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IURI BEZERRA DE BARR
OS
AVALIAÇÃO QUÍMICA E DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS
DE Coccoloba mollis
LONDRINA
2009
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IURI BEZERRA DE BARROS
AVALIAÇÃO QUÍMICA E DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS
DE Coccoloba mollis
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Quí
mica de
R
ecursos Naturais
da Universidade Estadual de Londrina para
obtenção do título de M
estre
.
Orientadora: Profa. Dra. Dalva Trevisan
Ferreira
LONDRINA
2
009
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Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
B277a Barros, Iuri Bezerra de.
Avaliação química e das atividades biológicas de
Coccoloba mollis / Iuri
Bezerra de Barros. – Londrina, 2009.
122 f. : il.
Orientador: Dalva Trevisan Ferreira.
Dissertação (Mestrado em Química dos Recursos Naturais)
Universidade
Estadual de Londrina, Centro de Ciênci
as Exatas, Programa de Pós-Graduação
em Química de Recursos Naturais, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Química orgânica – Teses. 2. Plantas medicinais – Teses. 3. Recursos
naturais – Química – Teses. 4. Coccoloba mollis – Teses. I. Ferreira, Dalva
Trevisan. II. Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Exatas.
Programa de Pós-Graduação em Química dos Recursos Naturais. III. Título.
CDU 547
IURI BEZERRA DE BARROS
AVALIAÇÃO QUÍMICA E DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS
DE Coccoloba mollis
Dissertação apresentada
ao
Programa de
Mestrado em Química dos Recursos
Naturais da Universidade Estadual de
Londrina para obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
____________________________________
Profa. Dra. Dalva Trevisan Ferreira
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________
Profa. Dra. Silvana Maria de Oliveira Santin
Universidade Estadual de Maringá
____________________________________
Profa. Dra. Maria Inês Rezende
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 30 de março de 2009.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Dalva Trevisan Ferreira pela orientação neste trabalho, e
também pela sua amizade e apoio.
Ao Mestre Jurandir Pereira Pinto, o grande deus da cromatografia por todo o
apoio técnico e principalmente a amizade.
À Profa. Dra. Maria José Sparça Salles de Faria e a todos os estagiários do
Laboratório de Toxicologia do Desenvolvimento, especialmente a Liliane Kelen Miguel sem
os quais seria impossível a relização do estudo de toxicologia materna.
À Profa. Dra. Maria Inês Rezende e Profa. Dra. Juliana Feijó de Souza
Daniel que possibilitaram os ensaios de atividade antimicrobiana.
À Profa. Ms. Audrey Alesandra Stinghen Garcia Lonni, ao técnico do
Laboratório de Ciências Farmacêuticas Nelson Heitor Fuzinato e o aluno Gideão Silva
Ribeiro pelo auxílio na quimiprospecção.
À Profa. Dra. Lúcia Sadayo Assari Takahashi pelo orientação no ensaio de
atividade alelopática.
Aos professores Dr. Fernando César de Macedo Júnior, Dr. Cesar Cornélio
Andrei e Dra. Terezinha de Jesus Faria que muito contribuiram na realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Raimundo Braz Filho da Universiade Estadual Norte
Fluminense e o Prof. Dr. Mario Geraldo de Carvalho da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro pelos espectros de RMN.
À Profa. Dra. Ana Odete Santos Vieira pela identificação da espécie.
Aos meus irmãos de bancada, Queli Cristina Fidelis, Ana Laura Mantuani
Ivan, Luiz Fernando Lepre, Priscilla Bernardes, Gabriel F. dos Santos sem os quais esse
trabalho seria inviável.
Aos amigos Danilo Antonio Giarola (Cowboy) e Luciana Natalia Cividatti
por todas as risadas.
À minha namorada Dayana Lacerda Custódio pela amizade, carinho e amor.
À Universidade Estadual de Londrina e ao Programa de Mestrado em
Química dos Recursos Naturais por viabilizarem o trabalho.
À Capes pelo apoio financeiro.
BARROS, Iuri Bezerra de. Avaliação química e das atividades biológicas de Coccoloba
mollis. 116p. Dissertação (Mestrado em Química dos Recursos Naturais) – Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, 2009.
RESUMO
Coccoloba mollis (Polygonaceae) é uma planta medicinal amplamente utilizada em Londrina-
PR como energético e modulador da memória. Este trabalho apresenta a avaliação química
dos extratos etanólicos das raízes e folhas de C. mollis e testes biológicos. Os extratos foram
submetidos a processos cromatográficos usuais de fracionamento e purificação em Química
de Produtos Naturais conduzindo ao isolamento dos seguintes constituintes: Nas folhas e
raízes foram identificadas misturas de hidrocarbonetos alifáticos de cadeias longas (C-28 a C-
34 excetuando C-30 e 31 e C-16 a C-31 exceto o C-17 respectivamente) e ésteres etílicos de
ácidos graxos (C- 18, 22, 24, 25 e 27 e C - 12, 15, 18, 22, 25, 26, 27 respectivamente), nas
raízes foram identificadas duas antraquinonas: a emodina (1,6,8-trihidroxi-3- metil-
antraquinona) e a fisciona (1,8-dihidroxi-3-metil-6-metoxi-antraquinona) e nas folhas um
triterpeno, a taraxerona (13 - metil - 27-norolean-14-en-3-ona (D-Friedoolean-14-en-3-ona))
e o malato de dietila. A quimioprospecção realizada com as raízes e as folhas utilizando-se de
métodos farmacognósticos revelou a presença de flavonóides e taninos, em ambas, e
antraquinonas apenas nas raízes. Os extratos das raízes e das folhas foram submetidos a testes
biológicos: avaliação da atividade antioxidante (DPPH), da atividade antimicrobiana,
alelopatia, letalidade de Artemia salina e toxicidade materna em camundongos. O poder
antioxidante (CMI
50
µg/mL) resultante das folhas (10,11 ± 0,12) e das raízes (15,96 ± 0,55)
apresentaram valores semelhantes aos do BHT (butil hidroxi tolueno). Nos testes
antimicrobianos as raízes apresentam a melhor atividade antibacteriana e as folhas melhor
atividade antifúngica. As raízes apresentaram maior toxicidade em relaçao à Artemia salina, e
ambos os extratos não revelaram toxicidade materna nas concentrações testadas. As
antraquinonas isoladas das raízes revelaram atividade antifúngica.
Palavras-chave: Coccoloba mollis. Avaliação química. Antioxidante. Antimicrobianos.
Toxicidade materna.
BARROS, Iuri Bezerra de.
Evaluation of chemical and biological activities of Coccoloba
mollis. 116p. Dissertação (Mestrado em Química dos Recursos Naturais) – Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, 2009.
ABSTRACT
Coccoloba mollis (Polygonaceae) is a plant that is being used as medicine in Londrina
(memory herb), this specie has been praised as efficient in the treatment of stress, and as
memory modulator. This work presents the chemical evaluation of the root and leaf ethanolic
extracts of C. mollis and biological tests. The extracts were submitted to usual
chromatographic methods of separation and purification in Natural Products Chemistry.
Leading to the isolation of the following constituents: In the leaves and roots were identified
aliphatic hydrocarbons (C-16 to C-31 except -17 and C-28 to C-34 except C-30 and 31
respectively) and fatty acids ethyl esters ( C – 18, 22, 24, 25 and 27 and C – 12, 15, 18, 22,
25, 26, and 27 respectively) . In the roots they were identified two anthraquinones emodin
(1,6,8-trihydroxy-3- methyl-anthraquinone) and fission (1,8-dihydroxy-3-methyl-6-metoxi-
anthraquinone). In the leaves one triterpen taraxerone (13 - methyl - 27-norolean-14-en-3-
one (d-friedoolean-14-en-3-one)) and diethyl malate. Phytochemical screening have been
characterized using pharmacognostic methods to determine the major chemical groups present
in roots and leafs of this species. Flavonois and tannins in both and anthraquinones in roots.
The extracts of roots and leaves were sunjected to biological tests: Evaluation of antioxidant
activity (DPPH), antimicrobial activity, allelopathy, lethality of Artemia salina and maternal
toxicity in mice. The antioxidant activity (CMI
50
µg/mL) das folhas (10.11 ± 0.12) e raizes
(15.96 ± 0.55) are similar of BHT (butylateg hydroxytoluene). Antimicrobial tests roots
showed the best results as antibacterial and the leaves as antifungal. Roots presented toxicity
larger against Artemia salina than leaves. and both extracts don’t’ show maternal toxicity at
the concentrations assayed. The isolated anthraquinones showed antifungal activity.
Key words: Coccoloba mollis. Chemical evaluation. Antioxidant. Antimicrobial. Maternal
toxicity.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
H
– deslocamento químico de hidrogênio
C
– deslocamento químico de carbono
– comprimento de onda
%ASR – atividade de seqüestro de radicais
ANOVA – análise de variância
AVC – acidente vascular cerebral
BDA – Batata Dextrose Ágar
BHT – 2,6-di-t-butil-4-methil-fenol
CG-DIC – cromatografia gasosa com detector de ionização de chama
CG-EM – cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CMF-1 – mistura de hicrocarbonetos obtida da fração acetato de etila do extrato etanólico
das folhas de C. mollis
CMF-2 – mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos obtida da fração acetato de etila do
extrato etanólico das folhas de C. mollis
CMF-3 – taraxerona obtida da fração acetato de etila do extrato etanólico das folhas de C.
mollis
CMF-4 – malato de dietila obtido da fração acetato de etila do extrato etanólico das folhas
de C. mollis
CMI
50
- concentração mínima inibitória de 50%
CMR-1 – mistura de hicrocarbonetos obtida da fração hexano do extrato etanólico das raízes
de C. mollis
CMR-2 – mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos obtida da fração hexano do extrato
etanólico das raízes de C. mollis
CMR-3 – fisciona obtida da fração hexano do extrato etanólico das raízes de C. mollis
CMR-4 – emodina obtida da fração hexano do extrato etanólico das raízes de C. mollis
DMSO – dimetilsulfóxido
DPPH – 2,2- difenil-1-picril-hidrazil
EM – espectrometria de massas
EPM – erro padrão da medição
FDA – Food and Drug Association
IV – Infravermelho
IVG – índice de velocidade de germinação
LC
50
– concentração letal 50%
m/z – relação massa carga
NDA – new drug application
PBS – Phosphate buffered saline
RMN ressonância magnética nuclear
ROS – substâncias reativas oxigenadas
SAMR Staphylococcus aureus meticilina-resistentes
TPPI – taxa de perdas pós-implantação
UFC – unidades formadoras de colônia
UV – ultravioleta
v/v – volume / volume
VRE – vancomicina resistente Enterococcus
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Estruturas de substâncias utilizadas como princípios ativos
isolados de plantas............................................................................. 17
Figura 2 -
Estrutura da palitoxina ..................................................................... 18
Figura 3 -
Da planta aos princípios ativos.....................................................
.....
21
Figura 4 -
Rotas biossintéticas resumidas dos metabólitos secundários ........... 22
Figura 5 -
Rota biossintética dos ácidos graxos................................................. 25
Figura 6 -
Rota biossintética dos terpenóides e esteróides.......................
..........
28
Figura 7 -
Ácido giberélico................................................................................ 29
Figura 8 -
Estrutura básica das antraquinonas................................................... 30
Figura 9 -
Rota biossintética das antraquinonas exclusivamente via acetato.... 31
Figura 10 -
Rota biossintética das antraquinonas via acetato – chiquimato........ 32
Figura 11 -
Estrutura da alizarina (1,2-dihidroxi-9,10-antracenediona).............. 33
Figura 12 -
Estrutura básica dos flavonóides....................................................... 33
Figura 13 -
Estrutura básica das diferentes classes de flavonóides...................
...
34
Figura 14 -
Rota biossintética dos flavonóides.................................................... 35
Figura 15 -
Exemplos de tanino condensado (proantocianidina) e hidrolisável
(corilagina)........................................................................................ 36
Figura 16 -
Estrutura da betulina e -sitosterol isolados da C. acrostichoides.... 39
Figura 17 -
Triterpenos isolados de C. dugandiana............................................. 40
Figura 18 -
Estrutura da miricetina-3-ramnosídeo, flavonóide encontrado em
C. dugandiana................................................................................... 41
Figura 19 -
Estrutura do ácido gálico, presente na C. dugandiana...................... 41
Figura 20 -
Antraquinonas isoladas da C. uvifera................................................ 42
Figura 21 -
Estrutura da -amirina isolada da C. uvifera..................................... 43
Figura 22 -
Coccoloba mollis............................................................................... 44
Figura 23 -
Estrura das substâncias já isoladas na Coccoloba mollis.................. 45
Figura 24 -
Representação da reação entre o DPPH e a molécula doadora de
hidrogênios, formando a molécula estável reduzida DPPH-H ......... 50
Figura 25 -
A – Cromatograma da amostra CMF–1; B – Cromatograma da
amostra CMR-1................................................................................. 73
Figura 26 -
Número de carbonos x tempo de retenção em minutos.................... 74
Figura 27 -
A – Cromatograma da amostra CMF–2; B – Cromatograma da
amostra CMR-2.................................................................................
75
Figura 28 -
Gráfico relacionando o número de carbonos dos ésteres etílicos de
ácidos graxos vs. o tempo de retenção em minutos.......................... 75
Figura 29 -
Cromatograma da amostra CMR-3................................................... 76
Figura 30 -
Proposta de fragmentação para a fisciona......................................... 77
Figura 31 -
Cromatograma da amostra CMR-4................................................... 78
Figura 32 -
Proposta de fragmentação para a emodina........................................ 79
Figura 33 -
Espectro de RMN de
1
H da amostra CMR-3.................................... 81
Figura 34 -
Espectro de RMN de
1
H da amostra CMR-4.................................... 82
Figura 35 -
Espectro de RMN de
13
C da amostra CMR-3................................... 83
Figura 36 -
Espectro de RMN de
13
C da amostra CMR-4................................... 84
Figura 37 -
Cromatograma da amostra CMF-3.................................................... 86
Figura 38 -
Proposta de fragmentação para a tarexorona...................................
..
87
Figura 39 -
Fragmentação via retro Diels-Alder em triterpenos da classe dos
ursanos e oleananos........................................................................... 88
Figura 40 -
Espectro de RMN de
1
H da amostra CMF-3..................................... 90
Figura 41
-
Espectro de RMN de
13
C da amostra CMF-3...................................
.
91
Figura 42 -
Ampliação da região entre 13 e 31 ppm do espectro de RMN de
13
C da amostra CMF-3...................................................................... 92
Figura 43 -
Ampliação da região entre 31 e 56 ppm do espectro de RMN de
13
C da amostra CMF-3...................................................................... 93
Figura 44 -
Cromatograma da amostra CMF-4.................................................... 95
Figura 45 -
Proposta de fragmentação para o malato de dietila........................... 96
Figura 46 -
Gráfico da % de Artemia salina Lench vivos vs. logarítmo da
concentração do extrato etanólico das raízes (A) e folhas (B) da C.
mollis................................................................................................. 100
LISTA DE
TABELAS
Tabela 1 -
Fármacos baseados em produtos naturais em diferentes estágios de
desenvolvimento .........................................................................
......
20
Tabela 2 -
Categorias terapêuticas de fármacos derivados de produtos
naturais nos diferentes estágios de desenvolvimento........................ 20
Tabela 3 -
Classificação das substâncias químicas de acordo com o seu
potencial teratogênico, segundo o FDA............................................ 47
Tabela 4 -
Quimioprospecção de Coccoloba mollis........................................... 72
Tabela 5 -
Deslocamentos químicos observados para as amostras CMR-3 e
CMR-4 de referência para a fisciona e emodina respectivamente.... 80
Tabela 6 -
Deslocamentos químicos observados para a amostra CMF-3 e
valores de referência para taraxerona................................................ 89
Tabela 7 -
Efeitos do tratamento nos parâmetros maternos de camundongos... 97
Tabela 8 -
Efeitos do tratamento nos parâmetros relativos ao
desenvolvimento intra-uterino da prole
.............................................
98
Tabela 9 -
Atividade antioxidante (expressa em CMI
50
) dos extratos de
Coccoloba mollis............................................................................... 101
Tabela 10 -
Atividade antibacteriana dos extratos etanólicos de Coccoloba
mollis................................................................................................. 102
Tabela 11 -
Atividade antifúngica dos extratos etanólicos de Coccoloba mollis. 103
Tabela 12 -
Atividade antifúngica dos extratos etanólicos de folhas e raízes de
C. mollis e da fisciona e da emodina................................................. 104
Tabela 13 -
Atividade alelopática dos extratos etanólicos das raízes e das
folhas de C. mollis............................................................................. 105
SUM
ÁRIO
1
INTRODUÇÃO........................................................................................
14
2 OBJETIVOS
.............................................................................................
15
2.1 Objetivo Geral........................................................................................... 15
2.2 Objetivos Específicos................................................................................ 15
3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 16
3.1 Considerações Sobre Produtos Naturais.................................................... 16
3.2 Metabólitos Secundários............................................................................ 21
3.2.1 Ácidos Graxos e Derivados....................................................................... 24
3.2.1.1
Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa............................................... 25
3.2.1.2
Ésteres alifáticos de cadeia longa.............................................................. 26
3.2.2 Terpenos e Esteróides................................................................................ 27
3.2.3 Antraquinonas............................................................................................ 30
3.2.4 Flavonóides................................................................................................ 33
3.2.5 Taninos...................................................................................................... 36
3.3 Considerações Sobre Elucidação Estrutural.............................................. 37
3.4 Polygonaceae............................................................................................. 38
3.4.1 O Gênero Coccoloba................................................................................. 39
3.4.1.1
Coccoloba acrostichoides.......................................................................... 39
3.4.1.2
Coccoloba dugandiana.............................................................................. 40
3.4.1.3
Coccoloba excoriate.................................................................................. 41
3.4.1.4
Coccoloba uvifera...................................................................................... 41
3.4.2 Coccoloba mollis....................................................................................... 43
3.5 Considerações sobre Avaliação Toxicológica........................................... 46
3.5.1 Testes de Toxicidade Reprodutiva............................................................ 46
3.5.2 Toxicidade sobre Artemia salina Leach.................................................... 48
3.6 Avaliação da Atividade Antioxidante........................................................ 49
3.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana................................................... 51
3.8 Avaliação do Potencial Alelopático.......................................................... 54
4 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 56
4.1 Material Vegetal........................................................................................ 56
4.2 Quimioprospecção..................................................................................... 56
4.2.1 Pesquisa de Heterosídeos Fenólicos Simples............................................ 56
4.2.2 Pesquisa de Flavonóides............................................................................ 57
4.2.3 Pesquisa de Cumarinas.............................................................................. 57
4.2.4 Pesquisa de Taninos................................................................................... 58
4.2.5 Pesquisa de Antraquinonas........................................................................ 58
4.2.6 Pesquisa de Saponinas............................................................................... 59
4.2.7 Pesquisa de Glicosídeos Cardiotônicos..................................................... 59
4.2.7.1
Reagente de Kedde.................................................................................... 60
4.2.8 Pesquisa de Alcalóides.............................................................................. 60
4.2.8.1
Reagente de Dragendorff........................................................................... 61
4.2.8.
2
Reagente de Mayer.................................................................................... 61
4.2.8.3
Reagente Bertrant...................................................................................... 61
4.3 Desenvolvimento Fitoquímico.................................................................. 62
4.3.1 Equipamentos............................................................................................ 62
4.3.2 Obtenção dos Extratos Brutos e das Frações............................................. 62
4.3.3 Isolamento e Purificação dos Constituintes............................................... 63
4.3.4 Isolamento e Purificação de Constituintes do Extrato Hexânico das
Raízes......................................................................................................... 63
4.3.5 Isolamento e Purificação de Constituintes do Extrato em Acetato de
Etila das Folhas.......................................................................................... 64
4.3.6 Revelador de Vanilina............................................................................... 64
4.4 Toxicidade Materna dos Extratos de Coccoloba mollis............................ 65
4.4.1 Animais...................................................................................................... 65
4.4.2 Grupos Experimentais para Avaliação da Toxicidade Materna................ 65
4.4.3 Análise Estatística...................................................................................... 66
4.5 Teste de Letalidade de Artemia salina..........................................
.............
66
4.5.1
Composição da Água do Mar Artificial.....................................................
67
4.6 Teste de Atividade Antioxidante............................................................... 67
4.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana................................................... 68
4.7.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana Frente à Bactérias e Leveduras. 68
4.7.2 Avaliação da Atividade Antimicrobiana Frente à Fungos Filamentosos.. 69
4.8 Avaliação do Potencial Alelopático de Extratos de Coccoloba mollis..... 70
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................. 72
5.1 Quimioprospecção..................................................................................... 72
5.2 Identificação das Amostras CMF-1 e CMR-1........................................... 73
5.3 Identificação das Amostras CMF-2 E CMR-2.......................................... 74
5.4 Identificação das Amostras CMR-3 E CMR-4.......................................... 75
5.5 Identificação da Amostras CMF-3............................................................ 85
5.6 Identificação da amostra CMF-4............................................................... 94
5.7 Toxicidade Materna dos Extratos Etanólicos das Folhas e das Raízes de
Coccoloba mollis....................................................................................... 96
5.8 Teste de letalidade de Artemia salina........................................................ 99
5.9 Teste de Atividade Antioxidante............................................................... 101
5.10 Teste de Atividade Antimicrobiana........................................................... 102
5.11 Avaliação do Potencial Alelopático.......................................................... 105
6 CONCLUSÕES........................................................................................
106
7 REFERÊNCIAS....................................................................................... 108
14
1 INTRODUÇÃO
Há mais de 200 anos o isolamento e estudo de produtos naturais são funções das
ciências químicas e biológicas, sendo que o Dictionary of Natural Products apresenta dados
químicos, estruturais e bibliográficos para mais de 190.000 produtos naturais e substâncias
relacionadas (BRAZ-FILHO, 1994; University of Texas Libraries, 2007).
As plantas representam uma importante fonte de fármacos, considerando-se a grande
diversidade de moléculas com potencial medicinal e dessa forma podem oferecer uma efetiva
contribuição na busca de novas substâncias bioativas, medicamentos semi-sintéticos, e
originar modelos de moléculas para sínteses de medicamentos (BARBOSA-FILHO et al.,
2007).
O crescente uso e comercialização de plantas consideradas medicinais fizeram com
que se intensificassem os estudos para identificar os constituintes químicos e a comprovação
das possíveis atividades farmacológicas das espécies empregadas como fitoterápicos (BENT,
2008; HAMBURGER; HOSTETTMAN, 1991 apud CRUZ, 1999). As plantas medicinais se
apresentam como o único recurso terapêutico de parte da população do Brasil e de 2/3 da
população mundial, este mercado de fitoterápicos movimenta aproximadamente U$ 22
milhões por ano e vem seduzindo cada vez mais adeptos nos países desenvolvidos. Um grave
problema na comercialização desses produtos no Brasil bem como na possibilidade de
exportação dos mesmos é a falta de garantia de sua eficácia, segurança e qualidade, padrões
estes, que devem ser mensurados em bases científicas, para segurança do usuário (PINTO et
al., 2002).
A Coccoloba mollis está sendo formulada e receitada como fitoterápico, em
Londrina, como o nome de “Erva da memória” registrada no “Guia Homeopático da Farmácia
Q. curatun”, como benéfico principalmente em casos de falta de memória e estresse. A
inexistência de estudos sobre a espécie na literatura científica justifica o presente trabalho
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudo químico dos extratos das folhas e das raízes de Coccoloba mollis
complementados pela avaliação das atividades biológicas e toxicológicas.
2.2 Objetivos Específicos
Realizar a quimioprospecção farmacognóstica para determinar as principais classes
de metabólitos secundários presentes na Coccoloba mollis.
Isolar, purificar e realizar a determinação estrutural de constituintes químicos
presentes nas folhas e raízes da C. mollis.
Avaliar a toxicidade materna dos extratos etanólicos das folhas e raízes de C. mollis
utilizando camundongos Swiss.
Realizar a avaliação toxicológica, utilizando o bioensaio com o microcrustáceo
Artemia salina.
Avaliar a atividade antioxidante dos extratos etanólicos das folhas e raízes de C.
mollis empregando o método do radical estável DPPH.
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos das folhas e raízes de C.
mollis frente bactérias, leveduras e fungos filamentosos.
Avaliar a atividade alelopática dos extratos etanólicos das folhas e das raízes de C.
mollis usando sementes de Lactuca sativa.
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Considerações Sobre Produtos Naturais
Atualmente a biodiversidade recebe importância para o desenvolvimento e bem-estar
da humanidade e é a grande responsável pelo equilíbrio ambiental, mesmo tendo apenas uma
pequena parte já estudada e os seus benefícios futuros ainda não sejam totalmente conhecidos,
cada vez mais se tem valorizado a sua capacidade de gerar benefícios socioeconômicos em
virtude de seu potencial como matéria-prima para diferentes campos, entre eles a área de
fármacos para a medicina e diversos setores da indústria (FERRO et al., 2006).
As plantas adquiriram importância crucial na medicina popular, devido as suas
propriedades terapêuticas ou tóxicas e o uso de extratos vegetais no tratamento de algumas
doenças é um hábito amplamente difundido no Brasil, tal hábito pode ser explicado, ao menos
em parte, pela crença de que, devido ao caráter natural, não possuem efeitos colaterais
(MOTA et al., 2008).
O tratamento e a cura de enfermidades utilizando plantas é tão antigo quanto a
humanidade (MACIEL et al., 2002), sendo a ingestão de ervas e folhas, talvez, uma das
primeiras formas de utilização de Produtos Naturais (VIEGA Jr. et al., 2006). Evidências
indicam que homens de Neanderthal, que viveram há 60.000 anos, onde hoje é o Iraque,
utilizavam malva rosa (Alcea rosea L.) (COWAN, 1999), planta que até hoje é empregada em
etnomedicina para o combate a problemas no sistema respiratório e ciclo menstrual (PAPIEZ,
2004).
As primeiras descrições de plantas medicinais remontam às escrituras sagradas e ao
papiro de Ebers. Papiro este, descoberto e publicado por Georg Ebers, traduzido pela primeira
vez em 1890 por H. Joachim, encontrado nas proximidades da casa mortuária de Ramsés II,
porém pertence à época da XVIII dinastia. Esse papiro enumera aproximadamente 100
doenças e descreve um grande número de drogas de natureza animal e vegetal (PINTO et al.,
2002). O vasto conhecimento que os povos primitivos e os indígenas possuem sobre o arsenal
químico da natureza pode ser considerado fator fundamental para a descoberta de substâncias
tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo (VIEGA Jr. et al., 2006).
O desenvolvimento da Química Orgânica ocorreu paralelamente com o estudo de
plantas, principalmente a partir do século XIX, quand
o ocorreram os primeiros registros de
17
estudos de plantas com bases científicas. Destes estudos originaram-se algumas substâncias
que se consagraram como princípios ativos eficazes, e que ainda hoje, são utilizadas no
tratamento de certas doenças, tendo como exemplo: a morfina (potente analgésico), a quinina
(antimalárico), a cânfora (antitussígeno local, rubefaciente) e a cocaína (que serviu de modelo
para a introdução dos anestésicos locais). As estruturas destas moléculas estão representadas
na Figura 1 (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
H
O
N
H
O
H
O
H
morfin
a
N
H
N
O
H
H
O
H
quinin
a
O
canfor
a
O
N
OO
O
cocain
a
Figura 1: Estruturas de substâncias utilizadas como princípios ativos isolados de plantas
A natureza é responsável pela produção da maioria das substâncias orgânicas
conhecidas e o reino vegetal é responsável pela maior parcela da diversidade química
conhecida e registrada na literatura (VIEGA Jr. et al., 2006). Mesmo com o grande
desenvolvimento da Síntese Orgânica e de novos processos biotecnológicos, 25 % dos
medicamentos prescritos nos países industrializados são derivados do reino vegetal sendo que
120 constituintes de origem natural são obtidos a partir de 90 espécies de plantas. Os produtos
naturais estão envolvidos diretamente no desenvolvimento de 40 % de todos os novos
fármacos (HOSTETTAMANN et al., 2003).
A grande variedade e complexidade de metabólitos secundários, ou melhor,
definidos como metabólitos especiais segundo Gottlieb, biossintetizad
os pelas plantas teriam
18
se formado e evoluído, como mecanismos de defesa desses vegetais em resposta às condições
ambientais. No contexto evolutivo das plantas terrestres, estimativas atuais apontam para
500.000 espécies ocupando todo o planeta, sendo que as angiospermas constituem 50 % desse
total. No auge do processo evolutivo, as angiospermas alcançaram um desenvolvimento
ímpar, devido à ocorrência de micromoléculas distintas e complexas, com vários centros
estereogênicos, tais características constituem uma possível explicação às inúmeras
finalidades atribuídas a estas. (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
A mais importante fonte de novos fármacos tem sido os produtos naturais cujas
moléculas apresentam freqüentemente alta especificidade de ação biológica, e muitos
fármacos de sucesso foram originalmente sintetizados para mimetizar a ação de moléculas
encontradas na natureza (FEHER; SCHMIDT, 2003). A biossíntese de substâncias
enantioméricas puras é uma característica incrível das plantas considerando-se que a síntese
destas moléculas, em laboratório, é um desafio e exige técnicas e recursos humanos
especializados (MONTANARI; BOLZANI, 2001). Um ótimo exemplo da extraordinária
capacidade sintética da natureza e sua estereoespecificidade é a palitoxina (Figura 2) isolada
de corais do gênero Palythoa sp que apresenta 64 centros estereogênicos, esta substância
parece atuar inibindo a bomba de Na
+
/K
+
, e é uma das substâncias naturais mais ativas e
tóxicas conhecidas (VIEGA Jr. et al., 2006).
Figura 2: Estrutura da palitoxina.
19
Diversos exemplos de plantas medicinais da Biota brasileira podem ser citados,
porém, a maioria dos produtos fitoterápicos comercializados no Brasil é proveniente de outros
países. As plantas medicinais endêmicas são ainda pouco conhecidas e se constituem num
fascinante assunto de pesquisa acadêmica e de desenvolvimento (PINTO et al., 2002). A
Química Medicinal dedica-se, em uma visão moderna, a compreender as razões moleculares
da ação dos fármacos, da relação entre estrutura química e atividade farmacológica dos
mesmos, considerando fatores farmacodinâmicos e farmacocinéticos que se traduzem em
propriedades farmacoterapeuticamente úteis. Este conceito moderno da Química Medicinal
inclue, em muitas universidades americanas, na grade curricular o estudo dos fármacos em
conjunto com a farmacognosia. (VIEGA Jr. et al., 2006).
O panorama dos produtos naturais entra no processo de descoberta de novos
fármacos de diversas formas. Na forma mais direta, um produto natural pode possuir potência,
seletividade e qualidades farmacocinéticas para ser empregado como medicamento. Mais
comumente o produto natural funciona como um guia, proporcionando uma plataforma
estrutural na qual pode ser elaborada, ou simplificada para chegar a um fármaco.
Analogamente isso pode ser atingido modificando diretamente o produto natural, o que seria
considerado um “derivado de produto natural”. Outra alternativa, seria o produto natural
biologicamente ativo servir de inspiração para o químico, fornecendo idéias de formas
estruturais valiosas. Os produtos naturais vêm recuperando espaço e importância na indústria
farmacêutica, seja per-se, seja como fonte inspiradora de novos padrões moleculares bioativos
(VIEGA Jr. et al., 2006; WILSON; DANISHEFSKY, 2006).
Mais de uma centena de derivados de produtos naturais estão sendo avaliados em
testes clínicos, e no mínimo outra centena de projetos similares está em desenvolvimento pré-
clínico (Tabela 1). A maioria é derivada de substâncias oriundas de plantas e bactérias, sendo
que os projetos baseados em produtos naturais predominantemente buscam armas contra o
câncer ou como antiinfecciosas, mas não se pode ignorar a existência de pesquisas em outras
linhas (Tabela 2). No entanto, cresce o interesse na possibilidade de desenvolver produtos que
contenham uma mistura definida de substâncias extraídas de plantas utilizadas na medicina
tradicional. O FDA (Food and Drug Association) recentemente aprovou uma nova aplicação
de um fármaco ”new drug application” (NDA) baseada no extrato do chá verde (Camelia
sinensis) com o nome registrado “Veregen” para o tratamento tópico de verrugas genitais e
perianais (HARVEY, 2008; WU et al., 2008).
20
Tabela 1: Fármacos baseados em produtos naturais em diferentes estágios de
desenvolvimento (HARVEY, 2008)
Planta Bactéria Fungo Animail
Semi-
síntese
total
Pré-clinico 46 12 7 7 27 99
Fase I 14 5 0 3 8 30
Fase II 41 4 0 10 11 66
Fase III 5 4 0 4 13 26
Pré-registro 2 0 0 0 2 4
Total 108 25 7 24 61 225
Tabela 2: Categorias terapêuticas de fármacos derivados de produtos naturais nos diferentes
estágios de desenvolvimento (HARVEY, 2008)
Pré-
clinicos
Fase I Fase II Fase III
Pré-
registro
Total
Antineoplásicos 34 15 26 9 2 86
Antiinfecciosos 25 4 7 2 2 40
Neurofármacos 6 3 9 4 0 22
Fármacos
cardiovasculares/
gastrointestinais
9 0 5 6 0 20
Antiinflamatórios 6 2 9 2 0 18
Metabolismo 7 3 6 1 0 17
Dermatológicos 7 1 2 0 0 10
Hormonais 3 0 2 1 0 6
Imunossupressores 2 2 0 2 0 6
Total 99 30 66 26 4 225
O objetivo da Química de Produtos Naturais é esclarecer e registrar os constituintes
resultantes do metabolismo secundário, através do seu isolamento e elucidação de suas
estruturas moleculares (NIERO et al., 2003), as principais etapas do trabalho de isolamento e
identificação de princípios ativos de uma planta estão resumidas na Figura 3.
Considerando-se que as plantas podem conter milhares de constituintes, processos de
separação e isolamento podem ser longos e tediosos. O processo de isolar produtos naturais
geralmente combina várias técnicas de separação, que dependem da solubilidade, volatilidade
e estabilidade química dos componentes a serem separados, sendo a escolha das técnicas a
serem empregadas de grande importância (STICHER, 2008).
21
Figura 3: Da planta aos princípios ativos.
3.2 Metabólitos Secundários
Ao estudar as características químicas de uma planta, deve-se considerar a existência
de dois grupos distintos de metabólitos, os primários que são encontrados em todos os
sistemas vivos, essenciais ao crescimento e a vida, como os aminoácidos, monossacarídeos,
ácidos carboxílicos, lipídeos, etc.; e os secundários que são produtos metabolizados a partir de
metabólitos primários. E em geral, o termo “produto natural” é sinônimo de metabólito
secundário (NIERO et al., 2003)
Acreditava-se que os metabólitos secundários eram resultado de aberrações
acidentais do metabolismo ou formas ímpares de armazenamento de nutrientes, porém
inúmeros estudos apontam que as plantas desenvolveram intrincados mecanismos para
produzir e armazenar tais metabólitos, a maioria dos estudos aponta para mecanismos
enzimáticos elaborados, embora, as plantas utilizem poucas rotas biossintéticas para a
produção de um impressionante número de moléculas (Figura 4) (LEWINSOHN; GIJZEN,
2009). A definição original de metabólitos secundários advém da idéia de que não são
essenciais para a sobrevivência e reprodução da p
lanta, no entanto, o corrente conceito é que
22
numerosos metabólitos secundários produzidos por plantas superiores desempenham
importantes funções em interações bióticas e abióticas (IZHAKI, 2002).
GLICOS
E
polissacarídeos
glicosídio
s
ácido chiquimic
o
acetil-Co
A
antraquinonas
flavónóides
taninos condensado
s
ácido corísmico
ácido gálic
o
taninos hidrolisávei
s
triptofano
fenilanina
tirosin
a
alcalóides
indólicos e quinólinico
s
protoalcalóides
alcalóides
isoquinolínicos e
benzilisoquinolínicos
ácido cinâmic
o
fenilpropanoide
s
ligninas, lignanas
cumarinas
via
mavelonat
o
terpenóides
e esteróides
ciclo do
ácido cítrico
condensaçã
o
ácidos graxos
acetogenina
s
ornitina
lisin
a
alcalóides
pirrolidínicos,
tropânicos,
pirrolizidínicos
piperidínicos e
quinolizidínicos
Figura 4: Rotas biossintéticas resumidas dos metabólitos secundários (SOUZA, 2008)
Os metabólitos secundários são um grande, variado e, às vezes, misterioso grupo de
moléculas, sendo que
muitos desempenham importantes funções na defesa ou proteção na
23
planta e por isso podem ser considerados biologicamente ativos. Em virtude destas atividades
biológicas estas moléculas podem ser utilizadas no tratamento de doenças humanas e através
dos séculos as plantas têm sido usadas em medicina tradicional em todo o mundo (KOLEWE
et al., 2008)
O vasto número de metabólitos secundários é conseqüência de forças ecológicas
através dos tempos, por exemplo, a resposta defensiva das plantas a predadores, parasitas, e
doenças tem sido associada com a biossíntese e ao acúmulo de classes químicas específicas.
Desta forma, pequenas alterações na estrutura das moléculas podem acarretar mudanças
significativas em sua atividade biológica. Os metabólitos secundários também são associados
com competições interespecíficas e como promotores de reprodução produzindo substâncias
coloridas ou voláteis para atrair os polinizadores (WU; CHAPPELL, 2008, LEWINSOHN;
GIJZEN, 2009).
Os metabólitos secundários podem ser classificados segundo as suas características
químicas, a origem da planta ou origem biossintética. Segundo a classificação química os
constituintes são divididos em diversas classes, baseadas em determinadas características, por
exemplo, os alcalóides são caracterizados por um nitrogênio básico, outros grupos ou
subgrupos são caracterizados pela presença de determinados tipos de esqueletos básicos como
antracenos, cumarinas, quinonas, etc. A classificação segundo a origem da planta pode ser
exemplificada pelos alcalóides do ópio (morfina, hipnoanalgésico, Papaver somniferum) e
glicosídeos digitálicos (digoxina, cardiotônico, Digitalis purpurea). A classificação baseada
no origem biossintética tem como exemplo os terpenóides, fenilpropanóides e policetídeos.
Todos os terpenóides derivam da rota biossintética do isoprenóide (C
5
), os fenilpropanóides e
policetídeos, respectivamente são derivados da fenilanina/tirosina (C
9
) e acetato (C
2
) (NIERO
et al., 2003).
As concentrações relativas e totais dos metabólitos secundários nas plantas sofrem
variações temporais em diferentes níveis (sazonais e diárias; intraplanta, inter- e
intraespecífica), pois estes representam uma interface química entre as plantas e o ambiente,
desta forma a sua síntese é freqüentemente afetada pelas condições ambientais (GOBBO-
NETO; LOPES. 2007).
24
3.2.1 Ácidos Graxos e Derivados
Os ácidos graxos são os lipídios mais simples, caracterizados por uma região
hidrofílica conectada a um radical hidrofóbico. Alguns lipídios, incluindo os ácidos graxos,
são utilizados para armazenar energia, mas a maioria é encontrada na membrana lipo-protéica
das células. Embora os ácidos graxos sejam usados como blocos de construção dos lipídios
saponificados, apenas traços são encontrados livres nas células e tecidos, geralmente estão
presentes em diferentes formas, incluindo os ésteres de cadeia longa (ceras), os triglicérides
ou triglicerídios, como glicerofosfolipídios e esfingolipídios (membrana lipídica). Nas plantas
superiores a maioria dos ácidos graxos encontrados apresentam número par de carbonos entre
C
14
a C
22
sendo o acido oléico (C
18
) o mais comum (BRIELMANN et al., 2006).
A biossíntese de ácidos graxos envolve um conjunto de enzimas e é bem conhecida
nas plantas (Figura 5) (DEWICK, 2001).
25
SCo
A
O
SCo
A
O
C
O
2
H
S
O
CO
2
H
AC
P
S
O
En
z
S
O
AC
P
O
S
O
AC
P
O
H
H
R
R
R
S
O
AC
P
R
-H
2
O
S
O
AC
P
R
O
H
O
R
SCo
A
O
R
malonil-Coa
malonil-ACP
ACP
acetil-CoA
beta-ceto-acil-ACP
NADPH
NADPH
redução ad dupla ligação
H
2
O
HSCoA
a cada ciclo a cadeia
ganha dois carbonos
ácido graxo
Figura 5: Rota biossintética dos ácidos graxos (DEWICK, 2001).
3.2.1.1 Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa
Os hidrocarbonetos são os menos polares dos produtos naturais, eles formam um
grupo relativamente pequeno de moléculas, contendo apenas átomos de carbono e hidrogênio.
A ausência de heteroátomos nestes constituintes resulta em estruturas relativamente simples,
podendo conter cadeias lineares ou ramificadas assim como anéis. Eles são extremamente
insolúveis em água e geralmente de menor densidade que esta (BRIELMANN et al., 2006).
Nas plantas os hidrocarbonetos alifáticos geralmente possuem um número ímpar de átomos de
carbono, pois diversos estudos demonstram que eles resultam do alongamento seguido pela
descarboxilação de ácidos graxos. Hidrocarbonetos simples ra
mificados também raramente
26
ocorrem em quantidades significativas (BRIELMANN et al., 2006; KOLATTUKUDY et al.,
1974).
Os hidrocarbonetos saturados são universalmente distribuídos nos vegetais como
ceras cuticulares presentes nas folhas ou nos frutos (EGLINTON; HAMILTON, 1967).
Algumas plantas são ricas em hidrocarbonetos alifáticos que são usados como óleo vegetal,
como o óleo de oliva extraído dos frutos da oliveira (Olea europea) que contém
hidrocarbonetos de C
13
a C
28
(DELL’AGLI; BOSISIO, 2002).
Entre os metabólitos secundários, os alcanos de ceras epicuticular têm alcançado
importância como indicador de relações taxonômicas entre as plantas e a atenção tem sido
direcionada a estas substâncias para possibilitar o uso desta distribuição como uma maneira de
estabelecer sistemas taxonômicos baseados nas características químicas (SANTOS et al.,
2005)
3.2.1.2 Ésteres alifáticos de cadeia longa
A ocorrência natural de ésteres de cadeias curtas e longas tem sido documentada em
diversas espécies de plantas e animais (LASETER; WEETE, 1971) e eles são formados
através da condensação de alcoóis e ácidos e tendem a apresentar um odor característico,
geralmente agradável (BRIELMANN et al., 2006).
Os ésteres contem as ceras cuticulares das plantas que apresentam uma grande
variação entre as espécies, por exemplo, a cutícula de folhas e galhos de Arabidopsis contem
apenas 0,1 a 0,2% e 0,7 a 2,9% de ésteres respectivamente enquanto na Copernicia cerifera
representam 85% das cutículas das folhas. Estes ésteres funcionam como reserva energética
em sementes de Simmodsia chinesis onde constitui aproximadamente 97% do óleo das
sementes (LI et al., 2008)
Estudos indicam que teores de metil e etil ésteres de ácidos graxos são indicadores da
qualidade de azeitonas e óleo de oliva, onde níveis baixos destes ésteres indicam uma melhor
qualidade (BIEDERMANN et al., 2008).
27
3.2.2 Terpenos e Esteróides
Os terpenos e os esteróides são formados através da rota biossintética do mevalonato.
A polimerização do mevalonato vai originar moléculas de cadeias carbonadas crescentes de
cinco em cinco átomos de carbono (Figura 6) (SANTOS, 2001).
Os terpenos exercem funções ecológicas e fisiológicas nas plantas, muitos inibem o
crescimento de outras plantas, alguns apresentam atividade inseticida, outros atraem insetos
polinizadores, podemos citar, como exemplo, o ácido giberélico (Figura 7), um diterpeno, que
é um dos principais hormônios das plantas (BRIELMANN et al., 2006).
28
SCo
A
O
SCo
A
O
H
SCo
A
O O
H
SEn
z
O
acetil-CoA
EnzSH
H
O
2
C
SCo
A
O
H
O
EnzS
H
HO
2
C
SCo
A
O
H
O
H
HO
2
C
O
O
H
HO
2
C
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
OP
P
O
H
HO
P O
AD
P
O
O
H
O
O
H
OP
P
1
3
4
5
2
H
HH
OP
P
ácido mavelonico
NADPH
2 x ATP
NADPH
ATP
-co
2
reação de
Claise
n
C
5
OP
P
PP
O
OP
P
famesilpirofosfato (FPP)
geranilpirofosfato (GPP)
geranilgeranilpirofosfato (GGPP)
esqualeno
isopentenilpirofosfato
(IPP)
dimetilalipirofosfato
(DMAPP)
FPP
IPP
IPP
monoterpenos (10)
sesquiterpenos
(C15)
diterpenos (20)
triterpenos
pentacíclicos
(C30)
esteróides
(C27)
triterpenos
modificados
(C30)
Figura 6: Rota biossintética dos terpenóides e esteróides (DEWICK, 2001; SANTOS, 2001)
29
O
H
O
H
H
O
H
O
O
H
O
Figura 7: Ácido giberélico
Diversas propriedades têm sido atribuídas aos terpenos na prevenção e tratamento de
doenças, tais como: antineoplásicas, antimicrobianas, anti-parasítica, antivirais, antialérgicas,
antiespasmódicas, antiinflamatórias, anti-hiperglicêmicas, além de propriedades
imunomoduladoras (PADUCH et al., 2007).
No reino animal os esteróides possuem grande importância como hormônios,
coenzimas, e provitaminas, no entanto, no reino vegetal seu papel é menos conhecido.
Evidências mostram que alguns fitoesteróides são eficazes no tratamento de doenças
vasculares (KRIS-ETHERTON et al., 2002) e outros estudos indicam que o consumo de
fitoesteróides pode reduzir os níveis de colesterol (MARTINS, et al., 2004). Os fitoesteróides
são utilizados como matéria prima na indústria farmacêutica na produção de fármacos de
reposição de hormônios sexuais e anticoncepcionais.
Estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que uma dieta rica em
fitoesteróides pode oferecer uma proteção para os alguns tipos de câncer comuns na sociedade
ocidental, tais como câncer de cólon, de mama e de próstata (AWAD; FINK, 2000)
30
3.2.3 Antraquinonas
As antraquinonas são constituintes importantes de fungos filamentosos, líquens e
plantas superiores. Elas são componentes de inúmeros fitoterápicos e apresentam diversas
atividades biológicas ou farmacológicas ntas superiores
encontram-se as antraquinonas principalmente nas famílias Rubiaceae, Caesalpiniaceae,
Rhamnaceae, Polygonaceae, Liliaceae, Verbenaceae e Asphodelaceae (FALKENBERG,
2004).
A estrutura básica das antraquinonas é representada por um anel antracênico com
dois grupos cetônicos nas posições C-9 e C-10 (Figura 8). Nas Polygonaceae e Rhamnaceae
elas são formadas pela via acetato-malonato (Figura 9) já nas Bignoniaceae e Verbenaceae a
rota biossintética envolve o ácido chiquímico (Figura 10). Elas estão presentes,
principalmente unidas a moléculas de açúcares na forma de heterosídeos quando o açúcar é a
glicose são chamados de glicosídeos, mas comumente são encontradas na forma livre
(agliconas) (SANTOS, 2001; IZHAKI, 2002).
O
O
1
2
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
9a
10
10a
Figura 8: Estrutura básica das antraquinonas.
31
SEn
z
O
O O O
O O O O
OOO
O
C
O
2
H
OOO
H
O
CO
2
H
OOO
H
O
CO
2
H
O
HO
O
H
H
O
CO
2
H
O
O
HO
O
H
O
O
HO
O
H
O
O
H
O
HO
O
H
H
O
O
O
HO
O
H
Me
O
O
O
HO
O
H
O
O
H
O
HO
O
H
CO
2
H
O
NADPH
NADPH
reação aldol
-H
2
O
enolização
oxidação
-H
2
O
enolização
oxidação
-CO2
-H
2
O
enolização
2 x oxidação
-CO2
SAM
O - metilação
do fenol
descarboxilação
facilitada por
orto-hidroxila
-CO
2
oxidação de metila
para álcool
O
O
oxidação de álcool
para ácido carboxílico
reina
fisciona
emodina
aloe-emodina
crisofanol
islandicina
endocrocina
intermediário hipotético I
intermediário hipotético II
intermediário hipotético I
I
SCo
A
O
SCo
A
O
CO
2
H
7x
acetil-CoA
malonil-CoA
Figura 9: Rota biossintética das antraquinonas exclusivamente via acetato (DEWICK, 2001).
32
C
O
2
H
O
CO
2
H
O
H
HO
2
C
CO
2
H
O
CO
2
H
O
CO
2
H
O
H
TP
P
CO
2
H
O
CO
2
H
O
CO
2
H
CO
2
H
O
CO
2
H
CO
2
H
CO
2
H
O
H
O
H
H
O
CO
2
H
O
H
O
H
H
O
CO
2
H
O
H
CO
2
H
O
H
O
H
O
O
O
H
ácido chiquímico
ácido alpha-cetoglutárico
ácidon corísmico
ácido isocorísmico
ácido o-succinilbenzóico
ácido mevalónico
áccido 1,4-dihidróxi-2-naftóico
ácido 1,4-dihidróxi-3-prenil-2-naftóico
antraquinona
Figura 10: Rota biossintética das antraquinonas via acetato – chiquimato (SANTOS, 2001).
33
Entre as diversas atividades farmacológicas apresentadas pelas antraquinonas podem
ser citadas: antiviral, antibacteriana, antifúngica, antineoplásica, antiinflamatória, adstringente
laxativa e diurética. Elas também são empregadas na indústria como tinturas têxteis, corantes
A alizarina (Figura 11), obtida das raízes de Rubia tinctorum L. (Rubiaceae) foi um
dos primeiros materiais corantes utilizados pelo homem, já era conhecida e empregada no
antigo Egito, Pérsia e Índia, (FALKENBERG, 2004).
O
O
O
H
O
H
Figura 11: Estrutura da alizarina (1,2-dihidroxi-9,10-antracenediona)..
3.2.4 Flavonóides
Os flavonóides apresentam um esqueleto básico, formado por dois anéis aromáticos
ligados por uma ponte de três carbonos (Figura 12) (ZUANAZZI, 2001).
O
A
B
C
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6`
Figura 12: Estrutura básica dos flavonóides.
34
Os flavonóides podem ser divididos em oito classes: flavonóis, flavonas, flavononas,
catequinas, antocianidinas, isoflavonas, dihidroflavonóis e chalconas (Figura 13) (PELUSO,
2006).
O
O
O
O
O
H
O
O
O
O
O
H
O
O
chalconas
flavonas
flavonóis flavononas
antocianidinas
isoflavona
s
O
O
H
O
O
H
O
catequinas
dihidroflavonóis
Figura 13: Estrutura básica das diferentes classes de flavonóides.
Os flavonóides resultam de duas rotas biossintéticas distintas, a do ácido chiquímico
que origina a fenilalanina, precursor do ácido cinâmico responsável pelo anel B e a ponte de
três carbonos. A outra rota, a do acetato origina o outro anel aromático, anel A (Figura 14)
(SANTOS, 2001).
35
CoA
S
O
O
H
O
H
O
O
O
SCo
A
O
SCo
A
OO
O
O
O
H
SCo
A
O
O
H
O
O
O
H
O
O
H
O
H
H
O
O
H
O
O
H
H
O
O
H
O
O
H
O
O
H
H
O
O
O
H
O
H
O
naringenina
(flavonóide)
liquiritigenina
(flavonóide)
4-hidroxicinamoil-Co
A
3 x malonil-CoA
NADPH
reação de
Claisen
reação de
Claisen
Figura 14: Rota biossintética dos flavonóides (DEWICK, 2001).
Os flavonóides exercem efeitos benéficos no tratamento de diversas doenças,
incluindo o câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Muito destas atividades
têm sido atribuídas às propriedades antioxidantes dos flavonóides, a sua capacidade de auto-
oxidação e na possível influência nos processos redox intracelulares (WILLIAMS et al.,
2004). Estudos populacionais indicam que o consumo de flavonóides é inversamente
correlacionado com a mortalidade por doenças cardiovasculares, e numerosos flavonóides têm
apresentado efeitos benéficos no combate à arteriosclerose (PELUSO, 2006).
36
3.2.5 Taninos
Os taninos são oligômeros, ricos em grupamentos fenólicos capazes de se ligar ou
precipitar proteínas solúveis em água, são comuns em plantas vasculares, principalmente em
tecidos lenhosos, mas também podem ser encontrados em folhas, flores ou sementes. Esses
metabólitos conferem um sabor amargo forte aos tecidos onde são encontrados repelindo
predadores (BRIELMANN, 2006).
Os taninos podem ser classificados em hidrolisáveis e condensados, os taninos
condensados são formados biossinteticamente através da condensação de flavonóis formando
polímeros. Os taninos hidrolisáveis são ésteres de um açúcar (geralmente glicose) com uma
ou mais moléculas de ácido gálico, a Figura 15 apresenta um exemplo de tanino condensado
(proantocianidina) e hidrolisável (corilagina) (MELLO; SANTOS, 2001; BRIELMANN,
2006)
O
O
H
O
H
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
H
O
O
H
O
H
O
O
H
O
H
H
O
O
H
O
H
O
H
H
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
O
O
O
O
H
O
O
H
O
O
O
H
O
H
O
H
proantocianidina
corilagina
Figura 15: Exemplos de tanino condensado (proantocianidina) e hidrolisável (corilagina).
Diversas atividades biológicas têm sido atribuídas a esta classe de metabólitos dentre
as quais podem ser citadas: atividade antimicrobiana, antiviral, moluscicida e antitumoral.
Para explicar essas atividades empregam-se três características que podem ser atribuídas, em
menor ou maior grau, aos taninos: 1) complexação com íons metálicos; 2) atividade
37
antioxidante; 3) habilidade de se complexar com outras moléculas incluindo macromoléculas
tais como proteínas e polissacarídeos (MELLO; SANTOS, 2001)
O crescimento de muitos fungos, bactérias e vírus são inibidos por estes metabólitos
que apresentam atividade antimicrobiana bem documentada. Há indícios de que sua atividade
antimicrobiana está associada com a hidrólise de uma ligação éster entre o ácido gálico e os
polifenóis hidrolizados que ocorre, por exemplo, após o amadurecimento de diversas frutas, e
neste caso os taninos funcionam com uma defesa natural contra infecções microbianas e esta
propriedade pode ser empregada para ampliar a vida útil de determinados alimentos (SAMY;
GOPALAKRISHNAKONE, 2008).
Os taninos encontrados em
Vaccinium vitis-idaea L, apresentam grande atividade
antimicrobiana contra fungos e bactérias com potencial para ser empregados na periodontia
(HO et al., 2001). Os taninos condensados presentes na pastagem demonstram potencial no
controle de parasitas gastrointestinais em ruminantes (MIN; HART, 2003).
Os extratos aquosos e etanólicos de algumas plantas que apresentavam atividade
inibitória das enzimas topoisomerase I e II ao serem submetidos a um processo para
eliminação de taninos perderam tal atividade mostrando a ligação entre estes metabólitos e a
atividade atribuída aos extratos (WALL et al., 1996).
3.3 Considerações Sobre Elucidação Estrutural
O fantástico desenvolvimento de técnicas analíticas de separação e elucidação
estrutural, nos últimos 30 anos e mais recentemente de instrumentos analíticos hifenizados
possibilitou o conhecimento de inúmeros metabólitos secundários isolados de angiospermas,
dos quais muitos ainda sem qualquer avaliação com relação ao potencial farmacológico. Desta
forma, os produtos naturais foram e continuam sendo de importância determinante em
diferentes setores da sociedade moderna, mesmo considerando o grande número de produtos
de síntese (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
Na identificação de produtos naturais três técnicas são utilizadas habitualmente:
espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (
1
H) e de carbono
(
13
C); espectrometria de infravermelho (IV) e a espectrometria de massas (EM). O conjunto
de informações fornecido pelas diferentes técnicas proporciona a compreensão da estrutura da
molécula (ANDREI;
FACCIONE, 2003). A espectrometria de infravermelho fornece
38
informações relacionadas aos grupos funcionais presentes na molécula, a ressonância
magnética nuclear indica a disposição do esqueleto hidrocarbônico, enquanto a espectrometria
de massas permite determinar a fórmula, além de poder contribuir para a elucidação estrutural
devido ao padrão de fragmentação das diferentes funções orgânicas (RIBEIRO; SOUZA,
2007). A difração de Raios-X também é um método auxiliar valioso na elucidação estrutural,
porém a dificuldade de se obter mono cristais ideais dificulta sua utilização (GARCIA, 2007).
Caso as técnicas mencionadas anteriormente ainda mantenham alguma ambigüidade
na determinação estrutural, pode se recorrer a modificações químicas da molécula com
reagentes contendo grupos específicos ou a degradação da molécula desconhecida de uma
maneira previsível, até que uma molécula conhecida seja obtida ampliando a chance de
predizer a sua estrutura (NIERO et al., 2003).
3.4 Polygonaceae
A identificação da família Polygonaceae como um grupo natural ocorreu em 1789,
por Jussieu e esta família compreende, atualmente, aproximadamente 1200 espécies
distribuídas em 48 gêneros, incluindo desde pequenas ervas até árvores com mais de 20 m de
altura distribuídas em todo o mundo, porém a maioria das espécies está concentrada na região
temperada do hemisfério norte (SANCHEZ; KRON, 2008). No Brasil sete gêneros ocorrem
espontaneamente, sendo o gênero Coccoloba o mais representativo, com 45 espécies (MELO,
2000; MELO, 2004).
Algumas espécies apresentam toxidez, tais como as folhas de Polygonum hydropiper
L. que são tóxicas aos peixes
Heteropneustes fossilis
e
Ctenopharyngodon idella, e as folhas
de Polygonum hydropiperoides Michaux, conhecido popularmente como pimenta-do-brejo e
erva-de-bicho que possui suco acre e picante (SILVA-BRAMBILLA; MOSCHETA, 2001).
39
3.4.1 O Gênero Coccoloba
O gênero neotropical Coccoloba pertencente à família Polygonaceae compreende
cerca de 400 espécies distribuídas desde o México e sul dos Estados Unidos até o sul da
América do Sul, sendo que o Brasil apresenta 45 espécies, 23 das quais ocorrem na Amazônia
(MELO, 2004).
3.4.1.1 Coccoloba acrostichoides
O extrato etanólico e as frações de partes aéreas C. acrostichoides mostraram
atividade antibacteriana in vitro, e ação antifúngica, principalmente as frações n-hexano e
acetato de etila. O -sitosterol e a betulina (Figura 16) isolados a partir das partes da área da
planta também foram testados sendo que a betulina se mostrou ativa contra Fusarium
oxysporum (COTA et al., 2003).
M
e
C
H
2
M
e
M
e
H
O
M
e
M
e
H
H
H
O
H
M
e
betulin
a
H
O
H
H
H H
-sitostero
l
Figura 16: Estrutura da betulina e -sitosterol isolados da C. acrostichoides
40
3.4.1.2 Coccoloba dugandiana
Os triterpenos friedelina, taraxerona, lupeol, acetato de lupeol, ácido botulínico e
ácido ursólico (Figura 17) foram isolados em estudos com C. dugandiana além do esteróide
-sitosterol realizados por Dan e Dan (1986). O flavonóide miricetina-3-ramnosídeo (Figura
18) e o ácido gálico (Figura 19) foram identificados por Compagnone e colaboradores (1995).
M
e
M
e
O
M
e
M
e
M
e
M
e
M
e
M
e
HH H
friedelin
a
M
e
M
e
H
M
e
M
e
H
O
M
e
M
e H
C
O
2
H
M
e
ácido ursólic
o
O
H
M
e
M
e
M
e
CO
2
H
H
M
e
H H
M
e
H
2
C
H
M
e
ácido betulínic
o
M
e
M
e
M
e
O
M
e
M
e
M
e
M
e H
H
H
taraxeron
a
M
e
M
e
H
H
M
e
H
M
e
CH
2
H
O
M
e
M
e
M
eH
lupeo
l
M
e
M
e
H
H
M
e
H
M
e
CH
2
Ac
O
M
e
M
e
M
eH
acetato de lupeol
Figura 17: Triterpenos isolados de C. dugandiana
41
O
O
O
H
O
H
O
M
e
O
H
H
O
O
H
O
H
O
H
O
H
Figura 18: Estrutura da miricetina-3-ramnosídeo, flavonóide encontrado em C. dugandiana.
O
H
H
O
H
O
C
O
2
H
Figura 19: Estrutura do ácido gálico, presente na C. dugandiana.
3.4.1.3 Coccoloba excoriate
Estudos com as folhas e as cascas de C. excoriate permitiram o isolamento de
taraxerona, lupeol, acido betulínico, ácido ursolico e -sitosterol, e de friedelina apenas nas
folhas e acetato de lupeol nas cascas (DAN; DAN, 1986).
3.4.1.4 Coccoloba uvifera
Pesquisas com C. uvifera para o controle do nível de glicose no sangue em pacientes
diabéticos conduziram a obtenção de um produto que está protegido sob patente (BUCKLEY,
2001). Em outro estudo esta espécie mostrou atividade antioxidante e anti-tirosinase e o seu
extrato metanólico apresentou potencial fotoprotetor em melanócitos submetidos à radiação
ultravioleta (SILVEIRA et al., 2008).
42
O extrato metanólico das sementes de C. uvifera apresentou atividade frente a
Salmonella typhimurium e Staphylococcus aureus, enquanto a análise fitoquímica indicou a
presença de flavonóides, saponinas, polifenóis e taninos. A partição com acetato de etila do
extrato metanólico produziu um precipitado de cor marrom que inibiu o crescimento das
bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e dos fungos Candida albicans,
Fusarium oxysporum e F. decencellulare. Este sólido de cor marrom foi submetido a técnicas
de separação e purificação permitindo a obtenção de ácido gálico, ácido hexenodióico e
1,3,4,6,7,8-hexa-hidro-4,6,6,8,8,8-hexametilciclopenta-2-benzopirano (MORALES et al.,
2008).
Malathi e colaboradores (1995) relataram a presença das antraquinonas reina,
crisofanol, emodina e fisciona (Figura 20), do triterpeno -amirina (Figura 21) e do esteróide
-sitosterol em pesquisas com C. uvifera.
O
O
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H
O
H O
O
C
O
2
H
M
e
Me
O
M
e
H
O
reina
crisofanol
emodina
fisciona
M
e
Figura 20: Antraquinonas isoladas da C. uvifera.
43
M
e
M
e
H
H
M
e
M
e
M
e
H
M
e
M
e
H
O
M
e
Figura 21: Estrutura da -amirina isolada da C. uvifera.
3.4.2 Coccoloba mollis
A Coccoloba mollis Casaretto (Figura 22) é uma espécie vegetal popularmente pouco
conhecida, mas que vem sendo empregada como fitoterápico em Londrina-PR. Uma tintura
produzida a partir desta espécie (folhas, caules e raízes) a qual está registrada no “Guia
Homeopático da Farmácia Q. curatun” com o nome de “Erva da memória”, com as seguintes
atividades terapêuticas descritas neste formulário: “Rica em cálcio, ferro, fósforo e zinco. O
insumo desta planta em forma científica homeopática tem sido maravilhoso nos casos de
estresse, na insônia, nas anemias, e em quando há queda de visão. É um remédio para
estudantes nervosos. Esse insumo pode ser utilizado em impotência sexual”.
44
Coccoloba mollis. A - Ramo fértil; B – Ramo
com ócrea; C - Bráctea e ocréola; D1 - Flor
pistilada; D2 - Flor pistilada fechada (A-D Melo
et al. 2894, 3017); E - Flor andrógina (França et
al. 3316); F1 - Perianto frutífero em estágio
inicial; F2 – Perianto frutífero jovem; G -
Perianto frutífero imaturo (F
-
G Melo & França
2495); H - Pericarpo (Zaruch
3192)
A
B
C
A
D
Coccoloba mollis. A - Ramo fértil; B – Ramo
com ócrea; C - Bráctea e ocréola; D1 - Flor
pistilada; D2 - Flor pistilada fechada (A-D Melo
et al. 2894, 3017); E - Flor andrógina (França et
al. 3316); F1 - Perianto frutífero em estágio
inicial; F2 – Perianto frutífero jovem; G -
Perianto frutífero imaturo (F-G Melo & França
2495); H - Pericarpo (Zaruch 3192)
A
B C
A
D
Figura 22: Coccoloba mollis (B, C - LORENZI, 2002; D – MELO, 2004).
A C. mollis (sin. C. polystachya Weddel) , um arbusto ou árvore (4 – 16m de altura
por 10 cm de diâmetro), apresenta ampla distribuição geográfica ocorrendo na Costa Rica,
Panamá, Colômbia, Venezuela, Suriname, Guiana Francesa, Equador, Bolívia e Brasil. Ela é
conhecida popularmente no Mato Grosso por “novateiro”, “novato”, “pajau”, “pau-jau”; no
Mato Grosso do Sul, “taquari-de-cachimbo”; em Minas Gerais, “folha-larga”, “piscoteira” ou
“amora”; em Goiás, “capeiba”; no Rio de Janeiro, “caaussú-da-mata”, (MELO, 2004; MELO
e
FRANÇA, 2006). Ela apresenta ampla distribuíção no Brasil onde ocorre em cerradões e
mata semidecídua da bacia do Paraná (MORS et al., 2000; LORENZI, 2002).
A Pesquisa bibliográfica no Chemical Abstract indicava a ausência de literatura
científica sobre a espécie quando este trabalho foi iniciado. Recentemente foram
registrados
45
na literatura dois trabalhos científicos: a investigação fitoquímica das partes aéreas de C.
mollis apresentando o isolamento de dois fitoesteróides (sitosterol e sitostenona), um
diterpeno (trans-fitol), um triterpeno (simiarenol) e de um benzenóide (ácido vanílico) (Figura
23) (OLIVEIRA et al., 2008a). O estudo com diversos extratos vegetais, relata a atividade
larvicida da fração hexânica dos talos (LC
50
= 137,9µgmL
-1
), cascas (LC
50
= 128,3µgmL
-1
) e
folhas (LC
50
= 129,4µgmL
-1
) de C. mollis contra
Aedes aegypti
(OLIVEIRA et al., 2008b).
H
O
H H H
O
H
H
O
Me
O
O
H
O
H
H
O
simiarenol
ácido vanilico
sitostenona
trans-fito
l
Figura 23: Estrutura das substâncias já isoladas na Coccoloba mollis.
Em trabalhos de colaboração com o nosso grupo de pesquisa foram realizados
estudos com os extratos etanólicos de folhas e raízes da C. mollis, em um deles, Remondi e
colaboradores (2008), sugerem que os extratos de etanólicos de folhas e raízes de C. mollis
apresentam, em camundongos, dose letal oral 50% (DL
50
) superior a 2000 mg Kg
-1
e ausência
de efeitos farmacológicos no sistema nervoso central. Em outro estudo os extratos foram
avaliados quanto a um possível efeito mutagênico, citotóxico e indutor de apoptose em
sistemas-teste in vitro e in vivo. Para a avaliação in vitro foi utilizada a linhagem hepática de
Rattus novergicus (HTC) nos ensaios de citotoxicidade (MTT) e mutagenicidade (Cometa e
Micronúcleo com bloqueio de citocinese - MNCtB) e; as linhagens TA98 e TA100 de
Salmonella typhimurium no ensaio Salmonella
/microssoma.
In vivo
, a mutagenicidade foi
46
avaliada em sangue periférico de camundongos, também através dos ensaios do Cometa e
Micronúcleo. Os dados obtidos sugerem que apesar da baixa capacidade de indução de danos
ao DNA nas condições experimentais realizadas, os extratos da C. mollis, especialmente o
obtido das raízes, possuem alta toxicidade e capacidade de indução de apoptose. (TSUBOY,
2008).
3.5 Considerações sobre Avaliação Toxicológica
Os estudos toxicológicos constituem parte essencial no desenvolvimento de uma
fitoterapia médica e de um fitoterápico. Wu e colaboradores (2008), em artigo recente,
relatam e discutem as exigências e recomendações relacionadas aos estudos de vários tipos de
toxicidade não clínicas como suporte aos ensaios de triagens clínicas para uma nova aplicação
de um fármaco. Estes tópicos incluem perspectivas em farmacologia/toxicologia não clínicas,
em nomenclatura de fitoterápicos, sua identificação, experiência humana prévia, proposta de
triagem clínica inicial, aspectos regulatórios de estudos de toxicidade crônica e de toxicidade
aguda, estudos de mutagenicidade, estudos de toxicidade reprodutiva e estudos de
carcinogenicidade em fitoterápicos.
3.5.1 Testes de Toxicidade Reprodutiva.
Durante a gestação, a utilização de qualquer medicamento deve ser feita com
cuidado, já que algumas substâncias tóxicas podem atravessar a barreira placentária e
interferir no desenvolvimento embriofetal, muitas vezes de forma negativa. Esse mesmo
cuidado deve ser aplicado ao uso de plantas medicinais, principalmente devido à escassez de
informações sobre as mesmas.
A toxicologia reprodutiva é o estudo da ocorrência, causas, manifestação e seqüelas
de efeitos adversos de agentes exógenos durante o processo reprodutivo (ECOBICHON,
2001). Qualquer alteração morfológica ou funcional causada por elementos químicos ou
físicos que interferem com crescimento, homeostasia, desenvolvimento, diferenciação e/ou
comportamento do feto é considerada toxicidade do desenvolvimento (BRANCH, 2004).
47
Para avaliar a possível teratogenicidade de um agente (fármaco / produto químico /
físico ou agente infeccioso) três princípios devem ser analisados: o genótipo do embrião, os
períodos críticos no desenvolvimento e a dosagem de uma droga, fármaco ou produto químico
ou físico (MOORE; PERSAUD, 2008).
A agência Food and Drug Administraction (FDA), com base nos dados obtidos em
pesquisas com animais e dados epidemiológicos, classificou os agentes químicos segundo sua
ação tóxica pré natal e sobre a reprodução (Tabela 3) (FISHER et al., 2008).
Tabela 3: Classificação das substâncias químicas de acordo com o seu potencial teratogênico,
segundo o FDA
Categoria Descrição
A
Estudos controlados demonstram não haver risco. Estudos adequados, bem
controlados, em mulheres grávidas não mostraram risco para o feto.
B
Sem evidência de risco humano. Estudos em animais mostram risco, mas
estudos em humanos não o mostram, ou, se não há estudos adequados em
humanos, os estudos animais são negativos.
C
O risco não pode ser afastado. Faltam estudos em humanos, e os estudos
em animais ou são positivos para o risco fetal ou igualmente faltam.
Entretanto, os benefícios potenciais podem justificar o possível risco.
D
Evidência positiva de risco. Dados de investigação preliminar ou pós
comercialização mostram risco para o feto. Entretanto, os benefícios
potenciais podem ser maiores que o risco potencial.
X
Contra-indicada na gravidez. Estudos em animais ou humanos, ou relatos
de investigação preliminar ou pós-comercialização, mostram risco fetal
que claramente se sobrepõe a qualquer possível benefício para a paciente.
Os roedores e os coelhos contribuem com os dados sobre a toxicidade reprodutiva
devido a estas espécies serem relativamente padronizadas: pequenos, alta fertilidade (ninhadas
grandes), além de fornecerem número adequado de progênie para as análises estatísticas dos
resultados. Os efeitos adversos observados em estudos com animais são indicati
vos de
48
potencial risco para humanos. Mas é óbvio que a ocorrência de um efeito adverso específico
em animais não significa que o mesmo efeito será observado em outra espécie, inclusive na
humana, embora a concordância de um efeito específico em um alvo especifico em múltiplas
espécies não é necessariamente obrigatória (COSTA, et al., 2005, ECOBICHON, 2001).
A crença de que produtos naturais não produzem efeitos colaterais transforma as
gestantes e lactantes em um grupo populacional de risco e que culturalmente recorre ao uso de
plantas medicinais, no entanto, as informações sobre a segurança de utilização destes produtos
durante a gravidez são escassas (CLARKE et al., 2007).
3.5.2
Toxicidade sobre
Artemia salina Leach
A avaliação de toxicidade geral é considerada fundamental no estudo de substâncias
com propriedades biológicas (MAHLE, 2008). O organismos simples têm sido utilizados para
um rápido e relativamente simples monitoramento da resposta biológica, onde existe apenas
um parâmetro envolvido: morte ou vida (CAVALCANTE et al., 2000).
O microcrustáceo Artemia salina L (Artemiidae), um invertebrado que compõe a
fauna de ecosistemas de água salgada, pode ser empregado em bioensaios laboratoriais para
determinar a toxicidade. Este método, que determina a concentração letal de 50% (LC
50
) de
substâncias ativas e extratos de plantas em meio salino em µg mL
-1
, tem sido usado em
pesquisas com plantas medicinais em diferentes países para avaliar a toxicidade (KANWAR,
2007).
O ensaio com microcrustáceos é um método seguro, econômico e prático para
determinar a bioatividade de substâncias sintéticas ou naturais (SILVA et al., 2007). Os
primeiros trabalhos empregando Artemia salina datam de 1956 e desde então inúmeras
pesquisas têm empregado esta metodologia para diversos fins, tais como, detectar toxicidade
preliminar de algas marinhas, triagem de toxinas fúngicas, avaliar efeitos de exposição a
metais pesados e pesticidas, testes de toxicidade em materiais dentários, toxicidade de
extratos de plantas (CAVALCANTE et al., 2000; CARBALLO et al., 2002; LHULLER et al.,
2006).
49
3.6 Avaliação da Atividade Antioxidante
O metabolismo oxidativo é essencial à sobrevivência das células, porém apresenta
um efeito colateral, a produção de radicais livres e outras “espécies reativas de oxigênio =
EROs” (ROS, reactive oxygen species). Existem evidências do envolvimento destas espécies
no sistema regulatório normal in vivo. Além disso, os ROS aparentemente estão envolvidos
com sistemas de sinalização celular. Porém, quando um excesso de radicais livres é formado,
eles podem acarretar efeitos destrutivos ou até letais à célula (ex. apoptose). A oxidação
também afeta alimentos, onde é uma das maiores causas de desperdício, acredita-se que
metade das lavouras de frutas e vegetais mundiais são perdidas devido à deterioração
(ANTOLOVICH, et al., 2002).
Os antioxidantes naturais protegem o corpo humano de radicais livres, prevenindo o
estresse oxidativo que está associado a diversas doenças. Evidências epidemiológicas indicam
que o consumo de alimentos contendo antioxidantes naturais é vantajoso para a saúde
(AMAROWICZ, et al., 2004).
Os carotenóides, flavonóides, e outros derivados fenólicos, tais como ácidos
fenólicos, taninos, lignanas e ligninas são comumente encontrados nos diferentes órgãos
vegetais. A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas
propriedades redutoras e a estrutura química. Estas características desempenham um papel
importante na neutralização ou seqüestro de radicais livres e quelação de metais de transição,
agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. Os
intermediários formados pela ação de antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis,
devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias
(AMAROWICZ, et al., 2004
;
LÓPEZ, et al., 2007). Um antioxidante por definição é uma
substância que retarda ou previne a oxidação de um substrato oxidável quando presente em
baixa concentração em relação a este substrato. O termo “substrato oxidável” inclui
praticamente tudo que pode ser encontrado em um tecido vivo, principalmente proteínas,
lipídios, carboidratos e DNA (DAN, 2008).
Uma das técnicas para a determinação da atividade antioxidante utiliza o DPPH (2,2-
difenil-1-picril-hidrazil), método amplamente difundido e relativamente rápido. Esta técnica é
baseada na capacidade do radical livre estável a temperatura ambiente reagir com substâncias
doadoras de hidrogênio incluindo derivados fenólicos (SANCHEZ-MORENO, et al.,1998;
50
ROGINSKY; LISSI, 2005). O consumo do DPPH é caracterizado pela alteração da cor roxa
para amarelo indicando a formação da molécula estável DPPH-H (Figura 24).
N
O
2
N
N
NO
2
O
2
N
NO
2
N
H
N
NO
2
O
2
N
R
H
DPPH-H
DPPH
molécula
doadora
radical livre
forma reduzida
Figura 24: Representação da reação entre o DPPH e a molécula doadora de hidrogênios,
formando a molécula estável reduzida DPPH-H
O 2,6-di-t-butil-4-methil-fenol ou butil hidroxi tolueno (BHT) é um antioxidante
sintético usado, principalmente, como aditivo para alimentos, mas também é usado em
cosméticos, fármacos, combustíveis para jatos, borrachas e derivados de petróleo (TURNER;
KORKMAZ, 2007). O BHT diminui a taxa de auto-oxidação de alimentos e previne
alterações na coloração, odor e sabor dos alimentos reagindo com os radicais livre, podendo
ser adicionado diretamente aos alimentos ou às embalagens. Fujisawa e colaboradores (2004)
sugerem que o BHT é eficiente para quebrar a cadeia oxidativa.
A busca de antioxidantes naturais para a indústria alimentícia e farmacêutica
aumentou consideravelmente a partir dos anos 80 devido ao potencial de carcinogênese e
diversos outros males atribuídos aos antioxidantes sintéticos (DEGÁSPARI et al., 2004;
LÓPEZ, et al., 2007), entre os quais se encontra o BHT (FUJISAWA et al., 2004) embora esta
substância apresente alguns estudos contraditórios como Slaga (1995) que atribui a inibição
da indução de câncer por alguns agentes carcinogênicos ao BHT.
51
3.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
As substâncias antimicrobianas têm se tornado menos efetivas contra muitos agentes
infecciosos e a incidência de infecções oportunistas continua crescendo rapidamente devido
ao aumento do número de pacientes imunodeficientes e isto tem criado a necessidade de
procurar novas terapias mais eficazes contra estes patógenos. Desta forma, a pesquisa com
extratos de plantas representa um ponto de partida para a descoberta de novos fármacos com
atividade antimicrobiana (SETZER; VOGLER, 2006).
A resistência bacteriana certamente não representa um fato novo. Desde a introdução
da benzilpenicilina em 1943 observa-se que as bactérias desenvolverão resistência a qualquer
virtual antibiótico introduzido na prática clínica.
Apesar do surgimento de vacinas e agentes antimicrobianos eficazes na medicina
humana, a múltipla resistência bacteriana aos antibióticos é um problema mundial. O
surgimento de Haemophilus, Klebsiella, Escherichia coli e muitos outros produtores de -
lactamase tornaram-se um dos maiores problemas na terapêutica. As cepas de Staphylococcus
aureus meticilina-resistentes (SAMR) estão largamente distribuídas em hospitais.
Infelizmente a classe dos antibióticos -lactâmicos de uso corrente são ineficazes para o
tratamento das infecções do tipo SAMR.
Em virtude do seu mecanismo de ação diferenciado na parede celular, a vancomicina
um preeminente glicopeptídio tornou-se o antibiótico de “último recurso” contra as bactérias
Gram-positivas resistentes. O Enterococcus spp tornou-se problemático em conseqüência de
sua resistência freqüente a vancomicina originando a sigla VRE (vancomicina resistente
Enterococcus). Os Enterococci e Enterobacter spp vancomicina-resistentes, resistem a
maioria dos antibacterianos conhecidos incluindo as quinolonas, macrólidos e inibidores da
parede celular. (FERREIRA, et al 2004, PEREZ et al., 2008 ).
No mundo mais de 25% das mortes que estão diretamente relacionadas a doenças
infecciosas, e muito desta mortalidade é devido a infecções por organismos resistentes e,
obviamente, existe uma urgência na descoberta de novos agentes anti-infecciosos com novos
mecanismos de ação e perfil de ação ampliado. No entanto, nas últimas três décadas apenas
duas novas classes de antibióticos foram introduzidas, representadas pelo produto natural
daptomicina (ciclopeptídio) e o linezolida oxazolidinona (KOEHN, 2008).
Na agricultura a procura por novos agentes antimicrobianos é intensa devido à
crescente resistência dos microorganismos fitopatogênic
os frente aos produtos sintéticos
52
utilizados e outra preocupação é o impacto ambiental do uso de pesticidas a longo prazo.
Frente a este problema, uma estratégia atual da agricultura vem sendo buscar métodos
alternativos para o controle de doenças e pestes, que visem causar menos danos ao ambiente e
à saúde humana (AMARAL et al., 2005). Devido à grande diversidade de constituintes
presentes nas plantas elas se tornam fontes potenciais de substâncias que possam ser utilizadas
como defensivos agrícolas contra os fitopatógenos (RODRIGUES et al., 2006).
A busca de produtos naturais que sejam eficazes no controle de doenças de plantas
tem crescido nos últimos anos visando alternativas aos fungicidas sintéticos e que não
apresentem efeitos negativos à saúde humana e ao meio ambiente. Estudos têm demonstrado a
eficiência de alguns óleos e extratos de algumas espécies vegetais no controle de doenças de
plantas, seja pela ação fungitóxica direta ou pelo aumento da resistência frente as doenças da
cultura tratada (CARNEIRO et al., 2007).
As bactérias do gênero
Bacillus apresentam grande importância econômica sendo
empregadas em diversos processos industriais, e o Bacillus subtilis é empregado na
identificação e validação de novos agentes antibacterianos, onde é empregado para identificar
mecanismos e potencias alvos para novos fármacos (ZEIGLER; PERKINS, 2008).
A bactéria Pseudomonas aeruginosa é um patógeno nosocomial freqüente,
responsável por infecções em diversas partes do corpo humano, principalmente em pacientes
imunocomprometidos. Ela esta amplamente distribuída no ambiente e é capaz de persistir por
longos períodos em ambientes adversos desenvolvendo resistência aos agentes
antimicrobianos (FUENTEFRIA et al., 2008).
O principal agente etiológico de infecções do trato urinário, uma das infecções mais
comuns, é a bactéria Escherichia coli, responsável por 65%-90% dos casos (GUIDONI et al.,
2008), e estudos indicam alta taxa de resistência desse microrganismo a
amoxacilina/ampicilina, sulfametoxazol-trimetoprima e cefalotina (KOCH et al., 2008).
A intoxicação estafilocócica é a causa mais freqüente de surtos de doenças
microbianas transmitidas por alimentos em diversos países. Sendo a espécie Staphylococcus
aureus a mais freqüentemente associada a casos e surtos de intoxicação alimentar, devido a
sua habilidade de produzir vários tipos de enterotoxinas (BORGES et al., 2008).
Na microbiota normal da boca a Candida albicans é o comensal evidenciado com
maior freqüência atingindo até 70% do total de isolamentos apresentando um papel relevante
no desencadeamento de infecções bucais, porém espécies consideradas patogênicas como
C.
kefir, C. krusei, C. tropicalis, C. stelatoidea, entre outras têm sido detectadas em casos de
candidose bucal, principalmente naqueles relacionados à
imunossupressão (ALVES et al.,
53
2006). Espécies de Candida são encontradas no tubo gastrointestinal em 20 a 80 % da
população adulta saudável. Estes microorganismos comensais tornam-se patogênicos caso
ocorram alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro ou se ocorre o comprometimento
de barreiras anatômicas em função de queimaduras ou de procedimentos médicos invasivos.
As alterações dos mecanismos de defesa do hospedeiro podem ser decorrentes de mudanças
fisiológicas características da infância (prematuridade) e envelhecimento ou mais
freqüentemente, associadas a doenças degenerativas, neoplásicas, imunodeficiências
congênitas ou adquiridas e imunodepressão induzida por atos médicos (COLOMBO
;
GUIMARÃES, 2003).
Os fungos patogênicos do gênero Botryosphaeria causam prejuízos a uma
diversidade de hospedeiros incluindo várias culturas economicamente importantes tais como
maçãs, mangas, uvas e eucalipto embora, eles estejam presentes como endofíticos em plantas
saudáveis (BURGESS et al., 2005; TAYLOR et al., 2005). Algumas espécies apresentam os
primeiros registros como fungos patogênicos entre eles o B ribis está sendo associado a
manchas nas folhas de Magnolia aff. Candollei (MACEDO; BARRETO, 2008), e
Botryosphaeria rhodina associado a manchas brancas em Pistacia vera L. (MICHAILIDES et
al., 2002).
O Lasiodiplodia theobromae é um fungo cosmopolita, polífago e oportunista vem se
constituindo em um sério problema para os agricultores brasileiros. Ele apresenta uma gama
de mais de 500 hospedeiros já catalogados em regiões tropicais e temperadas incluindo
diversas plantas com interesse econômico entre as quais destacam-se as mangueiras,
coqueiros e cajueiros, podendo causar diferentes sintomas nas plantas infectadas, incluindo
seca-descendente (die-back), cancro em ramos, caules e raízes, lesões em estacas, folhas,
frutos e sementes, além de incitar a morte de mudas e enxertos. A sua capacidade de infectar
frutos coloca-o dentre os patógenos de maior poder de causar problemas de pós-colheita
disseminados por meio de sementes. Em virtude da grande variedade de hospedeiros
apresentada pelo o L. theobromae o controle químico por si só não oferece proteção nem
controle efetivo das culturas sendo então indispensável à adoção de medidas adicionais como
o controle biológico e manejo de culturas (FREIRE et al., 2004, PEREIRA et al., 2006).
54
3.8 Avaliação do Potencial Alelopático
Alelopatia, como relata Chon e colaboradores (2005), foi definida por Molish em
1937 como a interação química entre as plantas, incluindo influências inibitórias e
estimulantes. A alelopatia desempenha um papel importante tanto em ecosistemas naturais
quanto agrícolas. A maioria das plantas apresenta efeitos alelopáticos na germinação,
crescimento e desenvolvimento de outras plantas liberando substâncias no solo. Os
aleloquímicos, como são chamados os compostos alelopáticos, estão presentes em
praticamente todas as plantas e nos seus tecidos, tais como folhas, galhos, raízes, flores,
sementes, etc. (MUTLU; ATICI, 2008).
Os compostos alelopáticos identificados pertencem a várias classes químicas como
terpenos, alcalóides, compostos fenólicos, esteróides, ácidos graxos de cadeia longa e lactonas
insaturadas. Estes constituintes apresentam ações como herbicidas naturais, sem apresentar os
efeitos prejudiciais dos herbicidas sintéticos (DIAS et al., 2005).
Para a escolha de uma planta teste para atividade alelopática, a espécie deve
apresentar germinação rápida e uniforme, e um grau de sensibilidade que permita expressar os
resultados sob baixas concentrações de aleloquímicos. A resistência a metabólitos secundários
é uma característica espécie-específica, existindo aquelas plantas mais sensíveis como a alface
(Lactuca sativa L.), o tomate (Lycopersicon esculentum Miller) e o pepino (Cucumis sativus
L.), que são espécies consideradas indicadoras de atividade alelopática (ALVES et al., 2004).
No âmbito da ecologia, o fenômeno da alelopatia pode explicar os mecanismos da
sucessão vegetal, onde espécies invasoras podem excluir espécies nativas a partir de
aleloquímicos (HIERRO; CALLAWAY, 2003). Logo, a presença dessas espécies numa área
de plantio pode apresentar significativa influência no desenvolvimento de culturas (BATISH
et al., 2001; SINGH et al., 2001).
Os aleloquímicos se mantêm nos tecidos das plantas mesmo depois de mortas, de
onde são liberadas por volatilização ou lixiviação, sendo arrastadas para o solo, onde, ao
atingirem a concentração necessária, podem influenciar o desenvolvimento das plantas que
nele se encontram desta forma o efeito alelopático pode se pronunciar, tanto durante o ciclo
de cultivo, quanto nos cultivos subseqüentes (TEIXEIRA et al., 2004). A vegetação de uma
área pode ter um modelo de sucessão condicionado às plantas pré-existentes e desta forma, no
manejo agrícola, florestal e na horticultura, a ocupação prévia da área pode ter significativa
influência sobre os cultivos que estão sendo implantados (FERREIRA; AQUILA, 2000).
55
A atividade alelopática envolve fatores bióticos (densidade vegetal, estágios de
crescimento e microrganismos) e fatores abióticos (disponibilidade de água, temperatura e
incidência de raios UV), dentre outros. Tais fatores podem afetar a liberação, a
disponibilidade, a composição química e o modo de ação das substâncias alelopáticas
(INDERJIT, 1996).
56
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material Vegetal
As folhas e as raízes de Coccoloba mollis foram coletadas em Natingui e Briolândia,
distritos de Ortigueira-Paraná e no campus da Universidade Estadual de Londrina. O material
foi desidratado à sombra e moído. A identificação botânica da espécie vegetal foi realizada
pela professora Dra. Ana Odete Santos Vieira e uma exsicata foi depositada no Herbário da
Universidade Estadual de Londrina – Paraná (BARROS, I. B de 001).
4.2 Quimioprospecção
Realizou-se a identificação dos principais grupos químicos presentes na espécie
Coccoloba mollis. As partes dos materiais vegetais selecionadas para execução das técnicas
neste trabalho foram as folhas e as raízes da C. mollis. Todos os testes realizados foram
conduzidos em duplicatas e seguindo metodologias descritas na Farmacopéia Brasileira (1977
e 1997) com pequenas modificações.
4.2.1 Pesquisa de Heterosídeos Fenólicos Simples
Aproximadamente 1g da droga vegetal foi acondicionada em uma câmara de
microssublimação, e na seqüência foram adicionadas seis gotas de ácido clorídrico 6 N. Em
seguida a câmara foi coberta com uma lâmina de vidro (1). A câmara de microssublimação foi
submetida à ação de uma chapa quente (100
ºC). A sublimação ocorre entre os primeiros dez
minutos. A primeira lâmina (1) foi descartada e substituída por duas outras lâminas (2 e 3)
devidamente identificadas. O descarte é necessário, pois a primeira lâmina apresenta alto teor
de água, o que interferiria nas reações subseqüentes. Ao sublimado formado na lâmina (2)
foram adicionadas três gotas de AgNO
3
(1
% em amônia). A formação de precipitado preto
57
indica reação positiva. Ao sublimado presente na lâmina (3) foram adicionadas três gotas de
FeCl
3
(1 % em água). O desenvolvimento de coloração verde representa uma reação positiva.
A presença de heterosídeos fenólicos simples na amostra só é confirmada quando as duas
reações, com AgNO
3
e FeCl
3
, apresentarem resultados positivos.
4.2.2 Pesquisa de Flavonóides
Uma solução a 10 % da droga vegetal foi preparada, (etanol a 75 % v/v), seguida de
filtração com algodão em um balão volumétrico de 100 mL, completando o volume com
álcool etílico. 2 mL da solução a 10 % foi transferida para uma cápsula de porcelana e
submetida a banho-maria (45 ºC) até secura. O resíduo obtido na cápsula foi submetido a
tratamento com 0,2 mL de clorofórmio, para eliminação da clorofila. A cápsula foi retirada do
banho-maria, o resíduo obtido foi redissolvido com 1 mL de álcool etílico a 70 % v/v e
transferido para um tubo de ensaio. Ao tubo de ensaio foram adicionados 200 mg de
magnésio metálico em pó e 1 mL de ácido clorídrico concentrado, cuidadosamente pelas
paredes do tubo. O desenvolvimento de coloração róseo-avermelhada representa resultado
positivo.
4.2.3 Pesquisa de Cumarinas
Em câmara de microssublimação, foi adicionado 1 g da droga vegetal, aquecida em
chapa quente (100 ºC, 10 min.). O sublimado formado na lâmina superior foi dissolvido com
0,5 mL de metanol. Em uma folha de papel filtro foram adicionadas cinco gotas do material
dissolvido, de modo a obter uma mancha de aproximadamente um centímetro de diâmetro.
Duas gotas de solução de KOH (10 % em etanol) foram adicionadas sobre a mancha e
mantida a temperatura ambiente até secar. As manchas foram expostas a radiações
ultravioletas (lâmpada UV com nm). Quando a mancha apresenta uma
fluorescência verde ou azul, já aparente após o primeiro minuto o resultado é considerado
positivo.
58
4.2.4 Pesquisa de Taninos
Uma solução a 5 % da droga vegetal foi preparada (5 g da droga foram adicionadas a
100 mL de água destilada e aquecida até fervura). A solução obtida foi filtrada a quente e
mantida em temperatura ambiente até resfriamento. A solução foi dividida em quatro tubos de
ensaio devidamente identificados. No primeiro tubo de ensaio foram adicionados 2 mL da
solução 5 % da droga vegetal duas gotas de ácido clorídrico 6 N e seis gotas de solução de
gelatina (2,5 % em água). A formação de precipitado é evidência de presença de taninos. No
segundo tubo de ensaio 2 mL da solução 5 % foram acondicionados com 10 mL de água
destilada e quatro gotas de solução de FeCl
3
(1 % em metanol). O desenvolvimento de
coloração azul ou verde caracteriza reação positiva para taninos hidrolisáveis ou condensados,
respectivamente. No terceiro tubo de ensaio foram adicionados 10 mL de solução de ácido
acético (10 % em água), 5 mL de solução de acetato de chumbo (10 % em água) e 5 mL da
solução 5 %. A formação de precipitado esbranquiçado é considerada como reação positiva
para taninos hidrolisáveis. O último tubo de ensaio foi identificado como o branco, com
adição apenas de 5 mL da solução 5 % da droga vegetal. A amostra é considerada como
positiva para taninos, desde que no mínimo duas das três reações acima sejam positivas.
4.2.5 Pesquisa de Antraquinonas
A técnica divide-se em duas fases. Na primeira, 2 g da droga vegetal com 4 mL de
éter etílico, ou o suficiente para cobrir o pó da droga vegetal, foram adicionadas em um tubo
de ensaio com agitação por dois minutos. A solução formada foi filtrada com algodão e
adicionada em outro tubo de ensaio. Ao novo tubo de ensaio foi adicionado 1 mL de solução
de NaOH (10 % em água). Está reação, conhecida como reação de Bornträger direta, o
desenvolvimento de coloração rósea-avermelhada indica resultado positivo. A segunda fase
compreende a Reação de Bornträger indireta com hidrólise, 2 g da droga vegetal foram
adicionados em um béquer juntamente com 20 mL de álcool etílico 25 % v/v aquecidos até
fervura. A solução obtida foi filtrada a quente em algodão e acondicionada juntamente com 30
mL de ácido sulfúrico (5 % em água) em um funil de separação, que em seguida foi agitado e
mantido em temperatura ambiente até resfriamento. Após resfriamento, 20 mL de hexano
59
foram adicionados ao funil de separação que cuidadosamente, foi agitado e mantido em
repouso até separação das fases. A fase orgânica foi recolhida e 5 mL da mesma foram
transferidos para um tubo de ensaio. Ao tubo de ensaio foram adicionados 3 mL de NH
4
OH
(10 % em água). O desenvolvimento de coloração rósea-avermelhada na camada amoniacal é
considerado reação positiva.
4.2.6 Pesquisa de Saponinas
Em um béquer foram adicionados 5 g da droga vegetal juntamente com 25 mL de
água destilada submetidos à fervura por três minutos. O decoto obtido foi filtrado e
transferido, em torno de 10 mL, para um tubo de ensaio com agitação enérgica no sentido
vertical por 15 min. A presença de espuma persistente, igual ou maior a um centímetro, é
considerada reação positiva.
4.2.7 Pesquisa de Glicosídeos Cardiotônicos
Foram adicionados 5 g da droga vegetal em um sachê feito de papel de filtro seguida
da adição de 30 mL de álcool etílico 50 % v/v ou quantidade suficiente para cobrir o sachê,
aquecidos sob refluxo até ferver. A solução obtida, foi filtrada a quente por meio de algodão e
adicionada com 30 mL de acetato de chumbo (10 % em água). A mistura permaneceu em
temperatura ambiente até resfriamento e seguida de nova filtração. Ao filtrado foram
adicionados 20 mL de água destilada e particionado em um funil de separação com três
porções de 10 mL de clorofórmio. Após repouso a fase orgânica foi coletada, filtrada e
dividida em volumes iguais para três cápsulas de porcelana devidamente identificadas. As
cápsulas de porcelana foram aquecidas em chapa quente (100 ºC) até obtenção de resíduo
seco. Na primeira cápsula foi adicionado 1 mL de anidrido acético, transferido para tubo de
ensaio, e em seguida adicionado, cuidadosamente pelas paredes do tubo, 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado, sem agitar. Essa reação, conhecida como reação de Liebermann-
Burchard, é considerada positiva através do desenvolvimento de coloração azul ou verde,
vermelha-rósea-
púrpura ou violácea para provável presença de núcleo esteroidal e de
60
triterpenos policíclicos. Na segunda cápsula foram adicionadas seis gotas do reativo de
Kedde, preparado imediatamente antes do uso. A reação de Kedde é utilizada para
identificação do anel lactônico, caracterizada como positiva através do desenvolvimento de
coloração castanho-avermelhada a vermelho-violeta. Na terceira cápsula, o resíduo seco foi
dissolvido com 1 mL de ácido acético glacial, adicionado de duas gotas de solução de FeCl
3
(2 % em água) e transferido para um tubo de ensaio. Ao tubo de ensaio foi adicionado,
cuidadosamente pelas paredes do tubo, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, de modo que os
dois líquidos não se misturassem. A metodologia utilizada, conhecida como reação de Keller-
Killiani é utilizada para identificação de açúcares (desoxioses em extremidades livres),
evidenciada pela formação de anel vermelho-acastanhada. A presença de glicosídeos
cardiotônicos na droga vegetal não pode ser confirmada apenas por resultados positivos para
as reações de Liebermann-Buchard, Kedde e Keller-Kiliani, sendo necessária a realização de
uma metodologia adicional.
4.2.7.1 Reagente de Kedde
A uma solução metanólica de ácido 3,5-dinitrobenzóico a 2% (4 mL , recente) foram
adicionados 6 mL de solução metanólica de KOH 1N.
4.2.8 Pesquisa de Alcalóides
Dois testes são preconizados, um preliminar e um decisivo. No teste preliminar, em
um béquer, 10 g da droga vegetal juntamente com 30 mL de ácido clorídrico 2 N foram
aquecidos e submetidos a fervura por três minutos. A solução resfriada foi filtrada e dividida
em quatro tubos de ensaio devidamente identificados. Aos tubos um, dois e três, foram
adicionadas três gotas do reagente de Dragendorff, Mayer e Bertrand, respectivamente em
cada tubo. O tubo quatro foi o branco. A reação positiva é caracterizada pela formação de
turvação e/ou precipitado. Para confirmação dos resultados o teste decisivo foi realizado
adicionando-se em um béquer, 10 g da droga vegetal com 50 mL de ácido clorídrico 2 N e
aquecidos até fervura. A solução obtida foi mantida em temperatura ambiente até resfriamento
61
e então filtrada. Ao filtrado foi adicionado uma solução de NH
4
OH (40 % em água) até pH 9.
A solução alcalinizada foi transferida para funil de separação e particionada com a adição de
50 mL de clorofórmio. Após repouso, a fase orgânica foi recolhida, transferida a outro funil
de separação, que foi adicionado de 20 mL de ácido clorídrico 2 N. Após os processos de
agitação, repouso e separação de fases, a porção aquosa foi recolhida e dividida em quatro
tubos de ensaio devidamente identificados. Aos tubos um, dois e três, foram adicionadas três
gotas dos reagentes de Dragendorff, Mayer e Bertrand, respectivamente. O tubo quatro foi o
branco. A reação positiva é caracterizada pela formação de turvação e/ou precipitado. A
pesquisa de alcalóides só é considerada positiva, quando os resultados são positivos para o
teste preliminar e para o decisivo.
4.2.8.1 Reagente de Dragendorff
Para preparar a Solução A, 0,6 g de nitrato de bismuto foram dissolvidos em 2,5 mL
de ácido clorídrico concentrado seguida da adição de 2,5 mL de água destilada. Para preparar
a Solução B, 1,5 g de iodeto de potássio foram dissolvidos em 10 mL de água destilada. As
Soluções A e B foram misturadas em volumes iguais para assim formar o reagente de
Dragendorff.
4.2.8.2 Reagente de Mayer
Em um béquer foram adiconados cloreto de mercúrio (2,72 g), a iodeto de potássio
(10 g) dissolvidos em 20 mL de água, Dilui-se a solução final para 200 mL com auxílio de um
balão volumétrico.
4.2.8.3 Reagente Bertrant
Foi dissolvido 5 g de ácido silicotúngstico em 100 mL de água.
62
4.3 Desenvolvimento Fitoquímico
4.3.1 Equipamentos
As análises de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)
foram realizadas no CG17A acoplado com CGMS-QP5000 Shimadzu e o software CLASS
5000 com as bibliotecas NIST12 e NIST62. Os dados foram obtidos por meio de uma coluna
capilar DB-1 J&W Scientific (30 m x 0,25 mm, espessura de filme 0,25 µm). As condições de
analise utilizadas foram: gás de arraste He; vazão de 1,5 mL min
-1
; temperatura do injetor 300
ºC; temperatura da coluna programada, sendo iniciada a 60 ºC por 4 min, rampa de 10 ºC min
-
1
até 250 ºC, 20 ºC min
-1
até 330 ºC, permanecendo em 330 ºC por 10 min; modo “split” 1:10;
faixa de massa 45 a 700. As análises de cromatografia gasosa com detector de ionização de
chama (CG-DIC) foram realizadas no CG17A Shimadzu, e uma coluna capilar DB-5 J&W
Scientific (30 m x 0,25 mm, espessura de filme 0,25 µm). As condições de análise foram:
temperatura de injetor e detector 300 ºC, gás de arraste N
2
, vazão de 1,2 mL min
-1
;
programação de temperatura : 100 ºC por 5 min, 20 ºC até 320 ºC, permanecendo a 320 ºC por
10 min; modo “split” 1:10. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e
carbono (RMN
1
H e
13
C) foram obtidas em um Bruker DRX-500, espectros de
1
H (399,782
MHz) e
13
C (100,525 MHz) foram obtidos a 27 C utilizando CDCl
3
como solvente.
4.3.2 Obtenção dos Extratos Brutos e das Frações
As raízes e as folhas desidratadas foram trituradas e submetidas à extração exaustiva
com etanol. As soluções obtidas foram filtradas e concentradas em evaporador rotatório sob
pressão reduzida. Partes dos extratos etanólicos foram separadas para testes biológicos. O
extrato obtido das raízes foi submetido a uma extração com hexano resultando em uma fração
solúvel em hexano (6 g), o extrato bruto das folhas foi extraído com acetato de etila gerando
uma fração solúvel em acetato de etila (30 g).
63
4.3.3 Isolamento e Purificação dos Constituintes
Os fracionamentos cromatográficos foram realizados utilizando-se como adsorvente
a sílica-gel 60 (0,063 a 0,200 mm) Merck. As cromatografias em camadas delgadas (CCD)
foram realizadas com sílica gel G UV
254
(Macherey-Nagel). A revelação das placas
cromatográficas foi realizada por meio de detecção na região do ultravioleta (254 nm) e com o
reagente de vanilina.
4.3.4 Isolamento e Purificação de Constituintes do Extrato
H
exânico das
R
aízes
Considerando-se as dificuldades encontradas na solubilização do extrato em acetato
de etila, para contornar este problema iniciou-se o fracionamento com a fração hexânica mais
apolar.
A parte solúvel em hexano (4,5 g) foi eluída em coluna cromatográfica de vidro (4,5
cm de diâmetro) com sílica-gel (163,5 g) como fase estacionária e a pastilha a ser
cromatografada foi preparada com sílica gel 60 (5 g). A eluição cromatográfica foi realizada
por meio de hexano, Hexano:diclorometano, diclorometano, diclorometano:acetato de etila
acetato de etila em polaridades crescentes, 1954 frações (250 mL) foram coletadas. As
frações foram concentradas em evaporador rotatório, analisadas por meio de cromatografia
em camada delgada, reveladas com vanilina e reunidas de acordo com as suas semelhanças.
As frações 001 a 030, 031 a 060 e 270 a 310 foram reunidas, solubilizadas em diclorometano,
precipitadas com metanol e submetidas a resfriamento (-5 ºC). Os precipitados obtidos CMR-
1 e CMR-2 (cores branca) e CMR-3 (alaranjada), foram separados através de centrifugação.
As frações 1501 a 1505 foram submetidas a uma extração ácido-base levando e a fração
ácida, de cor alaranjada (CMR-4).
64
4.3.5 Isolamento e Purificação de Constituintes do Extrato em Acetato de Etila das
Folhas
A porção solúvel em acetato de etila (30 g) foi eluída em coluna cromatográfica (4,5
cm de diâmetro) de sílica gel 60 G (174,5 g) e a pastilha a ser cromatografada foi preparada
com sílica-gel 60 G. O sistema eluente utilizado foi hexano, Hexano:diclorometano,
diclorometano, diclorometano:acetato de etila acetato de etila em polaridades crescentes.
Foram coletadas 352 frações de 250 mL cada. As frações foram concentradas em evaporador
rotatório, analisadas por cromatografia em camada delgada, reveladas com vanilina e reunidas
de acordo com as suas semelhanças. As frações 001 a 019 e 021 a 029 foram reunidas,
solubilizadas em diclorometano, seguidas da adição de metanol, levadas ao freezer (-5
0
C)
conduzindo a formação de precipitados de cores branca. (CMF-1 e CMF-2). As frações 096 a
135 e 248 a 256 foram reunidas e submetidas à Cromatografia de Camada Delgada
Preparativa (CCDP) possibilitando a obtenção das amostras CMF-3 e CMF-4.
4.3.6 Revelador de Vanilina
O reagente revelador vanilina (3 g ) foi dissolvido em 135 mL de metanol seguido da
adição de 135 mL de água destilada. A solução foi colocada em banho de gelo e
cuidadosamente foram adicionados 30 mL de ácido sulfúrico concentrado. A solução foi
armazenada em frasco âmbar a 4 ºC.
65
4.4 Toxicidade Materna dos Extratos de Coccoloba mollis
4.4.1 Animais
Os animais utilizados foram os camundongos Swiss (Mus musculus), machos e
fêmeas, adultos, pesando aproximadamente 30 g, provenientes do Biotério Central do Centro
de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina.
Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com tampa de arame
zincado, contendo maravalha e permaneceram em regime de luminosidade controlada, ciclo
de 12 horas claro / 12 horas escuro, a 22 ± 2 ºC, com água e ração ad libitum. Todo o
experimento foi conduzido de acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Estadual de Londrina.
Para obtenção dos animais dos diferentes grupos experimentais foram colocados para
acasalar no final da tarde, um camundongo macho com dois camundongos fêmeas por gaiola.
No dia seguinte, com um intervalo de 12 horas, , as vaginas das fêmeas foram examinadas
para verificar a presença do “plug vaginal” o qual determinou o dia zero gestacional.
4.4.2 Grupos Experimentais para Avaliação da Toxicidade Materna
As fêmeas foram distribuídas em oito grupos experimentais. Elas foram tratadas via
gavagem com o extrato etanólico das folhas e das raízes de Coccoloba mollis do quinto ao
décimo sétimo dia gestacional. O grupo 1 foi tratado com PBS (Phosphate Buffered Saline,
tampão de fosfato pH =7) como controle negativo, o grupo 2 foi tratado com uma solução de
PBS e DMSO (Dimetilsulfóxido, 20 % v/v), caracterizando o controle do veículo empregado,
os grupos 3, 4 e 5 e 6, 7 e 8 foram tratados com o extrato etanólico das folhas e das raízes de
Coccoloba mollis respectivamente nas concentrações de 50, 75 e 100 mgKg
-1
em cada grupo.
Para a avaliação do ganho de peso materno, as fêmeas foram pesadas durante todo o
período de prenhez. No 18º dia, foram eutanasiadas por deslocamento cervical e, em seguida,
foi realizada a laparotomia. O útero com fetos foi pesado e realizou-se a histerectomia e
onfalectomia. A correção do ganho de peso materno foi realizada considerando-se o ga
nho de
66
peso materno menos peso do útero gravídico. O conteúdo uterino das fêmeas foi analisado,
verificando-se a presença de reabsorções, número de fetos vivos e mortos, peso fetal e
placentário, comprimento e peso fetal. O número de sítios de implantação foi determinado
através do método de Salewisk (1964). Com estes dados foram calculados: taxa de reabsorção
(nº de reabsorções x 100 / nº implantações); taxa de perdas pós-implantacionais (nº de
implantações – nº fetos vivos x 100 / nº de implantações); taxa de viabilidade fetal (nº de fetos
vivos x 100 / nº implantações) e índice placentário (peso placentário / peso fetal). As vísceras
maternas: coração, pulmões, fígado e rins foram pesados.
4.4.3 Análise Estatística
Os dados com distribuição normal foram analisados através de ANOVA (análise de
variância) seguido do teste de comparação de médias – Teste de Tukey e os com distribuição
não-normal foram analisados por Mann-Whitney e Dunn através do programa estatístico
INSTAT
(Software livre para análise
estatística
). O nível de significância considerado foi de 5
%.
4.5 Teste de Letalidade de Artemia salina
O teste de letalidade de Artemia salina foi realizado segundo metodologia descrita
por Silva e colaboradores (2007) com pequenas alterações.
Os ovos de A. salina foram incubados em água de mar artificial, a 20-30 C. Para a
eclosão dos ovos no período de 48 horas foi utilizada uma caixa de plástico contendo no seu
interior uma divisória com microperfurações de forma que, apenas um dos lados ficava
iluminado para permitir, por fototropismo, a migração das larvas de um compartimento da
caixa para o outro. Os extratos etanólicos das folhas e das raízes foram solubilizados e
adicionados a um balão volumétrico de 5 mL com no máximo 3 gotas de Tween 80 e 2 mL de
DMSO e o volume foi aferido com água marinha artificial. A solução de água marinha foi
empregada para as diluições das diferentes concentrações de extratos testadas. No teste, foram
empregadas cinco diferentes concentrações dos extratos entre de 20 a 2000 µg mL
-1
em tubos
67
de ensaio com 5 mL de solução. A cada tubo foram adicionadas de 10 a 12 larvas de modo
que os tubos ficaram expostos a iluminação por 24 h. Após este período procedeu-se a
contagem das larvas verificando quantas permaneceram vivas e quantas morreram. O teste foi
realizado em quadruplicata. O valor de DL
50
foi calculado através de regressão linear. Os
resultados são considerados bioativos se os valores de DL
50
forem inferiores a 1000 g mL
-1
.
Como controle negativo foi utilizada uma solução idêntica a empregada para
solubilizar o extrato e como controle positivo uma solução de dicromato de potássio (10 mg
mL
-1
) solubilizada da mesma forma.
4.5.1 Composição da Água do Mar Artificial
Os constituintes da água do mar artificial são: 23 g NaCl, 11 g MgCl
2
.6H
2
O, 4 g
Na
2
SO
4
, 1,3 g CaCl
2
.2H
2
O e 0,7 g de KCl em 1000 mL de água destilada (PARRA et al.,
2001).
4.6 Teste de Atividade Antioxidante
A capacidade dos extratos de remover o radical estável 2,2–difenil–1–picril-hidrazil
(DPPH) foi monitorado pelo método de Amarowicz e colaboradores (2004) com pequenas
modificações. Este método baseia-se na remoção do radical estável DPPH do meio reacional
pela ação dos antioxidantes presentes na amostra.
O grau de descoloração do radical DPPH foi medido espectrofotometricamente em
uma solução metanólica. Os extratos etanólicos das folhas e das raízes foram dissolvidos em 4
mL de metanol de forma a obter soluções de concentrações de 0,2 a 500 µg mL
-1
. A cada
amostra foram adicionados 500 µL de uma solução de DPPH (0,1 mM). A mistura
permaneceu no escuro a temperatura ambiente por 30 minutos. A absorbância das soluções
resultantes foram medidas a 517 nm em um espectrofotômetro V-1200 Pró-
Analise
®
. Uma
solução metanólica de DPPH que apresentou total decaimento da coloração roxa (2 mg de
BHT dissolvido em 4 mL de metanol com 0,5 mL da solução de DPPH a 0,01 mM
) foi
68
utilizada para correção de “background”. A atividade de seqüestro de radicais (%ASR) foi
calculada como porcentagem de descoramento do DPPH usando a seguinte equação:
100%
AbsCN
AbsAAbsCN
ASR
Onde: AbsCN é a absorbância da solução de DPPH sem adição alguma e a AbsA é a
absorbância de uma solução de DPPH com adição de extrato em uma determinada
concentração.
A concentração mínima inibitória de 50 % (CMI
50
) foi calculada através de regressão
linear em um gráfico de dispersão da concentração do extrato versus a %ASR (r
2
> 0,98), o
teste foi realizado em triplicata e o coeficiente de variação máximo aceito foi de 5 %.
4.7 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
4.7.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana Frente
a
Bactérias e Leveduras
As bactérias gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), as gram-
positivas (Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis) e as leveduras (Cândida albicans, C.
krusei e C. tropicalis) foram utilizadas nos testes com os extratos etanólicos das folhas e das
raízes de Coccoloba mollis.
Com o auxílio de uma alça de platina os microrganismos foram inoculados em meio
líquido de Müller Hinton para as bactérias e Sabouraud para as leveduras. Os cultivos foram
então incubados a 37 ±2 ºC por 24 h até atingir 1 x 10
8
UFC mL
-1
quando comparados à
escala de Mac Farland.
Para a avaliação da atividade antimicrobiana foram utilizadas placas de Petri com os
meios Müller Hinton e Sabouraud acrescidos de 2 % de ágar-ágar, a estas placas foram
inoculadas com 50 µL de suspensão de células e espalhadas com alça de Drigalski. Em cada
placa foram perfurados oito poços eqüidistantes e um central com auxílio de uma ponteira
plástica esterilizada e a cada um deles foi adicionado 30 µL das amostras a serem testadas. As
placas foram incubadas a 37 ±2 ºC e avaliadas após 24 e 48 h.
69
Como controles positivos foram utilizados os antibióticos Tetraciclina para as
bactérias gram-positivas, Penicilina para as bactérias gram-negativas e Nistatina para as
leveduras (0,05 mg em 30 µL). Foi também avaliado o efeito do solvente DMSO (30 µL) no
crescimento dos referidos microrganismos.
4.7.2 Avaliação da Atividade Antimicrobiana Frente a Fungos Filamentosos
Os fungos fitopatogênicos Botryosphaeria rhodina, B.ribis e Lasiodiplodia
theobromae,
foram cultivados em Batata Dextrose Ágar (BDA) por cinco dias a 28
±2 °C,
após este período foram retiradas esferas com aproximadamente 0,7 cm de diâmetro e estas
foram utilizadas como inóculo para os testes com as substâncias isoladas (fisciona e emodina)
e os extratos das folhas e das raízes de Cocoloba mollis.
As amostras foram solubilizadas em DMSO nas diferentes concentrações analisadas,
0,8 mL de cada uma destas soluções foram adicionadas em 17 mL de BDA e então o meio foi
distribuído em placas de Petri, logo após foram inoculadas as esferas contendo hifas
distribuídas homogeneamente, as placas foram incubadas a 28 ±2 ° C por 5 dias. Após este
período o diâmetro das colônias foi medido e foi realizado o cálculo da porcentagem de
inibição do crescimento. Como controles foram utilizados os seguintes cultivos, somente em
BDA (controle negativo), BDA contendo DMSO (ação inibitória do DMSO) e BDA contendo
0,18 % de Captan (controle positivo).
A porcentagem de inibição foi calculada através da seguinte fórmula:
100%
CC
CE
CC
Inibição
onde, CC é o crescimento micelial no controle, e CE é o crescimento micelial com a adição da
amostra teste (QUIROGA et al., 2001).
70
4.8 Avaliação do Potencial Alelopático de Extratos de Coccoloba mollis.
O ensaio foi conduzido segundo metodologia de Ferreira e colaboradores (2007) com
pequenas modificações.
A solução mãe foi preparada com 1 g do extrato etanólico de folhas e de raizes C.
mollis respectivamente, 5 mL de acetato de etila, 9 gotas de Tween 80 e completou-se para o
volume para 50 mL com água destilada em um balão volumétrico, obtendo-se uma solução a
2 % de cada extrato. A partir da solução mãe foram feitas diluições de modo que atingissem
as seguintes concentrações: 0,125 %; 0,25 %; 0,50 % e 1,00 %. Para controle do solvente foi
utilizada uma solução idêntica a utilizada para solubilizar os extratos e a água destilada como
controle negativo.
Para realizar o teste de germinação foram usadas sementes de Lactuca sativa,
cultivar Simpson, tratadas com Captan 75% a 2%.
Folhas de papel filtro esterilizadas, recortadas em círculos de aproximadamente 9 cm
de diâmetro e colocadas em placas de Petri com diâmetro semelhante. Cada círculo de papel
filtro pesava em média 1,48 g, deste modo adicionaram-se as soluções diluídas de cada
tratamento na proporção de 2,5 vezes o peso do papel. Após o umedecimento do papel de
filtro com os devidos extratos, as placas foram expostas por cerca de uma hora para a
volatilização dos solventes orgânicos. Em seguida foram colocadas 50 sementes por placa, e
foram mantidas em estufa B.O.D. (demanda bioquímica de oxigênio) à temperatura de 25 ºC
± 2 fotofase de 14 horas. O experimento foi conduzido em quadruplicata.
As sementes foram avaliadas diariamente no mesmo horário durante sete dias, sendo
a germinação considerada efetiva a partir da emissão da radícula com cerca de 2 mm.
Para cada repetição, foi calculado o índice de velocidade de germinação (IVG),
somando-se o número de sementes germinadas a cada dia, dividindo pelo respectivo número
de dias transcorridos a partir de semeadura, conforme Maguire (1962):
N
N
N
G
N
G
N
G
IVG ...
2
2
1
1
onde: G
1
, G
2
e G
N
representam o número de sementes normais germinadas até o enésimo dia.
N
1
, N
2
e N
N
representam o número de dias em que se avaliaram as germinações G
1
, G
2
e G
N
.
71
Para a análise dos dados foi determinado o delineamento inteiramente casualizado,
comparando-se as médias por Tukey, a 5 % de probabilidade utilizando o software SASM-
Agri (ALTHAUS; CANTERI; GIGLIOTI, 2001).
72
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Quimioprospecção
A pesquisa fitoquímica tem por objetivos avaliar a presença de classes químicas
presentes na espécie de interesse, há necessidade de uma abordagem química, isto é, um
exame que forneça uma avaliação geral da composição química da planta, indicando os
grupos de metabólitos secundários relevantes da mesma; isto é realizado
por meio da análise
fitoquímica preliminar (MATOS, 1997; SIMÕES et al., 2000).
Os ensaios realizados demonstraram a presença de flavonóides e taninos nas folhas e
raízes e antraquinonas somente nas raízes de C. mollis (Tabela 4).
As classes de metabólitos detectados são compatíveis com as substâncias já isoladas
neste gênero.
Tabela 4: Quimioprospecção de Coccoloba mollis
RESULTADOS
Classe de Metabólitos
FOLHA RAIZ
Heterosídeos Fenólicos
Simples
- -
Flavonóides + +
Cumarinas - -
Taninos + +
Antraquinonas - +
Saponinas - -
Glicosídeos Cardiotônicos - -
Alcalóides - -
+ presença do grupo químico; - ausência do grupo químico
73
5.2 Identificação das Amostras CMF-1 e CMR-1
As amostras CMF-1 e CMR-1 ao serem submetidas a uma análise por CG-EM
mostraram constituir-se de uma mistura de hidrocarbonetos alifáticos de cadeias longas
(Figura 25). Para a identificação utilizou-se a análise por CG-DIC na qual foram injetadas as
amostras e um padrão composto por hidrocarbonetos (DRH-004S Luft/Lust) nas mesmas
condições. A identificação foi realizada comparando-se os tempos de retenção e índices de
Kovats obtidos com as amostras e o padrão empregado. A Figura 26 apresenta a reta obtida
com os padrões relacionando o tempo de retenção e o tamanho das cadeias dos
hidrocarbonetos respectivamente.
A
B
A
B
Figura 25: A – Cromatograma da amostra CMF–1; B – Cromatograma da amostra CMR-1
A análise permitiu identificar hidrocarbonetos alifáticos de C-16 a C-31 exceto o C-
17 na amostra CMF-1 e C-28 a C-34 excetuando C-30 e 31 na amostra CMR-1.
74
y = 2,0367x - 4,7713
R
2
= 0,9900
10
15
20
25
30
35
40
45
8 10 12 14 16 18 20 22
24
tempo (min)
Figura 26: Número de carbonos x tempo de retenção em minutos.
5.3 Identificação das Amostras CMF-2 E CMR-2
As amostras CMF-2 e CMR-2 ao serem analisados por CG-EM mostraram-se como
misturas de ésteres etílicos de ácidos graxos, a Figura 27 traz os cromatogramas obtidos. Para
a identificação utilizou-se a análise por CG-EM na qual foram injetadas as amostras e um
padrão composto por ésteres etílicos de ácidos graxos (FAAES 49454-U) nas mesmas
condições. A identificação foi realizada comparando-se os tempos de retenção e índices de
Kovats obtidos com as amostras e o padrão empregado. A Figura 28 mostra o gráfico obtido
com os padrões relacionando o tempo de retenção e o tamanho das cadeias dos ésteres etílicos
de ácidos graxos.
Foram identificados os ésteres etílicos de ácidos graxos de 12, 15, 18, 22, 25, 26, 27
na mostra CMF-2 e 18, 22, 24, 25 e 27 carbonos na amostra CMR-2.
75
A
B
A
B
Figura 27: A – Cromatograma da amostra CMF–2; B – Cromatograma da amostra CMR-2
y = 1,0921x - 4,2210
R
2
= 0,9924
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
10 15 20 25
30
Tempo de Retenção
Figura 28: Gráfico relacionando o número de carbonos dos ésteres etílicos de ácidos graxos
vs. o tempo de retenção em minutos.
5.4 Identificação das Amostras CMR-3 E CMR-4
A amostra CMR-3 foi submetida a CG-EM e o espectro obtido para o único pico que
apresentou grande semelhança ao espectro da fisciona (1,8-dihidroxi-3-metil-6-metoxi
-
76
antraquinona) que consta na biblioteca NIST12 com pico do íon molecular sendo o pico base
em 284 m/z (Figura 29). A Figura 30 traz uma proposta de fragmentação para a fisciona.
O
O
M
e
OM
e
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
A
B
C
D
O
O
M
e
OM
e
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
O
O
M
e
OM
e
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
A
B
C
D
Figura 29: Cromatograma da amostra CMR-3 (A), seguida pelo espectro de massas do único
pico presente no cromatograma (B), que apresenta grande semelhança com o espectro de
massas da fisciona (C) da biblioteca NIST12 (D).
77
O
O
O
H
O
H
OM
e
O
O
O
H
O
H
OM
eH
2
C
O
O
O
H
OM
e
H
m/z = 284
m/z = 283
m/z = 283
O
O
H
O
H
OM
e
m/z = 25
6
O
O
H
OM
e
m/z = 255
H
O
H
O
H
CO
CO
O
O
H
O
m/z = 24
1
CO
Me
O
H
O
O
H
m/z = 21
3
CO
O
H
O
H
O
H
m/z = 185
Figura 30: Proposta de fragmentação para a fisciona.
78
A amostra CMR-4 apresentou um único pico quando submetida à CG-EM, e o
espectro de massas obtido para esse pico apresentou grande semelhança com o espectro da
emodina (1,6,8-trihidroxi-3- metil-antraquinona) presente no banco de dados NIST12 sendo o
pico base e íon molecular em 270 m/z. (Figura 31). A Figura 32 apresenta uma proposta para
a fragmentação para a emodina.
O
O
M
e
O
H
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
A
B
C
D
O
O
M
e
O
H
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
O
O
M
e
O
H
O
H
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8a
9a
4a10
a
A
B
C
D
Figura 31: Cromatograma da amostra CMR-4 (A), seguida pelo espectro de massas do único
pico presente no cromatograma (B), que apresenta grande semelhança com o espectro de
massas da emodina (C) da biblioteca NIST12 (D).
79
O
O
O
H
O
H
O
H
O
O
O
H
O
H
O
HH
2
C
O
O
O
H
O
H
H
m/z = 270
m/z = 269
m/z = 269
O
O
H
O
H
O
H
m/z = 24
2
O
O
H
O
H
m/z = 241
H
O
H
O
H
CO
CO
C
O
O
O
H
O
H
m/z = 21
3
C
O
O
H
O
H
m/z = 18
5
Figura 32: Proposta de fragmentação para a emodina.
A Tabela 5 traz os deslocamentos químicos observados nos espectros de ressonância
magnética realizados a fim de confirmar a identificação das amostras CMR-3 e CMR
-
4 [RMN
de
1
H (Figura 33 e 34 respectivamente) e de
13
C
(Figura 35 e 36 respectivamente)
],. O
espectro de RMN
1
H revelou para cada antraquinona dois sinais simples (
H
12,06 e 12,19
(CMR-3); 11,96 e 12,04 (CMR-4)) referentes aos grupamentos hidroxila
quelados por
80
ligações de hidrogênio e em
H
2,51 (CMR-3) e 2,38 (CMR-4), um sinal integrado para três
hidrogênios referente aos grupamentos metila e CMR-3 apresentou um sinal referente aos 3H
H
3,95. Essas informações aliadas à análise dos espectros de RMN
13
C e
comparação com valores da literatura permitiram confirmar a determinação estrutural das
amostras CMR-3 e CMR-4.
Tabela 5: Deslocamentos químicos observados para as amostras CMR-3 e CMR-4 de
referência para a fisciona e emodina respectivamente (CHU et al., 2005)
fisciona CMR-3 emdoina CMR-4
H
C
H
C
H
C
H
C
C
1
12,06
166,1 12,01
166,92 11,96 164,6 11,96 166,44
C
2
6,74 106,1 6,62 107,30 6,56 107,9 6,54 108,17
C
3
161,9 162,48 161.4 162,14
C
4
7,32 107,8 7,21 108,47 7,11 108.8 7,10 109.36
C
5
7,64 124,0 7,57 124,84 7,42 124,0 7,40 124,51
C
6
148,0 149,13 148,2 148,76
C
7
7,09 120,7 6,89 12 1,10 7,07 120,4 7,10 121,23
C
8
12,19
164,7
12,21
164,81 12,04 164,4 12,06 166,17
C
9
190,2 190,76 189,6 190,43
C
10
181,6 182,11 181,2 181,34
C
4a
134,7 135,82 135,0 135,47
C
8a
113,1 114,32 113,3 113,90
C
9a
110,2 110,34 108,7 109,36
C
10a
132,7 133,25 132,7 133.10
O-Me 3,92 55,7 3,95 57,09
Me 2,42 21,7 2,51 22,44 2,38 21,5 2,38
81
Figura 33: Espectro de RMN de
1
H da amostra CMR-3.
82
Figura 34: Espectro de RMN de
1
H da amostra CMR-4.
83
Figura 35: Espectro de RMN de
13
C da amostra CMR-3.
84
Figura 36: Espectro de RMN de
13
C da amostra CMR-4
85
As antraquinonas encontradas apresentam diversas propriedades farmacológicas
relatadas na literatura (IZHAKI, 2002; CHUKWUJEKU et al., 2006). Entre as pesquisas
realizadas destacam-se os resultados obtidos com fisciona que, em ratos, apresentou efeitos
protetores contra acidentes vasculares cerebrais (ZHANG et al., 2005a; ZHANG et al.,
2005b).
5.5 Identificação da Amostras CMF-3
O cromatograma obtido por CG-EM para a amostra CMF-3 apresentou dois picos,
porém com grande predominância do pico 1, que apresentou um espectro de massas
semelhante ao da taraxerona (13 - metil-27-norolean-14-en-3-ona (D-Friedoolean-14-en-3-
ona)), apresentando o pico base em 55 m/z e pico do íon molecular 424 m/z , além de picos
proeminentes em 204 e 200 m/z (Figura 37). A Figura 38 traz uma proposta para a
fragmentação da taraxerona.
Na série do grupo do taraxerol (triterpeno pentacíclico) tendo como representante a
taraxerona a fragmentação via retro-Diels-Alder conduz ao íon (m/z 300) no qual os anéis A,
B e C permanecem unidos. A presença deste íon auxilia na identificação com base no espectro
de massas se ele pertence à classe do taraxerol ou a classe dos ursanos e oleananos. Os
representantes das - e -amirinas não são rapidamente diferenciados por meio dos espectros
de massas considerando-se que eles exibem uma fragmentação principal idêntica que ocorre
no processo da retro-Diels-Alder reação que envolve a dupla ligação em
12
e que os picos de
massas mais intensos representam os anéis D e E (Figura 39), (DJERASSI, 1963).
Para confirmar a identificação, a amostra CMF-3, foi analisada por RMN de
1
H
(Figura 40) e de
13
C (Figuras 41, 42 e 43), e os resultados comparados aos da literatura estão
apresentados (Tabela 6). O espectro de RMN de
13
C apresentou 30 sinais destacando a
presença de u
C
217,3 referente ao carbono carboní
C
157,6 e
117,2) referentes aos carbonos da dupla ligação. O espectro de RMN de
1
H apresenta oito
H
0,82, 0,90, 0,91, 0,95, 1,06, 1,07, 1,08, 1,13) e um
duplo dupleto em
H
5,55 referente ao hidrogênio ligado ao carbono 15.
86
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22
2
1
2324
25
26
27
2
8
2
9
3
0
A
B
C
D
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22
2
1
2324
25
26
27
2
8
2
9
3
0
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22
2
1
2324
25
26
27
2
8
2
9
3
0
A
B
C
D
Figura 37: Cromatograma da amostra CMF-3 (A), seguida pelo espectro de massas do pico 1
presente no cromatograma (B), que apresenta grande semelhança com o espectro de massas
da taraxerona (C) da biblioteca NIST12 (D).
87
O
O
m/z = 424
m/z = 30
0
CO
m/z = 272
O
C
H
3
CO
CH
3
m/z = 285
m/z = 257
m/z = 20
4
m/z = 189
CH
3
Figura 38: Proposta de fragmentação para a taraxerona
88
O
H
-amirina
O
H
-amirina
O
H
-amirina
O
H
-amirina
Figura 39: Fragmentação via retro Diels-Alder em triterpenos da classe dos ursanos e
oleananos.
89
Tabela 6: Deslocamentos químicos observados para a mostra CMF-3 e valores de referência
para taraxerona (AHMAD; RAHMAN, 1994).
taraxerona CMF-3
C
H
C
H
C
3 217,3 213,57
4 47,6 47,52
8 38,9 38,82
10 37,6 37,68
13 37,7 37,59
14 157,6 157,60
17 37,7 37,73
20 28,8 28,79
CH
5 55,8 55,7
9 47,7 48,69
15 117,2
5,56(dd)
117,18 5,55 dd)
18 48,8 48,78
CH
2
1 38,4 38,34
2 34,1 34,13
6 20,0 19,94
7 35,2 35,09
11 17,5 17,43
12 35,8 35,76
16 36,7 36,66
19 40,7 40,62
21 33,6 33,57
22 33,1 33,06
CH
3
23 26,2 1,12 (s) 26,09 1,13 (s)
24 21,5 1,06 (s) 21,47 1,08 (s)
25 14,8 1,06 (s) 14,79 1,07 (s)
26 29,9 1,06 (s) 29,91 1,06 (s)
27 25,6 0,97 (s) 25,55 0,95 (s)
28 29,9 0,93 (s) 29,89 0,91 (s)
29 33,4 0,93 (s) 33,35 0,90 (s)
30 21,4 0,83 (s) 21,33 0,82 (s)
90
Figura 40: Espectro de RMN de
1
H da amostra CMF-3
91
Figura 41: Espectro de RMN de
13
C da amostra CMF-3
92
Figura 42: Ampliação da região entre 13 e 31 ppm do espectro de RMN de
13
C da amostra
CMF-3
93
Figura 43: Ampliação da região entre 31 e 56 ppm do espectro de RMN de
13
C da amostra
CMF-3
94
5.6 Identificação da amostra CMF-4.
A amostra CMF-4, quando submetida a CG-EM, apresentou 4 picos, porém com
grande predominância do pico 1, o espectro de massas deste pico apresentou grande
semelhança ao espectro de massas do malato de dietila com o pico base em 71 m/z e um pico
proeminente em 117 m/z (Figura 44), a Figura 45 traz uma proposta de fragmentação para
esta molécula.
95
O
O
O
O
H
O
1
2
3
4 1
`
2
`
1
"
2
"
A
B
C
D
O
O
O
O
H
O
1
2
3
4 1
`
2
`
1"
2
"
A
B
C
D
Figura 44: Cromatograma da amostra CMF-4 (A), seguida pelo espectro de massas do pico 1
presente no cromatograma (B), que apresenta grande semelhança com o espectro de massas
do malato de dietila (C) da biblioteca NIST12 (D).
96
O
O
O
O
H
O
O
O
O
H
O
O
O
H
O
H
O
EtO
H
2
C CH
2
CO
CO
m/z = 145 m/z = 11
7
O
O
O
H
H
2
C CH
2
O
O
H
O
H
m/z = 89
m/z = 117
H
2
O
C
O
H
O
m/z = 71
m/z = 190
Figura 45: Proposta de fragmentação para o malato de dietila.
5.7 Toxicidade Materna dos Extratos Etanólicos das Folhas e das Raízes de Coccoloba
mollis
Dentre os parâmetros analisados para verificar a toxicidade do extrato etanólico das
folhas e das raízes de Coccoloba mollis sobre a performance reprodutiva das fêmeas, não
houve diferença estatística entre os grupos experimentais com o grupo controle em relação a
ganho de peso materno corrigido, peso relativo dos órgãos maternos (Tabela 7).
Os parâmetros relativos ao desenvolvimento intra-uterino da prole são apresentados
na Tabela 8 e demonstraram que os extratos de Coccoloba mollis não alteraram nenhum
parâmetro analisado quando comparado ao grupo controle.
Os resultados deste estudo indicam que os extratos etanólicos das folhas e das raízes
de C. mollis, nas doses administradas, e período estudado não apresentaram toxicidade
materna e também não causaram teratogenicidade na prole das fêmeas tratadas. Portanto,
podemos considerar que o seu uso é seguro durante o período gestacional.
97
98
99
5.8 Teste de letalidade de Artemia salina
O teste de letalidade de Artemia salina é uma técnica rápida, simples e de baixo
custo além de precisar de uma quantidade pequena de amostra, capaz de detectar um amplo
espectro de bioatividade em extratos brutos. A toxicidade a A. salina é um indicativo de
citotoxicidade e atividade pesticida, particularmente existindo uma correlação positiva entre a
letalidade da A. salina e citotoxicidade frente a células 9 KB (carcinoma nasofaríngeo
humano) e outros tumores sólidos, assim como linhagem celular P388 (leucemia de roedores
in vivo) (GHISALBERTI, 2007).
O ensaio realizado permitiu estimar a DL
50
para o extrato etanólico das raízes de C.
mollis em 68,5 µg mL
-1
(Figura 46a) e para o extrato etanólico das folhas em 1342 µg mL
-1
(Figura 46b). A maior toxicidade do extrato etanólico das raízes em comparação com o das
folhas condizem com os resultados obtidos por Tsuboy (2008) que relata uma maior
toxicidade do extrato etanólico das raízes em comparação com o extrato etanólico das folhas
em testes citotóxicos.
100
y = -80,0014x + 196,8398
R
2
= 0,9967
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3
2,4
log da [ ]
y = -293,9049x + 969,5341
R
2
= 0,9859
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 3,05 3,1 3,15 3,2 3,25 3,3
3,35
log da [ ]
A
B
y = -80,0014x + 196,8398
R
2
= 0,9967
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4
log da [ ]
y = -293,9049x + 969,5341
R
2
= 0,9859
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 3,05 3,1 3,15 3,2 3,25 3,3 3,35
log da [ ]
A
B
Figura 46: Gráfico da % de Artemia salina Lench vivos vs. logarítimo da concentração do
extrato etanólico das raízes (A) e folhas (B) da C. mollis.
A grande diferença entre a letalidade dos extratos testados, ao menos em parte, pode
ser explicado pela presença de antraquinonas no extrato das raízes, Montoya e colaboradores
(2003) encontraram resultados semelhantes em estudos com extratos de Heterophyllae
pustulata onde os extratos ricos em antraquinonas eram significativamente mais tóxicos a
Artemia salina em comparação aos demais extratos, outro estudo, realizado por Ayo e
colaboradores (2007) determinou a DL
50
da emodina como 42,77 µg mL
-1
.
Diversos trabalhos mostram o isolamento de antraquinonas guiado pelo teste de
letalidade de Artemia salina, entre os quais podemos citar o trabalho de Feng e colaboradores
(2005) que a partir de um extrato de Prismatomeris tetrandra que apresentava toxicidade a
Artemia salina e linhagens de células tumorais humanas foram isolados 3 novas
antraquinonas (1-hidroxi-2,3-dimetoxi-7-metil-9,10-anthraquinona, 1,3-dihidroxi-5,6-
dimetoxi-2-metil-9,10-anthraquinona e 3-hidroxi-1,5,6-trimetoxi-2-metil-9,10-anthraquinona)
além de 5 outras antraquinonas já conhecidas.
101
5.9 Teste de Atividade Antioxidante
O DPPH é um radical orgânico que apresenta coloração roxa, com absorbância
máxima entre 515 e 528 nm. Moléculas antioxidantes podem suprimir o radical DPPH
(doando um átomo de hidrogênio, um elétron ou via ataque radicalar) promovendo uma
visível alteração na coloração de roxo para amarelo (AMAROWICZ et al., 2004; GALOTTA
et al., 2008)
O extrato etanólico das folhas de C. mollis apresentou uma CMI
50
de 10,11 ± 0,12 µg
mL
-1
, já o extrato das raízes apresentaram CMI
50
igual a 15,96 ± 0,55 µg mL
-1
, ambos os
extratos apresentaram um grande potencial antioxidante destacando-se o das folhas que
apresentou resultados melhores que os do BHT (CMI
50 =
13,23 ± 0,27 µg mL
-1
), um
antioxidante sintético amplamente utilizado como aditivo alimentar (Tabela 9).
Tabela 9: Atividade antioxidante (expressa em CMI
50
) dos extratos de Coccoloba mollis.
CMI
50
(µg mL
-1
)
extrato etanólico das folhas 10,11 ± 0,12
extrato etanólico das raízes 15,96 ± 0,55
BHT 13,23 ± 0,27
A presença de taninos e flavonóides nas folhas e raízes da C. mollis contribuem para
o bom desempenho dos extratos etanólicos avaliados, pois esses metabólitos são conhecidos
por suas propriedades antioxidantes (WILLIAMS et al., 2004; MELLO; SANTOS, 2001). O
maior potencial antioxidante do extrato etanólico das folhas em relação ao das raízes pode ser
explicado, ao menos em parte, pela presença das clorofilas e seus derivados que apresentam
atividade antioxidante (LANFER
-
MARQUEZ et al., 2005; KRÄUTLES, 2008) e ação
antimutagênica destacando indícios de que dietas ricas em clorofila e seus derivados podem
ser benéficas à saúde (FERRUZZI et al., 2002). A atividade antioxidante demonstrada pelos
derivados de clorofila aparentemente não é relacionada a capacidade de doar hidrogênio, mas
provavelmente na proteção do ácido linoléico contra oxidação e/ou decomposição por
hidroperóxidos (LANFER-MARQUEZ et al., 2005).
102
5.10 Teste de Atividade Antimicrobiana
Os extratos etanólicos das folhas e raízes de C. mollis foram submetidos a uma
avaliação quanto ao seu potencial antibacteriano empregando-se a técnica de difusão em ágar,
frente às bactérias gram-negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa), gram-
positivas (Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis). O extrato etanólico das folhas
apresentou atividade apenas frente a E. coli, enquanto que o extrato das raízes não apresentou
atividade frente a esse microorganismo mas apresentou atividade frente a todos as demais
bactérias testadas (Tabela 10), o maior potencial antibacteriano do extrato das raízes em
comparação com o das folhas pode estar associado a presença das antraquinonas que possuem
efeito antibacteriano e estão ausentes nas folhas.
Tabela 10: Atividade antibacteriana dos extratos etanólicos de Coccoloba mollis.
Diâmetro do halo de inibição (cm)
Amostra (mg)
Escherichia coli
(ATCC 25922) *
Pseudomonas
aeruginosa
(ATCC 23853)*
Staphylococcus
aureus
(ATCC 25923)**
Bacillus subtilis
(ATCC 8276)
**
extrato etanólico das
folhas (0,189)
0,9 Negativo Negativo Negativo
extrato etanólico das
raízes (0,210)
Negativo 1,2 1,2 1,0
Tetraciclina* (0,05)
2,0 1,5 ND ND
Penicilina** (0,05) ND ND 2,0 2,5
Diversos microrganismos patogênicos comuns apresentam sensibilidade a emodina
(AYO et al., 2007), a substância isolada em maior quantidade das raízes de Coccoloba mollis.
Chukwujekwu e colaboradores (2006), em estudos com emodina isolada de Cassia
occidentalis, determinaram sua concentração mínima inibitória como 7,8 x 10
-3
e 3,9 x 10
-3
mgmL
-1
respectivamente frente às bactérias gram-positivas Bacillus subtilis e Staphylococcus
aureus e a ausência de atividade até a concentração de 5 x 10
-1
mg mL
-1
frente duas bactérias
gram-negativas (Klebstella pneumoniae e Escherichia coli).
Os extratos etanólicos da folhas e raízes de C. mollis foram avaliados quanto ao seu
potencial antifúngico através da técnica de difusão em ágar frente às leveduras Candida
tropicalis, C. krusei e C. albicans. O extrato das folhas apresentou
atividade frente as três
103
leveduras testadas enquanto que o extrato das raízes não apresentou atividade frente a
Candida tropicalis (Tabela 11).
Tabela 11: Atividade antifúngica dos extratos etanólicos de Coccoloba mollis.
Diâmetro do halo de inibição (cm)
Amostra (mg)
Candida
tropicalis
Candida krusei Candida albicans
extrato etanólico das
folhas (0,189)
1,0 1,1 1,1
extrato etanólico das
raízes (0,210)
Negativo 1,3 1,0
Nistatina (0,05) 2,0 Negativo 2,0
Empregando a técnica de diluição em ágar além dos extratos das folhas e raízes as
antraquinonas fisciona e emodina isoladas das raízes de C. mollis foram avaliadas quanto seu
potencial antifúngico frente aos fitopatógenos Botryosphaeria rhodina, B. ribis e o
Lasiodiplodia theobromae. Os microrganismos testados cresceram satisfatoriamente nos
controles do meio (Controle-I), o solvente empregado, DMSO (Controle II), inibiu o
crescimento dos três fungos testados principalmente sobre o Botryosphaeria ribis, o Captan
(Controle III) inibiu completamente ocrescimento do Botryosphaeria ribis, enquanto que o
Botryosphaeria rhodina e o Lasiodiplodia theobromae apresentaram uma porcentagem de
inibição de 60,5 e 49,4 respectivamente. O extrato etanólico das folhas apresentou atividade
antifúngica superior ao das raízes e a substância que apresentou a maior porcentagem de
inibição foi a emodina sendo 43,7 para o Botryosphaeria rhodina, 30,3 para o Botryosphaeria
ribis e 31,6 para o Lasiodiplodia theobromae (Tabela 12).
104
Tabela 12: Atividade antifúngica dos extratos etanólicos de folhas e raízes de C. mollis e da
fisciona e da emodina.
Botryosphaeria rhodina Botryosphaeria ribis Lasiodiplodia theobromae
Amostras
Halo de
crescimento
(cm)
%
de Inibição
Halo de
crescimento
(cm)
%
de Inibição
Halo de
crescimento
(cm)
%
De Inibição
Controle-I
(BDA 17 mL)
8,0 0 8,0 0 8,0 0
Controle-II
(BDA+DMSO 0,8 mL)
6,3 5,0 6,3
Controle-III
(BDA+Captan 0,18%)
2,5 60,5 0,0 100 3,2 49,4
Emodina
(1 mg / 17 mL)
3,5 43,7 3,5 30,3 4,3 31,6
Fisciona
(1 mg / 17 mL)
4,0 36,1 4,2 16,7 5,6 11,7
Extrato etanólico das folhas
de C. mollis (3mg / 17mL)
3,5 43,5 4,0 21,1 4,2 33,2
Extrato etanólico das raízes
de C. mollis (3 mg / 17mL)
4,1 34,9 4,3 14,4 6,9 0
Os triterpenos lupeol, ácido betulinico, ácido ursólico, e ácido 2-hydroxi-ursólico
isolados de Curtisia dentata demonstraram atividade antifúngica frente aos fungos Sporothrix
schenckii, Microsporum canis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Cryptococcus
neoformans, Candida guilliermondi e Candida spicata com concentração mínima inibitória
entre 8 a 65 µg mL
-1
(SHAI, et al., 2008) estes mesmos triterpenos foram relatados no gênero
Coccoloba, excetuando o ácido 2-hydroxi-ursólico (DAN; DAN, 1986; COTA et al., 2003)
sendo que a betulina isolada de Coccoloba acrostichoides mostrou atividade frente ao fungo
Fusarium oxysporum (COTA et al., 2003) esses dados coadunam com os resultados obtidos
com os extratos das folhas de C. mollis que apresentam os triterpenos simiarenol (OLIVEIRA
et al., 2008a) e taraxerona.
Estudos recentes demonstram que diversos extratos e óleos essenciais de plantas
além de algumas substâncias isoladas destes, inibem o crescimento de vários fungos e o uso
de tais matérias no combate a fitopatógenos tem crescido (ACHARYA et al., 2006).
105
5.11 Avaliação do potencial alelopático
Todos os tratamentos utilizando-se dos extratos de C. mollis atingiram germinação
superior a germinação nominal das sementes empregadas (95%) no segundo dia do
experimento mostrando ausência de atividade alelopática dos extratos nas concentrações
analisadas (Tabela 13).
Tabela 13: Atividade alelopática dos extratos etanólicos das raízes e das folhas de C. mollis.
Controle
Extrato etanólico das raízes
C. mollis Exrato etanolico das folhas de C. mollis
negativo solvente 0,125 % 0,25 % 0,5% 1% 0, 125 % 0,25 % 0,5% 1%
IVG
47,4 46,6 46,0 46,1 46,9 48,5 45,5 45,5 46,4 45,3
Germinação
(%)
97,5 96,0 96,5 96,0 96,0 97,0 96,5 95,5 96,5 95,0
IVG – índice de velocidade de germinação
Este resultado é contraditório aos registrados na literatura, que indicam atividade
alelopática a taninos que estão presentes nos dois extratos avaliados, outro grupo de
metabólitos comuns aos dois extratos avaliados são os flavonóides, e entre estes alguns
também são considerados aleloquímicos (EINHELLIG, 2003).
Um número relativamente grande de aleloquímicos fitotóxicos é proveniente da rota
dos terpenóides (DUKES; OLIVA, 2003) e o triterpeno taraxerona, que foi isolado nas folhas
de C. molis, inibe o crescimento de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. (Solanaceae) var.
Pomodoro) e capim-arroz [Echinochloa crus-galli L. (Beauv.) (Poaceae)] (MACÍAS-
RUBALCAVA et al., 2007). As antraquinonas também apresentam atividade alelopática,
inclusive a emodina, que foi isolada em quantidade considerável a partir das raízes de C.
mollis, inibe fortemente o crescimento de alface (IZHAKI, 2002), a planta teste empregada,
que é uma planta conhecidamente sensível (ALVES et al., 2004).
106
6 CONCLUSÕES
A política nacional de plantas medicinais inserida no decreto n 5.813, de 22 de junho
de 2006 tem como objetivo: “Garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da
biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional.” Desta forma
o presente estudo coaduna com os objetivos do decreto supra citado. O conhecimento de
constituintes químicos e os testes biológicos realizados contribuem para a utilização mais
segura da espécie Coccoloba mollis que esta sendo empregada como fitoterápico no
município de Londrina – PR.
O isolamento de antraquinonas nesta espécie indica a sua importância na área de
fitoterápicos uma vez que elas apresentam atividades diversas (antineoplásica, anti-mutação,
antibacteriana, antifúngica, ativas contra o Schistosoma mansoni, antiinflamatória, laxante,
efeito inibitório na lipoperoxidação e da monoaminoxidase e como ativador da lípase). A
identificação da fisciona é altamente promissora considerando-se o número elevado de
pesquisas científicas que estão sendo realizadas com este princípio ativo em que ela apresenta
muitas das atividades descritas para as antraquinonas e destacam-se os resultados obtidos em
ratos em que a fisciona apresentou efeitos protetores em acidentes vasculares cerebrais (AVC
isquêmico). O número de fármacos utilizados no tratamento desta patologia é restrito, dessa
forma, esta antraquinona e a planta C. mollis representam um novo agente terapêutico para o
AVC em que 30 % das vezes conduz à morte do paciente.
Os extratos etanólicos das folhas e das raízes demonstraram atividade antimicrobiana
destacando a atividade antibacteriana das raízes e antifúngica das folhas. As antraquinonas
isoladas também apresentaram atividade antifúngica com destaque para a emodina.
Os ensaios de quimioprospecção realizados demonstraram a presença de flavonóides
e taninos nas folhas e raízes e antraquinonas somente nas raízes desta espécie. Enquanto nos
processos de isolamento, purificação e determinação estrutural realizados somente as
antraquinonas foram identificadas, novos fracionamentos com solventes mais polares deverão
ser direcionados para a pesquisa de flavonóides e taninos
O ensaio de atividade antioxidante (DPPH) mostrou que os extratos etanólicos das
folhas (IMC
50
= 10,11 ± 0,12 µg mL
-1
) e das raízes (IMC
50
= 15,96 ± 0,55 µg mL
-1
)
apresentam capacidade de capturar radicais comparáveis ao BHT (IMC
50
= 13,23 ± 0,27 µg
107
mL
-1
), um antioxidante amplamente empregado pela indústria, principalmente alimentícia e
farmacêutica.
O teste de letalidade de Artemia salina apresentou resultados de toxicidade
condizentes com os resultados obtidos em testes de citoxicidade onde as raízes se mostraram
mais tóxicas que folhas.
Os resultados dos testes de toxicidade materna indicam que os extratos etanólicos das
folhas e das raízes de C. mollis, nas doses administradas, e período estudado não apresentaram
toxicidade materna ou nem causaram teratogenicidade na prole das fêmeas tratadas. Portanto,
podemos considerar que o seu uso é seguro durante o período gestacional.
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