( PDF ) Desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados de quitosana/MDI para aplicações cosméticas

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS MICRO E

NANOESTRUTURADOS DE QUITOSANA/MDI PARA

APLICAÇÕES COSMÉTICAS

Bento Pereira da Costa Neto

Orientadora: Profª Drª Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata PPGEQ/UFRN

Co-orientadora: Drª Maria Inês Ré – IPT/SP

Natal / RN

Março / 2009

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Bento Pereira da Costa Neto

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS MICRO E

NANOESTRUTURADOS DE QUITOSANA/MDI PARA

APLICAÇÕES COSMÉTICAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Engenharia

Química da Universidade Federal do Rio

Grande de Norte, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre em

Engenharia Química.

Natal/RN

Março/2009

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Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Costa Neto, Bento Pereira da.

Desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados de

quitosana/MDI para aplicações cosméticas / Bento Pereira da Costa Neto.

– Natal, RN, 2009.

124 f.

Orientadora: Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata.

Coorientadora: Maria Inês Ré.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química.

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

1. Microencapsulação – Dissertação. 2. Policondensação interfacial –

Dissertação. 3. Emulfisificação espontânea – Dissertação. 4. Liberação

controlada. I. Mata, Ana Lúcia de Medeiros Lula da. II. Ré, Maria Inês.

III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BCZM CDU 66.08(043.3)

COSTA NETO, Bento Pereira - Desenvolvimento de sistemas micro e

nanoestruturados de quitosana/MDI para aplicações cosméticas. Dissertação de

Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de

Concentração: Engenharia de Processos – Subárea de concentração: Encapsulação.

Orientadora: Profª Drª Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata – PPGEQ/UFRN

Co-orientadora: Drª Maria Inês Ré – IPT/SP

Resumo: O presente trabalho visou o estudo e desenvolvimento de um sistema micro e

nanoestruturado de quitosana reticulada por diisocianato, pela técnica de

policondensação interfacial combinada com emulsificação espontânea, para

encapsulação de benzofenona-3 (BZ-3), um filtro solar químico. Foi elaborado

primeiramente um planejamento experimental de 2

para desenvolvimento da

formulação de

partículas de quitosana e MDI (4,4’-difenil metano diisocianato), onde as

variáveis foram às concentrações de MDI, de quitosana e do solvente. A partir dos

dados fornecidos pelo planejamento experimental, optou-se pelas condições de processo

e formulação capazes de gerar o menor diâmetro de partícula. O estudo prosseguiu com

a incorporação de BZ-3 e Miglyol (núcleo das cápsulas formadas). Suspensões de

nanocápsulas com concentrações de 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 18,75 mg/mL e 25

mg/mL de BZ-3 foram preparadas, porém durante o período de armazenamento ocorreu

o aparecimento de precipitados cristalinos, nas suspensões de 18,75 mg/mL e 25 mg/mL

de BZ-3. Este aparecimento de precipitados cristalinos foi atribuído à difusão da BZ-3

para a fase aquosa não ocorrendo sua encapsulação. A suspensão contendo 6,25 mg/mL

de BZ-3 apresentou diâmetro médio de 1,47µm, potencial zeta de 61 mV, pH de 5,64 e

teor de encapsulação próximos a 100 %. A suspensão contendo 12,5mg/mL de BZ-3

apresentou diâmetro médio de 1,76µm, potencial zeta de 47,4mV, pH 5,71 e teor de

encapsulação próximos a 100 % e foi selecionada juntamente com a de 6,25 mg/mL

para a continuidade do estudo. Estas formulações foram caracterizadas também pela

morfologia, turbidimetria, espectroscopia de absorção na região do infravermelho, DSC

e foi elaborado um estudo de liberação controlada do fármaco em diferentes meios

receptores. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra que estas

formulações são sistemas promissores para a aplicação cutânea de filtros solares.

Palavras-chaves: Microencapsulação; Policondensação interfacial; Emulsificação

espontânea; Reticulação cruzada; Liberação controlada.

Abstract

Currently, studies in the area of polymeric microcapsules and nanocapsules and

controlled release are considerably advanced. This work aims the study and

development of microcapsules and nanocapsules from Chitosan/MDI, using a new

technique of interfacial polycondensation combined to spontaneous emulsification, for

encapsulation of BZ-3. It was firstly elaborated an experimental design of 2

of the

particle in white without the presence of BZ-3 and Miglyol, where the variables were

the concentrations of MDI, chitosan and solvent. Starting from the data supplied by the

experimental design was chosen the experiment with smaller particle diameter and only

added like this BZ-3 and Miglyol.

The suspension containing concentrations of 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL, 18.75

mg/mL, 25 mg/mL of BZ-3 were prepared, nevertheless, during the storage time, these

formulations presented drug precipitates in the suspensions of 18.75 mg/mL and 25

mg/mL of BZ-3. This apparition of precipitate was attributed to the diffusion of BZ-3

for the aqueous phase without any encapsulation, suggesting so the use of the smaller

concentrations of the BZ-3. The suspension containing 6.25mg/mL of BZ3 presented

average size of 1.47µm, zeta potential of 61 mV, pH 5.64 and this sample showed an

amount of BZ-3 and drug entrapment of 100 %. The suspension containing 12.5mg/mL

of BZ-3 presented average size of 1.76µm, zeta potential of 47.4 mV, pH 5.71 and this

sample showed an amount of BZ-3 and drug entrapment of 100 %. Then, showing such

important characteristics, these two formulations were chosen for futher continuity to

the study. These formulations were also characterized by the morphology, FTIR,

stability for Turbiscan, DSC and a study of controlled release of the BZ-3 was

elaborated in different receiving means.

Keywords: Microencapsulation; Interfacial polycondensation; Spontaneous

emulsification; Cross-linking; Controlled release.

Dedicatória

A Deus, em quem deposito toda a minha fé e esperança.

Obrigado por permanecer constante em minha vida e não me

abandonar nos momentos mais difíceis;

Aos meus pais Antonio e Neta, os quais sempre me apoiaram

nas realizações dos meus projetos. Agradeço por todo carinho

e amor que sempre me dedicaram e, principalmente, por

acreditarem em mim;

As minhas irmãs Marjorie, Maarâni e Lúcia, por toda

amizade. Agradeço por sempre estarem ao meu lado e pelos

conselhos que me deram;

A minha Noiva, Gidyonne, por sempre me apoiar e acreditar

em mim. Agradeço por toda paciência nos momentos difíceis,

por me fazer rir mesmo estando longe. Obrigado por tornar a

minha vida mais bela;

Por último, mas não menos importante, ao Doutor Adriano

Marim de Oliveira, a Autarquia do Saber. Agradeço pela

dedicação, esforço e paciência. Obrigado pelas palavras

amigas e pelos ensinamentos constantes. Essa dissertação não

teria sido finalizada se não contasse com sua ajuda.

Agradecimentos

Ás Professoras, Dra. Ana Lúcia de Medeiros e Dra Maria Inês Ré pela oportunidade

oferecida, por ter confiado em minha capacidade de trabalho, pelas orientações e correções

e por me proporcionar muitas oportunidades que contribuíram para a minha vida

profissional.

Aos amigos do Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, Ana

Letícia, Vivianne Buono, Shirley, Suca, David, Kleber, Maria Helena, Priscila, Luciana

e Marcio pela amizade, incentivo e apoio. Obrigado pelas contribuições de cada um

tanto para a minha dissertação quanto para a minha vida. Entendo que amigos vão e

vem, mas que um punhado deles, preciosos, eu tenho que guardar com carinho. Esses

amigos preciosos são vocês.

Aos amigos da UFRN, Luiz, Ricardo Henrique e Iara pela amizade,

companheirismo e dedicação durante a graduação e mestrado.

Ao meu grande amigo Pierre, o Anhangüera, por toda disposição que teve para

me ajudar nos ensaios, pela grande amizade que nasceu entre nós, pelas longas e

valiosas conversas que sempre tivemos e pelas risadas e mais risadas que demos ao

longo dessa jornada.

Ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química pela oportunidade de

melhorar minha qualificação profissional.

Ao IPT pela oportunidade de realizar os ensaios experimentais no Laboratório de

Processos Químicos e Tecnologia de Partículas.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq , pelo

apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho.

Sumário

1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................................

2. ASPECTOS TEÓRICOS.................................................................................................

2.1. NANOTECNOLOGIA................................................................................................

2.2. MICRO/NANOENCAPSULAÇÃO.............................................................................

2.3. MÉTODOS DE ENCAPSULAÇÃO...........................................................................

2.4. TÉCNICA DE EMULSIFICAÇÃO ESPONTÂNEA...................................................

2.5. TÉCNICA DE POLICONDENSAÇÃO INTERFACIAL............................................

2.6. TÉCNICA DE POLICONDENSAÇÃO INTERFACIAL COMBINADA COM

EMULSIFICAÇÃO ESPONTÂNEA............................................................................

2.7. REAÇÃO DE RETICULAÇÃO CRUZADA...............................................................

2.8. MECANISMOS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE ATIVOS..............................

2.9. MATÉRIAS – PRIMAS............................................................................................

2.9.1. Quitosana.....................................................................................................

2.9.2. Diisocianato – MDI.....................................................................................

2.9.3. Benzofenona-3.............................................................................................

2.9.4. Miglyol.........................................................................................................

2.9.5. Tensoativos..................................................................................................

2.9.5.1 Tween 80............................................................................................

2.9.5.2 Span 80..............................................................................................

3. ESTADO DA ARTE.........................................................................................................

4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL...........................................................................

4.1. MATERIAIS..............................................................................................................

4.1.1. Equipamentos....................................................................................................

4.1.2 Reagentes............................................................................................................

4.2. ENSAIOS PRELIMINARES.......................................................................................

4.3. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL........................................................................

4.4. METODOLOGIA PARA OBTENÇÃO DAS PARTÍCULAS DE QUITOSANA/MDI.

4.5. CARACTERIZAÇÃO DAS SUSPENSÕES DE PARTÍCULA DE

QUITOSANA/MDI......................................................................................................

4.5.1. Granulometria e índice de polidispersão..........................................................

4.5.2. Microscopia e morfologia..................................................................................

4.5.3. Potencial zeta....................................................................................................

4.5.4. Eficiência de encapsulação da BZ-3 por CLAE................................................

4.5.5. Turbidimetria......................................................................................................

4.5.6. Estudo da liberação controlada.......................................................................

4.5.6.1. Estudo da liberação controlada livre de membranas.......................

4.5.6.2. Estudo da liberação controlada com membranas de diálise..............

4.5.7. pH.......................................................................................................................

4.5.8. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho...............................

4.5.9. Análises térmicas..............................................................................................

4.5.9. 1. Análise Termogravimétrica (TG) e Análise térmica diferencial

(DTA)....................................................................................................

4.5.9.2. Análise de calorimetria diferencial de varredura – DSC..................

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................

5.1. ENSAIOS PRELIMINARES...................................................................................

5.1.1. Introdução do miglyol no sistema........................................................

5.1.2. Concentração do miglyol no sistema............................................................

5.1.3. Escolha do solvente.......................................................................................

5.2. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL......................................................................

5.3. ENCAPSULAÇÃO DA BZ-3....................................................................................

5.4. ANÁLISE DA ESTABILIDADE FÍSICA DAS SUSPENSÕES (TURBIDIMETRIA

DINÂMICA)..............................................................................................................

5.5. GRANULOMETRIA E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO..........................................

5.6. MICROSCOPIA E MORFOLOGIA DAS PARTÍCULAS........................................

5.7. ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO.......

5.8. ANÁLISES TÉRMICAS............................................................................................

5.8.1. Análise Termogravimétrica (TG) e análise térmica diferencial (DTA) da

quitosana.................................................................................................................

5.8.2. Análise de calorimetria diferencial de varredura – DSC...........................

5.9. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO......................................................................

5.10. POTENCIAL ZETA.................................................................................................

5.11. DETERMINAÇÃO DO PH......................................................................................

5.12. LIBERAÇÃO CONTROLADA.................................................................................

5.12.1. Estudo livre de membrana...........................................................................

5.12.2. Estudo de liberação incorporando membrana............................................

6. DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO......................................................................

SUGESTÕES DE CONTINUIDADE....................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................

ANEXOS................................................................................................................................

104

Lista de Figuras

Figura 2.1.. Diferentes áreas de aplicação da nanotecnologia............................

Figura 2.2. Representação de cápsulas e esferas.................................................

Figura 2.3. Esquema da emulsificação espontânea..............................................

Figura 2.4. Mecanismo de preparação de partículas usando a técnica de

policondensação interfacial combinada com emulsificação

espontânea..............................................................................................................

Figura 2.5. Fórmula estrutural do MDI................................................................

Figura 2.6. Fórmula estrutural da BZ-3...............................................................

Figura 2.7. Estruturas de ressonância das benzofenonas...................................

Figura 2.8. Triglicerídeos de ácido caprílico.....................................................

Figura 2.9. Triglicerídeos de ácido cáprico.......................................................

Figura 2.10. Estrutura molecular do Tween 80....................................................

Figura 2.11. Estrutura molecular do Span 80......................................................

Figura 3.1. Principais fatos históricos em nanotecnologia..................................

Figura 4.1. Fluxograma das etapas de obtenção das partículas...........................

Figura 4.2.. Representação esquemática do princípio de funcionamento do

Turbiscan...............................................................................................................

Figura 5.1. Cristais de BZ-3 na fase aquosa (Microscopia óptica; 200X)........

Figura 5.2. Suspensões preparadas com diferentes concentrações de miglyol,

microscopia óptica 200X: (a) 2000mg; (b) 2500 mg............................................

Figura 5.3. Diâmetros de partículas com diferentes tipos de solventes..............

Figura 5.4. Gráfico de Pareto...............................................................................

Figura 5.5. Relação entre os valores preditos pelo tratamento matemático e os

valores observados................................................................................................

Figura 5.6. Valor residual versus valores observados.........................................

Figura 5.7. Valor residual versus valores preditos...............................................

Figura 5.8. Superfície de resposta........................................................................

Figura 5.9. Gráficos de variação de transmissão e backscattering da

formulação de 6,25mg/mL....................................................................................

Figura 5.10. Gráficos de variação de transmissão e backscattering da

formulação de 12,5mg/mL.....................................................................................

Figura 5.11. Gráfico de diâmetro de partícula COULTER ® granulometer

para solução de 6,25mg/mL de BZ-3...................................................................

Figura 5.12. Gráfico de diâmetro de partícula Zetamaster S para solução de

6,25mg/mL de BZ-3...............................................................................................

Figura 5.13. Gráfico de diâmetro de partícula COULTER ® granulometer

para solução de 12,5mg/mL de BZ-3....................................................................

Figura 5.14. Gráfico de diâmetro de partícula Zetamaster S para solução de

12,5mg/mL de BZ-3...............................................................................................

Figura 5.15. Microscopia eletrônica de transmissão das partículas de

Quitosana/MDI......................................................................................................

Figura 5.16. Microscopia eletrônica de varredura das partículas.......................

Figura 5.17. Microscopia óptica de uma cápsula.................................................

Figura 5.18. Comparação entre os FT-IR............................................................

Figura 5.19. FT-IR das cápsulas de quitosana/MDI............................................

Figura 5.20. Curvas de TG e SDTA da amostra de quitosana de baixo peso

molecular...............................................................................................................

Figura 5.21. Curvas DSC das partículas contendo 6,25 e 12,5 mg/mL de BZ-3,

da quitosana e da BZ-3 pura................................................................................

Figura 5.22. Potencial zeta das partículas: (a) 12mg/mL; (b) 6,25mg/mL..........

Figura 5.23. Perfis cinéticos de liberação de Bz3 de formulações de partículas

quitosana/MDI: a) 6,25 mg/mL; b) 12,5 mg/mL livre de membrana...................

Figura 5.24. Curva de liberação das formulações 6,25 e 12,5 mg/mL em

etanol......................................................................................................................

Lista de Tabelas

Tabela 2.1. Métodos de obtenção de microencapsulação. (Adaptada de BENITA,

1996)................................................................................................................................

Tabela 4.1. Planejamento experimental para obtenção de partículas quitosana/MDI..

Tabela 5.1. Variáveis do planejamento experimental.....................................................

Tabela 5.2. Planejamento experimental..........................................................................

Tabela 5.3. Efeitos calculados no Statística 7.0 para Planejamento Fatorial 2

...........

Tabela 5.4. Análise de

variância......................................................................................

Tabela 5.4. Composição da suspensão de partículas contendo 6,25 mg/mL de BZ-3...

Tabela 5.5. Composição da suspensão de partículas contendo 12,5 mg/mL de BZ-3...

Tabela 5.6. Composição da suspensão de partículas contendo 18,75 mg/mL de BZ-3.

Tabela 5.7. Composição da suspensão de partículas contendo 25 mg/mL de BZ-3......

Tabela 5.9. Porcentagem de BZ-3 encapsulada.............................................................

Lista de Abreviaturas e Siglas

BZ-3: Benzofenona-3;

CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;

CTFA: Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association;

DSC:

Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura;

MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura;

MET: Microscopia Eletrônica de Transmissão;

DTA: Análise térmica diferencial;

DP: Desvio padrão.

EPIs: Equipamentos de proteção individual;

FPS: Fator de Proteção Solar;

HLB: Hidrofilic-Lipofilic Balance (Balanço hidrófilo-lipófilo);

MCO: Metoxicinamato de octila;

MDI: 4,4’-difenil metano diisocianato;

TG: Análise Termogravimétrica;

UV: Ultravioleta

UVA: Ultravioleta A

UVB: Ultravioleta B

µg/mL: Microgramas por mililitro;

mg/mL: Miligramas por mililitro;

µm: Micrômetro(s)

nm: Nanômetro(s)

µL: Microlitro(s)

mL: Mililitro(s)

min.: Minuto(s)

h: Hora(s)

λ: Comprimento de onda

“Os emergentes campos da Nanociência e Nanotecnologia lideram níveis sem

precedentes de compreensão e de controle das unidades estruturais de tudo o que é

físico. Isto irá mudar sobremaneira como tudo será desenvolvido e fabricado.”

National Nanotechnology Initiative.

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Capítulo 1. Introdução geral Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Introdução geral

No atual contexto mundial em que a competitividade industrial é crescente, o

domínio da tecnologia, ou seja, a aplicação de princípios, métodos, instrumentos ou

processos elaborados a partir da pesquisa científica para desenvolver e aperfeiçoar

produtos, é essencial para qualquer país. Algumas tecnologias podem ser utilizadas em

variados setores e permitem um controle mais sofisticado das propriedades de diferentes

produtos que vem alcançando hoje maior valor estratégico. Uma destas tecnologias que

apresenta um enorme potencial, é a encapsulação. Ainda pouco conhecida no Brasil,

essa tecnologia envolve processos complexos que permitem incorporar a um material

ativo novas propriedades funcionais e inteligentes, tornando mais eficaz o produto final

do qual esse material fará parte (Filho & Oliveira, 1999).

A encapsulação é uma tecnologia que permite o revestimento fino a partículas

sólidas, gotas de líquidos, dispersões, como um filme protetor. Os sistemas coloidais

incluem as emulsões, esferas, cápsulas, lipossomas e complexos lipídicos e são capazes

de atuar como veículos para fármacos lipofílicos e hidrofílicos. Os sistemas micros e

nanoestruturados podem ser administrados pelas vias intravenosas, subcutâneas, oral,

tópica, ocular e intramuscular. A principal vantagem destes sistemas é a capacidade de

modificar consideravelmente a penetração intracelular das substâncias a eles associados

(Alvarez-Román et al., 2001). A utilização dos sistemas coloidais como carreadores de

substâncias de uso dermatológico tem sido alvo de inúmeras pesquisas, contribuindo

para a introdução gradual destes sistemas no mercado farmacêutico e de cosméticos

(Dingler et al., 1999; Umbach, 1995).

O termo partícula refere-se à esferas e cápsulas e esta tecnologia de produção de

partículas é utilizada para transporte de fármacos hidrofóbicos. As partículas podem ser

projetadas e produzidas com características específicas, permitindo maior eficiência de

encapsulação e liberação controlada quando comparadas aos sistemas de encapsulação

convencional. Elas são ainda atrativas por serem pequenas o suficiente para serem

injetadas diretamente no sistema circulatório, além de poderem ser administradas por

outras vias como pulmonar, nasal, transcultânea, transdérmica e oral (Picos et al,. 2000).

Capítulo 1. Introdução geral Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Os componentes estruturais das partículas compreendem polímeros sintéticos ou

naturais, onde os naturais são normalmente utilizados em aplicações de curta duração,

enquanto os sintéticos podem apresentar liberação controlada por períodos prolongados.

As esferas têm um tipo de estrutura matricial. A droga pode ser absorvida na superfície

da esfera ou encapsulada dentro da partícula. No caso das cápsulas encontra-se um

sistema vesicular onde o fármaco é confinado em uma cavidade (núcleo) dentro da

partícula, recoberta por uma membrana polimérica (Couvrer, 1995).

As cápsulas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor de

um núcleo oleoso, podendo o fármaco estar dissolvido neste núcleo e/ou adsorvido à

parede polimérica (Weiss, 2001). Assim, um micro - nanocosmético pode ser definido

como sendo uma formulação cosmética que veicula ativos ou outros ingredientes micro

e nanoestruturados e que apresenta propriedades superiores quanto ao seu desempenho

em comparação com produtos convencionais (Fronza et al., 2007). Logo, as micro e

nanopartículas estão sendo propostas como veículos tópicos, especialmente para

bloqueadores UV, com o propósito de prolongar o tempo de resistência dos filtros

solares no estrato córneo (Alvarez-Román et al., 2004).

Tendo como base os conceitos de nanotecnologia, micro e nanoencapsulação o

presente trabalho enquadra-se no âmbito das atividades da Rede de Pesquisas de

Nanocosméticos financiada pelo CNP. Foi realizado em parceria com o Instituto de

Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT-SP) e o Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química (PPGEQ/UFRN), tendo como alvo uma

concentração de competências e esforços interinstitucionais para a obtenção e

desenvolvimento de micro e nanopartículas poliméricas de Quitosana/MDI com o

intuito de encapsular a Benzofenona-3, um ativo lipofílico aplicado em filtros solares. O

presente trabalho se mostra inovador, trazendo para o âmbito do PPGEQ/UFRN uma

nova linha de pesquisa: a micro e nanoencapsulação, podendo ser utilizada em parceria

com projetos já elaborados com o uso da quitosana nos laboratórios da UFRN.

Acompanhando essa linha de raciocínio os objetivos específicos desse trabalho

foram: desenvolver e aperfeiçoar o processo de obtenção das micro e nanocápsulas,

obter os menores diâmetros de partícula sem a presença de MDI residual, obter a maior

eficiência de encapsulação e elaborar um estudo de liberação do ativo em diferentes

meios.

Capítulo 1. Introdução geral Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Esta dissertação apresenta, portanto, os resultados destes estudos e está dividida

em seis capítulos. No Capítulo 1 foi feita uma breve introdução sobre o assunto em tela,

abordando-se alguns trabalhos da literatura e ressaltando-se a importância da parceria

realizada entre o PPGEQ/UFRN e o IPT-SP. No Capítulo 2 são abordados os aspectos

teóricos referentes aos conceitos de nanotecnologia, micro e nanoencapsulação, os

métodos de encapsulação, as técnicas de emulsificação espontânea e policondensação

interfacial, a reação de reticulação cruzada, os mecanismos de liberação controlada e as

matérias-primas utilizadas neste trabalho (quitosana, MDI, miglyol, BZ-3 e os

tensoativos). O Estado da Arte está contemplado no Capítulo 3 onde é apresentado um

“histórico” da nanotecnologia aplicada na área cosmética: como e quando teve início,

metodologias e técnicas, quais rumos tomou e como se encontra hoje no cenário

científico-tecnológico. O Capítulo 4 descreve a Metodologia Experimental utilizada

para a realização desta pesquisa, os materiais utilizados, o planejamento experimental

realizado, a metodologia para obtenção das partículas de quitosana/MDI e as

caracterizações das suspensões de partículas de quitosana/MDI (granulometria, índice

de polidispersão, morfologia, carga superficial, teor de ativo encapsulado, estabilidade

física das suspensões e caracterizações térmicas). Os Resultados e Discussões são

apresentados no Capítulo 5 analisando-os e discutindo-se as caracterizações realizadas

nas suspensões de partículas de quitosana/MDI. Fechando esta Dissertação o Capítulo 6

apresenta uma breve discussão geral sobre os resultados e as conclusões obtidas no

trabalho, propondo-se inclusive sugestões para trabalhos futuros.

CAPÍTULO 2

ASPECTOS TEÓRICOS

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Aspectos teóricos

2.1. Nanotecnologia

Muito se tem discutido sobre a tendência de miniaturização que abrange desde

computadores e periféricos a máquinas responsáveis pela produção dos mais diversos

itens. Entretanto, um aspecto que tem inquietado o meio acadêmico nos últimos anos,

relaciona-se a miniaturização de uma forma surpreendentemente diferente, não mais se

restringindo a miniaturizar máquinas e equipamentos, mas em fabricá-los em escala

atômica, ou melhor, dizendo, em escala nanométrica.

A nanotecnologia é o estudo e manipulação dos materiais quando reduzidos a

partículas cujos tamanhos encontram-se na casa do nanômetro ou milionésimo do

milímetro – número cem mil vezes menor do que o diâmetro de um fio de cabelo. Em

média, um átomo mede de 0,2 a 0,4 nanômetro, logo outra definição pode ser dada para

a ciência, por se, tratar-se da capacidade de manipular átomos e moléculas de forma a

dar aos materiais propriedades diferentes das que eles apresentam em seu estado natural

(Sant’anna, 2007).

Dois procedimentos de produção são utilizados atualmente em nanotecnologia,

são eles: bottom up (de baixo para cima) e top down (de cima para baixo). O método top

down refere-se à diminuição do material de sua forma volumosa (bulk) para dimensões

nanométricas por técnicas de litografia. Esse método, no entanto, tem encontrado

limitações sendo pouco utilizado. O método “bottom up”, refere-se à construção de

dispositivos a partir de átomos ou moléculas ligados quimicamente. Nesse caso, as

estruturas são vistas como versáteis “blocos de construção” para a obtenção de

dispositivos nanométricos, por exemplo, a funcionalização de um substrato com

moléculas de propriedades e funções específicas (Moraru; Panchapakesan; Huang,

2003).

Na escala nanométrica surgem novos fenômenos que não aparecem em escala

macroscópica. As mudanças mais importantes de comportamento são causadas não

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

apenas pela ordem de magnitude da redução de tamanho, mas por novos fenômenos

intrínsecos observados que se tornam predominantes em nanoescalas (Nicolau et al.,

2000; Rieth, 2003; Galembeck, 2003). À medida que os corpos diminuem de tamanho,

as forças gravitacionais, o atrito e a combustão diminuem sua influência, enquanto

novas forças, como forças eletrostática ganham destaque. Na escala nanométrica a força

de atração eletrostática entre dois prótons é cerca de 10

vezes maior que a força

gravitacional (Fishbine, 2002; Rocco, 1995; Rocco; Bainbridge, 2001; Rocco et al.,

1999; Seeman, 2003).

Existe hoje uma produção científica significativa no Brasil, nos temas de

manipulação de nano-objetos, nanoeletrônica, nanomagnetismo, nanoquímica e

nanobiotecnologia, incluindo os nanofármacos, a nanocatálise e as estruturas

nanopoliméricas. Também há uma produção tecnológica representada por patentes e há

projetos sendo executados por empresas, isoladamente ou em cooperação com

universidades ou institutos de pesquisa. Isto mostra que a nanotecnologia é

multidisciplinar, unindo diversas áreas de conhecimento, tais como: química, física,

biologia e engenharias. Apesar de estar relacionada a estruturas muito pequenas, a

nanotecnologia traz benefícios enormes, permitindo atingir o que em alguns anos atrás

era apenas ficção. Por esta razão, é agora um dos campos mais importantes

mundialmente. Observando a relevância da nanotecnologia, a Figura 2.1 apresenta

algumas possibilidades de aplicação dos nanomateriais em diferentes áreas da ciência.

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

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Figura 2.1. Diferentes áreas de aplicação da nanotecnologia (Adaptado do INOVABRASIL, 2007).

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2.2. Micro/Nanoencapsulação

Define-se microencapsulação como uma tecnologia de empacotamento de

sólidos, gotículas de líquido ou materiais gasosos em finas camadas poliméricas que

podem liberar seu conteúdo a taxas controladas e condições específicas (Sparks, 1981).

O material encapsulado é conhecido como ativo e o material de cobertura pode ser

chamado de membrana, carregador ou parede (Gibbs et al., 1999).

As principais nanoestruturas utilizadas para encapsulação de ativos são as

nanopartículas poliméricas, as nanopartículas lipídicas, os lipossomas e as

ciclodextrinas. As vantagens desses sistemas são a melhoria da estabilidade química e

física dos ativos, melhoria da biodisponibilidade, manutenção do ativo no tecido alvo,

muitas vezes, possibilitando a penetração deste em zonas corpóreas de difícil acesso,

solubilização de ativos hidrofóbicos, redução de efeitos colaterais e da toxicidade, assim

como do número de doses e freqüência de administração, proporcionando maior

conforto ao paciente e, conseqüentemente, a maior adesão ao tratamento (Lasic, 1993;

Szejtli, 1988).

Estes sistemas possuem características vantajosas que fazem deles promissores

veículos para aplicações cosméticas, dentre as quais se destacam a capacidade de

proteção a compostos lábeis contra degradação química, a possibilidade de controlar a

liberação dos componentes ativos, a atuação como agentes oclusivos, permitindo um

aumento no conteúdo de água na pele, e a potencial ação como bloqueadores das

radiações UV, atuando como filtros físicos, podendo ser combinados a filtros químicos

melhorando a fotoproteção (Wissing & Müller, 2003). Nanocarreadores apresentam

tamanho reduzido possibilitando um aumento do contato de moléculas ativas com o

estrato córneo, além de facilitar sua formulação em produtos dermatológicos e propiciar

confortável aplicação cutânea (Alves et al., 2007; Guterres et al., 2007).

A obtenção de partículas é condicionada a vários fatores como: concentração do

polímero e ativo, quantidade de tensoativo, concentração de óleo na fase orgânica e

velocidade de difusão da fase orgânica na aquosa (Couvrer et al., 2002). Algumas

características físico-químicas são essenciais para o equilíbrio dos sistemas, tendo como

exemplo o diâmetro de partícula. Este é um parâmetro importante utilizado no controle

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de qualidade, pois a estabilidade física das dispersões depende do tamanho da partícula

e do índice de polidispersão (Müller-Goymann,2004). O pH também é uma

característica físico-química importante a ser analisada, pois mudanças em seus valores

podem estar associados à degradação do polímero ou de outros elementos pertencentes à

formulação, sendo sua determinação também útil no monitoramento da estabilidade de

suspensões coloidais poliméricas (Schaffazic et al., 2003; Guterres et al., 2007).

A microcápsula consiste, em geral, de uma camada de polímero que atua como

um filme protetor, isolando a substância ativa e evitando os efeitos de sua exposição

inadequada. Essa membrana desfaz-se sob estímulos específicos, liberando a substância

em locais específicos ou na taxa mais adequada ao tratamento. Outra possibilidade de

encapsulação, além das cápsulas, é a formação de microesferas. Neste segundo caso, o

material ativo encontra-se disperso em uma matriz sólida de polímero (Ré, 2000). A

Figura 2.2 representa bem essa diferença entre as cápsulas e esferas.

Figura 2.2. Representação de cápsulas e esferas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso; b) fármaco

adsorvido à parede polimérica; c) fármaco retido na matriz polimérica; d) fármaco adsorvido ou

disperso molecularmente na matriz polimérica (Adaptado do INFARMA, 2005).

As microcápsulas são usadas principalmente para aumentar a estabilidade de

uma droga, para modificar ou retardar sua liberação em locais específicos de ação,

substâncias antiinflamatórias, por exemplo, podem ter seu tempo de atuação no plasma

sanguíneo aumentado pela microencapsulação, prolongando seu efeito no organismo

(Ré, 2000). As nanocápsulas apresentam uma série de vantagens em relação a outros

sistemas e emulsões, pois conferem proteção do ativo nela incorporada frente à

Parede polim

rica

cleo oleosos

psulas

sferas

rmaco

Matriz

polim

rica

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degradação química, uma vez que o ativo fica retido no interior de uma matriz

polimérica sólida ou de um invólucro polimérico que também tem a função de controlar

a liberação do ativo no meio de dispersão (Dingler et al., 1999).

Um grande número de fármacos apresenta pouca solubilidade ou instabilidade

em meio aquoso, fatores que podem originar problemas no desenvolvimento de

formulações. Neste sentido, as nanopartículas poliméricas podem proteger moléculas

lábeis e moléculas com problemas de solubilidade (Legrand et al., 1999).

Aplicando-se a micro e nanoencapsulação de fármacos na área cosmética obtem-

se uma série de vantagens (Natura, 2007) tais como:

• Aumenta a penetração do ativo no substrato (pele ou cabelo);

• Liberação mais efetiva do ativo para o substrato (área de superfície);

• Possibilidade de distribuição de ativos mais uniformes no substrato (pele ou

cabelo);

• Maior possibilidade de penetração através da pele causando melhora de eficácia

biológica dos ativos;

• Aumenta a solubilidade dos ativos, permitindo maior flexibilidade na

formulação;

• Aumento da estabilidade físico-química.

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2.3. Métodos de Encapsulação

Vários métodos de encapsulação são aplicados atualmente, inclusive em escala

industrial, como o “Spray-drying”, policondensação interfacial, entre outros. Estes

métodos também podem ser divididos em duas classes, sendo a primeira aquela em que,

durante o processo de formação das nanopartículas ocorre uma reação de polimerização;

a segunda classe, a nanopartícula é formada por um processo físico-químico,

empregando um polímero pré-formado (Reis et al., 2006). O processo de encapsulação

polimérica envolve uma larga área de aplicações, as quais se podem citar: as

formulações de produtos farmacêuticos e agrícolas, na indústria de cosméticos e em

revestimentos. Este processo é muitas vezes utilizado por razões de toxicidade do

produto à ser encapsulado, para mascarar gosto e odor, ou para facilitar a estocagem e o

transporte do produto encapsulado (Janssen, 1995). A Tabela 2.1 mostra os vários

métodos de encapsulação que são aplicados atualmente.

Tabela 2.1. Métodos de obtenção de microencapsulação. (Adaptada de BENITA, 1996).

Métodos Físicos Métodos Físico-Químicos Métodos Químicos

“Spray-drying” Coacervação Simples Polimerização interfacial

“Spray-chilling” Coacervação Complexa Polimerização “in-situ”

Leito fluidizado

Emulsificação e evaporação de

solvente

Deposição eletrostática Gelificação iônica/térmica

Extrusão centrífuga

Incompatibilidade polímero -

polímero

Separação rotacional de

suspensões

Centrifugação multiorifício

Revestimento em turbinas

Dessolvatação em meio líquido

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2.4. Técnica de emulsificação espontânea

Na emulsificação clássica preparam-se duas fases, uma lipofílica e outra

hidrofílica, que são aquecidas separadamente e vertidas, uma sobre a outra, sob

agitação, seguida da redução do diâmetro médio das gotículas realizado através de

métodos físicos (Kessler, 2001; Fronza; Campos; Teixeira, 2004). A preparação de

formulações por esta técnica foi descrita para diversos fármacos por Sznitowska et al

(2001), assim como para o diazepam (Levy & Benita, 1989) e mais recentemente,

para a nalbufina (Wang et al., 2006).

A emulsificação espontânea é uma alternativa interessante para estudos de

desenvolvimento, uma vez que permite a preparação de pequenos volumes de

formulação. Outra vantagem desta técnica é que a preparação das nanoemulsões é

realizada sem necessidade de aquecimento das fases, o que é interessante para fármacos

termos-sensíveis. Por esse método, o fármaco lipofílico é dissolvido em um solvente

orgânico miscível em água juntamente com o óleo que constitui a fase interna da

nanoemulsão e com um tensoativo lipofílico. A fase aquosa é composta, além de água,

de um tensoativo hidrofílico. Após a preparação das duas fases, verte-se a fase orgânica

sobre a aquosa sob agitação moderada, e o solvente orgânico é retirado por evaporação

à pressão reduzida (Yu et al., 1993; Pouton, 1997; Bouchemal et al., 2004, b). A

Figura 2.4 representa bem o esquema da emulsificação espontânea.

Fase

orgânica

Fase aquosa

Difusão

rápida do

solvente

miscível

em água

Nanopartículas

Fase

orgânica

Fase

orgânica

Fase aquosa

Difusão

rápida do

solvente

miscível

em água

Nanopartículas

Figura 2.3. Esquema da emulsificação espontânea.

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2.5. Técnica de policondensação interfacial

O método de policondensação interfacial foi descrito por Chang para a

preparação de células artificial em 1960 (Chang & Granato, 1992). Ela envolve dois

monômeros complementares na interface de duas fases imiscíveis. Na prática, se os dois

monômeros têm valores de coeficientes de partição relativamente elevados e opostos,

que pode ser assumido de forma a satisfazer os critérios de solubilidade implícita na

definição de policondensação interfacial. Em um sistema, o local inicial da

policondensação pode estar em um lado ou no outro lado da interface, em função dos

coeficientes de partição dos dois monômeros no sistema de duas fases. Em outras

palavras, a reação policondensação começa quando o produto das concentrações dos

dois monômeros tem o valor mais elevado.

A técnica de policondensação interfacial envolve duas etapas (Bouchemal et al.,

2002):

• Emulsificação: formação de emulsão O/A utilizando uma agitação mecânica durante

alguns minutos. O monômero está delimitado nas gotas da emulsão.

• Polimerização: Um segundo monômero é adicionado à fase externa da emulsão e a

etapa de policondensação ocorre na interface líquido-líquido da emulsão.

A etapa de emulsão é a de maior importância no processo clássico de

policondensação interfacial, pois ela determina o tamanho e índice de polidispersão das

partículas. Uma quantidade de energia mecânica é mantida durante alguns minutos para

conseguir a etapa de emulsificação e uma distribuição de tamanho estável. Além disso,

o agente ativo poderia difundir juntamente com o solvente para a fase aquosa, enquanto

o rendimento do encapsulamento decresceria (Frère; Danicher; Gramain, 1998).

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2.6. Técnica de policondensação interfacial combinada com

emulsificação espontânea

A técnica de policondensação interfacial combinada com emulsificação

espontânea trata-se de uma etapa do processo, onde uma fase orgânica (S

) é composta

por um solvente miscível em água, monômero, óleo, ativo e um surfactante lipofílico,

onde essa fase orgânica é injetada em uma fase aquosa contendo o polímero e o

emulsificante hidrofílico. O solvente miscível em água deve difundir-se para a fase

aquosa (S

), o óleo precipita como nano-gotas, o polímero e o monômero reagem na

interface, formando uma membrana ao redor da nano-emulsão levando a formação da

nanocápsulas (Montasser et al., 2001). A Figura 2.4 apresenta as etapas da técnica de

policondensação interfacial combinado com a emulsificação instantânea.

Figura 2.4. Mecanismo de preparação de partículas usando a técnica de policondensação interfacial

combinada com emulsificação espontânea (Montasser et al., 2001).

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2.7. Reação de Reticulação Cruzada

A reticulação cruzada é uma reação química que une duas ou mais moléculas por

ligações covalentes. Reagentes reticulantes contêm extremidades reativas para grupos

funcionais específicos. O processo de reticulação introduz ligações cruzadas, ou seja,

ligações entre moléculas lineares produzindo polímeros tridimensionais com alta massa

molar. Com o aumento da reticulação, a estrutura se torna mais rígida (Clegg & Collyer,

1991).

A quitosana possui grupos funcionais amina e hidroxilas que fornecem

excelentes sítios para reação da reticulação cruzada. Diversos reagentes, incluindo epóxi

de glutaraldeído, goma de dialdeído, diisocianatos e compostos de natureza não-tóxicas

têm sido utilizados como agentes reticuladores de quitosana. Entre estes estão os

diisocianatos, uma das importantes classes de reticuladores de quitosana, pois os

isocianatos possuem alta reatividade para com o grupo funcional amina, bem como para

grupo de hidroxila (Santosh et al., 2007).

No caso do uso da técnica de policondensação interfacial os grupos de isocianato

podem reagir com a água pela difusão do diisocianato para a fase aquosa formando um

grupo de ácido âmico, que é instável e se dissocia em uma cadeia com grupo aminas e

dióxido de carbono (Jabbari & Khakpour., 2000). Esta reação encontra-se representado

na Equação (1). A reação de reticulação cruzada esperada entre a quitosana e o MDI

(4,4’-difenil metano diisocianato), encontra-se representado na Equação (2).

-N=C=O + H

O -NH-COOH -NH

+ CO

(1)

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Equação (2) Reação de reticulação entre quitosana e MDI.

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2.8. Mecanismos de liberação controlada de ativos

A tecnologia de liberação controlada caracteriza o sistema capaz de prover

algum controle terapêutico, seja de natureza temporal, espacial ou ambos. Quando o

veículo empregado promove apenas uma liberação em tempo prolongado podemos

denominar como liberação sustentada. Tal tecnologia envolve diferentes aspectos

multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço da saúde humana. Os sistemas

de liberação oferecem inúmeras vantagens quando comparados a outros de dosagem

convencionais (Duran; Marcato; Teixeira, 2007), tais como:

• Maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada do fármaco;

• Diminuição significativa da toxicidade e maior tempo de permanência na

circulação;

• Natureza e composição dos veículos, além de proteção contra mecanismos de

instabilidade e decomposição do fármaco (inativação prematura);

• Administração segura, sem reações inflamatórias locais;

• Diminuição do número de doses devido à liberação progressiva;

• Possibilidade de direcionamento a alvos específicos.

Ensaios para avaliar a liberação de um ativo na pele são de difícil interpretação,

devido à natureza do estrato córneo e a interação com o veículo (Cross et al., 2001).

Fármacos, quando encapsulados no interior de matrizes poliméricas, não estão

prontamente disponíveis para o sistema biológico como quando em solução. Assim, o

polímero tem que dissolver ou desintegrar para que o fármaco possa ser liberado, ou

então o fármaco tem que dissolver e/ou difundir do interior da matriz. De qualquer

modo, a liberação do fármaco para o meio fisiológico é estendida a um tempo muito

maior comparado ao fármaco na sua forma livre, sendo esta características um dos

principais fatores para a pesquisa e desenvolvimento de sistemas microparticulados

(Filho & Oliveira,1999).

Os sistemas de liberação controlada podem ser classificados em diferentes

classes, destacando-se: sistemas controlados por difusão, sistemas ativados por solvente,

sistemas controlados quimicamente. Nos sistemas difusivos, o ativo pode estar

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armazenado de duas formas diferentes: em reservatório (micro/nanocápsulas) ou em

uma matriz (micro/nanoesferas). Neste tipo de sistema de liberação o ativo irá difundir

do interior da partícula e as características físico-químicas do ativo e do polímero irão

governar o perfil de liberação controlada. O controle difusivo pode ser otimizado com a

utilização de materiais estímulos-resposta, que por meio de estímulos de temperatura,

pH, força iônica, força elétrica, compostos químicos, enzimas e ultrasom aumentam ou

diminuem a difusão do ativo pela matriz polimérica (Benita, 1996).

Polímeros biodegradáveis são aqueles em que a quebra das cadeias resulta em

unidades monoméricas que podem ser eliminadas pelas vias metabólicas normais e essa

quebra das cadeias pode ocorrer por ação de hidrólise (degradação hidrolítica) ou de

enzimas (degradação enzimática). Sistemas erosivos ou degradáveis e, mais

particularmente, aqueles que se degradam em meio biológico têm encontrado grande

utilidade no desenvolvimento de sistemas de liberação controlada (Lima & Rodrigues-

Júnior, 1999).

A eliminação natural de um polímero após liberação total do ativo tem a

vantagem de dispensar o inconveniente de acúmulo de polímero no organismo. Sendo

assim, sistemas micro e nanoestruturados biodegradáveis e biocompatíveis

(microesferas, microcápsulas, nanoesferas e nanocápsulas) têm sido desenvolvidos para

liberação controlada de drogas (Soppimath et al., 2001; Benoit, 1996). O papel do

polímero na formulação desses sistemas de liberação controlada é muito diferente do

papel de um excipiente inerte em formulações farmacêuticas. O polímero influencia não

apenas na cinética de liberação do agente ativo como esperado, mas também na

estabilidade da droga, na toxidade e na compatibilidade com o organismo vivo

(Anderson & Shive, 1997).

A utilização destes sistemas em liberação controlada de fármacos envolve um

amplo campo de estudos e tem reunido muitos esforços, atualmente, na área de

nanopartículas. Estes esforços estão representados pelas novas estratégias para a

veiculação de ingredientes ativos, os quais incluem aplicações importantes das ciências

de polímeros, de surfactantes e de colóides.

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2.9. Matérias - primas

2.9.1. Quitosana

A quitosana é um biopolímero do tipo polissacarídeo amino. Constitui a maior

parte dos exoesqueletos dos insetos, crustáceos e parede celular de fungos. Por se tratar

de um polímero natural biodegradável extremamente abundante e atóxico a quitosana

tem sido proposta como um material potencialmente atraente para usos diversos. É

solúvel em meio ácido diluído, formando um polímero catiônico, com a protonação

(adição de prótons) do grupo amino (NH

), que confere propriedades especiais

diferenciadas em relação às fibras vegetais (Goosen, 1996; Roberts, 1992).

A quitosana é geralmente obtida pela desacetilação da quitina, uma reação que

pode ser executada em diferentes condições empregando diferentes álcalis. Entretanto, a

execução da reação de desacetilação de quitina em temperaturas elevadas e empregando

soluções concentradas de NaOH é o método mais usual para obtenção da quitosana

(Campana & Desbrières, 2000).

Adicionalmente, a quitosana possui atividade bacteriostática, que reduz o

crescimento de bactérias e outros tipos de microrganismos que entram em contato com a

mesma. Outra propriedade importante é a reconhecida propriedade homeostática da

quitosana que auxilia a cicatrização e estanca sangramentos em lesões cutâneas. Essa

propriedade permite a criação de bandagens para estancar sangramentos, e hemorragias

em ferimentos e incisões, protegendo de forma simultaneamente a área afetada de

infecções. Devido a sua habilidade em formar filmes hidrofílicos (que absorvem água)

sobre a pele, os cientistas estão investigando o uso da quitosana para o tratamento de

queimaduras.

A quitosana possui várias características que a tornam atraente para a utilização

em cosméticos. Ela se destaca por apresentar carga global positiva em pH biológico, ou

seja, apresenta-se como um polímero policatiônico, enquanto a maioria dos

biopolímeros apresentam-se negativamente carregados nas mesmas condições. As

cargas positivas da quitosana interagem com tecidos negativamente carregados, tais

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como pele e cabelo. Essa capacidade bioadesiva da quitosana é o principal fator para o

seu uso em cosméticos (Polymar, 2007).

Nos produtos para a pele, a quitosana encontra aplicação, principalmente por

conta da sua capacidade de formar camadas protetoras transparentes que apresentam a

propriedade de reter a umidade, sem causar reações alérgicas. A quitosana apresenta-se

ainda como uma matriz apropriada para outros ingredientes ativos, como pigmentos e

fragrâncias em diversos tipos de cosméticos. O caráter hidrofílico e hidrofóbico da

quitosana faz deste polímero um potente estabilizador de emulsões, o qual tem

aplicação direta em produtos com baixo pH.

Em composições de produtos para tratamento da pele, a adição da quitosana

aumenta a capacidade de retenção de umidade. Devido à presença de grupos amino, a

quitosana reage quimicamente com facilidade com produtos oxidantes protegendo

efetivamente as células epiteliais desses compostos. Outro aspecto muito importante é

que substâncias que absorvem radiação ultravioleta e corantes podem ser facilmente

ligadas de forma covalente aos grupos amino da quitosana (Polymar, 2008).

Em protetores solares, a quitosana reduz a perda dos filtros UV decorrente da

ação da água ou suor. Essa propriedade melhora a tolerância da pele ao protetor e

protege contra o ressecamento da mesma. A quitosana forma um filme sobre a pele que

reduz a quantidade de luz ultravioleta absorvida pela pele, aumentando o fator de

proteção solar. Em batons, a quitosana (utilizada nas concentrações de 0,05% a 1%)

aumenta a resistência dos filtros UV e de substâncias lipofílicas ativas, protegendo a

pele contra o ressecamento (Polymar, 2007).

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2.9.2. Diisocianato – MDI

Os isocianatos são substâncias altamente reativas e que apresentam muitas

aplicações em transformações sintéticas e processos industriais. Os isocianatos são

altamente insaturados e reagem rapidamente com substâncias que possuem prótons

ativos, como álcool e fenol. A aplicação de diisocianatos no campo da química de

polímero tem tomado a dianteira para a preparação de vários tipos de polímeros de

condensação como poliamidas, poliuretano e poliuréias (Tamami & Koohmareh, 2007).

Os isocianatos possuem o grupo NCO que reage com compostos que possuam átomos

de hidrogênio ativo, como os polióis, a água, os extensores de cadeia, etc. Todos os

isocianatos usados comercialmente possuem no mínimo dois grupos funcionais. Deles,

mais de 95% são aromáticos à base do TDI (31%) e dos diferentes tipos de MDI (66%).

Temos ainda os isocianatos especiais como: 1,5-naftaleno diisocianato (NDI) usado em

elastômeros sólidos e microcelulares de alto desempenho; bitolileno diisocianato

(TODI) com propriedades superiores em altas temperaturas; e p-fenileno diisocianto

(PPDI) com propriedades dinâmicas e termomecânicas superiores (Poliuretanos, 2008).

O 4,4’-difenil metano diisocianato, CH

NCO)

, também conhecido

como MDI é uma molécula simétrica possuindo grupos NCO com reatividades iguais

como mostra a Figura 2.5. Os diisocianatos são classes importante de reagentes para a

reticulação cruzada da quitosana porque os isocianatos possuem reatividade elevada

para o grupo amina assim como para grupos de hidroxilas. Mas, o maior problema é que

a maioria dos diisocianatos disponíveis no mercado tem reatividade elevada com água e

é insolúvel em soluções aquosas ácidas (Jin; Song; Hourston, 2004).

Figura 2.5. Fórmula estrutural do MDI.

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2.9.3. Benzofenona-3

A benzofenona-3 também conhecida como oxibenzona, metanona e

difenilcetona, é um derivado benzofenônico utilizado em aplicações tópicas como filtro

solar químico, que necessita ser adequadamente solubilizada nas emulsões de forma a se

evitar a recristalização e conseqüente perda e/ou diminuição da sua efetividade. Embora

tipicamente as benzofenonas sejam absorvedores UVB (290 a 320 nm), a benzofenona-

3 também absorve radiação UVA (320 a 360 nm), podendo ser considerado um filtro de

largo espectro. É utilizada como co-absorvedor, em associação a filtros específicos de

UVB (Martindale, 1999; Flor; Davolos; Correa, 2007). Sua fórmula estrutural está

representada na Figura 2.6.

Figura 2.6. Fórmula estrutural da BZ-3.

As benzofenonas são as únicas classes de filtros solares formada por cetonas

aromáticas. A deslocalização por ressonância é acrescida pela presença de um

grupamento doador de elétrons nas posições orto e/ou para. O grupamento carbonila

participa deste processo, sendo o grupamento receptor de elétrons (Shaath, 1997). A

BZ-3 possui dois picos de absorção com λ máximos em 288 nm e 325nm, é fotolábil e

pode ser oxidada rapidamente (Kullavanijaya & Lim, 2005).

Quando comparadas a outros filtros, as benzofenonas fazem ressonância mais

facilmente requerendo menor energia quântica para a transição eletrônica como

apresenta a Figura 2.7 e como a energia é inversamente proporcional ao comprimento

de onda (E = hc/λ), os compostos desta classe absorverão a energia com valores

correspondentes de comprimento de onda acima de 320 nm (Skoog & Leary, 1992;

Shaath, 1997).

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Figura 2.7. Estruturas de ressonância das benzofenonas (Shaath, 1997).

Embora seja um filtro amplamente utilizado, a BZ-3 pode causar reações

adversas. A BZ-3 pode causar eritemas faciais em pessoas alérgicas a este composto

(Nedorost, 2003), podendo causar também urticária logo após aplicação e uma

dermatite tardia (Collins & Ferguson, 1994).

A ANVISA aprova o uso da BZ-3 como filtro solar em produtos para higiene

pessoal, cosméticos e perfumes na concentração máxima de 10% e ressalta que para

concentrações maiores que 0,5% deve-se incluir a seguinte advertência na rotulagem:

contém oxibenzona (ANVISA, 2002), mas sua concentração de uso varia normalmente

entre 2 a 6%. Possui fórmula molecular C

, massa molar de 228,2 g/mol, ponto

de fusão entre 62 e 64 ºC, dose letal (oral) menor que 5 g/kg (Yesudian, 2002; Flor;

Davolos; Correa, 2007). Sua solubilidade de acordo com a comissão européia é de:

• Água: 0.0037 g/l (20°C);

• Glicerina: < 0,01%;

• Etanol: 6,0%;

• Isopropanol: 10,0%;

• Butanol: 10,0%;

• Miglyol® 812: 14,0%;

• Acetona: > 20,0%;

• Clorofórmio: > 20,0%.

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2.9.4. Miglyol

O Miglyol é um óleo neutro de aparência clara, ligeiramente amarelada

praticamente incolor e de odor e sabor neutro, constituído de uma mistura de

triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico. É um bom solvente, como outros óleos

éster e possui baixa viscosidade. Não é sensível ao calor, mesmo em climas quentes,

refrigeração não é necessária, têm um baixo teor de água, e, portanto, não é sensível a

divisão hidrolítica e microbiana. O miglyol é solúvel a 20 ° C, nos seguintes solventes:

Hexano, tolueno, éter etílico, acetato de etila, acetona, isopropanol, etanol a 96% (Sasol,

2008).

O miglyol possui as seguintes vantagens em comparação com óleos naturais:

• Alta estabilidade contra a oxidação;

• Permanece líquido a 0 ° C;

• Excelente espalhabilidade sobre a pele e boa absorção cutânea;

• Não inibe a respiração da pele;

• Promove excelente penetração;

• É emoliente (hidrata a pele e restaura a oleosidade perdida devido ao

ressecamento);

• Boas características de solubilidade.

O ácido caprílico é o nome usual dado ao ácido graxo de cadeia normal aberta

homogênea formada por oito carbonos, também conhecido como ácido octanóico. É

encontrado em sua forma natural nos coqueiros e no leite materno. Consiste num

líquido oleoso, de gosto desagradável e rançoso, e que é pouco solúvel em água. Possui

a fórmula química CH

(CH

)

COOH. A Figura 2.8 ilustra os triglicerídeos de ácido

caprílico.

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Figura 2.8. Triglicerídeos de ácido caprílico.

O ácido cáprico, também conhecido como ácido decanóico, é um ácido

carboxílico de fórmula CH

(CH

)

COOH. Sintetizado a partir de células da pele de

caprinos, é responsável pelo odor característico da espécie, a Figura 2.9 ilustra o

triglicerídeo de ácido cáprico.

Figura 2.9. Triglicerídeos de ácido cáprico.

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

2.9.5. Tensoativos

2.9.5.1 Tween 80

O tween é composto por ésteres de sorbitan etoxilados. Conforme o tipo de

ácido graxo de origem e grau de etoxilação pode ser obtido produtos com diferentes

balanços hidrofílico-lipofilico (HLB), que se adaptam as diversas aplicações, mas no

caso do tween 80 seu HLB é de 15,5. Sua estrutura se encontra representada na Figura

2.10.

HO(CH

(OCH

)

CH(OCH

)

O (CH

Z-1

O C

(CH

)

CH=CHCH

(CH

)

Somatório de w+x+y+z=20

Figura 2.10. Estrutura molecular do Tween 80.

A característica hidrofílica da cadeia de polioxietileno faz do tween, tensoativos

hidrofílicos (alto HLB), geralmente solúveis ou dispersíveis em água e empregados para

obter emulsões do tipo óleo em água (O/A), como dispersantes ou solubilizantes de

óleos e como cotensoativos em xampus. Estas características do tween são

determinantes para suas aplicações em cosméticos, por exemplo, em cremes e loções.

Nestes tipos de produtos a presença de grupos hidrofílicos e lipofílicos nas moléculas

promove uma redução da tensão interfacial entre os componentes da formulação,

permitindo a obtenção de emulsões estáveis (Mapric, 2008). O Tween 80 é praticamente

não irritante possuindo uma toxidade potencialmente muito baixa. A ingestão diária em

decigramas por quilograma de peso corpóreo, correspondente a um adulto pesando 70

kg consumindo cerca de 1,75 mg de tween 80 diariamente sem qualquer risco de

toxicidade potencial (Epic, 2008).

Capítulo 2. Aspectos teóricos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

2.9.5.2 Span 80

O Span 80 ou Sorbitana monooleato é éster de sorbitana amplamente usado em

produtos alimentícios e farmacêuticos. É um tensoativo não iônico (Epic, 2008). Sua

estrutura molecular é representada pela Figura 2.11.

Figura 2.11. Estrutura molecular do Span 80.

O Span é tensoativo lipofílico, ou seja, exibem baixos valores de HLB. O caráter

lipofílico faz com que este produto seja solúvel ou dispersível em óleo, favorecendo sua

aplicação em emulsões do tipo água em óleo (A/O).

O Span e o Tween 80 têm uso previsto no “Cosmetic Ingredient Handbook” da

CTFA

e na Farmacopéia Americana (USP). O relatório sobre segurança dos produtos do

“Cosmetic Ingredient Review” conclui que estes produtos são seguros para uso em

formulações cosméticas. O Span e o Tween não são irritantes aos olhos e à pele,

conforme testes realizados em coelhos e em seres humanos, porém em se tratando de

produtos químicos puros recomenda-se, quando de seu manuseio, a utilização de EPIs

como luvas de PVC, óculos de segurança e avental (Oxiteno, 2008).

CAPÍTULO 3

ESTADO DA ARTE

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Estado da arte

Durante uma palestra para a Sociedade Americana de Física em 1959, o físico

americano Richard Feynman (1918-1988) apresentou seu projeto para uma nova

pesquisa. Em sua apresentação intitulada “There is plenty of room at the bottom”, ou

em português: “Há muito espaço lá em baixo”, Feymann sugeriu meios para

desenvolver a habilidade de manipular átomos e moléculas. Segundo o autor, "Os

princípios da física não falam contra a possibilidade de se manipular as coisas átomo

por átomo". Feymann afirmou que há tanto lugar nessa pequena escala que, dominada a

manipulação dos átomos individualmente, seria possível registrar tudo o que a

humanidade escreveu até a presente data em um cubo de um décimo de milímetro de

lado: ou seja, em um grão de poeira.

O termo Nanotechnology foi criado em 1974, na Universidade de Ciências de

Tókio pelo professor Norio Taniguchi para descrever a manufatura precisa de materiais

com tolerâncias nanométricas. Na década de 80, o termo foi reinventado e sua definição

expandida pelo professor K. Eric Dexler do Massachusetts Institute of Technology -

MIT, mais especificamente em seu livro “Engines of Creation – The Coming Era of

Nanotechnology”, de 1986. Sua tese de doutorado “Nanosystems: Molecular

Machinery, Manufacturing and Computation”, publicado em 1992 reacendeu o

interesse pela tecnologia no meio cientifico mundial. Na Figura 3.1. estão listados

eventos importantes em nanotecnologia.

1974

1981

1985

1986

1989 1992 2001

199719911959

•Palestra de

Richard

Feynman

•Termo

Nanotecnologia é

criado por Norio

Taniguchi

•Invenção

Microscópio de

Tunelamento

•Descoberta a

molécula de

fullereno

•Eric Dexier lança

o livro “Engines

of creation- The

Coming Era of

Nanotechnology

•IBM manipula

35 átomos de

Xenônio e

escreve com eles

sua marca numa

placa de níquel

•Descoberta

dos

nanotubos

•Descoberta

dos

nanocones

•IBM desenvolve

método para

crescimento de

nanotubos de

carbono

•Criada a primeira

empresa de

nanotecnologia – a

Zyvex

1931

•Invenção do

Microscópio

Eletrônico

1974

1981

1985

1986

1989 1992 2001

199719911959

•Palestra de

Richard

Feynman

•Termo

Nanotecnologia é

criado por Norio

Taniguchi

•Invenção

Microscópio de

Tunelamento

•Descoberta a

molécula de

fullereno

•Eric Dexier lança

o livro “Engines

of creation- The

Coming Era of

Nanotechnology

•IBM manipula

35 átomos de

Xenônio e

escreve com eles

sua marca numa

placa de níquel

•Descoberta

dos

nanotubos

•Descoberta

dos

nanocones

•IBM desenvolve

método para

crescimento de

nanotubos de

carbono

•Criada a primeira

empresa de

nanotecnologia – a

Zyvex

1974

1981

1985

1986

1989 1992 2001

199719911959

•Palestra de

Richard

Feynman

•Termo

Nanotecnologia é

criado por Norio

Taniguchi

•Invenção

Microscópio de

Tunelamento

•Descoberta a

molécula de

fullereno

•Eric Dexier lança

o livro “Engines

of creation- The

Coming Era of

Nanotechnology

•IBM manipula

35 átomos de

Xenônio e

escreve com eles

sua marca numa

placa de níquel

•Descoberta

dos

nanotubos

•Descoberta

dos

nanocones

•IBM desenvolve

método para

crescimento de

nanotubos de

carbono

•Criada a primeira

empresa de

nanotecnologia – a

Zyvex

19741974

19811981

19851985

19861986

19891989 19921992 20012001

19971997199119911959

•Palestra de

Richard

Feynman

1959

•Palestra de

Richard

Feynman

•Termo

Nanotecnologia é

criado por Norio

Taniguchi

•Invenção

Microscópio de

Tunelamento

•Descoberta a

molécula de

fullereno

•Eric Dexier lança

o livro “Engines

of creation- The

Coming Era of

Nanotechnology

•IBM manipula

35 átomos de

Xenônio e

escreve com eles

sua marca numa

placa de níquel

•Descoberta

dos

nanotubos

•Descoberta

dos

nanocones

•IBM desenvolve

método para

crescimento de

nanotubos de

carbono

•Criada a primeira

empresa de

nanotecnologia – a

Zyvex

1931

•Invenção do

Microscópio

Eletrônico

Figura 3.1. Principais fatos históricos em nanotecnologia.

Tempo

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

A nanotecnologia farmacêutica teve início em meados da década de 1970 com

os lipossomas como carregadores de fármacos hidrofílicos ou lipofílicos. Em 1980

surgiram as nanopartículas poliméricas carreadoras de fármacos lipofílicos,

principalmente empregando polímeros biodegradáveis. Na década de 1990 surgiram as

nanopartículas lipídicas sólidas. Cada um desses sistemas apresenta peculiaridades que

devem ser consideradas na escolha do sistema de liberação. Mas foram as emulsões os

primeiros sistemas de liberação de ativos cosméticos na pele, e constituem uma

dispersão composta por gotículas de um líquido, distribuídas em um veículo no qual é

imiscível, a fase dispersante, por intermédio de um tensoativo (Ansel; Popovich; Allen,

2000). Deve-se destacar que o desenvolvimento de novos sistemas de liberação em

cosméticos foi influenciado principalmente pelo estudo de novos tensoativos sintéticos

e pela maior compreensão da estrutura e função da pele em relação à absorção

percutânea, tendo sido intensamente estudados, ao longo dos anos (Nacht,1995;

Magdassi, 1997).

A área de cosméticos vem empregando nanotecnologia nos mais diversos

produtos, como: partículas metálicas para aumento de brilho em maquiagens;

nanoemulsões para cabelos que são hidratantes mais promissores; proteção de ativos

contra a degradação, por exemplo no encapsulamento da vitamina C; liberação em

camadas mais profundas da pele de ativos anti-rugas; melhoria da textura do creme e

formação de um filme mais eficiente de protetores solar, como exemplo, o emprego de

nanopartículas de dióxido de zinco. Tais produtos, no entanto, devem ser

cuidadosamente investigados anteriormente à introdução no mercado, uma vez que tais

sistemas nanoparticulados apresentam inúmeros benefícios, mas também podem ter

algum efeito danoso. As nanopartículas de dióxido de zinco em proteção solar, por

exemplo, não devem penetrar até camadas mais profundas da pele, uma vez que poderia

ocasionar reações inclusive de danos ao DNA (Nanobiotecnologia, 2008).

Em 1891, Hammer publicou uma revisão em que ele descrevia a influência da

luz sobre a pele. Ele reuniu diversas evidências de que a queimadura solar era devida à

radiação UV e foi o primeiro a recomendar o uso de filtros solares químicos: “Materiais

que impedem a radiação UV de atingir a pele protegendo-a contra os eritemas solares”

(Urbach, 2001).

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Os filtros solares têm seu uso relatado no cenário mundial a partir de 1928,

quando foi lançada nos Estados Unidos uma emulsão contendo dois filtros solares

químicos, o salicilato de benzila e o cinamato de benzila. Durante a II Guerra Mundial o

exército americano fez uso de vários produtos de natureza física e química, o que

acabou resultando em uma relação de produtos aprovados e suas concentrações de uso,

entre estas substâncias destacam-se: ácido paminobenzóico PABA (3 %), salicilato de

etilhexila (5 %), salicilato de homometila (8 %) e salicilato de dipropilenoglicol (4 %)

(Shaath, 1997).

Alvarez-Román et al., (2001) elaboraram o primeiro estudo de encapsulação de

um filtro solar. Eles estudaram nanocápsulas contendo metoxicinamato de octila

(MCO), um filtro solar lipofílico e avaliaram o perfil de liberação das mesmas

incorporadas em um gel, bem como sua habilidade em proteger a pele de porco contra a

radiação UVB. As nanocápsulas proporcionaram uma liberação contínua da substância

no modelo utilizando a pele de porco. A finalidade do estudo foi constatar o efeito das

nanocápsulas na fotoproteção. Foi observado que a proteção contra eritema induzido por

radiação ultravioleta foi expressivamente maior (p < 0.05) a partir do gel contendo

nanocápsulas, as quais foram produzidas utilizando poli (epsilon-caprolactona) pelo

método de deposição interfacial. A taxa de encapsulação foi alta (99 ± 1% da

concentração inicial de MCO), sendo obtidas nanocápsulas com um diâmetro médio de

300 nm. Segundo os autores, os resultados apresentados sugerem que as nanopartículas,

devido à sua alta área superficial específica, são capazes de cobrir eficientemente a

superfície da pele e melhorar a habilidade do protetor solar em inibir o eritema. Os

pesquisadores destacaram que os resultados deste estudo enfatizam o potencial de

nanocápsulas como novos sistemas de distribuição de substâncias ativas na pele.

Em outro estudo desenvolvido por Alvarez-Román et al., (2004) avaliou-se a

retenção do MCO no estrato córneo de pele suína através da técnica de “tape stripping

in vitro”. A quantidade de filtro solar químico retida no estrato córneo foi 3,4 vezes

maior quando vinculado a nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) do que na forma livre.

Após 6 horas de experimento o filtro solar não foi detectado no compartimento receptor.

Neste mesmo estudo avaliou-se, através de microscopia confocal, a distribuição de uma

sonda fluorescente nanoencapsulada e livre. Observou-se uma melhora na distribuição

da sonda quando liberada a partir das nanopartículas, porém os autores afirmam que as

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

imagens não possibilitam definir se a sonda, melhor distribuída, é originalmente

nanoencapsulada ou livre.

Em outro estudo sobre nanocápsulas contendo MCO, Jiménez et al., (2004)

compararam o desempenho do ativo na forma livre e na forma encapsulada, sendo

preparadas quatro emulsões A/O e O/A contendo MCO. A técnica utilizada para

preparar as nanocápsulas foi à de deposição interfacial, utilizando poli (epsilon-

caprolactona), e as formulações foram aplicadas em pele de porco num estudo in vitro.

As nanocápsulas obtidas apresentaram um diâmetro médio de 374 nm e uma alta

percentagem de encapsulação (97,52%). Os autores verificaram que as nanocápsulas

diminuíram a penetração cutânea do MCO, retendo esta substância na superfície da

pele, o que é fundamental para uma efetiva fotoproteção. Além disso, proporcionaram

uma liberação contínua aumentando, conseqüentemente, o tempo de contato do ativo

com a superfície da pele. Diante dos resultados, os pesquisadores salientaram que

emulsões contendo nanocápsulas podem ser utilizadas como carreadores de moléculas

ativas, sendo novos tipos de sistemas de aplicação de substâncias na pele. Os dados

demonstram que a aplicabilidade das nanocápsulas em produtos destinados à

fotoproteção representa um vasto potencial de mercado.

O método de obtenção de nanocápsulas e sua penetração cutânea foram

avaliados por Olvera-Martínez et al., (2005). Neste estudo os autores obtiveram

nanocápsulas de MCO através do método de emulsificação-difusão com diâmetros entre

400 e 615 nm e nanoemulsão com aproximadamente 160 nm. Após caracterização dos

nanocarreadores a penetração cutânea do filtro solar foi avaliada, a partir das

nanocápsulas, nanoemulsão e emulsão convencional, através da técnica de “tape

stripping in vivo”, determinando a quantidade de MCO retida no estrato córneo. A

incorporação do MCO em nanoemulsão aumentou sua penetração quando comparada ao

ativo incorporado em nanocápsulas ou na emulsão convencional. Os autores atribuem o

aumento da penetração do ativo incorporado na nanoemulsão ao tamanho das gotículas

e a flexibilidade das mesmas quando comparadas às nanocápsulas, que apresentaram

diâmetro médio maior além de serem estruturas mais rígidas.

Para avaliar o local de liberação do MCO a partir de nanocápsulas poliméricas

incorporadas em um gel de hidroxietilcelulose e sua penetração cutânea, Weiss-Angeli

(2007), desenvolveu um novo sistema de extração do ativo retido na pele nos

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

experimentos de penetração cutânea utilizando célula de difusão de Franz. Neste

trabalho dois protocolos foram empregados, no primeiro o MCO foi extraído das

diferentes camadas da pele em estudo utilizando um solvente de extração convencional,

acetonitrila, possibilitando o doseamento do ativo livre e encapsulado, pois este solvente

dissolve as nanocápsulas. O segundo protocolo empregado utilizou como solvente de

extração o miristato de isopropila, que não solubiliza o polímero, mas solubiliza o filtro

solar livre, e posterior ultracentrifugação, separando as nanocápsulas presentes no

sistema e possibilitando o doseamento do ativo livre. Os resultados demonstram não

haver diferença entre as quantidades doseadas através dos dois protocolos nas camadas

mais profundas da pele. Entretanto, na superfície cutânea houve uma diferença

significativa entre a quantidade de filtro livre e total, indicando haver liberação do ativo

a partir das nanocápsulas acumuladas nesta camada da pele. Os autores concluem que

esse efeito pode ser explicado pelo reduzido tamanho das nanocápsulas e pela

hidrofobicidade do polímero, poli(ε- caprolactona), ambos fatores que contribuem para

o acúmulo de nanocápsulas na superfície da pele.

Os mecanismos de permeação de nanopartículas poliméricas preparadas com

poli(ε-caprolactona)-b-poli(etilenoglicol) contendo minoxidil e o efeito do tamanho das

nanopartículas sobre a taxa de permeação do fármaco foram avaliados por Shim et al.,

(2004). Foram preparadas nanopartículas com diâmetros médios de 40 e 130 nm, que

foram avaliadas através de célula de difusão de Franz utilizando-se como membrana de

estudo a pele de “porcos da índia” com e sem pêlos. Os resultados sugeriram que, para

as membranas com pêlos, as partículas de menor tamanho facilitaram amplamente a

permeação do minoxidil para o compartimento receptor, aumentando 1,5 vezes a

quantidade permeada até a epiderme e 1,7 vezes a quantidade no fluido receptor,

quando comparadas às partículas maiores. No entanto, para as membranas sem pêlos, a

permeação do fármaco não foi dependente do tamanho de partícula, sugerindo que a

liberação do minoxidil a partir das nanopartículas pode acontecer, principalmente, nos

folículos pilosos.

Nanocápsulas contendo o antisséptico clorexidina aumentam o tempo de contato

desta substância com a pele, como verificaram Lboutounne et al., (2002) utilizando pele

de porco. As nanoestruturas foram preparadas utilizando poli(epsilon-caprolactona),

através do método de deposição interfacial, e proporcionaram uma liberação contínua da

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

substância por pelo menos 8 horas. Houve uma alta taxa de encapsulação do

antisséptico, corroborando com Jiménez et al., (2004). A concentração residual de

clorexidina no estrato córneo foi três vezes maior utilizando a suspensão de

nanocápsulas em hidrogel em relação à formulação contendo a substância ativa não-

encapsulada, proporcionando uma atividade antimicrobiana tópica prolongada contra

Staphylococcus epidermidis.

Perioli et al., (2006) utilizaram a TG e DSC para caracterizar a inclusão do filtro

solar, ácido sulfônico fenibenzilimidazol, em argila aniônica e concluíram que as

hidrotalcitas (hidróxidos duplos lamelares com elevada capacidade de troca aniônica)

foram boas matrizes para a incorporação de o filtro solar. Já Scalia; Villani; Casolari

(1999) utilizaram a análise térmica, DTA e TGA, além de outros métodos analíticos

para a comprovação da inclusão de filtro solar, 2-etil-hexil-p-dimetilaminobezoato, na

cavidade de ciclodextrina.

Pérez et al., (2004) realizaram estudo termoanalítico de substâncias que atuam

como filtros solares, isoladas e na forma de misturas, com objetivo de avaliar o

comportamento térmico por TG e por DSC. A partir dos resultados obtidos, os autores

concluíram que a decomposição térmica dos filtros solar despertou o interesse para

posterior estudo por TG isotérmica, visando à determinação da meia-vida destes

materiais. A técnica forneceu informações importantes quanto ao comportamento

térmico dos filtros solares.

A análise térmica, juntamente com outros parâmetros analíticos, reologia,

espectrofotometria no ultravioleta (UV) e cromatografia líquida de alta eficiência, foram

utilizados no estudo de estabilidade de emulsões contendo filtros solares que

absorveram nas regiões do UV e infravermelho. No trabalho realizado por Pérez et al.,

(2004), a DSC, TG e DTG foram utilizadas para verificar o comportamento térmico dos

filtros solares, benzofenona-3 e p-metoxinamato de octila (Santoro et al., 2000).

Com relação à estabilidade das emulsões, Silva; Nacco; Matos (1994)

propuseram a aplicação da análise térmica na avaliação de emulsões O/A, sendo

abordada a liberação de água a partir da elaboração de curvas TG, uma vez que a

temperatura de liberação da água é uma primeira característica representativa da força

de ligação da água. Foi sugerida a técnica para o desenvolvimento de formas de

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

liberação controlada de água e a investigação de transição de fase e estabilidade de

formulações.

Já os estudos com a quitosana se destacam os publicados por Tharanathan &

Prashanth (2007) que realizaram uma extensa pesquisa sobre a quitina e a quitosana,

pesquisando suas modificações e aplicações. Neste estudo ficou comprovado que as

áreas de aplicações da quitina/quitosana e seus derivados são ilimitados, uma vez que

estes podem ser obtidos na forma de fibras, microesferas e nanopartículas. São

mencionadas aplicações na área de alimentos e nutrição, ciência dos materiais, ciências

médicas e farmacêuticas, microbiologia, imunologia, dentre outras.

Moura; Aouada; Mattoso (2008) desenvolveram nanopartículas através da

polimerização do ácido metacrílico na presença da quitosana, neste estudo foram

analisados o diâmetro da partícula que ficou entre 99 a 218nm, potencial zeta que

diminui com o aumento do pH, infravermelho, ressonância magnética nuclear e

microscopia eletrônica de transmissão. As nanopartículas obtidas apresentaram uma

morfologia bem homogênea além de um índice de polidispersão baixo. Foi observado

também que o diâmetro da partícula dependia da concentração da quitosana durante o

método de preparação: quanto maior a concentração de quitosana menor seria a

partícula.

Jiang et al., (2006) estudaram a aplicação de um sistema de dispersão de

nanopartículas de quitosana em queimaduras da pele. Eles evidenciaram que o sistema

de dispersão de nanopartículas de quitosana possuía efeitos curativos e reduzia o tempo

de cura e cicatrização, sugerindo que este sistema poderia ser desenvolvido para uma

nova perspectiva médica. O filme protetor de quitosana permite a passagem de oxigênio

permitindo uma rápida cicatrização. Além disso, após a cicatrização do ferimento, não

havia necessidade de remover a quitosana, pois as enzimas presentes nos tecidos

epiteliais degradam o polímero permitindo a sua absorção pelo organismo. Como

benefício adicional, evita-se danos na área cicatrizada causados pela remoção da

bandagem.

As benzofenonas começaram a ser utilizadas como filtros solares no final da

década de 50. A benzofenona-3 (BZ-3) (2-hidroxi-4-metoxibenzofenona) ou

oxibenzona, um composto lipofílico, é o mais utilizado dessa categoria nos Estados

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Unidos (Nedorost, 2003). Além dos problemas dermatológicos associados à BZ-3,

algumas pesquisas têm levantado a possibilidade de ações adversas sistêmicas da BZ-3.

Hayden et al., (1997) quantificaram a absorção sistêmica da BZ-3 em voluntários

humanos. Após 12 horas de ensaio, 1% a 2%, da quantidade de BZ-3 aplicada na pele,

foi detectado na urina. Nesta pesquisa foram utilizadas quantidades de filtro seis vezes

maiores que as utilizadas para determinação do fator de proteção solar (Hayden et al.,

1997).

Luppi et al., (2003) estudaram a permeação, através de célula de difusão de

Franz, da BZ3 nanoencapsulada, utilizando como polímero o álcool polivinílico ligado a

diferentes ácidos graxos com dois graus de substituição (40 e 80 %), visando

aperfeiçoar uma formulação que limite a permeação do ativo através da pele até a

circulação sistêmica. A natureza dos substituintes e o grau de substituição influenciaram

no tamanho de partícula e na habilidade de interação do ativo com a pele. As

nanopartículas obtidas com baixo grau de substituição apresentaram melhor localização

do ativo na epiderme, entretanto às obtidas com alto grau de substituição preveniram a

absorção percutânea da BZ3.

Simeoni et al., (2006) estudaram a influência da complexação da BZ3 com

hidropropil-α-ciclodextrina (HP-α-CD) e sulfobutileter-β- ciclodextrina (SBE-β-CD) na

penetração cutânea do filtro químico. Os estudos de penetração foram conduzidos em

células de difusão de Franz. Os resultados demonstram que a complexação da BZ3 em

HP-α-CD não alterou seu perfil de penetração, porém a complexação com SBE-β-CD

reduziu significativamente a penetração percutânea (quantidade detectada tanto no

estrato córneo, quanto epiderme e derme), minimizando assim o contato do filtro solar

com a pele e os riscos toxicológicos associados a ele. Segundo os autores este aspecto é

particularmente importante em preparações comerciais contendo BZ3, visto que estas

contêm elevadas concentrações do filtro solar e são aplicadas repetidas vezes em

grandes extensões de pele permanecendo por um longo período de tempo.

Em um estudo de segurança da BZ-3, após administração dérmica em ratos, a

BZ-3 formulada em uma base oleosa foi aplicada na dose de 100 mg/Kg de peso

corpóreo, duas vezes ao dia, por quatro semanas. Baseando-se nos seus resultados

bioquímicos, hematológicos e patológicos sugeriu-se que a BZ-3 não é tóxica nas

condições da pesquisa (Okereke et al., 1995).

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

As nanopartículas poliméricas têm sido extensivamente estudas como

carreadores de fármacos nos campos farmacêuticos e médicos, porque eles mostram-se

promissores como sistemas de entrega de droga e de liberação controlada ou sustentada.

Foram desenvolvidos vários métodos para obtenção de nanopartículas durante as

últimas duas décadas, classificadas de acordo com a formação da partícula: se envolve

uma reação de polimerização, surge de uma macromolécula ou de um polímero pré-

formado. Reis et al., (2006) fez uma revisão destes métodos onde foram descritos os

métodos de preparação mais importantes para a obtenção de nanopartículas,

especialmente os que fazem uso de polímeros naturais. As vantagens e desvantagens

foram apresentadas facilitando a seleção do método de encapsulação apropriado, de

acordo com a aplicação específica.

Segundo Bouchemal et al., (2004) (a), o alfa-tocoferol (vitamina E) é largamente

utilizado como antioxidante em muitos cosméticos, mas apresenta uma rápida

degradabilidade, devido à sua sensibilidade à luz, ao calor e ao oxigênio. Os

pesquisadores relatam que carreadores capazes de encapsular substâncias ativas, tais

como nanocápsulas, são uma oportunidade atraente para proteger moléculas contra a

degradação. Este grupo de pesquisa produziu nanocápsulas de 150 a 500 nm

encapsulando o alfatocoferol, utilizando o polímero poliuretano e poli (éter uretano),

através de uma nova técnica que engloba a policondensação interfacial (Montasser et

al., 2001) combinada com emulsificação espontânea. Os autores verificaram que o

método oferece numerosas vantagens, quando comparado à técnica clássica de

policondensação interfacial. Eles destacam que uma das vantagens destes sistemas

nanométricos está em apresentar uma enorme área superficial, o que torna tais

dispositivos convenientes para importantes aplicações cosméticas e farmacêuticas, bem

como formulações tópicas de substâncias lipofílicas encapsuladas para uma liberação

homogênea.

As nanoemulsões consistem em dispersões de óleo/água, obtendo gotículas de

diâmetro entre 100-600 nm. No trabalho elaborado por Bouchemal et al., (2004) (b), as

nanoemulsões foram preparadas pelo mecanismo de emulsificação espontânea, que se

inicia quando uma fase orgânica e uma fase aquosa são misturadas. A fase orgânica é

uma solução homogênea de óleo, surfactante lipofílico solvente miscível em água, a

fase aquosa consiste de um surfactante hidrófilo e água. Um estudo experimental de

Capítulo 3. Estado da arte Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

otimização do processo de obtenção da nanoemulsão baseado na distribuição de

tamanho foi executado. Os resultados mostraram que a composição da fase orgânica

inicial era de grande importância no processo de emulsificação espontânea, e também

para as propriedades físico-químicas das emulsões obtidas. Primeiramente, o HBL da

nanoemulsão foi superior a 8, obtendo gotas de diâmetro de 171 nm. Segundo, a

concentração do solvente miscível em água (acetona) e seu efeito no processo de

emulsificação foram estudados, verificando que quanto mais polar o solvente menor

será o diâmetro da partícula. A etapa de emulsificação representa um importante passo

na obtenção de partículas poliméricas usando nanoprecipitação ou policondensação

interfacial combinado com emulsificação espontânea.

Bouchemal et al., (2006) em um outro estudo, obtiveram partículas nanométricas

que possuíam um núcleo oleoso e uma parede polimérica ( nanocápsulas), combinando

em uma única fase o processo de emulsificação e uma reação de polimerização de

interfacial. A emulsificação espontânea produziu uma dispersão de gotículas de óleo

entre 100-400 nm de diâmetro, onde, logo em seguida, a reação de policondensação

interfacial aconteceu. O processo foi aperfeiçoado considerando à escolha do α-

tocoferol como óleo e fez destaque à presença de monômeros dentro da fase aquosa e da

fase orgânica e a conversão deles em polímero. A causa principal de dificuldades era a

grande concentração de monômeros de diamina na fase aquosa que fez as gotículas de

óleo imediatamente instável ocorrendo agregação depois da formação. Foi observado

que, uma vez que o emulsificante tenha sido adsorvido e a polimerização completada, as

suspensões finais de nanocápsulas permaneceram estáveis por longos períodos. Uma

população secundária de partículas micrométricas que coexistiram com as nanocápsulas

estava presente em vários casos onde era desfavorável sua presença, considerando a

aplicação delas como um sistema de entrega de droga para aplicações cosméticas.

Na busca por material científico indexado em bancos de dados, foram

encontrados poucos trabalhos direcionados especificamente a nanocápsulas em

cosméticos. A escassez de informações técnico-científicas talvez possa ser explicada

pelo fato de que a utilização de nanocápsulas em cosméticos é bem mais recente que o

uso das mesmas em fármacos, para os quais já há um número bem maior de estudos

publicados.

CAPÍTULO 4

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

4. Metodologia experimental

4.1. Materiais

4.1.1. Equipamentos

 Reator mecanicamente agitado de 200ml;

 Condensador de allihn tipo bola;

 Termômetro digital portátil tipo espeto, modelo TM879, Marca Equitherm, faixa

de temperatura -50 ºC a 300 ºC, com precisão de + 1 ºC;

 Centrífuga Selecta, Modelo Medifriger-BL;

 Banho termostático Haake DC 30;

 CLAE Shimadzu, Modelo CBM-20A;

 Espectrofotômetro Cintra, Modelo Cintra 10E;

 Zetamaster (Medidor de potencial Zeta) - Marca Malvern, Modelo Zetamaster S;

 Incubadora Nova Ética, Modelo 430;

 DSC- Marca Mettler Toledo, Modelo DSC822;

 TG - Marca Mettler Toledo, Modelo SDTA851;

 Balança de precisão Marca Mettler Toledo, Modelo XS205;

 Espectrômetro Perkin Elmer, Modelo Spectrum One;

 Turbiscan Lab - Versão Expert;

 Beckman Coulter - LS230 Laser Diffration Particle Size Analyzer;

 Microscópio óptico Nikon Eclipse, Modelo E400 POL;

 Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol, Modelo JSM-6360LV;

 Microscópio Eletrônico de Transmissão Philips, Modelo CM120;

 pHmetro DIGIMED, Modelo DM 21;

 Ultrassom Elma, Modelo T460;

 Balança analítica Ohaus, Modelo E12140

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

4.1.2 Reagentes

 Quitosana de baixo peso molecular - Sigma-Aldrich;

 Diisocianato - Sigma-Aldrich;

 Span 80 - Oxiteno;

 Tween 80 - Sigma-Aldrich;

 Benzofenona-3 - Delaware;

 Água ultrapura.

 Acetona - Quimex;

 Ácido acético glacial - Sigma-Aldrich;

 Miglyol cedido gentilmente pela Dhaymers Química Fina;

 Óleo mineral NP-35 ANIDROL;

 Etanol - Quimex;

 Isopropanol - Quimex;

 Metanol grau CLAE-Merck;

4.2. Ensaios preliminares

Nos ensaios preliminares foram estudadas, de forma randômica, as

concentrações das matérias primas e algumas variáveis de processo, variando seus

valores dentro do sistema. Obteve-se assim uma série de informações importantes para

o estudo de obtenção das micro/nanopartículas, tais como: tipo de solvente utilizado, os

limites máximos e mínimos para um planejamento experimental das variáveis

estudadas, temperatura de execução dos ensaios, intensidade de agitação mecânica do

sistema e a solubilidades da BZ-3 em Miglyol.

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

4.3. Planejamento experimental

Os ensaios para obtenção de partículas quitosana/MDI, conforme o

planejamento experimental, foram realizados em um reator mecanicamente agitado

acoplado a um banho termostático com controle de temperatura e a um condensador.

O sistema estudado consistiu de uma fase orgânica e uma fase aquosa, com as

seguintes composições:

1. Fase orgânica: monômero (MDI), solvente (acetona) e tensoativo (Span 80).

2. Fase aquosa: quitosana, tensoativo (Tween 80) e ácido acético.

Os intervalos deste estudo de sensibilidade paramétrica foram escolhidos de

modo a abranger grande parte dos estudos apresentados na literatura. Para determinação

das condições experimentais que encontrassem o menor diâmetro de partículas com

máximo consumo de monômero, um planejamento experimental do tipo 2

resultando

em 8 experimentos mais a tréplica do ponto central em cada caso, totalizando 11

experimentos foi elaborado (Tabela 4.1). As variáveis independentes analisadas foram

às seguintes:

A. concentração de quitosana (0,1 a 0,5% m:m)

B. concentração do diisocianato (0,1 a 0,25% m:m)

C. razão mássica entre fases orgânica e aquosa (1:2 e 1:5).

Parâmetros fixados : tipo de solvente (acetona) e tempo de reação (4h).

Tabela 4.1. Planejamento experimental para obtenção de partículas quitosana/MDI.

A= MDI; B = quitosana; C = razão de fases orgânica: aquosa

Ensaio A B C

1 -1 -1 -1

2 -1 -1 1

3 -1 1 -1

4 -1 1 1

5 1 -1 -1

6 1 -1 1

7 1 1 -1

8 1 1 1

9 0 0 0

10 0 0 0

11 0 0 0

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

A análise do planejamento experimental foi realizada através do software

STATISTICA. Visando obter uma comparação direta do efeito de cada variável, as

variáveis independentes foram normalizadas no intervalo de -1 a +1. O nível -1

representa o limite inferior e o nível +1 representa o limite superior de cada variável.

Do planejamento experimental, determinou-se as condições de formulação para

a etapa seguinte do trabalho que consistiu na incorporação da substância ativa a

encapsular, a benzofenona (BZ-3) e um outro componente destinado a formar um

núcleo oleoso para retenção da BZ-3 no interior das partículas.

4.4. Metodologia para obtenção das partículas de quitosana/MDI

As suspensões de partículas contendo BZ-3 e Miglyol foram preparadas segundo

método de polimerização interfacial combinado com emulsificação espontânea descrito

anteriormente na literatura (Montasser et al., 2001). A Figura 4.1 apresenta o

fluxograma das etapas de obtenção das partículas.

1. A solução orgânica (S

) é composta pelo MDI, a Benzofenona-3, o tensoativo

(Span 80), e o solvente miscível em água (acetona) e Miglyol. Primeiramente o

MDI é solubilizado sob agitação mecânica na acetona; a seguir, adiciona-se BZ-

3, Span 80 e Miglyol no sistema.

2. A fase aquosa (S

) é formada por água ultrapura, quitosana de baixo peso

molecular e tensoativo Tween 80. A quitosana é solubilizada por 24h em água

ultrapura sob agitação mecânica com pH ajustado para 4,0 com ácido acético

glacial. Após as 24 h a solução aquosa de quitosana é filtrada em uma peneira

de 400 mesh.

3. Injeção da fase orgânica (S

) na fase aquosa (S

) sob agitação mecânica de 2400

rpm, a partícula precipita instantaneamente, e a membrana principal é formada

imediatamente. Nessa etapa ocorre a difusão do solvente da fase orgânica para

fase aquosa.

4. A agitação mecânica é mantida durante 4 h à temperatura de 50ºC, a fim de

assegurar o crescimento da parede polimérica (etapa de maturação).

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

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5. A totalidade do solvente (acetona), bem como uma parte da água é removida

por evaporação durante 10 min sob ação de vácuo.

Figura 4.1. Fluxograma das etapas de obtenção das partículas.

Capítulo 4.

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4.5. Caracterização das suspensões de partículas de quitosana/MDI

Cada suspensão de partículas de quitosana/MDI foi caracterizada quanto a sua

granulometria, índice de polidispersão, morfologia, carga superficial, teor de ativo

encapsulado, estabilidade física das suspensões e caracterizações térmicas.

4.5.1. Granulometria e índice de polidispersão

A granulometria das partículas é medida em uma suspensão aquosa estática por

espalhamento de luz laser em uma LS 230 COULTER ® granulometer. O LS 230 mede

a granulometria das partículas usando o princípio da difração laser. Uma amostra é

colocada no fluido do módulo onde é distribuída através de uma célula a velocidade

constante. Um feixe de luz laser brilha através da célula onde é difratada pelas

partículas no interior da amostra. A luz é dispersa e recolhida por um conjunto de

detectores. As informações sobre as partículas menores que 0,04 µm são limitadas pela

difração padrão do equipamento. Nesse caso, quando o diâmetro da partícula é menor

que 0,04 µm, é usado outro equipamento. Esse equipamento é o Malvern, Modelo

Zetamaster S, que trabalha por espalhamento de luz de ângulo fixo de 90º e obtém

medições de 1 a 1000 nm.

As determinações do diâmetro e do índice polidispersão das micro e

nanopartículas em suspensão foram realizadas através de espalhamento de luz dinâmico.

As amostras foram diluídas 500 vezes (v:v) em água ultrapura à temperatura ambiente e

os resultados determinados através da média de três repetições.

4.5.2. Microscopia e morfologia

A morfologia das nanopartículas foi investigada pela microscopia eletrônica de

transmissão (TEM) Philips ® CM120, 80 kV. Geralmente, as amostras são preparadas

pela colocação de uma gota em um apoio de grades collodion cooper (Malaiya e Vyas,

1988). No caso das micropartículas foi utilizado um Microscópio Eletrônico de

Varredura Jeol, Modelo JSM-6360LV onde uma pequena quantidade de micropartículas

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

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é adicionada a uma fita de cobre fixada em um porta-amostra de latão. Em seguida, as

amostras foram metalizadas com Au pelo processo de Sputtering (evaporação do metal

e deposição de uma fina camada – 10nm - sobre a amostra) utilizando-se um

metalizador BAL-TEC. Foi utilizado também um microscópio óptico Nikon Eclipse,

Modelo E400 POL para observar se nos ensaios ocorria a difusão da BZ-3 da fase

orgânica para a fase aquosa.

4.5.3. Potencial zeta

Os tensoativos estabilizam a interface da emulsão não apenas com a formação de

uma barreira mecânica, mas também através da produção de uma carga elétrica de

superfície, denominada potencial zeta, que tem a habilidade de produzir forças

repulsivas entre as gotículas de óleo evitando a coalescência (Benita & Levy, 1993;

Floyd, 1999).

A carga superficial das partículas foi verificada por um Malvern Zetasizer. As

partículas foram diluídas 500 vezes (v:v) em solução de 1 mmol.L

-1

de NaCl à

temperatura ambiente e os resultados determinados através da média de quinze

repetições (Maia; Santana; Ré, 2004).

4.5.4. Eficiência de encapsulação da BZ-3 por CLAE

A quantificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou HPLC

tem sido adotada para diversas análises por ser uma metodologia bastante versátil e

prática, pois pode ser totalmente automatizada. Ela tem a capacidade de realizar

separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes

em diversos tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta

resolução, eficiência e sensibilidade (Guimarães & Collins, 1997).

Além disso, existem ensaios descritos por CLAE com a separação e

determinação de filtros solares (Vanquerp; Rodriguez; Coiffard, 1999; Ikeda; Suzuki;

Watanabe, 1989; Gagliardi; Cavazzutti; Montanarella, 1989; Rastogi & Jensen, 1998;

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Salvador et. al., 2003; Chisvert & Salvador, 2002; Dinunzio & Gadde, 1990; Scalia,

2000; Smyrniotakis & Archontaki, 2003).

Para separar as partículas do meio aquoso para uma futura análise de eficiência

foi utilizado o método de centrifugação proposto por Cheng; Liang; Li, (2005), pois

para a centrifugação de nanopartículas é necessário a utilização de uma ultracentrífuga.

Pelo método proposto por Cheng; Liang; Li, (2005) não se faz necessário essa

utilização. O método consiste em: um grama da suspensão é dispersa em 25 ml de uma

solução aquosa de sacarose a 20% (ρ = 1.0584 g/mL) em tubos de centrífuga e, em

seguida, segue para centrifugação por 1h a 13400 rpm em temperatura ambiente. O

equipamento utilizado foi uma centrífuga Selecta e o modelo é Medifriger-BL. O uso de

uma solução concentrada de sacarose, como em muitos casos de separações biológicas,

contribui para manter a separação entre diferentes tipos de nanopartículas por causa da

diferença de densidade entre elas ao término da centrifugação (Cheng; Liang; Li, 2005).

As amostras foram centrifugadas pelo método proposto por Cheng; Liang; Li,

(2005), re-suspensas e outras vez centrifugadas. Em seguida foram colocadas para secar

em um dessecador protegido da luz por 24 h, para que não ocorresse a degradação da

BZ-3. Após a secagem, as amostras foram pesadas de acordo com a curva de calibração

do CLAE em um

erlenmeyer de 50 ml e diluídas em 25 ml de isopropanol. As amostras

foram submetidas ao ultrassom por 30 min para que ocorresse a ruptura da parede

polimérica e a BZ-3 difundi-se para o isopropanol. Em seguida foram transferidas para

balões volumétricos de 50 ml e completados com isopropanol.

O doseamento da BZ-3 foi feitos em triplicata e realizado através de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por

Sarveiya; Risk; Benson, (2004), modificada. Em seguida, as amostras foram filtradas

através de membrana (0,45 µm, Millipore), e analisadas através de CLAE em

cromatógrafo Shimadzu, Modelo CBM-20A, utilizando-se detector ultravioleta visível

289 nm, coluna C-18. A fase móvel isocrática de metanol:água em uma proporção

95:5(v/v), com pH aparente igual a 4,0, fluxo de 1,0 mL por minuto, e como agente de

pareamento iônico, perclorato de tetrabutilamônio (4mg/%). O cálculo de rendimento

de encapsulação da BZ-3 está descrito na Equação 3.

Capítulo 4.

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Sendo:

R: Rendimento de encapsulação (%);

Mbz3: Massa da BZ-3 na amostra;

Mbz3clae: Massa de BZ-3 obtida no CLAE.

4.5.5. Turbidimetria

Turbidimetria é um grau de medida da turvação de suspensão em um meio. Ela é

determinada graças a um sistema ótico que mede a diminuição, a absorbância e a

diminuição da intensidade de um raio luminoso que atravessa a suspensão.

Na determinação da transmitância das suspensões de nano e micropartículas será

utilizado um equipamento de medidas de turbidez da marca Turbiscan LAb® que avalia

a transmissão e o backscattering, utilizando uma fonte de infravermelho próximo (850

nm) e detectores que medem a quantidade de luz que é refletida (a 45º do feixe

incidente) ou transmitida (a 180º do feixe incidente) através da amostra em análise.

O princípio da análise é fundamentado na alteração da fração volumétrica da

gotícula/partícula, resultando na variação da transmissão e do backscattering (Figura 4.

2). Através desta análise é possível identificar fenômenos de migração de

gotícula/partícula como cremagem (resulta da diferença de densidade entre as duas

fases) e sedimentação, e fenômenos de alteração de diâmetro como floculação e

coalescência. O maior benefício na utilização do Turbiscan é a detecção dos fenômenos

de instabilidade em emulsões, suspensões ou espumas não diluídas, muito antes que

estes fenômenos sejam detectados por observação visual do analista, especialmente no

caso de sistemas opacos e concentrados (Mengual et. al., 1999; Lemarchand et al.,

2003).

R = Mbz3clae x 100

Mbz3

(3)

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

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Altura da cubeta (mm)

Interface claro/opaco

Backscatering

Transmissão

Porcentagem de transmissão

ou espalhamento de luz

Backscatering

Transmissão

Altura da cubeta (mm)

Interface claro/opaco

Backscatering

Transmissão

Porcentagem de transmissão

ou espalhamento de luz

Backscatering

Transmissão

Figura 4.2. Representação esquemática do princípio de funcionamento do Turbiscan (Adaptado de

DAOUD-MAHAMMED et al., 2007).

As formulações contendo BZ-3 e miglyol foram analisadas pela metodologia

proposta por Paese, 2008. Esta metodologia consiste em fazer as análises logo após a

preparação por 24 horas à temperatura de 40ºC, com varreduras a cada 10 min,

possibilitando a identificação e o estudo dos fenômenos de instabilidade das mesmas.

4.5.6. Estudo da liberação controlada

4.5.6.1. Estudo da liberação controlada livre de membranas

Este método permite a investigação de liberação de um ativo encapsulado

independente de membranas. O princípio do método reside na difusão do ingrediente

ativo da formulação para um receptor lipofílico:

- 3 mL da dispersão contendo as cápsulas foram colocados em um tubo de vidro.

4 mL de uma solução aquosa de Tween 80 a 3% (pH 5,46) foram adicionados. 10 mL

de triglicérides de cadeia média (Miglyol) foram cuidadosamente colocados vertidos

sobre a solução aquosa. Miglyol foi escolhido como receptor por solubilizar a

benzofenona-3 e não alterar a estrutura física das partículas de quitosana/MDI. As

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

amostras foram armazenadas em uma incubadora Ética, Modelo 430 sob condições

controladas de temperatura e intensidade de agitação (32°C; 70 rpm). Amostras de 300

µl foram retiradas da fase oleosa após 1, 2, 4, 8 e 24 h, e diluídas com 2,7ml de etanol

96% (v/v). A absorbância foi medida em 286 nm usando um espectrofotômetro Cintra,

Modelo Cintra 10E. Uma solução de Miglyol: etanol 96% (1:9) (v/v) foi usada como

referência (Neubert & Wohlrab, 1990).

4.5.6.2. Estudo da liberação controlada com membranas de diálise

Etanol foi usado como meio receptor neste estudo. As amostras foram

centrifugadas pelo método descrito no item 4.5.4.. Em seguida, o sedimento foi

armazenado em um dessecador protegido da luz por 24 h, para que não ocorresse a

degradação da BZ-3. As amostras secas foram pesadas e acondicionadas em membranas

de diálise. Para cada amostra foram feitas três triplicatas. Para este estudo foram

utilizados 200 mL do meio receptor, erlenmeyers de 250 mL e uma Incubadora Nova

Ética, Modelo 430. As membranas foram submersas no meio receptor e a incubadora foi

mantida a 37°C e agitação de 70 rpm. Foram retiradas alíquotas de 3 mL do etanol em

um período de 3, 5, 10, 15, 20 e 30 min e também no período de 1, 2, 4, 8 e 24h.

As concentrações de BZ-3 nas amostras foram determinadas através de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por

Sarveiya e colaboradores (2004), modificada. A fase móvel isocrática de metanol água

em uma proporção 95:5(v/v), com pH aparente igual a 4,0, fluxo de 1,0 mL por minuto,

e como agente de pareamento iônico, perclorato de tetrabutilamônio (4mg/L).

O etanol foi escolhido como meio receptor por solubilizar a BZ-3 (a solubilidade

da BZ-3 no etanol apresenta-se superior a 58 mg/mL à 37º C, valor verificado

experimentalmente neste trabalho) e por estabelecer uma metodologia in vitro de análise

comparativa de diferentes formulações.

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

4.5.7. pH

A determinação de pH foi realizada em pHmetro DIGIMED modelo DM 21,

em potenciômetro calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente nas

suspensões coloidais, após a preparação e durante um período de 9 meses, verificando

se as amostras variavam ou fixavam o pH. Os resultados representam a média de três

determinações.

4.5.8. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

Amostras de partículas foram analisadas por transformada de Fourier usando

espectroscopia de infravermelho, para verificar a formação da parede polimérica das

cápsulas. A suspensão de partículas foi posta diretamente em cima das pastilhas de

NaCl e logo em seguidas foram postas no dessecador para secar. Os espectros de

absorção das amostras foram obtidos em um espectrômetro Perkin Elmer, modelo

Spectrum One, na faixa de 500 a 4000cm-1.

4.5.9. Análises térmicas.

4.5.9.1. Análise termogravimétrica (TG) e Análise térmica diferencial

(DTA).

A TG fornece dados com relação às variações de massa em função do tempo

e/ou temperatura sob determinadas condições atmosféricas. Os experimentos são

executados por meio de uma termobalança de elevada sensibilidade, reprodutibilidade e

resposta rápida às variações de massa. As curvas obtidas fornecem informações

relativas à composição e estabilidade térmica da amostra, dos produtos intermediários e

do resíduo formado. Utilizando apenas a TG é possível estudar a decomposição térmica

de compostos orgânicos, inorgânicos e de substâncias poliméricas, determinar a

velocidade de evaporação e sublimação, desidratação e higroscopicidade (propriedade

que os materiais porosos têm para, quando colocados no estado seco num determinado

ambiente a uma determinada umidade relativa, reterem nos seus poros uma certa

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

quantidade de umidade existente no ambiente) (Wendlandt, 1986; Haines, 1995; Matos

& Machado, 2004). Em resumo a TG indica eventos térmicos relacionados a variações

de massa.

A DTA é a técnica pela qual a diferença de temperatura (∆T) entre a substância

e o material de referência (termicamente estável) é medida em função da temperatura,

enquanto ambos são submetidos a uma programação controlada de temperatura. A

temperatura é medida por termopares conectados aos suportes metálicos das cápsulas de

amostra e do material de referência, ambos contidos no mesmo forno. As variações de

temperatura na amostra são devidas às transições entálpicas ou reações endotérmicas ou

exotérmicas. As curvas DTA representam os registros de ∆T em função da temperatura

(T) ou do tempo (t), de modo que os eventos são apresentados na forma de picos. Os

picos ascendentes caracterizam os eventos exotérmicos e os descendentes os

endotérmicos (Wendlandt, 1986; Machado & Matos, 2004).

As curvas de TG e DTA da quitosana foram obtidas por um TG/SDTA - Marca

Mettler Toledo, Modelo SDTA851 e as amostras foram pesadas em uma balança de

precisão Marca Mettler Toledo, Modelo XS205. A partir dos dados obtidos foram feitos

estudos mais detalhados de DSC das partículas. Foi usado um porta-amostra padrão de

alumínio selado. As análises foram feitas em atmosfera de nitrogênio, a um fluxo de 80

mL.min

-1

, na faixa de temperatura de 0 a 100ºC na taxa de aquecimento de 10ºC/min.

4.5.9.2. Análise de calorimetria diferencial de varredura - DSC

A DSC é a técnica de análise térmica, na qual se mede a alteração de energia

fornecida à substância e a um material de referência (termicamente estável), em função

da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos a uma

programação controlada de temperatura. Existem duas configurações possíveis para

aparelhos de DSC: DSC com compensação de potência e DSC com fluxo de calor. Na

primeira configuração a amostra e o material de referência são aquecidos em

compartimentos separados em condições isotérmicas e submetidos à igual variação de

potência de entrada no forno. Neste caso, os eventos são apresentados na curva DSC

como picos, os ascendentes correspondem a processos endotérmicos e os descendentes a

Capítulo 4.

Metodologia experimental Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

exotérmicos. No caso da DSC com fluxo de calor, a amostra e o material de referência

são colocados em cápsulas idênticas, localizadas sobre o disco termoelétrico e aquecidas

por uma única fonte de calor. As curvas DSC obtidas nesse sistema mostram picos

ascendentes que caracterizam eventos exotérmicos, enquanto os descendentes eventos

endotérmicos (Wendlandt, 1986; Machado & Matos, 2004). Em resumo a DSC detecta

eventos associados ou não à perda de massa.

Os termogramas de DSC das amostras foram obtidos por um Calorímetro

Diferencial de Varredura DSC- DSC822 (Mettler Toledo) usando um porta-amostra

padrão de alumínio selado onde as amostras foram pesadas em uma balança de precisão

Marca Mettler Toledo, Modelo XS205. As análises foram feitas em atmosfera de

nitrogênio, a um fluxo de 80 mL.min

-1

, na faixa de temperatura de 0 a 100ºC na taxa de

aquecimento de 10ºC/min.

CAPÍTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Capítulo 5.

Resultados e discussões Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Resultados e discussões

5.1. Ensaios preliminares

5.1.1. Introdução do miglyol no sistema

No início deste estudo foram realizados diversos ensaios onde foram obtidas

informações importantes sobre sistema, como por exemplo, a inclusão do miglyol na

fase orgânica (Bouchemal et al., 2006). Sem a sua presença na fase orgânica a difusão

do solvente para fase aquosa era extremamente rápida seqüestrando assim a BZ-3 para o

meio aquoso. A Figura 5.1 ilustra essa situação. A solução proposta foi então de usar o

Miglyol como reservatório para a BZ-3, minimizando assim a difusão desta para a fase

aquosa.

Figura 5.1. Cristais de BZ-3 na fase aquosa (Microscopia óptica; 200X).

5.1.2. Concentração do miglyol no sistema

Para verificar o efeito da concentração de miglyol no sistema estudado,

primeiramente avaliou-se experimentalmente a solubilidade da BZ-3 neste meio

(miglyol), que é de 210 mg/mL. Investigou-se o efeito da quantidade de miglyol no

sistema. Foram preparadas suspensões de partículas fixando-se o valor da BZ-3 em

500mg e variando-se o volume do miglyol em 0,575, 1,15, 1,725, 2,3 e 2,875 mL. As

seguintes concentrações de BZ-3 no miglyol foram obtidas respectivamente: 869,56

mg/mL; 434,78 mg/mL; 289,85 mg/mL; 217,39 mg/mL; 173,91mg/mL. Nas três

primeiras concentrações que ficaram muito acima da solubilidade estabelecida de 210

Capítulo 5.

Resultados e discussões Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

mg/mL ocorreu a difusão da BZ-3 para o meu aquoso. Com as contrações de 217,39 e

173,91mg/mL não houve difusão da BZ-3 para a fase aquosa (Figura 5.2.), porém

notou-se a formação de aglomerados quando a concentração de 173,91 mg/mL foi

empregada. Devido a isto, fixou-se a concentração de 217,39 mg de BZ-3 por mL de

miglyol.

(a) (b)

Figura 5.2. Suspensões preparadas com diferentes concentrações de miglyol, microscopia óptica

200X: (a) 2000mg; (b) 2500 mg.

5.1.3. Escolha do solvente

Na técnica de policondensação interfacial combinada com emulsificação

espontânea quanto maior a polaridade do solvente, mais rápida será a difusão para a fase

aquosa, conseqüentemente menor será o diâmetro da partícula formada a partir da fase

dispersa da emulsão (Bouchemal et al., 2004 a). A Figura 5.3 apresenta uma análise

granulométrica de três suspensões de partículas, obtidas empregando-se diferentes

solventes orgânicos: acetona, acetato de etila e clorofórmio. Nota-se por estes resultados

que a acetona, solvente de maior miscibilidade com água, favorece a formação dos

menores diâmetros de partículas, razão de seleção deste solvente para a continuidade do

trabalho.

Capítulo 5.

Resultados e discussões Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

Figura 5.3. Diâmetros de partículas com diferentes tipos de solventes.

5.2. Planejamento experimental

Um planejamento fatorial 2

resultando em 8 experimentos mais a tréplica do

ponto central, totalizando 11 experimentos, foi elaborado visando extrair o máximo de

informações do processo de obtenção das partículas de quitosana/MDI, já que o caso em

estudo se trata de um processo de obtenção de um menor diâmetro de partícula. Tal

planejamento foi capaz de avaliar a influência das variáveis na obtenção das partículas

bem como de propor um modelo matemático que representasse o seu diâmetro. As

variáveis independentes neste estudo foram: (A) concentração do diisocianato da

unidade; (B) concentração de quitosana; e (C) razão mássica fase orgânica: fase aquosa

(Tabela 5.1). O diâmetro de partícula foi definido como variável-resposta. Os resultados

do planejamento experimental se encontram na Tabela 5.2. Estes dados foram

submetidos a uma regressão linear utilizando o Statistica 7.0, onde foi possível calcular

os efeitos de cada variável (Tabela 5.3).

Tabela 5.1. Variáveis do planejamento experimental.

Variável -1 0 1

A Concentração de MDI (m:m) 0,1 0,175 0,25

B Concentração de Quitosana (m:m) 0,1 0,300 0,5

Razão mássica fase orgânica: fase

aquosa

1:5 7:20 1:2

Capítulo 5.

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Tabela 5.2. Planejamento experimental.

Ensaio A B C A B C Dp

1 -1 -1 -1 0,1 0,1 1:5 1,289

2 -1 -1 1 0,1 0,1 1:2 1,459

3 -1 1 -1 0,1 0,5 1:5 0,371

4 -1 1 1 0,1 0,5 1:2 1,601

5 1 -1 -1 0,25 0,1 1:5 5,113

6 1 -1 1 0,25 0,1 1:2 7,034

7 1 1 -1 0,25 0,5 1:5 8,761

8 1 1 1 0,25 0,5 1:2 6,129

9 0 0 0 0,175 0,3 7:20 2,739

10 0 0 0 0,175 0,3 7:20 2,692

11 0 0 0 0,175 0,3 7:20 2,591

Tabela 5.3. Efeitos calculados no Statística 7.0 para Planejamento Fatorial 2

As variáveis estudadas individualmente bem como suas interações se mostraram

estatisticamente significativas com exceção da variável C. A variável MDI foi a

estatisticamente mais significativa para um nível de 95% de confiança. Isto pode ser

constatado através do diagrama de Pareto (Figura 5.4), que ilustra os efeitos das

variáveis estudadas individualmente bem como suas interações, de duas a duas, com

relação ao diâmetro das partículas. O efeito da variável será tão significativo quanto

mais à direita da linha vermelha ele estiver, no nível de significância de 95 % de

confiança.

Capítulo 5.

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GRÁFICO DE PARETO

2**(3-0) design; MS Pure Error=,005719

DV: Dp

3,221174

9,196008

-9,86923

-16,3303

16,45183

104,3352

p=,05

Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

SOLVENTE

QUITOSANA

MDI by SOLVENTE

QUITOSANA by SOLVENTE

MDI by QUITOSANA

MDI

Figura 5.4. Gráfico de Pareto.

Com a regressão dos dados utilizando-se o Statistica 7.0, obteve-se um modelo

matemático (Equação 3) para a obtenção do diâmetro da partícula considerando o

intervalo de probabilidade de 95% de confiança. Tal modelo foi gerado a partir dos

dados apresentados na Tabela 5.3.

O coeficiente de correlação R

ajustado para o modelo apresentado pela Equação

3 foi de 0,897, o que demonstra uma regressão satisfatória, o que é ilustrada pela Figura

5.5, onde se visualiza uma boa correlação entre os valores preditos pelo modelo e os

valores observados, pois se observa uma disposição relativamente ordenada dos pontos

em torno da reta representativa.

D = 3,6163 + 2,7896 MDI + 0,2459 Q + 0,4399 MDI.Q – 0,2639 MDI.S – 0,4366 Q.S (3)

Capítulo 5.

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Figura 5.5. Relação entre os valores preditos pelo tratamento matemático e os valores

observados.

As Figuras 5.6 e 5.7 apresentam os gráficos dos resíduos, onde também fica

evidente a validade do modelo e a significância da regressão. Observa-se uma boa

distribuição dos pontos em torno do ponto zero, onde também é possível perceber que o

modelo deixou poucos resíduos, pois de acordo com Barros Neto; Scarminio; Bruns,

(2001), tão mais significativo será o modelo quanto menor o resíduo a ele associado.

Capítulo 5.

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Figura 5.6. Valor residual versus valores observados.

Figura 5.7. Valor residual versus valores preditos.

Capítulo 5.

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Na Figura 5.8 são mostradas as superfícies de respostas em função das variáveis

do processo: Concentração de MDI, de quitosana e de solvente em relação à fase

aquosa. Observa-se que a superfície de resposta na Figura 5.8 (a) que representa a

interação entre MDI e Solvente apresenta uma inclinação bastante pronunciada em

direção ao seu ponto máximo – maior diâmetro - quando há um aumento da

concentração de MDI, isso ocorre também no Figura 5.8 (b) da superfície de resposta

(interação MDI e Quitosana). Porém, analisando-se a Figura 5.8 (c) nota-se uma

variação pequena na superfície de resposta (interação Quitosana e Solvente).

Capítulo 5.

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Figura 5.8. Superfície de resposta: (a) MDI vs. Solvente; (b)

MDI vs. Quitosana; (c)

Quitosana vs.

Solvente.

(a)

(b)

(c)

Capítulo 5.

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A significância estatística foi determinada através da análise de variância para o

modelo e é apresentada na Tabela 5.4. O valor da razão entre o F calculado e o F

5,5

(tabelado) foi maior que 1, significando que a regressão obtida é estatisticamente

significativa sob o ponto de vista do teste F, porém não serve para fins preditivos de

acordo Barros Neto; Scarminio; Bruns (2001), pois para tanto, seria necessário que o F

calculado fosse pelo menos 10 vezes superior ao F tabelado, condição esta que não é

satisfeita.

Mesmo sendo o modelo estatisticamente significativo, faz-se necessário o teste F

devido á falta de ajuste para verificar se o modelo está ou não bem ajustado aos dados

experimentais. Neste teste, a razão entre o F

calc

e o F

3.2

(tabelado) deve ser menor que 1.

Isto pode ser verificado na Tabela 5.4, já que o F

calc

é bem maior que o F

3,2

(tabelado).

Isto significa que o modelo está bem ajustado às respostas do planejamento fatorial,

além de ser um modelo significativo sob o ponto de vista estatístico.

Tabela 5.4.Análise de variância

FONTE DE VARIAÇÂO

Soma Quadrática

N g.I.

Média

Quadrática F.cal. (95%) F. tab (95%)

Regressão 66,36978863 5 13,27395773 8,651484487 5.05

Resíduos 7,671491375 5 1,534298275

Falta de Ajuste 7,60072 3 2,533573333 443,0098502 9.55

Erro Puro

0,01144

2 0,005719

Total 74,04128 10

É possível então concluir que as respostas estão bem ajustadas ao modelo linear.

Parte dos resíduos deixados pelo modelo se deve aos erros aleatórios, geralmente

atribuídos à imprecisão dos equipamentos e medidas feitas durante os procedimentos

laboratoriais. Tais resíduos podem, no entanto, também serem atribuídos à falta de

ajuste do modelo, o que não é constatado pelo teste F, ou seja, o modelo não é capaz de

cobrir toda faixa de variação dos fatores estudados devido aos erros aleatórios. Para um

intervalo de 95% de confiança, o modelo se mostra satisfatório estatisticamente, porém

é incapaz de fazer previsões dentro dos intervalos de interesse para cada fator já que se

trata de um modelo empírico. Com base nos dados do planejamento experimental e

verificando as superfícies de respostas, teria que ser escolhido um ensaio que

Capítulo 5.

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apresentasse a menor concentração de MDI; logo, escolheu-se as condições do

experimento 03 para dar continuidade ao estudo.

5.3. Encapsulação da BZ-3

Após a escolha do experimento 03 do planejamento experimental, as suspensões

de partículas contendo concentrações crescentes de BZ-3 foram preparadas segundo o

método de polimerização interfacial combinado com emulsificação espontânea descrito

no procedimento experimental (item 4.4), fixando-se as composições apresentadas nas

Tabelas 5.5 e 5.6.

Tabela 5.5. Composição da suspensão de partículas contendo 6,25 mg/mL de BZ-3.

FASE AQUOSA FASE ORGÂNICA

Água ultrapura.................................80 mL

MDI................................................. 80 mg

Tween 80...................................... 136 mg

Miglyol...........................................2,3 mL

Quitosana ..................................... 400 mg

Span 80............................................ 80 mg

BZ-3...............................................500 mg

Acetona............................................20 mL

Tabela 5.6. Composição da suspensão de partículas contendo 12,5 mg/mL de BZ-3.

FASE AQUOSA FASE ORGÂNICA

Água ultrapura.................................80 mL

MDI................................................. 80 mg

Tween 80...................................... 136 mg

Miglyol...........................................4,6 mL

Quitosana ..................................... 400 mg

Span 80............................................ 80 mg

BZ-3.......................................................1g

Acetona............................................20 mL

Capítulo 5.

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Tabela 5.7. Composição da suspensão de partículas contendo 18,75 mg/mL de BZ-3.

FASE AQUOSA FASE ORGÂNICA

Água ultrapura.................................80 mL

MDI................................................. 80 mg

Tween 80...................................... 136 mg

Miglyol...........................................6,9mL

Quitosana ..................................... 400 mg

Span 80............................................ 80 mg

BZ-3....................................................1,5g

Acetona............................................20 mL

Tabela 5.8. Composição da suspensão de partículas contendo 25 mg/mL de BZ-3.

FASE AQUOSA FASE ORGÂNICA

Água ultrapura.................................80 mL

MDI................................................. 80 mg

Tween 80...................................... 136 mg

Miglyol...........................................9,2 mL

Quitosana ..................................... 400 mg

Span 80............................................ 80 mg

BZ-3...................................................2,0 g

Acetona............................................20 mL

5.4. Análise da estabilidade física das suspensões (turbidimetria

dinâmica).

As análises feitas no Turbiscan LAB® possibilitam a identificação de

fenômenos de instabilidade em suspensões e emulsões. A vantagem desta técnica é a

detecção desses fenômenos antes que os mesmos sejam observados por métodos

convencionais (Mengual et al., 1999).

As Figuras 5.9 e 5.10 apresentam gráficos referentes à variação de

“backscattering” e de transmissão das suspensões de cápsulas contendo BZ-3 nas

concentrações de 6,25 e 12,5mg/mL. O manual do equipamento informa que, podem ser

analisados os gráficos de variação de “backscattering” caso os valores de variação de

transmissão sejam inferiores a 0,2 %. Portanto só foram analisados os gráficos de

“backscattering”, pois os valores de transmissão foram inferiores a 0,2 %. Em cada

Capítulo 5.

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gráfico, a parte da esquerda refere-se à base da cubeta de análise e a direita ao topo da

mesma. Os fenômenos de instabilidade como sedimentação, floculação, coalescência,

são demonstradas na base, no topo ou no centro da cubeta, observando-se a elevação ou

diminuição de “backscattering”. Ambas as formulações não apresentaram variação na

transmissão e no backscattering durante a análise, indicando não haver fenômenos de

instabilidade física nas amostras estudadas.

Figura 5.9. Gráficos de variação de transmissão e backscattering da formulação de 6,25mg/mL.

Figura 5.10. Gráficos de variação de transmissão e backscattering da formulação de 12,5mg/mL.

Capítulo 5.

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Durante o período de armazenamento ocorreu o aparecimento de precipitados

cristalinos (BZ-3) nas suspensões de 18,75 mg/mL e 25 mg/mL. Este aparecimento de

precipitados cristalinos foi atribuído à difusão da BZ-3 para a fase aquosa devido à

grande quantidade de miglyol no sistema, sugerindo assim o uso de concentrações

menores do ativo. Assim, este estudo de estabilidade física de suspensões por

turbidimetria dinâmica só foi realizado com as formulações contendo 6,25 e 12,5

mg/mL de BZ-3.

5.5. Granulometria e índice de polidispersão

O tamanho de partícula é um importante parâmetro a ser avaliado para controlar

o processo de obtenção e, particularmente, assegurar a qualidade da formulação, porque

a estabilidade física de suspensões depende do tamanho de partícula e da distribuição do

tamanho (Müller-Goymann, 2004). Na suspensão com concentração 6,25 mg/mL de

BZ-3 obteve-se um diâmetro médio de partícula de 1,46µm no Beckman Coulter

(Figura 5.11) e 952,5nm no Zetamaster (Figura 5.12), um índice de polidispersão

superior a 1 e uma curva de distribuição de tamanho do tipo bimodal. Na suspensão

estudada de concentração 12,5 mg/mL de BZ-3 obteve-se um diâmetro médio de

partícula de 1,76µm no Beckman Coulter (Figura 5.13) e 1416,8nm no Zetamaster

(Figura 5.14), um índice de polidispersão de superior a 1 e uma curva de distribuição de

tamanho monomodal. Em suma, estes resultados indicam que ambas as suspensões

analisadas são constituídas de partículas micro e nanométricas.

Uma primeira análise frente a dados de literatura para sistemas particulados

desenvolvidos para veiculação de filtros solares químicos como a BZ-3 mostra que o

diâmetro das partículas obtidas no presente trabalho são superiores aos encontrados na

literatura, visto que a literatura cita partículas da ordem de 300 a 600 nm (Alvarez-

Román et al., 2001; Alvarez-Román et al., 2004; Olvera-Martínez et al., 2005; Jiménez

et al., 2004; Verna et al., 2003).

Capítulo 5.

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Figura 5.11. Gráfico de diâmetro de partícula

COULTER ® granulometer para solução de

6,25mg/mL de BZ-3.

Figura 5.12. Gráfico de diâmetro de partícula Zetamaster S para solução de 6,25mg/mL de BZ-3.

Capítulo 5.

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Figura 5.13. Gráfico de diâmetro de partícula

COULTER ® granulometer para solução de

12,5mg/mL de BZ-3.

Figura 5.14. Gráfico de diâmetro de partícula

Zetamaster S para solução de 12,5mg/mL de BZ-3.

Capítulo 5.

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5.6. Microscopia e morfologia das partículas

A microscopia óptica foi utilizada com o objetivo de verificar a existência de

cristais de BZ-3 na suspensão. No entanto, a microscopia eletrônica de transmissão

(MET) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram associadas neste trabalho

para uma visualização e análise mais detalhadas das partículas de quitosana/MDI

obtidas das formulações contendo 6,25 e 12,5mg/ mL de BZ-3. As Figuras 5.15 (MET)

e 5.16 (MEV) mostram que as partículas obtidas apresentam uma forma

predominantemente esférica e ordem de grandeza de tamanho compatível com as

medidas por granulometria laser, revelando a existência de duas populações, uma

micrométrica e outra nanométrica. A Figura 5.17, obtida por microscopia óptica, ilustra

a ruptura da parede polimérica da cápsula em um meio aquoso e o escoamento do

núcleo oleoso com o ativo dissolvido.

Figura 5.15. Microscopia eletrônica de transmissão das partículas de Quitosana/MDI.

Figura 5.16. Microscopia eletrônica de varredura das partículas.

Capítulo 5.

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Figura 5.17. Microscopia óptica de uma cápsula.

5.7. Espectro de Absorção na Região do Infravermelho

Os espectros de absorção na região do infravermelho são provocados pelos

diferentes modos de interação da radiação eletromagnética com a molécula (vibração e

rotação). Pode ser considerado como uma “impressão digital” do composto.

Para o acompanhamento da reação entre quitosana e MDI o seguinte

procedimento foi proposto: análise por espectroscopia na região do infravermelho do

produto obtido procurando-se constatar o consumo de reagente (MDI) e a formação da

parede polimérica das partículas.

Para esta análise, a Figura 5.18 reúne os espectros de diferentes amostras:

1. Quitosana;

2. Mistura física de quitosana/MDI na proporção 1:1;

3. Partículas de quitosana/MDI, razão mássica quitosana:MDI de 1:2 (Branco 07);

4. Partículas de quitosana/MDI, razão mássica quitosana:MDI de 1:5 (Branco 03).

Capítulo 5.

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Figura 5.18. Comparação entre os FT-IR.

Como se pode observar na Figura 5.18, o pico característico do MDI é

apresentado na mistura física quitosana/MDI, servindo como referência para se observar

a presença de MDI residual nas formulações [banda de absorção do isocianato, -N = C =

O (2.275 -2.250 cm

-1

)].

O objetivo foi de acompanhar o consumo de MDI, em partículas produzidas com

diferentes relações mássicas de quitosana e MDI. Com base nessa informação foi

observada a presença de um pico de MDI não reagido no branco 07 e um pequeno pico

residual no branco 03, indicando o consumo progressivo do MDI em função da

formulação.

Para a reação, onde foi inserido o BZ-3 e o miglyol, as principais bandas de

absorção identificadas que indicam a reação entre quitosana e MDI, são:

- Bandas de absorção das aminas primárias e secundárias da quitosana que são

respectivamente, 1650 e 1570 cm

-1

(Choudhari et al., 2007; Huang; Pal; Moon, 1999).

- Banda em torno de 1700 e 1750 cm

-1

, referente ao grupo funcional da uréia

ligada a carbonos (Choudhari et al., 2007; Kurita et al., 1993).

Capítulo 5.

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- Bandas em 3.500 cm

-1

, 1.200 cm

-1

, referentes aos estiramentos OH e C-N-

amina primária que caracterizam os grupos funcionais da quitosana (Fraga et al., 2006).

A Figura 5.19 apresenta o FT-IR das cápsulas de quitosana/MDI com a adição

do miglyol e da BZ-3 no sistema. As bandas de absorção dos principais grupos

funcionais são apresentadas, onde se observa o consumo do MDI na reação, não

apresentando o pico característico do isocianato. Essa informação sugere a ocorrência

da reação entre a quitosana e o MDI, como também, a formação da parede polimérica

da cápsula.

Figura 5.19. FT-IR das cápsulas de quitosana/MDI.

5.8. Análises térmicas

5.8.1. Análise Termogravimétrica (TG) e análise térmica diferencial

(DTA) da quitosana.

Foi elaborado um rápido estudo de TG e DTA da quitosana de baixo peso

molecular utilizada na produção das partículas. O objetivo foi determinar a faixa de

estabilidade térmica da quitosana

para um posterior estudo de DSC.

Como se pode

constatar na Figura 5.20

nas curvas de TG e DTA da quitosana, esta se apresenta estável

até temperaturas de cerca de 120ºC.

Capítulo 5.

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Figura 5.20. Curvas de TG e SDTA da amostra de quitosana de baixo peso molecular.

5.8.2. Análise de calorimetria diferencial de varredura - DSC

A DSC é usada para investigar as propriedades térmicas de materiais orgânicos e

inorgânicos. Ela fornece informações quantitativas sobre estas mudanças térmicas

incluindo as entalpias de transformação como, por exemplo, de fusão. A Figura 5.21

mostra as curvas de DSC das partículas, onde se observou eventos endotérmicos que

não caracterizam as transições térmicas observadas com os materiais puros (quitosana,

BZ-3). Pode-se inferir, a partir destes dados experimentais, que o método de

encapsulação pela técnica de policondensação interfacial combinada com emulsificação

instantânea parece ser eficiente na encapsulação da BZ-3 em partículas de

quitosana/MDI, nas duas diferentes concentrações analisadas deste ativo (6,25 e

12,5mg/ml).

Capítulo 5.

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Figura 5.21. Curvas DSC das partículas contendo 6,25 e 12,5 mg/mL de BZ-3, da quitosana e da

BZ-3 pura.

5.9. Eficiência de encapsulação

A quantificação nas partículas com 6,25 e 12,5 mg/mL de BZ-3 foi realizado

através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia

descrita por Sarveiya e colaboradores (2004), modificada. A curva de calibração e as

cromatografias das referentes formulações são encontradas no Anexo 1. Teores

elevados de BZ-3 foram detectados nas partículas, comprovando a excelente capacidade

de encapsulação destes novos sistemas quitosana/MDI com núcleo de miglyol (> 99%),

como mostra a Tabela 5.9.

Tabela 5.9. Porcentagem de BZ-3 Encapsulada.

FORMULAÇÃO % DE BZ-3 ENCAPSULADA ± DP**

6,25mg/mL 99,4 ± 3

12,5mg/mL 99,5 ± 3

** - média e desvio padrão de uma triplicata de medidas

Capítulo 5.

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5.10. Potencial Zeta

A Figura 5.22 mostra que as partículas têm carga superficial positiva, e os

resultados foram determinados através da média de quinze repetições. Onde se obteve:

+ 47.4 mV para a amostra de 12,5 5 mg/mL de BZ-3 e + 61 mV para a amostra de 6,25

mg/mL de BZ-3.

As cargas positivas das partículas interagem com tecidos negativamente

carregados, tais como pele e cabelo. Essa capacidade bioadesiva das partículas é um

aspecto importante para o seu uso em cosméticos.

Figura 5.22. Potencial zeta das partículas: (a) 12mg/mL; (b) 6,25mg/mL.

5.11. Determinação do pH

O pH das suspensões de partículas de quitosana/MDI contendo BZ-3 foi

determinado em potenciômetro calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente

nas suspensões coloidais. O pH das soluções manteve-se inalterado após a preparação e

durante o período de estudo (nove meses), onde apresenta a ordem de 5,6 - 5,7.

(a)

(b)

Capítulo 5.

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5.12. Liberação controlada

Nano e micropartículas poliméricas têm sido estudadas como sistemas de

liberação controlada de substâncias ativas. A liberação da BZ-3 dos sistemas aqui

desenvolvidos pode ocorrer por difusão pelos poros da matriz, por degradação do

polímero ou por uma combinação dos dois mecanismos. Neste trabalho, estudou-se a

liberação da BZ-3 dos sistemas desenvolvidos por dois diferentes métodos “in vitro”,

um livre de membrana (Neubert & Wohlrab, 1990) e outro com a presença da

membrana de diálise e uso de etanol como meio receptor (Dittgen, 1998; Venkatraman

& Gale, 1998; Dall’Agnol et al., 2006).

5.12.1. Estudo livre de membrana

Como já apresentado anteriormente, o principio do método é a difusão do ativo

do meio em que se encontra (disperso em fase aquosa) para um meio lipofílico de sua

afinidade. O objetivo do emprego deste método foi de desenvolver formas comparativas

do comportamento dos sistemas com relação à capacidade de liberar o ativo, depois de

encapsulá-lo. O estudo difusivo foi realizado durante 24h de contato com o meio

lipofílico (miglyol). Os resultados obtidos, expressos na forma de porcentagem de BZ-3

presente no meio lipofílico em função do tempo de contato entre as 2 fases aquosa e

oleosa, são apresentados na Figura 5.23.

0 5 10 15 20 25

Tempo (h)

%Liberação

6,25mg/mL

12,5mg/mL

Capítulo 5.

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Figura 5.23. Perfis cinéticos de liberação de Bz3 de formulações de partículas quitosana/MDI:

a) 6,25 mg/mL; b) 12,5 mg/mL livre de membrana.

Ambas as curvas apresentam duas fases do processo de liberação, ocorrendo a

velocidades diferentes: uma 1ª fase rápida seguida de uma segunda fase de liberação

lenta até 24h. Teores muito próximos de BZ-3 foram liberados das formulações

preparadas com diferentes teores, o que sugere que a velocidade de liberação independe

do teor encapsulado para a faixa estudada.

5.12.2. Estudo de liberação com membrana de diálise

As amostras foram preparadas de acordo com a metodologia descrita no

Capítulo 4. A Figura 5.24 apresenta a curva de liberação de BZ-3 da formulação

contendo 6,25 e 12,5 mg/ml de BZ-3.

100

120

0 5 10 15 20 25

Tempo (h)

% Liberação

6,25mg/mL

12,5mg/mL

Figura 5.24. Curva de liberação das formulações 6,25 e 12,5 mg/mL em etanol.

A formulação de menor teor de BZ-3 (6,25 mg/mL) apresenta um “burst”

de cerca de 40% de liberação do ativo nas primeiras 2 horas em contato com o meio

receptor. Este comportamento pode ser devido a fatores como a presença de cristais

próximos da superfície, facilmente extraídos das partículas pelo etanol. No entanto,

comparando-se com a curva obtida com a formulação contendo maior teor de BZ-3

Capítulo 5.

Resultados e discussões Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

(12,5 mg/mL), nota-se uma grande diferença de comportamento : - neste segundo caso,

o “burst” é inferior a 10% no mesmo período de tempo, no entanto, a curva é

caracterizada por uma velocidade praticamente constante ao longo das 24 horas.

Nanopartículas já descritas na literatura (Alvarez-Román et al, 2001) apresentam este

segundo comportamento, ou seja, velocidade constante de liberação e pequeno “burst”,

comportamento atribuído a fatores como hidrofobicidade e cristalinidade elevadas do

ativo, que restringem sua difusão para o meio receptor. A inexistência de uma fase burst

pronunciada mostra que a BZ-3 encontra-se totalmente encapsulada e não adsorvida à

superfície externa das cápsulas.

Ao término das 24 h do estudo, ambas as formulações liberaram cerca de 92%

do ativo encapsulado. Algumas considerações sobre estes resultados: as condições de

liberação como agitação e quantidade de partículas/volume de solvente não foram

exaustivamente estudados, porém, foram utilizadas condições que garantissem a não

saturação do meio receptor. Assim sendo, a escolha das condições de liberação bem

como do solvente foi baseada no estudo de solubilidade do material encapsulado no

solvente de liberação. No entanto, o meio receptor não foi destinado a imitar as

condições da pele, sendo adequado para estudos comparativos in vitro de perfis

cinéticos de liberação de partículas obtidas de condições diferentes de processo e /ou

formulação.

CAPÍTULO 6

DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO

Capítulo 6.

Discussão geral e conclusão Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto/2009

Discussão geral e conclusão

A originalidade do trabalho se dá com relação à proposta de um novo sistema de

cápsulas constituído de um núcleo oleoso capaz de reter ativos hidrofóbicos e um

envoltório polimérico formado por um complexo quitosana-MDI.

Um estudo de condições de processo e composição (como teor de reagentes para

a formação da membrana, teor de ativo encapsulado) comprovou a formação destas

cápsulas com tamanho na faixa micro (< 2 microns)-submicrométrica (> 900 nm),

representativo de uma larga polidispersidade. Pode-se verificar que tais partículas

apresentam carga positiva de superfície (> + 40mV) e estabilidade física em suspensão

aquosa onde foram analisadas logo após a preparação por 24 horas à temperatura de

40ºC e são capazes de encapsular um elevado teor de BZ-3 (> 99%).

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, verifica-se que a técnica de

policondensação interfacial combinada com emulsificação espontânea empregada é

eficiente na formação das cápsulas de quitosana/MDI. A formação da cápsula foi

confirmada pelas análises de FTIR, DSC, MET e MEV. Um parâmetro importante

neste estudo foi a concentração do MDI, tendo-se verificado através de um

planejamento experimental que esta é a variável que mais influenciou o diâmetro da

partícula dentro do sistema, nas condições estudadas.

Os resultados obtidos com concentrações de 6,25mg/mL e de 12,5 mg/mL de

BZ-3 indicaram a presença de um sistema monomodal e bimodal, respectivamente, com

elevado índice de polidispersão. A elevada polidispersidade indicada pela técnica de

espalhamento de luz foi confirmada pelas técnicas MEV e MET. As técnicas de MEV e

MET foram fundamentais na caracterização da morfologia das partículas contendo BZ-

3. Foi possível verificar que as partículas apresentam um formato predominantemente

esférico, com uma aparente rugosidade da parede polimérica.

O pH das suspensões de partículas geradas (entre 5 e 6) permaneceu inalterado

ao longo do estudo. Estas partículas possuíam carga superficial

Capítulo 6.

Discussão geral e conclusão Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto/2009

positiva (potencial zeta), indício de que estas podem interagir com tecidos

negativamente carregados (pele). Os resultados de liberação controlada demonstraram

que as formulações são capazes de controlar a liberação da BZ-3 ao longo de 24h.

A avaliação do conjunto dos resultados obtidos demonstra que estas duas

formulações de micro e nanocápsulas poliméricas contendo BZ-3 em seu núcleo oleoso

são sistemas promissores para o uso em filtros solares

SUGESTÕES DE CONTINUIDADE

Sugestões e continuidade Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

O trabalho aqui realizado abre uma nova frente de investigação referente a

sistemas de liberação controlada a base de quitosana. Demonstrou-se a viabilidade de

geração de cápsulas com núcleo oleoso e parede. No entanto, estes sistemas demandam

uma série adicional de testes de avaliação que não foram aqui realizados e que se sugere

para uma continuidade do desenvolvimento destes sistemas:

1. Para as formulações já desenvolvidas:

- estabilidade do ativo (BZ-3 é conhecida por ser fotodegradável. É preciso saber se esta

formulação protege o ativo da degradação pela luz);

- testes de liberação in vitro com outros meios e utilização da célula de difusão de

Franz;

- utilização de ultrassom e do Ultra Turrax para promover uma diminuição da gota (fase

orgânica), antes do início da formação da parede polimérica;

- testes de Fator de Proteção Solar (FPS) “in vitro” e “in vivo” das suspensões das

partículas.

2. Continuidade ao desenvolvimento destas partículas, aprofundando o estudo de

processo e otimização da formulação e da cinética de formação da membrana

polimérica visando posterior controle de suas características.

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ANEXOS

Anexos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

104

Anexo 1.

Curva de calibração para estudo de quantificação da BZ-3 encapsulada.

CLAE 1º triplicata da formulação contendo 6,25 mg/mL de BZ-3.

Anexos Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

105

CLAE 2º triplicata da formulação contendo 6,25 mg/mL de BZ-3.

CLAE 3º triplicata da formulação contendo 6,25 mg/mL de BZ-3.

CLAE 1º triplicata da formulação contendo 12,5 mg/mL de BZ-3.

CLAE 2º triplicata da formulação contendo 12,5 mg/mL de BZ-3.

Capítulo 10. Referências Bibliográficas Projeto de Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

107

CLAE 3º triplicata da formulação contendo 12,5 mg/mL de BZ-3.

Anexo 2

y = 0,0077x - 0,0244

= 0,9986

-0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

0 20 40 60 80 100

Curva de Calibração para o estudo de liberação livre de membrana.

Capítulo 10. Referências Bibliográficas Projeto de Dissertação de Mestrado

Bento Pereira da Costa Neto

108

Tempo(h)

Y X % liberação.

1 0,36698

50,82857

1,626514

2 0,88934

118,6675

3,797361

4 1,45366

191,9558

6,142587

8 1,85736

244,3844

7,820301

24 2,10952

277,1325

8,868239

Tabela de valores da liberação livre de membrana da formulação 6,25mg/mL

Tabela de valores da liberação livre de membrana da formulação 12,5mg/mL

Tempo (h)

Y X % liberação.

1 0,6846

92,07792

2,946493506

2 1,38896

183,5532

5,873703896

4 1,7441

229,6753

7,34961039

8 1,84004

242,1351

7,748322078

24 1,92398

253,0364

8,097163636

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