UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

TROMBOPOIESE MEDULAR EM CÃES

Luis Fernando Negro Silva

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

Medicina Veterinária e Zootecnia, da

Universidade Estadual Paulista, UNESP,

Campus de Botucatu, para a obtenção do título

de Mestre em Medicina Veterinária, área de

concentração Patologia Clínica Veterinária.

COMISSÃO EXAMINADORA

Autor: Luis Fernando Negro Silva

Título: Plaquetas reticuladas na avaliação da trombopoiese medular em cães.

Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira

Dr. Marcelo Larami Santoro

Membro

Laboratório de Fisiopatologia

Instituto Butantã

AGRADECIMENTOS

Para buscar conforto a alma – Deus,

Para admirar pela luta do dia a dia, educação, oportunidade, respeito, amor,

criação – Meus pais;

Para dividir, amar, admirar, confiar – a minha irmã Chel;

Para ter companheirismo, aconchego, bons momentos, discutir idéias, dividir

objetivos, boas risadas, contribuir para a evolução e evoluir junto, esperar

pacientemente quando estaríamos mais perto – a Namorada;

Para entender, divulgar o conhecimento, apoiar, motivar, ter mais que uma

Para dividir histórias, risadas, ajudar a trilhar caminhos – Amigos: de

Piracicaba, da XXXIX, das outras turmas, da vet Usp, do Centro;

Para contribuir com anestésicos e animais – Professores de anestesiologia;

Para auxiliar na estatística, dar estrutura para a confecção da tese, receber

muito bem, ajudar em momentos de transição – Suely e Joaquim;

Para conseguir uma calorosa recepção, para ter disposição – meus cães Adila,

Goiaba e os postiços, Chico e Pupu;

Para conseguir fazer o trabalho e mesmo nas condições em que se

encontravam permitiram o desenrolar do projeto – Os cães;

Para apoiar e financiar – FAPESP

Para apoiar e auxiliar – Professor Raimundo, Laboratório Clínico e Fmvz-

Unesp;

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Seleção da população de plaquetas pelos parâmetros de tamanho

(FSC) e granulosidade (SSC) – A; emissão autofluorescência no tubo sem

direito – C: .............................................................................................................. 26

hiperplasia de megacariócitos (100X). ................................................................... 32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Valores existentes em literatura para a quantificação de

megacariócitos em medula óssea por diversas técnicas ....................................... 17

Tabela 2: Valores relativos e absolutos para plaquetas reticuladas,

megacariócitos por espícula e por campo, e as respectivas análises

estatísticas apresentadas em média e desvio padrão ............................................ 27

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Valores descritivos do grupo controle .................................................. 44

Quadro 2: Valores descritivos do grupo A ............................................................. 45

Quadro 3: Valores descritivos do grupo B ............................................................. 45

%- porcento,

ANOVA – análise de variância,

et al – e colaboradores,

GM-SDF – fator de estimulação de crescimento de granulócitos,

mL-mililitros,

TIM- trombocitopenia imunomediada,

TPO- trombopoietina,

produzidas por meio de um complexo e ativo mecanismo de reorganização dos

componentes do citoesqueleto e extensão citoplasmática (Italiano, 1999;

Kaushansky, 2008).

Esse processo de extensão e reorganização dos pseudópodos com

arranjos de microtúbulos origina as pró-plaquetas, que por meio de um sistema

de contração do citoesqueleto de actina e migração de grânulos e organelas

para o topo dessas projeções origina as plaquetas maduras (Italiano et al.,

1999).

intravital que os megacariócitos posicionados em contato íntimo com os

culminar na trombopoiese, que é a produção de plaquetas maduras.

Apesar do crescente conhecimento a respeito da trombopoiese, algumas

transcrição de fatores, múltiplos sinais bioquímicos que permitem a

diferenciação das linhagens celulares do megacariócito, sofrendo

transformações no citoplasma originando as pro-plaquetas e liberação nos

sinusóides medulares originando, por fim, as plaquetas.

2.2 TROMBOCITOPENIA

A trombocitopenia é a diminuição no número de plaquetas circulantes

(Russell, 2000), sendo um dos distúrbios hematológicos mais identificados em

medicina veterinária (Zimmerman, 2000). Pode ocorrer em diversas doenças e

suas causas incluem: consumo, diminuição da produção, destruição e

Nas trombocitopenias por consumo e destruição ocorre produção normal

de plaquetas, porém essas são utilizadas em processos hemostáticos

(fisiológicos ou patológicos) ou sofrem dano direto ou remoção por fagocitose

imunomediada, que é o mecanismo mais usual (Stockham e Scott, 2002).

A trombocitopenia imunomediada pode ser primária ou secundária, mas de

maneira geral caracteriza-se pela ligação de imunoglobulinas a receptores da

superfície plaquetária precipitando a glicoproteína IIb/IIIa, acelerando a

destruição das plaquetas pelo sistema mononuclear-fagocitário devido à

presença de anticorpos antiplaquetas (Scott, 2000).

No caso da trombocitopenia por seqüestro a massa plaquetária não se

De maneira geral todas afetam a produção medular por doença medular

generalizada, ação direta nos megacariócitos podendo ser imunomediada,

Leptospira), podem ocasionar trombocitopenia por mais de uma causa durante

hipoplasia/aplasia ou infecção direta da medula (Stockham e Scott, 2002).

2.3 MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DA TROMBOPOIESE

O método usualmente utilizado para avaliação da trombopoiese é a

colheita de medula óssea para a estimativa do número de megacariócitos,

predizendo dessa forma a produção plaquetária.

Entretanto, um estudo retrospectivo relatou que a citologia de medula

óssea isolada pode não proporcionar diagnóstico em cães com trombocitopenia

pacientes. Desta forma, há um maior valor diagnóstico em trombocitopenias

moderadas, recomendando a utilização deste método em cães com

trombocitopenia imunemediada não responsiva a corticosteróide, e

trombocitopenias associadas a anemias não regenerativas ou pancitopenias

(Miller e Lunn, 2005).

A avaliação histológica da medula óssea é mais confiável que a avaliação

citológica obtida pela punção aspirativa para uma adequada verificação da

celularidade, porém essa última tem custo menor e a preparação da amostra é

imediata (Stockham e Scott 2002), sendo a sua análise mais prática e rápida.

As técnicas mais usadas para quantificação dos precursores de plaquetas em

medula óssea são o squash direto do aspirado, ou squash das espículas

aos valores para cães encontrados em literatura (tabela 1).

Tabela 1: Valores existentes em literatura para a quantificação de

megacariócitos em medula óssea por diversas técnicas.

Autor

quantificação

Megacariócitos

Mylonakis, 2005

por espícula

1,6 - 0,06 4,5

Mylonakis, 2005

camada leucocitária 8,1 - 1,6 17,1

Mylonakis, 2005

camada lipídica 3,1 - 0,3 8,8

A mensuração da trombopoiese através da contagem percentual dos

megacariócitos no total de células nucleadas no maior aumento não é indicada,

pois há uma baixa proporção dessa célula na medula óssea, além da facilidade

com a qual esses podem ser identificados no menor aumento (Mischke e

Busse, 2002). Portanto, a mensuração da atividade trombopoiética é

extremamente dependente do tipo de técnica (Mylonakis et al., 2005), sendo

importante considerar a experiência do patologista clínico no momento da

análise dos esfregaços.

anticoagulantes, plaquetas agregadas e ativadas interferem na determinação

(Sullivan, 1995; Stockham, 2002).

Em um estudo o VPM aumentou em pacientes durante a recuperação de

aplasia medular após quimioterapia (Balduini et al., 1999), em outro, o aumento

foi apenas em relação ao grupo aplásico e não ao grupo controle (Macchi et al.,

2002).

Apesar da citologia e biópsia de medula óssea serem mais utilizadas em

animais para avaliação da trombopoiese; estudos em humanos e poucos

estudos em medicina veterinária relatam a importância das plaquetas

reticuladas como marcadores da trombopoiese medular.

A avaliação das plaquetas reticuladas pode ser realizada por contadores

hematológicos automáticos com essa função, como por exemplo o R-2000

Sysmex Inc. (Sakakura, 2006), e XE-2100 Sysmex Inc (Abe et al., 2006, Briggs

et al., 2004) ou por citometria de fluxo, sendo essa última a mais comumente

utilizada.

A utilização da citometria de fluxo na prática clínica veterinária ainda é

restrita. No entanto, há uma aplicação potencial em pesquisa e diagnóstico no

campo da hematologia. Esta permite o diagnóstico de anemias e

trombocitopenias auto imune, trombopatias e granulocitopatias, leucemias e

linfomas, a imunotipificação de leucócitos, a detecção de parasitas intra

Saxon et al, 1998; Wang et al, 2002).

Dale et al. (1995), usando a técnica de biotinilação afirmam que plaquetas

da trombopoiese como a análise da medula óssea, que é considerada uma

técnica mais invasiva, de interpretação subjetiva e alto custo (Richards e

Baglin, 1995, Russel, 1997, Saxon 1998, Jiménez 2000, Michimoto, 2004). Em

relação ao VPM, apesar da existência de correlação positiva com a plaqueta

reticulada (Balduini, 1999), esta é considerada um parâmetro mais confiável

para mensurar a regeneração medular (Macchi, 2002).

A quantificação de PR permite diferenciar as causas de trombocitopenia,

particularmente em doenças complexas na qual a etiologia da trombocitopenia

é multifatorial e a contribuição do consumo de plaquetas ou da aplasia de

medula pode ser de difícil determinação (Saxon, 1998; Kajihara et al., 2007),

etiologia da trombocitopenia é por consumo ou por aplasia (Rinder et al., 1993;

Richards e Baglin, 1995).

Alguns estudos conduzidos em humanos relatam a importância dessa

mensuração como diagnóstico, acompanhamento e prognóstico de pacientes

com púrpura trombocitopênica (PT), no pós-tratamento com quimioterápicos,

pós-transplante de medula, entre outros (Richards e Baglin; 1995 Saxon, 1998;

Jiménez, 2000; Wang et al, 2002).

Em um grupo de pacientes trombocitopênicos com atividade

trombopoiética normal ou diminuída e outro com atividade aumentada relatou-

se que a determinação da PR é uma ferramenta útil para o diagnóstico

sugere a importância dessa estimativa para evitar a exaustão medular, bem

como para o manejo dos doadores (Gyongyossy-Issa, 2001).

Foi observado que plaquetas reticuladas e plaquetas gigantes estavam

significativamente aumentadas em pacientes com PT, principalmente na fase

ativa, e em pacientes com anemia aplástica na fase de remissão parcial.

Porém, a contagem estava normal na fase de remissão completa da anemia

aplástica, e significativamente diminuída na leucemia mielóide crônica e na

trombocitose essencial (Sakakura et al., 2005).

Baixas porcentagens de plaquetas reticuladas estão associadas a

trombocitopenia por causas hipoproliferativas incluindo quimioterapia (Rider,

1993). Dessa forma, foi verificado que o aumento das PR é sinal de

recuperação da trombocitopenia em pacientes tratados com quimioterapia

aumento da contagem de plaquetas maduras em 3 a 6 dias (Macchi et al.,

2002).

O aumento de plaquetas reticuladas foi relacionado com trombopoiese

ativa em pessoas não trombocitopênicas com hipertireoidismo, em que a

contagem de PR diminuiu significativamente pós-tratamento (Stiegler et al,

1998).

Plaquetas reticuladas em humanos podem ser o primeiro marcador de

recuperação medular após transplante de medula (Richards e Baglin 1995,

Saxon, 1998), demonstrando que o transplante autólogo de células

progenitoras do sangue periférico é mais eficiente na recuperação da contagem

Em cães não trombocitopênicos não foi observada diferença significativa

nos valores de PR entre os animais saudáveis e os clinicamente doentes;

cavalos infectados sem trombocitopenia os valores de PR estavam dentro dos

valores de referência, concluindo que essa técnica é útil para avaliar a

trombopoiese em equinos (Russell, 1997).

Um aumento significativo nas plaquetas reticuladas foi observado em cães

trombocitopênicos com linfoma, babesiose, leucemia mielóide aguda e

trombocitopenia imunomediada em comparação aos cães saudáveis

(Hanahachi et al. 2001). Os mesmos autores, em 2002, relataram um caso de

trombocitopenia púrpura idiopática em cão, e verificaram aumento da

porcentagem de plaquetas reticuladas, as quais diminuíram significativamente

após tratamento afirmando a utilidade do teste como triagem para a colheita de

Resultados semelhantes foram encontrados em um caso de Síndrome de

Evans (Michimoto et al., 2004), corroborando com a afirmação de que a

investigação das PR é importante para acompanhar a eficácia do tratamento

bem como a produção plaquetária.

Por outro lado, Wilkerson et al. (2001) não observaram valores absolutos

de plaquetas reticuladas sempre elevados durante o curso da trombocitopenia

imunomediada (TIM) primária e secundária, estando freqüentemente dentro

dos valores de referência, principalmente devido ao baixo número de plaquetas

em muitos animais.

No mesmo estudo, relata-se aumento absoluto das plaquetas reticuladas

diminuição considerável dos níveis de IgG associados à superfície plaquetária

contribuiu para o aumento no número de plaquetas totais e de plaquetas

3. OBJETIVOS

Os objetivos do presente trabalho foram:

- Comparar duas técnicas de quantificação de megacariócitos em citologia

de medula óssea de cães;

- Estabelecer um valor de referência para plaquetas reticuladas em cães

saudáveis e compará-los com os presentes em literatura;

- Avaliar a importância das plaquetas reticuladas como marcadores da

trombopoiese em cães;

4. MATERIAIS E MÉTODOS

O grupo controle foi constituído de 30 cães sadios adultos (1 a 8 anos), de

ambos os sexos. Os animais foram selecionados com base no exame físico e

resultados do hemograma.

O grupo A foi constituído de 15 cães com trombocitopenia (< 100.000

A colheita de medula óssea foi realizada em todos os animais com agulha

(Komiyashiki, Japão) especial para biopsia aspirativa de medula óssea,

mediante punção na cabeça do úmero dos cães. Os animais foram

anestesiados antes do início da colheita. Após a indução, o cão foi colocado

6. DISCUSSÃO

A avaliação da produção de plaquetas usualmente é mensurada pela

quantificação de megacariócitos em citologia ou biópsia de medula óssea, que

é uma avaliação subjetiva. A presente dissertação vem a contribuir para a

discussão dos métodos para avaliação da trombopoiese medular através da

quantificação das plaquetas reticuladas, e correlacioná-las a quantificação de

megacariócitos em citologia de medula óssea.

A mensuração das plaquetas reticuladas e dos megacariócitos na medula

óssea foram realizadas em cães não trombocitopênicos e em cães

trombocitopênicos nas condições de hipoplasia de megacariócitos e número

ficam a cargo da técnica utilizada no preparo e leitura das lâminas, bem como

da experiência do patologista clínico (Mylonakis, 2005), a quantificação de

dos megacariócitos, principalmente pela técnica de análise por campo, pois,

nesses casos, observa-se uma diminuição do número de megacariócitos

presentes em lâmina.

Os resultados encontrados para os megacariócitos em cães saudáveis são

semelhantes àqueles relatados em literatura. Para os cães com

trombocitopenia, os considerados hipoplásicos apresentaram uma quantidade

extremamente diminuída de megacariócitos em citologia de medula (Figura 2).

observada nas duas técnicas foi de 8 megacariócitos.

FIGURA 2: Citologia de medula óssea. Observa-se baixa celularidade,

grande quantidade de células de estroma e ausência de megacariócitos

que tornaria o procedimento mais oneroso, pois as plaquetas são identificadas

por meio de software específico em escala logarítmica.

Os valores relativos e absolutos encontrados nos cães do grupo controle

são semelhantes ao relatado para cães em sangue total (Smith, 2002), e

inferiores para os valores relativos relatados por Weiss and Townsend (3,9-

15,1%). No entanto, esses autores utilizaram PRP fixado com paraformaldeído

que pode justificar as diferenças observadas. Em cães não trombocitopênicos é

esperado uma baixa porcentagem de plaqueta reticulada, pois o estímulo para

o aumento da produção de plaquetas é a diminuição da massa plaquetária.

Os cães do grupo A apresentaram, em sua maioria, altos valores de

valor muito baixo (0,65%) mesmo apresentando uma alta contagem de

megacariócitos na medula óssea. Esse fato pode ser explicado por uma

resposta muito recente da medula óssea, uma vez que o aumento do número

de megacariócitos possivelmente ainda não resultou em produção massiva de

plaquetas.

Os cães do grupo B, também apresentaram, em sua maioria, altos valores

de plaquetas reticuladas, principalmente relativo, não apresentando a mesma

condição para os valores absolutos devido ao reduzido número de plaquetas

na contagem total. Situação semelhante foi observada em cães com TIM

primária e secundária (Wilkerson, 2001).

celularidade (80%) devido à mieloftise, apresentou um valor reduzido de PR.

Na maioria dos animais do grupo B que apresentaram celularidade normal

hipoplasia de megacariócitos na citologia de medula óssea estariam realmente

com a produção de plaquetas diminuída, salvo casos de hipoplasia intensa.

Apesar disso, a literatura humana considera que as plaquetas reticuladas são

um indicador confiável da trombopoiese, assumindo que baixas contagens de

PR estão associadas à hipoplasia megacariocítica. Entretanto, não foram

encontrados relatos relacionado-as à quantificação de megacariócitos da

medula.

De certa forma, a quantificação de megacariócitos medulares é útil,

principalmente em medicina veterinária, pois a citometria de fluxo ainda é uma

realidade distante da rotina clínica, além do que a análise da medula óssea

permite a avaliação de outros parâmetros como morfologia celular e outras

linhagens hematopoiéticas.

Para humanos, um valor de 15% de PR pode ser considerado como

resposta adequada à trombocitopenia quando a contagem plaquetária é de

aproximadamente 70.000/µL (Richards e Baglin, 1995), no entanto esse estudo

não menciona um valor de resposta adequada para valores abaixo de

70.000/µL. Por outro lado, para cães, trabalhos referem valores limites para

plaqueta reticulada de 6-7% (Wilkerson, 2001, Smith e Thomas, 2002).

Considerando esse valor, apenas dois animais no grupo A estariam com a

resposta medular inadequada à trombocitopenia, frente a cinco animas do