,
p. 205-218. 1993.
RAWLINGS, N. D.; MORTON, F. R.; KOK, C. Y.; KONG, J. e BARRETT, A.J. MEROPS: the
peptidase database. NucleicAcidsRes. v.36, p. D320-D325. 2008.
REN, S. X.; FU, G.; JIANG, X. G.; ZENG, R.; MIAO, Y. G.; XU, H.; ZHANG, Y. X.; XIONG, H.;
LU, G.; LU, L. F.; JIANG, H. Q.; JIA, J.; TU, Y. F.; JIANG, J. X.; GU, W. Y.; ZHANG, Y. Q.;
CAI, Z.; SHENG, H. H.; YIN, H. F.; ZHANG, Y.; ZHU, G. F.; WAN, M.; HUANG, H. L.;
QIAN, Z.; WANG, S. Y.; MA, W.; YAO, Z. J.; SHEN, Y.; QIANG, B. Q.; XIA, Q. C.; GUO,
X. K.; DANCHIN, A.; SAINT GIRONS, I.; SOMERVILLE, R. L.; WEN, Y. M.; SHI, M. H.;
CHEN, Z.; XU, J. G.; ZHAO, G. P. Unique and physiological and pathogenic features
of Leptospira interrogans revealed by whole genome sequencing. Nature. v. 422,
p.888–893. 2003.
RISTOW, P.; BOURHY, P.; DA CRUZ MCBRIDE, F. W.; FIGUEIRA. C. P.; HUERRE, M.; AVE,
P.; GIRONS, I. S.; KO, A. I.; PICARDEAU, M. The OmpA-like protein Loa22 is essential
for leptospiral virulence. PLoSPathog. v. 3, nº7, p. e97. 2007.
MORTY, R. E. e MOREHEAD, J. Cloning and Characterization of a Leucyl
Aminopeptidase from Three Pathogenic Leishmania Species. J.Biol.Chem.v. 277,
nº 9, p. 26057–26065. 2002.
SAINT-GIRONS, I.; BOURHY, P.; OTTONE, C.; PICARDEAU, M.; YELTON, D.; HENDRIX, R.
W.; GLASER, P.; CHARON, N. The LE1 Bacteriophage Replicates as a Plasmid within
Leptospira biflexa: Construction of an L. biflexa-Escherichia coli Shuttle Vector. J
Bacteriol. v. 182, nº. 20, p. 5700–5705. 2000.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Mol.Biol.Evol. v. 4, nº 4, p. 406-425. 1987.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
New York, Cold Spring Harbor Press, 1989, 956 p. 1989.
SANTANA, J. M.; GRELLIER, P.; RODIER, M. H.; SCHREVEL, J.; TEIXEIRA, A. Purification
and characterization of a new 120 kDa alkaline proteinase of Trypanosoma cruzi.
BiochemBiophysResCommun. v. 187, nº 3, p. 1466-1473. 1992.
ST. JOHN M. A.; KING, S.; BULLEN, S. E.; CHERIAN, J. e LEVETT, P. N. Leptospirosis
occurring in two children after fresh water immersion. WestIndianMedJ. v. 49, p.
3403–43. 2000.
82
STACK, C. M.; LOWTHER, J.; CUNNINGHAM, E.; DONNELLY, S.; L. GARDINER, D. L.;
TRENHOLME, K. R.; SKINNER-ADAMS, T. S.; TEUSCHER, F.; GREMBECKA, J.; MUCHA,
A.; KAFARSKI, P.; LUA, L.; BELL, A.; e DALTON, J. P. Characterization of the
Plasmodiumfalciparum M17 leucyl aminopeptidase: a protease involved in amino
acid regulation with potential for antimalarial drug development. J.Biol.Chem. v.
282, nº 3, p. 2069-2080. 2007.
STORCK, C. H.; POSTIC, D.; LAMAURY, I.; PEREZ, J. M. Changes in epidemiology of
leptospirosis in 2003–2004, a two El Niño Southern Oscillation period, Guadeloupe
archipelago, French West Indies. EpidemiolInfect. In press. 2007.
STRANDBERG, L. e ENFORS, S. O. Factors Influencing Inclusion Body Formation in the
Production of a Fused Protein in Escherichia coli. ApplEnvironMicrobiol. v. 57, nº
6, p. 1669–1674. 1991.
STRÄTER, N.; SHERRATT, D. J.; COLLOMS, S. D. X-ray structure of aminopeptidase A
from Escherichia coli and a model for the nucleoprotein complex in Xer site-specific
recombination. EMBOJ. v. 18, nº 16, p. 4513-4522. 1999.
TURNER, L. H.; MOHUN, A.F. Leptospirosis. BrMedJ. v. 1, nº 5693, p. 433-434. 1970.
VENTURA, S e VILLAVERDE, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends
Biotechnol. v. 24, nº 4, p. 179-185. 2006.
VIRIYAKOSOL, S.; MATTHIAS, M. A.; SWANCUTT, M. A.; KIRKLAND, T. N.; VINETZ, J. M.
Toll-like receptor 4 protects against lethal Leptospira interrogans serovar
icterohaemorrhagiae infection and contributes to in vivo control of leptospiral
burden. InfectImmun. v. 74, nº 2, p. 887-895. 2006.
VOET, D. E VOET, J. G. Biochemistry. 1. Ed. New York, Willey, 1990.
WANG, X.; FU, M.; REN, J. e QU, X. Evaluation of different culture conditions for high-
level soluble expression of human cyclin A2 with pET vector in BL21(DE3) and
spectroscopic characterization of its inclusion body structure. ProteinExprPurif. v.
56, nº 1, p. 27-34. 2007.
WOLF, Y. I.; ROGOZIN, I. B.; GRISHIN, N. V.; TATUSOV, R. L. e KOONIN, E. V. Genome
trees constructed using five different approaches suggest new major bacterial
clades. BMC.Evol.Biol. v. 1, p.8. 2001
WOOLWINE, S. C.; SPRINKLE, A. B.; e WOZNIAK, D. J. Loss of Pseudomonas aeruginosa
PhpA aminopeptidase activity results in increased algD transcription. J.Bacteriol. v.
183, p. 4674–4679. 2001.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Guidelines for the control of leptospirosis. Faine, S
(Ed). 1982. Geneva. nº 67.
83
XU, H.; ZHANG, Y.; GUO, X.; REN, S.; STAEMPFLI, A. A.; CHIAO, J.; JIANG, W. e ZHAO, G.
Isoleucine Biosynthesis in Leptospira interrogans Serotype lai Strain 56601
Proceeds via a Threonine-Independent Pathway. JBacteriol. v. 186, nº 16, p. 5400-
5409.
YANG, C. W.; HUNG, C. C.; WU, M.S.; TIAN, Y. C.; CHANG, C. T.; PAN, M. J.;
VANDEWALLE, A. Toll-like receptor 2 mediates early inflammation by leptospiral
outer membrane proteins in proximal tubule cells. Kidney Int. v. 69, p. 815–822.
2006.
ZOU, Y.; GUO, X.; PICARDEAU, M.; XU, H.; ZHAO, G. A comprehensive survey on
isoleucine biosynthesis pathways in seven epidemic Leptospira interrogans
reference strains of China. FEMSMicrobiolLett. v. 269, nº 1, p. 90-96. 2007.
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