( PDF ) Avaliação da biodegradação de efluente sintético contendo óleo diesel empregando cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS)

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

Ub a

2005

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE EFLUENTE

CONTENDO ÓLEO DIESEL EMPREGANDO

CULTURA MISTA ENRIQUECIDA COM BACTÉRIAS

REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

erlândi

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE EFLUENTE

CONTENDO ÓLEO DIESEL EMPREGANDO

CULTURA MISTA ENRIQUECIDA COM BACTÉRIAS

REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

Cynara Reis Aguiar

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química da Universidade Federal de

Uberlândia como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre

em Engenharia Química, área de

concentração em Pesquisa e

Desenvolvimento de Processos Químicos.

Uberlândia - MG

2005

ads:

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-

GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE

UBERLÂNDIA COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA, EM 26 / 08 / 2005.

BANCA EXAMINADORA:

_____________________________

Profa. Dra. Vicelma Luiz Cardoso

Orientadora (PPG-EQ/UFU)

_____________________________________

Profa.. Dra. Eliana Flávia Camporese Sérvulo

(EQ/UFRJ)

_____________________________________

Prof. Dr. Ubirajara Coutinho Filho

(PPG-EQ/UFU)

_____________________________________

Profa. Dra. Magali Christe Cammarota

(EQ/UFRJ)

Dedico este trabalho aos meus pais,

Marcelo e Filomena, aos meus

irmãos, Cynthia e Anderson, ao

Venceslau e a todos os amigos e

familiares que me deram apoio e

incentivo nesta etapa tão importante

da minha vida.

AGRADECIMENTOS

 A Deus pela herança da vida, pela oportunidade, pela força e pela paz interior,

sem as quais seria impossível dar seguimento a esta etapa tão importante e tão

gratificante da minha vida;

 À Profª. Vicelma Luiz Cardoso pela orientação, pela total dedicação e confiança

neste trabalho, pelos ensinamentos e pela amizade;

 Á Profª. Eliana Flávia Camporese Sérvulo pela co-orientação, colaboração e

incentivo ao longo deste projeto;

 À CAPES pela oportunidade a mim concedida de fazer parte do programa de

pós-graduação e pelo apoio financeiro, sem o qual este projeto pessoal não

poderia ser realizado;

 À Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro pelo

fornecimento da cultura microbiana empregada neste trabalho e pelas análises

realizadas de forma a complementar meus resultados;

 Ao CETEM por ter cedido o biosurfactante raminolipídeo empregado neste

trabalho;

 À Petrobrás pela realização da análise de enxofre presente no óleo diesel;

 Aos amigos e parceiros do Núcleo de Bioquímica, especialmente ao Cristian

Bolner, à Patrícia Vieira, à Sandra Faria, à Cristiane Lopes pela ajuda sempre

disponível, pelos momentos de descontração e de alegria;

 Aos alunos de iniciação científica, Aline Marques, Rafael Vieira e Talita

Alexandrina pela ajuda nos experimentos e atividades do laboratório que muito

contribuíram para o êxito deste trabalho;

 À amiga Sandra Mara Santana Rocha (Ballu) pela parceria, pelo apoio, pelas

horas mais divertidas, pelo incentivo nas horas mais difíceis. À amiga Taísa

Shimosakai de Lira por ser uma pessoa especial nesta etapa da minha vida, pela

amizade e ajuda sempre que precisei. À vocês agradeço parte do resultado deste

trabalho e de vocês levarei e guardarei a mais sincera amizade;

 Ao Cláudio Duarte pela elaboração do programa utilizado na otimização do

planejamento experimental e pelo esclarecimento das dúvidas;

 Ao Édio Alves pela ajuda e colaboração nos assuntos relacionados à informática;

 Ao Anísio Ferreira Martins Júnior pela confecção do suporte do reator e outros

acessórios;

 Aos técnicos e funcionários da FEQUI pela ajuda indispensável;

 Aos professores João Jorge Damasceno, Luiz Cláudio Oliveira, Ricardo Reis,

Márcia Gonçalves, Moilton Ribeiro, Euclides Honório pelo aprendizado obtido

nas disciplinas por eles ministradas;

 Ao professor Eloízio Júlio Ribeiro pelo incentivo, pelo carinho e atenção. Ao

professor Ubirajara Coutinho Filho pelas correções, críticas e sugestões ao meu

trabalho e pela ajuda sempre disponível. À profa. Miriam Maria de Resende e a

profa. Magali Christe Cammarota pelas sugestões e correções que muito

contribuíram para finalização do trabalho;

 Aos amigos Alessandra Azevedo, Alexandre Bezerra, Ângelo Roncalli, Camila

Bezerra, Carlos Eduardo Aguiar, Cristiane Capistrano, Diana Lopes, Flávio

Azevedo, Luana Alam Mendonça, Temístocles Luz pelos vários momentos de

descontração, pela amizade, pelo companheirismo, sem os quais seria difícil

seguir esta caminhada;

 Ao Venceslau Xavier de Lima Filho pelo incentivo, pelo amor e carinho, pelas

orientações preciosas, pela amizade sincera e pelos bons momentos;

 Aos meus pais Filomena Maria Reis Aguiar e Marcelo Rios Aguiar pelo apoio

incondicional, pelo incentivo, pelo amor, que mesmo distantes sempre se fizeram

presentes durante todo este período. A eles agradeço a minha educação, a minha

alegria, a minha vida. Aos meus irmãos Anderson e Cynthia pela amizade, pelo

amor, pelo apoio e pelo histórico de felicidade;

 Aos meus familiares (família Reis e família Aguiar) pela ajuda, pelo carinho,

pelas recordações familiares. Especialmente agradeço aos meus tios Carlos

Alberto Reis, Graça Reis, Marta Rios pela amizade e pelo carinho especial;

 A todos que colaboraram para o bom desenvolvimento deste trabalho.

“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido.

Não na vitória propriamente dita.”

Mahatma Gandhi

SUMÁRIO

Ìndice de Figuras ................................................................................................................. v

Índice de Tabelas................................................................................................................. viii

Resumo................................................................................................................................ x

Abstract................................................................................................................................ xi

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS.......................................................... 1

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................. 5

2.1 – PETRÓLEO................................................................................................................ 5

2.1.2 – Características e composição química do petróleo ........................................ 6

2.1.3 – Óleo diesel...................................................................................................... 8

2.1.4 – Problemas ambientais relacionados com derivados de petróleo.................... 12

2.2 – TÉCNICAS PARA DESPOLUIÇÃO DE ÁREAS CONTAMINADAS POR

HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO .......................................................................... 14

2.2.1 – Tratamentos físico-químicos ou abióticos ..................................................... 15

2.2.2 – Tratamentos biológicos.................................................................................. 16

2.3 – BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA......................................................................... 20

2.4 – MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE

HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO .......................................................................... 22

2.5 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS) ................................................ 23

2.5.1 – Caracterização................................................................................................ 25

2.5.2 – Crescimento ................................................................................................... 27

2.5.3 – Cultivo............................................................................................................ 28

2.5.4 – Ciclo do enxofre e redução desassimilativa do sulfato.................................. 29

2.6 – BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA DE HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO:

METABOLISMO................................................................................................................ 32

2.7 – BIOSURFACTANTE................................................................................................. 38

CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS................................................................. 42

3.1 – ÓLEO DIESEL........................................................................................................... 42

3.2 – CULTURA MICROBIANA ...................................................................................... 42

3.3 – BIOSURFACTANTE................................................................................................. 42

3.4 – MEIOS DE CULTIVO............................................................................................... 42

3.5 – MANUTENÇÃO DA CULTURA MICROBIANA .................................................. 44

3.6– ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA AO ÓLEO DIESEL................. 44

3.7 – TESTES PRELIMINARES........................................................................................ 45

3.7.1 – Concentração de óleo diesel utilizada no planejamento experimental........... 45

3.7.2 – Teste de sensibilidade da cultura microbiana ao biosurfactante.................... 45

3.7.3 – Concentração de nitrogênio utilizada no planejamento experimental ........... 46

3.7.4 – Padronização do inóculo da cultura microbiana. ........................................... 46

3.8 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL..................................................................... 46

3.8.1 – Avaliação da biodegradação de óleo diesel ................................................... 50

3.8.2 – Análise estatística das respostas..................................................................... 51

3.9 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EFLUENTE SINTÉTICO DO

BIORREATOR.................................................................................................................... 54

3.10 – CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO NO BIORREATOR.................................... 55

3.10.1 – Condições reacionais no biorreator.............................................................. 55

3.10.2 – Composição do meio reacional.................................................................... 56

3.10.3 – Operação do biorreator................................................................................. 56

3.11 – METODOLOGIA ANALÍTICA.............................................................................. 57

3.11.1 – Demanda química de oxigênio – DQO ........................................................ 58

3.11.2 – Demanda bioquímica de oxigênio – DBO ................................................... 58

3.11.3 – Óleos e graxas .............................................................................................. 58

3.11.4 – Sulfeto total.................................................................................................. 58

3.11.5 – Determinação de sulfato............................................................................... 59

3.11.5.1 – Determinação de sulfato em óleo diesel ................................................... 59

3.11.6 – Determinação de fósforo total ...................................................................... 60

3.11.7 – Determinação de nitrogênio total (KJELDAHL) ......................................... 60

3.11.8 – Determinação de hidrocarboneto total de petróleo (TPH)61

3.11.9 –QUANTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA .................................................. 61

3.11.9.1 – Bactérias redutoras de sulfato (BRS).......................................... 61

3.11.9.2 – Bactérias anaeróbias.................................................................... 62

CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................... 63

4.1 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA ................................................. 63

4.2 – TESTE DE SENSIBILIDADE DA CULTURA MICROBIANA AO

BIOSURFACTANTE.......................................................................................................... 64

4.3 – PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO DA CULTURA MICROBIANA ..................... 65

4.4 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL..................................................................... 66

4.4.1 – Avaliação da biodegradação de óleo diesel ................................................... 66

4.4.2 – Análise estatística das respostas..................................................................... 66

4.4.2.1 – Remoção de TPH................................................................................ 67

4.4.2.2 – Quantificação de bactérias redutoras de sulfato ................................. 73

4.4.2.3 – Quantificação de bactérias anaeróbias................................................ 81

4.4.2.4 – Consumo de sulfato ............................................................................ 88

4.4.2.5 – Produção de H

S................................................................................. 94

4.4.2.6 – Resumo dos resultados do planejamento............................................ 101

4.5 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EFLUENTE SINTÉTICO DO

REATOR ............................................................................................................................. 102

4.6 – CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO ....................................................................... 103

4.6.1 – Monitoramento do pH.................................................................................... 104

4.6.2 – Crescimento microbiano ................................................................................ 104

4.6.3 – Remoção de TPH ........................................................................................... 105

4.6.4 – Consumo do sulfato ....................................................................................... 108

4.6.5 - Produção de sulfeto ........................................................................................ 111

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES......................................................... 114

5.1 – CONCLUSÕES.......................................................................................................... 114

5.2 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS POSTERIORES ............................................. 116

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 118

APÊNDICE A .................................................................................................................... 124

APÊNDICE B..................................................................................................................... 125

APÊNDICE C .................................................................................................................... 142

APÊNDICE D .................................................................................................................... 143

APÊNDICE E..................................................................................................................... 144

APÊNDICE F..................................................................................................................... 145

APÊNDICE G.................................................................................................................... 146

APÊNDICE H.................................................................................................................... 147

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 - Acidentes em postos de combustíveis no Estado de São Paulo, atendidos

pela CETESB. Total de 541 acidentes, no período de 1984 a junho de 2004..................... 2

Figura 1.2 – Dados com base na distribuição dos acidentes por produtos identificados

nos atendimentos na Grande São Paulo, no período de 1984 e junho/2004........................ 2

Figura 1.3 – Causas dos vazamentos de combustíveis no Estado de São Paulo, no

período de 1984 a junho/2004. ............................................................................................ 3

Figura 2.1 – Modelos de Reatores Anaeróbios. .................................................................. 21

Figura 2.2 – Interações das bactérias redutoras de sulfato .................................................. 24

Figura 2.3 – Colônia de bactérias redutoras de sulfato da espécie Desulfobacter

postgatei, com um diâmetro celular de 1,5 mm................................................................... 27

Figura 2.4 – Ciclo Biológico do Enxofre. Célula-enxofre indica o enxofre ligado a

bactérias, fungos, animais e plantas. (1) Redução assimilativa do sulfato por bactérias,

fungos e plantas; (2) Morte e decomposição por bactérias e fungos; (3) Excreção do

sulfato por animais; (4) Assimilação do sulfeto por bactérias (e algumas plantas); (5)

Redução desassimilativa do sulfato; (6) Redução desassimilativa do enxofre elementar;

(7) Oxidação quimiotrófica e fototrófica do sulfeto; (8) Oxidação quimiotrófica e

fototrófica do enxofre.......................................................................................................... 30

Figura 2.5 - Possível rota para a redução desassimilativa do sulfato. ................................. 32

Figura 2.6 – Rotas Possíveis da Utilização de Hidrocarbonetos por Microrganismos. As

setas tracejadas indicam a ativação dos hidrocarbonetos.................................................... 33

Figura 2.7 – Rota da oxidação anaeróbia do tolueno a benzoil-CoA.................................. 36

Figura 2.8 – Rota conceitual de degradação de PAH sob redução de sulfato..................... 37

Figura 2.9 - Estrutura dos raminolipídeos RL1 produzido por Pseudomonas aeruginosa. . 40

Figura 3.1 – Esquema do Planejamento Composto Central................................................ 48

Figura 3.2 – Translação da superfície de resposta da origem para o ponto estacionário. ... 53

Figura 3.3 – Biorreator utilizado na cinética de biodegradação de óleo diesel................... 56

Figura 4.1 – Distribuição dos resíduos relativa à remoção de TPH. ................................... 69

Figura 4.2 – Valores preditos em função dos observados relativos à remoção de TPH. .... 70

Figura 4.3 – Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações

de óleo diesel e NH

Cl. ....................................................................................................... 72

Figura 4.4 – Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações

de óleo diesel e biosurfactante............................................................................................. 73

Figura 4.5 – Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações

de NH

Cl e biosurfactante................................................................................................... 73

Figura 4.6 – Distribuição dos resíduos relativa à quantificação de BRS. ........................... 77

Figura 4.7 – Valores preditos em função dos observados relativos à quantificação de

BRS...................................................................................................................................... 77

Figura 4.8 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das

concentrações de óleo diesel e de NH

Cl. ........................................................................... 79

Figura 4.9 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das

concentrações de óleo diesel e biosurfactante..................................................................... 80

Figura 4.10 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das

concentrações de NH

Cl e biosurfactante. .......................................................................... 80

Figura 4.11 – Distribuição de resíduos relativa à quantificação de bactérias anaeróbias. .. 84

Figura 4.12 – Valores preditos em função dos observados relativos à quantificação de

bactérias anaeróbias............................................................................................................. 84

Figura 4.13- Superfície de resposta para o crescimento de bactérias anaeróbias em

função das concentrações de óleo diesel e de NH

Cl.......................................................... 86

Figura 4.14- Superfície de resposta para o crescimento de bactérias anaeróbias em

função das concentrações de óleo diesel e biosurfactante................................................... 87

Figura 4.15 - Superfície de resposta para o crescimento de bactérias anaeróbias em

função das concentrações de NH

Cl e biosurfactante. ........................................................ 87

Figura 4.16 – Distribuição dos resíduos relativa à concentração final de sulfato. .............. 90

Figura 4.17 – Valores preditos em função dos observados relativos à concentração final

de sulfato. ............................................................................................................................ 90

Figura 4.18- Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de óleo diesel e de NH

Cl. ........................................................................... 92

Figura 4.19- Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de óleo diesel e biosurfactante..................................................................... 93

vii

Figura 4.20 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de NH

Cl e biosurfactante. .......................................................................... 93

Figura 4.21 - Distribuição dos resíduos relativa a produção de H

S................................... 96

Figura 4.22 - Valores preditos em função dos observados relativos a produção de H

S. ... 97

Figura 4.23 - Superfície de resposta para produção de H

S em função das concentrações

de óleo diesel e de NH

Cl.................................................................................................... 99

Figura 4.24 – Superfície de resposta para produção de H

S em função das concentrações

de óleo diesel e biosurfactante............................................................................................. 100

Figura 4.25 – Superfície de resposta para produção de H

S em função das concentrações

de NH

Cl e biosurfactante................................................................................................... 100

Figura 4.26 – Monitoramento do pH durante o processo de biodegradação....................... 104

Figura 4.27 – Monitoramento do TPH durante o processo de biodegradação .................... 106

Figura 4.28 – Consumo de TPH em cada período de coleta, durante o processo de

biodegradação...................................................................................................................... 107

Figura 4.29 – Monitoramento do teor de sulfato durante a biodegradação anaeróbia de

óleo diesel............................................................................................................................ 109

Figura 4.30 – Taxa de consumo de sulfato no período........................................................ 111

Figura 4.31 – Monitoramento da produção de sulfeto no processo de biodegradação. ...... 113

viii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2.1 – Análise elementar do óleo cru típico (% em peso)......................................... 6

Tabela 2.2 – Constituintes do óleo cru típico...................................................................... 7

Tabela 2.3 – Composição química de um petróleo típico ................................................... 8

Tabela 2.4 – Frações de um petróleo típico......................................................................... 8

Tabela 2.5 – Especificações para óleo diesel automotivo comercial .................................. 10

Tabela 2.6 - Especificações para óleo diesel marítimo ....................................................... 11

Tabela 2.7 - Custo estimado de remediação para os diferentes tipos de tratamento. .......... 15

Tabela 2.8 – Vantagens e desvantagens dos processos anaeróbios..................................... 19

Tabela 2.9 - Equações estequiométricas da oxidação de tolueno por bactérias anaeróbias. 35

Tabela 3.1 – Composição do meio Postgate E modificado................................................. 43

Tabela 3.2: Variáveis do processo....................................................................................... 49

Tabela 3.3 – Matriz do planejamento.................................................................................. 50

Tabela 4.1 – Ensaio para aclimatação da cultura microbiana a diferentes concentrações

de óleo diesel. ...................................................................................................................... 63

Tabela 4.2 – Ensaio para aclimatação da cultura microbiana ao crescimento na ausência

de lactato de sódio. .............................................................................................................. 64

Tabela 4.3 – Teste de sensibilidade da cultura microbiana ao biosurfactante..................... 65

Tabela 4.4 – Valores obtidos na padronização do inóculo da cultura microbiana.............. 66

Tabela 4.5 – Resultados da remoção de TPH, em diferentes condições experimentais...... 67

Tabela 4.6 – Resultados da regressão múltipla para remoção de TPH................................ 68

Tabela 4.7 – Resultados da quantificação de bactérias redutoras de sulfato por NMP, nas

condições de cada experimento........................................................................................... 74

Tabela 4.8 – Resultados da regressão múltipla para a quantificação de BRS..................... 76

Tabela 4.9 – Resultados da quantificação de bactérias anaeróbias em NMP/mL, com as

condições de cada experimento........................................................................................... 81

Tabela 4.10 - Resultados da regressão múltipla da quantificação de bactérias anaeróbias. 82

Tabela 4.11 – Resultados das concentrações de sulfato ao final do processo nas

condições de cada experimento........................................................................................... 88

Tabela 4.12 – Resultados da regressão múltipla para a concentração final de sulfato........ 89

Tabela 4.13 – Resultados da produção de H

S, nas condições de cada experimento. ........ 94

Tabela 4.14 – Resultados da regressão múltipla para a produção de H

S........................... 95

Tabela 4.15 – Resumo dos pontos de maximização das respostas...................................... 101

Tabela 4.16 – Caracterização físico-química antes e após o tratamento biológico do

efluente sintético do reator e padrões de lançamento.......................................................... 102

Tabela 4.17 – Concentração inicial e final de BRS e bactérias anaeróbias para

biodegradação de óleo diesel em biorreator ........................................................................ 105

Tabela 4.18 – Resultados obtidos da análise de TPH.......................................................... 106

Tabela 4.19 – Variação da concentração de sulfato e a taxa de consumo durante a

biodegradação anaeróbia de óleo diesel .............................................................................. 108

Tabela 4.20 – Produção de sulfeto na fase líquida, na fase gasosa e produção total........... 112

RESUMO

Este trabalho avaliou a biodegradação anaeróbia de hidrocarbonetos presentes em um efluente

sintético contendo óleo diesel. Para tanto, foi empregada uma cultura mista, isolada da água de

produção de Carmópolis - SE, enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS).

Inicialmente a cultura microbiana foi aclimatada em concentrações crescentes de óleo diesel

de 0,25% (v/v) a 5% (v/v), podendo-se observar crescimento em todas as concentrações

testadas. Foi realizado um planejamento composto central (PCC) para estudar a influência das

concentrações de óleo diesel, de nitrogênio (NH

Cl) e de biosurfactante industrial

(raminolipídeo) na biodegradação do óleo diesel em condição de anaerobiose. Foram

avaliadas como respostas a remoção de hidrocarboneto total de petróleo (TPH); o crescimento

de bactérias anaeróbias e bactérias redutoras de sulfato, o consumo de sulfato e a produção de

sulfetos. Com a otimização do processo de biodegradação anaeróbia, empregando a técnica de

superfície de resposta, obteve-se os pontos de maximização das respostas avaliadas no

planejamento. Os resultados da otimização da remoção de TPH mostraram que as

concentrações de 1,15% de óleo diesel; 2,92 g/L de NH

Cl e 0,06% de biosurfactante levam a

uma máxima degradação de hidrocarbonetos (80,56%). Estes dados foram então avaliados

numa cinética de biodegradação em biorreator à temperatura de 25 ± 2

C, sob agitação de 120

rpm, pH em torno de 7,0 e purgas de nitrogênio para estabelecer a condição de anaerobiose.

Nesta etapa a biodegradação de óleo diesel foi observada através da análise da remoção de

TPH, do crescimento microbiano, da concentração de sulfato e da produção de sulfeto. Como

resultado, obteve-se uma remoção de TPH de 82,2% após 38 dias de processo. As bactérias

anaeróbias apresentaram uma concentração da ordem de 10

NMP/mL, enquanto as BRS de

NMP/mL. A caracterização final do efluente mostra que os valores residuais ainda ficaram

acima dos limites máximos permitidos para descarte pela legislação ambiental vigente. Porém,

o resultado de remoção de TPH indica a viabilidade da biodegradação anaeróbia para

tratamento de efluentes contendo óleo diesel.

Palavras-chave

: óleo diesel, biodegradação anaeróbia, bactérias redutoras de sulfato,

tratamento biológico anaeróbio.

ABSTRACT

This work investigates the ability of anaerobic microorganism to biodegradation of

hydrocarbons from a synthetic effluent containing diesel fuel. For this purpose it was used a

mixed bacteria culture isolated from produced water generated in petroleum extraction in

Carmópolis–SE that was enriched with sulfate-reducing bacteria (SRB). This microbial

consortium was acclimated to increasing concentrations of diesel fuel from 0,25% (v/v) to 5%

(v/v). A central composite design (CCD) was done in order to study the influence of diesel

fuel, nitrogen (NH

Cl) and industrial biosurfactant (raminolipid) concentrations on diesel fuel

biodegradation at anaerobic conditions. The total petroleum hydrocarbon (TPH) removal, the

growth of anaerobic and sulfate-reducing bacteria, the sulfate consumption and sulfide

production were evaluated as responses. The response surface methodologies for optimization

of the anaerobic biodegradation showed the maximization points. The TPH removal

optimization results were 1,15% of diesel fuel; 2,92 g/L of NH

Cl and 0,06% of biosurfactant

to best result of hydrocarbon removal (80,56%). These results were evaluated using a

bioreactor at 25 ± 2°C, 120 rpm and with anaerobic condition provided by nitrogen gas. At

this stage the biodegradation was observed through analysis of TPH removal, microbial

growth, sulfate concentration and sulfide production. As result we obtained 82

,2% of TPH

removal after 38 days of process. Anaerobic bacteria showed the concentrations of cells at the

order of 10

NMP/mL, while the BRS exhibit 10

NMP/mL. The final effluent

characterization showed that the residual values were still above the maximum limits specified

by environmental legislation to discharge. However these TPH removal results indicates the

viability of anaerobic biodegradation in effluents containing diesel fuel treatment.

Key words

: diesel fuel, anaerobic biodegradation, sulfate-reducing bacteria, anaerobic

biological treatment.

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1 – INTRODUÇÃO

O mundo moderno tem se deparado com um problema crucial: aliar o progresso

tecnológico e a preservação ambiental, ou seja, promover o desenvolvimento industrial sem

prejuízo à saúde humana e ao meio ambiente.

Vários países têm se preocupado, em grande parte por pressão de organizações

ambientais e institutos de pesquisa, em reduzir a carga poluente gerada por atividades fabris,

dentre outras. Em conseqüência, protocolos foram assinados e leis rigorosas foram criadas,

sobretudo nos países desenvolvidos, impondo multas de grande monta aos causadores de

danos ao meio ambiente.

Nos últimos anos, o transporte de petróleo e seus diversos derivados, devido a

diferentes tipos de falhas, foi a causa de graves acidentes, com derramamento de grandes

quantidades de hidrocarbonetos, que resultaram em danos de graves conseqüências à

população e ao meio ambiente. Porém, a queima de combustíveis em automotores é que

representa a maior fonte de poluição nas cidades brasileiras dada a imensa quantidade de

veículos em circulação.

O óleo diesel é um dos combustíveis mais usados no nosso país, principalmente pela

frota rodoviária que consome quase a totalidade da produção nacional. As principais causas

de poluição por óleo diesel são as emissões de óxidos de enxofre na atmosfera. A

PETROBRÁS tem investido no desenvolvimento de tecnologias para dessulfurização do óleo

diesel e acaba de lançar o diesel 500, que apresenta 75% menos enxofre [BR Distribuidora,

2005].

Atualmente, o Brasil possui 32.697 postos de revenda de combustíveis, muitos dos

quais foram instalados na década de 70 [ANP, 2001; CETESB, 2005]. Por isso supõe-se que a

vida útil de grande parte dos tanques de armazenamento esteja próxima do final, aumentando

os riscos de ocorrência de vazamentos. Segundo a CETESB, no Estado de São Paulo foram

realizados 541 atendimentos emergenciais em postos de revenda de combustíveis e de

prestação de serviços, no período de 1984 a junho de 2004, como apresentado na Figura 1.1.

Dentre as emergências atendidas pela CETESB, em postos de revenda de

combustíveis na Grande São Paulo, no mesmo período, destaca-se que 19% destes foram

decorrentes de vazamento de óleo diesel conforme mostra a Figura 1.2.

Capítulo 1 – Introdução e Objetivos 2

Figura 1.1 - Acidentes em postos de combustíveis no Estado de São Paulo, atendidos pela

CETESB. Total de 541 acidentes, no período de 1984 a junho de 2004.

Fonte: CETESB, 2005.

Figura 1.2 – Dados com base na distribuição dos acidentes por produtos identificados nos

05.

este período, os principais causadores de vazamentos foram os tanques de

armazena

atendimentos na Grande São Paulo, no período de 1984 e junho/2004.

Fonte: CETESB, 20

mento e as tubulações, conforme representados na Figura 1.3. Os passivos

ambientais, como contaminação do solo ou da água subterrânea, resultantes de outras

ocorrências também foram consideráveis.

Capítulo 1 – Introdução e Objetivos 3

Figura 1.3 – Causas dos vazamentos de combustíveis no Estado de São Paulo, no período de

1984 a junho/2004.

Fonte: CETESB, 2005.

Uma das principais preocupações associadas ao vazamento de combustíveis é a

contaminação dos aqüíferos usados como fontes de abastecimento de água para o consumo

humano. Em virtude da solubilidade parcial em água, os combustíveis - que contêm mais de

uma centena de componentes - estarão inicialmente presentes no subsolo como líquido de fase

não aquo

inais de

combustíveis e postos de gasolina, cujo descarte na maioria das vezes ocorre sem o menor

cuidado.

Algumas técnicas já foram desenvolvidas para o tratamento de áreas contaminadas e

de eflue co-químicos e biológicos; os últimos empregam

micror i

biológicos

anaeróbios ente a biodegradação dos compostos orgânicos. No

entanto, nas últimas décadas, a biodegradação anaeróbia tem sido citada como uma técnica

promis a

[BOOPAT

Neste cas

[BOOPATHY, 2003b; GRISHCHENKOV et al., 2000; WIDDEL & RABUS, 2001; HEIDER

et al., 1999; ATLAS, 1981]. As BRS são microrganismos anaeróbios estritos que se

sa (NAPL) [VIEIRA, 2004; SILVA et al., 2002].

Outro problema é a geração de efluentes originados pelas lavagens de term

Note-se que estes efluentes devem ser submetidos a um tratamento, conforme

proposta deste trabalho, para posterior descarte ou reaproveitamento da água.

ntes, através de processos físi

gan smos com capacidade de degradar hidrocarbonetos de petróleo. Os processos

aeróbios por muito tempo foram dominantes uma vez que, em comparação com os

, promovem mais rapidam

sor no tratamento de solos e aqüíferos contaminados com hidrocarbonetos de petróleo

HY, 2004; BHANDARI & KARTHIKEYAN, 2001; WIDDEL & RABUS, 2001].

o, uma possibilidade é o emprego das bactérias redutoras de sulfato (BRS)

Capítulo 1 – Introdução e Objetivos 4

caracte a

compostos

P ente o tratamento de efluentes

contaminados com óleo diesel, proporcionando assim, um campo bastante amplo para avaliar

a ação m

anaeróbio riquecida com

bactérias redutoras de sulfato (BRS).

Os objetivos específicos foram:

 Aclimatar a cultura mista enriquecida com BRS em meio sintético (meio Postgate

E modificado), com concentrações crescentes de óleo diesel, variando de 0,25%

(v/v) a 5% (v/v);

 Otimizar as condições de processo através de um planejamento experimental,

avaliando o efeito das variáveis - concentrações de óleo diesel, de nitrogênio

empregando cloreto de amônio e de biossurfactante - na biodegradação do óleo

diesel;

 Estudar o comportamento dessas variáveis com relação à remoção de

hidrocarbonetos totais de petróleo (TPH), ao crescimento microbiano, à produção

de gás sulfídrico e ao consumo de sulfato;

 Avaliar a cinética de biodegradação anaeróbia do óleo diesel em efluente sintético

em biorreator, utilizando como condições de processo os valores de otimização das

variáveis para a remoção de hidrocarboneto total de petróleo (TPH).

riz m por utilizar o íon sulfato como aceptor final de elétrons para metabolização de

orgânicos [POSTGATE, 1984].

oucos estudos têm abordado especificam

de icrorganismos anaeróbios neste tipo de efluente.

este contexto, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a viabilidade do tratamento

na biodegradação de óleo diesel, empregando uma cultura mista en

CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – PETRÓLEO

O petróleo vem participando da vida do homem desde os tempos bíblicos. Antigas

civilizações já faziam uso de seus benefícios para diversos fins. Graças à sua gama de

derivados, dentre os quais destacam-se os combustíveis, o mundo experimentou um grande

desenvolvimento industrial e até os dias atuais tem no petróleo a maior fonte de energia e de

matéria-prima para as indústrias. Com o advento da petroquímica, centenas de novos produtos

são produzidos, muitos deles diariamente utilizados, como plásticos, borrachas sintéticas,

tintas, corantes, adesivos, solventes, detergentes, explosivos, produtos farmacêuticos,

cosméticos, etc. Com isso, o petróleo, além de produzir combustível, passou a ser

imprescindível às facilidades e comodidades da vida moderna [THOMAS, 2001].

O petróleo movimenta a economia mundial, sendo sua produção cada vez mais

intensa para suprir a demanda desta matéria-prima. A cada minuto são extraídas em torno de

seis mil toneladas de petróleo cru em todo o mundo. Ainda existem reservas de cerca de 136

bilhões de toneladas que, de acordo com estimativas, se o petróleo continuar sendo extraído

nesta proporção, será esgotado em aproximadamente 43 anos [Ambiente Brasil, 2005].

De acordo com o anuário estatístico de 2004 divulgado pela ANP (Agência Nacional

de Petróleo), até o ano de 2003 o Brasil possuía 9.209 poços produtores de petróleo e gás

natural, sendo que destes 8.439 estão no continente e outros 770 estão no mar;

correspondendo a uma reserva total de petróleo de 13 milhões 493 mil barris por dia só no

território brasileiro. O Brasil produziu 546 milhões e 74 mil barris de petróleo durante o ano

de 2003. Em todo o ano de 2004 foram refinados 38.535.016 m

de óleo diesel e 17.577.808

de gasolina [ANP, 2004].

Apesar de ser a matéria-prima mais disputada e que mais movimenta a economia

mundial, o petróleo é um poluidor em potencial do meio ambiente. As atividades de

prospecção, refino e transporte têm sido as principais causas de problemas ambientais.

Centenas de derramamentos de petróleo já geram danos incalculáveis aos oceanos e à

população praieira. Os vazamentos nos sistemas de armazenamento subterrâneo e a

disposição incorreta dos resíduos entre outras causas de poluição, provocam danos ao solo e

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 6

às águas subterrâneas e superficiais. Além disso, o efluente gerado devido à água de lavagem

de terminais de combustíveis e de postos de gasolina, muitas vezes despejado sem o menor

cuidado, deve ser tratado para posterior descarte ou reaproveitamento desta água.

2.1.2 – CARACTERÍSTICAS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO PETRÓLEO

O petróleo é comumente encontrado em rochas sedimentares, onde a matéria

orgânica nelas depositada, oriunda de plantas e animais, é degradada pela ação de

microrganismos, em condições termoquímicas apropriadas, por milhões de anos [VIEIRA,

2003].

No estado líquido o petróleo é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a

água, com cheiro característico e cor variando entre o negro e o castanho-claro. É constituído,

basicamente, por uma mistura complexa de compostos químicos orgânicos, os

hidrocarbonetos [THOMAS, 2001]. Apesar de sua composição química variar em função do

reservatório, os diferentes tipos de petróleo apresentam semelhanças na análise elementar,

como mostrado na Tabela 2.1.

Tabela 2.1 – Análise elementar do óleo cru típico (% em peso).

Hidrogênio 11-14%

Carbono 83-87%

Enxofre 0,06-8%

Nitrogênio 0,11-1,7%

Oxigênio 0,1-2%

Metais Até 0,3%

Fonte: THOMAS, 2001.

Os constituintes do óleo cru, a fração líquida do petróleo, são apresentados na Tabela

2.2.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 7

Tabela 2.2 – Constituintes do óleo cru típico

Constituinte Descrição

Hidrocarbonetos Saturados

ou Parafínicos

Moléculas lineares (C

a C

), ramificadas (C

a C

) e

cíclicas.

Hidrocarbonetos Aromáticos Contendo de um a sete núcleos aromáticos.

Resinas

Polímeros contendo compostos sulfurados,

nitrogenados e oxigenados.

Asfaltenos

Macromoléculas de estrutura altamente complexa

formadas por anéis aromáticos fundidos, núcleos

saturados e cadeias laterais ramificadas.

Hidrocarbonetos Insaturados

ou Olefínicos

Raros no óleo cru e formados no craqueamento das

frações do petróleo.

Fonte: BAPTISTA, 2003.

Outros constituintes do petróleo aparecem sob a forma de compostos orgânicos

contendo, principalmente, nitrogênio (piridinas, quinolinas, pirróis), enxofre (mercaptanas,

gás sulfídrico, sulfetos alifáticos e cíclicos), oxigênio (fenóis, cresóis, ácidos alifáticos, ácidos

aromáticos) e alguns metais [BAPTISTA, 2003]. Estes geralmente estão presentes nas frações

mais pesadas, podendo também aparecer em toda a faixa de ebulição do petróleo [THOMAS,

2001]. A Tabela 2.3 mostra a composição química de um petróleo típico.

A variabilidade da composição do petróleo influencia na evaporação, dissolução e

suscetibilidade ao ataque químico e bioquímico. Além disso, muitos dos hidrocarbonetos

constituintes do óleo cru possuem solubilidade em água limitada e decrescente com o

aumento da massa molecular, o que é desfavorável para a degradação microbiana

[DEL’ARCO, 1999].

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 8

Tabela 2.3 – Composição química de um petróleo típico

Parafinas normais 14%

Parafinas ramificadas 16%

Parafinas cíclicas

(naftênicas)

30%

Aromáticos 30%

Resinas e asfaltenos 10%

Fonte: THOMAS, 2001.

Os derivados de petróleo são obtidos através de destilação do óleo cru em frações de

diferentes pontos de ebulição. A Tabela 2.4 demonstra as frações de um petróleo típico.

Tabela 2.4 – Frações de um petróleo típico

Temperatura Fração

Inferior a 32,2

C Butanos e leves

32,2-104,4

C Gasolina

104,4-157,2

C Nafta

157,2-232,2

C Querosene

232,2-426,7

C Diesel

Superior a 426,7

C Resíduo

Fonte: VIEIRA, 2004.

2.1.3 – ÓLEO DIESEL

O óleo diesel é um combustível derivado do petróleo, constituído por uma mistura

complexa de hidrocarbonetos. É formado principalmente por átomos de carbono, hidrogênio e

em baixas concentrações por enxofre, nitrogênio e oxigênio, selecionados de acordo com as

características de ignição e de escoamento adequadas ao funcionamento dos motores diesel. É

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 9

um produto inflamável, medianamente tóxico, volátil, límpido, isento de material em

suspensão e com odor forte e característico [BR DISTRIBUIDORA – PETROBRÁS, 2005].

O óleo diesel é utilizado em motores de combustão interna e ignição por compressão

(motores do ciclo diesel) empregados nas mais diversas aplicações, tais como: automóveis,

furgões, ônibus, caminhões, pequenas embarcações marítimas, máquinas de grande porte,

locomotivas, navios e aplicações estacionárias (geradores elétricos, por exemplo).

Nos postos de revenda de combustíveis são encontrados os seguintes tipos de óleo

diesel [BR DISTRIBUIDORA – PETROBRÁS, 2005]:

 Óleo diesel comum – é o óleo diesel mais simples, sem adição de nenhum tipo de

aditivo. Possui coloração amarelada ou alaranjada. Pode ser utilizado em qualquer

veículo movido a óleo diesel;

 Extra diesel aditivado – difere do óleo diesel comum pela presença de aditivos

detergentes/dispersantes, antiespumante, anticorrosivo e desemulsificantes. A

adição desses compostos tem a função de manter o motor limpo, evitar a formação

de espuma durante o abastecimento, evitar a formação de ferrugem, ajudar na

separação água/óleo. Possui coloração amarelada ou alaranjada e pode ser

utilizado em qualquer veículo movido a óleo diesel.

As Tabelas 2.5 e 2.6 apresentam as especificações para o óleo diesel automotivo

comercial e para o óleo diesel marítimo.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 10

Tabela 2.5 – Especificações para óleo diesel automotivo comercial.

Limites Métodos

Tipos (1)

Características Unidades Interior (B) Metropolitano (D) ABNT ASTM

APARÊNCIA

Aspecto Límpido e isento de impurezas Visual (2)

Cor ASTM, máx. 3.0 (3) (6) 3.0 NBR 14483 D1500

COMPOSIÇÃO

- D 1552

- D 2622

Enxofre Total, máx. % massa 0.35 0.20

NBR 14533 D 4294

VOLATILIDADE

Destilação

50% vol., recuperado, máx. 245.0 - 310.0

85% vol., recuperado, máx.

ºC

370.0 360.0

NBR 9619 D 86

NBR 7148 D 1298

Massa Específica a 20 ºC Kg/m

820 - 880 820 - 865

NBR 14065 D 4052

NBR 7974 D 56

Ponto de Fulgor, mín. ºC 38.0 (6)

- D 3828

FLUIDEZ

Viscosidade a 40 ºC, máx. mm

/s(cSt) 2.5 - 5.5 NBR 10441 D 445

Ponto entupimento filtro a frio ºC (4) NBR 14747 D 6371

COMBUSTÃO

Número de Cetano, mín. - 42 (6) - D 613

Resíduo de Carbono

Ramsbottom do resíduo dos

10% finais da destilação, máx.

% massa 0.25 NBR 14318 D 524

Cinzas, máx. % massa 0.02 NBR 9842 D 482

CORROSÃO

Corrosividade ao Cobre,

3h a 50 ºC, máx.

- 1 NBR 14359 D 130

CONTAMINANTES

Água e Sedimentos, máx. % volume 0.05 NBR 14647 D 1796

Fonte: Regulamento técnico ANP N

6/2001 da Portaria N

310 de 27 de dezembro de 2001.

(1) O óleo diesel metropolitano (D) deverá ser obrigatoriamente comercializado nos municípios relacionados no

anexo I, conforme determinação do Ministério do Meio Ambiente.

(2) A visualização será realizada em proveta de vidro, conforme Método NBR 7148 ou ASTM D 1298.

(3) Limite requerido antes da adição de corante. O corante, conforme teor e características constantes na Tabela

III, adicionado pelas Refinarias, Centrais de matérias-primas, Petroquímicas, Importadores e Formuladores,

deverá proporcionar ao Óleo Diesel Interior (B) a cor vermelha visualmente aparente.

(4) Limites conforme Tabela II da mesma Portaria.

(5) Alternativamente ao ensaio de Número de Cetano fica permitida a determinação do índice de cetano

calculado pelo Método ASTM D 4737, com valor mínimo de 45. Em caso de desacordo de resultados

prevalecerá o valor do Número de Cetano.

(6) As Refinarias, Centrais de matérias-primas, Petroquímicas, Importadores e Formuladores de óleo diesel

automotivo deverão atender às exigências referentes a adição do corante, Ponto de Fulgor e Número de Cetano a

partir de 01/05/2002.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 11

Tabela 2.6 - Especificações para óleo diesel marítimo.

ÉTODOS

Características Unidade Especificações

(1)

ABNT ASTM /

APARÊNCIA

Límpido e isento

de impurezas

Visual Visual

Aspecto

Cor ASTM, máx.

3,0 MB-351 D-1500

COMPOSIÇÃO

Enxofre, máx. % mín. 1,00 MB-902

D-1552,

D-2622 ou

D-4294

VOLATILIDADE

Destilação °C

NBR-9619 D-86

- 50% recuperados

245,0 - 310,0

- 85% recuperados, máx.

370,0

Ponto de fulgor, mín. °C 60 MB-48

D-93 ou

D-56

Densidade a 20/4°C

0,8200 a 0,8800 NBR-7148

D-1298 ou

D-4052

FLUIDEZ

Viscosidade a 40°C CSt 1,600 - 6,000 NBR10441 D-445

Ponto de entupimento de filtro a frio,

máx.

°C (2) . IP-309

CORROSÃO

Corrosividade ao cobre (3h a 50°C),

máx.

2 MB-287 D-130

COMBUSTÃO

Cinzas, máx. % m/m 0,020 NBR-9842 D-482

Resíduo de Carbono Ramsbottom do

resíduo dos 10% finais da destilação,

máx.

% m/m 0,25 MB-290 D-524

Número de Cetano, mín. . 40 (3) . D-613

CONTAMINANTES

Água e sedimentos % v/v 0,05 . D-1796

Fonte: BR Distribuidora – Petrobrás, 2005.

(1) Todos os limites especificados são valores absolutos de acordo com a Norma ASTM E 29.

(2) Conforme TABELA II.

(3) Fica permitida, alternativamente ao ensaio de número de cetano, a utilização do índice de cetano calculado

pelo método ASTM D 4737, com valor mínimo de 45. Em caso de desacordo de resultados prevalecerá o valor

do número de cetano.

Os tipos de óleo diesel se diferenciam especialmente quanto ao teor de enxofre

[CARDOSO, 2004]. Assim, o óleo diesel D, que apresenta o menor teor de enxofre, é

comercializado nas regiões metropolitanas de São Paulo, Cubatão, Santos, Rio de Janeiro,

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 12

Salvador, Aracaju, Recife e Fortaleza. Em Belo Horizonte, Porto Alegre, Curitiba, Belém,

Campinas e São José dos Campos há disponibilidade do óleo diesel tipo C, que apresenta um

teor de enxofre maior comparativamente ao anteriormente mencionado. O óleo diesel tipo B,

com maior teor de enxofre, está disponível nas demais regiões do Brasil.

O óleo diesel marítimo, conforme a especificação sugere, é exclusivamente

produzido para utilização em motores de embarcações. E existe ainda o do tipo padrão

somente fornecido para os fabricantes de motores e órgãos responsáveis para homologação

dos mesmos, com vistas à utilização em testes para avaliação de consumo e emissão de

poluentes.

Em fevereiro de 2005, a PETROBRAS lançou no mercado o óleo diesel S500, assim

designado por conter 500 ppm de enxofre. Esse tipo de óleo diesel está sendo distribuído nas

regiões metropolitanas do Rio de Janeiro, São Paulo, Campinas, Baixada Santista, São José

dos Campos, Belo Horizonte e Vale do Aço. Estes municípios concentram cerca de 70% da

frota nacional de ônibus e caminhões, representando 21% da demanda de óleo diesel pelo país

[REVISTA PETROBRAS, 2005].

2.1.4 – PROBLEMAS AMBIENTAIS RELACIONADOS COM DERIVADOS DE

PETRÓLEO

Os combustíveis derivados de petróleo têm uma importância fundamental na vida do

homem. Por volta de 1859, Cel. Drake na Pensilvânia descobriu que a destilação do petróleo

resultava em produtos que substituíam o querosene obtido a partir de carvão e o óleo de

baleia, que eram largamente utilizados para iluminação. Posteriormente, com a invenção dos

motores a gasolina e a diesel estes derivados, até então desprezados, adicionaram lucros

expressivos à atividade [THOMAS, 2001].

Atualmente, a gasolina e o óleo diesel ainda lideram o ranking dos combustíveis,

apesar dos problemas que têm causado ao ambiente pela sua combustão. No Brasil, na década

de 80, através do Programa Pró-álcool, houve o incentivo à produção de etanol, para uso

como combustível alternativo aos derivados do petróleo. Nos dias atuais, a busca pela

proteção do meio ambiente continua a incentivar pesquisas no sentido de desenvolver

energias menos poluidoras. Por isso, o Governo e empresários têm investido, cada vez mais,

na produção e consumo do álcool. Ainda há a expectativa do uso comercial do biodiesel, que

é um combustível derivado de plantas oleaginosas e, portanto, biodegradável por ser de

origem vegetal.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 13

Apesar da introdução de novas fontes de energia automotiva, o óleo diesel e a

gasolina ainda serão utilizados por muito tempo, já que a exploração de petróleo continua em

alta. Portanto, faz-se necessária a pesquisa na busca de soluções para remediar os impactos

gerados pelo uso intensivo destes combustíveis.

O refino de petróleo gera, inevitavelmente, volumes consideráveis de lamas oleosas.

As fontes mais comuns dessas lamas são os tanques subterrâneos de armazenamento,

separadores de óleo/água, unidades de flotação e de tratamento desses efluentes, limpeza de

equipamentos, e derramamentos ocasionais de óleo nos pátios das refinarias [BARTHA &

DIBBLE, 1979]. As principais fontes de contaminação do solo e águas subterrâneas por

combustíveis são provenientes de vazamento de tanques de armazenamento do combustível

(TAS) [VIEIRA, 2004]. O número alarmante destes vazamentos e a contaminação de

aqüíferos a partir desses derramamentos tem sido um assunto de grande interesse nas últimas

décadas [SILVA et al. 2002]. A agência de Proteção Ambiental Norte Americana (EPA)

estima que 30% dos TAS nos Estados Unidos estão com problemas de vazamentos. Este

aumento repentino está relacionado ao final da vida útil dos tanques, que é de

aproximadamente 25 anos [SILVA et al., 2002].

Os maiores problemas de contaminação são atribuídos aos hidrocarbonetos

monoaromáticos, que são os constituintes mais solúveis e mais móveis da gasolina e do óleo

diesel. Estes hidrocarbonetos monoaromáticos, tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno e

xilenos (orto-, meta-, para-), são denominados BTEX. Os valores máximos permitidos em

água de abastecimento para os BTEX, de acordo com o estabelecido pela Portaria 1.469/2000

do Ministério da Saúde [MS,2000] são 5 µg/L para o benzeno, 170 µg/L para o tolueno, 200

µg/L para o etilbenzeno e 300 µg/L para o xileno. Esses compostos são poderosos depressores

do sistema nervoso central, apresentando toxicidade crônica. O benzeno é uma substância

comprovadamente carcinogênica, se ingerida mesmo em baixas concentrações durante

períodos não muito longos de tempo [SILVA et al., 2002].

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 14

2.2 – TÉCNICAS PARA DESPOLUIÇÃO DE ÁREAS CONTAMINADAS POR

HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO

Inúmeras pesquisas têm sido realizadas com o intuito de remediar os ambientes

contaminados por petróleo e seus derivados, seja no solo ou em águas subterrâneas. As

diferentes técnicas existentes se dividem em processos físico-químicos, processos térmicos, e

processos biológicos.

Dentre os processos de tratamento pode-se citar: recuperação do produto livre,

biodegradação sob condições desnitrificantes, biodegradação utilizando-se diferentes

aceptores de elétrons, extração de vapor do solo (SVE), remediação pela eletrocinética, adição

de nitrato, bioventilação pela injeção de ar no solo, utilização de lodo para promover

subsídios à biodegradação anaeróbia, adsorção com carvão ativado, incineração, torres de

aeração, entre outras [SILVA et al, 2002].

Os tratamentos podem ser conduzidos no próprio local contaminado (in situ) ou em

um outro local (ex situ) mais seguro e que disponha de recursos tecnológicos, sendo

necessário, neste caso, a prévia remoção do material contaminante [DEL’ARCO, 1999]. As

tecnologias in situ são aplicadas quando a contaminação já atingiu o lençol freático ou quando

se deseja evitar que a pluma venha a contaminar o aqüífero. A principal vantagem do

tratamento in situ é que a área contaminada não precisa ser transportada, o que reduz os

custos. Porém, tem como desvantagens a necessidade de adequação das condições do local

contaminado e o elevado tempo necessário para que ocorra a descontaminação. As

tecnologias ex situ necessitam de um menor prazo e pode-se adequar as condições para

melhoria da técnica. Entretanto, faz-se necessária a escavação do local contaminado

[BAPTISTA, 2003].

No entanto, alguns fatores devem ser previamente avaliados para então fazer a

escolha do melhor método [VIEIRA, 2004; DA CUNHA, 1996]:

 Verificar a legislação que regulamenta o padrão de qualidade das águas

subterrâneas e do ar;

 Avaliar a hidrogeologia do local, avaliando o transporte e destino do contaminante

(permeabilidade do solo);

 A quantidade de contaminante.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 15

A Tabela 2.7 relaciona o custo aproximado de remediação para os diferentes tipos de

tratamento.

Tabela 2.7 - Custo estimado de remediação para os diferentes tipos de tratamento.

Tratamento

CUSTO ESTIMADO DE

REMEDIAÇÃO

(US$/Tonelada)

Remoção para Aterro Acima de 100

Processos Físicos:

Lavagem físico-química

Extração a vapor

50-175

Tratamentos Térmicos:

Dessorção térmica

Incineração

25-225

50-1200

Tratamentos Biológicos:

Landfarming

Bioventing

Bioslurry

Biopilhas

Biorremediação in situ

10-90

15-75

50-85

15-35

175

Fonte: VIEIRA, 2004.

2.2.1 – TRATAMENTOS FÍSICO-QUÍMICOS OU ABIÓTICOS

Poucos processos abióticos convertem compostos orgânicos complexos em

compostos de menor carga poluente. Entretanto, as transformações físico-químicas podem

ocorrer sinergis ticamente com as transformações bioquímicas, aumentando as taxas de

degradação.

Para o tratamento do ambiente contaminado através de processos físico-químicos é

necessário o prévio conhecimento das propriedades dos contaminantes, como: potencial de

precipitação, solubilidade, coeficiente de partição e acidez. Os processos de neutralização,

oxidação, precipitação e adsorção em carvão ativado têm sido muito aplicados para a

melhoria da qualidade de efluentes de indústrias petroquímicas. Porém, essas operações

apresentam desvantagens quanto aos custos elevados e a formação de subprodutos tóxicos

[PRINCE, 1993].

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 16

2.2.2 – TRATAMENTOS BIOLÓGICOS

A aplicação de processos biológicos no tratamento de resíduos representa uma

tecnologia promissora, tanto pelo interesse das agências reguladoras como pela maior

aceitação da sociedade. Além disso, apresentam baixo custo, há possibilidade de aplicação in

situ e aplicabilidade para diversos tipos de contaminantes [WEBER & CORSEUIL, 1994]. No

entanto, o custo varia de acordo com a metodologia aplicada, o local afetado, as quantidades e

características dos contaminantes.

Os tratamentos biológicos são vários, tais como: uso de plantas para absorção do

óleo no sítio contaminado, uso de microrganismos nativos (endógenos), pertencentes ao sítio

contaminado, ou não (exógenos). O uso de biosurfactantes também é indicado, pois permitem

um maior contato célula-óleo [DEL’ARCO, 1999; MORGAN, 1992].

A biorremediação é considerada o principal processo natural de remoção das frações

não voláteis de petróleo do meio ambiente e a mais eficiente opção para tratamento de áreas

poluídas por estes compostos [DEL’ARCO, 1999; KARLSON & FRANKENBERGER,

1989].

Existem alguns critérios que devem ser considerados antes da escolha da

biorremediação como método de tratamento [ALEXANDER, 1999]:

 Devem existir microrganismos portadores da atividade catabólica requerida para

o devido fim;

 Esses microrganismos devem ser capazes de degradar o poluente em um tempo

razoável;

 A rota metabólica envolvida na biodegradação não pode gerar produtos ou

intermediários considerados tóxicos;

 A área em questão deve estar livre de substâncias consideradas inibitórias para a

atuação da microbiota ou, se presentes, estarem em concentrações baixas, que

não afetem o desempenho dos microrganismos;

 Os contaminantes a serem removidos devem estar acessíveis aos

microrganismos;

 O processo de biodegradação deve ser escolhido e desenvolvido de modo a

fornecer condições favoráveis à atuação dos microrganismos;

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 17

 O custo da tecnologia empregada não deve ser igual ou menor que outros tipos

de tecnologia igualmente eficazes na remoção do mesmo contaminante.

Pode-se definir biodegradação como sendo a redução da complexidade de compostos

químicos, biologicamente catalisada, ou seja, corresponde à degradação dos compostos pela

ação de microrganismos, tais como bactérias, actinomicetos e fungos. Estes microrganismos

utilizam os compostos orgânicos como fontes de nutrientes e de energia [U. S. EPA, 1996]. O

termo biodegradação é freqüentemente usado para descrever processos microbianos distintos

que ocorrem em ecossistemas naturais, tais como, mineralização, redução da toxicidade e

cometabolismo.

A mineralização ocorre quando há completa biodegradação de uma molécula

orgânica em compostos inorgânicos (dióxido de carbono, água e/ou N, P, S na forma

inorgânica), biomassa e produtos típicos de vias catabólicas [RISER-ROBERTS, 1998 apud

BAPTISTA, 2003].

Muitos processos podem reduzir a toxicidade de hidrocarbonetos, como por

exemplo: hidrólise, hidroxilação, desalogenação, desmetilação ou ainda desalquilação,

metilação, desaminação, nitro-redução e conversão de nitrila a amida.

Existem algumas técnicas de biorremediação que podem ser empregadas para

melhorar a eficiência da biodegradação dos poluentes [U. S. EPA, 1995; BAPTISTA, 2003].

Nos tratamentos in situ e/ou ex situ pode-se utilizar as seguintes técnicas [BAPTISTA, 2003;

ALEXANDER, 1999]:

 Bioventing (in situ e/ou ex situ) - consiste em adicionar oxigênio através da

aeração do sistema;

 Bioestimulação (in situ e/ou ex situ) – consiste na adição de nutrientes e/ou

aceptores finais de elétrons ao sistema [BOOPATHY, 2004];

 Bioaumento ou bioenriquecimento (in situ e/ou ex situ) – consiste na adição de

culturas microbianas (exógenas ou endógenas) no meio contaminado;

 Cometabolismo (in situ) – processo utilizado para degradar o substrato

secundário por meio de enzimas produzidas pela oxidação de substratos

primários. Envolve a injeção de água contendo o substrato primário (por

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 18

exemplo, metano) no lençol freático, para dar início à quebra dos substratos

secundários;

 Biodegradação intrínseca ou atenuação natural (in situ) – consiste numa

remediação passiva que depende dos processos naturais para degradar e dissipar

contaminantes no solo e nas águas subterrâneas [ALVAREZ & DA SILVA,

2004];

 Biopilhas (ex situ) – consiste em remover parte do solo contaminado e colocá-lo

em pilhas, em local devidamente equipado com sistema de aeração e coleta de

lixiviado;

 Landfarming (ex situ) – os resíduos são espalhados e misturados à camada fértil

do solo, de forma controlada, a fim de que a própria microbiota do solo atue

como agente de degradação;

 Biorreatores (ex situ) – consiste na utilização de um reator, que pode ser

aplicado para tratar líquidos ou borras e resíduos sólidos. Facilitam o controle da

qualidade do processo: produtos finais, temperatura, nutrientes, aeração,

crescimento populacional, comportamento da biomassa e umidade. Também

possibilitam a aclimatação da microbiota, o desenvolvimento dos

microrganismos, o bioenriquecimento e talvez até a aplicação de microrganismos

bioengenheirados. Ainda, concorre com a redução dos riscos de danos ao meio

ambiente.

Dependendo da disponibilidade do oxigênio, divide-se a biodegradação de

compostos orgânicos em dois grandes grupos: processos aeróbios e anaeróbios. Os

hidrocarbonetos saturados e os hidrocarbonetos aromáticos são compostos que exibem pouca

reatividade química e, por muitas décadas, pensava-se que só poderiam ser biodegradados na

presença de oxigênio livre. Contudo, durante a última década foi estabelecido que vários

microrganismos são capazes de degradar estes hidrocarbonetos sob condições estritamente

anóxicas [WIDDEL & RABUS, 2001]. Ainda hoje, muitas das estratégias de biorremediação

de hidrocarbonetos de petróleo são baseadas em processos aeróbios, que embora efetivos,

apresentam custos elevados por conta do suprimento de oxigênio. A predominância das

tecnologias aeróbias está relacionada a observações históricas de que os primeiros passos da

biodegradação de hidrocarbonetos por microrganismos envolvem a oxidação do substrato por

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 19

oxigenases e pelo fato do oxigênio ser um fator limitante em muitos ambientes naturais

[BOOPATHY, 2004].

A biodegradação anaeróbia tem sido citada como uma técnica promissora no

tratamento de solos e aqüíferos contaminados com hidrocarbonetos de petróleo

[BOOPATHY, 2004; BHANDARI & KARTHIKEYAN, 2001; WIDDEL & RABUS, 2001].

A Tabela 2.8 apresenta algumas vantagens e desvantagens dos processos anaeróbios em

relação aos aeróbios, notadamente no que se refere à produção de gás metano e à baixíssima

produção de sólidos.

Tabela 2.8 – Vantagens e desvantagens dos processos anaeróbios.

Vantagens Desvantagens

Baixa produção de sólidos, cerca de 5

a 10 vezes inferior à que ocorre nos

processos aeróbios;

As bactérias anaeróbias são susceptíveis

à inibição por um grande número de

compostos;

Baixo consumo de energia;

A partida do processo pode ser lenta na

ausência de lodo adaptado;

Baixa demanda de área;

Alguma forma de pós-tratamento é

necessária;

Baixos custos de implementação;

A bioquímica e a microbiologia da

digestão anaeróbia são complexas e

ainda precisam ser estudadas;

Produção de metano, gás combustível

de alto teor calórico;

Possibilidade de geração de maus

odores, porém controláveis;

Possibilidade de preservação de

biomassa, sem alimentação do reator,

por vários meses;

Possibilidade de geração de efluente com

aspecto desagradável;

Tolerância a elevadas cargas

orgânicas;

Remoção de nitrogênio, fósforo e

patogênicos insatisfatória.

Aplicabilidade em pequena e grande

escala;

Baixo consumo de nutrientes.

Fonte: CHERNICHARO, 1997.

Apesar da biodegradação aeróbia ocorrer mais rapidamente e ser aplicada com

sucesso para diferentes tipos de efluentes, nem sempre se apresenta como a melhor solução

[WIDDEL & RABUS, 2001]. Os problemas mais usuais desse processo, quando aplicado na

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 20

biorremediação, são: a produção excessiva de biomassa e o suprimento inadequado de

oxigênio, necessário para que a biodegradação ocorra satisfatoriamente. Nos sistemas

aeróbios, ocorre somente cerca de 40 a 50% de degradação biológica, com a conseqüente

conversão em CO

. Há uma incorporação de 50 a 60% da matéria orgânica em biomassa

microbiana. Já nos processos anaeróbios, verifica-se que a maior parte do material orgânico

biodegradável é convertida em biogás (cerca de 70 a 90%), sendo o restante convertido em

material celular [CHERNICHARO, 1997].

2.3 – BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA

No processo de conversão da matéria orgânica em condições de ausência de oxigênio

são utilizados aceptores de elétrons inorgânicos como

−

(redução de nitrato),

−

(redução de sulfato), ou

(formação de metano) [ATLAS, 1981].

Muitos pesquisadores têm demonstrado que benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno

(BTEX) podem ser degradados em ecossistemas, em condição de anaerobiose [BOOPATHY,

2004]. Alcanos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) e alcenos também podem ser

degradados em condições anaeróbias [SUFLITA et al., 2000].

Na digestão anaeróbia diversos grupos de microrganismos atuam interativamente na

conversão da matéria orgânica complexa em metano, gás carbônico, água, gás sulfídrico e

amônia, além de novas células microbianas. Os microrganismos que participam do processo

de decomposição anaeróbia podem ser divididos em quatro importantes grupos de bactérias,

com comportamentos fisiológicos distintos: bactérias fermentativas, bactérias acetogênicas,

Archeas metanogênicas e bactérias redutoras de sulfato [BARTON, 1995].

Para a biodegradação anaeróbia de compostos orgânicos, vários modelos de reatores

anaeróbios foram desenvolvidos, apresentando características distintas quanto às dimensões,

retenção celular, carga orgânica e separação de fases sólido-líquido-gás, entre outras (Figura –

2.1) [MCCARTY, 1982].

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 21

Figura 2.1 – Modelos de reatores anaeróbios.

Fonte: Adaptado de MCCARTY, 1982.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 22

2.4 – MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE

HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO

A capacidade de degradar hidrocarbonetos de petróleo não é restrita a poucos

microrganismos, envolvendo diferentes espécies de bactérias e fungos [ATLAS, 1981].

ZoBell (1946) mostrou que mais de 100 espécies, pertencentes a 30 gêneros, possuíam a

capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono. Posteriormente, Bartha e

Atlas (1977) apresentaram 22 gêneros de bactérias, 1 de algas e 14 de fungos como

degradadores de hidrocarbonetos de petróleo. Os gêneros considerados como os potenciais

degradadores de hidrocarbonetos são: Pseudomonas, Achromobacter, Arthrobacter,

Micrococcus, Nocardia, Vibrio, Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium,

Flavobacterium, Candida, Rhodotorula e Sporobolomyces. Em ambientes aquáticos, as

bactérias e leveduras prevaleceram como degradadoras de hidrocarbonetos.

O efeito global de um organismo sobre um substrato complexo é limitado por sua

capacidade de “ataque” a certas substâncias ou intermediários acumulados, em virtude da

dificuldade de sofrer degradação [BAPTISTA, 2003]. Cada organismo apresenta

especificidade de atuação sobre os hidrocarbonetos. No entanto, a degradação extensiva de

compostos de petróleo, de um modo geral, é alcançada pela atuação associada de diferentes

populações de microrganismos [BAPTISTA, 2003; BOOPATHY, 2003a, ATLAS, 1978].

Inclusive, a utilização de consórcios microbianos tem demonstrado maior potencial de

degradação para uma faixa mais ampla de compostos complexos do que culturas puras

[FRITSCHE & HOFRICHTER, 2000]. Isso ocorre porque em populações microbianas mistas

existe um pool enzimático mais diversificado que, por isso, permite a metabolização de

misturas complexas de hidrocarbonetos [CRAVO Jr., 1998].

Microrganismos que degradam hidrocarbonetos anaerobicamente podem ser

divididos em dois grupos em relação ao oxigênio: os anaeróbios facultativos (bactérias

redutoras de nitrato, ferro e manganês) e os anaeróbios estritos (bactérias redutoras de sulfato)

[GRISHCHENKOV et al., 2000].

Estudos sobre a biodegradação anaeróbia de hidrocarbonetos por culturas bacterianas

puras têm enfatizado a habilidade dessas bactérias em conduzir este processo sob condições

particulares e pré-determinadas, como reduções de nitrato, sulfato, ferro e manganês

[GRISHCHENKOV et al., 2000]. Foram investigadas aproximadamente quinze culturas puras

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 23

de redutoras de nitrato e dez de redutoras de sulfato que podem degradar anaerobicamente

diferentes hidrocarbonetos monoaromáticos [HEIDER et al., 1999]. Isto mostra a capacidade

desses microrganismos em degradar estes compostos na ausência de oxigênio, desenvolvendo

um metabolismo alternativo, com reações independentes do oxigênio, para o ataque inicial

desses substratos. Widdel e colaboradores (1999) demonstraram a degradação anaeróbia dos

alquilbenzenos por uma cepa bacteriana pura que cresceu em óleo cru, sob condições tanto de

redução de sulfato como de redução de nitrato.

A degradação de compostos orgânicos na natureza é freqüentemente resultado da

interação de uma população de microrganismos, geralmente chamada de consórcio

[BOOPATHY, 2003b].

2.5 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

As bactérias redutoras de sulfato (BRS) formam um grupo fisiológico de

procariontes que têm a capacidade exclusiva de utilizar sulfato como aceptor final de elétrons

durante a respiração [BARTON & TOMEI, 1995]. Essas bactérias fazem parte de um grupo

distinto de microrganismos presentes em uma grande variedade de ambientes anaeróbios

[KRUMHOLZ, et al., 2002; ODOM & SINGELTON, 1993].

Inicialmente pouca atenção foi dispensada às BRS, no entanto, pesquisadores

demonstraram interesse em descobrir suas interações com outras formas de vida e seus

processos metabólicos. Então, foi descoberto que essas bactérias estão amplamente

distribuídas na Terra e reconheceu-se que esses organismos desenvolvem papéis significantes

na natureza, em virtude do seu potencial para numerosas interações, conforme ressalta a

Figura 2.2. Uma característica marcante das BRS é a maneira pela qual o sulfato é

metabolizado [BARTON & TOMEI, 1995].

As bactérias redutoras de sulfato foram descobertas por Beijerinck em 1895, que

descreveu a espécie Spirillum desulfuricans. Logo sucederam-se estudos e pesquisas a

respeito destas bactérias e outros fatos marcantes na caracterização das BRS podem ser assim

relatados [POSTGATE, 1984]:

1903 – Van Delden relatou variações destas bactérias em ambiente marinho e com

tolerância à salinidade;

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 24

1925 – Elion descobriu as espécies termofílicas;

1930 – Baars publicou uma tese, onde foi apresentado um extensivo estudo a respeito

destas bactérias;

1936 – Kluyver e Van Niel estabeleceram o gênero Desulfovibrio;

1965 – Campbell e Postgate estabeleceram o gênero Desulfotomaculum.

BRS

ASSOCIAÇÕES

COM ANIMAIS

TRATAMENTO

DE RESÍDUOS

BIOCORROS

BIORREMEDIAÇ

CICLO DE

ENXOFRE

DECOMPOSIÇ

TRANSFORMAÇÕ

OQU

ÍMI

PRODUÇÃO

Figura 2.2 – Interações das bactérias redutoras de sulfato.

Fonte: BARTON & TOMEI, 1995.

Nos últimos anos, as BRS vêm sendo reconhecidas por atuarem em vários processos,

tais como: corrosão microbiologicamente induzida, biodessulfurização e remediação

ambiental.

Na corrosão microbiologicamente induzida, a formação de H

S produzido através do

metabolismo das BRS ataca as superfícies de metais empregados na construção de

equipamentos e dutos, e inclusive de não metais, como concreto [GENTIL, 1996].

Por outro lado, as BRS podem ser empregadas na biodessulfurização do petróleo e de

seus derivados. Os combustíveis fósseis apresentam, em sua composição, compostos

sulfurados, em concentrações variáveis, que são muito prejudiciais à saúde humana e ao meio

ambiente (emissão de SO

, formação da chuva ácida, redução da fertilidade do solo) e às

indústrias (corrosão de equipamentos). Para diminuir a concentração desses compostos o

petróleo é atualmente tratado na fase de refino e produção. A biodessulfurização anaeróbia é

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 25

uma opção mais atrativa do que a aeróbia, já que o produto final do processo (H

S) pode ser

facilmente recuperado por operações nas refinarias [VIEIRA, 2003].

O emprego das bactérias redutoras de sulfato também tem sido estudado para

aplicação na biorremediação de solos, águas subterrâneas e outros ambientes contaminados

por hidrocarbonetos de petróleo [ALVAREZ & DA SILVA, 2004; BOOPATHY, 2003a e b;

KLEIKEMPER et al., 2002; KARTHIKEYAN & BHANDARI, 2001; SUFLITA et al., 2000;

WIDDEL et al., 1999; LOVLEY et al., 1996]. Essas bactérias conseguem ter atividade

metabólica na presença de compostos reconhecidamente recalcitrantes e prejudiciais ao meio

ambiente.

2.5.1 – CARACTERIZAÇÃO

As bactérias redutoras de sulfato estão amplamente distribuídas em ambientes

terrestres e aquáticos. A presença de BRS com alta atividade metabólica é facilmente

reconhecida pelo enegrecimento da água ou dos sedimentos devido a precipitação do sulfeto

de ferro (FeS), e pelo odor característico de sulfeto de hidrogênio (H

S). Essas bactérias são

facilmente encontradas em ambientes marinhos, estuários, sedimentos e lagos salinos ou

hipersalinos, por conterem altas concentrações de sulfato. Porém, já foram encontradas BRS

ativas em ambientes não salinos e em água doce. Também é relatada a presença de BRS em

ambientes poluídos como em plantas de purificação anaeróbia, em alimentos deteriorados,

plantas de lodo, em águas de campos de exploração de óleo, ambientes contaminados com

hidrocarbonetos e com compostos halogenados, etc [POSTGATE, 1984; BARTON, 1995;

KLEIMKEMPER et al., 2002].

As bactérias redutoras de sulfato podem ser classificadas em 4 grupos: mesófilas

Gram-negativas, eubactérias termófilas Gram-negativas, Gram-positivas formadoras de

esporos e arqueobactérias termófilas Gram-negativas [POSTGATE, 1984; BARTON, 1995].

As BRS mesófilas Gram-negativas não formadoras de esporos são as mais difundidas

na natureza. Dentre elas, cinco gêneros oxidam parcialmente compostos orgânicos a acetato:

Desulfovibrio, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfohalobium e Desulfomicrobium.

Enquanto sete gêneros oxidam substratos orgânicos completamente a CO

: Desulfoarculus,

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 26

Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema e

Desulfosarcina [BARTON, 1995].

Os dois gêneros mais conhecidos de bactérias redutoras de sulfato são Desulfovibrio e

Desulfotomaculum, mas ao longo dos anos outros gêneros foram identificados (Desulfobacter,

Desulfonema, Desulfobulbus, etc.) [POSTGATE, 1984]. O gênero Desulfovibrio é o mais

conhecido, pois seus membros são geralmente fáceis de isolar e purificar. Esse gênero inclui

cinco espécies que não esporulam e têm flagelos polares [BARTON & TOMEI, 1995].

As células de BRS apresentam morfologia bastante diversificada, podendo ser

esféricas, ovais, espirais, na forma de bastonetes ou de vibríos, com diâmetro variando de 0,4

a 3,0 µm. Algumas espécies apresentam mobilidade e outras são capazes de esporular. As

filamentosas (Desulfonema) exibem um movimento deslizante [HOLT et al., 1994 apud

VIEIRA, 2003].

Os membros do gênero Desulfovibrio são geralmente curvos e sigmóides, mas existem

exceções à regra, como por exemplo, a espécie Desulfovibrio desulfuricans que têm a forma

de bastonetes ou vibrios. Desulfovibrios são propensos a pleomorfismos em culturas velhas

ou adquirem a forma espiralada em ambientes inadequados ao crescimento [POSTGATE,

1984].

A maioria dos desulfovibrios são monotríquios, apesar de serem conhecidas cepas de

Desulfovibrio desulfuricans sem flagelos. Algumas espécies de Desulfovibrio apresentam

duplo flagelo [POSTGATE, 1984].

As bactérias do gênero Desulfotomaculum são Gram-positivas formadoras de esporos

e inclui espécies que oxidam compostos orgânicos completa e incompletamente. Neste gênero

há espécies termófilas, que sobrevivem em temperaturas entre 50 e 65

C, principalmente

devido à formação de esporos [BARTON, 1995].

O gênero Thermodesulfobacterium é parte do grupo das eubactérias termófilas e

Gram-negativas. Neste gênero há espécies que são nutricionalmente restritas e que não

oxidam completamente compostos orgânicos. As arqueobactérias redutoras de sulfato são

Gram-negativas, termófilas; são encontradas em áreas hidrotermais submarinas anaeróbias e

necessitam de sal e altas temperaturas para seu crescimento [BARTON, 1995].

A Figura 2.3 mostra uma fotografia de uma colônia de bactérias redutoras de sulfato

da espécie Desulfobacter postgatei.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 27

Figura 2.3 – Colônia de bactérias redutoras de sulfato da espécie Desulfobacter postgatei,

com um diâmetro celular de 1,5 µm.

Fonte: http://202.114.65.51/fzjx/wsw/newindex/tuku/MYPER/b08/673.htm

2.5.2 – CRESCIMENTO

As bactérias redutoras de sulfato são microrganismos estritamente anaeróbios.

Algumas podem crescer na ausência de sulfato, usando outro aceptor final de elétrons,

entretanto não podem crescer tendo o oxigênio como aceptor final de elétrons.

Essas bactérias crescem lentamente se comparadas com outras espécies bacterianas,

como, por exemplo, as do gênero Pseudomonas [POSTGATE, 1984]. O crescimento de BRS

mesófila

crescimento das culturas de Desulfovibrio, em diferentes meios, é linear ao invés

a qualitativa que os organismos produtores de

acetato, como a maioria das espécies dos gêneros Desulfovibrio e Desulfotomacula, crescem

rapidamente, ocorrendo duplicação da concentração celular, a 30

C, em 3 a 6 horas. Os tipos

que uti

s é geralmente lento, levando de alguns dias a duas semanas a 30

C, de acordo com a

espécie. Já as termófilas crescem mais rapidamente; a 55

C, o crescimento leva de 12 a 18

horas. Uma razão para o crescimento lento é a geração de H

S - produto da respiração - que

diminui a taxa de crescimento que pode ser zero para altas concentrações de H

S. Esse

fenômeno pode ser devido à toxicidade intrínseca do H

S aos sistemas vivos, mas é mais

provável que seja decorrente da insolubilidade do ferro pela formação de FeS [POSTGATE,

1984].

de exponencial. É possível generalizar de form

lizam acetato, como Desulfobacter spp, crescem muito mais lentamente e,

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 28

normalmente, são incapazes de dobrar a massa celular em tempos inferiores a 20 horas

[POSTGATE, 1984].

2.5.3 – CULTIVO

Vários tipos de meios de cultura são utilizados para crescimento das BRS. Porém, o

meio ma

star abaixo de –

150 mV

Os metais são muito importantes como cofatores para muitas enzimas das BRS, por

isso dev

crescimento; algumas

linhagens podem fixar nitrogênio gasoso. Determinadas linhagens são também capazes de

crescer à

mas podem

também utilizar alguns constituintes do petróleo como os alcanos, tolueno, benzeno e

hidrocar

is comumente usado é o meio Postgate C, que tem a seguinte composição, por litro:

, 0.5 g; NH

Cl, 1.0 g; Na

, 4.5 g; CaCl

.2H

O, 0.06 g; MgSO

.7H

O, 2.0 g;

Extrato de leveduras, 1.0 g; FeSO

.7H

O, 0.004 g; Citrato de sódio, 0.3 g e Lactato de sódio

(ou outro doador de elétrons), 3.5 g. O potencial de redução do meio deve e

e o ambiente redutor pode ser obtido através do uso de 1mM de Na

S ou 1mM de

tioglicolato de sódio mais 1mM de ascorbato de sódio [BARTON, 1995].

As BRS podem ser encontradas tanto em ambientes ácidos (pH 4,0) [POSTGATE,

1984] como em ambientes alcalinos com pH até 9,5 [BARTON, 1995].

em estar presentes nos meios de crescimento. O ferro é essencial para a produção de

citocromos e produção de hidrogenases (enzima responsável pela oxidação do hidrogênio

molecular). Níquel e selênio são necessários para a atividade dessas enzimas.

As BRS utilizam nitrogênio, orgânico ou inorgânico, para

s custas de nitrato como aceptor final de elétrons. Barton (1995) isolou uma cepa de

Desulfovibrio sp capaz de usar nitrato, nitrito e 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) como fontes de

nitrogênio e aceptores de elétrons para crescimento [BARTON, 1995].

As BRS são capazes de utilizar uma grande variedade de doadores orgânicos de

elétrons, incluindo lactato, formato, malato, fumarato, piruvato, álcoois e até contaminantes

ambientais [KRUMHOLZ et al., 2002; ODOM & SINGELTON, 1993]. Algu

bonetos poliaromáticos [SOGIN et al., 2003].

Diferentemente da maioria das bactérias anaeróbias, as BRS são capazes de

sobreviver na presença de quantidade limitada de oxigênio. Esta tolerância ao ar pode ser

atribuída a presença de catalase e superoxido dismutase [BARTON, 1995]. Se a concentração

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 29

de oxigênio dissolvido em águas residuárias estiver entre 0,1 e 1,0 mg/L, as BRS serão

inibidas, mas conseguem sobreviver, permanecendo em estado latente. Em concentrações

acima de

IEIRA, 2003 apud da SILVA, 2000].

lgumas substâncias também provocam a inibição da redução do sulfato, por

apresentarem estruturas análogas. Dentre elas destacam-se o selenato e os íons

um inibidor, assim como o cromato, mas não da mesma forma que o selenato; este ânion inibe

as célula

S) ini

xidada, como sulfato e óxidos de enxofre no solo, rochas, rios e mares.

Biologicamente, para incorporação das diferentes formas de enxofre em material celular, este

deve ser reduzido. A redução biológica do sulfato, assim como a fixação biológica do

nitrogênio e a produção biológica de oxigênio são considerados processos indispensáveis à

vida no planeta. Sabe-se que os animais não têm a capacidade de conduzir a reação de

conversão de sulfatos em sulfetos, sendo assim dependentes das plantas e dos microrganismos

para seu suprimento de enxofre reduzido. A redução do sulfato inorgânico a sulfeto, orgânico

ou inorgânico, e a subseqüente oxidação d te sulfeto a sulfato, é conhecida como Ciclo do

Enxofre (Figura 2.4). Este ciclo é constituíd de uma parte assimilativa e outra desassimilativa

[BARTON, 1995].

1,0 mg/L, ocorre a inibição da redução do sulfato, em conseqüência do aumento do

potencial de oxi-redução do meio [V

monofluorofosfato que são os inibidores mais poderosos e mais específicos. O molibdato é

s de Desulfovibrio formando um análogo instável do sulfato ativado, esgotando os

ATPs da célula. O efeito do molibdato nas BRS é relativamente específico e, por isso, é um

inibidor útil na redução do sulfato [POSTGATE, 1984].

Segundo Barton (1995), o sulfeto de hidrogênio em elevadas concentrações (16 m

be o crescimento das BRS.

2.5.4 – CICLO DO ENXOFRE E REDUÇÃO DESASSIMILATIVA DO SULFATO

As bactérias redutoras de sulfato são as únicas que têm a capacidade de utilizar o

sulfato como aceptor final de elétrons. Esse processo de respiração, que ocorre em condições

anaeróbias, é conduzido pelas BRS com o propósito de gerar compostos de alta energia para

reações de biossíntese envolvidas no seu crescimento e manutenção [BARTON, 1995].

Há milhões de anos, o enxofre presente na superfície da Terra está disponível na

biosfera na forma o

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 30

e coenzimas, respectivamente. As bactérias redutoras de sulfato realizam tanto a

redução

age com

do enxofre é

assimilada pelo organismo, sendo sua grande maioria liberada no ambiente como íon sulfeto,

normalm

SULFATO

SULFETO

CÉLULA -

ENXOFR

ENXOFRE

Parte Assimilativa Parte Desassimilativa

Figura 2.4 – Ciclo biológico do enxofre.

Célula-enxofre indica o enxofre ligado a bactérias, fungos, animais e plantas. (1) Redução

assimilativa do sulfato por bactérias, fungos e plantas; (2) Morte e decomposição por

bactérias e fungos; (3) Excreção do sulfato por animais; (4) Assimilação do sulfeto por

bactérias (e algumas plantas); (5) Redução desassimilativa do sulfato; (6) Redução

desassimilativa do enxofre elementar; (7) Oxidação quimiotrófica e fototrófica do sulfeto; (8)

Oxidação quimiotrófica e fototrófica do enxofre.

Fonte: Adaptado de BARTON, 1995.

As plantas, os fungos e algumas espécies de bactérias usam o sulfato como sua única

fonte de enxofre, e para tanto, reduzem o átomo de enxofre do maior estado de oxidação para

o mais reduzido. Este processo é dito redução assimilativa do sulfato, assim chamado pois o

enxofre é assimilado, isto é, ele é incorporado nos organismos em aminoácidos (cisteína e

metionina) e vitaminas (tiamina, biotina, ácido pantotênico), que são constituintes de

proteínas

assimilativa como a redução desassimilativa do sulfato. Nesta última, o íon sulfato

o agente oxidante para a assimilação da matéria orgânica, como ocorre com o

oxigênio na respiração aeróbia. De modo que, somente uma pequena quantidade

ente convertido a H

S livre em meio aquoso. Este processo também é denominado de

respiração do sulfato [POSTGATE, 1984]. Abaixo estão representadas as equações

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 31

correspondentes à redução do sulfato mediante oxidação total (1) ou parcial (2) da matéria

orgânica.

+ 2 CH

O → H + 2 CO

ução do sulfato corresponde à ativação deste íon pelo ATP

(trifosfat ão de um composto orgânico de enxofre de alta

a adenos

ção, que é catalisada pela enzim

sulfurilase, ocorre a substituição de dois resíduos de fosfato do ATP pelo sulfato. Em seguida,

o pirofosfato (PP

depende

icroganismo estivesse em condição

desfavor

A segunda etapa é a redução da adenosina fosfosulfato a AMP (monofosfato de

adenosina) e sulfito pela ação da enzima APS-redutase.

fato a sulfito e a sulfeto [BARTON,

1995].

+ CH

COOH

(1)

Uma grande variedade de compostos orgânicos pode ser assimilada pelas BRS,

variando desde ácidos graxos simples a hidrocarbonetos aromáticos complexos.

A etapa inicial na red

o de adenosina) com formaç energia,

’

ina 5

-fosfosulfato (APS). Durante esta rea a ATP-

) é rapidamente convertido em fosfato inorgânico pela enzima pirofosfatase,

nte de Mg

, Co

e Mn

, sendo inativada em aerobiose. Parece que a pirofosfatase

teria a função fisiológica de conservar ATP quando o m

ável, através da inibição da conversão de APS. A constante de equilíbrio da ATP-

sulfurilase não é favorável à formação de APS, sendo a reação conduzida neste sentido

somente pela hidrólise do PP

+ ATP ↔ APS + PP

(2)

+ H

O → 2 P

(3)

APS + 2 e

↔ AMP +

(4)

Em seguida, o sulfito (SO

) é reduzido a sulfeto (S

) através de uma série de etapas

que são muito pouco conhecidas bioquimicamente. Historicamente, pensava-se que esse

processo de redução era causado por um “sistema de sulfito redutase”; no entanto, evidências

sugerem que o sulfito é reduzido a sulfeto por um ou dois mecanismos possíveis. Uma

hipótese é que a redução direta de sulfito a sulfeto ocorra sem a formação de nenhum

composto intermediário. Outra hipótese propõe a formação de dois intermediários, tritionato e

tiossulfato, sendo que a etapa final é a redução de tiossul

A possível rota da redução desassimilativa do sulfato, de acord com Postgate

(1984), segue os passos apresentados na Figura 2.5. O sulfito é convertido a metabissulfito

), que é reduzido a tritionato (S

), passando por alguns intermediários como, por

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 32

exemplo, o ditionato, S

. Parte do tritionato é então convertido a tiossulfato (S

) e

parte é usada para regenerar o sulfito. Em seguida, o tiossulfato é reduzido a sulfeto, sendo

uma parte novamente convertida a sulfito. Entre os transportadores de elétrons envolvidos no

metabolismo das BRS tem-se: citocromos (b, c3), ferrodoxinas, flavodoxinas, NAD

NADP

[MADIGAN et al., 1997; Apud VIEIRA, 2003].

As bactérias que conduzem a redução desassimilativa do sulfato fazem parte de um

grupo de quatorze gêneros de eubactérias. São eles: Desulfovibrio, Desulfoarculus,

Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfococcus,

Desulfomicrobium, Desulfohalobium, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfosarcina,

Desulfotomaculum, Thermodesulfobacterium, e um gênero de arqueobactéria, Archaeoglobus

[BARTON, 1995].

Figura 2.5 - Possível rota para a redução desassimilativa do sulfato.

Fonte: POSTGATE, 1984.

2.6 – BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA DE HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO:

METABOLISMO

A presença de hidrocarbonetos na biosfera, ao longo da história da vida, pode

explicar porque muitos microrganismos adquiriram equipamento enzimático que os permitia

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 33

fazer uso desses compostos como substratos para seu crescimento. A Figura 2.6 mostra as

possíveis formas de assimilação desses hidrocarbonetos pelos microrganismos. Em todas as

reações quimiotróficas, uma parte dos hidrocarbonetos é utilizada para produção de energia

(catabolismo), sendo o restante assimilado para formação de novas células. Na oxidação

aeróbia (parte superior, à direita na figura), o oxigênio não é somente o aceptor final de

elétrons, mas também necessário para ativação substrato, através de reações catalisadas por

oxigenases [WIDDEL & RABUS, 2001].

na presença de oxigênio, são

xigênio não estar presente em

todos os

Bactérias e fungos, que utilizam hidrocarbonetos

conhecidos desde o início do Século 20. Porém, o fato do o

ambientes onde os hidrocarbonetos estão, trouxe o questionamento de saber se é ou

não possível a biodegradação de hidrocarbonetos em condições anóxicas [WIDDEL &

RABUS, 2001]. Sabe-se que 10 a 15% da população bacteriana presente em solos, águas e em

sedimentos pode ser constituída por microrganismos anaeróbios [BHANDARI &

KARTHIKEYAN, 2001].

Figura 2.6 – Rotas possíveis da utilização de hidrocarbonetos por microrganismos.

As setas tracejadas indicam a ativação dos hidrocarbonetos.

Fonte: WIDDEL & RABUS, 2001 – modificada pela autora.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 34

Somente no final da década de 80 foi reconhecida a capacidade de algumas bactérias

em degradar hidrocarbonetos saturados e aromáticos, entre outros, em condições anaeróbias

[SUFLITA et al., 2003; WIDDEL & RABUS, 2001; HEIDER et al., 1999]. Estudos

provaram a ocorrência da biodegradação de compostos BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno,

xileno), alcanos, alguns hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) e alguns alcenos, em

anaerobiose [SUFLITA et al., 2003; WIDDEL & RABUS, 2001]. Porém, ainda pouco se sabe

a respeito do metabolismo anaeróbio de microrganismos crescendo nesta vasta diversidade de

compostos presentes no óleo cru e em seus derivados. Até então, estudos têm demonstrado

que os mecanismos bioquímicos utilizados pelos microrganismos anaeróbios diferem

completamente do metabolismo aeróbio, embora esses mecanismos não tenham sido

completa

a presença desses

microrga

culturas puras de bactérias redutoras de ferro, bactérias desnitrificantes e bactérias

dutoras de sulfato [LOVLEY et al., 1996]. Uma pesquisa realizada com trinta e oito

q o

do sulfato é responsável pela atenuação de 70% da contaminação [KLEIMKEMPER et al.,

2002].

O interesse na mineralização anaeróbia do tolueno se deu após a observação de que

ele era mais rapidamente degradado em lodo ativado e em sedimentos anaeróbios

contaminados por hidrocarbonetos [VOGEL & GRBIC-GALIC, 1986 Apud HEIDER et al.,

1999]. Em uma cultura anaeróbia enriquecida, na presença de óleo e em condições de redução

de sulfato, o tolueno foi mais rapidamente consumido dentre os alquilbenzenos [RABUS et

al., 1996]. A Tabela 2.9 mostra exemplos da oxidação de tolueno por bactérias anaeróbias, a

partir de diferentes aceptores de elétrons [HEIDER et al., 1999]. O tolueno é ativado por

condensação com fumarato, produzindo benzilsuccinato; este é então oxidado, por reações

mente elucidados [WIDDEL & RABUS, 2001].

Durante a década de 40, e novamente vinte anos depois, houve relatos da oxidação

anaeróbia de alcanos por bactérias redutoras de sulfato, do gênero Desulfovibrio. O interesse

na possibilidade de oxidação de hidrocarbonetos por BRS surgiu por ser

nismos freqüente em plantas de produção de óleo, onde são responsáveis por efeitos

indesejáveis, em especial devido a geração de sulfeto [WIDDEL et al, 1999].

Os primeiros hidrocarbonetos para os quais a biodegradação anaeróbia pode ser

inequivocamente mostrada foram os alquilbenzenos. A degradação destes compostos,

especialmente a do tolueno, foi demonstrada para culturas enriquecidas de bactérias bem

como para

a üíferos contaminados com hidrocarbonetos de petróleo revelou que, em média, a reduçã

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 35

que lem ra benzoil-CoA e succinil-CoA (Figura

2.7) [W

Algumas espécies de bactérias desnitrificantes e redutoras de sulfato são capazes de

mine s (to -cumeno),

entre outros. Além disso, já é conhecida uma erro III,

Geob r m áticos.

m consórcio

de bactérias, atuando em sintrofismo. Inicialmente, as bactérias “redutoras de prótons”

hidro mação de hidrogênio, que é então consumido pelas

Arch metanogênicas, tornando esse processo .9). A

baixa nergia livre de Gibbs corrobora com a idéia de um EIDER et

al.,19 .

T la 2.9 - u d p r bactérias anaeróbias.

Fonte: HEIDER et al., 1999.

) Bactérias Desnitrificantes

b m a β-oxidação de ácidos graxos, e produz

IDDEL et al., 1999].

ra izar alcanos, alcenos e alquilbenzel no lueno, m-xileno, etilbenzeno, p

espécie de bactéria redutora de f

acte etallireducens, capaz de degradar hidrocarbonetos arom

A degradação de hidrocarbonetos també é p ssível pela atividade do e um

lisam os hidrocarbonetos com a for

eas termodinamicamente possível (Tabela 2

e a associação sintrófica [H

99]

abe Eq ações estequiométricas da oxi ação de tolueno o

+ 0,2 H

→

HCO

+ 3,6 N

+ 0,6 H

)

-1

+ 7,2 N

∆G

O’

= - 3554 kJ . (mol tolueno

(2) Bactérias Redutoras de Ferro III:

H →

7 FeCO

+ 29 Fe

+ 145 H

∆G

O’

= - 3398 kJ . (mol tolueno)

-1

(3) Bactérias Redutoras de Sulfato:

+ 4,5 SO

-2

+ 3 H

O →

7 HCO

+ 2,5 H

+ 4,5 HS

∆G

O’

= - 205 kJ . (mol tolueno)

-1

(4) Consórcio Metanogênico:

a) C

+ 9 H

O →

b) 6 H

+ 1,5 HCO

+ 1,5 H

→

c) 3 H

C – COO

+ 3 H

O →

Somatório:

+ 7,5 H

O →

HCO

+ 3H

C – COO

+ 4H

+ 6H

∆G

O’

= + 166 kJ . (mol tolueno)

-1

1,5 CH

+ 4,5 H

∆G

O’

= - 203 kJ . (6 moles de H

)

-1

3 CH

+ 3 HCO

∆G

O’

= - 93 kJ . (3 moles de acetato)

-1

4,5 CH

+ 2,5 HCO

+ 2,5 H

∆G

O’

= - 131 kJ . (mol tolueno)

-1

+ 94 Fe(OH)

Figura 2.7 – Rota da oxidação anaeróbia do tolueno a benzoil-CoA.

Fonte: HEIDER et al., 1999.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 37

Widdel e colaboradores (1999) determinaram o consumo de n-alcanos, como único

substrato orgânico, durante o crescimento de novas espécies mesófilas de bactérias redutoras

de sulfato em condição de anaerobiose. Porém, os mecanismos da oxidação anaeróbia de

alcanos ainda são insuficientemente conhecidos.

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) são compostos com anéis

fundidos, com baixa solubilidade em água, que exibem propriedades tóxicas em baixas

concentrações, podendo ser carcinogênicos. Muitos desses compostos são listados como

poluentes prioritários no monitoramento em efluentes industriais, sedimentos, águas e solos.

[BHANDARI & KARTHIKEYAN, 2001; LOVLEY, et al., 1996]. Coates et al. (1996) foram

os primeiros a demonstrar a oxidação de PAH por bactérias redutoras de sulfato pela oxidação

do naftaleno e do fenantreno a CO

; e ainda revelaram que metilnaftaleno, fluoreno e

fluoranteno também eram anaerobicamente transformados em CO

, ao contrário do pireno e

do benzopireno.

Ainda há dúvidas em relação aos mecanismos de biodegradação de PAH por

bactérias redutoras de sulfato. Alguns autores concordam que a carboxilação é a etapa inicial

da biodegradação do naftaleno, como mostra a reação a seguir (Figura 2.8).

Experimentos realizados por Boopathy (2003a) para remoção de hidrocarbonetos de

petróleo em solo, mostraram que 55% dos hidrocarbonetos totais de petróleo (TPH) foram

eliminados em condições de redução do sulfato, após 290 dias de operação do reator. Em

sedimentos de terras alagadas e contaminadas com óleo diesel, Boopathy (2003b) obteve

remoção de 62% deste óleo após 510 dias, também em condições que favoreciam a redução

de sulfato. Em estudo posterior [BOOPATHY, 2004], foi observada a biodegradação

anaeróbia de 54,5% de óleo diesel em solo após 310 dias, para condições de redução de

sulfato.

Figura 2.8 – Rota conceitual de degradação de PAH sob redução de sulfato.

Fonte: Adaptado de BHANDARI & KARTHIKEYAN, 2001.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 38

Phelps et al. (1996), estudando a biodegradação de benzeno em misturas de BTX,

através da análise da geração de

, observaram que houve a completa mineralização do

benzeno

r exemplo na gasolina e no óleo diesel. Este trabalho comprova que a degradação

microbiana do benzeno é possível a partir da redução do sulfato.

Lovley et al. (1996) observaram que naftaleno e fenantreno foram oxidados a CO

, a

anaerobiose. Com isso, concluíram que a oxidação microbiana

de PAH, em condição anaeróbia, ocorre em associação com a redução desassimilativa do

sulfato.

2.7 – BIOSURFACTANTE

UNHA, 2004].

de, solubilização,

molhabilidade ou detergência [PORTER, 1994]. A solubilidade dos surfactantes é responsável

por sua adsorção à superfície e pela formação de micelas, que por sua vez propicia a redução

por bactérias que utilizam o sulfato como aceptor final de elétrons. Estes

microrganismos anaeróbios foram capazes de degradar o benzeno em concentrações iniciais

relativamente altas e em misturas com outros hidrocarbonetos aromáticos contaminantes,

como po

partir da redução do sulfato em

Um fator limitante nos processos de biorremediação é a baixa solubilidade dos

hidrocarbonetos de petróleo. Isto impede a biodisponibilidade destes poluentes, dificultando a

biodegradação [DA C

Os surfactantes são moléculas anfipáticas, constituídas de uma fração polar ou

hidrofílica e uma fração apolar ou hidrofóbica [GEORGIOU et al., 1992; JOHNSEN et al.,

2005]. A porção apolar é freqüentemente formada por hidrocarbonetos de cadeias alifáticas,

grupos aromáticos e policíclicos. A porção polar pode ser iônica (aniônica ou catiônica), não-

iônica ou anfotérica.

Em função da presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula, os

surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de

polaridade (óleo/água e água/óleo). A formação de um filme molecular, ordenado nas

interfaces, reduz a tensão interfacial e superficial, sendo responsável pelas propriedades

únicas dos surfactantes [DESAI & BANAT, 1997].

Como principais propriedades que caracterizam os surfactantes pode-se citar a

capacidade de adsorção, formação de micelas, formação de macro e microemulsões, dispersão

ou agregação de sólidos, ação espumante ou anti-espumante, solubilida

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 39

da visco

es de petróleo, bem

como n

do sua solubilidade em água, diminuindo a tensão

interfaci

mpreende os raminolipídeos, biosurfactantes comercialmente

dispon

re quando estes

microrga

sidade e solubilização de compostos no mesmo [JOHNSEN et al., 2005]. Por outro

lado, a adsorção dos surfactantes resulta em molhabilidade, emulsificação, formação de

espumas, dispersão de partículas e detergência [DESAI & BANAT, 1997].

Os surfactantes quimicamente sintetizados são usados na indústria do óleo cru, como

auxiliares no tratamento despoluente de ambientes acometidos por derram

a recuperação de óleo de reservatórios. Porém, estes compostos não são

biodegradáveis e podem ser tóxicos para o ecossistema [BANAT, 1995]. Portanto, o uso de

biosurfactantes é uma alternativa eficaz e não é tóxico ao meio ambiente.

Bactérias, leveduras e fungos filamentosos que degradam substratos insolúveis em

água como hidrocarbonetos sólidos e líquidos, gorduras, óleos e graxas, usualmente produzem

biosurfactantes [GERSON, 1993]. Os biosurfactantes são compostos biodegradáveis que, em

muitos casos, têm mostrado possuir propriedade emulsificante equivalente aos compostos

químicos [BANAT, 1995]. Os surfactantes de origem microbiana, similarmente aos sintéticos,

emulsificam hidrocarbonetos, aumentan

al e aumentando o deslocamento das substâncias oleosas agregadas às partículas do

solo [BANAT, 1995]. Desta forma, facilitam o contato da bactéria com o contaminante a ser

biodegradado [JOHNSEN et al., 2005].

Os glicopeptídeos constituem uma classe de surfactantes microbianos de interesse.

Por sua vez, esta classe co

íveis e um dos mais estudados. Os raminolipídeos apresentam em sua estrutura 1 ou 2

moléculas de raminose ligadas a 1 ou 2 moléculas de ácido β-hidroxidecanóico os principais

[DESAI & BANAT, 1997].

Várias espécies do gênero Pseudomonas são capazes de produzir grandes quantidades

destes compostos a partir de diferentes substratos [PARRA et al., 1989]. Estas bactérias

podem usar glicerol, frutose, glicose, n-parafina e óleos vegetais para produzir raminolipídeos

[BOULTON, 1987]. Na verdade a maior produção de raminolipídeos ocor

nismos são cultivados em meios de cultura contendo fontes de carbono hidrofóbicas,

como hidrocarbonetos, já que a presença destes compostos tensoativos permite a assimilação

das moléculas insolúveis pelos microrganismos [COOPER & ZAJIC, 1980].

Em 1949, Jarvis e Johnson descreveram o raminolipídeo produzido por

Pseudomonas aeruginosa (TAHZIBI, KAMAL & ASSADI, 2004). Anos depois, em 1963,

foi proposta a via metabólica de síntese e, em 1994, foi isolado e caracterizado o gene

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 40

respon

as tecnologias de produção de raminolipídeos em escala industrial foram

desenvolvidas. Uma envolve o cultivo por processo continuo em meio de cultura de

composição e condições otimizadas. Posteriormente, há o reciclo de células e recuperação do

produto usando tecnologia de ponta, permitindo alcançar rendimento e produtividade

elevados.

sável pela sua biossíntese. Existem 4 diferentes homólogos de raminolipídeos

produzidos por P. aeruginosa, sendo o L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato

(RL2) e o L-ramnosil-L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato (RL1) os principais

(Figura 2.9).

Algum

Figura 2.9 - Estrutura dos raminolipídeos RL1 produzido por Pseudomonas aeruginosa.

Fonte: TAHZIBI et al., 2004.

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 41

Jeneil Biosurfactant Company (Wisconsin, USA) foi a primeira empresa a produzir

uma série de biosurfactantes à base de raminolipídeos, tornando-os comercialmente

disponíveis a preços competitivos. Estes produtos, segundo o fabricante, apresentam boas

propriedades como agentes de emulsificação, detergência, molhabilidade e formação de

espuma. Ademais, apresentam reduzida toxicidade e são facilmente degradados; os produtos

resultantes da degradação não apresentam persistência e danos para o ambiente. A sua

qualidade permite os mais diversos tipos de aplicação

[http://www.epa.gov/greenchemistry/sba04.html, 2005].

CAPÍTULO 3

MATERIAIS E MÉTODOS

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – ÓLEO DIESEL

Neste trabalho foi utilizado óleo diesel proveniente de um único posto de

abastecimento de combustíveis (BR Distribuidora de Combustíveis), armazenado em dois

galões de 5 litros, sob refrigeração a 4

C, durante todo o período experimental, para garantir a

não volatilização das frações mais leves.

A utilização de uma única amostra de óleo diesel, durante todo o desenvolvimento do

trabalho, foi realizada de modo a evitar a variação do produto e, conseqüentemente, garantir a

confiabilidade dos resultados. Os derivados de petróleo apresentam composição diversificada

dependendo da fonte e do processo de separação utilizados na sua obtenção.

3.2 – CULTURA MICROBIANA

Foi utilizada uma cultura mista de bactérias anaeróbias enriquecida com bactérias

redutoras de sulfato (BRS). A cultura foi obtida a partir de cultivos sucessivos de amostra da

água de produção de Carmópolis, em Sergipe, em meio apropriado (item 3.4)

3.3 – BIOSURFACTANTE

Foi utilizado o biosurfactante comercial JBR–425 cedido pelo

Centro de Tecnologia

Mineral (CETEM). Este produto, fabricado por Jeneil Biosurfactant Company (Wiscosin,

USA), contém 25% de raminolipídeos.

3.4 – MEIOS DE CULTIVO

O crescimento, a manutenção e a quantificação das BRS foram realizados em meio

Postgate E modificado [POSTGATE, 1984], cuja composição está descrita na Tabela 3.1.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 43

Este meio foi utilizado por Vieira (2003) para biodegradação anaeróbia de água de

produção com cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato.

Tabela 3.1 – Composição do Meio Postgate e Modificado.

Compostos Concentração (g/L)

0,5

Cl 1,0

CaCl

.2H

O 0,67

MgCl

.6H

O 1,68

1,0

FeSO

.7H

O 0,5

Ágar-agar 1,9

Extrato de Lêvedo 1,0

Ácido Ascórbico 0,1

Solução de Lactato de

Sódio (50%)

3,5 mL/L

Solução de Resarzurina

(0,025%)

4,0 mL/L

Fonte: POSTGATE, 1984.

O preparo do meio foi realizado sob purga de nitrogênio para evitar a presença de O

Após ajuste do pH a 7,8 ± 0,1 com a adição de NaOH 1N, foram distribuídos 40 mL de meio

em frascos tipo penicilina de 50 mL de volume útil (para o planejamento experimental) e 9

mL de meio em frascos tipo penicilina de 10 mL de volume útil (para a quantificação celular).

Foram vedados com tampas de borracha e lacres metálicos a fim de se garantir a condição de

anaerobiose. Em seguida, os meios foram esterilizados por autoclavagem a 1 atm por 20

minutos. No momento da inoculação, adicionava-se 0,1 mL de solução de tioglicolato de

sódio (12,4 g/L), um seqüestrante de oxigênio, na proporção de 0,1 mL para 10 mL de meio.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 44

3.5 – MANUTENÇÃO DA CULTURA MICROBIANA

A cultura mista de bactérias anaeróbias enriquecida com BRS (cultura estoque) foi

mantida através de repiques mensais em meio Postgate E modificado, incubados a 30 ± 1

3.6– ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA AO ÓLEO DIESEL

A aclimatação da cultura foi realizada em duas etapas. Na primeira, a cultura

microbiana foi cultivada no meio Postgate E modificado na presença de concentrações

crescentes de óleo diesel, variando de 0,25 a 5% (v/v), na seguinte ordem: 0,25%; 0,5%;

1,0%; 2,0%; 3,0%; 4,0% e 5,0%. Estes ensaios foram conduzidos em frascos do tipo

penicilina de 50 mL de capacidade contendo 40 mL de meio, vedados e lacrados para garantir

condição de anaerobiose. Para inoculação do meio contendo 0,25% de óleo diesel foram

utilizados 4 mL da cultura estoque, descrita no item 3.5. O frasco foi incubado a 30 ± 1

C e,

uma vez observado crescimento, alíquota (4 mL) do cultivo nele contido foi utilizada para

inocular 40 mL do meio contendo óleo diesel na concentração superior (0,5%). Este

procedimento foi repetido até obter cultura capaz de crescer na presença de 5% de óleo diesel.

A tolerância da cultura ao óleo diesel foi avaliada pelo crescimento das BRS, que

promovem o escurecimento do meio devido à formação de precipitado preto de sulfeto de

ferro (FeS). Este precipitado resulta da reação do ácido sulfídrico (H

S), gerado através do

metabolismo dessas bactérias, com Fe

presente na formulação do meio Postgate.

Na segunda etapa, foi testado o crescimento da cultura já aclimatada (etapa anterior)

em meio contendo 5% de óleo diesel e concentrações decrescentes de lactato de sódio (única

fonte de carbono do meio Postgate E), a fim de induzir o consumo preferencial do óleo diesel

como fonte de carbono e energia pelas bactérias. Foi adotado o mesmo procedimento acima

descrito, de modo que, logo após observar crescimento, alíquota do cultivo era transferida

para novo meio com menor conteúdo de lactato, até total supressão deste.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 45

3.7 – TESTES PRELIMINARES

Alguns ensaios foram preliminarmente realizados com o intuito de definir os valores

para estimativa da concentração de biosurfactante a ser adotada no planejamento experimental

para avaliação da biodegradação de óleo diesel.

Os valores das demais variáveis consideradas importantes neste estudo –

concentração de óleo diesel e relação carbono/nitrogênio - foram definidos a partir de

levantamento bibliográfico.

3.7.1 – CONCENTRAÇÃO DE ÓLEO DIESEL UTILIZADA NO PLANEJAMENTO

EXPERIMENTAL

No planejamento experimental optou-se por avaliar o comportamento da cultura nas

concentrações de óleo diesel no nível inferior de 0,5%, no nível central 1,5% e no superior de

2,5%. Esses valores foram baseados em estudo anterior realizado por VIEIRA (2004) que

trabalhou com efluentes gerados em terminais de combustíveis (gasolina e óleo diesel) da

cidade de Uberlândia - MG. Como forma de avaliar o percentual de combustíveis presente

neste efluente, VIEIRA (2004) obteve uma relação entre óleos e graxas e concentração de

combustíveis e verificou que este efluente apresentava concentração de 1,0 a 2,0% da mistura

óleo diesel e gasolina. Assim, optou-se por estudar concentração de óleo diesel em valores

abaixo de 1,0% e acima de 2,0%.

3.7.2 – TESTE DE SENSIBILIDADE DA CULTURA MICROBIANA AO

BIOSURFACTANTE

A sensibilidade da cultura microbiana ao biosurfactante raminolipídeo foi testada

para concentrações de 0,01%; 0,05% e 0,1% (v/v). O teste foi realizado com base no

crescimento das BRS, verificando seu crescimento pelo escurecimento do meio pela formação

de precipitado negro de FeS, após uma semana de incubação em estufa a 30

C ± 1

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 46

3.7.3 – CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO UTILIZADA NO PLANEJAMENTO

EXPERIMENTAL

No planejamento experimental foi adotado cloreto de amônio (NH

Cl) como fonte de

nitrogênio. Assim sendo, a concentração de NH

Cl, correspondente à relação C/N calculada

com base nos constituintes do meio Postgate foi utilizada como nível inferior (-1), enquanto

para o nível superior (+1) foi considerada uma concentração de NH

Cl cinco vezes maior.

Os cálculos se encontram no Apêndice A.

3.7.4 – PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO DA CULTURA MICROBIANA

A cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato foi padronizada por

contagem através da técnica de número mais provável (NMP) [HARRISON JR., 1982] em

meio Postgate E modificado.

Para tanto, 4 mL da cultura aclimatada em 5% de óleo diesel foram inoculados em 40

mL de meio Postgate E modificado sem agar-agar e lactato de sódio. Após 3, 5 e 7 dias de

incubação em estufa a 30 ± 1

C, com o auxílio de seringas estéreis, foram retiradas alíquotas

para quantificação microbiológica. As alíquotas foram submetidas a diluições decimais

sucessivas em solução redutora (item 3.11.7), que em seguida foram inoculadas nos meios

fluido ao tioglicolato e Postgate E modificado, para o cultivo de bactérias anaeróbias e BRS,

respectivamente. Após incubação a 30 ± 1

C por 28 dias, o crescimento das BRS foi visto

através da formação de precipitado preto e o das bactérias anaeróbias através da turvação do

meio.

3.8 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Para a realização de experimentos significativos e confiáveis, deve-se utilizar um

método científico de planejamento. Além disso, quando o problema envolve dados que podem

conter erros experimentais, um modo adequado de análise é por métodos estatísticos. Em

qualquer análise experimental devem-se seguir duas etapas: o planejamento experimental e a

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 47

análise estatística dos dados, esta última dependente do tipo de planejamento realizado

[OLIVEIRA, 2004].

As vantagens do uso do planejamento experimental são [BARROS NETO et al.,

1995, apud OLIVEIRA, 2004]:

 Redução do tempo de experimentação, pois permite a otimização do número de

experimentos;

 Redução dos custos relativos à execução dos ensaios, fato que está relacionado à

redução da quantidade de experimentos;

 Permite a avaliação e minimização do erro experimental;

 Permite uma otimização multivariada, e

 Não requer conhecimentos elevados em estatística.

O processo de biodegradação envolve diversas variáveis, assim a análise e

planejamento dos experimentos são mais confiáveis utilizando técnicas estatísticas para esse

fim. A técnica de superfície de resposta, que tem como base o planejamento fatorial dos

experimentos, é de fundamental importância neste trabalho, pois permite verificar os efeitos

individuais e as interações entre as variáveis, a avaliação dos erros experimentais e de

regressão e o equacionamento empírico dos resultados em função das variáveis escolhidas

[BOX et al., 1978].

O número de variáveis a serem estudadas aliado à necessidade de obter uma

estimativa de parâmetros de uma superfície de segunda ordem e ainda, a redução do esforço

experimental, levaram à utilização do Planejamento Composto Central (PCC). O PCC é um

planejamento fatorial de 1

ordem aumentado por pontos adicionais para permitir a estimação

dos parâmetros de uma superfície de 2

ordem. Portanto, foi realizado um PCC composto por

um planejamento fatorial a dois níveis com três variáveis acrescido de duas réplicas no ponto

central e ainda 6 experimentos nos pontos axiais (α), totalizando 16 experimentos.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 48

-1 -1 -1

-1 -1 +1

-1 +1 -1

-1 +1 +1

+1 -1 -1

+1 -1 +1

+1 +1 -1

+1 +1 +1

-α

0 0

+α

0 0

0 0 0

Planejamento

Fatorial 2

Pontos Axiais

2.K

Pontos Centrais

Figura 3.1 – Esquema do planejamento composto central.

Neste planejamento experimental foram realizados experimentos para verificar a

influência de três variáveis no processo de biodegradação do óleo diesel por uma cultura

mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS). As variáveis mais significativas

neste processo foram:

 X

– Concentração de óleo diesel (%);

 X

– Concentração de nitrogênio (NH

Cl em g/L) e,

 X

– Concentração de biosurfactante (%).

Os valores destas variáveis foram obtidos através de testes preliminares apresentados

na seção 3.7 e também por consulta bibliográfica.

Os níveis das variáveis estudadas foram colocados na forma codificada

(adimensionalizada), utilizando as seguintes equações de codificação:

Equação geral:

()

+−

−

(3.1)

Onde: orma codificada;

X é o valor real da variável a ser calculado;

Xn é o valor da variável no experimento na f

é o valor real da variável no ponto central;

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 49

é o valor real da variável no nível superior;

- Percentagem de óleo diesel:

-1

é o valor real da variável no nível inferior.

1, 0%

(%) 1,5%OD

−

= (3.2)

- Concentração de NH

Cl:

(/)3,0(/)

2,0( / )

Ng L gL

−

= (3.3)

- Percentagem de biosurfactante:

(%) 0,03%

0,023%

−

= (3.4)

O valor de α = 1,287 foi calculado para que o PCC fosse ortogonal, isto é, um

planejam l e os parâmetros estimados

não são correlacionados entre si [BOX et al., 1978].

i calculado através da seguinte equação:

ento onde a matriz de variância e covariância é diagona

O valor de α, fo

1/4

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

(3.5)

onde ,

()

1/2

QGT G

⎡⎤

= 2k + número de réplicas

centrais.

Abaixo, na Tabela 3 processo e seus respectivos

valores, de acordo com seus níveis: inferior, central e superior.

Variá p so.

NÍVEIS

−

⎣⎦

G = número de pontos fatoriais (G = 2

, se completo);

T = número de pontos adicionais no PCC; T

.2, estão relacionadas as variáveis do

Tabela 3.2 - veis do roces

Variáveis Descriminação

- α

-1 0 +1

+ α

Óleo Diesel (%) 0,213 0,5 1,5 2,5 2,787

Biosurfactante (%) 0 0,007 0,03 0,053 0,06

Nitrogênio - NH

Cl (g/L) 0,426 1,0 3,0 5,0 5,6

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 50

Na Tabela 3.3, temos a matriz do planejamento apresentando os valores codificados

e reais das variáve

Tabe .3 – Mat o pla

VARIÁVEIS DIFICA VARIÁVEIS REAIS

is.

la 3 riz d nejamento

CO DAS

Experimento OD OD ) NH

/L) N BS (% Cl (g BS(%)

-1 -1 -1 0,5 1,0 0,007

-1 -1 +1 0,5 1, 0,053

-1 +1 -1 0,5 5,0 0,007

-1 +1 +1 0,5 5,0 0,053

+1 -1 -1 2,5 1,0 0,007

+1 -1 +1 2,5 1,0 0,053

+1 +1 -1 2,5 5,0 0,007

+1 +1 +1 2,5 5,0 0,053

0 0 ,213 3,0 0,03

0 0 ,787 3,0 0,03

0 1,5 ,426 0,03

+ α

0 1,5 5,6 0,03

0 0

- α

1,5 3,0 0,00

0 0

+ α

1,5 3,0 0,0

0 0 0 1,5 3,0 0,03

Legenda: Óleo diesel (OD); Cloreto de amônio (NH

Cl); Biosurfactante (BS)

capacidade,

de anaerobiose. Aos frascos tipo penicilina foram adicionados:

3.8.1 – AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE ÓLEO DIESEL

Os experimentos foram realizados em frascos tipo penicilina de 50 mL de

vedados com tampas de borracha e lacres metálicos a fim de garantir a condição

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 51

 40 mL de meio Postgate E modificado sem ágar-agar e sem lactato de sódio,

 rfactante, nas concentrações correspondentes a cada

reparado com três dias de antecedência e colocado

C, por um período de 30 dias.

role abiótico para contabilizar as perdas

naturais.

, foram analisadas as

seguintes respostas:

 Remoção de Hidrocarboneto Total de Petróleo (TPH);

 Quantificação de bactérias redutoras de sulfato por NMP;

 Quantificação de bactérias anaeróbias por NMP;

Consumo de sulfato;

Produção de sulfeto total.

alho estão descritas no final deste

capítulo.

pelo método dos mínimos quadrados, para cada uma das

resposta

sendo ajustada a concentração de NH

Cl de cada experimento no preparo do

meio;

 1 mL de tioglicolato de sódio (12,4 g/L);

Óleo diesel e biosu

experimento;

 Inóculo aclimatado que foi p

em estufa a 30 ± 1

Os frascos foram então dispostos em uma mesa agitadora a 150 rpm, na temperatura

de 25 – 28

Visando uma maior confiabilidade nos resultados obtidos, foram realizadas réplicas

para cada experimento, e ainda, foi feito o cont

Após decorridos 30 dias de incubação, para cada condição



As metodologias analíticas utilizadas neste trab

3.8.2 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS RESPOSTAS

A análise estatística dos dados foi feita utilizando o programa Statistica 5.1

, a partir

da análise de regressão múltipla,

s, tendo como parâmetros, os termos isolados, de interação e quadráticos das três

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 52

variáveis estudadas. A equação empírica de 2ª ordem proposta para representar cada uma das

resposta e

+ hX

+ iX

+ jX

(3.6)

a,b,c,...j = constantes ou parâmetros da equação;

s não relevantes quando p superior a 10%. Os parâmetros

não sign

cesso. O valor do R

e a

comparação entre F calculado e F tabelado foram utilizados para constatação da significância

ou não d

Com o objetivo de verificar o comportamento da resposta estudada, isto é, se ela

apresenta ponto de máximo, de mínimo ou não apresenta nem ponto de máximo e n

mínimo escobrir o ponto estacionário.

Os pontos estacionários são obtidos através da derivada da equação da resposta Y

pela variável X

, isto é:

s s gue a seguinte forma:

Y = β

+ aX

+ bX

+ cX

+ eX

+ fX

+ gX

endo:

Y = resposta estudada;

= valor médio da resposta;

= porcentagem de óleo diesel (%);

= concentração de NH

Cl (g/L);

= porcentagem de biosurfactante (%).

A esta equação foram aplicados os resultados obtidos e feita uma avaliação

estatística da estimação dos parâmetros através dos valores de t de Student para cada um,

sendo eliminados aqueles com nível de significância (p) superior a 10%, ou seja, as variáveis

relacionadas a estes são considerada

ificativos foram eliminados, obtendo-se assim, uma equação que representa os efeitos

das variáveis na biodegradação do óleo diesel e que determina qual delas mais afeta a

resposta. Pode-se ainda, prever qual a melhor condição para este pro

o modelo [FELIPE, 1999].

em de

(ponto de sela) é necessário d

12 k

XX X∂∂ ∂

... 0

====

(3.7)

YY Y∂∂ ∂

sendo, Y = b

+ x’b + x’Bx

bxbxBxb Bx

∂∂

⎡⎤

=++=+

⎣⎦

∂∂

(3.8)

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 53

onde, b

é o termo independente;

x’b são os termos de 1ª. ordem na função de resposta;

x’Bx é a contribuição quadrática.

Então, o ponto estacionário será dado por: x

= - (1/2) B

-1

b, onde B é a matriz (k x k)

na qual a d tes dos termos quadráticos da equação e os

termos fora da diagonal são correspondentes aos coeficientes das interações divididos por 2

(ex: a

e A matriz b é uma matriz coluna

compost e iáveis lineares).

point”).

ja fora da região experimental.

Para determinar a natureza desse ponto estacionário foi necessário fazer uma análise

canônica, que considera uma translação da superfície de resposta da origem (X

, X

, ... , X

) =

(0, 0, ... , 0) para o ponto estacionário x

(Figura – 3.2) . Daí a função de resposta é formulada

em term

, w

, ... , w

Figura 3.2 – Translação da superfície de resposta da origem para o ponto estacionário.

iagonal é composta pelos coeficien

correspondem ao coeficiente da interação X

a p los coeficientes associados às variáveis isoladas (var

O ponto estacionário (x

) pode ser:

 Um ponto onde a superfície atinge um máximo;

 Um ponto onde a superfície atinge um mínimo, ou

 Um ponto nem de máximo, nem de mínimo ⇒ Ponto de sela (“saddle

orém, podem existir problemas relacionados a estes pontos estacionários:

 Pode existir uma região de máximo e não um ponto de máximo;

 Pode ser que o ponto estacionário este

os de novas variáveis, w

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 54

Então, obtêm-se a função de resposta em termos das novas variáveis:

(3.9)

, λ , ... , λ são constantes.

ovimentamos em qualquer direção a partir do

ponto es

sinais diferentes, o ponto estacionário x

não é nem ponto de máximo, nem de mínimo.

realizados utilizando um algoritmo implementado

no software Maple V Release 4

(ver Apêndice B).

rabalho foi utilizado um efluente sintético nas condições favoráveis

ao cres

orrespondentes à remoção de hidrocarboneto

total de petróleo (TPH).

Este efluen io Postgate E modificado sem ágar-agar,

sem lactato de sódio; concentração de óleo diesel de 1,15%, concentração de NH

Cl de 2,92

g/L e co n

c te efluente foi realizada empregando as seguintes análises:

011 22

...Yy w w

λλ

=+ + ++

onde:

: é a resposta estimada no ponto estacionário e,

1 2 k

Os sinais dos λ’s e a grandeza dos λ’s ajudam a determinar a natureza do ponto

estacionário e, a relação entre os w’s e os x’s também são importantes pois indicam ao

pesquisador regiões úteis para exploração.

Se λi < 0, sendo i = 1,2,...,k, quando m

tacionário, teremos um decréscimo de Y, isto é, o ponto estacionário x

é um ponto de

resposta máxima da superfície ajustada. Se λi > 0, o ponto estacionário x

é um ponto de

mínimo para a superfície ajustada e, se os λ’s têm

A obtenção dos pontos estacionários e a análise canônica dos dados para cálculo dos

pontos de maximização das respostas foram

3.9 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EFLUENTE SINTÉTICO DO

BIORREATOR

Durante todo o t

cimento microbiano e à biodegradação do óleo diesel. Nesta etapa, após o

planejamento experimental, realizou-se a caracterização físico-química do efluente sintético

com as concentrações das variáveis otimizadas c

te sintético era composto por: me

nce tração de biosurfactante de 0,06%.

A aracterização des

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 55

 Demanda Química de Oxigênio (DQO);

DBO);

 Determinação de Fósforo;

 Determinação de Enxofre no Óleo Diesel;

o um biorreator de bancada de 2L de

capacidade. Durante o experimento foi realizado um teste controle visando avaliar as perdas

abióticas, acrescentando 1% de azida sódica para inibir o crescimento microbiano.

O biorreator possuía portes para purga de nitrogênio, adição de inóculo, retirada de

amostras, retirada do gás produzido no reator e medição de pH (por meio de eletrodo

potencio

3.10.1 – CONDIÇÕES REACIONAIS NO BIORREATOR

ental e a otimização das variáveis

do processo de biodegradação, obtiveram-se as condições ótimas de remoção de TPH:

 1,15% (v/v) de Óleo Diesel;

 2,92 g/L de NH

Cl;

 0,06% (v/v) de Biosurfactante Raminolipídeo.

 Demanda Bioquímica de Oxigênio (

 Óleos e graxas;

 Determinação de Sulfato;

 Determinação de Nitrogênio Total;

 Hidrocarbonetos Totais de Petróleo (TPH).

3.10 – CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO NO BIORREATOR

Após o estudo estatístico do planejamento experimental e de posse dos valores

ótimos da remoção de hidrocarboneto de petróleo (TPH) estudou-se a cinética de

biodegradação do óleo diesel em escala maior, utilizand

métrico), conforme apresentado na Figura 3.3.

Com o estudo estatístico do planejamento experim

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 56

Figura 3.3 – Biorreator utilizado na cinética de biodegradação de óleo diesel.

3.10.2 – COMPOSIÇÃO DO MEIO REACIONAL

No biorreator de 2L de capacidade, ocupou-se 1,5 L de volume útil, adicionando-se:

 1278 mL de meio Postgate E modificado, sem ágar-agar, sem lactato de sódio e

com ajuste da concentração de NH

CL de 2,92 g/L; previamente autoclavado a 1

atm por 20 minutos;

 17,25 mL de óleo diesel;

 0,92 mL de biosurfactante raminolipídeo;

 37,5 mL de tioglicolato de sódio (12,4 g/L);

 150 mL de inóculo reaclimatado nas condições ótimas de remoção de

hidrocarboneto total de petróleo, inoculado e incubado a 30 ± 1

C, três dias antes

da partida do reator.

3.10.3 – OPERAÇÃO DO BIORREATOR

O biorreator foi operado à temperatura ambiente de 25 ± 2

C disposto em mesa

agitadora da marca Certomat® MO (B. Braun Biotech International) numa rotação de 120

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 57

rpm e com controle de pH em torno de 7 com o auxílio de um eletrodo potenciométrico, da

marca GEHAKA - modelo PG2000, sendo ajustado, quando necessário, com NaOH 1N.

Antes da adição do inóculo, e ao longo de todo o processo, purgas de nitrogênio

foram feitas para garantir a condição de anaerobiose e para arraste do H

S produzido, para

posterior quantificação.

O inóculo foi transferido para o biorreator com o auxílio de seringas, assim como o

óleo diesel, o biosurfactante e o tioglicolato de sódio; sempre sob purga de nitrogênio.

O biorreator foi monitorado através de análises de:

 Hidrocarboneto Total de Petróleo (TPH);

 Sulfeto Total, produzido tanto na forma gasosa como dissolvido na fase líquida.

Na fase gasosa foi coletado, através de arraste por purga de N

, em dois frascos

borbulhadores em série contendo, cada um, 10 mL de solução de hidróxido de

cádmio. Na fase líquida foram coletados 2 mL de amostra para análise em

duplicata;

 Quantificação inicial e final de bactérias anaeróbias;

 Quantificação inicial e final de bactérias redutoras de sulfato.

As amostras para TPH e sulfeto na fase líquida foram coletadas a cada dois ou três

dias. A quantificação do sulfeto na fase gasosa foi realizada sempre que se formava

precipitado amarelo, correspondente à formação de sulfeto de cádmio, nos frascos

borbulhadores. Todas as análises foram feitas em duplicata, exceto a quantificação de sulfeto

na fase gasosa.

O tempo de processo foi de 38 dias sendo determinado pela produção de sulfeto que

é um indicativo da atividade das bactérias redutoras de sulfato.

3.11 – METODOLOGIA ANALÍTICA

Os métodos analíticos empregados na caracterização do efluente sintético, na

padronização da cultura microbiana e, no monitoramento dos experimentos do planejamento

experimental e da cinética de biodegradação estão descritos a seguir.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 58

3.11.1 – DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO – DQO

A análise de Demanda Química de Oxigênio (DQO) foi realizada através do método

de oxidação por dicromato de potássio em meio ácido, empregando o procedimento descrito

no STANDARD METHODS, 5210 D1995.

3.11.2 – DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO – DBO

Para a determinação da Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) foi utilizado o

Método de incubação (20

C, cinco dias) – NBR 12614.

3.11.3 – ÓLEOS E GRAXAS

A determinação de óleos e graxas foi realizada pelo método de partição gravimétrica

para óleos e graxas adaptado para determinação de hidrocarbonetos [MACÊDO, 2003].

3.11.4 – SULFETO TOTAL

A concentração de sulfetos totais foi determinada através da adaptação do método

colorimétrico para dosagem de gás sulfídrico [JACOBS et al., 1957; APHA, 1992].

Com o intuito de solubilizar os compostos de sulfeto insolúveis, adicionava-se 1 mL

de ácido clorídrico concentrado, com o auxílio de uma seringa, a 1 mL de amostra contida em

um frasco tipo penicilina vedado com tampa de borracha e lacre metálico. O frasco era então

aquecido em banho a 70

C por 10 minutos.

O gás sulfídrico formado, pela reação do sulfeto presente com o ácido clorídrico

adicionado, era coletado através de purga de gás inerte (nitrogênio) em dois borbulhadores

acoplados em série, cada um contendo 10 mL de solução de hidróxido de cádmio. Há a

formação de precipitado amarelo correspondente ao sulfeto de cádmio, cuja intensidade da

coloração está relacionada à concentração de sulfeto presente na amostra.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 59

Para a dosagem do sulfeto, juntava-se o conteúdo dos dois borbulhadores,

adicionava-se 0,6 mL de ácido aminosulfúrico e transferia-se para balão volumétrico de 25

mL. Após a adição de 2 gotas de indicador cloreto férrico, completava-se o volume com água

destilada e deixava-se em repouso por 30 minutos.

As leituras das absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro da marca Genesys,

no comprimento de onda de 670 nm. Determinava-se a concentração de sulfeto através da

curva de calibração anteriormente preparada com diluições de uma solução-mãe preparada

com Na

S. 9H

O P.A, da marca Vetec. A curva de calibração encontra-se no Apêndice C

deste trabalho.

3.11.5 – DETERMINAÇÃO DE SULFATO

A determinação do sulfato foi feita utilizando-se o kit de dosagem Sulfaver da marca

HACH [VIEIRA, 2003].

Os íons sulfato reagem com o bário contido no kit de dosagem, formando um

precipitado de sulfato de bário. A turbidez do meio é proporcional à quantidade de sulfato

presente na amostra. A leitura foi realizada em espectrofotômetro da marca Genesys, no

comprimento de onda de 450 nm. A curva de calibração encontra-se no Apêndice D deste

trabalho. Esta curva não passa pela origem devido ao erro experimental quando a análise é

realizada para concentrações de sulfato muito baixas.

3.11.5.1 – DETERMINAÇÃO DE SULFATO EM ÓLEO DIESEL

A determinação do sulfato presente no óleo diesel foi realizada utilizando a

metodologia descrita a seguir.

O óleo diesel foi inicialmente aquecido em placa aquecedora a aproximadamente

150

C, até que este secasse completamente. Posteriormente, foi adicionado 10 mL de HCl 4N

para que houvesse a solubilização do sulfato presente no resíduo da secagem.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 60

Após a solubilização, determinou-se a concentração de sulfato presente na suspensão

utilizando-se o kit de dosagem Sulfaver da marca HACH [VIEIRA, 2003], conforme descrito

no item 3.11.4.

3.11.6 – DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO TOTAL

O fósforo foi determinado por método colorimétrico por redução com ácido

ascórbico (NBR – 12772/1992), que permite a determinação de formas específicas de

compostos fosforados, em águas naturais e de despejos. O método é usado numa faixa de 0,01

a 0,5 mg/L de fósforo. Esta faixa aplica-se a medidas fotométricas efetuadas a 880 nm em

células de 20 a 25 mm. Altas concentrações também podem ser determinadas por diluição da

amostra ou pela medição da cor em 625 a 650 nm.

O método tem como princípio a formação de um complexo de antimônio-fosfato-

molibdato, pela reação do molibdato de amônio e do tartarato de potássio e antimônio com o

ortofosfato. Este complexo é reduzido com ácido ascórbico para formar uma coloração azul

característica do complexo de molibdênio. A intensidade da cor é proporcional à concentração

de fósforo.

A curva padrão da determinação de fósforo total utilizada neste trabalho está

apresentada no Apêndice E.

3.11.7 – DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO TOTAL (KJELDAHL)

O método Kjeldahl foi usado na determinação de nitrogênio total, que consiste na

soma do nitrogênio orgânico e nitrogênio amoniacal. O método aplica-se em amostras de água

de abastecimento público, águas residuárias e efluentes domésticos, conforme descrito no

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (1998).

A amostra é aquecida em presença de ácido sulfúrico concentrado, sulfato de

potássio e sulfato de cobre, evaporada até o aparecimento de fumaças de SO

e total

decomposição da matéria orgânica. O resíduo líquido era alcalinizado e passava pela

destilação da amônia presente e posterior titulação.

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 61

3.11.8 – DETERMINAÇÃO DE HIDROCARBONETO TOTAL DE PETRÓLEO

(TPH)

A dosagem de TPH é feita utilizando-se o solvente S-316 para extrair o óleo da

amostra e um espectrofotômetro de infravermelho (equipamento OCMA-350), no qual é

realizada a leitura da amostra [HORIBA, 1995].

Essa metodologia é adequada para medir hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos,

independente de sua faixa de carbono. A luz emitida na faixa do infravermelho é usada para

irradiar o extrato e medir a concentração de TPH. A análise de infravermelho utilizada para

medir TPH envolve medidas de absorbância, visto que as ligações carbono-hidrogênio nos

hidrocarbonetos absorvem luz na faixa do infravermelho.

Durante a análise, absorbâncias associadas com as configurações CH, CH

e CH

são

medidas em um comprimento de onda próximo de 3,4 µm. O equipamento opera numa faixa

de comprimento de onda de 3,38 a 3,50 µm, sendo capaz de medir as configurações CH (3,38

µm), CH

(3,42 µm) e CH

(3,50 µm) e possui o software para converter as medições em teor

total de hidrocarboneto [U.S EPA, 2001].

Para análise foram utilizados 10 mL de amostra de efluente e adicionado ácido

clorídrico para levar o pH para valor igual ou inferior a 2,0. Posteriormente, os TPH foram

extraídos utilizando o solvente S-316. A leitura foi feita no equipamento OCMA-350,

devidamente calibrado.

3.11.9 – QUANTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA

3.11.9.1 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

A quantificação das bactérias redutoras de sulfato foi feita pela técnica do número

mais provável (NMP) [HARRISON JR., 1982] utilizando meio Postgate E modificado,

conforme já citado, com diluições sucessivas em solução redutora.

A solução redutora tem a seguinte composição: 0,1 g/L de ácido ascórbico; 4 mL/L

de rezarsurina e 0,124 g/L de tioglicolato de sódio com ajuste de pH em 7,6. O meio Postgate

E modificado apresenta a mesma composição citada na Tabela 3.1. Ambos os meios foram

Capítulo 3 – Materiais e Métodos 62

distribuídos em volumes de 9 mL para frascos tipo penicilina de 10 mL de volume útil, sob

purga de nitrogênio, e então foram vedados com tampas de borracha e lacres metálicos, a fim

de garantir a condição de anaerobiose. Posteriormente, foram autoclavados a 1 atm por 20

minutos para esterilização.

Foram realizadas diluições decimais sucessivas, todas em triplicata, com o uso de

seringas. Retirava-se 1 mL da cultura, inoculava-se na solução redutora e desta retirava-se 4

mL para inocular 1 mL em cada frasco da triplicata de meio Postgate correspondente a

primeira diluição e 1 mL na solução redutora da próxima diluição. Este procedimento deve ser

realizado até a diluição desejada, trocando-se a seringa a cada diluição. Neste trabalho,

utilizou-se diluição até 10

. Aos frascos contendo meio Postgate foi adicionado 0,1 mL de

solução de tioglicolato de sódio (12,4 g/L) antes da inoculação.

Após inoculação, os frascos foram incubados em estufa a 30 ± 1

C por 28 dias. Ao

final deste período o crescimento das BRS foi visto através da formação de precipitado negro

de FeS, que resulta da reação de H

S, gerado através do metabolismo das BRS, com o

FeSO

.7H

O presente no meio Postgate.

3.11.9.2 – BACTÉRIAS ANAERÓBIAS

Este grupo de bactérias foi quantificado pela técnica do número mais provável

(NMP) [HARRISON JR., 1982] utilizando meio fluido ao tioglicolato (MERK), após

diluições decimais sucessivas em solução redutora. O procedimento de inoculação foi o

mesmo utilizado para as bactérias redutoras de sulfato.

Após inoculação, os frascos foram incubados em estufa a 30 ± 1

C por 28 dias. O

crescimento dessas bactérias foi observado através da turvação do meio.

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÃO

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA

A cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato utilizada neste

trabalho foi inicialmente aclimatada, conforme descrito na seção 3.6. Este procedimento

visava adaptar lentamente a cultura microbiana a concentrações crescentes de óleo diesel, para

assim selecionar os microrganismos capacitados e com maior potencial para biodegradar as

frações de hidrocarbonetos constituintes do óleo diesel.

A Tabela 4.1 apresenta o crescimento da cultura microbiana no meio Postgate E

modificado [POSTGATE, 1984] contendo diferentes concentrações iniciais de óleo diesel. O

crescimento foi observado pelo escurecimento do meio pela formação de precipitado negro de

FeS, após uma semana de incubação em estufa a 30 ± 1

C. O critério de aumento da

concentração de óleo diesel empregado foi relacionado com o crescimento da cultura; caso

fosse positivo repicava-se a cultura previamente aclimatada em meio contendo maior

concentração do combustível.

Tabela 4.1 – Ensaio para aclimatação da cultura microbiana a diferentes concentrações de

óleo diesel.

Concentração de Óleo Diesel

(% v/v de contaminante)

Crescimento

0,25% + + +

0,5% + + +

1,0% + + +

2,0% + + +

3,0% + + +

4,0% + + +

5,0% + + +

+ crescimento positivo – observado pela formação de precipitado negro de FeS.

Experimento realizado em triplicata.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 64

Terminada a fase de adaptação da cultura ao óleo diesel, esta foi cultivada em

condição de supressão da fonte de carbono mais facilmente assimilável (lactato de sódio),

constituinte do meio Postgate E modificado. Observou-se que a cultura não só suportou a total

deleção do lactato, mas sobretudo, foi capaz de crescer às custas do óleo diesel, como

principal fonte de carbono e energia, conforme mostra a Tabela 4.2.

Tabela 4.2 – Ensaio para aclimatação da cultura microbiana ao crescimento na ausência de

lactato de sódio.

Concentração de Lactato

de Sódio (50%)

Concentração de Óleo Diesel

(v/v)

Crescimento

50% 5% + + +

0% 5% + + +

+ crescimento positivo – observado pela formação de precipitado negro de FeS.

Experimento realizado em triplicata

Foi observado, durante todo o período de aclimatação, que houve crescimento em

todas as fases, sem efeito inibitório relacionado ao aumento da concentração do óleo diesel e à

ausência de lactato de sódio.

4.2 – TESTE DE SENSIBILIDADE DA CULTURA MICROBIANA AO

BIOSURFACTANTE

Para verificar o efeito do biosurfactante comercial JBR-425 no crescimento da

cultura microbiana, esta foi cultivada na presença de diferentes concentrações do produto

(0,01%; 0,05% e 0,1%).

A Tabela 4.3 mostra a resposta da cultura microbiana às diferentes concentrações de

biosurfactante raminolipídeo, após uma semana de incubação a 30 ± 1

Pode-se observar que aparentemente não houve alteração do metabolismo

microbiano pela adição de biosurfactante até a concentração de 0,05%. Contudo, o

crescimento realizado na presença de 0,1% do raminolipídeo foi diferenciado. Neste caso, o

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 65

cultivo apresentou, ao final do período de incubação, aspecto leitoso de coloração

ligeiramente acinzentada, com alguns poucos pontos pretos. Tal fato sugere ter havido

inativação ou inibição parcial das BRS presentes no consócio microbiano, na concentração de

biosurfactante de 0,1%.

A fim de determinar a ação do biosurfactante na concentração de 0,1%, alíquotas de

0,1 mL de cada um dos três cultivos foram transferidas para 10 mL de meio Postgate E

modificado. Após cinco dias de incubação, foi observado um intenso enegrecimento dos

novos cultivos, indicativo da atividade metabólica das BRS. Por conseguinte, pode-se

concluir que o biosurfactante em uso apresenta efeito inibitório no crescimento de populações

de BRS em concentrações iguais ou superiores a 0,1%.

Tabela 4.3 – Teste de Sensibilidade da Cultura Microbiana ao Biosurfactante.

Concentração de Biosurfactante (%) Crescimento

0 + + +

0,01 + + +

0,05 + + +

0,1 - - -*

* observou-se que o meio ficou acinzentado, leitoso e com alguns pontos pretos.

4.3 – PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO DA CULTURA MICROBIANA

A padronização do inóculo, realizado pela contagem de células presentes no mesmo,

após 3, 5 e 7 dias de incubação a 30 ± 1

C, está relacionado na Tabela 4.4.

Observa-se que praticamente não houve variação no número de bactérias anaeróbias,

no período estudado. E, embora para BRS tenha sido constatado um aumento neste período,

em 3 dias a sua concentração apresentava valor próximo ao das bactérias anaeróbias no

consórcio microbiano. Além disso, verifica-se que após 3 dias de incubação houve diminuição

da velocidade de crescimento, tendo a concentração se mantido na mesma ordem de grandeza.

Assim, adotou-se o tempo de 3 dias de incubação para desenvolvimento dos experimentos

deste estudo. No planejamento experimental foram adotadas como concentrações iniciais de

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 66

células nos reatores: 1,5x10

± 0,5x10

NMP/mL para as bactérias anaeróbias e 2,2x10

0,1x10

NMP/mL para as BRS.

Tabela 4.4 – Valores obtidos na padronização do inóculo da cultura microbiana.

Dias de

incubação*

Número de Bactérias Anaeróbias

(NMP/mL)

Número de BRS

(NMP/mL)

1,5x10

± 0,5x10

2,2x10

± 0,1x10

2,2x10

± 0,1x10

4,2x10

± 0,1x10

2,2x10

± 0,0 7,5x10

± 0,0

* número de dias de incubação do inóculo, antes do procedimento de contagem.

4.4 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

4.4.1 – AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE ÓLEO DIESEL

Conforme descrito no Capítulo 3, definida a matriz do planejamento, foram

realizados os experimentos e analisadas as respostas da biodegradação de óleo diesel. Nesta

etapa foi realizada a otimização do processo de biodegradação em relação às variáveis:

concentração de óleo diesel (OD), concentração de cloreto de amônio (N) e concentração de

biosurfactante (BS). A seguir, serão apresentados os resultados obtidos para as seguintes

respostas: remoção de TPH, quantificação celular de bactérias anaeróbias, quantificação de

bactérias redutoras de sulfato, consumo de sulfato e produção de H

No teste controle, realizado para avaliação das perdas abióticas, o máximo percentual

de remoção de TPH foi de 2,5% (ver Apêndice E). Na quantificação microbiológica não

foram detectados microrganismos, não sendo portanto, observado o consumo de sulfato e nem

a produção de sulfeto.

4.4.2 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS RESPOSTAS

A partir dos resultados obtidos para as respostas analisadas, efetuou-se, para cada

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 67

uma das respostas, uma regressão múltipla, tendo como fatores, os termos isolados, as

interações e os quadráticos das três variáveis estudadas.

4.4.2.1 – REMOÇÃO DE TPH

A Tabela 4.5 apresenta a porcentagem de remoção de TPH de cada experimento do

planejamento experimental. Nestes resultados já foram subtraídas as perdas abióticas,

conforme estão apresentadas no Apêndice F.

Tabela 4.5 – Resultados da remoção de TPH, em diferentes condições experimentais.

Exp. OD (

%v/v) N (g/L) BS (%v/v) TPH Inicial TPH Final % Remoção

1 0,5 1,0 0,007

3900 ± 20 1340 ± 8 65,64 ± 0,06

2 0,5 1,0 0,053

4120 ± 32 1050 ± 10 74,51 ± 0,09

3 0,5 5,0 0,007

3950 ± 15 1270 ± 7 67,85 ± 0,11

4 0,5 5,0 0,053

4060 ± 25 1110 ± 5 72,66 ± 0,09

5 2,5 1,0 0,007

8950 ± 50 4270 ± 12 52,29 ± 0,26

6 2,5 1,0 0,053

9110 ± 62 3540 ± 10 61,14 ± 0,31

7 2,5 5,0 0,007

8980 ± 33 3920 ± 11 56,34 ± 0,07

8 2,5 5,0 0,053

9070 ± 55 3170 ± 8 65,05 ± 0,25

9 0,213 3,0 0,03

3210 ± 25 995 ± 5 69,00 ± 0,17

10 2,787 3,0 0,03

9980 ± 68 4075 ± 15 59,19 ± 0,25

11 1,5 0,426 0,03

6510 ± 44 2120 ± 10 67,43 ± 0,13

12 1,5 5,6 0,03

6620 ± 21 2030 ± 5 69,33 ± 0,05

13 1,5 3,0 0,00

6370 ± 38 2220 ± 7 65,15 ± 0,20

14 1,5 3,0 0,06

6680 ± 42 1395 ±

5 79,13 ± 0,11

15 1,5 3,0 0,03

6450 ± 50 1645 ± 10 74,50 ± 0,09

16 1,5 3,0 0,03

6530 ± 45 1520 ± 10 76,72 ± 0,02

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 68

Foi observado que a variação das concentrações de óleo diesel (X

), NH

Cl (X

) e

biosurfactante (X

) resultou em cerca de 52 a 79% de remoção de TPH (Tabela 4.5).

Comparando os resultados verifica-se que o aumento na concentração de cloreto de amônio de

0,426 para 5,6 g/L (experimentos 11 e 12), para as diferentes proporções óleo diesel e

biosurfactante estudadas, não provocou alteração significativa na remoção de TPH. No

entanto, o aumento da concentração de biosurfactante favoreceu a biodegradação do óleo

diesel, sendo necessária uma concentração tanto maior quanto maior a concentração de óleo

diesel. Tal comportamento foi confirmado para os ensaios realizados na concentração

intermediária de OD de 1,5% (experimentos 13 a 16). Esses resultados demonstram a

importância da otimização destas variáveis para intensificar a biodegradação anaeróbia de

óleo diesel.

Após a realização da regressão múltipla no programa Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

REMOÇÃO DE TPH = 74,699 – 5,169X

+ 0,952X

+ 4,350X

– 5,999X

–

3,406X

– 1,139X

+ 0,951X

+ 0,484X

– 0,526X

(4.1)

A Tabela 4.6 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da remoção de

TPH.

Tabela 4.6 – Resultados da regressão múltipla para remoção de TPH.

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

73,89 0,00000

(OD) - 5,17 0,00007

(BS) 4,35 0,000033

(OD

) - 6,00 0,000048

) - 3,41 0,003763

= 0,94 F

= 40,87 F

(0,01) = 5,95

Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância do teste t

de Student superiores a 10%, sendo as variáveis relacionadas a estes consideradas não

relevantes. Assim, foram desprezados o termo isolado da concentração de cloreto de amônio

), o termo quadrático da concentração de biosurfactante (X

) e as interações concentração

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 69

de óleo diesel/concentração de cloreto de amônio (X

), concentração de óleo

diesel/concentração de biosurfactante (X

) e concentração de cloreto de

amônio/concentração de biosurfactante (X

A Tabela 4.6 mostra as variáveis que influenciam na remoção de TPH. Analisando

esta tabela verifica-se que a combinação de menores concentrações de óleo diesel e maiores

concentrações de biosurfactante resultaram numa melhor remoção de TPH.

O coeficiente de correlação (R

) de 0,94 indica um ajuste adequado dos dados

experimentais na resposta de remoção de TPH, mostrando que 94% da variabilidade dos

dados foram explicados pela equação empírica proposta.

O resultado de F calculado (Fc) foi superior ao F tabelado (F

) para um nível de

significância de 1%. Esta comparação pode ser interpretada através de um teste de hipótese. A

hipótese de nulidade (H

) diz que o modelo não é significativo, ou seja, todos os parâmetros

são iguais a zero. A hipótese alternativa (H

) afirma que o modelo é significativo. O resultado

do teste F mostrou que se pode rejeitar H

no nível de significância de 1%, ou seja, tem-se

uma confiança de 99% que o modelo é significativo. Esta análise foi extrapolada para as

demais respostas obtidas neste planejamento experimental.

A Figura 4.1 mostra a distribuição dos resíduos em torno do zero e a Figura 4.2, a

representação dos valores preditos versus observados.

52.5 55.0 57.5

60.0

62.5 65.0 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 80.0

Valores Preditos para Remoção de TPH

-4

-3

-2

-1

Resíduos

Figura 4.1 – Distribuição dos resíduos relativa à remoção de TPH.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 70

50.0 52.5 55.0 57.5 60.0 62.5 65.0 67.5 70.0 72.5 75.0 77.5 80.0

Valores Preditos para Remoção de TPH

50.0

80.0

77.5

57.5

60.0

62.5

65.0

67.5

70.0

72.5

75.0

Valores Observados

52.5

55.0

Figura 4.2 – Valores preditos em função dos observados relativos à remoção de TPH.

Observando a Figura 4.1, vê-se que a distribuição dos resíduos comportou-se

aleatoriamente em torno do zero, não apresentando nenhuma tendência quanto à distribuição.

Na Figura 4.2, nota-se que as respostas experimentais para remoção de TPH apresentaram

valores bem próximos aos fornecidos pela equação empírica.

Após a eliminação dos parâmetros não significativos, conforme apresentado na

Tabela 4.6, obteve-se a seguinte equação:

REMOÇÃO DE TPH = 73,894 – 5,169X

+ 4,350X

– 6,00X

– 3,406X

(4.2)

6, e 3 e 7 em que houve uma diminuição de remoção de 20, 18 e 17%

de TPH,

16%, respectivamente, com o aumento da concentração do biosurfactante. O sinal negativo da

variável X

1 3

provado pela comparação dos resultados dos

experim pectivamente. Observa-se nos experimentos 11 e 12, que a

concentr o contribuiu significativamente para a variação na

remoção de TPH, justificando a não inclusão desse termo na Equação 4.2 que apresenta o

modelo ajustado.

Analisando esta equação, pode-se observar pelos coeficientes das variáveis X

e X

que a concentração de óleo diesel influenciou mais significativamente na remoção de TPH.

Este fato pode ser confirmado pela comparação dos resultados de remoção obtidos nos

experimentos 1 e 5; 2 e

respectivamente, com o aumento da concentração de óleo diesel. Em relação aos

experimentos 1 e 2; 3 e 4 e, 5 e 6 observa-se que houve um aumento de remoção de 13, 7 e

e positivo de X pode ser com

entos 9 e 10 e 13 e 14, res

ação de cloreto de amônio nã

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 71

reto de amônio e de biosurfactante.

lado, a biodegradação de água de produção de petróleo por consórcio

microbiano anaerób

partir da equação completa (Eq. 4.1) foi feita a implementação de um algoritmo no

programa Maple V release 4 para calcular o ponto estacionário para remoção de TPH. As

coordenadas x

= - 0,35; x

= - 0,04 e x

= 1,287, representam os valores codificados que

maximizam a resposta.

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4) obtêm-se os valores reais

das concentrações das variáveis no ponto de maximização da remoção de TPH:

= 1,15% de óleo diesel;

= 2,92g/L de NH

Cl;

= 0,06% de biosurfactante.

A partir dos valores codificados das variáveis X

, X

e X

no ponto de máximo,

determinou-se que o percentual de remoção de TPH neste ponto foi de 80,56%. Comparando

este valor com a percentagem de remoção de TPH no experimento 14, quando foi obtida

maior remoção (79,13%), verifica-se que os resultados foram semelhantes. Isto era previsto,

já que os valores, correspondentes às concentrações das variáveis do processo no ponto de

otimização, estão próximos àqueles do experimento 14, principalmente com relação às

concentrações de clo

Os resultados dos experimentos 15 e 16 mostram que para concentrações no ponto

central os valores de remoção de TPH (74,50% e 76,72%, respectivamente) foram próximos

ao valor obtido no ponto de maximização (80,56%).

Em geral, as informações existentes a cerca de tratamentos biológicos de rejeitos

tratam de processos conduzidos em condição aeróbica, em vista do alto percentual de

remoção em tempo reduzido. Truax et al. (1995), em estudo desenvolvido em biorreator

contínuo de bancada, para tratamento aeróbio de solo contaminado com óleo diesel obtiveram

remoção de TPH de 91,2% após 63 dias de retenção. Tellez et al. (2002), utilizando um

sistema com lodo ativado, alcançaram remoções de 98 – 99% para tempo de retenção de

sólidos de 20 dias.

Por outro

io em diferentes condições de operação resultou em remoções de óleos e

graxas de 34 a 62%, para tempos de 15 dias [VIEIRA et al., 2005].

Pode-se notar que o tratamento anaeróbio realizado neste trabalho ainda apresenta

resultado inferior aos obtidos por estes autores, em processos aeróbios. Sabe-se que o

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 72

metabolismo aeróbio age de forma mais rápida e com maiores remoções na biodegradação de

hidrocarbonetos, porém com a otimização do processo anaeróbio e com o estabelecimento de

condiçõe

No entanto, os tratamentos anaeróbios podem ser também vantajosos uma vez que

apresentam baixo custo operacional em função de não requerem oxigênio, baixo consumo de

energia e geram pouca quantidade de biomassa. Logo, em termos da relação custo/benefício,

ção forem alcançados, através de estudos que permitam otimizar as

condições de processo.

ção de TPH,

estão apresentadas nas Figuras 4.3, 4.4 e 4.5 as superfícies de resposta relacionando as

variáveis duas a duas com a resposta.

s mais favoráveis ao metabolismo dos microrganismos anaeróbios pode-se conseguir

alcançar maiores percentuais de degradação. Obviamente, estes resultados são superiores

comparativamente aos levantados neste estudo para biodegradação anaeróbia de

hidrocarbonetos.

o processo anaeróbio poderá ser uma opção mais adequada, principalmente se maior

percentuais de remo

Como forma de ilustrar os efeitos das variáveis na biodegradação do óleo diesel pela

cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato com relação à remo

71.5

60.5

49.5

Figura 4.3 – Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações de

leo diesel e NH

Cl.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 73

A Figura 4.3 mostra que para os valores de concentração de óleo diesel abaixo

ponto ce tral (- 0,35 o

u 1,15%), assim como para valores de concentração de NH

próximos ao ponto central (- 0,04 ou 2,92 g/L), há aumento de remoção de TPH.

71.5

60.5

49.5

Figura 4.4

óle

– Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações de

o diesel e biosurfactante.

71.5

68.3571

65.2143

62.0714

58.9286

Figura 4.5 – Superfície de resposta para remoção de TPH em função das concentrações de

Cl e biosurfactante.

.7857

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 74

A Figura 4.4 apresenta as variáveis que mais enciaram e que

para val abaixo do ponto central e para maiores

quantida

oncentrações do biosurfactante, tendendo para + α,

a remoçã

influ na remoção. Nota-s

ores na concentração de óleo diesel pouco

des de biosurfactante tendendo para o ponto + α (+1,287 ou 0,06%) a remoção de

TPH aumenta.

Analisando a Figura 4.5 observa-se que para valores de concentração de NH

próximos do ponto central e para maiores c

o de TPH é maior.

4.4.2.2 – QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO

A Tabela 4.7 mostra a média dos resultados obtidos na quantificação de bactérias

redutoras de sulfato para cada experimento do planejamento experimental. Os valores obtidos

nas análises em triplicata estão apresentados no Apêndice G.

Tabela 4.7 – Resultados da quantificação de bactérias redutoras de sulfato por NMP, nas

condições de cada experimento.

Exp. OD(

%v/v) N (g/L) BS (%v/v) BRS (NMP/mL)

1 0,5 1,0 0,007

1,5x10

± 0,5x10

2 0,5 1,0 0,053

1,2x10

± 0,1x10

3 0,5 5,0 0,007

2,2x10

± 0,1x10

4 0,5 5,0 0,053

3,3x10

± 0,3x10

5 2,5 1,0 0,007

2,1x10

± 0,1x10

1,2x10

± 0,1x10

12 1,5 5,6 0,03

7,2x10

± 0,2x10

± 0,0

1,5 3,0 0,03

2,3x10

± 0,3x10

8 8

2,5 1,0 0,053

9,2x10

± 0,2x10

7 2,5 5,0 0,007

4,6x10

± 0,0

8 2,5 5,0 0,053

3,3x10

± 0,3x10

9 0,213 3,0 0,03

7,2x10

± 0,2x10

10 2,787 3,0 0,03

9,5x10

± 0,0

11 1,5 0,426 0,03

1,5 3,0 0,00

4,3x10

± 0,0

14 1,5 3,0 0,06

1,1x10

1,5 3,0 0,03

2,0x10

± 0,0

10 10

Concentração inicial de BRS = 1,5x10

NMP/mL.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 75

Em todas as condições testadas houve aumento da população de BRS, demonstrando

a capacidade destes microrganismos em utilizar óleo diesel como fonte de carbono e energia.

No entan

mento, conforme as condições operacionais, no

decorrer de 15 dias [VIEIRA et al., 2005]. Observa-se que neste trabalho foi observado um

maior crescim eses) e

portanto, esta já estava bem adaptada às condições experimentais.

Pode-se verificar que o aument ção da o também não

foi relevante pa to da po BRS, sobret 0,5 e 1,5% OD,

indicando que a quantidade mínima de N

da foi suficie r a demanda

de nitrogênio pelas bactérias. Nas ma rações de ó l estudadas (2,5 e

2,787%) foi evide enor cresci possivelmente está relacionado com a

limitação de outro nutriente e/ou devido e pelos produ ltantes do processo

de biodegradação, em relações C/N, alta ou baixa ncentração do

biosurfactante (experimentos 9 e 10) praticamente não houve variação do número de BRS.

ção de TPH (79,13%) e maior crescimento de BRS (1,1x10

NMP/mL).

1 2

69x10

– 2,377x10

–

2,129x 1

to, em função da condição, houve uma variação considerável da concentração final

de BRS, de 1,5x10

a 1,1x10

NMP/mL.

Em estudo de biodegradação anaeróbia de água de produção de petróleo empregando

cultura mista, também constituída de bactérias anaeróbias e redutoras de sulfato, foi

observado que a concentração de células viáveis permanecia praticamente inalterada, ou no

máximo aumentava em 2 ordens de cresci

ento da cultura, possivelmente pelo longo período de aclimatação (6 m

o da concentra fonte de nitrogêni

ra o crescimen pulação de udo para

Cl utiliza nte para atende

iores concent leo diese

nciado m mento. Isto

à toxicidad tos resu

visto que , e na mesma co

A adição de biosurfactante estimulou o crescimento de BRS, para cada concentração

de óleo testada. Este resultado era esperado, considerando que a presença deste composto

propicia a interação célula-hidrocarboneto, intensificando a biodegradação. [BANAT, 1995;

JOHNSEN et al., 2005]. Não obstante, é possível haver microrganismos capazes de produzir

compostos com propriedades tensoativas em consórcios microbianos, em especial, os que já

foram aclimatados em óleo e derivados, como o objeto deste estudo.

As condições do experimento 14 (Tabelas 4.7 e 4.5) foram as que propiciaram maior

remo

A realização da regressão múltipla no programa Statistica 5.1 levou a seguinte

equação:

BRS = 3,180x10

+ 3,391x10

X + 2,995x10

X + 1,1

+ 2,236x10

+ 2,743x10

+ 4,633x10

+ 3,205x10

(4.3)

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 76

A Tabela 4.8 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

quantificação de bactérias redutoras de sulfato sendo eliminados os parâmetros não

significativos. Assim, foram desprezados os termos isolados das concentrações de óleo diesel

e de cloreto de amônio; e as interações concentração de óleo diesel/concentração de cloreto de

amônio, concentração de óleo diesel/concentração de biosurfactante e concentração de cloreto

de amônio/concentração de biosurfactante.

Tabela 4.8 – Resultados da regressão múltipla para a quantificação de BRS.

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

3,180x10

0,0028

(BS) 1,169x10

0,0194

(OD

) - 2,377x10

0,0026

(BS

) 2,236x10

0,0039

= 0,81 F

= 11,96 F

(0,01) = 5,95

) -2,129x10

0,0052

A Tabela 4.8 apresenta as variáveis que mais influenciaram no crescimento das BRS.

Analisan

variação expressiva do

número de BRS em termos de ordem de grandeza, em relação ao aumento da concentração de

óleo diesel (experim

O coeficiente de correlação de 0,81 indica que foi feito um bom ajuste dos dados ao

nível de

significâ

do esta tabela observa-se que maiores concentrações de biosurfactante

proporcionaram maior número de BRS. Este fato pode ser verificado comparando os

experimentos 1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8 e, 13 e 14. Porém, para os experimentos realizados com

valores constantes do biosurfactante, foi constatado que não houve

entos 9 e 10) e ao aumento da concentração de NH

Cl (experimentos 11 e

12).

modelo. O resultado de F calculado (Fc) foi superior ao F tabelado (F

) para um

ncia de 1% comprovando que o modelo é significativo.

A Figura 4.6 mostra a distribuição dos resíduos em torno do zero e a Figura 4.7, o

gráfico de valores preditos em função dos observados.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 77

-2E10 0 2E10 4E10 6E10 8E10 1E11

-3E10

Resíduos

2E10

3E10

1E10

-2E10

-1E10

Valores Preditos para Quantificação de BRS

Figura 4.6 – Distribuição dos resíduos relativa à quantificação de BRS.

-2E10 0 2E10 4E10 6E10 8E10 1E11 1.2E11

Valores Preditos

-2E10

1.2E11

2E10

4E10

6E10

Valores Observados

8E10

1E11

Figura 4.7 – Valores preditos em função dos observados relativos à quantificação de BRS.

Observando a Figura 4.6, vê-se que a distribuição dos resíduos comportou-se

aleatoriamente em torno do zero, não apresentou qualquer tendência quanto à distribuição. Na

Figura 4.7, nota-se que as respostas experimentais para quantificação de BRS apresentaram a

maioria dos valores próximos aos fornecidos pela equação empírica.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 78

Após a eliminação dos parâmetros não significativos e o reajuste dos dados, obteve-

se a seguinte equação do modelo ajustado, fornecido pelo software Statistica 5.1, utilizando

os valores apresentados na Tabela 4.7 como matriz:

BRS = 3,180x10

+ 1,169x10

– 2,377x10

– 2,129x10

+ 2,236x10

(4.4)

A única variável significativa isolada foi a concentração de biosurfactante, porém o

menor valor do coeficiente desta variável (X

) e o maior valor de p, apresentado no modelo e

na Tabela 4.8, respectivamente, mostram que, entre as variáveis significativas, esta foi a que

menos contribuiu para o crescimento de BRS. Assim, as interações quadráticas foram as que

mais atuaram no número de BRS.

O cálculo do ponto estacionário para a quantificação de BRS realizado conforme

citado anteriormente levou aos seguintes valores: x

= 0,04806; x

= 0,053102 e x

= -

0,270119. As coordenadas do ponto estacionário estão dentro da região experimental.

Os valores dos λ’s referentes à quantificação de BRS indicaram que esta resposta

possui um ponto de sela, pois λ

(- 2,4427x10

); λ

(- 2,0810x10

) e λ

(2,25416x10

)

esmo algoritmo implementado no programa Maple V release 4,

calculou-se os valores das variáveis codificadas (X’s) correspondentes à maximização da

resposta para o crescim

Substituindo os valores dos λ’s na equação canônica, obteve-se: Y = 3,18x10

2,4427x10

- 2,0810x10

+ 2,25416x10

. Para maximizar a resposta os termos

possível. Em decorrência, obteve-se: w

= 1,56 e Y

máx

= 6,7 x 10

ram obtidos os valores

reais das concentrações das variáveis:

= 1,63% de óleo diesel;

= 3,23g/L de NH

Cl;

= 0,06% de biosurfactante.

apresentam sinais diferentes.

inda usando o mA

ento de BRS, utilizando a forma canônica Y = y

- λ

e w

foram zerados e então, foram atribuídos valores para w

tal que Y fosse o maio

A partir daí, obteve-se os seguintes valores das variáveis codificadas no ponto de

maximização da resposta: x

= 0,1276; x

= 0,1125 e x

= 1,2867.

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4) fo

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 79

Substituindo as variáveis codificadas do ponto de otimização da remoção de TPH e

da quantificação de BRS no modelo ajustado da equação de crescimento de BRS (Eq. 4.4),

obtém-se 8,1x10

e 8,3x10

NMP/mL, respectivamente. Verifica-se que no ponto de

otimização o número de BRS foi inferior ao encontrado no experimento 14 (Tabela 4.7). Este

fato está relacionado ao ajuste do modelo aos dados experimentais, isto é, conforme o valor de

, apenas 81% dos resultados experimentais são representados pelo modelo. Além disso, os

valores das quantificações de BRS nos pontos de otimização de remoção de TPH e de

quantificação de BRS foram próximos, mostrando a atuação efetiva das mesmas na redução

desta resposta.

As Figuras 4.8, 4.9 e 4.10 apresentam as superfícies de resposta mostrando a

influência das variáveis duas a duas com a resposta de quantificação de BRS.

4e+010

3e+010

2e+010

1e+010

alis a 4.8, se qu s pr anto

da per tagem d o diesel c da conc de NH

respectivamente) o ero de BRS aumenta.

Figura 4.8 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das concentrações

de óleo diesel e de NH

Cl.

An ando a Figur observa- e para valore óximos ao ponto central t

cen e óle omo entração

Cl (+0,1276 e +0,1125,

núm

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 80

6.97e+010

6e+010

5e+010

4e+010

3e+010

2e+010

1e+010

Figura 4.9 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das concentrações

de óleo diesel e biosurfactante.

Analisando a Figura 4.9, observa-se que para valores próximos ao ponto central da

percentagem de óleo diesel (+0,1276 ou 1,63%) e valores maiores (tendendo para 1,287

equivalente à 0,06%) de biosurfactante aumentam o número de BRS.

6.76371e+010

6e+010

5e+010

4e+010

3e+010

2e+010

1e+010

Figura 4.10 - Superfície de resposta para quantificação de BRS em função das concentrações

de NH

Cl e biosurfactante.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 81

Analisando a Figura 4.10, observa-se que valores próximos ao ponto central de

Cl (+0,1125 equivalendo a 3,23 g/L) e valores maiores (tendendo para 1,287) de

biosurfa

planejamento composto central. Os resultados obtidos

na quantificação em triplicata estão apresentados no Apêndice H.

cada experimento.

Exp. OD(%v/v) N (g/L) BS (%v/v) Anaeróbias (NMP/mL)

ctante aumentam o número de BRS.

4.4.2.3 – QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS

A Tabela 4.9 apresenta a média dos resultados da quantificação de bactérias

anaeróbias para cada experimento do

Tabela 4.9 – Resultados da quantificação de bactérias anaeróbias em NMP/mL, com as

condições de

0,5 1,0 0,007

9,2x10

± 0,2x10

0,5 1,0 0,053

9,5x10

± 0,0

5,0 7

0,0

5,0 053

± 0,7x10

1,0 07

± 0,1x10

2 1,0 53

± 0,5x10

± 0,1x10

2,5 5,0

± 0,9x10

0,213 3,0 03

± 0,2x10

2,787 3,0

6,4x10

± 0,0

0,03

2,2x10

0,1x10

9 9

15 1,5 3,0 0,03

7,2x10

± 0,2x10

16 1,5 3,0 0,03

7,5x10

± 0,0

0,5 0,00

4,0x10

0,5 0,

8,5x10

2,5 0,0

1,2x10

,5 0,0

1,5x10

2,5 5,0 0,007

2,2x10

0,053

5,5x10

9,3x10

0,03

1,5 0,426

5,2x10

0,8x10

1,5 5,6 0,03

1,5 3,0 0,00

7,2x10 ± 0,2x10

14 1,5 3,0 0,06

6,2x10

± 0,8x10

9 9

Concentração inicial de bactérias anaeróbias = 2,2x10

NMP/mL

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 82

No que concerne às bactérias anaeróbias pode-se observar um comportamento

distinto comparativamente às BRS. Na maioria das condições (experimentos 1 - 4, 7, 10 e 12)

prevalec

uma justificativa. Nestas condições, a ordem de grandeza das bactérias

anaeróbias foi sempre cerca de pelo menos 1 ordem de grandeza superior ao das BRS.

Distintam

Em consonância com os resultados observados para BRS, houve o favorecimento do

metabolismo das bactérias anaeróbias em óleo diesel (0,5 e 2,5%) com o aumento da

concentração de biosurfactante (experimentos 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8) e com o aumento da

con da

concentração de óleo diesel de 0,213% para 2,787%, neste caso resultou em decréscimo da

população microbiana.

Boopathy (2003a) avaliando a biodegradação anaeróbia de solo contaminado com

óleo diesel, em biorretator, obteve aumento da população de bactérias anaeróbias de

aproximadamente 2 ordens de grandeza (de 3,4x10

UFC/mL a 6,6x10

UFC/mL) após 30

dias de processo. Note-se, então, que as condições empregadas neste trabalho foram mais

favoráveis ao crescimento dessas bactérias já que foi alcançada a concentração máxima de

8,5x10

NMP/mL.

Após a realização da regressão múltipla no programa Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

ANAERÓBIAS = 9,297x10

– 4,574x10

+ 1,436x10

+ 1,894x10

– 3,487x10

– 1,690x10

+ 1,440x10

– 2,875x10

– 4,425x10

+ 1,548x10

(4.5)

da concentração de óleo

eu a população de bactérias anaeróbias, não havendo fato(s) relevante(s) que possam

contribuir para

ente, nas condições de 1,5% de OD e 3g/L de N, na presença ou ausência do

biosurfactante (experimentos 13-16), houve um ligeiro predomínio das BRS, apesar da

concentração deste grupo microbiano ser também elevada.

centração de nitrogênio (experimentos 1 e 3, 2 e 4, 5 e 7, 6 e 8). O aumento

A Tabela 4.10 a seguir apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

quantificação de bactérias anaeróbias.

Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância

superiores a 10%. Assim, foram desprezados os termos quadráticos

diesel e da concentração de NH

Cl e o termo de interação concentração de óleo diesel/cloreto

de amônio.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 83

Tabela 4.10 - Resultados da regressão múltipla da quantificação de bactérias anaeróbias.

Fatores Parâmetros

significância (p)

Nível de

Constante (β

)

6,951x10

0,0264

(OD) - 4,574x10

0,0471

(NH

Cl) 1,436x10

0,0001

(BS) 1,894x10

0,0000

(BS

) 1,440x10

0,0007

(OD.BS) - 4,425x10

0,0943

(NH

Cl.BS) 1,548x10

0,0001

= 0,96 F

= 36.61 F

(0,01) = 5,95

a a significância

deste.

s isoladas influenciam no crescimento das

bactérias anaeróbias. Analisando esta tabela, observa-se que a combinação de menores

percenta trações de NH

Cl e maior percentagem de

biosurfa ero de bactérias anaeróbias.

e residual dos dados obtidos no

planejam

O coeficiente de correlação de 0,96 mostra que a maioria dos dados foi explicada

pelo modelo e o resultado de F calculado superior ao F tabelado confirm

A Tabela 4.10 mostra que todas as variávei

gens de óleo diesel, maiores concen

ctante resultaram num maior núm

As Figuras 4.11 e 4.12 mostram a anális

ento.

Na Figura 4.11 a distribuição dos resíduos comportou-se aleatoriamente em torno do

zero, não apresentando tendência quanto à distribuição. Na Figura 4.7 as respostas

experimentais apresentaram a maioria dos valores próximos aos fornecidos pela equação

empírica.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 84

-2E10 0 2E10 4E10 6E10 8E10 1E11

Valores Preditos para Quantificação de

Bactérias Anaeróbias

-1.2E10

8E9

1E10

1.2E10

1.4E10

-1E10

-8E9

-6E9

-4E9

-2E9

2E9

4E9

6E9

Resíduos

Figura 4.11 – Distribuição de resíduos relativa à quantificação de bactérias anaeróbias.

0 2E10 4E10 6E10 8E10 1E11

Valores Preditos para Quantificação de

Bactérias Anaeróbias

2E10

4E10

6E10

8E10

1E11

Valores Observados

Figura 4.12 – Valores preditos em função dos observados relativos à quantificação de

bactérias anaeróbias.

Após o reajuste dos dados e a eliminação dos parâmetros não significativos na

Equação 4.5, obtém-se a seguinte equação conforme a Tabela 4.10:

9 9 10 10 10 2

(4.6)

ANAERÓBIAS = 6,951x10

– 4,574x10 X

+ 1,436x10 X

+ 1,894x10 X

+ 1,440x10 X

– 4,425x10

+ 1,548x10

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 85

A partir da equação completa (Eq. 4.5) e fazendo uso do algoritmo implementado no

: x

= -0,2499; x

= 0,4964 e x

= - 0,9627. No

ponto estacionário as coordenadas x

2 e

estão dentro da região experimental.

então foram calculados os valores das variáveis codificadas (X’s)

correspondentes à maximização da resposta para a quantificação de bactérias anaeróbias,

utilizando a for

inados os valores: w

1,99; Y

= 4,3x10

alores das variáveis codificadas no ponto de

maximização da resposta: x

= -1,087; x

= 1,13 e x

= 1,27.

= 0,41% de óleo diesel;

= 0,059% de biosurfactante.

tituin eis c do imizaçã TPH e

da quantificação de ba ias anaeróbias no modelo ajustado da equação de crescimento de

anaeróbi (Equação obtém-se, 5,7x10

e 1 NMP/mL ente. Isto

mostra q houve cres nto satisfatório de bactér eróbias e, co aior

do que as BRS. Assim s bactérias ribuíram decisivamente para e TPH.

e otimização para BRS e bactérias anaeróbias as

concentrações de óleo diesel foram ,63% e 0 respectivam

ponto de otimização de remoção PH foi 5%. Isto s as BRS

apresentaram maior crescimento em aior concentração de óleo diesel e podem ter

contribu significat te para a ção de TP

programa Maple V release 4 foram calculadas as coordenadas do ponto estacionário pa

quantificação de bactérias anaeróbias, são elas

Os valores das raízes características (λ

= - 4,118x10

; λ

= - 3,196x10

= 1,80601x10

) referentes à quantificação de bactérias anaeróbias indicaram que esta

resposta possui um ponto de sela.

A partir de

ma canônica Y = y

- λ

+ λ

. Substituindo-se os valores de λ na

forma canônica tem-se: Y = 6,951x10

- 4,118x10

- 3,196x10

+ 1,80601x10

Para maximizar a resposta os termos w

e w

foram zerados e então, determinou-se o valor

para w

tal que Y fosse o maior possível. Em seguida, foram determ

áx

Assim, foram obtidos os seguintes v

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4) foram determinados os

valores reais das concentrações das variáveis

= 5,26g/L de NH

Cl;

Subs do as variáv odificadas ponto de ot o da remoção de

ctér

as 4.6),

,0x10

respectivam

ue cime ias ana mparativamente m

, esta cont a remoção d

Vale ressaltar, que nas condições d

de 1 ,41%, ente, enquanto que no

de T de 1,1 ignifica que

ído ivamen remo H.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 86

Os resultad planejam experim (Tabela 4. que os

experim s com ma uantidad ctérias anaeróbias (experi 12 e 14)

foram aqueles em que ncentração loreto de io e do biosu am iguais

ou superiores à concentração do ponto central, o que rma o resulta ra o ponto

de otimi o da quan e de bactér naeróbias.

a ilustrar o itos das variáveis com re ero de bactérias anaeróbias,

estão apresentadas nas Figuras 4.13, 4.14 e 4.15 as superfícies de resposta relacionando as

variáveis

os do ento ental 9), mostram

ento ior q e de ba mentos 4, 8,

a co de c amôn rfactante for

confi do obtido pa

zaçã tidad ias a

Par s efe lação ao núm

com a resposta.

4.31451e+010

4e+010

3e+010

2e+010

1e+010

Figura 4.13- Superfície de resposta para o função das

concentrações de óle e de NH

Cl.

Analisando a Figura 4.13, observa-se que a superfíci ente

constante em rel ação de óle apresentando dência a aumentar

a quantidade de óbias quando em baixas percenta

equivalente à concentração de 0,41%). J res concentrações de NH

Cl (+1,13 ou

5,26 g/L), o número de bactérias anaeróbias aumenta.

crescimento de bactérias anaeróbias em

o diesel

e permanece praticam

ação à concentr o diesel, suave ten

bactérias anaer gens de óleo diesel (-1,087

á para maio

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 87

6e+010

4e+010

2e+010

Figura 4.14- Superfície de resposta para o crescimento de bactérias anaeróbias em função das

concentrações de óleo diesel e biosurfactante.

9.94589e+010

8e+010

6e+010

4e+010

2e+010

Figura 4.15 - Superfície de resposta para o crescim função

das concentrações de NH

Cl e biosurfactante.

actérias anaeróbias, embora comparativamente às BRS, sejam mais

influenc

ento de bactérias anaeróbias em

Na Figura 4.14, observa-se que a concentração de biosurfactante também favorece o

crescimento das b

iadas. A combinação de baixas concentrações de óleo diesel e altas concentrações de

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 88

biosurfa

anaeróbias. A combinação de maiores

concentr

Tabela

(g/L) BS (%v/v) Sulfato (mg/L)

ctante (tendendo para o ponto +α equivalente à 0,059%) aumenta o número de

bactérias anaeróbias.

Analisando a Figura 4.15, observa-se o comportamento das variáveis que mais

influenciaram no crescimento das bactérias

ações de NH

Cl (+1,13 ou 5,26 g/L) e maiores concentrações de biosurfactante (+α

ou 0,059%) aumenta o número de bactérias anaeróbias.

4.4.2.4 – CONSUMO DE SULFATO

A Tabela 4.11 apresenta os resultados das concentrações finais de sulfato nas

condições do planejamento experimental.

4.11 – Resultados das concentrações de sulfato ao final do processo nas condições de

cada experimento.

xp. OD(

%v/v) N

1 0,5 1,0 0,007

614,1 ± 0,9

2 0,5 1,0 0,053

428,4 ± 1,0

0,007

548,3 ± 0,7

0,03

474,7 ± 1,0

16 1,5 3,0 0,03

302,0 ± 1,0

3 0,5 5,0

4 0,5 5,0 0,053

415,7 ± 1,1

5 2,5 1,0 0,007

454,6 ± 0,9

6 2,5 1,0 0,053

373,2 ± 1,0

2,5 5,0 0,007

438,3 ± 1,2

2,5 5,0 0,053

348,3 ± 0,8

0,213 3,0 0,03

503,5 ± 0,7

2,787 3,0

1,5 0,426 0,03

406,7 ± 1,2

1,5 5,6 0,03

365,0 ± 0,9

13 1,5 3,0 0,00

328,9 ± 0,7

14 1,5 3,0 0,06

295,4 ± 0,7

15 1,5 3,0 0,03

298,0 ± 1

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 89

Após a realização da regressão múltipla no programa Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

-2

= 310,423 – 34,401X

– 18,861 X

– 50,634X

+ 103,189X

+ 40,854X

–

3,641X

+ 9,662X

+ 23,362X

+ 0,562X

(4.7)

A Tabela 4.12 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

concentr

adrático da concentração de

biosurfactante e as interações concentração de óleo diesel/concentração de cloreto de amônio,

e concentração de cloreto de amônio/concentração de biosurfactante.

Tabela 4.12 – Resultados da regressão múltipla para a concentração final de sulfato.

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

ação de sulfato, na qual foram eliminados os parâmetros com nível de significância

superiores a 10%. Assim, foram desprezados o termo qu

Constante (β

)

307,850 0,0000

(OD) - 34,401 0,0085

(N) - 18,861 0,0994

(BS) - 50,634 0,0008

(OD

) 103,188 0,0001

(NH

) 40,853 0,0217

= 16,54 F

(0,01) = 5,95

(OD.BS) 23,362 0,0880

= 0,92

maior consumo de

foi adequado para os dados experimentais. O resultado de F calculado (16,54) foi superior ao

F tabelado (5,95) para um nível de significância ostra que o modelo proposto é

a o comportamento aleatório dos resíduos em torno do zero,

não apresentando nenhuma tendência quanto à distribuição. Na Figura 4.17 nota-se que as

Conforme Tabela 4.12, verifica-se que a combinação de menores concentrações de

óleo diesel, de cloreto de amônio e de biosurfactante resultaram num

sulfato pelas BRS. O coeficiente de correlação (R

) de 0,92 indica que o modelo de regressão

de 1%, o que m

significativo.

A Figura 4.16 apresent

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 90

respostas experimentais para a concentração final de sulfato apresentaram valores bem

próximos aos fornecidos pela equação empírica.

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Valores Preditos para a

-60

-40

-20

Resíduos

Concentração Final de Sulfato

Figura 4.16 - Distribuição dos resíduos relativa à concentração final de sulfato.

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

Valores Preditos para a

200

350

450

500

550

600

650

400

Valores Observados

250

300

Concentração Final de Sulfato

Figura 4.17 - Valores preditos em função dos observados relativos à concentração final de

sulfato

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 91

Após a elimin dos parâm s não sig os e o reaju bteve-se a

seguinte equação:

-2

= 307,850 – 34,401X

8,861X

– 50,634X

+ 103, ,853X

23,362X

(4.8)

ilizando a ção compl q. 4.7) e ritmo imple programa

Maple V release 4 foram calculadas as coordenadas do ponto estacionário para a concentração

final de fato. Obte seguintes ores: x

= 0,6923; x

= 0,18 ,7181. As

coorden estão de região ex ental.

= - 4,9048; λ

= 40,4897 e λ = 104,8164)

referentes a concentração final de sulfato indicaram que esta resposta possui um

ão, foram calculados os valores das vari

minimiz da conce ão final de fato, utilizando a forma canô

- λ

. Substituindo os valores de λ na form nica tem-se: Y = 307,850 – 4,9048

+ 40,4897 w

+ 104,8164w

. Para minimizar a resposta o termo w

foi zerado e então,

determinando os valores para w

e w tal que o valor de Y fosse o menor possível. Então

foram obtidos os valores codificados das vari

tante aumenta o consumo de sulfato em 30, 24, 18 e 21%,

respectiv e 12 e

ainda nos experimentos 1 e 5; 4 e 8; 9 e 10 que o aumento nas concentrações de cloreto de

amônio

obtidos

ação etro nificativ ste destes, o

– 1 188X

+ 40

Ut equa eta (E o algo mentado no

sul ndo os val

14 e x

= - 4

adas ntro da perim

Os valores dos respectivos λ’s (

ponto de sela.

Ent áveis codificadas (X’s) correspondentes à

ação ntraç sul nica Y = y

w a canô

2 3

áveis no ponto de minimização da resposta: X

0,213; X

= 0,1998 e X

= 1,238.

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4) obtêm-se os valores reais

das concentrações das variáveis no ponto de mínima concentração de sulfato:

= 1,70% de óleo diesel;

= 3,40g/L de NH

Cl;

= 0,058% de biosurfactante.

Os resultados dos experimentos 1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8 mostram que o aumento na

concentração de biosurfac

amente. Verifica-se também, nos experimentos 1 e 3; 2 e 4; 5 e 7; 6 e 8; 11

e de óleo diesel, aumentam o consumo de sulfato no máximo em 11% e 26%,

respectivamente. Estes resultados confirmam os valores dos efeitos das variáveis X

, X

e X

no modelo ajustado (Equação 4.8).

Observa-se, no experimento 14, que concentrações de óleo diesel, cloreto de amônio

no ponto central e de biosurfactante no ponto de maior concentração provocaram o maior

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 92

consumo de sulfato, isto é, a concentração final do mesmo foi de 295,4 mg/L o que

corresponde ao consumo de 555,9 mg/L (65,3%). Os experimentos no ponto central (15 e 16)

apresentaram valores de consumo de sulfato bem próximos do experimento 14.

Aplicando na Equação 4.8, os valores das variáveis codificadas no ponto de

otimização se 246,54

mg/L e 242,22 mg/L de sulfato, respectivamente. Este fato mostra a apro ação dos valores

obtidos para os do de otimiza a parti a redução do

sulfato.

As Figura 9 e 4.20 ilust vés das superf resposta os efeitos

das variáveis na mi da concentração final de sulfato.

da concentração final de sulfato e de quantificação de BRS, obteve-

xim

cipação das BRS nis pontos ção e a efetiv

s 4.18, 4.1 ram atra ícies de

nimização

606

555.5

505

454.5

404

353.5

Figura 4.18 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de óleo diesel e de NH

Cl.

Analisando a Figura 4.18 observa-se que concentrações de óleo diesel e de cloreto de

amônio pró iminuem a

concentração final de sulfato, isto é, aumentam consumo do mesmo.

ximas ao ponto central (1,7% e 3,4 g/L, respectivamente) d

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 93

606

555.5

505

454.5

404

353.5

303

Figura 4.19 – Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de óleo diesel e biosurfactante.

505

454.5

404

353.5

Figura 4.20 – Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de NH

Cl e biosurfactante.

Observando a Figura 4.19 verifica-se que a combinação de concentrações de óleo

diesel próximas ao ponto central (1,70 %) e concentrações de biosurfactante tendendo para +

α (0,059 %) aumenta o consumo de sulfato.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 94

Na Figura 4.20 observa-se que concentrações de cloreto de amônio próximas ao

ponto central (3,4 g/L) e concentrações de biosurfactante tendendo para + α (0,058 %)

aumenta é, diminuem a concentração final do mesmo.

4.4.2.5 –

os da produção de H

S, nas condições de cada experimento.

m o consumo de sulfato, isto

PRODUÇÃO DE SULFETO

A Tabela 4.13 apresenta os resultados de produção de H

S nas condições de cada

experimento do planejamento.

Tabela 4.13 – Resultad

xp. OD(

%v/v) N (g/L) BS (%v/v) Produção H

S (mg/L)

1 0,5 1,0 0,007

113,0 ± 0,8

2 0,5 1,0 0,053

170,7 ± 1,0

3 0,5 5,0 0,007

133,3 ± 0,7

4 0,5 5,0 0,053

174,7 ± 1,2

5 2,5 1,0 0,007

163,2 ± 1,0

6 2,5 1,0 0,053

188,9 ± 0,6

2,5 5,0 0,007

168,0 ± 0,8

2,5 5,0 0,053

196,9 ± 1,2

0,213 3,0 0,03

147,2 ± 0,9

2,787 3,0 0,03

157,6 ± 1,0

1,5 0,426 0,03

185,7 ± 0,7

1,5 5,6 0,03

191,0 ± 1,2

13 1,5 3,0 0,00

201,6 ± 0,6

14 1,5 3,0 0,06

208,2 ± 1,0

15 1,5 3,0 0,03

202,5 ± 0,8

16 1,5 3,0 0,03

203,6 ± 0,9

Pode-se observar que a produção de sulfeto foi diretamente relacionada com a

concentração de nitrogênio, e sobretudo com a quantidade adicionada de biosurfactante. Estes

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 95

resultado

mpreender que a presença de

biosurfa

regressão múltipla no programa Statistica 5.1 resultou na seguinte equação:

S = 203,506 + 12,259X

+ 3,882X

+ 14,337X

– 31,059X

– 9,355X

0,636X

– 1,437X

– 5,562X

– 1,637X

2 3

(4.9)

A Tabela 4.14 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da produção

de H

S. Foram eliminados os parâmetros considerados não significativos. Assim, foram

concentração de biosurfactante; e as interações concentração de óleo diesel/concentração de

cloreto d

Tabela 4.14 – Resultados da regressão múltipla para a produção de H

Fatores Parâmetros

Nível de

Significância (p)

s estão em consonância com o comportamento das BRS (Tabela 4.7), conforme

previsível, considerando que gás sulfídrico é principalmente formado durante o metabolismo

desassimilativo do sulfato (KLEIKEMPER et al., 2002; PODGÓRSKA, AMERYK &

BOLAŁEK, 2000; LONDRY, SUFLITA & TANNER,1996). Logo, uma quantidade

adequada de nitrogênio e, em especial, uma maior disponibilidade de carbono favorecerá o

crescimento de BRS e, conseqüentemente, a geração de H

S. Assim, considerando a

insolubilidade dos hidrocarbonetos em água, pode-se co

ctantes, promovendo a dispersão destes compostos no meio aquoso, intensificará o

metabolismo microbiano.

desprezados o termo isolado da concentração de cloreto de amônio; o termo quadrático da

e amônio, concentração de óleo diesel/concentração de biosurfactante e concentração

de cloreto de amônio/concentração de biosurfactante.

Constante (β

)

203,956 0,0000

(OD) 12,259 0,0046

(BS) 14,337 0,0016

(OD

) - 31,059 0,0001

(NH

) - 9,355 0,0863

= 0,87 F

= 18,10 F

(0,01) = 5,95

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 96

A Tabela 4.14 mostra as variáveis que influenciam na produção de H

S. Observa-

que a combinação de maior

es concentrações de óleo diesel e de biosurfactante resultaram

numa maior produção de H

O coeficiente de correlação (R

) de 0,87 e o resultado de F calculado (Fc) superior ao

F tabelado (F

), para um nível de significância de 1%, indicam que o modelo é significativo e

s Figuras 4.21 e 4.22 apresentam a análise residual dos dados relativos à produção

de H

que os dados foram ajustados adequadamente a este.

-25

-10

-5

Resíduos

-20

-15

130 140 150

160

170 180 190 200 210 220 230

-30

Valores Preditos para a

roP dução de H

ão de HFigura 4 s res roduç

portou-se aleatoriamente em torno do zero, não

apresentando nenhuma tendência quanto à distribuição (Figura 4.21). Nota-se ainda, que as

re para a produção de H

S apresentaram valores bem os aos

fornecidos pela equação empírica (Figura 4.22).

.21 – Distribuição do íduos relativa a p

A distribuição dos resíduos com

spostas experimentais

próxim

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 97

140 160 180 200 220 240

Valores Preditos para a

Produção de H

140

160

180

200

220

240

Valores Observados

pós a eliminação dos parâmetros não significativos obteve-se a seguinte equação:

a Maple V release 4 calculou-se as coordenadas do ponto estacionário e o ponto de

maximização para a produção de H

S. Foram obtidos os seguintes valores: x

= 0,7926; x

está fora.

Os valores das raízes características (λ

= - 31,3297; λ = -9,3822 e λ = 0,9339)

referentes a produção de H

S ind espos onto d

variávei s (X’s) ntes à m ação da

produç

calculado a forma canônica Y = y

- λ

w es de anônica 203,956 – 30 w

–

9,382 w

+ 0,934 w

. Para maximizar a resposta os term

foram zerados e então,

determinou-se o valor de w

que m valor de to, tem-se que: w

= 8,17;

máx

= 222,99; m obtidos os valores codificados das variáveis no ponto de

maximização da resposta: X

= 0,100; X = 0,147 e X

= 1,278.

Figura 4.22 – Valores preditos em função dos observados relativos a produção de H

S = 203,956 + 12,259X

+ 14,337X

– 31,059X

– 9,355X

(4.10)

A partir da equação completa (Eq. 4.9) e da implementação de um algoritmo no

program

,7452 e x

= - 6,8406. As coordenadas x

e x

estão dentro da região experimental, porém x

2 3

icaram que esta r ta possui um p e sela.

Os valores das s codificada corresponde aximiz

ão de H

S foram s utilizando w

. Substituindo os valor λ na forma c tem-se: Y = 31,3

os w

e w

aximizasse o Y. Feito is

Então fora

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 98

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4) obteve-se

das concentrações das variáveis no ponto de máximo:

= 1,60% de óleo diesel;

= 0,059% de biosurfactante.

e otimização

de remo

ndo os valores das variáveis X

, X

e X

dos pontos de otimização para

remoção

15 e 16 da remoção de TPH (Tabela

4.5), do

TPH, de consumo de sulfato e produção de H

S, altas

concentrações de bactérias anaeróbias e a maior concentração de bactérias redutoras de

icrorganismos na biodegradação do efluente e

moção de TPH para maior concentração de

biosurfactante e concentrações de óleo diesel e cloreto de amônio próximas ao ponto central.

os valores reais

= 3,30g/L de NH

Cl;

Os resultados das concentrações das variáveis do planejamento experimental no

ponto de maximização do número de BRS, da produção de H

S e do consumo de sulfato

foram semelhantes, mostrando que o crescimento das BRS esteve relacionado com o consumo

de sulfato e a produção de sulfeto. Este ponto também está próximo do ponto d

ção de TPH, indicando a participação efetiva deste grupo de bactérias na

biodegradação do efluent

Os resultados dos experimentos 1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8 mostram que o aumento na

concentração de biosurfactante aumenta a produção de H

S em 51%, 31%, 16% e 17%,

respectivamente. Verifica-se também, nos experimentos 2 e 4; 5 e 7; 6 e 8; 11 e 12 que o

aumento na concentração de cloreto de amônio não altera substancialmente a produção de

S, com um percentual máximo de alteração de 5,3%. Estes resultados confirmam o modelo

ajustado, apresentado pela Equação 4.10 no qual o maior coeficiente é o da variável X

e a

variável X

foi eliminada

devido a sua não significância conforme critério adotado.

Substitui

de TPH e produção de H

S na Equação 4.10, obtêm-se as respectivas quantidades de

S: 196,42 e 222,99 mg/L. Isto permite demonstrar não só a aproximação dos resultados

obtidos para os dois pontos de otimização, como também a participação ativa das BRS na

remoção de hidrocarbonetos.

Os resultados correspondentes aos experimentos

consumo de sulfato (Tabela 4.11) e da produção de H

S (Tabela 4.13) mostram que

para concentrações das variáveis no ponto central do planejamento obtêm-se respostas

elevadas, inferiores apenas às obtidas no experimento 14. Neste experimento obteve-se além

dos valores máximos de remoção de

sulfato. Isto mostra a participação efetiva dos m

convalida o ponto de otimização com relação à re

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 99

Observa-se ainda que, nos quatro últimos experimentos, a produção de H

S no

planejamento ultrapassou os 200 mg/L nos experimentos 13 a 16. Sabe-se que pode ocorrer a

inibição da cultura microbiana quando a concentração de sulfetos no meio está acima deste

valor [S

fato pode ser justificado pelo período de aclimatação da cultura, o que provavelmente

permitiu a adaptação da cultura a níveis elevados de sulfeto.

mostram as superfícies de resposta relacionando as

variáveis com a produção de H

PEECE, 1996]. Porém, neste estudo, não foi observada a inibição destas bactérias, já

que em todos os experimentos foi verificado crescimento microbiano (Tabelas 4.7 e 4.9). Este

As Figuras 4.23, 4.24 e 4.25

196.3

181.2

166.1

151

135.9

120.8

Figura 4.23- Superfície de resposta para produção de H

S em função das concentrações de

óleo diesel e de NH

Cl.

iesel e de NH

próximas ao ponto +0,1, isto é, 1,6% de óleo diesel e 3 g/L de NH

Cl, maximizam a produção

de H

Observando a Figura 4.23, verifica-se que concentrações de óleo d

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 100

211.4

196.3

181.2

166.1

151

135.9

120.8

105.7

Figura osta pa

óleo diesel e biosurfactante.

4.24- Superfície de resp ra produção de H

S em função das concentrações de

196.3

181.2

166.1

151

Figura 4

.25 - Superfície de resposta para produção de H

S em função das concentrações de

Cl e biosurfactante.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 101

A Figura 4.24 apresenta as variáveis que mais influenciaram na produção de H

Para concentrações de óleo diesel próximas a + 0,1 (1,6 %) e concentrações de biosurfactante

tendendo para 1,287 (ponto + α), ou 0,06%, maximizam a produção de H

Na Figura 4.25 observa-se que concentrações de NH

Cl próximas a 3 g/L (ponto 0) e

oncentrações de biosurfactante próximas a + α (0,06%) aumentam a produção de H

4.4.2.6 – RESUMO DOS RESULTADOS DO PLANEJAMENTO

Na Tabela 4.15 estão relacionados todos os ntos de maximização das respostas:

remoção de H, quantificaç rias anaeróbi antificação de BRS e produção de

abela 4.15 – pontos de m ização das resposta

Variá

- Concentração

de Óleo Diesel (%)

- Concentração

de NH

g/L)

– Concentração de

Biosur te (%)

TP ão de bacté as, qu

T Resumo dos axim s.

vel

Cl (

factan

Remoção de TPH 1,15 2,92 0,06

Quantificação de

BRS

Quantificação de

Bact. Anaeróbias

Consum

Sulfa

Produção de H

S 1,60 3,29 0,06

1,63 3,23 0,06

0,41 ,26 0,059

o de

1,70 ,40 0,058

.20; 4.23; 4.24 e

4.25 que pode-se estabelecer que as concentrações de óleo diesel e de NH

Cl um pouco acima

do ponto central e a maior concentração de biosurfactante foram as variáveis que mais

contribuíram para o crescimento de BRS, para o consumo de sulfato e para a produção de

S. Isto significa que o crescimento de BRS está relacionado com a redução do sulfato e,

conseqüentemente, com a produção de H

S. Porém, o crescimento das bactérias anaeróbias

diminuiu com o aumento da concentração de óleo diesel. Estes fatos devem ter contribuído

para os valores obtidos para o ponto de otimização de remoção de TPH.

Observa-se na Tabela 4.15 e nas Figuras 4.8; 4.9; 4.10; 4.18; 4.19; 4

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 102

Os resultados de maximização das variáveis X

, X

e X

para a remoção de TPH

foram utilizados num ensaio para avaliar a cinética de biodegradação de um efluente sintético

contendo óleo diesel, empregando um reator batelada com capacidade de 2L.

4.5 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EFLUENTE SINTÉTICO DO

REATOR

A Tabela 4.16 apresenta a caracterização físico-química, antes e após o tratamento

biológico do efluente sintético, nas concentrações do ponto de otimização de remoção de

TPH.

Tabela 4.16 – Caracterização físico-química antes e após o tratamento biológico do efluente

sintético do reator e padrões de lançamento.

Valor antes do Valor após CONAMA

Parâmetro

tratamento tratamento 357/05

DQO (mgO

/L)

7400 ± 370 1480 ± 50

ND*

(mgO

/L)

3120 ± 150 330 ± 20

ND*

Òleos & Graxas (mg/L)

8200 ± 110 1600 ± 50

pH 7,8 7,81 5,0 – 9,0

TPH (mg/L)

5600 ± 100 997 ± 30

S (mg/L) 0 6,7

1 mg S

Sulfato (mg/L) 851 90,3 ND*

Nitrogênio Total (mg/L)

850 ± 40 54 ± 5

20,0 mg/L

Fósforo (mg/L)

115 ± 10 34 ± 2

ND*

DQO – Demanda Química de Oxigênio; DBO

– Demanda Bioquímica de Oxigênio analisada no 5

dia;

TPH – Hidrocarboneto Total de Petróleo.

*ND – não definido.

Apesar da redução considerável de óleos e graxas, seu teor final ficou acima do

permitido (20 mg/L) pela legislação vigente [CONAMA 357/05], para descarte. Portanto,

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 103

caso não se consiga estabelecer condição que resulte em adequação do efluente com base

este parâmetro, será necessário um tratamento posterior para a remoção destes.

relação DBO/DQO, que representa o grau de biodegradabilidade, é um parâmetro

impor es do

tratamento biológico essa r ento, para 0,22. Segundo

CKENFELDER (1995), relações na faixa de 0,1 a 0,4 indicam que o efluente é refratário, ou

seja, difícil de ser tratado. Este resultado mostra to o efluente

diminuiu suas carac s de biodegra e, isto é, as mais facilmente

biodegradáveis foram decompostas perm as de mais difícil assimilação pelos

microrganismos.

A redução de QO, óleos e gr TPH foram de 80%, 80,5% e 82,2%,

respectivamente. Apes e ter sido obtida moção em torno de 80%, o efluente final

ainda apresenta alta c orgânica. Estes dos mostram a necessidade de um estudo

mais detalhado que pe ta reduzir ainda te valor ou de lecer um tratamento

complementar visando adequar o efluente para descarte.

As quantidades de nitrogênio e de fósforo consumidas durante o processo de

biodegradação foram 93,6% e 70,4% ectivamente (Tabela 4.16). Assim uma

complementação de nutrientes durante o p pode vir a con para o aumento da

degradação anaeróbia leo diesel.

4.6 – CI

O experimento da cinética de biodegradação de óleo diesel em efluente sintético por

uma cultura mista enriquecida com BRS foi realizado num biorreator, com as condições

processo foi monitorado ao longo de 38 dias, quando então a produção de sulfeto

diminuiu

O pH final encontra-se dentro da faixa permitida pela legislação (5,0 – 9,0), estando

próximo à neutralidade.

tante que, por conseguinte, também deve ser considerado. Para o efluente ant

elação era de 0,42 passando, após o tratam

também que após o tratamen

terística dabilidad substâncias

anecendo

D axas e

ar d uma re

arga resulta

rmi mais es estabe

de , resp

rocesso tribuir

do ó

NÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO

otimizadas de remoção de TPH, conforme descrito na seção 3.10.

, isto é, as BRS já não estavam em plena atividade.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 104

4.6.1 – MONITORAMENTO DO pH

O pH variou ao longo do processo, apresentando decréscimos na maior parte do

período monitorado (Figura 4.26). Contudo, por 30 dias, permaneceu entre 7,0 e 7,8, valores

considerados ideais para o crescimento das BRS [POSTGATE, 1984]. No 32

dia, houve a

necessidade de ajustar o pH, o que foi feito através da adição de NaOH 1,0 N, elevando o pH

para 7,8. A partir daí, o pH se manteve inalterado.

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40

6,4

6,6

Tempo de Processo (dias)

Figura 4.26 – Monitoramento do pH durante o processo de biodegradação.

4.6.2 – CRESCIMENTO MICROBIANO

O consórcio microbiano anaeróbio cresceu satisfatoriamente em óleo diesel, como

fonte principal de carbono e energia, apresentando crescimento já nas primeiras 24 h. Esse

crescimento foi constatado pelo escurecimento do meio, devido à formação de precipitado

negro de FeS.

A Tabela 4.17 apresenta os dados relativos às concentrações de bactérias anaeróbias

e redutoras de sulfato no início e no final do processo de biodegradação, em reator batelada.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 105

Tabela 4.17 – Concentração inicial e final de BRS e bactérias anaeróbias para biodegradação

de óleo diesel em biorreator

Concentração celular (NMP/mL)

Inicial Final

BRS

1,5x10

± 0,5x10

5,0x10

± 0,9x10

Bactérias

4 4 10 10

anaeróbias

2,2x10 ± 0,1x10 7,3x10 ± 0,2x10

De acordo com os dados obtidos no planejamento composto central (PCC), as

concentrações de BRS e de bactérias anaeróbias no ponto de maximização da remoção de

TPH deveriam ser de 8,10x10

NMP/mL e 5,7x10

NMP/mL, respectivamente. Contudo, foi

detectado valor inferior para BRS (Tabela 4.17), enquanto as bactérias anaeróbias atingiram o

valor previsto. A redução no número de BRS provavelmente foi decorrente de morte celular

como, por exemplo, pela sensibilidade ao gás sulfídrico.

4.6.3 – REMOÇÃO DE TPH

A quantidade de TPH presente no biorreator foi monitorada com periodicidade de 2-

3 dias, num tempo total de processo de 38 dias. Os dados obtidos estão apresentados na

Tabela 4.18 e foram plotados em gráficos (Figuras 4.27 e 4.28) para favorecer a análise do

processo.

Observando os gráficos das Figuras 4.27 e 4.28 constata-se que as bactérias foram

diesel, promovendo remoção de cerca 80% decorridos 24 dias

e processo. Na Figura 4.27 observa-se que houve um decréscimo contínuo do TPH neste

período, m

mais facilmente assimiláveis, ao aumento da concentração

de H

S e/ou a redução de nutrientes do meio (conforme Tabela 4.16), já que houve uma

diminuição substancial de nitrogênio e fósforo durante a biodegradação.

eficazes na degradação do óleo

antendo-se praticamente inalterado no restante do tempo, indicando a queda da

atividade metabólica das BRS. Este fato pode estar relacionado ao aumento de recalcitrância

devido ao esgotamento das frações

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 106

Tabela 4.18 – Resultados obtidos da análise de TPH.

Tempo de Processo

(dias)

TPH

(mg/L)

TPH Consumido

(mg/L)

Remoção de TPH

(%)

5600 ± 50

- -

5331 ± 40

269 4,8

5146 ± 43

185 8,1

4726 ± 30

420 15,6

4351 ± 42

375 22,3

3651 ± 20

700 34,8

3276 ± 50

375 41,5

2760 ± 35

516 50,7

2167 ± 33

593 61,3

1669 ± 22

498 70,2

1131 ± 18

247 79,8

997

17 82,2

995 ± 12

2 82,2

1378 ± 25

291 75,4

1047 ± 23

1014 ± 15

81,3

81,9

± 10

Figura 4.27 onitoramento do TPH durante o processo de biodegradação. – M

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 107

Figura

o pelas bactérias

de compostos mais facilmente assimiláveis, como o extrato de lêvedo.

BOOPATHY (2003) observou que 55% dos hidrocarbonetos totais de petróleo

(TPH), em solo, foram eliminados em condições de redução do sulfato, após 290 dias de

processo. Ainda em 2003, BOOPATHY realizou estudos em terras alagadas e contaminadas

por óleo diesel e obteve remoção de 62% para 510 dias de processo. Em 2004, este mesmo

autor observou a remoção de 62% de óleo diesel presente em solo após 310 dias. Esses dados

vêm comprovar a eficiência do processo de biodegradação anaeróbia realizado neste trabalho,

já que foi obtida uma remoção superior de TPH de 82,2% em um tempo muito inferior.

4.28 – Consumo de TPH em cada período de coleta, durante o processo de

biodegradação.

A Figura 4.28 e a Tabela 4.18 mostram que entre o 8º e o 10° dia e entre 13° e 19°

dias as taxas de remoções de THP foram as mais altas obtidas. As baixas remoções

observadas nos primeiros dias de processo podem ser atribuídas ao consum

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 108

4.6.4 – CONSUMO DE SULFATO

A Tabela 4.19 apresenta os resultados obtidos nas análises de sulfato durante

biodegradação de óleo diesel no biorreator e ainda, a taxa de consumo de sulfato no período.

Tabela 4.19 – Variação da concentração de sulfato e a taxa de consumo durante a

biodegradação anaeróbia de óleo diesel.

Tempo

(Dias)

Sulfato

(mg/L)

Taxa de Consumo

(mg/L.dia)

0 851,0 -

4 726,2 31,2

8 578,3 37,0

10 449,3 64,5

13 372,8 38,2

15 303,0 34,9

17 207,2 47,9

24 117,7 6,4

28 107,9 2,45

38 90,3 1,96

21 143,2 16,0

Os dados referentes à concentração residual de sulfato durante a biodegradação de

óleo diesel em biorreator estão representados na Figura 4.29.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 109

– Monitoramento do teor de sulfato durante a biodegradação anaeróbia de óleo Figura 4.29

diesel.

4.29) corresp

mais uma vez com

também uma rem

com as bacté

A T

dia, sofrendo

o consumo

seção 4.6.5). Este fato pode estar relacionado à morte celular com liberação de sulfato para o

meio reacional.

O aumento da quantidade de sulfato no meio reacional pode também ser atribuído à

degradação de óleo diesel por outras bactérias não pertencentes ao grupo das BRS. No

consórcio microbiano empregado como inóculo, poderiam estar presentes bactérias

fototróficas anoxigênicas, que utilizam compostos reduzidos de enxofre, tal como sulfeto,

O consumo de sulfato foi mais acentuado nos primeiros 21 dias de processo (Fig.

ondendo com a fase em que a geração de H

S foi intensa (Figura 4.31), o que

prova a atividade das BRS na redução do sulfato. Neste período obteve-se

oção significativa de TPH (Figura 4.28), mostrando que as BRS juntamente

rias anaeróbias participaram do processo de biodegradação dos hidrocarbonetos.

abela 4.19 mostra que a taxa de consumo de sulfato se manteve elevada até o 17º

uma queda substancial com o andamento do processo.

Apesar da redução de sulfato ter ocorrido durante todo o processo de biodegradação,

de sulfato foi inferior ao necessário para quantidade de sulfeto produzida (ver

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 110

como doado étrons, este pode

ser oxidado diretamente a sulfato ou a enxofre elementar, que pode ser acumulado intra ou

extracelu IEIRA, 2003].

seu

metabolismo as

bactérias fot ficas

[MADIGAN ida;

no caso das hodopseudomonas capsulata, por exemplo, existem cinco caminhos

possíveis de metabolismo anaeróbio: fotoautotroficamente, utilizando H

e CO

;

fotohetero o

como fonte uro,

quimioautotr

utor.

provavelmen de

das BRS dev crescimento, por isso foram encontrados

valores sc do a

atividade de elas

bactérias ano elas

BRS, resulta

Ainda há a hipótese da oco

simultaneam óleo

diesel estari química/biologicamente, liberando sulfeto no meio

reacional. Es izar

anaerobicam eno

e o dibenzo

VIEIRA, 200

a de

biodegradaçã

res de elétrons. Quando o sulfeto de hidrogênio é o doador de el

larmente [FRY et al., 1985; MADIGAN, 1988; da SILVA, 2000 e V

As bactérias fototróficas anoxigênicas não produzem oxigênio durante

e são responsáveis pela formação de depósitos de enxofre na natureza. Já

otróficas facultativas crescem em condições fotoheterotróficas e fotoautotró

, 1988]. A diversidade metabólica desses microrganismos é bastante conhec

bactérias R

tr ficamente, com diferentes substratos orgânicos; no escuro, utilizando açúcares

de carbono e energia; no escuro, quimioheterotroficamente; no esc

oficamente com H

como fonte de energia e poder red

Se presentes no consórcio microbiano, as bactérias fototróficas anoxigênicas

te já estavam ativas desde o começo do processo. Nos primeiros dias, a ativida

e ter sido maior, já que se favorecia seu

cre entes de sulfeto, produto gerado pelo metabolismo dessas bactérias. Quan

ssas bactérias ficou menos intensa, a quantidade de sulfeto consumida p

xigênicas, ao que parece, ultrapassou a quantidade de sulfeto produzido p

ndo em uma quantidade líquida de sulfeto menor.

rrência de fenômenos concorrentes estarem acontecendo

ente no reator. Acredita-se que outros compostos sulfurosos presentes no

am sendo transformados

sas transformações podem ser atribuídas a capacidade das BRS em dessulfur

ente compostos de enxofre presentes no óleo diesel, por exemplo, o benzotiof

tiofeno, com a liberação do sulfato na forma de H

S [AITANI, 2000 apud

3].

A Figura 4.30 mostra a taxa de consumo de sulfato no período durante a cinétic

o de óleo diesel.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 111

Figura 4

fato;

um entre o 8 com

uma taxa de

4.6.5 – PRODUÇÃO DE SULFETO

ar a

atividade da em

intervalos de o do sulfeto total na fase líquida. A determinação do

sulfeto gasoso foi realizada sempre que se formava precipitado amarelo no recipiente

contendo hidróxido de cádm reator. A reação de sulfeto com hidróxido de

cádmio resulta na formação de sulfeto de cádmio (precipitado amarelo). As respostas das

análises e líquida, e sua produção total estão

apresent s

.30 – Taxa de consumo de sulfato no período.

Analisando a Figura 4.30 observa-se que houve dois picos de consumo de sul

e o 10

dia, com uma taxa de 64,5 mg/L.dia, e outro entre o 15

e o 17

dia,

47,9 mg/L.dia.

A produção de H

S foi acompanhada durante todo o processo a fim de verific

s bactérias redutoras de sulfato. Amostras do meio reacional foram coletadas

2-3 dias para quantificaçã

io conectado ao bior

de sulfeto, tanto na fase gasosa como na fas

ado na Tabela 4.20 e ainda representados na Figura 4.31.

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 112

Tabela sosa e produção total.

Tem d

4.20 – Produção de sulfeto na fase líquida, na fase ga

po e processo

ias)

Sulfeto na fase

líquida (mg/L)

Sulfeto [H

S] na

fase gasosa (mg/L)

S - fase

líquida+gasosa

(mg/L)

2 40,2 50,4 90,6

4 39,7 49,5 89,2

6 47,7 53,8 101,5

8 53,3 65,8 119,1

10 82,3 102,4 184,7

13 51,1 61,3 112,8

15 48,3 56,8 105,1

17 60,2 76,8 137,0

19 42,3 56,5 98,8

21 39,2 37,3 76,5

23 32,6 30,2 62,8

25 20,2 11,0 31,2

27 15,3 10,5 25,8

29 12,5 7,8 20,3

32 8,2 4,9 13,1

36 5,0 3,2 8,2

38 3,9 2,8 6,7

Total no período 602,0 681,0 1283,4

Capítulo 3 – Resultados e Discussões 113

0 5 10 15 20 25 30 35 40

100

120

140

160

180

200

Sulfeto, H

S e Sulfeto Total (mg H

S/L)

Tempo de Processo (dias)

Sulfeto

Sulfeto Total

Figura 4.31 – Monitoramento da produção de sulfeto no processo de biodegradação.

Analisa rande produção

de sulfetos durante o período monitorado. No décimo e no décimo sétimo dia obteve-se a

produção de 184,7 e 137 mg/L de sulfeto, respectivamente.A partir daí a produção começa a

decrescer continuamente até que no 38

dia, quando chegou a uma concentração praticamente

insignificante. Comparando as Figuras 4.28, 4.30 e 4.31 nota-se que os dias de pico de

produção de H

S coincidem com os de maiores remoções de TPH e de maior consumo de

sulfato. Este fato indica que apesar da cultura ser mista e as rotas metabólicas serem

complexas e pouco conhecidas, a atividade das BRS na produção de H

S está relacionada com

o consumo de sulfato e ainda, com a biodegradação dos hidrocarbonetos que compõe o óleo

diesel.

No planejamento experimental, assim como na cinética de biodegradação, pode-se

verificar em todos os dezesseis experimentos uma produção experimental de H

S maior do

que a teórica de acordo com o sulfato consumido. Observou-se que esta produção foi no

máximo 25,9% maior do que a teórica (experimento 1). Este resultado é bem inferior ao

obtido no reator, provavelmente devido a toxicidade do H

S presente durante o processo, já

que no biorreator de 2L esse composto era retirado quando em fase gasosa.

ndo a Tabela 4.20 e a Figura 4.31 verifica-se que houve uma g

CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES E SUGESTÕES

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES

5.1 – CONCLUSÕES

udo, pode-se enunciar as seguintes

vel;

osto central (PCC), tendo como variáveis as concentrações de

óleo diesel, de cloreto de amônio e de biosurfactante, observou-se que:

ndo as concentrações de óleo

de biodegradação anaeróbia foi obtida para 1,15%

(v/v) de

biosurfactante, resultam em remoção de TPH de 80,56% no ponto de máximo;

) e de cloreto de amônio (3,0) próximas

(208,2 mg/L), maior quantidade de bactérias redutoras de sulfato (1,1x10

do efluente e

A partir dos resultados obtidos neste est

conclusões:

 Na etapa de aclimatação a cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de

sulfato cresceu satisfatoriamente utilizando óleo diesel como fonte de carbono e

energia, em concentrações de até 5% do combustí

No planejamento comp

 A remoção de TPH máxima foi de 79,13 %, se

diesel e de biosurfactante as variáveis que mais influenciaram na remoção.

 A otimização do processo

(v/v) de óleo diesel, 2,92 g/L de cloreto de amônio e 0,06%

 Em concentrações de óleo diesel (1,15%

ao ponto central e concentração de biosurfactante (0,06%) próxima ao ponto de

máximo, obteve-se maior remoção de TPH (79,13%), maior produção de H

NMP/mL), maior consumo de sulfato (295,4 mg/L) e uma quantidades elevada

de bactérias anaeróbias (6,2x10

NMP/mL). Estes resultados mostraram a

participação efetiva dos microrganismos na biodegradação

convalidaram o ponto de otimização com relação à remoção máxima de TPH;

 Os valores das variáveis do planejamento experimental no ponto de otimização

para a maximização do número de BRS, da produção de H

S e do consumo de

Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões 115

 sulfato foram semelhantes, mostrando que o crescimento das BRS está

sso foram obtidos 5,2 x 10

NMP/mL de BRS e 7,5 x

ização de TPH (8,10x10

do pH após 21 dias de processo coincidiu com o período de

comparativamente as BRS, ou seja, essas bactérias contribuíram

esso e, a inalteração

o final do processo, e/ou ao

dos nutrientes, já que houve

orte celular de BRS,

igênicas, e/ou a biodessulfurização de compostos

relacionado com o consumo de sulfato e a produção de sulfeto;

No estudo da cinética de biodegradação no reator observou-se que:

 Ao final do proce

NMP/mL de bactérias anaeróbias; o crescimento das BRS tendo

ficado abaixo do calculado no ponto de otim

NMP/mL), possivelmente, devido à inativação/morte das BRS durante o

processo;

 A redução

queda de produção de H

S e de consumo de sulfato, indicando que pode ter

ocorrido redução da atividade metabólica das BRS;

 A concentração final de bactérias anaeróbias, da ordem de 10

, foi maior

decisivamente para a remoção de TPH;

 O decréscimo contínuo do TPH durante 24 dias de proc

da sua concentração no restante do período podem estar associados a pouca

atividade metabólica do consórcio microbiano n

aumento da recalcitrância do efluente devido ao esgotamento das frações

mais facilmente assimiláveis, e/ou a redução

uma diminuição substancial das concentrações de nitrogênio e fósforo

durante a biodegradação;

 O consórcio microbiano foi eficaz na biodegradação do óleo diesel,

levando a 82,2 % de remoção de TPH em 38 dias de processo. Este

resultado foi ligeiramente superior ao predito no ponto de otimização da

remoção de TPH (80,56 % para 30 dias de processo);

 Houve uma grande produção de H

S, sendo superior ao esperado apenas

pela redução do sulfato, provavelmente devido a m

liberando sulfato no meio reacional, e/ou a presença de bactérias

fototróficas anox

sulfurosos presentes no óleo diesel;

Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões 116

 Os períodos de maior produção de H

S coincidiram com os máximos de

das BRS juntamente com as bactérias anaeróbias na biodegradação de

óleos e graxas e TPH foram respectivamente de 80%, 80,5% e 82,2%.

ela legislação vigente (CONAMA 357/05).

mento deste efluente para redução

dação do óleo diesel, adicionando

manutenção dos nutrientes no meio e conseqüente aumento da

lizar um tratamento físico-químico, como por exemplo, os POA’s

;

remoção de TPH e de consumo de sulfato, mostrando a efetiva participação

hidrocarbonetos presentes no óleo diesel;

 A caracterização físico-química do efluente sintético utilizado no

biorreator, antes e após o tratamento, mostrou que a redução de DQO,

Porém, apesar desta remoção o efluente permaneceu com alta carga

orgânica, acima da permitida p

Portanto, faz-se necessário um pós-trata

desta carga.

5.2 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS POSTERIORES

Após a conclusão deste trabalho, sugere-se para posteriores estudos:

 Estudar a redução do tempo de biodegra

ao efluente resíduos protéicos de fácil assimilação pelos microrganismos

para favorecer a atividade metabólica do consórcio microbiano;

 Desenvolver um processo de biodegradação com alimentação de diferentes

fontes de fósforo e nitrogênio, em separado e em conjunto, visando a

decomposição do efluente;

 Rea

(Processos Oxidativos Avançados), antes do biológico a fim de reduzir a

recalcitrância do efluente;

 Avaliar várias concentrações de inóculo com o objetivo de obter maior

biodegradabilidade do efluente;

 Verificar e avaliar a produção de metano

 Avaliar técnica e economicamente a recuperação de enxofre a partir do gás

sulfídrico gerado;

Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões 117

 Avaliar diferentes formas de condução do processo de biodegradação de

como dos produtos gerados pelo metabolismo microbiano.

óleo diesel (batelada alimentada, cíclica e contínuo);

 Realizar análises cromatográficas do efluente objetivando acompanhar a

biodegradação dos diversos hidrocarbonetos presentes no óleo diesel, bem

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALEXANDER, M. Biodegradation and biorremediation

. 2

ed. San Diego, U.S.A., Academic

Press, 1999. 239 p.

ALVAREZ, P.J.J; DA SILVA, M.L.B. Enhanced anaerobic biodegradation of benzene –

toluene – ethylbenzene – xylene – ethanol mixtures in bioaugmented aquifer columns.

Applied and Environmental Microbiology

, v. 70, p. 4720-4726, 2004.

Agência Nacional do Petróleo – ANP, Portaria Nº 310 de 27 de dezembro de 2001.

APHA, AWWA, WPCF. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater

. 18

edition, New York, 1992.

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater

, 20th edition, p. 4-99 a 4-

126, 1998.

ATLAS, R. M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental

perspective. Microbiological Reviews

, v. 45, p. 180-209, 1981.

BARROS NETO,B.; SCARMINO, I.S.; BRUNS, R.E. Planejamento e otimização de

experimentos. 2

. ed., Editora Unicamp, Campinas,1995.

BHANDARY, A.; KARTHIKEY transformation of aromatic and

polycyclic aromatic hydrocarbons in soil microcosms: a review. Journal of Hazardous

AN, R. Anaerobic bio

Substance Research, v. 3, 2001.

BANAT, I. M. Biosurfactant production and possible eses in microbial enhanced oil recovery

and oil pollution remediation: a review. Bioresearch Technology

, 51: 1-12, 1995.

BAPTISTA, S. J. 2003. Seleção das melhores condições de biodegradação de petróleo em

solo argiloso. Dissertação de Mestrado - EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2003. 163 p.

BARTHA, R.; ATLAS, R. M. The microbiology of aquatic oil spills. Adv. Appl. Microbiol

.v.

22, p. 225-266, 1977.

BARTHA, R.; DIBBLE, J. T. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil

sludge. Applied and Environmental Microbiology, v. 37, p. 729-739, 1979.

BARTON, L. L., Sulphate-reducing bacteria

. Biotechnology Handbooks, v. 8, New York,

Plenun Express, 1995;

BARTON, L. L. & TOMEI, F.A. Characteristics and activities of sulfate-reducing bacteria.

In: _______. Sulphate-reducing bacteria

. Biotechnology Handbooks, v. 8, New York,

Plenun Express, 1995;

BOOPATHY, R. Use of anaerobic soil slurry reactor for the removal of petroleum

hydrocarbons in soil. International Biodeterioration & Biodegradation

, v. 52, p. 161-166,

2003a.

Referências Bibliográficas 120

BOOPATHY, R. Anaerobic degrada el fuel in the wetland sediments of

Barataria-Terrebonne estuary under various electron acceptor conditions. Bioresource

tion of No. 2 dies

Technology, v. 86, p. 171-175, 2003b.

BOOPATH mn study.

Bioresource Technology

Y, R. Anaerobic biodegradation of no. 2 diesel fuel in soil: a soil colu

, v. 94, p. 143-151, 2004.

BOULTON, C.A. and RATLEDGE, C. Biosynthesis of lipid percursors to surfactant

production. Biosurfactants and Biotecnhnology

, New York (USA): Ed. KOSARIC, N.;

IRNS, W. L. & GRAY, N. C. C.; DEKKER, M. Inc., p. 47 - 87, 1987.

BOX, G. E. P. HUNTER, W. G., HUNTER, T.S. Statistics for Experimenters

. United States

of America and Canada, John Wiley & Sons, Inc., 1978.

CARDOSO, L.C.S. Logística do petróleo: transporte e armazenamento. Rio de Janeiro,

Interciência, 192 p., 2004.

CHERNICHARO, C.A.L. Princípios do tratamento biológico de águas residuárias – reatores

anaeróbios. SEGRAC Editora Gráfica, v. 5, 246 p., 1997.

COATES, J.D.; ANDERSON, R. T.; LOVLEY, D.R. Oxidation of polycyclic aromatic

hydrocarbons under sulfate-reducing conditions. Applied and Environmental

Microbiology, p. 1099-1101, 1996.

CONAMA – Conselho Nacional de Meio Ambiente, Resolução N

375 de 2005.

COOPER, D.G., ZAJIC, J.E. Surface-active compounds from microorganism. Advances in

Ap ipl ed Microbiology, v.26, p.229 - 252, 1980.

CRAV JO r., W.B. Biodegradação de querosene de aviação (QVA) por culturas mistas e por

Pseudomonas aeruginosa. Dissertação de Mestrado - EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 68 p.,

1998

da CUN A loH , C. D. Avaliação da biodegradação de gasolina em so

. Dissertação de Mestrado

– EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 97 p., 1996.

DEL’ARCO, J. P. Degradação de hidrocarbonetos por bactérias e fungos em sedimento

arenoso. Tese de Doutorado – EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 171 p., 1999.

DESAI, J.D., BANAT, ercial

potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews

I.M. Microbial production of surfactants and their comm

, v.61, n.1, p.47-64, 1997.

DHILLON, A.; TESKE, A.; DILLON, J.; STAHL, D.A. e SOGIN*, M.L. Molecular

characterization of sulphate-reducing bacteriain the Guaymas Basin. Applied and

Environmental Microbiology, v. 69, p. 2765-2772, 2003.

ECKENFELDER, W.W; MUSTERMAN, J.L. Activated sludge treatment of industrial

wastewater. Technomic Pub. Co. Lancaster-Basel, p. 75-80, 1997.

FELIPE, C.A.V. Influência das variáveis de processo na qualidade de sementes de soja

submetidas a secagem em leito deslizante e escoamentos concorrentes. Dissertação de

Mestrado – FEQUI/UFU, Uberlândia, 1999.

Referências Bibliográficas 121

FRITSCHE, W.; HOFRICHTER, dation by microorganisms, 2000.

Disponível em

www.wiley-vch.de/books/biotech

M. Aerobic degra

GENTIL, V. Corrosão

. 3 .ed, Rio de Janeiro, Livros Técnicos e Científicos, 1996, 345 p.

D. F. Biosurfactantes: production - properties - apllications

GERSON,

. Editado

ic. 269 - 286, 1993.

por Naim

Kosar

GEORGIOU, G., LIN, SC, SHARMA, M.M. Surface-active compounds from

organisms. Biotechnologymicro

, v. 10, p. 60-65, 1992.

RISHCHENKOV, V.G.; TOWNSENDO, R.T.; McDONALD, T.J; AUTENRIETH, R.L.;

ns by facultative

ess Biochemistry

BONNER, J.S.; BORONIN, A.M. Degradation of petroleum hydrocarbo

anaerobic bacteria under aerobic and anaerobic conditions. Proc

, v. 35,

ARRISON, J.R., A.P. Microbial sucession and mineral leaching in a artificial coal spoil.

p. 889-896, 2000.

Applied and Environmental Microbiology, n. 131, p. 68-76, 1982.

.; SPORMANN, A.M.; BELLER, H.R.; WIDDEL, F. Anaerobic bacterial

biology Reviews

HEIDER, J

metabolism of hydrocarbons. FEMS Micro

, v. 22, p. 459-473, 1999.

manual of determinative bacteriologyHOLT, J.G. et al. Bergey’s

. 9

edition, editor John G.

f, Williams & Wilkins Baltimore, London, 1994.

oriba, Ltd. Japão, 1995.

.; HOCHEISER, S. Ultramicrodetermination of

Holt – in – Chie

HORIBA, Instruction manual. Copyright H

JACOBS, M.B.; BRAVERMAN, M.M

sulfides in air. Anal. Chem

. V. 29, p. 1349-1951, 1957

H. Principles of microbial PAH-degradation in JOHNSEN, A. R.; WICK, L.Y.; HARMS,

ental Pollutionsoil. Environm

. v. 133, p. 71-84, 2005.

KARLSON, U., FRANKENBERGER, JR., W. T. Microbial degradation of benzene and

ronmental Contamination and Toxicologytoluene in groundwater. Bulletin of Envi

, v. 43,

, M. H.; SIGLER, W.V.; SCHMUCKI, M.; BERNASCONI,

S.M.; ZEYER, J. Activity and diversity of sulfate-reducing bacteria in a petroleum

ntaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology

p. 505-510, 198

KLEIMKEMPER, J.;SCHROTH

hydrocarbon-co

, v. 68, p.

, J.L.; VINCENT, C.; BALLARD, J.D. Desulfovibrio sp. genes

sulfate during metabolism of hydrogen and lactate. Applied

1516-1523, 2002.

KRUMHOLZ, L.R.; STEGER

involved in the respiration of

and Environmental Microbiology, v. 68, p. 1932-1937, 2002.

SUFLITA, J.M.; TANNER, R.S. Cresol metabolism by the sulfate-reducing

bacterium Desulfotomaculum sp. strain groll. Can. J. Microbiol./Rev. Can. Microbiol

LONDRY, K.L.;

. v.

inated harbor sediments under

45 (6), p. 458-463, 199

LOVLEY, D.R.; COATES, J.D; ANDERSON, R.T.; WOODWARD, J.C.; PHILLIPS, E.J.P.

Anaerobic hydrocarbon degradation petroleum-contam

Referências Bibliográficas 122

sulfate-reducing and artificially imposed iron-reducing conditions. Environmental

Science Technology, v. 30, p. 2784-2789, 1996.

s: análises físico-químicas e microbiológicas. 2ª MACÊDO, J.A.B. Métodos laboratoriai

edição, atualizada e revisada, Belo Horizonte, CRQ, 450 p., 2003.

DIGAN, M. T. Microbiology, Physiology and Ecology of Phototrophic BacteriaMA

. In:

Biology of Anaerobic Microorganisms. Edited by Alexander J.B. Zehnder, p. 39-111,

One hundred years of anaerobic treatment. In: International Symposium

Digestion, v.2, 1981, Travemunde. Proceedings … Amsterdam: Elsevier

1988.

MCCARTY, P. L.,

on Anaerobic

Biomedical Press B.V., p. 3-22, 1982.

INISTÉRIO DA SAÚDE, Portaria 1.469 de 2000.

ORGAN, P. Biotechnology and oil spills. Biotechnology Education

, v. 3, n. 2, p. 83-88,

oxigênio (DBO) - Método de

1992.

NBR 12614 - Determinação da demanda bioquímica de

incubação (20

C, cinco dias).

NBR – 12772/1992 - Método colorimétrico por redução com ácido ascórbico

ulphate-reducing bacteria: comtemporary ODOM, J. M.; R. SINGELTON, Jr. The s

perspectives. New York, Springer-Verlag, 1993.

coluna do rejeito remoído do processo de OLIVEIRA, M. dos Santos. Flotação em

concentração da apatita (Cap. III e IV). Dissertação de Mestrado. FEQUI/UFU,

ARRA, J.L., GUINEA, J., MANRESA, M.A. Chemical characterization and physico-

ehavior of biosurfactants. Surfactants and Detergents Technical

Uberlândia, 2004, 131 p.

chemical b

. JAOCS, v.66,

MI, J.; YOUNG, L.Y. Anaerobic degradation of benzene in BTX

t on sulfate reduction. FEMS Microbiology Letters

n.1, 1989.

PHELPS, C.D.; KAZU

mixtures dependen

, v. 145, p. 433-

A, B.; AMERYK, A.; BOLALEK, J. The occurence and activity of sulphate-

reducing bacteria in the bottom sediments of the Gulf of Gdansk. Oceanologia

437, 1996.

PODGÓRSK

, v. 42 (1),

p. 105-117, 2000.

PORTER, M.R. Handbook of surfactants.

New York: Chapman & Hall, 2

ed., 1994.

aPOSTGATE, J. R, The sulphate-reducing bacteri

. 2

ed. Cambridge, London. New York –

Melbourne, Cambridge University Press, 1984;

RINCE, R. C. Petroleum spill bioremediation in marine environments. Critical Reviews in P

Microbiology, v. 19, p. 217-242, 1993.

; WILKES, H.; WIDDEL, F. Degradative capacities and 16S rRNA-

l hybridisation of sulfate-reducing bacteria in an anaerobic enrichment

RABUS, R.; FUKUI, M.

targeted whole-cel

Referências Bibliográficas 123

culture utilizing alkylbenzenes from crude oil. Applied and Environmental Microbiology,

técnico ANP, N

6/2001 da Portaria N

310 de 27 de dezembro de 2001.

00 – O ar está mais leve. Ano 11, nº 105, maio/junho,

S, EVE. Remediation of petroleum contaminated soils

v. 62, p.3605-3613, 1996.

Regulamento

REVISTA PETROBRÁS. Diesel S5

2005.

RISER-ROBERT

. Lewis Publisher,

APTISTA, 2003.

; BARRA, C.M.; MONTEIRO, T.C.N.; BRILHANTE, O. M. Estudo da

combustíveis orgânicos e possíveis conseqüências para

o de Janeiro, Brasil. Cad. Saúde Pública

1998. apud B

SILVA, R. L. B.

contaminação de poços rasos por

a saúde pública no Município de Itaguaí, Ri

, Rio

. 1599-1607, 2002.

remoção biológica de sulfeto a partir de uma população

de Janeiro, v. 18(6), p

da SILVA, A.F.C. Avaliação da

fotossintética anoxigênica. Dissertação de Mestrado – EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2000.

, A.; TESKE, A.; DILLON, J.; STAHL, D.A. Molecular

zation of sulfate-reducing bacteria in the Guaymas Basin. Applied and

SOGIN, M.L.; DHILLON

characteri

Environmental Microbiology, v. 69, no. 5, p. 2765-2772, 2003.

aerobic biotechnologySPEECE, R.E. An

. 1

edição, Nashville, Archae Press, 394 p, 1996.

AVIDOVA, I.A. Anaerobic oxidation of n – Dodecane by

a sulfate-reducing bacterial enrichment culture. Applied and

SUFLITA, J. M.; KROPP, K.G.; D

an addition reaction in

Environmental Microbiology, v. 66, p. 5393-5398, 2000.

.M. Improved production of rhamnolipids by a

Pseudomonas aeruginosa mutant. Iranian Biomedical Journal

ELLEZ, G.T.; NIRMALAKHANDAM, N.; TORRESDEY-GARDEA, J.L. Performance

f an activated sludge system for removing petroleum hydrocarbons from

dvances in Environmental Research

TAHZIBI, A.; KAMAL, F.; ASSADI, M

evaluation o

oilfield produced water. A

, v. 6, p. 455-470, 2002.

ngenharia do petróleoTHOMAS, J. E. Fundamentos da e

. Rio de Janeiro, Interciência, 271 p.,

fuel-contaminated soils. Waste Management

2001.

TRUAX, D.D; BRITTO, R.; SHERRARD, J.H. Bench-scale studies of reactor-based

, v. 15, N

. 5/6, p.351-357,

age tank

treatment of

1995.

U.S.EPA. How to evaluate alternative clean up technologies for underground stor

sites: - A guide for connective action plan reviewers. EPA 510/B-95/007

. Washington

D.C., 1995.

_______, A citizen’s guide to bioremediation. EPA 542-F-96-007

. Washington, D.C., 1996.

ogy verification report. Fiel measurement technologies for TPH

– OCMA-350 oil content analyzer. EPA/600/R-

_______, Innovative technol

in soil. Horiba instruments incorporated

hington D.C., 2001 01/089. Was

Referências Bibliográficas 124

VIEIRA, D. S. Avaliação da biodegradação anaeróbia no tratamento de água de produção.

radação de efluente contendo óleo diesel e gasolina

Dissertação de Mestrado, EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2003, 156 p.

VIEIRA, P. A. Avaliação da biodeg

empregando culturas mistas. Dissertação de Mestrado, FEQUI/UFU, Uberlândia, 2004.

VIEIRA, D.S.; SÉRVULO, E.F.C.; CAMMAROTA, M.C. Degradation potencial and growth

of anaerobic bacteria in produced water. Environmental Techonology

, v.26, n° 8, p. 915-

poration of oxygen from water into toluene and

transformation. Applied and Environmental

922, 2005.

VOGEL, T.M.; GRBIC-GALIC, D. Incor

benzene during anaerobic fermentative

Microbiology, v. 52, p.200-2002, 1986.

ORSEUIL, H. X. Inoculation of contaminated subsurface soils with

enriched indigenous microbes to enhance bioremediation rates. Water Research

WEBER, W. J.; C

, v.8, n. 6,

BELL, C. E.1946. Action of microorganisms on hydrocarbons. Bacteriol. Rev

p. 1407-1414, 1994.

. 10: 1-49.

FUKUI, M.; HARMS, G.; RABUS, R.; SCHRAMM, A.; ZENGLER, K.;

M, C.; WILKES, H. Anaerobic degradation of oil hydrocarbons by sulfate-

and nitrate-reducing bacteria. Microbial Ecology of Oil Fields

WIDDEL, F.

BOREHA

reducing

, In: 8

International Symposium on Microbial Ecology, Canada, 1999.

WIDDEL, F.; RABUS, R. Anaerobic biodegradation of saturated and aromatic hydrocarbons.

Environmental Biotechnology

, v. 12, p. 259-276, 2001.

www.ambientebrasil.com.br : acessado em fevereiro de 2005;

www.anp.gov.br: acessado em fevereiro de 2005 e março de 2005 para consulta do Anuário

estatístico 2001 e 2004;

www.cetesb.gov.br: acessado em fevereiro de 2005;

rwww.br.com.b : acessado em abril de 2005 especificações do óleo diesel

ora.com.brwww.brdistribuid , acessado em maio de 2005;

www.petrobras.com.br, acessado entre janeiro e julho de 2005;

sw/newindex/tuku/MYPER/b08/673.htmhttp://202.114.65.51/fzjx/w , acessado em 2005.

ba04.htmlhttp://www.epa.gov/greenchemistry/s , acessado em agosto de 2005

APÊNDICES

APÊNDICE A

CÁLCULO DA RELAÇÃO CARBONO-NITROGÊNIO

o óleo diesel e da concentração de nitrogênio presente no meio Postgate E modificado.

ão carbono-cloreto de amônio no meio Postgate E modificado é de

proximadamente 4,5. Considerou-se que o óleo diesel tem uma análise elementar semelhante

ntidade de carbono é de 83 – 87% [THOMAS, 2001]. Foi adotado

tal para a concentração de 2,5% de óleo diesel, uma concentração

io.

ativa está no desenvolvimento abaixo:

L/100mL ⇒ 25 mL/L de óleo diesel;

sidade do óleo diesel é aproximadamente 0,85 g/mL [Br Distribuidora,

];

m, têm-se que: 25 mL/L x 0,85 g/mL = 21,25 g/L

 Considerando que a concentração de carbono no óleo diesel é de 85% [THOMAS,

2001], têm-se:

21,25 g/L x 0,85 = 18,1 g de Carbono/L.

no/L para cada 1 g/L de NH

Cl.

ários 4 g/L de NH

Cl para 18,1 g de carbono/L de óleo diesel.

A relação carbono-nitrogênio foi obtida através da concentração de carbono presente

A relaç

à do petróleo, no qual a qua

no planejamento experimen

de 5 g/L de cloreto de amôn

A justific

 2,5% (v/v) de óleo diesel corresponde a 2,5 m

 A den

2005

 Assi

Já no meio Postgate a relação é de 4,5 g de carbo

Então, seriam necess

Apêndices 125

APÊNDICE B

ÇÃO E MINIMIZAÇÃO DAS

SPOSTAS DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

start;

rint(`##################################################################`);

em fevereiro de 2005 (Claudio Roberto Duarte)`);

pontos de máximo, mínimo ou sela para um PE`);

############################################`);

ro de variaveis de planejamento:`);

condvariaveis=2 then

rmo independente`);

t0:=readstat(``);

ferente ao termo X1`);

rint(`Entre com o valor referente ao termo X2`);

valor referente ao termo X1^2`);

``);

m o valor referente ao termo X2^2`);

t22:=readstat(``);

nte ao termo X1X2`);

:=matrix(2,2,[t11,t12/2,t12/2,t22]):

b:=matrix(2,1,[t1,t2]):

erse(A)&*b):

[i]:=x0[i,1] od:

2',X[2]);

]);

+t11*X[1]^2+t22*X[2]^2+t12*X[1]*X[2]:

ALGORITMO PARA MAXIMIZA

Pe:=proc();

lprint(`Programa implementado

lprint(`Este programa obtém os

lprint(`######################

#Primeiramente obter a forma canônica para o modelo ajustado de ordem 2:

with(linalg):

lprint(`Digite o nume

condvariaveis:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor do te

lprint(`Entre com o valor re

t1:=readstat(``);

t2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o

t11:=readstat(

lprint(`Entre co

lprint(`Entre com o valor refere

t12:=readstat(``);

charpoly(A,lambda):

lambda:=[eigenvals(A)]:

x0:=evalm(-0.5*inv

for i from 1 to 2 do X

#lprint('X1',X[1]);

#lprint('X

#lprint('lambda[1]',lambda[1]);

#lprint('lambda'[2],lambda[2

y[0]:=t0+t1*X[1]+t2*X[2]

Apêndices 126

if lambda[1]*lambda[2]>0 then

if lambda[1]>0 then

ema possui ponto de mínimo`);

lprint('X1',X[1]);

i ponto de máximo`);

o possui ponto de máximo e nem de mínimo`);

mizar [1] ou minimizar [2] a sua resposta:`);

ondiaux:=readstat(``);

t12/2,t12/2,t22-lambda[1]]):

extra:=matrix(2,1,[m11,m21]):

[1,1])=0:

11linha:=solve(P1,m11):

lprint('m11linha',m11linha);

21linha:=1:

lprint('m21linha',m21linha);

11:=m11linha/produto: m21:=m21linha/produto:

:=matrix(2,2,[t11-lambda[2],t12/2,t12/2,t22-lambda[2]]):

extra:=matrix(2,1,[m12,m22]):

a):

lprint(`Este probl

lprint('X2',X[2]);

fi;

if lambda[1]<0 then

lprint(`Este problema possu

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

fi;

#Portanto a forma canônica ajustada é :

if lambda[1]*lambda[2]<0 then

lprint(`Este problema nã

lprint(`Você deseja máxi

y:=y[0]+lambda[1]*w[1]^2 +lambda[2]*w[2]^2

A:=matrix(2,2,[t11-lambda[1],

m21:=1:

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

P1:=evalm(Mat1

#lprint('P1',P1);

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0

produto:=(m11linha^2+m21linha^2)^(0.5):

m22:=1:

Mat1:=evalm(A&*Mextr

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

Apêndices 127

m12linha:=solve(P1,m12):

inha);

roduto:=(m12linha^2+m22linha^2)^(0.5):

uto:

12:=m12linha/produto:

22',m22);

12,m21,m22]):

1,[x1-X[1],x2-X[2]]):

*MatrizX):

,X[2]);

omo quero maximizar a resposta farei

f condiaux=1 then

f lambda[1]<0 then www1:=w1: www2:=w2: fi;

a para w:`):

rint(`menor valor da faixa:`);

rint(`Entre com o incremento desejado:`):

(``);

to auxw2 by increw do w2:=i:

esp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

assign('x2'):

from 1 to (cont-2) do

[i]>=-1 and Xx2[i]<=1 then

#lprint('m12linha',m12l

m22linha:=1:

m22:=m22linha/prod

#lprint('m11',m11);

#lprint('m12',m12);

#lprint('m21',m21);

#lprint('m

Matrizm:=matrix(2,2,[m11,m

transM:=transpose(Matrizm):

MatrizW:=matrix(2,1,[www1,www2]):

MatrizX:=matrix(2,

Eq:=evalm(transM&

#lprint('x1',x1);

#lprint('x2',x2);

#lprint('X[1]',X[1]);

#lprint('X[2]'

if lambda[1]>0 then www1:=w2: www2:=w1: fi;

w1:=0: cont:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faix

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

increw:=readstat

for i from auxw1

assign(Resp[cont]): Ww2[cont]:=w2: Xx1[cont]:=x1: Xx2[cont]:=x2: unassign('x1'): un

cont:=cont+1: od:

aux:=1:

for i

if Xx2

if Xx1[i]>=-1 and Xx1[i]<=1 then

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

Apêndices 128

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vw2[aux]:=Ww2[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

axw2:=(max(seq(Vw2[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

rint(`O valor do w2 máximo em modulo é=`,Maxw2);

w2:=Maxw2: Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

Var2:=x2:

2'):

t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

tra,Var1=-1..1,Var2=-1..1,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection =

RTHOGONAL));

w2: fi;

lambda[1]<0 then www1:=w2: www2:=w1: fi;

ont:=0:

`):

w1:=readstat(``);

uxw2 by increw do w2:=i:

[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

w2[cont]:=w2: Xx1[cont]:=x1: Xx2[cont]:=x2: unassign('x1'): unassign('x2'):

#lprint(`O valor de x2 é=`,Vx2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

od:

assign(Resp[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

fi;

Var1:=x1:

Var3:=0:

unassign('Var1'): unassign('Var

Eqextra:=t0+t1*Var1+

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqex

#Como quero mínimizarr a resposta farei

if condiaux=2 then

if lambda[1]>0 then www1:=w1: www2:=

w1:=0: c

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:

lprint(`menor valor da faixa:`);

aux

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to a

Resp[cont]:=solve({Eq

assign(Resp[cont]): W

cont:=cont+1: od:

aux:=1:

Apêndices 129

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-1 and Xx2[i]<=1 then

and Xx1[i]<=1 then

aux]:=Xx2[i]:

2[aux]:=Ww2[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

lprint(`O valor de x2 é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

ux+1:

;

od:

w2:=(max(seq(Vw2[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

w2:=Maxw2: Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

rint(`Entre com o valor referente ao termo X1`);

t(`Entre com o valor referente ao termo X2`);

rint(`Entre com o valor referente ao termo X1^2`);

t(`Entre com o valor referente ao termo X2^2`);

t22:=readstat(``);

t12:=readstat(``);

nt(`Entre com o valor referente ao termo X1X3`);

t13:=readstat(``);

erente ao termo X2X3`);

alpha de ortogonalidade`);

adstat(``);

atrix(3,3,[t11,t12/2,t13/2,t12/2,t22,t23/2,t13/2,t23/2,t33]):

if Xx1[i]>=-1

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

Vx2[

aux:=a

fi;

Max

lprint(`O valor do w2 máximo em modulo é=`,Maxw2);

assign(Resp[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

fi;

if condvariaveis=3 then

lprint(`Entre com o valor do termo independente`);

t0:=readstat(``);

t1:=readstat(``);

lprin

t2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X3`);

t3:=readstat(``);

t11:=readstat(``);

lprin

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X3^2`);

t33:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1X2`);

lpri

lprint(`Entre com o valor ref

t23:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor do

alpha:=re

A:=m

print(evalm(A));

Apêndices 130

charpoly(A,lambda):

b:=matrix(3,1,[t1,t2,t3]):

33*X[3]^2+t12*X[1]*X[2]+t13*X[1]*X[3]+t23*

nt('X1',X[1]);

'X2',X[2]);

#lprint('X3',X[3]);

#lprint('lambda[1]',lambda[1]);

#lprint('lambda'[2],lambda[2]);

]);

*lambda[2]>0 then

lambda[1]>0 then

ínimo`);

lprint('X2',X[2]);

('X3',X[3]);

lambda[1]<0 then

e máximo`);

rint('X3',X[3]);

;

2]*lambda[3]<0 or lambda[1]*lambda[2]<0 and

(`Este problema não possui ponto de máximo e nem de mínimo`);

ar [2] a sua resposta:`);

iaux:=readstat(``);

2]*w[2]^2+lambda[3]*w[3]^2:

bda[1]]):

lambda:=[eigenvals(A)]:

x0:=evalm(-0.5*inverse(A)&*b):

for i from 1 to 3 do X[i]:=x0[i,1] od:

y0:=t0+t1*X[1]+t2*X[2]+t3*X[3]+t11*X[1]^2+t22*X[2]^2+t

X[2]*X[3]:

#lpri

#lprint(

#lprint('lambda'[3],lambda[3

if lambda[1]

if lambda[2]*lambda[3]>0 then

lprint(`Este problema possui ponto de m

lprint('X1',X[1]);

lprint

fi;

lprint(`Este problema possui ponto d

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

fi;

if lambda[1]*lambda[2]>0 and lambda[

lambda[2]*lambda[3]>0 then

lprint

lprint(`Você deseja máximizar [1] ou minimiz

cond

y:=y0+lambda[1]*w[1]^2 +lambda[

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[1],t12/2,t13/2,t12/2,t22-lambda[1],t23/2,t13/2,t23/2,t33-lam

m31:=1:

Mextra:=matrix(3,1,[m11,m21,m31]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

Apêndices 131

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

#lprint('P1',P1);

2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

t('P2',P2);

lprint('m11linha',m11linha);

lprint('m21linha',m21linha);

roduto:=(m11linha^2+m21linha^2+m31linha^2)^(0.5):

lprint('m21',m21);

23/2,t13/2,t23/2,t33-lambda[2]]):

,m22,m32]):

at1:=evalm(A&*Mextra):

])=0:

,{m12,m22})):

32linha:=1:

lprint('m12linha',m12linha);

)^(0.5):

12:=m12linha/produto:

22:=m22linha/produto:

linha/produto:

lprint('m22',m22);

12/2,t22-lambda[3],t23/2,t13/2,t23/2,t33-lambda[3]]):

,[m13,m23,m33]):

extra):

at1[2,1])=0:

#lprin

assign(solve({P1,P2},{m11,m21})):

m11linha:=m11:

m21linha:=m21:

m31linha:=1:

#lprint('m31linha',m31linha);

m11:=m11linha/produto: m21:=m21linha/produto: m31:=m31linha/produto:

#lprint('m11',m11);

#lprint('m31',m31);

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[2],t12/2,t13/2,t12/2,t22-lambda[2],t

m32:=1:

Mextra:=matrix(3,1,[m12

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

P2:=evalm(Mat1[2,1

assign(solve({P1,P2}

m12linha:=m12:

m22linha:=m22:

#lprint('m22linha',m22linha);

#lprint('m32linha',m32linha);

produto:=(m12linha^2+m22linha^2+m32linha^2

m32:=m32

#lprint('m12',m12);

#lprint('m32',m32);

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[3],t12/2,t13/2,t

m33:=1:

Mextra:=matrix(3,1

Mat1:=evalm(A&*M

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

P2:=evalm(M

Apêndices 132

assign(solve({P1,P2},{m13,m23})):

inha:=m13:

23linha:=m23:

nha:=1:

lprint('m33linha',m33linha);

roduto:=(m13linha^2+m23linha^2+m33linha^2)^(0.5):

duto:

uto:

t('m13',m13);

nt('m33',m33);

trizm:=matrix(3,3,[m11,m12,m13,m21,m22,m23,m31,m32,m33]):

##############################################################

###`);

print(`A matriz m é:`);

rint(evalm(Matrizm));

###########################################################################

######################`);

2,www3]):

evalm(transM&*MatrizX):

t('x1',x1);

t('X[3]',X[3]);

Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

f lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]> 0 then

lambda[1]>0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

: www3:=w3: fi;

f lambda[3]>0 then www1:=w2: www2:=w3: www3:=w1: fi;

2:=0: w3:=0: cont:=0:

m13l

m33li

#lprint('m13linha',m13linha);

#lprint('m23linha',m23linha);

m13:=m13linha/pro

m23:=m23linha/produto:

m33:=m33linha/prod

#lprin

#lprint('m23',m23);

#lpri

lprint(`#######################

###############################

lprint(`##########

#############

transM:=transpose(Matrizm):

MatrizW:=matrix(3,1,[www1,www

MatrizX:=matrix(3,1,[x1-X[1],x2-X[2],x3-X[3]]):

Eq:=

#lprin

#lprint('x2',x2);

#lprint('x3',x3);

#lprint('X[1]',X[1]);

#lprint('X[2]',X[2]);

#lprin

#Como quero maximizar a resposta farei

if condiaux=1 then

auxpositivo:=sort([seq(lambda[i],i=1..3)]);

if lambda[2]>0 then www1:=w2: www2:=w1

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

Apêndices 133

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

rint(`Entre com o incremento desejado:`):

uxw2 by increw do w1:=i:

2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

1[cont]:=w1: Xx1[cont]:=x1; Xx2[cont]:=x2; Xx3[cont]:=x3; unassign('x1'):

nassign('x2'): unassign('x3'):cont:=cont+1: od;

x1[i]<=alpha then

x3[i]>=-alpha and Xx3[i]<=alpha then

x1[aux]:=Xx1[i]:

:=Xx2[i]:

x]:=Xx3[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

x2[aux]);

`,Vw2[aux]);

:=aux+1:

1[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

(`O valor de x1 é=`,x1);

valor de x2 é=`,x2);

r de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

ar3:=x3:

gn('Var1'): unassign('Var2'):

qextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

*(Var3):

Var1=-alpha..alpha,Var2=-

lpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

gn('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

auxw2:=readstat(``);

increw:=readstat(``);

readlibe(unassign):

for i from auxw1 to a

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[

assign(Resp[cont]): Ww

aux:=1:

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-alpha and Xx2[i]<=alpha then

if Xx1[i]>=-alpha and X

if X

Vx2[aux]

Vx3[au

Vw1[aux]:=Ww1[i]:

#lprint(`O valor de x2 é=`,V

#lprint(`O valor do vw2 é=

aux

fi;

od;

Maxw1:=(max(seq(Vw

lprint(`O valor do w máximo em modulo é=`,Maxw1);

w1:=Maxw1:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=

assign(Resp[cont]):

lprint

lprint(`O

lprint(`O valo

unassi

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)

print(plot3d(Eqextra,

unassi

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

Apêndices 134

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

Var1:=x1:

=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

ar3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

ha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

raízes lambda sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

dição para que uma raíz lambda seja negativa e pretendo maximizar a resposta

www2,www3]):

3:=0: cont:=0: cont2:=0:

libe(unassign):

t(`maior valor da faixa:`);

dstat(``);

nt(`Entre com o incremento desejado:`):

by increw do w1:=i: cont2:=0:

from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=j:

ont,cont2]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

gn(Resp[cont,cont2]): Ww1[cont,cont2]:=w1: Ww2[cont,cont2]:=w2: Xx1[cont,cont2]:=x1;

x2[cont,cont2]:=x2; Xx3[cont,cont2]:=x3; unassign('x1'): unassign('x2'): unassign('x3'):

nt:=cont+1: od;

:=1:

contador:=(auxw2-auxw1)/increw;

from 0 to (contador) do

Xx1[i,j]>=-alpha and Xx1[i,j]<=alpha then

x]:=Xx3[i,j]:

]:=Ww1[i,j]:

w2[aux]:=Ww2[i,j]:

[2]*Ww2[i,j]^2+lambda[3]*Ww3[i,j]^2:

#lprint(`O valor de x1[`,aux,`] é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2[`,aux,`] é=`,Vx2[aux]);

ux,`] é=`,Vx3[aux]);

unassign('Var2'): unassign('Var3'):

Eqextra:

r1)*(V

alp

fi; #Finaliza a Condição para que duas

#Con

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]< 0 then

#MatrizW:=matrix(3,1,[www1,

if lambda[1]<0 then www1:=w3: www2:=w1: www3:=w2: fi;

if lambda[2]<0 then www1:=w1: www2:=w3: www3:=w2: fi;

if lambda[3]<0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

read

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprin

auxw2:=rea

lpri

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to auxw2

for j

Resp[c

assi

cont2:=cont2+1: od; co

aux

for i

for j from 0 to (contador) do

if Xx2[i,j]>=-alpha and Xx2[i,j]<=alpha then

if Xx3[i,j]>=-alpha and Xx3[i,j]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i,j];

Vx2[aux]:=Xx2[i,j]:

Vx3[au

Vw1[aux

#AuxWmax[aux]:=y0+lambda[1]*Ww1[i,j]^2 +lambda

#lprint(`O valor de x3[`,a

Apêndices 135

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

#lprint(`O valor de vw1 é=`,Vw1[aux]);

codi:=i:

codj:=j:

aux:=aux+1:

;

od;

#lprint('codi',(codi-1));

int('codj',(codj-1));

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

AuxWmax[i]:=y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2:

#lprint(`AuxWmax[`,i,`]é:`,AuxWmax[i]);

,i,`]`,AWW1[i]);

,i,`]`,AWW2[i]);

,i,`]`,AWW3[i]);

od;

rint(`O valor do lambda3`,lambda[3]);

ormaximoW:=max(seq(AuxWmax[i],i=1..(aux-1)));

ambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

W2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

if lambda[2]<0 then w1:=Vw1[i]: w3:=0: w2:=Vw2[i]: fi;

bda[3]<0 then w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: w3:=0: fi;

rint(`W1`,AWW1[i]);

lprint(`W2`,AWW2[i]);

lprint(`W3`,AWW3[i]);

;

uxWmax[0]:=0:

fi;

od;

#lpr

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=

#lprint(`W1[`

#lprint(`W2[`

#lprint(`W3[`

#lprint(`O valor do lambda1`,lambda[1]);

#lprint(`O valor do lambda2`,lambda[2]);

#lp

val

lprint(`valor máximo da eq`,valormaximoW);

for i from 1 to (aux-1) do

if l

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AW

if valormaximoW=(y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2) then

if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: fi;

if lam

od;

Apêndices 136

#for i from 1 to (aux-1) do

#if AuxWmax[i]<= AuxWmax[i-1] then

#AuxWmax[i]:=AuxWmax[i-1]:

# if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=AWW2[i]: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[2]<0 then w1:=AWW1[i]: w3:=0: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[3]<0 then w1:=AWW1[i]: w2:=AWW2[i]: w3:=0: fi;

#lprint(`O valor do AuxWmax

#lprint(`O valor do w1 máximo é=`,w1);

#lprint(`O valor do w2 máximo é=`,w2);

# fi;

#od;

#lprint(`O valor maximo da eq é:`,AuxWmax[aux-1]);

#for j from 1 to (cont-2) do

#Maxw1[1]:=max(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1)));

#Maxw2[1]:=max(seq(Vw2[i],i=1..(aux-1)));

#od;

#MAXw1:=max(seq( Maxw1[j],j=1..(aux-1)));

#MAXw2:=max(seq( Maxw2[j],j=1..(aux-1)));

lprint(`O valor do w1 máximo é=`,w1);

lprint(`O valor do w2 máximo é=`,w2);

Resposta[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resposta[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('V

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var r3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33* +t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(V

print(plot3d(Eqextra,Var ..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCO xes=BOXED,projection = ORTHO ));

unassign('Var1'): unassign('V r2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Va 3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33* +t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(V

print(plot3d(Eqextra,Va ..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHC ,axes=BOXED,projection = ORTHO ));

unassign('Var2'): unassign('V 1:=x1:

qextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

[i] máximo é=`,AuxWmax[i]);

ar2'):

2+t3*Va

ar3):

(Var3)^2

1=-alpha

NTOUR,a GONAL

ar3'): Va

r2+t3*Var (Var3)^2

ar3):

r1=-alpha

ONTOUR GONAL

ar3'): Var

Apêndices 137

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes= RTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lamb a sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

fi;

#*********************** ***********************

************************

#Como quero mínimizar a resposta farei

*****************************************************************************************

***********************************

if condiaux=2 then

uxpositivo:=sort([seq(lambda[i],i=1..3)]);

#Condição para que dua positiva e pretend

if lambda[1]*lambda[2]*lambda 0 then

if lambda[1]<0 then www1:=w1 w2:=w2: www3:=w3: fi;

if lambda[2]<0 then www1:=w2: www2:=w1: www3:=w3: fi;

if lambda[3]<0 then www1:=w2 w2:=w3: www3:=w1: fi;

w2:=0: w3:=0: cont:=0:

lprint(`Entre com a faixa para w

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

adlibe(unassign):

or i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i:

esp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

ssign(Resp[cont]): Ww1[cont]:=w1: Xx1[cont]:=x1; Xx2[cont]:=x2; Xx3[cont]:=x3; unassign('x1'):

unassign('x2'): unassign('x3'):cont:=cont+1:

aux:=1:

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-alpha and Xx2[i]<

Xx1[i]>=-alpha and Xx1[i]<=alpha then

Xx3[i]>=-alpha and Xx3[i]<=alpha then

x1[aux]:=Xx1[i]:

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vx3[aux]:=Xx3[i]:

Vw1[aux]:=Ww1[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

,Var3=-

BOXED,projection = O

*******************************************

***********

s raízes lambda sejam o minimizar a resposta

[3]<

: ww

:`):

od;

=alpha then

Apêndices 138

fi;

od;

#Maxw1:=(min(seq(Vw1[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

Maxw1:=(min(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1))));

lprint(`O valor do w mínimo em modulo é=`,Maxw1);

w1:=Maxw1:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont]):

Eqfinal:=t0+t1*x1+t2*x2+t3*x3+t11*(x1)^2+t22*(x2)^2+t33*(x3)^2+t12*(x1)*(x2)+t13*(x1)*(x3)+t23*(x2)*(

x3):

lprint(`O valor mínimo da resposta é `,Eqfinal);

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

nassign('Var1'): unassign('Var2'):

qextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

ar1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PAT =BOXED,projection

unassign('Var1'): unassign('Var r2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var ar3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33* +t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var pha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('V ar1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var ar3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33* +t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,p jection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lamb negativa e pretendo minimizar a resposta

#Condição para que uma raíz lambda seja po izar a resposta

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]> 0 then

#MatrizW

if lambda[1]

if lambda[2]>0

if lambda[3]>0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

CHCONTOUR,axes = ORTHOGONAL));

3'): Va

2+t3*V (Var3)^2

1=-alpha..al

ar3'): V

2+t3*V (Var3)^2

da sejam

sitiva e pretendo minim

:=matrix(3,1,[www1,www2,www3]):

>0 then www1:=w3: www2:=w1: www3:=w2: fi;

then www1:=w1: www2:=w3: www3:=w2: fi;

Apêndices 139

w3:=0: cont:=0: cont2:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

aux d

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw dstat

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw eadstat

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i: cont2:=0:

for j from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=j:

Resp[cont,cont2]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont,cont2]): Ww1[cont,cont2]:=w1: Ww2[cont,cont2]:=w2: Xx1[cont,cont2]:=x1;

Xx2[cont,cont2]:=x2; Xx3[cont,cont2]:=x3; unassign('x1'): unassign('x2'): unassign('x3'): cont2:=cont2+1:

od; cont:=cont+1: od;

aux:=1:

contador:=(auxw2-auxw1)/increw;

for i from 0 to (contador) do

for j from 0 to (contador) do

if Xx2[i,j]>=-alpha and Xx2[i,j]<=alpha then

if Xx1[i,j]>=-alpha and Xx1[i,j]<=alpha then

if Xx3[i,j]>=-alpha and Xx3[i,j]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i,j];

Vx2[aux]:=Xx2[i,j]:

Vx3[aux]:=Xx3[i,j]:

Vw1[aux]:=Ww1[i,j]:

Vw2[aux]:=Ww2[i,j]:

#AuxWmax[aux]:=y0+lambda[1]*Ww1[i,j]^2 +lambda[2]*Ww2[i,j]^2+lambda[3]*Ww3[i,j]^2:

#lprint(`O valor de x1[`,aux,`] é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2[`,aux,`] é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor de x3[`,aux,`] é=`,Vx3[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

#lprint(`O valor de vw1 é=`,Vw1[aux]);

codi:=i:

codj:=j:

aux:=aux+1:

fi;

od;

#lprint('codi',(codi-1));

#lprint('codj',(codj-1));

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

w1:=rea stat(``);

2:=rea (``);

:=r (``);

Apêndices 140

AuxWmax[i]:=y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2:

#lprint(`AuxWmax[`,i,`]é:`,AuxWmax[i]);

#lprint(`W1[`,i,`]`,AWW1[i]);

#lprint(`W2[`,i,`]`,AWW2[i]);

#lprint(`W3[`,i,`]`,AWW3[i]);

od;

#lprint(`O valor do lambda1`,lambda[1]);

#lprint(`O valor do lambda2`,lambda[2]);

#lprint(`O valor do lambda3`,lambda[3]);

valormaximoW:=min(seq(AuxWmax[i],i=1..(aux-1)));

lprint(`valor mínimo da eq`,valormaximoW);

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

if valormaximoW=(y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2) then

if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then w1:=Vw1[i]: w3:=0: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: w3:=0: fi;

lprint(`W1`,AWW1[i]);

lprint(`W2`,AWW2[i]);

lprint(`W3`,AWW3[i]);

fi;

od;

#AuxWmax[0]:=0:

#for i from 1 to (aux-1) do

#if AuxWmax[i]<= AuxWmax[i-1] then

#AuxWmax[i]:=AuxWmax[i-1]:

# if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=AWW2[i]: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[2]<0 then w1:=AWW1[i]: w3:=0: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[3]<0 then w1:=AWW1[i]: w2:=AWW2[i]: w3:=0: fi;

#lprint(`O valor do AuxWmax[i] mínimo é=`,AuxWmax[i]);

#lprint(`O valor do w1 mínimo é=`,w1);

#lprint(`O valor do w2 mínimo é=`,w2);

# fi;

#od;

#lprint(`O valor mínimo da eq é:`,AuxWmax[aux-1]);

#for j from 1 to (cont-2) do

Apêndices 141

#Maxw1[1]:=max(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1)));

#Maxw2[1]:=max(seq(Vw2[i],i=1..(aux-1)));

#od;

#MAXw1:=max(seq( Maxw1[j],j=1..(aux-1)));

#MAXw2:=max(seq( Maxw2[j],j=1..(aux-1)));

lprint(`O valor do w1 mínimo é=`,w1);

lprint(`O valor do w2 mínimo é=`,w2);

lprint(`O valor do w3 mínimo é=`,w3);

Resposta[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resposta[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('Var3'): Var1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

r1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo minimizar a resposta

fi;

end;

Apêndices 142

APÊNDICE C

CURVA PADRÃO DE SULFETO

y = 40.769x

= 0.9956

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Absorbância (670 nm)

S (mg/L)

BS (mg/L) Absorbância (670 nm)

0 0

1,768 0,051

3,536 0,081

5,304 0,131

7,072 0,165

10,608 0,270

12,376 0,311

17,680 0,448

19,448 0,455

Apêndices 143

APÊNDICE D

CURVA PADRÃO DE SULFATO

y = 131.27x - 17.101

= 0.9737

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

Absorbância (450 nm)

Sulfato (mg/L)

Sulfato (mg/L) Absorbância (450 nm)

10 0,214

20 0,288

30 0,380

40 0,413

50 0,518

60 0,539

70 0,693

Apêndices 144

APÊNDICE E

CURVA PADRÃO DE FÓSFORO

y = 1.6881x + 0.0006

= 0.9999

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.1 0.2 0.3 0.4

Absorbância (880 nm)

Fósforo (mg/L)

Fósforo (mg/L) Absorbância (880 nm)

0 0

0,05 0,028

0,10 0,061

0,20 0,118

0,35 0,205

0,60 0,356

Apêndices 145

APÊNDICE F

RESULTADOS REMOÇÃO DE TPH DOS EXPERIMENTOS

CONTROLE DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Exp. OD (%) N(g/L) BS (%) TPH Inicial TPH Final % Remoção

1 0,5 1,0 0,007

3900 ± 20 3790 ± 8

1,04

2 0,5 1,0 0,053

4120 ± 32 4020 ± 10

1,71

3 0,5 5,0 0,007

3950 ± 15 3930 ± 7

2,00

4 0,5 5,0 0,053

4060 ± 25 4000 ± 5

5 2,5 1,0 0,007

8950 ± 50 8790 ± 12

1,24

6 2,5 1,0 0,053

9110 ± 62 8930 ± 10

1,97

2,5 5,0 0,007

8980 ± 33 8890 ± 11

1,00

2,5 5,0 0,053

9070 ± 55 8840 ± 8

2,50

0,213 3,0 0,03

3210 ± 25 3170 ± 5

1,25

2,787 3,0 0,03

9980 ± 68 9780 ± 15

2,00

1,5 0,426 0,03

6510 ± 44 6440 ± 10

1,07

1,5 5,6 0,03

6620

21 6490 ± 5

1,96

1,5 3,0 0,00

6370

38 6280 ± 7

1,40

1,5 3,0 0,06

6680

42 6540 ± 5

2,10

1,5 3,0 0,03

6450

50 6320

2,00

1,5 3,0 0,03

6530

45 6400

2,00

Apêndices 146

APÊNDICE G

RESULTADOS DA QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS REDUTORAS

DE SULFATO (BRS) DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

BRS (NMP/mL)

Exp. OD (%) N (g/L) BS (%) 1 2 3 Final

1 0,5 1,0 0,007 1,5x10P

1,1x10P

2,0x10P

1,5x10P

0,5 1,0 0,053 1,1x10P

1,4x10P

1,1x10P

1,2x10P

0,5 5,0 0,007 2,3x10P

2,3x10P

2,1x10P

2,2x10P

0,5 5,0 0,053 3,5x10P

3,2x10P

3,1x10P

3,3x10P

2,5 1,0 0,007 2,0x10P

2,3x10P

2,0x10P

2,1x10P

2,5 1,0 0,053 9x5x10P

9,0x10P

9,2x10P

2,5 5,0 0,007 4,6x10P

4,6x10P

2,5 5,0 0,053 3,9x10P

3,3x10P

3,0x10P

3,3x10P

0,213 3,0 0,03 7,0x10P

7,0x10P

7,5x10P

7,2x10P

2,787 3,0 0,03 9,5x10

9,5x10P

1,5 0,426 0,03 1,1x10P

1,1x10P

1,5x10P

1,2x10P

1,5 5,6 0,03 7,0x10P

7,0x10P

7,5x10P

7,2x10P

13 1,5 3,0 0,00 4,3x10P

4,3x10P

1,5 3,0 0,06 1,1x10P

1,1x10P

1,5 3,0 0,03 2,0x10

2,0x10P

1,5 3,0 0,03 3,0x10P

2,0x10P

2,3x10P

Apêndices 147

APÊNDICE H

RESULTADOS DA QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS

DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS (NMP/mL)

Exp. OD (%) N (g/L) BS (%) 1 2 3 Final

1 0,5 1,0 0,007 9,0x10P

9,0x10P

9,5x10P

9,2x10P

0,5 1,0 0,053 9,5x10P

9,5x10P

0,5 5,0 0,007 4,0x10P

4,0x10P

0,5 5,0 0,053 9,0x10P

9,0x10P

7,5x10P

8,5x10P

2,5 1,0 0,007 1,1x10P

1,2x10P

2,5 1,0 0,053 1,1x10P

1,5x10P

2,0x10P

1,5x10P

7 2,5 5,0 0,007 2,3x10P

2,1x10P

2,2x10P

8 2,5 5,0 0,053 6,4x10P

4,6x10P

5,5x10P

9 0,213 3,0 0,03 9,0x10P

9,0x10P

9,5x10P

9,3x10P

10 2,787 3,0 0,03 6,4x10P

6,4x10P

11 1,5 0,426 0,03 4,6x10P

4,6x10P

6,4x10P

5,2x10P

12 1,5 5,6 0,03 2,3x10P

2,1x10P

2,2x10P

13 1,5 3,0 0,00 7,0x10P

7,0x10P

7,5x10P

7,2x10P

14 1,5 3,0 0,06 7,0x10P

7,0x10P

4,3x10P

6,2x10P

15 1,5 3,0 0,03 7,0x10P

7,0x10P

7,5x10P

7,2x10P

16 1,5 3,0 0,03 7,5x10P

7,5x10P

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 