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GIOVANNA MARCELLA CAVALCANTE CARVALHO
COMPARAÇÃO DO TRATAMENTO COM LASSBio 596
OU DEXAMETASONA NA LESÃO PULMONAR AGUDA
INDUZIDA POR MICROCISTINA-LR
Dissertação submetida à Pós-graduação do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à
obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2009
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COMPARAÇÃO DO TRATAMENTO COM LASSBio 596 OU
DEXAMETASONA NA LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR
MICROCISTINA-LR
GIOVANNA MARCELLA CAVALCANTE CARVALHO
ORIENTADOR: WALTER ARAUJO ZIN
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção
do título de Mestre.
APROVADA POR:
________________________________________________________________
Prof
a
. Débora Souza Faffe
Prof
a
. Adjunta UFRJ
_________________________________________________________________
Prof
a
. Lidia Moreira Lima
Prof
a
. Adjunta UFRJ
_________________________________________________________________
Prof
a
. Sandra Maria Feliciano de Oliveira Azevedo
Prof
a
. Adjunta UFRJ
_________________________________________________________________
Prof
a
. Patrícia Rieken Macedo Rocco – Revisora e Suplente Interna
Prof
a
. Adjunta UFRJ
_________________________________________________________________
Prof
a
Valéria Freitas de Magalhães – Suplente Externa
Prof
a
Adjunta UFRJ
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
Carvalho, Giovanna Marcella Cavalcante
Comparação do tratamento com LASSBio 596 ou dexametasona na lesão
pulmonar aguda induzida por microcistina-LR / Giovanna Marcella Cavalcante
Carvalho – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2009.
xx, 160 f.: il.; 30 cm.
Orientador: Walter Araújo Zin.
Dissertação (mestrado) – UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), 2009.
Referências Bibliográficas: f. 130 – 149
1. Lesão Pulmonar Aguda. 2. Cianobactérias. 3. LASSBio 596. 4. Mecânica Pulmonar –
Tese. I. Zin, Walter Araujo. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Programa de
Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia). III. Comparação do tratamento
com LASSBio 596 ou dexametasona na lesão pulmonar aguda induzida por
microcistina-LR.
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Respiração do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),
Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ), Conselho de Ensino para Graduados e Pesquisa da UFRJ (CEPG-
UFRJ), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX), Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Instituto Milênio.
A Deus,
por ter iluminado o meu caminho e por ter me dado força e paz nos momentos em que
mais precisei.
Ao meu pai Antônio Augusto Carvalho,
pelo amor, incentivo, carinho e apoio constantes dedicados a mim.
A minha mãe Hozana Maria Cavalcante Carvalho,
pelo amor, paciência, imensa dedicação e apoio em todos os momentos de minha vida.
Ao meu irmão Marcello Cavalcante Carvalho,
pela cumplicidade e pelos momentos de descontração.
AGRADECIMENTOS
Nesta importante fase da minha vida, não poderia deixar de agradecer a todas
as pessoas que, de alguma forma, me ajudaram no decorrer deste trabalho.
Ao Prof. Walter Araújo Zin, por sua orientação e atenção a mim dispensadas em
toda a minha vida acadêmica, desde a iniciação científica. Pela confiança e incentivo
constantes que aumentam a minha vontade de aprender, pelo exemplo de pesquisador,
ensinando a importância da seriedade na área da pesquisa. Pela dedicação na
elaboração desta dissertação e principalmente, pela compreensão nos momentos
difíceis. Muito obrigada.
À Profª. Débora Souza Faffe por seus ensinamentos, conselhos e auxílios ao
longo da minha formação, pela prestatividade e disponibilidade para ajudar.
Ao Prof. Samuel Valença e seus alunos do Laboratório de Reparo Tecidual
(UERJ), pela imensa ajuda neste trabalho, desde a análise do estresse oxidativo até a
interpretação dos dados.
Às colaboradoras e amigas do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de
Cianobactérias, Profª. Sandra Azevedo, Raquel Soares e Luana Mattos por todo o
auxílio, dedicação e paciência para responder às minhas dúvidas.
À colaboradora do Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas,
Profª. Lidia Moreira Lima, pela grande contribuição neste trabalho, desde a obtenção do
fármaco utilizado até a interpretação dos dados.
Ao Prof. Paulo Hilário do Nascimento Saldiva, pela brilhante ajuda na análise
histopatológica das lâminas de fígado.
À Profª Patrícia Rocco pela criteriosa revisão desta dissertação.
Aos colaboradores do Laboratório de Fisiologia da Respiração, Vinicius Rosa de
Oliveira e Viviane Ramos Cagido, pela ajuda nos experimentos, análise dos resultados
e principalmente pela fiel amizade.
No laboratório existem ainda muitas pessoas que participaram direta ou
indiretamente deste trabalho e outros tantos que somente pela convivência me ensinaram
a ser uma pessoa melhor e fizeram o dia-a-dia no laboratório mais feliz. Com certeza,
nesses cinco anos de convivência, foram criados laços de amizade que perdurarão
para o resto da vida. Que a vida lhes retorne em dobro todas as coisas boas que
fizeram por mim. A todos vocês devo meu profundo e sincero agradecimento e
especialmente à Flávia Mazzoli da Rocha, Clarissa Magalhães, Douglas Riva, Douglas
Fonseca, Natalia Casquilho, Silviane Fernandes, Flávia Brandão e Halina Cidrini pela
ajuda crucial nos momentos mais difíceis deste trabalho.
Aos funcionários do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, em especial aos
técnicos de laboratório Sr. Antônio Carlos de Souza Quaresma e ao Sr. João Luiz
Coelho Rosas Alves, sempre dispostos a ajudar.
Aos meus queridos e maravilhosos pais, Antônio Augusto e Hozana, pelo amor,
educação e criação, amizade e tamanha ajuda, sem a qual eu não estaria aqui. Amo
vocês.
Ao meu querido irmão, Marcello, pela amizade, carinho, compreensão e
paciência. Amo você demais.
A todas as pessoas da minha família que sempre acreditaram no meu trabalho e
compreenderam os momentos de dedicação a este estudo.
Ao querido Daniel Chrity (
in memoriam
), pela compreensão, carinho, amor,
respeito e incentivo. Muito obrigada por toda felicidade que me proporcionou durante os
anos que passamos juntos.
E, finalmente, a Deus, pela excelente família e amigos que tenho, por me
fortalecer na fé a cada dia, e por tudo que sou.
RESUMO
COMPARAÇÃO DO TRATAMENTO COM LASSBIO 596 OU DEXAMETASONA NA
LESAO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR MICROCISTINA-LR
Introdução: Microcistina-LR (MCYST-LR) é a toxina mais frequentemente produzida por
cianobactérias na água, podendo induzir inflamação e alterações na mecânica
pulmonar. Este estudo comparou os efeitos de um novo inibidor das fosfodiesterases 4
e 5 (LASSBio 596) ou da dexametasona na lesão pulmonar aguda induzida por
exposição à MCYST-LR.
Métodos: Camundongos Suíços receberam injeção intraperitoneal (i.p.) com 60 µL de
salina (Ctrl=9) ou dose sub-letal de MCYST-LR (40 µg/kg, n=27). Após 6 horas, os
animais foram tratados com salina (Tox), LASSBio 596 (10 mg/kg em 2,5 µL de
dimetilsulfóxido e 197,5 µL de salina, L596) ou dexametasona (1 mg/kg, 0,1 mL, Dexa),
i.p.. Após 2 horas, a elastância estática (Est), o componente elástico da
viscoelasticidade (∆E) e as pressões pulmonares resistiva (∆P1), viscoelástica (∆P2) e
total (∆Ptot) foram determinados pelo método de oclusão ao final da inspiração. Os
pulmões foram fixados para análise histológica (HE), sendo determinada fração de área
de colapso alveolar. Os fígados foram igualmente fixados com (HE) para análise
histopatológica qualitativa. Foram realizadas quantificação de MCYST-LR nos tecido
pulmonar e hepático e análises bioquímicas de estresse e dano oxidativo por meio da
quantificação das enzimas: Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT),
Mieloperoxidase (MPO) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS).
Resultados: O grupo Tox mostrou aumento significativo em todos os parâmetros
mecânicos em relação ao Ctrl. Após tratamento com LASSBio 596, tais parâmetros
foram semelhantes ao Ctrl, enquanto o tratamento com Dexa foi similar apenas para
Est, ∆E e ∆P2. O grupo Tox apresentou maior porcentagem de colapso alveolar no
parênquima pulmonar comparado com Ctrl. Tratamento com LASSBio 596 ou
dexametasona reduziu o colapso alveolar em relação a Tox. CAT, MPO, e TBARS
foram maiores em Tox comparado com Ctrl. Os tratamentos com L596 ou Dexa
reduziram o conteúdo destas substâncias. SOD foi menor nos grupos Tox e Dexa.
MCYST-LR foi encontrada nos fígados de todos os grupos. A histologia hepática não
evidenciou padrão de recuperação em nenhum dos grupos tratados.
Conclusão: O presente estudo evidenciou que o LASSBio 596 atuou no processo
inflamatório induzido pela MCYST-LR, evitando as alterações na mecânica pulmonar e
bioquímicas e minimizando as modificações histológicas. Os efeitos benéficos do
LASSBio 596 superaram aqueles evidenciados pela dexametasona.
Palavras-chave: Lesão pulmonar aguda, Cianobactérias, LASSBio 596, Mecânica
Pulmonar.
Rio de Janeiro
Fevereiro, 2009
ABSTRACT
COMPARISON OF DEXAMETHASONE OR LASSBIO 596 TREATMENT IN ACUTE
LUNG INJURY INDUCED BY MICROCYSTIN-LR
Introduction: Microcystin-LR (MCYST-LR) is the most common toxin released by
cyanobacteria in water, can inducing inflammation and changes in lung mechanics. We
compared the effects of LASSBio 596 with dexamethasone in a model of lung injury
induced by MCYST-LR.
Methods: Swiss mice received (i.p.) 60 µl of saline (Ctrl) or a subletal dose of MCYST-
LR (40 µg/kg). After 6 h the animals were treated (i.p.) with saline (Tox), LASSBio 596
(10 mg/kg, L596) or dexametasone (1 mg/kg, 0.1 mL, Dexa). 8 h after MCYST-LR
injection, static elastance (Est), elastic component of viscoelasticity (!E), and resistive
(!P1), viscoelastic (!P2) and total (!Ptot) pressures were determined. Fraction area of
alveolar collapse, was determined in lung parenchyma. The livers were fixed with (HE)
for qualitatively.histopathological analysis. We performed quantification of MCYST-LR in
the lung and liver and biochemical analysis of stress and oxidative damage by
quantification of enzymes: Superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT),
myeloperoxidase (MPO) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS ).
Results: The Tox group showed significant increase in all mechanical parameters in
relation to the Ctrl. After treatment with LASSBio 596, these parameters were similar to
Ctrl, while treatment with DEXA was similar only for Est, ∆E and ∆P2. The Tox group
showed increase alveolar collapse in lung parenchyma compared with Ctrl.Both
therapies reduced the alveolar collapse when compared with Tox. CAT, MPO, and
TBARS were higher in Tox compared with Ctrl. L596 or DEXA therapies reduced the
content of these substances. SOD was lower in groups Tox and DEXA. MCYST-LR was
found in the livers of all groups. The liver histology showed no pattern of recovery in any
of the treated groups.
Conclusion: Our study showed that both LASSBio 596 and dexamethasone reduced the
inflammation and changes in lung mechanics induced by MCYST-LR, however, the
beneficial effects of LASSBio 596 outperformed those evidenced by dexamethasone.
Key-words: Acute lung injury; Cyanobacteria; LASSBio 506; Lung mechanics.
Rio de Janeiro
February, 2009
ÍNDICE
FICHA CATALOGRÁFICA iii
AGÊNCIAS FINANCIADORAS iv
AGRADECIMENTOS vi
RESUMO ix
ABSTRACT x
ÍNDICE xi
ÍNDICE DE FIGURAS xiv
ÍNDICE DE TABELA xvi
ABREVIATURAS xvii
1 INTRODUÇÃO 2
1.1 CIANOBACTÉRIAS 2
1.2 MICROCISTINAS 7
1.2.1 Estrutura Química 7
1.2.2 Farmacocinética 10
1.2.3 Mecanismo de ação 11
1.2.4 Síndrome de Caruaru 14
1.3 MICROCISTINAS E ESTRESSE OXIDATIVO 15
1.4 EFEITOS DA MICROCISTINA NO PULMÃO 19
1.5 TRATAMENTO DA LESÃO PULMONAR INDUZIDA POR
MCYST-LR
22
1.6 DEXAMETASONA 24
1.7 LASSBIO 596 26
1.8 NOÇÕES BÁSICAS DE ESTRESSE OXIDATIVO E
MECÂNICA RESPIRATÓRIA
33
1.8.1 Radicais livres 33
1.8.1.1 Reações de Fenton e de Haber-Weiss 35
1.8.1.2 Peroxidação lipídica 36
1.8.1.3 Sistemas de defesa antioxidante 37
1.8.1.3.1 Superóxido dismutase (SOD) 38
1.8.1.3.2 Catalase (CAT) 39
1.8.1.3.3 Glutationa peroxidase (GPx) 39
1.8.1.4 Estresse Oxidativo 40
1.8.2 Mecânica Respiratória 41
1.8.2.1 Estudo da Mecânica Respiratória 45
2 JUSTIFICATIVA 55
3 OBJETIVOS 58
3.1 OBJETIVO GERAL 58
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 58
4 MATERIAIS E MÉTODOS 60
4.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS 60
4.2 EXPERIMENTOS 62
4.2.1 Mecânica Respiratória 63
4.2.2 Histologia Pulmonar 70
4.2.2.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia
óptica
70
4.2.2.2 Análise histológica 72
4.2.3 Análise de MCYST-LR por ELISA 73
4.2.4 Ensaios bioquímicos de estresse e dano oxidativo 74
4.2.4.1 Dosagem de proteínas 75
4.2.4.2 Medida do dano oxidativo 76
4.2.4.3 Medidas de estresse oxidativo 76
4.2.4.3.1 Superóxido dismutase (SOD) 77
4.2.4.3.2 Catalase (CAT) 77
4.2.4.4 Mieloperoxidase (MPO) 77
4.2.5 Histologia hepática 78
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 78
5 RESULTADOS 81
5.1 MECÂNICA RESPIRATÓRIA 81
5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA 88
5.2.1 Análise qualitativa 88
5.2.2 Análise quantitativa 90
5.3 ATIVIDADE DE MPO 92
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE MCYST-LR POR ELISA 94
5.5 ENSAIOS BIOQUÍMICOS DE ESTRESSE E DANO
OXIDATIVO
96
5.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DO FÍGADO 102
6 DISCUSSÃO 105
7 CONCLUSÕES 126
8 PERSPECTIVAS 129
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 131
10 ANEXOS 151
ANEXO A Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal 151
ANEXO B Percentual de áreas normais e colapsadas em
cada animal
153
ANEXO C Atividade da enzima Mieloperoxidase em cada
animal
155
ANEXO D Análise da MCYST-LR pelo método ELISA em
cada animal
156
ANEXO E Substâncias Reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em cada animal
158
ANEXO F Atividade da enzima catalase (CAT) em cada
animal
159
ANEXO G Atividade da enzima Superóxido dismutase (SOD)
em cada animal
160
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Floração tóxica de cianobactérias 3
Figura 2 Uso recreativo da água 6
Figura 3 Desenho esquemático da molécula de MCYST-LR 9
Figura 4 Desenho esquemático do efeito de microcistinas
sobre hepatócitos e capilares sinusóides
13
Figura 5 Mecanismo proposto por Wei e colaboradores (2008) 17
Figura 6 Gênese dos novos derivados duais 27
Figura 7 Reações catalisadas pelas enzimas antioxidantes 40
Figura 8 Modelo linear uni-compartimental 46
Figura 9 Método de oclusão ao final da inspiração 48
Figura 10 Modelo de molas e amortecedores para
interpretação da mecânica do sistema respiratório
49
Figura 11 Organograma experimental 62
Figura 12 Montagem Experimental 66
Figura 13 Método de oclusão ao final da inspiração 68
Figura 14 Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para
análise histológica
72
Figura 15 Variações de pressão necessárias para vencer os
componentes resistivo, viscoelásticos/inomogêneos
pulmonares e pressão total exercida contra os componentes
viscosos e viscoelásticos do pulmão
83
Figura 16 Elastância estática do pulmão 86
Figura 17 Componente elástico da viscoelasticidade do
pulmão
87
Figura 18 Fotomicrografias de parênquima pulmonar 89
Figura 19 Fração de área de alvéolos colapsados no
parênquima pulmonar
91
Figura 20 Atividade da mieloperoxidase (MPO) no pulmão 93
Figura 21 Análise de microcistina-LR no fígado pelo método ELISA 95
Figura 22 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS)
97
Figura 23 Atividade da catalase (CAT) no pulmão 99
Figura 24 Atividade da superóxido dismutase (SOD) no
pulmão
101
Figura 25 Fotomicrografias do fígado 103
Figura 26 Fotomicrografias das vias aéreas 113
ÍNDICE DE TABELA
Tabela 1 Fluxo e volume dos animais estudados 81
ABREVIATURAS
∆E – componente elástico da viscoelasticidade
∆P – variação de pressão
∆P1 – variação de pressão relativa ao componente viscoso pulmonar
∆P2 – variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo
pulmonar
∆Ptot – variação de pressão total pulmonar
∆V – variação de volume gasoso mobilizado
AMPc – monofosfato cíclico de 3’5’ adenosina
ATP – adenosina trifosfato
CAT – catalase
CEUA – Comissão de Ética com Uso de Animais
CoQ – coenzima Q
CRF – capacidade residual funcional
Crs – complacência do sistema respiratório
Ctrl – grupo Controle
CVF – capacidade vital forçada
Dexa – grupo Dexametasona
DPOC – doença pulmonar obstrutiva crônica
E – elastância
Edyn,L – elastância dinâmica do pulmão
Est,L – elastância estática do pulmão
ERO – espécies reativas de oxigênio
GM-CSF – fator estimulante de colônia de macrófagos
GMPc – monofosfato cíclico de 3’5’guanosina
GPCR – receptores acoplados a proteína G
GPx – glutationa peroxidase
GR – glutationa redutase
GSH – glutationa reduzida
GSSG – glutationa oxidada
HClO – ácido hipocloroso
HE – hematoxilina e eosina
H
2
O
2
– peróxido de hidrogênio
HO
2
– radical hidroperoxila
IFN-γ - interferon-gama
IL - interleucina
i.p. – intraperitoneal
i.t – intratraqueal
JNK – c-Jun N-terminal protein kinase
L596 – grupo LASSBio 596
L
•
- radical alquila
LO
•
- radical alcoxila
LOO
•
- radical peroxila
LOOH – lipídeo hidroperóxido
LPA – Lesão Pulmonar Aguda
LPS - lipolissacarídeo
MCYST - microcistina
MCYST- microcistina-LR
MDA – malondialdeído
MPO - Mieloperoxidase
NADH/NADPH – nicotinamida- adenina-nucleotídeo-oxidase
OH - radical hidroxila
O
2
-
- radical superóxido
O
2 –
oxigênio molecular
P – pressão
PDE - fosfodiesterases
PEEP – pressão positiva ao final da expiração
PEF – pico de fluxo expiratório
Pel – pressão de retração elástica do pulmão
Pi – pressão pulmonar no ponto de inflexão
PL – pressão transpulmonar
Pmáx – pressão máxima ou de pico inspiratório
PMN – células polimorfonucleares
ppm – partículas por milhão
PP – proteínas fosfatases
Pres – pressão resistiva
Ptr – pressão traqueal
R – resistência do sistema respiratório
Raw – resistência de vias aéreas
Req – resistência do equipamento
Rinit,L – resistência intrínseca do pulmão
Rinit,w – resistência intrínseca da parede torácica
Rinit,rs – resistência intrínseca do sistema respiratório
SDRA – Síndrome do Desconforto respiratório Agudo
SOD – superóxido dismutase
rpm – rotações por minuto
Rtis – resistência tecidual
Rtot – resistência pulmonar total
Rrs – resistência do sistema respiratório
TBARS – Sustâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
T
I
– tempo inspiratório
TNF-α - fator de necrose tumoral alfa
Tox – grupo Toxina
V’ – fluxo aéreo
V
T
– volume corrente
WHO –
World Health Organization
1 INTRODUÇÃO
1.1 CIANOBACTÉRIAS
As cianobactérias, também conhecidas como cianofíceas ou algas-azuis, são
microrganismos com características de bactérias e algas, logo, são procariontes e
fotossintetizantes. Possuem larga variabilidade morfológica e geralmente suas células
são envolvidas por uma camada gelatinosa, que aumenta a possibilidade de
sobrevivência, mesmo em condições ambientais adversas (LEAL & SOARES, 2004;
FUNARI & TESTAI, 2008). Estima-se que tenham sido os primeiros produtores
primários de matéria orgânica a liberarem oxigênio elementar na atmosfera, tendo sua
origem datada de 3,5 bilhões de anos. Possuem grande diversidade genotípica e
fenotípica devido à ampla distribuição geográfica que apresentam (AZEVEDO, 1998;
LEAL & SOARES, 2004).
Os habitats com maior ocorrência de cianobactérias são os ecossistemas de
água doce, naturais ou artificiais, mares e águas salobras (HUMM & VICKS, 1980;
COOD, 2005; ANDRINOLO, 2008). No entanto, tais organismos também habitam
ambientes de condições extremas como fontes termais, regiões geladas ou até mesmo
regiões desérticas, onde aparecem em relações simbióticas com fungos. Sob condições
favoráveis para o crescimento (temperatura, baixa intensidade de luz e abundância de
nutrientes, como nitrogênio e fósforo), pode ocorrer o fenômeno conhecido como
floração (YOO, 1995; FUNARI & TESTAI, 2008). Neste contexto, floração significa o
intenso crescimento de cianobactérias, com dominância de uma ou poucas espécies
destes microrganismos em determinado ambiente, podendo apresentar-se como
camadas espessas de células na superfície da água (Figura 1).
Figura 1. Floração tóxica de cianobactéria.
Foto A
: Lagoa de Jacarepaguá, Rio de Janeiro,
Brasil. Foto publicada na primeira página do jornal O Globo em 13/08/01. Observe o barco
na parte inferior da foto abrindo um caminho no meio da densa camada de células.
Foto B
:
Reservatório Copco (Rio Klamath), Sacramento, Califórnia, EUA. Foto tirada por Karuk
Tribe, em matéria publicada por Matt Weiser no
The Sacramento Bee,
em 15 de agosto de
2006 (disponível em http://dwb.sacbee.com/content/news/science/story/14297374p-
15153377c.html).
O aumento na quantidade de nutrientes na água configura o processo de
eutrofização. Esse processo é intensificado, principalmente, pela atividade humana
ligada ao desenvolvimento urbano, agrícola e industrial, com despejo de esgoto nos
corpos d’água. Entretanto, há relatos pré-históricos de mortalidade de animais
atribuídas à intoxicação por cianobactérias, como a floração de
Planktothrix
no Rio Nilo,
descrita no Antigo Testamento da Bíblia. A partir destes achados, conclui-se que tais
florações já ocorrem há tempos (STEWART, 2008).
Causa especial preocupação o fato de algumas espécies de cianobactérias
serem potencialmente produtoras de toxinas, chamadas de cianotoxinas (DAWSON,
1998; FUNARI & TESTAI, 2008) O primeiro relato de intoxicação e morte de animais
relacionados à cianobactéria foi publicado em 1878, por George Francis na revista
Nature (
apud
LEAL & SOARES, 2004; STEWART, 2008), no qual a floração de
Nodularia spumigena
e o consumo acidental da água por ovelhas, cavalos, cachorros e
porcos, resultou em morte dos mesmos em até 24 horas após a exposição. Desde
então, florações tóxicas foram descritas em vários países, incluindo o Brasil (YOO,
1995; STEWART, 2008).
No Brasil, a intensa eutrofização dos ecossistemas aquáticos tem favorecido a
proliferação desses organismos, com o agravante que grande parte das cepas de
cianobactérias isoladas de corpos d’água brasileiros mostrou-se produtora de toxinas
(COSTA & AZEVEDO, 1994; DOMINGOS, 1999; SANT’ANNA & AZEVEDO, 2000).
Como muitos desses mananciais abastecem a rede pública, a liberação dessas toxinas
na água representa um risco relevante para a saúde pública.
As toxinas produzidas pelas cianobactérias são endotoxinas normalmente
liberadas quando há o rompimento celular. Por este motivo, a tentativa de controlar as
florações com o uso de algicidas agrava o problema, uma vez que provoca a lise
desses organismos, liberando as toxinas para a água. Uma característica desse grupo
reside no fato de uma mesma espécie de cianobactéria ter a capacidade de produzir
mais de um tipo de toxina, assim como podem existir cepas produtoras e cepas não
produtoras de toxinas. Os principais grupos de cianotoxinas são as dermatotoxinas,
citotoxinas, neurotoxinas e hepatotoxinas, sendo as duas últimas as mais
freqüentemente encontradas em corpos d’água (CARMICHAEL, 1997; FUNARI &
TESTAI, 2008).
As principais vias de exposição à cianotoxinas são: dérmica e oral, pelo uso
recreativo da água e o consumo de água, peixes, alimentos e suplementos à base de
microalgas. Porém, outras vias devem ser consideradas, como a inalatória e, no caso
de hemodiálise, a via endovenosa (RESSOM, 1994; LEAL & SOARES, 2004; FUNARI
& TESTAI, 2008; ANDRINOLO, 2008). Atividades aquáticas, tais como, nado, mergulho
e esqui aquático envolvem um alto risco de exposição, por via inalatória, quando
realizadas em corpos d’água contendo mais de 15.000 – 20.000 células de
cianobactérias tóxicas/mL (RESSOM, 1994) (Figura 2).
Figura 2. Uso recreativo da água.
Fotos
: Maré Vermelha na Praia do Leblon, Rio de Janeiro,
Brasil. Foto publicada na primeira página do jornal O Globo em 21 de dezembro de 2008
(disponível em http://oglobo.globo.com/rio/fotogaleria/2008/7525).
A intoxicação causada por hepatotoxinas constitui-se no tipo mais comum de
injúria causada por cianobactérias e os sinais observados após ingestão dessas toxinas
incluem prostração, anorexia, vômitos, diarréia, gastroenterite, febre, dores de garganta,
cabeça, musculares, articulares e abdominais, vertigem, irritações de pele e da mucosa
ocular, tosse seca e pneumonia atípica (CARMICHAEL & SCHWARTZ, 1984;
BEASLEY, 1989; CARMICHAEL, 2001; AZEVEDO, 2002; CODD, 2005).
Há alguns relatos, de diferentes regiões do mundo, sobre intoxicação humana
devido à ingestão de cianobactérias tóxicas, levando, inclusive, ao óbito (BILLINGS,
1981; FALCONER, 1989; CODD, 2005; FUNARI & TESTAI, 2008). Teixeira e
colaboradores (1993) descreveram possível correlação entre a ocorrência de florações
de cianobactérias no reservatório de Itaparica (Bahia) e a morte de 88 pessoas, entre
2000 intoxicadas, pelo consumo de água do reservatório, em um período de 42 dias no
ano de 1988.
1.2 MICROCISTINAS
Microcistinas (MCYST) são cianotoxinas hepatotóxicas, produzidas por algumas
espécies de cianobactérias, principalmente pela
Microcystis aeruginosa
, e estão entre
as cianotoxinas mais freqüentemente encontradas (CARMICHAEL, 1994; ANDRINOLO,
2008).
1.2.1 Estrutura Química
A estrutura química das MCYSTs foi elucidada por Botes e colaboradores (1984,
1985) como heptapeptídeos cíclicos contendo 2 L-aminoácidos variáveis e cinco D-
aminoácidos: D-aminoácido alanina (D-Ala); D-eritro-"-ácido metilaspártico (D-MeAsp);
ácido glutâmico (D-Glu);
N
-metildehidroalanina (Mdha) e (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-
metoxi-10-fenil-2,6,8-trimetildeca-4,6-ácido dienóico (Adda). Esses dois últimos são
tidos como aminoácidos incomuns (DAWSON, 1998; FUNARI & TESTAI, 2008)
A estrutura das MCYSTs pode variar nos grupos metil e na natureza de seus
dois L–aminoácidos, resultando em cerca de 80 variantes (PRIETO, 2006; KUJBIDA,
2008; WANG, 2008). Tais modificações trazem consequências para a estrutura terciária
da molécula, gerando diferenças significativas de toxicidade e propriedades
hidrofóbicas/hidrofílicas (RINEHART, 1994; GULLEDGE, 2002). Na figura 3 estão
destacados os dois L-aminoácidos da molécula de microcistina-LR (MCYST-LR), no
caso a leucina (L) e a arginina (R). A estrutura química das MCYSTs possibilita sua
estabilidade em água, podendo resistir a grandes variações de temperatura e de pH
(DAWSON, 1998).
Figura 3. Desenho esquemático da molécula de microcistina-LR. Estão destacados os
dois L-aminoácidos variáveis (L = leucina e R = arginina). D-Ala (D-aminoácido
alanina); D-MeAsp (D-eritro-"-ácido metilaspártico); D-Glu (ácido glutâmico); Mdha
(
N
-
metildehidroalanina); Adda [(2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-
trimetildeca-4,6-ácido dienóico]. Adaptado de CARMICHAEL (1994).
O aminoácido Adda é essencial para a atividade biológica e hepatotoxicidade
das MCYSTs, além de conferir hidrofobicidade à molécula (HARADA, 1990a,b; CHOI,
1993). Dahlem (1989) demonstrou que a remoção deste aminoácido reduz
consideravelmente a toxicidade da MCYST-LR. Outra importante característica para a
toxicidade das MCYSTs é conferida pela presença de um ácido carboxílico livre na
unidade D-Glu (STOTTS, 1993). Foi demonstrado para as MCYSTs que a toxicidade de
uma cepa depende da mesma possuir, ou não, o gene para a produção de MCYSTs.
1.2.2 Farmacocinética
As MCYSTs são moléculas hidrofílicas e não há indícios de que essas toxinas
atravessem a membrana celular por simples difusão, requerendo um mecanismo de
captação ativo (RUNNEGAR, 1991, LEAL & SOARES, 2004). No fígado, essas
moléculas são captadas pelo sistema de transporte do ácido biliar. Esse fato foi
comprovado por meio da observação
in vitro
de que o influxo de MCYST no hepatócito
reduz-se de forma concentração-dependente na presença de sais biliares. (ERIKSSON,
1990). Esse mecanismo de entrada celular explicaria uma provável especificidade e
afinidade das MCYSTs pelo fígado (MORENO, 2005). No entanto, estudos
in vitro
mostraram que a MCYST-LR é capaz de gerar o mesmo grau de lesão em hepatócitos,
células epiteliais renais e fibroblastos, após 4 minutos, 1 ou 8 horas, respectivamente
(KHAN, 1995). Por outro lado, Wang e colaboradores (2008) analisaram a distribuição
temporal por via intravenosa, das MCYSTs-LR e RR em diversos órgãos e observaram
que a maior concentração dessas toxinas encontrava-se nos rins, seguida pelo pulmão,
estômago, fígado e uma pequena quantidade no coração de ratos Wistar. Acredita-se
que a MCYST é capaz de entrar na célula por pinocitose e as diferenças observadas
in
vivo
e
in vitro
devem-se ao mecanismo de captação mais demorado em outros tipos
celulares, em relação aos hepatócitos (RUNNEGAR, 1993).
Outra importante característica é a rapidez do transporte dessa toxina. Em
experimentos
in vivo
, utilizando camundongos, foi administrada MCYST [
14
C]
intraperitonealmente (i.p.). Após 1 minuto, 70% deste marcador radioativo já se
localizava no fígado, aumentando para 90% 3 horas após a exposição (BROOKS &
CODD, 1987). Em estudos posteriores onde [
3
H]-MCYST-LR foi injetada também i.p.,
novamente grande concentração do marcador foi encontrada no fígado. (ROBINSON,
1989, 1991a).
A dose letal para 50% dos camundongos injetados i.p. com MCYST-LR (DL
50
)
varia de 50 a 100 µg/kg de peso corpóreo (WHO, 1998). Tal variação se deve a
diferenças de idade, sexo, raça e condições fisiológicas dos animais. A morte ocorre
entre 1 e 3 horas após a administração de MCYST (WATANABE, 1996). Já a DL
50
oral
apresenta valores de 50 a 170 vezes mais altos do que a DL
50
i.p.. No entanto, não há
evidências de que a MCYST seja hidrolisada por peptidases gástricas. Pouco se sabe
acerca dos processos de absorção gastrointestinal desta toxina, mas, aparentemente,
uma quantidade significativa consegue ultrapassar a barreira intestinal e ser absorvida
(CHORUS & BARTRAM, 1999).
1.2.3 Mecanismo de Ação
Diversos autores demonstraram os efeitos tóxicos das MCYSTs em grupos
variados de organismos, incluindo peixes e mamíferos (BURY, 1997; MIURA, 1989).
Sua bioacumulação também já foi bem caracterizada em zooplâncton, peixes,
crustáceos e moluscos (FERRÃO-FILHO, 2002b; MAGALHÃES, 2003; LEAL &
SOARES, 2004; IBELINGS & CHORUS, 2007).
No fígado, essas moléculas inibem as proteínas fosfatases (PP) da família
serina/treonina, especialmente as PP1 e 2A dos hepatócitos, podendo levar ao óbito ou
intoxicação crônica, inclusive induzindo o aparecimento de tumores hepáticos por
proliferação celular (FUGIKI, 1992; NISHIWAKI-MATSUHIMA,1992; CODD, 2005;
KUJBIDA, 2006). Nas células eucarióticas, a maior parte da fosforilação protéica ocorre
em resíduos de serina e treonina. Portanto, o papel das fosfatases do grupo PP1 e PP2
é crucial, uma vez que estas enzimas são responsáveis por grande parte da atividade
fosfatásica celular. A ligação MCYST-PPase ocorre em duas etapas principais:
inicialmente, o aminoácido hidrofóbico Adda das MCYSTs ocupa o sítio ativo das PP
por ligação não-covalente, produzindo o efeito inibitório da toxina. Em seguida, o
aminoácido Mdha liga-se covalentemente ao resíduo de cisteína 273 das PP
(HONKANEN & GOLDEN, 2002).
A inibição de PP por MCYSTs aumenta a fosforilação de diversos alvos
subcelulares, inclusive proteínas do citoesqueleto e proteínas associadas ao mesmo,
provocando o seu desarranjo. Conseqüentemente, as células hepáticas tendem a se
arredondar, se separam e perdem sua estrutura normal. Também ocorre rompimento
dos sinusóides hepáticos, com extravasamento de sangue para o espaço intersticial
(Figura 4). Não há evidências de que o rompimento dos capilares sinusóides esteja
relacionado aos efeitos da MCYST nas células endoteliais. Considera-se que o
rompimento dos sinusóides seja uma conseqüência das alterações provocadas por
essas toxinas na estrutura dos hepatócitos (FALCONER, 1981; HOOSER; 1990;
WICKSTROM, 1996).
Figura 4. Desenho esquemático do efeito de microcistinas sobre hepatócitos e capilares
sinusóides. Retirado de CARMICHAEL (1994).
Dependendo do tempo de exposição e da dose de MCYST, podem ocorrer
efeitos agudo e crônicos, em animais e humanos (CHORUS & BARTRAM, 1999). Na
intoxicação aguda, observa-se necrose hemorrágica extensa, desestruturação dos
sinusóides e mudanças no formato celular, peroxidação lipídica, estresse oxidativo,
apoptose e morte em poucas horas (MIURA, 1989; WENG, 2007). Na hemorragia intra-
hepática, o sangue retido no fígado faz com que o órgão duplique de peso, levando à
morte por choque hipovolêmico ou falência hepática (CARMICHAEL, 1994). A
intoxicação crônica promove dois desfechos principais: lesão hepática progressiva, e
tumor hepático pré-neoplásico (GUPTA, 2003, FUNARI & TESTAI, 2008).
Experimentalmente, o crescimento de tumores apresenta efeitos contraditórios:
apoptose e proliferação celular (KUJBIDA, 2006). Gehringer (2004) afirma que doses
mais altas levam à apoptose e doses mais baixas promovem proliferação celular.
Portanto, a exposição prolongada a doses baixas de MCYSTs pode favorecer o
surgimento de câncer hepático.
1.2.4 Síndrome de Caruaru
O primeiro caso confirmado de morte humana por intoxicação por MCYST
ocorreu na cidade de Caruaru (1996), estado de Pernambuco, onde mais de 130
pacientes renais crônicos foram intoxicados e 60 morreram devido à exposição do
circuito de hemodiálise à água contendo MCYST (JOCHIMSEN, 1998; CARMICHAEL,
2001; AZEVEDO, 2002; FUNARI & TESTAI, 2008). A região sofria de uma forte seca e
os reservatórios que abasteciam a cidade apresentavam intensa floração de
cianobactérias. O insuficiente abastecimento de água levou as clínicas de hemodiálise
da cidade a buscarem água diretamente destes reservatórios, transportada por
caminhões. Entretanto, a adição de cloro nesses caminhões para tratar a água resultou
em lise das cianobactérias e liberação da toxina na água. Na clínica, o tratamento dado
à água mostrou-se inadequado, já que os sistemas de colunas de troca iônica e carvão
ativado não estavam em condições adequadas de uso e, assim, não puderam reter as
toxinas. Este fato ficou conhecido como “Síndrome de Caruaru”
A preocupação mundial com os riscos impostos pela ocorrência de
cianobactérias em corpos d’água utilizados para o abastecimento público refletiu-se na
criação de legislações específicas, visando ao aperfeiçoamento do controle da
qualidade da água, incluindo o monitoramento de cianobactérias e cianotoxinas. A
Organização Mundial de Saúde estabeleceu em 1 µg/L/dia o nível máximo de
microcistinas na água para consumo. O Brasil foi o primeiro país a estabelecer tal
medida, por meio da portaria 1469 de 29 de dezembro do Ministério da Saúde (2000),
posteriormente substituída pela portaria 518 (2004).
1.3 MICROCISTINAS E ESTRESSE OXIDATIVO
De acordo com Watanabe e colaboradores (1996), embora a ação clássica das
MCYSTs seja através da inibição das PP1 e 2A, há evidências demonstrando que o
dano oxidativo tem um papel importante na sua toxicidade. Alguns trabalhos mostram
que MCYSTs podem induzir a formação intracelular de espécies reativas de oxigênio
(ERO), lesão celular e peroxidação lipídica, causando lesão ao fígado por meio do
estresse oxidativo (ver 1.8.1) (DING, 1998a,b; DING & ONG, 2003; KUJBIDA, 2006,
2008; WENG, 2007; ZEGURA, 2006; ATENCIO, 2008).
Diversos trabalhos demonstram que o estresse oxidativo tem um papel
importante na toxicidade induzida por MCYST-LR. Em 2005, Moreno e colaboradores
realizaram o primeiro estudo que mediu a atividade das enzimas antioxidantes
(superóxido dismutase-SOD, catalase-CAT, glutationa peroxidase-GPx e glutationa
redutase-GR) e a peroxidação lipídica, produzida após administração aguda de
MCYST-LR intraperitoneal (i.p.) no fígado e rim de ratos. Os resultados mostraram uma
redução das enzimas e um aumento da peroxidação lipídica em ambos os órgãos, mais
acentuadamente no fígado. Posteriormente, outros autores seguiram nessa linha de
pesquisa e obtiveram resultados semelhantes em camundongos, peixes e eritrócitos
humanos (JAYARAJ, 2006; SICINSKA, 2006; WENG, 2007; ATENCIO, 2008).
Em resumo, sabe-se que a intoxicação por MCYST-LR leva à lesão hepática,
aumentando as ERO e, conseqüentemente, gerando estresse oxidativo. Nesse
contexto, Wei e colaboradores em 2008 propuseram que a MCYST-LR causa lesão ao
fígado por meio do acúmulo de ERO e peroxidacao lipídica, levando ao estresse
oxidativo. O estresse oxidativo, por sua vez, via JNK (c-Jun N-terminal protein kinase),
estimula Bid e AP-1 (substratos da JNK) levando à disfunção mitocondrial e apoptose
do hepatócito (Figura 5).
Figura 5. Mecanismo proposto por WEI e colaboradores (2008). Microcistina-LR gerando lesão
hepática pela produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), levando a disfunção
mitocondrial, conseqüente apoptose, culminado com a lesão hepática. (JNK, c-Jun N-terminal
protein kinase; Bid e AP-1, substratos da JNK)
MCYST-LR
Produção de ERO e
peroxidação lipídica
Ativação da JNKc
Bid AP-1
Disfunção mitocondrial
Ativação
caspase-3 e caspase-9
Apoptose
Lesão Hepática
Embora a ação clássica das MCYSTs seja pela inibição das PP1 e 2A, as
MCYSTs também ativam enzimas que participam da via metabólica do ácido
aracdônico, como fosfolipase A
2
e cicloxigenase, que, por sua vez, induzem a produção
dos mediadores inflamatórios: tromboxano A
2
(indutor de agregação plaquetária) e
prostaglandina I
2
. Além disso, alguns estudos demonstraram que MCYSTs têm a
capacidade de estimular macrófagos peritoniais a produzirem TNF-# (fator de necrose
tumoral–#) e IL-1 (interleucina-1). Desta forma, é possível que macrófagos hepáticos
(células de Kupffer) respondam às MCYSTs, produzindo mediadores inflamatórios, e
que esse processo inflamatório no fígado contribua para a patogênese e letalidade
(WATANABE
et al
. 1996). De acordo com o descrito, alguns autores sugerem que a
intoxicação ocorre a partir de um processo inflamatório (CARMICHAEL
,
2001; NOBRE,
2001, 2003; KUJBIDA, 2006), no qual foi encontrado infiltrado inflamatório composto
predominantemente de leucócitos polimorfonucleares (PMN) no fígado das vítimas da
“Síndrome de Caruaru”. Sabe-se que a MCYST-LR inibe as PP1 e 2A dos hepatócitos;
isto leva à ativação da proteína quinase C, que por sua vez ativa enzimas que
participam da via metabólica do ácido aracdônico e os PMN. PMN estimulam a
produção de ERO e entram em processo de degranulação, liberando principalmente a
enzima mieloperoxidase (enzima lisossomal envolvida na atividade bactericida dos
PMN). Ambos induzem a inflamação por meio da ativação do fator de transcrição NF-
kB, que controla a formação de citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão, levando
à lesão celular e doença hepática.
De acordo com o exposto, o aspecto histopatológico do fígado é: desarranjo
hepatocelular, perda da arquitetura hepática, alto grau de hepatócitos binucleados ou
multinucleados, vacuolização citoplasmática, esteatose hepática, hepatócitos
hipertróficos, cariomegalia, inflamação, necrose, apoptose, fibrose centro-lobular e
colestase (RUNNEGAR, 1987; THEISS, 1988; DAWSON, 1998; GUPTA, 2003;
ANDRINOLO, 2008).
1.4 EFEITOS DA MICROCISTINA NO PULMÃO
Os efeitos de doses sub-letais de MCYSTs não se restringem aos danos
causados ao fígado, sendo também observadas lesões em outros órgãos, como
pulmão, rim, intestino, estômago, gônadas, coração e cérebro (WANG, 2008).
Há poucos trabalhos analisando os efeitos das MCYSTs no pulmão, apesar
deste ser um órgão que pode ser exposto às toxinas tanto pela via aérea quanto pela
circulação sanguínea. Os pulmões são particularmente vulneráveis às lesões
inflamatórias, por um lado (via direta), porque mantêm contato com o meio externo e,
por outro lado (via indireta), porque os mediadores são liberados na circulação e os
pulmões recebem a totalidade do débito cardíaco. Como conseqüência, leucócitos são
atraídos, tornam-se ativados, liberando mediadores inflamatórios que lesam
diretamente o epitélio alveolar e/ou o endotélio vascular, propagando o processo
inflamatório (MARTIN, 1999).
Em 1945 foi relatada a morte de animais silvestres e domésticos após o
consumo da água de um lago na Província de Manitoba, no Canadá, que continha
floração de cianobactérias. A água foi então coletada e doses experimentais foram
administradas pelas vias oral e i.p. a roedores, os sinais clínicos foram: perda de
equilíbrio, paralisia progressiva, espasmos musculares e disfunção respiratória, levando
à cianose com morte subseqüente entre 12 e 65 horas após a administração. Este foi o
primeiro relato relacionando uma floração tóxica de cianobactérias e o prejuízo ao
sistema respiratório, entretanto, não houve comprovação de que a floração foi de
microcistinas (McLEOD & BONDAR, 1952).
Alguns estudos experimentais e relatos de doenças em humanos fornecem fortes
indícios de que a via aérea é uma importante porta de entrada para as MCYSTs. Ito e
colaboradores (2001) mostraram que as MCYSTs podem alcançar o pulmão, sendo
absorvidas de forma rápida por via direta. Uma única administração de dose sub-letal
de MCYST-LR via intratraqueal (i.t.) em camundongos levou à presença desta toxina no
tecido pulmonar por 7 horas. Outros trabalhos sobre a exposição por inalação
verificaram necrose extensa do epitélio da mucosa, tanto da via respiratória quanto
olfatória, com presença de infiltrado neutrofílico e degeneração, bem como necrose e
atrofia das células epiteliais olfatórias de camundongos (FITZGEORGE, 1994;
BENSON, 2005).
A exposição por inalação a essas toxinas assume maior relevância quando se
considera o uso recreativo da água com florações de cianobactérias. Partículas de água
contaminada podem ser inaladas, em especial pelo
spray
lançado por lanchas e
jet
skis
. Turner e colaboradores (1990) descreveram episódio em que recrutas no Reino
Unido deram entrada no hospital com quadro de pneumonia basal esquerda, 5 dias
após exercícios de canoagem em um reservatório com alta concentração de células de
Microcystis aeruginosa
. Também foram observados inflamação da faringe, tosse seca,
vômito e dor abdominal. A floração de cianobactéria era comprovadamente tóxica
(células produtoras de MCYST-LR) e os autores acreditaram ter sido essa a razão mais
plausível para o quadro clínico observado.
Em um dos primeiros trabalhos citando os efeitos da MCYST no pulmão, Slatkin
e colaboradores (1983) observaram que camundongos injetados i.p. com altas doses
de MCYST-LR apresentaram trombose pulmonar atípica. Em 2003, Gupta e
colaboradores conduziram um estudo comparando a toxicidade de três variantes de
MCYST pela via i.p. na dose de 1 LD
50
. A histologia pulmonar evidenciou lesões
predominantemente nos brônquios e parênquima pulmonar, além de inflamação,
congestão e hemorragia. Por outro lado, as variantes de MCYST causaram morte
abrupta, sem alterações significativas das variáveis respiratórias analisadas, mostrando
que tais toxinas não possuem um efeito direto sobre o sistema respiratório de
camundongos.
Recentemente, foi descrito pelo nosso grupo um processo inflamatório no
pulmão de camundongos, causado pela injeção i.p. de dose sub-letal (40 µg/kg) do
extrato aquoso obtido de uma linhagem tóxica da
Microcystis aeruginosa
. A inflamação
teve como característica um início rápido (2 horas após a injeção), que persistiu mesmo
após 96 horas de estudo, caracterizada na histologia pulmonar por edema intersticial e
recrutamento de células inflamatórias, além de colapso alveolar (PICANÇO, 2004). No
entanto, a presença de metabólitos secundários no extrato poderia ter contribuído para
os resultados observados. Posteriormente, as alterações pulmonares foram
confirmadas em estudo utilizando a toxina purificada. (SOARES, 2007). Nesse trabalho
foram evidenciadas alterações da função pulmonar com aumento dos parâmetros da
mecânica respiratória e da resposta inflamatória, representada por edema intersticial e
recrutamento de células inflamatórias, em um modelo de exposição a doses sub-letais
em camundongos.
1.5 TRATAMENTO DA LESÃO PULMONAR INDUZIDA POR MCYST-LR
Não existem trabalhos na literatura que mostrem o tratamento da lesão pulmonar
induzida por MCYST-LR. No entanto, alguns mostram o tratamento da lesão hepática
de maneira profilática (RAO, 2004).
Adams e colaboradores (1989) investigaram oito fármacos, de forma profilática,
que afetavam a função de macrófagos. Os componentes foram administrados a
camundongos Suíços 1 h, 1 dia ou 1 semana antes de uma dose letal de 100 µg/kg de
MCYST-LR. Dos compostos estudados, apenas um, o vermelho de tripano, mostrou-se
eficaz, fornecendo proteção contra a morbidade e mortalidade por até três meses.
Ciclosporina A e rifampicina possuem atividades biológicas relevantes, além de
serem imunossupressores e agentes ativos de membrana. Por isso, Hermansky e
colaboradores (1990a) estudaram a ciclosporina A (10 mg/kg) administrada 0,5 a 3
horas antes da intoxicação com 100 µg/kg de MCYST-LR e descobriram que tal
composto forneceu proteção completa aos camundongos. Quando a droga foi
administrada junto ou após a MCYST-LR, não houve efeito protetor.
Rifampicina é um derivado semi-sintético da rifampicina B, que é um antibiótico
produzido por
Streptomyces mediterranei
. É muito usada contra a tuberculose e outras
infecções bacterianas em humanos (MANDELL & SANDE, 1990). Foi conduzido um
estudo administrando-se rifampicina profilaticamente (intragástrico) a camundongos que
receberam dose letal de MCYST-LR e foi observada proteção a todos os animais.
Quando mudada a via de administração (i.p. ou oral) e aumentada a dose de MCYST-
LR, também foi evidenciada proteção dos animais (WANNEMACHER, 1990). Ainda em
1990, Hermansky
,
(1990b), conduziu um trabalho somente com rifampicina (25 mg/kg
i.p.) administrada antes, durante e depois da exposição de camundongos à MCYST-LR
e mostrou a eficácia do medicamento tanto de forma profilática como terapêutica.
Em 1991, o mesmo grupo (HERMANSKY, 1991) associou ambas as drogas
citadas com outros agentes (indutores de enzimas, bloqueadores de canais de cálcio,
antioxidantes, compostos ativos hepáticos e da glutationa) administrados antes e
durante a intoxicação com 100 µg/kg de MCYST-LR em camundongos. Os agentes que
apresentaram os melhores resultados foram: a glutationa, os antioxidantes: vitamina E e
silimarina e os compostos ativos hepáticos: rifampicina e ciclosporina A.
Por outro lado, Rao e colaboradores (2004) estudaram as três drogas mais
usadas até o momento, após intoxicação por MCYST-LR. Foram utilizadas ciclosporina-
A (10 mg/kg), rifampicina (25 mg/kg) e silimarina (400 mg/kg) profilaticamente em
camundongos injetados com 100 µg/kg de MCYST-LR. Após análises bioquímicas,
enzimáticas e imunohistoquímicas foi observado que todos os tratamentos protegeram
os animais da morte. No entanto, as manifestações tóxicas permaneceram e não foram
revertidas até 7 dias após a exposição a MCYST-LR.
Trabalho com glicocorticóides (fluocinolona, dexametasona e hidrocortisona, na
dose de 1 µM) em hepatócitos de ratos, também de forma profilática, mostrou
benefícios na intoxicação induzida por MCYST, no sentido de inibir a liberação de
mediadores inflamatórios (NASSEM, 1990).
Nobre e colaboradores (2001) estudaram o pré-tratamento com dexametasona
(20 µg/mL) e indometacina (10 µg/mL) na toxicidade renal induzida por MCYST-LR e
mostraram que eram eficazes na manutenção das condições fisiológicas e histológicas
deste órgão. Em 2003, o pré-tratamento com ciclohexamida, quinacrina, talidomida e
dexametasona em rins de ratos, perfundidos com o sobrenadante de macrófagos
estimulados com MCYST-LR, mostrou eficácia. (NOBRE, 2003).
Uma recente linha de pesquisa estuda o tratamento da intoxicação por MCYST-
LR com antioxidantes exógenos, administrados previamente (WENG, 2007; JAYARAJ,
2007; PRIETO, 2008). Weng e colaboradores (2007) estudaram o papel das ERO na
apoptose e lesão hepática após injeção de 60 µg/kg de MCYST-LR em camundongos.
O autor incluiu em seu trabalho dois grupos pré-tratados oralmente com vitamina C e
vitamina E respectivamente, demonstrando significativa redução na geração de ERO e
sugerindo o efeito protetor destes antioxidantes na lesão hepática. Prieto e
colaboradores (2008) também utilizaram vitamina E previamente a uma dose oral de
MCYST-LR em peixes e mostraram o potencial profilático deste antioxidante. Jayaraj e
colaboradores (2007) administraram 3 flavonóides diferentes antes de injeção com
MCYST-LR (57,5 µg/kg) a camundongos e observaram reversão dos efeitos
hepatotóxicos.
Algumas intervenções agressivas foram relatadas, como transfusão sanguínea
para corrigir o desequilíbrio eletrolítico e administração de anticonvulsivantes no manejo
dos sintomas, mas ambos, com pouco benefício aparente (BEASLEY, 1989; CORKILL,
1989).
1.6 DEXAMETASONA
A dexametasona é um corticosteróide da classe dos glicocorticóides que atua
controlando o metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas. Seu principal efeito
se refere a uma alteração na resposta imune linfocitária, representada pela ação
antiinflamatória e imunossupressora, proporcionando alívio sintomático. Algumas das
ações antiinflamatórias dos glicocorticóides resultam dos efeitos inibitórios sobre a
síntese de prostaglandinas. Além disso, podem inibir a produção de determinadas
citocinas, incluindo o TNF-α e as interleucinas. A resposta antiinflamatória ocorre por
ação local, tanto na fase precoce (edema, dilatação capilar, migração de leucócitos,
atividade fagocitária), quanto na fase tardia do processo inflamatório (proliferação
capilar e de fibroblastos, deposição de colágeno e cicatrização) (DAMIANI, 2001).
Os corticosteróides são essencialmente metabolizados no fígado, mas, também,
em outros tecidos. A lenta metabolização dos corticosteróides sintéticos, como a
dexametasona, associada a uma baixa ligação às proteínas plasmáticas explica a
elevada potência e a longa duração de ação comparada com os corticosteróides
naturais. (MAMMEL, 1983; YEH, 1998; HACK & FANAROFF, 1999; O’SHEA, 1999;
RADEMAKER, 2007; DRUMMOND, 2008).
A dexametasona é um dos principais compostos glicocorticóides utilizados
experimentalmente. No tocante à intoxicação por microcistina, a dexametasona já foi
utilizada com comprovada eficácia, mediante aplicação profilática (NOBRE, 2001,
2003). Alguns autores demonstraram que a dexametasona suprimiu a liberação de
ácido aracdônico, prostaciclina e tromboxano em hepatócitos de ratos intoxicados com
MCYST-LR. Rocha e colaboradores, em 2000, verificaram que a dexametasona
bloqueou a resposta intestinal eletrogênica na mucosa ileal de ratos contaminados por
MCYST. Já foi demonstrado que a MCYST-LR pode afetar a fisiologia renal, alterando
parâmetros vasculares, glomerulares e urinários (NOBRE, 1999). Entretanto, esse
mesmo grupo verificou que, dentre outros efeitos, a dexametasona bloqueava as
alterações renais (NOBRE, 2001,2003). Nesse sentido, cabe ressaltar que nenhum
trabalho analisou efeitos terapêuticos da dexametasona no pulmão, frente à agressão
por microcistina.
1.7 LASSBio 596
O LASSBio 596 é um híbrido da talidomida modificada e do sildenafil,
desenvolvido pelo Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas
(LASSBio) da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, que
inibe as fosfodiesterases 4 e 5 (PDE-4 e 5) e o TNF-α (LIMA, 2002).
O LASSBio 596 foi desenhado por modificação molecular na estrutura da
talidomida, visando a otimização das suas propriedades farmacoterapêuticas e
eliminação dos efeitos teratogênicos desse fármaco. Desta feita, LASSBio 596 foi
planejado aplicando-se a estratégia de hibridação molecular entre os protótipos
talidomida [1], sulfonamida [2] e do sildenafil [3], descritos como inibidores de TNF-α,
PDE-4 e PDE-5, respectivamente (Figura 6).
Figura 6. Gênese dos novos derivados duais (4a-e, LASSBio 468; 5a-e, LASSBio 595;
6a-e, LASSBio 596), inibidores de fosfodiesterases (PDEs) e das ações do TNF-α,
desenhados pela hibridação molecular entre os protótipos talidomida (1), arilsulfonamida
(2) e sildenafil (3).
A alteração estrutural da molécula do LASSBio 596 levou à retirada do anel
glutarimídico (responsável pelos efeitos teratogênicos da talidomida) e do anel
responsável pelo priaprismo do sildenafil. Dessa forma, possivelmente os eventuais
efeitos teratogênicos serão evitados. Em função de sua potência inibitória das PDE-4 e
5 ser da ordem de 50% na concentação de 300 µM, possivelmente, o LASSBio 596 não
apresenta os efeitos indesejáveis observados com o uso clínico dos demais inibidores
de fosfodiesterases testados no tratamento da asma, Síndrome do Desconforto
Respiratório Agudo (SDRA) e da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). Seu
valor como antiinflamatório decorre de ação sobre a catabolização do AMPc e do GMPc
e sobre a modulação do TNF-α (LIMA, 2002).
O estabelecimento do envolvimento dos segundos mensageiros nucleotídeos
cíclicos na sinalização celular e homeostase fez com que a regulação dessa via pelos
inibidores de fosfodiesterase (iPDE) se tornasse uma área de considerável interesse
(ESSAYAN, 2001).
As fosfodiesterases (PDE) constituem uma família de enzimas responsáveis pela
degradação dos nucleotídeos cíclicos - monofosfato cíclico de 3´5´-adenosina (AMP
cíclico) e monofosfato cíclico de 3´5´-guanosina (GMP cíclico) – levando à formação do
AMP e do GMP. Essas duas moléculas influenciam um grande número de processos
celulares, incluindo a produção e a ação de mediadores inflamatórios, a função dos
canais iônicos, a contração muscular, a diferenciação celular, a apoptose, a lipogênese,
a glicogenólise e a gliconeogênese. O AMPc é um mensageiro secundário intracelular
ubíquo, que medeia respostas a diversos hormônios, a fatores de crescimento e a
neurotransmissores. Por ser um agente importante na regulação de respostas
relacionadas aos mecanismos patogenéticos de diversas doenças, tem sido alvo de
diferentes intervenções terapêuticas. O AMPc é produzido por uma família de enzimas
denominadas
adenilato cliclases
(AC), que convertem a adenosina trifosfato (ATP) em
AMPc. As adenilato cliclases estão distribuídas diferentemente entre os vários tecidos,
células e localizações intracelulares, gerando diferenças na regulação da síntese do
AMPc (HURLEY, 1999). A atividade da adenilato ciclase, por sua vez, é regulada pelas
proteínas G, as quais são ativadas por uma grande família de receptores denominados
receptores acoplados da proteína G (GPCR). Dessa forma, quando um agonista se liga
ao GPCR, o receptor ativa as proteínas Gs, que por sua vez ativam a AC, levando à
produção de AMPc (NEVES, 2002).
Uma vez produzido, o AMPc passa a ativar uma série de mecanismos em
cadeia. O mais importante deles envolve a proteínoquinase A (PKA). Quando ativada
pelo AMPc, a PKA fosforila um grande número de substratos protéicos, modulando a
função celular (FIMIA, 2001). A ativação do AMPc também desencadeia um mecanismo
que leva à sua inativação através das PDE.
Até o momento, mais de cinqüenta isoformas de PDE foram identificadas,
agrupadas em onze famílias, e suas concentrações variam nos diferentes tecidos
(CLAYTON, 2004).
A possibilidade farmacológica de modular seletivamente a elevação intracelular
do AMPc favorece o potencial terapêutico para o uso dos inibidores de PDE (iPDE).
Uma outra perspectiva terapêutica para os iPDE advém do fato de eles serem capazes
de modificar a resposta inflamatória através da modulação seletiva da produção de
citocinas pró-inflamatórias. A inibição seletiva da PDE1 bloqueia a síntese de IL-6 sem
inibir o TNF-α. A inibição da PDE3 bloqueia a produção da IL-6 e atenua a produção de
TNF-α. Inibindo a PDE4 ou a PDE5, a produção de IL-6 também fica bloqueada, mas o
efeito sobre o TNF-α mostra-se bifásico, ou seja, excitatório /inibitório. A inibição da
PDE3 e da PDE4 atenua a proliferação de músculo liso na camada íntima dos vasos e
inibe a proliferação de músculo liso na via aérea (BILLINGTON, 1999). A inibição
simultânea das PDE5, 6 e 9 reduz, de modo dose-independente, a síntese da IL-6 e do
TNF-α. Finalmente, a inibição não seletiva de PDE pela pentoxifilina suprime a secreção
de IL-6 e TNF-α.
A substância avaliada no presente estudo é um inibidor específico de baixa
potência, das fosfodiesterases (PDE) 4 e 5. A família PDE4 compõe-se por quatro
subtipos (A, B, C e D). Cada subtipo é produto de um gene diferente, localizado em três
cromossomos (MILATOVICH, 1994; SZPIRER, 1995). Todos os subtipos são
específicos para o AMPc, mas diferem na distribuição tecidual, celular e subcelular, e
também na sensibilidade aos inibidores. A PDE4 representa a PDE predominante nas
células imunes e nas células inflamatórias, incluindo os mastócitos, eosinófilos,
macrófagos, linfócitos T e célula muscular lisa do pulmão. A elevação do AMPc
intracelular foi relacionada com a inibição da função de vários tipos de células, incluindo
linfócitos, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos, basófilos, células
endoteliais e células epiteliais do pulmão (NICHOLSON, 1991; NICHOLSON &
SHAHID, 1994). As ações supressivas dos iPDE4 incluem: 1) a inibição da geração de
citocinas importantes na maturação e no recrutamento de linfócitos T e de eosinófilos
(IL-2, IL-4, IL-5 e fator estimulante de colônias de macrófagos- GM-CSF) e 2) a inibição
da produção e a liberação de citocinas pró-inflamatórias e de quimiocinas (TNF-α,
interferon gama- IFN-γ , IL-8 ) (TORPHY, 1998; AU, 1998). Mais ainda, os inibidores da
PDE4 reduzem a produção de espécies reativas de oxigênio e de mediadores pró-
inflamatórios pelos basófilos, neutrófilos e eosinófilos, assim como atenuam a
degranulação dessas células (TORPHY, 1998). Inibidores seletivos das PDE4 reduzem
ou abolem a migração de eosinófilos e de neutrófilos para o pulmão em resposta a
antígenos, a histamina e a lipopolissacarídeo de membrana (LPS) (BARNETTE, 1996a;
TEIXEIRA, 1997; TORPHY, 1998). É possível que os inibidores da PDE4 possam ter
efeitos sobre o remodelamento brônquico (WONG & LEONG, 2004). As PDE4 e 5
predominam nas células do epitélio brônquico.
A PDE5 catalisa a hidrólise do GMPc com absoluta especificidade. O GMPc é o
transdutor de sinal para o relaxamento endotelial mediado pelo óxido nítrico e para a
diurese mediada pelo fator natriurético arterial. A elevação do GMPc via inibição da
PDE5 estimula o relaxamento endotelial e a diurese, ação combinada útil no tratamento
da hipertensão arterial e da insuficiência cardíaca congestiva (SYBERTZ &
CZARNIECKI, 1997). Os estudos com iPDE5 em modelos de doença cardiovascular
mostraram que eles são capazes de reduzir a pressão arterial pulmonar com efeitos
mínimos sobre a freqüência cardíaca, fazendo deles uma nova classe de
vasodilatadores pulmonares (SAEKI & TAKESE, 1996). Pauvert e colaboradores (2002)
demonstraram que as PDE3, 4 e 5 são as principais enzimas envolvidas no controle do
tônus vascular da artéria pulmonar. A inibição da PDE5, com conseqüente aumento do
GMPc, promove o relaxamento da musculatura lisa da via aérea (RYBALKIN, 2003),
além de ter reduzido substancialmente o edema pulmonar em um modelo de
transplante pulmonar (KOROM, 2006).
O mecanismo preciso pelo qual o LASSBio 596 atenua a inflamação no pulmão
não é conhecido, mas há evidências de que iPDE4 e 5 podem inibir a liberação de
citocinas inflamatórias (SEKUT, 1995; MIOTLA, 1998), regular negativamente
moléculas de adesão celular (ESSAYAN, 2001), inibir a migração de leucócitos
(SEKUT, 1995; MIOTLA, 1998) e a função de diversas células envolvidas no processo
inflamatório (macrófagos alveolares, neutrófilos, linfócitos e monócitos) (SEKUT, 1995;
MIOTLA, 1998; ESSAYAN, 2001) e aumentar a produção de citocinas antiinflamatórias
pelos macrófagos. Em um estudo sobre seu valor na lesão pulmonar aguda (LPA)
induzida por lipolissacarídeo (LPS) de
Escherichia coli
, o LASSBio 596 preveniu as
alterações na mecânica pulmonar, evitando a redução do calibre das vias aéreas
centrais, a liberação de TNF-α, o colapso alveolar e a deposição de fibras colágenas no
septo alveolar (ROCCO, 2003). É possível que a ação benéfica do LASSBio 596 sobre
a função pulmonar se deva à inibição da PDE4, que levaria ao relaxamento da
musculatura lisa da via aérea, à modulação da atividade neural pulmonar e à supressão
da ativação de células inflamatórias. Nesse estudo de Rocco e colaboradores foi
demonstrado, também, que o papel antiinflamatório do LASSBio 596, inibindo a
neutrofilia e o TNF-α, não elevou a susceptibilidade à infecção (ROCCO, 2003). Em um
trabalho posterior, foi avaliado o efeito protetor do LASSBio 596 sobre a função
pulmonar e o remodelamento em um modelo crônico de sensibilização alérgica em
camundongos BALB/c (CAMPOS, 2006). Os animais foram tratados 24 horas antes de
receber a primeira instilação intratraqueal de ovalbumina. O LASSBio 596 inibiu as
alterações da mecânica pulmonar, da celularidade, a broncoconstricção, assim como o
remodelamento pulmonar.
Tais achados permitem supor que o composto LASSBio 596, por possuir um
perfil antiinflamatório, agindo nas isoenzimas PDE e reduzindo os níveis de TNF-#,
possa apresentar uma ação eficaz no tratamento de lesões pulmonares agudas.
1.8 NOÇÕES BÁSICAS DE ESTRESSE OXIDATIVO E MECÂNICA RESPIRATÓRIA
1.8.1 Radicais livres
Radicais livres são átomos ou moléculas com um ou mais elétrons
desemparelhados no seu orbital externo e que se formam quando há quebra homolítica
de uma ligação covalente. Devido à presença de tais elétrons não pareados, os radicais
são altamente reativos e podem interagir com importantes componentes celulares,
como a membrana celular ou o DNA mitocondrial, levando ao dano da função celular ou
até mesmo a morte da célula (CIENCEWICKI, 2008).
Entretanto, além dessa potencial ação nefasta sobre a integridade e
funcionalidade celular, os radicais livres e outras substâncias com eles relacionadas
também têm sido responsabilizados pela regulação de importantes mecanismos
fisiológicos, tais como: sinalização celular, regulação da expressão de alguns genes,
mediação de reações inflamatórias e potencialização dos mecanismos de defesa
orgânica, uma vez que fazem parte do arsenal de armas letais leucocitárias (PRYOR,
1986; DROGE, 2002; HII & FERRANTE, 2007).
Os radicais livres podem ser encontrados em grande quantidade na natureza
associados aos átomos de oxigênio, nitrogênio, hidrogênio, carbono, enxofre, sendo
classificados em função do átomo portador dos elétrons desemparelhados
(VASCONCELOS, 2007). Todavia, os radicais livres de oxigênio: radical superóxido (O
2
-
), hidroxila (OH) e hidroperoxila (HO
2
) são os que possuem uma maior relevância
biológica, não só devido à sua elevada toxicidade, mas, também, pelo fato de serem os
mais prevalentes nos organismos vivos que utilizam o oxigênio como fonte de energia.
Existem, contudo, outras moléculas altamente reativas e potencialmente tóxicas para o
organismo, as quais, por não conterem nenhum elétron desemparelhado nos seus
orbitais, não se enquadram na definição de radical livre. Apesar de não serem
verdadeiros radicais, estas moléculas, que incluem o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o
ácido hipocloroso (HClO), são potenciais geradoras de radicais livres, e, por esta razão,
as suas repercussões orgânicas, fisiológicas ou tóxicas, devem ser igualmente
consideradas. (PRYOR, 1986; SHAN, 1989; HALLIWELL, 1991; LEE, 2004). Logo, ao
invés da denominação “radicais livres”, passou-se a utilizar “espécies reativas”, para
englobar além dos radicais, essas moléculas. Como em sua maioria, tais espécies são
derivadas do metabolismo do O
2
, normalmente utiliza-se o termo “espécies reativas de
oxigênio” (ERO) (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).
O balanço redox em líquidos biológicos, organelas, células ou tecidos é
determinado pela presença de pares redox responsáveis pelo fluxo de elétrons. Esses
sofrem freqüentes interconversões entre o estado reduzido e o oxidado
(VASCONCELOS, 2007). Cabe recordar que reações de redução implicam em ganho
de elétrons, e as de oxidação em perda. Portanto, quando no metabolismo normal
ocorrer uma redução do oxigênio molecular (O
2
), este ganhará um elétron, formando o
radical superóxido (O
2
-
), considerado instável por possuir número ímpar de elétrons na
ultima camada.
ERO são encontradas em todos os sistemas biológicos. As fontes geradoras são:
cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria, retículo endoplasmático e
nicotinamida-adenina nucleotídeo (NADH/NADPH) oxidase associada à membrana.
Durante esse processo são formados intermediários reativos, como os radicais
superóxido (O
2
-
), hidroperoxila (HO
2
) e hidroxila (OH
-
) e o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
). Este apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons
desemparelhados na última camada, é um metabólito do oxigênio extremamente
deletério, uma vez que participa da reação que produz o OH
-
, é capaz de atravessar
camadas lipídicas, pode reagir com a membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao
ferro, mostrando-se altamente tóxico para as células. A reatividade das ERO é
neutralizada com a entrada de quatro elétrons no processo de redução do O
2.
1.8.1.1 Reações de Fenton e de Haber-Weiss
O estudo sobre os mecanismos de lesão oxidativa tem, progressivamente,
confirmado a ação catalítica dos metais nas reações que levam a essas lesões. O papel
dos metais na formação
in vitro
das ERO é confirmado pelas reações de Fenton e de
Haber-Weiss (DUNFORD, 1987; ARUOMA, 1989; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990).
Embora o cobre possa, também, catalisar a reação de Haber-Weiss, o ferro é o metal
pesado mais abundante no organismo e está biologicamente mais capacitado para
catalisar as reações de oxidação de biomoléculas. As reações são:
Reação de Fenton:
Fe
2+
+ H
2
O
2
-----------------------> Fe
3+
+ OH
•
+ OH
-
Reação de Haber-Weiss:
H
2
O
2
+ O
2
-
-----------------------> O
2
+ OH
•
+ OH
-
Fe
3+
/Cu
2+
1.8.1.2
Peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica pode ser definida como uma cascata de eventos
bioquímicos resultante da ação dos radicais livres sobre os lipídeos insaturados das
membranas celulares, gerando principalmente L
•
(radical alquila), LO
•
(alcoxila) e LOO
•
(peroxila), levando à destruição de sua estrutura. Todos os componentes celulares são
suscetíveis a ação das ERO, porém a membrana é um dos mais atingidos, há perda da
seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas
hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos citotóxicos (como o
malondialdeído). Todas essas modificações oxidativas causam mudanças nas
propriedades físicas e químicas das membranas, culminando com a morte celular. A
lipoperoxidação também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento,
câncer e a exacerbação da toxicidade de xenobióticos. Nem sempre os processos de
lipoperoxidação são prejudiciais, pois seus produtos atuam significativamente na reação
em cascata a partir do ácido aracdônico (formação de prostaglandinas) e, portanto, na
resposta inflamatória (HALLIWELL, 1990). Todavia, o excesso de tais produtos pode
ser lesivo (ROSS & MOLDEUS, 1991, VASCONCELOS, 2007)
A peroxidação lipídica é uma reação em cadeia, representada pelas etapas de
iniciação, propagação e terminação. A etapa de iniciação, como já descrito,
compreende o ataque de uma espécie reativa (geralmente OH
-
), que abstrai um átomo
de hidrogênio de um grupo metileno, normalmente, de um ácido graxo poli-insaturado,
deixando um elétron desemparelhado no carbono. Este radical é comumente
estabilizado por rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Sob condições
aeróbicas, o carbono radicalar do dieno conjugado reage com O
2
(que é uma molécula
hidrofóbica e, portanto, se concentra no interior das membranas) e forma o radical
peroxila. Este radical peroxila é capaz de abstrair hidrogênio de moléculas de lipídeos
adjacentes, cujo carbono radicalar sofre novo rearranjo, reage com O
2
e forma outro
radical peroxila e assim sucessivamente, caracterizando a reação em cadeia da etapa
de propagação. O radical peroxila combina-se então com o hidrogênio abstraído,
gerando o lipídeo hidroperóxido (LOOH) que, ao sofrer quebra, forma aldeídos como
malonaldeido entre outros. Na decomposição dos hidroperóxidos lipídicos são gerados
radicais peroxila e alcoxila através da reação de Fenton. A terceira e última etapa da
peroxidação lipídica, a etapa de terminação, instala-se com a neutralização dos radicais
formados por ação de antioxidantes lipossolúveis ou pela reação de dois radicais
lipídicos, formando produtos não radicalares.
1.8.1.3 Sistemas de defesa antioxidante
Devido ao elevado potencial de toxicidade do oxigênio e à sua grande utilização
pelos organismos aeróbios, torna-se necessário que esses estejam suficientemente
munidos de uma diversidade de sistemas antioxidantes para proteger as suas células
dos efeitos nocivos das ERO (EVANS, 2000; BANERJEE, 2003; LAMBERTUCCI,
2007).
Um antioxidante é, por definição, qualquer substância que, quando presente em
baixas concentrações relativas à dos potenciais substratos oxidáveis, atrasa
significativamente, ou inibe, a oxidação desses substratos pelas ERO (HALLIWELL,
1991; SIES, 1997; DROGE, 2002). Essas substâncias possuem a capacidade de
fornecer elétrons/átomos de hidrogênio às ERO sem se transformarem em moléculas
instáveis. Os mecanismos de defesa antioxidante nos diferentes tecidos compreendem
sistemas enzimáticos e não enzimáticos (GOLDFARB, 1999) e podem ser classificados
em função da sua localização orgânica (antioxidantes intracelulares e extracelulares) e
da sua origem, seja da dieta (antioxidantes exógenos), ou da síntese endógena
(antioxidantes endógenos).
No interior da célula, a eliminação dos compostos reativos, constitui um pré
requisito para a sobrevivência celular, sendo normalmente efetuada por: 1) sistemas
enzimáticos, tais como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa
peroxidase (GPx) e a glutationa redutase (GR) e 2) sistemas não-enzimáticos, tais
como glutationa reduzida (GSH), coenzima Q (CoQ), ácido úrico, vitamina E (alfa-
tocoferol), vitamina C (ácido ascórbico), flavonóides, carotenóides, proteinas de
transpote de metais de transição, transferrina e ceruloplasmina (BECKMAN & AMES,
1998; SEN, 2001). Desses, os agentes que apresentam um papel mais preponderante
dentro dos sistemas intracelulares de defesa antioxidante são a SOD, a CAT e a GPx (
LEE, 2004; MORENO, 2005; FORONJY, 2006). Em situações de produção exagerada
de ERO, cada uma dessas enzimas possui a capacidade de catalisar reações que
conduzem à produção de espécies menos reativas (FERREIRA, 2006).
1.8.1.3.1 Superóxido dismutase (SOD)
A SOD metaboliza o O
2
-
com formação de H
2
O
2
(Figura 7). Nos mamíferos
existem três isoenzimas da SOD, codificadas e reguladas de forma independente: a
citosólica (Cu,Zn-SOD ou SOD1), a mitocondrial (Mn-SOD ou SOD2) e uma forma
extracelular da Cu,Zn-SOD ou (SOD3). A atividade total da SOD é percebida
principalmente no fígado, rim, eritrócitos, cérebro, coração e pâncreas (HALLIWELL,
1991; FERREIRA, 2006).
1.8.1.3.2 Catalase (CAT)
A CAT é uma enzima presente na maioria dos organismos aeróbios e é
responsável pela conversão do H
2
O
2
intracelular em água e oxigênio (Figura 7),
estando a maior parte da atividade dessa enzima localizada nos peroxissomas. Na
maioria dos animais, a CAT está presente em praticamente todos os órgãos, estando
particularmente concentrada no fígado e nos eritrócitos. O encéfalo, o coração e os
músculos esqueléticos contêm pequenas quantidades desta enzima. Algumas
organelas como mitocôndria e retículo endoplasmático contêm também alguma
atividade da CAT, embora muito reduzida (HALLIWELL, 1991; FERREIRA, 2006).
1.8.1.3.3 Glutationa Peroxidase (GPx)
A GPx é considerada a enzima mais importante para a oxidação do H
2
O
2
à água.
A GPx dos mamíferos tem maior afinidade pelo H
2
O
2
do que a CAT, o que significa que
em concentrações baixas de H
2
O
2
, a GPx apresenta um papel muito mais ativo na sua
remoção celular. Apresenta-se sob quatro formas: GPx 1 ou clássica, encontrada no
citosol de todas as células do corpo; a GPx 2 ou gastrointestinal, especifica do trato
gastrointestinal; GPx 3 ou plasmática ou extracelular, encontrada no fluido do
revestimento interno do pulmão e no leite materno, além do plasma em mamíferos, e a
GPx 4, que atua sobre peróxidos de resíduos de ácidos graxos na membrana e
lipoproteínas (BAST & HAENEN, 1991). O seu correto funcionamento está dependente
da presença de selênio (nutriente antioxidante) na sua constituição e da disponibilidade
de H
2
O
2
e de outros hidroperóxidos, utilizando a GSH como doador de elétrons,
formando a glutationa oxidada (GSSH) e água (Figura 7). Este funcionamento atribui à
GPx um papel importante na proteção celular das membranas lipídicas, proteínas e
ácidos nucléicos contra as ERO (HALLIWELL, 1991; FERREIRA, 2006).
2O
2
-
+ 2H
+
-----------------------> H
2
O
2
+ O
2
SOD
2H
2
O
2
-----------------------> 2H
2
0 + O
2
CAT
H
2
O
2
+ 2GSH
-----------------------> 2H
2
O + GSSG
GPx
Figura 7. Reações catalisadas pelas enzimas antioxidantes (SOD- superóxido dismutase; CAT-
catalase e GPx- glutationa peroxidase, GSH e GSSG- formas reduzida e oxidada da glutationa).
1.8.1.4 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre a ação dos agentes oxidantes
e antioxidantes, com predomínio dos oxidantes, com conseqüente dano tanto aos
lipídeos quanto ao DNA. Em termos gerais, o estado de estresse oxidativo orgânico
parece variar com a concentração de oxigênio, o tipo de tecido analisado, dieta e a
idade do individuo, ingestão de fármacos, exposição a condições ambientais
impróprias, tais como radiação ultravioleta, poluição, umidade relativa, temperatura
ambiente e estresse emocional.
Essa situação de estresse oxidativo traduz-se na incapacidade de impedir ou
reparar as repercussões das ERO sobre as estruturas celulares e já foi descrito que
ocorre em todos os seres biológicos, mesmo em situações de funcionalidade basal, isto
é, em repouso (MOTA, 2004). Um incremento do estresse oxidativo pode dever-se não
só a um aumento na produção de ERO, mas, também, a uma redução da capacidade
antioxidante ou, ainda, à conjugação destes dois fatores.
1.8.2 Mecânica Respiratória
A respiração representa um processo cíclico, envolvendo trabalho mecânico dos
músculos respiratórios para a movimentação do sistema respiratório. Dois componentes
constituem o sistema respiratório: o pulmão e a parede torácica. Como parede torácica
subentendem-se todas as estruturas em movimento durante o ciclo respiratório à
exceção dos pulmões. A pressão motriz, gerada pela contração muscular durante a
inspiração, precisa vencer forças de oposição, tais como: a) forças elásticas dos tecidos
pulmonares e parede torácica; b) forças resistivas resultantes do fluxo de gás pelas vias
aéreas e movimentação das moléculas constituintes do tecido pulmonar e dos tecidos
da parede torácica (D’ANGELO, 1994); c) forças viscoelásticas dos tecidos pulmonares
e da parede torácica; d) forças plastoelásticas responsáveis pela histerese
(HILDEBRANDT, 1970); e) forças inerciais (dependem da massa dos tecidos e dos
gases) (MEAD, 1961); f) forças gravitacionais (incluídas nas forças elásticas) (MILIC-
EMILI, 1977); e g) forças de distorção da parede torácica. Contudo, durante a
respiração basal, considera-se as forças inerciais e de distorção da parede como
desprezíveis (RODARTE & REHDER, 1986).
A elasticidade é uma propriedade da matéria que permite ao corpo retornar à sua
forma original após ter sido deformado por uma força sobre ele aplicada. Um corpo
perfeitamente elástico como uma mola, obedecerá à lei de Hooke, ou seja, a variação
de comprimento é diretamente proporcional à força aplicada, até que seu limite elástico
seja atingido. Em visão tridimensional, teríamos volume proporcional à pressão.
O tecido pulmonar e a parede torácica possuem propriedades elásticas e
obedecem à lei de Hooke, de modo que quanto maior a pressão motriz, maior o volume
de gás inspirado. A inclinação da curva volume-pressão ou a relação entre a variação
de volume gasoso mobilizado (∆V) e a pressão motriz necessária para manter o
sistema respiratório insuflado é conhecida como complacência do sistema respiratório
(Crs). Logo, Crs = ∆V/Pel,rs, onde Pel,rs corresponde à pressão elástica do sistema
respiratório.
Cabe ressaltar que, ao invés de complacência, utiliza-se freqüentemente a
variável elastância. Esta corresponde ao inverso da complacência (Ers = 1/Crs), ou
seja, representa a relação entre a variação de pressão e o volume mobilizado
resultante. O cálculo da elastância do sistema respiratório apresenta vantagens, já que
as elastâncias do pulmão (EL) e da parede torácica (Ew) são adicionadas diretamente:
Ers = EL + Ew, enquanto se somam os inversos das complacências: 1/Crs = 1/CL +
1/Cw.
Dois fatores respondem pelo comportamento elástico do pulmão. Um deles é
representado pelos componentes elásticos do tecido pulmonar (fibras elásticas e
colágenas). Acredita-se que o comportamento elástico do pulmão não dependa do
simples alongamento das fibras de tecido conjuntivo, mas, principalmente, do seu
arranjo geométrico. Todas as estruturas pulmonares encontram-se interligadas pela
trama de tecido conjuntivo pulmonar, de forma que, quando há insuflação, todos esses
componentes se dilatam. Esse fenômeno chama-se “interdependência” e contribui para
manter todos os espaços aéreos abertos.
Além das propriedades elásticas dos tecidos pulmonares, os pulmões ainda
apresentam um importante fator a contribuir para as suas características elásticas: a
tensão superficial exercida pelas moléculas recobrindo a zona de troca gasosa.
Existe tensão superficial em uma interface ar-líquido porque as moléculas do
líquido são atraídas com maior intensidade para o interior do próprio líquido do que para a
fase gasosa acima deste. A tensão superficial tem a propriedade importante de gerar
pressão no interior de uma bolha. A relação entre a tensão superficial na parede e a
pressão desenvolvida dentro da bolha de sabão é dada pela Lei de Laplace. Essa lei
afirma que, para cada superfície da bolha, a pressão (P) é proporcional ao dobro da
tensão (T) desenvolvida pelo raio (r), ou, para ambas as superfícies, P = 4T/r. Entretanto,
quando somente uma interface está envolvida, como em um alvéolo esférico revestido por
líquido na sua face interna, o numerador apresenta o número 2 em lugar de 4.
Considerando-se dois alvéolos de diferentes tamanhos conectados através de uma via
aérea comum, e com tensão superficial semelhante, pode-se depreender, com base na
Lei de Laplace, que a pressão no alvéolo menor seria maior do que no alvéolo maior.
Desta forma, os alvéolos menores esvaziar-se-iam nos maiores, resultando em alvéolos
colapsados e ductos alveolares hiperinsuflados. Contudo, isso não ocorre nos pulmões
normais, pois a tensão superficial do surfactante, líquido de composição protéica e,
principalmente, fosfolipídica secretado pelos pneumócitos tipo II, é consideravelmente
menor do que a da solução salina que recobre as mucosas pulmonares. Dessa forma, há
um equilíbrio entre os alvéolos maiores e menores, com mesma pressão mantida em seus
interiores.
Durante a movimentação do sistema respiratório, quando ocorre fluxo de gás, um
elemento adicional ao elástico precisa ser vencido pela pressão motriz: a resistência. A
resistência do sistema respiratório (Rrs) pode ser calculada dividindo-se Pres,rs por
fluxo aéreo. Pres,rs representa a pressão resistiva do sistema respiratório, ou seja, a
pressão necessária para vencer seus componentes resistivos. Semelhantemente à
complacência, e pelas mesmas razões, a resistência do sistema respiratório se
subdivide em seus componentes pulmonar e de parede.
A resistência pulmonar pode ser subdividida em dois subcomponentes: a
resistência das vias aéreas (Raw), que depende do fluxo de ar no interior dos pulmões,
e a resistência tecidual (Rtis), determinada pelas perdas energéticas geradas pela
viscosidade (isto é, atrito) pertinente à movimentação do pulmão. A resistência das vias
aéreas pode ser influenciada pela geometria da árvore traqueobrônquica, pelo volume
pulmonar, pela complacência das vias aéreas, pela densidade e viscosidade do gás
inspirado e pela musculatura lisa dos brônquios. A resistência tecidual depende da
velocidade do deslocamento, o que é importante tanto durante a inspiração como na
expiração. A resistência da parede torácica também sofre influência das perdas
energéticas geradas pela viscosidade pertinente à movimentação das moléculas que
constituem os tecidos da parede torácica.
Além dos componentes elásticos e resistivos, o sistema respiratório apresenta,
também, propriedades viscoelásticas, tanto no tecido pulmonar quanto na parede
torácica. A viscoelasticidade foi descrita a partir do comportamento de fios de seda.
Esse tipo de material obedece à lei da proporcionalidade entre a força aplicada e o
alongamento resultante (Lei de Hooke), porém apenas por um curto período de tempo
após a aplicação da força. Quando se mantém a carga por um tempo prolongado, o
alongamento passa a aumentar continuamente. Este fenômeno está presente em vários
tecidos animais (DORRINGTON, 1980).
Substâncias viscoelásticas, quando mantidas sob deformação constante,
apresentam queda da tensão, chamada de relaxamento de tensão (
“estresse
relaxation”
), ou simplesmente, relaxamento, quando o corpo é estirado. Por outro lado,
sob tensão constante, o corpo tende a se deformar continuamente com o decorrer do
tempo, fenômeno chamado
“creep”
. Ressalte-se que esta deformação não é
irreversível, mas sim reprodutível, podendo ser repetida, desde que seja precedida por
um período de tempo onde o material permaneça em condições de repouso, a fim de
apagar a memória do evento anterior. A viscoelasticidade permite o intercâmbio de
energia (pressão) entre o componente elástico e o resistivo. Por exemplo, durante uma
pausa inspiratória, a energia potencial (pressão) acumulada no componente elástico
pode ser dissipada sob a forma de calor pelo componente resistivo.
1.8.2.1 Estudo da Mecânica Respiratória
Na tentativa de compreender a complexidade do sistema respiratório e seus
componentes (pulmão e parede torácica), além dos diversos mecanismos envolvidos
durante a respiração, foram utilizados modelos matemáticos relativamente simples, que
se aproximam da realidade. Para isso, faz-se necessária a interpretação fisiológica de
variáveis mensuráveis tais como fluxo, volume e pressão na abertura das vias aéreas.
O modelo mais simples compõe-se de 2 elementos, uma resistência
(representada por um tubo) e uma elastância (representada por um balão) (Figura 8).
Figura 8. Modelo linear uni-compartimental. Representação anatômica (A), elétrica (B) e
reológica (corpo de Voigt, C). R, resistência do sistema respiratório; E, elastância do sistema
respiratório; V, variações de volume.
Esse modelo baseia-se na assertiva de que as propriedades mecânicas do
sistema respiratório independem do volume pulmonar e do fluxo, e que os fatores
inerciais são desprezíveis. Considerando-se o sistema respiratório normal, esse modelo
pode ser utilizado, e tornou-se tão popular que a equação a ele associada é geralmente
referida como "equação de movimento do sistema respiratório". Nessa equação, P(t) =
E.V(t) + R.V’(t), em qualquer instante t, E e R correspondem, respectivamente, à
elastância e à resistência do sistema respiratório e P é a pressão motriz capaz de
produzir volume (V) e fluxo aéreo (V’). Entretanto, apesar do modelo de compartimento
único continuar sendo amplamente utilizado, não se deve aplicá-lo, por razões ligadas à
precisão, ao estudo da mecânica em presença de doenças pulmonares, sendo
necessário um modelo de dois ou mais compartimentos, no qual os compartimentos
apresentem diferentes constantes de tempo, para descrever o comportamento
mecânico do sistema respiratório. Além disso, essa equação de movimento não explica
A
B
C
o decaimento lento da pressão traqueal observado após oclusão das vias aéreas ao
final da inspiração (DON & ROBSON, 1965; BATES, 1985a,b), a dependência de
freqüência de R e E na faixa de 0-2 Hz (HANTOS, 1986, 1987; BARNAS, 1987; BATES,
1989; BRUSASCO, 1989), bem como a presença de histerese na curva volume-pressão
quase-estática em pulmões isolados (SIMILOWSKI, 1991).
Iniciou-se, então, o estudo da mecânica respiratória utilizando-se modelos
bicompartimentais que consideravam a heterogeneidade de distribuição de gás nos
pulmões (MEAD, 1961) e a viscoelasticidade dos tecidos (MOUNT, 1955).
Na década de 60, foram descritos os primeiros modelos bicompartimentais para
estudo da mecânica respiratória, que associavam a natureza multicompartimental do
sistema respiratório à heterogeneidade da distribuição de gás nos pulmões (OTIS,
1956; MEAD, 1969) ou à viscoelasticidade dos tecidos torácicos (MOUNT, 1955).
Em 1985, Bates e colaboradores representaram a proposta original de Mount na
forma de um modelo físico composto por elementos elásticos representados por molas
e por elementos resistivos expressos por amortecedores (BATES, 1985a,b). Os autores
realizaram uma análise teórica do comportamento não homogêneo do sistema
respiratório submetido à ventilação mecânica com fluxo inspiratório constante, seguida
por uma oclusão súbita das vias aéreas. Imediatamente após a oclusão, ocorre uma
queda rápida da pressão traqueal (∆P1), indo do seu valor máximo (Pmáx) até um
ponto de inflexão (Pi), seguida por uma queda lenta (∆P2) até atingir um platô, que
corresponde à pressão de retração elástica do sistema respiratório (Pel) (Figura 9).
VOLUME
(L)
FLUXO
(L/s)
PRESSÃO
TRAQUEAL
(cmH
2
O)
V
T
INS
P
OCLUSÃO
LIBERAÇÃO
Pi
Pel
Pmáx
5s
Figura 9. Modelo do método de oclusão ao final da inspiração. Registros de volume, fluxo aéreo
e pressão traqueal em função do tempo. INSP, inspiração; V
T
, volume corrente; Pmáx, pressão
máxima ou de pico inspiratório; Pi, pressão pulmonar no ponto de inflexão; Pel, pressão de
retração elástica do pulmão.
O modelo de Bates e colaboradoes é constituído por dois submodelos, pulmão e
parede torácica, apresentando um arranjo em paralelo, uma vez que sofrem a mesma
variação de volume (Figura 10). A subunidade pulmonar consiste de um amortecedor,
representando a resistência das vias aéreas (Rinit,L), em paralelo com um corpo de
Kelvin, que consiste de uma mola representando a elastância estática (Est,L) em
paralelo com um corpo de Maxwell, caracterizado por uma mola, componente elástico
(E2,L), e um amortecedor, componente resistivo (R2,L), dispostos em série. E2,L, R2,L
e a constante de tempo correspondente (τ2,L=R2,L/E2,L) estimam as propriedades
viscoelásticas do pulmão. Já a subunidade da parede torácica é representada por uma
resistência (Rinit,w) e pelo corpo de Kelvin, caracterizado pela elastância estática da
parede torácica (Est,w) e pelos parâmetros que correspondem a viscoelasticidade
(E2w, R2 e τ2w).
Figura 10. Modelo de molas e amortecedores para interpretação da mecânica do sistema
respiratório com a técnica de interrupção do fluxo, proposto por Bates
et al.
(Bates
et al.
, 1985).
Pulmão e parede torácica apresentam um componente resistivo (Rinit,L e Rinit,w,
respectivamente) em paralelo com um corpo de Kelvin; este composto por componente elástico
(Est,L e Est,w, respectivamente), representando a elastância estática dos dois compartimentos,
em paralelo com um corpo de Maxwell, conjunto de amortecedor e mola em série (R2,L – E2,L,
e R2,w – E2,w, respectivamente), os quais representam o comportamento viscoelástico. A
distância entre as duas barras horizontais é análoga ao volume pulmonar (V) e a tensão entre
elas é análoga da pressão na abertura das vias aéreas (P).
Quando esse modelo é alongado (afastamento das duas barras horizontais) a
uma velocidade constante (v), a carga da mola E2 aumenta com o tempo (Ti) e a
velocidade do amortecedor R2 se aproxima da velocidade de alongamento (v). Assim, a
força exercida pela mola E2 aproxima-se de R2.v. Se for realizada uma manobra de
interrupção de fluxo, o movimento das duas barras horizontais cessa. Com isso, o
comprimento da mola E2 diminui gradualmente até atingir seu comprimento de
equilíbrio. Logo, nesse modelo, o decaimento pressórico lento (∆P2), observado após a
interrupção do fluxo, é interpretado como equivalente ao relaxamento da mola E2,
resultando em dissipação calórica de energia no amortecedor R2.
Baseado no modelo de BATES e colaboradores (1988), a queda de pressão que
ocorre imediatamente após a oclusão das vias aéreas, durante a insuflação pulmonar
com fluxo constante, fornece a variação de pressão do sistema respiratório que seria
obtida na ausência de desigualdades da constante de tempo e “
estresse relaxation
”, ou
seja, o componente viscoso ou homogêneo do sistema respiratório. A queda mais lenta
da pressão, que ocorre subseqüentemente até ser atingindo o platô, reflete a pressão
dissipada em decorrência da viscoelasticidade e/ou heterogeneidade do sistema, as
quais são determinadas, respectivamente, pelo “
estresse relaxation
” e “
pendelluft
”
(BATES, 1985a,b; BATES, 1988).
“
Estresse relaxation
” pulmonar é a capacidade do pulmão de se adaptar a uma
insuflação mantida, apresentando redução da pressão em função do tempo. Quando
permanece sob um comprimento constante (volume), o pulmão pode alterar sua tensão
com o tempo, logo, o gradiente de pressão diminui progressivamente. O “
estresse
relaxation
” ocorre após alterações súbitas do comprimento, “
strain
”. Nesse caso, súbito
significa que o tempo necessário para o estiramento é menor do que a constante de
tempo (
τ
2
= R
2
.C
2
). O “estresse relaxation” depende do realinhamento da matriz
extracelular e de perdas de energia nos tecidos pulmonares e na interface ar-líquido
(HORIE, 1971). Já o “
pendelluft
” corresponde à transferência de um pequeno volume
de gás dos compartimentos pulmonares de maior pressão para os compartimentos de
menor pressão, representando o reajuste estático das diferenças regionais de volume
pulmonar resultantes de desigualdades de constante de tempo (BATES, 1985a,b; OTIS,
1956).
Vários fatores contribuem para o “
estresse relaxation
” no pulmão, como o
fenômeno de abertura e fechamento das vias aéreas e espaços alveolares, e as perdas
de energia nos tecidos e na interface ar-líquido. As fibras de colágeno e elastina,
isoladamente, apresentam pouca adaptação ao estiramento, mas o arranjo da matriz
fibro-elástica apresenta contribuição significativa para este fenômeno (HORIE, 1971).
Alguns autores ressaltam o papel da interface ar-líquido como o principal determinante
do “
estresse relaxation
” no pulmão (HORIE, 1971).
O comportamento não homogêneo da parede torácica não está completamente
esclarecido. A parede torácica pode se comportar como um sistema de dois
compartimentos, um de baixa complacência, representando pela caixa torácica e outro
de complacência mais elevada, o abdome (PESLIN, 1975). Além disso, a pressão
intrapleural não é uniforme em toda a cavidade torácica, sendo afetada pela contração
do diafragma e pela movimentação do abdome (D’ANGELO, 1974). As propriedades
mecânicas do sistema respiratório podem sofrer influência da parede abdominal,
ajudando a explicar a queda heterogênea da pressão pleural após a oclusão das vias
aéreas (ZIN, 1989). A abertura extensa da parede abdominal leva ao aumento da
elastância e resistência, provavelmente secundário à redistribuição de volumes gasosos
no pulmão (ZIN, 1989).
O primeiro estudo em animais realizado de acordo com o proposto por Bates e
colaboradores (1985), com subdivisão do sistema em seus componentes pulmonar e
parede, foi realizado por Saldiva e colaboradores (1987). Posteriormente, outros
trabalhos também demonstraram a contribuição significativa da parede torácica para as
desigualdades do sistema respiratório (AULER, 1987; KOCHI, 1988a;
Zin, 1989;
D´ANGELO, 1994; MOREIRA, 1997; MACEDO-NETO, 1998; ROCCO, 1999),
comprovando que elas podem ser atribuídas aos componentes pulmonar e de parede.
O método de oclusão das vias aéreas após insuflação com fluxo constante não
permite determinar a contribuição relativa do “
pendelluft
” (desigualdades de constantes
de tempo) e do “
estresse relaxation
” (componente viscoelástico) para o
desenvolvimento da queda lenta observada na pressão traqueal (BATES, 1985;
BATES, 1988; KOCHI, 1988b). No entanto, vários autores acreditam ser a maior
contribuição representada provavelmente pelo “
estresse relaxation
” (BATES, 1988;
KOCHI, 1988b; SIMILOWSKI, 1991).
Em 1988, o modelo de oclusão ao final da inspiração foi validado através de
estudos experimentais utilizando-se cápsulas posicionadas em pontos diferentes da
superfície pleural. Ao medir diretamente a pressão alveolar, comprovou-se ser esta
homogênea através dos pulmões, apresentando pico de pressão coincidente com o
ponto de inflexão (Pi) observado na curva de pressão traqueal. Logo, a pressão alveolar
mostra comportamento semelhante ao encontrado na segunda fase da queda de
pressão traqueal - a queda lenta. Tal observação indica que a variação de pressão
responsável pela queda lenta (∆P2) ocorre em conseqüência de um fenômeno distal às
pequenas vias aéreas, ou seja, no tecido pulmonar. Logo, ∆P2 é uma manifestação do
comportamento tecidual de adaptação ao estresse (BATES, 1988; SALDIVA, 1992).
Apesar de haver diversas técnicas que analisam a mecânica do sistema
respiratório, nos últimos anos o método da oclusão ao final da inspiração vem sendo
bastante utilizado no estudo da mecânica respiratória, tanto em animais, quanto em
humanos anestesiados (BATES, 1985; AULER, 1987; SALDIVA, 1987; KOCHI, 1988a;
D’ANGELO, 1989; D’ANGELO, 1994; MACEDO-NETO, 1998; ROCCO, 1999; ROCCO,
2004; FERNANDES, 2006). Empregou-se este método no presente trabalho, por
fornecer informações individualizadas acerca do componente pulmonar e permitir a
análise de suas propriedades elástica, viscosa e viscoelástica.
JUSTIFICATIVA
2 JUSTIFICATIVA
A compreensão acerca do tratamento da lesão induzida por MCYST-LR torna-se
relevante, uma vez que já foi evidenciado que esta toxina atinge diversos órgãos do
organismo. Além disso, alguns estudos com animais e relatos de intoxicação em
humanos comprovam o aparecimento de alterações no sistema respiratório (TURNER,
1990;
FITZGEORGE, 1994; ITO
,
2000,2001; WANG, 2008). O nosso grupo demonstrou
que a administração i.p. de extrato tóxico de cianobactérias contendo MCYST-LR causa
efeitos deletérios no pulmão, evidenciados por meio de análise histológica (PICANÇO,
2004). Ademais, a administração i.p. de MCYST-LR purificada, acarretou, alteração da
mecânica respiratória, recrutamento de células inflamatórias e edema intersticial ao
longo do tempo (SOARES, 2007).
Até o momento, o tratamento das alterações induzidas por MCYST-LR são, em
sua maioria, profiláticos (ADAMS, 1989; NOBRE, 2003). Somente um trabalho analisou
a terapêutica da lesão, porém, o fármaco foi administrado 15 minutos após a lesão,
sendo observada eficácia contra a letalidade dos animais (HERMANSKY, 1990b). Com
relação ao tratamento da lesão pulmonar, nenhum relato foi encontrado na literatura.
Sabe-se que os estudos experimentais representam uma importante ferramenta na
avaliação dos benefícios terapêuticos após lesão pulmonar induzida por MCYST-LR.
Portanto, seria desejável a identificação de substâncias com um efetivo perfil
antiinflamatório e poucos efeitos colaterais para serem empregados nessas condições.
Os trabalhos iniciais empregando o LASSBio 596 em modelos de SDRA e de
asma, demonstraram resultados promissores (ROCCO, 2003; CAMPOS, 2006). Assim,
o objetivo do estudo é avaliar se o novo candidato a fármaco apresenta eficácia
terapêutica relevante na lesão pulmonar aguda induzida por MCYST-LR e compará-lo
com uma droga de amplo uso experimental, a dexametasona.
OBJETIVOS
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Comparar o potencial terapêutico de LASSBio 596 com a dexametasona sobre o
processo inflamatório pulmonar agudo induzido pela exposição à microcistina-LR em
doses subletais, administrada intraperitonealmente em camundongos saudáveis.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) avaliar, pelo método de oclusão ao final da inspiração, as propriedades
elásticas, resistivas e viscoelásticas e/ou inomogêneas do pulmão;
b) estudar as alterações histológicas no parênquima pulmonar;
c) avaliar o processo inflamatório e a resposta aos tratamentos por meio de
ensaios bioquímicos de estresse e dano oxidativos;
d) avaliar a concentração de microcistina-LR no pulmão e no fígado e,
e) avaliar a histologia hepática.
MATERIAIS E MÉTODOS
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Grupos Experimentais
Os animais utilizados, oriundos do Biotério Central da Fundação Oswaldo Cruz,
Rio de Janeiro, foram cuidados conforme o guia preparado pelo Comitê de Cuidados e
Uso dos Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisas dos Estados
Unidos (U. S. Department of Health and Humane Services, 1985). Aprovado pela
Comissão de Ética com Uso de Animais (CEUA), Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob o número IBCCF 012.
Trinta e seis camundongos Suíços machos normais adultos, pesando 35±5 g
(média±DP) foram divididos, aleatoriamente, em dois lotes, a saber: grupo controle
(n=9) e animais que receberam microcistina purificada em dose sub-letal de MCYST-LR
(40 µg/kg i.p.), padrão cedido pelo Prof. Wayne Carmichael, Wright State University,
EUA). Este lote foi dividido em 3 grupos com 9, 8 e 10 animais respectivamente, com
base nos tratamentos propostos. (n=27). Assim, quatro grupos foram formados, a
saber:
ϖ grupo controle (Ctrl) – injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina
(NaCl a 0,9%) e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), formando uma
solução final com 60 µL. Após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e
DMSO era injetado (i.p.);
ϖ grupo toxina (Tox) - injeção de 40 µg/kg i.p. de MCYST-LR diluídos em solução
salina (NaCl a 0,9%), solução final com 60 µL. Após 6 horas 60 µL de solução
salina eram injetados (i.p.);
ϖ grupo LASSBio 596 (L596) - injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em
solução salina, solução final com 60 µL. Após 6 horas administração i.p. de
LassBio596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina,
solução final 200 µL);
ϖ grupo dexametasona (Dexa) - injeção de 40 µg/kg i.p. de MCYST-LR diluídos em
solução salina, solução final com 60 µL. Após 6 horas administração de
dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL).
O experimento foi realizado 2 horas após os tratamentos. (Figura 11)
Figura 11. Organograma experimental. Grupos Ctrl [animais submetidos à injeção
intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo),
solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram
injetados (i.p.)]. Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-
LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução salina
foram injetados (i.p.)]. L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR
diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio
596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)].
Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina
(1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)].
4.2 Experimentos
Todos os animais foram submetidos à análise de mecânica e histologia
pulmonares 8 horas após a primeira injeção, totalizando 2 horas de tratamento.
S
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EXPERIMENTO
2h 2h 2h
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1
1
0
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)
2h
Após a realização da medida da mecânica respiratória
in vivo
os animais foram
sacrificados e tiveram seus pulmões removidos para análise da morfometria pulmonar,
realizada no Laboratório de Fisiologia da Respiração.
4.2.1 Mecânica Respiratória
Oito horas após a primeira injeção, os animais foram sedados com diazepam (1
mg i.p.), pesados (balança Filizola, modelo BR, Indústrias Filizola SA, SP, Brasil) e,
então, anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/kg i.p.).
Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa
sob foco cirúrgico em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por esparadrapo.
Os membros superiores foram mantidos horizontalmente abduzidos a 90 graus em
relação ao corpo e os membros inferiores estendidos em diagonal. Após o
posicionamento cirúrgico, foi realizada traqueotomia com introdução de jelco (20G com
32 mm de comprimento e 0,8 mm de diâmetro interno), sendo a cânula fixada à traquéia
por meio de fios de algodão. Os animais foram paralisados com injeção intravenosa de
brometo de pancurônio (0,1 mg/kg).
Os camundongos foram, então, acoplados à prótese ventilatória e ventilados por
um ventilador de fluxo constante (Samay VR15, Universidad de la Republica,
Montevidéu, Uruguai) com freqüência de 100 incursões respiratórias por minuto e um
volume corrente (V
T
) de 0,2 mL.
Após a adaptação ao respirador, procedeu-se à tricotomia e abertura da pele e
do subcutâneo dos animais, na linha mediana, do manúbrio ao pubis. A seguir, esses
planos foram separados da musculatura por tração lateral. O plano muscular e o
peritôneo foram, então, secionados bilateralmente, seguindo o bordo inferior das
costelas, até atingir a linha axilar anterior. Com a cavidade abdominal aberta, foi
possível visualizar o diafragma, que foi perfurado e secionado segundo a mesma
orientação da abertura da parede abdominal. Antes da perfuração do diafragma foi
instalada pressão positiva ao final da expiração (PEEP) de 2 cmH
2
O, a fim de evitar o
desenvolvimento de colapso pulmonar (POWERS, 1973; SALDIVA, 1992;
RODRIGUES, 1993).
Após a retirada do diafragma, a parede torácica anterior foi removida por incisões
longitudinais bilaterais ao nível da linha axilar anterior, em toda sua extensão, e incisão
transversal superior, abaixo das clavículas.
O ventilador foi ajustado previamente para gerar uma pausa de 5 segundos ao
final da inspiração. Foram tomados cuidados especiais para a manutenção de volume
(V
T
= 0,2 mL) e fluxo (V’= 1 mL/s) constantes em todos os animais, a fim de evitar os
efeitos de diferentes fluxos, volumes e tempo inspiratório nas variáveis medidas
(KOCHI, 1988a,b; SIMILOWSKI, 1989).
O tubo traqueal foi conectado a um pneumotacógrafo para pequenos animais,
como descrito por Mortola e Noworaj (MORTOLA & NOWORAJ, 1983), para medida de
fluxo aéreo (V'), sendo o respirador acoplado à outra extremidade do pneumotacógrafo.
Este é constituído por uma cânula metálica com duas saídas laterais ligadas a um
transdutor diferencial de pressão, Validyne MP 45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA,
EUA), para medida de fluxo aéreo, sendo o volume corrente obtido por integração
digital do sinal de fluxo. Através de outra saída lateral, a via aérea foi conectada a um
transdutor diferencial de pressão Validyne MP45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA,
EUA) para medida da pressão traqueal (Ptr).
Uma vez que não houve modificações abruptas no diâmetro no nosso circuito,
provavelmente foram evitados erros de medida da resistência ao fluxo (CHANG &
MORTOLA., 1981; LORING, 1979). O espaço morto do equipamento foi de 0,3 mL. Os
sinais de V’ e Ptr foram condicionados e amplificados em um polígrafo Beckman tipo R
(Beckman Instruments, Schiller Park, IL, EUA). Os sinais foram, então, passados
através de filtros Bessel de 8 pólos (902LPF, Frequency Devices, Haverhill, MA, EUA),
convertidos de analógicos para digitais em conversor de 12 bits (DT-2801A, Data
Translation, Malboro, MA, EUA) e armazenados em computador. Todos os dados foram
coletados usando o software LABDAT (RHT-InfoData Inc., Montreal, QC, Canadá) A
montagem experimental encontra-se na Figura 12.
Figura 12. Montagem experimental consistindo de:
1 - Cilindro de ar comprimido.
2 - Válvula redutora de pressão.
3 - Ventilador de fluxo inspiratório constante composto por duas válvulas solenóides.
4 - Pneumotacógrafo.
5 - Peça em “T” para medida de pressão na abertura das vias aéreas.
6 - Cânula traqueal.
7 - Mesa cirúrgica.
8 - Transdutor diferencial de pressão transpulmonar.
9 - Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo.
10 - Polígrafo de oito canais para amplificação dos sinais de fluxo e pressão.
11 - Filtros passa-baixa Bessel de 8 polos.
12 - Conversor analógico-digital de 12 bits.
13 - Microcomputador.
Durante os experimentos evitou-se ao máximo a manipulação da cânula traqueal
com aspirações e insuflações, para eliminar possíveis interferências sobre os
parâmetros medidos.
Os parâmetros da mecânica respiratória foram determinados 8 horas após a
primeira injeção de salina ou de MCYST-LR. Para tanto, 10 ciclos respiratórios foram
capturados por animal e a análise efetuada pelo método de oclusão ao final da
inspiração.
O método de oclusão ao final da inspiração (BATES, 1985a,b) permite analisar
separadamente os componentes elástico, resistivo e viscoelástico e/ou inomogêneo do
sistema respiratório.
No animal com o tórax aberto, a Ptr é, na realidade, a pressão transpulmonar
(PL), logo, todos os parâmetros medidos correspondem à mecânica pulmonar. Após a
oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, sob fluxo constante, ocorre uma queda
súbita da PL até um ponto de inflexão (Pi), a partir do qual o decaimento da pressão
assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção terminal. Esta fase de
platô corresponde à pressão de retração elástica do pulmão (Pel). A diferença de
pressão, que caracteriza a queda rápida inicial (∆P1), é representada pela diferença
entre a pressão máxima inicial (Pmax) e o ponto a partir do qual a queda se torna mais
lenta (Pi) e corresponde ao componente viscoso pulmonar. A segunda variação de
pressão (∆P2), representada pela queda lenta, do Pi ao platô (Pel), reflete a pressão
dissipada para vencer os componentes viscoelástico (
estresse relaxation
) e/ou
inomogêneo (
pendelluft
) do tecido pulmonar. A soma de ∆P1 e ∆P2 fornece a variação
total de pressão no pulmão (∆Ptot) (Figura 13).
Figura 13. Método de oclusão ao final da inspiração. Registros dos sinais de fluxo aéreo,
volume (V) e pressão transpulmonar (PL) em função do tempo. Os pulmões foram ventilados
com volume corrente de 0,2 mL e fluxo aéreo de 1 mL/s. O platô foi alcançado após uma pausa
inspiratória de 5 s. Após a oclusão das vias aéreas, há uma queda rápida na PL de seu valor
máximo (Pmax) até um ponto de inflexão (Pi), ∆P1, que corresponde à pressão dissipada para
vencer o componente viscoso do pulmão. Segue-se uma queda lenta (∆P2), pressão dissipada
para vencer os componentes viscoelástico e/ou inomogêneo do pulmão, até um ponto de
equilíbrio elástico, representado pela pressão de retração elástica pulmonar (Pel). A linha de
base do registro de pressão corresponde à pressão positiva ao final da expiração (PEEP) de 2
cmH
2
O. Ins, inspiração. V
T
, volume corrente.
As elastâncias estática (Est) e dinâmica (Edyn) do pulmão foram obtidas
dividindo-se Pel e Pi, respectivamente, pelo volume corrente. O componente
viscoelástico da elastância (∆E) foi, então, obtido pela diferença entre Edyn e Est.
Para a realização da oclusão, o ventilador mecânico utiliza uma válvula com
tempo de fechamento definido (10 ms). Como este fechamento não é absolutamente
instantâneo, o volume nunca cai a zero imediatamente após a oclusão, propiciando,
assim, a existência de um pequeno fluxo. Este fluxo será responsável pelo aumento do
volume pulmonar e, conseqüentemente, de Pi e Pel. Por isso, foi feita correção de
acordo com Kochi e colaboradores (1988a).
As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica pulmonar:
Onde:
∆P1 = variação de pressão utilizada para vencer o componente viscoso
∆P2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo
∆Ptot = variação de pressão total
Pmáx = pressão máxima atingida
Pi = pressão no ponto de inflexão
∆P1 = Pmax – Pi
∆P2 = Pi – Pel
∆Ptot = ∆P1 + ∆P2
Est = Pel / V
T
Edyn = Pi / V
T
∆E = Edyn – Est
Ti = V
T
/V´
Pel = pressão de retração elástica
Est = elastância estática
Edyn = elastância dinâmica
∆E = componente viscoelástico da elastância
V
T
= volume corrente
T
I
= tempo inspiratório
V’= fluxo inspiratório
A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi
previamente aferida através da aplicação de fluxos de ar ao sistema, com concomitante
registro das variações de pressão (∆P). Uma vez que R = ∆P / V’, a resistência do
equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ∆PxV’. A Req, constante até
fluxos de 26 mL/s (bem acima da faixa de fluxo utilizada no presente experimento), foi
de 0,12 cmH
2
O/mL/s. A variação de pressão determinada pelo equipamento (∆Peq =
Req.V’) foi subtraída das pressões resistivas do pulmão, de tal forma que os resultados
representam propriedades mecânicas intrínsecas.
4.2.2 Histologia Pulmonar
4.2.2.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia óptica
Após a determinação da mecânica pulmonar, os animais foram heparinizados
(veia cava inferior, 1000 IU) e, em seguida, sacrificados por seção da aorta abdominal e
da veia cava inferior. A traquéia foi ocluída ao final da expiração com fio de algodão. A
porção abdominal do esôfago foi identificada e isolada, sendo presa por uma pinça
hemostática. As estruturas do pescoço foram dissecadas com liberação das vias
aéreas. A pinça que prendia o esôfago foi suavemente tracionada para cima, permitindo
separá-lo das estruturas aderidas à parede torácica posterior. Com todas as estruturas
individualizadas, a traquéia foi secionada acima do local ligado pelo fio e,
posteriormente, o esôfago foi separado do conjunto por leve tração.
Os pulmões dos animais foram congelados por imersão rápida em nitrogênio
líquido (aproximadamente 3 min), retirados e mantidos em solução de Carnoy (etanol
60%, clorofórmio 30% e ácido acético 10%) a -70º C por 24 h. Após esse período, o
material foi desidratado progressivamente através de imersão em soluções com
concentração crescente de etanol:
- MC-1: etanol 70%, clorofórmio 22,5% e ácido acético 7,5%, a -20
o
C durante 1 h;
- MC-2: etanol 80%, clorofórmio 15% e ácido acético 5%, a -20
o
C durante 1 h;
- MC-3: etanol 90%, clorofórmio 7,5% e ácido acético 2,5%, a -20
o
C durante 1 h;
- etanol a 100%, a -20
o
C durante 1 h e, em seguida, a -4
o
C durante 24 h;
- formol a 10% tamponado- Millonig (100 mL de formol 40%, 18,6 g de NaH
2
PO
4
, 4,2 g
de NaOH e 900 mL de água destilada) até a obtenção dos cortes pulmonares em
parafina.
Depois da fixação, o material foi processado como de rotina para estudo
histológico e emblocado em parafina, obtendo-se, então, cortes histológicos com 4 µm
de espessura.
As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e
eosina (HE) e analisadas por microscopia óptica (Axioplan, Zeiss, Oberkochen,
Alemanha), segundo seus aspectos qualitativos e quantitativos.
4.2.2.2 Análise histológica
As lâminas com os cortes pulmonares montados foram analisadas por
microscopia óptica (microscópio Axioplan, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) tanto
qualitativa quanto quantitativamente. Para a análise qualitativa, toda a superfície da
lâmina foi observada com todas as estruturas pulmonares representadas, em aumento
de 100x.
A análise quantitativa foi realizada por meio da técnica convencional de
contagem de pontos (
point-couting
) (GUNDERSEN, 1988), utilizando uma ocular
contendo um sistema de referência de 100 pontos e 50 linhas dispostos em paralelo
(Figura 14).
Figura 14. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para análise histológica.
Em um aumento de 200x foram avaliados de cinco a dez campos aleatórios e
não coincidentes por lâmina. Foi quantificada a fração de área ocupada por alvéolos
normais, colapsados e hiperinsuflados (WEIBEL, 1990), onde o número de pontos que
caíam em área de alvéolos normais, colapsados ou hiperinsuflados, respectivamente,
foi dividido pelo total de pontos contados em cada campo analisado e expresso sob a
forma de percentual.
Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) de
8-9 lâminas por grupo, sendo cada animal representado por apenas uma lâmina.
4.2.3 Análise de MCYST-LR por ELISA
Para esta análise, bem como para as medidas do estresse oxidativo e dano
hepático, outros 36 camundongos (35±5 g), foram aleatoriamente divididos nos mesmos
grupos anteriormente descritos e analisados nos mesmos tempos dos outros animais. O
pulmão direito de cada animal foi separado para a análise do conteúdo de MCYST-LR
por ELISA, o pulmão esquerdo para as medidas de estresse oxidativo e o fígado para
histologia hepática.
O pulmão direito foi homogeneizado (0,1 g de tecido/mL) em solução tampão
contendo EDTA (0,1 mM), DTT (1 mM), Tris-HCl a pH = 7,0 (50 mM) e o inibidor de
protease PMSF (0,1 mM) em banho de gelo, utilizando-se homogeneizador Tissuemiser
(Fisher Scientific, Hampton, NH, USA). O homogenato resultante foi centrifugado a
10000 g e o sobrenadante (citosol) obtido armazenado em freezer a -20
o
C até o
momento da análise.
Amostras de citosol pulmonar foram analisadas por ELISA para a detecção de
MCYST-LR. O método utiliza anticorpos policlonais de coelho anti-MCYST-LR, com
reatividade cruzada também contra vários congêneres de microcistina. O método ELISA
competitivo direto, utilizado para estas análises, identifica o antígeno (a microcistina)
através de uma combinação de anticorpos secundários (anti – IgG) e anticorpos
primários anti–MCYST-LR. Entretanto, este método consegue detectar somente
microcistinas livres. Foram utilizados kits de ELISA comerciais da Beacon Analytical
Systems (Portland-ME, EUA), seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. O
limite de quantificação deste método corresponde a 0,1 ppb.
A quantificação do conteúdo MCYST-LR no pulmão e no fígado foi realizada no
Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias, Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
4.2.4 Ensaios bioquímicos de estresse e dano oxidativo
As análises de estresse oxidativo no pulmão foram realizadas no Laboratório de
Reparo Tecidual, Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Biologia
Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Para análise do desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes sofrido pelos
diferentes tecidos foram realizados ensaios bioquímicos que medem a atividade das
enzimas antioxidantes ou de marcadores de estresse e dano oxidativo.
O estresse oxidativo foi mensurado por atividade de enzimas antioxidantes como
a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD). Já o dano oxidativo foi avaliado pelo
método de estudo das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e foi
analisada ainda a atividade da mieloperoxidase (MPO), enzima lisossomal envolvida na
atividade bactericida de polimorfonucleares (usado como índice de acúmulo de
neutrófilos).
Para estas análises, os brônquios principais direito e esquerdo foram ocluídos
com fio de algodão e os pulmões separados. O pulmão esquerdo foi removido e
mantido a -70ºC por uma semana. Em seguida, foi homogeneizado (homogeneizador
modelo NT 136, Novatécnica, São Paulo, Brasil) com solução tampão (fosfato de
potássio 100 mM + EDTA 5 mM, solução final 1000 mL) e centrifugado (centrífuga
modelo 243M, FANEM, São Paulo, Brasil) a 7500 rpm durante dez minutos. Ao final, foi
medida a quantidade de proteína em cada amostra.
4.2.4.1 Dosagem de proteínas
A dosagem de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD,
1976), que utiliza o corante coomassie brilliant blue G-250 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EUA) para a determinação de proteínas totais em uma amostra. Tal método
consiste na interação entre o corante G-250 e macromoléculas de proteínas que
contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a
interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante estabiliza a forma
aniônica do mesmo, causando uma visível mudança de coloração inicialmente castanha
para tons em azul, de acordo com a concentração da proteína. G-250 ligado à proteína
tem sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Em uma placa de 96 poços,
prepara-se a curva padrão com albumina (1 mg/mL) em triplicata e, em seguida, o poço
teste (200 µL de reagente Bradford e amostra). Após completa mistura, observa-se se o
tom de azul do poço teste está entre o menor ou o maior valor da curva padrão. Uma
vez estabelecido o valor da amostra, distribui-se os diferentes grupos nos poços em
duplicata com volume final de 200 µL, colocando-se primeiramente o reagente Bradford
(maior quantidade) e por último a amostra (menor quantidade). Com auxílio de uma
pipeta faz-se a homogeneização. A leitura da placa foi realizada com leitor de ELISA
(Modelo 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) no comprimento de onda de 595 nm.
4.2.4.2 Medida do dano oxidativo
O dano oxidativo foi mensurado pelo método de estudo das substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (DRAPER & HADLEY, 1990). O ácido tiobarbitúrico
reage com lipídios de membrana oxidados gerando um subproduto da lipoperoxidação
(malondialdeído, MDA). MDA reage com TBA, gerando um produto colorido róseo lido
em espectrofotômetro (Ultrospec 2100 pro, Amersham-Biosciences, Buckinghamshire,
Inglaterra). Alíquotas do homogeneizado pulmonar dos grupos controle, toxina,
LassBio596 e dexametasona (200 µL) foram desproteinizadas com 800 µL de 10% de
ácido tricloroacético e centrifugadas a 1000 rpm por dez minutos. O sobrenadante (500
µL) foi misturado com 500 µL de TBARS 0,67%. A mistura foi aquecida por trinta
minutos em água fervente e, então, resfriada em temperatura ambiente por cinco
minutos. A fase orgânica contendo o cromógeno rosa foi extraída com 750 µL de n-
butanol e absorbância de 532 nm mensurada usando o espectrofotômetro (Ultrospec
2100 pro, Amersham-Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra). Os valores de TBARS
(nMol/mg proteína) foram expressos com base em uma curva padrão de MDA.
4.2.4.3 Medidas de Estresse Oxidativo
4.2.4.3.1 Superóxido dismutase (SOD)
A análise bioquímica que avalia a atividade da enzima antioxidante superóxido
dismutase (SOD) foi feita a partir da inibição da auto-oxidação da adrenalina. A SOD
constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a produção intracelular de radicais
livres. Está presente na matriz mitocondrial, no citosol e no meio extracelular.
Homogenatos pulmonares dos quatro grupos experimentais (diferentes doses: 20, 40 e
60 µL) foram diluídas em tampão glicina (ácido amino acético 3,75 mg/mL + 200 mL de
água destilada, com pH= 10,2), catalase (2,4 mg/mL de água destilada) e adrenalina
(60 mM). A mudança de cor na mistura foi detectada por espectrofotômetro, no
comprimento de onda de 480 nm. Os valores de SOD foram corrigidos pelo valor da
proteína de cada amostra (U/mg proteína) (BANNISTER & CALABRESE, 1987).
4.2.4.3.2 Catalase (CAT)
A análise bioquímica que avalia a atividade da enzima antioxidante catalase
(CAT), produzida por células e organelas, foi mensurada em resposta à quantidade de
peróxido de hidrogênio (AEBI, 1984). O consumo de H
2
O
2
gera diferença de cor medida
em espectrofotômetro no comprimento de onda de 240 nm. Assim, misturou-se 60 µL
do homogeneizado pulmonar dos quatro grupos experimentais com tampão fosfato e
peróxido de hidrogênio. 1,6 µL/mL. Os valores de CAT foram corrigidos pelo valor de
proteína de cada amostra (U catalase/mg proteína).
4.2.4.4 Mieloperoxidase (MPO)
Alíquotas do homogeneizado pulmonar (100 µL) foram extraídas pela adição de
0,5 mL de HTBA (brometo de cetildimetiletilamônio) em temperatura ambiente por 20
minutos. Após esse período as amostras foram acondicionadas em estufa a 60ºC por 2
horas. O material foi, então, centrifugado a 15000 rpm por 15 min. O sobrenadante (600
µL) foi adicionado a 450 mL de TMB (3,4,5-ácido trimetoxibenzóico, 8-dietilamina-octil
éster) e o substrato foi lido em leitor de ELISA (Modelo 550, Bio-Rad, Hércules, CA,
USA) a 655 nm. Os resultados foram referenciados com base em uma curva padrão de
mieloperoxidase
vs
. neutrófilos. Para a curva padrão, foi utilizada mieloperoxidase
purificada. O resultado foi dado como atividade de MPO (mU/mg proteína) (SUZUKI,
1983)
4.2.5 Histologia hepática
A análise histológica do fígado foi realizada no Laboratório de Poluição
Atmosférica Experimental, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (USP).
O fígado foi retirado do animal imediatamente após o término do experimento,
mergulhado em formol a 10% tamponado - Millonig (100 mL de formol 40%, 18,6 g de
NaH
2
PO
4
, 4,2 g de NaOH e 900 mL de água destilada) e, em seguida, processado e
corado com hematoxilina-eosina. Um patologista, que desconhecia a origem do
material, analisou as lâminas em aumentos de 100 e 400x.
4.3 Análise Estatística
Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
Inicialmente os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov (com
correção de Lilliefors) para avaliar a normalidade de suas distribuições. A seguir foi
aplicado o teste da mediana de Levene para verificar a igualdade de variâncias. Como
em todos os casos ambas as condições foram satisfeitas, foi aplicada análise de
variância para um fator (one-way ANOVA), seguida pelo teste de Student-Newman-
Keuls para comparações múltiplas, quando necessário.
Os parâmetros de morfometria foram submetidos à transformada arcoseno, para
posteriormente serem comparados.
Em todos os testes, o nível de significância considerado foi de 5%. As análises
estatísticas foram realizadas pelo programa Sigma Stat 3.11 (Systat Software, Inc., San
Jose, CA, USA).
RESULTADOS
5 RESULTADOS
5.1 MECÂNICA RESPIRATÓRIA
No intuito de avaliar o potencial terapêutico de LASSBio596 e dexametasona
sobre a função pulmonar de camundongos expostos a microcistina-LR, foram medidos
os parâmetros da mecânica pulmonar
in vivo
.
Os valores de volume e fluxo utilizados durante o experimento são mostrados na
tabela 1 e não variaram significativamente entre os grupos estudados.
Tabela 1: Fluxo e volume nos animais estudados.
Fluxo (mL/s) Volume (mL)
Ctrl 1,00 ± 0,001 0,20 ± 0,002
Tox 1,00 ± 0,004 0,20 ± 0,002
L596 1,00 ± 0,001 0,20 ± 0,002
Dexa 1,00 ± 0,000 0,20 ± 0,001
Os valores representam média ± EPM de 10 determinações por animal de 8-10 animais por
grupo. Ctrl, animais submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e
2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL. Após 6 horas,
novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.). Tox, animais
submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de (microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução
salina, solução final com 60 µl. Após 6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.).
L596, animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µl. Após 6 horas administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg
i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL). Dexa,
camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL). Após 6 horas administração de dexametasona diluída em
salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL). As medidas foram realizadas 8 horas após a
primeira injeção.
Os parâmetros de mecânica pulmonar (Est, ∆E, ∆P1, ∆P2 e ∆Ptot) observados
nos animais dos grupos Ctrl, Tox, L596 e Dexa estão representados nas figuras 15, 16
e 17. Os valores de ∆P1, ∆P2 e ∆Ptot do grupo Tox foram significativamente maiores do
que os valores do grupo Ctrl, enquanto o grupo L596 apresentou valores semelhantes
aos do Ctrl. Entretanto, o grupo Dexa mostrou-se semelhante ao Ctrl somente para
valores de ∆P2. Entre os tratamentos observamos que LASSBio 596 atuou em todos os
parâmetros e a dexametasona atuou somente nas alterações de ∆P2.
Ctrl
∆
P1 (cmH
2
O)
0
1
2
3
Tox L596 Dexa
b
a
a
b
Ctrl
∆
P2 (cmH
2
O)
0
1
2
3
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
Ctrl
∆
PTot (cmH
2
O)
0
1
2
3
Tox L596 Dexa
b
a
a
b
Figura 15. Pressões pulmonares necessárias para vencer os componentes resistivos (∆P1) e
viscoelástico/inomogêneo (∆P2) e pressão total exercida contra os componentes viscosos e
viscoelásticos do pulmão (∆Ptot). Foram realizadas 10 determinações em 8-10 animais por
grupo. Os valores são expressos como média + EPM nos grupos Ctrl [animais submetidos à
injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-
veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO
foram injetados (i.p.)]. Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR
(MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução
salina foram injetados (i.p.)]. L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR
diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio
596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)].
Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina
(1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. As medidas foram realizadas 8 horas após a primeira
injeção. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (p<0,05).
As figuras 16 e 17 mostram Est e ∆E mais elevados nos animais Tox do que nos
grupos Ctrl. A terapia nos grupos L596 e Dexa impediu tais modificações. Os dados da
mecânica pulmonar de cada animal separadamente são apresentados no anexo A.
Figura 16. Elastância estática (Est) do pulmão. Foram realizadas 10 determinações em 8-10
animais por grupo. Os valores são expressos como média + EPM nos grupos Ctrl [animais
submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo
volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]. Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40
µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após
6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.)]. L596 [animais submetidos à injeção i.p.
de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas
administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução
salina, solução final 200 µL)]. Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de
MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de
dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. As medidas foram
realizadas 8 horas após a primeira injeção. Letras diferentes indicam valores significativamente
diferentes (p<0,05).
Ctrl
Est (cmH
2
O/mL)
0
10
20
30
40
50
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
Figura 17. Componente elástico da viscoelasticidade do pulmão (∆E). Foram realizadas 10
determinações em 8-10 animais por grupo. Os valores são expressos como média + EPM nos
grupos Ctrl [animais submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e
2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o
mesmo volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]. Tox [animais submetidos à injeção i.p.
de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60
µl; após 6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.)]. L596 [animais submetidos à
injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após
6 horas administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de
solução salina, solução final 200 µL)], Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40
µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas
administração de dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. As
medidas foram realizadas 8 horas após a primeira injeção. Letras diferentes indicam valores
significativamente diferentes (p<0,05).
Ctrl
∆
E (cmH
2
O/mL)
0
3
6
9
12
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA
Visando a fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento
tecidual seguido à administração intraperitoneal de MCYST-LR e tratamento com
LASSBio 596 ou dexametasona, foram realizadas análises qualitativas e quantitativas
no tecido pulmonar.
5.2.1 Análise qualitativa
A figura 18 apresenta fotomicrografias do parênquima pulmonar dos grupos Ctrl,
Tox, L596 e Dexa. Podemos notar que a administração de MCYST-LR provocou
inflamação do parênquima pulmonar, evidenciada pela presença de espessamento de
septo e edema alveolares, principalmente nos grupo Tox e Dexa. Além disso, os
animais do grupo Tox apresentaram a maior área de colapso alveolar em comparação
com os demais. Os grupos L596 e Dexa também apresentaram áreas de colapso,
mostrando-se significativamente diferente de Ctrl e Tox, bem como entre si.
Figura 18. Fotomicrografias de parênquima pulmonar (200x) coradas com hematoxilina-eosina.
As fotos são representativas de animais dos grupos: Ctrl [animais submetidos à injeção
intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo),
solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram
injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-
LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução salina
foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR
diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio
596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)]; e,
Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina
(1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os pulmões foram retirados 8 horas após a primeira injeção
i.p. Setas indicam áreas de colapso. Barra = 100 µm.
L596
Dexa
100
µ
m
Ctrl Tox
5.2.2 Análise quantitativa
A figura 19 apresenta a análise morfométrica do parênquima pulmonar dos
animais dos grupos Ctrl, Tox, L596 e Dexa. Oito horas após a primeira injeção de
MCYST-LR já se observou aumento significativo de colapso alveolar nos grupos Tox,
L596 e Dexa.
A fração de área de alvéolos normais foi menor no grupo Tox em comparação
aos demais. LASSBio 596 impediu tais alterações e dexametasona minimizou as
mesmas. Os dados de cada animal individualmente são apresentados no anexo B.
Figura 19. Fração de área de alvéolos colapsados no parênquima pulmonar de camundongos
analisados 8 h após a primeira injeção i.p. O gráfico mostra animais dos grupos: Ctrl [animais
submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo
volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40
µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após
6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p.
de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas
administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução
salina, solução final 200 µL)]; e, Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de
MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de
dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem
à média + EPM de 5-10 campos por lâmina de 8-9 animais por grupo em um aumento de 200x.
Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (p<0,05).
Ctrl
Fração de colapso (%)
0
20
40
60
80
Tox L596 Dexa
b
a
c
d
5.3 ATIVIDADE DE MPO
Visando a avaliar o efeito terapêutico de LASSBio 596 e dexametasona na
resposta inflamatória aguda induzida por MCYST-LR, quantificamos a atividade da
enzima lisossomal Mieloperoxidase (MPO), usada como índice de neutrófilos
infiltrados, após exposição à MCYST-LR. Notamos que o grupo Tox apresentou maior
atividade de MPO em relação aos demais grupos. Ctrl, L596 e Dexa foram semelhantes
entre si. Os dados de cada animal separadamente são apresentados no anexo C
(Figura 20).
Figura 20: Atividade da mieloperoxidase (MPO) no pulmão de camundongos analisados 8 h
após a primeira injeção i.p. O gráfico mostra animais nos grupos: Ctrl [animais submetidos à
injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-
veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO
foram injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR
(MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução
salina foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR
diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio
596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)]; e,
Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina
(1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem à média + EPM de 3-5 animais
por grupo. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (p<0,05).
Ctrl
MPO (mU/mg proteína)
0
100
200
300
400
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE MCYST-LR POR ELISA
Com o intuito de avaliar a presença de MCYST-LR nos pulmões e nos fígados
dos camundongos, utilizamos um método imunoenzimático sensível e específico. A
análise por ELISA não detectou a presença de MCYST-LR livre no homogenato dos
pulmões de animais dos quatro grupos estudados. Já a análise do fígado evidenciou a
presença de MCYST-LR nos animais dos grupos Tox, L596 e Dexa em relação ao
controle. No entanto, não houve diferença significativa entre eles (Figura 21). Os dados
de cada animal separadamente são apresentados no anexo D.
Figura 21. Análise de microcistina-LR no fígado pelo método ELISA. O gráfico mostra
camundongos dos grupos: Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-
LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de
solução salina foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de
MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p.
de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final
200 µL)]; e, Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos
em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona
diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem à média + EPM
de 4-5 animais por grupo.
Tox
Microcistina-LR no fígado (ng/g)
0
2
4
6
L596 Dexa
5.5 ENSAIOS BIOQUÍMICOS DE ESTRESSE E DANO OXIDATIVO
Visando a avaliar o desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes sofrido pelos
tecidos após exposição à MCYST-LR, foram realizados ensaios bioquímicos que
determinam a atividade das enzimas antioxidantes ou de marcadores de estresse e
dano oxidativo.
A figura 22 mostra o dano oxidativo provocado pela exposição à MCYST-LR e os
respectivos tratamentos com LASSBio 596 e dexametasona. Observa-se que o grupo
Tox apresentou maior dano em relação ao Ctrl, L596 e Dexa e que os grupos tratados
não foram diferentes nem entre si nem do Ctrl. Os dados de cada animal
separadamente são apresentados no anexo E.
Figura 22: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no pulmão de camundongos
analisados 8 h após a primeira injeção i.p. O gráfico mostra animais nos grupos: Ctrl [animais
submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo
volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40
µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após
6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p.
de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas
administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução
salina, solução final 200 µL)]; e, Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de
MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de
dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem
à média + EPM de 3-6 animais por grupo, nesta análise o EPM foi muito baixo e por isso não é
visualizado no gráfico. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (p<0,05).
Ctrl
TBARS (nMol x 10
-2
/mg proteína)
0
1
2
3
4
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
A figura 23 apresenta a quantidade de catalase (CAT) no pulmão. A atividade da
catalase foi maior no grupo Tox em relação ao Ctrl, L596 e Dexa. Os grupos tratados
(L596 e Dexa) não foram diferentes entre si e nem do Ctrl, mas foram diferentes de Tox.
Os dados de cada animal separadamente são apresentados no anexo F.
Figura 23: Atividade da catalase no pulmão de camundongos analisados 8 h após a primeira
injeção i.p. O gráfico mostra animais nos grupos: Ctrl [animais submetidos à injeção
intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo),
solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram
injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-
LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução salina
foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR
diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio
596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)]; e,
Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina
(1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem à média + EPM de 3-5 animais
por grupo. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (p<0,05).
Ctrl
Catalase (U x 10
-1
/mg proteína)
0
2
4
6
8
Tox L596 Dexa
b
a
a
a
A figura 24 ilustra a atividade da superóxido dismutase (SOD). A atividade desta
enzima foi menor nos grupos Tox e Dexa comparados com Ctrl e L596. Os dois últimos
não apresentaram diferença entre eles, e o mesmo comportamento foi observado entre
Tox e Dexa. Pode-se observar ainda que entre os grupos tratados, L596 mostrou maior
atividade de SOD em relação à Dexa. Os dados de cada animal separadamente são
apresentados no anexo G.
Figura 24: Atividade da superóxido dismutase (SOD) no pulmão de camundongos analisados 8
h após a primeira injeção i.p. O gráfico mostra camundongos nos grupos: Ctrl [animais
submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo
volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]; Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40
µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após
6 horas 60 µL de solução salina foram injetados (i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p.
de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas
administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p., em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução
salina, solução final 200 µL)]; e, Dexa [camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de
MCYST-LR diluídos em solução salina, solução final com 60 µL; após 6 horas administração de
dexametasona diluída em salina (1 mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os valores correspondem
à média + EPM de 3-4 animais por grupo. Letras diferentes indicam valores significativamente
diferentes (p<0,05).
Ctrl
SOD (U/mg proteína)
0
100
200
300
400
Tox L596 Dexa
b
b
a
a
5.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DO FÍGADO
Com o intuito de avaliar o dano hepático provocado pela toxina da
Microcystis
aeruginosa
, foram realizadas análises patológicas qualitativas no tecido hepático. A
figura 25 apresenta fotomicrografias de cortes de fígados em HE (400x) de
camundongos nos grupos controle (Ctrl), injetado com MCYST-LR (Tox), injetado com
MCYST-LR e tratado com LASSBio 596 (L596) ou dexametasona (Dexa).
No grupo Ctrl está evidenciada a veia centro lobular e o espaço porta com
hepatócitos normais; a hialinização encontra-se dentro dos critérios de normalidade. No
painel Tox vê-se uma grande área de necrose, hialinização, hepatócitos em proliferação
e dilatação dos sinusóides hepáticos. Nos painéis L596 e Dexa observa-se áreas de
inflamação, necrose, hepatócitos em proliferação, perda da trabécula e vacuolização
em andamento, como no grupo Tox. O padrão histopatológico observado nos grupos
intoxicados por MCYST-LR condiz com os achados da literatura. Pode-se concluir, por
conseguinte, que LASSBio 596 e dexametasona não trataram a lesão provocada pela
toxina.
Figura 25. Fotomicrografias do fígado (400x) coradas com hematoxilina-eosina. As fotos são
representativas de animais nos grupos: Ctrl [animais submetidos à injeção intraperitoneal (i.p.)
de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final com 60
µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)]; Tox
[animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em
solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução salina foram injetados
(i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p.,
em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)]; e, Dexa
[camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina,
solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina (1
mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os fígados foram retirados 8 horas após a primeira injeção i.p.
(*, área de necrose; #, proliferação de hepatócitos, circulo, hialinização, retângulo,
vacuolização). Barra = 100 µm.
100
µ
m
*
#
inflamação
Ctrl
Veia Centro
Lobular
Espaço Porta
*
#
Dilatação dos
sinusóides
Tox
Dexa
#
inflamação
L596
Perda da
trabécula
*
DISCUSSÃO
6 DISCUSSÃO
A MCYST-LR é uma cianotoxina hepatotóxica, cujos efeitos deletérios no fígado
são extensamente conhecidos. Sabe-se que outros órgãos também podem ser afetados
e o nosso grupo já mostrou que o sistema respiratório pode ser atingido tanto estrutural
quanto funcionalmente (PICANÇO, 2004; SOARES, 2007). Há relatos na literatura de
intoxicação e morte de animais e seres humanos após exposição às MCYSTs. Nesse
sentido tornou-se necessário buscar medidas terapêuticas para contornar este
problema, no entanto, a literatura sobre o assunto ainda é muito escassa, mostrando
estudos apenas com animais e a grande maioria de forma profilática (NASSEM, 1990;
RAO, 2004; WENG, 2007).
No presente estudo, foram avaliados os efeitos terapêuticos de LASSBio 596 e
dexametasona sobre o processo inflamatório pulmonar agudo causado pela exposição
a doses subletais de MCYST-LR i.p., em camundongos saudáveis. Os resultados
mostraram que o LASSBio 596 manteve valores idênticos aos do grupo Ctrl em relação
à mecânica respiratória, enquanto o tratamento com dexametasona apenas reverteu
parcialmente as alterações funcionais causadas pela toxina. Entretanto, a análise
histológica do parênquima pulmonar nos grupos tratados evidenciou áreas de colapso
alveolar, embora em menor quantidade do que no grupo Tox, espessamento de septo e
presença de edema intersticial, principalmente no grupo Dexa. Além disso, também foi
observada maior atividade da enzima mieloperoxidase somente no grupo lesado e
tratado com salina, os grupos tratados com o candidato a fármaco (LASSBio 596) e o
fármaco (dexametasona) mostraram-se semelhantes ao grupo Ctrl. Houve, também,
estresse oxidativo, evidenciado pelas enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase
(SOD) e pelas substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) no pulmão.
Encontrou-se MCYST-LR livre no fígado de todos os grupos que receberam a toxina; a
histologia hepática não apresentou padrão de melhora em nenhum dos grupos.
O presente estudo é inédito pela comparação dos efeitos de um conhecido
agente farmacológico (dexametasona) com um candidato a fármaco concebido pela
hibridação molecular de dois outros igualmente conhecidos, talidomida e sildenafil (i.e.,
LASSBio 596) sobre a função pulmonar, morfometria, recrutamento de células
inflamatórias, presença da toxina nos tecidos pulmonar e hepático, estresse oxidativo e
histologia do fígado, em um modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) induzida por
MCYST-LR. Estudo anterior em modelo experimental de LPA induzida por LPS de
E.
coli
revelou que LASSBio 596 protegeu os camundongos, mantendo os valores das
variáveis mecânicas semelhantes àqueles do grupo controle, e apresentando menor
colapso alveolar, com normalização do número de polimorfonucleares (células
inflamatórias) (ROCCO, 2003). Outro estudo do nosso grupo avaliou o efeito profilático
do LASSBio 596 sobre a função pulmonar e o remodelamento em um modelo de
sensibilização alérgica crônica e, provou que este medicamento inibe alterações na
mecânica pulmonar, histologia, broncoconstrição e fibroproliferação (CAMPOS, 2006).
Seguindo esta linha, ainda em 2006, LASSBio 596 foi aplicado em um modelo de lesão
por isquemia e reperfusão pulmonar, sendo observado melhora dos parâmetros
histológicos e de mecânica pulmonar (MORARD, 2006). Assim, nosso trabalho amplia
esses conhecimentos, estudando, pela primeira vez, os efeitos do LASSBio 596 sobre a
função, histologia e bioquímica pulmonares, bem como histologia hepática em
camundongos intoxicados por MCYST-LR. Além disso este tratamento foi comparado
com a dexametasona.
Uma parte importante da interpretação dos resultados de uma pesquisa biológica
é a cuidadosa seleção da espécie a ser utilizada. Existe uma enorme variedade de
espécies animais disponíveis e, como regra geral, a espécie filogeneticamente mais
próxima à humana possui a melhor correlação clínica. Os modelos experimentais
auxiliam na compreensão dos fenômenos naturais e possibilitam o estudo de estruturas
e órgãos de difícil acesso em seres humanos. A possibilidade de controlar as variáveis
ambientais, sociais e patológicas em animais de experimentação também justificou, no
nosso experimento, a escolha de pequenos animais. Diversas espécies de
camundongo e rato têm sido utilizadas para avaliar os efeitos da MCYST nos diferentes
sistemas, sendo facilmente encontrado os valores da DL
50
desta toxina de acordo com
sexo e espécie do animal. Sendo assim, escolhemos camundongos Suíços machos
adultos, os quais são largamente utilizados para estudos com MCYST e não
necessitam de um período muito longo de tempo para se encontrarem em condições de
uso, após seu nascimento. Um aspecto que deve ser ressaltado quanto ao uso de
animais dessa linhagem diz respeito ao fato desta não ser isogênica. Para alguns
estudos esta pode ser uma característica que compromete a correta interpretação dos
resultados, uma vez que o padrão de resposta observado poderá apresentar grande
variabilidade. Neste estudo, a utilização de oito a dez camundongos por grupo foi
suficiente pra detectar diferenças significativas entre os mesmos.
Existem poucos grupos de pesquisa no mundo se dedicando a investigar os
efeitos de MCYSTs no pulmão e nenhum grupo avaliando a terapêutica desta lesão.
Entretanto, os resultados obtidos com esta dissertação e outros estudos já citados
demonstram que este é um órgão claramente afetado por essas cianotoxinas, mesmo
em doses sub-letais, por diferentes vias de exposição. Deve-se ter em mente que a
exposição de animais e humanos a pequenas concentrações de MCYST na água é
certamente muito mais freqüente do que a intoxicação letal. No entanto, muitos casos
em seres humanos não são divulgados pelo desconhecimento, tanto por parte do
paciente quanto do médico, dos sintomas provocados por tal intoxicação por
cianotoxinas e, por isso, não existe um tratamento medicamentoso estabelecido. Neste
trabalho todos os animais estavam expostos às mesmas condições cirúrgica e
ventilatória, podendo-se admitir que as alterações encontradas foram decorrentes
exclusivamente da administração da toxina e das substâncias e não de uma
interferência causada pelo tipo de preparação.
Os camundongos utilizados neste estudo sofreram randomização no tocante ao
efeito dos tratamentos com salina, LASSBio 596 ou dexametasona, entretanto alguns
animais morreram após anestesia. Não houve óbito dos animais após injeção de
MCYST-LR, uma vez que a dose escolhida está abaixo da LD50. O desenho
experimental foi proposto com base em um trabalho prévio do nosso grupo que
analisou os efeitos temporais da intoxicação por MCYST-LR (40 µg/kg) no pulmão
(SOARES, 2007). Esse estudo mostrou que o montante de células polimorfonucleares
(PMN) aumentou, chegando ao pico em 2 e 8 horas e que todos os componentes da
mecânica respiratória encontravam-se igualmente aumentados em todos os tempos
analisados. Concluiu, ainda, que a MCYST-LR acarreta resposta inflamatória aguda no
tecido pulmonar, que permaneceu até 96 horas. Já com relação ao candidato a
fármaco, o tempo de administração foi baseado no trabalho de Rocco e colaboradores
(2003), que estudaram os efeitos do LASSBio 596 sobre a função e histologia
pulmonares na dose de 10 mg/kg administrada por via i.p. em um modelo de LPA
induzida por LPS. Os autores injetaram a molécula 1 hora antes e 6 horas depois da
lesão pulmonar, mostrando que o mesmo preveniu as alterações na mecânica
pulmonar, modulou o processo inflamatório e bloqueou a resposta fibroproliferativa,
independentemente do momento da injeção. O nosso estudo teve como objetivo
estudar a terapêutica da lesão pulmonar induzida por doses subletais de MCYST-LR.
Como os trabalhos profiláticos contra a intoxicação são muitos e o nosso objetivo era
realmente o tratamento, optamos por induzir a lesão, tratar os animais 6 horas depois e
analisá-los 2 horas após o tratamento, totalizando 8 horas, que foi um dos picos da
lesão segundo Soares em 2007. A dexametasona foi incluída na pesquisa, uma vez
que é um fármaco utilizado em muitas afecções na prática clinica e já foi utilizada como
tratamento profilático em intoxicações por MCYST-LR com considerável eficácia
(ROCHA, 2000; NOBRE, 2001, 2003).
Neste estudo, medidas da função pulmonar foram usadas como instrumentos
para analisar o valor terapêutico de LASSBio 596 e dexametasona. Mensurar
parâmetros da função pulmonar em animais tão pequenos quanto os camundongos
representa um desafio. Entretanto, está comprovado que, com o equipamento
adequado, como foi o caso do presente estudo, as medidas são fiéis e fornecem
informações importantes para a compreensão dos mecanismos envolvidos nas doenças
pulmonares (IRVIN & BATES, 2003).
Uma vez que os agentes terapêuticos testados atuam no pulmão, optamos pela
retirada da parede torácica ântero-lateral, pois, assim, a medida da pressão na abertura
das vias aéreas representa a pressão transpulmonar, isto é, aquela utilizada para
movimentar o pulmão, simplificando a preparação. Ademais, evita-se o ruído mecânico
introduzido nas medidas pelo batimento cardíaco, levando, assim, à maior precisão nos
dados obtidos.
Em função dessa retirada, para evitar o colapso das vias aéreas e manter a
capacidade residual funcional fisiológica, o valor da PEEP a ser aplicado foi medido em
cada animal e, em média, correspondeu a 2 cmH2O, como descrito em ratos por
Saldiva e colaboradores (1992).
Além disso, durante a anestesia, há formação de áreas de atelectasia com
consequente redução da capacidade residual funcional (CRF) (POWERS, 1973;
HEDENSTIERNA, 1990). A aplicação de PEEP leva a pelo menos três conseqüências
fisiológicas individualizadas: manutenção do número de alvéolos ventilados, queda do
débito cardíaco e redistribuição do fluxo sanguíneo pulmonar (POWERS, 1973), sendo
que os dois últimos são evitados pela remoção do plastrão esternal, como no presente
estudo, pois não há compressão da veia cava e nem da aorta.
Foi observado aumento significativo dos parâmetros de função pulmonar nos
grupos injetados com MCYST-LR e tratados com salina em relação ao Ctrl, confirmando
a indução da lesão e reproduzindo os achados de Soares (2007). Outros trabalhos na
literatura estão de acordo com o nosso, uma vez que relacionaram alterações na
mecânica pulmonar como resultado do processo inflamatório, tais como: veneno de
cobra e lipopolyssacarídeo e, além disso, os dados dos animais do nosso grupo
controle estão de acordo com os valores apresentados na literatura para este grupo
(FAFFE, 2000; SILVEIRA, 2004). O grupo tratado com LASSBio 596 apresentou todos
os parâmetros de mecânica pulmonar semelhantes aos do grupo controle, sem
diferença significativa, e o grupo dexametasona foi semelhante ao controle somente
para os componentes elástico (Est), elástico da viscoelasticidade (∆E) e viscoelástico
e/ou inomogêneos do pulmão (%P2), (Figuras 15, 16 e 17). Há várias técnicas
desenvolvidas para a análise da mecânica respiratória, porém o método de oclusão das
vias aéreas ao final da inspiração difundiu-se por apresentar a vantagem de
individualizar variações de pressões em seus componentes resistivos, elásticos e
viscoelásticos e/ou inomôgeneos (BATES, 1985a). Avanços importantes ocorreram
clínica e experimentalmente a partir desse conhecimento.
Em um animal destituído de sua parede torácica e, considerando-se o volume
corrente e o fluxo aéreo constantes, as alterações observadas em ∆Ptot refletem as
modificações nos componentes resistivos e viscoelásticos e/ou inomogêneos do
pulmão. ∆P1 reflete a pressão dissipada para vencer a resistência de vias aéreas
centrais (SIMILOWSKI, 1989). ∆P2 está relacionada ao relaxamento por tensão
(
estresse relaxation
) do tecido pulmonar, juntamente com pequena contribuição do
pendelluft
(BATES, 1988; D’ANGELO, 1989; SALDIVA, 1992).
Portanto, o aumento das pressões resistivas (%P1) no pulmão de camundongos
injetados com a toxina e tratados tanto com salina quanto com dexametasona, sugere
que as vias aéreas são afetadas de alguma forma e que há recuperação total após
injeção de LASSBio 596. O aumento das pressões necessárias para vencer os
componentes elásticos (Est) e viscoelástico e/ou inomogêneos (%P2), indicam um
enrijecimento pulmonar, lembrando que o grupo tratado com LASSBio 596 retornou os
parâmetros de mecânica para valores semelhantes aos do grupo Ctrl e que o grupo
Dexa ainda apresentou valores de ∆P1 e ∆PTot semelhantes ao grupo Tox, atuando de
forma significativa em ∆P2, Est e ∆E, reduzindo-os a valores de Ctrl. Tais achados
funcionais podem ser explicados pelas alterações morfológicas do parênquima
pulmonar evidenciadas na microscopia óptica e pela análise da enzima MPO, discutidos
a diante (Figuras 18, 19 e 20).
O colapso alveolar nos grupos Tox, L596 e Dexa, mais marcadamente em Tox
(Figura 19) acarretou heterogeneidade do parênquima pulmonar e contribuiu para o
aumento de ∆P2, ∆E e da Est (BATES, 1985a,b). Outros fatores também podem ter
contribuído para essa alteração, como distorção dos alvéolos patentes, o processo
inflamatório desencadeado e disfunção do surfactante pulmonar. Cabe ressaltar que
embora tenha havido colapso nos grupos tratados, estes foram em menor grau e
significativamente diferentes do grupo Tox, mostrando um princípio da recuperação do
parênquima. Isto pode ser explicado pelo curto período de ação dos fármacos (2 horas).
Vemos, ainda, nesse gráfico que o grupo L596 apresentou menos colapso do que o
grupo Dexa. O processo inflamatório evidenciado pelo espessamento do septo alveolar,
recrutamento de células inflamatórias e presença de edema intersticial no tecido
pulmonar nos grupos Tox e Dexa (Figuras 18 e 20) pode, potencialmente, comprometer
a síntese e/ou armazenamento do surfactante pulmonar, elevando a tensão superficial,
gerando, assim, áreas de colapso com conseqüente aumento da Est.
Fotomicografias das vias aéreas mostraram constrição das mesmas nos grupos
Tox e Dexa, podendo ser uma possível explicação para o aumento do componente
resistivo (∆P1), uma vez que a constrição das vias aéreas aumenta a resistência à
passagem do ar. Com essa constatação, podemos supor então, que o ∆P1 do grupo
Dexa não diminuiu porque o referido grupo apresentou mais áreas de colapso em
relação ao L596, influxo de células inflamatórias e vias aéreas constrictas, semelhantes
aos do grupo Tox, observadas qualitativamente (Figura 26).
Figura 26. Fotomicrografias das vias aéreas (400x) coradas com hematoxilina-eosina. As fotos
são representativas de animais dos grupos: Ctrl [animais submetidos à injeção intraperitoneal
(i.p.) de 57,5 µL de solução salina e 2,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO-veículo), solução final
com 60 µL; após 6 horas, novamente o mesmo volume de salina e DMSO foram injetados (i.p.)];
Tox [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de microcistina-LR (MCYST-LR) diluídos em
solução salina, solução final com 60 µl; após 6 horas 60 µL de solução salina foram injetados
(i.p.)]; L596 [animais submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução
salina, solução final com 60 µl; após 6 horas administração i.p. de LASSBio 596 (10 mg/kg i.p.,
em 2,5 µL de DMSO e 197,5 µL de solução salina, solução final 200 µL)]; e, Dexa
[camundongos submetidos à injeção i.p. de 40 µg/kg de MCYST-LR diluídos em solução salina,
solução final com 60 µL; após 6 horas administração de dexametasona diluída em salina (1
mg/kg i.p., solução final 100 µL)]. Os pulmões foram retirados 8 horas após a primeira injeção
i.p. Barra = 100 µm.
Ctrl
L596
Tox
100 µm
Dexa
Em 2003, GUPTA e colaboradores conduziram um estudo, comparando a
toxicidade de três variantes de MCYST por via i.p. na dose de 1 LD
50
em camundongos.
A histologia pulmonar evidenciou lesões predominantemente nos brônquios e
parênquima pulmonar, além de inflamação, congestão, necrose e hiperplasia do epitélio
brônquico, edema e hemorragia entre 30 e 60 minutos após a injeção. Além disso, as
fotomicrografias daquele estudo assemelham-se às nossas (Figura 26), uma vez que
evidenciaram estenose e oclusão de bronquíolos. Entretanto, este trabalho não mediu
parâmetros de mecânica respiratória, nem avaliou a histologia pulmonar de forma
qualitativa, assim, não podem ser comparados diretamente com os nossos resultados.
Um estudo anterior conduzido pelo nosso grupo de pesquisa mostrou que a
injeção i.p. de extrato de cianobactérias contendo MCYST-LR também induziu a um
processo inflamatório rápido, com presença de colapso alveolar, influxo de células
inflamatórias no parênquima pulmonar e edema intersticial (PICANÇO, 2004). No
entanto, como o extrato contém outros metabólitos secundários, era de fundamental
importância estudar os efeitos da toxina purificada (SOARES, 2007) Neste trabalho, foi
utilizada MCYST-LR padrão, com grau de pureza superior a 95% e foram obtidos
resultados semelhantes ao estudo de Picanço e colaboradores (2004), evidenciando,
assim, que os efeitos encontrados haviam sido provocados pela toxina. Nesse sentido,
o nosso trabalho utilizou MCYST-LR purificada, reproduzindo os dados anteriores em
relação ao estabelecimento da lesão pulmonar aguda induzida pela toxina, analisada
pela mecânica e histologia pulmonares.
Em relação ao candidato a fármaco LASSBio 596 podemos observar que é
eficaz em diferentes modelos de lesão pulmonar, tais como: induzida por LPS,
sensibilização alérgica com ovalbumina, isquemia e reperfusão; nosso estudo mostrou
a eficácia do mesmo em um modelo de LPA induzida por MCYST-LR (ROCCO, 2003;
CAMPOS, 2006; MORARD, 2006). Rocco e colaboradores evidenciaram aumento de
todos os parâmetros da mecânica pulmonar após LPA induzida por LPS, que foram
revertidos a valores de controle após administração i.p. de LASSBio 596 na mesma
dose aplicada em nosso estudo (10 mg/kg). Além disso, o candidato a fármaco inibiu o
recrutamento de neutrófilos e a liberação de TNF-α, ou seja, modulou o processo
inflamatório, assim como em nosso estudo que observou redução na atividade da
enzima MPO no grupo L596. Em 2006 o mesmo grupo aplicou LASSBio 596 (10 mg/kg)
e dexametasona (1mg/kg) em um modelo crônico experimental de asma alérgica e
descreveu que ambos os fármacos atuam igualmente na função pulmonar, no entanto,
LASSBio 596 preveniu as alterações no tecido pulmonar de forma mais efetiva. O
mesmo padrão estrutural foi observado em nosso estudo, onde LASSBio 596
apresentou menor fração de áreas de colapso quando comparado com Dexa.
O LASSBio 596, projetado estruturalmente como híbrido de talidomida e
sildenafil, exibe um amplo perfil antiinflamatório e imunomodulatório (LIMA
,
2002). A
molécula deste análogo da talidomida não contém o anel glutarimidio, responsável
pelos efeitos teratogênicos da talidomida, o que garante a ausência de quaisquer
eventuais efeitos teratogênicos no uso de LASSBio 596. O mecanismo pelo qual o
LASSBio 596 modula o processo inflamatório está relacionado à inibição dos tipos 4 e 5
da fosfodiesterase (PDE). Os tipos 4 e 5 das isoenzimas de PDE regulam a quebra dos
segundos mensageiros intracelulares AMP-cíclico e GMP-cíclico, respectivamente. A
inibição de PDE aumenta os níveis intracelulares do AMP-c e do GMP-c, conduzindo à
inibição da função de vários tipos de células incluindo linfócitos, monócitos, macrófagos,
neutrófilos, células endoteliais, e as células epiteliais do pulmão (TEIXEIRA, 1997). O
composto 596 apresenta perfil antiinflamatório duplo, agindo sobre as isoenzimas de
PDE e reduzindo os níveis de TNF-α.
Certamente, os efeitos antiinflamatórios resultantes da inibição da PDE4
(SEKUT, 1995; MIOTLA, 1998; ESSAYAN, 2001) e da PDE5 (ICHINOSE, 1998, 2001) e
o efeito sobre o TNF-α (LIMA, 2002) contribuíram para os resultados favoráveis do
LASSBio 596 observados no presente estudo.
A presença de MCYSTs no pulmão após a administração da toxina via i.p. já foi
demonstrada em vários trabalhos utilizando-se MCYST marcada de diferentes formas
(BROOKS & CODD, 1987; ROBINSON, 1989; NISHIWAKI, 1994; STOTTS, 1997a,b;
SOARES, 2007; WANG, 2008). ITO e colaboradores (2001) demonstraram que a
MCYST-LR é capaz de alcançar a corrente sanguínea e outros órgãos, a partir do
pulmão. A toxina foi detectada no pulmão, fígado e rins após a instilação intratraqueal
(i.t.). Embora os autores relatem que não houve danos ao tecido pulmonar, nenhuma
avaliação histopatológica detalhada foi realizada e as fotomicrografias pulmonares
apresentadas no artigo mostram áreas de colapso alveolar.
Outro trabalho utilizando MCYST-LR mostrou que a exposição de camundongos
via aerosol gerou necrose ou inflamação das células epiteliais respiratórias da cavidade
nasal, com presença de infiltrado neutrofílico, degeneração, necrose e atrofia das
células epiteliais olfatórias (BENSON, 2005). Entretanto, nenhuma lesão foi observada
no parênquima pulmonar. Cabe ressaltar que já foi demonstrado que a DL
50
da MCYST-
LR por via nasal é similar àquela da via intravenosa ou intraperitoneal - 50 µg/kg (ITO,
2001; FITZGEORGE, 1994). Benson
e colaboradores. (2005) utilizaram a MCYST-LR
numa dose máxima de 12,5 µg/kg de peso corpóreo, talvez por isso não tenham
encontrado efeitos pulmonares ou em outros órgãos. Nesse trabalho embora tenha sido
utilizada um dose subletal de MCYST-LR (40 µg/kg), foram observadas alterações
funcionais, estruturais e bioquímicas no pulmão, ressaltando a gravidade da exposição
humana a estas cianotoxinas.
O método de ELISA identificou MCYST-LR livre no tecido hepático de todos os
grupos que receberam MCYST-LR e, entretanto, não a identificou no tecido pulmonar.
A provável explicação para este fato reside na especificidade da toxina pelo fígado
(MORENO, 2005), já que é rapidamente captada pelos transportadores de sais biliares
presentes no hepatócito (ROBINSON, 1991; CARMICHAEL, 1994). Quando a toxina é
injetada no peritônio, ela alcança a corrente sangüínea, inicialmente pela circulação
porta, facilitando a sua chegada ao fígado. Esse transporte ocorre de forma rápida,
sendo descritos tempos entre 1 e 60 minutos para a chegada de mais de 60% de
MCYST no fígado após injeção i.p. (BROOKS & CODD, 1987; ROBINSON, 1989). Ao
entrar no hepatócito, a MCYST forma ligação covalente com as PP 1 e 2A, inibindo a
atividade dessas enzimas e iniciando um processo de desestruturação do citoesqueleto
dos hepatócitos, que culmina com a morte celular, principalmente pelo mecanismo de
apoptose (DING, 1998a,b). Quando o hepatócito se rompe, as MCYSTs entram
novamente na circulação sangüínea, só que agora, possivelmente conjugadas a uma
PP ou parte dela, através do aminoácido Mdha. Ainda no fígado, as MCYSTs podem
ser detoxificadas pela GSH e formar conjugados, também através do aminoácido Mdha
(KONDO, 1996). Esses conjugados são menos tóxicos do que a forma livre da toxina,
tanto
in vivo
quanto
in vitro
, já que não podem mais formar ligação covalente com as PP
(ITO, 2001; KONDO, 1992; METCALF, 2000). Esse comportamento das MCYSTs nos
leva a pensar que a toxina que chega ao pulmão pelo sangue não se encontra na sua
forma livre, não sendo, portanto, detectada pelo ELISA. Quanto ao fígado observamos
que nenhuma das moléculas foi capaz de alterar este perfil. Isto pode estar aliado ao
padrão histopatológico, o qual não demonstrou recuperação, a análise qualitativa dos
grupos tratados foi semelhante a do grupo Tox.
Estudos indicam que as MCYSTs circulam no sangue ligadas às proteínas
fosfatases, muito mais do que na sua forma livre (HILBORN, 2005). Sendo assim, ao
analisar a presença de MCYST por ELISA pode-se subestimar suas concentrações no
sangue ou nos tecidos. Além disso, a hipótese de que a forma livre da toxina tenha
alcançado o pulmão em concentrações muito baixas não pode ser descartada.
A injeção i.p. de MCYST-LR é capaz de estimular os macrófagos peritoniais a
produzir mediadores inflamatórios, como TNF-# e IL-1. Este achado foi observado por
NAKANO (1991) após a administração i.p. de MCYST-LR e de extratos tóxicos de
Microcystis aeruginosa
a camundongos. IL-1 é um importante estimulador da migração
de PMN para o parênquima pulmonar (WAGNER & ROTH, 2000) e TNF-# age
preparando o endotélio para a migração celular. Logo, caso a MCYST-LR não tenha
alcançado os pulmões, é possível que o processo inflamatório tenha sido
desencadeado por citocinas produzidas por macrófagos peritoniais e carreadas pela
corrente sanguínea, o que levaria à ativação de células em diferentes tecidos, inclusive
o pulmão. Em modelo de LPA induzida por LPS, pela via inalatória, Faffe e
colaboradores (2000) demonstraram que a liberação de TNF-α (medida no lavado
bronco alveolar) foi dependente do tempo, atingindo niveis máximos 3 horas após a
inalação. Não existe trabalho na literatura demonstrando a ação do TNF-α no pulmão
após intoxicação por MCYST. No entanto, assim como no modelo de LPA induzido por
LPS tenha essa rápida liberação, o modelo de LPA induzida por MCYST-LR também
pode apresentar tal comportamento, explicando o processo inflamatório no pulmão.
Experimentos
in vitro
demonstraram que MCYSTs são capazes de estimular
macrófagos alveolares a produzir prostaglandinas F2 e PGE2, além de tromboxano B2
e ácido aracdônico (NASEEM, 1989; NOBRE, 2001, 2003). Além disso, como o
mecanismo de hepatotoxicidade das MCYSTs não se dá somente pela inibição das PP,
mas também pela indução de estresse oxidativo, então, esse poderia ser um possível
mecanismo de lesão pulmonar. Caso a MCYST-LR livre tenha de fato atingido o
pulmão, mesmo em concentrações muito pequenas, é possível que tenha promovido a
resposta inflamatória também de forma direta. Uma hipótese levantada por nós de
acordo com os dados apresentados nesta dissertação é de que: o processo inflamatório
desenvolvido no pulmão é secundário à intoxicação gerada no fígado e então, através
da liberação pelo fígado, principalmente de citocinas inflamatórias e espécies reativas
de oxigênio (ERO), os efeitos agudos da toxina atinjam o pulmão.
Nesse sentido, foi medida em nosso trabalho a atividade da enzima
mieloperoxidase (MPO) (Figura 20), que traduz a resposta de leucócitos PMN a um
processo inflamatório (SUZUKI, 1983). Podemos perceber, pela análise da Figura 20,
que tal enzima estava aumentada no grupo Tox em comparação com os demais e que
estes não apresentaram diferença entre si. Tal dado está de acordo com a
porcentagem de colapso alveolar no parênquima pulmonar dos camundongos Tox
(Figura 19). Logo, este é mais um resultado que confirma a presença do processo
inflamatório instalado no pulmão. Ainda na figura 20 vemos que não há diferença entre
os tratamentos e que são semelhantes ao grupo controle, mostrando a eficácia de
ambos em reduzir o processo inflamatório, no entanto Dexa ainda mostra maior
pocentagem de colapso alveolar quantitativa e qualitativamente.
Já foi relatado que a hepatotoxicidade induzida pela MCYST está fortemente
associada com a formação de ERO e apoptose nos hepatócitos (DING, 1998; WENG,
2007). Além disso, já foi igualmente comprovado que MCYSTs provocam estresse
oxidativo em diversas espécies, tais como: camundongo (GEHRINGER, 2004), rato
(MORENO, 2003) peixes (PRIETO, 2006) e seres humanos (SICISNSKA, 2006;
KUJBIDA, 2006, 2008). O pulmão também pode ser danificado pelo processo
inflamatório, através da produção de ERO pelas células de defesa ativadas, como
neutrófilos, monócitos e macrófagos. Esse fenômeno explicaria o aumento do colapso
alveolar nos camundongos injetados com MCYST-LR, já que pneumócitos tipo II
danificados não produzem surfactante em quantidades adequadas.
Como resultado do estresse oxidativo, tais espécies animais tentam reduzir o
dano utilizando-se do sistema de defesa antioxidante. Foram medidas pela primeira
vez, neste estudo, algumas enzimas envolvidas na cadeia do estresse oxidativo (SOD e
CAT), bem como o dano oxidativo, avaliado pelo método das substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) em amostras de tecido pulmonar de camundongos
intoxicados com MCYST-LR e tratados com dexametasona e LASSBio 596. (Figuras
22, 23, 24).
Sabe-se que a peroxidação lipídica (ou lipoperoxidação) é um indicativo de que a
condição de estresse oxidativo está estabelecida (JAYARAJ, 2006; WENG, 2007). A
lipoperoxidação é uma cascata de eventos e cada evento da reação, a partir do radical
lipídico, gera um subproduto que pode ser dosado para quantificar dano oxidativo. O
TBARS está no início dessa cascata de eventos.
Já foi mencionado que tanto o aumento, quanto a redução, na atividade de
enzimas antioxidantes indica o aumento da produção de ERO (MORENO, 2005;
PRIETO, 2006). Além disso, alguns autores afirmam que biomarcadores do estresse
oxidativo são excelentes ferramentas para monitorar o efeito das MCYSTs no fígado,
devido à afinidade das MCYSTs por este órgão (ATENCIO, 2008; ANDRINOLO, 2008).
Além disso, o fígado tem sido descrito como o órgão mais importante envolvido na
regulação do metabolismo redox; logo, o seu equilíbrio oxidativo pode estar mais
significativamente afetado pela toxina (PRIETO, 2006). Nosso estudo mostrou aumento
de TBARS no grupo Tox, que não foi visto nos outros grupos, podemos afirmar, então,
que se instalou a condição de estresse oxidativo no pulmão destes animais e que os
fármacos preveniram tal condição.
O sistema SOD-CAT é a primeira linha de defesa contra as ERO (FORONJY,
2006). SOD catalisa a dismutação do ânion superóxido a oxigênio molecular e peróxido
de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é detoxificado pela atividade da CAT e
geralmente ambas respondem igualmente após exposição a um contaminante
(PANDEY, 2003). O presente trabalho identificou redução na atividade da SOD nos
grupos Tox e Dexa (Figura 24) e aumento na atividade de CAT no grupo Tox. Muitos
trabalhos afirmam que o consumo das enzimas antioxidantes, no fígado e no rim de
diversas espécies, bem como o aumento da peroxidação lipídica (JAYARAJ, 2006;
WENG, 2007), ocorrem em situação de estresse oxidativo (MORENO, 2005; SICINSKA,
2006; JAYARAJ, 2006; PRIETO, 2006, 2007; ATENCIO, 2008), confirmando os nossos
achados e relacionando-os com o pulmão.
Houve, de fato, o consumo de SOD nos grupos tratados com salina e
dexametasona (Tox e Dexa), indicando, mais uma vez, a condição de estresse
oxidativo neste grupo lesado. O grupo tratado com Dexa não apresentou aumento de
TBARS; entretanto, teve a enzima SOD consumida, caracterizando o estresse
oxidativo. Já o grupo L596 apresentou a atividade da enzima SOD semelhante à do
grupo Ctrl, mostrando a sua eficácia em manter o equilíbrio redox. Contrariamente, a
enzima CAT apresentou-se aumentada no grupo Tox e, para isto, existem algumas
explicações. Os autores discutem que o estímulo pela MCYST-LR aumenta a produção
do ânion superóxido, e, como este é catalisado pela SOD, sua atividade diminui, como
visto em nossos resultados. Como SOD-CAT formam um sistema complementar de
defesa antioxidante, a atividade de CAT também estaria diminuída pelo excesso do
radical superóxido. No entanto, dois trabalhos mostram aumento destas enzimas em
fígado e rim de peixes (JOS, 2005; CAZENAVE, 2006). O primeiro expôs os animais
oralmente à água contaminada com MCYST-LR (60 µg/peixe/dia) e avaliou a resposta
14 e 21 dias depois, observando aumento de SOD e CAT nestes animais. Jos e
colaboradores (2005) explicam os resultados afirmando que o tempo de exposição foi
longo e a dose pequena, em se tratando de peixes, e que os peixes desenvolveram
uma resposta defensiva após exposição às MCYSTs. Cazenave e colaboradores (2006)
expuseram os animais a diferentes concentrações de MCYST-RR e observaram
aumento de CAT em concentrações menores, corroborando a hipótese da resposta
protetora. Entretanto, cabe ressaltar que em nosso estudo injetamos uma dose subletal
de MCYST-LR i.p. em camundongos que foram avaliados 8 horas depois (tecido
pulmonar). Assim, os trabalhos citados estão muito distantes do nosso modelo
experimental. Por outro lado, Moreno e colaboradores (2005) injetaram (100 e 150
µg/kg MCYST-LR i.p.) em ratos e analisaram as enzimas participantes da cadeia do
estresse oxidativo, entre elas SOD e CAT, bem como a peroxidação lipídica no fígado e
no rim dos animais. Aqueles autores observaram redução de todas as enzimas e
aumento da peroxidação lipídica em ambos os órgãos, porém o fígado apresentou as
respostas de forma mais acentuada e os autores confirmam os efeitos órgão
específicos da MCYST-LR pelo fígado. Esta pode ser uma explicação viável para os
nossos resultados, uma vez que analisamos o tecido pulmonar.
Com relação à histologia hepática nenhum tratamento mostrou-se eficaz em
reverter a lesão e o padrão patológico encontrado já foi descrito por outros autores
(DAWSON 1998; AZEVEDO, 2002; GUPTA, 2003; ANDRINOLO, 2008). Acreditamos
ser o curto tempo de exposição aos medicamentos, apenas 2 horas, comparada com a
rápida chegada da MCYST-LR a este órgão (2 horas) (SOARES, 2007), o fato de não
ter havido recuperação. Ademais, as moléculas utilizadas têm espectro de ação
antiinflamatório e não atuariam na ligação MCYST com as PPs, origem da cascata de
eventos disparada no fígado.
Comparando-se os tratamentos, podemos perceber que o LASSBio 596 foi mais
eficaz, reduzindo todos os parâmetros de mecânica pulmonar, o processo inflamatório e
as enzimas antioxidantes estudadas, mas não atuando de forma terapêutica no fígado
dos camundongos. Dexametasona melhorou parcialmente a mecânica pulmonar, o
processo inflamatório e as enzimas antioxidantes no pulmão, e também não mostrou
resultado na histologia hepática. Ambos são antiinflamatórios, no entanto LASSBio 596
age nas principais fosfodiesterases do pulmão (4 e 5) e há relato de que a talidomida é
capaz de estabilizar a membrana dos neutrófilos PMN, reduzindo a produção de
radicais livres, além de diminuir o recrutamento de células, exibindo seu efeito
antiinflamatório sobre elas (TADESSE, 2004). Assim sendo, como a produção de ERO
está relacionada com a hepatotoxicidade das MCYSTs e o LASSBio 596 atua nestes
radicais, esta parece ser uma explicação adicional possível para a melhor eficácia do
LASSBio 596 em relação à dexametasona na lesão pulmonar aguda induzida por
MCYST-LR. Além disso, o tempo de meia vida da dexametasona é de
aproximadamente 6 horas e o tratamento foi de apenas 2 horas, isto pode explicar os
resultados parciais obtidos no grupo Dexa.
Apesar do modelo experimental empregado neste estudo refletir algumas das
alterações observadas em pacientes intoxicados com MCYST-LR, os resultados aqui
apresentados não devem ser extrapolados diretamente para seres humanos. Os efeitos
benéficos das moléculas aqui estudadas sugerem que eles possam se tornar
ferramentas importantes do arsenal terapêutico contra a intoxicação por MCYST-LR,
respeitadas as características farmacológicas das mesmas.
CONCLUSÕES
7 CONCLUSÕES
Foi evidenciado que o LASSBio 596 atuou no processo inflamatório induzido pela
exposição à MCYST-LR, evitando as alterações na mecânica pulmonar e bioquímicas e
minimizando as modificações histológicas. Os efeitos benéficos do LASSBio 596
superaram àqueles evidenciados pela dexametasona.
O grupo L596 teve todos os parâmetros de mecânica pulmonar semelhantes aos
do grupo Ctrl, enquanto o grupo Dexa mostrou semelhança somente para ∆P2, Est e
∆E.
Ambos os tratamentos reduziram o processo inflamatório, mas a histologia
pulmonar evidenciou maior percentual de colapso alveolar no grupo Dexa.
Como não foi detectada a presença de MCYST-LR livre no tecido pulmonar pelo
método de ELISA, acreditamos que esta toxina possa ter chegado aos pulmões em sua
forma conjugada, ou na sua forma livre em quantidades inferiores àquelas detectáveis
por ELISA. Outra hipótese para a lesão pulmonar seria a liberação pelo fígado de
agentes pró-inflamatórios.
Foi detectada MCYST-LR livre no tecido hepático, no entanto, não foi observada
diferença entre os grupos. Estes fatos evidenciam o processo de intoxicação e
inflamação no fígado.
Foi observada alteração das enzimas antioxidantes no pulmão. Isto sugere um
mecanismo de defesa pulmonar contra espécies reativas de oxigênio. Não se pode,
todavia, afirmar que a origem do processo tenha sido no próprio pulmão, ou oriunda de
lesão hepática inicial.
A histologia hepática não evidenciou padrão de melhora do tecido, afirmando
que os tratamentos propostos não são eficazes para tal órgão nas condições
experimentais por nós estabelecidas.
PERSPECTIVAS
8 PERSPECTIVAS
Analisar a duração do tratamento com LassBio596 sobre a função pulmonar e o
fígado, após exposição subcrônica (30 dias) a doses subletais de MCYST-LR em
camundongos saudáveis. O agente farmacológico será aplicado a cada 12 horas por
uma semana.
Identificar os mecanismos de lesão envolvidos na intoxicação, pelo estudo da:
- mecânica pulmonar;
- histologia pulmonar e hepática;
- estresse e dano oxidativos no pulmão e no fígado por meio de ensaios bioquímicos;
- apoptode das células pulmonares e hepáticas pelas técnicas de TUNEL e caspase-3
clivada (imunohistoquímica);
- conteúdo de MCYSY-LR no pulmão e no fígado (ELISA e LC-MS)
- expressão das citocinas inflamatórias no pulmão (TNF-α, IL-1, IL-6 e MIP-2), por
ELISA.
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ANEXOS
ANEXO A – Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal dos grupos Controle,
Toxina e tratamentos (LassBio 596 e dexametasona).
CTRL
Fluxo Volume Est Edyn
∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot
CTRL 1 1 0,19 36,04 43,12 7,08 0,48 1,35 1,83
CTRL 2 1 0,2 32,18 38,04 5,86 0,42 1,18 1,59
CTRL 3 1 0,2 29,96 35,76 5,79 0,39 1,18 1,57
CTRL 4 1 0,2 24,29 29,75 5,46 0,28 1,1 1,38
CTRL 5 1 0,19 37,2 44,59 7,39 0,33 1,38 1,71
CTRL 6 1 0,21 31,54 38,1 6,56 0,29 1,38 1,68
CTRL 7 1 0,2 22,94 29,76 6,82 0,34 1,35 1,69
CTRL 8 1 0,2 27,54 33,7 6,16 0,24 1,24 1,48
CTRL 9 0,99 0,2 26,35 33,53 7,17 0,15 1,4 1,55
Média 1 0,2 29,78 36,26 6,48 0,32 1,28 1,61
DP 0 0,01 4,68 4,96 0,65 0,09 0,11 0,13
EPM 0 0 1,56 1,65 0,22 0,03 0,04 0,04
n 9 9 9 9 9 9 9 9
DP/Média 0 0,03 0,16 0,14 0,1 0,28 0,08 0,08
TOX
Fluxo Volume Est Edyn
∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot
TOX 1 1 0,21 44,72 51,59 6,87 0,52 1,46 1,99
TOX 2 1 0,19 44,89 53,19 8,3 0,57 1,56 2,14
TOX 3 0,97 0,19 33,09 41,84 8,75 0,61 1,67 2,28
TOX 4 1 0,2 34,32 42,27 7,95 0,43 1,62 2,05
TOX 5 1 0,2 33,98 41,21 7,23 0,36 1,44 1,8
TOX 6 1 0,2 39,3 48,04 8,74 0,54 1,76 2,3
TOX 7 1 0,2 41,85 50,53 8,67 0,52 1,71 2,23
TOX 8 1 0,2 41,85 51,46 9,61 0,6 1,92 2,52
TOX 9 1,03 0,2 50,85 59,9 9,05 0,58 1,84 2,42
Média 1 0,2 40,54 48,89 8,35 0,53 1,67 2,19
DP 0,01 0,01 5,63 5,86 0,82 0,08 0,15 0,21
EPM 0 0 1,88 1,95 0,27 0,03 0,05 0,07
n 9 9 9 9 9 9 9 9
DP/Média 0,01 0,03 0,14 0,12 0,1 0,15 0,09 0,1
L596
Fluxo Volume Est Edyn
∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot
L596-1 1 0,21 26,79 31,97 5,18 0,45 1,09 1,34
L596-2 1 0,19 18,24 22,51 4,26 0,33 0,82 1,15
L596-3 1 0,2 35,6 43,52 7,92 0,35 1,55 1,86
L596-4 1 0,2 32,97 39,73 6,76 0,47 1,34 1,61
L596-5 1 0,19 30,95 38,04 7,09 0,24 1,37 1,61
L596-6 1,01 0,2 30,61 39 8,39 0,35 1,65 2
L596-7 1 0,2 25,3 32,83 7,52 0,45 1,51 1,97
L596-8 0,99 0,21 38,28 46,16 7,87 0,23 1,61 1,84
Média 1 0,2 29,84 36,72 6,87 0,36 1,37 1,67
DP 0 0,01 5,92 6,99 1,35 0,09 0,27 0,29
EPM 0 0 2,09 2,47 0,48 0,03 0,09 0,1
n 8 8 8 8 8 8 8 8
DP/Média 0 0,03 0,2 0,19 0,2 0,24 0,2 0,17
DEXA
Fluxo Volume Est Edyn
∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot
DEXA 1 1 0,19 48,06 57,3 9,24 0,56 1,78 2,34
DEXA 2 1 0,2 31,71 39,16 7,45 0,38 1,46 1,83
DEXA 3 1 0,2 27,5 34,19 6,69 0,68 1,36 2,04
DEXA 4 1 0,19 25,56 31,94 6,38 0,69 1,21 1,89
DEXA 5 1 0,2 35,7 43,94 8,24 0,69 1,62 2,3
DEXA 6 1 0,19 22,18 27,69 5,51 0,69 1,05 1,73
DEXA 7 1 0,2 20,76 25,19 4,43 0,73 0,9 1,63
DEXA 8 1 0,19 22,15 27,99 5,85 0,52 1,14 1,66
DEXA 9 1 0,21 31,1 40,1 9 0,26 1,85 2,11
DEXA 10 1 0,21 47,5 56,19 8,69 0,48 1,8 2,28
Média 1 0,2 31,22 38,37 7,15 0,57 1,42 1,98
DP 0 0,01 9,42 10,79 1,55 0,15 0,32 0,26
EPM 0 0 2,98 3,41 0,49 0,05 0,1 0,08
n 10 10 10 10 10 10 10 10
DP/Média 0 0,03 0,3 0,28 0,22 0,26 0,23 0,13
ANEXO B – Percentual de áreas normais, hiperinsufladas e colapsadas em cada animal
dos grupos Controle, Toxina e tratamentos (LassBio 596 e dexametasona).
CTRL
%NORM. %COLAP. %HIPER.
CTRL 1 74,72 25,28 0
CTRL 2 69,61 30,39 0
CTRL 3 77,83 22,17 0
CTRL 4 74,92 25,08 0
CTRL 5 66,87 33,13 0
CTRL 6 78,67 21,33 0
CTRL 7 68,65 31,35 0
CTRL 8 70,81 29,19 0
CTRL 9 72,05 27,95 0
Média 72,68 27,32 0
DP 3,87 3,87 0
EPM 1,29 1,29 0
n 9 9 9
DP/Média 5,33% 14,17% 0,00%
TOX
%NORM. %COLAP. %HIPER.
TOX 1 31,65 68,35 0
TOX 2 35,53 64,47 0
TOX 3 39,49 60,51 0
TOX 4 32,21 67,79 0
TOX 5 44,67 55,33 0
TOX 6 39,79 60,21 0
TOX 7 38,19 61,81 0
TOX 8 42,75 57,25 0
TOX 9 41,11 58,89 0
Média 38,38 61,62 0
DP 4,23 4,23 0
EPM 1,41 1,41 0
n 9 9 9
DP/Média 11,02% 6,86% 0,00%
L596
%NORM. %COLAP. %HIPER.
L596-1 74,76 25,24 0
L596-2 63,85 36,15 0
L596-3 60,65 39,35 0
L596-4 60,48 39,52 0
L596-5 67,04 32,96 0
L596-6 62,63 37,37 0
L596-7 71,61 28,39 0
L596-8 78,35 21,65 0
Média 67,42 32,58 0
DP 6,33 6,33 0
EPM 2,24 2,24 0
n 8 8 8
DP/Média 9,39% 19,44% 0,00%
DEXA
%NORM. %COLAP. %HIPER.
DEXA 1 61,72 38,28 0
DEXA 2 64,38 35,62 0
DEXA 3 55,74 44,26 0
DEXA 4 67,91 32,09 0
DEXA 5 53,22 46,78 0
DEXA 6 56,16 43,84 0
DEXA 7 62,42 37,58 0
DEXA 8 63,19 36,81 0
DEXA 9 67,25 32,75 0
Média 61,33 38,67 0
DP 4,9 4,9 0
EPM 1,63 1,63 0
n 9 9 9
DP/Média 7,99% 12,68% 0,00%
ANEXO C – Atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO) em cada animal dos grupos
Controle, Toxina e tratamentos (LassBio596 e Dexametasona).
Amostra
mg
proteína
MPO
(mU/mg
ptn)
CTRL2 0,046 144,79
CTRL3 0,052 113,49
CTRL4 0,047 95,70
CTRL5 0,045 118,09
CTRL7
0,048 142,36
TOX1
0,044 221,70
TOX3
0,042 178,03
TOX4
0,029 401,18
L596-1
0,03 141,23
L596-2
0,035 145,10
L596-3
0,038 125,22
DEXA2
0,043 127,39
DEXA3
0,045 162,43
DEXA4
0,043 182,59
DEXA5
0,036 125,85
ANEXO D – Análise de MCYST-LR pelo método ELISA em cada animal dos grupos
Controle, Toxina e tratamentos (LassBio596 e Dexametasona).
Resultado da amostra (ng/mL) TOX
0,1g de figado/mL
MCYST (ng/g de tecido)
TOX 2 0,21 2,14
TOX 3 0,53 5,28
TOX 4 0,25 2,51
TOX 5 0,21 2,11
TOX 6 0,24 2,43
Média 2,89
DP 1,35
EPM 0,6
n 5
Resultado da amostra (ng/mL)
L596
0,1g de figado/mL
MCYST (ng/g de tecido)
L596-2 0,72 7,23
L596-3 0,45 4,52
L596-4 0,27 2,73
L596-5 0,35 3,54
L596-6 0,27 2,66
Média 4,13
DP 1,89
EPM 0,84
n 5
Resultado da amostra (ng/mL)
DEXA
0,1g de figado/mL
MCYST (ng/g de tecido)
DEXA 1 0,46 4,59
DEXA 2 0,41 4,1
DEXA 3 0,48 4,79
DEXA 4 0,59 5,92
DEXA 5 0,25 2,5
DEXA 6 0,13 1,3
Média 3,87
DP 1,68
EPM 0,69
n 6
ANEXO E – Sustâncias Reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) em cada animal dos
grupos Controle, Toxina e tratamentos (LassBio596 e Dexametasona).
Grupos
mg proteina
na amostra nMol de TBA/mg de proteína
CTRL 2 1,32 0,022
CTRL 4 1,34 0,023
CTRL 5 1,3 0,024
CTRL 6 1,42 0,028
TOX 1 1,27 0,033
TOX 3 1,21 0,038
TOX 4 0,82 0,030
L596-1 0,85 0,029
L596-5 1,17 0,023
L596-6 1,12 0,026
DEXA 1 0,022 0,020
DEXA 2 0,021 0,030
DEXA 3 0,029 0,040
DEXA 4 0,021 0,030
DEXA 5 0,025 0,030
DEXA 6 0,023 0,030
ANEXO F – Atividade da enzima Catalase (CAT) em cada animal dos grupos Controle,
Toxina e tratamentos (LassBio 596 e dexametasona).
Grupo mg proteina
U de
catalase/mg
de proteina
CTRL 2 0,3945 0,352005964
CTRL 3 0,4486 0,427183536
CTRL 4 0,4023 0,297674685
CTRL 6
0,4273 0,220500586
TOX 1 0,3809 0,417268194
TOX 2 0,3273 0,634470684
TOX 3 0,3627 0,584332707
L596-3 0,3273 0,288344863
L596-5 0,3495 0,177527176
L596-6 0,3364 0,17997921
DEXA 2 0,3705 0,104791879
DEXA 3 0,3823 0,170210754
DEXA 4 0,3673 0,28721133
DEXA 5 0,3059 0,141614297
DEXA 6 0,3682 0,312632065
ANEXO G – Atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD) em cada animal dos
grupos Controle, Toxina e tratamentos (LassBio 596 e dexametasona).
Grupo
mg
proteina
U de
SOD/mg
de
proteina
CTRL 2 0,3945 295
CTRL 3 0,4486 296
CTRL 4 0,4023 267
TOX 1 0,3809 179
TOX 2 0,3273 197
TOX 3 0,3627 169
TOX 4 0,317 127
L596-3 0,3273 295
L596-5 0,3495 393
L596-6 0,3364 265
DEXA 2 0,3705 111
DEXA 3 0,3823 98
DEXA 4 0,3673 157
DEXA 5 0,3059 156
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