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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
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Marcelle Carolina Colhone
Ribeirão Preto
2009
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Marcelle Carolina Colhone
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Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini
Co-orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto
Ribeirão Preto
2009
T
ese Apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para Obtenção do Título de Doutor
em Ciências, Área: Bioquímica.
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Colhone, Marcelle Carolina.
Proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de Leishmania amazonensis:
isolamento e incorporação em sistemas miméticos de membranas.
Ribeirão Preto, 2009.
115 p.
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, Área de concentração em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini
Co-orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto
1. Leishmania amazonensis – 2. Proteínas ancoradas por GPI – 3. Sistemas miméticos
de membranas – 4. Vacinação.
Dedicatória
Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida:
Aos meus pais Lúgiro Colhone e Maria de Lourdes Colhone. Obrigada por acreditarem em
mim e por todo o incentivo, amor, dedicação e sacrifícios oferecidos em pró da minha
formação acadêmica e pessoal.
Às minhas irmãs Cássia e Michelle. Obrigada pelo apoio, incentivo, paciência, amor e por
sempre estarem perto nos momentos de alegrias e tristezas e por sempre acreditarem em mim.
Ao meu namorado Rodrigo Gimenez por todo apoio, amor, paciência e incentivo e por
simplesmente entrar em minha vida e estar ao meu lado agora.
Agradecimentos
Em especial agradeço ao Professor Dr. Pietro Ciancaglini pela valiosa orientação,
oportunidade concedida, amizade e pelo exemplo de dedicação, competência e
responsabilidade. Gostaria de expressar todo o meu carinho e reconhecimento
por esse grande professor.
Ao Professor Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto pela co-orientação deste
trabalho e por permitir a utilização do espaço físico do seu laboratório.
À Professora Maria Elisabete D. Zaniquelli e a sua aluna Thatyane M. Nobre por
toda atenção, orientação e apoio que contribuíram grandemente para o
desenvolvimento e finalização deste trabalho. Obrigada por permitir a utilização
do espaço físico de seu laboratório e utilização dos seus equipamentos.
Ao Professor Dr. Rodrigo G. Stabeli pelas valiosas sugestões e auxílio para o
desenvolvimento do artigo científico e por todo auxílio e apoio oferecidos em
Porto Velho - RO.
À Professora Dra. Vânia Luíza Deperon Bonato, pela atenção e valiosas sugestões
nas técnicas imunológicas que enriqueceram este trabalho.
À amiga e técnica Denise Brufato Ferraz por todo o auxílio e apoio técnico em
meus experimentos que contribuíram grandemente para o desenvolvimento
deste trabalho. Obrigada pela amizade e pelo exemplo de profissionalismos e
competência.
Aos técnicos Nilton Rosa Alves e Ivana Aparecida Borin pelo apoio e exemplos de
competência, seriedade e profissionalismo.
Ao Professores Drs. Luis Ricardo O. Tosi, Joaquim Coutinho Netto, Lúcia Maria X.
Lopes e Fábio T. M. Costa pela participação na banca examinadora e pelas
valiosas sugestões a este trabalho.
Aos Docentes, Pós-Graduandos e Funcionários do Departamento de Bioquímica
da FMRP, pelo aprendizado, convivência e auxílios dispensados durante a
realização deste trabalho.
Aos funcionários do Biotério de Criação de Camundongos Isogênicos da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelo
fornecimento dos animais necessários para este trabalho.
Às amigas Izaltina, Vanessa, Andressa, Fabiana, Fernanda, Viviane e Mariana
pela convivência agradável e momentos de alegria e principalmente por todo
apoio necessário para a realização deste trabalho. Em especial a Iza por todo
apoio e auxílio oferecidos em Porto Velho - RO.
Aos amigos do laboratório Luiz Eduardo, Carolina, Ana Maria, Simone,
Rosângela, Maytê, Juliana, Tony e Fernanda pela amizade, companheirismo,
pelos momentos de alegria compartilhados e acima de tudo obrigada por todo
apoio e auxílio que me ofereceram durante todos esses anos de convivência. Em
especial a Juliana Sakamoto Yoneda pela convivência diária, pela amizade e
apoio.
Aos amigos da iniciação científica Imaculada, Bruno, Thais, Ricardo, Andréia pela
amizade, companheirismo e pelos auxílios no laboratório.
À CAPES e ao FAEPA pela bolsa e auxílios concedidos.
Agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma forma com a execução
deste trabalho.
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Resumo
Abstract
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o............................................................................................1
1.1 A leishmaniose tegumentar ................................................................2
1.2 Proteínas ancoradas por GPI da superfície celular do parasita..................5
1.3 Resposta imune do hospedeiro na leishmaniose................................... 10
1.4 O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose.............................. 13
1.5 Os lipossomos ................................................................................ 18
1.6 Monocamadas de Langmuir .............................................................. 20
2
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2.1 Objetivos Gerais ............................................................................. 23
3
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3.1 Animais ......................................................................................... 26
3.2 Obtenção e cultivo dos parasitas ....................................................... 26
3.3 Preparação do soro contendo os anticorpos contra os determinantes
imunogênicos de L. amazonensis ............................................................ 26
3.4 Solubilização de proteínas de membrana ancoradas por GPI de
promastigotas de L. amazonensis ........................................................... 27
3.5 Tratamento com fosfolipase C........................................................... 27
3.6 Eletroforese em condição desnaturante [SDS-PAGE (sodium dodecyl
sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)] .............................................. 28
3.7 Western Blotting ............................................................................. 28
3.8 Remoção do detergente Triton X-114................................................. 29
3.9 Preparação dos lipossomos e dos proteolipossomos contendo as proteínas
de membrana ancoradas por GPI de promastigotas de L. amazonensis ........ 29
3.10 Medidas de distribuição de tamanho de partícula por espalhamento de luz
dinâmico ............................................................................................. 30
3.11 Preparação do gradiente isopícnico de densidade de sacarose.............. 31
3.12 Dosagem de proteínas ................................................................... 32
3.13 Dosagem de fosfato inorgânico........................................................ 32
3.14 Dosagem de colesterol................................................................... 33
3.15 Imunização de camundongos com os proteolipossomos e avaliação da
proteção contra a infecção com L. amazonensis ........................................ 33
3.16 Monocamadas de Langmuir: isotermas
π
- A e cinética de adsorção...... 34
3.17 Obtenção, cultivo e estimulação de macrófagos peritoneais murinos..... 34
3.18 Infecção das culturas de macrófagos com L. amazonensis................... 35
3.19 Avaliação da viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos .............. 35
3.20 Análise da produção de nitrito ......................................................... 36
3.21 Análise estatística ......................................................................... 37
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4.1 Solubilização das proteínas ancoradas por GPI da membrana de L.
amazonensis utilizando o detergente Triton X-114..................................... 39
4.2 Preparação dos lipossomos e proteolipossomos e suas caracterizações. .. 43
4.3 Caracterização dos proteolipossomos preparados com DPPC:Colesterol... 54
4.4 Avaliação da incorporação de proteínas ancoradas por GPI de L.
amazonensis em monocamadas de Langmuir. .......................................... 56
4.5 Avaliação da proteção contra a infecção com L. amazonensis em
camundongos BALB/c: Primeira imunização com os proteolipossomos.......... 61
4.6 Avaliação da proteção contra a infecção com L. amazonensis em
camundongos BALB/c: Segunda imunização com os proteolipossomos. ........ 67
4.7 Avaliação dos efeitos dos diferentes tratamentos na infecção de
macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L. amazonensis.71
4.8 Análise da produção de óxido nítrico (NO). ......................................... 76
4.9 Análise da viabilidade de macrófagos peritoneais murinos estimulados com
lipossomos, EBS
GPI
e proteolipossomos. ................................................... 78
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Anexos
Índice de Figuras e Tabelas
Figura 1 - Estrutura de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI)
(modificado de www.sigmaaldrich.com, acessado em 01/10/2008).............. 06
Figura 2 - Proteínas da superfície da forma promastigota de Leishmania
(modificado de Bogdan & Rollinghoff, 1998)............................................. 08
Figura 3 - Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração
pela prata ........................................................................................... 41
Figura 4 - Análise por Western Blotting das proteínas da superfície de
promastigotas de L. amazonensis ........................................................... 42
Figura 5 - Efeito das diferentes razões molares dos lipossomos na
incorporação de proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de L.
amazonensis........................................................................................ 45
Figura 6 - Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração
pela prata ........................................................................................... 53
Figura 7 - Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose............... 55
Figura 8 - Curva pressão superficial x área molecular (π-A) para as diferentes
monocamadas ..................................................................................... 57
Figura 9 - Cinética da adsorção de proteínas ancoradas por GPI da superfície
de formas promastigotas de L. amazonensis, em monocamadas a 30mN/m.. 59
Figura 10 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados
por via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos ou com 5 µg de
proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de L. amazonensis .... 62
Figura 11 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados
por via i.p. com tampão ou com 10 µg de proteolipossomos e desafiados com
10
4
promastigotas de L. amazonensis...................................................... 64
Figura 12 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados
por via i.p. com tampão ou com 20 µg de proteolipossomos e desafiados com
10
4
promastigotas de L. amazonensis...................................................... 65
Figura 13 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados
por via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos, EBS
GPI
ou com
proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de L. amazonensis .... 68
Figura 14 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados
por via i.p. com tampão (controle), 200 µL de lipossomos, 5 µg de EBS
GPI
ou
com 40 µg de proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de L.
amazonensis........................................................................................ 70
Figura 15 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 72
Figura 16 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 74
Figura 17 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 75
Figura 18 - Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais
murinos estimulados com diferentes tratamentos...................................... 77
Figura 19 – Efeitos de diferentes tratamentos na viabilidade de macrófagos
peritoneais murinos .............................................................................. 79
Figura 20 - Efeitos das proteínas ancoradas por GPI na viabilidade de
macrófagos peritoneais murinos ............................................................. 80
Tabela I - Composição lipídica (razão em mol) e diâmetro médio (nm) dos
lipossomos e proteolipossomos preparados conforme descrito em Material e
Métodos.............................................................................................. 44
Tabela II - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na ausência
do colesterol........................................................................................ 47
Tabela III - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na presença
do colesterol........................................................................................ 48
Tabela IV - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias
hidrocarbônicas na ausência do colesterol ................................................ 50
Tabela V - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias
hidrocarbônicas na presença do colesterol................................................ 51
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A: área
APC: células apresentadoras de antígenos
AP-GPI: fostatase alcalina ancorada por GPI
BCG: bacilo de Calmette-Guérin
BSA: albumina de soro bovino
C3b: componente C3 do sistema complemento
C3bi: componente C3 do sistema complemento
CaCl
2
: cloreto de cálcio
DAB: 3,3’ diaminobenzidina
DCs: células dentríticas
DHFR-TS: dihidrofolato redutase-timidilato sintase
DLPC: dilauroilfosfatidilcolina
DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina
DNA: ácido desoxirribonucléico
DPPA: ácido dipalmitoilfosfatídico
DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
DPPG: dipalmitoilfosfatidilglicerol
DPPS: dipalmitoilfosfatidilserina
DSPC: distearoilfosfatidilcolina
DTH: hipersensibilidade do tipo tardia
EBS
GPI
: extrato bruto solubilizado enriquecido com as proteínas ancoradas por
GPI de formas promastigotas de L. amazonensis.
FML: ligante de fucose e manose
fPPG: forma filamentosa das proteofosfoglicanas
GIPL: glicoinositolfosfolipídeos livres de GPI
gp42: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 42 KDa
gp46/M2: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 46 KDa
gp63: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 63 KDa
GPI: Glicosilfosfatidilinositol
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
HCl: ácido clorídrico
HEPES: ácido hidroxietil piperazina etanosulfúrico
i.p.: intraperitoneal
IFN-γ: interferon-γ
IgG: imunoglobulina G
IL-12: interleucina-12
IL-1α: interleucina 1-α
IL-2: interleucina-2
IL-4: interleucina-4
iNOS: óxido nítrico sintase induzível
KO: knock-out
LACK: Leishmania homologue of receptors for activated C kinase
LC: líquido condensado
LE: líquido expandido
LPG: lipofosfoglicanas
LTA: Leishmaniose Tegumentar Americana
MTT: (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazolina)
MyD88: fator de diferenciação mielóide 88
NaCl: cloreto de sódio
NK: células natural Killer
NO: óxido nítrico
O
2
-
: superóxido
PBS: salina tamponada com fosfato
PIPLC: fosfolipase C específica para glicosilfosfatidilinositol
PO: proteína ribossomal ácida de Leishmania
PPG: proteofosfoglicanas
s.c.: subcutânea
Sch/SFB: Schneider contendo sulfato de gentamicina e soro fetal bovino
Sch: Schneider
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
SFB: soro fetal bovino
SPF: Specific Patogen Free
Th1: T helper 1
Th2: T helper 2
TNF-α: fator de necrose tumoral α
Tris: (hydroxymethyl-)aminomethane
Triton X-114: Octylphenoxypoly-ethoxyethanol
Tween 20: polyoxyethylenesorbitan monolaurate
π: pressão superficial
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Neste trabalho, nós investigamos a influência de diferentes lipídios:colesterol
(mol:mol) na incorporação de proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol
(GPI) de Leishmania amazonensis em lipossomos e monocamadas de Langmuir.
Em um segundo passo, nós avaliamos se proteolipossomos carregando proteínas
ancoradas por GPI de formas promastigotas do parasita podem induzir
imunidade protetora em camundongos BALB/c. Lipossomos foram formados em
todas as condições estudadas, mas a incorporação das proteínas ancoradas por
GPI ocorreu somente na presença do colesterol, alcançando um máximo de
adsorção da proteína (57±9 %) quando a razão molar 2,1:1 de
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC):Colesterol foi usada. O aumento da quantidade
de colesterol não aumenta a adsorção das proteínas ancoradas por GPI. Além
disso, na ausência do colesterol, a reconstituição é mais dificultada, sendo este
resultado confirmado por experimentos em monocamadas de Langmuir, onde a
inserção da proteína via GPI, leva a desestabilização da monocamada de DPPC.
Para avaliar a proteção, camundongos BALB/c foram injetados
intraperitonealmente com tampão, lipossomos, extrato bruto de proteínas
ancoradas por GPI solubilizadas com Triton X-114 (EBS
GPI
) ou proteolipossomos
e, após três semanas, foram desafiados na pata traseira direita com 10
4
formas
promastigotas de L. amazonensis. A proteção foi avaliada semanalmente até a
14ª semana através de medidas do tamanho das lesões causadas pelo parasita.
Camundongos BALB/c imunizados com 40 µg (proteínas totais) de
proteolipossomos mostraram uma proteção de 50 %, quando comparados aos
camundongos que receberam somente tampão. Entretanto, camundongos
imunizados com 5 µg (proteínas totais) de EBS
GPI
mostraram um máximo de
proteção de 60 % pós infecção. Assim, esses resultados indicam que tanto o
EBS
GPI
quanto os proteolipossomos podem ser usados para induzir imunidade
protetora em camundongos contra L. amazonensis. Além disso, macrófagos
peritoneais murinos estimulados com lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos
mostraram redução da porcentagem de células infectadas (42, 39 e 99%,
respectivamente) e do número de parasitas intracelulares por célula (29, 32 e
99%, respectivamente). A cinética de infecção indica que diferentes estímulos
não impediram a fagocitose de amastigotas de L. amazonensis, mas induziram
macrófagos a reduzirem o parasitismo intracelular.
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The reconstitution of membrane proteins into liposomes is a useful tool to
prepare antigenic components to induce immunity. In this work we investigated
the influence of different lipids:cholesterol molar ratios in the incorporation of a
glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins from Leishmania
amazonensis in liposomes and Langmuir monolayers. In a second step, we
evaluated if proteoliposomes carrying GPI-anchored proteins of parasite
promastigotes could induce infection protective immunity in BALB/c mice. The
liposomes were formed in all conditions studied, but the incorporation of the GPI-
proteins occurs only in the presence of cholesterol, reaching a maximum of
protein adsorption (57±9 %) when a 2,1:1 ratio of dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC):cholesterol was used. The increase of cholesterol quantities does not
increase GPI-protein adsorption. Moreover, in the absence of cholesterol,
reconstitution is more difficult and it was correlated to the disruption of the DPPC
layer. To assay protective immunity, BALB/c mice were injected intraperitoneally
with buffer, liposomes, Triton X-114 solubilized GPI-protein extract (EBS
GPI
) or
proteoliposomes and, three weeks later, challenged in the footpad with 10
4
L.
amazonensis promastigotes. Protective immunity was evaluated weekly for up to
14 weeks by measuring the size of lesions caused by the parasite. BALB/c mice
immunized with 40 µg (total protein) of proteoliposomes showed a protection of
50 %, as compared to mice that received only the buffering solution. However,
mice immunized with 5 µg (total protein) of GPI-solubilized protein extract
(EBS
GPI
) displayed a maximum protection of 60 % post-infection. Thus, these
results indicate that either EBS
GPI
or proteoliposomes may be used to induce
protective immunity against L. amazonensis in mice. Furthermore, murine
peritoneal macrophages stimulated with liposomes, EBS
GPI
or proteoliposomes
showed a reduction of the percentage of infected cells (42, 39 and 99%,
respectively) and of the number of intracellular parasites per cell (29, 32 and
99%, respectively). The kinetic of infection indicated that different stimulus did
not depress L. amazonensis phagocytosis but induced macrophages to reduce
intracellular parasitism.
1
1
.
.
I
I
n
n
t
t
r
r
o
o
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d
u
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ç
ç
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o
o
1.1 A leishmaniose tegumentar
Entre todas as doenças emergentes, aquelas causadas por protozoários
são de grande importância por apresentarem um elevado nível de morbidade e
mortalidade, como é o caso da leishmaniose (Santos et al., 2008). Esta doença
afeta aproximadamente 12 milhões de pessoas e está presente em 88 países,
principalmente em áreas tropicais e subtropicais. A incidência anual é de
aproximadamente 2 milhões de novos casos e cerca de 350 milhões de pessoas
vivem em áreas endêmicas revelando assim a importância dessa doença
negligenciada (http://www.who.int/).
A leishmaniose é causada por parasitas do gênero Leishmania, um grupo
de protozoários kinetoplastida, que podem causar um amplo espectro de
manifestações clínicas. Na pele, essas manifestações variam de úlceras cutâneas
localizadas (leishmaniose cutânea) e mucocutânea (leishmaniose mucocutânea)
a leishmaniose cutânea difusa e visceral que pode muitas vezes ser fatal
(Teixeira, 2006). A variedade de manifestações clínicas presentes na
leishmaniose cutânea está diretamente relacionada ao estado imunológico do
paciente e a espécie de Leishmania envolvida. As diferentes formas de
leishmaniose cutânea constituem um importante problema de saúde pública
principalmente pela dificuldade de sua prevenção (MS/FUNASA, 2000).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença que
acompanha o homem desde a antiguidade, existindo relatos e descrições
encontrados na literatura desde o séc. I d.C (Laison, 1997; Camargo & Barcinski,
2003). O primeiro a observar o parasita do gênero Leishmania foi Cunningham
em 1885, na Índia, em casos de leishmaniose visceral. No Brasil, Cerqueira, em
1855, observou a existência da moléstia da pele, identificando-a clinicamente
como botão de Biskra. Em 1895, na Itália, Breda, descreveu a moléstia em
italianos provenientes de São Paulo (Pessoa, 1982).
Entretanto, no Brasil, a natureza leishmaniótica das lesões cutâneas e
nasofaríngeas só foi confirmada, pela primeira vez, em 1909, por Lindenberg,
que encontrou formas de Leishmania, idênticas a Leishmania tropica (Wright,
1903) da leishmaniose do Velho Mundo, em lesões cutâneas de indivíduos que
trabalhavam nas matas do interior do Estado de São Paulo (Pessoa, 1982).
A leishmaniose tegumentar tem aumentando nos últimos 20 anos em
quase todos os estados brasileiros, e surtos epidêmicos tem ocorrido no Sudeste,
Centro-Oeste, Nordeste, e mais recentemente, região Amazônica, devido ao
processo predatório de colonização (Delorenzi et al., 2001; Gontijo & Melo,
2004).
Há aproximadamente 21 espécies de Leishmania, transmitidas por cerca
de 30 espécies de flebotomíneos (Cunningham, 2002). Nos hospedeiros
mamíferos, representados na natureza por várias ordens e espécies, a
Leishmania assume a forma amastigota, arredondada e imóvel, que se multiplica
obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário. À medida
que as formas amastigotas vão se multiplicando, os macrófagos se rompem
liberando parasitas que serão fagocitados por outros macrófagos (Gontijo &
Carvalho, 2003).
Todas as espécies do gênero são transmitidas pela picada de fêmeas
infectadas de dípteros da subfamília Phlebotominae, pertencentes aos gêneros
Lutzomyia – no Novo Mundo, e Phlebotomus – no Velho Mundo. Esses vetores
sugam junto com o sangue as formas amastigotas de um animal infectado, que
se alojam em partes de seu intestino levando-as a se transformar em
promastigotas, morfológicas e bioquimicamente distintas das amastigotas
(Marzochi, 1992; Gontijo & Carvalho, 2003). Esta forma é alongada e apresenta
um longo flagelo livre. No sistema digestivo de seus vetores, as formas
promastigotas multiplicam-se por aparente divisão simples e assexuada e
migram para a probóscíde do inseto após aproximadamente 4 a 5 dias. A esta
altura, bloqueiam o proventrículo, de onde podem ser inoculadas na pele do
hospedeiro vertebrado, junto com a saliva (Marzochi, 1992).
Leishmania tem desenvolvido uma variedade de mecanismos adaptativos
não somente para viver dentro do vetor, mas também para escapar da resposta
imune do hospedeiro vertebrado, inclusive dentro do macrófago (Cunningham,
2002). Vários receptores da superfície celular dos macrófagos, moléculas da
superfície do parasita e fatores derivados do soro são responsáveis pelas
interações das formas promastigotas com a célula hospedeira garantindo assim a
sobrevivência, multiplicação, patogênese ou mesmo a morte do parasita no
hospedeiro (Mosser & Rosenthal, 1993; Garg et al., 2005).
O controle da leishmaniose, tanto em saúde pública como individualmente,
é pouco eficiente, não existindo medidas simples e eficazes de proteção e
consiste principalmente em tratamentos quimioterápicos, e infelizmente, ainda
não há uma vacina efetiva contra este parasita (Silva & Camargo-Neves, 2004).
Atualmente, o tratamento da leishmaniose primeiramente conta com
quimioterapias, com algumas tentativas no uso de imunoterapias (Ghosh et al.,
2003; Santos et al., 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). A primeira linha de
tratamento é predominantemente baseada em antimoniais pentavalentes, um
tratamento clássico na maioria das áreas endêmicas. Contudo, a sua utilidade
tem sido comprometida pela emergência de resistência. A segunda linha de
tratamento inclui drogas tais como anfotericina B e pentamidina, que são
caracterizadas pela alta eficiência, mas são relativamente caras e apresenta
vários efeitos colaterais (Berman, 2003; Davis e Kedzierski, 2005).
Novas drogas, tais como formulações lipídicas de anfotericina B, têm sido
efetivas no tratamento da leishmaniose visceral, mas o custo dessa droga é
certamente inviável para a maioria dos pacientes (Berman et al., 1998; Murray,
2004). Recentemente, miltefosine tem mostrado ser um tratamento oral efetivo
para leishmaniose visceral na Índia (Sundar et al., 2002), e para leishmaniose
cutânea na América do Sul (Soto et al., 2001).
Com a restrita oferta de poucas drogas utilizadas para o tratamento de
infecções por Leishmania ssp. é necessário a busca de novas drogas para o
controle desta doença.
1.2 Proteínas ancoradas por GPI da superfície celular do parasita
Considerando a estratégia de invasão da Leishmania, proteínas presentes
na superfície celular desses parasitas são de extrema importância, sendo
responsáveis pela interação com a célula do hospedeiro garantindo a
manutenção da sobrevivência, multiplicação e patogênese do parasita no
hospedeiro (Garg et al., 2005).
A superfície celular de todos os tripanossomatídeos é dominada por
proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI), formando uma cobertura
que protege a superfície do parasita e medeiam essenciais interações parasita-
hospedeiro. No parasita Leishmania essas proteínas formam uma efetiva barreira
de difusão macromolecular que protege as formas promastigotas de processos
microbicidas tais como lise mediada pelo sistema complemento, radicais oxigênio
e hidrolases dos hospedeiros vertebrados e invertebrados (Descoteaux &Turco,
1999; Ilgoutz & McConville, 2001).
Protozoários tendem a expressar significativamente maiores densidades de
proteínas ancoradas por GPI na superfície celular do que eucariotos superiores
(Macedo et al., 2003). Acredita-se que essas proteínas ancoradas por GPI
formem clusters em microdomínios da membrana celular geralmente chamado
lipids rafts, em associação com glicoesfingolipidios, esfingomielina, colesterol e
outras proteínas sinalizadoras.
Como mostra a Figura 1, a âncora dessas proteínas é covalentemente
ligada à porção C terminal das proteínas e consiste de uma cadeia central
conservada de glicana ligada ao fosfatidilinositol com duas cadeias acil ancoradas
na bicamada da membrana (Simons & Ikonen, 1997; Macedo et al., 2003).
Figura 1. Estrutura de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (modificado de
www.sigmaaldrich.com, acessado em 01/10/2008).
Possíveis modificações para
Man
3-
GlcN:
R
1
: Man α-(1-2)
R
2
: Fosfoetanolamina
R
3
: Fosfoetanolamina
R
4
: Gal
4
R
5
: GalNac β-(1-4)
R
6
: Ácido Graxo em C
2
ou C
3
do
inositol
As formas promastigotas de Leishmania são cobertas por um grande
número de glicoproteínas ancoradas por GPI, como por exemplo, gp63, gp42,
gp46/M2 e proteofosfoglicanas (PPG), e ainda um complexo lipofosfoglicano
(LPG) que possui uma âncora estruturalmente distinta da GPI (McConville &
Ferguson, 1993) e uma abundante família de GPIs livre (aproximadamente 10
vezes mais abundante do que proteínas ancoradas por GPI e LPG), denominada
glicoinositolfosfolipideos (GIPL) (McConville et al., 2002).
Ao contrário, as formas amastigotas de Leishmania, que proliferam dentro
do fagolisossomo do macrófago do hospedeiro, são recobertas por um mínimo
glicocálix que é quase exclusivamente composto por GIPLs e glicolipídeos
derivado da célula do hospedeiro, e a expressão das proteínas ancoradas por GPI
e LPG é dramaticamente baixo-regulada neste estágio (McConville & Blackwell,
1991; Winter et al., 1994).
A glicoproteína ancorada por GPI mais predominante da superfície de
Leishmania é a zinco-metaloprotease chamada gp63 com peso molecular de 63
KDa (Bordier, 1987; Button & McMaster, 1988). Essa proteína é expressa na
superfície de promastigotas de diferentes espécies de Leishmania e nas formas
promastigotas e amastigotas de L. major e L. mexicana (Frommel, 1990). Cada
promastigota é coberta com aproximadamente 5x10
5
cópias de gp63 o que
corresponde a aproximadamente 1% das proteínas totais (Ilgoutz & McConville,
2001). Essa glicoproteína apresenta um importante papel na leishmaniose por
agir com aceptor para o componente C3 do complemento (C3b e C3bi) mediando
a ligação da forma promastigota ao macrófago (Brittingham et al., 1995; Russell
et al., 1989). Outros estudos também mostraram que gp63 é o ligante para
múltiplos receptores de macrófagos, incluindo Mac-1 (CD11b/CD18) e receptor
celular para fibronectina (Figura 2) (Brittingham et al., 1999).
Figura 2. Proteínas da superfície da forma promastigota de Leishmania (modificado de
Bogdan & Rollinghoff, 1998).
Ainda, gp63 pode ter um importante papel na proteção contra degradação
dentro do fagolisossomo do macrófago (Chaudhuri et al., 1989). Essa proteína
exibiu atividade ótima sob o ambiente ácido do fagolisossomo, e têm mostrado
degradar as enzimas lisossomais presentes neste ambiente (Cunningham, 2002).
Devido a sua abundância e sua habilidade em mediar resistência contra
promastigotas infectantes, gp63 tem sido sugerida como uma possível candidata
para vacinação contra infecções por Leishmania (Bhowmick et al., 2008; Jaafari
et al., 2006, 2007).
Macrófago
Macrófago
Outras proteínas ancoradas também mostraram ter um importante papel
na resposta imune como, por exemplo, as PPGs que constituem uma classe
distinta de moléculas e que são sintetizadas por ambas formas promastigotas e
amastigotas do parasita. Essas proteofosfoglicanas podem estar ancoradas por
GPI na superfície celular ou serem secretadas (forma filamentosa fPPG) (Ilgoutz
& McConville, 2001) e apresentam importante papel na virulência do parasita
tanto no hospedeiro vertebrado quanto no hospedeiro invertebrado (Ilg et al.,
1999).
As proteínas antigênicas gp42 e gp46/M2 também parecem estar
envolvidas na resposta imunológica do hospedeiro vertebrado. A gp42 mostrou
induzir alta resposta proliferativa, assim como produção de interleucina-2 (IL-2)
e interferon-γ (IFN-γ) por linfócitos humanos de pacientes com leishmaniose
(Burns et al., 1991). Também, protocolos de vacinação com gp46/M2 em
associação com outras proteínas da superfície do parasita, resultou em uma
significativa inibição do desenvolvimento de lesões em camundongos suscetíveis
BALB/c desafiados com L. major (Tonui et al., 2004).
Ainda, outra proteína da superfície do parasita e que apresenta importante
papel na interação parasita-hospedeiro é a LPG. Essa proteína, uma das mais
abundante na superfície de promastigotas de Leishmania, forma um denso
glicocálix ao redor do parasita. Ela possui uma âncora estruturalmente distinta
das GPIs, constituída por unidades repetidas de Galβ1,4Manα-PO
4
ligada a
membrana de promastigotas via uma ancora lipídica específica; 1-Ο-alquil-2-liso-
fosfatidil(mio)inositol com uma cadeia não usual longa de ácido graxo saturado
de 24-26 carbonos (Turco & Descoteaux, 1992). A LPG, assim como outros
glicoconjugados, têm um importante papel na interação Leishmania-
complemento e ainda, se ligam e interagem com outras proteínas do soro para
promover a entrada na célula hospedeira. A LPG pode contribuir para a
habilidade da Leishmania em resistir ou escapar dos efeitos antimicrobicidas dos
macrófagos (Descoteaux & Turco, 2002). Dentro dos macrófagos, as LPGs
apresentam vários efeitos como, por exemplo, inibição da maturação do
fagossomo, inibição da proteína C kinase e modulação da produção de óxido
nítrico (NO) (Winberg et al., 2009; Descoteaux & Turco, 2002).
O papel biológico específico dessas moléculas ancoradas por GPI da
superfície do parasita tem sido o tema de muitas pesquisas. Assim, o principal
foco no desenvolvimento de vacinas é a elucidação de uma variedade e
especificidade de uma resposta imune anti-Leishmania, e a identificação de
antígenos definidos provenientes deste parasita. Conhecer tais antígenos é
necessário para o desenvolvimento de imunoproteção como vacinas. Em adição,
os antígenos podem ser ferramentas úteis para avaliações imunes da infecção,
doença e resistência, e ainda serem usados para o desenvolvimento de novos
diagnósticos (Forgber, 2006).
1.3 Resposta imune do hospedeiro na leishmaniose
Imunidade protetora contra leishmaniose é principalmente mediada por
células T. A expansão de clones T helper do tipo 1 (Th1) parece proteger durante
a infecção, enquanto a expansão de células T helper do tipo 2 (Th2) exacerba a
doença (Cunningham, 2002). O tipo da resposta imune do hospedeiro é um dos
principais fatores controladores da doença. O modelo animal de infecção é
amplamente utilizado para definir mecanismos imunológicos que contribuem pra
o controle desse patógeno intracelular. Ainda, foi mostrado que células do
sistema imune (macrófagos, células dentríticas (DCs), células natural killer (NK),
células CD4
+
e CD8
+
), citocinas (IFN-γ e IL-12), e moléculas efetoras (NO
produzido pela indução da enzima óxido nítrico sintase (iNOS)) são os
componentes chaves da reposta imune contra o parasita Leishmania (Bogdan et
al., 1993; Solbach & Laskay, 2000; Liese et al., 2008).
Em anos recentes, o envolvimento de células T CD8+ tem mostrado um
importante papel na imunidade contra leishmaniose cutânea (Belkaid et al.,
2002; Rodrigues et al., 2003). Semelhantemente, imunidade inata incluindo
células NK, IL-1α e o fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) agem como
imunomoduladores determinando resistência inicial a infecção (Handman, 2001).
Macrófagos e DCs são as principais fontes de IL-12 imediatamente após
infecção com Leishmania (Gorak et al., 1998). A produção de IL-12 por essas
células induz as produção de IFN-γ por células NK e células T. IFN-γ em
associação ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) produzido pelo próprio
macrófago infectado induzem a ativação do macrófago para produzir moléculas
que serão tóxicas ao parasita (Kane & Mosser, 2000). Os dois mediadores mais
bem descritos e envolvidos na morte do parasita por macrófagos ativados com
IFN-γ e TNF-α são os radicais do oxigênio como o superóxido (O
2
-
) e o peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) e os intermediários reativos de nitrogênio como o NO e o
peroxinitrito que são formados durante o burst respiratório (Kane & Mosser,
2000; Linares et al., 2001).
O papel das citocinas na resistência e suscetibilidade durante infecções
experimentais de camundongos com as diferentes espécies do gênero
Leishmania, como por exemplo, L. major ainda não está claro. Esse parasita
parece induzir a produção de IL-4 por camundongos BALB/c levando a
suscetibilidade enquanto a produção de IL-12, dependente da produção de IFN-γ
por muitas linhagens de camundongos, leva a ativação de macrófagos e controle
do crescimento do parasita (Sacks & Noben-Trauth, 2002).
Contudo, há evidências de que a resposta imune do hospedeiro a infecções
por L. amazonensis, que é a espécie utilizada em nosso trabalho, é diferente da
resposta causada por L. major. Camundongos C3H, C57BL/6 e C57BL/10, que
são resistentes a L. major, desenvolvem lesões crônicas com parasitismo
persistente quando infectadas com L. amazonensis (Afonso & Scott, 1993; Jones
et al., 2000; Jones et al., 2002; Soong et al., 1996). A manutenção da lesão
crônica é independente da expressão de IL-4 e de uma correspondente resposta
Th2 (Afonso & Scott, 1993; Jones et al., 2000; Soong et al., 1996). L.
amazonensis causa produção inicial de IL-12 e IFN-γ em camundongos C57BL/6
similarmente a L. major (Oliveira et al., 2000), mas infecções de camundongos
C3H resultam em produção de baixos níveis de IL-12 e IFN-γ por células TCD4
+
antígenos-específicas (Jones et al., 2000). De fato, infecções crônicas por L.
amazonensis em camundongos C3H e C57BL/6 persistem após administração de
IL-12 (Jones et al., 2000) e IFN-γ exógenos (Barral-Netto et al., 1996).
A incapacidade da IL-12 de dirigir uma resposta imune celular efetiva
mediada por células durante infecção com L. amazonensis sugere que o parasita
pode provocar um potente mecanismo imunomodulatório para evitar a morte
generalizada estimulando assim infecções crônicas. Contudo, o desenvolvimento
de lesões e a carga parasitária mostram ser exacerbados por células TCD4
+
(Soong et al., 1997; Terabe et al., 2000), demonstrando que células T são
ativadas durante infecções com L. amazonensis e que elas podem contribuir
significativamente para imunopatologia da doença (Soong et al., 1997).
DCs são células apresentadoras de antígenos (APC) altamente
especializadas, que recebem sinais da imunidade inata e converte-os em uma
resposta celular T adequada (Steinman, 2003). DCs são essenciais para uma
resposta imune contra patogénos, que em termos, tem desenvolvido
mecanismos para evitar a iniciação de uma resposta imune, por exemplo, por
interferir com a biologia e função de DCs (Favali et al., 2007). Ainda, DCs de
regiões periféricas estão em um estado imaturo e tem máxima capacidade de
fagocitar antígenos. Uma vez ativadas, essas células produzem IL-12, que
promove diferenciação de Th1, caracterizada pela produção de IFN-γ. Esta
citocina é crítica para matar macrófagos infectados com Leishmania (Favali et al.,
2007). Entretanto, recentemente estudos sugerem que L. amazonensis podem
infectar e possivelmente alterar a biologia das DCs, favorecendo o
estabelecimento da infecção (Qi et al., 2001).
Células NK são classicamente definidas como CD3
-
e CD16/56
-
e
participam da imunidade inata, por apresentar atividade citotóxica e produção
inicial de citocinas antes da imunidade adaptativa ser estabelecida (Tosi, 2005).
Durante infecções com Leishmania, células NK direcionam a resposta imune de
células T em direção ao tipo Th1 pela liberação de IFN-γ em poucas horas após a
infecção (Scharton & Scott, 1993). Modelos murinos de infecção mostram
deficiência de NK como um fator de suscetibilidade conduzindo a uma
significativa maior replicação e distribuição de parasitas comparáveis a
vulnerabilidade de camundongos após depleção de IFN-γ (Belosevic et al., 1989;
Laskay et al., 1995). Ainda, Lieke et al. (2008) identificaram gp63 como uma
importante molécula inibitória que age através da ligação direta com um subtipo
de células NK.
1.4 O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose
A resistência às drogas (antimoniais pentavalentes, como o glucantime)
utilizadas tradicionalmente na terapia contra as leishmanioses, aliada aos efeitos
colaterais destes compostos fazem com que alternativas ao tratamento sejam
estudadas (Herwaldt, 1999). Devido à facilidade na utilização dos modelos in
vivo e in vitro de infecção com Leishmania, a eficiência de vários compostos e
protocolos de vacinação estão sendo testados (Handman et al., 2000).
Vacinação contra leishmaniose cutânea humana tem sido praticada por
séculos. A primeira vacina contra leishmaniose foi desenvolvida por Adler da
Universidade Hebrew de Jerusalém. Ele observou que mães libanesas expunham
os braços de seus filhos a picadas pelo inseto vetor porque elas intuitivamente
sabiam que o desenvolvimento de uma primeira e única lesão que se auto curava
poderia proteger seus filhos de uma forma mais severa da doença no futuro. Por
essa razão, práticas antigas inoculavam em indivíduos não infectados o material
infeccioso de lesões, em regiões do corpo onde a cicatriz pudesse ser escondida
(Palatnik-de-Souza, 2008). Essa prática era chamada de leishmanização e o uso
de material de lesões humanas ou de outros animais foi substituído pelo uso de
promastigotas de L. major obtidas de culturas (Greenblatt, 1980; Senekji &
Beattie, 1941). A leishmanização foi usada em Israel na década de 70 e no Irã
nos anos 80 (Nadim et al., 1983), como uma vacina profilática. Essa prática
também foi adotada pelo Governo iraniano em um programa que abrangeu cerca
de 2 milhões de pessoas, durante a guerra entre o Irã e o Iraque, um conflito
que foi de 1980 a 1988. A variabilidade no tamanho e na duração das lesões
resultantes da inoculação de cepas virulentas fez com que a técnica fosse
abandonada no Irã, após a guerra. Assim, vacinas de primeira geração
compostas de parasitas mortos foram gradualmente substituindo a
leishmanização (Modabber, 1995).
Em geral, as vacinas em desenvolvimento contra a leishmaniose, assim
como contra outras doenças infecciosas, podem ser divididas em três categorias:
(i) Vacinas vivas, incluindo também as construções geneticamente modificadas;
(ii) Vacinas de primeira geração, que são aquelas produzidas com frações do
agente patogênico ou ainda com o patógeno inteiro e morto, com ou sem
adjuvante e (iii) Vacinas de segunda e terceira geração, produzidas com
proteínas recombinantes ou DNA (ácido desoxirribonucléico) e vetores
microbianos (vírus e bactérias) expressando antígenos do parasita.
Vacinação usando preparações contendo antígenos obtidos de formas
promastigotas de várias espécies de Leishmania, tanto com ou sem o adjuvante
BCG (bacilo de Calmette-Guérin), foram testados contra leishmaniose cutânea e
visceral em triagens clínicas humanas em ambos Velho e Novo Mundo. Em geral,
não há evidencias que duas injeções de L. major autoclavadas resultaram em
significativa proteção comparada com BCG sozinho (Khalil et al., 2000). Triagens
de vacinação que demonstram que tanto o cocktail composto de cinco linhagens
de Leishmanias mortas ou uma única linhagem de L. amazonensis induz
significativa proteção da doença causada por infecções naturais (De luca et al.,
1999), têm conduzido o registro no Brasil de uma vacina para leishmaniose.
Esses estudos também indicam que a hipersensibilidade do tipo tardia (DTH)
pode ser usada como um marcador substituto para imunidade protetora. Embora
esses métodos de vacinas utilizando extratos brutos do parasita não sejam
ideais, eles confirmam alguns dados em animais indicando que a indução de
proteção contra leishmaniose é possível e pode ser conseguida com uma vacina
viável ou com componentes do parasita (Coler & Reed, 2005).
No Brasil, o uso de parasitas mortos na tentativa de se induzir uma
proteção contra a leishmaniose teve início na década de 40. A partir de 1970,
Wilson Mayrink e seus colaboradores na Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG), desenvolveram uma vacina morta composta de quatro espécies
diferentes de Leishmania (Genaro et al., 1996). Essa vacina acabou sendo
simplificada pelo uso de uma única espécie e está sendo usada aqui no Brasil
como um adjuvante durante o tratamento contra a leishmaniose (Machado-Pinto
et al., 2002) após ter sido aprovada pelo Ministério da Saúde. Além disso, essa
vacina também foi testada na Colômbia (Vélez et al., 2000; Vélez et al., 2005) e
no Equador (Armijos et al., 2004).
As vacinas de primeira geração, produzidas com frações do parasita,
também já foram empregadas. Uma vacina de subunidade contra a leishmaniose
visceral canina, conhecida como Leishmune
®
está sendo produzida e
comercializada no Brasil, desde que foi autorizada pelo Ministério da Agricultura
em junho de 2003. Essa vacina, constituída pelo ligante de fucose e manose
(FML) da L. donovani com saponina, induz cerca de 92 a 97% de proteção contra
a leishmaniose visceral zoonótica (Saraiva et al., 2006). A Leishmune
®
, apesar
de eficaz, traz riscos para a população, pois tanto o cão que recebeu a vacina
como o que foi infectado naturalmente, se tornam soropositivos, dificultando a
distinção entre o animal vacinado e o infectado assintomático.
Outra abordagem na busca de uma vacina contra a leishmaniose baseia-se
na manipulação gênica e criação de parasitas geneticamente modificados. Nessa
estratégia, aqueles genes que são essenciais para a sobrevivência da Leishmania
no seu hospedeiro são bloqueados, removidos ou mesmo substituídos por outros
genes. A primeira construção que gerou um mutante deficiente para um gene
deu origem a uma cepa de L. major knock-out (KO) para a enzima dihidrofolato
redutase-timidilato sintase (DHFR-TS) (Cruz et al., 1991). Os camundongos
inoculados com esses mutantes apresentaram uma proteção significativa, mas
temporária, após o desafio com os parasitas virulentos (Veras et al., 1999; Titus
et al., 1995).
Na construção das vacinas de segunda geração, muitos antígenos de
Leishmania já foram utilizados. A região codificadora para a parte protéica da
glicoproteína da superfície da Leishmania, a gp63, foi a primeira vacina de
plasmídeo produzida contra a leishmaniose (Xu & Liew, 1994). Ainda, outro
antígeno utilizado é o LACK (Leishmania homologue of receptors for activated C
kinase), contudo, resultados conflitantes foram observados. Enquanto cães
vacinados com vetores do vírus da vaccinia expressando esse antígeno
apresentaram 60% de proteção contra a leishmaniose visceral causada pela L.
infantum (Ramiro et al., 2003), camundongos BALB/c vacinados com DNA do
LACK não foram protegidos contra a infecção pela L. chagasi (Marques-da-Silva
et al., 2005).
Outras proteínas tais como a dp72 e PO (proteína ribossomal ácida) da
superfície de promastigotas de L. donovani e L. infantum; cisteínas proteases da
membrana de formas amastigotas de Leishmania; proteínas P4 e P8 de
amastigotas; vacinas com antígenos únicos ou com vários componentes e ainda
componentes da saliva do inseto vetor também estão sendo estudados como
possíveis alvos para o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose
(Kedzierski & Handman, 2006).
Recentemente, o uso de substâncias com estruturas moleculares bem
definidas em vacinas de segunda e terceira geração contra leishmaniose estão
emergindo (Coler & Reed, 2005). Embora o desenvolvimento de vacinas de
primeira geração seja mais barato e não necessita equipamentos sofisticados e
avanços tecnológicos, o desenvolvimento de uma vacina de antígenos bem
definidos tem vantagens na reprodutibilidade sobre vacinas com o extrato bruto
de Leishmania. Muitos dos antígenos de Leishmania que estão sendo testados
em modelos animais mostraram proteger quando usados com um adjuvante
apropriado (Afonso et al., 1994; Aebischer et al., 2000; Campos-Neto et al.,
2001).
Assim, vacinas preventivas são reconhecidas como a melhor e com maior
medida de proteção contra patógenos, e Leishmania não é uma exceção.
Contudo, o desenvolvimento de vacinas para leishmaniose tem demonstrado ser
uma tarefa difícil e desafiadora, que pode ser provavelmente devido a
conhecimentos insuficientes da patogênese do parasita e a complexidade da
resposta imune necessária para proteção. Vários novos antígenos estão sendo
avaliados e com a conclusão do genoma de L. major e L. infantum serão, sem
dúvida, descobertos mais candidatos promissores (Kedzierski et al., 2006).
1.5 Os lipossomos
Há uma urgente necessidade de se obter um adjuvante eficaz e seguro que
possa promover uma apropriada resposta imunológica às vacinas em programas
de imunização humana. Isto é especialmente verdade para a maioria dos
peptídios sintéticos e vacinas contendo subunidades antigênicas que, em adição,
tornam-se caros ou somente avaliáveis em pequenas quantidades, e podem ser
fracos ou não imunogênicos. Entretanto, adjuvantes imunológicos até agora
avaliados como, por exemplo, adjuvantes incompletos ou completos como o
Freund's, endotoxinas bacterianas, poliânions, adsorventes minerais, induzem
toxicidade local ou sistêmica, formam granulomas, tem pouca eficiência ou tem
efeitos por tempo limitado. Outro possível perigo com alguns adjuvantes é a
apresentação de reações alérgicas às vacinas em alguns casos, principalmente
aqueles que já haviam sido sensibilizados pelo antígeno (Gregoriadis et al., 1993;
Powell & Newman, 1995).
Os lipossomos são tipicamente constituídos de moléculas lipídicas naturais,
biodegradáveis, não tóxicas e não imunogênicas e podem encapsular ou se
ligarem a uma variedade de moléculas que podem ser encontradas associadas à
membrana lipídica ou dentro do lipossomo. Ainda, os lipossomos são fagocitados
por macrófagos e podem, portanto servir como um excelente veículo de liberação
de drogas nestas células (Lasic, 1998).
A propriedade adjuvante imunológica dos lipossomos foi estabelecida
primeira quando uma forte resposta imune humoral a difeteria tóxica
(encapsulada em lipossomos) foi obtida depois de injetadas em camundongos.
Diferentes de outros adjuvantes, não há granulomas no local da injeção (Manesis
et al., 1978; Gregoriadis et al., 1999) e nenhuma reação de hipersensibilidade foi
observada em animais pré-imunizados com antígenos dentro de lipossomos
(Gregoriadis & Allison, 1974). Além disso, lipossomos compostos de fosfolipídios
apropriados (como por exemplo, fosfatidilcolina do ovo) não desenvolve
anticorpos contra seu componente lipídico (Alving, 1991) e não apresenta
nenhum efeito colateral em pacientes injetados repetidamente (Gregoriadis,
1995; Gregoriadis et al., 1999).
Antígenos sozinhos são geralmente fracos imunógenos e requerem um
adjuvante para induzir imunidade protetora. Novamente, uma proteína precisa
não somente ser protegida da degradação extracelular, mas necessita ser
apresentada para as células relevantes do sistema imune. Lipossomos são úteis
como adjuvantes imunológicos para vários antígenos de Leishmania (Kahl et al.,
1989; Sharma et al., 2006; Jaafari et al., 2006). Eles podem induzir respostas
das células T CD4
+
e dos linfócitos T citotóxicos (Chikh & Schutze-Redelmeier,
2002). O potencial do adjuvante em relação ao antígeno associado é devido em
parte a eficiência em apresentar o antígeno para as APCs, incluindo macrófagos e
DCs (Nakanishi et al., 1997; Foged et al., 2004). A qualidade da resposta imune
gerada, contudo, depende da ação combinada do antígeno e da natureza física do
lipossomo, incluindo tamanho, composição lipídica e carga na superfície
(Felnerova et al., 2004).
Muitos protocolos de vacinação contra a leishmaniose experimental
utilizando lipossomos como adjuvantes podem ser encontrados na literatura e
muitos deles apresentam resultados promissores. Assim, a obtenção de proteínas
antigênicas ancoradas por GPI da superfície celular de formas promastigotas de
L. amazonensis, associadas à lipossomos, pode indicar uma possível aplicação
desses sistemas miméticos de membranas na preparação de uma vacina contra o
parasita Leishmania.
1.6 Monocamadas de Langmuir
Embora muitas investigações sobre as interações de proteínas com lipídios
usando a técnica de Langmuir sejam relatadas (Gericke et al., 1997; Rosengarth
et al., 1998; Ruano et al., 1998; Wang et al., 1998; Johnson et al., 1998;
Estrela-Lopis et al., 2001), há muito poucos resultados a respeito da natureza
das interações envolvendo proteínas ancoradas por GPI com lipídios (Kloboucek
et al., 1999).
Bicamadas lipídicas, vesículas e monocamadas de Langmuir são os
sistemas biomiméticos mais comumente usados, e cada um têm vantagem
particular dependendo do aspecto da aplicação de interesse (Brockman, 1999;
Maget-Dana, 1999; Ronzon et al., 2002; Brown & Brockman, 2007). Como já
visto, a reconstituição de proteínas de membrana em lipossomos mostrou ser
uma técnica útil para preparar componentes antigênicos para induzir imunidade
em modelos experimentais. Contudo, para compreender a organização de
membranas biológicas e a interação entre proteínas e lipídios, membranas
artificiais são os modelos mais bem usados.
Monocamadas de Langmuir são formadas pelo espalhamento de moléculas
anfifílicas insolúveis, como lipídios, em uma interface ar/água, produzindo filmes
monomoleculares que podem ser comprimidos por meio de barreiras móveis na
interface (Langmuir, 1917; Langmuir, 1937). Elas constituem a metade de uma
bicamada e assim podem também ser usadas como modelos de biomembranas
(Brockman, 1999). Uma importante característica desse sistema é a
possibilidade de estudar densidades superficiais e o empacotamento da superfície
em curvas de pressão (
π) - área (A).
Várias substâncias têm influência no empacotamento dos fosfolipídios e na
fluidez da monocamada, como por exemplo, o colesterol. Por isso, a adição de
substâncias capazes de interagir simultaneamente como o fosfolipídio e a
proteína altera a curva
π − Α e consequentemente a fluidez da monocamada. Os
efeitos do colesterol em monocamadas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) são
bem descritos na literatura (Regen, 2002; Róg & Pasenkiewicz-Gierula, 2001;
Dynarowicz-£atka & Hac-Wydro, 2004). Alguns autores observaram um efeito de
condensação manifestado na presença do esterol que pode ser atribuído a uma
formação complexa entre as moléculas, ou um peculiar efeito dos grupos cabeça
polar dos fosfolipídios agindo como guarda-chuvas, protegendo o contato da
porção apolar do colesterol com a água (Dynarowicz-£atka & Hac-Wydro, 2004;
Huang & Feigenson, 1999).
Recentemente têm sido investigadas as interações da fosfatase alcalina
(AP-GPI), uma proteína ancorada por GPI, em sistemas biomiméticos de
membranas tais como monocamadas, para determinar a natureza das interações
da proteína com o lipídio e as relações estrutura-função de tais proteínas
(Brockman, 1999; Maget-Dana, 1999; Ronzon et al., 2002; Caseli et al., 2005).
2
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2.1 Objetivos Gerais
Obter proteínas ancoradas por GPI das formas promastigotas de L.
amazonensis e reconstituí-las em sistemas de lipossomos.
Especificamente pretendemos:
1. Solubilizar proteínas ancoradas por GPI da superfície celular de formas
promastigotas de L. amazonensis e reconstituí-las em lipossomos,
contendo diferentes proporções de lipídios.
2. Estudar a influência das diferentes proporções de lipídios na incorporação
de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em sistemas de
monocamadas.
3. Avaliar o potencial profilático de proteínas antigênicas ancoradas por GPI,
associadas a lipossomos, na indução de resposta imune em camundongos
BALB/c.
4. Analisar os efeitos in vitro na resistência/susceptibilidade à infecção com
L. amazonensis e na produção de NO em culturas de macrófagos
peritoneais murinos, estimulados com as proteínas ancoradas por GPI e
com os sistemas de lipossomos.
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3
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Lista de alguns compostos utilizados e procedências
Meio de Cultura Schneider Sigma, USA
Sulfato de Gentamicina Ducto, BR
SFB HyClone, USA
Tris Sigma, USA
Triton X-114 Sigma, USA
PI-PLC Sigma, USA
Padrão de Peso Molecular (20-120 KDa) Sigma, USA
SDS Gibco, USA
Membrana de Nitrocelulose Gibco, USA
Leite em Pó Desnatado Nestlé, BR
3,3’ aminobenzidina Sigma, USA
Biobeads BioRad, USA
DPPC Sigma, USA
Colesterol Sigma, USA
DMPC Sigma, USA
DLPC Sigma, USA
DSPC Sigma, USA
DPPA Sigma, USA
DPPS Sigma, USA
DPPG Sigma, USA
BSA Sigma, USA
Meio de Cultura RPMI 1640 Sigma, USA
HEPES Sigma, USA
Giemsa Sigma, USA
MTT Sigma, USA
Reagente de Griess Sigma, USA
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c, fêmeas, 8-12
semanas de idade, entre 19-22g e SPF (Specific Patogen Free) obtidos do
Biotério de Criação de Camundongos Isogênicos da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
3.2 Obtenção e cultivo dos parasitas
Formas amastigotas e promastigotas de Leishmania (Leishmania)
amazonensis IFLA/BR/67/PH8, foram utilizadas a partir de uma cultura original
de promastigotas.
A propagação in vitro das promastigotas de L. amazonensis foi feita em
meio Schneider (Sch) contendo 50 mg/L de sulfato de gentamicina e 10% de
soro fetal bovino (SFB) previamente inativado a 56ºC por 30 minutos.
A cultura inicial foi obtida de camundongos BALB/c previamente infectados
com 10
6
promastigotas de L. amazonensis pela via subcutânea (s.c.) na pata
traseira. Após 2 meses de infecção, os animais foram sacrificados e as patas
contendo a lesão foram retiradas e mantidas em álcool para a remoção da pele
necrosada. Em seguida, as patas foram maceradas em meio Sch/SFB liberando
as amastigotas de L. amazonensis que foram isoladas e colocadas em meio
Sch/SFB, onde se transformaram em promastigotas. Os parasitas foram
mantidos a 25ºC e repicados por sucessivas passagens.
3.3 Preparação do soro contendo os anticorpos contra os determinantes
imunogênicos de L. amazonensis
Camundongos BALB/c foram infectados pela via s.c. em uma das patas
traseiras com 10
6
promastigotas de L. amazonensis. Dois meses após a infecção,
o sangue dos animais foi coletado por via retrorbital para a obtenção do soro
contendo os anticorpos contra os determinantes imunogênicos do parasita.
Para analisar o perfil protéico no proteolipossomo, camundongos BALB/c
foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) com 40 µg de proteolipossomos e
após 14 semanas de imunização o soro foi coletado por via retrorbital.
3.4 Solubilização de proteínas de membrana ancoradas por GPI de
promastigotas de L. amazonensis
Formas promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de
crescimento, obtidas como descrito anteriormente, foram lavadas e o pellet,
obtido após centrifugação a 1.200 x g durante 10 minutos foi estocado a -20ºC.
O pellet foi ressuspenso em tampão Tris [(hydroxymethyl-)aminomethane]-HCl
(ácido clorídrico) (50 mM, pH 7,25) contendo 2 mM CaCl
2
(Cloreto de Cálcio) e
10 mM NaCl (Cloreto de Sódio) e sonicado. Após a ultracentrifugação da
suspensão a 100.000 x g por 1 hora a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o
pellet ressuspenso e ultracentrifugado novamente. O pellet contendo a fração de
membrana (5 mg/mL) foi então ressuspenso na solução tampão Tris-HCl 50mM e
solubilizado em 1% de Triton X-114 (Octylphenoxypoly-ethoxyethanol) em
banho de gelo por 1 hora em constante agitação. O material solubilizado pelo
detergente foi aquecido a 37ºC, permitindo a separação de fases dependente da
temperatura, com as proteínas ancoradas por GPI localizadas na fase do
detergente. As fases aquosa, detergente e pellet, formadas após a separação de
fases foram isoladas e estocadas a -70ºC para posterior análise por SDS-PAGE e
Western Blotting.
3.5 Tratamento com fosfolipase C
O pellet contendo a fração de membrana (2 mg/mL) ressuspendido em
tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,25 e a fase detergente contendo as proteínas
ancoradas por GPI foram tratados com 0,2 U (4 µl/mL) de fosfolipase C
específica para glicosilfosfatidilinositol (PI-PLC) de Bacillus thuringiensis por 1h a
37ºC sob constante agitação. Após, as amostras foram centrifugadas a 100.000
x g por 30 minutos a 4ºC, pellet e sobrenadante foram separados e estocados a -
20ºC para posterior análise por SDS-PAGE e Western Blotting.
3.6 Eletroforese em condição desnaturante [SDS-PAGE (sodium dodecyl
sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)]
Os pesos moleculares das proteínas foram determinados pelo método
descrito por Laemmli (1970). Resumidamente, 5% de poliacrilamida foi utilizada
no gel de empilhamento e 10% no gel de separação. As amostras, tratadas
conforme descritos pelo método de Laemmli (1970), foram levadas ao banho-
maria a 100ºC por 5 minutos e aplicadas no gel. Padrões de massa molecular
(20-120 KDa) foram utilizados em cada gel para determinar a mobilidade relativa
de cada proteína.
Para a visualização das proteínas fracionadas no SDS-PAGE, o gel foi
corado pela prata segundo o método descrito por Blum et al. (1987).
3.7 Western Blotting
As amostras de proteínas foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida, como descrito acima, e transferidas por corrente elétrica para
membranas de nitrocelulose. Após a transferência feita sob voltagem constante
de 100 V a 4ºC por 1 hora, a membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio
PBS (salina tamponada com fosfato)/Tween 20 (polyoxyethylenesorbitan
monolaurate) 0,05% contendo 5% de leite em pó desnatado por 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente, a membrana foi lavada com tampão de
lavagem (PBS/Tween 20 0,05%) e incubada “overnight” com o soro imune
diluído 1:75 em tampão de bloqueio. A membrana foi lavada com tampão de
lavagem e incubada por 1 hora com o anticorpo de cabra anti-IgG de
camundongo conjugado com peroxidase diluído 1:1000 em tampão de lavagem.
A membrana foi revelada com 3,3’ diaminobenzidina (DAB) na concentração de
0,5 mg/mL.
3.8 Remoção do detergente Triton X-114
Para remover o excesso de detergente utilizado para solubilizar as
proteínas ancoradas por GPI, foi utilizada a resina hidrofóbica Biobeads na
proporção 0,07g para cada mililitro de amostra com 2 trocas em banho de gelo.
Após 3 horas de contato, a resina foi trocada e novamente mantida em contato
com a amostra por mais 2 horas. Após a decantação da resina, a suspensão foi
coletada e adicionada ao sobrenadante da mistura contendo lipossomos
conforme descrito a seguir, ou adicionada ao tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,25,
contendo 2 mM CaCl
2
e 10 mM NaCl para formar o extrato bruto solubilizado
(EBS
GPI
) enriquecido com proteínas ancoradas por GPI do parasita.
3.9 Preparação dos lipossomos e dos proteolipossomos contendo as
proteínas de membrana ancoradas por GPI de promastigotas de L.
amazonensis
Os lipossomos constituídos de somente DPPC e DPPC:Colesterol nas
proporções 2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1 (mol:mol), e ainda lipossomos
constituídos por dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dilauroilfosfatidilcolina (DLPC),
distearoilfosfatidilcolina (DSPC), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA),
dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) na ausência
ou presença do colesterol na razão molar 1,2:1, foram preparados conforme
descrito por Camolezi et al. (2002). Resumidamente, dissolveu-se 1 mg/mL do
fosfolipídio em clorofórmio e posteriormente o clorofórmio foi evaporado através
da passagem de nitrogênio pela solução. Em seguida, o lipídio foi ressuspenso
em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,25, contendo 2 mM CaCl
2
e 10 mM NaCl e a
mistura foi mantida a 60ºC por 1 hora, com agitações constantes a intervalos de
10 minutos. Então, a mistura foi sonicada e ultracentrifugada a 100.000 x g por
20 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi estocado a 4ºC e
posteriormente foi utilizado para obter o proteolipossomo.
Para preparação dos proteolipossomos, as amostras de proteínas que
foram obtidas na fase rica em detergente e tratadas com a resina hidrofóbica
Biobeads conforme descrito no item 3.8, para remoção do excesso de
detergente, foram adicionadas ao sobrenadante da mistura acima contendo os
lipossomos. A mistura foi então mantida por 16 horas à temperatura ambiente.
Em seguida, a amostra foi ultracentrifugada a 100.000 x g por 1 h a 4ºC.
Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o pellet contendo os
proteolipossomos foi ressuspenso ao volume original em tampão Tris-HCl 50 mM,
pH 7,25 contendo 2 mM CaCl
2
e 10 mM NaCl.
3.10 Medidas de distribuição de tamanho de partícula por espalhamento
de luz dinâmico
A determinação de distribuição de tamanho de lipossomos e/ou
proteolipossomos foi realizada por espalhamento de luz, usando um Beckman
Coulter submicron particle size analyzer (modelo N5), com cubetas de 1 cm de
caminho óptico. As amostras foram filtradas e diluídas para um adequado índice
de polidispersão. Nos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, o
diâmetro médio é determinado a partir do coeficiente de difusão, D, das
vesículas quando estas se movem ao acaso devido ao movimento Brawniano. O
coeficiente de difusão das vesículas é calculado a partir da flutuação da
intensidade da luz espalhada, expressa através do decaimento da função de
correlação:
g(τ) = 1 + e
(-2Dq2 τ )
onde g(τ) é função de auto-correlação temporal,
D é o coeficiente de difusão das partículas,
q é o módulo do vetor de espalhamento
q =
λ
Π
4
sen
2
θ
onde
λ
é o comprimento de onda da radiação e θ é o ângulo da luz coletada em
relação ao feixe incidente.
A intensidade de luz espalhada é modulada através do movimento
Brawniano das vesículas que se difundem resultando na ampliação da largura da
linha do laser (efeito Doppler). Pelo exame da amplitude espectral da luz
espalhada, o tamanho da vesícula pode ser calculado.
O raio hidrodinâmico pode ser obtido pela equação de Navier-Stokes:
D =
h
B
R
TK
η
Π6
onde K
B
é a constante de Boltzmann
T é a temperatura (kelvin)
η é a viscosidade do solvente
R
h
é o raio hidrodinâmico
3.11 Preparação do gradiente isopícnico de densidade de sacarose
Um gradiente contínuo de sacarose foi preparado (1 – 15% de sacarose
em tampão Tris-HCl 50 mM contendo 2 mM CaCl
2
e 10 mM NaCl, com a
densidade variando de 3.0 to 10.6 g/mL), utilizando-se para a montagem do
mesmo um Gradient Maker. As amostras de proteolipossomos, lipossomos e
proteínas ancoradas por GPI solúveis (0,5 mL) foram aplicadas no gradiente e
ultracentrifugadas a 180.000 x g durante 4 horas a 4
o
C. Os gradientes foram
fracionados (0,5 mL) e analisados para proteínas e fosfato inorgânico conforme
descrito por Chen et al. (1956).
3.12 Dosagem de proteínas
As concentrações de proteínas foram determinadas pelo método descrito
por Hartree (1972) na presença de 2 % de dodecil sulfato de sódio (SDS)
utilizando-se como padrão a albumina de soro bovino (BSA).
Especificamente, para a determinação da concentração protéica das
frações de proteolipossomos obtidas após a centrifugação em gradiente de
sacarose foi empregado o método descrito por Read e Northcote (1981),
utilizando-se também BSA como padrão.
3.13 Dosagem de fosfato inorgânico
O fosfato inorgânico liberado pela hidrólise dos fosfolipídios foi quantificado
utilizando-se o procedimento descrito por Chen et al. (1956). Alíquotas de 0,3
mL da amostra foram tratadas com 0,5 mL de ácido nítrico 65 % a temperatura
de 120ºC até a completa secagem. Em seguida, as alíquotas foram ressuspensas
em 0,5 mL de água destilada e misturadas com 1,0 mL do reagente (1 parte de
ácido ascórbico 10 % para 6 partes da solução de molibdato de amônio 3,4 mM e
ácido sulfúrico 0,45 mM). Em seguida, as amostras foram mantidas por 20
minutos em banho-maria a 45ºC e submetidas à análise espectrofotométrica,
utilizando-se um comprimento de onde de 820 nm. A determinação da
concentração de fosfato inorgânico foi estimada a partir da regressão linear dos
valores obtidos.
Para a obtenção da curva padrão. Foram utilizadas concentrações de 5 a
80 nM de fosfato preparado a partir de uma solução estoque de dihidrogênio
fosfato de sódio 1,0 mM.
3.14 Dosagem de colesterol
As concentrações de colesterol foram determinadas pelo método descrito
por Higgins (1987), utilizando-se como padrão uma solução de colesterol 0,01 %
em ácido acético glacial.
Após a completa secagem das alíquotas através da passagem de uma
corrente de nitrogênio pela solução foi adicionado 1,5 mL de ácido acético glacial
e 0,5 mL de uma solução constituída de cloreto de ferro hexa-hidratado 2,5 %
em ácido ortofosfórico 85 % diluído 12,5 vezes em ácido sulfúrico concentrado.
Após 10 minutos de incubação, as amostras foram submetidas à análise
espectrofotométrica utilizando-se um comprimento de onda de 550 nm.
3.15 Imunização de camundongos com os proteolipossomos e avaliação
da proteção contra a infecção com L. amazonensis
Grupos de cinco camundongos BALB/c foram imunizados com tampão Tris-
HCl (50 mM, pH 7,25 contendo 10 mM NaCl e 2 mM CaCl
2
), lipossomos (200 µL),
proteínas ancoradas por GPI solubilizadas com Triton X-114 (EBS
GPI
) (5 µg) ou
proteolipossomos (5, 10, 20 e 40 µg de proteínas ancoradas por GPI
incorporadas nesses sistemas). Após três semanas, os animais foram desafiados
com 10
4
formas promastigotas de L. amazonensis de fase estacionária de
crescimento. O desafio foi feito por via s.c. na pata traseira direita de cada um
dos camundongos e o tamanho da lesão foi avaliado semanalmente. As patas
traseiras dos animais foram medidas com o auxílio de um paquímetro de
resolução 0,02 mm (Starrett, cat. # 125MEA-6/150, Brasil) e o tamanho da lesão
foi calculado pela diferença de tamanho entre a pata direita e a pata esquerda. O
tamanho da lesão foi representado pela média ± SE das diferenças obtidas em
cada camundongo.
Para que o EBS
GPI
fosse utilizado nesses ensaios, a retirada do detergente
foi necessária conforme descrito no item 3.8.
3.16 Monocamadas de Langmuir: isotermas π - A e cinética de adsorção
Monocamadas contendo as misturas de DPPC:Colesterol nas proporções
2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1 foram preparadas a uma temperatura de 24 ± 0,5ºC,
em uma cuba de Langmuir (Insight-Brasil). Para cada proporção lipídica foi
espalhado 1 mg/mL da mistura lipídica em 125 mL de solução tampão (50 mM
Tris-HCl, pH 7,25 contendo 10 mM NaCl e 2 mM CaCl
2
) presente na cuba. Após,
a monocamada foi comprimida até a pressão de 30 mN/m e uma pequena
alíquota da solução de proteína (0,05 µg/mL), previamente tratada com a resina
Biobeads como descrito no item 3.8, foi injetada na subfase próxima da
interface, e os valores de π foram monitorados em função do tempo.
3.17 Obtenção, cultivo e estimulação de macrófagos peritoneais murinos
Camundongos isogênicos BALB/c foram sacrificados por deslocamento
cervical. Com auxílio de seringa estéril descartável, injetou-se 15 mL de solução
de PBS estéril suplementada com gentamicina no peritôneo do camundongo; o
abdômen do animal foi massageado e a pele rebatida. Novamente introduziu-se
a seringa na cavidade peritoneal do animal para retirada do exsudato,
armazenando-o em frasco imerso em banho de gelo. O exsudato foi centrifugado
a 7.000 x g por 10 minutos a 4°C, e posteriormente ressuspendido em meio
RPMI 1640 (suplementado com 10% de SFB, 20mM de bicarbonato de sódio,
10mM de tampão HEPES e 25 µg/mL de sulfato de gentamicina) e o número de
células foi contado em câmara de Neubauer (Boeco, Alemanha). Foi plaqueado 1
x 10
6
macrófagos/mL em placas de cultura de 24 poços (Corning, TRP),
incubando-os por 4 horas a 37ºC (estufa incubadora com 21% O
2
, 5% CO
2
).
Após, os macrófagos foram estimulados com 50 µL/mL de lipossomos, 5 µg/mL
de EBS
GPI
e 1 µg/mL proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados
com formas amastigotas de L. amazonensis conforme descrito a seguir.
3.18 Infecção das culturas de macrófagos com L. amazonensis
As culturas de macrófagos peritoneais murinos estimuladas com os
diferentes tratamentos conforme descrito anteriormente, foram infectadas com 3
amastigotas para cada macrófago e incubadas por 1 hora a temperatura
ambiente. Após este período o meio de cultura foi retirado e adicionou-se meio
de cultura fresco. As culturas foram então incubadas em estufa úmida a 5% CO
2
,
21% O
2
a 37ºC por 24 horas.
Para a avaliação do número de células, de parasitas e a porcentagem de
infecção, as lamínulas com os macrófagos aderidos e infectados foram fixadas
em metanol (10 min) e coradas com Giemsa (10 min) (Giorgio & Barão, 1998) e
avaliados em microscópio óptico.
3.19 Avaliação da viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos
A viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos, estimulados com os
lipossomos, EBS
GPI
e proteolipossomos como descrito no item 3.17, foi
determinada através do teste do MTT (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil
brometo tetrazolina). Os macrófagos foram cultivados e então estimulados com
os diferentes tratamentos (lipossomos ou proteolipossomos) conforme descrito
no iten 3.17, e incubados em estufa úmida a 5% CO
2
, 21% O
2
a 37ºC por 48
horas. Já para o EBS
GPI
, as culturas de macrófagos (2 x 10
5
células/ 100 µL)
foram estimuladas com 5 µg/100µL de EBS
GPI
e mantidas em estufa úmida (5%
CO
2
, 21% O
2
a 37ºC) por 20 horas. A seguir, o meio de cultura foi retirado e
adicionou-se meio de cultura novo, para remover o excesso de Triton X-114, e as
culturas foram novamente incubadas por 24 horas a 5% CO
2
, 21% O
2
a 37ºC.
Em cada poço foi adicionado o MTT (1,6 mg de MTT/mL de meio RPMI 1640 sem
SFB), e as placas foram então incubadas a 37ºC por 4h. Após este período, foi
retirado todo o meio de cultura e adicionou-se isopropanol com um volume igual
ao volume inicial do meio de cultura. Logo após a adição do isopropanol, a
viabilidade celular foi medida em diferentes comprimentos de ondas conforme
metodologia descrita por Mosmann (1983).
3.20 Análise da produção de nitrito
Macrófagos peritoneais murinos foram cultivados em meio RPMI 1640 a
uma concentração de 1 x 10
6
células/mL. Os sobrenadantes das culturas
celulares estimuladas com os lipossomos, EBS
GPI
e proteolipossomos conforme
descrito no item 3.17, foram coletados após 20 horas de estímulo e congelados a
-20ºC.
A produção de óxido nítrico foi dosada indiretamente pela concentração de
seu metabólito no meio de cultura (nitrito), pelo método de Griess (Green et al.,
1984). Resumidamente, os sobrenadantes foram descongelados e um volume de
150 µL foi colocado em placa de 96 poços (Corning, TRP), adicionando-se igual
quantidade de reagente de Griess. As placas foram incubadas a temperatura
ambiente por 15 minutos e a quantificação colorimétrica foi realizada em 540 nm
em leitor de ELISA. A curva padrão foi feita com nitrito.
3.21- Análise estatística
Foi utilizada a análise de 1 via (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Os
valores foram considerados estatisticamente diferentes quando o valor de p era
menor ou igual a 0,05. O teste estatístico foi realizado no software GraphPad
Prism 5.
4
4
.
.
R
R
e
e
s
s
u
u
l
l
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
4.1 Solubilização das proteínas ancoradas por GPI da membrana de L.
amazonensis utilizando o detergente Triton X-114.
Para se obter as proteínas ancoradas por GPI presentes na superfície das
formas promastigotas do parasita, frações de membranas foram solubilizadas
com 1% do detergente não iônico Triton X-114, que tem sido frequentemente
utilizado para obter preparações enriquecidas com proteínas ancoradas por GPI
de homogeinados celulares. Esse procedimento separa as proteínas em três
frações de acordo com a sua solubilidade. Após a separação de fases dependente
da temperatura, conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos, as
proteínas ancoradas por GPI são recuperadas na fase rica em detergente
enquanto que proteínas solúveis encontradas na fase aquosa e outras proteínas
que não foram solubilizadas pelo detergente formando um pellet, foram
removidas. A média de recuperação das proteínas ancoradas por GPI na fase rica
em detergente foi de 8%.
Para visualizar as proteínas presentes nas diferentes fases após o
tratamento com o detergente, foi realizada a eletroforese em condição
desnaturante. O perfil eletroforético das proteínas de membrana da superfície de
L. amazonensis mostrou um limitado número de componentes variando de 20 a
66 KDa (Figura 3). Ainda, o perfil eletroforético das proteínas ancoradas por
GPI mostrou uma maior intensidade das bandas entre 65-45 KDa
aproximadamente (Figura 3, coluna d). Como proteínas ancoradas por GPI
podem ser facilmente identificadas por tratamento com PIPLC, nós utilizamos
essa enzima a fim de se comprovar a presença dessas proteínas ancoradas
solubilizadas e recuperadas na fase rica em detergente. Como podemos
observar, quando tratamos a fase rica em detergente (0,2 mg/mL de proteína
total) com 0,2 U/mL de PI-PLC de B. thuringiensis, análises por eletroforese
mostraram similares resultados entre as amostras da fase rica em detergente e
as amostras tratadas com PI-PLC (Figura 3, colunas d e e,
respectivamente).
A fim de verificar se o tratamento da fração de membrana com o
detergente Triton X-114 alteraria a atividade antigênica das proteínas, foi
realizado um Western Blotting. A Figura 4 mostra a análise das proteínas que
foram solubilizadas pelo detergente e posteriormente submetidas à separação de
fases a 20ºC com o soro contendo os anticorpos contra os determinantes
imunogênicos de L. amazonensis. Como podemos observar o material
solubilizado não apresentou alteração significativa na ligação com o anticorpo
(Figura 4, coluna d).
Uma vez determinadas as condições adequadas para a solubilização das
proteínas ancoradas por GPI da superfície de L. amazonensis, foram realizados
estudos sistemáticos para definir a melhor condição para a incorporação dessas
proteínas em lipossomos.
Figura 3. Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração pela
prata. (a) fração de membrana de formas promastigotas. Alíquotas de 0,5 mg/mL de
fração de membrana foram incubadas por 1 hora em banho de gelo com o Triton X-114
conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos: (b) pellet contendo membrana; (c)
fase aquosa; (d) fase rica em detergente. Uma alíquota da fase rica em detergente foi
tratada com PI-PLC e (e) corresponde ao sobrenadante após tratamento conforme
descrito no item 3.5 de Material de Métodos. Padrão de massa molecular em KDa.
66
45
36
24
20
a b c d e
Figura 4. Análise por Western Blotting das proteínas da superfície de
promastigotas de L. amazonensis. (a) fração de membrana de formas promastigotas.
Alíquotas de 0,5 mg/mL de fração de membrana foram incubadas por 1 hora em banho
de gelo com o Triton X-114 conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos: (b)
pellet contendo membrana; (c) fase aquosa; (d) fase rica em detergente. Uma alíquota
da fase rica em detergente foi tratada com PI-PLC e (e) corresponde ao sobrenadante
após tratamento conforme descrito no item 3.5 de Material de Métodos.
a b c d e
66
45
29
36
4.2 Preparação dos lipossomos e proteolipossomos e suas
caracterizações.
Para preparar os lipossomos e os proteolipossomos diferentes proporções
lipídicas contendo DPPC:Colesterol (2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1) (mol:mol) ou
somente DPPC e 0,0625 mg/mL de proteínas ancoradas por GPI solubilizadas
pelo Triton X-114 foram preparados conforme descrito no item 3.9 de Material e
Métodos.
Na Tabela I, observamos que lipossomos foram formados em todas as
condições estudadas, mas a incorporação das proteínas ancoradas só ocorreu na
presença do colesterol, alcançando um máximo de incorporação (57 ± 4 %)
quando foi utilizada a proporção molar 2,1:1 de DPPC:Colesterol (Figura 5).
Podemos observar ainda que o aumento da quantidade de colesterol não
aumentou significativamente a adsorção das proteínas (Figura 5).
O aumento da quantidade de colesterol não afetou expressivelmente o
diâmetro hidrodinâmico dos lipossomos, medido através do espalhamento de luz,
como indicado na Tabela I. Contudo, após incorporação das proteínas ancoradas
o diâmetro dos proteolipossomos foi aproximadamente 2 vezes maior que dos
lipossomos (Tabela I).
Diâmetro (nm) DPPC:Colesterol
razão (mol/mol)
Lipossomo Proteolipossomo
1,0:0
99,4 ± 8
Não forma
2,1:1
78,7 ± 12 204,0 ± 13
1,5:1
71,8 ± 9 178,0 ± 21
1,2:1
82,7 ± 13 224,0 ± 41
0,9:1
82,5 ± 11 197,0 ± 15
Tabela I. Composição lipídica (razão em mol) e diâmetro médio (nm)
dos lipossomos e proteolipossomos preparados conforme descrito em
Material e Métodos.
O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em seis diferentes
preparações (média ± SD).
2,14:1 1,5:1 1,2:1 0,9:1
45
54
63
Proteína incorporada (%)
Lipossomos (DPPC:Colesterol mol:mol)
Figura 5. Efeito das diferentes razões molares dos lipossomos constituídos de
DPPC:Colesterol na incorporação de proteínas ancoradas por GPI de
promastigotas de L. amazonensis. Alíquotas de 0,0625 mg/mL de proteínas
ancoradas por GPI solubilizadas com o Triton X-114, foram incubadas overnight com os
lipossomos nas diferentes razões molares. A porcentagem de proteína incorporada foi
acompanhada pela dosagem de proteínas no pellet e no sobrenadante, conforme descrito
no item 3.9 de Material e Métodos.
Um passo importante para alcançar um alto rendimento na incorporação das
proteínas ancoradas por GPI nesses sistemas vesiculares é o estudo da
composição lipídica mais adequada. Portanto, para verificar se variações na
composição lipídica poderiam alterar a incorporação dessas proteínas, utilizamos
além de DPPC outros lipídios que apresentam diferentes grupos cabeça polar
(DPPS, DPPG e DPPA) ou então que apresentam variações no comprimento da
cadeia de ácidos graxos (DLPC, DMPC e DSPC) na presença ou ausência de
colesterol.
Quando fomos avaliar a formação de lipossomos e proteolipossomos
utilizando fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar, observamos a
formação de lipossomos em todas as condições estudadas, alcançando um maior
diâmetro (126,5 ± 6 e 115,8 ± 6 nm)
com o fosfolipídio DPPS, que apresenta
carga negativa na sua superfície (Tabela II e III, respectivamente). Não
observamos a incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do
parasita na ausência do colesterol (Tabela II). Contudo, podemos observar um
aumento de aproximadamente 3 vezes no diâmetro dos proteolipossomos após
incorporação das proteínas nos lipossomos constituídos pelos diferentes
fosfolipídios na presença do colesterol (Tabela III).
Tabela II. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na
ausência do colesterol.
a
em pH 7,25
(*) Não forma proteolipossomos
O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes
preparações (média ± SD).
Fosfolipídio (1 mg/mL)
DPPG DPPS DPPA DPPC
Carga do Fosfolipídio
a
-1 -1 -1 0
Diâmetro dos Lipossomos
(nm)
87,7 ± 4 126,5 ± 6 73,9 ± 4 82,7 ± 13
Diâmetro dos
Proteolipossomos (nm)
* * * *
Incorporação de proteína
(%)
0 0 0 0
Tabela III. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na
presença do colesterol.
*em pH 7,25.
O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes
preparações (média ± SD).
Fosfolipídío:Colesterol
1,2:1 (razão em mol)
DPPG:Col DPPS:Col DPPA:Col DPPC:Col
Carga do Fosfolipídio* -1 -1 -1 0
Diâmetro dos Lipossomos
(nm)
78,1 ± 4 115,8 ± 6 80,5 ± 4 82,7 ± 13
Diâmetro dos
Proteolipossomos (nm)
398,6 ± 20 386,1 ± 19 388,8 ± 19 224,0 ± 41
Incorporação de proteína
(%)
48,5 ± 2 49,3 ± 2 43,6 ± 2 51,0 ± 2
Fomos avaliar também se lipossomos constituídos de fosfolipídos, que
apresentam diferentes tamanhos na cadeia hidrocarbônica, influenciariam a
formação dos proteolipossomos. As Tabelas IV e V mostram que em todas as
condições estudadas, podemos verificar a formação de lipossomos, apresentando
um maior diâmetro (124,9 ± 6 nm) para o fosfolipídio DSPC que apresenta 18
carbonos na sua cadeia hidrocarbônica. Novamente, não observamos a
incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita na
ausência do colesterol (Tabela IV).
Também, não observamos diferenças significativas na incorporação das
proteínas ancoradas por GPI nos diferentes lipossomos estudados, mostrando
uma eficiente incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície de L.
amazonensis nesses sistemas (Tabela V). Podemos observar ainda que durante
a formação do proteolipossomo constituído de DSPC:Colesterol houve um
aumento de aproximadamente 5 vezes no seu tamanho (Tabela V).
A partir desses resultados, padronizamos uma metodologia de obtenção de
proteolipossomos utilizando-se DPPC:Colesterol sempre na proporção molar
1,2:1. Essa relação escolhida apresentou eficiente incorporação de proteínas
ancoradas por GPI (51,0 ± 2 %) (Figura 5), além de se mostrarem muito
estáveis mesmo após quinze dias de preparo. Ainda, como podemos observar na
Tabela I, a presença do colesterol foi um fator limitante para formação dos
proteolipossomos e uma maior concentração de colesterol pode, portanto facilitar
a incorporação de proteínas ancoradas, assim como já relatado na literatura e
como observado nos experimentos realizados com monocamadas de Langmuir.
Tabela IV. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias
hidrocarbônicas na ausência do colesterol.
(*) Não forma proteolipossomos
O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes
preparações (média ± SD).
Fosfolipídio (1 mg/mL)
DLPC DMPC DPPC DSPC
Comprimento da cadeia
Hidrocarbônica
12 14 16 18
Diâmetro dos Lipossomos
(nm)
69,7 ± 3 99,3 ± 5 82.7 ± 13 124,9 ± 6
Diâmetro dos
Proteolipossomos (nm)
* * * *
Incorporação de proteína
(%)
0 0 0 0
Tabela V. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos
preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias
hidrocarbônicas na presença do colesterol.
O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes
preparações (média ± SD).
Fosfolipídío:Cholesterol
1,2:1 (razão em mol)
DLPC:Col DMPC:Col DPPC:Col DSPC:Col
Comprimento da cadeia
Hidrocarbônica
12 14 16 18
Diâmetro dos Lipossomos
(nm)
69,7 ± 3 99,3 ± 5 82.7± 13 124,9 ± 6
Diâmetro dos
Proteolipossomos (nm)
240,4 ± 12 205,5 ± 10 224,0 ± 41 575,2 ± 29
Incorporação de proteína
(%)
46,9 ± 2 45,8 ± 2 51,0 ± 2 52,2 ± 3
Em adição, o perfil eletroforético revelou uma variedade de proteínas com
uma distribuição similar entre as amostras do EBS
GPI
e as amostras dos
proteolipossomos (Figura 6A, coluna b e c, respectivamente), indicando
incorporação não seletiva das proteínas do parasita nesses lipossomos.
Ainda, na Figura 6B podemos observar o potencial desses sistemas
vesiculares em induzir a produção de anticorpos contra as proteínas de L.
amazonensis. Para isso, cinco camundongos da linhagem BALB/c foram
inoculados pela via i.p. com 40 µg de proteínas ancoradas por GPI incorporadas
nos proteolipossomos, preparados com DPPC:Colesterol na razão 1,2:1
(mol:mol). A Figura 6B mostra o Western Blotting do EBS
GPI
previamente
separado por eletroforese, transferido para uma membrana de nitrocelulose e
imunocorado com o anticorpo secundário acoplado a peroxidase. Como podemos
observar, as bandas protéicas foram reconhecidas pelos anticorpos presentes no
soro de camundongos imunizados com proteolipossomos, indicando que tanto o
EBS
GPI
quanto esses sistemas vesiculares apresentam atividade imunogênica
(Figura 6B, coluna b e c).
A B
Figure 6. (A) Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração
pela prata. (P) Padrão de massa molecular em KDa. (a) fração de membrana de
promastigotas de L. amazonensis; (b) EBS
GPI
e (c) proteínas presentes nos
proteolipossomos. (B) Western Blotting. (a) Fração de membrana de promastigotas de
L. amazonensis. Análise do EBS
GPI
(b) e das proteínas presentes nos proteolipossomos
(c) com soro coletado 14 semanas após imunização i.p. de camundongos BALB/c com 40
µg de proteolipossomos.
a b c
66
45
36
24
20
P
a b c
4.3 Caracterização dos proteolipossomos preparados com
DPPC:Colesterol.
Para caracterizar o grau de incorporação das proteínas ancoradas por GPI
de L. amazonensis nos proteolipossomos, foi realizada uma centrifugação em
gradiente de densidade de sacarose, e as frações foram analisadas para seus
conteúdos protéicos e de fosfato inorgânico. Na Figura 7A, as frações contendo
os lipossomos apresentaram um pico correspondente ao conteúdo de fosfato
inorgânico ao redor de 4% de sacarose. Já para as frações contendo o EBS
GPI
,
podemos observar a presença de proteínas na região média do gradiente, na
faixa de 8-10% de sacarose (Figura 7B). Finalmente, os proteolipossomos
mostraram um único pico e ao redor de 6% de sacarose (Figura 7C). Esses
picos únicos, correspondentes ao conteúdo de fosfato inorgânico e proteínas,
indicam uma eficiente incorporação durante a reconstituição das proteínas
presentes no EBS
GPI
nos sistemas de lipossomos.
Figura 7. Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. (A) lipossomos,
(B) EBS
GPI
e (C) proteolipossomos. Análise espectrofotométrica: (ο) proteína, utilizando-
se comprimento de onda de 595 nm e (●) lipídio, utilizando-se comprimento de onda de
820 nm; (■) porcentagem de sacarose determinada por refratometria.
Absorbância
Sacarose (%)
Frações
Absorbância
Sacarose (%)
Frações
4.4 Avaliação da incorporação de proteínas ancoradas por GPI de L.
amazonensis em monocamadas de Langmuir.
Para investigar a influência da fluidez da membrana na incorporação das
proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita, foram feitos experimentos
de penetração da proteína em monocamadas utilizando a mistura lipídica
DPPC:Colesterol em diferentes proporções molares (2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1).
A Figura 8 mostra as isotermas da pressão superficial x área obtidas
usando DPPC puro e na presença de diferentes razões molares DPPC:Colesterol.
Podemos observar na isoterma obtida para o DPPC puro a característica transição
de fase de líquido expandido (LE) para líquido condensado (LC) representado por
um platô ao redor de 10 mN/m e uma área limitante ao redor de 60 Å
2
.
Entretanto, essa região característica de transição de fase observada para as
monocamadas constituídas de DPPC puro foi eliminada na presença do colesterol
(Figura 8). Ainda, observamos que a área mínima observada para a
monocamada de DPPC puro (60 Å
2
) diminui para 50 e 43 Å
2
quando utilizamos
monocamadas mistas de DPPC:Colesterol nas razões molares 1,5:1 e 0,9:1,
respectivamente (Figura 8). O inserto na Figura 8 mostra que o módulo
compressional (Cs
-1
), correspondente à isoterma, exibe mais pronunciadamente
a influência do aumento de colesterol na composição mista das monocamadas.
Esses resultados denotam alterações na fluidez promovida pela presença do
colesterol, uma vez que maiores conteúdos de colesterol resultam em
monocamadas mais condensadas.
Figura 8. Curva pressão superficial x área molecular (π-A) para as diferentes
monocamadas. (
___
) DPPC puro; (---) DPPC:Colesterol razão molar 1,5:1 e (
……
)
DPPC:Colesterol razão molar 0,9:1. Inserto: Cs
-1
valores correspondentes as isotermas.
As isotermas foram feitas a 24±0.5 °C, em uma cuba de Langmuir como descrito no item
3.16 de Material e Métodos, pelo espalhamento de 1mg/mL da solução lipídica em
solução tampão constituída por 50mM Tris-HCl, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM
CaCl
2
. Os experimentos foram realizados em triplicatas e as curvas representam os
valores médios.
Área molecular (Å
2
)
Pressão Superficial (mN/m)
Área molecular (Å
2
)
Cs
-1
(mN/m)
Área molecular (Å
2
)
Pressão Superficial (mN/m)
Área molecular (Å
2
)
Cs
-1
(mN/m)
Mudanças na pressão superficial após injeção das proteínas ancoradas por
GPI, como mostra a Figura 9, representa a cinética da penetração da proteína
nas monocamadas constituídas de DPPC puro e na presença de diferentes
proporções de DPPC:Colesterol. A flecha em 30 mN/m em 10 segundos
representa o ponto de injeção. A monocamada lipídica de Langmuir foi pré-
formada e comprimida até a pressão superficial atingir 30 mN/m. Esse
empacotamento lipídico foi escolhido devido a equivalência com o
empacotamento lipídico de uma biomembrana. Ainda, podemos assumir que os
efeitos de difusão são os mesmos, já que a injeção foi feita no mesmo ponto e o
volume total foi o mesmo para todas as condições estudadas.
A injeção de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em
monocamadas constituídas por somente DPPC (Figura 9) causa um rápido
aumento na pressão superficial, que permanece constante por quase 8 minutos,
ao redor de 42 mN/m. Após esse tempo, a pressão superficial diminui
exponencialmente, alcançando valores mais baixos que os iniciais. A Figura 9
também mostra a incorporação das proteínas ancoradas por GPI em
monocamadas mistas de DPPC:Colesterol. Quando a proporção molar 1,5:1 de
DPPC:Colesterol foi usada, após 1 minuto da injeção da proteína o aumento na
pressão superficial ocorreu em passos ou escadas (durante 30 segundos),
permanecendo constante por aproximadamente 30 minutos, ao redor de 47
mN/m.
Figura 9. Cinética da adsorção de proteínas ancoradas por GPI da superfície de
formas promastigotas de
L. amazonensis, em monocamadas a 30mN/m como
descrito em Material e Métodos.
As monocamadas são constituídas por: (
___
) somente
DPPC, (---) DPPC:Colesterol razão molar 1.5:1 e (
……
) DPPC:Colesterol razão molar 0,9:1.
Após a estabilização da pressão superficial, uma pequena alíquota da solução da
proteínas ancoradas por GPI do parasita (0,0625 mg/mL), previamente tratada com
Biobeads, foi injetada (como indicada pela flecha) na subfase próxima da interface, e a
pressão superficial foi monitorada em função do tempo. Os experimentos foram
realizados em triplicata e as curvas representam os valores médios.
Tempo de Adsorção (s)
Pressão Superficial (mN/m)
Tempo de Adsorção (s)
Pressão Superficial (mN/m)
Por outro lado, quando a razão molar 0,9:1 DPPC:Colesterol foi usada,
após um retardo no tempo de aproximadamente 20 segundos, observamos um
aumento na pressão superficial ocorrendo em um único passo e permanecendo
constante logo após 40 segundos, ao redor de 40 mN/m. Entretanto,
contrastando com a curva obtida para monocamadas constituídas de somente
DPPC, a pressão superficial nas monocamadas mistas de DPPC:Colesterol não
diminui após 40 minutos (Figura 9). Para um menor conteúdo de colesterol nas
monocamadas mistas, como ocorre na razão molar 1,5:1 DPPC:Colesterol, o
atraso no tempo muda para 50 segundos e o equilíbrio da pressão superficial
ultrapassa 45 mN/m (Figura 9).
4.5 Avaliação da proteção contra a infecção com L. amazonensis em
camundongos BALB/c: Primeira imunização com os proteolipossomos.
Após caracterização dos proteolipossomos constituídos de DPPC:Colesterol
na razão molar de 1,2:1, eficientemente incorporado com proteínas ancoradas
por GPI (51,0 ± 2 % de incorporação) da superfície de formas promastigotas do
parasita, fomos testar uma possível atividade protetora dessa preparação. Para
isso, camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados com tampão Tris-HCl
(50 mM, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM CaCl
2
), lipossomos, 20 µg/animal
do EBS
GPI
e 5, 10 e 20 µg/animal de proteolipossomos. Estas proporções sempre
estão relacionadas com a quantidade de proteína presente nas amostras
administradas, ou seja, 20 µg de extrato protéico (EBS
GPI
) por animal ou 5, 10 e
20 µg de proteína incorporada no proteolipossomo por animal. Os camundongos
receberam uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na
pata traseira direita com 10
4
formas promastigotas de L. amazonensis.
A Figura 10 mostra o desenvolvimento das lesões características da
leishmaniose na pata traseira dos camundongos imunizados com o tampão,
lipossomos ou com 5 µg de proteolipossomos, e como podemos observar até a
6ª semana todos os grupos de camundongos imunizados apresentaram o mesmo
padrão de crescimento da pata. Contudo, podemos observar que a partir da 7ª
semana os grupos de camundongos imunizados com os lipossomos ou com os
proteolipossomos apresentaram diferenças significativas no tamanho da lesão,
apresentando lesões (aproximadamente 58 e 20 %, respectivamente) menores
quando comparado ao grupo de camundongos que receberam somente tampão
(Figura 10).
024681012141618
0
1
2
3
4
5
6
7
Tamanho da lesão (mm)
semanas
tampão
lipossomos
5 µg de proteolipossomos
Figura 10. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por
via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos ou com 5 µg de proteolipossomos e
desafiados com 10
4
promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam
uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira
direita. A medida e o cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos
no item 3.15 de Material de Métodos.
Ainda, o grupo imunizado com os lipossomos manteve essa diferença
significativa no crescimento da pata até a 16ª semana. Contudo, o grupo
imunizado com os proteolipossomos não mostra mais diferenças significativas no
desenvolvimento da lesão a partir da 11ª semana após infecção (Figura 10).
Quando fomos avaliar outras concentrações de proteolipossomos (10 e 20
µg) podemos observar que os grupos imunizados com esses sistemas
apresentaram o mesmo padrão de crescimento da pata quando comparado ao
grupo de animais imunizados com proteolipossomos em concentração menor (5
µg). O grupo imunizado com 10 µg de proteolipossomos apresentou uma
diferença significativa de cerca de 20 % no tamanho da pata quando comparado
ao grupo imunizado com o tampão (Figura 11). Contudo, uma maior diferença
significativa foi observada quando grupos de animais foram imunizados com 20
µg de proteolipossomos, mostrando uma diferença de aproximadamente 60 %
no tamanho da lesão quando comparado ao grupo que foi imunizado com o
tampão (Figura 12).
Novamente, a partir da 11ª semana essas diferenças diminuem até atingir
o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões do grupo imunizado com o
tampão (Figura 11 e 12).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tamanho da lesão (mm)
semanas
tampão
10 µg de proteolipossomos
Figura 11. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por
via i.p. com tampão ou com 10 µg de proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de
L. amazonensis. Os camundongos receberam uma imunização e
após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita. A medida e o
cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos no item 3.15 de
Material de Métodos.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
1
2
3
4
5
6
Tamanho da lesão (mm)
semanas
tampão
20 µg de proteolipossomos
Figura 12. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por
via i.p. com tampão ou com 20 µg de proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de
L. amazonensis. Os camundongos receberam uma imunização e
após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita. A medida e o
cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos no item 3.15 de
Material de Métodos.
Os resultados apresentados nas Figuras 10, 11 e 12 sugerem que as
imunizações dos camundongos com os lipossomos ou com os proteolipossomos
parecem retardar o aparecimento das lesões nas patas desses animais. Contudo
esses tratamentos não foram suficientes para manter a proteção por períodos
mais longos de infecção com o parasita, tornando-se insignificantes no final do
experimento, indicando assim que concentrações maiores de proteolipossomos
podem ser necessárias.
Ainda, os animais do grupo que foram imunizados com 20 µg de EBS
GPI
morreram após 10 minutos de imunização. Esses resultados sugerem um
possível efeito tóxico do detergente ou até mesmo das proteínas que estão
presentes no EBS
GPI
. Contudo, serão necessários estudos com menores
concentrações desse tratamento.
4.6 Avaliação da proteção contra a infecção com L. amazonensis em
camundongos BALB/c: Segunda imunização com os proteolipossomos.
Na tentativa de buscar uma melhor proteção com os proteolipossomos,
decidimos variar as concentrações do EBS
GPI
e dos proteolipossomos. Novamente
para isso, camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados com tampão
Tris-HCl (50 mM, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM CaCl
2
), lipossomos, 5
µg/animal do EBS
GPI
e 40 µg/animal de proteolipossomos. Contudo, devido a
grande dificuldade em se obter quantidades suficientemente altas de
proteolipossomos não conseguimos utilizar mais de uma concentração para esses
experimentos. Os camundongos receberam uma imunização e após três semanas
foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita com 10
4
formas
promastigotas de L. amazonensis.
Na Figura 13, podemos observar que até a 7ª semana todos os grupos de
camundongos apresentaram o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões nas
patas, e a partir da 8ª semana uma pequena diferença já pode ser observada no
tamanho das patas dos grupos imunizados com o EBS
GPI
e com os
proteolipossomos. A partir da 9ª semana, podemos observar que os
camundongos imunizados com o EBS
GPI
ou com os proteolipossomos mostraram
uma proteção de cerca de 60 e 50 %, respectivamente, no desenvolvimento da
lesão das patas, quando comparados aos animais que receberam tampão
(Figura 13). Essas diferenças apresentadas pelos grupos tratados com o EBS
GPI
ou com os proteolipossomos se mantiveram até o final do experimento.
02468101214
0
1
2
3
4
5
6
Tampão
Lipossomos
5 µg de EBS
40 µg de Proteolipossomos
tamanho da lesão (mm)
semanas
Figura 13. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por
via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos, EBS
GPI
ou com proteolipossomos e
desafiados com 10
4
promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam
uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira
direita. A medida e o cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos
no item 3.1 de Material de Métodos.
Ainda, não observamos diferenças significativas entre os grupos
imunizados com o tampão e os grupos imunizados com os lipossomos até a 11ª
semana de infecção. A partir da 12ª semana de infecção os grupos tratados com
os lipossomos começam a apresentar uma discreta diferença significativa (20 %)
no tamanho da lesão quando comparado ao grupo que recebeu tampão,
chegando a apresentar uma maior proteção (aproximadamente 36%) na 13ª
semana de infecção (Figura 13).
A Figura 14 mostra a lesão dos animais inoculados com tampão,
lipossomos, 5 µg de EBS
GPI
e 40 µg de proteolipossomo. Esses animais foram
fotografados quando estavam com treze semanas de infecção. Como podemos
observar, os animais imunizados com o EBS
GPI
ou com o proteolipossomo
apresentaram um menor tamanho da lesão nas patas traseiras infectadas com o
parasita L. amazonensis.
Figura 14. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por
via i.p. com tampão (controle), 200 µL de lipossomos, 5 µg de EBS
GPI
ou com 40
µg de proteolipossomos e desafiados com 10
4
promastigotas de L. amazonensis.
Os camundongos receberam uma imunização e após três semanas foram desafiados por
via s.c. na pata traseira direita. As imagens foram feitas quando os animais estavam com
treze semanas de infecção após a imunização.
Controle Lipossomo
EBS Proteolipossomo
Controle Lipossomo
EBS Proteolipossomo
4.7 Avaliação dos efeitos dos diferentes tratamentos na infecção de
macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L.
amazonensis.
Para avaliar um possível efeito dos diferentes tratamentos estudados, na
infecção de macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L.
amazonensis, as células foram estimuladas com 50 µL/mL de lipossomos, 5
µg/mL de EBS
GPI
ou 1 µg/mL de proteolipossomos durante 20 horas e
posteriormente infectadas com o parasita conforme descrito no item 3.18 de
Material e Métodos.
Para comprovar que as células foram eficientemente infectadas com o
parasita, avaliamos a porcentagem de células infectadas após 1 hora de infecção,
tempo necessário para que o macrófago fagocite o parasita. Nas Figuras 15 e
16 podemos observar que não há diferenças significativas na porcentagem de
infecção e nem no número de parasitas por células quando estimuladas com os
diferentes tratamentos e comparadas com as células controles que não
receberam nenhum estímulo.
Na Figura 15, podemos observar significativas diminuições na
porcentagem de macrófagos infectados e estimulados com os diferentes
tratamentos após 24 horas de infecção. Quando fomos analisar os efeitos dos
lipossomos na infecção de macrófagos, observamos que a porcentagem de
infecção foi significativamente menor (cerca de 42%) nas células estimuladas
com lipossomos após 24 horas quando comparadas as células controles que
apresentaram cerca de 70 % de infecção (Figura 15). O mesmo resultado pode
ser observado quando avaliamos o número de amastigotas por células.
0123456789101112
0
15
30
45
60
75
Proteolipossomo
EBS
Lipossomo
controle
Porcentagem de células infectadas (%)
Figura 15. Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de
L. amazonensis. Macrófagos peritoneais
(1x10
6
cel/mL) foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBS
GPI
ou
1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados com amastigotas
na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa úmida a 20,8% O
2
, 5% CO
2
e
N
2
atmosférico durante 1h ou 24h. A porcentagem de células infectadas foi determinada
em lamínulas coradas com Giemsa. Diferenças significativas entre controle, lipossomo,
EBS
GPI
e proteolipossomo após 24 horas de infecção. ***P < 0,001.
1h de infecção
24h de infecção
***
***
***
Macrófagos estimulados com os lipossomos apresentaram uma diminuição
significativa no numero de parasitas por células (cerca de 29 %) após 24 horas
quando comparadas às células controle (Figura 16). Ainda, células estimuladas
com os proteolipossomos (1 µg/mL) também apresentaram uma diminuição
significativa (cerca de 39 %) na porcentagem de infecção quando comparadas as
células controle após 24 horas de infecção (Figura 15), e uma diminuição
significativa (cerca de 32 %) no número de parasitas por células (Figura 16).
Contudo, quando avaliamos o efeito do EBS
GPI
na infecção de macrófagos
peritoneais, observamos uma drástica diminuição (cerca de 99 %) no número de
células infectadas após 24 horas de infecção com o parasita quando comparada
as células controles (Figura 15). Novamente, o mesmo efeito foi observado com
relação ao número de parasita por célula (cerca de 99 %) quando comparado ao
controle (Figura 16).
Estes resultados sugerem que macrófagos, estimulados com lipossomos,
EBS
GPI
ou proteolipossomos durante 20 horas, foram capazes de reduzirem a
porcentagem de infecção e conduzirem a destruição de amastigotas
intracelulares de L. amazonensis pelo macrófago.
Como podemos observar na Figura 17, fotografias das culturas de
macrófagos peritoneais murinos que foram estimuladas com os diferentes
tratamentos e infectadas com amastigotas de L. amazonensis, mostram redução
na porcentagem de células infectadas.
0
5
10
15
20
25
30
ProteolipossomoEBS
Lipossomo
controle
Parasitas por células
Figura 16. Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de
L. amazonensis. Macrófagos peritoneais
(1x10
6
cel/mL) foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBS
GPI
ou
1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados com amastigotas
na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa úmida a 20,8% O
2
, 5% CO
2
e
N
2
atmosférico durante 1h ou 24h. O número de parasitas por célula foi determinado em
lamínulas coradas com Giemsa. Diferenças significativas entre controle, lipossomo,
EBS
GPI
e proteolipossomo após 24 horas de infecção. **P < 0,01. ***P < 0,001.
1h de infecção
24h de infecção
**
***
**
Figura 17. Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais
murinos infectados com amastigotas de
L. amazonensis. (A) Macrófagos
peritoneais (1x10
6
cel/mL) que não receberam nenhum tratamento, e macrófagos
peritoneais (1x10
6
cel/mL) que foram estimulados com (B) 50µL/mL de lipossomos, (C)
5µg/mL de EBS
GPI
ou (D) 1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente
infectados com amastigotas na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa
úmida a 20,8% O
2
, 5% CO
2
e N
2
atmosférico durante 1h ou 24h. (Æ) Macrófago
infectado com o parasita. As lamínulas foram coradas com Giemsa (400x).
A
B
C
D
4.8 Análise da produção de óxido nítrico (NO).
Considerando-se que o NO é uma das principais substâncias envolvidas
nos efeitos leishmanicidas de macrófagos ativados com INF-γ e LPS (Linares et
al., 2000), avaliamos sua produção em macrófagos estimulados com 50 µL/mL
de lipossomos, 5 µg/mL de EBS
GPI
ou 1 µg/mL de proteolipossomos que, como já
observado, reduziram a carga parasitária. Avaliamos a concentração de nitrito no
sobrenadante dessas culturas pelo método de Griess.
Como podemos observar na Figura 18, baixos níveis de nitrito são
produzidos pelas células controles que não receberam nenhum estímulo (0,015
µM). Contudo, quando culturas de macrófagos foram estimuladas com
lipossomos podemos observar um aumento significativo de aproximadamente 46
% na quantidade de nitrito presente no sobrenadante dessas culturas quando
comparado às culturas controles (Figura 18). Culturas de macrófagos
estimuladas com EBS
GPI
apresentaram uma maior produção de nitrito no seu
sobrenadante (0,042 µM) quando comparada as culturas controles (0,015 µM)
(Figura 18). Ainda, culturas estimuladas com os proteolipossomos também
mostraram um aumento significativo na produção de nitrito nos seus
sobrenadantes (cerca de 40 %) quando comparadas às culturas controles
(Figura 18).
O aumento na produção de nitrito (Figura 15) observado nos
sobrenadantes das culturas que foram estimuladas com os diferentes
tratamentos sugere que esses estímulos podem estar ativando as células, o que
pode conduzir a um maior efeito leishmanicida dos macrófagos.
12345678
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Proteolipossomo
EBS
Lipossomo
Controle
Nitrito (µM)
Figura 18. Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais murinos
estimulados com diferentes tratamentos
. Macrófagos peritoneais (1x10
6
cel/mL)
foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBS
GPI
ou 1µg/mL de
proteolipossomos foram mantidos em estufa úmida a 21% O
2
, 5% CO
2
e N
2
atmosférico
durante 20h. Após, o sobrenadante das amostras de células foram utilizados para
análises da concentração de nitrito através do método de Griess conforme item 3.20 de
Materiais e Métodos. Diferenças significativas entre controle, lipossomo, EBS
GPI
e
proteolipossomo. *P < 0,05. ***P < 0,001.
*
***
*
4.9 Análise da viabilidade de macrófagos peritoneais murinos
estimulados com lipossomos, EBS
GPI
e proteolipossomos.
Considerando que o número de macrófagos infectados é reduzido quando
estes foram estimulados com os diferentes tratamentos durante 20 horas
(Figura 15), decidimos avaliar se isto ocorreu devido a uma diminuição do
número de célula nas culturas estimuladas com lipossomos, EBS
GPI
ou
proteolipossomos. Para tanto, utilizamos o ensaio do MTT para analisar a
viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos estimulados com 50 µL/mL de
lipossomos, 5 µg/mL de EBS
GPI
ou 1 µg/mL de proteolipossomos durante 48
horas de estímulo.
As Figuras 19 e 20 mostram que todas as culturas que foram
estimuladas não apresentaram uma menor viabilidade quando comparadas com
as culturas controles que não receberam nenhum estímulo. Como podemos
observar na Figura 20, uma viabilidade significativamente menor foi observada
para as culturas estimuladas com o EBS
GPI
quando comparada com as culturas
controles. Contudo, mesmo apresentando uma menor viabilidade podemos
observar que o tratamento não apresentou um efeito extremo tóxico nessas
culturas. De acordo com esses resultados, podemos sugerir que os lipossomos, o
EBS
GPI
e os proteolipossomos durante o período de estímulo não exerceram um
efeito tóxico nos macrófagos peritoneais murinos.
123456
0,2
0,4
0,6
0,8
ProteolipossomoLipossomo
Controle
Densidade óptica (570nm - 690nm)
Figura 19. Efeitos de diferentes tratamentos na viabilidade de macrófagos
peritoneais murinos.
Macrófagos peritoneais (1x10
6
cel/mL) foram estimulados com
50µL/mL de lipossomos ou 1µg/mL de proteolipossomos e mantidos em estufa úmida a
21% O
2
, 5% CO
2
e N
2
atmosférico durante 48 horas. A viabilidade foi avaliada pelo teste
do MTT conforme descrito no item 3.19 de Material e Métodos.
1,0 1,5
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Controle EBS
Densidade óptica (570 - 690 nm)
Figura 20. Efeitos das proteínas ancoradas por GPI na viabilidade de
macrófagos peritoneais murinos.
Macrófagos peritoneais (2x10
5
cel/100µL) foram
estimulados 5µg/100µL de EBS
GPI
e mantidos em estufa úmida a 21% O
2
, 5% CO
2
e N
2
atmosférico durante 20 horas. Após, o meio de cultura foi retirado e adicionou-se meio
de cultura novo, e as culturas foram mantidas por mais 24 horas em estufa úmida a 21%
O
2
, 5% CO
2
e N
2
atmosférico. A viabilidade foi avaliada pelo teste do MTT conforme
descrito no item 3.19 de Material e Métodos. Diferenças significativas entre controle e
EBS
GPI
. ***P < 0,001.
***
5
5
.
.
D
D
i
i
s
s
c
c
u
u
s
s
s
s
ã
ã
o
o
A membrana plasmática dos parasitas tem um importante papel nos
processos de infecções. As proteínas da superfície celular e/ou glicoproteínas têm
um importante papel estrutural e estão envolvidas em diferentes processos, tais
como adsorção, transporte de nutrientes, reconhecimento celular e escape (De
Souza, 1995). Portanto, proteínas e glicoproteínas da membrana do parasita são
os principais alvos para uma efetiva resposta imune, e por isso, muito utilizadas
na preparação de vacinas. Algumas vacinas são constituídas por patógenos
irradiados ou atenuados quimicamente (Daneshvar et al., 2003). A atenuação da
virulência apresenta certo risco, pois existe a possibilidade dos agentes
patogênicos atenuados sofrerem reativação ou mesmo escapar ao tratamento.
Esses riscos são importantes devido à capacidade que muitos organismos têm de
produzir doenças graves.
Uma alternativa que é empregada com sucesso é o isolamento de
compostos, particularmente proteínas, da membrana de agentes patogênicos e a
sua reconstituição em lipossomos (Daghastanli et al., 2004; Santos et al., 2006;
Jaafari et al., 2007). Por esses processos, tenta-se preservar as características
estruturais desejáveis para sua antigenicidade, sem o perigo da patogenicidade.
Como as técnicas utilizadas para isolar e purificar as proteínas de
membranas são bastante drásticas, podendo causar a desorganização da
estrutura nativa da proteína, a principal preocupação nesses estudos é a de
preservar a estrutura protéica e, consequentemente, a sua função, para que
estas não sejam alteradas ou perdidas, após os procedimentos de solubilização e
purificação (le Maire et al., 2000).
Uma maneira de impedir a desnaturação dessas proteínas é reincorporá-
las em uma estrutura que mimetize a membrana plasmática, um processo
conhecido como reconstituição (Rigaud, 2002). A reconstituição de proteínas de
membrana em lipossomos revelou-se uma alternativa viável para a preparação
de componentes antigênicos visando a indução de imunidade (imunogenicidade)
em animais de experimentação (Leserman, 2004). Além de preservar a estrutura
nativa das proteínas, os lipossomos apresentam a vantagem de conferir
atividade adjuvante nas vacinas contra vários patógenos (Laing et al., 2006;
Daghastanli et al., 2004; Santos et al., 2006).
Como os componentes da membrana da Leishmania estão associados com
a sua patogenicidade, acredita-se que a geração de uma resposta imune contra
esses componentes possa levar ao desenvolvimento de uma imunoprofilaxia
contra a leishmaniose (Sacks & Nobentrauth, 2002). Nesse trabalho nós
utilizamos formas promastigotas de L. amazonensis como fonte de antígenos
para estudos de interações com sistemas miméticos de membranas e para a
preparação de uma possível vacina contra a leishmaniose. Proteínas ancoradas
por GPI da superfície desse parasita são responsáveis por mediar essenciais
interações parasita-hospedeiro, e por essa razão essas proteínas têm sido
amplamente utilizadas como possíveis candidatas à vacina. Há vários trabalhos
na literatura utilizando proteínas ancoradas por GPI, principalmente a gp63 da
superfície de promastigotas de Leishmania, na tentativa de induzir imunidade
contra a leishmaniose utilizando como adjuvante os lipossomos, com altas taxas
de proteção (Jaafari et al., 2006, 2007; Afrin et al., 2002; Bhowmick et al.,
2008). Contudo, a maioria desses autores utiliza a forma recombinante ou
purificada dessa proteína ancorada por GPI da superfície do parasita. Não há
relatos na literatura da utilização de um pool de proteínas ancoradas por GPI de
promastigotas de L. amazonensis incorporadas em lipossomos como um possível
candidato a vacinas. Por essa razão, nós padronizamos uma metodologia rápida
e eficaz para obtenção de proteínas ancoradas por GPI da superfície de formas
promastigotas de L. amazonensis utilizando o detergente não iônico Triton X-
114. Uma vez solubilizadas, fomos verificar a interação dessas proteínas com
sistemas miméticos de membrana e, com isso, verificar se os proteolipossomos
eram capazes de proteger camundongos isogênicos contra a leishmaniose
cutânea experimental.
Para se obter as proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita,
preparações foram solubilizadas em Triton X-114, que tem sido frequentemente
utilizado para obter preparações enriquecidas com proteínas ancoradas por GPI
de homogeinados celulares totais. Uma característica dessas preparações que
utilizam o Triton X-114 é a separação de fases dependente de temperatura, onde
proteínas anfipáticas integrais da membrana e proteínas ancoradas por GPI são
recuperadas na fase detergente enquanto que as proteínas hidrofílicas não
ligadas à membrana são recuperadas na fase aquosa.
Análise por SDS-PAGE das proteínas da membrana do parasita
demonstrou a presença de um limitado número de componentes variando de 20
a 66 KDa (Figura 3). Várias repetições revelaram um padrão bem estabilizado e
reprodutível de obtenção das proteínas ancoradas por GPI. Isto indica a
credibilidade dessa metodologia de separação e sua reprodutibilidade para se
obter especificamente frações ricas em proteínas ancoradas por GPI.
Observamos ainda a presença de proteínas com aproximadamente 65-60, 52 e
50-47 kDa (Figura 3) da superfície do parasita como já descrito por outros
autores (Hernandez et al., 1981; Araújo-Soares et al., 2003; Rojas et al., 2008).
Além disso, proteínas ancoradas por GPI podem ser facilmente
identificadas por tratamentos com PI-PLC, que hidrolisa a ligação fosfodiéster
produzindo diacilglicerol e um fosfato cíclico inositol no motivo glicosil
remanescente da proteína (Cardoso de Almeida & Heise, 1993). Nós utilizamos
PI-PLC de B. thuringiensis para confirmar se essas proteínas solubilizadas da
superfície do parasita eram realmente ancoradas por GPI, e análises por SDS-
PAGE mostraram similares resultados entre as amostras recuperadas da fase rica
em detergente e as amostras tratadas com PI-PLC (Figura 3, colunas d e e,
respectivamente). Esses resultados sugerem perda do motivo lipídico
covalentemente ligado, indicando que essas proteínas são ancoradas na
membrana através de um domínio GPI.
Ainda, o tratamento das frações de membranas com o detergente Triton
X-114 não afetou de forma considerável a capacidade de ligação das proteínas
solubilizadas com os anticorpos gerados contra os determinantes antigênicos de
L. amazonensis (Figura 4, coluna d). Assim, uma vez padronizada a
metodologia de solubilização das proteínas ancoradas por GPI da superfície do
parasita, fomos avaliar a interação dessas proteínas com os sistemas miméticos
de membrana.
Em ordem, para preparar os lipossomos e proteolipossomos, diferentes
proporções molares de diferentes lipídios e 0,0625 mg/mL de proteínas
ancoradas por GPI foram usados (Tabelas I, II, III, IV e V). Lipossomos foram
formados em todas as condições estudadas, mas a incorporação das proteínas só
ocorre na presença do colesterol, alcançando um máximo de incorporação (57 ±
4 %) quando a razão molar DPPC:Colesterol 2,1:1 foi usada. Observamos ainda
que o aumento da concentração de colesterol não aumenta a incorporação das
proteínas nesses sistemas (Figura 5).
O aumento da quantidade de colesterol na mistura também não afetou o
diâmetro hidrodinâmico dos lipossomos, como indicado na Tabela I, III e V.
Contudo, após incorporação das proteínas o diâmetro dos proteolipossomos foi
aproximadamente 2, 3 e até mesmo 5 vezes maior do que os lipossomos
(Tabela I, III e V, respectivamente). A incorporação de proteínas em
sistemas miméticos de membrana depende de muitos fatores, mas
principalmente do tamanho da cadeia hidrocarbônica dos ácidos graxos e do tipo
de cabeça polar dos fosfolipídios componentes dos lipossomos, como descrito
para proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida (Camolezi et
al., 2002; Daghastanli et al., 2004). Contudo, em nosso trabalho observamos
que variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica ou no grupo cabeça polar
dos diferentes fosfolipídios estudados não influenciaram a porcentagem de
incorporação das proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis nesses
sistemas (Tabela III e V).
O SDS-PAGE dos proteolipossomos constituídos de DPPC:Colesterol
revelou uma variedade de proteínas com uma distribuição similar a observada
para as proteínas solubilizadas pelo Triton X-114, indicando uma incorporação
não seletiva das proteínas ancoradas por GPI do parasita nos lipossomos
(Figura 6A, coluna b e c, respectivamente). Nossos resultados indicam que
proteínas ancoradas por GPI do parasita são eficientemente incorporadas em
proteolipossomos contendo diferentes lipídios em associação com o colesterol.
Para caracterizar o grau de incorporação dessas proteínas nos
proteolipossomos, foi feita uma centrifugação em gradiente de densidade de
sacarose e observamos que um pico para o fosfato inorgânico, originado da
hidrólise ácida do lipídio, foi encontrado ao redor de 4 % de sacarose,
correspondente às frações contendo os lipossomos (Figura 7A). Já para o
EBS
GPI
, um pico pode ser observado na faixa de 8-10 % de sacarose (Figura
7B) e finalmente um pico único ao redor 6 % de sacarose para as frações que
continham os proteolipossomos (Figura 7C). Assim, proteolipossomos
mostraram um único perfil simétrico de eluição, como detectado pela estimação
do fosfato e proteínas, indicando uma distribuição notavelmente homogenia do
sistema e uma consistente ausência de outros agregados de lipídios-proteínas.
Além disso, esses sistemas aparecem em baixas densidades provavelmente
devido ao seu conteúdo de colesterol, como já descrito por outros autores (Cevc
& March, 1987). Nossos resultados claramente indicam que o método utilizado
pode conduzir a uma eficiente reconstituição das proteínas em lipossomos.
Algumas proteínas se associam preferencialmente com microdomínios da
membrana plasmática ricos em colesterol, conhecidos como lipid rafts (Almeida
et al., 2005). As proteínas ancoradas por GPI são preferencialmente localizadas
nesses domínios. Denny et al. (2001) demonstraram que essas regiões estão
presentes em Leishmania.
Por essa razão, através de estudos utilizando monocamadas fomos
verificar a influência da fluidez da membrana, associada ao conteúdo de
colesterol, na incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do
parasita. Para isso, utilizamos monocamadas de Langmuir constituídas da
mistura lipídica DPPC:Colesterol em diferentes razões molares (2,1:1, 1,5:1,
1,2:1 e 0,9:1). Como mostra a Figura 8, isotermas obtidas para monocamadas
constituídas por somente DPPC apresentaram uma típica transição de fase (LE
para LC) representada por um platô ao redor de 10 mN/m e uma área limitante
ao redor de 60 Å
2
. Essa área, relativamente menor do que a descrita por outros
autores, pode ser atribuída à composição do tampão presente na subfase. Ainda,
essa transição de fase observada para as monocamadas de DPPC foi eliminada
na presença do colesterol. Essa observação é amplamente atestada na literatura
para outras composições derivadas de fosfatidilcolina e colesterol (Dynarowicz-
£atka & Hac-Wydro, 2004; Chapman et al., 1969
). Esse efeito do colesterol na
pressão superficial é provavelmente uma conseqüência do maior caráter anfifílico
do colesterol comparado com o DPPC.
Alterações na área molecular mostrada na Figura 8, onde observamos
que a área mínima para a monocamada de DPPC puro (60 Å
2
) diminui para 50 e
43 Å
2
quando utilizamos monocamadas mistas de DPPC:Colesterol nas razões
molares 1,5:1 e 0,9:1 respectivamente, denotam alterações na fluidez
promovida pela presença do colesterol, uma vez que maiores conteúdos de
esteróis resultam em uma monocamada mais condensada.
A cinética da penetração da proteína nas monocamadas constituídas de
DPPC puro e na presença de diferentes proporções de DPPC:Colesterol, mostrou
mudanças na pressão superficial após injeção das proteínas ancoradas por GPI
(Figura 9). A injeção de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em
monocamadas constituídas por somente DPPC causa um rápido aumento na
pressão superficial, que permaneceu constante por quase 8 minutos, ao redor de
42 mN/m. Após esse tempo, a pressão superficial diminui exponencialmente,
alcançando valores mais baixos que os iniciais.
Essa seqüência de rápido aumento, seguida por uma contínua diminuição
na pressão superficial já foi relatada na literatura para adsorção da fosfatase
alcalina, que também é ancorada por GPI, em um fosfolipídio carregado
negativamente em altas pressões superficiais (Caseli et al., 2003). Entretanto,
neste caso, a mudança resultante na pressão superficial, (∆
π = π
eq
- π
in
) foi
quase zero, que é interpretada por outros autores (Ronzon et al., 2002) como a
ausência da penetração da proteína dentro da monocamada em elevadas
pressões superficiais. Por outro lado, Caseli et al. (2008) concluiu que a adsorção
da enzima fosfatase alcalina tem um comportamento semelhante a um pistão.
Após que, o motivo polipeptídio da proteína se organiza na subfase, mantendo
somente a ancora GPI na interface, causa a diminuição observada na pressão
superficial.
Contudo, com base nos resultados obtidos, nós podemos afirmar que a
interação das proteínas ancoradas por GPI com monocamadas constituídas de
somente DPPC ocorre pelo menos em dois passos: primeiro, a rápida penetração
da proteína, devido à diluição/precipitação, a qual causa uma transiente
reorientação das cadeias hidrofóbicas do fosfolipídio; o segundo passo, contudo,
difere do observado por Caseli et al. (2008), já que o equilíbrio da pressão
superficial é menor do que o medido para monocamadas contendo somente
DPPC. Há duas possibilidades para explicar esse resultado: a proteína é de fato
pelo menos parcialmente incorporada causando uma expansão da monocamada,
aumentando a fluidez e diminuindo a pressão superficial ou, por outro lado, há
também a possibilidade que algumas moléculas de fosfolipídios serem removidas
da monocamada e solubilizadas em uma grande fase pela interação com a
âncora da proteína. Esta segunda explicação é corroborada com a não formação
dos proteolipossomos quando utilizamos os lipossomos constituídos por somente
DPPC (Tabela I).
Ainda, a Figura 9 mostrou a incorporação das proteínas em
monocamadas mistas de DPPC:Colesterol e observamos que quando a proporção
molar 1,5:1 de DPPC:Colesterol foi usada, após 1 minuto da injeção da proteína
o aumento na pressão superficial ocorreu em passos ou escadas (durante 30
segundos), permanecendo constante por aproximadamente 30 minutos, ao redor
de 47 mN/m (Figura 9). Estágios iniciais da adsorção, na qual nós observamos
algumas oscilações nos valores da pressão superficial, são provavelmente devido
ao processo de reorganização das proteínas ancoradas na interface. Embora
esses platôs possam estar associados a reorientações ou mudanças
conformacionais das proteínas, isto não é comum e provavelmente pode ser que
eles estejam associados com a adsorção de diferentes frações de proteínas, de
acordo com seus pesos moleculares.
Por outro lado, observamos um retardo no aumento da pressão superficial
e um único passo após injeção da proteína, que permaneceu constante logo após
40 segundo ao redor de 40 mN/m, quando uma razão molar de 0,9:1
DPPC:Colesterol foi usada. Contudo, a pressão superficial para as monocamadas
mistas não diminui após 40 minutos comparada a monocamada com somente
DPPC. Nós podemos concluir, baseado nos efeitos do colesterol, que a
penetração inicial das proteínas ancoradas por GPI nas monocamadas mistas é
facilitada em monocamadas mais condensada (alto conteúdo de colesterol)
implicando em um retardo no tempo de adsorção. Isso já foi anteriormente
relatado que polipeptídios não ancorados interagem unicamente com os grupos
cabeças polares dos lipídios através de interações eletrostáticas e sem
penetração na monocamada, não afetando a pressão superficial (Demel et al.,
1973). Entretanto, a mudança na área por molécula de fosfolipídio observada
para DPPC:Colesterol e DPPC:Colesterol:Proteína ancorada (Figura 8 e 9,
respectivamente) sugerem que o empacotamento molecular do DPPC em altas
densidades superficiais é influenciada pela presença do colesterol e permite a
inserção das GPIs e estabilização.
As diferenças observadas para os efeitos do aumento da concentração do
colesterol nas isotermas das monocamadas de DPPC:Colesterol (Figura 8),
reforçam a importância da âncora GPI para a adsorção da proteína nas
monocamadas de fosfolipídios. Realmente, grandes mudanças na pressão
superficial são esperadas ocorrerem para macromoléculas hidrofílicas como é o
caso quando a âncora de GPI é removida (Caseli et al., 2003), confirmando que
a ausência do motivo diacilglicerol na proteína resulta em uma menor atividade
superficial. A presença da âncora hidrofóbica é aparentemente envolvida no
empacotamento das moléculas de fosfolipídios, e este processo é dependente do
estado da monocamada e da presença de uma apropriada composição para
permitir a adsorção da GPI e estabilização.
Após caracterização dos proteolipossomos e avaliações das interações das
proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita com monocamadas, fomos
avaliar a atividade protetora desses sistemas de proteolipossomos. Para isso
camundongos da linhagem suscetível BALB/c foram imunizados através da via
i.p. com tampão, lipossomos, EBS
GPI
e proteolipossomos e após três semanas da
imunização eles foram desafiados por via s.c. com 10
4
formas promastigotas de
L. amazonensis e acompanhamos semanalmente o desenvolvimento das lesões
características da leishmaniose cutânea experimental.
Como observamos na Figura 10, camundongos que foram imunizados
com lipossomos apresentaram proteção por aproximadamente 15 semanas
quando comparado ao grupo imunizado com o tampão, contudo, a partir da 16ª
semana essa proteção foi diminuída até se tornar insignificante no final do
experimento. Ainda, os animais que receberam 5, 10 ou 20 µg de
proteolipossomos tiveram um comportamento semelhante ao observado para o
grupo que foi imunizado com os lipossomos. Novamente, os animais que
receberam os proteolipossomos com as diferentes concentrações apresentaram
proteção até aproximadamente a 12ª semana quando a partir daí, essa proteção
foi diminuindo até se tornar insignificante no final do experimento (Figuras 10,
11 e 12). Para tentar melhorar essa proteção conferida pelos proteolipossomos,
nós decidimos aumentar a concentração dos proteolipossomos.
Embora lipossomos vazios apresentarem uma parcial proteção em
camundongos imunizados com esse sistema, essa proteção foi significativamente
menor quando comparado aos grupos de animais que foram imunizados com 5
µg de EBS
GPI
e 40 µg de proteolipossomos (Figura 13). Contudo, não
observamos um aumento significativo da capacidade adjuvante dos
proteolipossomos, uma vez que, como observado na Figura 13, animais
imunizados com o EBS
GPI
apresentaram uma maior proteção (cerca de 60 %) do
que a encontrada para animais imunizados com os proteolipossomos (cerca de
50 %).
Segundo alguns autores, antígenos sozinhos são geralmente fracos
imunógenos e requerem um adjuvante para induzir imunidade protetora. A
qualidade da resposta imune gerada, contudo, depende da ação combinada do
antígeno e da natureza física dos lipossomos (Felnerova et al., 2004; Bhowmick
et al., 2007). Vários trabalhos na literatura mostram significativos níveis de
proteção à leishmaniose utilizando proteínas da superfície de Leishmania
associadas com adjuvantes, tais como os lipossomos. Uma proteína bastante
estudada como um possível alvo para vacinas é a gp63, que está envolvida em
vários eventos relacionados com a interação parasita-hospedeiro. Segundo
Jaafari et al. (2006), o crescimento da pata de camundongos BALB/c imunizados
com a gp63 recombinante (rgp63) associada a lipossomos, diminuiu
significativamente após desafio com promastigotas de L. major. Por outro lado, o
crescimento da pata diminuiu parcialmente em camundongos imunizados com a
rgp63 sozinha.
Imunizações de camundongos BALB/c utilizando a proteína nativa gp63
purificada e incorporada em lipossomos protegeram significativamente todos os
animais contra infecções progressivas com L. donovani (Bhowmick et al., 2008).
Contudo, resultados conflitantes foram relatados em modelos experimentais
usando a gp63 purificada e diferentes adjuvantes (Rivier et al., 1999).
Antígenos solúveis totais de formas promastigotas de Leishmania
associados a lipossomos também estão sendo usados para imunizar
camundongos, alcançando altos níveis de proteção (70 - 87 %) contra infecções
com o parasita (Afrin et al., 2002; Afrin & Ali, 1997; Bhowmick et al., 2007;
Mazumdar et al., 2004). Por outro lado, em estudos realizados por Gurunathan
et al. (1998), vacinação de camundongos BALB/c com antígenos solúveis e LACK
recombinante mais a IL-12 recombinante, falharam em controlar a infecção
quando os animais foram desafiados com L. major 12 semanas após imunização.
Similarmente, proteção por longo tempo contra leishmaniose cutânea não foi
demonstrada em camundongos C57BL/6 quando estes foram imunizados com
antígenos do parasita e IL-12 recombinante (Méndez et al., 2001).
Como podemos observar há muitos trabalhos utilizando proteínas da
superfície do parasita associadas a lipossomos, com altas taxas de proteção.
Contudo, não há dados na literatura relacionados à proteção de camundongos
suscetíveis utilizando um pool de proteínas ancoradas por GPI da superfície de
promastigotas de L. amazonensis associadas a lipossomos constituídos por
DPPC:Colesterol, como utilizado em nosso trabalho.
Ainda, as proteínas ancoradas por GPI utilizadas em nossos estudos,
mostraram ser fortes imunógenos e induziram parcial proteção (60 %) na
ausência do adjuvante em camundongos imunizados e posteriormente desafiados
com o parasita (Figura 13). Resultados similares a esse também já foram
observados por outros autores. Jaafari et al. (2006) mostraram que rgp63
sozinha em PBS sem nenhum imunoadjuvante pode induzir uma resposta
positiva em camundongos vacinados e proteger parcialmente contra
promastigotas de L. major. Também, antígenos solúveis na ausência de
adjuvantes foram imunogênicos, resultando em uma proteção parcial, sugerindo
que estas moléculas podem ter uma inerente atividade adjuvante (Afrin & Ali,
1997; Ali & Afrin, 1997). Nesses trabalhos o nível de proteção é aumentado
quando essas proteínas são incorporadas a lipossomos, contudo, isso não foi
observado em nossos resultados (Figura 13).
Bhowmick et al. (2007) também observaram que a capacidade
imunopotencializadora de lipossomos neutros pareceu baixa, uma vez que eles
não mostraram impacto na atividade protetora de antígenos solúveis de L.
donovani sozinhos. Esses autores observaram que esses antígenos solúveis
sozinhos, parcialmente protetores, induzem significativos e comparáveis níveis
de IL-12 assim como antígenos solúveis incorporados em lipossomos carregados
positivamente, o que é bastante interessante uma vez que a IL-12 pode
promover o desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1 (Sypek et al.,
1993; Heinzel et al., 1993), sugerindo o potencial desses antígenos solúveis
sozinhos como um possível imunoterapêutico contra leishmaniose visceral.
Segundo Melby et al. (1998) e Armijos et al. (1998), o sucesso da
vacinação em humanos e animais é frequentemente relacionado a antígenos que
induzem uma resposta DTH (Hipersensibilidade do Tipo Tardia) in vivo, e
estimulação de células T com mitógenos e antígenos in vitro. Baixos, mas
significativos níveis de DTH foram observados por Mazumdar et al. (2004) em
animais imunizados com antígenos sozinhos, sugerindo uma correlação entre
resposta imune mediada por células, e imunidade à infecção neste modelo.
Ainda, esses mesmos autores observaram que camundongos BABL/c imunizados
com antígenos encapsulados apresentaram uma resposta IgG específica ao
antígeno. Contudo, essas respostas IgG parecem estar ausentes em outros
animais incluindo aqueles imunizados com antígenos sozinhos.
Em conclusão, nós demonstramos que tanto o EBS
GPI
quanto os
proteolipossomos foram capazes de proteger parcialmente camundongos BALB/c
contra infecção com L. amazonensis. Contudo, imunizações com maiores
concentrações de EBS
GPI
e proteolipossomos, e avaliações para verificar o tipo da
resposta imune gerada nesses camundongos imunizados são necessárias.
Ainda, para verificar se os mecanismos utilizados pelos macrófagos para
matar o parasita intracelularmente in vivo são induzidos pelas imunizações,
culturas de macrófagos peritoneais de animais sadios foram estimuladas com os
lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos e posteriormente infectadas com formas
amastigotas de L. amazonensis, e a porcentagem de infecção, o número de
parasita por célula e a produção de nitrito foram avaliados.
A porcentagem de infecção e o número de parasitas intracelulares nas
culturas de macrófagos peritoneais que foram estimuladas por 20 horas com
lipossomos, 5 µg/mL de EBS
GPI
ou 1 µg/mL de proteolipossomos foram
semelhantes após 1 hora de infecção com o parasita quando comparados as
culturas de macrófagos que não foram estimuladas (controle). Esses resultados
indicam claramente que os estímulos não impediram a entrada e a presença
inicial dos parasitas nos macrófagos (Figura 15 e 16). Entretanto, após 24
horas de infecção os macrófagos imunizados com os diferentes tratamentos
apresentaram significativamente menores porcentagens de infecção e menores
números de parasitas por células comparadas às culturas controles, que
apresentaram uma elevada multiplicação dos parasitas após 24 horas de infecção
(Figura 16). Ainda, observamos que as culturas estimuladas com o EBS
GPI
apresentaram uma significativa diminuição de aproximadamente 99 % de células
infectadas (Figura 15).
A habilidade do EBS
GPI
e dos proteolipossomos em ativar macrófagos
peritoneais para impedir a multiplicação das amastigotas intracelulares foi
confirmada pelos significativos aumentos na produção de NO, avaliados nos
sobrenadantes dessas culturas após 20 horas de estímulos comparados as
culturas controles (Figura 18). Observamos ainda uma maior produção de NO
nas culturas estimuladas com o EBS
GPI
quando comparadas às culturas
estimuladas com os proteolipossomos, corroborando com os resultados acima
obtidos, uma vez que culturas estimuladas com o EBS
GPI
apresentaram uma
maior diminuição da infecção (Figura 15).
A maior produção de NO nessas culturas estimuladas indica uma super-
regulação da iNOS por citocinas associadas as células Th1 e confirma que os
mecanismos efetores mediados por NO dos macrófagos é critico para controlar a
replicação do parasita em camundongos (Murray & Nathan, 1999).
Diminuição no número de parasitas intracelulares e aumentos nos níveis
de NO também foi observada por Mazumdar et al. (2004). Culturas de
macrófagos peritoneais de camundongos vacinados, que foram estimuladas por
antígenos livres de L. donovani e antígenos incorporados em lipossomos
constituídos por DSPC, apresentaram significativas diminuições no número de
parasitas por células, contudo, neste caso culturas que foram estimuladas com
os antígenos incorporados em lipossomos apresentaram uma maior diminuição
no número de parasitas por células quando comparadas às culturas estimuladas
com antígenos livres. Ainda, maiores níveis de NO também foram observados
nas culturas estimuladas com os antígenos incorporados em lipossomos por 72
horas. Também, Afrin et al. (2002) observaram que estimulações com gp63
livres ou incorporadas em lipossomos ativam macrófagos peritoneais impedindo
assim a multiplicação de amastigotas de L. donovani in vitro. A atividade
leishmanicida dos macrófagos estimulados com os lipossomos associados a gp63
foi significativamente maior quando comparada à atividade dos macrófagos
estimulados com a gp63 livre.
Para avaliar se a redução na infecção observada durante o estímulo com
os lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos não está relacionada a uma menor
viabilidade de macrófagos, realizamos o teste do MTT. Esse teste tem muitas
vantagens, como, por exemplo, é rápido, podem-se analisar muitas amostras de
uma só vez e o substrato não interfere na medida do produto. Segundo
Mosmann (1983) através do teste do MTT é possível diferenciar células vivas de
células mortas sendo de ampla aplicabilidade para medidas de sobrevivência e
proliferação de várias células. Nossos resultados mostram que macrófagos
peritoneais não apresentaram grandes diferenças significativas na viabilidade
celular quando estimulados com os diferentes tratamentos quando comparado às
culturas controles (Figura 19 e 20). Assim podemos sugerir que a redução na
infecção não está relacionada à morte de macrófagos provocada pelos diferentes
estímulos.
Os dados do presente trabalho mostram que o estímulo com os
lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos não afetou a fagocitose de amastigotas
de L. amazonensis pelos macrófagos (Figura 15 e 16), mas induz culturas de
macrófagos a inibir o crescimento e/ou induzem morte intracelular do parasita
(Figura 16). Podemos sugerir assim que macrófagos são ativados/estimulados
com os diferentes tratamentos.
6
6
.
.
C
C
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n
c
c
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e
e
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1. As proteínas ancoradas por GPI da superfície de formas promastigotas de
L. amazonensis foram eficientemente solubilizadas após tratamento com
Triton X-114.
2. As proteínas ancoradas por GPI isoladas da superfície do parasita
mostraram um limitado número de componentes variando de 20 a 66 KDa,
com uma maior intensidade das bandas entre 65-45 KDa
aproximadamente.
3. Lipossomos foram formados em todas as condições estudadas, contudo a
incorporação das proteínas ancoradas por GPI, formando os
proteolipossomos, só ocorre na presença do colesterol.
4. Lipossomos constituídos por lipídios com diferentes tamanhos da cadeia
hidrocarbônica dos ácidos graxos ou diferentes grupos cabeça polares, na
presença do colesterol, foram igualmente eficazes no processo de
incorporação das proteínas ancoradas por GPI do parasita.
5. Estudos em monocamadas de Langmuir indicam que a presença do
colesterol facilita a adsorção das proteínas ancoradas por GPI em
lipossomos, e que uma apropriada proporção lipídica (DPPC:Colesterol na
razão molar 1,5:1) é necessária para a inserção dessas proteínas e
subseqüente estabilização.
6. Camundongos da linhagem BALB/c imunizados com 40 µg de proteínas
ancoradas por GPI incorporadas nos proteolipossomos mostram proteção
parcial (cerca de 50 %) após o desafio com 10
4
formas promastigotas de
L. amazonensis por aproximadamente 14 semanas.
7. As proteínas antigênicas ancoradas por GPI da superfície do parasita
sozinhas (5 µg de proteínas ancoradas por GPI totais) apresentaram uma
maior capacidade de induzir proteção parcial (cerca de 60 %) em
camundongos da linhagem BALB/c, após o desafio com 10
4
formas
promastigotas de L. amazonensis por aproximadamente 14 semanas.
8. Estudos in vitro mostram que culturas de macrófagos peritoneais murinos
estimulados com lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos reduzem a
porcentagem de infecção (42, 39 e 99%, respectivamente) e o número de
amastigotas intracelulares de L. amazonensis (29, 32 e 99%,
respectivamente). Essa redução não está relacionada à morte de
macrófagos, mas provavelmente a capacidade destas células de eliminar o
parasita diante do estímulo.
9. A maior produção de NO nas culturas de macrófagos peritoneais murinos
indica que essas células são ativadas pelos diferentes tratamentos
(lipossomos, EBS
GPI
ou proteolipossomos) para matar o parasita
intracelular.
7
7
.
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R
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Ms. No.: JCIS-08-2206R1
Title: Incorporation of antigenic GPI-proteins from Leishmania amazonensis
to membrane mimetic systems: influence of DPPC/cholesterol ratio
Corresponding Author: Professor Pietro Ciancaglini
Authors: Marcelle C Colhone, MS; Thatyane M Nobre, PhD; Maria Elisabete D
Zaniquelli, PhD; Rodrigo G Stabeli, PhD;
Dear Professor Ciancaglini,
I am pleased to inform you that your manuscript referenced above has been
accepted for Publication in the Journal of Colloid & Interface Science.
Proofs of the article will be sent to you in the near future.
Many thanks for submitting your manuscript to the Journal of Colloid &
Interface Science. We hope that you have been pleased with the handling of
your manuscript, and that you will consider submitting other quality
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support contact details should you need any further assistance from one of
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With kind regards,
Catherine Wilson
Journal Managers
Journal of Colloid and Interface Science
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Elsevier
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San Diego, CA 92101-4495
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Fax: (619) 699-6855
E-mail: [email protected]
ARTICLE IN PRESS
UNCORRECTED PROOF
Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.1 (1-7)
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Incorporation of antigenic GPI-proteins from Leishmania amazonensis to membrane
mimetic systems: Influence of DPPC/cholesterol ratio
Marcelle C. Colhone
a
, Thatyane M. Nobre
b,c
, Maria Elisabete D. Zaniquelli
b
,RodrigoG.Stabeli
d
,
Pietro Ciancaglini
b,∗
a
Depto Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP), 14049-900, São Paulo, Brazil
b
Depto Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP), Universidade de São Paulo (USP), 14040-901, São Paulo, Brazil
c
Instituto de Física de São Carlos (IFSC), Universidade de São Paulo (USP), São Carlos-SP, Brazil
d
Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Rondônia (UNIR) and Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais – IPEPATRO, Rondônia, Brazil
article info abstract
Article history:
Received 12 December 2008
Accepted 16 January 2009
Available online xxxx
Keywords:
Leishmania amazonensis
DPPC
Cholesterol
GPI-proteins
Lipids
Proteoliposomes
The reconstitution of membrane proteins into liposomes is a useful tool to prepare antigenic components
that induce immunity. We have investigated the influence of the dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC)/cholesterol molar ratio on the incorporation of a GPI-protein from Leishmania amazonensis
on liposomes and Langmuir monolayers. The latter system is a well behaved and practical model,
for understanding the effect of variables such as surface composition and lipid packing on protein
incorporation. We have found that the DPPC/cholesterol molar ratio significantly alters the incorporation
of the GPI-protein. In the absence of cholesterol, reconstitution is more difficult and proteoliposomes
cannot be prepared, which we correlated with disruption of the DPPC layer. Our results provide important
information that could be employed in the development of a vaccine system for this disease or be used
to produce other GPI-systems for biotechnological application.
© 2009 Published by Elsevier Inc.
1. Introduction
The cell surface of all trypanosomatids, including the Leishma-
nia species, are dominated by (GPI)-anchored proteins localized
on the outer layer of the plasma membrane. These proteins form
protective surface coatings and mediate essential host-parasite in-
teractions, forming an effective macromolecular diffusion barrier
that protects the promastigotes from microbicidal processes such
as complement-mediated lysis, and attack by oxygen radicals and
hydrolases in the mammalian and insect host environments [1,2].
GPI-anchored proteins are a diverse set of (glyco)lipid-linked cell-
surface, exoplasmic eukaryotic proteins [3].Theyarebelievedto
be clustered in membrane microdomains generally called rafts [4],
in association with glycosphingolipids, sphingomyelin, cholesterol,
and other signaling proteins. However, some authors state that
they are diffusely distributed on the cell surface, thus belying the
existence of rafts [3,5–8]. Whichever their distribution, the GPI
anchor is covalently attached to the C-termini of proteins and con-
sists of a glycan chain bound to phosphatidylinositol with two acyl
chains anchored into the membrane bilayer.
*
Corresponding author. Fax: +55 16 36024838.
Some recent studies have reported the interaction between a
GPI-enzyme (alkaline phosphatase as only one protein component)
with a liposome system [9] and Langmuir monolayers [10,11],re-
vealing that lipid composition is an important choice in protein
reconstitution. There are very few results concerning the nature
of the interaction involving GPI-anchored proteins from Leishmania
with biomimetic membrane systems.
Lipid bilayers, vesicles, and Langmuir monolayers are the most
commonly employed biomimetic systems. Each of them has spe-
cific advantages, depending on the aspect or application of inter-
est [12–15]. Liposomes and bilayer vesicles encapsulating aqueous
contents have been used as delivery systems for drugs, peptides,
proteins, and DNA [16].
The reconstitution of membrane proteins into liposomes has
been shown to be a useful tool for the preparation of antigenic
components that induce immunity in experimental models [17–
20]. Liposomes have been demonstrated to serve as appropriate
antigen carriers for the generation of antibody response in vivo and
as effective vehicles for peptides and proteins, thus enhancing their
immunogenicity [21,22]. In addition, liposomes have adjuvant ac-
tivity in vaccines against protozoan parasites [23–25].
Langmuir monolayers are formed by the spreading of insoluble
amphiphilic molecules, such as lipids, at the air/water interface,
producing monomolecular films that can be compressed by means
of barriers sliding on the interface [26,27]. They constitute half of
0021-9797/$ – see front matter © 2009 Published by Elsevier Inc.
doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
ARTICLE IN PRESS
UNCORRECTED PROOF
Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.2 (1-7)
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a bilayer and can therefore be used as a biomembrane model [12].
This system enables determination of surface densities and surface
packing from the surface pressure (
π)–area (A)curves.
Several substances have influence on the phospholipid packing
and monolayer fluidity, quantified from the 2D isothermal com-
pressibility C
s
, or more often from the interfacial compression
modulus C
−1
s
=−(∂π/∂ ln A)
T
. Therefore, addition of substances
able to simultaneously interact, with the phospholipid and protein
to be immobilized should alter the
π–A curve and thus the mono-
layer fluidity.
The effects of cholesterol on DPPC monolayers have been well
described in the literature. Many authors have described that
the non-ideal behavior is promoted by mutual phospholipid–
cholesterol interactions [28–31]. In this sense, the observed effect
of condensation manifested in the presence of the sterol is at-
tributed by some authors to formation of a complex between the
molecules, or to a peculiar effect of the phospholipid head groups,
which act as “umbrellas” and protect the apolar part of cholesterol
from contact with water [31,32].
In this study, we have obtained GPI-anchored proteins of Leish-
mania amazonensis promastigotes, hereafter called GPI-proteins,
and reconstituted them in liposomes containing different DPPC/
cholesterol ratios. The efficiency of multiple protein incorporation
into liposomes was characterized by isopycnic centrifugation in
sucrose gradient and dynamic light scattering. We also describe
GPI-proteins penetration experiments on mixed DPPC/cholesterol
monolayers at different molar ratios, in order to investigate the
influence of the membrane fluidity on protein incorporation our
results reveal, for the first time, the cholesterol-dependent inser-
tion of a GPI-anchored protein.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals
All solutions were prepared using Millipore DirectQ ultra pure
apyrogenic water. Bovine serum albumin (BSA); 3,3
-diaminobenzi-
dine (DAB); dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC); 1-piperazine-
ethane sulfonic acid; 4-(2-hydroxyethyl)-monosodium salt (HEPES);
phosphate buffered saline (PBS); sodium dodecylsulfate (SDS);
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris); molecular weight mark-
ers (14 to 205 kDa); cholesterol, polyoxyethylene-sorbitan mono-
laurate (Tween 20); Triton X-114; RPMI-1640 and Schneider’s
medium were purchased from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO,
USA). Peroxidase labeled goat anti-mouse IgG conjugate was ac-
quired from Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham,
AL, USA). Biobeads SM2-adsorbent resin was obtained from Bio-
Rad (Hercules, CA, USA). All other reagents, salts, and solvents,
grade p.a. from known suppliers, were used. RPMI-1640 medium
was supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum
(Cultilab, Brazil), 20 mM HEPES, 0.5 μg mL
−1
gentamicin, and
0.2 μg mL
−1
sodium bicarbonate.
2.2. Mice and parasites
Female BALB/c mice, 8–12 weeks old, were bred and main-
tained under standard conditions in the animal facility at the
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo. The parasite strain IFLA/BR/67/PH8 of L. amazonensis was
maintained in BALB/c [33,34]. The amastigotes were isolated from
footpad lesions of infected mice and transferred to Schneider’s
medium.
2.3. Preparation and solubilization of GPI-anchored protein of
L. amazonensis
L. amazonensis promastigotes were cultured at 26
◦
C in Schnei-
der’s medium containing 10% fetal calf serum (FCS). Promastigotes
were harvested at the early stationary phase (day 4 to 5), at the
peak of their cytolytic activity [35]. Parasites were washed twice
with 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.25 containing 10 mM NaCl,
and 2 mM CaCl
2
. Pellets obtained by centrifugation at 1200g for
15 min, were kept at
−20
◦
C until required.
The frozen promastigote pellets were resuspended in the same
buffer and sonicated at 4
◦
Cduring30sat240W,centrifuged
at 1000g for sedimentation of organelles, nuclei and intact cells,
which were discarded. Membrane fractions were isolated after
supernatant ultracentrifugation at 100
,000g for 1 h at 4
◦
C. The re-
suspended pellet was ultracentrifugated again, in the same condi-
tions above. Samples of membrane fraction proteins (0.5 mg mL
−1
)
were solubilized in 1% Triton X-114 for 1 h at 4
◦
C, under con-
stant agitation, and vortexed at 10-min intervals [36]. After phase
separation at 20
◦
C, the detergent-rich phase, aqueous phase and
membrane-containing pellet were analyzed by SDS-PAGE and
Western blotting.
2.4. PI-PLC treatment
To confirm the presence of GPI-proteins in the detergent rich
phase, an aliquot of this fraction (0.2 mg mL
−1
of total protein)
was incubated with 0.2 U mL
−1
phosphatidylinositol-specific phos-
pholipase C (PI-PLC from B. thuringiensis) for 1 h, under constant
stirring, at 37
◦
C. Both samples were centrifuged at 100,000g for
20 min, at 4
◦
C. The supernatants were analyzed by SDS-PAGE and
Western blotting.
2.5. Estimation of protein concentration
Protein concentration was estimated in the presence of SDS
2.0% (w/v) by the procedure described by Hartree [37],usingcrys-
tallized BSA as standard. The method described by Read and North-
cote [38], which also uses crystallized BSA as standard, was em-
ployed to estimate protein concentration in the fractions collected
after isopycnic density gradient centrifugation.
2.6. Antiserum preparation
BALB/c mice were infected subcutaneously in the lipid footpad
with 10
6
stationary growth phase L. amazonensis promastigotes.
Two months after infection, the animals were bled, and the serum
against total L. amazonensis antigenic determinants was collected.
In addition, in order to analyze the protein extract of L. ama-
zonensis in the proteoliposome, BALB/c mice were immunized in-
traperitoneally with 40 μg of proteoliposomes, and the serum was
collected 14 weeks after immunization.
2.7. SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting
Determination of the molecular mass of the proteins was
achieved by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), as de-
scribed by Laemmli [39]. Briefly, 5% polyacrylamide was used for
the stacking gel and 10% for the running gel. The gels were silver-
stained for visualizations of the protein band profile. Molecular
weight markers ranged from 10 to 120 kDa. Western blotting was
performed by electrophoretically transferring the protein bands
to a nitrocellulose membrane. The membrane was treated with
blocking buffer (PBS, containing 5% (w/v) nonfat milk and 0.05%
(w/v) Tween 20) for 1 h and probed with antiserum against total
L. amaonensis at a dilution of 1:75 in the blocking buffer overnight.
ARTICLE IN PRESS
UNCORRECTED PROOF
Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.3 (1-7)
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Excess proteins were removed with four 5 min washes, with wash-
ing buffer (PBS, containing 0.05% (v/v) Tween 20). Finally, the
membrane was probed with peroxidase-labeled goat anti-mouse
IgG conjugate at a 1:1000 dilution in the washing buffer. The DAB
substrate was used to reveal protein–antibody interaction.
2.8. Liposome and proteoliposomes preparation
Liposomes and proteoliposomes were prepared with cholesterol
and DPPC at different ratios. The phospholipids and cholesterol in
appropriate proportion (6 mg) were dissolved in 1 mL chloroform,
and dried under nitrogen flow, and the obtained lipid film was
maintained under vacuum for 1 h. Then, 6 mL of a 50 mM Tris-HCl
buffer solution was added to the film. The mixture was incubated
for 1 h at 60
◦
C, above the critical temperature of the lipid, and
vortexed at 10 min intervals. After that, the lipid emulsion was
sonicated, for 2 min at 240 W, by means of a microtip. The ob-
tained mixture was centrifuged at 100
,000g for 20 min at room
temperature, and the pellet was discarded. The supernatant that
corresponds to small unilamellar vesicles was used to obtain the
proteoliposome.
A protein sample obtained from the Triton X-114 rich phase
(0.25 mg of total protein) was treated with 0.07 g mL
−1
Biobeads
hydrophobic resin for 5 h at 4
◦
C, to remove excess detergent.
The resulting sample was then mixed with 4 mL of the previ-
ously obtained liposome. The mixture was incubated overnight at
room temperature. Finally, the resulting solution was centrifuged
at 100
,000g for 1 h. The pellet, constituted by proteoliposomes,
was resuspended in 50 mM Tris-HCl buffer, and the supernatant
was discarded. The phospholipids and cholesterol were quantified
as described by Chen, Toribara and Warner [40], and Higgins [41],
respectively.
After standardization, the usual liposome and proteoliposome
preparations were achieved using a 1.5:1 DPPC/cholesterol molar
ratio. The resulting preparations were employed in the other steps
of this work.
2.9. Isopycnic density gradient centrifugation
A continuous sucrose gradient was prepared (1–15% sucrose in
50 mM Tris-HCl buffer, density ranging from 3.0 to 10.6 g mL
−1
)
using a Gradient Maker (Hoefer Scientific Instruments San Fran-
cisco, CA). Samples of solubilized GPI-anchored protein, liposomes
or proteoliposomes (1 mL) were loaded onto the gradient and cen-
trifuged in a Hitachi P65VT3 vertical rotor, in a Hitachi 55P-72
ultracentrifuge at 180
,000g for 4 h at 4
◦
C. The gradients were
then fractioned into 0.5 mL fractions and analyzed for protein and
inorganic phosphate content, as described by Chen, Toribara and
Warner [40].
2.10. Light scattering of proteoliposomes
The determination of liposome and/or proteoliposome size dis-
tribution was done by dynamic light scattering using a Beckman
Coulter (model N5 submicron particle size analyzer). The sample
was filtered and diluted to an adequate polydispersion index.
2.10.1. Langmuir monolayers:
π–A isotherms and adsorption kinetics
Langmuir monolayers of the DPPC/cholesterol mixtures were
prepared at 24
± 0.5
◦
C, in a Langmuir trough (Insight-Brazil), by
spreadinga1mgmL
−1
lipid solution on a buffer solution (50 mM
Tris-HCl, pH 7.25 containing 10 mM NaCl, and 2 mM CaCl
2
). The
monolayer was compressed up to 30 mN m
−1
. After that, a small
aliquot of protein solution (6.25 μg mL
−1
), previously treated with
Biobeads as described above, was injected into the subphase near
to the interface, and the
π values were monitored as a function of
time.
Fig. 1. Silver-stained SDS-PAGE gel proteins from promastigotes L. amazonensis.
(P) Molecular mass standard proteins in kDa. (a) Membrane fraction from promatig-
ote cells. Aliquots of 0.5 mgmL
−1
of membrane fraction were mixed with Triton
X-114 at 4
◦
C, as described in Section 2: (b) membrane-containing pellet; (c) aque-
ous phase; (d) detergent-rich phase. An aliquot of the detergent-rich phase was
treated with PI-PLC: (e) corresponds to the supernatants after the treatment de-
scribed in Section 2.
3. Results and discussion
3.1. Solubilization of L. amazonensis membrane and identification of
antigenic proteins
To begin the analysis of the surface of the L. amazonensis
promastigote membrane, preparations were solubilized in Tri-
ton X-114, which has been frequently used to obtain prepara-
tions enriched with GPI-anchored proteins from crude cellular
homogenates. This procedure separates the proteins into three
fractions, according to their solubility behavior [36,42].Aftera
temperature-dependent phase separation, amphipathic integral
membrane and GPI-proteins were recovered in the detergent
phase, and the aqueous phase containing non-membrane-bound
hydrophilic components was removed. Analysis by SDS-PAGE of
L. amazonensis membrane proteins demonstrated the presence of
a limited number of components ranging from 20 to 66 kDa
(Fig. 1). Several repeated assays revealed a well-stabilized and
reproducible GPI-anchored protein pattern. This indicates the re-
liability of the separation methodology and its reproducibility to
obtain specific GPI-anchored protein rich fractions with approxi-
mately 65–60, 52, and 50–47 kDa (Fig. 1d) compared with those
previously obtained by other researcher on surface proteins of
Leishmania [43,44]. The maximum recovery of solubilized GPI-
anchored protein was 8% in the detergent-rich phase. The cell
surfaces of all trypanosomatids are dominated by GPI-anchored
protein and/or free GPI glycolipids, which form protective sur-
face coatings and mediate essential host-parasite interaction [2].
Furthermore, GPI-anchored proteins can be easily identified by
treatment with PI-PLC, which hydrolyze the phosphodiester bond,
thus producing diradylglycerol and an inositol cyclic phosphate on
the reminiscent glycosyl moiety of the protein [45]. Therefore, to
confirm that we were recovering GPI-anchored proteins from the
parasite extract, after phase separation at 20
◦
C, the detergent rich
phase was treated (0.2 mg mL
−1
of total protein) with 0.2 U mL
−1
of PI-PLC of the Bacillus thuringiensis, and analysis by SDS-PAGE
showed similar results between the sample of the detergent-rich
phase and the sample treated with PI-PLC (Fig. 1e). This suggests
loss of their covalently bound lipid moiety, indicating that these
proteins were anchored to the membrane domains through the
GPI anchor. Fig. 2 shows the antigenic profiles of the crude ex-
tract and Triton X-114-solubilized protein extract after reaction
with antiserum against total L. amazonensis antigenic determi-
nants.
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Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.4 (1-7)
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23 89
24 90
25 91
26 92
27 93
28 94
29 95
30 96
31 97
32 98
33 99
34 100
35 101
36 102
37 103
38 104
39 105
40 106
41 107
42 108
43 109
44 110
45 111
46 112
47 113
48 114
49 115
50 116
51 117
52 118
53 119
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Fig. 2. Western blotting analysis of proteins from promastigotes L. amazonensis.
(a) Membrane fraction from promatigote cells. Aliquots of 0.5 mg mL
−1
of mem-
brane fraction were mixed with Triton X-114 at 4
◦
C, and carried out as described
in Section 2: (b) membrane-containing pellet; (c) aqueous phase; (d) detergent-rich
phase. An aliquot of the detergent-rich phase was treated with PI-PLC: (e) corre-
sponds to the supernatants after the treatment described in Section 2.
Table 1
Summary of the lipid composition (mol mol
−1
ratio) and average diameters (nm)
of the liposomes and proteoliposomes preparations done as described in Section 2.
Lipid proportions were determined in the initial mixture and in the prepared lipo-
somes. The diameters of the liposome and the proteoliposome were determined in
three different preparations (mean
± SD).
DPPC/cholesterol
ratio (mol mol
−1
)
Diameter (nm)
Liposome Proteoliposome
1:0 99.4 ± 8Notformed
2.14:1 78
.7 ± 12 204 ± 13
1.5:1 71
.8 ± 9178± 21
1.2:1 82
.7 ± 13 224 ± 41
0.9:1 82
.5 ± 11 197 ± 15
3.2. Liposome and proteoliposome preparation and characterization
In order to prepare liposome and proteoliposomes, different
cholesterol/DPPC ratios 0 to 1.1) and 0.0625 mg mL
−1
of Triton
X-114 solubilized GPI-protein extract (Table 1) were used. Lipo-
somes were formed in all the studied conditions, but incorpora-
tion of the GPI-proteins occurs in the presence of cholesterol only,
reaching a maximum of protein adsorption (57
± 9%) when a 2:1
DPPC/cholesterol ratio was employed. The increase in cholesterol
quantities does not increase GPI-protein adsorption.
The increase in the amount of cholesterol does not expres-
sively affect the liposome hydrodynamic diameter, as indicated in
Table 1. However, after GPI-protein adsorption, the diameters of
the proteoliposomes are approximately twofold larger than that
of the liposome (see Table 1). It is noteworthy that pure DPPC
does not form proteoliposomes, demonstrating the importance of
cholesterol in the system. Incorporation of the protein into vesi-
cles depends on the synergic combination of several factors in the
polar head group, the hydrocarbon chains and aqueous environ-
ment [46]. In previous works it was described that the incorpo-
ration of antigenic membrane proteins of Pasteurella multocida in
liposome was dependent on the length of the fatty acid hydrocar-
bon chains and the type of polar head group of the phospholipid
component in the liposomes [9,17]. Both parameters affect the flu-
idity of the liposome system. In addition, SDS-PAGE of proteoli-
posomes revealed a variety of proteins with a distribution similar
to that observed in the Triton X-114-solubilized protein extract of
L. amazonensis, indicating the nonselective incorporation of para-
site proteins into the liposomes (Fig. 3c). Our results suggest that
L. amazonensis GPI-proteins are efficiently incorporated on proteoli-
Fig. 3. (A) Silver-stained SDS-PAGE of proteins from L. amazonensis.(B)Westernblot-
ting analysis of protein extract from L. amazonensis as described in Section 2. Sera
used were collected 14 weeks after the intraperitoneal immunization of mice with
40 μg of total protein present in proteoliposomes. (P) Molecular mass of standard
protein in kDa. (a) Membrane fraction from promatigote cells; (b) Triton X-114-
solubilized proteins extract; and (c) proteins present in the proteoliposome.
Fig. 4. Isopycnic density sucrose gradient centrifugation study. (A) Liposome; (B) Tri-
ton X-114-solubilized protein extract from L. amazonensis; and (C) Proteoliposome.
(
!) Protein, absorbance at 595 nm; (") lipid, absorbance at 820 nm; and (2)per-
cent sucrose.
posomes containing the palmitoyl acyl chain, which is present in
phosphatidylcholine and cholesterol.
To characterize the degree of incorporation of L. amazonensis
GPI-protein into proteoliposomes, an isopycnic density gradient
centrifugation was performed, and the fractions were assayed for
protein and phosphate contents (Fig. 4). A peak for the inorganic
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UNCORRECTED PROOF
Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.5 (1-7)
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24 90
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Fig. 5. Surface pressure–area (π–A) curves for lipid monolayers constituted by: (—) pure DPPC; (- - -) DPPC/cholesterol 1.5:1 molar ratio; and (···) DPPC/cholesterol 1:1 molar
ratio. Insert: C
−1
s
values corresponding to the isotherms. The isotherms were recorded at 24 ± 0.5
◦
C, in a Langmuir monolayer as described in Section 2,byspreadinga
1mgmL
−1
lipid solution on a buffer solution constituted by 50 mM Tris-HCl, pH 7.25 containing 10 mM NaCl, and 2 mM CaCl
2
. The experiments were carried out in
triplicate and the curves represent average values.
phosphate, generated from the acid hydrolysis of the lipids, was
found in the range of 4% sucrose, corresponding to the liposome
fraction (Fig. 4A). As shown in Fig. 4B, analysis of the solubilized
GPI-protein extract revealed the presence of protein in the near
middle region of the gradient (around 8–10% sucrose concentra-
tion). Finally, proteoliposomes showed a single peak at 6% sucrose,
for both the inorganic phosphate and protein, indicating efficient
incorporation during reconstitution of solubilized GPI-protein ex-
tract (Fig. 4C). Our results concerning the use of sucrose density
gradients to characterize protein incorporation on the lipid bi-
layer of liposomes suggest that liposomes reconstituted with DPPC
and cholesterol present a peak of phosphate due to the acid hy-
drolysis of phospholipids. This gives evidence of liposome pop-
ulations distributed in a single peak. Proteoliposomes showed a
single symmetric elution profile, as detected by phosphate and
protein estimation, indicating a remarkably homogeneous distri-
bution of the vesicle population and the consistent absence of
other lipid–protein aggregates. Furthermore, these systems appear
in lower densities probably because of their cholesterol content, as
described by other authors [47]. Our results clearly show that the
method employed here may lead to efficient protein reconstitution.
3.3. Incorporation on Langmuir monolayers
Fig. 5 shows the surface pressure–area isotherms obtained us-
ing pure DPPC and in the presence of different DPPC/cholesterol
molar ratios. The isotherm obtained for pure DPPC displays the
characteristic liquid-expanded (LE) to liquid-condensed (LC) phase
transition represented by a plateau around 10 mN m
−1
and a mini-
mum area, taken as the extrapolation of the more-condensed state
to a nil surface pressure, around 60 Å
2
, in agreement with previ-
ous reports [48]. This area, relatively lower than those described
by several authors, could be attributed to the buffer composi-
tion present in the subphase. The coexistence region between the
liquid-expanded (LE) and liquid-condensed (LC) states observed for
the DPPC monolayer was eliminated in the presence of choles-
terol. This observation is largely attested in the literature even for
other PC derivatives/cholesterol compositions [31,48].Thiseffect
of cholesterol on the surface pressure is probably a consequence
of the highly amphiphilic character of cholesterol compared with
DPPC. The minimum areas observed for DPPC were approximately
60 Å
2
, and for DPPC/cholesterol 1.5:1 and 1:1 molar ratios this
value decreased to 50 and 43 Å
2
, respectively. The insert in Fig. 5
shows that the compressional modulus (C
−1
s
), corresponding to the
isotherms, increases as the cholesterol content in the composition
of the mixed monolayers increases. These results denote alterations
in fluidity promoted by the presence of cholesterol, since higher
contents of the sterol resulted in more condensed monolayers. The
condensing effect of sterols on phospholipid monolayers has long
been known, being attributed by the majority of authors to the for-
mation of stable phospholipids/sterol complexes in the condensed
region, as a consequence of hydrogen bond formation between
both components [49]. These complexes have been intensively in-
vestigated by different morphological techniques such as Brewster
angle microscopy (BAM) and epifluorescence microscopy measure-
ments [50], which resulted in the observation of domains rich in
one of the compounds. These observations could be related with
the ability of the GPI-proteins to incorporate into the mixed mono-
layer, influenced by the alteration in fluidity and domain formation
promoted by cholesterol.
Nonionic surfactants are often used to solubilize GPI-proteins,
and spreading of the protein in a large area/volume ratio causes its
dilution and surface precipitation [14,51].Caselietal.[52] verified
the influence of C
12
E
9
on the surface properties of a GPI-alkaline
phosphatase by measuring surface pressure curves and monolayer
transfer with mass quantification by the quartz crystal microbal-
ance technique. Their results indicated that, in that specific case,
the nonionic surfactant effect could be neglected. Since the pro-
tein/surfactant ratios employed to solubilize the GPI-proteins by
Caseli et al. [10,52] and in the present work were similar, we may
adopt the idea that the influence of the detergent solubilized GPI-
protein is mainly due to the protein itself.
Changes in surface pressure upon injection of the GPI-protein
shown in Fig. 6 represent the kinetics of protein penetration on
the monolayer constituted by DPPC alone and in the presence of
different DPPC/cholesterol ratios. The arrow at 30 mN m
−1
in 10 s
represents the injection point. The lipid Langmuir monolayer was
preformed and compressed up to 30 mN m
−1
. This lipid packing
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Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
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Fig. 6. Kinetics of L. amazonensis GPI-proteinadsorptiononamonolayerat
30 mN m
−1
carried out as described in Section 2. The monolayers were con-
stituted by: (—) pure DPPC; (- - -) DPPC/cholesterol 1.5:1 molar ratio; and (
···)
DPPC/cholesterol 1:1 molar ratio. After stabilization of the surface pressure, a small
aliquot of the GPI-protein solution (6.25 μg mL
−1
), previously treated with Biobeads,
was injected (as indicated by the arrow) onto the subphase near the interface, and
surface pressure was monitored as a function of time. The experiments were carried
out in triplicate and the curves represent average values.
was chosen be cause of the equivalence with the lipid packing in a
biomembrane [53]. It is assumed that the bulk diffusion effects are
the same, since the injection was performed at the same point.
The total volume was also considered the same for the studied
conditions. The injection of GPI-proteins on pure DPPC monolay-
ers, Fig. 6, causes a fast increase in surface pressure, which remains
constant for almost 8 min (around 42 mN m
−1
). After that, the sur-
face pressure decreases exponentially, reaching lower values than
the initial one.
The sequence of fast increase followed by a continuous de-
crease in surface pressure has already been reported in the lit-
erature for the adsorption of an alkaline phosphatase GPI-protein
onto a negatively charged phospholipid at high surface pressure
[10]. However, in that case the resulting change in surface pres-
sure (
π = π
eq
− π
in
), was almost zero, which is interpreted by
other authors [14] as the absence of protein penetration within
the monolayer at elevated surface pressure. On the other hand,
on the basis of results from monolayer transfer and FTIR analysis
Caseli et al. [11], concluded that the enzyme adsorbs in a piston-
like behavior. After that, the polypeptide moiety organizes itself in
the subsurface. This maintains only the GPI-anchor at the interface,
thus leading to the observed decrease in
π.
By revising these papers, we can affirm that the interaction
of the GPI-proteins with pure DPPC monolayer occurs at least
in two steps. Firstly, there is fast penetration due to a dilu-
tion/precipitation, process which causes a transient reorientation of
the phospholipid hydrophobic chains, analogous to the piston-like
behavior. The second step, however, differs from the one observed
by Caseli et al. [11], since the equilibrium surface pressure is lower
than the one measured for the pure DPPC monolayer. One could
explain this result in two ways: either the protein is in fact at
least partially incorporated, causing an expansion of the monolayer
and, increasing its fluidity and decreasing
π, or some phospholipid
molecules are removed from the monolayer and solubilized into
the bulk phase by interaction with the GPI anchor of the protein.
This second explanation is corroborated by the fact that there is
no formation of proteoliposomes with pure DPPC (see Table 1).
Fig. 6 also shows the incorporation of the GPI-proteins on
mixed DPPC/cholesterol monolayers. When a DPPC/cholesterol
1.5:1 molar ratio was used, the increase in surface pressure oc-
curs in steps or jumps (for 30 s) after 1 min of the GPI-protein
infection, and it remains constant at 30 min (around 47 mN m
−1
).
The earlier stages of the adsorption, in which we observe some
oscillation in
π values, are probably due to the reorganization of
the GPI-protein at the interface. Although these plateaus could be
associated with reorientation or changes in protein conformation,
this is not usual. So it is likely that the plateaus are associated
with the adsorption of different GPI-protein fractions, probably ac-
cording to their molecular weights.
On the other hand, when a DPPC/cholesterol 1:1 molar ratio
was employed, the increase in surface pressure occurred in one
step after a delay time of about 20 s, and it remained constant
soon after 40 s (around 40 mN m
−1
). However, contrasting with
the curve obtained for the pure DPPC monolayer, the surface pres-
sure for the mixed monolayers did not fall even after 40 min.Fora
lower cholesterol content in the mixed monolayer (corresponding
to a DPPC/cholesterol molar ratio of 1.5:1), the delay time shifts to
50 s and the equilibrium surface pressure surpasses 45 mN m
−1
.On
the basis of the effect of cholesterol on the equilibrium elastic-
ity or C
−1
s
, one may conclude that the initial penetration of the
GPI protein on the mixed monolayer is facilitated by the more
condensed monolayer (higher cholesterol content), implying in a
lower delay time for adsorption. It has been previously reported
that non-anchored polypeptides interacting solely with the lipid
head groups through electrostatic interactions and without pene-
tration into the monolayer do not affect the surface pressure [54].
However, the shift in area per phospholipid molecule observed for
the DPPC/cholesterol and DPPC/cholesterol/GPI-Protein (Figs. 5 and
6, respectively) suggests that the molecular packing of DPPC at
high phospholipid surface density is influenced by the presence
of cholesterol and allows GPI insertion and stabilization. Therefore,
it is likely that the difference in
π from ∼15 to ∼10 mN m
−1
for
DPPC/cholesterol ratios of 1.5:1 and 1:1 represents the incorpora-
tion of the protein together with an effect of monolayer accom-
modation. In other words, we believe that, although the protein
content is roughly the same in the proteoliposome above a choles-
terol content corresponding to a molar ratio DPPC/cholesterol of
2.1:1, protein arrangement or distribution could be somehow mod-
ified by probably considering the cholesterol-rich domain “rafts”
within the membrane/monolayer.
The differences observed for the effect of increasing choles-
terol concentrations on the surface isotherms of DPPC/cholesterol
mixed monolayers (see Fig. 5) reinforce the importance of the GPI
anchor for protein adsorption on the phospholipid monolayer. In-
deed, large changes in the surface pressure are not expected to
occur for hydrophilic macromolecules, as is the case when GPI
is removed [10]. This confirms that the absence of the diacyl-
glycerol moiety in the protein resulted in lower surface activity.
The hydrophobic anchor is apparently involved in the packing of
the phospholipid molecules, and this process is dependent on the
monolayer state and the presence of an on appropriate composi-
tion to allow GPI adsorption and stabilization.
4. Conclusions
The influence of cholesterol on the adsorption of the GPI-
hydrophobic anchor of the antigenic protein from L. amazonensis
at Langmuir monolayers and liposomes has been studied. Our data
show that cholesterol in liposomes prepared by the mixed system,
DPPC/cholesterol, facilitates the adsorption of GPI-proteins. Our re-
sults also demonstrate that an increase in the cholesterol content
at the liquid–air interface speeds the adsorption of the GPI-protein
and its subsequent stabilization. In conclusion, the GPI-protein ex-
hibits penetration phenomena on DPPC/cholesterol (1.5:1 or 1:1
molar ratio) monolayers, forming mixed monolayers and stable
proteoliposomes.
ARTICLE IN PRESS
UNCORRECTED PROOF
Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043
JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.7 (1-7)
M.C. Colhone et al. / Journal of Colloid and Interface Science ••• (••••) •••–••• 7
1 67
2 68
3 69
4 70
5 71
6 72
7 73
8 74
9 75
10 76
11 77
12 78
13 79
14 80
15 81
16 82
17 83
18 84
19 85
20 86
21 87
22 88
23 89
24 90
25 91
26 92
27 93
28 94
29 95
30 96
31 97
32 98
33 99
34 100
35 101
36 102
37 103
38 104
39 105
40 106
41 107
42 108
43 109
44 110
45 111
46 112
47 113
48 114
49 115
50 116
51 117
52 118
53 119
54 120
55 121
56 122
57 123
58 124
59 125
60 126
61 127
62 128
63 129
64 130
65 131
66 132
Acknowledgments
The authors thank Mrs. Cynthia M. de Campos Prado Manso
and Priscila Cerviglieri for revision of the text. We also thank
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Su-
perior (CAPES), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP), and Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e As-
sistência do Hospital das Clínicas da FMRP-USP (FAEPA) for finan-
cial support. M.C.C. was the recipient of a scholarship from CAPES.
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