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DANIELA SOARES DOS SANTOS
Micropropagação da bromélia ornamental
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch
e a influência do etileno
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na Área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
SÃO PAULO
2009
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DANIELA SOARES DOS SANTOS
Micropropagação da bromélia ornamental
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch
e a influência do etileno
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na Área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
ORIENTADORA: DRA. CATARINA CARVALHO NIEVOLA
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Ficha Catalográfica elaborada pela Seção de Biblioteca do Instituto de Botânica
Santos, Daniela Soares dos
S237m Micropropagação da bromélia ornamental Acanthostachys strobilacea (Schultz F.)
Klotzsch e a influência do etileno / Daniela Soares dos Santos -- São Paulo, 2009.
121 p. il.
Dissertação (Mestrado) -- Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, 2009
Bibliografia.
1. Bromeliaceae. 2. Cultivo in vitro. 3. Gás. I. Título
CDU : 582.564
Dedico,
Aos meus pais João dos Santos Filho e
Sonia Soares dos Santos.
À minha orientadora
Dra. Catarina Carvalho Nievola
Muito obrigada por todos os ensinamentos, dedicação e paciência durante todo o
desenvolvimento do trabalho em especial na finalização dessa dissertação. Desde o
início, na graduação, sempre acreditando em uma capacidade que nem eu mesma
imaginava que existia em mim. Sempre aprendi muito com você, seja como
pesquisadora, professora e principalmente como pessoa, um exemplo de
profissionalismo e seriedade em tudo o que faz.
Que Deus ilumine seu caminho e desejo que a paz, a alegria e o amor sejam
constantes em sua vida.
Agradecimentos
Ao Instituto de Botânica de São Paulo nas pesssoas da Diretora Geral Dra.
Vera Lúcia Ramos Bononi. Ao programa de Pós-Graduação em Biodiversidade
Vegetal e Meio Ambiente nas pessoas da Dra. Solange Cristina Mazzoni Viveiros e
Dra. Sônia M. C. Dietrich, e a todos os docentes e alunos, em especial à secretária
Márcia Regina Angelo, e ao Antonio Aparecido Carlos Borges, sempre dispostos a
auxiliar em todos os momentos.
A Capes por ter concedido a bolsa de estudo, fundamental para a execução do
projeto.
Ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, por ter viabilizado
os estudos com etileno. Em especial à Dra. Maria Aurineide Rodrigues, pelo
acompanhamento nos estudos com etileno, sempre disposta a contribuir com suas
experiências, agradeço pelos ensinamentos e paciência, que mesmo em fase de
finalização de projeto esteve sempre disposta a ajudar.
À Dra. Vivian Tamaki, sempre buscando melhorias no laboratório da Seção de
Ornamentais do Instituto de Botânica, onde desenvolvi a maior parte do trabalho de
mestrado.
À Seção de Anatomia do Instituto de Botânica, em especial à Fernanda
Tresmondi, responsável pelos cortes anatômicos, além da amizade e atenção
dispensada a mim.
À Seção de Sementes do Instituto de Botânica, em especial ao Edmir Vicente
Lamarca, devido ao auxílio na coleta de gases viabilizando a execução de um
capítulo deste trabalho, e também pela amizade durante o curso.
Aos pesquisadores da Seção de Ornamentais Clóvis, Armando, Francismar,
Vanessa, Domingos e Silvia, pelo convívio animado no laboratório. Em especial ao
pesquisador Dr. Shoey Kanashiro por toda a atenção e dedicação em relação aos
diferentes contratempos no laboratório, sempre disposto a ajudar e ensinar.
Aos funcionários da Seção de Ornamentais, Ivomar Aparecido Medina e Luzia
Rodrigues Scarpeta amigos e companheiros do dia-a-dia, dividindo sempre,
principalmente as coletas. Ao Sr. Geraldo sempre disposto a colaborar.
Aos estagiários da Seção de Ornamentais e também os ex-estagiários pelo
convívio e aprendizado constante. Em especial à Luciana Cabral, amiga e
companheira.
À minha grande amiga Cristiane Marinho Guimarães, por sempre me apoiar e
me amparar nos momentos mais difíceis, pela paciência, por me alegrar nos
momentos de tensão, companheira de todas as horas.
Agradeço ao Sr. Walter Pereira, da Rohm and Haas Company, pela doação do
SmartFresh
TM
, o que viabilizou os estudos com etileno.
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................vii
ABSTRACT.............................................................................................................................ix
INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 1
BROMELIACEAE............................................................................................................... 1
CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS DE INTERESSE ECONÔMICO...................... 5
Seleção do explante......................................................................................................... 8
Desinfestação ................................................................................................................. 10
Meio nutritivo ................................................................................................................ 12
Condições de luminosidade.......................................................................................... 16
Vedação dos frascos...................................................................................................... 18
Acúmulo de gases ...................................................................................................... 20
Etileno ..................................................................................................................... 21
Transferência das plantas produzidas in vitro para cultivo em casa de vegetação
.......................................................................................................................................... 22
PROPOSTA PARA A REALIZAÇÃO DESTE TRABALHO .................................... 24
OBJETIVOS ....................................................................................................................... 28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 29
CAPÍTULO 1 - Micropropagação da bromélia ornamental Acanthostachys
strobilacea (Schultz F.) Klotzsch ....................................................................................... 44
RESUMO ............................................................................................................................. 44
ABSTRACT........................................................................................................................ 45
INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 47
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 50
Coleta de sementes ........................................................................................................ 50
Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de sementes ....................................... 52
Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de segmentos nodais ........................ 53
RESULTADOS .................................................................................................................. 54
DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 71
CAPÍTULO 2 - Influência do etileno no alongamento e anatomia de plantas de
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch cultivadas in vitro ......................... 79
RESUMO ............................................................................................................................ 79
ABSTRACT......................................................................................................................... 80
INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 81
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 85
RESULTADOS .................................................................................................................. 87
DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 95
CAPÍTULO 3 - Influência do tipo de vedação dos frascos de cultura no alongamento
de plantas de Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch cultivadas in vitro . 99
RESUMO ............................................................................................................................ 99
ABSTRACT...................................................................................................................... 100
INTRODUÇÃO................................................................................................................ 102
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 105
RESULTADOS ................................................................................................................ 109
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 111
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 115
CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 119
RESUMO
Muitos membros de Bromeliaceae são plantas ornamentais devido à beleza de
suas folhas, brácteas coloridas e flores vistosas. Acanthostachys strobilacea (Schultz
F.) Klotzsch é uma bromélia saxícola ou epífita de ampla distribuição, pertencente à
subfamília Bromelioideae. Devido ao seu valor ornamental, esta espécie tem sido
alvo do extrativismo ilegal o que pode desencadear a redução do número de plantas
dessa espécie na natureza. Existe, portanto, a necessidade de produzir exemplares
dessa espécie, de modo a atender ao mercado de plantas ornamentais e evitar o
interesse por exemplares provenientes do ambiente natural. O cultivo in vitro pode
ser utilizado como uma das etapas para a produção de espécies de importância
econômica, dentre elas, plantas ornamentais potencialmente ameaçadas de extinção.
Adicionalmente, essa técnica tem permitido o desenvolvimento de estudos de
fisiologia por permitir o controle de fatores como fornecimento de luz, nutrientes e
temperatura. Contudo, devido à necessidade dos frascos de cultivo ser mantidos
fechados para evitar a contaminação, existe a possibilidade de que gases produzidos
pelas plantas em cultivo sejam acumulados e interfira no desenvolvimento da planta,
um aspecto pouco abordado. Além da utilização de sementes, é possível, para
algumas espécies, desenvolver a micropropagação utilizando-se outros explantes,
provenientes de plantas mantidas in vitro. Este trabalho apresenta um protocolo para
a produção de mudas de A. strobilacea a partir de sementes e segmentos nodais
obtidos de plantas cultivadas in vitro, além de investigar as razões pelas quais as
plantas dessa espécie apresentam um alongamento do eixo caulinar quando cultivadas
nessa condição. A desinfestação das sementes foi feita com ácido clorídrico a 25 %
seguido de solução comercial de hipoclorito de sódio a 2 %. A composição do meio
nutritivo favorável à obtenção de segmentos nodais como explantes para a produção
de plantas foi o de Murashige & Skoog (MS) contendo os macronutrientes reduzidos
a 1/5, além de 0,20 %
de sacarose, 100 mg L
-1
de myo-inositol e 0,1 mg L
-1
de
tiamina. O pH foi ajustado em 5,8. O meio foi geleificado (6 g L
-
¹ de Agar) e
esterilizado em autoclave por 15 minutos a 121 ºC. Os frascos de cultivo foram
mantidos em sala de crescimento à temperatura de 26 ± 2 °C, fotoperíodo de 12 horas
e irradiância de 40 µmol m
-
² s
-
¹, fornecida por lâmpadas fluorescentes (Osram
®
,
super luz do dia 40 W). Quando frascos de cultura foram colocados nas mesmas
condições, porém sob diferentes intensidades luminosas, verificou-se que na
intensidade luminosa de 14 µM m
-2
s
-1
ocorreu maior alongamento das plantas, em
comparação àquelas mantidas sob intensidades mais altas e, na ausência de
luminosidade. Observou-se que a os segmentos nodais isolados, provenientes da
região mediana e basal do caule, quando transferidos para meio de cultura,
originaram plantas alongadas; os segmentos oriundos da região apical produziram
plantas não alongadas, o que indica uma possível influência do gradiente hormonal
endógeno. Somente as plantas não alongadas sobreviveram após a transferência para
condições ex vitro. No entanto, as plantas que apresentaram o alongamento
constituíram um importante material para fornecer segmentos nodais para a
manutenção da produção de plantas in vitro, viabilizando a formação de clones.
Verificou-se que o alongamento das plantas ocorreu exclusivamente devido a fatores
relacionados ao cultivo in vitro, como o tipo de vedação dos frascos que possibilitava
o acúmulo de gases no interior dos mesmos. As plantas que apresentaram maior
alongamento desenvolveram-se no interior dos frascos vedados com tampas de
plástico envoltas por filme de PVC. O alongamento das plantas foi atribuído ao
efeito do gás etileno que poderia ter-se acumulado no interior dos frascos.
Experimentos realizados com aplicação exógena de etileno e do inibidor de
receptores desse gás 1 – metilcilopropeno (1-MCP) mostraram que esse hormônio
influenciou a anatomia das plantas cultivadas in vitro induzindo o aumento do
diâmetro da célula. Portanto, além do estabelecimento de um protocolo para a
produção de plantas da bromélia ornamental A. strobilacea por meio do cultivo in
vitro de sementes e segmentos nodais, este trabalho verificou aspectos relacionados à
fisiologia dessa espécie. Fatores como a intensidade luminosa, a posição do
segmento nodal no eixo caulinar e acúmulo de etileno no interior dos frascos,
alteraram a morfologia de plantas produzidas in vitro, induzindo um alongamento do
caule, pouco freqüente em plantas cultivadas na presença de luz. Por meio do
protocolo de cultivo in vitro estabelecido neste trabalho foi possível obter-se a partir
de uma única semente, após um ano, cerca de 15.000 plantas cultivadas em vasos. A
possibilidade de utilizar diluições do meio MS, sem reguladores de crescimento
contribui para a redução dos custos de produção, além de minimizar a variação
somaclonal atribuída, em muitas espécies, à utilização desses reguladores. O
estabelecimento do cultivo de espécies ornamentais que são retiradas ilegalmente do
ambiente natural é estratégia importante para sua preservação.
Palavras-chave: Bromeliaceae, cultivo in vitro, gases
ABSTRACT
Many members of the Bromeliaceae are ornamental plants due to the beauty of
their leafs, colored bracts and dashing flowers. Acanthostachys strobilacea (Schultz F.)
Klotzsch is an saxicolous or epiphytic bromeliad of broad distribution, of the
Bromelioideae subfamily. This species have been being target of illegal extrativism,
which can triggers the reduction of number of individuals in nature. There is, hence, the
need of producing clone, in a way to answer the ornamental plants market and to avoid,
with this, the interest for copies from the natural environment. In vitro cultivation can be
used like one of the stages for the economic importance species, among they, potentially
extinction threaten ornamental plants. In addition, this technique has been allowing the
basics physiology studies development because it allows the control of factors like the
light catering, nutrients and the temperature control. Although, the need of keeping the
cultivation bottles up closed to avoid the contamination, there is the possibility that
these gases produced by plants in cultivation be amassed into them influencing on the
plant development. This aspect is little broached. Although the bromeliads cultivation in
vitro establishment from the utilization of seeds be usually, is possible, for some
species, to develop the micropropagation using others explants, from plants which are
kept up in vitro. This work presented a protocol to the Acanthostachys strobilacea
seedling production from the utilization of seeds and nodal segments obtained from
plants which were cultivated in vitro, besides investigating the reasons for this species
plants presents a stem elongation when cultivated in this condition. The seeds
disinfestations was obtained with chloridric acid at 25% followed by sodium
hypochlorite at 2% commercial solution. The nutritive solution composition to the plant
elongation to facilitate the obtaining of nodal segments like explants for the plants
production was the Murashige & Skoog (1962) (MS) one containing the micronutrients
in the original concentration and the macronutrients reduced to 1/5. It was added to
these salts 20 g.L
-1
of saccharose, 100 mg L
-1
of myo-inositol e 0,1 mg L
-1
de thiamine.
The pH was ajusted in 5,8. The environment was gelled (6 g L
-
¹ de Agar) and sterilized
in autoclave for 15 minutes at 121 ºC. The cultivation bottles were kept up in growth
room at 26 ± 2 °C temperature, photoperiod of 12 hours and irradiance of 40 µmol m
-
² s
-
¹, supplied by fluorescent lamps (Osram
®
, super luz do dia 40 W). When cultivation
bottles were put at the same conditions although in different ligh intensities, it was
verified that at the 14 µM m
-2
s
-1
light intensity it was observed a plants large elongation
in comparison to those ones which were kept up under high intensities and, including,
the light absence. It was observed that the explants position which were cultivated
previously in vitro plants stem influenced the elongated plants obtaining. The isolated
nodal segments from the median and basal region of stem, when transferred to the
nutrition solution, originated elongated plants; the segments from the apical region
produced not elongated plants, which indicate a possible endogenous hormonal gradient
influence. Only the not elongated plants survived after its transfer to ex vitro conditions.
However, the plants which presented the elongation became an important material
which, kept up in cultivation, supplied other nodal segments used like explants for the in
vitro plants production maintenance, making possible the formation of clones. It was
verified that the stem elongation occurred exclusively due to factors related to the in
vitro cultivation, like the bottles’ stopping up type which enabled the gas amassing into
them. The plants which presented the large elongation developed it selves into the
plastic lids stopped up bottles wreathed by PVC film in comparison to those ones growth
in bottles with plastic lids, without PVC film. The stem elongation was ascribed to the
ethylene gas effect which it is possible accumulated into the flasks. Experiments where
exogenous application of ethylene and of this gas inhibitor 1– metilcilopropeno (1-
MCP) shown that this hormone influenced the anatomy of the plants which were
cultivated in vitro inducing to a cell diameter increase. Hence, besides the establishment
of a protocol for the ornamental bromeliad plants production, A. strobilacea by seeds
and nodal segments in vitro cultivation, this work verified physiology related aspects of
this species. It was possible to verify that factors like light intensity, the position of the
nodal segment at the stem and the ethylene into the flasks, changed the A. strobilacea
plants produced in vitro morphology, inducing a stem elongation, few frequent in plants
cultivated at the presence of light. Through cultivation in vitro protocol established in
this work, is possible to obtain from only one seed, after one year, about 15.000 A.
strobilacea plants cultivated in flower-pots. The possibility of using nutrition solution
MS dilutions, without growth regulators contributes to the production cost decrease,
besides minimizing the somaclonal variation to take place for many species, to the use
of these regulators. The cultivation establishment of ornamental species that are illegally
taken out from its natural environment is important strategy for its preservation.
Keywords: Bromeliaceae, in vitro culture, gas
1
INTRODUÇÃO GERAL
BROMELIACEAE
Bromeliaceae representa uma das maiores famílias com distribuição neotropical,
compreende 57 gêneros e aproximadamente 3.086 espécies (Luther 2006)
distribuídas
em três subfamílias: Pitcairnioideae, Tillandsioideae e Bromelioideae. Ocupam
ambientes que variam quanto à disponibilidade de água e seus representantes são
encontrados em todos os tipos de vegetação, desde ambientes mesofílicos até xéricos
(Smith & Downs 1974, 1977, 1979), em diferentes altitudes sob intensidades
luminosas variáveis. A família abriga uma grande diversidade de formas de vida,
algumas são terrestres, epífitas dotadas de fitotelmatas (sobreposição de bainhas
foliares nas quais podem ficar retidos água e nutrientes), ou ainda epífitas extremas,
cujas espécies são completamente independentes do solo para nutrição. O sucesso da
transição entre o hábito terrestre para o epífito tem sido relacionado ao surgimento
de tricomas na superfície foliar característico da família aos quais tem se atribuído
função na nutrição (Benzing 2000).
Dada à variedade de ocupação na natureza pelas espécies de bromélias, Benzing
(1980) sugeriu uma classificação ecológica fundamentada no grau de independência
do solo como fornecedor de nutrientes. A subfamília Pticairnoideae, que abrange um
maior número de representantes terrestres, possui raízes cuja função é a de absorver
nutrientes. Membros da subfamília Bromelioideae apresentam características bem
variadas, podendo ser terrestres ou epífitas, sendo a raiz responsável pela absorção
de nutrientes e/ ou fixação. Em Tillandsoideae estão agrupados indivíduos cujas
raízes têm como função principalmente a fixação da planta no substrato, sendo
consideradas espécies mais especializadas.
O surgimento do hábito epífito veio acompanhado do desenvolvimento de
escamas em níveis variáveis de especialização além de uma redução do sistema
radicular. Evolutivamente o ovário tende a ser cada vez mais protegido, resultando
em ovário ínfero nos indivíduos morfologicamente derivados, portanto o
desenvolvimento do fruto leva a uma dispersão das sementes cada vez mais
especializada. Existem dois tipos de frutos na família, o capsular, dotada de muitas
sementes pequenas com presença de apêndices dispersadas pelo vento, e a forma
bacacea, onde as sementes são maiores e produzidas em menor quantidade (Smith &
Downs 1974).
2
Muitas espécies de Bromeliaceae possuem síndrome de dispersão por
endozoocoria, em que o animal ingere o fruto e elimina o diásporo (Dittrich et al.
1999). Faustino e Machado (2006) observaram a ave Schistoclamys ruficapillus
alimentando-se do fruto inteiro da bromélia Hohenbergia ramageana. Outras aves,
como Pipra rubrocapilla (Pipridae) e Tangara faustuosa (Thraupinae) foram
observadas dispersando frutos de Canistrum aurantiacum (Siqueira Filho & Machado
2001). Aechmea nudicaulis também é citada como espécie ornitocórica por
Gonçalves & Waechter (2003). Sementes de Aechmea lindenii são dispersas por
pássaros das famílias Thraupidae e Pipridae, segundo trabalho realizado por Lenzi et
al. (2006).
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch, é uma espécie de ampla
distribuição pertencente à subfamília Bromelioideae. Pode ser encontrada como
saxícola ou epífita, desenvolvendo-se preferencialmente nas bifurcações dos troncos
(Reitz 1983) (Figura 1). Floresce durante a estação seca, período em que poucas
flores, cuja polinização é realizada pelas aves, estão disponíveis no sudeste do Brasil
(Sazima et al. 1995). Seu polinizador fica empoleirado de cabeça para baixo sobre as
longas folhas espinhosas (Sazima & Sazima 1999). As infrutescências formam
grandes bagas e produzem cerca de oito sementes por fruto cuja dispersão destas é
realizada pelas aves (Figueiredo 2003).
Figueiredo (2003), em Minas Gerais, cita que a população desta espécie está
sendo drasticamente reduzida devido à retirada das árvores que servem de suporte
para ela. Outro fator que contribui para esta redução são as características
morfológicas que lhe servem de atributo ornamental sendo alvo de extrativismo
ilegal, contribuindo para a redução dos indivíduos desta bromélia na natureza.
Alguns exemplares têm sido comercializados na Companhia de Entrepostos e
Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP). Segundo Lawn (2008), existe um
crescimento intenso pela procura de espécies que podem ser cultivadas em cestos
suspensos, dentre elas A. strobilacea, provavelmente devido à presença de folhas que
chegam a atingir até 2 m de comprimento (Figura 2).
Pereira (1988) descreveu detalhadamente o estádio de desenvolvimento de planta
normal de A. strobilacea, e constatou que logo no início do desenvolvimento esta
planta apresenta suas duas primeiras folhas elevadas pelo entrenó, o que a distingue
de outras espécies. Existem poucos estudos sobre a multiplicação da espécie.
3
Figura 1. (A) Acanthostachys strobilacea na Reserva Biológica e Estação
Experimental de Mogi-Guaçu, São Paulo. (B) Características morfológicas de A.
strobilacea registradas na prancha 63 da Flora Brasiliensis Vol. III, Part III, Fasc.
112, publicada em 15-Mai-1892. (C) detalhe dos tricomas presentes ao longo da
lâmina foliar (D) inflorescência de A. strobilacea no campo e (E) infrutescência em
diferentes níveis de maturação, (1) imatura, (2) 3 meses depois e (3) 6 meses depois.
4
Figura 2. Utilização de A. strobilacea como planta ornamental, fotos extraídas da internet.
Fonte: (A) http://www.charlies-web.com/bromeliads-alphalist/guestphotos/pix.htm1, (B)
http://fcbs.org/pictures/bscf02.htm, (C) http://www.bromeliads.info/archives/acanthostachys-
bromeliad-plant-species e (D) http://www.toptropicals.com/cgibin/garden_catalog.
5
Apesar de suas características atrativas e de alguns exemplares terem sido
encontrados a venda, não existem relatos da produção dessa espécie voltada a atender
o mercado de plantas ornamentais.
CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS DE INTERESSE ECONÔMICO
Cultivo in vitro é a cultura de células ou órgãos vegetais, em frascos de
cultivo contendo meio nutritivo sob ambiente controlado (Hartmann et al. 2002).
Muitos aspectos da biotecnologia têm levado a um aumento no interesse na pesquisa
do cultivo in vitro de plantas. Micropropagação é uma área em expansão na produção
comercial, pois permite rápida multiplicação de material vegetal geneticamente
idêntico de matrizes selecionadas (Mercier & Kerbauy 1997), atendendo demanda
específica do mercado interno e externo, como por exemplo, época de floração,
coloração, tamanha e forma das flores, número de flores por planta entre outros
aspectos (Kerbauy 1997). Outra vantagem dessa técnica é a produção de plantas livre
de doenças (Mercier & Kerbauy 1997), pois plantas propagadas convencionalmente,
uma vez infectadas por microorganismos endógenos, transmitem os patógenos às
gerações seguintes, resultando em uma diminuição no rendimento das culturas. Por
meio do cultivo in vitro existe a possibilidade do isolamento de regiões livres de
microorganismos, como pequenas porções de tecidos meristemáticos apicais que
podem ser cultivados em escala comercial (Kerbauy 1997).
A micropropagação teve início com a teoria postulada por volta de 1839, por
Schwann e Shleide em que afirmavam que células vegetais são totipotentes (uma
simples célula possui a programação genética necessária para gerar uma planta
inteira), ou seja, podem se desenvolver em um organismo completo. Contudo, apenas
em 1902, Haberlandt cultivou células isoladas de modo a colocar em prática os
conceitos referentes à teoria da totipotencialidade. Ele observou um aumento de
volume celular, porém não verificou a ocorrência de divisão celular. Essas células
sobreviveram por apenas 20 dias (Hartmann et al. 2002).
Algum tempo depois, em 1934, foi mantido por seis meses o crescimento de
cultura de calos de algumas espécies arbóreas em meio nutritivo adicionado de
auxina e agar. Em 1948, foi descoberta a citocinina, que culminou com a descoberta
que o balanço auxina/ citocinina em calo de tabaco poderia induzir a formação de
parte aérea ou raiz (Hartmann et al. 2002).
6
Em 1962, foi estabelecido, por Murashigue & Skoog, o meio nutritivo que seria o
mais usado na cultura de tecidos. Diversos trabalhos foram então realizados de modo
a aperfeiçoar o cultivo e atender necessidades específicas de diversos tipos de tecidos
de espécies variadas. A aplicação das técnicas de micropropagação iniciou-se entre
as décadas de 1960 e 1970, extendendo-se ao desenvolvimento em pequenos
laboratórios comerciais nos Estados Unidos, Europa, Austrália e Ásia sendo
expandido em 1980 (Hartmann et al. 2002).
No Brasil, a aplicação comercial da micropropagação é relativamente recente,
com diversos grupos trabalhando em Instituições públicas de pesquisa e
universidades. Poucas são as empresas que atuam na área. Não é prática comum
instalar laboratórios junto a viveiros, com exceção de algumas empresas produtoras
de orquídeas e outras especializadas em reflorestamento (Grattapaglia & Machado
1998).
A propagação vegetativa in vitro, também denominada de micropropagação
devido ao tamanho dos explantes, é a aplicação prática da cultura de tecidos. De
acordo com Ferri et al. (1969) explante é a estrutura utilizada para propagação ou
multiplicação vegetativa de uma planta. Diversos países do mundo utilizam a técnica
de micropropagação em escala comercial com intuito de acelerar os métodos
convencionais de propagação de espécies de interesse comercial, como as plantas
ornamentais (Grattapaglia & Machado 1998).
As técnicas de cultivo in vitro, também podem ser utilizadas como
instrumento para multiplicação de espécies de plantas ameaçadas, neste sentido,
observa-se um aumento na micropropagação nos últimos anos e é provável que esta
tendência se mantenha uma vez que diversas espécies vêm enfrentando o risco de
extinção (Sarasan et al. 2006).
A micropropagação é realizada em quatro estágios, os quais podem ser
manipulados através da modificação do meio e das condições ambientais. Esses
estágios são: (1) estabelecimento, que envolve a seleção da fonte de explante,
desinfestação, meio de cultura e estabilização; (2) multiplicação, que tem como
propósito multiplicar a quantidade de brotos necessários ao enraizamento, nesse
estágio muitas vezes são utilizados reguladores de crescimento; (3) formação de raiz,
que pode ser realizada tanto em condições in vitro como ex vitro e (4) aclimatização,
esse estágio envolve substituição de uma condição heterotrófica (fornecimento de
açúcar) para outra autotrófica (livre de açúcar) (Hartmann et al. 2002). Entretanto,
existem diferenças nos protocolos de multiplicação estabelecidos para diferentes
7
espécies, que vão depender das peculiaridades do explante bem como da espécie de
interesse (Grattapaglia & Machado 1998).
Diversas espécies ornamentais são multiplicadas via cultura de tecidos, como
Lilium longiflorum cuja micropropagação foi relatada por Nhut (1998). O material
vegetal foi submetido a todos os processos mencionados anteriormente: o explante
foi desinfestado e depositado em meio de cultura, os mesmos foram submetidos à
indução de brotação, multiplicação e subcultivo, e também foi induzido o
enraizamento dos brotos e tranferidos para condição ex vitro. Outra espécie
ornamental cultivada in vitro é Gypsophila paniculata L. micropropagada por
Radmann et al. (2001), o explante foi depositado em meio nutritivo sem regulador de
crescimento, e foram submetidos a enraizamento ex vitro e aclimatização. Protocolos
de micropropagação são também utilizados em espécies com outros interesses, como
o de proteção de espécies ameaçadas ou endêmicas, como Amomum microstephanum,
endêmica da Índia (Thoyajaksha & Rai 2006), cujo processo de multiplicação é
semelhante ao estabelecido para Lilium longiflorum e no trabalho realizado por
Pereira (2006) com a espécie Vaccinium cylindraceum uma espécie protegida.
Os protocolos de micropropagação de espécies ornamentais de bromélias
também seguem as etapas descritas anteriormente. Na cultura de tecidos de Vriesea
reitzii, Rech-Filho et al. (2005) induziram uma proliferação celular de plantas já
estabelecidas in vitro. Os autores denominaram de “protuberâncias” que foram
subcultivadas em meio com reguladores de crescimento. Após 10 semanas pequenos
segmentos da parte aérea originária destas protuberâncias foram depositados em novo
meio nutritivo contendo reguladores de crescimento (ácido naftaleno acético (ANA)
e benzilaminopuria (BAP)), e posteriormente os explantes foram subcultivados em
meio de cultura contendo ácido giberélico, para então ser multiplicados novamente
com uso de ANA e BAP. As plantas produzidas foram aclimatadas.
O cultivo in vitro oferece vantagens em relação à produção convencional de
plantas. Pickens et al. (2003), avaliando o crescimento e a sobrevivência da bromélia
Tillandsia eizii durante seu cultivo in vitro e em estufa, constataram que as sementes
germinam mais rapidamente quando cultivadas in vitro em relação à casa de
vegetação, e também a germinabilidade é maior in vitro do que ex vitro, e plantas
cultivadas in vitro expandem suas folhas mais rapidamente em relação as plantas da
casa de vegetação.
O desenvolvimento de métodos de propagação de bromélias ornamentais
contribui para o fornecimento dessas plantas ao mercado internacional. A
8
micropropagação tem permitido uma eficiente produção dessas espécies. Entretanto,
a multiplicação vegetativa natural tem sido considerada muito baixa, produzindo
poucos brotos por planta. Tem sido considerado que o cultivo a partir de sementes
não permite uma produção uniforme devido à variabilidade genética e muitas
espécies apresentam crescimento lento. Além disso, não há disponibilidade de
sementes no mercado. O sucesso na formação de plantas tem sido alcançado através
do cultivo in vitro de meristema apical, gemas axilares, folhas removidas de plantas
adultas e segmentos nodais. Região basal de folhas removidas de plantas cultivadas
em condições assépticas gera um grande número de gemas adventícias, as plantas
formadas não apresentam alterações na morfologia ou nos padrões de pigmentação,
características ornamentais muito apreciadas. Segundo Mercier & Kerbauy (1997),
muitas espécies de bromélias formadas a partir do cultivo in vitro não apresentam
dificuldades de aclimatação quando transferidas para vasos.
O cultivo in vitro de A. strobilacea foi descrito na dissertação de Figueiredo
(2003), onde plantas sem raízes previamente estabelecidas in vitro foram
subcultivadas em meio nutritivo contendo regulador de crescimento, sendo
posteriormente submetidas a uma fase de enraizamento. Esse autor não relatou a
possibilidade de utilização de outro tipo de explante além das sementes com objetivo
de formar clones, que é importante para a uniformização do cultivo em larga escala.
Além disso, utilizaram reguladores de crecimento que podem induzir variações
somaclonais segundo Pierik (1987), Zaffari et al. (2002) e Joyce et al. (2003).
Seleção do explante
A seleção e a manutenção da fonte do explante são importantes aspectos no
sucesso da micropropagação. Três aspectos necessitam atenção particular: as
características genéticas e epigenéticas da planta matriz, controle de patógenos e a
condição fisiológica da planta de modo a otimizar o estabelecimento da cultura
(Hartmann et al. 2002).
As culturas podem ser estabelecidas tanto a partir de fragmentos de tecidos
maduros (folhas, caules, etc), quanto de tecidos meristemáticos, constituidos de
células em constante divisão celular e geralmente localizados nos ápices do caule e
raiz em crescimento (Kerbauy 1997). Apesar de qualquer parte vegetal poder ser
usado como explante, procura-se utilizar aqueles que possuem maior porção de
tecidos meristemáticos ou que tenham maior capacidade de expressar a totipotência
(Grattapaglia & Machado 1998).
9
Para estudos básicos aplicados em espécies de importância econômica como o
eucalipto, Arruda et al. (2000) utilizaram hipocótilos de Eucalyptus urophyla para
induzir a proliferação de calos com objetivo de avaliar o efeito da concentração de
cálcio na morfogênese in vitro. Para Eucalyptus nitens foram utilizados meristema
apical e segmentos nodais a fim de melhorar a qualidade da árvore para a indústria de
papel (Gomes & Canhoto 2003). Outras espécies de importância econômica como
laranja também são cultivadas a partir de hipocótilo, como no trabalho desenvolvido
por Schinor et al. (2006) que teve como objetivo obter um eficiente protocolo de
micropropagação de Citrus aurantium, Citrus sinensis, Citru volkameriana e
Poncirus trifoliata x Citrus sinensis.
Em relação à Bromeliaceae, diversas espécies são micropropagadas a partir de
sementes como Pticairnia flammea, Vriesea fosteriana e Tillandsia pohliana
(Nievola et al. 2001), Vriesea reitzii (Rech-Filho et al. 2005), Tillandsia eizii
(Pickens et al. 2003 e Pickens et al. 2006), Orthophytum mucugense e Neoregelia
mucugensis (Bellintani et al. 2007). Quando o principal objetivo é a preservação do
patrimônio genético de uma dada espécie, a micropropagação deve ser iniciada por
meio da cultura in vitro de sementes coletadas de diferentes populações. Assim que o
cultivo é estabelecido, as plantas podem se tornar doadoras de explantes assépticos
para micropropagação de bromélia rara e/ou ameaçada de extinção.
Contudo, para muitas espécies, é possível a micropropagação por meio da
utilização de fragmento de plantas. Por meio dessa técnica é possível a obtenção de
clones, o que é aconselhável quando o objetivo é a produção em larga escala
(Mercier & Kerbauy 1997), devido à possibilidade de homogeneizar o lote de plantas
produzidas. Várias espécies de Bromeliaceae de interesse econômico têm sido
propagadas por meio da utilização de gemas axilares (Almeida 2002 e Silva et al.
2004), segmentos caulinares com uma ou mais gemas (Kiss et al. 1995 e Mendes et
al. 2007) e ainda segmentos foliares (Fonseca et al. 1999). Dentre os estudos, a
maioria utiliza reguladores de crescimento, porém, o uso destas substâncias tem sido
associado à indução de variações somaclonais dos tecidos (Pierik 1987, Zaffari et al.
2002 e Joyce et al. 2003). Tamaki et al. 2007 relataram não haver necessidade de
fitorreguladores na produção de mudas de abacaxizeiro na etapa de utilização de
segmentos nodais provenientes de plantas cultivadas in vitro. Neste trabalho, a
utilização dos segmentos nodais esteve associada à indução do estiolamento caulinar
de plantas de Ananas comosus mantidas em ausência de luminosidade.
10
Segmentos nodais podem ser utilizados na micropropagação de plantas,
entretanto a regeneração de nós in vitro pode depender da posição que o explante
ocupa no eixo caulinar da planta matriz, devido à presença de um gradiente basípeto
de auxina ao longo do caule que vai permitir a expressão de potenciais
morfogenéticos específicos (Termignoni 2005).
A influência da posição do segmento nodal no desenvolvimento de várias
espécies de plantas tem sido investigada. Pereira et al. (2005) verificaram que o
segmento nodal de origem basal foi o mais adequado para a multiplicação in vitro de
batata. Puddephat et al. (1997) utilizaram segmentos nodais das regiões apical,
mediana e basal de Quercus robur e observaram que as maiores taxas de regeneração
de brotos foram obtidos com os segmentos nodais da região mediana do caule.
Schinor et al. (2006) avaliaram a resposta organogênica de explantes coletados em
diferentes regiões do epicótilo (basal, mediana e apical) de diferentes genótipos de
Citrus. Nhut et al. (2001) testaram 7 posições de pedaços de 1mm de comprimento
ao longo do caule jovem de Lilium longiflorum e observaram que apesar de todos os
explantes utilizados formarem brotos, os de origem um e dois que seriam os mais
próximos do ápice do caule apresentaram maior índice de regeneração após 60 dias
de cultivo, a eficiência de formação de parte aérea diminui com o aumento da
distância do meristema apical.
Em relação a Bromeliaceae, Souza et al. 2003 verificaram que plantas
estioladas de Ananas comosus apresentaram diferenças na regeneração dos segmentos
nodais provenientes de plantas com o ápice. Modificações histológicas ocorreram
durante o desenvolvimento, além de alterações nos níveis hormonais endógenos. Os
autores mostraram que os explantes com ápice desenvolveram em nova planta em 15
dias e nos explantes sem ápice não foi observado desenvolvimento da gema.
O cultivo in vitro de A. strobilacea a partir de nós não foi estabelecido, apenas
a partir de sementes. No caso do objetivo ser a partir de nós, a posição deste deve ser
considerada. Mas para isto, a planta deve estar alongada para possibilitar o
isolamento dos nós.
Desinfestação
O estabelecimento do cultivo in vitro requer cuidados especiais em relação ao
material vegetal a ser utilizado, uma vez que a proliferação de fungos e bactérias no
interior do frasco de cultivo pode inviabilizar a cultura. No processo de desinfestação
que é a eliminação de microrganismos superficiais de explantes (Torres et al. 1999),
11
várias substâncias têm sido utilizadas que possuem ação germicida, sendo que as
mais comuns são as soluções de etanol e os compostos à base de cloro, tais como
hipoclorito de sódio e de cálcio, além de outras substâncias ácidas ou básicas,
adicionadas de algumas gotas de detergente. A concentração e o tempo de exposição
do tecido a estas substâncias são bastante variáveis (Grattapaglia & Machado 1998).
Tecidos de plantas estabelecidas in vitro apresentam algumas vantagens em
comparação às culturas iniciadas a partir de tecido de plantas provenientes do campo,
pois os explantes provenientes das plantas cultivadas in vitro já são assépticos e,
portanto, não necessitam serem submetidos a processos de desinfestação, nem sempre
eficazes.
Wawrosch et al. (1999) utilizaram solução de NaOCl a 0,63 % para desinfestar
sementes de Swertia chirata que posteriormente foram enxaguadas com água
destilada esterilizada em autoclave. Thoyajaksha & Rai (2006) desinfestaram gemas
laterais de Amomum microstephatum (espécie endêmica de Karnataka na Índia)
coletadas em seu ambiente natural, com água da torneira e detergente, fungicida a 0,3
% e uma solução antibacteriana a 0,2 %. Nhut (1998) utilizou meristemas caulinares
de Vaccinum cylindraceum cultivados in vitro. Estes foram lavados sob água corrente
e detergente, posteriormente submersos em etanol 70 % e, em seguida, lavados com
água destilada e colocados em uma solução aquosa a 0,1% de cloreto de mercúrio.
A desinfestação superficial mais comumente aplicada para Bromeliaceae tem
sido o hipoclorito de sódio, em soluções diluídas (1-20%) com algumas gotas de
Tween 20
®
em diferentes tempos (5-30 min), em seguida, os explantes são
severamente lavados em água destilada antes de ser transferidos para o meio de
cultura (Mercier & Kerbauy 1997).
Na desinfestação de sementes de Vriesea gigantea, Endres & Mercier (2001),
utilizaram etanol 92 % por 5 minutos, e em seguida as sementes foram imersas em
solução de NaOCl a 2 %. Carneiro et al. (1999) utilizaram solução de etanol a 70 %,
hipoclorito de sódio a 5 % com adição de Tween 80
®
para desinfestar sementes de
Neoregelia cruenta. Rech-Filho et al. (2005), desinfestando sementes de Vriesea
reitzii, utilizaram a mesma concentração de etanol porém em solução mais diluída de
hipoclorito de sódio (2 %) em ambos trabalhos o tempo sob o hipoclorito de sódio foi
de trinta minutos. Sementes de Dyckia agudensis foram submersas em etanol a 70 %
e em seguida 60 minutos em 5 % de NaOCl (Silva et al. 2007).
Para a maioria das espécies de bromélias somente tratamento com etanol,
hipoclorito de sódio e detergente sempre sob agitação é o suficiente para evitar
12
contaminações (Mercier & Nievola 2003). Contudo, as sementes de A. strobilacea
são envoltas por uma mucilagem (Figura 3), de difícil remoção, responsável por uma
taxa elevada de contaminação (experimentos preliminares).
Como já mencionado anteriormente, os membros de Bromeliaceae apresentam
dois tipos de sementes, as que são dotadas de apêndices plumosos que, podem reter
partículas responsáveis por causar contaminação do meio de cultura. A remoção
mecânica destes apêndices é o suficiente para resolução do problema (Mercier &
Kerbauy, 1997). Outras bromélias apresentam sementes na forma de bagas sendo que
algumas são envoltas por uma mucilagem cuja remoção pode depender de substância
química, como pôde ser observado no trabalho de Grossi (2000), no qual foi utilizado
ácido clorídrico para desinfestar sementes de Aechmea nudicaulis, além das
substâncias usuais, de modo a facilitar a remoção da mucilagem.
Sementes de A. strobilacea também apresentam mucilagem, portanto, para o
estabelecimento do cultivo in vitro dessa espécie, é necessário desenvolver um
protocolo de desinfestação adequado para minimizar a contaminação, para que em
seguida, possam ser depositadas no meio de cultura.
Embora Pereira (2006) tenha relatado a micropropagação de A. strobilacea por
meio de sementes, esse autor não menciona qual foi a taxa de contaminação destas.
Experimentos prévios, por nós realizados, mostraram que cerca de 40 % das sementes
contaminam quando se utiliza apenas hipoclorito de sódio e detergente, apontando
para a necessidade de redução dessa taxa de modo a obter-se um protocolo mais
adequado à produção.
Meio nutritivo
Após o estabelecimento do processo de escolha do explante e desinfestação, a
seleção do meio de cultura mais adequado é importante para o estabelecimento do
cultivo uma vez que pode ser um fator limitante para o crescimento e
desenvolvimento das plantas cultivadas (Grattapaglia & Machado 1998, Caldas et al.
1999). O sucesso no estabelecimento do cultivo, indução e multiplicação dos brotos,
pode ser difícil para algumas espécies, diversas plantas têm necessidades específicas
para a multiplicação in vitro então, variações substanciais existem nas formulações
do meio de cultura. Em geral, requerimentos de sais minerais variam de um grupo de
planta a outro, bem como fitorreguladores específicos ou suplementos orgânicos
aumentam bastante a regeneração e crescimento em muitos casos (Sarasan et al.
2006).
13
Figura 3. (A) A. strobilacea na natureza, (B) detalhe da inflorescência (seta) e fruto (círculo) e
(C) fruto com sementes maduras expostas (círculo) envoltas por mucilagem (seta).
14
Os meios de cultura incluem um suporte semi-sólido (Agar ou outro produto), meio
basal inorgânico (macro e micronutrientes), uma fonte de energia (sacarose) e
frequentemente algum suplemento vitamínico. A utilização de auxinas e citocininas
adicionadas às soluções nutritivas podem ser importantes na fase de estabelecimento
da cultura. Tipicamente, o meio de cultura tem baixas concentrações de hormônios
durante o estabelecimento em comparação com o estágio de multiplicação (Hartmann
et al. 2002).
O início dos estudos a respeito das formulações nutritivas data da década de
1930. Nessa época já se conhecia a auxina que era utilizada em alguns experimentos.
Na década de 1940 foram adicionadas sacarose e vitaminas como suplementos
orgânicos. Já em 1951 foi realizada uma revisão dos meios nutritivos e a ênfase dos
trabalhos concentrava-se na identificação de elementos essenciais para o crescimento
de células e outros tecidos vegetais. Várias modificações surgiram de modo a
estabelecerem um aumento nas concentrações dos sais em geral, uma diminuição de
sódio e aumento de nitrogênio na forma de amônio para complementar a fonte na
forma de nitrato (Caldas et al. 1999).
Em 1962, Murashige & Skoog, estabeleceram modificações nos meios de
cultura originando a composição mais utilizada na propagação de diversos tecidos de
diferentes espécies vegetais (Caldas et al. 1999). Foi desenvolvido a partir de
exigências nutricionais do tabaco, é frequentemente utilizado em cultura de tecidos
(Wawrosch et al. 1999, Dalal & Raí 2001, Rai & Thoyajaksha 2001, Kitaya et al.
2005 e Sharma et al. 2006), sendo também bastante comum no cultivo de bromélias
(Mercier & Kerbauy 1997 e Souza et al. 2003). Entretanto, diluições dos
macronutrientes desse meio podem ser mais adequadas ao cultivo in vitro de diversas
espécies desta família (Mercier & Kerbauy 1997, Tamaki et al. 2007 e Kanashiro et
al. 2007). Segundo Grattapaglia & Machado (1998), diluições das formulações
básicas têm, em geral, possibilitado melhor enraizamento, pois na presença de
auxinas, altas concentrações de sais tendem a inibir todas as fases do enraizamento,
particularmente a de crescimento das raízes.
Além do meio de Murashige & Skoog (1962) (MS), o meio de Knudson (1946)
tem sido também utilizado na consistência líquida ou geleificado em sua composição
total ou reduzido pela metade. Meio nutritivo Knudson (1946) geleificado foi
utilizado no cultivo de Guzmania sp, Ananas erectifolius, Portea petropolitana
(Mapes 1973), Guzmania ligulata, Tillandsia polystachia, Vriesea heliconioides,
Vriesea splendens, Vriesea Meyers (Mekers 1977), Vriesea fosteriana (Mercier &
15
Kerbauy 1992), Dyckia macedoi (Mercier & Kerbauy 1993), Vriesea hieroglyphica
(Mercier & Kerbauy 1994, 1995) e Tillandsia eizii (Pickens et al. 2003). Knudson
(1946) líquido foi utilizado na cultura de Aechmea fasciata e Aechmea distichanta
(Zimmer & Pieper 1976), solução nutritiva MS completa líquida foi utilizada na
propagação de Aechmea fasciata (Jones & Murashige 1974), Cryptanthus bivittatus
(Davidson & Donnan 1977), Quesnelia quesneliana, Vriesea poelmannii, Aechmea
fasciata (Hosoki & Asahira 1980), Tillandsia cyanea (Pierik & Sprenkels 1991) e
Cryptanthus sinuosus (Arrabal et al. 2002). Em MS completo geleificado são
cultivadas Cryptanthus bromelioides (Mathews & Rao 1982), Puya tuberosa
(Varadarajan et al. 1993), Aechmea fasciata (Vinterhalter & Vinterhalter 1994),
Cryptanthus sinuosus (Carneiro et al. 1998), Dyckia distachya (Pompelli & Guerra
2005), Vriesea reitzii (Rech-Filho et al. 2005) e Ananas comosus (Tamaki et al.
2007). Meio MS com metade das concentrações de macronutrientes foi utilizado pra
cultivar Ananas comosus (Teng 1997), Orthopytum mucugense (Bellintani et al.
2007) e Neoregelia mucugensis (Bellintani et al. 2007 b).
Diluições dos macronutrientes do meio de Murashige & Skoog (1962) (MS)
podem ser adequadas ao cultivo in vitro de diversas espécies de bromélias (Teng
1997, Bellintani et al. 2007, Tamaki et al. 2007, Kanashiro et al. 2007). Além disso,
altas concentrações iônicas causadas pelo acúmulo de sais diminuem o potencial
hídrico do meio de cultura resultando em uma menor disponibilidade de água para a
planta.
Grossi (2000) recomenda que se determinem concentrações mínimas de
macronutrientes para o cultivo de bromélias in vitro, de modo a proporcionar um
melhor equilíbrio osmótico entre a planta e o meio de cultura e consequentemente
obter-se um melhor desenvolvimento da mesma, pois em relação à Aechmea
nudicaulis, a quantidade máxima absorvida de macronutrientes do meio MS ao longo
de 5 meses não ultrapassou 70 % da concentração original utilizada no cultivo in
vitro desta espécie.
Por se tratar de uma bromélia epífita de cerrado, A. strobilacea deve estar
adaptada a ambientes oligotróficos, portanto há necessidade de se investigar o
crescimento e o desenvolvimento de plantas em soluções mais diluídas. Uma vez
estabelecido o melhor meio nutritivo, fatores abióticos que podem influenciar nas
respostas morfogênicas do explante devem ser considerados, como a luz por
exemplo.
16
Condições de luminosidade
A luz é um dos sinais ambientais que ao ser percebido desencadeia mudanças
no metabolismo e desenvolvimento das plantas micropropagadas (Majerowicz &
Peres 2007). Os efeitos da luz podem ser separados em relação ao impacto da
irradiância luminosa (radiação fotossintética ativa), duração (fotoperíodo) e
qualidade (comprimento de onda) no crescimento e desenvolvimento.
Em micropropagação a irradiância usada varia entre 40 e 80 µmol m
-2
s
-1
,
entretanto a irradiância que incide no interior do frasco pode ser muito menor, pois a
qualidade do vidro e o tipo de tampa utilizada para vedar os frascos podem reduzir a
transmissão para o interior do frasco. Embora as espécies vegetais possuam
necessidades variáveis de luz, esta escala é uma irradiância muito baixa quando
comparadas com a de casa de vegetação que pode variar de 600 a 1200 µmol m
-2
s
-1
(Hartmann et al. 2002). As diferenças nas intensidades luminosas, dependendo da
posição do frasco na prateleira na sala de cultura, podem também influenciar o
desenvolvimento da planta (Grattapaglia & Machado 1999).
O fornecimento de luz da sala de cultura, onde normalmente as plantas
permanecem durante o período de seu cultivo, deve ser controlado, pois os processos
relacionados à fotossíntese, fotomorfogenese e fototropismo são dependentes de luz.
Além disso, alta irradiância pode elevar a temperatura no interior dos frascos de
cultivo e assim prejudicar o desenvolvimendo das plantas (Pierik 1987).
Embora o uso de baixa irradiância no cultivo in vitro seja freqüente devido ao
fato de se considerar que a fotossíntese de plantas cultivadas in vitro é limitada
devido a uma baixa concentração de CO
2
nos frascos, não é procedimento correto
uma vez que no interior dos frascos de cultivo encontra-se CO
2
em quantidade
maiores do que se supõe (Pierik 1987).
Na ausência de luz, as plantas que têm um cotilédone seguem um programa de
desenvolvimento caracterizado pelo estiolamento, onde o coleóptilo adquire o
aspecto alongado e pálido devido à inibição da biossíntese de clorofilas e
antocianinas. Sob exposição à luz, as plantas alteram o padrão de desenvolvimento
(fotomorfogênse). Assim, o coleóptilo para rapidamente o alongamento e se torna
mais espesso, o meristema apical é acionado, iniciando-se a biossíntese de clorofila e
antocianina e as folhas começam a se desenvolver. Todo este processo ocorre pela
exposição da planta ao estímulo luminoso e consequente transdução de sinais, em
17
segundos, pois as plantas dispõem de moléculas sensíveis a luz que determinam com
precisão a qualidade, a quantidade e a duração da luz (Eckardt 2001).
Lee et al. (2007), com intuito de verificar a influência da quantidade e da
qualidade da luz sobre o crescimento e desenvolvimento de plantas de Withania
somnifera cultivadas in vitro, observaram que esta espécie apresenta um grande
crescimento sob intensidade luminosa de 30 µmol m
-2
s
-1
em relação ao tamanho da
parte aérea, da raiz, e massa fresca e seca. As plantas cultivadas sob intensidade de
15 e 90 µmol m
-2
s
-1
apresentaram pouco crescimento. Apesar do número de folhas
ser o mesmo sob 30 e 60 µmol m
-2
s
-1
, a área foliar foi maior nas plantas cultivadas
em 30 µmol m
-2
s
-1
,
houve um aumento progressivo nas concentrações de clorofilas e
de carotenóides a 60 µmol m
-2
s
-1
, provavelmente relacionado à síntese destes
pigmentos. O aumento na razão carotenóide/ clorofila simultaneamente ao aumento
da intensidade luminosa é considerado uma medida protetora da planta contra a
absorção excessiva de luz (Levitt 1980).
A influência da intensidade luminosa tem sido bem investigada em diversos
trabalhos de plantas cultivadas in vitro, a ausência de luminosidade resulta em
alongamento do caule em plantas de roseta sendo documentado por diversos autores
como Kiss et al. (1995), Barboza & Caldas (2001) e Moreira et al. (2003). Radmann
et al. (2001), estudando a influência da densidade do fluxo luminoso na
multiplicação de Gypsophila paniculata, observaram que mesmo em condições de
luminosidade as plantas apresentaram alongamento do seu eixo caulinar. Esses
autores verificaram não existir diferenças significativas em relação ao número de
entrenós, entretanto, as plantas submetidas a 15,705 W.m
-2
de
densidade de fluxo
luminoso apresentaram maior comprimento dos entrenós em relação às plantas dos
demais tratamentos que tinham maior intensidade (41,88 e 83,79 W.m
-2
).
Plantas de Catasetum fimbriatum, cultivadas no escuro, apresentaram eixo
caulinar alongado e aclorofilado, completa inibição da formação de raiz, e um
aumento da massa seca em relação às plantas mantidas na luz (Suzuki & Kerbauy
2006). Nesse trabalho foi observada a influência da luz sobre hormônios endógenos,
o conteúdo endógeno de citocinina e auxina nas partes aérea e radicular variaram
significativamente sob condições de luminosidade. No escuro, o intenso crescimento
da parte aérea coincide com um significante acúmulo de citocinina endógena, cuja
concentração foi duas vezes maior em relação à luz.
Alongamento do eixo caulinar na presença da luz foi observado em plantas de
tabaco cultivada a partir de segmentos nodais sob irradiância de 50 µmol m
-2
s
-1
18
(Haisel et al. 2001) e também no cultivo de Arabidopsis thaliana a partir de
segmentos nodais na irradiância de 75 µmol m
-2
s
-1
(Smalle et al. 1997).
A intensidade luminosa utilizada na micropropagação de diversas espécies de
bromélias varia de 10 a 50 µmol m
-2
s
-1
(Teng 1997, Carneiro et al. 1999, Endres &
Mercier 2001, Arrabal et al. 2002, Mercier et al. 2003, Pickens et al. 2003,
Sripaoraya et al. 2003, Droste et al. 2005, Silva et al. 2005, Bellintani et al., 2007,
Silva et al. 2008 e Tavares et al., 2008), exceção encontrada apenas no cultivo de
Tillandsia eizzi cuja irradiância aplicada foi de 125 µmol m
-2
s
-1
(Pickens et al.
2003). Contudo a avaliação simultânea de diferentes intensidades luminosas durante
o cultivo in vitro de bromélias não foi encontrada. Além da luz, o tipo de tampa
utilizada nos frascos de cultivo permite acúmulo de gases na atmosfera interna dos
frascos de cultura que podem influenciar no crescimento e desenvolvimento das
plantas.
Vedação dos frascos
A produção de plantas in vitro é um sistema asséptico de modo a evitar que
fungos e outros organismos se desenvolvam no meio nutritivo. Com intuito de
proteger a cultura asséptica de infecções e para prevenir a dessecação tanto da planta
quanto do meio de cultivo, as plantas são propagadas em frascos vedados, com
restrição não intencional de trocas gasosas entre a atmosfera interna do frasco e o
meio externo (Mensuali-Sodi, et al. 1992, Buddendorf-Joosten & Woltering 1994).
Isso interfere na morfogênese de explantes de diversas espécies (Jackson et al. 1991,
Nour & Torper 1994, Suzuki & Kerbauy 2006).
De acordo com Nour & Thorper (1994), o crescimento e a diferenciação das
células vegetais in vitro são afetados por substâncias voláteis, resultado do
metabolismo secundário das plantas que se acumulam no interior dos frascos de
cultivo. Entre as substâncias voláteis produzidas pelos tecidos estão: etileno, CO
2
,
etano, acetaldeído, etanol e jasmonato, sendo que as repostas a estes diferentes gases
são bastante variáveis em relação ao tecido cultivado.
Buddendorf-Joosten & Woltering (1994) citam que os fatores mais
importantes que afetam o acúmulo de gases são: o tipo e a quantidade de material
vegetal depositado no meio de cultura, as propriedades físicas dos frascos e a tampa,
os componentes nutricionais do meio de cultivo e aspectos do macroclima
(temperatura, ventilação e intensidade luminosa). A quantidade e a qualidade destes
19
gases podem variar em função do tipo de vedação que os frascos de cultura possuem,
resultando num ambiente com maior ou menor acúmulo dessas substâncias no
interior dos mesmos (Hartmann et al. 2002).
Buddendorf-Joosten & Woltering (1994) discutem a ocorrência de diferentes
componentes gasosos nos frascos de cultivo in vitro, com especial ênfase nos efeitos
dos diferentes gases que afetam o crescimento e desenvolvimento de explantes, como
o etileno, dióxido de carbono e o oxigênio. Segundo esses autores, uma vantagem na
diminuição da concentração de oxigênio na atmosfera do frasco de cultivo seria a
inibição do crescimento de fungos e bactérias, considerados contaminantes do
processo de transferência das plantas para condições in vitro, que podem inviabilizar
o cultivo in vitro das plantas.
A concentração de dióxido de carbono no frasco altera devido à respiração e
fotossíntese das plantas, portanto, no escuro, a concentração deste gás tende a
aumentar devido a respiração, e durante o período de luz, esta concentração pode
diminuir dependendo da atividade fotossintética da planta (Buckeridge et al. 2007).
A concentração de etileno pode variar dependendo do tipo e do estado fisiológico do
explante utilizado, da concentração ambiental deste gás durante a transferência do
material vegetal e do tipo de tampa utilizada no frasco de cultivo (Buddendorf-
Joosten & Woltering 1994).
Nour & Torper (1994) estudaram o efeito do tipo de tampa utilizado frasco e
sua influência na fase gasosa sobre as respostas morfogênicas em explantes
cultivados in vitro de Thuja occidentalis. Embriões desta planta foram cultivados em
frascos que variavam em seu grau de troca gasosa, substâncias que reagem com o
etileno retirando o mesmo da atmosfera do frasco e CO
2
.
Tem sido reconhecido por muito tempo que sem aeração adequada, as plantas
cultivadas in vitro são alteradas devido a uma diminuição do influxo de oxigênio,
resultando em uma diminuição na disponibilidade de dióxido de carbono externo
privando os tecidos fotossintéticos deste gás limitando a produção de massa seca
(Jackson et al. 1991).
A pequena movimentação do ar pode retardar as trocas gasosas entre as
plantas e o ambiente do frasco de cultura, e conseqüentemente limitar o crescimento
da planta, conforme comprovado por Kitaya et al. (2005), ao determinarem a
influência de uma corrente de ar no aumento da fotossíntese das plantas de batata
cultivadas in vitro.
20
Nour & Thorper (1994), examinaram o efeito da fase gasosa no frasco de
cultivo tanto na indução de formação de gemas a partir de embriões quanto no
desenvolvimento de gemas axilares a partir de brotos de cedro branco. Os explantes
foram cultivados em placa de Petri vedada com filme de PVC, frascos de erlenmeyers
com tampa de soro e com tampa de espuma, que permitem menor e maior troca
gasosa entre a atmosfera interna e externa dos frascos de cultura respectivamente,
foram observadas diferenças nas respostas dos tecidos em função dos diferentes
tratamentos utilizados.
Jackson et al. (1991) descreveram como frascos de cultivo podem ser vedados
de modo a proteger a cultura de contaminação e dessecação de modo que a falta de
ventilação não afetasse o desenvolvimento da planta. Estes autores utilizaram
diferentes vedações dos frascos de cultura para possibilitar níveis variáveis de
ventilação em plantas micropropagadas de Gerbera jamesonii, Ficus lyrata e
Solanum tuberosum. Entretanto foram observadas diferenças entre as espécies.
Bellintani et al. (2007) estudaram o efeito da ventilação in vitro na
aclimatação da bromélia Orthophtum mucugense através da vedação de tubos de
ensaio contendo segmentos nodais, com filme de PVC e com algodão, os resultados
mostraram que plantas provenientes dos tubos de ensaio fechados com algodão
apresentaram 95,4% de sobrevivência e as plantas originárias dos tubos vedados com
filme de PVC a taxa de sobrevivência foi de 80 %. Portanto estudos sobre o ambiente
interno de cultivo de A. strobilacea são necessários de modo a otimizar o cultivo e a
aclimatação da espécie. Entretanto não foram encontrados trabalhos que avaliassem a
influência dos gases sobre o alongamento do caule de bromélias cultivadas in vitro.
Acúmulo de gases
As trocas gasosas entre o O
2
e CO
2
do interior da planta e a atmosfera que a
envolve interfere no metabolismo do carbono no interior da célula. Durante a
fotossíntese a planta fixa CO
2
e libera O
2
, durante a respiração, a planta libera CO
2
e
consome O
2
, revertendo assim, a troca destes gases (Larcher 2006).
A taxa respiratória varia de acordo com o tipo de órgão, idade, ambiente,
estação, etc. Cada órgão respira independentemente, sendo que as raízes respiram
intensamente, principalmente as primárias e jovens uma vez que apresentam
meristemas em contínua atividade mitótica para formação de novas células que
entrarão em processo de alongamento e desenvolvimento, necessitando de grande
21
quantidade de energia (Buckeridge et al. 2004). Geisler (1965) constatou que plantas
de ervilha cultivadas sob aeração apresentavam maior comprimento e alongamento
das raízes primárias em relação às plantas não aeradas, independente de um pré-
tratamento de aeração.
São poucos os relatos sobre a influência da concentração de oxigênio no
crescimento vegetal in vitro. O consumo de O
2
varia muito de espécie para espécie
bem como entre cultivares (Righetti et al. 1990). Segundo Buddendorf-Joosten &
Woltering (1994), uma vantagem na diminuição da concentração de O
2
na atmosfera
do frasco de cultivo seria a inibição do crescimento de fungos e bactérias que podem
inviabilizar o cultivo in vitro das plantas. Não foram encontradas referências sobre o
acúmulo de O
2
e CO
2
nos frascos de cultivo de Bromeliaceae. Contudo, além destes
gases, o etileno tem sido bastante estudado devido a sua relação com alterações
morfológicas em diferentes espécies (Pérez-Bermúdez et al. 1985, Arigita et al.
2003).
Etileno
O acúmulo de etileno pode alterar o fenótipo das plantas (Nour & Thorper
1994). Etileno é um fitorregulador que pode ser produzido pela semente em
germinação ou pela própria planta que afeta o crescimento e o desenvolvimento de
diferentes espécies de plantas cultivadas in vitro. Além da produção pela planta,
outros fatores podem estar envolvidos como o agar utilizado como agente
geleificante do meio de cultura que pode liberar uma quantidade considerável de
etileno quando exposto à luz, podendo intensificar a quantidade de etileno acumulada
no interior dos frascos de cultivo, como constatado por Mensuali-Sodi et al. (1992),
cultivando lavanda (Lavandula officinalis x Lavandula latifolia).
O etileno é produzido a partir da conversão do aminoácido metionina a S-
adenosil metionina, posteriormente convertido a aminociclopropano (ACC) através
da ação da enzima ACC sintase, e o ACC dá origem ao etileno por ação da enzima
ACC oxidase. Os tecidos meristemáticos e as regiões nodais geralmente apresentam
uma produção elevada desse gás, também observada durante a abscisão de folhas,
senescência de flores e o amadurecimento de frutos (Colli 2007).
Concentrações de etileno são freqüentemente abordados no estudo das
respostas de crescimento e desenvolvimento de plantas submetidas a diferentes
situações de estresse. Contudo é muito difícil demonstrar a especificidade de seus
efeitos (Hall & Smith 1995). O efeito da aplicação exógena de etileno nas respostas
22
morfogenéticas das plantas pode ser estudado através da adição de precursores, como
o ACC, de inibidores da biossíntese, através da adição de substâncias que são
capazes de liberar o etileno, criando uma atmosfera enriquecida com este
fitorregulador ou ainda pela eliminação do etileno utilizando a técnica de ventilação
forçada (Arigita et al 2002) o que permite uma renovação do ar no interior dos
frascos de cultivo. Outro modo de se estudar a ação do etileno na morfogênese é
através do uso de bloqueadores específicos dos receptores de etileno, como por
exemplo, o 1-metilciclopropeno (1MCP).
Locke et al. (2000) verificaram que devido a adição do precursor de etileno
ACC (aminociclopropano) no meio de cultura houve um aumento no crescimento da
parte aérea e diminuição da raiz em plantas de soja. O etileno pode interagir com
outros hormônios como verificado para hipocótilos de Digitalis obscura cultivados in
vitro (Pérez-Bermúdes et al. 1985) e em rizoma de Kohleria eriantha (Almeida et al.
2005).
Suzuki & Kerbauy (2006), observaram que em plantas de Catasetum
fimbriatum cultivadas in vitro na presença de luz e tratadas com etileno houve uma
forte redução do tamanho dos brotos, crescimento foliar, e crescimento radicular.
Como fenótipo observado no crescimento foliar foi o mesmo observado com outros
gêneros de orquídeas quando cultivadas em frascos pouco ventilados, estes autores
atribuíram este fato ao provável acúmulo de etileno.
Buddendorf-Joosten & Woltering (1994) verificaram que o etileno suprime a
dominância apical em bromélias cultivadas in vitro. Esse efeito causa um aumento do
número de brotos axilares formados pelas plantas. Smalle et al. (1997) constataram
que etileno tem um efeito promotor no alongamento do eixo caulinar de Arabidopis
thaliana quando cultivadas in vitro na presença de luz. Não foram encontrados
trabalhos onde houvesse a verificação da influência desse gás no alongamento de
bromélias cultivadas in vitro.
Transferência das plantas produzidas in vitro para cultivo em casa de vegetação
A produção de plantas ornamentais por meio do cultivo in vitro envolve a
aclimatação das plantas às condições ex vitro. Essa etapa de transplantio é
caracterizada pela adaptação da planta às condições ambientais antes da tranferência
para o campo (Torres et al. 1999). Essa passagem é crítica e representa, em alguns
casos, um fator limitante do processo de micropropagação. Isto se deve basicamente
23
aos seguintes fatores: transferência das plantas de uma situação de reduzido fluxo
respiratório, devido à baixa intensidade de luz e elevada umidade relativa, para um
ambiente que demanda um incremento na taxa de transpiração, tornando-as
susceptíveis ao estresse hídrico; passagem da existência heterotrófica, a qual depende
de um suprimento externo de energia (sacarose no meio de cultura), para um estado
autotrófico, no qual as plantas devem realizar fotossíntese para sobreviver;
transferência de uma condição de alta disponibilidade de nutrientes no meio de
cultura para outra onde é necessário incrementar a absorção de sais; mudança da
planta de um ambiente asséptico para outro onde está sujeita ao ataque de
microorganismos saprófitos e, eventualmente, patogênicos (Torres et al. 1999).
O fornecimento de adubação adequada às plantas recém transferidas é
importante para seu desenvolvimento de maneira semelhante ao que ocorria quando
estava em condições de cultivo in vitro. Entretanto, a maioria dos trabalhos
referentes à aclimatação de plantas produzidas in vitro não abordam os aspectos
nutricionais, como observado no trabalho de Chen et al. (2006) que não descreveram
o método de adubação das plantas de Bupleurum kaoi (planta medicinal ameaçada de
extinção) recém transferidas da condição in vitro para casa de vegetação. O mesmo
foi observado no trabalho de Preece & West (2006), que estabeleceram um protocolo
de produção em casa de vegetação de Hibiscus moscheutos, testando apenas a
profundidade do material vegetal no substrato, a umidade do ambiente e pré-
tratamento de luz, sem mencionar se houve ou não fornecimento de nutrientes.
Todavia é comum os relatos sobre o uso de fertilizantes comerciais, como no
trabalho de Valero-Aracama et al. (2007), que aplicou adubo comercial Peters nas
proporções 20N-20P-20K, em plantas de Uniola paniculata produzidas in vitro
durante o processo de aclimatação.
Benzing (2000) relata que os membros de Bromeliaceae desenvolveram
adaptações para sobreviver em ambientes com baixa disponibilidade nutricional
indicando que soluções comerciais muito concentradas podem não ser adequadas ao
crescimento dessas plantas ex vitro. A adubação ideal para as bromélias pode
considerar a disponibilidade de nutrientes no ambiente natural de muitas espécies da
família.
24
PROPOSTA PARA A REALIZAÇÃO DESTE TRABALHO
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch (figura 1) é uma espécie
com grandes atributos ornamentais que se caracteriza por apresentar folhas finas e
acanaladas. Possui inflorescência que varia do vermelho ao laranja, na forma de um
cone, se assemelhando ao estróbilo de uma conífera, o que deu origem ao seu nome
específico (Reitz, 1983). Lawn (2008) recomenda o uso dessas plantas em cestos
suspensos, pois suas folhas podem atingir 2 metros de comprimento (figura 2),
Alguns exemplares podem ser encontrados à venda na Companhia de Entrepostos e
Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP). Na Espanha esta espécie é considerada
uma planta ornamental, indicando seu valor para exportação. Apesar de ser uma
espécie de ampla distribuição no Brasil, faz parte da lista vermelha de espécies da
fauna e flora do Paraguai sob Resolução n° 524/06 março/2006 categorizada como
uma espécie vulnerável, que segundo a IUCN (International Union for Conservation
of Nature) significa que a população desta espécie está sofrendo um declínio cujo
futuro é incerto.
Apesar do seu valor ornamental, poucos são os relatos sobre a produção dessa
espécie para atender ao mercado de plantas ornamentais. Figueiredo (2003)
estabeleceu o cultivo desta espécie por meio da utilização de diferentes
concentrações de reguladores de crescimento. Portanto, o desenvolvimento de
protocolos que objetivem a produção é necessário para disponibilizá-la em maior
número no mercado de ornamentais. Indiretamente, isso contribui para a redução da
procura por exemplares retirados da natureza, contribuindo para a preservação da
espécie.
O cultivo in vitro tem sido utilizado como instrumento de conservação de
bromélias devido à produção de conhecimento sobre suas características fisiológicas
e necessidades nutricionais, além de outros aspectos do desenvolvimento das
espécies desse grupo (Pierik & Sprenkels 1991, Mercier & Kerbauy 1992, Guerra et
al. 1999, Grossi 2000, Nievola et al. 2001, Mercier & Nievola 2003, Tamaki 2003,
Carneiro & Mansur 2004, Kanashiro 2005 e Barboza et al. 2006). Muitos estudos
foram realizados visando à micropropagação de bromélias de interesse comercial e
também das bromélias endêmicas, raras e/ou ameaçadas de extinção (Mercier &
Kerbauy 1993, Mercier & Kerbauy 1995, Mercier & Kerbauy 1997, Naves 2001,
Arrabal et al. 2002, Rodrigues et al. 2004 e
Rech-Filho 2005). As vantagens
oferecidas por este método de multiplicação de plantas são inúmeras, pois existe a
25
possibilidade de se obter um grande número de plantas em um curto espaço de
tempo, com qualidade fitossanitária, o que não ocorre em ambiente natural (Mercier
& Kerbauy 1995 e Carneiro & Mansur 2004).
Quando o objetivo da multiplicação de plantas é a preservação do patrimônio
genético de uma dada espécie, a micropropagação deve ser iniciada por meio da
cultura in vitro de sementes (Mercier & Nievola 2003). No caso de plantas de A.
strobilacea, estas produzem poucas sementes e são difíceis de serem encontradas em
seu ambiente natural, pois servem de alimento para a avifauna. Portanto, o
desenvolvimento de estratégias de propagação alternativas ao uso de sementes torna-
se desejável. Contudo a utilização de explantes oriundos de plantas já estabelecidas
in vitro é mais adequada à obtenção de explantes de plantas do ambiente natural
como meristemas, estolões, rizoma, pois a porcentagem de contaminação é menor.
Assim, o cultivo in vitro dessa espécie deve ser iniciado a partir de sementes,
podendo ser avaliada a possibilidade de utilização de outras fontes de explantes, a
fim de otimizar a produção in vitro.
Trabalhos desenvolvidos na Seção de Ornamentais do Instituto de Botânica
mostraram que o estabelecimento de A. strobilacea in vitro requer condições
especiais, pois as sementes possuem mucilagem (figura 3) facilitando o
desenvolvimento de fungos e a contaminação do meio de cultura. As tentativas para o
estabelecimento do cultivo in vitro dessa espécie por meio da utilização de
protocolos convencionais de desinfestação de sementes ofereceram apenas 20 % de
sementes não contaminadas. Estas, quando germinadas originavam plantas que
apresentavam o eixo caulinar alongado e outras que cresciam sem apresentar este
alongamento, à semelhança de outras bromélias, denotando uma não uniformidade
das plantas produzidas (experimentos prévios). Portanto, embora fosse possível
estabelecer o cultivo in vitro dessa espécie, o número e o aspecto das plantas
produzidas não correspondia a um eficiente protocolo de cultivo in vitro para essa
bromélia.
Vale ressaltar que o aspecto alongado ocorreu somente quando as sementes
foram cultivadas in vitro. Experimentos preliminares mostraram que sementes de
plantas de A. strobilacea cultivadas em gerbox contendo substrato casca de Pinus,
nas mesmas condições de temperatura e luz que outras cultivadas in vitro, não
originavam plantas que apresentavam o alongamento do caule (figura 4).
26
Figura 4. Plantas de A. strobilacea com três meses de idade (A) não alongadas cultivadas em
bandejas plásticas com casaca de pinus e (B) plantas alongadas cultivadas in vitro a partir de
sementes sob temperatura de 26 ± 2°C e fotoperíodo de 12 horas.
27
Portanto, é possível supor que a condição do cultivo in vitro tenha sido a
principal responsável pela ocorrência desse fenótipo. Joyce et al. (2003) relataram
vários fatores responsáveis por alterações morfológicas in vitro em comparação às
plantas crescidas em casa de vegetação.
O aspecto alongado do caule de A. strobilacea cultivadas in vitro culminou na
hipótese relacionada à possibilidade de utilizar os segmentos nodais provenientes das
plantas alongadas para a micropropagação dessa espécie. Assim, com base na
literatura que apresenta a possibilidade de utilização desses explantes isolados para a
produção de plantas (Kiss, et al. 1995, Mercier & Nievola 2003, Souza et al. 2003 e
Mendes et al. 2007), este trabalho procurou estabelecer um protocolo de
micropropagação da espécie por meio do estabelecimento inicial do cultivo via
sementes e posterior investigação da possibilidade de utilização dos segmentos
nodais como explantes. Para isto, houve a necessidade de melhorar o processo de
desinfestação e estudar os fatores que poderiam estar relacionados ao alongamento
do eixo caulinar das plantas de A. strobilacea.
28
OBJETIVOS
Este trabalho objetivou aprimorar a metodologia de propagação in vitro de
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch, estabelecendo a melhor condição
de crescimento das plantas visando à produção destas em casa de vegetação.
Paralelamente investigou-se o efeito do etileno no alongamento caulinar que essa
espécie apresenta quando cultivada in vitro.
29
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CAPÍTULO 1 - Micropropagação da bromélia ornamental Acanthostachys
strobilacea (Schultz F.) Klotzsch.
RESUMO
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch é uma bromélia epífita ou saxícola,
que é utilizada como planta ornamental devido as suas características morfológicas. Embora
seja possível encontrar exemplares dessa planta oferecidos no mercado de ornamentais, não
existem relatos sobre sua produção. Espécies de bromélias têm sido produzidas por meio do
cultivo in vitro. Tem sido considerado que essa técnica é adequada à seleção e à multiplicação
de fenótipos de interesse com qualidade fitossanitária. É comum o estabelecimento das
culturas utilizando sementes. Entretanto, as sementes de A. strobilacea apresentam uma
mucilagem que as envolve, causando contaminação quando transferidas para meio de cultura,
sendo necessário verificar a possibilidade de utilização de explante alternativo ao uso destas.
Quando as sementes germinam em condições in vitro, cerca de 60 % das plantas produzidas
apresentam um alongamento do caule, apontando para a possibilidade de utilização dos
segmentos nodais como explantes. O objetivo deste trabalho foi aprimorar o estabelecimento
do cultivo in vitro da bromélia ornamental Acanthostachys strobilacea por meio de sementes
e segmentos nodais, visando à produção. Sementes de A. strobilacea foram coletadas de
plantas existentes na Reserva Biológica e Estação Experimental de Mogi-Guaçu, SP. Foram
utilizados 2 protocolos de desinfestação com uso de hipoclorito de sódio e ácido clorídrico. A
fim de investigar a possibilidade de utilização de segmentos nodais como explantes foram
estabelecidas condições que favorecessem o aparecimento de plantas alongadas, variando, por
exemplo, a formulação do meio de cultura, utilizando a composição original do meio de
Murashige & Skoog (1962) (MS) e várias diluições dos macronutrientes: diluídos a metade
(MS/2), a um quinto (MS/5) e a um décimo (MS/10), sendo que a todos esses tratamentos in
vitro foram adicionados os micronutrientes de MS na composição original, 2% de sacarose,
100 mg L
-1
de myo-inositol e 0,1 mg L
-1
de tiamina, pH 5,8 (geleificado com 6 g L
-
¹ de Agar);
a utilização de diferentes intensidades luminosas como 14 µM m
-2
s
-1
, 41 µM m
-2
s
-1
e 50 µM
m
-2
s
-1
e escuro contínuo, além da verificação da influência da posição do segmento nodal da
planta matriz para regeneração de novas plantas. Todos os tratamentos foram mantidos em
sala de crescimento a temperatura de 26 ± 2 °C, fotoperíodo de 12 horas e irradiância de 40
µmol m
-2
s
-1
(com exceção aos experimentos nos quais variavam as intensidades luminosas).
As plantas alongadas e não alongadas foram transferidas para estufa, onde receberam soluções
nutritivas correspondentes às mesmas diluições do meio MS. Os resultados mostraram que a
45
desinfestação mais eficiente das sementes foi obtida com hipoclorito de sódio, detergente e
ácido clorídrico a 25 %. As plantas que apresentavam o maior alongamento do caule foram
cultivadas na diluição MS/5, intensidade luminosa de 14 µM m
-2
s
-1
, sendo provenientes de
segmentos nodais isolados da região mediana e basal do caule da planta matriz. Os demais
tratamentos originaram maior número de plantas não alongadas. Estas, ao serem transferidas
para casa de vegetação apresentaram 100% de sobrevivência quando regadas com a solução
nutritiva contendo a metade dos macronutrientes do meio MS. As demais plantas que
apresentavam o alongamento do caule permaneceram em cultivo, constituindo um importante
material para fornecimento de outros segmentos nodais utilizados como explantes,
viabilizando a formação de clones. Por meio do protocolo de cultivo in vitro estabelecido
neste trabalho, é possível obter-se a partir de uma única semente, após um ano, cerca de
15.000 plantas de A. strobilacea cultivadas em vasos.
ABSTRACT
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch is an epiphyte or saxicolous bromeliad.
Although possible to find this plant clones offered in the ornamental market, there aren't
reports about its production. Bromeliad species has been produced by in vitro cultivation. It
has been considered that this technique is suitable to obtain interesting phenotypes selection
and with phytosanitary quality. It's common the cultivations establishment using seeds.
However, A. strobilacea seeds presents a mucilage, causing contamination when transfered to
nutrition solution in vitro, being necessary to verify the possibility of alternative explant.
When seeds germinates in in vitro conditions, about 60% of the plants produced presents a
stem elongation, showed to the possibility of using the nodal segments a explants. The
objective of this work was to aprimored the ornamental bromeliad A. strobilacea in vitro
establishment by seeds and nodal segments, aim at production. A. strobilacea seeds were
collected from existents plants at the Mogi-Guaçu Biological Reserve and Experimental
Station at São Paulo. It were used 2 disinfestation protocols, using sodium hypochlorite and
chloridric acid. To investigate the possibility of nodal segments utilization like explants it
were established conditions whose would in the appearance of elongated plants like: nutrition
solution cultivation, using the Murashige & Skoog (1962) (MS) original composition and
many macronutrients dilutions: diluted at half (MS/2), at a fifth (MS/5) and at one tenth
(MS/10). It were added to all these in vitro treatments the MS micronutrients in the original
composition, 2% of saccharose, 100 mg L
-1
of myo-inositol and 0,1 mg L
-1
of thiamine, pH
5,8 (gelled with 6 g L-¹ of Agar); the utilization of different light intensities 14 µM m-¹ s-², 41
46
µM m-¹ s-² e 50 µM m-¹ s-² and continuous dark, besides the verification of the influence of
the nodal segment position at the originated from that plants production. All the treatments
were kept in growth rooms at 26 ± 2 °C temperature, photoperiod of 12 hours and irradiance
of 40 µmol m-² s-¹ (except the experiments in whose the light intensities changed). The
elongated and not elongated plants were transfered to the greenhouse, where they received
nutritious solutions corresponding to the same MS macronutrient dilutions. The results
showed that the best seed disinfestation was obtained with sodium hypochlorite, detergent and
chloridric acid at 25%. The plants whose presented the large stem elongation were cultivated
in the MS/5 dilution, light intensity of 14 µM m
-2
s
-1
, being from the isolated nodal segments
from median and basal regions in the plant stem. The other treatments originated high number
of not elongated plants. When these ones were transferred to the greenhouse presented 100%
of survival when irrigated with the nutritious solution containing half of the macronutrients of
MS solution. The plants that presented the stem elongation were kept in cultivation, becoming
an important material for the other nodal segments supplying like explants, making it possible
the formation of clones. Through the in vitro cultivation protocol established in this work, its
possible to obtain from only one seed, after one year, about 15.000 A. strobilacea plants
cultivated in flower-pots.
47
INTRODUÇÃO
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch é uma bromélia epífita ou
saxícola, de folhas finas e acanaladas contendo tricomas ao longo da lâmina foliar.
Possui o escapo floral verde com inflorescências avermelhadas em forma de cone,
sendo utilizada como planta ornamental (Reitz 1983, Figueiredo 2003 e Lawn 2008).
O extrativismo das árvores que servem de suporte para esta espécie em seu ambiente
natural resultou em uma drástica redução da população de A. strobilacea (Figueiredo
2003). Embora existam exemplares sendo comercializados, não foram encontradas
referências sobre a produção comercial dessa espécie. O desenvolvimento de
protocolos que visem à produção dessa espécie pode contribuir para aumentar o
fornecimento de exemplares para o mercado interno, contribuindo para a diminuição
do extrativismo.
O cultivo in vitro de bromélias tem sido considerado uma importante técnica
para otimizar a produção dessas plantas de modo a atender o mercado de
ornamentais, pois permite a seleção e a multiplicação de fenótipo de interesse com
qualidade fitossanitária (Arrabal et al. 2002, Mercier & Nievola 2003 e Rech-Filho et
al. 2005). Vários estudos têm sido realizados visando ao cultivo in vitro de bromélias
de interesse comercial e também das bromélias endêmicas, raras e/ou ameaçadas de
extinção (Arrabal et al. 2002, Rodrigues et al. 2004 e Rech-Filho et al. 2005).
Em muitos deles o estabelecimento do cultivo é iniciado a partir de sementes.
Entretanto, a presença de mucilagem envolvendo as sementes pode causar
contaminação como é o caso de A. nudicaulis (Grossi 2000). A. strobilacea também
possui mucilagem envolvendo as sementes. A presença de mucilagem pode
relacionar-se ao tipo de dispersão das sementes, por aves (Figueiredo 2003). Muitas
espécies de Bromeliaceae possuem síndrome de dispersão por endozoocoria, em que
o animal ingere o fruto e em seguida elimina o diásporo (Dittrich et al. 1999).
Faustino e Machado (2006) observaram a ave Schistoclamys ruficapillus
alimentando-se do fruto inteiro da bromélia Hohenbergia ramageana. Pipra
rubrocapilla (Pipridae) e Tangara faustuosa (Thraupinae) foram observados
dispersando os frutos de Canistrum aurantiacum (Siqueira Filho & Machado 2001).
Aechmea nudicaulis, também é citada como espécie ornitocórica no trabalho de
Gonçalves & Waechter (2003). Os frutos e sementes de Aechmea lindenii são
dispersos por pássaros das famílias Thraupidae e Pipridae, segundo trabalho
realizado por Lenzi et al. (2006).
48
Portanto, devido ao fato de serem utilizados pela fauna aliado à baixa
produção de sementes (Figueiredo 2003), há necessidade de investigar outro modo de
produção dessa espécie.
O estabelecimento do cultivo in vitro a partir de sementes ou de tecidos de
plantas provenientes do campo ou casa de vegetação requer a eliminação de
microorganismos do material para que não haja crescimento destes no interior do
frasco. A desinfestação superficial mais utilizada para sementes de Bromeliaceae tem
sido a submersão destas em solução diluída (1-20%) de hipoclorito de sódio,
adicionado de algumas gotas de Tween 20
®
, por diferentes tempos (5-30 min),
seguidas de enxágue com água destilada esterilizada antes de serem transferidos para
o meio de cultura (Mercier & Kerbauy 1997, Endres & Mercier 2001, Rech-Filho et
al. 2005 e Silva et al. 2007). Entretanto as sementes de A. strobilacea são envoltas
por uma mucilagem, de difícil remoção, responsável por facilitar o estabelecimento
de microorganismos, o que deve ser considerado ao testar um protocolo para
desinfestação das sementes dessa espécie. Grossi (2000) utilizou ácido clorídrico na
desinfestação de Aechmea nudicaulis, cujas sementes são envoltas por mucilagem, e
diminuiu a porcentagem de contaminações.
Além do processo de desinfestação, a seleção do meio de cultura mais
adequado é importante para o estabelecimento do cultivo uma vez que pode ser um
fator limitante para o crescimento e desenvolvimento das plantas cultivadas. O meio
nutritivo formulado por Murashige & Skoog (1962) (MS) desenvolvido a partir das
exigências nutricionais do tabaco, é freqüentemente utilizado em cultura de tecidos,
sendo também bastante comum no cultivo de bromélias (ver revisão em Mercier &
Kerbauy 1997). Entretanto, diluições dos macronutrientes desse meio podem ser mais
adequadas ao cultivo in vitro de diversas espécies desta família (Mercier & Kerbauy
1997; Tamaki et al. 2007; Kanashiro 2007).
Uma vez estabelecido o cultivo in vitro a partir de sementes, para muitas
espécies é possível a micropropagação por meio da utilização de fragmentos das
plantas mantidas em cultura, minimizando a contaminação, uma vez que o explante
usado está em condições assépticas, como por exemplo, gemas axilares (Almeida et
al. 2002, Silva et al. 2004), segmentos caulinares com uma ou mais gemas (Kiss et
al. 1995, Mendes et al. 2007) e ainda segmentos foliares (Fonseca et al. 1999). Por
meio dessa técnica é possível a obtenção de clones, o que é aconselhável quando o
objetivo é a produção (Mercier & Kerbauy 1997), devido à possibilidade de
homogeneizar o lote de plantas produzidas. Dentre os estudos, a maioria utiliza
49
reguladores de crescimento, porém, o uso destas substâncias tem sido associado à
indução de variações somaclonais dos tecidos (Pierik 1987, Zaffari et al. 2002, Joyce
et al. 2003). Tamaki et al. 2007, relataram não haver necessidade de fitorreguladores
na produção de mudas de abacaxizeiro por meio de segmentos nodais provenientes de
plantas cultivadas in vitro, submetidas às condições de estiolamento, como a
ausência de luminosidade, à semelhança do observado por Kiss et al. (1995),
Barboza & Caldas (2001) e Moreira et al. (2003). Contudo tem sido demonstrado
alongamento do caule associado a diferentes intensidades luminosas (Smalle et al.
1997, Haisel et al. 2001, Radmann et al. 2001). Para A. strobilacea não foram
encontradas referências sobre a presença do alongamento do caule na presença de
luz, situação necessária para o isolamento dos segmentos nodais.
Devido à presença de um gradiente basípeto de auxina ao longo do caule que
vai permitir a expressão de potenciais morfogenéticos específicos, a regeneração de
nós in vitro pode depender da posição que o explante ocupa no eixo caulinar da
planta matriz (Termignoni 2005), como observado para batata (Pereira et al. 2005),
Quercus robur (Puddephat et al. 1997) e Citrus (Schinor et al. 2006). Na espécie de
bromélia Ananas comosus foi observado que há diferenças na regeneração dos
segmentos nodais se estes forem provenientes de planta com o ápice ou sem o ápice,
sendo que os primeiros originaram em nova planta em 15 dias e os outros não
desenvolveram gema (Souza et al. 2003).
Uma vez regeneradas as plantas, a etapa seguinte que visa à produção é a
retirada destas das condições in vitro para o crescimento em vasos, em casa de
vegetação, sendo necessário o fornecimento de nutrientes, como descrito para
Bupleurum kaoi (Chen et al. 2006) e Hibiscus moscheutos (Preece & West 2006), por
exemplo. Freqüentemente utilizam-se fertilizantes comerciais, como o adubo
comercial Peter nas proporções 20N-20P-20K (Valero-Aracama et al. 2007) ou de
soluções nutritivas em baixa concentração, em relação ao meio de cultura (Tadesse et
al. 2000). Rech-Filho (2005), trabalhando com Vriesea reitzii utilizaram como
substrato turfa mineral suplementada com N-4, P
2
O
5
-14, K
2
O-8. Benzing (2000)
relata que as bromélias desenvolveram adaptações para sobreviver em ambientes com
baixa disponibilidade nutricional condição diferente daquela na qual são cultivados
in vitro, indicando haver diferenças nas necessidades nutricionais das plantas,
quando compara-se a condição in vitro com a ex vitro.
Figueiredo (2003) estabeleceu a micropropagação de A. strobilacea com uso
de reguladores de crescimento. Entretanto, esse autor não documenta a porcentagem
50
de contaminação das sementes, o rendimento do protocolo além de mencionar a
adubação das plantas quando transferidas para as condições ex vitro, dado importante
para a produção da espécie.
O objetivo deste trabalho foi aprimorar o cultivo in vitro da bromélia
ornamental Acanthostachys strobilacea a partir de sementes e desenvolver protocolo
para a micropropagação dessa espécie a partir de segmentos nodais e posterior
aclimatação das plantas em casa de vegetação.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta de sementes
Sementes de Acanthostachys strobilacea foram coletadas na Reserva Biológica e
Estação Experimental de Mogi-Guaçu, SP. Para evitar que as sementes fossem
utilizadas pela avifauna, alguns frutos imaturos foram envolvidos por um tecido fino
amarrado à planta por um fio metálico (figura 1). Assim que atingiram a maturidade,
os frutos foram removidos e levados ao laboratório da Seção de Ornamentais do
Instituto de Botânica de São Paulo. As sementes foram retiradas dos frutos e
depositadas em caixas do tipo gerbox, abertas, para diminuir a umidade da
mucilagem que as envolve. Em seguida, foram acondicionadas em sacos de papel e
armazenadas em geladeira a 10 °C até a montagem dos experimentos. As sementes
permaneceram armazenadas por aproximadamente um ano.
51
Figura 1. Aspecto do fruto de A. strobilacea envolvido com tecido para evitar a ingestão por
pássaros.
52
Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de sementes
Sementes de Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch, foram
submetidas a dois protocolos de desinfestação: TH – 100 sementes foram imersas em
etanol 70 % por 5 min; fungicida (Benomyl 0,1 %) por 15 min, e posteriormente com
hipoclorito de sódio por 1 hora com 2 gotas de Tween 20
, sendo mantidas sob
agitação; TC - 100 sementes foram imersas em solução de hipoclorito de sódio
comercial (2 % de cloro ativo) acrescido de 2 gotas de Tween 20
mantidas sob
agitação por 20 minutos. Foram então transferidas para uma solução aquosa de HCl
(ácido clorídrico) a 25 % por 10 minutos. Após enxágue com água destilada, as
sementes foram colocadas em etanol 70 % por 5 minutos, e em seguida em fungicida
(Benomyl 0,1 %), por mais 15 minutos e posteriormente em hipoclorito de sódio
comercial com 2 gotas de Tween 20
por 1 hora sob agitação.
Para cada tratamento, as sementes foram distribuídas igualmente em 10 placas
de Petri (10 sementes por placa) contendo 15 mL de solução de sacarose a 2 %, pH
5,8, geleificada com agar (6 g L
-
¹), esterilizada em autoclave por 15 minutos a 121
°C. As placas foram mantidas em sala de crescimento à temperatura de 26 ± 2 °C,
fotoperíodo de 12 horas e irradiância de 40 µmol m
-
² s
-
¹, fornecida por lâmpadas
fluorescentes (Osram
®
, super luz do dia 40 W). Após 20 dias foram calculadas a
porcentagem de sementes não contaminadas e de emergência das plantas.
Assim que se estabeleceu o protocolo de desinfestação, foi avaliada a diluição
ideal dos macronutrientes da solução de Murashige & Skoog (1962). Foram testadas
3 diluições: metade (MS/2), um quinto (MS/5) e um décimo (MS/10). A todos esses
tratamentos foram adicionados micronutrientes de MS, 2% de sacarose, 100 mg L
-1
de myo-inositol e 0,1 mg L
-1
de tiamina. O pH foi de 5,8. Os meios foram
geleificados (6 g L
-
¹ de Agar) e esterilizados em autoclave por 15 minutos a 121 ºC.
Para cada tratamento utilizaram-se 5 frascos de vidro de 250 mL de capacidade com
40 mL de meio cada, com 5 sementes por frasco, por tratamento. Estes foram
mantidos em sala de crescimento à temperatura de 26 ± 2 °C, fotoperíodo de 12 horas
e irradiância de 40 µmol m
-
² s
-
¹, fornecida por lâmpadas fluorescentes (Osram
®
,
super luz do dia 40 W).
Após três meses, as plantas foram avaliadas quanto ao número de folhas e
raízes, comprimento da raiz e massa fresca e seca das partes aérea e radicular. O
experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com 5
53
repetições, sendo cada repetição constituída de 5 explantes. A comparação entre as
médias dos tratamentos foi realizada pelo teste de Tukey (α = 0,05).
Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de segmentos nodais
Inicialmente avaliou-se a influência da luz sobre o alongamento de A.
strobilacea com o objetivo de obterem-se segmentos nodais isolados.
Sementes de A. strobilacea foram desinfestadas e transferidas para o meio de
cultivo considerado mais adequado. Cinco frascos contendo 5 sementes cada foram
colocados por três meses, em câmaras de germinação ajustadas para diferentes
intensidades luminosas: 14 µM m
-2
s
-1
, 36 µM m
-2
s
-1
e 50 µM m
-2
s
-1
e escuro
contínuo, todos sob temperatura de 26 ± 2 °C. Os parâmetros utilizados para a
análise comparativa do crescimento e desenvolvimento dessas plantas foram: número
de folhas e raízes por planta, tamanho da raiz, teores de massa fresca e seca das
partes aérea e radicular e o número de segmentos nodais provenientes do eixo
caulinar alongado das plantas. O delineamento experimental adotado foi inteiramente
casualizado com 5 repetições, sendo cada repetição constituída por 5 plantas. A
comparação entre as médias dos tratamentos foi realizada pelo teste de Tukey (α =
0,05).
Com o objetivo de verificar a influência da posição do explante no eixo
caulinar sobre o alongamento das plantas regeneradas, segmentos nodais
provenientes de plantas com 60 dias de idade foram isolados e transferidos para o
meio de cultura onde permaneceram.
Os segmentos nodais foram classificados em apical (o mais próximo à gema
apical), basais (o mais próximo à base) e medianos, considerados aquele situado os
outros dois. Cinco segmentos nodais correspondentes a cada uma das três posições
foram transferidos para frasco de vidro de 250 ml de volume, fechados com tampa
plástica e contendo 40 ml de meio nutritivo. Foram utilizados 5 frascos por
tratamento contendo 5 explantes por frasco, mantidos em sala de cultura com 50
µmol m
-
² s
-
¹ de luminosidade. Após 3 meses de cultivo foram avaliados o número de
nós, folhas e raízes, tamanhos do caule e da raiz das plantas obtidas a partir do
desenvolvimento das gemas laterais. O experimento foi realizado em delineamento
inteiramente casualizado e as médias foram submetidas à análise de variância fator
único, para comparação entre as médias, foi aplicado teste de Tukey com nível de
significância de 5 %.
54
Transferências das plantas de A. strobilacea para casa de vegetação
Plantas com 2 meses de idade, alongadas e não alongadas provenientes do
desenvolvimento da gema lateral de segmentos nodais apicais, medianas e basais
foram transferidas para condições ex vitro. Foram utilizadas 288 plantas, sendo a
metade apresentando eixo caulinar alongado e a outra metade sem o alongamento do
caule, distribuídas em 5 tratamentos dispostas em três blocos. Após serem retiradas
dos frascos, as raízes foram lavadas em água corrente de modo a remover o meio de
cultura, e transferidas para vasos plásticos com capacidade para 500 mL contento
substrato de casca de pinus fina, em casa de vegetação. Semanalmente, as plantas
recebiam adubação que consistia de 50 mL por planta de solução de Murashige &
Skoog (1962), composta por diferentes concentrações de macronutrientes: MS
completo, MS/2, MS/5, MS/10, MS/100. No inicio do cultivo as plantas receberam
doses semanais de solução a 1 % de benomyl (fungicida) no período de quatro
semanas, e foram aplicadas duas doses de inseticida actara
®
(0,1 g/l). Após 8 meses
de cultivo, as plantas foram avaliadas quanto ao número e tamanho de folhas, massas
fresca e seca das partes aérea e radicular.
Para medir o comprimento do caule, as plantas tiveram suas folhas removidas
e desconsideradas.
RESULTADOS
Desinfestação
A tabela 1 mostra os resultados do teste de desinfestação, onde as sementes de
desinfestadas com álcool etílico e hipoclorito de sódio apresentaram uma taxa de
contaminação de 40 %, contudo, o tratamento que incluiu a adição da solução a 25 %
de ácido clorídrico propiciou uma redução nessa taxa, chegando a 3 %, o que
mostrou ser esse o protocolo mais adequado para essa espécie. Observou-se que em
ambos os tratamentos a porcentagem de germinação foi de 100%, e a emergência da
plântula ocorreu em 8 dias.
55
Tabela 1 – Porcentagem de contaminação e germinação in vitro de sementes de A. strobilacea (n=10
com 5 repetições), após 20 dias de inoculação.
Método de desinfestação de sementes
Respostas observadas
Hipoclorito de sódio
Hipoclorito de sódio +
Ácido clorídrico
% Sementes contaminadas 40 3
% Porcentagem de emergência da plântula 100 100
Composição nutricional do meio de cultura
A tabela 2 mostra que as plantas cultivadas em MS completo e MS/5
apresentaram maiores números de folhas produzidas (15), quando comparadas aos
meios MS/2 e MS/10 (12 e 11 unidades respectivamente). Em relação ao
comprimento e número de raízes, não houve diferenças significativas entre os
tratamentos MS/2 e MS/5 e MS. Entretanto, as plantas cultivadas em MS/10
apresentaram raízes em menor número e tamanho (5 raízes, de 11,68 cm de
comprimento em média) em relação aos demais tratamentos.
O tratamento que induziu o maior número de segmentos nodais foi o MS/5
(tabela 2), mostrando ser esse o meio mais adequado à obtenção de plantas alongadas
das quais pudesse se utilizar os nós como explantes. Apenas em relação ao número
de nós que as plantas cultivadas nessa condição diferenciaram-se daquelas mantidas
em MS completo. Para os demais parâmetros, quantidade de folhas, ao comprimento
e número de raízes não houve diferenças significativas quando se adicionou a
concentração original do meio de Murashige & Skoog (1962).
Tabela 2 – Parâmetros biométricos de A. strobilacea cultivadas in vitro a partir de sementes em
diferentes diluições de macronutrientes do meio de Murashige & Skoog (1962).
Tratamentos
Número
de folhas (un)
Número
de nós (un)
Comprimento
da raiz (cm)
Número
de raiz (un)
MS completo 15 a 8 b 12,92 a 8 a
MS/2 12 b 4 c 14,94 a 6 ab
MS/5 15 a 14 a 11,42 a 6 ab
MS/10 11 c 6 c 11,68 a 5 b
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si
pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
A tabela 3 mostra que não foram observadas diferenças significativas no
acúmulo de matéria fresca e seca da parte aérea de plantas de A. strobilacea quando
cultivadas in vitro em qualquer das diluições de macronutrientes de MS utilizadas. É
importante salientar que as amostras eram compostas pelo caule e folhas. Em relação
56
ao sistema radicular, apenas as plantas cultivadas no tratamento MS/10 é que
apresentaram maior conteúdo de massa fresca. Para as plantas dos outros tratamentos
não foram observadas diferenças significativas quanto às quantidades de massa
fresca e seca das raízes.
Tabela 3 – Massa fresca e seca das partes aérea e radicular de plantas produzidas a partir de
sementes de Acanthostachys strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962)
com diferentes diluições de macronutrientes.
Parte aérea Raiz
Massa fresca (g) Massa seca (g) Massa fresca (g) Massa seca (g)
MS 0,24 a 0,02 a 0,06 b 0,01 a
MS/2 0,24 a 0,02 a 0,07 b 0,01 a
MS/5 0,20 a 0,02 a 0,05 b 0,01 a
MS/10 0,19 a 0,01 a 0,14 a 0,01 a
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
Observou-se, portanto, que a diluição dos macronutrientes de MS à 1/5
possibilitou o desenvolvimento de A. strobilacea de maneira semelhante à utilização
da composição original (MS completo), com a vantagem de que nessa diluição foi
observado significativo número de segmentos nodais visíveis a olho nu, indicando
ser essa a concentração que produz plantas das quais se pode utilizar o maior número
possível de segmentos nodais como explantes para obtenção de novas plantas.
Intensidade luminosa
A figura 2 mostra plantas de A. strobilacea cultivadas no escuro contínuo a
partir de sementes, apresentando aspecto estiolado, mantidas na intensidade de 50
µM m
-2
s
-1
, não sendo possível visualizar os segmentos nodais separados pelo
entrenó, e na intensidade de 14 µM m
-2
s
-1
, onde as plantas apresentaram eixo
caulinar alongado, sendo possível visualizar a olho nu cinco segmentos nodais.
A tabela 4 mostra os resultados de crescimento das plantas mantidas em
diferentes intensidades luminosas. Somente foi possível observar o número de
segmentos nodais nas plantas mantidas em 14 µM m
-2
s
-1
ou naquelas que
permaneceram no escuro (número médio de 5 e 3 respectivamente). Entretanto, o
maior comprimento do caule ocorreu nas plantas mantidas na ausência de luz. A
menor intensidade luminosa induziu uma menor quantidade de folhas que os
57
tratamentos de luz mais intensa. As plantas mantidas no escuro tinham a menor
quantidade de folhas que os demais tratamentos.
Os resultados mostram que a intensidade luminosa teve pouca influência no
crescimento e desenvolvimento das raízes. Cada planta produziu cerca de 2 a 3 raízes
(tabela 4), que variavam entre 12 e 13 centímetros. Contudo, as raízes cresceram
menos nas plantas mantidas no escuro do que naquelas cultivadas na presença de luz.
58
Figura 2.
Acanthostachys strobilacea cultivada in vitro sob temperatura de 26 ± 2 ºC,
submetida ao (A) escuro contínuo, (B) intensidade de 50 µM m
-1
s
-2
sem alongamento caulinar
e (C) intensidade de 14 µM m
-1
s
-2
, apresentando alongamento do eixo caulinar.
59
Tabela 4 – Análise biométrica de plantas com 3 meses de idade produzidas a partir de sementes de
Acanthostachys strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes
diluído à um quinto por três meses, em diferentes condições de luminosidade em fotoperíodo de 12 horas.
Número de
folhas (un)
Comprimento
do caule (cm)
Número de
raiz (un)
Comprimento da
raiz (cm)
Número de
segmentos nodais
(un)
Escuro
contínuo
4 c 7,50 a 2 a 7,09 b 3 b
14 µM m
-2
s
-1
9 b 5,50 b 2 a 12,51 a 5 a
41 µM m
-2
s
-1
11 a 0,5 c 3 a 13,02 a __
50 µM m
-2
s
-1
11 a 0,5 b 3 a 13,05 a __
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de
Tukey com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
A tabela 5 mostra que as plantas mantidas na ausência de luz apresentaram
menores teores de massas fresca e seca tanto da parte aérea, quanto da raiz, seguidas
daquelas cultivadas na intensidade luminosa baixa. As plantas mantidas nas 3
maiores intensidades luminosas 41 e 50 µM m
-1
s
-2
tinham mais massa fresca.
Entretanto, comparando-se a massa seca da parte aérea das plantas cultivadas em
condições de luminosidade, àquelas que cresceram sob menor intensidade (14 µM m
-1
s
-2
), foram diferentes significativamente em relação àquelas cultivadas na maior
intensidade (50 µM m
-1
s
-2
), (0,019 g e 0,028 g, respectivamente). Não foram
observadas diferenças significativas no acúmulo de massas fresca e seca da raiz nas
intensidades luminosas de 41 e 50 µM m
-1
s
-2
. Todavia, as plantas crescidas na menor
intensidade luminosa tinham menos massa fresca e seca das raízes quando
comparadas àquelas mantidas nas maiores intensidades. O tratamento que foi menos
propício ao desenvolvimento das raízes das plantas foi o de ausência de luz.
Tabela 5 – Massa fresca e seca das partes aérea e radicular de plantas produzidas a partir de
sementes de Acanthostachys strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962)
com macronutrientes diluídos a um quinto por três meses, em diferentes condições de luminosidade
em fotoperíodo de 12 horas.
Parte aérea Raiz
Massa fresca (g) Massa seca (g) Massa fresca (g) Massa seca (g)
Escuro contínuo 0,088 d 0,003 c 0,005 c 0,001 c
14 µM m
-1
s
-2
0,223 c 0,019 b 0,034 b 0,004 b
41 µM m
-1
s
-2
0,317 b 0,021 b 0,091 a 0,007 a
50 µM m
-1
s
-2
0,472 a 0,028 a 0,079 a 0,010 a
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
60
A tabela 4 mostra que ocorreum uma maior diferenciação na quantidade de
segmentos nodais visíveis a olho nu nas plantas incubadas sob intensidade luminosa
de 14 µM m
-1
s
-2
. Esses dados foram quantificados e apresentados na forma de
número médio de segmentos nodais por planta. Entretanto, observou-se que cerca de
10 % das plantas não alongaram. Este resultado sugere que outro fator esteja
envolvido no alongamento caulinar além da intensidade luminosa. Os resultados do
experimento de posição do nó, descritos a seguir, corroboraram essa hipótese.
Efeito da posição do nó
A tabela 6 mostra os resultados dos parâmetros biométricos de plantas
regeneradas a partir de segmentos nodais provenientes de diferentes posições no eixo
caulinar da planta matriz. Foi possível observar que a origem do nó influenciou no
crescimento e desenvolvimento de A. strobilacea. Verificou-se que explantes
originários das regiões mediana e basal do caule produziram plantas com maior
alongamento do eixo caulinar, possibilitando maior visualização dos nós a olho nu,
facilitando seu isolamento para utilização como explante. Já os segmentos nodais de
origem apical produziram plantas com menor alongamento quando comparados aos
demais segmentos nodais.
Tabela 6 – Análise biométrica de plantas produzidas a partir de segmentos nodais de Acanthostachys
strobilacea com três meses de idade originários de diferentes posições no caule alongado cultivados em meio
de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes diluído a um quinto por três meses.
Número de
folhas (un)
Comprimento da
parte aérea (cm)
Número de
raiz (un)
Comprimento da
raiz (cm)
Número de
segmentos nodais
(un)
Apical 10 b 12,00 a 3 b 16,81 a 3 b
Mediana 13 a 10,97 a 5 a 14,54 b 9 a
Basal 12 a 11,59 a 3 b 16,83 a 8 a
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
A tabela 7 mostra que o acúmulo de massa fresca e seca da parte aérea de A.
strobilacea não foi influenciado pela origem do explante. Para raiz, observou-se que
o segmento proveniente da região apical da planta matriz produziu raízes com maior
massa fresca e seca em relação àqueles retirados das regiões mediana e basal.
61
Tabela 7 – Análise de massa fresca e seca das partes aérea e radicular de plantas com três meses de idade
produzidas a partir de segmentos nodais de Acanthostachys strobilacea originários de diferentes posições no
caule alongado cultivados em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes diluído a um quinto
por três meses.
Parte aérea Raiz
Massa fresca (g) Massa seca (g) Massa fresca (g) Massa seca (g)
Apical 0,296 a 0,015 a 0,106 a 0,007 a
Mediana 0,303 a 0,018 a 0,073 b 0,005 b
Basal 0,290 a 0,014 a 0,059 b 0,004 b
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
Os resultados do estudo da intensidade luminosa na produção de plantas
mostraram que a intensidade luminosa de 14 µM m
-2
s
-1
foi a mais adequada à
produção de segemtnos nodais. Quando esses segmentos foram isolados e
subcultivados, as plantas mais alongadas foram àquelas provenientes das regiões
medianas e basais.
Cultivo em casa de vegetação
A tabela 8 mostra os resultados referentes aos parâmetros biométricos e massa
fresca e seca das partes aérea e radicular das plantas que receberam as soluções
nutritivas contendo macronutrientes do meio de Murashige e Skoog (1962) (MS/2,
MS/5, MS/10 e MS/100) além daquelas adubadas com a concentração original desse
meio. A figura 3 mostra o aspecto geral das plantas após o período de cultivo.
Os maiores valores significativos entre todos os tratamentos para cada
parâmetro avaliado foram observados nas plantas regadas com MS completo e com a
diluição dos macronutrientes à metade (MS/2). Com a menor concentração dos
macronutrientes, as plantas apresentaram menores valores dos parâmetros analisados.
Plantas regadas com MS/100 produziram menor quantidade de folhas por planta, sem
apresentar diferenças significativas da solução diluída a um décimo (MS/10). Em
relação aos teores de massa fresca das partes aérea e radicular, observa-se que quanto
mais diluído o meio menor o acúmulo de matéria fresca tanto na parte aérea quanto
na raiz.
62
Figura 3. Plantas de A. strobilacea regeneradas a partir do cultivo in vitro de segmentos
nodais, transferidas para condições ex vitro cultivadas por 8 meses adubadas com diferentes
diluições dos macronutrientes do meio nutritivo de Murashige & Skoog (1962): (1) MS
diluído à 1/100, (2) MS diluído à 1/10, (3) MS diluído à 1/5, (4) MS diluído à ½ e (5) MS
completo. (A) plantas nos vasos - (B) após retirada das plantas para avaliação.
63
Tabela 8 – Quantidade e tamanho de folhas, massas fresca e seca das partes aéreas e radicular de
plantas cultivadas ex vitro com 8 meses de idade regeneradas via segmentos nodais cultivados in
vitro por dois meses em meio MS/5 sob temperatura de 26 ± 2 ºC, fotoperíodo de 12 horas e
intensidade luminosa 40 µM m
-1
s
-2
.
Parte aérea Raiz
Tratamentos
Número
de folhas
(un)
Comprimento das
folhas (cm)
Massa
fresca (g)
Massa
seca (g)
Massa
fresca (g)
Massa
seca (g)
MS completo 51 a 50,75 a 76,04 a 7,97 a 44,46 a 5,95 a
MS/2 41 a 48,12 a 46,66 b 4,99 b 39,15 a 4,48 a
MS/5 28 b 40,75 b 22,14 c 2,38 c 18,98 b 2,56 b
MS/10 19 bc 23,44 c 9,60 d 1,06 cd 10,23 bc 0,84 c
MS/100 10 c 4,89 d 0,54 d 0,06 d 1,41 c 0,17 c
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
Os resultados do experimento de adubação mostraram que a diluição de MS/2
pode ser adequada ao crescimento das plantas. Comparando-se os dados da tabela 8
aos das tabelas 2 e 3 é possível observar que no cultivo ex vitro as plantas
apresentam melhor crescimento em solução contendo maior concentração de
macronutrientes do que na condição in vitro. Não foi observado alongamento do eixo
caulinar quando cultivada na casa de vegetação, sugerindo que o surgimento deste
fenótipo esteja relacionado com as condições do cultivo in vitro, as quais as plantas
são submetidas.
DISCUSSÃO
O cultivo in vitro a partir de sementes foi estabelecido para diversas espécies
de bromélias, como descrito por Mercier & Kebauy (1992), Grossi (2000), Nievola et
al. (2001), Pickens et al. (2003), Rech-Filho (2005), Pickens et al. (2006), Bellintani
et al.(2007), Kanashiro et al. (2007), dentre outros. As sementes presentes nas
espécies de Bromeliaceae podem apresentar apêndices que podem ser plumosos ou
aliformes, ou serem desprovidas de apêndices. Na subfamília Pitcairnioideae ocorrem
sementes aladas. Em Tillandsioideae as sementes são plumosas e nas Bromelioideae
as sementes não possuem apêndices (Moreira et al. 2006), como é o caso de
Acanthostachys strobilacea estudada neste trabalho. A maioria das espécies
cultivadas in vitro possui sementes com apêndice plumoso, tais como Tillandsia,
Vriesea gigantea, Vriesea
philippocoburgii
Alcantarea imperialis, Guzmania. Para a
desinfestação destas é comumente utilizada solução de hipoclorito de sódio
adicionada de detergente. Entretanto, o cultivo in vitro iniciado a partir de sementes
64
de Bromeliaceae que apresentam mucilagem como A. strobilacea é pouco
documentado. Grossi (2000) utilizou ácido clorídrico à 25 % no processo de
desinfestação para remover a mucilagem das sementes de Aechmea nudicaulis. Neste
trabalho o uso desse ácido também foi mais eficiente para desinfestação das sementes
de A. strobilacea.
O uso de ácido clorídrico também foi documentado para outras espécies cujas
sementes são envolvidas por mucilagem, como é o caso do tomateiro (Marigoni et al.
1994). Porém, segundo os autores, esse tratamento causou uma redução na
emergência das plântulas. Já as sementes de gabiroba que também são envoltas por
uma mucilagem, o uso de ácido clorídrico para a desinfestação não afetou a
qualidade das mesmas (Camona et al. 1994), da mesma forma que descrito neste
trabalho para A. strobilacea.
O desenvolvimento satisfatório das plantas cultivadas in vitro a partir das
sementes pode depender da composição do meio de cultivo. O meio de cultura mais
utilizado para o cultivo de bromélias é a formulação de Murashige e Skoog (1962)
(Mercier & Kerbauy 1997), entretanto essa composição pode ter algumas
modificações de modo a atender necessidades específicas de cada espécie (Chen et
al. 2006, Bellitani 2007). Contudo, neste trabalho, ao iniciar-se o estabelecimento do
cultivo de Acanthostachys strobilacea em diferentes diluições dos macronutrientes
do meio MS, foi verificado que em todos os tratamentos existiam plantas com eixo
caulinar alongado, diferente do que é observado na natureza. Esse aspecto
possibilitou que se utilizassem os segmentos nodais isolados de matrizes para
obtenção de novas plantas. Assim, observou-se que o meio MS/5 induziu a um
alongamento tal que permitiu a visualização melhor dos nós de modo a facilitar o
isolamento destes e posterior transferência para meio novo, potencializando a
obtenção de plantas. Gomes & Shepherd (2000), trabalhando com Sinningia
allagophyla, uma espécie herbácea nativa do cerrado, observaram uma diminuição do
eixo principal em solução de MS contendo menores concentrações de KH
2
PO
4
(1,7
mg L
-1
) diferentemente dos resultados obtidos com A. strobilacea que apresentou um
aumento do seu eixo caulinar utilizando-se 0,027 mg L
-1
desse sal (concentração
encontrada em MS/5). Assim, à semelhança de outras bromélias epífitas (Mercier &
Kerbauy 1992, Tamaki et al. 2007), A. strobilacea apresentou maior crescimento
quando cultivada em soluções diluídas dos sais de Murashigue & Skoog (1962).
Apesar de o maior alongamento ocorrer em plantas cultivadas em MS/5, não
foi observada diferença significativa no acúmulo de matéria fresca da parte aérea das
65
plantas em relação aos tratamentos, provavelmente devido à amostra de massa fresca
conter além do caule, as folhas das plantas. Contudo plantas cultivadas em MS/10
apresentaram maiores teores de matéria fresca na raiz, provavelmente devido a um
acúmulo maior de água em relação às plantas dos demais tratamentos, uma vez que
na análise de matéria seca não apresentou diferenças significativas em relação aos
demais meios nutritivos empregados neste estudo.
Kerbauy & Mercier (1997) verificando o efeito de diferentes fontes
nitrogenadas no crescimento in vitro de três espécies de bromélias, constataram um
aumento no comprimento da parte aérea da epífita Tillandsia pohliana, na presença
de NH
4
NO
3
na concentração de 16 mM de N, concentração esta semelhante à
encontrada em MS/5 (12,01 mM de N). De acordo com Benzing & Renfrow (1974) as
bromélias possuem
alta afinidade para os minerais em soluções muito diluídas
absorvendo-os rapidamente quando se tornam disponíveis no ambiente. Tamaki et al.
(2007) estudando o efeito de diferentes diluições do meio MS no crescimento de
Ananas comosus, concluíram que o cultivo pode ser feito em MS/5 e que diminuição
dos conteúdos de massa seca e fresca somente ocorreu em diluições dos
macronutrientes de MS acima de 60 vezes. Kanashiro et al. (2007) estudando
Aechmea blanchetiana, mostram que concentração de 7,5 mM de nitrogênio do meio
MS foi ótima para produção de massa seca e fresca, esta concentração corresponde a
aproximadamente ao MS/10 utilizado neste trabalho.
A propagação em massa de A. strobilacea por segmentos nodais possibilita a
otimização da produção, pois a partir de uma semente é possível obter-se pelo menos
mais três plantas, conforme demonstrado neste trabalho. Portanto as plantas
cultivadas em MS/5 podem ser uma alternativa ao cultivo por sementes, já que com o
caule alongado torna-se muito fácil isolar segmentos nodais e cultivá-los de modo a
produzir clones desta planta.
A utilização de segmentos nodais como explantes é comum no cultivo in vitro
de diversas espécies (Bordón et al. 2000, Nhut 1998), porém, em sua maioria, são
utilizados reguladores de crescimento no processo de regeneração de plantas a partir
dos explantes (Parabia et al. 2007, Kiss et al. 1995). Contudo, métodos que evitem o
uso dessas substâncias são recomendáveis, pois variações somaclonais podem estar
associadas à utilização destas (Joyce et al. 2003). Este trabalho mostrou que
segmentos nodais de A. strobilacea possuem taxa de regeneração de 100 % na
ausência de reguladores de crescimento semelhante a Ananas comosus demonstrado
nos trabalhos de Tamaki et al. (2007) e Souza et al. (2003).
66
Apesar da maioria das plantas cultivadas em MS/5 apresentarem o
alongamento do caule, em cerca de 10 % não ocorria esse alongamento (dados não
mostrados). Com intuito de verificar as causas desse alongamento não uniforme, foi
investigada a influência da luz no alongamento já que se trata do fator
freqüentemente associado a fenômenos como esse, pois segundo Von Arnim & Deng
(1996) a intensidade luminosa e a composição do comprimento de onda são fatores
importantes na determinação da velocidade do crescimento celular, no acúmulo de
pigmentos e na diferenciação de plastídeos.
A micropropagação de plantas por meio do alongamento do eixo caulinar é
bastante documentada para abacaxizeiro (Nievola et al. 2005; Moreira et al. 2003;
Kiss et al. 1995), utilizando plantas estioladas devido a condições de ausência de
luminosidade. Contudo, A. strobilacea apresentou maior número de segmentos
nodais visíveis no claro (14 µM m
-1
s
-2
) do que no escuro. Na presença de luz, os
segmentos nodais produzidos possuíam diâmetro maior em relação às plantas
estioladas no escuro, além de apresentar clorofila, indicando capacidade
fotossintética pelo explante (dados não mostrados).
Kodym & Zapata-Aria (1999), cultivando meristema apical de Musa
acuminata sob diferentes intensidades luminosas, 65 µmol m
-2
s
-1
em sala de cultura
e 570 µmol m
-2
s
-1
em ambiente natural, observaram que maiores taxas de
multiplicação foram observadas nas plantas que estavam submetidas a maiores
intensidades luminosas. Apesar de altas taxas de regeneração para algumas espécies
ocorrer em altas irradiâncias, a tecnologia de cultura de tecidos foi desenvolvida
usando baixas intensidades luminosas (15 – 65 µmol m
−2
s
−1
). Lee & Wetzstein
(1988) constataram que níveis de luz excedendo a 315 µmol m
−2
s
−1
induziu a clorose
foliar no cultivo de Liquidambar sp.. Exposição a alta irradiância pode levar à
fotoinibição e à fotooxidação danificando o aparato fotossintético potencializado por
fatores adicionais de estresse como baixos níveis de CO
2
e altas temperaturas
(Powels 1984).
Radmann et al. (2001), estudando a influência da densidade do fluxo luminoso
na multiplicação de Gypsophila paniculata, observaram que mesmo em condições de
luminosidade as plantas apresentaram alongamento do eixo caulinar. Esses autores
verificaram não existir diferenças significativas em relação ao número de entrenós,
entretanto, as plantas submetidas a 15,705 W.m
-2
de
densidade de fluxo luminoso
apresentaram maior comprimento dos entrenós em relação às plantas dos demais
tratamentos que tinham maior intensidade (41,88 e 83,79 W.m
-2
).
67
Os resultados apresentados neste trabalho mostram que para o crescimento e
desenvolvimento de A. strobilacea não houve diferenças em relação às intensidades
luminosas estudadas (14, 41 e 50 µM m
-1
s
-2
), podendo ser utilizada qualquer uma
delas, entretanto a menor intensidade estudada (14 µM m
-1
s
-2
) favoreceu o
alongamento do eixo caulinar facilitando a utilização dos segmentos nodais como
explante. Contudo, mesmo na intensidade de luz menor, o alongamento não era
observado em 100% das plantas cultivadas in vitro. Devido a esse resultado,
procurou-se investigar se a posição do segmento nodal, retirado das plantas matrizes
poderia estar influenciando o desenvolvimento das plantas em função de um
gradiente hormonal auxina/citocinina presente no eixo caulinar. É necessário
ressaltar que os segmentos nodais isolados eram obtidos de várias plantas, que
tinham seus caules seccionados, não havendo distinção do segmento nodal em
relação à sua posição no caule. Ou seja, todos os nós eram transferidos
indistintamente para os frascos de cultivo.
O eixo caulinar das plantas pode apresentar gradiente basípeto de auxina e
acrópeto de citocinina. Raízes são os principais centros produtores de citocinina,
porém, outros sítios de produção de citocinina são identificados em algumas
espécies. Este fitorregulador é transportado para a parte aérea via xilema e atuam,
entre outros, na formação de gemas caulinares, em sinergismo com auxina, que é
produzida no ápice caulinar e tecidos jovens e possuem um transporte basípeto
(Mercier 2004).
Estudos mostram que balanços hormonais com elevada proporção de
citocinina favorecem a diferenciação em gemas caulinares e de ao contrário, elevada
proporção relativa de auxina induz a diferenciação de raízes nos tecidos
parenquimáticos da medula (Skoog & Miller, 1956). Assim a razão citocinina/auxina
que pode estar presente no segmento nodal isolado pode interferir na morfogênese da
planta obtida a partir do desenvolvimento da gema lateral.
Este trabalho mostrou que independentemente do local de origem, todos os
segmentos nodais regeneraram via organogênese direta, por volta do décimo dia após
a deposição no meio nutritivo sem a transição para a fase de calo. No caso do
explante já possuir células meristemáticas, ocorre organogênese direta, sendo que
melhores resultados são atingidos a partir da utilização de tecidos jovens, os quais
possuem maior competência organogenética, e explantes com tecidos meristemáticos,
que são encontrados em gemas caulinares apicais e axilares. A competência é
68
entendida como a capacidade de responder ao estímulo hormonal necessário a
formação do órgão (Peres, 2002).
Além disso, foi observado que a origem do explante nodal em relação a sua
localização no eixo caulinar da planta matriz interferiu no alongamento das plantas
desenvolvidas. Estudos têm demonstrado que a posição do explante no eixo caulinar
da planta pode influenciar o desenvolvimento de várias espécies, a maioria arbórea.
Garcia-Luis et al. (1999) observaram que segmentos nodais da região apical
apresentaram maiores índices de regeneração direta dos explantes. Em Bromeliaceae
não foram encontrados registros de trabalhos sobre a influência da posição do nó
sobre o desenvolvimento da planta, possivelmente devido às características naturais
dos segmentos nodais que se localizam muito próximos, havendo necessidade de
alongamento para facilitar a manipulação para possível fonte de explantes.
Os resultados do experimento de efeito da posição do nó no crescimento de A.
strobilacea, mostraram que a utilização do segmento nodal apical originou plantas
não alongadas e os nós mediano e basal deram origem a plantas alongadas. Embora
não fossem realizadas análises hormonais endógenas, pode-se supor que o gradiente
hormonal tenha influenciado, pois o menor número de folhas foi observado nas
plantas provenientes de segmentos nodais da região apical, fonte endógena de auxina.
Contudo, na maioria dos parâmetros analisados, todas as plantas foram similares.
Este resultado favorece o cultivo in vitro nos dois aspectos, plantas alongadas não
aclimatam facilmente, portanto podem servir como planta matriz para fornecimento
de segmentos nodais como explante. Já nas plantas não alongadas o isolamento
destes nós é dificultado, entretanto aclimatam com facilidade podendo ser produzidas
para atender ao mercado de plantas ornamentais.
A etapa envolvida na produção de plantas por meio do cultivo in vitro
envolve a sua aclimatação. A micropropagação, como já mencionado tem sido
utilizada como técnica de multiplicação em massa de diversas espécies de plantas,
entretanto, muitas espécies exibem baixa taxa de sobrevivência ex vitro constituindo
um fator limitante para a produção de algumas espécies (Grattapaglia e Machado
1998). Chen et al. (2006), avaliando a produção de plantas de Bupleurum kaoi
produzidas por meio do cultivo in vitro de segmentos nodais, não relatou a utilização
de nutrientes na fase de aclimatação, somente a taxa de sobrevivência das plantas. A
maioria dos estudos relata a utilização de soluções comerciais é como pôde ser
observado para a espécie Uniola paniculata L. produzidas in vitro (Valero-Aracama
et al. 2007).
69
Valero-Aracama et al. (2007), verificando a influência do fornecimento de
sacarose e fluxo de CO
2
no cultivo in vitro de plantas de Uniola paniculata,
utilizaram o meio de Murashige & Skoog em duas concentrações: na primeira fase, o
estabelecimento do explante in vitro ocorreu no cultivo em MS completo, na fase de
enraizamento dos brotos, foi utilizado a mesma formulação, porém diluída pela
metade (MS/2) e na transferência destas plantas para condições ex vitro, foi aplicada
semanalmente solução comercial NPK (20-20-20).
Os experimentos de adubação realizados em plantas de A. strobilacea
mostraram que a solução MS/2 é adequada para possibilitar o crescimento
satisfatório das plantas mantidas ex vitro, diferentemente de quando foram cultivadas
in vitro, onde o meio de cultura selecionado para o cultivo foi aquele que continha os
macronutrientes de MS diluídos à quinta parte, pois as plantas cultivadas nesse
tratamento apresentaram maior quantidade de segmentos nodais. Pode-se supor que a
capacidade de retenção de nutrientes pelo substrato é maior em relação à solução
encontrada no interior do frasco de cultivo, sendo necessário ser fornecida uma maior
concentração de nutrientes para melhorar a absorção dos mesmos. Não foram
encontradas referências onde são abordadas diferenças no crescimento de plantas
quando adubadas com os mesmos sais presentes no meio de cultura no qual foram
produzidas antes de serem submetidas à aclimatação.
Após o período de 8 meses em que as plantas ficaram na condição ex vitro, as
mesmas foram levadas à Reserva Biológica e Estação Experimental de Mogi-Guaçu,
local onde foram realizadas as coletas de sementes. A taxa de sobrevivência das
mesmas foi de 80 %.
Este trabalho apresentou a possibilidade de multiplicação de Acanthostachys
strobilacea através do cultivo in vitro, utilizando como explante o segmento nodal
em alternativa ao uso de sementes. No protocolo estabelecido neste estudo, o uso de
reguladores de crescimento é dispensável até mesmo na fase de regeneração do
explante via segmento nodal. Verificou-se que o cultivo in vitro pode ser realizado
em soluções diluídas, mais diluídas que aquela utilizada para adubação na etapa de
aclimatação. Os segmentos nodais foram isolados a partir de plantas cultivadas em
baixa intensidade luminosa, a 14 µmol m
−2
s
−1
, sendo que intensidades superiores
induzem à produção de plantas não alongadas, submetidas diretamente ao processo
de aclimatação, uma vez que aquelas alongadas não sobrevivem satisfatoriamente à
transferência para condições ex vitro. Levando-se em conta a posição do segmento
nodal, aqueles de origem mediana e basal originam plantas com maior alongamento.
70
Por meio deste protocolo é possível obter-se 15.000 plantas a partir de uma semente
no período de um ano.
71
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79
CAPÍTULO 2 - Influência do etileno no alongamento e anatomia de plantas de
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch cultivadas in vitro
RESUMO
A técnica de micropropagação pode induzir modificações na morfologia das plantas
comparadas àquelas provenientes do ambiente natural. Acanthostachys strobilacea, uma
bromélia ornamental, quando cultivada in vitro, tende a alongar seu eixo caulinar,
evidenciando a presença dos segmentos nodais, diferentemente do que é observado na
natureza. As razões para esse alongamento provavelmente estão relacionadas à condição
estabelecida durante a micropropagação, pois quando sementes dessa espécie são cultivadas
em gerbox nas mesmas condições de luz e temperatura, originam plantas que não apresentam
o alongamento do caule. A micropropagação requer que os frascos utilizados para o cultivo
sejam vedados, de modo a evitar a contaminação por microorganismos. Esse procedimento
pode ocasionar um acúmulo de gases no interior dos frascos. Um dos gases produzidos pelas
plantas é o etileno, um fitorregulador que afeta o desenvolvimento das mesmas e que,
provavelmente, acumula-se no interior dos frascos de cultura, interferindo no crescimento de
plantas. Entretanto, a maioria dos trabalhos não relaciona a influência desse hormônio no
alongamento de plantas cultivadas in vitro. Este trabalho tem por objetivo verificar a
influência do etileno na indução do alongamento caulinar em plantas de Acanthostachys
strobilacea cultivadas in vitro. Para isto, foram utilizadas 280 plantas obtidas partir da
regeneração de segmentos nodais cultivados in vitro, distribuídas em Erlenmeyers de 250 ml
(10 plantas por frasco), distribuídos em 3 tratamentos: um lote que recebeu aplicação de
etileno; um lote que recebeu aplicações de 1-MCP (1-metilciclopropeno), um inibidor de
receptores de etileno e um lote que recebeu ar sintético. O alongamento das plantas foi
comparado a um lote controle, representado por plantas em frascos aos quais não foi aplicada
nenhuma substância. As plantas foram mantidas por 2 meses e as aplicações ocorreram
semanalmente. Foram realizadas avaliações dos comprimentos das partes aérea e radicular,
números de folhas e raízes, massa fresca e seca das partes aérea e radicular e das modificações
histológicas no caule após tratamentos. Os resultados mostraram que a aplicação de etileno
induziu plantas com maior alongamento, e conseqüente número de segmentos nodais quando
comparadas aos demais tratamentos. O etileno influenciou também a anatomia das plantas
cultivadas in vitro sendo observado um maior diâmetro das células dos caules das plantas
desse tratamento. A análise dos dados permitiu concluir que o etileno pode estar envolvido na
indução do alongamento caulinar que ocorre nas plantas de A. strobilacea cultivadas in vitro.
80
ABSTRACT
The micropropagation technique can induce changing in the plant morphology
compared to those ones from the natural environment. Acanthostachys strobilacea, an
ornamental bromeliad, when cultivated in vitro, tends to elongate its stem axle, showing the
presence of nodal segments, differently from what is observed in the nature. The reasons for
this elongation probably are related to the established condition while the cultivated in vitro,
because when this specie seeds are cultivated in gerbox at the same light and temperature
conditions, they originate plants whose doesn't presents the stem elongation. The
micropropagation needs that the bottles used for the cultivation be sealed, in a way to avoid
the contamination by microrganisms. This procedure can enable a gas accumulated into the
bottles. One of the gases produced by the plants is the ethylene, a regulator growth which
affects the plants development and that, probably, amass itself into the cultivation bottles,
interfering with its growth. However, mostly works don't relate this hormone influence at in
vitro cultivated plants elongation. This work has as objective to verify the ethylene influence
at the stem elongment induction in in vitro cultivated Acanthostachys strobilacea plants. For
that, it were used 280 plants obtained from the in vitro cultivated nodal segments
regeneration, distributed in 250 ml erlenmayers (10 plants per bottle), distributed at 3
treatments: a lot which received ethylene application; a lot which received 1-MCP
applications (1-metilciclopropeno), an ethylene inhibitor and a lot which internal air was
renewed (synthetic air). The plant elongment was compared to a control, represented by plants
in bottles to which it wasn't made any application of any substance. The plants were kept for 2
months and the applications happened weekly. The stem internal morphology was evaluated.
The results showed that the ethylene application inducted more elongated plants, and related
number of nodal segments when compared to the other treatments. The ethylene influenced
the in vitro cultivated plants' anatomy too what is observed because of the large diameter of
the cells from this treatment plant stem. The data analysis allowed concluding that the
ethylene can be involved at the stem elongation induction that occurs at the in vitro cultivated
A. strobilacea plants.
81
INTRODUÇÃO
O cultivo in vitro consiste na cultura de células ou órgãos vegetais em frascos
contendo meio nutritivo sob ambiente controlado (Hartmann et al. 2002). É
caracterizado pelo cultivo em condições assépticas de modo a evitar que fungos e
outros organismos se desenvolvam no meio nutritivo. Com intuito de proteger esta
cultura de infecções e para prevenir a dessecação tanto da planta quanto do meio de
cultivo, as plantas são propagadas em frascos vedados, com restrição não intencional
de trocas gasosas entre a atmosfera interna do frasco e o meio externo (Mensuali-
Sodi et al. 1992 e Buddendorf-Joosten & Woltering 1994). Esse procedimento
interfere na morfogênese de explantes de diversas espécies.
O crescimento e a diferenciação das células vegetais in vitro são afetados por
substâncias voláteis que se acumulam no interior dos frascos de cultivo, resultado do
metabolismo secundário das plantas (Nour & Thorper 1994). Diversos trabalhos são
realizados com intuito de se verificar a interferência dessas substâncias na
morfogênese de diferentes espécies (Jackson et al. 1991, Nour & Torper 1994 e
Suzuki & Kerbauy 2006). Entre as substâncias voláteis produzidas pelos tecidos está
o etileno, sendo que as repostas a este gás são bastante variáveis em relação às
condições de cultivo (Buddendorf-Joosten & Woltering 1994).
Etileno é um fitorregulador produzido a partir da conversão do aminoácido
metionina à S-adenosil metionina, posteriormente convertido a aminociclopropano
(ACC) através da ação da enzima ACC sintase, o ACC dá origem ao etileno por ação
da enzima ACC oxidase (Coli 2004). O etileno pode ser produzido pela própria
planta ou pela semente em germinação, sendo conhecido por afetar o crescimento e o
desenvolvimento das mesmas, podendo estar envolvido no alongamento caulinar
(Nour & Thorper 1994).
A taxa pela qual as células vegetais crescem depende de diversos fatores, tais
como sua posição na planta, tipo de células e uma diversidade de fatores ambientais.
Essa taxa é controlada pela pressão de turgor dentro da célula contra a parede celular
e pela extensibilidade da parede celular. O etileno influencia a re-orientação dos
microtúbulos na direção longitudinal, promovendo uma maior expansão lateral
(radial) das células, resultando na formação de caules mais curtos e espessos. Esse
fitorregulador pode tanto promover como inibir o crescimento dependendo da planta
e do tipo de célula (Raven 1996).
82
O material constituinte das tampas usadas para fechar os frascos de cultura,
bem como o agente geleificante do meio de cultura são fontes de etileno abiótico,
podendo interferir na quantidade desse gás acumulada no interior dos frascos de
cultivo, como constatado por Mensuali-Sodi et al. (1992) no cultivo de lavanda
(Lavandula officinalis x Lavandula latifolia).
O acúmulo de etileno pode alterar o fenótipo das plantas (Nour & Thorper
1994), fato verificado durante o cultivo in vitro de Arabidopsis, nas quais foi
observado o alongamento do caule (Smalle et al 1997). Locke et al. (2000),
verificaram que a adição de ACC (1- aminociclopropano 1-acido carboxílico) no
meio de cultura, o qual é convertido a etileno pela ACC oxidase, levou ao aumento
no crescimento da parte aérea e diminuição da raiz em plantas de soja. Pérez-
Bermúdes et al. (1985), testaram a influência da interação do etileno com outros
hormônios em hipocótilos de Digitalis obscura cultivados in vitro. Além disso, esse
hormônio esteve envolvido com o padrão de desenvolvimento em rizoma de Kohleria
eriantha (Almeida et al. 2005).
O efeito da aplicação exógena de etileno nas respostas morfogenéticas das
plantas pode se estudado através da adição de precursores, como o ACC, de
inibidores da biossíntese através da adição de substâncias que são capazes de liberar
o etileno, criando uma atmosfera enriquecida com este fitorregulador gasoso ou ainda
pela eliminação do etileno utilizando a técnica de ventilação forçada, o que permite
uma renovação do ar no interior dos frascos de cultivo (Arigita et al. 2002). Outro
modo de se estudar a ação do etileno na morfogênese, é através do uso de
bloqueadores específicos dos receptores de etileno, como por exemplo, o 1-
metilciclopropeno (1-MCP) (Blankenship & Dole 2003).
Um trabalho desenvolvido por Visser & Pierik (2007) mostra que o ritmo de
difusão do etileno em situação de alagamento varia conforme a espécie e que a
concentração do etileno no ápice radicular em solos alagados é fortemente
dependente da resistência do tecido adjacente ao ápice, em tecidos mais porosos o
mais provável é que o etileno circule via meristema apical.
Etileno inibe o crescimento foliar de plantas de Catasetum fimbriatum
cultivadas in vitro na presença da luz, em comparação com aquela mantidas no
escuro. Os teores endógenos de citocininas se mantêm similares nas plantas tratadas
e não tratadas com etileno, sugerindo que o etileno poderia estar envolvido no
processo de inibição do crescimento foliar sob condições de luminosidade (Suzuki &
Kerbauy 2006).
83
Estímulo na produção de etileno é comum em resposta de plantas submetidas a
estresses e este gás pode ter implicações em eventos como senescência de gemas,
inibição de antese e amarelecimento foliar, como observado na orquídea epífita
Psygmorchis pusilla quando cultivada sob fotoperíodo de dia longo (Vaz et al. 2004).
A relação existente entre o etileno e a indução do alogamento celular de
plantas cultivadas in vitro pode ser verificada no trabalho de Smalle et al. (1997), o
qual mostra que o etileno tem um efeito promotor no alongamento do eixo caulinar
de Arabidopsis thaliana quando cultivadas in vitro na presença de luz. Cortes
histológicos desse caule revelaram que as células do hipocótilo foram duas vezes
maiores nas plantas tratadas como precursor do etileno (ACC) que as plantas
controle, as quais não receberam essa substância. O efeito do etileno no
desenvolvimento de bromélias tem sido relacionado à supressão da dominância
apical, aumentando assim, a quantidade de brotos produzidos a partir do
desenvolvimento da gema axilar (Buddendorf-Joosten & Woltering 1994). Não foram
encontrados trabalhos sobre a relação entre etileno, alongamento caulinar e padrões
teciduais em espécies de bromélias.
Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch, estudada neste trabalho, é
uma bromélia epífita ou saxícola, de folhas finas e acanaladas contendo tricomas ao
longo da lâmina foliar. Possui o escapo floral verde com inflorescências
avermelhadas adquirindo a forma de um cone sendo utilizada como planta
ornamental (Reitz 1983). Quando cultivada in vitro esta espécie tende a alongar seu
eixo caulinar, como demonstrado no capítulo 1, evidenciando a presença dos
segmentos nodais a olho nu, diferentemente do que é observado na natureza. As
razões para esse alongamento provavelmente estão relacionadas à condição
estabelecida durante a micropropagação, pois plantas obtidas a partir da germinação
de sementes em gerbox não apresentam esse aspecto (figura 1).
Esta etapa do presente trabalho teve por objetivo verificar as respostas de A.
strobilacea a diferentes atmosferas gasosas durante seu cultivo in vitro, com ênfase
na interferência sobre os teores de etileno nos frascos (pela presença ou ausência de
renovação do conteúdo gasoso dos frascos com ar sintético livre de etileno, ou pela
aplicação de uma concentração relativamente elevada desse hormônio na atmosfera
dos frascos), ou ainda pela modulação da sua percepção pelas plantas (pela aplicação
de 1-MCP, um potente bloqueador de receptores de etileno).
84
Figura 1. (A) fenótipo de A. strobilacea cultivada em caixa do tipo gerbox sob fotoperíodo de
12 horas e temperatura de 26 ± 2 ºC, (B) transferência das plantas para substrato com casca de
pinus, (C) fenótipo de A. strobilacea cultivada in vitro sob fotoperíodo de 12 horas e
temperatura de 26 ºC ± 2 ºC e (D) detalhe do alongamento do eixo caulinar das plantas
cultivadas in vitro.
85
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo in vitro
Plantas de Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch foram obtidas por
meio da germinação de sementes in vitro, as quais foram imersas em solução de
hipoclorito de sódio comercial (2 % de cloro ativo) acrescido de 2 gotas de Tween
20
mantidas sob agitação por 20 minutos. Passado este período, foram transferidas
para uma solução de HCL (ácido clorídrico) a 25 % por 10 minutos. Após enxágue
com água destilada, as sementes foram colocadas em etanol 70 % por 5 minutos, e
em seguida em fungicida (Benomyl 0,1 %), por mais 15 minutos, sendo
posteriormente, submersas por 1 hora sob agitação em solução de hipoclorito de
sódio comercial (2 % cloro ativo) com 2 gotas de Tween 20
. Essas sementes foram
inoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura de Murashige & Skoog
(1962), com 1/5 dos macronutrientes da formulação original, 2% de sacarose, 100 mg
L-¹ de myo-inositol, 0,1 mg L-¹ de tiamina. O pH foi ajustado para 5,8. Foram
incubadas durante 2 meses em sala de crescimento com temperatura de 26 ± 2 ºC e
intensidade luminosa de 14 µmol m
-2
s
-1
. As plantas de A. strobilacea desenvolvidas
sob essas condições apresentaram um conspícuo alongamento caulinar, permitindo,
dessa forma, o isolamento dos seus segmentos nodais, os quais foram utilizados
como explantes para a regeneração de plantas a partir da liberação da gema lateral
contida em cada um. As plantas assim obtidas foram utilizadas como material
experimental onde se buscou analisar a possível influência do etileno sobre o
alongamento caulinar dessa espécie quando sumetida ao cultivo in vitro.
Dessa forma, esses segmentos nodais foram inoculados em erlenmeyers de 250
ml, com 10 explantes cada, contendo o mesmo meio de cultura descrito anteriormente
para o cultivo das sementes. Os explantes foram mantidos em incubação em sala de
crescimento com 26 ± 2 ºC de temperatura e 60 µmol m
-2
s
-1
de intensidade luminosa
por 75 dias. Durante esse período ocorreu a liberação das gemas laterais dos
segmentos nodais, bem como ocorreu o desenvolvimento das mesmas, originando
novas plantas com cerca de 1 cm de altura, independentes do explante inicial.
As plantas assim obtidas foram submetidas a partir desse estágio do
desenvolvimento a quatro tratamentos distintos, os quais foram compostos por 7
frascos cada um: um lote controle, onde as plantas permaneceram em erlenmeyers
totalmente vedados, sem qualquer interferência durante o período experimental; no
86
segundo lote realizou-se apenas a renovação semanal do conteúdo de ar dos
erlenmeyers por meio da aplicação de um fluxo contínuo de 3L.min
-1
de ar sintético
durante 1 minuto em cada frasco; cada frasco pertencente ao terceiro lote recebeu
semanalmente a renovação do conteúdo gasoso com ar sintético (3L.min
-1
por 1
minuto), seguida pela aplicação de 5000µM de etileno; por fim, cada frasco do
quarto lote de plantas recebeu semanalmente a renovação do conteúdo gasoso com ar
sintético (3L.min
-1
por 1 minuto), seguindo-se pela aplicação de 5 µM do inibidor de
etileno 1-MCP (1-metilciclopropeno) (SmartFresh
®
, preparado segundo
recomendações do fabricante).
Após 75 dias avaliaram-se os aspectos morfológicos mais relevantes tanto da
parte aérea quanto radicular de cada planta, tomando-se como parâmetros as medidas
do número de folhas e raízes, tamanho das partes aérea e radicular, massas fresca e
seca das partes aéreas e radiculares, bem como o número de segmentos nodais
visíveis à olho nu em cada planta.
Os experimentos foram realizados em delineamento inteiramente casualizado e
os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio da análise de
variância fator único, utilizando-se para comparação entre as médias o teste de Tukey
com nível de significância de 5 %.
Análise anatômica
Foram separadas aleatoriamente três plantas de A. strobilacea de cada
tratamento acima descrito, que foram fixadas em FAA 70 (Berlyn & Miksche 1976),
por 48 horas e em seguida lavadas em álcool a 70% e conservado em frascos com
álcool 50 %.
Para análise anatômica do material, foram retirados fragmentos da região basal
do caule dos indivíduos dos diferentes tratamentos. Em seguida, os fragmentos foram
hidratados e seccionados manualmente no sentido longitudinal; as secções foram
duplo-coradas com safranina a 1% e azul de Astra a 1% (1:9), e montadas em lâminas
semi-permanentes com glicerina.
O registro do material foi realizado por meio de fotomicrografias obtidas com
uso de microscópio fotônico equipado com câmera para captura de imagens (software
Image-Pro Express versão 4.0.1, da Midia Cybernetics).
A medida da parte aérea foi realizada após a retirada das folhas considerando-
se apenas o eixo caulinar.
87
RESULTADOS
A tabela 1 mostra através da análise biométrica, que a atmosfera no interior do
frasco interferiu no desenvolvimento das plantas de A. strobilacea. O número de
folhas foi significativamente maior nas plantas que receberam etileno (nove folhas)
quando comparado àquelas dos demais tratamentos. As plantas cultivadas nos frascos
que tiveram o ar interno renovado e as dos que receberam aplicações semanais do
inibidor de etileno tinham plantas que não apresentaram diferenças significativas no
número de folhas. Plantas que cresciam em frascos sem renovação de ar resultaram
em número de folhas significativamente maior em relação às plantas que cresciam
nos frascos com renovação de ar. Quando se avalia o tamanho da parte aérea das
plantas dos diferentes tratamentos, observa-se que as plantas que receberam
aplicação de 5000µM de etileno semanalmente tiveram o crescimento do seu eixo
caulinar significativamente maior em relação aos demais tratamentos. As plantas que
cresceram nos frascos que tiveram aplicação de 1-MCP não apresentaram
crescimento significativo do eixo caulinar.
A maior quantidade de segmentos nodais foi observada nas plantas que
receberam o etileno, conforme descrito na tabela 1. A aplicação de 1-MCP reduziu 4
vezes o número de segmentos nodais visíveis a olho nu, evidenciando ter havido
menor alongamento do caule nesse tratamento. Quando os frascos não tiveram o ar
renovado, foi possível observar a existência de 3 segmentos nodais. Esse valor foi
estatisticamente diferente do número observado para o tratamento com renovação de
ar (tabela 1).
Verifica-se que em relação ao crescimento radicular o efeito da aplicação do
etileno foi inibitório. Conforme mostrado na tabela 1, o tamanho das raízes foi
significativamente menor nas plantas que receberam etileno, cerca de 4 vezes
menores do que aquelas nas quais foi utilizado o inibidor da percepção desse
fitorregulador. Comparando-se os tratamentos com e sem renovação de ar, é possível
observar que as plantas que tiveram o ar renovado, ou seja, removido o etileno
produzido pelas plantas em cultura, tinham raízes menores em relação àquelas cuja
atmosfera do frasco manteve-se a mesma desde o início do experimento. Contudo,
não foi observado um efeito inibidor da quantidade de raízes nas plantas que
receberam o etileno exógeno. Apenas o tratamento com 1-MCP inibiu a quantidade
de raízes.
88
Tabela 1 – Análise biométrica de plantas produzidas a partir de segmentos nodais de Acanthostachys
strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes diluído a um
quinto por 75 dias, em frascos sem renovação de ar, com renovação de ar, aplicações de 5 µM de 1-MCP e de
5000µM
de etileno semanalmente.
Número de
folhas (un)
Número de
raiz (un)
Comprimento do
eixo caulinar (cm)
Comprimento da
raiz (cm)
Número de
segmentos
nodais (un)
Sem
renovação de
ar
8 b 4 a 4,61 b 6,15 c 3 b
Com
renovação de
ar
6 c 4 a 3,0 c 8,12 b 2 c
1- MCP
6 c 2 b 0,5 d 10,92 a 1 d
Etileno
9 a 3 ab 6,5 a 2,26 d 4 a
Letras distintas na vertical diferem entre si pelo teste Tukey com nível de significância de 0,05.
Avaliando os teores de matéria fresca de A. strobilacea cultivadas in vitro a
partir de segmentos nodais, os dados da tabela 2 mostram que apenas as plantas que
receberam o MCP apresentaram menores valores de massa fresca (valor médio, 0,061
g). As dos demais tratamentos não mostraram diferenças significativas entre si.
Entretanto, não houve diferenças quanto à massa seca da parte aérea das plantas de
todos os tratamentos. É importante ressaltar que os dados de massa fresca e seca
incluíram as folhas e o caule em uma mesma amostra. Diferenças significativas
foram verificadas para as raízes. O menor acúmulo tanto de massa fresca quanto de
massa seca foi observado nas plantas submetidas à aplicação de etileno em relação
aos demais tratamentos, conforme mostrado na tabela 2. Comparando-se esses dados
àqueles da tabela 1, nota-se que nesse tratamento as plantas apresentaram raízes
menores. Não houve diferenças significativas entre os demais tratamentos em relação
à quantidade de massa seca das raízes.
A tabela 1 mostra que com a aplicação de 1-MCP houve o crescimento
longitudinal das raízes, assim como também o aumento na massa fresca das plantas
(tanto da parte aérea quanto radicular) em relação àquelas crescidas com renovação
de ar (condição controle sem acúmulo de etileno).
89
Tabela 2 – Análise de massas fresca e seca das partes aérea e radicular de plantas produzidas a partir de
segmentos nodais de Acanthostachys strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962)
com macronutrientes diluído a um quinto por 75 dias, em frascos sem renovação de ar, com renovação de ar,
aplicações de 5 µM de 1-MCP e de 5000µM de etileno semanalmente.
Parte aérea Raiz
Massa fresca (g) Massa seca (g) Massa fresca (g) Massa seca (g)
Sem renovação de ar
0,084 a 0,007 a 0,023 b 0,002 a
Com renovação de ar
0,066 b 0,006 a 0,021 bc 0.002 a
1- MCP
0,061 b 0,006 a 0,032 a 0,003 a
Etileno
0,062 b 0,006 a 0,013 c 0,001 b
Letras distintas na vertical diferem entre si pelo teste Tukey com nível de significância de 0,05.
Os cortes histológicos longitudinal do caule revelaram que, aparentemente,
ocorreram diferenças no tamanho e no diâmetro das células da epiderme dos eixos
caulinares das plantas submetidas aos diferentes tratamentos (figura 2). Aquelas que
receberam a aplicação do inibidor de etileno apresentaram a tendência de possuir
células com diâmetro menor em relação àquelas que receberam o etileno (figuras 2B
e 2C, respectivamente). Comparando-se as plantas que ficaram nos frascos que não
tiveram renovação de ar (figura 2A), ou seja, que podeiram conter o etileno
produzido por elas durante o período que ficaram em cultivo, às plantas que
receberam o etileno exógeno (figura 2C), observa-se certa semelhança quanto ao
aspecto das células. As células são mais curtas quando comparadas com as plantas
dos frascos sem renovação de ar e com aquela que receberam 1-MCP (figuras 2A e
2C, respectivamente), o diâmetro das células da epiderme das plantas que receberam
aplicações de etileno são maiores quando relacionadas com os mesmos tratamentos
(figura 2).
90
Figura 2. Fotomicrografia da secção longitudinal do caule de A. strobilacea cultivadas in
vitro, em frascos com diferentes atmosfera gasosa (A) sem renovação de ar, B) 1-
metilclorocilopropeno e (C) com etileno. Escala 50 µm.
91
DISCUSSÃO
O etileno é freqüentemente utilizado no estudo das respostas de crescimento e
desenvolvimento de plantas submetidas a diferentes situações de estresse. Contudo,
apesar da evidência de que a biossíntese de etileno aumenta em função de diferentes
imposições da planta ao estresse, é muito difícil demonstrar a especificidade de seus
efeitos (Hall & Smith 1995).
Este trabalho mostrou que a aplicação de etileno promoveu alterações em
plantas da bromélia Acanthostachys strobilacea cultivada in vitro. O tratamento das
plantas com etileno, quando comparado às demais condições analisadas, promoveu a
visualização de um maior número de segmentos nodais a olho nu, assim como
proporcionou o incremento na altura da parte aérea. Em relação à parte aérea houve o
etileno promoveu o alongamento, demonstrado pelo número de segmentos nodais
visíveis a olho nu que ocorreram nas plantas que receberam esse hormônio. Em
relação ao comprimento do caule, as plantas que receberam aplicação de etileno
apresentaram maior crescimento, já naquelas que receberam o inibidor de receptores
de etileno o eixo caulinar foi significativamente menor em relação aos demais
tratamentos, o que corrobora a possível participação do etileno no controle do
desenvolvimento caulinar desta espécie. Adicionalmente, houve um desenvolvimento
da maior quantidade de folhas nessas plantas em relação aos demais tratamentos.
De maneira interessante, as plantas dos frascos que não tiveram renovação de
ar foram as que mais se assemelharam àquelas que receberam o etileno. É possível
supor que possa ter havido um efeito do etileno produzido pelas próprias plantas no
interior dos frascos e que se acumulou promovendo efeitos semelhantes às plantas
tratadas com o fitorregulador. Segundo Mesuali-Sodi et al. (2002), o tipo de material
constituinte das tampas utilizadas para fechar frascos de cultivo pode liberar etileno
como por exemplo, rolha rosqueável de plástico adaptado com rolha de borracha,
similares às tampas utilizadas para fechar os frascos nos quais eram mantidas as
plantas de A. strobilacea analisadas neste estudo.
Da mesma forma, Smalle et al. (1997) mostraram um alongamento do
epícótilo de plantas de Arabidopsis causado pelo etileno na presença de luz. Esses
autores mostraram haver inibição do alongamento nas plantas que crescem no escuro,
sugerindo que a resposta da parte aérea ao etileno é luz-dependente (Smalle et al.
1997). Nour & Torper 1994, constataram que o efeito promotor do etileno no
desenvolvimento e alongamento de brotos de Thuja occidentalis é contrário aos
92
registros dos efeitos inibitórios do etileno no crescimento e especialmente
alongamento na maioria das espécies.
Suzuki & Kerbauy (2006), observaram que plantas de Catasetum fimbriatum
cultivadas in vitro na presença de luz e tratadas com etileno apresentaram uma
redução do tamanho dos brotos estiolados e crescimento foliar, além de retardar o
crescimento radicular. Esses autores mencionam que o fenótipo observado no
crescimento foliar foi o mesmo observado com outros gêneros de orquídeas quando
cultivadas em frascos pouco ventilados, atribuindo este fato ao provável acúmulo de
etileno. Apesar de este fitorregulador induzir a uma redução da parte aérea desta
espécie quando cultivada no escuro, ele praticamente não exerce nenhum efeito no
tamanho e nem na massa seca destas plantas quando cultivadas no claro. O resultado
deste estudo mostra claramente que um aumento no nível de etileno leva a uma
redução no conteúdo de citocininas nas plantas, gerando uma diminuição do
alongamento da parte aérea. A significativa inibição induzida por etileno no
alongamento da parte aérea na luz e da raiz no escuro pode ter sido causado pela
redução do crescimento longitudinal da célula e pelo aumento dos níveis de
citocinina nas partes aéreas e radiculares respectivamente. Análises de hormônios
endógenos nas plantas de A. strobilacea contribuiriam consideravelmente para
explicar a interação do etileno com outros hormônios.
Hordeum vulgare quando tratados com substância com ação similar ao 1-MCP,
o tiosulfato de prata, observaram uma redução no tamanho da parte aérea de cerca de
40 % em relação ao controle (Locke et al. 2000). Contudo, existem trabalhos que
citam efeitos opostos aos que foram observados neste estudo. De Proft et al. (1985),
trabalhando com Magnólia soulangeana observaram uma redução no crescimento da
parte aérea destas plantas quando tratadas com etileno e CO
2
. Segundo Arigita et al.
2002, o papel desse fitorregulador na micropropagação é controverso: em alguns
casos ele atua como inibidor de processos organogênicos, e em outros, é relatado
como estimulador do desenvolvimento e alongamento de novas gemas e
enraizamento de muitas espécies. Tratamento com ethrel (substância que libera
etileno) induziu o desenvolvimento de parte aérea em rizoma de Kohleria eriantha,
enquanto que tratamento com inibidores de etileno inibiu o desenvolvimento das
brotações (Almeida, et al. 2005).
O efeito do etileno sobre as raízes das plantas de A. strobilacea observado
neste trabalho foi o oposto ao da parte aérea, ou seja, houve uma inibição no tamanho
das raízes que foram cerca de 5 vezes menores que aquelas das plantas tratadas com
93
o inibidor de etileno. A massa seca e fresca das raízes das plantas do tratamento com
etileno exógeno foi menor. Entretanto, não foram observadas diferenças
significativas na quantidade das raízes, indicando que pode ter havido modificações
histológicas relacionadas ao comprimento das células. Em relação a raiz o tiosulfato
de prata (um inibidor de receptores de etileno) parece não ter efeito sobre o
crescimento, apesar de que as raízes eram menores em relação ao controle. O ACC
aumenta a produção de etileno e diminui a produção de raiz, diminuindo o número de
raiz por planta e inibe seu crescimento, em segmentos caulinares de Rosa hybrida
(Kepezynski et al. 2006). De modo oposto, Pérez-Bermudéz et al. (1985),
constataram que etileno pode agir como promotor endógeno na regeneração de raiz
de segmentos hipocótilo de Digitalis obscura cultivada in vitro.
Os cortes anatômicos realizados neste trabalho mostram alterações na
estrutura celular quando em contato com etileno. As células do eixo caulinar de A.
strobilacea apresentaram a tendência de aumento no diâmetro quando tratadas com
etileno, comparando-se aos demais tratamentos, com a aplicação de 1-MCP, foi
possível observar celulas bem mais finas.
As semelhanças que foram observadas entre as plantas dos tratamentos com
etileno exógeno e aquelas que permaneceram nos frascos sem renovação de ar,
sugerem que o aspecto alongado dessa espécie cultivada in vitro possa ser devido à
ação do etileno produzido pelas plantas e acumulado no interior dos frascos de
cultivo durante o período de crescimento. Embora esse alongamento seja interessante
do ponto de vista da possibilidade de isolamento dos segmentos nodais, as plantas
alongadas não são aclimatadas com igual facilidade que aquelas não alongadas
(dados não mostrados), provavelmente devido ao tamanho reduzido das raízes e ao
maior comprimento do caule. Assim sendo, sabendo-se que esse fenótipo está
associado à presença desse gás, é possível evitar os efeitos que prejudiquem a fase de
retirada das plantas dos frascos para crescerem em casa de vegetação, etapa
importante para a produção comercial. Arigita et al. 2003 menciona que a ventilação
forçada, utilizada para evitar o acúmulo de gases do interior dos frascos, diminui os
efeitos inibitórios do etileno no desenvolvimento de alguns tecidos, entretanto, esses
autores mencionam que este processo pode levar a desidratação do meio de cultura,
aumento da concentração de sais minerais e aumento do risco de contaminação do
meio. Segundo o mesmo autor, o uso de bloqueadores dos receptores de etileno,
como o 1-MCP, é uma alternativa de se evitar os efeitos do acúmulo de etileno no
frasco de cultura sem gerar os efeitos negativos mencionados anteriormente.
94
Seguindo o mesmo raciocínio, Kepezy´nski et al. (2006), concluíram que 1-MCP
pode ser recomendado para regular o processo de enraizamento no cultivo de parte
aérea de R. hybrida, uma vez que promoveu tanto a emergência quanto o número de
raiz.
A taxa pela qual as células vegetais crescem depende de diversos fatores,
como sua posição na planta, tipo de células e uma diversidade de fatores ambientais.
Essa taxa é controlada pela pressão de turgor dentro da célula contra a parede celular
e pela extensibilidade da parede celular, o etileno inibe o crescimento da planta
devido a um decréscimo na extensibilidade (Raven 1996), além disso, o etileno
influencia a reorientação dos microtubulos na direção longitudinal, que promove uma
maior expansão lateral (radial) das células, resultando na formação de caules mais
curtos e espessos. Neste trabalho, foi mostrada a influência do etileno sobre a
morfologia interna de A. strobilacea. Contudo, Smalles et al. (1997), demonstrou que
o etileno está envolvido com uma quantidade muito maior de respostas morfogênicas,
portanto novas investigações são necessárias para uma melhor compreensão dos
efeitos do etileno sobre a anatomia de A. strobilacea.
95
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99
CAPÍTULO 3 - Influência do tipo de vedação dos frascos de cultura no alongamento
de plantas de Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch cultivadas in vitro
RESUMO
O cultivo in vitro tem sido aplicado como estratégia de multiplicação de espécies de
interesse comercial, pois pode possibilitar a obtenção de um grande número de
plantas em pouco tempo, com qualidade estética e fitossanitária. De modo a evitar
contaminações por microorganismos, as plantas são cultivadas em frascos fechados
que restrigem parcialmente a troca gasosa entre o interior dos frascos e o ambiente
externo. O acúmulo de gases pode influenciar na morfologia das plantas cultivadas in
vitro, como é o caso da bromélia ornamental Acanthostachys strobilacea, que quando
cultivada in vitro em frascos fechados com tampa plástica e vedados com policloreto
de vinila (PVC), apresentaram alongamento do eixo caulinar. Embora os segmentos
nodais isolados do caule alongado sejam utilizados para obterem-se novas plantas
quando subcultivados, as plantas alongadas apresentam taxa de sobrevivência
reduzida quando transferidas para condições ex vitro. Levando-se em conta que a
concentração dos gases no interior do frasco pode estar relacionada ao tipo de tampa
utilizada para vedação destes que permite maior ou menor troca gasosa, o objetivo
deste trabalho foi verificar a influência de diferentes tipos de vedação dos frascos no
alongamento de plantas de A. strobilacea cultivadas in vitro, e identificar se o
oxigênio e o gás carbônico estão envolvidos no alongamento do caule. Segmentos
nodais de A. strobilacea foram depositados em frascos contendo meio de Murashige
& Skoog (1962) com macronutrientes diluídos em 5 vezes, micronutrientes na
composição original, 2% de sacarose, 100 mg L
-1
de myo-inositol e 0,1 mg L
-1
de
tiamina, pH 5,8 (geleificado com 6 g L
-
¹ de Agar). Os frascos foram fechados com
três tipos de tampas: tampa plástica vedada com filme de PVC; somente tampa
plástica e os demais com rolha de borracha perfurada e preenchida com algodão
hidrófilo umedecido com sulfato de cobre. Todos os frascos foram mantidos à
temperatura de 26 ± 2 °C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 41 µM
m
-2
s
-1
por três meses. As medidas da concentração dos gases acumulados no interior
dos frascos foram realizadas quinzenalmente por meio do uso do medidor desses
gases (Illinois ILL6600). Observou-se que o maior número de plantas não alongadas
ocorreu nos frascos fechados com rolha ou tampa plástica, sem uso de PVC. A
análise da concentração de oxigênio e dióxido de carbono no interior dos frascos
100
fechados com tampa plástica e vedados com PVC, dentro dos quais foram observadas
as plantas mais alongadas, mostrou que o acúmulo desses gases ocorreu somente aos
90 dias de cultivo, ou seja, 45 dias após o surgimento de plantas alongadas, não
estabelecendo, portanto, relação entre o alongamento e a concentração desses gases.
Conclui-se, portanto, que a utilização de rolhas de borracha perfuradas e tampas
plásticas não vedadas com PVC são mais adequadas à obtenção de plantas não
alongadas, mostrando que as trocas gasosas podem influenciar esse fenótipo. No
entanto, o oxigênio e o dióxido de carbono acumulados parecem não influenciar no
alongamento das plantas de A. strobilacea cultivadas in vitro.
ABSTRACT
The in vitro cultivation has been applied in commercial interesting species
multiplying strategy because it can make possible the obtaining of a large number of
plants in little time, with esthetics and phitosanitary quality. In a way to avoid
contamination by microorganisms, the plants are cultivated in closed flasks whose
partly restricts the gas change between the flasks inner and the outer environment.
The gas accumulated can influences in the in vitro cultivated plant morphology, that
is the Acanthostachys strobilacea ornamental bromeliad case which when is in vitro
cultivated in closed with plastic lid and sealed with PVC bottles, presented stem
elongation. Although the nodals segments isolated from the elongated stem be used
for new plants obtaining when sub cultivated, the elongated plants presents survival
rate reduced when transfered to ex vitro conditions. Knowing that gas ccumulated in
the bottle can be related to the type of lid used for its seal which allows high or
smaller gas changing, the objective of this work was to verify the influence of
different types of the flasks sealing in the in vitro cultivated A. strobilacea plants
elongation, and identify if the oxygen and the carbon dioxide are involved in the
stem elongation. A. strobilacea nodal segments were put into flasks containing
Murashige & Skoog solution with macronutrients dilutes at a fifth, micronutrients at
the original composition, 2% of saccharose, 100 mg L-1 of myo-inositol and 0,1 mg
L-1 of thiamine, pH 5,8 (gelled with 6 g L-¹ of Agar). The flasks were closed with
three types of lids: plastic lid sealed with PVC film; only plastic lid and the others
with perforated rubber bottle-stopper and filled with hydrophilic cotton dampen with
copper sulphate. All were kept at 26 ± 2 °C temperature, photoperiod of 12 hours and
light intensity of 41 µM m
-2
s
-1
for three months. The measure concentration gas in
101
the flasks were made by using these gas measurer (Illinois ILL6600). It was observed
that not elongated plants occurred at the flasks closed with bottle-stopper or plastic
lid, without using PVC. The oxygen and carbon dioxide concentration analysis into
the flasks closed with plastic lids and sealed with PVC, whose inside were observed
the most elongated plants, showed that these gas accumulated occurred only at the 90
cultivation days, ie 45 days after the elongated plants emergence, doesn't
establishing, therefore, relation between the elongation and these gas amassing. It is
concluded, therefore, that the use of perforated rubber bottle-stoppers and not sealed
with PVC plastic lids are more suitable to the not elongated plant obtaining, showing
that the gas changing can influences this phenotype. However, the oxygen and the
carbon dioxide amassed seem to don't influence at the in vitro cultivated A.
strobilacea plants elongation.
102
INTRODUÇÃO
Muitos aspectos da biotecnologia têm levado a um aumento no interesse na
pesquisa do cultivo in vitro de plantas. Micropropagação é uma área em expansão na
produção em escala comercial, pois permite rápida produção de materiais vegetais
geneticamente idênticos e facilita a produção de plantas livres de doença
(Buddendorf-Joosten & Woltering 1994).
A micropropagação também tem sido utilizada no cultivo de bromélias,
contribuindo para a multiplicação de plantas com qualidade fitossanitária (Arrabal
2002, Mercier & Nievola 2003, Rodrigues et al. 2004 e Rech-Filho 2005), de modo a
atender a demanda do mercado por espécies ornamentais (Kanashiro 2005), muitas
vezes, alvos do extrativismo ilegal. Devido à possibilidade de manutenção das
culturas em condições controladas (luz, temperatura, fornecimento de nutrientes,
etc.), essa técnica tem sido utilizada para estudos de fisiologia básica (Jensen et al.
1996, Kurepin et al. 2007, Predieri & Rapparini 2007 e Tamaki et al. 2007).
Com intuito de proteger a cultura asséptica de infecções e para prevenir a
dessecação tanto das plantas quanto do meio nutritivo, no cultivo in vitro, as plantas
são micropropagadas em frascos vedados, com restrição não intencional de trocas
gasosas entre a atmosfera interna do frasco e o meio externo o que gera um acúmulo
de gases no interior dos frascos. Os mais importantes fatores que afetam o acúmulo
desses gases são: o tipo e a quantidade de material vegetal, o material utilizado para
a fabricação da tampa usada para o fechamento dos frascos, os componentes
nutricionais do meio e fatores externos como temperatura, ventilação e intensidade
luminosa. Dentre esses, o tipo de tampa utilizada pode permitir uma maior ou menor
troca gasosa, possibilitanto um acúmulo de gases (Buddendorf-Joosten & Woltering
1994).
O fechamento dos frascos pode ser realizado através de rolhas de algodão,
rolhas de celulose porosa semelhantes à cortiça, tampa de alumínio ou papel alumínio
e tampas plásticas e, além disso, para evitar evaporação excessiva do meio nutritivo,
há necessidade de se utilizar um segundo método de selamento sendo que um dos
materiais disponíveis para isso é o filme plástico de PVC (policloreto de vinila), em
principio, esta película deve permitir pequena troca de CO
2
, O
2
e etileno, mas não do
vapor d’água (Pierik 1987).
Segundo Grattapaglia & Machado (1998), o microambiente formado no
interior dos frascos é o responsável pela variabilidade no aspecto das plantas
103
cultivadas, influenciando na micropropagação. Isso pode ser devido à presença de
substâncias voláteis como o etileno, CO
2
e O
2
, sendo que as repostas a estes
diferentes gases são bastante variáveis em relação ao tecido cultivado (Nour &
Thorper (1994). Esses gases interferem no desenvolvimento de brotos e geralmente
produtores comerciais não se preocupam em alterar os níveis dos mesmos durante o
cultivo. Entretanto, todas as tampas usadas para fechar os frascos são permeáveis aos
gases em alguma intensidade (Hartmann et al. 2002). Se o tubo for fortemente
fechado, a evaporação é bastante reduzida, mas a umidade no tubo se torna muito
alta, induzindo a vitrificação das plantas cultivadas, além disso, o tipo de tampa pode
influenciar também na disponibilidade de luz, pois tampas transparentes permitem a
passagem de maior intensidade luminosa (Pierik 1987). Portanto, o estabelecimento
do cultivo de uma espécie vegetal in vitro deve levar em conta o tipo de tampa
utilizada para fechar os frascos.
A difusão que ocorre entre o ar interno e o ar externo ou ainda a filtração do ar
nas trocas gasosas dos diferentes métodos de fechamento dos frascos, podem
promover um aumento da concentração interna do CO
2
tornando-se disponível para a
fotossíntese resultando em crescimento das plantas cultivadas mesmo em cultura
heterotrófica (Hartmann et al. 2002). Existem poucos relatos sobre a influência da
concentração do oxigênio no crescimento das plantas in vitro. Espera-se que uma
diminuição moderada da concentração desse gás não tenha efeito no crescimento e
desenvolvimento vegetal. Contudo, a redução da quantidade de O
2
pode apresentar a
vantagem de inibir o desenvolvimento de fungos e bactérias no meio de cultura
(Buddendorf-Joosten & Woltering 1994).
Para algumas espécies de plantas de interesse econômico, o tipo de tampa
utilizado para fechar os frascos foi considerado durante o estabelecimento das
culturas, como é o caso de Bupleurum kaoi, uma espécie medicinal procedente da
China, estudada por Chen et al. (2006), por meio do cultivo de segmentos nodais. Os
autores utilizaram diferentes tipos de vedação: uma delas foi feita com duas camadas
de folha de alumínio e para outra eles utilizara três camadas de papel poroso para
fechar erlenmeyers. As plantas cultivadas nos frascos fechados com material mais
poroso apresentaram maior taxa de sobrevivência das mesmas quando transferidas
para condições ex vitro. Embora o tipo de tampa varie muito entre os cultivos in
vitro a partir de segmentos nodais, como por exemplo, o uso de algodão hidrofóbo
(Sharma et al. 2006), policarbonato envolto por filme plástico (Tadesse et al. 2000) e
também tampa plástica selada com parafilme (Carretero et al. 2007), os autores não
104
testaram diferentes tipos de tampa com intuito de verificar a influência destas sobre o
desenvolvimento das plantas obtidas.
Em Bromeliaceae foram observadas diferenças no crescimento e
desenvolvimento de algumas espécies em função do tipo de tampa usada para fechar
os frascos, Pierik (1987), observou o crescimento de Vriesea splendens em tubo de
ensaios vedados com rolha de algodão, sendo que parte dos tubos estava fechada com
tampas de extremidade carbonizada e outros tinham tampas não carbonizadas. Esses
autores observaram que as maiores plantas foram retiradas dos frascos cujas rolhas
não estavam queimadas. Bellintani et al. (2007), cultivou segmentos caulinares de
Ortophytum mucugense em tubos de ensaio vedados com dois tipos de tampas: PVC e
algodão. Observaram que as maiores taxas de sobrevivência em condições ex vitro
ocorreram nas plantas provenientes dos tubos vedados com algodão. Todavia, não foi
encontrado relato sobre a utilização de diferentes tampas na micropropagação de
bromélias com objetivo de comparar o desenvolvimento in vitro dessas plantas.
Em relação ao conteúdo gasoso existente no interior dos frascos de cultivo,
Nour & Torper (1994) estudaram a influência dos gases na indução de brotação,
desenvolvimento de embriões e gema axilar no cultivo in vitro da parte aérea de
cedro branco (Thuja occidentalis), foi observado que tanto os acúmulos de etileno e
dióxido de carbono, quanto baixas concentrações de oxigênio promoveram o
desenvolvimento de gemas axilares desta espécie. Jackson et al. (1991) compararam
a produção de gases entre plantas micropropagadas de Gerbera jamesonii, Ficus
lyrata e Solanum tuberosum. Concluiu que houve variação nas trocas gasosas de
acordo com a espécie e constatou que a concentração dos gases presentes no interior
dos frascos de cultivo pode definir limites na concentração de: etileno, dióxido de
carbono e oxigênio. Para Bromeliaceae não foram encontrados relatos a respeito da
influência do acúmulo de CO
2
e O
2
quando cultivadas in vitro. Todavia, a influência
do etileno foi verificada para a bromélia A. strobilacea, conforme apresentado no
capítulo 2 deste trabalho, que mostrou o efeito promotor desse gás no alongamento
das plantas cultivadas in vitro.
O capítulo 1 deste trabalho mostra que plantas de A. strobilacea apresentam
alongamento do caule quando cultivadas in vitro. Esse aspecto foi associado
exclusivamente ao cultivo in vitro, pois plantas dessa mesma espécie, cultivadas em
câmaras de germinação nas mesmas condições de luz e temperatura, não alongaram.
Esse resultado foi atribuído ao acúmulo de etileno, como apresentado no capítulo 2.
Portanto, tendo em vista que a condição in vitro é responsável pelo alongamento do
105
eixo caulinar de A. strobilacea, este trabalho visou verificar a influência do tipo de
vedação dos frascos de cultivo sobre o alongamento dessa espécie. Objetivou-se
também identificar a possível influência de O
2
e CO
2
acumulados no interior dos
frascos de cultivo sobre o alongamento, uma vez que foi comprovado que o etileno
está envolvido nesse processo.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal e condições de cultivo
As sementes de Acanthostachys strobilacea (Schultz F.) Klotzsch utilizadas
foram provenientes de plantas existentes na Reserva Biológica e Estação
Experimental de Mogi-Guaçu, São Paulo. O cultivo in vitro foi estabelecido no
laboratório da Seção de Ornamentais do Instituto de Botânica do Estado de São
Paulo, conforme descrito no capítulo 1 deste trabalho. As sementes foram imersas em
solução de hipoclorito de sódio comercial (2 % de cloro ativo) acrescido de 2 gotas
de Tween 20
mantidas sob agitação por 20 minutos. Passado este período, foram
transferidas para uma solução de HCL (ácido clorídrico) a 25 % por 10 minutos.
Após enxágue com água destilada, as sementes foram colocadas em etanol 70 % por
5 minutos, e em seguida em fungicida (Benomyl 0,1 %), por mais 15 minutos, sendo
posteriormente, submersas por 1 hora sob agitação em solução de hipoclorito de
sódio comercial (2 % cloro ativo) com 2 gotas de Tween 20
. Após a desinfestação,
em capela de fluxo de ar laminado, as sementes foram depositadas em frascos
contendo 40 ml de meio nutritivo de Murashige & Skoog (1962) (MS) cuja
concentração dos macronutrientes foi reduzida a 1/5 da formulação original,
adicionado de micronutrientes da composição original do MS, 2% de sacarose, 100
mg L
-
¹ de myo-inositol e 0,1 mg L
-
¹ de tiamina. O pH foi ajustado para 5,8. O meio
nutrititvo foi geleificado com 6 g L
-
¹ de agar, sendo esterilizado em autoclave por 15
minutos a 121 °C. A cultura foi mantida à temperatura de 26 ± 2 °C, sob fotoperíodo
de 12 horas e irradiância de 40 µmol m
-
² s
-
¹, fornecida por lâmpadas fluorescentes
(Osram
®
, super luz do dia 40 W). Segmentos nodais foram obtidos de plantas com
dois meses de idade, estabelecidas in vitro. Após 2 meses de idade, segmentos nodais
dessas plantas foram isolados e transferidos para frascos contendo o meio de cultura,
fechados com 3 diferentes tipos de tampas conforme descrito a seguir.
106
Teste da influência do tipo de vedação dos frascos
Para testar a influência do tipo de vedação utilizada nos frascos de cultivo,
foram depositadas 75 segmentos nodais, em frascos com volume de 250 ml (5 frascos
para cada tratamento com 5 explantes cada), contendo 40 ml de meio de cultura
descritos anteriormente. Foram testados três tratamentos: frascos com tampa plástica
vedados com filme de PVC (TPVC) (policloreto de vinila); frascos fechados somente
com tampa plástica (TP) e frascos fechados com rolha de borracha perfurada e
preenchida com algodão hidrófilo umedecido com sulfato de cobre (TRB), de modo a
eliminar os microorganismos para evitar a entrada dos mesmos no interior dos
frascos e contaminar a cultura (figura 1). Esse experimento foi realizado sob
fotoperíodo de 12 horas. Decorridos 3 meses, avaliou-se os seguintes parâmetros:
número de folhas e raízes, tamanho do caule e da raiz, massa seca e fresca das partes
aérea e radicular e número de segmentos nodais observados devido ao aumento dos
internós. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado e as
médias foram submetidas à análise de variância fator único, para comparação entre as
médias, foi aplicado teste de Tukey com nível de significância de 5 %.
107
Figura 1. Tampas utilizadas na vedação dos frascos do cultivo in vitro de segmentos nodais de
A. strobilacea (A) tampa plástica com filme de PVC (TPVC), (B) tampa plástica sem filme de
PVC (TP) e (C) rolha de borracha e preenchida com algodão hidrófilo umedecido com sulfato
de cobre (TRB). Vista superior das tampas (D) TPVC, (E) TP e (F) TRB.
D
E
F
108
Estimativa de gases
A porcentagem de concentração de oxigênio (O
2
) e dióxido de carbono (CO
2
) no
interior dos frascos foi determinada por analisador desses gases (Illinois ILL6600);
este equipamento possui um sensor de oxigênio e um sensor de dióxido de carbono.
Segmentos nodais de A. strobilacea foram depositados em frascos do tipo
erlenmeyers de 150 ml de volume, vedados com tampa de borracha e filme de PVC,
contendo 20 ml de meio de cultura e acondicionados sob as mesmas condições de
luminosidade e temperatura como descritos anteriormente, sendo três segmentos
nodais por frasco. As tampas de borracha permitiram inserir o eletrodo do
equipamento e tomar as medidas dos gases sem precisar abrir a tampa. Após as
medidas foram realizadas a quantificação dos números de folhas, raízes e segmentos
nodais visíveis, mediu-se o tamanho das partes aéreas e radiculares, as medições
ocorreram nos seguintes intervalos de tempo: 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90 e 105 dias.
A primeira medida foi feita assim que os explantes foram transferidos para o
meio de cultura e os frascos foram fechados (tempo zero). Foi considerada como
concentração controle de gases aquela presente na atmosfera externa ao frasco, ou
seja, 21 % de oxigênio e 0,03 % de dióxido de carbono que foram comparadas
àquelas concentrações existentes no interior dos frascos de cultivo fechados, medidas
nos diferentes tempos citados anteriormente.
Para medir o tamanho do eixo caulinar as folhas foram removidas e
desconsideradas.
109
RESULTADOS
A tabela 1 mostra que as plantas provenientes do tratamento TRB (tampa rolha
de borracha) e TP (tampa plástica) não apresentaram eixo caulinar alongado, este
aspecto foi observado apenas para aquelas de TPVC (tampa plástica com PVC) (3
segmentos nodais). Entretanto, com exceção do tamanho da parte aérea, nesse
tratamento foram observados valores menores para todos os outros parâmetros
avaliados. A quantidade de folhas foi significativamente maior nas plantas que
estavam nos frascos TRB, em relação às plantas que cresciam nos frascos TP e TRB.
A quantidade de raiz foi maior nas plantas do frasco fechados com tampa plásticas, e
também maiores em relação ao tamanho quando comparadas com as plantas dos
demais tratamentos em relação às plantas dos frascos TPVC e TRB. As plantas que
cresciam nos frascos TPVC apresentaram raízes menores quando comparadas com as
plantas dos demais tratamentos.
Tabela 1 – Análise biométrica de plantas produzidas a partir de segmentos nodais de Acanthostachys
strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes diluído a um
quinto por três meses, em frascos com diferentes tipos de vedação: TPVC
-
tampa plástica vedada com filme
de PVC, TP - tampa plástica e TRB - rolha de borracha perfurada e preenchida com algodão hidrófilo
umedecido com sulfato de cobre.
Número de
segmentos nodais
(un)
Número do
eixo caulinar
(cm)
Número de folhas
(un)
Número de raiz
(un)
Comprimento
da raiz (cm)
TPVC 3 a 6,33 a 6 b 3 b 6,61 c
TP -- 0,5 b 6 b 4 a 14,72 a
TRB -- 0,5 b 7 a 3 b 9,88 b
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
A tabela 2 mostra os teores de massa fresca e seca das partes aérea e radiular
das plantas originadas de segmentos nodais em frascos com diferentes tipos de
tampa. A massa fresca da parte aérea foi significativamente maior nas plantas que
cresciam nos frascos com TRB em relação às plantas que cresciam nos frascos
fechados com TP e TPVC, nestes dois últimos tratamentos não foram observadas
diferenças significativas entre eles.
Analisando a tabela 2 observa-se que a quantidade de massa fresca e seca da
parte aérea foi menor quando comparada aos demais tratamentos, contudo acúmulo
de massa fresca foi igual às plantas dos frascos TP. As plantas do frasco TP
apresentaram massa fresca e seca da raiz significativamente maiores quando
comparadas com as raízes das plantas que cresciam nos frascos dos demais tipos de
planta.
110
Tabela 2 – Massa fresca e seca das partes aérea e radicular de plantas produzidas a partir de segmentos nodais
de Acanthostachys strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes
diluídos a um quinto por três meses, em frascos com diferentes tipos de vedação.
Parte aérea Raiz
Massa fresca (g) Massa seca (g) Massa fresca (g) Massa seca (g)
TPVC
0,187 b 0,007 c 0,166 b 0,004 b
TP
0,217 b 0,016 a 0,240 a 0,012 a
TRB
0,317 a 0,012 b 0,126 b 0,005 b
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 5 com 5 replicatas).
A tabela 3 mostra a porcentagem de concentração de oxigênio e dióxido de
carbono durante o cultivo in vitro em frascos fechados com rolhas e vedados com
filme de PVC de segmentos nodais de A. strobilacea durante um período de 105 dias.
Tomando como referência a quantidade de oxigênio da atmosfera que é de 21 %,
observou-se que o acúmulo de oxigênio ocorreu apenas entre 45 e 60 dias de cultivo
(21,6%). Até 30 dias de cultivo observou-se menor concentração de oxigênio e maior
concentração de dióxido de carbono. Observa-se na tabela 4 que foi nesse mesmo
período que os segmentos nodais surgiram (3 segmentos).
Tabela 3 – Prcentagem de oxigênio e dióxido de carbono no interior dos
frascos de cultivo de segmentos nodas A. strobilacea cultivadas por 105 dias
sob fotoperíodo de 12 horas, temperatura de 26 ± 2 ºC e irradiância de 40
µmol m
-2
s
-1
.
Tempo em dias O
2
(%) CO
2
(%)
0 20,4 de 0,04 c
15 20 e 0,44 a
30 20 e 0,14 b
45 20,6 de 0 d
60 21,6 c 0 d
75 21 cd 0 d
90 23 b 0 d
105 24 a 0,1 b
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre
si pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade (n = 3 com 5 replicatas).
Em relação ao CO
2
, a medida controle é de 0,03 %, concentração encontrada
no ambiente externo ao frasco. Observou-se que a diminuição na concentração desse
gás ocorreu entre 30 e 45 dias de cultivo, atingindo valor igual a zero. A maior
concentração desse gás foi identificada aos 15 dias de cultivo. No tempo inicial,
observa-se um pequeno aumento na concentração deste gás.
111
Tabela 4 – Análise biométrica de plantas produzidas a partir de segmentos nodais de Acanthostachys
strobilacea cultivadas in vitro em meio de Murashige & Skoog (1962) com macronutrientes diluído a um
quinto por 105 dias.
Tempo
em dias
Número de
folhas (un)
Número de
raiz (un)
Comprimento do
eixo caulinar (cm)
Comprimento da
raiz (cm)
Número de
segmentos
nodais (un)
0 -- -- -- -- --
15 5 f 1 d 0,3 d 0,5 e --
30 12 ef 7 cd 0,5 d 10,8 d --
45 21 d 10 cd 2,0 c 13,4 d 1 d
60 34 c 17 bc 4 c 20,9 c 3 c
75 38 c 11 cd 7,5 b 28,6 bc 7 bc
90 77 b 24 b 10,5 b 35,6 b 9 b
105 123 a 37 a 13 a 47,9 a 12 a
Médias acompanhadas por letras distintas na vertical diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
com 5% de probabilidade (n = 3 com 5 replicatas).
A tabela 4 mostra os parâmetros biométricos referentes às plantas cultivadas
durante o período de quantificação do oxigênio e dióxido de carbono. Os resultados
mostram que as plantas cultivadas apresentaram um alongamento do eixo caulinar,
evidenciando os segmentos nodais. Os demais parâmetros avaliados mostram o
desenvolvimento da planta ao longo do tempo, como o crescimento da parte aérea,
como aumento do número de folhas e quantidade de raiz.
DISCUSSÃO
A utilização de tampas plásticas é bastante comum em laboratórios comerciais
de cultivo in vitro. Tem sido considerado que o tipo de tampa pode determinar os
níveis de trocas gasosas com o ambiente externo (Grattapaglia & Machado 1998).
Usualmente, para evitar contaminação, os frascos podem ser vedados com filme de
PVC que envolve as tampas de plástico ou rolhas de borracha. Porém, esse
procedimento pode restringir as trocas gasosas entre o interior do frasco e a
atmosfera externa a ele (Grattapaglia & Machado 1998).
Este trabalho mostrou que as plantas cultivadas nos frascos fechados com
tampa de plástico envolvida com PVC apresentaram um alongamento do caule
conspícuo. Em contraposição, as raízes dessas plantas eram menores que as das
plantas dos outros tratamentos os quais eram constituídos por plantas mantidas em
frascos com tampas que permitiam maior troca gasosa (tampa de borracha perfurada
e tampa de plástico sem filme de PVC). É provável que esses efeitos sejam devido ao
maior acúmulo de gases existentes no interior dos frascos vedados com PVC, pois a
difusão destes para a atmosfera externa foi dificultada pelo tipo de tampa. No
112
capítulo 2, que mostrou o efeito do gás etileno no alongamento de plantas cultivadas
in vitro, também foi utilizado PVC para fechar os frascos. Resultados semelhantes
foram observados no cultivo in vitro de macieira, Citrus e eucalipto quando
cultivados em frascos tampados com filme de PVC (Grattapaglia & Machado, 1998).
Nour & Torper (1994), trabalhando com Thuja oficcinalis, observaram que a
indução e alongamento de parte aérea desta planta foram significativamente afetados
pelo tipo de frasco utilizado, os brotos produzidos em frascos com tampa de soro
hermeticamente vedados apresentaram alongamento aproximadamente três vezes
mais que os dois outros tipos de frascos (rolha de espuma, placa de Petri selada com
filme), o tamanho da parte aérea apresentou diferença significativa somente após 60
dias de cultivo, até o 25º dia não se observaram diferenças nas plantas dos diferentes
tratamentos, com plantas de A. strobilacea, neste estudo, o maior comprimento da
parte aérea foi observado nas plantas que cresciam nos frascos TP, onde
possivelmente ocorriam maiores trocas gasosas com o meio externo quando
comparado com os frascos vedados com filme de PVC. Jackson et al. (1991),
constataram que uma baixa aeração do frasco de cultura pode ser prejudicial ao
crescimento das plantas, entretanto há respostas diferenciadas em função da espécie
cultivada.
Alguns trabalhos relacionam o efeito conjunto do etileno e o CO
2
sobre o
alongamento celular como relatado para plantas de Thuja oficcinalis, nas quais altos
níveis tanto de etileno quanto de CO
2
favoreceram o desenvolvimento e o
alongamento de brotos. Nesse trabalho foi demonstrado que a remoção de um ou
outro ou de ambos os gases, acarretou na redução tanto no número quanto no
tamanho dos brotos produzidos. Neste trabalho, os autores concluíram que a emissão
de compostos voláteis pelos explantes cultivados pode modificar o padrão de
morfogênese in vitro. Entretanto, a quantificação do oxigênio e do dióxido de
carbono presentes no interior dos frascos de cultivo das plantas de A. strobilacea não
mostraram efeito sobre o alongamento das plantas. Contudo, pôde-se observar que as
quantidades de CO
2
detectadas atingiram valores próximos de zero quando as plantas
apresentaram o início do alongamento. Medidas simultâneas de etileno e CO
2
do
interior dos frascos poderiam contribuir para verificar a interação desses gases no
alongamento.
Kitaya et al (2005), estudaram a velocidade da corrente de ar no interior de
frascos contendo explantes de plantas de batata. Os dados foram comparados aos
frascos sem plantas. Os autores concluíram que o ar presente no centro do frasco se
113
movimentou do sentido inferior para o superior, ou seja, em direção à tampa do
frasco, e no sentido oposto em relação à parede do frasco. Segundo esse trabalho, a
velocidade diminuiu com o aumento do tamanho da planta, comparativamente à
velocidade do ar no frasco de cultura que foi significativamente menor quando
comparado com o que ocorria na casa de vegetação e campo. O processo de difusão
do ar pode ser baixo e limitante no processo fotossintético e de transpiração da
planta, esses autores sugerem que o aumento do movimento do ar nos frascos
promove o crescimento da planta através da fotossíntese e a respiração.
As diferenças observadas entre a concentração de oxigênio e dióxido de
carbono referente ao tempo zero indicam que os níveis destes gases se alteraram
durante a deposição do explante no meio nutritivo, o que pode ser atribuído ao fluxo
de ar presente na capela de fluxo de ar laminar, que pode ter alterado a atmosfera
interna do frasco.
Neste trabalho, verificou-se que houve uma diminuição na porcentagem de
concentração de oxigênio que pode ter sido devida à respiração dos explantes (entre
o tempo zero e 30 dias). Todavia, aos 45 dias, a quantidade de oxigênio aumenta
progressivamente, enquanto que a de CO
2
declina (Tabela 3). Ao comparar esses
dados aos fornecidos na tabela 4, verifica-se que os segmentos nodais visíveis a olho
nu iniciam-se após 45 dias dos explantes terem sido depositados no meio nutritivo.
Ou seja, evidenciando o crescimento celular. Os dados referentes aos 60, 75, 90 e
105 dias mostram que as plantas estão crescendo (alongando o eixo caulinar) e
realizando a fotossíntese, pois os teores de CO
2
reduziram-se a zero. Aumento na
concentração de oxigênio no interior dos frascos coincide com aumento da parte
aérea e raízes, o que leva a sugerir que a produção de oxigênio seja devida ao
aumento da fotossíntese realizada pela planta.
Jackson et al. (1991) trabalhando com Gerbera jamesonii e Solanum
tuberosum constataram que em frascos fortemente vedados ocorre um maior acúmulo
de dióxido de carbono em relação aos frascos frouxamente fechados e intermediários,
e concomitantemente foi observado que as concentrações de oxigênio nos frascos
fortemente fechados foram reduzidas em aproximadamente a metade. No cultivo in
vitro de A. strobilacea houve o contrário, ao final de 105 dias pouco dióxido de
carbono e maior quantidade de oxigênio foi detectada no interior dos frascos.
Tisserat et al. (2002), testando a influência de atmosfera modificada com O
2
e
CO
2
, no crescimento, morfogênese e no metabolismo secundário de plantas de menta
cultivadas in vitro, observaram que o crescimento foi maior nos diferentes níveis de
114
O
2
aplicados quando foi adicionado ao meio 10.000 µmol mol
-1
de CO
2
quando
comparado com a concentração de 350 µmol mol
-1
deste mesmo gás. Em relação à
concentração de O
2
, aumento no crescimento e morfogênese foi observado nas
plantas que cresciam em concentrações de ≥ 21 % de oxigênio. Lembrando que a
concentração de oxigênio na atmosfera terrestre é de 21 % (Larcher 2006).
Neste estudo podemos concluir que o tipo de tampa utilizada na vedação dos
frascos de cultivo in vitro de A. strobilacea pode alterar o fenótipo das plantas, essa
alteração não tem relação direta com o conteúdo de dióxido de carbono e oxigênio,
não se observa grande acúmulo desses gases durante o período de cultivo observado.
Contudo, as avaliações dos teores desses gases puderam ser relacionadas à
fotossíntese realizada pelas plantas desenvolvidas a partir dos segmentos nodais.
115
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119
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Acanthostachys strobilacea é uma bromélia epífita ou saxicola que possue
características morfológicas peculiares que as tornam atrativas do ponto de vista
ornamental, apesar de ser explorada comercialmente, não foram encontrados
registros sobre a produção desta espécie em escala comercial. O cultivo in vitro é
uma técnica bastante utilizada na multiplicação de plantas ornamentais uma vez que
viabiliza a produção de clones de um fenótipo de interesse, e as plantas produzidas
são de ótima qualidade fitossanitária aumentando o valor de mercado da espécie. O
presente estudo se propôs a estabelecer um protocolo de cultivo para A. strobilacea
de modo a viabilizar sua exploração comercial.
O primeiro obstáculo a ser superado foi o estabelecimento das sementes em
condições assépticas, pois as mesmas são envoltas por uma mucilagem que além de
propiciar a proliferação de microorganismos no interior dos frascos de cultivo são
atrativas para a avifauna do seu ambiente natural, portanto as sementes maduras são
escassas no campo. Fundamentando-se em um trabalho com Aechmea nudicaulis,
espécie de bromélia cujas sementes também possuem mucilagem foi estabelecido um
protocolo de desinfestação para sementes de A. strobilacea através da utilização de
uma solução de ácido clorídrico, além das substâncias usuais como etanol,
hipoclorito de sódio e detergente, assim obtivemos êxito nas taxas de contaminação.
Uma vez estabelecido o melhor método de desinfestação superficial das
sementes, e controlados as taxas de contaminação, o passo posterior seria a escolha
do melhor meio nutritivo para o crescimento das plantas, a solução nutritiva mais
utilizada para micropropagação de bromélias é aquela formulada por Murashige &
Skoog (MS) no ano de 1962, entretanto, modificações na formulação original são
recomendadas para se atender necessidades específicas de cada espécie, assim tendo
como base teórica um trabalho desenvolvido com Ananas comosus, sementes de A.
strobilacea foram cultivadas em soluções diluídas de MS. Este experimento resultou
em algo inusitado para Bromeliaceae, algumas plantas apresentaram alongamento do
seu eixo caulinar, aumentando as distâncias dos segmentos internodais, facilitando o
isolamento dos nós.
Uma vez isolados e subcultivados em novo meio nutritivo, estes segmentos
nodais deram origem a novas plantas sem a necessidade de utilização de reguladores
de crescimento, muito comum no cultivo de fragmento de tecidos vegetais na indução
de novas plantas. Entretanto a produção de nós não era uniforme, apesar de
120
potencializar a propagação desta planta, havia necessidade de investigar o que
poderia uniformizar a produção de segmentos nodais.
Uma das hipóteses testadas foi a intensidade luminosa na qual os frascos
permaneciam durante o cultivo in vitro da espécie, a partir de medições da
intensidade na sala de cultura onde as plantas cresceram durante o estudo nutricional
associado a registros de intensidade luminosa para bromélias encontrada na
literatura, foi estabelecido o intervalo de intensidade onde foram testadas as
sementes de A. strobilacea. Foi identificado que menor intensidade luminosa induzia
ao alongamento do eixo caulinar nas plantas, porém intensidade luminosas maiores
também induziam o alongamento, sugerindo que outros fatores estavam envolvidos
no fenótipo.
Segmentos nodais subcultivados também apresentam alongamento do eixo
caulinar e, assim como as sementes, a produção não foi uniforme, investigações nos
levaram a outra hipótese, o alongamento caulinar poderia gerar ao longo do caule
razões de concentração endógenas hormonais diferenciadas que estaria influenciando
as alterações morfológicas das plantas regeneradas via segmento nodal. Esta hipótese
foi testada e surgiram diferenças em relação à posição que o nó se localizava no
caule quando isolado.
As investigações continuaram e surgiu a hipótese de outro fator abiótico, além
da luz, que seria o acúmulo de gases no interior dos frascos de cultivo, diferentes
tipos de tampa utilizadas para fechar os frascos de cultura foram testados e observou-
se que em frascos cuja tampa dificultava as trocas gasosas entre o interior do frasco e
o ambiente externo propiciou o alongamento caulinar nas plantas.
Um dos gases que poderia naquele momento estar envolvido era o etileno, foi
encontrado um trabalho realizado em 1994 com Arabidopsis thaliana, espécie
bastante utilizada como modelo fisiológico, em que estas plantas apresentavam
alongamento do eixo caulinar quando cultivadas in vitro na luz na presença de
etileno, é muito comum este fitorregulador se acumular no interior dos frascos de
cultivo em concentrações fisiologicamente ativas que podem alterar o crescimento e
desenvolvimento das plantas micropropagadas. Assim, foi realizado um teste com
sementes onde foi aplicado este fitorregulador e um potente inibidor de receptor de
etileno, as respostas foram muito sutis levando a reestruturar o experimento
aumentando-se a dose de etileno e do inibidor e desta vez em segmentos nodais, uma
vez que o mesmo foi estabelecido como explante para cultivo da espécie. Os
resultados mostraram que há relação entre o etileno e o alongamento do caule,
121
coletas de oxigênio e dióxido de carbono foram realizadas nos frascos bem fechado
de modo a investigar uma possível relação entre os gases, entretanto não foi
observada relação direta destes gases no alongamento do eixo caulinar de A.
strobilacea.
Plantas com eixo caulinar alongado são utilizadas como matrizes para retirada
de explante para obtenção de novas plantas e aquelas que não apresentam eixo
caulinar alongado são transferidas para condições ex vitro onde sobrevivem com
sucesso, estudos nutricionais mostraram que em condição de casa de vegetação estas
plantas requerem soluções concentradas quando comparadas com o cultivo in vitro.
Estudos na quantificação do etileno no interior dos frascos de cultivo bem
como dos teores endógenos de fitorreguladores poderiam indicar como este
alongamento ocorre. Estudos anatômicos são fundamentais na compreensão das
alterações que ocorrem durante o desenvolvimento da espécie. Além de um eficiente
protocolo de propagação para A. strobilacea, este trabalho propõe um novo modelo
para estudos fisiológicos com ênfase no etileno.
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