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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO
MOLECULAR E FUNCIONAL DA SUBUNIDADE Rpn10 DO
PROTEASSOMA DE Schistosoma mansoni
Enyara Rezende Morais
Dissertação de Mestrado apresentada
à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como requisito para a obtenção de
título de Mestre em Ciências. Área de
Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues
Ribeirão Preto
2009
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Milhares de livros grátis para download.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Morais, Enyara Rezende
Clonagem, expressão e caracterização molecular e funcional da subunidade Rpn10 do
proteassoma de Schistosoma mansoni. –Ribeirão Preto, 2009.
123p., il., 30cm
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós Graduação em Bioquímica) – Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, 2009.
1. Schistosoma mansoni. 2. Proteassoma. 3. Rnp10
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“ O correr da vida embrulha tudo.
A vida é assim,
esquenta e depois esfria,
aperta e daí afrouxa,
sossega e depois desinquieta,
o que ela quer da gente é
CORAGEM.”
Guimarães Rosa
Dedico esse trabalho à minha mãe, meu anjo da guarda,
meu grande exemplo de vida. Se cheguei até aqui e vou
mais adiante é porque sei que estará comigo.
Ao meu pai, Morais, por entender minhas fraquezas,
vibrar com minhas conquistas e me incentivar sempre.
Obrigada por muitas vezes ter abdicado dos seus sonhos
para viver os meus.
Ao meu irmão, Wágner, pelo carinho e amizade que me
fazem ir em frente. Com você ao meu lado todos os
obstáculos ficam mais fáceis de serem vencidos.
À Ivana, por ser meu espelho de profissional e pessoa; e
por não ser só uma amiga, mas uma irmãe. Você é muito
especial.
Ao Paulo, amor da minha vida, por compreender minhas
ausências, me apoiar, respeitar minhas escolhas, confiar
em mim, me amar, me proteger, ser meu amigo e
companheiro.
“Você caiu do céu,
um anjo lindo que apareceu,
com olhos de cristal,
me enfeitiçou,
eu nunca vi nada igual, ...”
Agradecimentos
A Deus, meu porto-seguro, por me confortar e socorrer quando preciso.
Ao PET-Farmácia/UFOP, pelas oportunidades e pelo aprendizado.
À Profa. Dra. Raquel do Pilar Machado e Profa. Dra. Andréia Alzamora,
por terem me recebido no LH, me iniciado na ciência e me
proporcionado bons momentos que jamais esquecerei.
À Profa. Dra. Renata Guerra de Sá, por ter me dado a chance de
descobrir meu caminho e me ajudado a dar os primeiros passos rumo a
essa conquista.
Aos mestres e alunos do LBBM-UFOP, pela amizade, companheirismo,
alegria, todos vocês estão guardados no fundo do meu coração.
À Roberta e ao Elton, meus grandes amigos e companheiros, obrigada
por fazerem parte da minha vida. A amizade de vocês é de um valor
inestimável.
Ao Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues por ter me recebido e confiado em
mim, por quem tenho profunda admiração e respeito.
Aos colegas de laboratório: Sérgio, Lizandra, Cláudia, Érika e Uendel;
pelo companheirismo e pela indispensável ajuda para o desenvolvimento
deste trabalho. Obrigada pelas risadas, trocas de conhecimentos e
oportunidade de crescimento, obrigada por me aceitarem na equipe!
Às técnicas Elenice e Mara pelo apoio técnico realizado com muita
eficiência e mais que isso, obrigada pelo carinho com que me receberam
e pelo bom convívio todo este tempo.
Aos colegas que passaram pelo laboratório e que cada um a sua maneira
contribuiu de uma forma especial para que esse trabalho se
concretizasse. Obrigada Carla, Camila e Prof. Dr. Olavo Pereira Júnior!
Ao Prof. Dr. William de Castro Borges por acreditar no meu trabalho,
abrir as portas do seu laboratório e me ajudar de maneira brilhante.
À Camila e Érika que foram mais que colegas foram amigas. Afinal,
companheiras são companheiras. Simplesmente obrigada!
Aos técnicos Lúcia e Nego pelos momentos agradáveis no decorrer
destes anos.
Ao Roenick, por me assessorar nos assuntos relativos à informática e
nunca me negar ajuda.
À Wendy, por ser uma pessoa especial e me ajudar, sempre tão
prestativa.
Ao Prof. Dr. Richard John Ward e ao Dr. Roberto Ruller por ter
colaborado para a realização deste trabalho.
A todos os professores, alunos e técnicos do Departamento de
Bioquímica e Imunologia e do Departamento de Biologia Celular que de
alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Aos secretários do Departamento de Bioquímica e Imunologia: Ivone,
Ronaldo, Téia e Lúcia, pelo desenvolvimento eficiente de suas funções e
pela atenção e carinho que sempre me trataram.
À Ana, secretária da Pós-Graduação em Imunologia, pela ajuda e pelo
socorro sempre que precisei.
Ao Dr. Vítor Dias Galban, pelo auxílio competente e valioso quando se
tratava de algum problema de informática.
À Luciana e Sílvia, pela companhia e carinho, que apesar das nossas
diferenças se tornaram pessoas importantes na minha vida.
Ao meu avô Roldão, pela sabedoria e poderosas orações que sempre me
ajudam.
À minha família: tios, tias, primos, primas e agregados, que me levantam
do chão quando a queda é grande e que comemoram comigo quando a
conquista é maior ainda. Obrigada pelo carinho, confiança, incentivo e
principalmente pelas orações!
À minha amiga Joyce, por sempre estar perto mesmo que longe.
Obrigada pela amizade!
Ao CNPq, FAPESP e CAPES, pelo financiamento e apoio dado para que
este trabalho fosse realizado.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que este trabalho
fosse concretizado. Obrigada!
SUMÁRIO
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...............................................................................i
ABREVIAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS ................................................................................iv
RESUMO..................................................................................................................................vi
ABSTRACT........................................................................................................................... viii
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................1
1.1 Aspectos Gerais ..............................................................................................................2
1.2 Ciclo de vida do parasita e patologia da esquistossomose..............................................3
1.3 Aspectos imunológicos....................................................................................................8
1.4 Transcriptoma e genoma do parasita .............................................................................10
1.5 Sistema proteolítico Ubiquitina-Proteassoma................................................................12
1.6 Rpn10: Reconhecimento específico de substratos poliubiquitinados............................17
2. OBJETIVOS........................................................................................................................22
2.1 Objetivo Geral...............................................................................................................23
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................23
3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................24
3.1 Manutenção do ciclo de vida de S. mansoni..................................................................25
3.2 Obtenção da fase de vermes adultos de S. mansoni.......................................................25
3.3 Obtenção da fase de ovos de S. mansoni .......................................................................25
3.4 Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos ........................................26
3.5 Análise in silico .............................................................................................................27
3.6 Análise da estrutura primária.........................................................................................27
3.7 Análise Filogenética ......................................................................................................28
3.8 Análise da estrutura genômica do gene SmRpn10 ........................................................28
3.9 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a análise da expressão
do transcrito que codifica para SmRpn10 no ciclo evolutivo de Schistosoma
mansoni utilizando PCR quantitativo ..................................................................................29
3.10 Extração de RNA total das diferentes fases evolutivas de S. mansoni........................29
3.11 Quantificação do RNA ................................................................................................31
3.12 Tratamento do RNA total com DNAse .......................................................................31
3.13 Obtenção do cDNA do transcrito que codifica para a subunidade Rpn10
em S. mansoni por Transcrição Reversa de RNA total (RT)..............................................32
3.14 Reação em cadeia da polimerase (PCR)......................................................................32
3.15 Purificação do produto de PCR ...................................................................................33
3.16 Clonagem no vetor pGEMT- easy e transformação em células
competentes .........................................................................................................................33
3.17 Minipreparação de DNA plasmidial............................................................................34
3.18 Sequenciamento dos nucleotídeos ...............................................................................35
3.19 Análise computacional das seqüências........................................................................35
3.20 Análise da expressão diferencial do gene que codifica para a subunidade
Rpn10 de S. mansoni utilizando PCR quantitativo – qPCR................................................36
3.21 Clonagem da seqüência codificadora de SmRpn10 em vetor de
clonagem
pET 28a+ (Novagen) para expressão em sistema bacteriano ..............................................36
3.21.1 Características do vetor pET 28a+..................................................................36
3.21.2 Preparação do vetor ........................................................................................38
3.21.2.1 Preparo de células cálcio-competentes ..................................................38
3.21.2.2 Transformação em E. coli DH5α ...........................................................38
3.21.2.3 Extração do DNA plasmidial.................................................................39
3.21.2.4 Digestão do vetor...................................................................................40
3.21.2.5 Defosforilação da forma linear do vetor................................................40
3.21.3 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para expressão da
proteína recombinante................................................................................................40
3.21.4 Amplificação da sequência codificadora da SmRpn10 e ligação
no vetor pET28a.........................................................................................................41
3.22 Expressão da proteína heteróloga em linhagens de E. coli BL21 Rosetta
[DE3]plysS ..........................................................................................................................42
3.22.1 Preparo de células BL21 competentes............................................................42
3.22.2 Expressão da proteína em função do tempo de indução.................................43
3.22.3 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-
PAGE)........................................................................................................................44
3.22.4 Purificação parcial em média escala de proteínas por
cromatografia de afinidade ........................................................................................44
3.22.5 Quantificação da proteína ...............................................................................45
3.23 Confirmação da identidade da proteína por espectrometria de massa.........................45
3.24 Produção de anticorpo anti-Rpn10 de S. mansoni em camundongos
Balb/C..................................................................................................................................46
3.25 Dot-blot........................................................................................................................46
3.26 Purificação do anticorpo..............................................................................................47
3.27 Western blot para detecção da proteína SmRpn10 em extratos protéicos
totais de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos .............................................47
3.28 Ensaio de desafio: infecção experimental por S. mansoni em
camundongos imunizados com SmRpn10 recombinante....................................................48
3.29 Sorologia convencional (ELISA) ................................................................................49
3.30 Preparação do extrato protéico bruto das fases de vermes adultos, ovos,
cercárias e esquistossômulos ...............................................................................................50
3.31 Coloração pela prata de gel de poliacrilamida para proteína.......................................50
3.32 Purificação de conjugados poliubiquitinados por afinidade à proteína
Rpn10...................................................................................................................................51
3.32.1 Preparação de Sepharose 4B aminada e carboxilada......................................51
3.32.1.1 Aminação da Sepharose epoxilada ........................................................51
3.32.1.2 Ativação da Sepharose succinilada........................................................52
3.32.2 Ligação da proteína recombinante Rpn10 à resina ativada ............................52
3.32.3 Verificação da ligação da proteína Rpn10 recombinante a
Sepharose 4B aminada e carboxilada por Western blot.............................................53
3.32.4 Ligação e purificação de conjugados poliubiquitinados.................................53
3.33 Western blot para detecção de proteínas poliubiquitinadas.........................................54
3.34 Análise das proteínas de vermes adultos eluídas da coluna de afinidade
(Rpn10) por LC-MS/MS......................................................................................................55
3.35 Análise estatística ........................................................................................................56
4. RESULTADOS ...................................................................................................................57
4.1 Análise in silico .............................................................................................................58
4.2 Alinhamento da sequência primária de SmRpn10 em relação aos seus
ortólogos e análise filogenética ...........................................................................................59
4.3 Estrutura genômica do gene SmRpn10..........................................................................62
4.4 Amplificação do transcrito do gene SmRpn10 em S. mansoni .....................................63
4.5 Análise da expressão do cDNA que codifica para SmRpn10 no ciclo de
vida do parasita....................................................................................................................63
4.6 Clonagem da sequência codificadora de SmRpn10 em vetor pET 28a+.......................65
4.7 Expressão da proteína recombinante em bactéria E. coli linhagem BL21
Roseta [DE3]pLysS .............................................................................................................68
4.7.1 Determinação do tempo de expressão da proteína SmRpn10...........................68
4.8 Purificação da proteína heteróloga Rpn10.....................................................................69
4.9 Confirmação da identidade da proteína recombinante por espectometria
de massa...............................................................................................................................69
4.10 Produção de anticorpos policlonais específicos contra SmRpn10 em
camundongos........................................................................................................................70
4.11 Expressão da proteína SmRpn10 em extratos protéicos de vermes
adultos, cercárias e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-
Rpn10 total...........................................................................................................................71
4.12 Purificação de anticorpos policlonais específicos contra SmRpn10................................72
4.13 Titulação dos anticorpos policlonais purificados anti-SmRpn10 ................................73
4.14 Expressão da proteína SmRpn10 em extratos protéicos de vermes
adultos, cercárias e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-
Rpn10 purificado .................................................................................................................74
4.15 Dosagem de IgG e IgE por ELISA..............................................................................76
4.16 Proteção induzida in vivo por SmRpn10 .....................................................................78
4.17 Purificação de conjugados poliubiquitinados por afinidade à proteína
Rpn10...................................................................................................................................79
4.17.1 Conjugação da proteína Rpn10 recombinante a sepharose 4B
aminada e carboxilada detectada por Western blot....................................................79
4.17.2 Western blot para detecção de proteínas poliubiquitinadas............................80
4.18 Análise das proteínas de vermes adultos eluídas da coluna de afinidade
(Rpn10) por LC-MS/MS......................................................................................................82
5. DISCUSSÃO........................................................................................................................84
6. CONCLUSÕES...................................................................................................................97
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................99
8. ANEXOS............................................................................................................................118
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Lista de Abreviaturas e Siglas_______________________________________
ii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP Adenosina Trifosfato
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CTAB Brometo de Hexadeciltrimetilamônio
CP Complexo Proteolítico
°C Grau Celcius ou Centígrados
cDNA DNA complementar
DTT Dithiothreitol
DEPC Dietilpirocarbonato
ESTs Expressed Sequence Tags
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
GO Gene Ontology
HEPS [N-(2 Hidroxietil)piperazina-N-(2-Etano Ácido
Sulfônico)]
Kb Kilobase
KDa Kilo Daltons = 1000 Daltons
mRNA RNA mensageiro
mM Milimolar
ml Mililitro
M Molar
NCBI National Center for Biotechnology Information
ONSA Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis
ORESTES Open Reading Frame Expression Sequence Tag
ORF Open Read Frame
Pfam Protein family database
pb Pares de Bases
Rad Radiation (grupo epistático de genes em leveduras)
Rpn Regulatory Particle Non-ATPase
Rpt Regulatory Particle Triple A protein
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
SFB Soro Fetal Bovino
Sm Schistosoma mansoni
Lista de Abreviaturas e Siglas_______________________________________
iii
SMART Simple Modular Architeture Research Tool Database
TE Tampão de Eluição
TFB Transformation Buffer
Tris Tris[hidroximetil]aminometano
µl Microlitro
UV Ultravioleta
UIM
Domínio de ligação à ubiquitina
XGal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Beta-D-Galactopyranoside
ABREVIAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS
Abreviação dos Aminoácidos_______________________________________
v
ABREVIAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS
AMINOÁCIDOS ABREVIAÇÃO DE TRÊS
LETRAS
ABREVIAÇÃO DE
UMA LETRA
Alanina
Ala A
Arginina
Arg R
Asparagina
Asn N
Ácido aspártico
Asp D
Ácido glutâmico
Glu E
Cisteína
Cys C
Glicina
Gly G
Glutamina
Gln Q
Histidina
His H
Isoleucina
Ile I
Leucina
Leu L
Lisina
Lys K
Metionina
Met M
Fenilanina
Phe F
Prolina
Pro P
Serina
Ser S
Tirosina
Tyr Y
Treonina
Thr T
Triptofano
Trp W
Valina
Val V
RESUMO
Resumo________________________________________________________
vii
A degradação intracelular de proteínas mediada pelo sistema de ubiquitina e
proteassoma é uma importante rota na qual inúmeras proteínas são marcadas para a
destruição.
É importante entender como o proteassoma 26S reconhece especificamente
proteínas poliubiquitinadas, porque este reconhecimento é o processo chave na
degradação seletiva destas proteínas. Estudos mostraram que uma subunidade de
50KDa do complexo 19S humano, originalmente chamada de S5a ou Rpn10, poderia
ligar conjugados poliubiquitinados in vitro.
No presente estudo, foi feita a caracterização molecular e funcional da
subunidade Rpn10 do proteassoma do parasita Schistosoma mansoni durante seu
ciclo evolutivo e também, a avaliação desta como alvo de vacina contra a
esquistossomose. Assim, o gene que codifica para Rpn10 foi recuperado dos bancos
de dados do parasita, clonado, expresso em sistema heterólogo, e a proteína
recombinante foi purificada. A partir da proteína purificada, camundongos foram
imunizados para a produção de anticorpos específicos anti-Rpn10.
Nossos resultados demonstraram que a expressão do gene que codifica para
SmRpn10 é diferencialmente expresso. Em relação à proteína, observamos a
presença de SmRpn10 na fase de ovos. A imunização com a SmRpn10 induziu 20%
de proteção contra a infecção experimental com S. mansoni. O experimento de
purificação de conjugados poliubiquitinados por afinidade a Rpn10 indicou que a
proteína é funcional.
Considerando o papel da Rpn10 como receptora de substratos
poliubiquitinados nossos resultados indicam que a proteína é funcional e faz-se
importante conhecer os conjugados poliubiquitinados por ela reconhecidos e o
impacto geral dela no turnover de substratos do proteassoma de S. mansoni.
ABSTRACT
Abstract________________________________________________________
ix
The intracellular degradation of proteins mediated by ubiquitin and the
proteasome system is an important route for proteins which are marked for the
destruction.
It is important to understand how the 26S proteassoma specifically
recognizes polyubiquitinated proteins, because this recognition is the key process in
the selective degradation of these proteins. It has been show that a 50KDa subunit of
the human 19S complex, originally called of S5a or Rpn10, can bind
polyubiquitinated substrates in vitro.
In the present study, molecular and functional characterization of the
proteasomal Rpn10 subunit was made during the life cycle of the parasite
Schistosoma mansoni and the protein was evaluated as a vaccine target against
schistosomiasis. The gene encoding the Rpn10 was identified from the parasite
databases, cloned, expressed in heterologous system, and the recombinant protein
was purified. The purified protein was used to immunized mice for the production of
specific anti-Rpn10 antibodies.
Our results demonstrated that the gene encoding SmRpn10 is differentially
expressed during life cycle of the parasite. We observed the presence of SmRpn10 in
eggs and immunization with SmRpn10 induced 20 % protection against experimental
infection with S. mansoni. Affinity purification of polyubiquitinated substrates for
Rpn10 indicated that the protein is functional.
Considering the importance of the Rpn10 as a receptor for polyubiquitinated
substrates our results indicate that the protein is functional, and therefore, emphasizes
the importance of understanding the process of recognition of ubiquitinated
conjugates, and its general impact on the turnover of substrates of the S. mansoni
proteasome.
1. INTRODUÇÃO
Introdução_______________________________________________________
2
1.1. Aspectos Gerais
O encontro de ovos de Schistosoma em múmias egípcias e chinesas datadas de
3.500 antes de Cristo mostra o quanto antiga é a esquistossomose (AMARAL &
PORTO, 1999).
O gênero Schistosoma foi descrito primeiramente por Bilharz em 1852 e
posteriormente Weinland em 1858, que denominou o gênero deste helminto de
Schistosoma, uma vez que o macho apresenta no corpo uma fenda longitudinal
(schisto=fenda; soma=corpo), conhecido como canal ginecóforo, local onde a fêmea
permanece alojada para que a fecundação ocorra. Entretanto a denominação da
espécie Schistosoma mansoni foi dada por Sambon em 1907. Estudos de Pirajá da
Silva na Bahia, realizados na mesma época, contribuíram muito para a confirmação
que o S. mansoni produzia ovos, habitava as veias mesentéricas e tratava-se de uma
espécie distinta.
O parasita Schistosoma mansoni é o causador da esquistossomose mansônica
humana, popularmente conhecida como “Barriga d'água”, “Xistose” ou “Mal do
Caramujo”.
A esquistossomose possui uma ampla distribuição geográfica, sendo uma das
parasitoses humanas mais difundidas pelo mundo. De acordo com a Organização
Mundial de Saúde, mais de 200 milhões de pessoas são afetadas em todo o mundo e
estima-se que mais de 1,53 milhões de pessoas estão incapacitadas devido à doença
(WHO, 2002 e CHITSULO et al., 2000). No Brasil devido ao clima tropical existem
condições favoráveis à sua transmissão, constituindo então, em um importante
problema de saúde pública, especialmente nas regiões nordeste e sudeste do país
(KATZ, 2003; MELO & COELHO, 2005).
Acredita-se que a introdução desta helmintíase no território brasileiro tenha
Introdução_______________________________________________________
3
ocorrido durante o tráfico de escravos originários da África, tendo início, portanto,
em Recife e Salvador (ARAÚJO, 1986; PARAENSE, 1986; COURA & AMARAL,
2004). A migração de indivíduos dessas áreas endêmicas contribuiu para a
disseminação desta parasitose em áreas até então indenes, onde as precárias
condições sanitárias favoreceram o contato das fezes de indivíduos infectados com
hospedeiros intermediários susceptíveis (ARAÚJO, 1986; PARAENSE, 1986;
AMARAL & PORTO, 1994).
As três espécies que melhor se adaptaram ao parasitismo humano são: S.
mansoni, encontrada nas Américas Central e do Sul e na África; S. hematobium,
encontrada na África e Oriente Médio; S. japonicum, encontrada na China, Japão e
nas Filipinas (BRINDLEY, 2005; MELO & COELHO, 2005).
1.2. Ciclo de vida do parasita e patologia da esquistossomose
Schistosoma mansoni é um trematódeo do gênero Schistosoma, família
Schistosomatidae, classe Trematoda e sub-classe Digenea, possuindo ciclo biológico
do tipo heteroxênico, com acentuado dimorfismo sexual, diferentes estágios de
desenvolvimento e duas formas aquáticas. O parasito apresenta um ciclo biológico
complexo envolvendo uma passagem por um hospedeiro invertebrado, representado
por moluscos do gênero Biomphalaria, e um habitat permanente no hospedeiro
definitivo, representado pela espécie humana (REY, 1991). Durante o ciclo de vida
de S. mansoni, ocorrem diversas mudanças estruturais, fisiológicas e bioquímicas no
parasita devido às adaptações sofridas em diferentes meios como a água e o ambiente
interno de seus hospedeiros.
O ciclo evolutivo do parasita S. mansoni, como demonstrado na Figura 1,
apresenta uma fase sexuada no hospedeiro vertebrado e uma assexuada no
Introdução_______________________________________________________
4
hospedeiro invertebrado. O ciclo se inicia quando a fêmea deposita seus ovos
imaturos e espiculados no sistema porta-hepático. Estes ovos se desenvolvem, uma
parte se aloja nos tecidos, especialmente no fígado induzindo a formação do
granuloma e outra parte atinge o lúmen intestinal, e posteriormente são eliminados
com as fezes, que em contato com a água doce eclodem estimulados pela
temperatura, luz intensa e oxigenação, liberando a forma larval denominada
miracídio. Este, por sua vez, nada ativamente a procura do hospedeiro intermediário
susceptível. No Brasil, os hospedeiros intermediários de maior interesse são os
caramujos das espécies: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria tenagophila e
Biomphalaria straminea. Dentre as de maior importância epidemiológica, B.
glabrata é a que se destaca (COURA & AMARAL, 2004; MELO & COELHO,
2005). Os mecanismos envolvidos no reconhecimento do caramujo, de acordo com
alguns relatos, são controlados por dois tipos de respostas. Primeiro, o miracídio
responderia a estímulos físicos do ambiente e, segundo aos estímulos químicos
originados pelo molusco (KAPP, et al., 2003). Imediatamente após penetrar na
hemocele do caramujo, o miracídio sofre metamorfose, tornando-se esporocisto-mãe.
A segunda geração, que consiste de numerosos esporocistos-filhos, desenvolve-se
por multiplicação assexuada. Estes, por sua vez, migram pelo sistema hemolinfático
até atingirem o hepatopâncreas e gônadas do hospedeiro intermediário, onde por
reprodução assexuada, originam as formas de vida livre, conhecidas como cercárias,
aproximadamente 30 dias após a infecção.
Após deixarem o molusco, as cercárias, devido ao fototropismo, nadam por
movimentação da cauda e permanecem agrupadas em águas rasas, onde têm um
contato máximo com o hospedeiro vertebrado. Em contato com a pele humana, as
Introdução_______________________________________________________
5
cercárias respondem a sinais químicos como os ácidos graxos de cadeia média e
penetram na pele por ação mecânica e enzimática (McKERROW & SALTER, 2002).
As cercárias possuem três tipos de glândulas com vesículas secretórias: as
glândulas acetabulares, a glândula da cabeça e os corpos celulares sub tegumentares,
cada uma delas com função na invasão do hospedeiro ou na transformação do
parasita (CURWEN & WILSON, 2003).
As cercárias penetram ativamente através da secreção de enzimas digestivas e
este processo leva apenas alguns minutos. Após a penetração, as cercárias perdem a
cauda, e algumas horas depois completam a metamorfose transformando-se em
esquistossômulos. Estes migram através da corrente sanguínea, atingem o coração e
o pulmão e, em seguida, o fígado. No sistema porta-hepático, ocorre o
desenvolvimento dos parasitas até a fase de vermes adultos, a maturação, o
acasalamento e o início da ovoposição (NEVES, 2005). Um casal de vermes adultos
ovopõem cerca de 300-1000 ovos/dia. Alguns ovos permanecem na circulação,
podendo atingir órgãos, como os pulmões, medula óssea, rim, baço, coração, e
especialmente o fígado. Os demais se movem progressivamente até atingir o lúmen
intestinal, sendo eliminados junto às fezes (WILSON, 1980).
Introdução_______________________________________________________
6
Figura 1: Ciclo Biológico do S. mansoni. Adaptado de RA Wilson, Introdução à Parasitologia Ed.
EDUSP, 1979.
Introdução_______________________________________________________
7
A patogenia da esquistossomose depende de vários fatores, dos quais podemos
destacar: a carga parasitária, a linhagem do parasita, as características do hospedeiro,
isto é, a imunidade, o estado nutricional e a idade. As características marcantes desta
patologia em longo prazo são: hipertensão portal, esplenomegalia e ascite.
O ovo é o principal fator patogênico na esquistossomose (STADECKER,
1992). Dos ovos depositados na parede intestinal, 30% são eliminados nas fezes. O
restante permanece retido nas paredes do intestino e no parênquima hepático, sendo
responsáveis pela reação inflamatória granulomatosa nos tecidos.
Os ovos liberam antígenos solúveis, e por isso ao se fixarem em tecidos, como
o fígado e intestino, desencadeiam uma reação inflamatória granulomatosa ao seu
redor, podendo resultar em fibrose, hipertensão portal, varizes esofagianas ou retais,
hemorragia e óbito. A fase inicial da formação do granuloma é caracterizada por uma
grande migração de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos em torno da região de
necrose causada pelo ovo. Com o tempo esta área de necrose desaparece, havendo
produção de colágeno e fibrosamento (COSTA-CRUZ et al., 1994; MELO &
COELHO, 2005). A severidade dos sintomas pode ser relatada através de ambas,
intensidade da infecção e resposta imune individual (GRYSEELS et al., 2006).
O desenvolvimento do S. mansoni ocorre como resultado da expressão
coordenada de um conjunto de genes distintos, necessários para as alterações
bioquímicas e adaptações morfológicas observadas durante o ciclo de vida. Desta
forma, o conhecimento dos genes e dos mecanismos que controlam as suas
expressões, permitirão uma melhor compreensão de como o parasita está
programado para viver em ambientes tão distintos. O conhecimento molecular
também poderá permitir novos modelos de investigação de moléculas importantes
que servirão de base para a estruturação de novas drogas quimioterápicas, que
Introdução_______________________________________________________
8
reduziriam os efeitos patológicos da doença na sua forma crônica, bem como de
futuras vacinas, que poderiam resultar numa ação de desencadeamento da resposta
imune protetora, ou num bloqueio do desenvolvimento do parasita no hospedeiro
vertebrado.
1.3. Aspectos imunológicos
Um dos aspectos mais fascinante da biologia do S. mansoni é o fato do parasita
sobreviver por vários anos exposto aos mecanismos imunológicos do hospedeiro sem
aparente dano. Isso pode ser atribuído, em parte, à expressão diferencial de antígenos
que ocorre durante a maturação do verme (SNARY et al., 1980), bem como ao
desenvolvimento de uma dupla membrana externa, constantemente renovada
(HOCKLEY, 1973; WILSON & BARNES, 1974). Outros mecanismos parecem
também implicados na evasão da resposta imune. Assim, a aquisição de proteínas do
hospedeiro como: 1) antígenos dos grupos sanguíneos (GOLDRING et al., 1976), 2)
antígenos do complexo principal de histocompatibilidade I e II (SHER et al., 1978),
3) proteínas inativadoras do sistema complemento (PEARCE et al., 1990), bem
como a síntese de algumas proteínas que bloqueiam a ação de determinados
componentes imunitários (LACLETTE et al., 1992; GHENDLER et al., 1994;
PARIZADE et al., 1994) parecem ser utilizadas pelo parasita como estratégia de
defesa.
Os Schistosomas evoluíram juntamente com seus hospedeiros mamíferos de
forma que os vermes adultos se tornaram capazes de sobreviver por 5 a 10 anos no
sistema vascular de hospedeiros imuno-competentes. Claramente, estes parasitos
tiveram que desenvolver mecanismos de evasão à resposta imune do hospedeiro.
Assim, eles secretam produtos que favoravelmente enganam ou suprimem a resposta
Introdução_______________________________________________________
9
imune do hospedeiro e se protegem com uma barreira refratária à imunidade
chamada de tegumento (VAN HELLEMOND et al., 2006).
Durante as primeiras semanas de infecção experimental em camundongos
observa-se uma resposta predominantemente do tipo T helper 1 (Th1), caracterizada
pela produção de citocinas como IL-2 e INF-γ (FALLON et al., 1998).
Coincidentemente com o início da postura dos ovos (7-8 semanas de infecção)
ocorre uma alteração para um padrão de resposta do tipo Th2 produtora de citocinas
como IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (GRZYCH et al., 1991; PEARCE et al., 1991;
VELLA & PEARCE, 1992).
O principal fator na patogênese da esquistossomose é decorrente da formação
granulomatosa em resposta aos antígenos solúveis dos ovos (MATHEW & BOROS,
1986) e do parasita (LEPTAK & MCKERROW, 1997). A formação do granuloma é
mediada por células T CD4+ (MATHEW & BOROS, 1986; HERNANDEZ et al.,
1997), apresentando, inicialmente, infiltrado celular constituído de neutrófilos,
eosinófilos, mastócitos, macrófagos e linfócitos (METWALI et al., 1996).
Evidências experimentais sugerem que tanto células produtoras de citocinas do
padrão Th1 quanto do padrão Th2 participem da formação da reação granulomatosa
(CHIKUNGUWO et al., 1991; VELLA & PEARCE, 1992; WYNN et al., 1993;
OSWALD et al., 1994; CHENSUE et al., 1995), sendo que essa rede interna de
mediadores solúveis parece ser controlada por citocinas regulatórias como IL-10 e
TGF-β (RAKASZ et al., 1998).
A resposta por células T CD4+ que é induzida pelos antígenos dos ovos
orquestra o desenvolvimento das lesões granulomatosas - que são compostas de
fibras de colágeno e células (macrófagos, eosinófilos e células T CD4+) em torno de
cada ovo (DUNNE & PEARCE, 1999; DAVIES & MCKERROW, 2001). Assim que
Introdução_______________________________________________________
10
os ovos morrem, os granulomas se resolvem, deixando placas fibróticas. As severas
conseqüências da infecção com S. mansoni são resultado de um aumento na pressão
sanguínea portal devido ao fígado tornar-se fibrótico, congestionado e de difícil
perfusão. Sob estas condições, o diâmetro da veia portal aumenta e a sua parede
torna-se fibrótica. Associado a estas mudanças está o desenvolvimento de ascite
(acúmulo de flúidos séricos na cavidade peritonial) e de novos vasos sanguíneos que
estabelecem uma passagem alternativa no fígado, os quais podem se romper, levando
a hemorragia que ameaça a vida (PEARCE & MACDONALD, 2002).
A esquistossome experimental tem sido classificada como uma doença que
cursa com predomínio de resposta do tipo Th2, o que implica em que esse tipo de
resposta possa ser considerado desfavorável para o hospedeiro. Essa hipótese tem
sido reforçada pelos dados obtidos com animais vacinados com antígenos de ovos
associados a IL-12. Eles desenvolvem granulomas menores e com menor grau de
fibrose quando comparados aos não vacinados. A IL-12 sabidamente favorece a
resposta do tipo Th1, e os efeitos na fibrose são acompanhados pela substituição do
padrão dominante de citocinas Th2 característico da infecção com S. mansoni por um
padrão dominante de citocinas Th1 (WYNN et al., 1995).
1.4. Transcriptoma e genoma do parasita
A partir da iniciativa do Programa de Pesquisas em Doenças Tropicais da
Organização Mundial de Saúde e de outras agências de fomento, vários grupos vêm
estudando de forma sistemática o genoma de S. mansoni, expandindo cada vez mais
seu conhecimento (JOHNSTON, 1997).
Durante o começo da década de 90, ocorreu uma rápida expansão do
conhecimento do genoma do Schistosoma, incluindo o desenvolvimento de
Introdução_______________________________________________________
11
bibliotecas de cDNA de várias fases do ciclo de vida do parasita, construção de
bibliotecas de cromossomos artificiais de leveduras, mapas físicos parciais dos
cromossomos, e a geração de mais que 6000 ESTs (Expressed Sequence Tags) que
são sequências parciais de DNA complemantar (cDNA) de S. mansoni (HILLIER et
al., 1996, ADAMS et al., 1993, BLAXTER et al., 1996).
Mas, o avanço no número de seqüências de Schistosoma ocorreu a partir de
2003, como resultado de dois projetos de sequenciamento que ocorreram
simultaneamente no Brasil e na Ásia, o projeto Transcriptoma do S. mansoni, que foi
financiado pela FAPESP, com a participação de um consórcio de laboratórios,
conhecidos como a rede ONSA (Organization of Nucleotide Sequence and Analysis)
e o projeto transcriptoma do S. japonicum, respectivamente.
Sob liderança do pesquisador Sérgio Verjovski-Almeida, no projeto
transcriptoma do S. mansoni foram seqüenciados 163,586 ESTs, com cerca de 150-
160 pb, obtidas das extremidades 5' e 3', sendo que 151,684 foram originadas de
bibliotecas do tipo ORESTES (Open reading frames ESTs), ou seja, a região central
do gene (DIAS-NETO , 2000), e as 11,902 seqüências restantes foram originadas de
bibliotecas normalizadas de vermes adultos. O total predito de genes é
aproximadamente 14,000 genes, o qual cobre aproximadamente 92% do
transcriptoma do parasita. Essas informações abriram perspectivas para o
entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos com o desenvolvimento,
evasão do sistema imune, organização tecidual, sinalização, dimorfismo sexual,
interação com os hospedeiros e a identificação de novos genes que codificam para
proteínas candidatas a vacinas e potencias alvos para a descoberta de novas drogas
(VERJOVSKI, et al., 2003).
Introdução_______________________________________________________
12
O parasita S. mansoni, apresenta um genoma estimado em 2x10
8
pb,
organizado em oito pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par
de cromossomos sexuais com um conteúdo de GC de 34%. Os machos são
homogaméticos (ZZ) e as fêmeas heterogaméticas (ZW) (TANAKA, 1995).
As iniciativas de sequenciamento do genoma completo do parasita S. mansoni
ainda estão em andamento com projetos financiados pelo National Institutes of
Health (NIH) no instituto TIGR (The Institute for Genomic Reasearch, Rockville,
MD, USA), por outra iniciativa brasileira, a Minas Gerais genome Network EST
project e também pelo Instituto Sanger Centre, financiado pela Welcome Trust, UK
(EL-SAYED et al, 2004, BRINDLEY, 2005).
1.5. Sistema proteolítico Ubiquitina-Proteassoma
As células possuem múltiplos sistemas proteolíticos associados a complexos
mecanismos regulatórios que juntos asseguram a degradação seletiva de substratos
alvo. Desta forma, a homeostase celular é mantida (LECKER et al., 2006). As taxas
de síntese e degradação de proteínas em cada célula devem ser balanceadas
precisamente, pois uma pequena redução na síntese ou uma pequena aceleração na
degradação das mesmas pode resultar, por exemplo, em perda de massa do
organismo (MITCH, et al., 1996).
Em células eucarióticas, o “turnover” de proteínas intracelulares é
primariamente mediado pelo sistema ubiquitina-proteassoma (GOLDBERG et al.,
1997). Entretanto, proteínas extracelulares e algumas proteínas de superfície celular
são capturadas por endocitose e degradadas nos lisossomos. Estas organelas contêm
várias proteases, incluindo as catepsinas B, H e D. Algumas proteínas citosólicas são
degradadas através da fusão de vacúolos autofágicos aos lisosssomos. Outro
Introdução_______________________________________________________
13
processo proteolítico citosólico, presente em células de mamíferos, é o sistema
dependente da ativação por Ca
2+
e independente de ATP, que envolve cisteíno
proteases, chamadas calpaínas (ROCK, et al., 1994, GOLL, et al., 2003).
O complexo proteolítico proteassoma-ubiquitina é o responsável pela
degradação das proteínas de meia vida curta, dentre elas as proteínas que regulam o
ciclo celular, fatores de crescimento, receptores de superfície e proteínas envolvidas
no processamento de antígenos para o MHC (complexo maior de
histocompatibildade) de classe I (HERSHKO A., 1996; HOCHSTRASSER M.,
1996; JENTSCH & SCHLENKER, 1995; CIECHANOVER A., 1994; TANAKA K.,
1998).
A via do proteassoma-ubiquitina é formada por dois componentes principais: o
sistema de ubiquitinação e um complexo protéico multicatalítico denominado
proteassoma 26S (GILCKMAN M. H. & CIECHANOVER A., 2002).
O mecanismo proposto para a degradação protéica mediada pelo proteassoma,
pode ser tanto dependente como independente de ATP e ubiquitina. Quando a
degradação é dependente de ATP e ubiquitina, primeiramente o substrato alvo é
poliubiquitinado e, posteriormente, degradado pelo proteassoma, resultando em
pequenos peptídeos e aminoácidos livres, com a reciclagem da ubiquitina.
Para que as proteínas sejam degradadas por esta via, as mesmas precisam
sofrer uma modificação pós-traducional. A ubiquitina é um importante grupo
modificador de proteínas (GLICKMAN & CIECHANOVER, 2002).
O sistema de ubiquitinação refere-se a um grupo de proteínas e enzimas cuja
função primária compreende a marcação de um substrato protéico com uma ou mais
moléculas de ubiquitina. A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos,
evolutivamente conservada em eucariotos. O processo de marcação não está
Introdução_______________________________________________________
14
necessariamente condicionado à degradação pelo proteassoma. Sabe-se atualmente
que somente as proteínas conjugadas com um número igual ou maior do que quatro
moléculas de ubiquitina são direcionadas à degradação pelo proteassoma
(PICKART, C. M., 2001).
O mecanismo de ubiquitinação é um evento dependente de energia, que
ocorre por intermédio da ação seqüencial de três classes de enzimas: enzima
ativadora de ubiquitina (E1), enzima conjugadora de ubiquitina (E2) e enzima de
ligação (E3) como mostrado na Figura 2. Esta última é a enzima chave do processo,
pois é ela quem reconhece o substrato protéico e catalisa a transferência da Ub
ativada ao substrato.
Figura 2. Esquema simplificado da via ubiquitina-proteassoma. A ubiquitina é inicialmente
transferida para enzima ativadora de ubiquitina, E1, de forma dependente de ATP. Esta ubiquitina
ativada é depois transferida para a enzima conjugadora de ubiquitina, E2. Por fim, a ubiquitina é
ligada covalentemente na proteína-alvo pela ubiquitina-ligase E3, dando origem à cadeia de
poliubiquitina. As proteínas poliubiquitinadas são reconhecidas pelo proteassoma 26S e degradadas
numa reação dependente de ATP. Figura adaptada de NAKAYAMA & NAKAYAMA, 2006.
Como mencionado anteriormente, somente o substrato que tenha sido
previamente poliubiquitinado será alvo da degradação pelo proteassoma. Nesta fase,
supõe-se a existência de dois eventos moleculares: o reconhecimento de regiões
específicas nas moléculas de ubiquitina por componentes da porção regulatória 19S
do proteassoma 26S, seguido pelo desenovelamento ATP dependente, realizado por
um grupo de seis ATPases situado na base desta porção regulatória. Somente após
Introdução_______________________________________________________
15
estes dois processos, a proteína é direcionada ao centro catalítico 20S do
proteassoma 26S (PASSMORE, L. A. & BARFORD, D., 2004).
A identificação de um complexo proteolítico com constante de sedimentação
de aproximadamente 26S, com peso molecular em torno de 2.5MDa, carregando o
proteassoma 20S como estrutura central (DRISCOLL & GOLDBERG, 1990),
estendeu os conhecimentos sobre esta máquina proteolítica, possibilitando um
melhor entendimento de muitos aspectos funcionais e estruturais, do agora
denominado Proteassoma 26S. Este complexo, além de possuir o proteassoma 20S
como centro catalítico, possui complexos regulatórios (TANAKA, 1998;
DEMARTINO & SLAUGHTER, 1999). Um deles é o complexo de
multisubunidades denominado de 19S ou PA700 (GLICKMAN et al, 1998;
DEMARTINO & SLAUGHTER, 1999). A associação do 19S a cada uma das
extremidades do proteassoma 20S resulta na formação do proteassoma 26S (EYTAN
et al, 1989; COUX et al, 1996; VOGES et al, 1999; FERRELL et al, 2000).
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Desenovelamento
Abertura
Clivagem
Liberação
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Desenovelamento
Abertura
Clivagem
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Desenovelamento
Abertura
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Desenovelamento
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26SNúcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26SNúcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26SNúcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)Núcleo catalítico 20S (CP)
Partícula regulatória 19S (RP)
Núcleo catalítico 20S (CP)
Proteassoma 26S
Tampa
Base
Reconhecimento
Desenovelamento
Abertura
Clivagem
Liberação
Figura 3. Organização e estrutura do proteassoma 26S. (a) Organização do núcleo catalítico (CP) e
(b) da partícula regulatória (RP) com suas subpartículas tampa e base. As dimensões do CP foram
obtidas a partir da estrutura em cristal do complexo de levedura. Os resíduos de treonina N-terminais
que formam os sítios ativos das proteases nas subunidades β1, β2 e β5 estão indicados. Abreviações:
N, subunidades não-ATPásicas da RP; T, subunidades ATPásicas da RP. (c) Estrutura proposta e
seqüência de eventos que levam a degradação de proteínas ubiquitinadas pela holoprotease 26S.
Figura adaptada de VIERSTRA, R. D.; 2003.
Introdução_______________________________________________________
16
O proteassoma 20S pode interagir com outro complexo regulatório
denominado de PA28, 11S ou REG, dando origem ao complexo denominado de
imunoproteassoma (DEMARTINO & SLAUGHTER, 1999; RECHSTEINER et al,
2000).
O proteassoma 20S possui uma estrutura cilíndrica de aproximadamente 700
KDa, semelhante a um barril, formado por quatro anéis de sete subunidades cada,
onde os dois anéis externos são compostos de subunidades do tipo α, e os dois anéis
internos compostos por subunidades do tipo β - α7β7β7α7 (SCHAUER et al., 1993;
KOPP et al, 1993).
Análises cristalográficas de raios-X do proteassoma 20S bovino e de levedura
(Sacharomyces cerevisae) mostraram que os dois anéis internos formam uma porção
central que abriga os sítios catalíticos ativos, sendo as subunidades β1, β2 e β5,
responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase, tripsina e
quimiotripsina, respectivamente.
O complexo regulatório 19S, de peso molecular de aproximadamente 900kDa,
é composto de 17 subunidades. A ligação desse complexo às extremidades do centro
catalítico 20S é reversível e dependente de ATP (ARENDT et al., 1997; GORBEA et
al., 2000; GLICKMAN et al., 2000). Este complexo pode ser dividido em dois
subcomplexos denominados de base e tampa.
A base é formada por duas subunidades não ATPásicas ou Rpns denominadas
de Rpn1 e Rpn2, e seis subunidades ATPásicas ou Rpts (superfamília AAA de
proteínas) denominadas de Rpt1, Rpt2, Rpt3, Rpt4, Rpt5 e Rpt6, que a despeito de
suas similaridades de seqüências, não são funcionalmente redundantes (RUBIN et
al., 1998; BRAUN et al., 1999). As subunidades Rpts associam-se na forma de um
Introdução_______________________________________________________
17
anel hexamérico fazendo contato direto com as subunidades α do proteassoma 20S
(GLICKMAN & CIECHANOVER, 2002).
A tampa é formada por oito subunidades não ATPásicas ou Rpns denominadas
de Rpn3, Rpn5, Rpn6, Rpn7, Rpn8, Rpn9, Rpn11 e Rpn12, organizadas em uma
forma discoidal de aproximadamente 400kDa. A subunidade Rpn10, também não-
ATPásica, fica localizada entre a base e a tampa do complexo regulatório 19S.
1.6. Rpn10: Reconhecimento específico de substratos poliubiquitinados
O reconhecimento específico de substratos poliubiquitinados destinados à
degradação é um evento de suma importância para o controle da proteólise
intracelular via proteassoma 26S. Portanto, entender como esse complexo
proteolítico realiza este reconhecimento específico é fundamental para se
compreender melhor o processo de degradação de substratos poliubiquitinados
(YOUNG et al., 1998).
Deveraux et al. (1994) demonstraram que a subunidade de 50 kDa presente no
complexo regulatório 19S de humano, denominada de S5a ou Rpn10, era capaz de se
ligar a conjugados poliubiquitinados in vitro, sendo portanto, a primeira subunidade
do proteassoma 26S relacionada a capacidade de reconhecer e se ligar a substratos
poliubiquitinados.
Assim, homólogos da Rpn10 têm sido identificados em vários eucariotos como
Saccharomyces cerevisae (VAN NOCKER et al, 1996a; KOMINAMI et al, 1997),
Saccharomyces pombe (WILKINSON et al., 2000), Arabdopsis thaliana (VAN
NOCKER et al, 1996b), Drosophila melanogaster (HARACSKA & UDVARDY,
1995), Phiscomitrella patens (GIROD et al, 1999), Oriza sativa (YANAGAWA et
al, 1998), Rattus novergicus (PUSCH et al, 1998) e Homo sapiens (FERRELL et al,
Introdução_______________________________________________________
18
1996), e vários nomes foram dados a esta subunidade como Mbp1, Mcb1, Sun1,
Pus1, ASF1, p54, S5a e Rpn10.
Os primeiros 190 aminoácidos da região N-terminal da subunidade Rpn10
definem o domínio denominado de vWA (fator de van Willebrand relacionado à
adesão de plaquetas). O domínio de ligação à cadeia de ubiquitina foi identificado
como uma parte hidrofóbica próxima à região C-terminal da Rpn10, denominado
UIM (FU et al, 1998a; HOFMANN & FALQUET, 2001).
Análises de deleção da Rpn10 revelaram que há pelo menos dois sítios
independentes de ligação a cadeias de poliubiquitina denominados motivo de
interação a ubiquitina – UIM1 (PUbS1) e UIM2 (PUbS2), na metade C-terminal da
Rpn10 de vertebrado (YOUNG et al., 1998; HOFMANN, K. & FALQUET, L. A.,
2001). Embora somente um sítio, por exemplo, UIM1, pareça ser suficiente para a
atividade de ligação de cadeias de poliubiquitina, foi observado em levedura que a
coexistência de UIM2 aumenta a afinidade pela ligação de cadeias de poliubiquitina
(van NOCKER et al., 1996; BEAL et al., 1998; ELSASSER et al., 2004). Sendo
assim, isto indica que UIM1 e UIM2 agem juntos no reconhecimento de cadeias de
poliubiquitina in vitro (YOUNG et al., 1998).
Em alguns organismos, como leveduras, esta proteína é encontrada em duas
situações, como subunidade do proteassoma 26S e como proteína livre (van
NOCKER et al, 1996; WILKINSON et al, 2000).
Uma família de Rpn10 é expressa em estágios específicos do desenvolvimento
do rato, formando proteassomas 26S estágio específico e tecido específico. A análise
do gene da Rpn10 de rato indicou que todos os membros da família da Rpn10 podem
ser gerados a partir de um único gene por splicing alternativo. Alguns dos genes da
família Rpn10 de rato foram encontrados sendo expressos em diferentes estágios de
Introdução_______________________________________________________
19
desenvolvimento, sugerindo que eles possuem funções diferentes durante a
embriogênese. Por exemplo, a Rpn10c e a Rpn10e foram expressas exclusivamente
em estágios específicos do desenvolvimento e em tecidos específicos, enquanto a
Rpn10a foi expressa constitutivamente (KAWAHARA et al., 2000).
van Nocker et al. (1996) mostrou que uma cepa mutante de levedura com
ausência da Rpn10 (∆rpn10) é viável mas hipersensível a análogos de aminoácidos
que produzem proteínas danificadas. O fenótipo ∆rpn10 indica que a Rpn10 não é
somente um receptor de cadeias de poliubiquitina, mas demonstra um papel maior no
reconhecimento de substratos específicos.
Em 1999, Harrop et al. descreveram a identificação de clones de cDNA por
triagem nas bibliotecas de expressão com um soro contra proteínas liberadas por
esquistossômulos no estágio pulmonar em meio de cultura. No total, 11 diferentes
espécies de cDNA foram identificadas. Um destes cDNAs teve um alto grau de
homologia com a subunidade S5a do proteassoma 26S.
Outro papel para a Rpn10 deve ser a estabilização do complexo regulatório
19S. A perda da Rpn10 permite que a tampa e a base do complexo 19S de levedura
se dissociem facilmente in vitro, sugerindo que ela ajude a manter ligado estes dois
subcomplexos (GLICKMAN et al, 1998; FU et al, 2001). Um aspartato na posição
11 próximo a região N-terminal da Rpn10 é crítico para esta associação (FU et al,
2001). Ele se situa dentro de uma região de aproximadamente 150 aminoácidos
relacionado ao domínio denominado fator de von Willebrand (vWA), o qual deve
ajudar na conexão entre a tampa e a base. Papéis adicionais da Rpn10 são possíveis
baseados na sua habilidade de interagir genética ou fisicamente com outras proteínas,
incluindo Rpn1 da base e, Rpn9 e Rpn12 da tampa (KOMINAMI et al, 1997;
TAKEUCHI et al, 1999; WILKINSON et al, 2000; FU et al, 2001).
Introdução_______________________________________________________
20
Para estudar a função desta subunidade em eucariotos superiores, uma cepa
mutante de Drosophila foi construída deletando-se uma única cópia do gene que
codifica a subunidade S5a/Rpn10/p54. Esta deleção causou letalidade polifásica
larva-pupa, defeitos mitóticos múltiplos, acúmulo de grandes multímeros de
proteínas ubiquitinadas e um grande acúmulo de partículas do proteassoma 26S
defeituosas. A deleção da subunidade S5a/Rpn10/p54 não desestabilizou o complexo
regulatório 19S e não atrapalhou a sua montagem com o núcleo catalítico 20S
(SZLANKA et al., 2003).
Um estudo recente mostrou que mutações na Rpn10, Rad23 e UFD1 (todas são
proteínas que podem agir como receptores de substratos poliubiquitinados)
prejudicam seletivamente o “turnover” de diferentes substratos do sistema
proteassoma-ubiquitina. Certos substratos deste sistema como Sic1, Clb2 e Gic2 são
fortemente influenciados pela Rpn10 (VERMA et al., 2004). Isto sugere que uma
classe restrita de substratos do sistema proteassoma-ubiquitina, possivelmente
reguladores de meia-vida curta do ciclo celular e de suas vias eferentes, são
direcionados ao proteassoma pela Rpn10 (MAYOR et al., 2005).
Em 2007, foi demonstrado que a degradação de proteínas ubiquitinadas
mediada pela Rpn10, catalisada pelos domínios UIMs, é indispensável para o
desenvolvimento do camundongo. A deleção da Rpn10 resultou em letalidade na
fase embrionária jovem. Camundongos expressando a porção N-terminal da Rpn10,
a qual contém o domínio vWA mas que perdeu os motivos UIMs, também exibiam
letalidade embrionária, sugerindo a importante contribuição dos domínios UIMs para
a viabilidade. Análises bioquímicas do fígado dos camundongos com a Rpn10
deletada mostraram um prejuízo da degradação específica de proteínas ubiquitinadas
(HAMAZAKI, J.; 2007).
Introdução_______________________________________________________
21
Foram identificados mais de 225 substratos candidatos à degradação pelo
complexo ubiquitina-proteassoma que se acumulam como conjugados ubiquitinados
sobre condição de inibição do proteassoma em Saccharomyces cerevisae. 27% dos
substratos acumularam como espécies ubiquitinadas em células com a Rpn10
depletada, enquanto somente um quinto acumulou em células com Rpn10 faltando o
domínio UIM (MAYOR, T. et al, 2007).
TAN et al usou a proteína recombinante de fusão S5a-GST em uma purificação
por afinidade de proteínas ubiquitinadas a partir de células hepáticas Chang.
Substratos potenciais foram identificados, estes são principalmente relacionados a
importantes funções celulares incluindo metabolismo, tradução e transcrição (TAN,
F. et al; 2008).
Neste sentido, o estudo da subunidade do proteassoma Rpn10, tão importante
no reconhecimento de substratos poliubiquitinados, permitirá um melhor
entendimento da função desta proteína durante o desenvolvimento do S. mansoni no
seu complexo ciclo de vida.
2. OBJETIVOS
Objetivos_______________________________________________________
23
2.1. Objetivo geral
Este trabalho tem como objetivo geral à caracterização molecular e funcional
da subunidade Rpn10 do proteassoma durante o ciclo de vida do parasita S. mansoni.
2.2. Objetivos específicos
Identificar a seqüência que codifica para a subunidade Rpn10 do proteassoma
através de análise in silico nos bancos de dados disponíveis.
Analisar a estrutura primária da proteína e sua filogenia.
Determinar a expressão do gene que codifica para a subunidade Rpn10 no
ciclo de vida do parasita, através de PCR quantitativo.
Expressar a subunidade Rpn10 em sistema heterólogo, purificar, e produzir
anticorpos anti-Rpn10 em camundongos.
Confirmar a identidade da proteína recombinante Rpn10 por espectrometria
de massa.
Avaliar a expressão da proteína nas fases de vermes adultos, ovos, cercárias e
esquistossômulos por Western blot.
Avaliar o efeito protetor desencadeado in vivo pela proteína Rpn10
recombinante contra a infecção por S. mansoni.
Avaliar a funcionalidade da proteína Rpn10 recombinante por meio da
purificação de conjugados poliubiquitinados por cromatografia de afinidade à
Rpn10 a partir de extratos protéicos de vermes adultos, ovos, cercárias e
esquistossômulos e confirmação da purificação por Western blot.
Analisar e identificar as proteínas eluídas da cromatografia de afinidade à
Rpn10 por espectrometria de massa.
3. MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos________________________________________________
25
3.1. Manutenção do ciclo de vida de S. mansoni
O ciclo biológico da linhagem LE do S. mansoni, é mantido rotineiramente no
laboratório de Biologia Molecular de Parasitas do Departamento de Bioquímica e
Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São
Paulo (USP), utilizando moluscos da espécie Biomphalaria glabrata, como
hospedeiros intermediários, e camundongos Swiss e BALB/c, como hospedeiros
definitivos. Os ovos de S. mansoni, presentes nas fezes de camundongos das
linhagens Swiss ou Balb/C previamente infectados com o parasita foram recolhidos
pelo método de Hoffmann (HOFFMANN et al., 1934) e expostos por
aproximadamente 1 hora sob luz, para a liberação dos miracídios. Os miracídios
(cerca de 15 a 18) foram utilizados para infectar o caramujo, que após 38 a 43 dias
liberaram as cercárias, que são as formas infectantes do parasita, que por sua vez
serão utilizadas para infectar o hospedeiro vertebrado. As cercárias foram inoculadas
nos camundongos por via subcutânea.
3.2. Obtenção da fase de vermes adultos de S. mansoni
Os camundongos infectados, após aproximadamente 45 dias, foram
sacrificados e os vermes adultos recuperados do sistema porta-hepático por perfusão,
como descrito por SMITHERS & TERRY (1965). Após a coleta, os parasitas foram
mantidos em meio RPMI (Invitrogen) a 37ºC, suplementado com 20 µM de tampão
HEPES, pH 7.5, sendo em seguida congelados a -70ºC até o momento do uso.
3.3. Obtenção da fase de ovos de S. mansoni
Além dos ovos terem sido obtidos pelo método de Hoffmann, eles também
foram recuperados do fígado de camundongos após 45 dias de infecção com o
Material e Métodos________________________________________________
26
parasita S. mansoni. Cerca de dez fígados foram coletados e homogeneizados em 200
mL de uma solução contendo 1.79 g de Na
2
HPO
4
, 0.09 g de KH
2
PO
4
, pH 8,3 e 20
mg de tripsina (Invitrogen). O homogeneizado foi incubado em estufa a 37ºC durante
3 horas e posteriormente, os ovos foram recuperados por duas peneiras de malhas
metálicas de 0.30 e 0.18 mm respectivamente, em solução de NaCl a 0.9%. (Castro-
Borges, W.; 2005).
3.4. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos
A transformação de cercárias em esquistossômulos foi feita segundo o
método descrito por Harrop e Wilson, 1993. Em linhas gerais, as cercárias após
serem liberadas pelos caramujos foram transferidas para um béquer de vidro de 100
mL e incubadas em gelo por duas horas para sedimentar. Transcorrido este período, o
sobrenadante foi aspirado com o auxílio de pipeta Pasteur. As cercárias presentes no
fundo do tubo foram transferidas para um tubo de poliestireno (tipo falcon) de 15
mL, ressuspendidas em 10 mL de água declorada autoclavada e deixadas em gelo por
10 minutos. O processo de lavagem com água declorada e descarte do sobrenadante
foi repetido por três vezes. Posteriormente a água foi retirada e foram adicionados 6
mL de meio RPMI 1640 (Invitrogen). Para a transformação mecânica, as cercárias
foram vigorosamente agitadas em vórtex (Tecnal TE 089), sob velocidade máxima,
durante 90 segundos para que ocorra a separação da cauda do corpo cercariano. Para
a remoção das caudas, 1 mL de meio RPMI 1640 foi adicionado em cada eppendorf
contendo os corpos cercarianos e as caudas, estes sofreram repetidas lavagens com
meio RPMI, com um intervalo de quatro minutos entre cada lavagem, para
sedimentação dos mesmos e remoção das caudas presentes no sobrenadante. As
lavagens foram acompanhadas em microscópio de luz invertida (Leitz, Diavert). O
Material e Métodos________________________________________________
27
material foi transferido para uma garrafa estéril de 50mL e o volume completado
para 30mL com meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 20 µM de HEPES,
pH 7.4, penicilina cristalina G (1000 UI/mL), estreptomicina (1000 µg/mL) e 10% de
soro fetal bovino (Gibco). A cultura foi mantida a 37°C com atmosfera de 5% CO
2
.
Após o período de incubação, aproximadamente 28 mL do sobrenadante foi aspirado
e descartado; e os 2 mL restantes foram distribuídos em tubos tipo eppendorf e
imediatamente recuperados por centrifugação (centrifuga 5417R-Eppendorf/ 1000g /
3minutos / 4ºC) e mantidos a -70ºC até o momento do uso.
3.5. Análise in silico
A seqüência referente ao cluster da subunidade Rpn10 do proteassoma
(número de acesso SmAE 608378.1) foi recuperada do banco de dados do projeto
transcriptoma do S. mansoni (Verjovski-Almeida et al 2003). A identificação da
provável região codificadora foi feita com o auxílio do algoritmo ORF finder
(www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html), este programa analisa a seqüência do RNAm
maduro identificando o primeiro códon que codifica para o aminoácido metionina e o
primeiro códon de parada da tradução. A seqüência predita para SmRpn10 foi
analisada utilizando os algorítimos BLASTn para nucleotídeos e BLASTx para
aminoácidos (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Visando identificar domínios conservados, a seqüência foi submetida a uma
análise na base de dados do algoritmo Pfam localizado no site
www.sanger.ac.uk/software/pfam/.
3.6. Análise da estrutura primária
As análises para a identificação dos domínios protéicos da proteína
Material e Métodos________________________________________________
28
recombinante SmRpn10 foram realizadas utilizando os programas Pfam
(www.pfam.sanger.ac.uk), SMART (SCHULTZ et al. ,2000) e expasy
(www.expasy.org) . A sequência da SmRpn10 foi alinhada com as sequências
provenientes de outros organismos usando o programa CLUSTALW
(www.2ebi.ac.uk/clustalw) e os resultados foram formatados com o auxílio do
programa Boxshade (www.biomed.pasteur.fr) .
3.7. Análise Filogenética
Os alinhamentos da seqüências preditas bem como dos ortólogos recuperados
do GENEBANK como: Homo sapiens NP002801, Rattus norvegicus AAG09200,
Caenorhabditis elegans NP492809, Xenopus laevis NP001084296, Drosophila
melanogaster NP524204, Schistosoma mansoni Smp000740.2, Schistosoma
japonicum AAW26345, e Schizosacharomyces pombe NP594628 como grupo
externo (outgroup). Estas sequências foram utilizadas para calcular a árvore
filogenética com a utilização do software Mega (version 4.0) (Kumar et al 2004),
utilizando a máxima parcimônia como método de análise. A confiabilidade dos
dados foi avaliada por análise “bootstrap” utilizando 1,000 amostragens. Os
alinhamentos para a reconstrução da filogenia foram feitos com o auxílio do
programa CLUSTAL W, contido no programa MEGA 4.0.
3.8. Análise da estrutura genômica do gene SmRpn10
A sequência de DNA genômico foi recuperada do banco de dados do parasita
S.mansoni GeneDB, cujo número de acesso é Smp000740.2, os íntrons foram
localizados e a seqüência genômica foi alinhada com a seqüência de cDNA com o
auxílio do programa CLUSTALW (
www.2ebi.ac.uk/clustalw).
Material e Métodos________________________________________________
29
3.9. Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a análise da expressão do
transcrito que codifica para SmRpn10 no ciclo evolutivo de Schistosoma
mansoni utilizando PCR quantitativo
Com base na seqüência Smp000740.2, presente no banco de dados do
GeneDB, idealizamos os oligonucleotídeos iniciadores para SmRpn10 com o auxílio
do programa Vector NTI (Invitrogen), para amplificar a matriz de leitura aberta
(ORF) predita do gene a ser estudado (Tabela 1). O alinhamento dos
oligonucleotídeos iniciadores pode ser observado no Anexo 1.
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para o PCR quantitativo. Os clusters foram
recuperados do banco de dados do GeneDB, Sanger-UK e analisados conforme descrito neste item. A
seguir, utilizamos o programa VectorNTI (Invitrogen) para a idealização dos oligos. Como controle
endógeno foi utilizado o gene que codifica para alfa-tubulina.
Cluster
Gene Oligos Temperatura
de
anelamento
Produto
Esperado
(pb)
Smp000740.2 Rpn10 F5’-TGTCGATATTATTAACTTTGGTGAG-3’
R5’-GAACCATCCTCACCAGCAAC-3’
60 °C 174
M80214*
α-tubulina
F5’-GAAATGCTTGTTGGGAGTTG-3'
R5’-TTATCACTTGGCATCTGTCC-3’
60 °C 70
*
Webster J, Seta K A, Chung S C, Mansur T E. A cDNA encoding on alfa-tubbulin from Schistosoma
mansoni. Molecular and biochemical parasitology. v. 51, p. 169-170, 1992.
3.10. Extração de RNA total das diferentes fases evolutivas de S. mansoni
Vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos, foram utilizados para a
extração do RNA total, como descrito a seguir: As diferentes fases evolutivas do
parasito S. mansoni, foram homogeneizadas em politron (JK IKA LABOR
TECHNIIK ULTRA TURRAX T8) com 1,0 mL de Trizol LS (Invitrogen), até
Material e Métodos________________________________________________
30
completa solubilização. Em seguida, a mistura foi incubada por 15 minutos à
temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos de
nucleoproteínas.
Decorrido este intervalo de tempo, o extrato foi passado em uma seringa de 1
mL com agulha de 26G (13 x 4.5) por 3 vezes para conferir a quebra do DNA
genômico e então, foi adicionado à mistura 200µL de clorofórmio. As amostras
foram agitadas vigorosamente em vórtex (tecnal TE 089) por 10 segundos e
incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos. Em seguida, a mistura foi
centrifugada a 12000g por 15 minutos a 4°C (centrífuga 5417R-eppendorf). Após
esta etapa de centrifugação, a mistura separou-se em duas fases, inferior (fase fenol-
clorofórmio), interfase e fase aquosa superior incolor. Neste processo, o DNA fica
retido na interfase, as proteínas na fase orgânica, enquanto o RNA permanece
exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um tubo de
poliestireno estéril (tipo eppendorf) de 1,5 mL e adicionamos aproximadamente 500
µL de etanol 70% em água previamente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) ao
RNA. O tubo foi vagarosamente invertido por três vezes e incubado à temperatura
ambiente por 15 minutos. Após esta fase de separação com Trizol LS (Invitrogen) o
RNA foi purificado com o auxílio do sistema “Purelink
TM
Micro-to-Midi Total RNA
Purification System”(Invitrogen). Aproximadamente 700 µL da amostra foram
transferidos para uma coluna com membrana de sílica e centrifugados a 12.000g por
15 segundos, o eluído foi descartado e o restante da amostra foi submetido ao mesmo
processo para que o RNA ficasse ligado à coluna. Posteriormente, foi realizada a
lavagem pela adição de 700 µL de Tampão de lavagem I e centrifugação a 12.000g
por 2 minutos. A coluna foi colocada em um novo tubo e então, adicionados 500 µL
de Tampão de lavagem II, centrifugadas a 12.000g por 15 segundos, este
Material e Métodos________________________________________________
31
procedimento foi realizado por 2 vezes. A coluna foi colocada em um tubo tipo
eppendorf de 1,5 mL, foram adicionados 30 µL de água livre de RNase para a
eluição do RNA. Após 5 minutos de incubação, as amostras foram centrifugadas a
12.000g por 15 segundos, a coluna foi desprezada e o precipitado final foi seco a
vácuo (speed vac), depois ressuspendido em 15 µL de água tratada com DEPEC, e
mantido a -70ºC até o momento do uso. Uma alíquota do material foi avaliada em gel
de agarose-formaldeído 1%, para verificar a qualidade do RNA.
3.11. Quantificação do RNA
As concentrações de RNA foram estimadas a partir da medida de absorbância
a 260nm em espectofotômetro (eppendorf Biophotometer 8,5mm). Uma unidade de
absorbância a 260nm corresponde aproximadamente a 40 µg/mL de RNA. O grau de
pureza da preparação foi estimado através da relação entre as leituras a 260 e 280nm.
As preparações foram consideradas boas, quando o valor da razão A=260/280
variava entre 1,8-2,1.
3.12. Tratamento do RNA total com DNAse
As amostras de RNA total foram tratadas com RQ1 RNAse-Free DNAse
(Promega), para degradar DNA contaminante proveniente da extração do RNA total
(item 3.8), como descrito: a 1 µg de RNA total foi adicionado 1 µL do tampão da
DNAse, 1u/µgRNA de DNAse e H
2
O em quantidade suficiente para 10 µL (volume
final da reação), a reação foi incubada a 37
o
C por 30 min. Após este tempo, foi
adicionado 1 µL da solução de parada da reação, seguido por incubação a 65
o
C por
10 min.
Material e Métodos________________________________________________
32
3.13. Obtenção do cDNA do transcrito que codifica para a subunidade Rpn10
em S. mansoni por Transcrição Reversa de RNA total (RT)
Para sintetizar o DNA complementar (cDNA) nos diferentes estágios
evolutivos do parasita S. mansoni, foi utilizada a técnica de RT-PCR. Neste
procedimento, inicialmente foi sintetizada a fita simples de cDNA, utilizando o kit
ThermoScript RT-PCR System (INVITROGEN), com o iniciador oligo (dT), como
resumidamente descrito abaixo:
Foi utilizado 1µg de RNA total obtido a partir de diferentes formas evolutivas
do parasita, 50pmol do iniciador oligo (dT), 10mM de dNTP`s e água livre de
RNase, para um volume final de 12µL. Esta mistura foi incubada por 5 minutos a
65ºC, seguido de banho de gelo por 3 minutos. Em seguida, foi adicionado tampão
5X para concentração final de 1X e a enzima transcriptase reversa, 0,1 M de DTT,
RNAout 40 u/µL e água livre de RNAse. Posteriormente, a amostra foi transferida
para um termociclador, sendo incubada por 60 minutos a 50ºC. Após este intervalo
de tempo, a reação foi interrompida por incubação a 85ºC por 5 minutos. Como
passo seguinte, foi adicionada à amostra 1µL de RNAse H, seguido de incubação por
20 minutos a 37ºC. As amostras foram armazenadas a -20ºC até o uso.
3.14. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Foram realizadas amplificações utilizando cDNA de vermes adultos,
combinados com os oligonucleotídeos específicos indicados na tabela 01 para a
amplificação do gene em estudo neste trabalho.
Para a reação do PCR, utilizamos um programa de amplificação com 35
ciclos, cada um composto de uma etapa de desnaturação durante 1 minuto a 94°C,
uma de anelamento durante 1 minuto a 60°C e uma de extensão durante 2 minutos a
Material e Métodos________________________________________________
33
72°C, utilizando a enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen). Como controle
endógeno, utilizamos o gene da alfa tubulina. Uma alíquota de 10µL desta reação foi
analisada em gel de agarose a 1%.
3.15. Purificação do produto de PCR
Alíquotas de 30
a 40µL das reações de amplificação foram aplicadas em gel
de agarose 1,5%, seguidas de coloração com brometo de etídio (0,5mg/mL). Em
seguida o gel foi exposto em luz ultravioleta (transiluminador Uvis-20), e um
pequeno bloco de agarose (200 a 300mg) contendo o fragmento de interesse foi
retirado, com o auxílio de um bisturi. Após este procedimento, o fragmento de
interesse foi extraído do bloco de agarose com o auxílio do kit Wizard® SV Gel and
PCR Clean-Up System (Promega) de acordo com o boletim técnico do fabricante, na
última etapa as amostras foram recuperadas em 25 µL de H
2
0 DEPC.
3.16. Clonagem no vetor pGEMT- easy e transformação em células competentes
Os fragmentos de cDNA devidamente purificados foram ligados em vetor de
sequenciamento pGEMT-easy (Promega), de acordo com especificações do
fabricante. Cerca de 5,0µL das reações de ligação foram utilizados nos
procedimentos de transformação. Nestes experimentos utilizamos células
competentes preparadas pelo método descrito por HANAHAN (1985).
O plasmídio foi introduzido em bactéria competente E. coli da linhagem
DH5α, através de choque térmico durante 90 segundos a 42°C, seguido de 3 minutos
em banho de gelo. Em seguida a bactéria foi mantida sob agitação em meio SOC
(SOB enriquecido com glicose 2M) a 200 rpm e 37°C, por 1h e 30 min. Decorrido
este intervalo, a suspensão bacteriana foi espalhada em meio sólido LB/ampicilina
Material e Métodos________________________________________________
34
contendo X-GAL (20µL/mL), para ser feita uma prévia seleção dos plasmídeos com
inserto (colônias brancas) e sem inserto (colônias azuis) e mantidas em estufa
durante 16 horas a 37°C.
3.17. Minipreparação de DNA plasmidial
Uma alíquota de uma colônia que supostamente continha o inserto foi
inoculada em 5mL de LB/ampicilina (100mg/mL) e incubada a 37ºC sob agitação
constante de 200 rpm por 16 horas. Após a incubação, 1,5mL da suspensão
bacteriana foi transferida para tubo eppendorf estéril e centrifugada a 12.000g por 1
minuto, e o sobrenadante foi desprezado. Este procedimento foi repetido mais duas
vezes. Portanto, a quantidade recuperada em cada eppendorf ao final desse processo
foi equivalente a 4,5mL de suspensão bacteriana. Em seguida, as bactérias foram
ressuspendidas em 400µL de tampão STET (glicose 8%, TritonX-100 0,1%, EDTA
50mM, Tris-HCl 50mM, pH 8,0) e adicionado 10µL de lisozima (50mg/mL). Os
tubos foram agitados em vórtex por 10 segundos, incubados 5 minutos a temperatura
ambiente por 45 segundos a 95ºC para inativar a enzima. Após este período, os tubos
foram centrifugados a 12.000g por 10 minutos e o precipitado removido com o
auxílio de um pequeno bastão de madeira. Ao sobrenadante, foram adicionados
10mL de uma solução de CTAB 5%. Os tubos foram invertidos por 5 vezes e
centrifugados a 12.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o
precipitado ressuspenso em 600µL de NaCL 1,2M. Em seguida, o DNA plasmidial
foi precipitado com a adição de 750µL de etanol 100%. A mistura foi vigorosamente
agitada em vórtex por 10 segundos e o DNA recuperado por centrifugação a 12.000g
por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o precipitado lavado com 800µL de
etanol 70%. Após nova centrifugação a 12.000g por 5 minutos, o sobrenadante foi
Material e Métodos________________________________________________
35
novamente removido e o precipitado seco a vácuo. Este foi ressuspendido em 25µL
de Tampão (Tris-HCl 10mM pH 8,0 e EDTA 0,1mM) e uma alíquota foi utilizada
para estimar a concentração e outra analisada em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídio. Os plasmídeos assim obtidos foram mantidos a -20ºC até o
momento do uso.
3.18. Sequenciamento dos nucleotídeos
Para realizar o sequenciamento dos plasmídeos bem como dos produtos de
PCR foi utilizada a técnica do término do crescimento da cadeia, inicialmente
desenvolvida por SANGER et al, 1977. As reações de sequenciamento foram
realizadas utilizando o kit Big-Dye Terminator (Applied Biosystems), de acordo com
as instruções do fabricante e as reações, analisadas no seqüenciador automático de
DNA, ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied-Biosystems). Os plasmídeos foram
seqüenciados nas direções “forward” e “reverse” com o auxílio dos oligos
iniciadores M13 universal (S) ou M13 reverso (AS).
3.19. Análise computacional das seqüências
As seqüências obtidas foram submetidas à busca de homologia com
nucleotídeos e aminoácidos com o auxílio dos algoritmos BLASTn e BLASTx,
respectivamente (www.ncbi.nlm.nih.gov). Também foi utilizado o algoritmo Pfam
(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) para identificar os domínios conservados nas
seqüências preditas de aminoácidos. O programa BLAST2 (www.ncbi.nlm.nih.gov)
e ClustalW (www.ebi.ac.uk) foram utilizados para auxiliar no alinhamento das
seqüências de nucleotídeos e aminoácidos preditas e o programa BOXSHADE
(bioweb.pasteur.fr) para a formatação dos resultados a serem apresentados.
Material e Métodos________________________________________________
36
3.20. Análise da expressão diferencial do gene que codifica para a subunidade
Rpn10 de S. mansoni utilizando PCR quantitativo – qPCR
Para a análise da expressão do gene que codifica para Rpn10 em S. mansoni
foi utilizada a técnica de PCR em tempo real. Para tanto, foram utilizados primers
específicos indicados na Tabela 01. As reações da PCR foram realizadas utilizando o
kit Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG ROX (Invitrogen), conforme o
manual do fabricante. A reação de PCR quantitativo foi conduzida conforme
programação contida no aparelho ABI 7500 Applied Biosystems. Os níveis relativos
de transcritos foram determinados utilizando-se alfa-tubulina como o gene de
controle endógeno. As análises foram feitas utilizando o método do ∆Ct, utilizando a
fórmula 2
-∆Ct
, para quantificar a expressão do gene em estudo durante o
desenvolvimento do parasita, conforme boletim técnico do fabricante (Applied
Biosystems).
As condições de termociclagem compreenderam uma incubação à 50
o
C por 2
minutos, seguida pela ativação da DNA polimerase a 95
o
C por 10 minutos, e 40
ciclos de desnaturação a 95
o
C por 15 segundos intercalados com anelamento e
extensão a 60
o
C por 1 minuto. As reações foram preparadas em triplicata, em um
volume final de 10µL, utilizando uma quantidade de cDNA correspondente a 0,5µg.
3.21. Clonagem da seqüência codificadora de SmRpn10 em vetor de clonagem
pET 28a+ (Novagen) para expressão em sistema bacteriano
3.21.1. Características do vetor pET 28a+
O vetor pET28a+ (Figura 4) possui duas seqüências que codificam para
cauda de histidina (17pb), uma origem de replicação (455pb), as regiões do
Material e Métodos________________________________________________
37
promotor, a seqüência referente ao operon da lactose, lac I (1079pb), e o gene que
confere resistência a Kanamicina (812pb). Além disso, apresenta também uma região
com múltiplos sítios de clonagem, que podem ser clivados por diversas enzimas de
restrição.
Figura 4. O vetor pET28a. Note as seqüências codificadoras do operon lac (lacI), a que confere
resistência a Kanamicina (kan) e a origem de replicação (ori) As enzimas NheI e BamHI marcadas
indicam a localização das seqüências clivadas para a inserção do gene de interesse (SmRpn10)
juntamente à seqüência da cauda de 6xHistidina), também previamente clivado com as mesmas
enzimas (adaptado, Novagen).
Material e Métodos________________________________________________
38
3.21.2. Preparação do vetor
3.21.2.1. Preparo de células cálcio-competentes
Células E. coli DH5α foram inoculadas em placa contendo meio LB seletivo
(100µL/mL de ampicilina) e mantidas 37°C durante 12 horas. Em seguida, 5 mL de
meio líquido LB foram inoculados com algumas destas colônias crescidas neste
período, deixando-se este pré-inóculo crescer durante a noite a 37°C com agitação de
180 rpm. Estes 5mL de cultura crescidos foram usados para semear 500mL (diluição
100 vezes) de meio LB líquido (contendo 20mM de glicose e 20mM de Mg
2+
). A
cultura foi crescida a 37°C sob agitação constante de 180 rpm, até que a DO
600
atingisse 0,3.
Em seguida, transferiu-se toda a cultura para tubos de centrífuga estéreis e
todo o processo foi feito a 4°C. Incubou-se a cultura no gelo por 5 minutos, em
seguida a mesma foi centrifugada a 4000g por 10 min. Na sequência, o sedimentado
foi ressuspendido em 100 mL de tampão cálcio/glicerol (CaCl
2
60mM, PIPES 10mM
e glicerol 15%).
Centrifugou-se por mais 10 min. a 4000g descartou-se o sobrenadante e as
células foram precipitadas em novos 100mL de tampão cálcio/glicerol e incubou-se
em gelo por 30 min. Repetiu-se posteriormente a etapa de centrifugação e o
sedimentado de células foi ressuspenso em 12mL de tampão cálcio/glicerol. As
bactérias foram distribuidas em alíquotas de 50µL e congeladas em banho de gelo
seco/etanol, sendo posteriormente armazenadas e mantidas por até 60 dias a -70°C.
3.21.2.2. Transformação em E. coli DH5α
As bactérias foram transformadas adicionando-se 50µL de 30mM MgCl
2
,
Material e Métodos________________________________________________
39
10mM CaCl
2
e 50µL de solução contendo as bactérias E.coli da linhagem DH5α
competentes e 100ng de vetor pET28a. A introdução dos vetores na bactéria foi
realizada por choque térmico (20 min. em gelo seguido de 20 min. à temperatura
ambiente). O crescimento das bactérias ocorreu por 1 hora a 37ºC em 1,0 mL de
meio de cultura Luria-Bertani (LB - 10g/L triptona, 5g/L extrato de levedura e 10g/L
Cloreto de Sódio), 10mM de glicose e 10mM MgCl
2
. Após este período, as células
foram centrifugadas (Centrífuga Eppendorf, modelo 5415 R) a 5000g por 3 minutos
a 25ºC. As bactérias foram ressuspensas em 100 µL de meio de cultura e semeadas
em placas de Petri contendo meio LB com 1,5% de Ágar e 40µg/mL de Kanamicina
(Sigma) e mantidas em estufa de cultura a 37ºC por 16 horas.
3.21.2.3. Extração do DNA plasmidial
As colônias de bactérias contendo o vetor foram inoculadas em tubos com
3mL de meio LB (SAMBROOK et al., 1989) e 40µg/mL de Kanamicina (Sigma) e
mantidas a 37°C durante 12 horas. A seguir, as culturas foram centrifugadas à
1000g/5minutos/4
o
C e o sedimentado foi ressuspenso em 100µL tampão GET
(50mmol.L
-1
Glicose, 10mmol.L
-1
EDTA pH8.0, 25mmol.L
-1
Tris-HCl pH8.0) e
agitado fortemente. Posteriormente, adicionou-se 200µL de solução de lise
(200mmol.L
-1
NaOH, 1% SDS), com agitação e foi mantida a 5 minutos a
temperatura ambiente. Após a lise, foram adicionados 150µL de 3mol.L
-1
de acetato
de potássio na solução e mantido por 5 minutos a temperatura ambiente. A solução
foi centrifugada à 10000g/5minutos e o sobrenadante foi precipitado com etanol
100%, lavado com 70% etanol, seco e mantido por 2 horas a 37
o
C em 200µg/mL de
RNase A (Sigma). Em seguida, o DNA foi extraído com fenol (dois volumes de
fenol, centrifugação 10000g/5 minutos/4
o
C, coleta da fase aquosa) e precipitado
Material e Métodos________________________________________________
40
(10% 3mol.L
-1
acetado de sódio, dois volumes de 100% etanol, centrifugação
10000g/5minutos/4
o
C, lavado com etanol 70% , seco e ressuspenso em 20µL de água
ultrapura autoclavada).
3.21.2.4. Digestão do vetor
O vetor pET28a foi digerido a 37°C durante 16 horas com 5U da enzima NheI
e 5U de BamHI (Promega). No final de cada digestão, a forma linear foi purificada
do gel de agarose 1,5% , conforme descrito anteriormente (item 3.13).
3.21.2.5. Defosforilação da forma linear do vetor
A defosforilação da forma linear foi feita com 0,01U de fosfatase alcalina de
bezerro/pmol DNA (Promega) por uma hora a 37ºC e posterior purificação do DNA
com o Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), conforme boletim
técnico do fabricante.
3.21.3 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para expressão da proteína
recombinante.
Foi feito um mapa de restrição da sequência codificadora da proteína
SmRpn10 (www.bioinformatics.org/sms2/rest_map.html) para se conhecer quais
enzimas de restrição cortam e quais não cortam a seqüência analisada, dentre as que
não cortam estavam a NheI e a BamHI. Os oligonucleotídeos foram idealizados para
a amplificação da sequência codificadora da proteína SmRpn10, inserindo-se sítios
de restrição para as enzimas NheI no sítio 5', com o códon iniciador da transcrição
para subsequente expressão (ATG), e BamHI no sítio 3', ambos sublinhados, como
demonstrado na Tabela 2. O mapa de restrição da seqüência está representado no
Material e Métodos________________________________________________
41
Anexo 2 e os oligonucleotídeos alinhados a sequência estão apresentados no Anexo
3.
Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados para a clonagem da sequência codificadora da proteína
SmRpn10. Os clusters foram recuperados do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma
geneDB, Sanger-UK. Os sítios sublinhados correspondem respectivamente as enzimas de restrição
NheI e BamHI .
Cluster
Gene
Oligos Temperatura
de
anelamento
Produto
Esperado
(pb)
Smp000740.2
Rpn10
F 5'-
CTAGCTAGCATGTCTCAGGAAGCTACG
-3'
R 5'-
CGGGATCCCTATTCTGCTTATCC
-3'
57°C 1259
3.21.4. Amplificação da sequência codificadora da SmRpn10 e ligação no vetor
pET28a
Para a amplificação da sequência codificadora da subunidade Rpn10, foi
escolhido o estágio de vermes adultos devido à facilidade de obtê-los. O cDNA foi
obtido conforme descrito no item 3.11.
As amplificações foram feitas utilizando cDNA proveniente de vermes
adultos, combinados com os oligonucleotídeos específicos. A reação foi feita com
uma etapa inicial de desnaturação: 1 minuto a 94° C, uma de anelamento: 1 minuto a
57°C, uma de extensão: 2 minutos a 72°C seguidos de 35 ciclos utilizando a enzima
Taq DNA Polimerase (Invitrogen). Como controle endógeno foi utilizado o gene da
alfa-tubulina. As amostras foram purificadas do gel conforme descrito (item 3.13) e
digeridas com as endonucleases de restrição NheI e BamHI (item 3.19.2.4).
O fragmento purificado e digerido com as enzimas NheI e BamHI foi ligado
ao vetor pET28a defosforilado. Para a ligação foi usada a proporção de 3 partes de
Material e Métodos________________________________________________
42
fragmento para 1 parte de vetor na presença de 1U da enzima T4 DNA ligase
(Promega) durante 18 horas/16°C. A solução de ligação foi usada na transformação
de bactérias E.coli da linhagem DH5α competentes (item 3.19.2.2), na presença de
40µg/mL de kanamicina.
A seleção das colônias de bactérias transformadas com os vetores contendo
fragmentos desejados foi feita pela reação de PCR de colônia com os iniciadores
idealizados para o promotor T7 (F 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' e R 5’-
GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), (Novagen). Após a observação da banda de
interesse no gel de agarose 1%, a colônia foi crescida em meio LB na presença de
40µg/mL de kanamicina, e o DNA plasmidial foi extraído da cultura conforme
descrito no item 3.19.2.3.
Os clones selecionados foram submetidos ao sequenciamento para verificar se
a janela de leitura estava correta conforme descrito no item 3.16.
3.22. Expressão da proteína heteróloga em linhagens de E. coli BL21 Rosetta
[DE3]pLysS.
3.22.1. Preparo de células BL21 competentes
As bactérias foram crescidas em uma placa contendo 34µg/mL de
cloranfenicol por 16 horas. Posteriormente inoculamos uma colônia isolada em 3mL
de meio HDM (15g de triptona, 25g de extrato de levedura pH7.5) a qual foi mantida
a 37°C por 16 horas (pré-inóculo).
Inicialmente, 400µl do pré-inóculo foram inoculados em 40 mL de meio
HDM e deixados sob agitação de 200 rpm a 37°C até atingir densidade óptica igual a
0,6 no comprimento de onda de 600
ηm. As bactérias foram centrifugadas a 3.500
Material e Métodos________________________________________________
43
rpm por 6 minutos, ressuspensas em 40mL de MgCL
2
0.1M, centrifugadas,
ressuspendidas em 20mL de CaCl
2
0.1M e novamente centrifugadas e ressuspendidas
em 4mL de CaCl
2
.
As bactérias permaneceram por 40 minutos no gelo e foram aliquotadas com
a adição de glicerol 80% e guardadas a -80°C até o momento do uso.
3.22.2. Expressão da proteína em função do tempo de indução
A linhagem de E. coli BL21 competente foi transformada com: pET28a+
(controle positivo), pET28a+Rpn10 e sem nenhum vetor (controle negativo). Foram
utilizados 100µL de solução contendo E.coli BL21 competentes. Os produtos foram
introduzidos na bactéria por choque térmico: 30 minutos no gelo seguidos de 5
minutos em banho-maria a 37°C. Após este procedimento, as bactérias cresceram por
1 hora a 37ºC em 1,0 mL de meio de cultura HDM. Em seguida, as células foram
centrifugadas (Centrífuga Eppendorf, modelo 5415 R) a 2000 rpm por 5 minutos, o
sobrenadante foi descartado e as bactérias ressuspensas em 100 µL de meio de
cultura, que foram transferidas para placas de Petri com meio de cultura HDM com
1,5% de ágar, 40µg/mL de kanamicina e 34µg/mL de cloranfenicol (Sigma) e
mantidas por 16 horas a 37°C. Uma colônia isolada foi inoculada em 3 mL de meio
HDM que após 16 horas de crescimento foi inoculada em 400mL de meio HDM na
presença de 40µg/mL de kanamicina e 34µg/mL de cloranfenicol sob agitação de
200 rpm a 37°C até atingir a densidade óptica 0,6 no comprimento de onda de 600
ηm, onde 1mL de cultura foi coletado (amostra sem indução) e o restante da cultura
foi induzida com 1mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) (Promega).
Até a quinta hora foi coletado 1mL de cultura a cada hora e centrifugado a 4000xg
por 3 minutos. O sedimentado foi ressuspendido em 100µL de tampão de amostra
Material e Métodos________________________________________________
44
para proteína (3,8mL de água, 1 mL de Tris-HCl 0,5M pH6.8, 0,8mL de glicerol,
1,6mL de SDS 10%, 0,4mL de 2-betamercaptoetanol, 0,4mL de azul de bromofenol
1%) e um volume correspondente a 0,15 unidades de OD
600
, foi aplicado em gel
desnaturante de poliacrilamida.
3.22.3. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A análise de proteínas das amostras foi feita em gel de poliacrilamida 12%
(SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) sob voltagem de 300V e corrente de 20mA. Soluções
de “Coomassie Blue (Sigma)” (0,1% “Coomassie R-250”, 50% metanol, 7% ácido
acético) foram usadas para a coloração das proteínas no gel ou coloração pela prata
(item 3.31).
3.22.4. Purificação parcial em média escala de proteínas por cromatografia de
afinidade
A resina utilizada para a purificação das proteínas expressas foi a Ni
Sepharose™ High Performance (GE Healthcare). Essa resina possui um adsorvente
que interage com 4 sítios de ligação do íon de níquel , deixando 2 sítios livres para a
interação com a cauda de histidina da proteína. Essa interação com os íons divalentes
é estável em várias condições, permitindo uma melhor variação de parâmetros para a
purificação da proteína de interesse.
A purificação parcial das proteínas em resina de Ni
2+
(Ni-NTA, Quiagen,
Hilden, Alemanha) foi iniciada com a adição de 40 mL de tampão de lise (60mM
imidazol, 50mM NaH
2
PO
4 ,
400mM NaCl, 4mM PMSF e Triton X 1% pH 8.0) e o
pellet bacteriano foi sonicado em gelo com pulsos de 10 segundos intercalados com
10 segundos de descanso por dez repetições.
Material e Métodos________________________________________________
45
O extrato solúvel da lise (40mL) foi incubado por uma hora a 4ºC com 1mL
de resina Ni Sepharose™ High Performance (GE Healthcare), previamente
equilibrada em tampão de lise. A resina foi empacotada em coluna de cromatografia
(10x1,5 cm). Coletou-se uma amostra do que não ligou na resina (“Flow Through”,
FT). A resina empacotada foi lavada com 30 volumes de tampão de lavagem (80 mM
imidazol 50mM NaH
2
PO
4
, 400 mM NaCl, pH 8,0) e a proteína foi eluída com 10
volumes de tampão de eluição (300 mM imidazol 50mM NaH
2
PO
4
, 400 mM NaCl,
pH 8,0), coletados a cada 1 mL. As amostras da eluição foram analisadas por
eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida conforme descrito no item 3.20.3.
3.22.5. Quantificação da proteína
A quantificação das proteínas recombinantes purificadas por cromatografia de
afinidade foi realizada pelo método de Pierce como descrito no boletim técnico do
fabricante. A curva padrão foi feita com albumina bovina na faixa de concentração
de 2,5 a 15mg/mL. A leitura da absorbância foi feita no comprimento de onda de
562ηm utilizando o espectofotômetro Hitachi U-2000.
3.23. Confirmação da identidade da proteína por espectrometria de massa
Cerca de 3 µg da proteína recombinante foi separada por SDS-PAGE num gel
de gradiente (4-12%) o qual foi posteriormente corado com Coomassie. A banda
correspondente foi retirada do gel e submetida à redução e alquilação na presença de
50 e 200 mM de DTT e iodoacetamida, respectivamente. Após o tratamento, a banda
foi submetida ao processo de digestão in gel durante 12 horas na presença de tripsina.
Um microlitro do sobrenadante da digestão foi misturado a uma solução saturada de
matriz (ácido alfa-cianohidroxicinâmico) e a mistura resultante aplicada a uma placa
Material e Métodos________________________________________________
46
de MALDI para análise por MS/MS utilizando-se o espectrômetro de massa
ULTRAFLEX III (Bruker). Os dados provenientes do espectro MS/MS foram
submetidos à busca de identidade no banco de dados do Schistosoma mansoni no
GeneDB, utilizando-se o software MASCOT.
3.24. Produção de anticorpo anti-Rpn10 de S. mansoni em camundongos Balb/C
Amostras da proteína Rpn10 (50µg/animal), recuperadas por cromatografia
de afinidade foram emulsificadas em 3mL de Adjuvante completo de Freund (ACF-
Sigma) e usadas para imunizações subcutâneas no dorso dos camundongos Balb/C.
Nas duas doses seguintes (21 e 28 dias após a primeira injeção) a proteína foi
emulsificada em 3 mL de adjuvante incompleto de Freund (AIF). Após uma semana
foi realizado um ensaio imunoenzimático (Dot-blot) para a detecção de anticorpos
específicos (item 3.25). Os soros recuperados foram armazenados a -20ºC
separadamente. O pool de soros pré-imunes foi utilizado com controle negativo.
3.25. Dot-blot
Aproximadamente 20µg/poço de proteína recombinante foram imobilizadas
em membrana de nitrocelulose (GE Healthcare) utilizando-se o sistema Hybri-Slot™
(Gibco BRL) por 15 minutos. A membrana foi incubada com tampão de bloqueio
(5% de leite desnatado, Tris 1M pH 7,5; 0,1% Tween 20) durante uma noite. Após
lavagens convencionais (10mM Tris-HCl pH7,5), a membrana foi incubada com soro
pré-imune ou imune do camundongo diluídos 1:1000. Seguiu-se a incubação com
anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com fosfatase alcalina (ZyMac
TM
Grade, Zymed) diluído 1:2500. A reação foi detectada com NBT
(nitrobluetetrazolium) e BCIP (5-bromo-4cloro-3indolil-fosfato) (Gibco BRL).
Material e Métodos________________________________________________
47
3.26. Purificação do anticorpo
Amostras do soro recuperadas dos camundongos (item 3.23) foram aplicadas
à coluna de Ni Sepharose™ High Performance (GE Healthcare) imobilizada com a
proteína recombinante Rpn10. A coluna foi previamente equilibrada com tampão
fosfato 20mM, pH 7,4. e lavada com o tampão de equilíbrio para remoção do
material não adsorvido à coluna. O material adsorvido foi eluído pela adição de 0.1M
de glicina pH 2,4. O procedimento cromatográfico foi realizado em sistema
cromatográfico automático FPLC (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden),
monitorado por absorbância em 280nm.
3.27. Western blot para detecção da proteína SmRpn10 em extratos protéicos
totais de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos
Após a corrida eletroforética das frações protéicas de vermes adultos, ovos,
cercárias e esquistossômulos para a detecção da proteína SmRpn10, o gel foi
preparado para a transferência (Biorad Trans-Blot) de acordo com o método descrito
por Towbin et al. (1979). Inicialmente, o gel foi imerso na solução de transferência
(25mM Tris-HCl, 0,192M de glicina , 20% de etanol absoltuto, pH8,3) por cerca de
20 minutos. Após a montagem do sistema de transferência, as proteínas presentes no
gel de poliacrilamida foram transferidas para membrana de nitrocelulose (GE
Healthcare), sendo o processo de transferência realizado durante 2 horas sob
voltagem fixa de 100Volts a 4°C. Após o término da transferência, a membrana foi
submetida ao imunoblot, sendo incubada overnight a 4°C, sob agitação, com a
solução de bloqueio (leite desnatado em pó 5%, 50mM de Tris-HCl pH7,5, 0,1% de
Tween 20). Após o bloqueio, a membrana foi lavada 3 vezes de 5 minutos cada com
Tris-HCl 10mM pH7,5 e incubada por 3 horas a temperatura ambiente com os
Material e Métodos________________________________________________
48
anticorpos primários policlonais, total e purificado, de camundongo anti-Rpn10
produzido em nosso laboratório, para a detecção da proteína Rpn10. As diluições dos
anticorpos primários foram realizadas em solução de imunoblotting (leite desnatado
em pó 5%, 50mM de Tris-HCl, 150mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) e utilizadas as
seguintes razões dos anticorpos 1:1000 e 1:2500 respectivamente. Os anticorpos
primários não ligados foram então retirados e a membrana devidamente lavada 3
vezes de 5 minutos cada com Tris-HCl 10mM pH7,5, posteriormente incubada
durante 1 hora e 30 minutos a temperatura ambiente com o anticorpo secundário anti-
IgG de camundongo conjugado à fosfatase alcalina (diluição de 1:2500 em tampão
de imunoblotting). Após a lavagem das membranas para remoção dos anticorpos
secundários não ligados, as membranas foram reveladas com NBT
(nitrobluetetrazolium) e BCIP (5-bromo-4cloro-3indolil-fosfato) (Gibco BRL).
3.28. Ensaio de desafio: infecção experimental por S. mansoni em camundongos
imunizados com SmRpn10 recombinante
Camundongos BALB/c (5 animais por grupo) foram imunizados do mesmo
modo como descrito no item 3.23. A detecção de anticorpos específicos foi realizada
através de Dot-blot como descrito no item 3.24. Quatro semanas após a última
imunização os animais foram desafiados. Simulando uma infecção natural, as caudas
dos camundongos foram expostas a 100 cercárias aproximadamente, como mostrado
na Figura 4, e estes foram sacrificados 8 semanas depois, para a obtenção de vermes
adultos. Os animais do grupo controle foram imunizados somente com adjuvante,
seguindo o mesmo protocolo experimental.
Material e Métodos________________________________________________
49
Figura 4. Infecção experimental dos camundongos com S. mansoni. Os camundongos ficam
acomodados nos tubos (A) com suas caudas expostas a uma solução com aproximadamente 100
cercárias (B).
O indicador de proteção (P) foi dado pela redução do número de vermes
adultos recuperados, calculado pela fórmula:
A é a média do número de vermes adultos recuperados do grupo controle e B
a média do número de vermes adultos recuperados do grupo imunizado com
SmRpn10.
3.29. Sorologia convencional (ELISA)
Amostras do soro de camundongos imunizados com a proteína recombinante
SmRpn10 (item 3.24) e infectados com S. mansoni foram estocadas a -80
o
C e os
testes por ELISA foram realizados de acordo com VOLLER et al; 1976. A amostra
de SmRpn10 em tampão carbonato-bicarbonato 50mM pH 9,6 foi adicionada a cada
P(%) =
(A – B)
A
x 100
P(%) =
(A – B)
A
(A – B)
A
x 100
A
B
A
B
A
B
Material e Métodos________________________________________________
50
poço da placa de poliestireno (MaxiSorp, Nunc A/S, Roskild, Demark) e mantidas
por 16h a 4
o
C. Após 3 lavagens com PBS-T, as placas foram bloqueadas com leite
desnatado 5%, lavadas novamente e incubadas com 50µL do soro teste em diferentes
diluições por 2h a 37
o
C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T e incubadas
por 1h a 37
o
C com IgG de humano anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase.
IgE total, IgG total conjugados a peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery,
USA) foram usados para a determinação dos níveis de anticorpos. As placas foram
lidas em espectrofotômetro, usando o filtro para 450nm (BIO-RAD, 3550). O cut-off
foi determinado usando a média da absorbância de 5 camundongos imunizados com
adjuvante de Freud (animais controle). O soro de 5 camundongos imunizados por
grupo foi coletado 45 dias após a primeira imunização.
3.30. Preparação do extrato protéico bruto das fases de vermes adultos, ovos,
cercárias e esquistossômulos
A partir de parasitas adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos foram
preparados extratos de proteínas totais. Os parasitas foram homogenizados no
tampão (Tris-HCl 100mM pH 7,5; Glicerol 1%, EDTA 5mM, NaCl 150mM, Triton-
X 0,5%, DTT 1mM, Iodoacetamida 10mM, MG132 50µM e 1X Inibidor de
Proteases – Sigma). O material foi brevemente sonicado e centrifugado a 10.000g
por 30 minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi centrifugado a
40.000g por 60 minutos.
As concentrações protéicas presentes nos extratos brutos foram determinadas
como descrito no item 3.22.5 e analisadas em SDS-PAGE 12% (item 3.22.3).
3.31. Coloração pela prata de gel de poliacrilamida para proteína
Material e Métodos________________________________________________
51
O gel foi colocado por aproximadamente 1 hora na solução fixadora (metanol
50%, ácido acético 12%). Em seguida, lavado com água destilada 3 vezes de 7
minutos cada, foi deixado em contato com uma solução de tiossulfato de sódio
0,04% por 1 minuto. Passado esse tempo, lavado com água destilada 3 vezes de 7
minutos cada, incubado com uma solução de nitrato de prata 0,1% por 20 minutos.
Fez-se uma lavagem rápida com água destilada, colocou-se o gel na solução de
desenvolvimento (carbonato de sódio 6%, formaldeído 0,1%, solução de tiossulfato
de sódio 2%). Depois de corado, o gel foi colocado na solução fixadora.
3.32. Purificação de conjugados poliubiquitinados por afinidade à proteína
Rpn10
3.32.1. Preparação de Sepharose 4B aminada e carboxilada
Obteve-se 10g de sepharose (Sigma Aldrich) seca por sucção (filtração a
vácuo, utilizando água para a lavagem da resina) e ressuspendeu-se a papa em 15mL
de água. Foram adicionados 6,5mL de NaOH 2,5M, 1,5mL de epicloridrina e a
suspensão incubada por 2 horas a 40
o
C. A suspensão foi lavada em funil de vidro
sinterizado com pelo menos 250mL de água. Após esta etapa obteve-se a sepharose
epoxilada.
3.32.1.1. Aminação da Sepharose epoxilada
O volume da papa foi medido e foram adicionados 1,5 volumes de amônia
concentrada. Incubou-se a 40
o
C por 1 hora e 30 minutos, mantendo o frasco
destampado. A papa foi lavada com pelo menos 250mL de NaCl 0,1M até o pH
chegar a 7. Ressuspendeu-se em 1,5 volumes de NaCl 1M. Foram adicionados 40mg
Material e Métodos________________________________________________
52
de anidrido succínico lentamente. Uma solução estoque de NaOH 20% foi preparada
e adicionada gota a gota para manter o pH da solução em torno de 6 para evitar a
hidrólise do anidrido succínico. Após cessada a adição de hidróxido de sódio para
manter o pH igual a 6, foi mantida sob agitação por 5 horas à temperatura ambiente.
A papa foi lavada e incubada em 0,1M de NaOH para inativar o excesso do anidrido
succínico por 30 minutos.
3.32.1.2. Ativação da Sepharose succinilada
Foram pesadas 2g da resina lavada anteriormente e fez-se uma lavagem com
dioxano para a completa eliminação de água. A resina foi ressuspendida com 3
volumes de dioxano. Adicionou-se 123mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) e
69mg de hidroxisuccinamida (NHS), incubou-se por 70 minutos a temperatura
ambiente (DCC e NHS devem estar na concentração final de 0,1M). Após esta
incubação, o gel foi lavado com 8 volumes de dioxano, seguido de 4 volumes de
metanol (para remover o ciclohexil uréia precipitada) e finalmente com 3 volumes de
dioxano. A resina neste momento estava ativada.
3.32.2. Ligação da proteína recombinante Rpn10 à resina ativada
A resina que está no funil foi lavada com 50mL de água destilada para
remover o dioxano. Foi adicionada imediatamente a solução descrita a seguir.
Preparou-se o tampão 1,8% NaCl, bicarbonato de sódio 0,02M pH 7,5, foram usados
5mL deste tampão e 5mL da solução da proteína recombinante Rpn10 purificada
(2mg/mL) foram misturadas, verificou-se o pH resultante da mistura, o ideal é em
torno de 7,5. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e mantida
sob refrigeração à 4
o
C durante a noite. Para o bloqueio dos sítios reativos
Material e Métodos________________________________________________
53
remanescentes, incubou-se o gel com 1 volume de etanolamina pH 8 por 1 hora a
temperatura ambiente. Após este tempo, a resina foi guardada a 4
o
C até o momento
do uso.
3.32.3. Verificação da ligação da proteína Rpn10 recombinante a Sepharose 4B
aminada e carboxilada por Western blot
Foram retiradas duas frações de 100µL cada da resina preparada no item
3.31.2, cada fração foi colocada em um tubo tipo eppendorf de 1,5 mL. A resina foi
lavada excessivamente com 50mM Tris-HCl pH7,5 até toda a proteína ou
etanolamina não ligada sair da coluna. Procedeu-se o bloqueio com 50mM Tris-HCl
pH7,5, 5% BSA por 40 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, a resina foi
lavada 3 vezes de 5 minutos cada com 10mM Tris-HCl pH7,5 e incubada com 50mM
Tris-HCl pH7,5, 5% BSA por 20 minutos. Após este tempo, foi adicionado a um dos
tubos (teste) o anticorpo de camundongo anti-Rpn10 purificado (item 3.26), diluição
1:2500, e incubou-se por 1 hora a temperatura ambiente, o outro tubo foi utilizado
como controle do ensaio. Posteriormente, a resina foi lavada 3 vezes de 5 minutos
cada com 10mM Tris-HCl pH7,5 e incubada com o anticorpo secundário anti-IgG de
camundongo ligado a fosfatase alcalina diluído 1:2500 em 50mM Tris-HCl pH7,5,
5% BSA por 30 minutos ambos os tubos (teste e controle). Decorrido este período, a
resina foi lavada 3 vezes de 5 minutos cada com 10mM Tris-HCl pH7,5 e procedeu-
se a revelação, foi adicionado à resina 1mL de NBT (nitrobluetetrazolium) e BCIP
(5-bromo-4cloro-3indolil-fosfato) (Gibco BRL), e, a formação de cor foi observada.
3.32.4. Ligação e purificação de conjugados poliubiquitinados
A resina preparada no item 3.31.2 foi lavada excessivamente com 50mM
Material e Métodos________________________________________________
54
Tris-HCl pH7,5 até toda a proteína ou etanolamina não ligada sair da coluna. A
resina foi dividida em quatro partes iguais em tubos tipo Falcon de 15 mL e
incubada, por 3 horas sob leve agitação, cada parte com um extrato protéico diferente
do parasita: vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos; preparados como
descrito no item 3.26. Após este período, a resina foi centrifugada a 2000 rpm por 5
minutos, o sobrenadante foi recuperado e a resina transferida para tubos tipo
eppendorf de 1,5 mL. A resina foi lavada excessivamente com 50mM Tris-HCl
pH7,5 e 500mM NaCl até toda a proteína não ligada sair da coluna. Em seguida,
procedeu-se a eluição das proteínas poliubiquitinadas, foram adicionados à resina
400µL de tampão da amostra (20mM Tris-HCl pH6,8, 0,5% SDS, 2mM DTT),
incubou-se à 70
o
C por 1 hora. A resina foi centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos, e
o sobrenadante recuperado foi guardado a -20
o
C.
3.33. Western blot para detecção de proteínas poliubiquitinadas
Após a corrida eletroforética dos eluídos de vermes adultos, ovos, cercárias e
esquistossômulos para a detecção de proteínas poliubiquitinadas, o gel foi preparado
para a transferência (Biorad Trans-Blot) de acordo com o método descrito por
Towbin et al (1979). Inicialmente, o gel foi imerso na solução de transferência
(25mM Tris-HCl, 0,192M de glicina , 20% de etanol absoluto, pH8,3) por cerca de
20 minutos. Após a montagem do sistema de transferência, as proteínas presentes no
gel de poliacrilamida foram transferidas para membrana de nitrocelulose (GE
Healthcare), sendo o processo de transferência realizado durante 2 horas sob
voltagem fixa de 100Volts a 4°C. Após o término da transferência, a membrana foi
submetida ao imunoblot, sendo incubada overnight a 4°C, sob agitação, com a
solução de bloqueio (leite desnatado em pó 5%, 50mM de Tris-HCl pH7,5, 0,1% de
Material e Métodos________________________________________________
55
Tween 20). Após o bloqueio, a membrana foi lavada 3 vezes de 5 minutos cada com
Tris-HCl 10mM pH7,5 e incubada por 3 horas a temperatura ambiente com o
anticorpo primário anti-ubiquitina para a detecção de proteínas poli-ubiquitinadas
(anticorpo de coelho anti-ubiquitina de humano-clone FKI-PW8805/BIOMOL). A
diluição do anticorpo primário foi realizada em solução de imunoblotting (leite
desnatado em pó 5%, 50mM de Tris-HCl, 150mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) e
utilizada a seguinte razão do anticorpo 1:500.
O anticorpo primário não ligado foi então retirado e a membrana devidamente
lavada 3 vezes de 5 minutos cada com Tris-HCl 10mM pH7,5, posteriormente
incubada durante 1 hora e 30 minutos a temperatura ambiente com o anticorpo
secundário anti-IgG de coelho conjugado à fosfatase alcalina (diluição de 1:2500 em
tampão de imunoblotting). Após a lavagem das membranas para remoção do
anticorpo secundário não ligado, a membrana foi revelada com NBT
(nitrobluetetrazolium) e BCIP (5-bromo-4cloro-3indolil-fosfato) (Gibco BRL).
3.34. Análise das proteínas de vermes adultos eluídas da coluna de afinidade
(Rpn10) por LC-MS/MS
Cerca de 10 µg das proteínas totais eluídas da coluna de afinidade foram
reduzidos na presença de 10 mM DTT durante 1 h a 65°C seguido de alquilação na
presença de 40 mM metil-metanotiosulfonato (MMTS) por 10 min à temperatura
ambiente. Tripsina (MS Grade) foi adicionada ao tubo de reação na proporção de
20:1 (razão substrato/enzima) previamente solubilizada em 100 mM de tampão
trietilamoniobicarbonato (TEAB) pH 8.5. A digestão ocorreu durante 20 horas à
37°C. Os peptídeos em solução foram purificados por troca iônica e separados em
nanoHPLC segundo um gradiente que variou de 2 a 50 % acetonitrila / 0.1 % ácido
Material e Métodos________________________________________________
56
heptafluorbutírico durante 30 min. Imediatamente após a eluição dos peptídeos os
mesmos eram plaqueados em placa de MALDI com o auxílio do PROBOT. A
análise por MS seguida de MS/MS dos 180 spots gerados foi realizada no
espectrômetro de massa Ultraflex III (Bruker). Os dados de fragmentação foram
submetidos à busca de identidade no banco de dados do Schistosoma mansoni no
GeneDB, utilizando-se o software MASCOT.
3.35. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão médio (SEM). Os
dados foram analisados estatisticamente pelo ANOVA one-way, seguido pelo teste
de comparação múltiplo de Tukey. Valores de P < 0.05 foram considerados
estatisticamente significantes.
4. RESULTADOS
Resultados______________________________________________________
58
4.1 Análise in silico
A sequência da subunidade Rpn10 do proteassoma do parasita S. mansoni foi
recuperada do banco de dados do projeto transcriptoma do S. mansoni (Verjovski-
Almeida et al, 2003) cujo número de acesso é SmAE 608378.1. É sabido que 92% do
transcriptoma do parasita já estão anotados, o que corresponde a aproximadamente
14.000 genes (Verjovski-Almeida et al, 2003). Para a identificação da provável
região codificadora, a seqüência predita para SmRpn10 foi submetida à análise
utilizando o algorítimo ORF finder (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) como
demonstrada na Figura 5.
Figura 5. Sequência de nucleotídeos da região codificadora do gene SmRpn10 de 1259 pares de
bases (pb). A sequência foi analisada com o auxílio do algorítimo ORF finder.
A seqüência foi submetida à análise utilizando os algoritmos BLASTn para
nucleotídeos e BLASTp para aminoácidos. Para confirmar a identidade das
1 ATGTCTCAGGAAGCTACGATCATAGCAGTTGATAATAGTGATTACATGAGGAATGGGGAC 60
61 TTCTTCCCAACACGTCTGCAGGCGCAAAATGATGCTGTCGGTTTGATCTGCCAGAGCAAG 120
121 CGTCAACGTAATCCAGAAAATACCATTGGTTTGTTGTCCCTTGCAAACACCGAAGTACTT 180
181 TGTACGCTAACAAATGATGTGAGTAAGATATACAATCGTTTACACCTTGTGGAGCCAAAG 240
241 GGCAGGATTATTTTCTGCTCATCAATAAGGATAGCCCACCTCGCACTTCGTCATCGACAA 300
301 TTGAGACATCAGAAAATGAGGATCGTATGTTTCATCGGTAGTCCCATATTAGAAGATGAA 360
361 AAAGAATTGACTAGGCTTGCCAAGCGTCTCAAAAAAGAGAAAGTAAATGTCGATATTATT 420
421 AACTTTGGTGAGAATGAAACAAATGAGCAAAAGTTGTCAGAATTCATCGACACATTGAAT 480
481 GGAAAGGATGGAACAGGTTCTCACCTCATATCTGTTGCCCCGGGGACAGTCTTACACGAT 540
541 ACTTTGATGACAAGCCCCGTTGTTGCTGGTGAGGATGGTTCTGGCATGGCTGGTGCCGGG 600
601 TTAGGTTTGGAGTTTGGATTAGATGGGGCAGAAGATCCTGATTTACTCTATGCCCTCAGA 660
661 GTATCAATGGAAGACCAGCGCATGCGTCAAGAACATGAGGTTAATGGAGATGGTAGTAAT 720
721 ACTTCAGTTGTAGCAACATCGTTACCAGCTGGGTCAGGAACGTCCGAAGAAGCTATGCTT 780
781 CAGCAGGCTTTGGCTATGTCAATGCAAATGAATAATACCGAGTCTTCATCCTTGCCTATG 840
841 GATATCGATCTGGCAGCTATGTCAGAAGAAGATCAGATAGCATATGCACTGCGCATGTCT 900
901 TTACAACAGATGGGAGAGGAAACGACTCAACCTACCACCACTACATTGGAGTCCGACAAG 960
961 ACTATTGTTGAACCCTCTGGTGTGGCTATGGATATAGATCAGACTCCAACTAAAGTTACT 1020
1021 GAAAATCCAAATTTATCTTCTAGTTCCGGTACATTGGCAGCTGCAACATCAGCTGTTCCT 1080
1081 ACATCTGCTGACTTGGATGTTATGTACGATGCTGAATTTTTGGAATCTGTTTTACAAAGT 1140
1141 TTGCCTGGTGTGGATACTCAGAATGAAGATGTTCGCAAGGCTATAAATGCTCTAACTAAG 1200
1201 TCCCAGTCACAGCGAGGTTCAAAGAAAGATGAAAAAGAAGATGAGGATAAGCAGAATAG 125
9
Resultados______________________________________________________
59
seqüências de aminoácidos preditas de SmRpn10, as seqüências também foram
analisadas em banco de dados que permitem a identificação de domínios conservados
numa seqüência primária de aminoácidos. Neste caso, foi utilizada a base de dados
do algoritmo Pfam (www.sanger.ac.uk/software/pfam/), onde constatou-se a
presença de três domínios, denominados: UIM1, UIM2 e UIM3. UIM1 está presente
no fragmento gênico de SmRpn10 que se inicia no 209° aminoácido e termina no
226° aminoácido, UIM2 no 254° aminoácido e termina no 271° aminoácido e UIM3
no 287° aminoácido e termina no 304° aminoácido. Também foi utilizada a base de
dados do algoritmo SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/), onde constatou-se a
presença do domínio vWA, além dos três domínios já citados, que se inicia no 4°
aminoácido e termina no 174° aminoácido. A disposição dos domínios pode ser
observada na Figura 6.
Figura 06. Sequência de aminoácidos predita de SmRpn10 destacando os domínios vWA, UIM1,
UIM2 e UIM3. A sequência predita de aminoácidos foi analisada com auxílio dos algorítimos Pfam e
SMART para a identificação de domínios conservados na sequência primária de aminoácidos. O
domínio vWA está em vermelho, UIM1 em azul, UIM2 em verde e UIM3 em amarelo.
4.2. Alinhamento da sequência primária de SmRpn10 em relação aos seus
ortólogos e análise filogenética
A seqüência de aminoácidos predita referente ao fragmento gênico SmRpn10
em S. mansoni, foi alinhada com os respectivos ortólogos com o auxílio do programa
1 MSQEATIIAVDNSDYMRNGDFFPTRLQAQNDAVGLICQSKRQRNPENTIG 50
51 LLSLANTEVLCTLTNDVSKIYNRLHLVEPKGRIIFCSSIRIAHLALRHRQ 100
101 LRHQKMRIVCFIGSPILEDEKELTRLAKRLKKEKVNVDIINFGENETNEQ 150
151 KLSEFIDTLNGKDGTGSHLISVAPGTVLHDTLMTSPVVAGEDGSGMAGAG 200
201 LGLEFGLDGAEDPDLLYALRVSMEDQRMRQEHEVNGDGSNTSVVATSLPA 250
251 GSGTSEEAMLQQALAMSMQMNNTESSSLPMDIDLAAMSEEDQIAYALRMS 300
301 LQQMGEETTQPTTTTLESDKTIVEPSGVAMDIDQTPTKVTENPNLSSSSG 350
351 TLAAATSAVPTSADLDVMYDAEFLESVLQSLPGVDTQNEDVRKAINALTK 400
401 SQSQRGSKKDEKEDEDKQNS 420
Resultados______________________________________________________
60
CLUSTALW (www.2.ebi.ac.uk/clustalw) e formatados com o auxílio do programa
Boxshade (www.biomed.pasteur.fr), com a intenção de identificar aminoácidos
conservados e idênticos. Como pode ser observada na Figura 7, a proteína é
conservada em relação aos seus ortólogos em outros organismos. O domínio vWA é
altamente similar entre os ortólogos comparados. O parasito S. mansoni possui 37
aminoácidos na região C-terminal a mais que os seus ortólogos.
Resultados______________________________________________________
61
Figura 7. Alinhamento das sequências preditas de aminoácidos da subunidade Rpn10 do
proteassoma provenientes de diferentes organismos. Esta análise foi feita com o auxílio dos
programas CLUSTALW (www.ebi.ac.uk) para os alinhamentos e Boxshade (www.biomed.pasteur.fr)
para a formatação dos resultados a serem apresentados. As caixas em preto indicam os aminoácidos
idênticos e as caixas em cinza indicam os aminoácidos conservados. Hs-Homo sapiens, Rn-Rattus
novergicus, Xl-Xenopus laevis, Dm-Drosophila melanogaster, Sm-Schistosoma mansoni, Sj-
Schistosoma japonicum, Sp-Schizosaccharomyces pombe, Ce-Caenorhabditis elegans.
Resultados______________________________________________________
62
Na Figura 8, mostramos um resultado de filogenia molecular, para reforçar a
conservação da SmRpn10 em relação aos outros organismos e também mostrar que a
sequência da proteína de S. mansoni, está filogeneticamente próxima da sequência do
parasita S. japonicum e de Caenorhabditis elegans e D. Melanogaster.
Figura 8. Filogenia molecular para a seqüência predita de aminoácidos de SmRpn10 e sua
conservação em relação aos seus ortólogos. A árvore filogenética foi calculada usando o algoritmo
Máxima Parcimônia presente no programa MEGA 4. As distâncias lineares entre as seqüências
homólogas são inversamente proporcionais às similaridades entre as seqüências de aminoácidos.
4.3. Estrutura genômica do gene SmRpn10
A seqüência de DNA genômico foi recuperada do banco de dados do parasita
S. mansoni GeneDB cujo número de acesso é Smp_000740.2. A Figura 9 demonstra
a organização estrutural do gene SmRpn10, cuja sequência de DNA tem um
tamanho de 5584pb, composta por 4 íntrons e 5 éxons. O primeiro íntron possui
39pb, o segundo 38pb, o terceiro 533pb e o quarto 3711pb.
Figura 9. Organização genômica do gene SmRpn10 em S. mansoni. Organização estrutural do
gene SmRpn10. Representação esquemática da região codificadora e a localização genômica dos
éxons e suas posições relativas.
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
RNAm
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
DNA
genômico
cDNA
1 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
1 26
66 405 444 825 1359 1570
1 26
66 405 444 825
1 26
66 405
1 261 26
66 405 444 825 1359 1570 5282 5584
RNAm
Resultados______________________________________________________
63
4.4. Amplificação do transcrito do gene SmRpn10 em S. mansoni
Para amplificação do gene que codifica para SmRpn10 foram idealizados
oligonucleotídeos que compreendiam uma pequena região localizada no interior da
região codificadora para posterior análise da expressão deste gene no ciclo de vida do
parasita. Como observado na Figura 10, após o RT-PCR obtivemos um cDNA que
apresentou um tamanho de 174 pares de bases (pb), o qual está de acordo com
análises prévias. O transcrito foi clonado no vetor pGEMT-easy e sequenciado como
descrito em materiais e métodos. Para confirmar a identidade do transcrito, as
sequências foram submetidas à busca de homologia em banco de dados
(www.ncbi.nlm.nih.gov), com o auxílio do algorítimo BLAST.
Figura 10. Amplificação do transcrito de 174pb provenientes do gene SmRpn10. Os
oligonucleotídeos foram idealizados com o auxílio do programa Vector-NTI e validados por PCR. As
amostras foram analisadas em gel de agarose 1%. PM-Peso Molecular de 100pb DNA ladder
(Invitrogen).
4.5. Análise da expressão do cDNA que codifica para SmRpn10 no ciclo de vida
do parasita
Para analisarmos a expressão do cDNA que codifica para SmRpn10 nos
estágios de vermes adultos, esquistossômulos mecanicamente transformados de
0hora (h), 2h, 4h, 6h, 8h, 24h, e 48h, cercárias e ovos, utilizamos os
PM Rpn10
500pb
1000pb
200pb
PM Rpn10
500pb
1000pb
200pb
PM Rpn10
500pb
1000pb
200pb
Resultados______________________________________________________
64
oligonucleotídeos apropriados à análise por PCR quantitativo em tempo real (tabela
01). Esses oligonucleotídeos possuem a particularidade de apresentarem um maior
conteúdo de GC na porção 3', e também apresentam um temperatura de anelamento
de 60°C o qual é mais adequado para a amplificação do transcrito nas condições do
PCR e também para a análise empregando curvas de dissociação. As reações de PCR
foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG ROX
(INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação de PCR quantitativo
foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500 (Applied
Biosystems).
Portanto, a análise da expressão do cDNA de 174pb obtido por qPCR que
codifica para SmRpn10 durante o desenvolvimento do parasita, aponta para uma
expressão diferencial desse.
Pode-se observar na Figura 11 a expressão a partir da fase evolutiva de
verme adulto aumenta discretamente até o estágio de cercária. Na fase de
esquistossômulo de Oh e 2h a expressão deste gene atinge o pico máximo em relação
a todas as outras fases. A partir do estágio de esquistossômulo de 4h até 24h a
expressão diminui, tendo um ligeiro aumento em 48h retomando o nível de expressão
próximo ao da fase de verme adulto.
Resultados______________________________________________________
65
Figura 11. Expressão do gene SmRpn10 no desenvolvimento do parasita. A expressão do mRNA
foi avaliada nos estágios de vermes adultos, ovos, cercárias, esquistossômulos mecanicamente
transformados de 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h e 48h. Como controle endógeno normalizador foi utilizado o
gene da alfa-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo método do ∆Ct,
utilizando a fórmula 2
-∆Ct
. Cerca de 1µg de RNA de cada estágio foram utilizados para a síntese do
cDNA. A expressão foi confirmada em gel de agarose 1,5%. ** P < 0,001.
4.6. Clonagem da sequência codificadora de SmRpn10 em vetor pET 28a+ .
Com o intuito de produzir e purificar a proteína heteróloga Rpn10, a
sequência que codifica para SmRpn10 foi amplificada por PCR utilizando
oligonucleotídeos iniciadores contendo sítios para as enzimas de restrição NheI , na
sua extremidade 5', e BamHI, na sua extremidade 3', as quais eram compatíveis com
os sítios das enzimas de restrição presentes no sítio múltiplo de clonagem do vetor
pET28a+.
O transcrito amplificado por PCR em vermes adultos apresenta um tamanho
de aproximadamente 1259pb, onde a temperatura de anelamento adotada foi a de
57°C para posteriores amplificações de acordo com a Figura 12.
**
**
**
**
Resultados______________________________________________________
66
Figura 12. PCR de gradiente com as amplificações da sequência codificadora para a proteína
Rpn10. Os oligonucleotídeos iniciadores foram idealizados adicionando-se sítios para as enzimas de
restrição NheI (extremidade 5') e BamHI (extremidade 3'), as quais eram compatíveis com os sítios
das enzimas de restrição presentes no sítio múltiplo de clonagem do vetor pET28a+. As amostras
foram analisadas em gel de agarose 1%. PM - Peso Molecular 1000pb (Invitrogen).
O produto de PCR foi purificado e digerido com as enzimas de restrição
citadas acima, assim como o vetor pET28a+. O produto de PCR digerido foi ligado
ao vetor digerido através de uma reação de ligação com a enzima T4 ligase.
Bactérias da linhagem DH5α foram transformadas com o produto da ligação e
foi feito o PCR das colônias existentes para identificar os clones que possuíam o
inserto. O DNA plasmidial dos clones positivos foi submetido ao sequenciamento
automático para confirmar se a proteína estava na fase de leitura correta. A Figura
13 apresenta o resultado do sequenciamento, mostrando parte da seqüência do vetor
com a cauda de histidina em destaque, confirmando que a proteína Rpn10 está na
fase de leitura correta, iniciando-se com a metionina. Desta forma partimos para a
próxima etapa que foi a expressão da proteína heteróloga.
PM
53
o
C
55
o
C
57
o
C
59
o
C
500pb
1000pb
PM
53
o
C
55
o
C
57
o
C
59
o
C
500pb
1000pb
PM
53
o
C
55
o
C
57
o
C
59
o
C
500pb
1000pb
500pb500pb
1000pb1000pb
Resultados______________________________________________________
67
Figura 13. Sequenciamento automático dos nucleotídeos do gene que codifica para a proteína
Rpn10 clonados no vetor de expressão pET28a+. Podemos observar a presença da sequência
codificadora da cauda de seis histidinas (sublinhada), pertencente ao vetor, na porção N-terminal da
proteína e o ATG, códon da metionina, inicial da proteína (dentro do quadrado).
Resultados______________________________________________________
68
4.7. Expressão da proteína recombinante em bactéria E. coli linhagem BL21
Roseta [DE3]pLysS.
4.7.1. Determinação do tempo de expressão da proteína SmRpn10
As bactérias
E. coli
linhagem BL21 Roseta [DE3]pLysS foram transformadas
com as construções de pET28a + Rpn10 e pET28a como controle interno. As
culturas de 400mL de meio HDM foram inoculadas com as colônias provenientes
das transformações. Ao atingir 0,6 de densidade óptica em 660 nm, 1mM de IPTG
foi adicionado às culturas para a indução da expressão da proteína recombinante. Na
análise da expressão em função do tempo, demonstrada na
Figura 14
, observa-se o
aumento significativo da banda correspondente à proteína heteróloga Rpn10 cujo
tamanho é por volta de 55kDa nos intervalos de 1 a 5 horas de indução quando
comparado com a cultura não induzida (NI). Para a expressão desta proteína o tempo
estabelecido foi de 4 horas.
Figura 14. Cinética da expressão da proteína recombinante Rpn10. A ORF que codifica para a
proteína Rpn10 foi clonada em vetor pET28a+ (Novagen) e a expressão foi induzida por 1mM de
IPTG. A análise da expressão foi monitorada pela retirada de alíquotas das bactérias em intervalos de
1 hora durante 5 horas (0h-5h), as quais foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%. NI: cultura não
induzida. -: vetor pET28a vazio. A seta aponta a banda de aproximadamente 55 kDa correspondente a
proteína Rpn10. O marcador de peso molecular utilizado foi Page Ruler™ Prestained Protein Ladder.
72 KDa
55 KDa
PM - NI 0h 1h 2h 3h 4h 5h
72 KDa
55 KDa
PM - NI 0h 1h 2h 3h 4h 5h
72 KDa
55 KDa
PM - NI 0h 1h 2h 3h 4h 5h
Resultados______________________________________________________
69
4.8. Purificação da proteína heteróloga Rpn10
Depois da expressão, partiu-se para a caracterização da proteína.
Primeiramente a proteína recombinante foi purificada por coluna de afinidade Ni
Sepharose™ High Performance conforme descrito no item 3.20.4. Para isso, o
extrato solúvel foi submetido a este procedimento. Como observado na
Figura 15
, a
proteína foi eluída em cinco frações e apenas nas duas primeiras frações há uma
pequena contaminação. O rendimento da proteína purificada chega próximo a 20mg
de proteína/litro.
Figura 15. Purificação da proteína heteróloga Rpn10 por cromatografia de afinidade. Gel de
poliacrilamida 12% corado com Comassie Blue demonstrando Peso molecular (PM), fração não ligada
à coluna (FT), lavagens 5, 10 e 15 (W5, W10 e W15 respectivamente) e as frações 1, 2, 3, 4 e 5 das
eluições (E1, E2, E3, E4 e E5). A seta indica a proteína Rpn10 purificada. O marcador de peso
molecular utilizado foi Page Ruler™ Prestained Protein Ladder.
4.9. Confirmação da identidade da proteína recombinante por espectometria de
massa
A banda correspondente à proteína SmRpn10 recombinante foi cortada do gel
e submetida à análise por espectrometria de massa e a busca de identidade no banco
PM FT W5 W10 W15 E1 E2 E3 E4 E5
72 KDa
55 KDa
PM FT W5 W10 W15 E1 E2 E3 E4 E5
72 KDa
55 KDa
PM FT W5 W10 W15 E1 E2 E3 E4 E5
72 KDa
55 KDa
Resultados______________________________________________________
70
de dados do
Schistosoma mansoni
GeneDB foi realizada utilizando o
software
MASCOT. A
Tabela 3
demonstra a análise realizada pelo
software
MASCOT no
banco de dados do GeneDB, confirmando desta forma a identidade da proteína
recombinante.
Tabela 3. Resultado da busca de identidade no banco de dados do Schistosoma mansoni
GeneDB realizada pelo software MASCOT utilizando as seqüências dos peptídeos identificados
por MALDI-MS/MS. C significa que o resíduo de cisteína foi modificado pelo tratamento com
iodoacetamida (carbamidometilação).
Proteína Número de acesso
no GeneDB
Número de
peptídeos
fragmentados
Sequência dos peptídeos
identificados por
MALDI - MS/MS
Rpn10
Smp_000740.1,
Smp_000740.2,
Sm00746
2
IIFCSSIR
IVCFIGSPILEDEKELTR
4.10. Produção de anticorpos policlonais específicos contra SmRpn10 em
camundongos
Foi produzido um anticorpo policlonal anti-Rpn10 em camundongos,
utilizando-se a proteína de fusão his-Rpn10. A imunização foi realizada com esta
proteína eluída que apresentava um perfil eletroforético semelhante ao mostrado na
Figura 15
e injetada nos camundongos conforme descrito em materiais e métodos.
Após a terceira imunização, o soro dos camundongos foi recuperado via
punção cardíaca e testado com a proteína recombinante Rpn10. O reconhecimento do
soro imune contra esta proteína imobilizada em membrana de nitrocelulose foi
revelado pela reação biotina/streptoavidina conjugada com fosfatase alcalina e
NBT/BCIP conforme mostrado na
Figura 16
.
Resultados______________________________________________________
71
Figura 16. Teste dos soros pré-imune e imune de camundongos imunizados com a proteína
Rpn10 heteróloga. Os soros: pré-imune, coletado antes das imunizações, e o imune, coletado após a
terceira imunização foram testados por Dot-blot para a produção de anticorpos específicos contra his-
Rpn10 imobilizada em membrana de nitrocelulose.
4.11. Expressão da proteína SmRpn10 em extratos protéicos de vermes adultos,
cercárias e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-Rpn10 total.
O
blot
foi realizado com os extratos protéicos totais das fases de vermes
adultos, ovos e cercárias. Foi feito um
imunoblotting
para análise do perfil de
reconhecimento das imunoglogulinas G total a partir dos soros dos camundongos
imunizados com a SmRpn10 recombinante nas diferentes fases evolutivas do parasita.
Correu-se um gel contendo 20µg dos extratos protéicos, fez-se a transferência para a
membrana de nitrocelulose e procedeu-se o
imunoblotting
usando um anticorpo IgG
total anti-Rpn10 (1:1000) como descrito em materiais e métodos. Como podemos
observar na
Figura 17
, o
imunoblotting
revela que o anticorpo purificado reconhece
uma proteína de tamanho aproximado de 50 kDa na fase evolutiva de ovos e também
revela a marcação de outras proteínas reconhecidas pelo anticorpo anti-SmRpn10. Os
mesmos extratos não revelam nenhuma marcação quando incubados apenas com o
anticorpo secundário excluindo assim, a possibilidade de interações inespecíficas
(dado não mostrado).
Imune
Pré-imune
Ac 2
o
Imune
Pré-imune
Ac 2
o
ImuneImune
Pré-imunePré-imune
Ac 2
o
Ac 2
o
Resultados______________________________________________________
72
Figura 17. Western blotting das proteínas reconhecidas pelo anticorpo anti-Rpn10 total em
extrato bruto de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. (A) Gel de poliacrilamida
12%, corado com prata, correspondente a 20µg de proteínas provenientes do extrato bruto de vermes
adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. (B) Detecção dos níveis protéicos dos extratos de vermes
adultos, cercárias e ovos por western blot com o uso do anticorpo anti-Rpn10 total em extratos brutos
de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. A seta indica a provável banda que
corresponde à proteína Rpn10 na fase de ovos. Abreviaturas: PM – peso molecular, VA – verme
adulto, Ovo – ovo, Cer – cercaria, Esq – esquistossômulo. O marcador de peso molecular utilizado foi
Page Ruler™ Prestained Protein Ladder.
4.12. Purificação de anticorpos policlonais específicos contra SmRpn10
Após o reconhecimento da proteína de interesse pelo soro de camundongos
imunizados, a próxima etapa foi purificar o anticorpo em procedimento
cromatográfico automático FPLC, monitorado por absorbância em 280nm para
garantir a pureza dos anticorpos. Para isto, a proteína recombinante foi imobilizada
na resina de níquel por afinidade à cauda de 6 histidinas e as amostras do soro dos
camundongos foram incubadas nesta coluna. O anticorpo ligado à resina imobilizada
com a proteína de interesse foi eluído pela adição de glicina em três picos, como
demonstrada na
Figura 18
.
Resultados______________________________________________________
73
Figura 18. Purificação do anticorpo policlonal anti Rpn10 em camundongos. A coluna foi
previamente equilibrada com tampão fosfato e lavada com o tampão de equilíbrio para remoção do
material não adsorvido à coluna. O anticorpo ligado à resina imobilizada com a proteína de interesse
foi eluído pela adição de glicina em três frações. O procedimento cromatográfico foi realizado em
sistema cromatográfico automático FPLC (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), monitorado
por absorbância em 280nm.
4.13.
Titulação dos anticorpos policlonais purificados anti-SmRpn10
Para determinar o título dos anticorpos policlonais anti-SmRpn10 produzidos
em camundongos, aproximadamente 150ng da proteína recombinante SmRpn10
foram imobilizadas em membrana de nitrocelulose e colocadas para reagir com soro
de camundongos contendo o anticorpo anti-SmRpn10 em diferentes diluições.
O anticorpo testado apresentou resposta positiva até o título de 1:20000
quando testado com a proteína recombinante como mostrado na
Figura 19
. Como
controle negativo da marcação, foi utilizado soro pré-imune dos camundongos, o
qual não apresentou o reconhecimento da proteína recombinante que pudesse
comprometer os resultados obtidos com os anticorpos anti-SmRpn10 (resultados não
mostrados).
Resultados______________________________________________________
74
Figura 19. Titulação dos anticorpos purificados. Aproximadamente 50ng de proteína recombinante
Rpn10 foram imobilizadas em membrana de nitrocelulose e colocadas para reagir com o anticorpo
policlonal anti-SmRpn10 nas diluições de 1:500, 1:1000, 1:2500, 1:5000, 1:10000, 1:20000, 1:50000
e com o anticorpo secundário anti IgG de camundongo conjugado a fosfatase alcalina como controle.
A reação foi revelada com NBT/BCIP.
4.14. Expressão da proteína SmRpn10 em extratos protéicos de vermes adultos,
cercárias e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-Rpn10
purificado.
Após a passagem das imunoglobulinas totais provenientes do soro dos
camundongos imunizados com a SmRpn10 pela resina de níquel com a proteína
recombinante imobilizada, como descrito em materiais e métodos, fizemos um
imunoblotting
para análise do perfil desta proteína nas fases de vermes adultos, ovos,
cercárias e esquistossômulos do parasita. Na
Figura 20
, a membrana foi incubada
com anticorpo policlonal anti-SmRpn10 purificado na diluição de 1:2500. O
imunoblotting
revela que o anticorpo purificado reconhece uma proteína de
aproximadamente 50 kDa na fase de ovos e uma leve marcação com este mesmo
tamanho no estágio de vermes adultos. Também revela uma forte marcação de outra
1:500 1:1000 1:2500 1:5000
1:10000 1:20000 1:50000 Ac 2
o
1:500 1:1000 1:2500 1:5000
1:10000 1:20000 1:50000 Ac 2
o
Resultados______________________________________________________
75
banda de aproximadamente 20 KDa reconhecida pelo anticorpo anti-SmRpn10 nestas
mesmas duas fases. O imunoblotting controle, incubado somente com o anticorpo
secundário, não revela nenhuma marcação, excluindo desta forma a possibilidade de
interações inespecíficas (dado não mostrado).
Figura 20. Western blotting das proteínas reconhecidas pelo anticorpo anti-Rpn10 puro em
extrato bruto de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. (A) Gel de poliacrilamida
12%, corado com prata, correspondente a 20µg de proteínas provenientes do extrato bruto de vermes
adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. (B) Detecção dos níveis protéicos dos extratos de vermes
adultos, cercárias e ovos por western blot com o uso do anticorpo anti-Rpn10 puro em extratos brutos
de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. A seta indica a provável banda correspondente
à proteína Rpn10 em ovos, principalmente, e vermes adultos. Abreviaturas: PM – peso molecular, VA
– verme adulto, Ovo – ovo, Cer – cercária, Esq – esquistossômulo. O marcador de peso molecular
utilizado foi Page Ruler™ Prestained Protein Ladder.
PM VA Ovo Cer Esq
130 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
Esq Cer Ovo VA PM
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
130 KDa
A B
PM VA Ovo Cer Esq
130 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
Esq Cer Ovo VA PM
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
130 KDa
A B
PM VA Ovo Cer Esq
130 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
PM VA Ovo Cer Esq
130 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
130 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
55 KDa
17 KDa
72 KDa
26 KDa
43 KDa
Esq Cer Ovo VA PM
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
130 KDa
Esq Cer Ovo VA PM
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
130 KDa
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
72 KDa
55 KDa
17 KDa
26 KDa
43 KDa
95 KDa
130 KDa
A B
Resultados______________________________________________________
76
4.15. Dosagem de IgG e IgE por ELISA
Após o término do protocolo de imunização foi realizada a detecção das subclasses
de anticorpos anti-Rpn10 produzidas no soro dos animais imunizados com adjuvante
completo de Freund associado à proteína Rpn10 recombinante. A detecção foi realizada
com auxílio da técnica de ELISA, utilizando-se a proteína recombinante Rpn10 como
antígeno para sensibilização das microplacas. Foi realizada a diluição seriada do soro dos
camundongos imunizados com a proteína recombinante (imune) ou soro controle de
animais somente imunizados com adjuvante de Freund (pré-imune). Como pode ser
observado na Figura 21A, as absorbâncias entre os soros imunes e pré-imunes foram
significativamente diferentes entre as diluições de 1:8 até 1:1024 para a detecção de
imunoglobulina G. Entretanto, a imunização não levou a produção de níveis significantes
de imunoglobulina E anti a proteína Rpn10, visto que as absorbâncias obtidas no soro dos
animais imunizados foram significativamente diferentes somente entre as diluições de 1:8 e
1:16 (Figura 21B).
Figura 21. Curva de titulação comparando valores de diluições seriais dos soros de
camundongos imunizados com adjuvante de Freund + SmRpn10 recombinante (imune) e de
camundongos imunizados somente com adjuvante de Freund (pré-imune). Os soros pré-imunes
foram coletados antes da primeira imunização e os imunes após uma semana da última imunização.
Várias diluições seriais (1:8 a 1:1024) dos soros estão indicadas. A proteína recombinante Rpn10 foi
usada como antígeno. Anticorpos secundários anti-IgG (A) e anti-IgE (B) de camundongo conjugados
a peroxidase foram adicionados. As reações foram lidas em espectrofotômetro, utilizando o filtro para
450nm.
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
A B
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1:8
1
:
16
1:32
1
:
64
1:128
1:256
1:512
1
:
1
024
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Pré-Imune
Imune
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1
:8
1:16
1
:
32
1:6
4
1:128
1
:256
1:
5
12
1:1024
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
A B
Resultados______________________________________________________
77
Na tentativa de identificar se há produção de anticorpos IgG e IgE anti-Rpn10
durante a infecção experimental pelo S. mansoni foi investigada a presença de anticorpos
específicos no soro de camundongos infectados. Para essa finalidade, placas de ELISA
foram recobertas com a proteína recombinante Rpn10 e incubadas com diferentes
concentrações do soro dos animais infectados ou soro controle, obtido de animais não
infectados. Como pode ser observado na Figura 22, houve diferença significativa entre a
produção de anticorpos específicos IgG somente quando utilizada a diluição de 1:8,
entretanto, em relação a produção de anticorpos específicos da subclasse IgE não houve
diferença significativa entre o grupo de animais infectados e não infectados, indicando que
não há produção deste anticorpo específico anti Rpn10 durante a infecção experimental
pelo S. mansoni.
Figura 22. Curva de titulação comparando valores de diluições seriais dos soros de
camundongos infectados com S. mansoni (infectados) e de camundongos controle (não
infectados). Os soros controles foram coletados antes da infecção experimental e os infectados após
56 dias de infecção. Várias diluições seriais (1:8 a 1:1024) dos soros estão indicadas. A proteína
recombinante Rpn10 foi usada como antígeno. Anticorpos secundários anti-IgG (A) e anti-IgE (B) de
camundongo conjugados a peroxidase foram adicionados. As reações foram lidas em
espectrofotômetro, utilizando o filtro para 450nm.
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Não infectado
Infectado
A B
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Total IgG - RPN 10
1
:
8
1
:
1
6
1:3
2
1
:64
1
:1
28
1:
2
5
6
1
:
5
1
2
1:
1
02
4
0.0
0.5
1.0
1.5
Not infected
Infected
Absorbance 450nm
Total IgE - RPN 10
1:8
1:
16
1:32
1:
64
1:
1
28
1:
256
1:512
1:102
4
0.0
0.2
0.4
0.6
Absorbance 450nm
Não infectado
Infectado
A B
Resultados______________________________________________________
78
4.16. Proteção induzida in vivo por SmRpn10
Camundongos BALB/c foram imunizados com três injeções de SmRpn10 ou
somente adjuvante de Freund (controle). A eficiência da imunização foi determinada
pela presença de anticorpos específicos nos soros dos animais, uma semana antes do
desafio com cercárias, por Dot-blot. A presença de anticorpos específicos anti-Rpn10
foi detectada no soro de camundongos imunizados com essa proteína, enquanto os
soros dos camundongos controle não apresentaram reatividade significativa como
mostrado na Figura 23.
Figura 23. Detecção de anticorpos anti-Rpn10 no soro de camundongo BALB/c imunizados com
a proteína recombinante Rpn10. Os soros controle e imune coletados após a terceira imunização
foram testados por Dot-blot para a produção de anticorpos específicos contra SmRpn10 imobilizada
em membrana de nitrocelulose.
Quatro semanas após a última imunização, os animais foram desafiados com
a exposição das caudas a uma solução contendo aproximadamente 100
cercárias/cauda como ilustrado em materiais e métodos. Oito semanas após o desafio,
os animais foram sacrificados e o número de vermes adultos, obtidos por perfusão
portal, foi determinado. A Figura 24 mostra o número de vermes recuperados, tanto
dos animais controle como dos imunizados. A imunização com a SmRpn10 reduziu o
número de vermes recuperados, proporcionando uma proteção de aproximadamente
20%.
Teste
Controle
Ac 2
o
Teste
Controle
Ac 2
o
Teste
Controle
Ac 2
o
Resultados______________________________________________________
79
Figura 24. Proteção contra a infecção por S. mansoni induzida pela imunização com SmRpn10.
Os resultados foram expressos como média do número de vermes adultos recuperados por grupo
(média ± desvio padrão). Os dados são representativos de dois experimentos independentes.
4.17. Purificação de conjugados poliubiquitinados por afinidade à proteína
Rpn10
Para determinar a função da proteína recombinante Rpn10, foi realizado o
ensaio de purificação de conjugados poliubiquitinados, a partir de extratos protéicos
das fases evolutivas de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos, através
de uma cromatografia de afinidade à proteína Rpn10.
4.17.1. Conjugação da proteína Rpn10 recombinante a Sepharose 4B aminada e
carboxilada detectada por Western blot
Cerca de 2mg da proteína recombinante his-Rpn10 expressa em E. coli e
purificada por cromatografia de afinidade ao níquel foi colocada para reagir com a
sepharose 4B aminada e carboxilada como descrito em materiais e métodos. A fim
de verificar o sucesso da conjugação foi realizado um western-blot na resina como
descrito em materiais e métodos. Para isso, duas frações de 100µL cada da resina
conjugada foram separadas, uma das frações (teste) foi colocada para reagir com o
0
2
4
6
8
10
12
14
Média do número de vermes adultos recuperados por grupo
Resultados______________________________________________________
80
anticorpo primário anti-Rpn10 puro (diluição 1:2500), enquanto a outra fração
(controle) não recebeu o anticorpo primário apenas o secundário. Como mostrado na
Figura 25, há uma coloração maior na fração teste quando comparada a fração
controle. O imunoblotting revela que a conjugação da proteína recombinante a
sepharose foi realizada com êxito.
Figura 25. Verificação da ligação da proteína Rpn10 recombinante a Sepharose 4B. A
conjugação da proteína recombinante Rpn10 a sepharose 4B foi demonstrada por western-blot na
resina usando o anticorpo anti-Rpn10 puro (diluição 1:2500).
4.17.2. Western blot para detecção de proteínas poliubiquitinadas
Após a passagem dos extratos protéicos totais das fases de vermes adultos,
ovos, cercárias e esquistossômulos pela resina com a proteína recombinante Rpn10
conjugada, os conjugados poliubiquitinados foram recuperados como descrito em
materiais e métodos. Foi feito um imunoblotting para análise do perfil destas
proteínas nas diferentes fases evolutivas do parasita. Correu-se um gel contendo
diferentes diluições dos extratos protéicos totais juntamente com os eluídos, fez-se a
transferência para a membrana de nitrocelulose e procedeu-se o imunoblotting
usando um anticorpo anti-Ubiquitina como descrito em materiais e métodos. Como
observado na
Figura 26, em todos os estágios observamos a presença de conjugados
Teste Controle Teste Controle Teste Controle
Resultados______________________________________________________
81
poliubiquitinados, principalmente de alto peso molecular, mas a quantidade destes
recuperados é muito pequena em comparação com a quantidade presente nos extratos
totais. Pode-se observar que o padrão do imunoblotting muda nas diferentes fases
evolutivas e que na fase evolutiva de ovos é que se encontra a maior quantidade
destas proteínas.
Figura 26. Western blotting de proteínas ubiquitinadas em extrato bruto e eluídos de vermes
adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos. A, C, E e G. Gel de poliacrilamida 12%, corado com
prata, apresentando as diluições de 5µg, 2,5µg e 1,25µg do extrato bruto e a fração eluída da
cromatografia de afinidade à Rpn10 de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos
respectivamente. B, D, F e H. Detecção dos níveis protéicos de proteínas poli-ubiquitinadas nas fases
de vermes adultos, ovos, cercárias, e esquistossômulos, respectivamente, por western blot com o uso
do anticorpo de camundongo anti-ubiquitina e revelado conforme descrito em material e métodos.
Abreviaturas: 5,0 – 5,0µg do extrato protéico total; 2,5 – 2,5µg do extrato protéico total; 1,25 – 1,25
µg do extrato protéico total; E – fração eluída da cromatografia de afinidade à Rpn10.
A DCB
E
G
F
H
5,0 2,5 1,25 E
E 1,25 2,5 5,0 E 1,25 2,5 5,05,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E 5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
A DCB
E
G
F
H
5,0 2,5 1,25 E
E 1,25 2,5 5,0 E 1,25 2,5 5,05,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E 5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
A DCB
E
G
F
H
5,0 2,5 1,25 E
E 1,25 2,5 5,0 E 1,25 2,5 5,05,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E 5,0 2,5 1,25 E
5,0 2,5 1,25 E
Resultados______________________________________________________
82
4.18. Análise das proteínas de vermes adultos eluídas da coluna de afinidade
(Rpn10) por LC-MS/MS
As proteínas totais eluídas da coluna de afinidade foram reduzidas, alquiladas
e digeridas. Os peptídeos em solução foram purificados por troca iônica e separados
em nanoHPLC. A análise foi realizada por MS seguida de MS/MS e os dados de
fragmentação foram submetidos à busca de identidade no banco de dados do
Schistosoma mansoni GeneDB, utilizando-se o software MASCOT. A Tabela 4
demonstra a análise preliminar realizada pelo software MASCOT no banco de dados
do GeneDB, apresentando a identidade de algumas das proteínas eluídas.
Tabela 4. Resultado da busca de identidade no banco de dados do Schistosoma mansoni
GeneDB realizada pelo software MASCOT utilizando as seqüências dos peptídeos identificados
por LC-MS/MS.
Proteína Número de
acesso em
SchistoDB
Número de
peptídeos
fragmentados
Sequencia dos peptídeos
identificados por MALDI -
MS/MS
Cadeia pesada
da miosina
Sm12294 17
SEEVEELKR
SSQEVSELQR
NLQSTSPSFIR
QQLSAQLEEAR
ATQETVDDLER
ATVLAGELDELR
LQNEQAIATMR
GVSAAPAGGPGHANR
VISYFAVVAAASK
ELETELEAEQR
ELQSQLEDDQR
LAEKEEEFEATR
IQELEEDLEAER
YADSQAELENAQR
IKQQLSAQLEEAR
KYADSQAELENAQR
YSILAPNVIPDGFVDGR
Actina Sm02067 5
GYSFTTTAER
DSYVGDEAQSKR
SYELPDGQVITIGNER
VAPEEHPVLLTEAPLNPK
DLYANTVLSGGTTMFPGIADR
Hsp70 Sm09042 2
DAGAIAGLNVLR
VEIIANDQGNR
Alfa tubulina Smp_016780 1
AVFVDLEPTVVDEVR
Enolase Sm12193,
Smp_024110
2
AGAAEAGLPLYR
AAVPSGASTGVHEALELR
Resultados______________________________________________________
83
Gliceraldeído
3P
desidrogenase
Sm01185,
Smp_056970.1 a
.4
1
VPTPDVSVVDLTCR
Poliubiquitina Sm00183 1
IQDKEGIPPDQQR
Paramiosina Sm11278,
Smp_021920.1 a
.3
1
YDEESEEASNLR
Hsp90 Sm11760,
Smp_155740
1
GVVDSEDIPLNLSR
Hsp60 Sm01537,
Smp_008550
1
AAIEEGIVPGGGTALLR
ATPase
transportadora
de Cálcio
Smp_136710.1 e
.2
1
EFDALPIEEQR
5. DISCUSSÃO
Discussão_______________________________________________________
85
O proteassoma 26S é um complexo proteolítico, constituído de múltiplas
subunidades, responsável pela degradação e processamento proteolítico de proteínas
celulares essenciais na regulação do desenvolvimento, diferenciação, proliferação,
ciclo celular, apoptose, transcrição gênica, transdução de sinal, senescência e
resposta ao estresse (NAUJOKAT et al, 2007).
O reconhecimento específico de substratos poliubiquitinados destinados à
degradação é um evento de suma importância para o controle da proteólise
intracelular via proteassoma 26S. Portanto, entender como esse complexo
proteolítico realiza este reconhecimento específico é fundamental para se
compreender melhor o processo de degradação de substratos poliubiquitinados
(YOUNG et al., 1998).
Deveraux et al (1994) demonstraram que a subunidade de 50 kDa presente no
complexo regulatório 19S de humano, denominada de S5a ou Rpn10, era capaz de se
ligar a conjugados poliubiquitinados in vitro, sendo portanto, a primeira subunidade
do proteassoma 26S relacionada a capacidade de reconhecer e se ligar a substratos
poliubiquitinados.
O proteassoma e a via de controle de degradação de proteínas associada têm
sido sujeitos de muitas pesquisas em vários sistemas, primeiramente em leveduras e
células de mamíferos (VOGES et al., 1999) e também em protozoários (PAUGAM
et al., 2003). Por comparação, consideravelmente pouco é conhecido sobre
degradação de proteínas em helmintos.
Estudos realizados em nosso laboratório, onde o sistema ubiquitina-
proteassoma em S. mansoni foi caracterizado, demonstraram sua importância durante
o desenvolvimento deste parasito (GUERRA-SÁ et al., 2005). Dando continuidade a
esta e outras investigações do papel desempenhado pelo proteassoma no
Discussão_______________________________________________________
86
desenvolvimento do parasito, iniciamos estudos sobre a subunidade Rpn10 do
proteassoma 26S devido a sua grande importância no reconhecimento de conjugados
poliubiquitinados.
A partir da entrada 608378.1 depositada no banco de dados do Projeto
Transcriptoma de S. mansoni, foi identificada a provável região codificadora desta
proteína e foram idealizados oligonucleotídeos específicos para a análise da
expressão do cDNA que codifica para Rpn10 no ciclo de vida do parasita. A partir
deste momento, passamos a denominar este gene de SmRpn10 (S. mansoni Rpn10).
Desta forma, a sequência do gene SmRpn10 foi analisada em bancos de dados
utilizando os algorítimos BLASTx e BLASTn, os quais correspondem a bancos de
dados de sequências de proteínas e nucleotídeos respectivamente. A análise da
sequência de 420 aminoácidos mostrou que o gene SmRpn10 apresenta quatro
domínios em seu fragmento gênico denominados vWA, UIM1, UIM2 e UIM3. Seu
domínio amino-terminal consiste de um motivo de von Willebrand A (vWA)
conservado que prende a subunidade Rpn10 ao proteassoma. O recrutamento de
cadeias de ubiquitina por esta proteína é mediado pelos motivos de interação a
ubiquitina (UIMs) (HOFMANN et al., 2001).
Os resultados da análise da sequência primária de aminoácidos e da filogenia
mostraram que a proteína SmRpn10 é conservada entre seus ortólogos, e que sua
conservação obedece à evolução das espécies. A proteína SmRpn10 possui na sua
extensão C-terminal 37 aminoácidos a mais que os demais ortólogos. Esta diferença,
quando comparada à proteína de humano, nos leva a acreditar que a estratégia de
usar a SmRpn10 como alvo de vacina contra a esquistossomose pode trazer bons
resultados.
Em relação à estrutura genômica, a sequência genômica depositada no banco
Discussão_______________________________________________________
87
de dados do parasita S. mansoni GeneDB com entrada Smp000740.2, foi observada
a existência de quatro íntrons, com comprimentos de 39pb, 38pb, 533pb e 3711pb
respectivamente.
Para avaliar a expressão do gene que codifica para SmRpn10 nas fases
evolutivas de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos, foram
desenvolvidas culturas de esquistossômulos mecanicamente transformados e
recuperados após 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h e 48h de cultivo in vitro. Esta fase mimetiza
o período correspondente aos dois primeiros dias de infecção dentro do hospedeiro
mamífero definitivo. Após a penetração da cercária, o desenvolvimento do
esquistossômulo pode ser dividido entre a migração da pele até os pulmões e deste
órgão para o fígado. A fase de crescimento se inicia ao final da migração dos
pulmões, quando o parasita recebe estímulos do hospedeiro (LAWSON E WILSON,
1980). Outros estudos indicam que a fase de migração compreende desde o dia zero
após a infecção, quando o parasita ainda está alojado na pele, chegando ao fígado no
oitavo dia (CRABTREE E WILSON, 1980). Neste processo de migração, o parasita
passa por um estado metabólico semi-dormente, havendo apenas mudanças na
morfologia do verme, possivelmente para se adequar aos tamanhos dos capilares das
veias, as quais compreendem a rota de migração do esquistossômulo (WILSON et al,
1978). Várias evidências indicam que a síntese de proteínas é bastante diminuída nas
primeiras 24 horas após a transformação em esquistossômulo e depois ocorre um
aumento até alcançar o pico máximo no oitavo dia (NAGAI et al, 1977;
YUCKENBERG et al, 1987; BLANTON E LICATE 1992; HARROP & WILSON,
1993), quando o verme recebe estímulo para crescer e também terminar de formar o
seu tegumento heptalaminado, característico de vermes adultos totalmente
diferenciados (HOCLEY & MACLAREN, 1973). Além do que, durante a migração,
Discussão_______________________________________________________
88
o esquistossômulo pode utilizar proteínas pré-sintetizadas na fase de cercária
(HARROP & WILSON, 1993).
O gene que codifica para SmRpn10 apresenta uma expressão diferencial nos
estágios estudados. O aumento significativo da expressão observado em
esquistossômulos de Oh e 2h pode ser devido à soma da expressão das duas
isoformas SmRpn10a e SmRpn10c presente nesta fase evolutiva como demonstrado
em nosso laboratório por Pereira-Júnior (2005).
Em 1999, foi demonstrado por Harrop & Wilson que esta proteína é
encontrada no meio de cultura de esquistossômulos cultivados in vitro, sendo assim,
o aumento da expressão neste estágio pode também estar relacionado com um
mecanismo de compensação pela diminuição desta proteína no meio intracelular.
Depois de analisar a expressão desse transcrito que codifica SmRpn10 no
ciclo de vida do parasita, partiu-se para uma análise da proteína SmRpn10 que foi
produzida em sistema heterólogo. Desta forma, o cDNA que expressa esta proteína
foi clonado em vetor de expressão pET28a+ para produção de anticorpo e para
estudar sua função no ciclo de vida do parasita. O sequenciamento indica que o
fragmento foi clonado na posição correta, evidenciando a cauda composta por 6
histidinas na porção N-terminal seguido dos aminoácidos referentes aos códons do
vetor e posterior início da proteína SmRpn10, na fase de leitura correta.
Após a purificação da proteína SmRpn10, observou-se uma proteína
aparentemente pura com o tamanho de aproximadamente 55 kDa. O aumento do
tamanho da proteína em relação à literatura (aproximadamente 50 KDa) é devido a
ausência do códon de parada na seqüência da SmRpn10 usada, sendo assim, a
tradução continuou até o códon de parada do vetor.
A produção de anticorpos policlonais anti his-Rpn10 em camundongos,
Discussão_______________________________________________________
89
sugere que o anticorpo produzido é aparentemente específico e foi demonstrado o
reconhecimento da proteína SmRpn10 pelos anticorpos policlonais anti-Rpn10 totais
no extrato protéico total de ovos. Uma banda de aproximadamente 50 KDa, que é o
tamanho esperado da proteína Rpn10, foi reconhecida somente no extrato da fase de
ovos. Como os anticorpos anti-Rpn10 são policlonais, ou seja, reconhecem diferentes
epítopos da proteína, as demais marcações no blot provavelmente são proteínas que
possuem epítopos semelhantes aos da Rpn10 como, por exemplo, proteínas que
possuem o domínio UIM, domínio este altamente conservado.
O anticorpo policlonal anti-Rpn10 foi purificado em procedimento
cromatográfico automático FPLC em três picos pela adição de glicina. Sendo que na
primeira fração havia a maior concentração de anticorpos anti-Rpn10 purificados
como mostrado na titulação destes em relação às outras duas frações (resultado não
mostrado). Houve reação dos anticorpos até a diluição de 1:20000, mas a diluição
escolhida para ser usada nos experimentos posteriores foi de 1:2500 para garantir
uma boa marcação.
O imunoblotting anti-Rpn10 feito com os anticorpos purificados revelou a
marcação de uma proteína de aproximadamente 50 KDa em ovos e uma marcação
fraca, mas presente, em vermes adultos da mesma banda que tem o tamanho
correspondente ao da Rpn10. A presença de uma banda forte de tamanho
correspondente ao da Rpn10 em ovos tanto neste blot quanto no anti-Rpn10 total
pode ser devido ao grande acúmulo de substratos poliubiquitinados que ocorre nesta
fase como mostrado por Castro-Borges (2005) em nosso laboratório, sendo assim,
deve haver uma maior expressão desta proteína levando então, ao direcionamento
destes substratos ao proteassoma para a degradação. Este blot também revelou a
marcação de uma forte banda de aproximadamente 20 KDa em ovos e vermes
Discussão_______________________________________________________
90
adultos, esta marcação pode ser devido a degradação da proteína Rpn10 como
também pode ser devido a marcação de outra proteína que contém o domínio UIM
que está presente em outras proteínas. Pode-se notar que algumas marcações
sumiram em relação ao immunoblotting anti-Rpn10 total mostrando assim, que a
purificação funcionou selecionando os anticorpos mais específicos anti-Rpn10, mas
não garante a especificidade somente a Rpn10 por ser anticorpos policlonais. Assim
como no immunoblotting anti-Rpn10 total, neste blot não houve marcação nas fases
de cercárias e esquistossômulos da proteína Rpn10, isto pode ser devido à baixa
expressão desta nestes estágios ficando abaixo do limite de detecção do western blot
com revelação por NBT/BCIP que é de 5µg de proteína.
A detecção das subclasses de anticorpos anti-Rpn10 produzidas no soro dos
animais imunizados com adjuvante completo de Freund associado (imunizado) ou
não (não-imunizado) à proteína RPN10 recombinante foi realizada por dosagem de
ELISA. A subclasse predominante é a IgG pois em todas as diluições a absorbância
obtida no soro dos animais imunizados foi significativamente diferente em relação ao
controle. Como demonstrado por Cardoso et al. (2008) a subclasse de
imunoglobulina G é produzida no soro de camundongos imunizados com a proteína
Sm29 e esta produção se inicia após a primeira imunização. A subclasse IgE também
é detectada, mas apenas nas diluições de 1:8 e 1:16 a absorbância obtida no soro dos
animais imunizados foi significativamente diferente em relação ao controle, o que
demonstra que somente uma baixa concentração desta imunoglobulina é produzida
contra a Rpn10.
A verificação da produção de anticorpos específicos das subclasses IgG e IgE
anti-Rpn10 no soro de camundongos durante a infecção experimental pelo S.
mansoni
foi realizada por dosagem destas imunoglobulinas por ELISA. Nenhuma
Discussão_______________________________________________________
91
das duas subclasses de imunoglobulinas contra a Rpn10 foi encontrada no soro dos
camundongos após 56 dias de infecção.
Correntemente, a estratégia de controle da esquistossomose é principalmente
baseada no tratamento de indivíduos infectados por quimioterapia com drogas
seguras e efetivas (HARDER, 2002). Entretanto, uma grande extensão de áreas
endêmicas e a constante reinfecção juntamente com condições sanitárias precárias
em países tropicais como o Brasil tornam o tratamento com drogas ineficiente
(BERGQUIST, 1998). O desenvolvimento de resistência à droga pelo parasita é
também uma preocupação que deve ser considerada (COLES et al., 1986).
Para uma estratégia de controle da doença em longo prazo é preciso combinar
quimioterapia em massa com uma vacina protetora. Embora o campo de
desenvolvimento de vacinas tenha experimentado mais fracassos que sucessos,
resultados encorajadores têm sido obtidos recentemente usando antígenos
recombinantes derivados do S. mansoni (OLIVEIRA et al., 2008).
A maioria dos estudos feitos com antígenos recombinantes no Brasil é com a
proteína Sm14. A primeira caracterização das propriedades protetoras de Sm14 foi
desenvolvida por Tendler et al. (1996) com a Sm14 recombinante expressa em E.
coli (vetor pGEMEX-1) como uma proteína de 40 KDa fusionada a proteína
principal do capsídeo do bacteriófago T7. De acordo com este estudo, Sm14 foi
capaz de induzir 67,9% de proteção quando combinada ao adjuvante de Freund e
64% sem o adjuvante em camundongos SWISS desafiados com 100 cercárias.
O Grupo de Trabalho em Esquistossomose da Organização Mundial de Saúde
(WHO) tem determinado que vacinas que diminuam a carga parasitária em 50%
serão efetivas na redução especialmente da morbidade e mortalidade (CHERFAS,
1991; BERGQUIST et al., 2002). Neste sentido, o Comitê de Direção de
Discussão_______________________________________________________
92
Descobrimento de Vacinas da WHO, em 1999, recomendou um plano de trabalho
para a esquistossomose, cujo objetivo é a produção de uma vacina que induza pelo
menos 50% de resistência a reinfecção após o tratamento com droga da população
susceptível. Similarmente, o Programa de Desenvolvimento das Nações Unidas/
Banco Mundial/ Programa Especial para Pesquisa e Educação em Doenças Tropicais
da WHO (Manila, Philippines, October 2003) novamente recomendaram que o ponto
de avaliação mais relevante da eficácia de uma vacina para a esquistossomose é a
redução da morbidade, e a efetividade desta deve ser determinada com base no seu
potencial anti-infecção, anti-doença ou anti-fecundidade.
Considera-se que seja possível obter uma vacinação eficiente contra
esquistossomose, uma vez que a imunização de animais experimentais com cercárias
irradiadas é capaz de induzir até 80% de proteção contra uma infecção subseqüente
com parasita. A proteção é medida pela redução da parasitemia, ou seja, no número
de vermes recuperados do fígado. Ao contrário de outras infecções, uma imunização
esterilizante não seria possível nem necessária, uma vez que a morbidade séria requer
níveis elevados de infecção por períodos prolongados. Modelos matemáticos
demonstram que uma redução na parasitemia de 45% seria suficiente para causar um
enorme impacto na endemia. Mais de 100 antígenos já foram identificados e testados
e uma dezena mostrou proteção entre 35-50% em modelos animais. Embora alguns
antígenos tenham demonstrado potencial e estão progredindo para ensaios clínicos,
até o momento não existe uma vacina eficiente contra a esquistossomose, e
provavelmente será necessária uma combinação de antígenos que induzam variados
tipos específicos de resposta imune para atingir uma proteção elevada (SIDDIQUI et
al., 2008).
Discussão_______________________________________________________
93
Com esse intuito foi avaliada a SmRpn10 como alvo de vacina para o
combate da esquistossome, pois esta proteína representa um potencial candidato com
base na sua propriedade de ser excretada pelo parasita durante a fase de
esquistossômulos encontrada no hospedeiro definitivo (HARROP & WILSON,
1999). Para isso, foi realizado o ensaio de desafio no qual os camundongos foram ou
não (grupo controle) imunizados com a SmRpn10. A imunização resultou na
produção de anticorpos anti-Rpn10. Após à imunização, os camundongos foram
desafiados com 100 cercárias/cauda. O número de vermes adultos recuperados por
perfusão do grupo imunizado foi menor que os recuperados do grupo controle, porém
a redução não foi significativa. A proteção de 20% conferida por essa imunização foi
baixa em relação a outros alvos já testados como descrito acima. Na tentativa de
melhorar a proteção e conseqüentemente reduzir a parasitemia dos camundongos
imunizados outras construções desta proteína poderão ser feitas, como por exemplo:
a retirada de algum dos domínios, a expressão de cada um dos domínios
separadamente ou até mesmo a expressão das regiões interdomínios, também poderá
ser realizada a combinação de antígenos que induzam tipos variados de resposta
imune.
Tendo feito a clonagem, expressão e caracterização molecular desta proteína,
seguiu-se então para a sua caracterização funcional.
Na tentativa de investigar a função da SmRpn10 como proteína ligadora de
substratos poliubiquitinados direcionados ao proteassoma 26S para a degradação, foi
idealizado um experimento de purificação de conjugados poliubiquitinados por
afinidade a proteína SmRpn10 recombinante e posterior detecção destes conjugados
utilizando anticorpo anti-ubiquitina. O western blot anti-Rpn10 feito na resina
demonstra que a conjugação da SmRpn10 recombinante à resina foi realizada com
Discussão_______________________________________________________
94
sucesso quando comparada a resina teste com a controle, as ligações inespecíficas do
anticorpo secundário observadas poderiam ter sido reduzidas com a adição de sal no
tampão de immunoblottig. Foi demonstrado que a proteína expressa é funcional, pois
foi capaz de ligar substratos poliubiquitinados. A fraca marcação tanto nos géis
replica quanto nos blots anti-ubiquitina dos eluídos de todas as fases evolutivas do
parasita é devido à baixa concentração de proteínas nestes, o que é conseqüência da
dificuldade de se obter vermes adultos e principalmente ovos, cercárias e
esquistossômulos, impossibilitando assim, a obtenção de extratos protéicos totais
altamente concentrados necessários neste tipo de experimento. Observa-se que há
maior quantidade dos substratos poliubiquitinados em ovos quando comparado com
as demais fases o que está de acordo com o trabalho realizado por Castro-Borges
(2005) em nosso laboratório que demonstrou que no estágio de ovos há um acúmulo
de proteínas poliubiquitinadas. Outro fato importante que pode ser observado é que
foram eluídos principalmente conjugados poliubiquitinados, não foram observados
monoubiquitinados, isso se deve à característica da proteína Rpn10 ser capaz de se
ligar a cadeias de poliubiquitinas contendo quatro ou mais ubiquitinas.
(DEVERAUX et al., 1995; DEVERAUX et al., 1994).
O reconhecimento de substratos poliubiquitinados pelo proteassoma é muito
importante para a degradação seletiva. Muitas proteínas como a Rpn10, Rad23 e
Dsk2 funcionam como receptores de cadeias de poliubiquitina, e cooperam na
degradação proteassomal (FUNAKOSHI et al., 2002; RAO & SASTRY, 2002;
ELSASSER et al., 2004; MADURA, 2004). Embora a redundância destes receptores
tenha sido relatada, os substratos individuais para cada receptor permanecem sendo
estudados (SEONG et al., 2007).
Para melhor entender a ubiquitinação e suas funções, ferramentas
Discussão_______________________________________________________
95
proteômicas têm sido desenvolvidas para purificar e identificar mais substratos
protéicos (TAN et al., 2008).
Os domínios UIMs tem sido usados para o enriquecimento de proteínas
ubiquitinadas em diferentes estudos. O UIM é um pequeno motivo helical que pode
ser encontrado em uma ampla variedade de proteínas. Os UIMs da Rpn10 interagem
preferencialmente com poliubiquitinas, enquanto ligam-se fracamente a
monoubiquitinas (HJERPE & RODRIGUEZ, 2008).
Em 2001, Layfield et al. usaram a proteína de fusão GST-S5a imobilizada
para purificar proteínas poliubiquitinadas a partir de tecidos de mamíferos, com a
intenção de expandir o repertório de substratos da via de ubiquitinação conhecidos.
Uma mistura complexa de proteínas poliubiquitinadas foi purificada com sucesso a
partir do extrato de cérebro de porco seguindo a indução da ubiquitinação in vitro.
Ventadour et al. (2007) também fez uma purificação por afinidade a partir de
células C2C12 tratadas com inibidor do proteassoma usando a região da S5a que
continha os domínios UIMs.
No estudo de Tan et al. (2008) foi usada a proteína de fusão GST-S5a
imobilizada para purificar por afinidade proteínas ubiquitinadas a partir de células
Chang do fígado.
Neste sentido, através de LC-MS/MS identificamos algumas proteínas de
vermes adultos que foram eluídas pela cromatografia de afinidade à Rpn10. Dentre
as proteínas identificadas, apenas a Sm00183, uma proteína da família da ubiquitina,
confirmou nossa expectativa quanto a funcionalidade da SmRpn10. Esta é uma
análise preliminar, outras proteínas podem ainda ser identificadas e uma busca mais
cuidadosa será realizada no sentido de encontrar resíduos de glicina C-terminal
remanescente na lisina modificada quando proteínas ubiquitinadas sofrem digestão
Discussão_______________________________________________________
96
por tripsina.
Considerando a importância da Rpn10 como receptora de substratos
poliubiquitinados endereçados a degradação via proteassoma 26S faz-se importante
conhecer quais são os substratos em S. mansoni que ela reconhece, se durante o
complexo ciclo de vida deste parasita o repertório de proteínas poliubiquitinadas
muda, ajudando-nos no entendimento da relação entre a maquinaria de ubiquitinação
e as diferentes funções celulares.
Pouco se sabe do impacto geral da Rpn10 no turnover de substratos do
proteassoma, fato que deve ser investigado e poderá ser realizado usando a técnica de
RNA de interferência (RNAi), o que nos permitirá conhecer um pouco mais sobre
esta proteína e revelar a verdadeira importância dela na degradação de proteínas via
proteassoma 26S e conseqüentemente no desenvolvimento do S. mansoni.
6. CONCLUSÕES
Conclusões_______________________________________________________
98
A partir dos dados obtidos nesse trabalho concluímos:
A estrutura primária desta proteína apresenta quatro domínios denominados
vWA, UIM1, UIM2 e UIM3 e sua sequência é altamente conservada em
outros organismos.
A proteína expressa em E. coli é funcional, pois foi capaz de ligar substratos
poliubiquitinados.
O gene que codifica para SmRpn10 apresenta uma expressão diferencial entre
as fases de vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos.
Os anticorpos policlonais anti his-Rpn10 produzidos em camundongos são
parcialmente específicos e reconhecem uma banda de aproximadamente 50
KDa, que é o tamanho esperado da proteína Rpn10, no extrato da fase de
ovos e uma banda de aproximadamente 20 KDa, nos extratos das fases de
vermes adultos e ovos.
Houve a indução de uma proteção de 20% em camundongos BALBc
imunizados com a proteína Rpn10 recombinante frente ao subseqüente
desafio com cercárias.
A análise preliminar das proteínas de verme adulto eluídas da cromatografia
de afinidade à Rpn10 demonstrou que apenas a proteína identificada
poliubiquitina (Sm00183) apresenta relação com a função de receptora de
conjugados poliubiquitinados da Rpn10.
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8. ANEXOS
Anexos_________________________________________________________
119
Anexo 1
Figura 27. Alinhamento da sequência de nucleotídeos que codifica para o gene SmRpn10 com os
oligonucleotídeos idealizados (sublinhado) para análise da expressão deste gene no ciclo de vida do
parasita pela técnica de PCR em tempo real.
ATGTCTCAGGAAGCTACGATCATAGCAGTTGATAATAGTGATTACATGAGGAATGGGGAC
TTCTTCCCAACACGTCTGCAGGCGCAAAATGATGCTGTCGGTTTGATCTGCCAGAGCAAG
CGTCAACGTAATCCAGAAAATACCATTGGTTTGTTGTCCCTTGCAAACACCGAAGTACTT
TGTACGCTAACAAATGATGTGAGTAAGATATACAATCGTTTACACCTTGTGGAGCCAAAG
GGCAGGATTATTTTCTGCTCATCAATAAGGATAGCCCACCTCGCACTTCGTCATCGACAA
TTGAGACATCAGAAAATGAGGATCGTATGTTTCATCGGTAGTCCCATATTAGAAGATGAA
AAAGAATTGACTAGGCTTGCCAAGCGTCTCAAAAAAGAGAAAGTAAATGTCGATATTATT
AACTTTGGTGAGAATGAAACAAATGAGCAAAAGTTGTCAGAATTCATCGACACATTGAAT
GGAAAGGATGGAACAGGTTCTCACCTCATATCTGTTGCCCCGGGGACAGTCTTACACGAT
ACTTTGATGACAAGCCCCGTTGTTGCTGGTGAGGATGGTTCTGGCATGGCTGGTGCCGGG
TTAGGTTTGGAGTTTGGATTAGATGGGGCAGAAGATCCTGATTTACTCTATGCCCTCAGA
GTATCAATGGAAGACCAGCGCATGCGTCAAGAACATGAGGTTAATGGAGATGGTAGTAAT
ACTTCAGTTGTAGCAACATCGTTACCAGCTGGGTCAGGAACGTCCGAAGAAGCTATGCTT
CAGCAGGCTTTGGCTATGTCAATGCAAATGAATAATACCGAGTCTTCATCCTTGCCTATG
GATATCGATCTGGCAGCTATGTCAGAAGAAGATCAGATAGCATATGCACTGCGCATGTCT
TTACAACAGATGGGAGAGGAAACGACTCAACCTACCACCACTACATTGGAGTCCGACAAG
ACTATTGTTGAACCCTCTGGTGTGGCTATGGATATAGATCAGACTCCAACTAAAGTTACT
GAAAATCCAAATTTATCTTCTAGTTCCGGTACATTGGCAGCTGCAACATCAGCTGTTCCT
ACATCTGCTGACTTGGATGTTATGTACGATGCTGAATTTTTGGAATCTGTTTTACAAAGT
TTGCCTGGTGTGGATACTCAGAATGAAGATGTTCGCAAGGCTATAAATGCTCTAACTAAG
TCCCAGTCACAGCGAGGTTCAAAGAAAGATGAAAAAGAAGATGAGGATAAGCAGAATAG
Anexos_________________________________________________________
120
Anexo 2
Mapa de restrição da SmRpn10
Restriction Map results
cuts once
cuts twice
Results for linear 1259 residue sequence "Rpn10" starting "ATGTCTCAGG"
MboI |gatc 18
NdeII |gatc 18
AluI ag|ct 14
1 V S G S Y D H S S * * * * L H E E W G L
1 C L R K L R S * Q L I I V I T * G M G T
1 M S Q E A T I I A V D N S D Y M R N G D
1 ATGTCTCAGGAAGCTACGATCATAGCAGTTGATAATAGTGATTACATGAGGAATGGGGAC
1 10 20 30 40 50
1 TACAGAGTCCTTCGATGCTAGTATCGTCAACTATTATCACTAATGTACTCCTTACCCCTG
MboI |gatc 105
NdeII |gatc 105
PstI ctgca|g 81
21 L P N T S A G A K * C C R F D L P E Q A
21 S S Q H V C R R K M M L S V * S A R A S
21 F F P T R L Q A Q N D A V G L I C Q S K
61 TTCTTCCCAACACGTCTGCAGGCGCAAAATGATGCTGTCGGTTTGATCTGCCAGAGCAAG
61 70 80 90 100 110
61 AAGAAGGGTTGTGCAGACGTCCGCGTTTTACTACGACAGCCAAACTAGACGGTCTCGTTC
AfaI gt|ac 177
RsaI gt|ac 177
ScaI agt|act 177
HincII gty|rac 125
41 S T * S R K Y H W F V V P C K H R S T L
41 V N V I Q K I P L V C C P L Q T P K Y F
41 R Q R N P E N T I G L L S L A N T E V L
121 CGTCAACGTAATCCAGAAAATACCATTGGTTTGTTGTCCCTTGCAAACACCGAAGTACTT
121 130 140 150 160 170
121 GCAGTTGCATTAGGTCTTTTATGGTAACCAAACAACAGGGAACGTTTGTGGCTTCATGAA
AfaI gt|ac 184
RsaI gt|ac 184
61 Y A N K * C E * D I Q S F T P C G A K G
61 V R * Q M M * V R Y T I V Y T L W S Q R
61 C T L T N D V S K I Y N R L H L V E P K
181 TGTACGCTAACAAATGATGTGAGTAAGATATACAATCGTTTACACCTTGTGGAGCCAAAG
181 190 200 210 220 230
181 ACATGCGATTGTTTACTACACTCATTCTATATGTTAGCAAATGTGGAACACCTCGGTTTC
MfeI c|aattg 299
TaqI t|cga 295
81 Q D Y F L L I N K D S P P R T S S S T I
81 A G L F S A H Q * G * P T S H F V I D N
81 G R I I F C S S I R I A H L A L R H R Q
241 GGCAGGATTATTTTCTGCTCATCAATAAGGATAGCCCACCTCGCACTTCGTCATCGACAA
241 250 260 270 280 290
241 CCGTCCTAATAAAAGACGAGTAGTTATTCCTATCGGGTGGAGCGTGAAGCAGTAGCTGTT
MboI |gatc 321
NdeII |gatc 321
101 E T S E N E D R M F H R * S H I R R * K
101 * D I R K * G S Y V S S V V P Y * K M K
101 L R H Q K M R I V C F I G S P I L E D E
301 TTGAGACATCAGAAAATGAGGATCGTATGTTTCATCGGTAGTCCCATATTAGAAGATGAA
301 310 320 330 340 350
301 AACTCTGTAGTCTTTTACTCCTAGCATACAAAGTAGCCATCAGGGTATAATCTTCTACTT
MseI t|taa 420
TaqI t|cga 411
BfaI c|tag 372
121 R I D * A C Q A S Q K R E S K C R Y Y *
121 K N * L G L P S V S K K R K * M S I L L
121 K E L T R L A K R L K K E K V N V D I I
361 AAAGAATTGACTAGGCTTGCCAAGCGTCTCAAAAAAGAGAAAGTAAATGTCGATATTATT
361 370 380 390 400 410
361 TTTCTTAACTGATCCGAACGGTTCGCAGAGTTTTTTCTCTTTCATTTACAGCTATAATAA
Anexos_________________________________________________________
121
TaqI t|cga 468
EcoRI g|aattc 461
141 L W * E * N K * A K V V R I H R H I E W
141 T L V R M K Q M S K S C Q N S S T H * M
141 N F G E N E T N E Q K L S E F I D T L N
421 AACTTTGGTGAGAATGAAACAAATGAGCAAAAGTTGTCAGAATTCATCGACACATTGAAT
421 430 440 450 460 470
421 TTGAAACCACTCTTACTTTGTTTACTCGTTTTCAACAGTCTTAAGTAGCTGTGTAACTTA
SmaI ccc|ggg 522
HpaII c|cgg 521
MspI c|cgg 521
AvaI c|ycgrg 520
XmaI c|ccggg 520
161 K G W N R F S P H I C C P G D S L T R Y
161 E R M E Q V L T S Y L L P R G Q S Y T I
161 G K D G T G S H L I S V A P G T V L H D
481 GGAAAGGATGGAACAGGTTCTCACCTCATATCTGTTGCCCCGGGGACAGTCTTACACGAT
481 490 500 510 520 530
481 CCTTTCCTACCTTGTCCAAGAGTGGAGTATAGACAACGGGGCCCCTGTCAGAATGTGCTA
HpaII c|cgg 597
MspI c|cgg 597
181 F D D K P R C C W * G W F W H G W C R V
181 L * * Q A P L L L V R M V L A W L V P G
181 T L M T S P V V A G E D G S G M A G A G
541 ACTTTGATGACAAGCCCCGTTGTTGCTGGTGAGGATGGTTCTGGCATGGCTGGTGCCGGG
541 550 560 570 580 590
541 TGAAACTACTGTTCGGGGCAACAACGACCACTCCTACCAAGACCGTACCGACCACGGCCC
MboI |gatc 634
NdeII |gatc 634
201 R F G V W I R W G R R S * F T L C P Q S
201 * V W S L D * M G Q K I L I Y S M P S E
201 L G L E F G L D G A E D P D L L Y A L R
601 TTAGGTTTGGAGTTTGGATTAGATGGGGCAGAAGATCCTGATTTACTCTATGCCCTCAGA
601 610 620 630 640 650
601 AATCCAAACCTCAAACCTAATCTACCCCGTCTTCTAGGACTAAATGAGATACGGGAGTCT
MseI t|taa 702
BbuI gcatg|c 685
SphI gcatg|c 685
221 I N G R P A H A S R T * G * W R W * * Y
221 Y Q W K T S A C V K N M R L M E M V V I
221 V S M E D Q R M R Q E H E V N G D G S N
661 GTATCAATGGAAGACCAGCGCATGCGTCAAGAACATGAGGTTAATGGAGATGGTAGTAAT
661 670 680 690 700 710
661 CATAGTTACCTTCTGGTCGCGTACGCAGTTCTTGTACTCCAATTACCTCTACCATCATTA
AluI ag|ct 773
AluI ag|ct 749
PvuII cag|ctg 749
241 F S C S N I V T S W V R N V R R S Y A S
241 L Q L * Q H R Y Q L G Q E R P K K L C F
241 T S V V A T S L P A G S G T S E E A M L
721 ACTTCAGTTGTAGCAACATCGTTACCAGCTGGGTCAGGAACGTCCGAAGAAGCTATGCTT
721 730 740 750 760 770
721 TGAAGTCAACATCGTTGTAGCAATGGTCGACCCAGTCCTTGCAGGCTTCTTCGATACGAA
HinfI g|antc 821
261 A G F G Y V N A N E * Y R V F I L A Y G
261 S R L W L C Q C K * I I P S L H P C L W
261 Q Q A L A M S M Q M N N T E S S S L P M
781 CAGCAGGCTTTGGCTATGTCAATGCAAATGAATAATACCGAGTCTTCATCCTTGCCTATG
781 790 800 810 820 830
781 GTCGTCCGAAACCGATACAGTTACGTTTACTTATTATGGCTCAGAAGTAGGAACGGATAC
Acc16I tgc|gca 893
AviII tgc|gca 893
FspI tgc|gca 893
NdeI ca|tatg 883
MboI |gatc 871
NdeII |gatc 871
AluI ag|ct 857
MboI |gatc 847
NdeII |gatc 847
BanIII at|cgat 846
BseCI at|cgat 846
BspDI at|cgat 846
ClaI at|cgat 846
TaqI t|cga 846
EcoRV gat|atc 844
Anexos_________________________________________________________
122
281 Y R S G S Y V R R R S D S I C T A H V F
281 I S I W Q L C Q K K I R * H M H C A C L
281 D I D L A A M S E E D Q I A Y A L R M S
841 GATATCGATCTGGCAGCTATGTCAGAAGAAGATCAGATAGCATATGCACTGCGCATGTCT
841 850 860 870 880 890
841 CTATAGCTAGACCGTCGATACAGTCTTCTTCTAGTCTATCGTATACGTGACGCGTACAGA
HinfI g|antc 950
HinfI g|antc 925
301 T T D G R G N D S T Y H H Y I G V R Q D
301 Y N R W E R K R L N L P P L H W S P T R
301 L Q Q M G E E T T Q P T T T T L E S D K
901 TTACAACAGATGGGAGAGGAAACGACTCAACCTACCACCACTACATTGGAGTCCGACAAG
901 910 920 930 940 950
901 AATGTTGTCTACCCTCTCCTTTGCTGAGTTGGATGGTGGTGATGTAACCTCAGGCTGTTC
HinfI g|antc 1003
MboI |gatc 997
NdeII |gatc 997
321 Y C * T L W C G Y G Y R S D S N * S Y *
321 L L L N P L V W L W I * I R L Q L K L L
321 T I V E P S G V A M D I D Q T P T K V T
961 ACTATTGTTGAACCCTCTGGTGTGGCTATGGATATAGATCAGACTCCAACTAAAGTTACT
961 970 980 990 1000 1010
961 TGATAACAACTTGGGAGACCACACCGATACCTATATCTAGTCTGAGGTTGATTTCAATGA
AluI ag|ct 1073
PvuII cag|ctg 1073
AluI ag|ct 1061
PvuII cag|ctg 1061
AfaI gt|ac 1051
RsaI gt|ac 1051
HpaII c|cgg 1047
MspI c|cgg 1047
BfaI c|tag 1041
341 K S K F I F * F R Y I G S C N I S C S Y
341 K I Q I Y L L V P V H W Q L Q H Q L F L
341 E N P N L S S S S G T L A A A T S A V P
1021 GAAAATCCAAATTTATCTTCTAGTTCCGGTACATTGGCAGCTGCAACATCAGCTGTTCCT
1021 1030 1040 1050 1060 1070
1021 CTTTTAGGTTTAAATAGAAGATCAAGGCCATGTAACCGTCGACGTTGTAGTCGACAAGGA
HinfI g|antc 1124
AfaI gt|ac 1106
RsaI gt|ac 1106
361 I C * L G C Y V R C * I F G I C F T K F
361 H L L T W M L C T M L N F W N L F Y K V
361 T S A D L D V M Y D A E F L E S V L Q S
1081 ACATCTGCTGACTTGGATGTTATGTACGATGCTGAATTTTTGGAATCTGTTTTACAAAGT
1081 1090 1100 1110 1120 1130
1081 TGTAGACGACTGAACCTACAATACATGCTACGACTTAAAAACCTTAGACAAAATGTTTCA
381 A W C G Y S E * R C S Q G Y K C S N * V
381 C L V W I L R M K M F A R L * M L * L S
381 L P G V D T Q N E D V R K A I N A L T K
1141 TTGCCTGGTGTGGATACTCAGAATGAAGATGTTCGCAAGGCTATAAATGCTCTAACTAAG
1141 1150 1160 1170 1180 1190
1141 AACGGACCACACCTATGAGTCTTACTTCTACAAGCGTTCCGATATTTACGAGATTGATTC
401 P V T A R F K E R * K R R * G * A E *
401 P S H S E V Q R K M K K K M R I S R I
401 S Q S Q R G S K K D E K E D E D K Q N
1201 TCCCAGTCACAGCGAGGTTCAAAGAAAGATGAAAAAGAAGATGAGGATAAGCAGAATAG
1201 1210 1220 1230 1240 1250
1201 AGGGTCAGTGTCGCTCCAAGTTTCTTTCTACTTTTTCTTCTACTCCTATTCGTCTTATC
Anexos_________________________________________________________
123
Anexo 3
Figura 28. Alinhamento da sequência de nucleotídeos que codifica para o gene Smrpn10 com os
oligonucleotídeos idealizados (sublinhado) para a clonagem em vetor de expressão pET28a+.
ATGTCTCAGGAAGCTACGATCATAGCAGTTGATAATAGTGATTACATGAGGAATGGGGAC
TTCTTCCCAACACGTCTGCAGGCGCAAAATGATGCTGTCGGTTTGATCTGCCAGAGCAAG
CGTCAACGTAATCCAGAAAATACCATTGGTTTGTTGTCCCTTGCAAACACCGAAGTACTT
TGTACGCTAACAAATGATGTGAGTAAGATATACAATCGTTTACACCTTGTGGAGCCAAAG
GGCAGGATTATTTTCTGCTCATCAATAAGGATAGCCCACCTCGCACTTCGTCATCGACAA
TTGAGACATCAGAAAATGAGGATCGTATGTTTCATCGGTAGTCCCATATTAGAAGATGAA
AAAGAATTGACTAGGCTTGCCAAGCGTCTCAAAAAAGAGAAAGTAAATGTCGATATTATT
AACTTTGGTGAGAATGAAACAAATGAGCAAAAGTTGTCAGAATTCATCGACACATTGAAT
GGAAAGGATGGAACAGGTTCTCACCTCATATCTGTTGCCCCGGGGACAGTCTTACACGAT
ACTTTGATGACAAGCCCCGTTGTTGCTGGTGAGGATGGTTCTGGCATGGCTGGTGCCGGG
TTAGGTTTGGAGTTTGGATTAGATGGGGCAGAAGATCCTGATTTACTCTATGCCCTCAGA
GTATCAATGGAAGACCAGCGCATGCGTCAAGAACATGAGGTTAATGGAGATGGTAGTAAT
ACTTCAGTTGTAGCAACATCGTTACCAGCTGGGTCAGGAACGTCCGAAGAAGCTATGCTT
CAGCAGGCTTTGGCTATGTCAATGCAAATGAATAATACCGAGTCTTCATCCTTGCCTATG
GATATCGATCTGGCAGCTATGTCAGAAGAAGATCAGATAGCATATGCACTGCGCATGTCT
TTACAACAGATGGGAGAGGAAACGACTCAACCTACCACCACTACATTGGAGTCCGACAAG
ACTATTGTTGAACCCTCTGGTGTGGCTATGGATATAGATCAGACTCCAACTAAAGTTACT
GAAAATCCAAATTTATCTTCTAGTTCCGGTACATTGGCAGCTGCAACATCAGCTGTTCCT
ACATCTGCTGACTTGGATGTTATGTACGATGCTGAATTTTTGGAATCTGTTTTACAAAGT
TTGCCTGGTGTGGATACTCAGAATGAAGATGTTCGCAAGGCTATAAATGCTCTAACTAAG
TCCCAGTCACAGCGAGGTTCAAAGAAAGATGAAAAAGAAGATGAGGATAAGCAGAATAG
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