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Katharina Carla Santos de Oliveira
Desenvolvimento de um biosensor potenciométrico,
à base de soja, para determinação de uréia
_______________________________________
Dissertação de Mestrado
Natal/RN, fevereiro de 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
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Katharina Carla Santos de Oliveira
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR
POTENCIOMÉTRICO, À BASE DE SOJA, PARA A
DETERMINAÇÃO DE URÉIA
Dissertação realizada sob a orientação do Prof.
Dr.Jailson Vieira de Melo, apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química da
UFRN em preenchimento parcial dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo
Natal /RN
2008
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Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / SISBI / Biblioteca Setorial
Especializada do Centro de Ciências Exatas e da Terra – CCET.
Oliveira, Katharina Carla Santos de.
Desenvolvimento de um biossensor potenciométrico, à base de soja, para a
determinação de uréia / Katharina Carla Santos de Oliveira. – Natal, 2008.
119 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.
1. Biossensor potenciométrico – Dissertação. 2. Membrana enzimática –
Dissertação. 3. Grãos de soja – Dissertação. I. Melo, Jailson Vieira de. II. Título.
RN/UF/BSE-CCET CDU: 543.062
Ao meu filho Thael
Aos meus pais, Neuma e Benigno pela paciência que tiveram.
Aos meus irmãos Arlei, Kare e Fernanda pelo apoio e motivação
AGRADECIMENTOS
Dirijo o meu mais sincero agradecimento...
A Deus, que nos fortalece nos momentos mais difíceis.
Ao Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo pelo apoio, confiança, paciência, incentivo e
orientação, tornando possível o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marconi Floripe Ginani e a Prof.
a
Maria de Fátima Vitória de Moura
pelos
relevantes comentários e sugestões no exame de qualificação;
A Débora Carvalho de Lira, pela longa amizade e com quem eu tive o privilégio de
trabalhar. E a Hirla Cunha pelo apoio recebido on-line.
A Cipriano pela colaboração com os seus conhecimentos e pela disponibilidade
demonstrada em todos os momentos solicitados.
A Paula, Ângela, Eliane, Isabel Daniela Cristiane e todos os amigos da Analítica.
Aos funcionários do Departamento de Química pela atenciosa e amigável forma com
que sempre se dirigem aos alunos.
Aos funcionários da Biblioteca Central e Setorial de Química, cuja eficiência só nos faz
enriquecer.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), à Pró- Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte (PPPg-UFRN) pelo suporte financeiro dado a este trabalho.
"A mais alta das torres começa no solo."
Provérbio Chinês
RESUMO
Neste trabalho, o alvo em estudo foi o desenvolvimento de um biossensor
potenciométrico para detecção de uréia, a partir da urease extraída de grãos de soja.
Inicialmente, fez-se um estudo quimiométrico, através de um planejamento fatorial 2
4,
objetivando-se encontrar condições ótimas para a extração da urease sem que suas
propriedades fossem afetadas. A partir deste estudo, determinaram-se as melhores
condições para a obtenção de extratos ricos em urease, permitindo a confecção de
biossensores com boas características. Estes foram confeccionados usando um
eletrodo de platina como transdutor com a urease dispersa em matriz de quitosana e
reticulada em vapor de glutaraldeído. Os biossensores obtidos apresentaram um limite
de detecção de uréia igual a 0,33 mM e faixa linear entre 0,33 e 3 mM do substrato. O
tempo de resposta foi considerado alto, principalmente, em concentrações baixas do
substrato, onde se levou cerca de 5 minutos por análise. Para concentrações altas
esse tempo foi reduzido para pouco mais de um minuto. O tempo de vida foi limitado
pela aderência da membrana enzimática ao transdutor, mas foi possível manter o
biossensor com funcionamento por um mês com cerca de 50 medidas realizadas. A
aplicação do biossensor para análises de fertilizantes à base de uréia apresentou
excelente resultado para uma amostra com poucos interferentes, mas foi diferente
quando o fertilizante utilizado era oriundo de uma amostra complexa. Porém o rótulo
não expressava se o teor de nitrogênio era totalmente proveniente da uréia. Uma
avaliação dos parâmetros cinéticos da reação catalítica do biossensor mostrou
coerência com os resultados expostos na literatura.
Palavras-Chave: Biossensor potenciométrico. Membrana enzimática. Grãos de soja
ABSTRACT
In this work, the objective in study was the development of a biossensor
potencyometric for urea detection, starting from the extracted urease of soy grains.
Initially, was made a chemometrics study, through a planning factorial 2
4
, objectified to
find great conditions for the extraction of the urease without its properties were
affected. Starting from this study, the best conditions were determined for the obtaining
of rich extracts in urease, allowing the biossensors making with good characteristics.
These were made using a platinum electrode as transducer with the dispersed urease
in chitosan head office and reticulated in glutaraldehyde vapor. The biossensors
obtained presented a limit of urea detection the same to 0,33 mM and lineal strip
between 0,33 and 3 mM of the substratum. The time of answer was considered loud,
mainly, in low concentrations of the substratum, where it was taken about 5 minutes by
analysis. For high concentrations that time was reduced for not more than one minute.
The time of life was limited by the adherence of the enzymatic membrane to the
transducer, but it was possible to maintain the biossensor with operation for one month
with about 50 accomplished measures. Application of the biossensor for analyses of
fertilizers to the urea base presented excellent result for a sample with few interfering,
but it was different when the used fertilizer was originating from of a complex sample.
Even so the label was not expressed the text of nitrogen it was totally coming of the
urea. An evaluation of the kinetic parameters of the catalytic reaction of the biossensor
showed coherence with the results exposed in the literature.
Keywords: Biossensor potencyometric. Enzymatic membrane. Soy grains.
LISTA DE FIGURAS
2.1 Esquema de um biossensor.
24
2.2 Modelo de reação entre a enzima e o glutaraldeído.
58
2.3 Estrutura monomérica dos biopolímeros.
60
4.1 Variação de pH no extrato de soja para uma concentração de uréia
igual a 6,25 mM em diferentes temperaturas
79
4.2 Resposta da atividade enzimática dos extratos de soja para uma
concentração de uréia igual a 6,25 mM.. 81
4.3 Representação geométrica dos resultados.
87
4.4 Gráfico de probabilidade acumulada. 90
4.5 Gráfico de probabilidade acumulada, em destaque os efeitos que se
encontram no limite de significância 91
4.6 Resposta da atividade enzimática do extrato de soja em função do pH. 91
4.7 Potencial do eletrodo de platina em tampão com diferentes valores de
pH.
92
4.8 Sistema de montagem para o eletrodo modificado
93
4.9 Visão geométrica das respostas do biossensor confeccionado a partir
da enzima purificada
95
4.10 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a
concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão 6,5 fosfato em
diferentes temperaturas
96
4.11 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a
concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes
pH.
97
4.12 Modelo de reticulação da enzima associada ao glutaraldeído e
quitosana
99
4.13 Média da diferença de potencial em relação à porcentagem do extrato
enzimático em filmes com diferentes quantidades do extrato de soja (8) e
quitosana, com a concentração de uréia igual a 0,065 mM em tampão
fosfato pH 6,5.
100
4.14 Resposta do biossensor elaborado com extrato de soja com a
concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes
temperaturas.
101
4.15 Curva de calibração com 0,2M de uréia em pH 6,5 para o biossensor
enzimático a partir da soja imobilizada.
102
4.16 Representação linear da curva de calibração para o biossensor
enzimático a partir da soja imobilizada.
102
4.17 Resposta de medidas sucessivas do biossensor confeccionado com
80% de extrato de soja para a concentração de uréia igual a 6,25 mM em
tampão fosfato 6,5 a 30
o
C.
103
4.18 Relação entre o tempo de resposta e resistência após sucessivas
medidas em um biossensor imobilizado pela soja com uma concentração
de 6,0 mM em tampão fosfato pH 6,5.
104
4.19 Gráfico com o tempo de resposta do biossensor com 80% do extrato
de soja em diferentes concentrações de uréia em tampão fosfato pH 6,5 a
30
o
C.
105
4.20 Variação da resposta em função do tempo, para os mesmas condições
de análise com diferentes espessuras de membranas enzimática:(a) 10 μL,
(b) 5 μL (c) 15 μL.
106
4.21 Resposta do biossensor enzimático a base de 80% do extrato de soja
utilizando concentrações distintas do substrato em pH 6,5 a 30ºC. Nos
sentidos crescente e decrescente da ordem de adição dos substratos.
107
4.22 Curva de calibração utilizando o filme a partir do extrato de soja em
tampão fosfato pH 6,5 a 30
o
C.
109
4.23 Representação gráfica da linearização da equação de Michaelis-
Menten.
110
4.24 Curva de calibração a partir dos resultados experimentais modificados
pela equação de Michaelis-Menten
111
LISTA DE QUADROS
1 Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado
25
2.2 Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados a transdutores
eletroquímicos.
32
2.3Combinações típicas bioreceptor/transdutor e seu respectivo sinal.
36
2.4 Tipos de transdutores eletroquímicos.
37
2.5 Principais técnicas de imobilização na construção de biossensores.
55
LISTA DE TABELAS
3.1 Fatores usados com seus respectivos valores dos níveis superiores e
inferiores.
67
3.2 Condições estabelecidas para o preparo dos 16 extratos.
68
4.1 Matriz de planejamento 2
4
, incluindo as interações de 1
a
, 2
a
, 3
a
e 4
a
ordem entre os fatores.
80
4.2 Ensaios experimentais para as análises realizadas no planejamento
fatorial 2
4
com suas respectivas respostas em (R
1
e R
2
) em duplicata, além
da média das respostas e desvios
81
4.3 Valores dos efeitos principais e interação dos fatores.
84
4.4 Respostas dos valores obtidos experimentalmente e os calculados pelo
modelo estatístico.
90
4.5 Condições de planejamento e resultados obtidos na análise do
biossensor com o uso da enzima purificada.
94
4.6 Efeitos do biosensor manufaturado pela urease pura comercial.
95
4.7 Avaliação da proporção extrato de soja/quitosana nas membranas
enzimáticas.
109
4.8 Porcentagem do teor de uréia contido em dois tipos de fertilizantes.
108
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético;
FET Transistores de efeito de campo;
ENFETs Biossensores potenciométricos com efeito de campo;
ISFET Transistores de efeito de campo a íons;
LD Limite de detecção;
ISEFET´s Transdutores, com efeito, em campo sensível a íons;
ISES´s Eletrodos de íons seletivos de íons;
LN Limite Nernstiano;
PIM Polímeros de impressão molecular;
PNA Ácidos nucléicos peptídicos;
Apts Aptâmeros;
DNA Ácido desoxirribonucléico;
RNA Ácido ribonucléico;
LD Limite Nerstiniano;
LN Limite de detecção
[E] Enzima;
[ES] Substrato;
[P] Produto;
pH log da concentração de H+;
Ka Constante de equilíbrio do ácido;
E
t
Concentração total da enzima;
K
m
Constante de Michaelis-Menten;
R Constante dos Gases;
pKa - log de Ka;
E
o
Potencial padrão da célula;
T Temperatura absoluta,
z
x
Carga iônica;
a
x
Atividade do íon x.
pH-FET Transistores de efeito de campo sensível a íons utilizados
para leitura de pH;
BioFETs Transistores de efeito de campo biomodificados
enzimaticamente;
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.
20
1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
21
2 REVISÃO DA LITERATURA.
23
2.1 BIOSSENSORES. 23
2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES 24
2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES. 27
2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES. 28
2.4.1 Tipo de interação.
29
2.4.1.1 Sensores biocatalíticos.
30
2.4.1.2 Sensores de bioafinidade.
33
2.4.2 Sistema de transdução.
35
2.4.2.1 Transdutor eletroquímico.
37
2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS.
37
2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos
39
2.5.1.1 Estabilidade.
39
2.5.1.2 Sensibilidade.
40
2.5.1.3 Tempo de resposta.
41
2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA.
42
2.6.1 Métodos Enzimáticos.
44
2.7 ENZIMAS.
45
2.7.1 Cinética enzimática.
46
2.7.2 Atividade enzimática.
49
2.7.3 Fatores que modificam a cinética enzimática.
49
2.7.3.1 Influência da concentração do substrato.
50
2.7.3.2 Influência da concentração da enzima.
50
2.7.3.3 Influência de ativadores.
51
2.7.3.4 Influência dos inibidores.
51
2.7.3.5 Influência da temperatura.
51
2.7.3.6 Influência do pH.
52
2.7.3.7 Influência do sistema tampão.
53
2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA.
53
2.8.1 Técnicas de imobilização.
54
2.8.1.1 Imobilização por oclusão.
56
2.8.1.2 Imobilização por adsorção.
56
2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente.
57
2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada
57
2.9 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO COM O USO DA
QUITOSANA E DO GLUTARALDEÍDO
59
2.9.1 Quitosana.
59
2.10 CARACTERIZAÇÃO DA UREASE OBTIDA A PARTIR DA
FONTE VEGETAL GLYCINE MAX.
61
2.10.1 Urease.
61
2.10.1.1 Características gerais da urease.
61
2.10.1.2 Principais fontes de urease.
61
2.10.1.3 Ativadores e inibidores da urease.
62
2.11 PLANEJAMENTO FATORIAL.
62
3 METODOLOGIA.
66
3.1 PLANEJAMENTO FATORIAL
66
3.2 PREPARO DOS EXTRATOS E MEDIDA DA ATIVIDADE DA
UREASE.
67
3.3 CONSTRUÇÃO DE UM BIOSSENSOR POTENCIOMÉTRICO
A PARTIR DO EXTRATO DE SOJA.
69
3.4 OBTENÇÃO DA RESPOSTA.
70
3.5 A AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO NERNSTINIANO DO
ELETRODO DE PLATINA.
71
3.6 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA.
71
3.7 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DO PH.
71
3.8 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES
72
3.8.1 Soluções iniciais.
72
3.8.2 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 6,5
73
3.8.3 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 7,4.
73
3.8.4 Preparação da solução de quitosana
73
3.8.5 Aquisição das amostras: soja e fertilizantes.
74
3.8.6 Preparação das amostras de fertilizante
74
3.9 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO
KJELDAHL
75
3.10 ESTUDO DO TEMPO DE VIDA DO ELETRODO.
75
3.11 ESTUDO DO TEMPO DE RESPOSTA.
75
3.12 ESTUDO DA REPRODUTIBILIDADE DAS AMOSTRAS.
76
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.
78
4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DO EXTRATO DE
SOJA.
78
4.1.1 Efeito da temperatura sobre a resposta enzimática no
extrato de soja
78
4.1.2 Avaliação das melhores condições para obtenção dos
extratos de soja. 79
4.1.2.1 Planejamento fatorial 2
4
79
4.1.2.2 Representação geométrica dos resultados.
86
4.1.2.3 Análise por meio dos gráficos normais.
87
4.1.2.4 Modelo estatístico.
88
4.1.3 Escolha do extrato.
90
4.1.4 Atividade enzimática em função do pH.
91
4.2 CONFECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOSSENSOR.
92
4.2.1 Comportamento Nerstiniano no eletrodo de platina.
92
4.2.2 Imobilização enzimática da urease pura.
92
4.2.2.1 Efeito da temperatura sobre a resposta do
biossensor.
96
4.2.2.2 Influência do pH.
96
4.2.3 Imobilização enzimática do extrato de soja.
97
4.2.4 Influência da temperatura sobre a resposta do
biossensor com a membrana de extrato de soja
100
4.2.5 Limite de detecção e faixa linear da resposta
101
4.2.6 Reprodutibilidade dos dados
103
4.2.7 Tempo de resposta
104
4.2.8 Tempo de vida dos biossensores
105
4.2.9 Avaliação da histerese do biossensor
107
4.3 APLICAÇÃO DO BIOSSENSOR NA ANÁLISE DE
FERTILIZANTES
108
4.4 CINÉTICA ENZIMÁTICA
109
5 CONCLUSÕES
113
5.1 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS
113
REFERÊNCIAS
115
Capitulo 1
Uma longa viagem de mil milhas inicia-se com o movimento de
um pé.
[Lao-Tse]
Capitulo 1- Introdução
20
1 INTRODUÇÃO
Ao longo das últimas décadas, os avanços nos campos da medicina, biologia
clínica, indústria agro-alimentar e no controle ambiental têm exigido o
desenvolvimento de métodos analíticos cada vez mais precisos. Os biossensores
proporcionam, sem dúvida, uma alternativa muito atraente por serem constituídos de
sistemas simples, com detecção rápida, seletiva e de baixo custo e também por
permitir uma aplicação vasta, sobretudo com cooperação interdisciplinar. Seu
potencial de aplicação é amplo, de modo que inúmeras pesquisas vêm sendo
desenvolvidas, em várias partes do mundo, no sentido de aperfeiçoar essa
tecnologia. A realização de congressos específicos de âmbito internacional e a
publicação de revistas especializadas revelam a importância que se tem dado ao
tema, nos últimos anos. Outros inúmeros exemplos, com mesma relevância, sobre
possíveis aplicações dos biosensores ainda poderiam ser citados. Contribuindo para
o melhor entendimento do assunto desta dissertação, nos capítulos seguintes, serão
apresentados da seguinte forma: O terceiro capítulo abordará diversos assuntos, de
cunho teórico, a respeito do mundo dos biossensores incluindo os diversos sistemas
de transdução, aplicações, etc. O quarto capítulo descreverá, em detalhes, a
metodologia utilizada em todas as etapas do trabalho. No quinto capítulo serão
apresentados os resultados obtidos com as principais observaçõese conclusões
retiradas da interpretação de cada um deles. O sexto capítulo traz um resumo das
principais conclusões obtidas sobre este trabalho.
O objetivo deste trabalho é desenvolver um biossensor potenciométrico para
medidas de uréia, utilizando-se urease de extratos de soja imobilizada em matriz de
quitosana.
Capitulo 1- Introdução
21
1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Estudar a viabilidade de materiais como grafite, aço inoxidável e platina para o
desenvolvimento de transdutores;
• Determinar o comportamento Nerstiniano do transdutor utilizado;
• Encontrar, através de um planejamento fatorial 2
4
, os efeitos de parâmetros como
EDTA, glicerol, e pH de extração e análise sobre a atividade da urease em extratos
de soja;
• Estudar a influência da proporção entre o extrato de soja/quitosana na estabilidade
da enzima no biossensor;
• Avaliar os parâmetros como estabilidade, temperatura e pH ótimo, faixa linear de
resposta, etc., do biossensor desenvolvido, além de suas constantes cinéticas;
• Aplicação do biossensor na determinação de uréia em fertilizantes.
Capitulo 2
"Deus não recebe respostas com palavras." [Lao-Tse]
Capitulo 2- Revisão da Literatura
23
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BIOSSENSORES
Os biossensores são dispositivos que possibilitam a conversão de uma resposta
biológica em um sinal elétrico, arranjados com base em substâncias como enzimas,
anticorpos, DNA, ou seja, o elemento de reconhecimento biológico do biossensor
será uma substância bioativa, cuja função é determinar, de forma seletiva, as
concentrações de diversas substancias em vários campos da ciência (RAYMUNDO,
2002). O primeiro biossensor construído, para analisar a glicose, desenvolvido por
Clark e Leons (MAAREF et al., 2006) em 1962 foi comercializado a partir de 1975,
com glicose oxidase. Neste caso, a enzima oxida a glicose produzindo um sinal
proporcional à concentração do oxigênio consumido. O termo biossensor só aparece
na literatura científica, no final dos anos 70, quando se desenvolveu um dispositivo
utilizando microorganismos vivos imobilizados em uma superfície de um eletrodo
sensível ao íon amônio. Este dispositivo detectava o aminoácido arginina, o qual foi
denominado sensor bio seletivo ou biossensor. Este termo ainda hoje é utilizado
para designar a união entre um material biológico e um transdutor. A partir desse
momento houve um crescimento de suas aplicações em campos distintos da
química analítica, com interesse mais recente nos campos de análises ambientais,
químicas e farmacêuticas.
Nos anos seguintes, desenvolveram-se muitos outros eletrodos enzimáticos para
substâncias específicas de grande interesse clínico, mediante a junção de enzimas
apropriadas a sensores eletroquímicos. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007) Desta
maneira se verifica que o número de publicações na forma de artigos científicos,
revisões e patentes sobre biossensores desenvolvidos, nos últimos anos, tem se
elevado, o que reflete o grande de interesse despertado pelo tema na comunidade
científica (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Este capítulo é dedicado à revisão
bibliográfica e aprofunda a definição de biossensores, bem como exemplifica suas
principais características.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
24
2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES
Por definição, um biossensor é uma ferramenta analítica composta de um
elemento biológico sensível chamado bio receptor intimamente ligado a um sistema
transdutor. O bio receptor deve ser capaz de reconhecer especificamente uma
substância alvo presente em um meio complexo, graças a seu sítio ativo
particularmente seletivo (ALFAYA; KUBOTA, 2002; MELO et al., 1999). A interação
específica entre o sítio ativo e a substância alvo, em um sinal elétrico mensurável.
Portanto, um biossensor tem como finalidade produzir um sinal proporcional à
concentração da espécie a ser detectada ao interagir como o bio receptor. Um
esquema de um biossensor pode ser visto na Figura 2.1 o qual mostra os
componentes constituintes dos dispositivos completo. Dependendo do bio receptor e
da sua reação com o substrato, diferentes transdutores podem ser utilizados para
sua confecção (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006) como mostra o Quadro 2.1.
Figura 2.1: Esquema de um biossensor
Fonte:
http://biologia-isa.blogspot.com
Capitulo 2- Revisão da Literatura
25
O princípio de um biossensor baseia se na detecção de um composto de
interesse específico para análise. O resultado dessa união produz uma variação das
propriedades físico-químicas como pH, composição, concentração, transferência de
elétrons, de calor, mudança de potencial, de massa, variação das propriedades
óticas, etc. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007; RUIZ, 2006) que é detectada pelo
transdutor. Este sistema transforma o sinal químico em um sinal elétrico indicando a
presença do analito correlacionando sua presença, na amostra (id)
Tipos de
Transdutores
Descrição
Ópticos O sinal formado é devido às interações entre o analito e a
energia radiante
Eletroquímicos O sinal formado é devido a uma interação eletroquímica entre o
analito e o elétrodo
Piezoelétrico Dispositivos que transformam a diferença de massa que ocorre
sobre o eletrodo modificado com propriedades piezoelétricas
Térmicos Dispositivos capazes de medir a diferença de temperatura
Quadro 2.1: Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado
Fonte: (RUIZ, 2006)
Dentre os transdutores mais utilizados encontram-se os térmicos (RICK et al.,
1978) e os eletroquímicos, e dentre os eletroquímicos podem se destacar os
amperométricos (COSNIER; LAMBERT; STOYTCHEVA, 2000; CHO; HUANG, 1998;
PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), e os potenciométrico (PEREIRA; SANTOS;
KUBOTA, 2002).
Um biossensor amperométrico mede a corrente produzida durante a oxidação de
um produto ou de um reagente a um potencial constante. Embora esse tipo de
sensor tenha um tempo de resposta rápida e boa sensibilidade, sua especificidade
pode ser comprometida pela seletividade parcial do bio-eletrodo. Desse modo, a
amostra pode necessitar de uma prévia preparação, separação ou alguma
compensação para a emissão correta dos sinais. Os biossensores potenciométricos
Capitulo 2- Revisão da Literatura
26
relacionam o potencial elétrico à concentração do analito usando os eletrodos íons-
seletivos ou gás seletivo (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006).
Um aspecto de crucial importância na fabricação de um biossensor é o método
de deposição da macromolécula biológica, em grande quantidade, sobre o
transdutor, com retenção de sua atividade e especificidade. Por essas razões, um
grande número de diferentes procedimentos de imobilização já foi investigado
empregando-se procedimentos como a adsorção física, ligação covalente ou
microencapsulação da biomolécula em diferentes matrizes (TUNER; KARUBE;
WILSON, 1987).
Cada um desses métodos apresenta vantagens em relação à
atividade enzimática, estabilidade, custo e facilidade de manipulação.
O desenvolvimento dos biossensores tem se centrado, principalmente, no campo
de diagnósticos clínicos, como exemplo os biossensores para glicose (ORTIZ;
PABELLO; PIETRINI, 2007), e, apesar deste interesse, não há uma saída desses
dispositivos dos laboratórios para a fabricação e comercialização, em larga escala,
para satisfazer as exigências do mercado. Salvo algumas exceções, devido a uma
série de obstáculos relacionados, principalmente, com as características do próprio
mercado (legislação, inércia metodológica, capacidade de absorção, etc.).
O uso de diferentes tecnologias, implicadas no desempenho e na construção de
biossensores, tem permitido amenizar algumas das dificuldades técnicas
inicialmente apresentadas. Um exemplo disso são as diferentes combinações de
seus componentes. Esses dispositivos estão classificados de acordo o tipo de
interação, entre o elemento de reconhecimento do analito e o método para identificar
essa interação. Muitos artigos, publicados, nos últimos anos, relatam a detecção de
uréia por métodos de imobilização do tipo enzimáticos (LUO; DO, 2004). Esses
dispositivos também podem ser utilizados na determinação de vários compostos
tóxicos, por apresentar facilidade de utilização e rapidez na obtenção das respostas.
Alguns sensores enzimáticos têm aplicações diretas na análise de toxinas, como por
exemplo, os fenóis podem ser detectados pelos biossensores baseados em uma
phenol oxidase (SOLDATKIN et al., 2000).
Os estudos de eletrodos modificados com enzimas são amplamente divulgados
na literatura, uma vez que esses apresentam a vantagem de diminuir o limite de
detecção e aumentar a seletividade das determinações (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).
Capitulo 2- Revisão da Literatura
27
No entanto, a pesquisa sobre biossensores enzimáticos não se restringe apenas à
utilização de enzimas purificadas, visto que é possível a utilização de tecidos de
plantas ou animais, que contêm uma multiplicidade de enzimas (PEREIRA;
SANTOS; KUBOTA, 2002).
2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES
As características desejadas em relação aos biossensores (ORTIZ; PABELLO;
PIETRINI, 2007) estão apresentadas abaixo:
• Alta sensibilidade: Capazes de detectar quantidades inferiores aos limites
exigidos por leis, incluindo concentrações de partes por bilhão (
μ
g/l) como no
caso de resíduos de praguicidas.
• Alta seletividade: O dispositivo interage exclusivamente com o composto de
interesse e não com outros que apresentam propriedades similares, sem
interferências com substâncias da mesma família.
• Alta confiabilidade: Sistemas que não sejam alterados pela amostra e não
apresentem grandes problemas de ruídos.
• Tempo de vida: A estabilidade química, física e mecânica do elemento de
reconhecimento condiciona a duração dos componentes biológicos devido à
sua própria natureza, geralmente com limitado tempo de vida.
• Baixo custo de produção: Em geral, estes sistemas podem ser fabricados em
escala industrial, mas, apesar disso, a disponibilidade limitada de algumas
enzimas e existência de fases críticas em sua construção (processo de
imobilização) dificultam, em alguns casos, a fabricação desses dispositivos
em massa.
• Baixa Manutenção: Biossensores que incorporam moléculas biológicas
podem apresentar estas características, mas os componentes biológicos
podem necessitar de condições especiais de controle (pH, temperatura) para
seu uso e conservação devido a sua baixa estabilidade.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
28
• Manejo sem técnicos especializados: Esta tecnologia não requer pessoal
qualidade, pois quando portáteis tornam-se possíveis realizar análise em
tempo real. Esta característica é especialmente interessante, no controle de
processos, ou análises clínicas, pois permitem a verificação e correção dos
parâmetros desejados de forma imediata e automática.
• Tempo de análise: O ideal que o tempo de análise seja curto e possibilite uma
resposta rápida.
• Pré-tratamento das amostras: Geralmente não são necessários, mas em
certas determinações, são imprescindíveis como etapas de concentração e
purificação. Estas permitem eliminar as interferências e assegurar a presença
de uma quantidade suficiente do analito mesmo utilizando um pequeno
volume.
• Miniaturizaveis: Graças ao desenvolvimento da microeletrônica e da
nanotecnologia se têm reduzido bastante as dimensões, permitindo o uso de
vários dispositivos em um mesmo sistema realizado assim várias tarefas ao
mesmo tempo. Também é aplicável onde o tamanho físico do dispositivo, o
volume da amostra e a localização da medida são fatores limitantes.
• Capacidade de multi-análise: Alguns tipos de biossensores operam com a
determinação de diferentes analitos de forma simultânea.
Por existir uma ampla variedade de biossensores distintos, nem todos possuem
as características citadas anteriormente. A combinação de vários desses dispositivos
poderia proporcionar, a muitos destes dispositivos, algumas vantagens frente às
técnicas de análise convencionais como a cromatografia, espectrometria, etc.
2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES
A escolha do material para eletrodo base, cuja superfície sofre modificações, faz
parte de um dos elementos chave na preparação de biossensores. Os materiais
utilizados podem ser desde o ouro, platina, pasta de carbono vítreo reticulado,
Capitulo 2- Revisão da Literatura
29
materiais plásticos condutores entre outros tipos de substratos menos usuais.
(PEREIRA et al. 2002). A preferência pelo substrato deve levar em conta as
características apropriadas adequadas ao método de imobilização a ser utilizado.
2.4.1 Tipo de interação
Dependendo do tipo de interação os biossensores podem ser classificados em
sensores biocatalíticos ou sensores de bioafinidade.
2.4.1.1 Sensores biocatalíticos
Este tipo de biossensor utiliza biocatalisadores constituídos por enzimas ou
sistemas multi-enzimáticos isolados, organismos celulares, células completas de
tecidos animais ou vegetais (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). A seguir veremos
a descrição de alguns dos elementos de reconhecimento do tipo biocatalítico. Estes
elementos de reconhecimento podem acoplar-se a distintos tipos de transdutores
como eletroquímicos, ópticos e termométricos.
Enzima
Em uma reação catalisada por uma enzima há uma união do substrato em uma
região especifica de sua estrutura denominada de centro ativo, que compreende um
sítio de ligação e um sítio catalítico. Uma vez formados os produtos, a enzima se
recupera podendo começar um novo ciclo de reação. Em ocasiões, pode ser
necessária a presença de cofatores para que a enzima possa se regenerar (ROVER
JUNIOR, L. et al., 2001). A atividade enzimática é controlada normalmente pelo pH,
a força iônica, a temperatura e a presença de cofatores. Sua estabilidade é um fator
limitante para o tempo de vida do biossensor do tipo enzimático.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
30
Células completas
Neste caso, em vez de purificar as enzimas, utiliza-se como elemento biológico,
uma célula completa que possui em seu interior sistemas multi-enzimáticos em meio
natural, sendo capaz de utilizar células modificadas geneticamente. A utilização de
células completas oferece uma sensibilidade ampla à variedade de substâncias de
ocorrência natural ou mesmo sintética. Além disso, a própria célula fornece o
mecanismo de transdução que vincula o reconhecimento molecular de uma
substância de teste a um evento mensurável pelo observador humano; podem estar
relacionadas células bacterianas, fúngicas, protozoários ou células provenientes de
organismos superiores e podem ser viáveis ou não (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI,
2007). Células viáveis podem metabolizar diversos compostos orgânicos dando
lugar ao surgimento de distintos produtos como amônio, dióxido de carbono e ácidos
que podem ser monitorizados com o uso de transdutores específicos. São utilizados
para detectar a presença de compostos relacionados ao metabolismo como
vitaminas, açucares e ácidos orgânicos ou compostos nitrogenados. Também são
úteis para detectar compostos que inibem a respiração microbiana como
contaminantes ambientais ou substâncias tóxicas.
A maior limitação em se utilizar células completas está na difusão dos substratos
e produtos através da membrana celular que resulta em uma resposta mais lenta
comparada com os sensores baseados em enzimas purificadas. Esta limitação pode
ser suprimida mediante a permeabilização da membrana por meio de métodos
físicos como tratamentos que permitem a formatação de poros nas membranas,
facilitando a difusão de moléculas pequenas e retendo a maior parte dos compostos
macromoleculares, como o caso das enzimas, dentro das células. Como
conseqüência desses tratamentos a célula torna-se viável, pois serve como uma
fonte enzimática intracelular. Pode-se utilizar para aplicações que não requerem
regeneração celular de cofatores ou respiração metabólica como é o caso de
aminoácidos, de enzimas, oxidases e invertases, etc. Outra limitação das células
completas, em comparação com as enzimas purificadas, é que elas têm uma menor
especificidade devido a reações catalisadas por outras enzimas presentes.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
31
Organismos subcelulares
Os organismos subcelulares podem conter determinados sistemas enzimáticos
completos, mas não possuem todos componentes presentes em uma célula
completa (ROVER JUNIOR, L. et al., 2001) como é o caso de cloroplastos
completos, tilacoides ou mitocôndrias. Mitocôndrias e cloroplastos são organismos
que cobrem as membranas que possuem sistemas enzimáticos relacionados com a
obtenção de energia do interior da membrana. Determinados agentes tóxicos como
praguicidas, metais pesados ou detergentes atuam sobre estes sistemas
enzimáticos inibindo, de modo que as membranas internas desses organismos
podem ser utilizadas como biossensores para detectar este tipo de compostos.
Tecidos
Existem determinados vegetais que, devido à sua função fisiológica no
organismo, são uma fonte de enzimas ou sistemas enzimáticos. Podem ser
utilizados tecidos distintos como folhas, raízes, frutas ou sementes, preparados e
homogeneizados (LOUZADA et al., 2004). Apesar de haver uma tendência recente
de utilização de tecidos de vegetais e/ou extratos brutos no lugar de enzimas
purificadas na confecção de biossensores e/ou procedimentos enzimáticos de
análise.
O uso de extratos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar, em alguns
casos, certa desvantagem na seletividade do método analítico (VIEIRA et al., 2004),
demonstrados na Quadro 2.2. Mas, por outro lado, são extremamente econômicos e,
geralmente, possuem tempo de vida superior àqueles métodos que utilizam enzimas
purificadas, visto que estas enzimas naturalmente imobilizadas nas células destes
matérias biológicos (habitat natural) são mais estáveis e geralmente possuem o seu
cofator disponível (FATIBELLO; VIEIRA, 2002). O Brasil tem uma grande variedade
de vegetais que se podem constituir em fontes inesgotáveis de enzimas para ser
aplicados nas mais diversas áreas do conhecimento.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
32
Vantagens Desvantagens
Baixo custo Limitada
seletividade
Simplicidade na construção Resposta lenta
Elevada estabilidade Baixa sensibilidade
Evitam processos de extração e purificação de enzimas
Não requerem a adição de cofatores de regeneração
enzimática
Vida útil apropriada
Atividade elevada
Quadro 2.2: Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados e transdutores eletroquímicos
2.4.1.2 Sensores de bioafinidade
A interação entre o analito de interesse e o elemento de reconhecimento, sem
que exista transformação catalítica é a base para o entendimento dos sensores de
bioafinidade (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Para medir a interação, onde não
existe consumo de substratos nem a geração de produtos, se podem utilizar um
marcador no receptor.
O inconveniente deste tipo de sistemas é que se requerem alguns passos
posteriores como limpeza e separação do excesso de moléculas marcadas e a
adição de substratos.
Existem distintos tipos de receptores de bioafinidade como anticorpos, lectinas,
células completas, ácidos nucléicos, PIMs, aptâmeros e PNAs.
Anticorpos
A maior parte dos biossensores de bioafinidade baseia-se nas reações de união
de antígenos a anticorpos específicos. Um anticorpo é uma proteína que se une, de
maneira seletiva, a uma molécula complementar denominada antígeno que, neste
caso, corresponde ao analito. A detecção de cada antígeno requer a produção de
um anticorpo particular, seu isolamento e, em algumas ocasiões, sua purificação
Capitulo 2- Revisão da Literatura
33
(DAMOS et al., 2004). Em geral, o antígeno e o anticorpo são espécies
eletroquimicamente inertes e, portanto, o imunosensor eletroquímico requer um
marcador que será útil para monitorar a reação de afinidade (RICCARDI et al.,
2002). Nesse sentido, o anticorpo ou o antígeno deve ser marcado com enzima,
constituindo então o conjugado.
A especificidade e afinidade da interação antígeno-anticorpo determinam a
seletividade e sensibilidade do imunosensor, assim como a possibilidade de
regeneração. Na prática, para alcançar uma sensibilidade adequada é necessário
que o complexo tenha uma alta afinidade, sendo difícil sua dissociação, porque
esses sistemas possuem um único uso. Não obstante, o anticorpo pode regenerar-
se por dissociação dos complexos mediante a aplicação de agentes distintos que
mudam as condições do meio e favorecem esta dissociação, porém, em alguns
casos, essas condições prejudicam a estrutura do anticorpo.
Receptores moleculares
As interações de reconhecimento molecular são eventos importantes
considerando-se os aspectos biológicos. Este tipo de afinidade entre biomoléculas
tem sido bastante investigado, nos últimos anos (FERREIRA, 2006) Nas membranas
celulares existem distintos receptores moleculares, além de proteínas de ligação que
podem imobilizar-se em diferentes superfícies e ser utilizadas como elementos de
reconhecimento associados aos diversos transdutores. Existem proteínas
transportadoras que formam canais que podem acoplar-se a membranas lipídicas
sintetizadas de maneira artificial. A união do analito a estes receptores produz a
formação de canais através dos quais se gera um fluxo de íons que se pode
monitorar mediante tipos distintos de transdutores eletroquímicos (ORTIZ;
PABELLO; PIETRINI, 2007).
Células completas
As células completas oferecem uma grande sensibilidade a muitas substancias
natural ou sintética, além de detectar um grande número de compostos químicos
dentro de um intervalo maio de pH e temperatura (id.). Nas células existem
receptores moleculares de membrana, as quais se unem a um ligante
Capitulo 2- Revisão da Literatura
34
correspondente emitindo respostas fisiológicas amplificadas como a abertura de
canais iônicos, a ativação de sistemas mensageiros secundários e a ativação de
enzimas que podem ser monitoradas por transdutores distintos. Estes tipos de
receptores apresentam afinidade por compostos relacionados estruturalmente,
tornando-se interessantes para a detecção de multi-analitos.
Lectinas
As lectinas pertencem a um grupo de proteínas, que se unem de maneira seletiva
e reversível a alguns sacarídeos como os oligossacarídeos, que se encontram nas
paredes celulares das bactérias. São moléculas facilmente disponíveis e econômicas
que podem associar-se a transdutores como os piezoelétrico (id.).
Ácidos nucléicos
O comportamento eletroquímico do DNA e os efeitos de sua adsorção sobre
diversos tipos de eletrodos vêm sendo pesquisados (LA-SCALEA; SERRANO;
GUTZ, 1999). Os biossensores para análise de DNA baseiam-se no processo de
hibridização quando ocorre a união de uma cadeia de DNA com sua cadeia
complementar, também conhecido como gene chips, utilizados para o
reconhecimento e quantificação de DNAs nas amostras de interesse. Este processo
pode ser realizado em dissolução de suportes sólidos e em seguida utilizam
marcadores específicos que se unem às seqüências híbridadas, como marcadores
fluorescentes ou enzimáticos. Podem acoplar-se em sistemas de transdução ópticos,
gravimétricos e eletroquímicos. São utilizados para a detecção de organismos
modificados geneticamente e microorganismos patógenos.
Polímeros de impressão molecular
Polímeros de impressão molecular ou PIMs (“Moleculary Imprinted Polymers”)
são matrizes sintetizadas artificialmente que apresentam, em teoria, a capacidade de
reconhecer e interagir de forma específica com determinados compostos. A
biomimetização de interações bioquímicas é um dos maiores desafios em várias
áreas da ciência (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005), tornando-se uma
ferramenta promissora para o desenvolvimento de sistemas com reconhecimento
Capitulo 2- Revisão da Literatura
35
biomimético semelhante aos sistemas específicos enzima-substrato e/ou antígeno-
anticorpo. Suas principais vantagens em relação aos materiais biológicos estão na
possibilidade de síntese em situações onde nenhuma biomolécula se encontra
disponível ou em ambientes adversos, nos quais biomoléculas naturais não
resistiriam, como na presença de ácidos, bases, íons metálicos, solventes orgânicos,
altas temperaturas e alta pressão.
Aptâmeros
Os aptâmeros (Apts) são pequenas moléculas capazes de reconhecer e ligar-se
a proteínas-alvo com afinidade e especificidade muito elevadas (FAROKHZAD et al.,
2006).
Por ser uma seqüência de oligonucleotídeos (DNA ou RNA) de cadeia
simples sintetizada artificialmente, são capazes de reconhecer diversas moléculas
com afinidade e especificidade elevadas (FERIOTTO et al., 2001). Estas moléculas
se assemelham aos anticorpos, adquirindo uma conformação determinada podendo
unir-se ao analito (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).
Ácidos nucléicos peptídicos
Os ácidos nucléicos peptídicos ou PNAs são outro tipo de moléculas sintéticas
que mimetizam o DNA-RNA. Logo, sua estrutura é muito similar a estes ácidos
(FERIOTTO et al., 2001). Estão formados por um esqueleto de monômeros (N-2-
aminoetilglicina) unidos por ligações peptídicas com bases nitrogenadas. A diferença
dos ácidos nucléicos para os PNAs é ausência de pentoses nos grupos fosfato. A
principal vantagem dessas moléculas, frente a seus análogos naturais e sua grande
afinidade para estabelecer ligações com cadeias de DNA. (ORTIZ; PABELLO;
PIETRINI, 2007).
2.4.2 Sistema de transdução
Existem múltiplos elementos de reconhecimento e sistemas de transdução.
Teoricamente, esses componentes admitem diversas combinações. Na prática, a
Capitulo 2- Revisão da Literatura
36
escolha do material biológico depende das características do composto que se
pretende analisar. No sistema de transdução, o transdutor é o elemento que
converte as variações das propriedades físicas ou químicas, que se produzem pela
interação entre o elemento de reconhecimento e o analito em um sinal
(PEREIRA;
SANTOS; KUBOTA, 2002). Sua escolha está condicionada ao tipo de elemento a
ser reconhecido, o qual determina que a variação das propriedades físico-químicas
ocorra devido às interações (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007), ver Quadro 2.3. O
sinal gerado pelo transdutor, em alguns casos, não pode ser interpretado
diretamente e se faz necessário à utilização de um software para seu
processamento (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).
Bioreceptor Sinal transmitido Tipo de transdutor
Conversão de substrato
Sensores
eletroquímicos
Consumo de substrato Potenciométrico
Geração de produto enzimático Amperométrico
Consumo de cofator
Sensores
termoquímicos
Produção de calor em decorrência da
conversão enzimática
Emissão de luminosidade Sensores ópticos
Anticorpos e material
genético
Enlace de antígeno
Massa
Sensores SAW,
BAW
Constante dielétrica
Sensores
capacitivos
Índice de refração Sensores SPR
Complexão seletiva de íons
Sensores
eletroquímicos
Ionóforos naturais Diferença de Potencial Potenciométrico
Quadro 2.3: Combinações típicas bioreceptor/transdutor e seu respectivo sinal.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
37
3.4.2.1 Transdutor eletroquímico
Os transdutores eletroquímicos transformam o sinal produzido pela interação
entre o sistema de reconhecimento e o analito detectado em um sinal elétrico,
proporcionando uma informação analítica quantitativa ou semiquantitativa específica.
O elemento de reconhecimento biológico e o elemento de transdução devem estar
em contato. Diferenciam em quatro tipos de transdutores eletroquímicos: os
condutimétricos, potenciométricos, amperométricos e impedimétricos, como
mostrado na Quadro 2.4. A pesquisa sobre transdutores potenciométricos recobertos
com um filme enzimático, cuja resposta baseia-se na reação da enzima com um
substrato orgânico ou inorgânico, que produz uma espécie sensível ao eletrodo,
cresceu consideravelmente com o passar dos anos. Esses transdutores podem ser
recobertos por uma camada enzimática que reage com o substrato, cofator ou
inibidor em ensaio (COUTO; MONTENEGRO, 2000).
Transdutor Tipo de medida
Condutimétrico Variação na medida de condutância
Potenciométrico Diferença do potencial elétrico
Amperométricos Corrente gerada pela redução ou oxidação das espécies
eletroativas
Impedimétrico Aumento da impedância
Quadro 2.4: Tipos de transdutores eletroquímicos
2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS
A potenciometria, como processo de detecção, passou por uma ampliação, nas
últimas duas décadas, com estabelecimentos de novos tipos de sensores e
diferentes tipos de acoplamento e processos de construção (id.). Desenvolvidos em
Capitulo 2- Revisão da Literatura
38
ambientes acadêmicos, esses dispositivos analíticos foram pioneiros, tanto em
desenvolvimento quanto na produção em escala comercial (RUIZ, 2006).
Os eletrodos íons seletivos podem ser definidos como sensores eletroquímicos
que respondem à atividade iônica de acordo com a equação proposta por Nernst:
E = E
0
±
RT/z
x
F ln (a
x
) (1)
No qual E
o
é o potencial padrão de redução da célula, R, a constante dos gases, T, a
temperatura absoluta, z
x
a carga iônica e a
x
a atividade de íon x que se deseja
determinar. O sinal da equação é positivo quando x é um cátion e negativo quando x
é um anion. A resposta é considerada como nernstiana sempre que o potencial do
eletrodo for proporcional ao logaritmo da atividade do íon em questão, mesmo
quando o valor da proporcionalidade não seja exatamente 2,303RT/zF. Para z = 1,
essa constante é igual a 59,1 mV a 25°C, porém são referidos como nernstianos
valores até 55,0 mV, devido às condições em que cada determinação é feita, o
termo subnernstiano é usado quando o valor está abaixo de 55 mV e super
nernstiano quando for maior que 60 mV. O íon primário é íon para o qual o eletrodo
foi construído, sendo que a maioria dos eletrodos é mais seletiva a uma espécie em
relação às outras (ROVER JUNIOR, 1995).
No método potenciométrico, o tempo de resposta é definido com o tempo em que
o eletrodo leva, quando ocorre uma mudança instantânea, na atividade do analito,
para variar em 1 mV a partir do potencial de equilíbrio; este tempo de resposta
depende das condições experimentais usadas, e envolve vários parâmetros. Um
gráfico, ou curva de calibração é aceito como a representação da diferença de
potencial entre o eletrodo íon seletivo e o eletrodo de referência (com valores
positivos no eixo das ordenadas) contra o logaritmo da atividade ou concentração do
íon primário na célula medida (eixo das abscissas).
O limite de detecção LD é definido como sendo a menor quantidade de analito
medida pelo eletrodo e o limite nernstiniano LN como parte da curva que apresenta
a resposta linear para dada faixa de concentração ou atividade do analito. A grande
variedade de eletrodos íon seletivos baseiam-se nas propriedades de diferentes
tipos de membranas, as quais são definidas com uma base finita no espaço
Capitulo 2- Revisão da Literatura
39
separando duas outras fases e exibindo resistência à interação de diferentes
espécies (RUIZ, 2006).
Os transístores com efeito de campo sensível a íons (ISEFET’s) e suas
modificações com membranas seletivas também incluem o grupo de sensores (id.) e
foram, inicialmente, propostos por Bergveld em 1970. A maior parte das referências
bibliográficas sobre este tipo de detector refere-se a pH-FET’s, transistores de efeito
de campo, biomodificados enzimaticamente, que permitem a determinação de
variações de pH provocadas por reações enzimáticas
(id.), fundamentalmente
destinadas ao controle de processos biotecnológicos e clínicos (COUTO;
MONTENEGRO, 2000; ROVER JUNIOR, 1995). Os Biossensores potenciométricos
que utilizam a creatinina têm diversas desvantagens, uma das quais é a interferência
devida à amônia e outras substâncias iônicas. Outro inconveniente é que a resposta
é muito não-linear, devido às mudanças induzidas no pH e na temperatura
provocarem a diminuição drástica da atividade e estabilidade da enzima
(PREMANODE; TOUMAZOU, 2006).
2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos
As características mais importantes em um biossensor potenciométrico são: a
estabilidade, o tempo de resposta e a sensibilidade. Atualmente, os projetos
eletroquímicos têm sido mais explorados devido à sua simplicidade e possibilidade
de se construir biossensores de baixo custo (CONN; STUMPF, 1976).
2.5.1.1 Estabilidade
A estabilidade pode ser por fatores principais como:
Capitulo 2- Revisão da Literatura
40
Tipo de imobilização
Os eletrodos como enzimas imobilizadas fisicamente, apresentam-se mais
estáveis por menores intervalos após sucessivas determinações
(RUIZ, 2006).
Imobilizações por métodos químicos produzem eletrodos mais estáveis e com maior
tempo de vida útil, devido às ligações mais efetivas entre a enzima e o suporte,
diminuindo a lixiviação da camada enzimática (ALFAYA; KUBOTA, 2002).
Geralmente, eletrodos com enzima solúvel são usados por cerca de uma semana
sendo possível a execução de 25 a 50 determinações sob determinadas condições,
desde que sejam bem acondicionadas quando fora de uso, sob refrigeração.
Quantidade e pureza da enzima
A estabilidade aumenta com a espessura enzimática, porém ocorre a elevação
do tempo de resposta. Quanto mais espessa a camada de enzima, mais difícil a
difusão dos íons gerados. Há uma quantidade crítica de enzima pura ou de alguma
fonte natural que propicie uma resposta nernstiana. (RUIZ, 2006) Às vezes, é mais
vantajoso elevar a quantidade da enzima, principalmente, quando a mesma não é
purificada.
Condições experimentais
Fazem parte da otimização do sistema o estabelecimento de parâmetros como
temperatura, pH, tipo de tampão, concentração dos substratos e outros, levando-se
em conta também a estabilidade do sensor base quando se utilizam eletrodos de
curto tempo de vida (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).
2.5.1.2 Sensibilidade
A sensibilidade de um biossensor está associada às características do sensor
utilizado. Logo, a escolha de um transdutor e as condições operacionais adequadas
para a determinação analítica influencia diretamente no desempenho de acordo com
o nível de concentração.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
41
2.5.1.3 Tempo de resposta
O tempo de resposta está associado à difusão do substrato através da
membrana enzimática e a difusão do produto formado até a superfície da membrana
do sensor base. Os principais fatores que modificam o tempo de resposta são:
Velocidade de Agitação
A velocidade de difusão do substrato é alterada pela agitação da solução. A
resposta do eletrodo, valor da diferença de potencial está associado à velocidade de
transferência de massa do substrato para o eletrodo e também à velocidade de
transferência de massa do produto para fora do eletrodo. Maior velocidade de
agitação fornece potenciais mais reprodutíveis como o menor tempo de resposta
desde que esta se mantenha constante.
Concentração da enzima
Um aumento na quantidade de enzima pode levar a um aumento no tempo de
resposta do sensor. Isso se deve ao fato de que o aumento na espessura da
membrana dificulta a difusão do substrato na mesma. É aconselhável a utilização de
enzimas com alta atividade, permitindo a obtenção de membranas enzimáticas mais
finas e permeáveis.
Membrana de diálise
Em muitos casos, as membranas de diálise servem para proteger as enzimas
prolongando a vida útil do biossensor. O tempo de resposta é modificado pela
variação da espessura dessas membranas de diálise.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
42
2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA
A uréia é o principal produto final do metabolismo das proteínas dos mamíferos,
dos anfíbios e de algumas espécies de peixes (CONN; STUMPF, 1976). Gerada no
fígado dos humanos é a principal fonte de excreção do nitrogênio pelo organismo,
difundida através da maioria das membranas celulares. A amônia em excesso além
do exigido para a biossíntese dos compostos nitrogenados, é convertida em uréia
que é excretada pela urina (CONN; STUMPF, 1976)
A dosagem da uréia no sangue é medida para avaliar doenças renais e
hepáticas, sendo um importante parâmetro no diagnostico aplicado como indicador
da função renal. Sua determinação é um dos exames mais solicitados em
laboratórios clínicos, permitindo avaliar a função renal juntamente com a
determinação da creatina (ROVER JUNIOR, 1995 ; CONN; STUMPF, 1976).
Em um indivíduo saudável, sua concentração varia de acordo com diferentes
fatores , tais como o conteúdo protéico da dieta e a hidratação, sendo o rim um dos
principais responsáveis pelo balanço hídrico corporal (TSAI; DOONG, 2004).
Níveis elevados de uréia no sangue e na urina são sinais patológicos de
insuficiência renal. Para pacientes que sofrem de doenças renais crônicas a diálise e
o transplante de rins são essenciais para o sustento da vida (id.).
O nível de uréia no sangue de um ser humano saudável e normal encontra-se
situado entre 10.2 e 49.8 mg dl
-l
, já a concentração para pessoas com doenças
agudas e crônicas pode variar até 720-900 mg dl
-l
e 300-420 mg dl
-l
,
respectivamente (LUO e DO, 2004). A determinação da concentração de uréia no
efluente dialisado é usada extensamente como um marcador para o monitoramento
de moléculas tóxicas durante a diálise.
A uréia pode ser sintetizada industrialmente a partir de amônia e de dióxido de
carbono. É utilizada em resinas, produtos farmacêuticos, como fonte de nitrogênio
não protéico para ruminantes e em fertilizantes nitrogenados (BARHOMI et al., 2006;
SUZUKI; MATSUGI, 2005).
O primeiro biossensor para uréia consistia de urease fisicamente imobilizada em
gel de poliacrilamida (GUILBAULT; MONTALVO, 1969) na superfície de um eletrodo
Capitulo 2- Revisão da Literatura
43
seletivo de amônio. Este eletrodo respondia a mudança na concentração de uréia
entre 5.10
-5
e 1.10
-1
M, com o tempo de resposta de 35 segundos e tempo média de
vida de 14 dias (RUIZ, 20006).
Silva et al. (apud NETO et al., 1994) mediram a uréia em amostras sorológicas
usando um eletrodo sensível a gás amônia e imobilizado pelo extrato enzimático da
leguminosa Canavalia marítima com o glutaraldeído na superfície do eletrodo no
qual se obtiveram respostas na concentração variando entre 0,25 a 9,25 mM.
Deng et. a.l (Ibid DENG et al. ,1991) utilizaram feijão de soja como fonte natural
de urease na determinação de uréia em um estudo comparativo entre 5 espécies
diferentes de feijões, utilizando eletrodos sensores a gás carbônico e amônia.
Srivasvata et. a.l., (SRIVASTA; KAAYASHA, 2001) utilizando sementes de
pigeompea fixadas em grânulos de gelatina através da reticulação com
glutaraldeído, observou que a urease extraída mostrou uma melhor resposta em pH
7,3 a 6,5. Os grânulos obtidos foram usados para a preparação de um novo
biossensor de uréia com um tempo de resposta de menos de 2 minutos e menos
que 14 amostras de uréia puderam ser medidas dentro de uma hora. Os grânulos
foram usados para analisar a quantidade de uréia em amostras clínicas dos
laboratórios de patologia. Os resultados obtidos com o biossensor foram similares
àqueles obtidos com os vários métodos geralmente empregados.
A urease obtida de feijões de soja foi a primeira enzima a ser cristalizada em
1926, por J. B. Sumner (apud. WHITAKER, 1972).
Eletrodos contendo urease
imobilizada em sensores empregados em medidas de pH, como o de vida e de
antimônio-óxido de antimônio
(FATIBELLO; VIEIRA, 2002; GUILBAULT et al., 1991)
foram construídos para a determinação de uréia em urina. Outros biossensores
propostos envolvem o monitoramento do dióxido de carbono, produzido na reação
enzimática, com um eletrodo potenciométrico de membrana de Teflon (id.).
As determinações da uréia podem ser realizadas com o uso de diferentes
técnicas, em que as mais conhecidas são (ROVER JUNIOR, 1995):
1. Método manométrico: baseado em medidas de reações que consomem ou
produzem gases. É considerado preciso com erro de aproximadamente 1%
porém não é usado para determinações de pequenas quantidades de uréia.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
44
2. Método gravimétrico: são muito elaborados e de alto custo, porém devido à
sua precisão e exatidão, podem ser utilizados como métodos de referência.
3. Método cromatográfico: sua principal é a determinação quantitativa baseada
numa reação especifica dispensando o uso de aparelhos ou reagentes
especiais utilizados especificamente para amostras sorológicas.
4. Método espectrofométrico: é baseado na reação da uréia com
diacetilmonoxina em meio fortemente ácido.
5. Método enzimático: São os mais utilizados nas rotinas dos laboratórios
clínicos para a determinação enzimática de uréia, onde os mais usados são
aqueles que utilizam a hidrólise da uréia como ilustra a equação abaixo.
(NH
2
)
2
C=O + 3H
2
O
⎯⎯→←
urease
2NH
+
4
+ CO
2
+ 2OH
-
(2)
2.6.1 Métodos Enzimáticos (Op.cit. ROVER JUNIOR, 1995)
Os métodos enzimáticos na determinação da uréia podem ser subdivididos em:
1. Métodos condutométricos: Têm como base o aumento da condutividade é
relacionado à concentração inicial da uréia.
2. Métodos espectrofotométricos: A amônia formada na degradação
enzimática da uréia é geralmente quantificada pelo reagente de Nessler
(VOGEL, 1981) ou pela reação de Berthelof (id.) e ainda podem ser
determinadas pela reação com uma reação com glutamato (ROVER
JUNIOR, 1995).
3. Método volumétrico: Esta metodologia consiste na conversão de uréia em
carbonato de amônio através da urease e uma quantificação antes e
depois da conversão por meio de uma titulação ácido-base usando o
alaranjado de metila como indicador.
4. Método potenciométrico: A maioria dos métodos eletroquímicos para a
determinação de uréia combina a seletividade enzimática com a
sensibilidade das tecnologias de detecção poteciométrica. Com o aumento
Capitulo 2- Revisão da Literatura
45
na degradação os íons bicarbonato e hidroxila, podem ser detectados,
respectivamente, ou por eletrodos íons seletivos a amônio, ou por
eletrodos sensores a gases (gás carbônico ou amônia) ou ainda eletrodos
de membrana de vidro (id.).
Em todos os casos há uma relação logarítmica
entre o sinal obtido e a concentração de uréia.
2.7 ENZIMAS
As enzimas são proteínas que catalisam reações químicas, nos seres vivos
(FATIBELLO; VIEIRA, 2002; ORTIZ et al. 2007), e possuem um centro ativo, onde
se processam as reações com determinados substratos. Esse centro ativo é
geralmente constituído de alguns resíduos de aminoácidos da cadeia de proteína e
um grupo não-protéico, sendo responsável pela atividade biológica. Algumas
enzimas dependem somente da sua própria estrutura protéica para exercer sua
atividade, enquanto outras necessitam também de um ou mais componentes não
protéicos chamados de cofatores, que podem ser íons metálicos ou moléculas
orgânicas denominadas de coenzimas, mas, muitas enzimas dependem de ambos
(FATIBELLO; VIEIRA, 2002). Enzimas são, portanto, na sua maioria, proteínas que
catalisam com grande eficiência reações biológicas. Essas aceleram várias reações
metabólicas importantes para a vida sob condições fisiológicas de pH, temperatura,
meio iônico, etc.
As reações catalisadas por enzimas há muito tempo vêm sendo usadas com
diferentes propósitos como a determinação de atividades de enzimas, inibidores
entre outros (LUCA; REIS, 2001). Em virtude de sua alta seletividade e poder
catalítico, as enzimas vêm sendo muito empregadas em química analítica, bem
como na medicina, agricultura, tecnologia de alimentos e estudos ambientais
(FATIBELLO; VIEIRA, 2002).
Capitulo 2- Revisão da Literatura
46
2.7.1 Cinética enzimática
(Op.cit.LEHNINGER, 1993)
A teoria inicial foi desenvolvida por Michaelis-Menten, em que segundo seu
modelo, toda enzima E, combina-se com o substrato S a fim de formar um complexo
enzima substrato ES, no qual esse complexo resulta de uma interação entre o sítio
ativo da enzima (E) e a molécula do substrato intermediário ES. Neste caso a
molécula se rompe para formar o(s) produto(s), P, segundo a reação abaixo:
E + S ⎯⎯→←
−1
1
k
k
ES (3)
ES + ⎯⎯→←
−2
2
k
k
E + P (4)
na qual, k
1
, k-1, k
2
e k-2 são as constantes de velocidade. As reações
consideradas reversíveis. A velocidade de reação diminui com tempo t, ou seja, a
velocidade de consumo de substrato ou formação de produto diminui em função do
tempo devido à diminuição da concentração do substrato no decorrer da reação.
A concentração total da enzima, E
t
, é soma da formas livres e combinadas:
[E
t
] = [E] + [ES] (5)
a equação matemática que define a velocidade inicial da reação catalisada por
enzimas está exemplificada como a combinação das etapas (3) e (4):
v
0
=
dt
Pd ][
= k
2
[ES] (6)
Uma vez que, nem k
2
nem [ES] podem ser determinados diretamente utilizamos
a velocidade de formação de ES, a partir de E e S, Sendo (3) representado pela
expressão
Capitulo 2- Revisão da Literatura
47
dt
ESd ][
= k
1
[P] [S] = k
1
([E
t
] – [ES]) [S] (7)
Ainda que ES possa também ser formado a partir de P e E, pela reação inversa
(4), a velocidade dessa reação pode ser desprezada, uma vez que, estamos
considerando o início da reação quando a concentração de um substrato é muito
elevada e a concentração do produto é próxima de zero.
A velocidade de desdobramento de ES é dada por:
dt
ESd ][
−
= (k
-1
+ k
2
) [ES (8)
Assumindo o estado de equilíbrio temos:
k
1
([E
t
] – [ES]) [S] = (k
-1
+ k
2
) [ES] (9)
Rearranjando a equação (9), obtemos:
([S] ([E
t
] – [ES])) [ES] =
1
2
)1(
k
kk
+
−
= K
m
(10)
A constante K
m
é definida como constante de Michaelis-Menten. Deduzindo-se o
valor de [S] da expressão (10):
([ES] =
][
]][[
SK
SE
M
t
+
([E
t
] – [ES])) (11)
Substituindo o termo [S] na equação da velocidade inicial temos:
v
0
= v
2
[ES] = k
2
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+ ][
]][[
SK
SE
m
t
(12)
Capitulo 2- Revisão da Literatura
48
Quando a concentração de substrato é elevada toda a enzima presente no
substrato está sob a forma do complexo ES, logo quando a enzima esta saturada é
alcançada a velocidade máxima, v
máx
, dada por:
[
]
t
Ekv
=
max
(13)
A seguir, e obtida a equação de Michaelis-Menten, para um substrato:
[
]
[]
SK
S
vv
m
máx
+
=
0
(14)
Os valores das constantes cinéticas, K
m
e v
máx’
podem ser obtidos através de um
gráfico v
o
versus [S]. A velocidade inicial de uma reação enzimática é uma função
entre a concentração da enzima e seu substrato, equação (14). Fixando a
concentração da enzima, a velocidade aumenta com a concentração do substrato
até certo ponto quando o excesso de substrato é alcançado e a velocidade se
mantém constante mesmo com a adição do substrato.
O valor de K
m
pode ser inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo
substrato; quanto menor for seu valor, maior será a afinidade. Logo o K
m
pode ser
considerado um parâmetro quantitativo de uma reação enzimática, não dependendo
da concentração da enzima. Seu valor é igual à concentração de substrato a qual a
velocidade inicial da reação é igual à metade da velocidade máxima, sendo
expresso em mol/L.
[]
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
=
máxmáx
m
vSv
K
v
111
0
(15)
Capitulo 2- Revisão da Literatura
49
2.7.2 Atividade enzimática
A velocidade inicial de uma reação enzimática é diretamente proporcional ao
número de sítios ativos presentes, quando a concentração de substrato não está em
níveis de saturação e outras variáveis são otimizadas e mantidas constantes. A
saturação do substrato limita a reação apenas pela concentração da enzima. Nessas
condições, a atividade enzimática pode ser estimada pelo acompanhamento da
velocidade racional (GUILBAULT, 1884; ROVER JUNIOR, 1995).
A atividade enzimática é função direta de suas estruturas terciárias e
quaternárias. Todo tratamento que modifique a conformação da enzima como o
aquecimento, alteração do pH do meio e outros, modificam também a estrutura do
sítio ativo diminuindo suas propriedades catalíticas. (ROVER JUNIOR, 1995) A
unidade de atividade é estabelecida através da medida da velocidade de reação a
partir do substrato consumido numa unidade de tempo e temperatura definidos.
2.7.3 Fatores que modificam a cinética enzimática
Alguns fatores atuam no mecanismo cinético dessas reações, podendo aumentar
ou diminuir a velocidade reacional pela modificação na estrutura dos sítios ativos das
enzimas, alterando assim a atividade catalítica (GUILBAULT, 1884; ROVER
JUNIOR, 1995 ).
Os principais são:
• A concentração da enzima.
• Presença ou ausência de ativadores ou inibidores.
• O pH.
• Temperatura.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
50
2.7.3.1 Influência da concentração do substrato
Para concentrações muito baixas, a velocidade inicial de reação é diretamente
proporcional à concentração do substrato, logo a reação será de 1
a
ordem.
[]
S
k
v
v
m
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
=
.max
(16)
Quando a concentração do substrato é elevada, a reação é considerada de
ordem zero.
vv
=
0
(17)
Nesse caso, a velocidade inicial não depende da concentração do substrato. À
medida que a concentração de substrato vai aumentando, a velocidade inicial da
reação se reduz e apresenta uma ordem mista. Pode ocorrer também a diminuição
na velocidade da reação por uma elevada concentração de substrato ou por causas
como competição ou formação de complexos com duas ou mais moléculas de
substrato combinando-se com o sítio ativo da enzima.
2.7.3.2 Influência da concentração da enzima (ROVER JUNIOR, 1995)
O aumento da velocidade racional pode ser esperado quando há uma elevação
da concentração da enzima, mas em concentrações muito elevadas, essa
linearidade pode ser interrompida, não significando uma queda na atividade, mas
limites no método de detecção. Esses desvios de linearidade podem ser oriundos de
agentes ativadores ou inibidores na preparação das enzimas.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
51
[
]
[]
[]
t
m
E
SK
Sk
v
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+
=
2
0
(18)
2.7.3.3 Influência de ativadores
Ativadores ou cofatores enzimáticos são substâncias que aumentam a
capacidade catalítica. Alguns ativadores são íons metálicos simples como Mn, Cu,
Ca ou podem ser substâncias orgânicas complexas como derivados vitamínicos.
2.7.3.4 Influência dos inibidores
Os estudos de inibição geralmente relacionam a especificidade enzimática,
arquitetura física e química do sítio ativo e mecanismo cinético da reação. O inibidor
é uma sustância que causa uma redução na velocidade da reação catalítica,
reagindo com o próprio catalisador ou com o substrato. As enzimas são sensíveis a
traços de metais podendo, ou não, sofrer um envenenamento irreversível.
2.7.3.5 Influência da temperatura
A reação enzimática consiste em três passos: a formação do complexo enzima-
substrato, a conversão deste em um complexo enzima-produto e a dissociação
deste último em produtos e enzima livre. O efeito total da temperatura na reação
resultará na separação desses três passos individuais. Com o aquecimento, a
energia livre de Gibbs e a entropia associadas, contribuem para os processos
termodinâmicos observados:
Capitulo 2- Revisão da Literatura
52
TdsdHdG
−
=
(19)
Para cada enzima existe uma temperatura ótima para um determinado conjunto
de condições experimentais. A velocidade da reação aumenta na medida em que se
eleva a temperatura. Esse aumento proporciona uma elevação da agitação
molecular e a freqüência de colisão entre as moléculas da enzima/substrato
contribuindo para a desnaturação protéica pela modificação da estrutura espacial da
enzima. Para evitar grandes perdas de atividade as enzimas são acondicionadas à
refrigeração, entre 2 e 5ºC. A temperatura recomendada para se desenvolver
reações enzimáticas é de 25ºC, embora possa aperfeiçoar a mesma de acordo com
as condições experimentais de análise mais satisfatórias. Ainda que muitas enzimas
sejam inativadas em temperaturas acima de 55ºC, algumas enzimas de espécies
termofílicas de bactérias que habitam fontes de água quente apresentam atividade
em temperaturas da ordem de 85ºC.
2.7.3.6 Influência do pH
As enzimas possuem um pH ótimo no qual apresentam atividade máxima sendo
determinadas experimentalmente para cada condição de trabalho. O pH ideal de
uma enzima não é necessariamente idêntico ao pH de seu meio intracelular normal,
que pode estar saturado na parte ascendente ou descendente de seu perfil de
atividade em função do pH. Isso sugere que a inter-relação entre pH e atividade
enzimática pode ser um fato de controle intracelular da atividade da enzima. Os
sítios ativos da enzima são geralmente compostos por grupos ativos ionizáveis, que
devem estar na forma iônica apropriada para manter sua conformação. Meios
fortemente ácidos ou alcalinos contribuem para a desnaturação da enzima,
modificando sua estrutura tridimensional afetando a atividade catalítica.
Capitulo 2- Revisão da Literatura
53
2.7.3.7 Influência do sistema tampão
A reação enzimática é afetada pela mudança no equilíbrio. A atividade de um
sistema enzimático não depende apenas de seu pH, mas também do tipo de solução
tampão a ser utilizada, a qual pode afetar a atividade ou estabilidade da enzima
devido à presença de cargas, ativação aniônica, termodinâmica da reação entre
outros. Para obterem-se resultados reprodutíveis se deve eliminar íons interferentes
e controlar a força iônica para que se assegure a concentração dos reagentes
(id.).
2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA
Como foram explicitados nas seções anteriores, os biossensores enzimáticos
têm sido de fundamental importância dentro da química analítica devido à
possibilidade de associar a seletividade e sensibilidade da enzima com a
simplicidade dos eletrodos eletroquímicos. A etapa fundamental no desenvolvimento
de um sensor é a imobilização e estabilização das proteínas ou enzimas na
superfície da matriz, com intuito de melhorar a estabilidade química dos materiais
responsáveis pelo reconhecimento
(PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). A
imobilização enzimática é o processo em que há o confinamento da enzima no
receptor sobre o transdutor eletroquímico na forma insolúvel sem a perda de sua
atividade
(RUIZ, 2006).
O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante por
proporcionar a reutilização das enzimas, aumentarem a estabilidade e reduzir os
custos. Esses fatores dependem, principalmente, da escolha apropriada do suporte
e dos reagentes utilizados nos processos de imobilização
(OLIVEIRA; VIEIRA,
2006). Vários métodos de imobilização enzimática em diferentes matrizes são
relatados, as mais convencionais se baseiam em técnicas que imobilizam por
ligações covalentes (SAHNEY et al., 2006). Reações enzimáticas de bioprodutos
não iônicos freqüentemente produzem espécies iônicas. Conseqüentemente, uma
Capitulo 2- Revisão da Literatura
54
variedade dos biossensores tem sido utilizada para determinação seletiva de muitas
substâncias, por exemplo, uréia e glucose
(TINKILIC; CUBUK; ISILDAK, 2002)
2.8.1 Técnicas de imobilização
A etapa chave na construção de biossensores é a imobilização do elemento de
reconhecimento sobre uma membrana matriz, que se fixa a superfície do transdutor.
Este material de base pode agir unicamente como suporte do componente biológico
ou participar também da transmissão do sinal do sistema de transdução, por
exemplo, mediante a inclusão de mediadores para a reação redox. A escolha de um
ou outro procedimento depende da natureza do elemento biológico, do tipo de
transdutor, das propriedades físico-químicas do analito e das condições de trabalho
do biossensor. Os métodos de imobilização podem ser resumidos em duas
categorias: retenção física ou ligação química. Entre as técnicas empregadas as
mais conhecidas são as imobilizações por oclusão, adsorção, ligação covalente e a
ligação covalente cruzada (cross-linking). O Quadro 2.5 resume algumas das
técnicas de imobilização empregadas atualmente, bem como suas principais
características (ROVER JUNIOR, 1995).
Capitulo 2- Revisão da Literatura
55
Técnica de
Imobilização
Descrição Matriz Vantagens
Adsorção física
União de ER* em uma
matriz mediante ligações
iônicas, pontes de
hidrogênio e forças de
Van der Waals
Celulose
Gel de silício
Colágeno
Acetato
Baixo custo,
Matriz
regenerável,
Sem
modificações no
ER*.
Entrecruzamento
Uniões irreversíveis dos
ER* entre si, mediante
funções reativas
Reativos: Glutaraldeído
Hexametileno-di-
isociamento, 2,4-dinitro-
benzeno
Custo moderado.
Ligações
Covalentes
Uniões covalentes dos
ER* com grupos químicos
ativados pela matriz ou
diretamente no transdutor
Simples
manipulação,
Estáveis em
condições
extremas.
Atrapiamento
Retenção física dos ER
nas cavidades interiores a
matriz
Géis; agár; nylon
poliacriamida
Matrizes eletródicas
compósitas rígidas:
grafite-teflon ou grafite
resina epóxi
Necessita de
pouca
quantidade de
ER,
Baixo custo,
Proximidade no
ER e no
transdutor.
*ER: Elemento de reconhecimento
Quadro 2.5: Principais técnicas de imobilização na construção de biossensores
Fonte: (ROVER JUNIOR, 1995).
Capitulo 2- Revisão da Literatura
56
2.8.1.1 Imobilização por oclusão
Nesse processo, as moléculas da enzima ficam retidas dentro de uma rede
tridimensional de um polímero insolúvel em água ou dentro de microcápsulas
delimitadas por uma membrana semipermeável, permitindo somente a passagem do
substrato e dos produtos reacionais. Polímeros como PVC, poliacrilamida e
metacrilato, são utilizados e algumas vezes são adicionados amido ou agentes
plastificantes com o propósito de tornar o polímero mais flexível às condições de uso
(id.).
A técnica de microencapsulação consiste na mistura de uma solução aquosa da
enzima com um monômero hidrofóbico provoca a reação de polimerização, levando
à formação de uma membrana ao redor das micro gotículas geradas.
Essa técnica permite que o material biológico esteja em contato com o
transdutor, sem que o mesmo se ligue a matriz
(CONN; STUMPF, 1976), mantendo,
por sua vez, a alta seletividade das enzimas uma vez que não são afetados pelas
mudanças de pH, temperatura e força iônica durante a medida
(RUIZ, 2006).
2.8.1.2 Imobilização por adsorção
No processo de imobilização por adsorção estão envolvidas forças de interação
fracas entre o suporte e a enzima, ligações de Van der Waals e de hidrogênio. A
adsorção consiste na dissolução do agente modificador em solvente apropriado e na
exposição
(PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002),
em geral, por imersão do eletrodo
nesta solução. Inicialmente, os trabalhos envolveram adsorção em eletrodos de
platina (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), porém entre os adsorventes mais
usados está o quartzo, o vidro, o carvão ativo, a sílica gel, a alumina e resinas de
troca iônica (ROVER JUNIOR, 1995)
A maior vantagem desse método reside na simplicidade e no emprego de
condições brandas de imobilização, preservando a atividade enzimática (RUIZ,
Capitulo 2- Revisão da Literatura
57
2006). Desta forma, filmes poliméricos têm sido empregados em sensores ou
eletrodos quimicamente modificados com o intuito de proteger a superfície dos
eletrodos de impurezas, bloquear interferentes, imobilizarem componentes e
fornecer biocompatibilidade (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). Porém, devido
às interações envolvidas, no decorrer do tempo há uma dessorção progressiva das
enzimas, diminuindo assim o tempo de vida útil do biossensor (ROVER JUNIOR,
1995).
2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente
Este método envolve a formação de ligações químicas entre a enzima e grupos
reativos de um suporte. Os suportes são escolhidos por características como
solubilidade, presença de grupos funcionais, estabilidade mecânica e área
superficial. Os mais usados são o vidro poroso, poliestireno, agarose, celulose,
carboximetilcelulose, nylon e outros
(id.).
Esta técnica utiliza quantidades mínimas de enzimas, o inconveniente se
encontra no risco de inativação parcial ou total da enzima no decorrer da reação de
fixação
(id.).
2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada
Nessa técnica, as moléculas da enzima ligam-se entre si por pontes
intermoleculares, utilizando agentes bi ou multifuncionais
(RUIZ, 2006), permitindo
amenizar as perdas de atividade enzimáticas devido a efeitos de difusão
(ROVER
JUNIOR, 1995). Dos reagentes polifuncionais, o glutaraldeído é o mais usado para
esta técnica de imobilização, devido à baixa toxidade e custo quando comparado
com os demais. A reação provavelmente envolve a adição conjugada de amino-
grupos da enzima a ligações etilênicas de oligômeros
β
α
, insaturados, contidos na
Capitulo 2- Revisão da Literatura
58
solução aquosa de glutaraldeído comercialmente usada. As ligações formadas pela
reação entre a enzima e o glutaraldeído são irreversíveis e possuem elevada
resistência às variações de pH e temperatura.
A reação entre a enzima e o glutaraldeído é mostrada na Figura 2.2. Esta técnica
propicia a formação de complexos de alta atividade e grande resistência à
desnaturação, explica por fenômenos de impedimento estérico. A maior
desvantagem é que muitas enzimas são sensíveis à reação alterando sua atividade
catalítica (id.). Desse modo, se deve aperfeiçoar a quantidade de agente
imobilizante para que o processo seja viável numa análise química.
Figura 2.2: Modelo de reação entre a enzima e o glutaraldeído
Fonte: (JUNIOR, L. R. 1995)
Capitulo 2- Revisão da Literatura
59
2.9 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO COM O USO DA
QUITOSANA E DO GLUTARALDEÍDO
Com a possibilidade de inúmeras aplicações, tornou-se vantajoso unir as
propriedades do glutaraldeído com a quitosana, devido à rede polimérica formada
ser capaz de complexar diversos íons metálicos que podem interferir na atividade de
enzimas como a urease, β-glucosidadse, α-amilase, pectinase, fosfalipase,
glucoamilase, lactase, fosfatase, e glucose isomerase (MONTEIRO JUNIOR, 1999).
Devido à complexidade de eventos que ocorrem durante as reações envolvidas
durante a reticulação da quitosana com glutaraldeído, são sugeridos alguns
mecanismos dos quais podem ocorrer a formação de somente uma base de Schiff,
com um grupo aldeído do glutaraldeído, e o outro grupo aldeídico permanece livre, e
é comumente usado para uma reação subseqüente.
Na literatura, foi atribuída a capacidade do polímero em absorver íons metálicos
aos grupos aldeídos formados na interação entre a quitosana e o glutaraldeído
(id.).
Essa interação influência na capacidade da quitosana reticulada com o glutaraldeído
imobilizar certas enzimas com alto grau de reticulação, cuja extensão torna difícil à
determinação.
(id.). Alguns pesquisadores atribuem a adsorção de enzimas e outros
compostos às condições eletrostáticas e hidrofóbicas do polímero (id.).
2.9.1 Quitosana
A quitina é segundo polissacarídeo natural mais abundante encontrado na
natureza presente em grande parte dos animais marinhos, como caranguejos,
lagostas e camarão e em insetos, fungos e leveduras
(id.). A quitosana, biopolímero
de formula geral [C
6
H
11
O
4
]N (MONTEIRO JUNIOR, 1999) é o principal derivado da
quitina obtida através da desacetilação por processo de hidrólise básica. Possui no
Capitulo 2- Revisão da Literatura
60
segundo carbono uma amina primária. A estrutura da quitina e da quitosana é muito
semelhante à estrutura da celulose, ver Figura 2.3.
A quitosana é utilizada na imobilização de enzimas, devido ao percentual de
grupos amino e hidroxila disponíveis em sua estrutura química. Por possuir uma
amina primária no segundo carbono, em comparação à estrutura da quitina e da
celulose, a quitosana apresenta características como uma melhor solubilidade e
reatividade devido ao fato de ser um polieletrólito
(id.), quando dissolvida em meio
ácido. Além de possuir facilidade para a formação de gel, é biodegradável,
hidrofílica, biocompatível e antibactericida. Atualmente a quitosana é bastante
empregada, nas indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de alimentos, por ser
economicamente viável devido a ser abundante na natureza e comumente obtida
por uma sintética simples
(id.). Também é empregada como adsorvente na remoção
de corantes e no tratamento de efluentes industriais
(OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).
Pode ser processado em diversas formas, como flocos, pó fino, grão, esponjas,
fibras, fios e géis
(MONTEIRO JUNIOR, 1999). A quitosana quimicamente
modificada tem sido empregada na adsorção de metais, na imobilização de enzimas
como as creatinase, galactose oxidase, glutamato oxidase, perioxidase, lactato
oxidase, sulfito oxidase (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006)
e na construção de biosensores
(MONTEIRO JUNIOR, 1999).
Figura 2.3: Estrutura monométrica dos biopolímeros: a) celulose b) quitina e c) quitosana
Fonte: (MONTEIRO JUNIOR, 1999).
Capitulo 2- Revisão da Literatura
61
2.10 CARACTERIZAÇÃO DA UREASE OBTIDA A PARTIR DA
FONTE VEGETAL GLYCINE MAX
2.10.1 Urease
2.10.1.1 Características gerais da urease
A urease é uma enzima de alto poder catalítico que hidrolisa a uréia em gás
carbônico e íons amônio. Pode ser encontrada em sementes de plantas,
microorganismos e alguns vertebrados. A urease presente na soja é resistente à
desnaturação de seu próprio substrato sendo capaz de desnaturar outras proteínas
(ROVER JUNIOR, 1995).
2.10.1.2 Principais fontes de urease
A urease encontra-se principalmente em sementes de feijão
(FATIBELLO, 2002)
e, a partir dele foi a primeira enzima a ser cristalizada, 1926, por J. B. Sumner
(apud.
WHITAKER, 1972). Em 1913, a urease extraída de Jack bean foi utilizada para
dosar uréia em amostras de sangue e urina, segundo um processo de aeração para
recolhimento e titulação da amônia resultante
(ROVER JUNIOR, 1995), mas, antes
disso, já se havia constatado a presença de urease em soja.
No Brasil, estudos que especificaram as melhores fontes de urease naturais
(MACHADO, 1958) são:
1. Feijão de soja (Soja hyspida)
2. Semente de melancia (Citrullus vulgaris)
3. Feijão de porco ou Jack bean (Canavalia ensiformis)
Capitulo 2- Revisão da Literatura
62
4. Abóbora moranga (Cucúrbita máxima).
Esta última apresenta a desvantagem de seus extratos desenvolverem
rapidamente elevados teores de amônio, provavelmente devido a outros
mecanismos enzimáticos como arginase, por exemplo. Duas outras fontes também
muito ricas em urease são as da família canavalia, porém de outros gêneros: a
Canavalia marítima e a Canavalia brasiliensis
(id.).
2.10.1.3 Ativadores e inibidores da urease
Como dito anteriormente, já se sabe que a presença de íons metálicos,
geralmente inativa a urease. Estudos concluíram que na determinação
poteciométrica direta do sistema uréia/urease, em condições experimentais
controladas de pH, temperatura, concentração de enzima e substrato, que a
complexação de um agente quelante como cianeto ou EDTA pode eliminar
interferências. A atividade de enzimas imobilizadas tem sido restaurada como o uso
de soluções de EDTA, ou tampões biológicos
(ROVER JUNIOR, 1995).
2.11 PLANEJAMENTO FATORIAL
O planejamento e uma ferramenta imprescindível durante a investigação de
qualquer prática analítica, muito aplicado em pesquisas é classificado como um
método do tipo simultâneo, no qual as variáveis de interesse que realmente
apresentam influências significativas na resposta são avaliadas ao mesmo tempo.
No inicio de um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem
estudadas e efetuam-se experimentos em diferentes valores desses fatores, sendo
realizados experimentos para todas as combinações possíveis dos níveis
selecionados. Torna-se necessário avaliar quantitativamente a influência dessas
combinações sobre a resposta de interesse. Muitas vezes, essas variáveis
Capitulo 2- Revisão da Literatura
63
interagem entre si, podendo prejudicar ou influenciar de forma positiva a obtenção
das respostas. Geralmente um planejamento é realizado com o objetivo de
determinar as melhores condições de obtenção da resposta durante os
experimentos, para fazer isto com o mínimo de experimentos com auxílio de
métodos estatísticos
Alguns cuidados devem ser observados para que se possa obter o máximo de
informação na realização do planejamento fatorial. Dentre estes se encontra a
necessidade de realizar repetições de alguns ensaios para que se possa estimar o
erro experimental. As replicatas devem ser repetições autênticas, devendo
representar adequadamente o espaço experimental no qual o planejamento fatorial
foi desenvolvido. Outro cuidado a ser observado refere-se à realização dos
experimentos. É importante que todos os ensaios e replicatas, previstos no
desenvolvimento do fatorial, sejam realizados de forma aleatória. Esses cuidados
visam evitar distorções estatísticas que possam comprometer a qualidade dos
resultados obtidos e dos efeitos calculados para as variáveis estudadas.
Nos planejamentos experimentais, em que as variáveis são exploradas em 2 níveis é
comum codificá-los usando os sinais (+) e (-). A atribuição destes sinais aos níveis
superiores ou inferiores é feita de forma arbitrária e não interfere na realização dos
experimentos ou interpretação dos resultados, além de permitir esquematizar o
planejamento na forma de matrizes de planejamento.
A matriz do planejamento é a listagem de todas as combinações possíveis entre
fatores e níveis, em um planejamento fatorial completo 2
4
, os experimentos são
realizados para todas as condições possíveis de todos os fatores, nos dois níveis, de
modo que com quatro fatores foram necessários, no mínimo, 16 experimentos para
todas as combinações possíveis
(BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 2003).
Para se estudar o efeito de qualquer fator sobre a resposta é necessário observar
a variação da resposta enquanto de variam os fatores. Isso implica ensaios em que,
pelo menos, variem dois níveis desse fator. Quando não ocorre interação não há
variação entre os fatores.
Para um planejamento fatorial 2
4
, além dos quatro efeitos principais, são
determinados onze efeitos de interação, sendo seis de 2 fatores, quatro de 3 fatores
e um de 4 fatores. A significância do efeito está relacionada com o módulo do valor,
Capitulo 2- Revisão da Literatura
64
portanto, se o sinal encontrado for negativo significa que a resposta cresce à medida
que o fator varia do nível superior para o inferior. A estimativa do erro pode ser
realizada a partir de ensaios em duplicata, para avaliar a significância estatística dos
efeitos. Para isto, a repetição deve ser autêntica em todas as etapas do processo em
estudo, condição que evita o surgimento de erros menores que o real. A essência de
um bom planejamento consiste em projetar um experimento de forma que ele seja
capaz de fornecer uma resposta satisfatória ao tipo de informação que buscamos.
Capitulo 3
"A maneira de fazer é ser."
[Lao-Tse]
Capítulo 3- Metodologia
66
3 METODOLOGIA
A essência de um bom planejamento experimental pode refletir tanto na
aquisição de resultados mais confiáveis quanto na economia de tempo e reagentes,
permitindo, na maioria dos casos, em redução significativa nos custos de muitas
análises.
Neste trabalho o planejamento se deu com a determinação de variáveis que,
potencialmente, interferissem na atividade enzimática. Neste caso, começamos com
um planejamento fatorial 2
4
com a intenção de investigar os efeitos de quatro fatores
(parâmetros) sobre a atividade da urease em extratos de soja no desenvolvimento
de biossensores para detecção de uréia.
A grande vantagem de um planejamento fatorial é o fato do mesmo permitir
avaliar a influência de muitas variáveis ao mesmo tempo, facilitando a otimização da
resposta do sistema em estudo, no sentido de maximizar ou minimizar o tipo de
resposta (BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 2003).
Este capítulo inicia-se pela escolha dos fatores que influenciam na atividade da
urease em extrato de soja, com o intuito de desenvolver um filme enzimático estável,
e com boas propriedades para a construção de um biossensor potenciométrico.
3.1 PLANEJAMENTO FATORIAL
Apesar de a urease ser uma enzima especifica para a decomposição hidrolítica
da uréia, diversos fatores podem interferir nessa reação. Para a aplicação em
biossensores, a estabilidade da enzima é fundamental. Devido aos seus sítios ativos
serem compostos por grupos sulfetos, alguns metais pode formar complexos
irreversíveis, tornando-a inativa na presença da uréia. Outros fatores como pH e
temperatura também podem interferir tanto no desempenho quanto na estabilidade
da enzima. O planejamento inicial deu-se pela determinação da eficiência da urease
obtida a partir da soja (Glycine max), frente a fatores distintos. Os fatores escolhidos
para o planejamento foram: 1) EDTA, devido ao fato de ser um agente seqüestrante
de metais, os quais podem inibir, irreversivelmente, a atividade catalítica da enzima;
Capítulo 3- Metodologia
67
2) glicerol, pelo fato deste já ser usado como estabilizante da enzima; 3) pH,
controlado nas etapas de extração e análise da urease, devido à sua influência no
desempenho enzimático. Os valores (níveis) do pH escolhidos foram,
respectivamente, o pH do ponto isoeletrônico da enzima (6,5) e o pH fisiológico do
sangue humano (7,4). Após a seleção desses fatores, foi realizado um planejamento
fatorial completo 2
4
utilizando os quatro fatores, em dois níveis, com a finalidade de
garantir uma maior estabilidade enzimática no extrato obtido. A Tabela 3.1 mostra os
fatores e seus respectivos níveis no planejamento.
Tabela 3.1: Fatores usados com seus respectivos valores dos níveis superiores e inferiores
Fatores/Nível -1 +1
1°- Glicerol 5% 10%
2°- EDTA 0 0,001 mol.L
-
1
3°- pH de extração – pH
(e)
6,5 7,4
4°- pH de análise – pH (a) 6,5 7,4
3.2 PREPARO DOS EXTRATOS E MEDIDA DA ATIVIDADE
DA UREASE
Os grãos de soja, sem tratamento térmico, foram adquiridos em supermercados
em sua forma bruta. Posteriormente, foram triturados e peneirados. A soja
pulverizada foi armazenada em saco plástico sob refrigeração, proporcionando
condições que garantissem a preservação das propriedades da urease.
A preparação dos extratos de soja seguiu o planejamento fatorial ilustrado na
Tabela 3.2. Pesou-se, inicialmente, 8 amostras de 10 g da soja processada e
transferiu-se para 8 recipientes limpos e secos. Adicionou-se, em seguida, 3,5 mL de
tampão fosfato com o valor de pH solicitado pelo número do ensaio, seguido da
adição do glicerol e/ou EDTA. Após a adição dos fatores mostrados na Tabela 3.1,
cada mistura foi submetida a agitação por 15 minutos e depois mantida em
refrigeração a 4° C por 24 h com o intuito de extrair a enzima para a fase aquosa.
Posteriormente, o extrato obtido foi centrifugado por 15 min em tubos de ensaio
Capítulo 3- Metodologia
68
numerados. Após a separação do líquido sobrenadante contendo o extrato da
enzima, 10 mL foram transferidos para uma célula termostatizada a 30°C.
A resposta deste experimento foi obtida com o uso de um pHmetro conectado ao
sistema através de um eletrodo de vidro e acompanhou-se a variação de pH em
intervalos de tempo de 10s, após a adição de 1mL de solução de uréia a 0,1 mol.L
-1
em tampão fosfato (pH 6,5 ou 7,4).
Os 16 ensaios foram obtidos a partir da combinação entre os 4 fatores em dois
níveis os quais estão apresentados na Tabela 3.2.
Tabela 3.2: Condições estabelecidas para o preparo dos 16 extratos
Ensaio Glicerol
(%)
EDTA
(mol.L
-1
)
pH de Extração
(Tampão)
pH de Análise
(Tampão)
01 5% 0,00 6,5 6,5
02 10% 0,00 6,5 6,5
03 5% 0,001 6,5 6,5
04 10% 0,001 6,5 6,5
05 5% 0,00 7,4 6,5
06 10% 0,00 7,4 6,5
07 5% 0,001 7,4 6,5
08 10% 0,001 7,4 6,5
09 5% 0,00 6,5 7,4
10 10% 0,00 6,5 7,4
11 5% 0,001 6,5 7,4
12 10% 0,001 6,5 7,4
13 5% 0,00 7,4 7,4
14 10% 0,00 7,4 7,4
15 5% 0,001 7,4 7,4
16 10% 0,001 7,4 7,4
Capítulo 3- Metodologia
69
3.3 CONSTRUÇÃO DE UM BIOSSENSOR
POTENCIOMÉTRICO A PARTIR DO EXTRATO DE SOJA.
Nos itens anteriores, foi estudada a influência dos quatro fatores na obtenção de
um extrato vegetal com boa atividade enzimática a partir da soja, com o intuito de
confeccionar um filme rico em urease para a elaboração de um biossensor
potenciométrico para detecção da uréia. Os resultados do planejamento fatorial 2
4
auxiliaram na escolha das melhores condições de obtenção do extrato enzimático a
partir da soja. Em um segundo momento foi examinado materiais como o aço
inoxidável e eletrodos a base de carbono e platina como possíveis sistemas de
transdução para deposição do extrato vegetal escolhido durante o planejamento,
permitindo assim a continuidade, no que se refere à imobilização enzimática, para a
montagem do biossensor.
Para avaliarmos a atividade da enzima no sistema de transdução escolhido,
fizemos um estudo prévio de seu desempenho construindo um biossensor à base de
urease comercial, imobilizada em matriz de quitosana. O estudo começou com um
planejamento fatorial 2
3
controlando-se o número de camadas enzimáticas, ou seja,
a espessura do filme, tempo de exposição da enzima ao glutaraldeído, tempo de
reticulação e o pH de análise. Em balança analítica, pesou-se 0,005 g. da enzima
pura, Urease un. 3,5. 15 type III from Jack Beans. Lote 88F/100 – 45, 300 units/g
solid SIGMA, e diluiu-se em 1 mL da solução de quitosana preservada a temperatura
de 4°C.
Aproximadamente, 10 μL desta mistura foram depositadas na superfície do
eletrodo de platina, com área de 0,3cm
2
, e exposta ao vapor de solução de
glutaraldeído (2,5% v/v) em um sistema fechado, permitindo que o eletrodo de
trabalho estivesse em contado apenas com seu vapor por tempo controlado.
Formando assim 8 filmes, no qual se variou o tempo de exposição do glutaraldeído
(10 a 15 min) e a quantidade de camadas da solução contendo a enzima purificada,
depositada sob o eletrodo de platina, que variavam de 10 a 20 μL. Em seguida, o
eletrodo foi submetido a vácuo, em que um filme foi formado após a remoção da
umidade.
Capítulo 3- Metodologia
70
Em outro momento, foi elaborado um filme enzimático a partir do extrato de soja
escolhido na seção 3.3, com a mesma solução de quitosana preparada
anteriormente, utilizando diferentes concentrações entre a quitosana e o extrato
vegetal, totalizando 8 filmes que variavam de 20% a 80%. Este estudo será
apresentado de forma mais detalhada na seção 4.2.3. O material foi acondicionado e
mantido sob refrigeração a 4°C em Eppendorf. Em seguida, aproximadamente 0,05
mL desse material, depositado na superfície do eletrodo de platina foram submetidos
à exposição do vapor de glutaraldeído e diferentes intervalos tempo. O tempo de
exposição ao glutaraldeído variou entre 10 a 180 min. Após a exposição ao
glutaraldeído, houve a formação de uma biomembrana, seca a vácuo em
temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida foi realizada a leitura em
célula termostatizada a 30°C, na presença de EDTA e glicerol com intuito de
conservar o sistema da membrana para futuras análises. Os dados obtidos a partir
desses experimentos tiveram como finalidade encontrar as melhores condições para
a imobilização da enzima, de modo a garantir a estabilidade do eletrodo e,
conseqüentemente, a reprodutibilidade das respostas produzidas por este.
3.4 OBTENÇÃO DA RESPOSTA
A resposta do biossensor foi considerada como a atividade enzimática da urease
imobilizada no eletrodo de platina após a adição do substrato, para tanto se fez a
associação de um pH-metro, Handy-lab1 Shott, utilizando-se como referência um
eletrodo de Ag/AgCl-KCl saturado e o eletrodo de platina modificado como indicador.
Durante a análise a célula foi mantida em um banho termostatizado com temperatura
controlada a 30°C. Os eletrodos foram imersos em uma solução tampão, e após
atingir a temperatura desejada acompanhou-se a variação do potencial.
Capítulo 3- Metodologia
71
3.5 A AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO NERNSTINIANO
DO ELETRODO DE PLATINA
Este estudo foi realizado da seguinte forma: tomaram-se várias soluções tampão
com valores de pH entre 3 a 11 e se fez a medida do potencial para cada solução,
usando um eletrodo de Ag/AgCl como eletrodo de referência e o eletrodo de platina
como indicador. A partir da curva do potencial versus o pH determinou-se a
inclinação da reta, a constante de Nernst.
3.6 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA
Dentre as limitações dos biossensores enzimáticos em relação às suas
aplicações está a grande sensibilidade da reação catalítica em função da
temperatura. Com o intuito de descobrir a melhor condição de trabalho se fez um
estudo da atividade da enzima em função da temperatura. Para tanto, controlou-se a
temperatura do sistema, entre 20° a 40°C, através de um banho termostático e
verificou-se a diferença de potencial após a adição de uma mesma quantidade do
substrato.
3.7 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DO PH
Outro parâmetro importante a se considerar em relação à atividade enzimática é
o pH. Normalmente a interação enzima-substrato é mais eficiente em um valor de pH
determinado, ou seja, o pH ótimo da reação. Nesse caso, preparamos diferentes
soluções tampão com valores de pH entre 5,5 e 8,5. Tomou-se 15 mL da solução em
uma célula contendo os eletrodos de trabalho e auxiliar e, em seguida, adicionou-se
Capítulo 3- Metodologia
72
1,0 mL da solução de uréia a 0,1M e acompanhou-se a variação do potencial do
potencial. Esta solução foi preparada usando como solvente um tampão fosfato de
pH igual ao da análise.
3.8 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES
3.8.1 Soluções iniciais
1. Monohidrogenofosfato de potássio P.A. (K
2
HPO
4
), marca Vetec a 1,0 x 10
-3
mol.L
-1
para 1 litro: Em um béquer dissolveu-se 0,174g de K
2
HPO
4
em 250
mL de água destinada transferindo-se, em seguida, o conteúdo para um balão
de 1,0 litro e completou-se com água destinada até o menisco.
2. Dihidrogenofosfato de potássio P.A. (KH
2
PO
4
), marca Vetec a 1,0 mol.L
-1
10
-3
mol.L
-1
para 1 litro: Em um béquer dissolveu-se 0,13g de K
2
HPO
4
em 250 mL
de água destinada transferiu-se, em seguida, o conteúdo para um balão de
1,0 litro e completou-se com água destinada até o menisco.
3. Hidróxido de sódio a 1M para 250 mL para ajuste do pH: Em um béquer
dissolveu-se 10g de NaOH em 50 mL de água destinada, transferiu-se o
conteúdo para um balão de 250 mL e completou-se com água destinada até o
menisco.
4. Uréia P.A. (NH
2
CONH
2
), marca Reagen a 0,1M para 50 mL: Em um béquer
dissolveu-se 0,3003g de uréia em 10 mL da solução tampão para cada valor
de pH descrita no item abaixo, transferindo-se o conteúdo para um balão de
50 mL e completando-se com o mesmo tampão até o menisco.
5. Uréia (NH
2
CONH
2
) a 0,2M para 50 mL:
6. Uréia (NH
2
CONH
2
) a 0,01M para 50 mL
Capítulo 3- Metodologia
73
3.8.2 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 6,5
1. Preparo do tampão: Em um béquer colocou-se 250 mL da solução de KH
2
PO
4
e, em seguida, adicionou-se a solução K
2
HPO
4
até que o pH da solução
atingisse o valor 6,5.
2. A solução tampão foi dividida em duas alíquotas. A primeira fração foi
reservada em frascos de vidro âmbar. A segunda fração de 200 mL foi
adicionada 0,074g de EDTA, Ácido etilenodiaminotetracético sal di-sódico
P.A., marca Reagen, obtendo-se uma concentração de 1,0 x 10
-3
M.
3.8.3 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 7,4
1. Preparo da solução tampão: Colocou-se em um béquer de 250 mL a solução
de K
2
HPO
4
e, em seguida, adicionou-se a solução de KH
2
PO
4
até que o pH
atingisse o valor de 7,4.
2. A solução tampão foi dividida em duas alíquotas. A primeira fração foi
reservada em frascos de vidro âmbar e a segunda fração de 200 mL foi
adicionada 0,074g de EDTA perfazendo uma concentração de 1,0 x 10
-3
M.
3.8.4 Preparação da solução de quitosana
A solução de quitosana foi preparada com a adição de 2 gramas de quitosana
(Polymar ltda., Brasil M = 2,9x10
5
-15% de acetilação) em 100 mL de tampão fosfato
em pH 6,0, sob a agitação por 24 h, sendo filtrada e em seguida preservada sob
refrigeração.
Capítulo 3- Metodologia
74
3.8.5 Aquisição das amostras: soja e fertilizantes
Os grãos de soja foram processados, in natura, sem tratamento térmico, e
pulverizados e peneirados até a obtenção de um pó fino, depois foram
acondicionados em saco plástico e mantidos sobre refrigeração. Os fertilizantes
foram adquiridos em lojas especializadas sendo de duas diferentes marcas: Uréia
Agrícola da Murer fertilizante lote 0408155 - 45% de nitrogênio total - e NPK 4.14.8
(N, P
2
O
5
, K
2
O – 4 partes de nitrogênio, 14 partes de fósforo e 8 partes de potássio).
O fertilizante da marca Murer é composto basicamente de uréia, indicando um teor
de aproximadamente de 45% de uréia. O fertilizante do tipo NPK indica na
embalagem um teor de nitrogênio igual a 4%, supondo um teor de uréia de
aproximadamente 8%, já que a embalagem não informava se o percentual de
nitrogênio era proveniente da uréia ou poderia se encontrar sob outra forma.
3.8.6 Preparação das amostras de fertilizante
Foram feitas soluções em tampão fosfato pH 6,5 para as duas amostras de
fertilizantes. Para o fertilizante NPK pesaram-se seis gramas e adicionou-se 20 mL
de tampão fosfato. Posteriormente, submeteu-se a 10min de ultra-som por 10
minutos. Em seguida filtrou-se o material lavando-se o resíduo com solução tampão
em um balão 50 mL que foi aferido com a mesma solução. A solução do fertilizante à
base de uréia foi preparada pesando-se 0,6 gramas do produto que foi diluído em
um balão volumétrico de 50 mL com solução tampão 6,5 .
Capítulo 3- Metodologia
75
3.9 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO
KJELDAHL
Este método é indicado na determinação de nitrogênio em compostos orgânicos,
é baseado na titulação de neutralização
(VOGEL, 1981). 0,1 grama da amostra foi
pesada e adicionada ao catalisador, 2g de sulfato de sódio e 0,05g de sulfato de
cobre, essa mistura foi acondicionada em papel manteiga e transferida para um tubo
de digestão e decomposta em 4 mL de ácido sulfúrico concentrado sob aquecimento
por 4 horas. Após a digestão o líquido foi resfriado, e transferido para o destilador
Kjeldahl, TE-0363 da marca Tecnal, diluído e alcalinizado (40% de NaOH). A amônia
liberada foi destilada e coletada em erlemayer contendo uma solução de ácido
bórico e posteriormente titulada com padrão de ácido clorídrico.
3.10 ESTUDO DO TEMPO DE VIDA DO ELETRODO
O estudo do tempo de vida foi avaliado com três biossensores diferentes. Nesse
estudo acompanhou-se a intensidade da resposta de cada biossensor após a adição
de uma mesma quantidade de substrato, ao longo de vários dias, até sua
desativação completa. Considerou-se a resposta de um dia igual a 100%.
3.11 ESTUDO DO TEMPO DE RESPOSTA
O tempo de resposta foi avaliado em um biossensor a base de 80% extrato de
soja em pH 6,5 a 30°C adicionando-se diferentes concentrações de uréia que
variavam de 0,65 a 6,57 mM. Neste caso, avaliou-se o tempo, após a adição do
substrato, que a resposta voltava a ficar constante, ou seja, tornava-se constante
após a sua variação máxima.
Capítulo 3- Metodologia
76
3.12 ESTUDO DA REPRODUTIBILIDADE DAS AMOSTRAS
Foram realizadas sucessivas leituras no mesmo dia em um mesmo biossensor
obtido a partir de 80% de extrato de soja. Neste caso, em cada repetição adicionou 1
mL de solução de uréia 0,1M a 15 mL de tampão fosfato com pH 6,5.
Capitulo 4
Quando a obra dos melhores chefes fica concluída, o povo diz:
fomos nós que a fizemos.
[Lao-Tse]
Capítulo 4- Resultados e discussão
78
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DO EXTRATO DE
SOJA
4.1.1 Efeito da temperatura sobre a resposta enzimática no extrato
de soja
As enzimas apresentam melhor desempenho catalítico em determinado valor de
temperatura denominada temperatura ótima. Uma das maiores dificuldades quanto à
aplicação dos biossensores enzimáticos é a sensibilidade da resposta em função da
temperatura. Temperaturas muito abaixo da ideal, geralmente, diminuem a
velocidade da reação, enquanto temperaturas superiores podem desnaturar
irreversivelmente a enzima. Com o intuito de descobrir a melhor temperatura para o
desempenho da enzima, mediu-se a resposta catalítica em várias temperaturas. Os
resultados, ver Figura 4.1, mostram um crescimento da resposta até 30 °C com um
decréscimo à medida que a temperatura supera este valor, indicando uma
temperatura ótima em cerca de 30 °C. Esses resultados estão de acordo com os
obtidos por Melo, et al.(MELO et al, 2002).
Os experimentos, na próxima etapa do
trabalho, foram obtidos a uma temperatura constante, controlada através de um
banho termostático modelo Lauda A100.
Capítulo 4- Resultados e discussão
79
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Resposta (mV)
Temperatura
o
C
Figura 4.1: Variação de pH no extrato de soja para uma concentração de uréia igual a 6,25mM em
diferentes temperaturas.
4.1.2 Avaliação das melhores condições para obtenção dos
extratos de soja
Este estudo foi realizado com intuito de descobrir as melhores condições de
obtenção dos extratos de modo a preservar as propriedades da enzima, com a
finalidade de se confeccionar biossensores mais estáveis e sensíveis.
4.1.2.1 Planejamento fatorial 2
4
Em um planejamento fatorial completo de dois níveis, os experimentos foram
realizados para todas as condições possíveis de todos os fatores nos dois níveis, de
modo que com quatro fatores foram necessários, no mínimo, 16 experimentos para
todas as combinações possíveis
(BARROS; SCARMINIO e BRUNS, 2002).
Este trabalho foi realizado com repetição de todas as medidas, visando
determinar o erro experimental.
Capítulo 4- Resultados e discussão
80
Matriz do planejamento 2
4
A matriz do planejamento é representada pela Tabela 4.1, mostra as variáveis
(fatores) utilizadas e seus respectivos valores (níveis), no qual se convenciona (-1)
para o nível inferior e (+1) para o nível superior. Nela são apresentados os dezesseis
ensaios em que cada um deles é resultado da combinação dos quatro fatores e dos
níveis. Os valores 1, 2, 3 e 4 na linha superior representam, respectivamente, os
fatores glicerol, EDTA, pH (e) e pH (a), enquanto os valores 12, 13,... 1234 são as
respectivas interações de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª ordem entre os 4 fatores.
Tabela 4.1: Matriz de planejamento 2
4
, incluindo as interações de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª ordem entre os
fatores
Ensaios 1 2 3 4 12 13 14 23 24 34 123 124 134 234 1234
1
-1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1
2
1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 -1 -1
3
-1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1
4
1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 1 1
5
-1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1
6
1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 1
7
-1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1
8
1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1
9
-1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1
10
1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 1
11
-1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1
12
1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1
13
-1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1
14
1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1
15
-1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1
16
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
A resposta obtida
O parâmetro escolhido como resposta foi a diferença entre a resposta inicial e
final do pH, ou de potencial (mV), após a adição de 1 mL de solução de uréia 0,1
mol.L
-1
. A Figura 4.2 exemplifica como foram calculadas as respostas para todos os
Capítulo 4- Resultados e discussão
81
ensaios. A Tabela 4.2 mostra as respostas obtidas para os 16 ensaios em duplicata
(R
1
e R
2
), além da média das respostas de cada ensaio e a diferença entre ambos.
Figura 4.2: Resposta da atividade enzimática dos extratos de soja para uma concentração de uréia
igual a 6,25 mM
Tabela 4.2: Ensaios experimentais para as análises realizadas no planejamento fatorial 2
4
, com suas
respectivas respostas (R
1
e R
2
) em duplicata, além da média das respostas e desvios.
Ensaio R1 R2 R d = R1-R2
01 1,66 1,51 1,59 0,15
02 1,81 1,61 1,71 0,20
03 1,33 1,70 1,52 -0,37
04 1,76 1,62 1,69 0,14
05 1,89 1,79 1,84 0,10
06 1,68 1,85 1,77 -0,17
07 1,83 2,08 1,96 -0,25
08 2,05 2,04 2,05 0,01
09 1,51 1,43 1,47 0,08
10 1,48 1,46 1,47 0,02
11 1,48 1,42 1,45 0,06
12 1,52 1,45 1,48 0,07
13 1,20 1,16 1,18 0,04
14 1,07 1,06 1,07 0,01
15 1,14 1,09 1,12 0,05
16 1,34 1,38 1,36 -0,04
0 120 240 360 480
7,4
7,6
7,8
8,0
8,2
8,4
8,6
8,8
9,0
pH
Tempo (s)
resposta: 8,7-7,5 = 7,2, variação de pH
Capítulo 4- Resultados e discussão
82
Cálculo dos efeitos
Os quatro efeitos principais foram calculados a partir da diferença entre a
resposta média do nível superior do respectivo fator e a média correspondente ao
seu nível inferior. O calculo é feito multiplicando-se os dados das médias das
respostas da Tabela 4.2 pelos sinais de cada fator ao longo da seqüência de
ensaios da Tabela 4.1 e, em seguida, fazendo-se a soma algébrica. Por último, o
resultado obtido da operação citada anteriormente é dividido por 8.
Resumindo, para se calcular o efeito principal do EDTA (fator 2) sobre a análise
realizada procede-se desta maneira:
EDTA = (1/8).(-1,59 - 1,71 + 1,52 + 1,69 – 1,84 – 1,7 + 1,9 + 2,04 – 1,47 + 1,45 +
1,48 – 1,18 – 1,06 + 1,11 + 1,36) = 0,0663. Os efeitos de interação também foram
calculados da mesma forma.
A interação entre os efeitos é obtida a partir de uma combinação linear do tipo:
1/8
Σ
a
i
R
i,
(20)
Onde R, é a resposta média do ensaio. O coeficiente a
i
pode assumir valores +1 ou -
1 e é encontrado a partir do sinal resultante do produto dos sinais de cada fator no
ensaio correspondente. Assim, para encontrar a
1
na interação de quarta ordem entre
os fatores G, EDTA, pH (e) e pH (a) no ensaio de número 5 basta fazer (G) (EDTA)
(pHe) (pHa) = (-1) (-1) (+1) (-1) = -1.
Para um planejamento fatorial 2
4
, além dos quatro efeitos principais, são
determinados onze efeitos de interação, sendo seis de 2 fatores, quatro de 3 fatores
e um de 4 fatores. A Tabela 4.3 mostra os valores para todos os efeitos encontrados
nos diferentes níveis de interação. A significância do efeito está relacionada com o
módulo do valor, portanto, se o sinal encontrado for negativo significa que a resposta
cresce, à medida que o fator varia do nível superior para o inferior.
Determinação do erro experimental
Um procedimento experimental bem definido é essencial para a obtenção de
dados confiáveis. Os erros sistemáticos podem ser evitados tomando-se a devida
atenção na execução dos experimentos, porém em ensaios que envolvem muitas
etapas, como este em curso, os erros são inevitáveis. Para a estimativa do erro,
Capítulo 4- Resultados e discussão
83
podem-se realizar os ensaios em duplicata, e a partir disto, avaliar a significância
estatística dos efeitos. Para isto, a repetição deve ser autêntica em todas as etapas
do processo em estudo, condição que evita o surgimento de erros menores que o
real.
Como todos os experimentos foram realizados em duplicada, a estimativa da
variância de uma observação individual é dada por:
S
2
=
Σ
d
2
/2N (21)
no qual d é a diferença entre as duas observações correspondentes ao enésimo
ensaio (R
1
-R
2
, ver Tabela 4.2) e N é o número total de ensaios. Substituindo os
valores dos desvios na equação acima e fazendo-se N=16, obtemos s
2
= 0,0107.
Uma estimativa da variância de um efeito pode ser determinada a partir da equação
abaixo:
∑
=
222
σσ
a
y
(22)
Em que σ
-2
é a variância da média das duas observações que é igual a (0,0107/2 =
0,0503) uma vez que o ensaio foi feito em duplicata. O coeficiente
a
para um
planejamento fatorial 2
4
é ± /-1:8, de forma que
2
a = 1/64, para i = 1, 2, 3,... 16.
Para calcular a estimativa da variância de um efeito aplica-se a equação abaixo:
V(efeito) = (16/64) (0,0107) = 0,0013 (23)
O erro padrão é a raiz quadrada de 0,0013 e tem como valor numérico 0,0365. Para
verificar na Tabela 4.3 quais dos efeitos foram significativos procura-se o valor do t
de Student para N = 16 graus de liberdade considerando-se um intervalo de 95% de
confiança para a variância. Os valores dos efeitos inferiores a 0,077, valor que
representa o produto entre o valor do t Student e o erro padrão, não são
considerados significativos. Portanto, analisando a Tabela 4.3, podemos afirmar que
de todos os efeitos principais de primeira ordem, apenas o pH de análise foi
significativo. No entanto, os efeitos principais do glicerol e do EDTA estão próximos
ao limite mínimo de significância, portanto não serão desprezados. Acreditamos que
a baixa influência do EDTA seja devido tanto à pequena quantidade de íons
Capítulo 4- Resultados e discussão
84
metálicos em todas as etapas do estudo, quanto ao fato da enzima se encontrar em
um meio complexo com várias outras substâncias capazes de adsorver ou
complexar metais.
Tabela 4.3: Valores dos efeitos principais e interação dos fatores
Ensaio Média global 0,1,54± 0,01825
Fatores
Efeitos de
1° ordem
1
2
3
4
G
EDTA
pH (extração)
pH (análise)
0,060± 0,0365
0,0663± 0,0365
-0,0062 ± 0,0365
-0,439 ± 0,0365
Interações de segunda ordem
Efeitos de
2° ordem
12
13
14
23
24
34
G e EDTA
G e pH (extração)
G e pH (análise)
pH (extração) e EDTA
pH (análise) e EDTA
pH (extração) e pH (análise)
0,0762± 0,0365
-0,024 ± 0,0365
-0,019 ± 0,0365
0,09± 0,0365
-0,01 ± 0,0365
-0,283± 0,0365
Interações de terceira ordem
Efeitos de
3° ordem
123
124
134
234
G e pH (extração) e EDTA
G e pH (análise) e EDTA
pH (extração) e pH (análise) e G
pH (extração) e pH (análise)
0,055 ± 0,0365
0,0225 ± 0,0365
0,0457 ± 0,0365
-0,031 ± 0,0365
Interações de quarta ordem
Efeitos de 4° ordem
1234
G, EDTA, pH (análise), pH (extração),G e EDTA 0,02625 ± 0,0365
A pouca influência do glicerol, apesar desta substância ser bastante usada como
estabilizante da urease comercial, foi interpretada como sendo devido à enzima já se
encontrar inserida em uma matriz biológica que lhe proporciona alta estabilidade ou,
também, pelo fato da quantidade estabelecida no nível inferior deste fator
proporcionar uma a estabilidade semelhante à do nível superior.
Embora os resultados da Tabela 4.3 não apresentem significância para o efeito
principal do pH de extração, é possível observar, na Figura 4.3, a grande influência
deste fator, porém percebe-se que o mesmo provoca um crescimento da resposta
quando o pH de análise encontra-se em seu nível inferior. No nível superior do pH
(a), o pH (e) apresenta um efeito negativo, refletindo na aparente falta de efeito
Capítulo 4- Resultados e discussão
85
principal. Esta premissa é confirmada pela elevada interação entre o pH (e) e o pH
(a).
Dentre todos os efeitos, o efeito principal do pH (a) foi o mais importante. Como
foi mencionado anteriormente, o melhor desempenho da atividade enzimática foi
obtido em condições controladas dos 4 fatores, além da temperatura de análise.
Uma observação importante neste estudo é que o pH 6,5 facilita as reações de
fermentação do meio durante o processo de extração. Por outro lado, observa-se
uma inversão na intensidade da resposta das amostras analisadas em pH 7,4.
Enquanto o estudo mostra que em pH 7,4 há uma preservação melhor da enzima
durante a obtenção do extrato, se a análise for realizada no mesmo pH a resposta é
menor do que aquela do extrato correspondente obtido em pH 6,5. Interpretamos
este comportamento da enzima como sendo causado pelo fato da extração em pH
7,4 garantir a integridade de uma maior quantidade de enzima, entretanto seria
necessário submetê-la a um pH menor (6,5) para a reativação de uma fração inativa.
Apesar de pequena, observou-se uma interação entre o EDTA e o pH de extração.
Uma análise mais minuciosa das respostas nos mostra que o EDTA funciona apenas
quando a extração é realizada em pH 7,4. Este resultado foi interpretado como
sendo devido ao fato de um pH mais elevado ser favorável à complexação de metais
presentes no meio pelo EDTA.
4.1.2.2 Representação geométrica dos resultados
Como não seria possível apresentar os 16 ensaios em 4 dimensões, colocaram-
se as três primeiras variáveis nos vértices de um cubo, representando um sistema
tridimensional, e a quarta variável pode ser visualizada através da comparação deste
com um segundo cubo, ver Figura 4.3.
Através da representação geométrica é possível observar que o fator 1 (glicerol)
só apresenta importância quanto à análise é realizada no pH 6,5. Este
comportamento pode ser verificado confrontando o nível (-) com o nível (+), que é
observado comparando-se os resultados da fase esquerda com os componentes da
fase direita. No primeiro cubo há um aumento na resposta, enquanto no segundo
Capítulo 4- Resultados e discussão
86
quase não sofre variação quando se aumenta a concentração do glicerol. Esses
resultados indicam que o glicerol só apresenta importância quando a análise é
realizada em pH 6,5.
O efeito do segundo fator (EDTA) pode ser verificado conferindo os dados da
fase frontal com seus correspondentes a fase posterior ao cubo. Neste caso,
podemos observar que a pequena contribuição do EDTA na resposta ocorre quando
o pH (e) se encontra no seu nível superior, ou seja, o aumento da concentração de
EDTA só apresenta aumento na resposta nas duas fases superiores dos cubos. Esta
observação explica a interação entre o EDTA e o pH (e) mostrado na Tabela 4.3
O efeito do terceiro fator pH (e) é observado comparando-se os resultados das
fases inferiores com os correspondentes na fase superior. Neste caso, observamos
que o cubo da esquerda há um aumento na resposta quando se passa do nível
inferior para o superior do pH (e), enquanto no da direita ocorre exatamente o
contrário, as respostas tendem a diminuir quando a análise é realizada em pH 7,4.
Este resultado explica porque o efeito principal do pH (e) é nulo devido a grande
interação entre o pH (e) e o pH (a).
O efeito do fator 4, pH (a), é observado comparando-se o vértice do cubo da
esquerda com o seu correspondente do cubo da direita, neste caso, todas as
respostas diminuem ao passar no nível inferior para o superior. Estes resultados
explicam o valor do pH (e) em relação aos demais fatores e também seu sinal
negativo.
Figura 4.3: Representação geométrica dos resultados
Capítulo 4- Resultados e discussão
87
4.1.2.3 Análise por meio dos gráficos normais
A análise por meio dos gráficos normais pode ser utilizada como uma técnica
alternativa para se tentar fazer uma distinção dentro dos resultados do planejamento
entre o efeito e o ruído
(BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 2003). Este tratamento é
feito traçando-se uma escala linear capaz de acomodar todos os valores dos efeitos
(de -0,439 a 0,09). Neste caso, podemos considerar os 15 valores dos efeitos como
uma amostra aleatória e colocamos em um sistema de probabilidade acumulada de
modo que cada uma delas pudesse representar 1/15 (6,67%) da arca total da
distribuição normal. Neste caso, observamos que os efeitos não significativos
(resíduos ou desvios) aparecem distribuídos de forma linear em torno de zero no
eixo dos efeitos e com uma média em torno de 50% no eixo das probabilidades.
Quanto mais distantes estejam da reta, à direita ou à esquerda, mais significativos
serão os efeitos. A Figura 4.4 mostra que, aparentemente, são significativos apenas
o efeito principal 4 e a interação 34, como previstos pelo erro padrão.
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2
0
20
40
60
80
100
34
4
P (%)
Efeito
Figura 4.4: Gráfico de probabilidade acumulada
Capítulo 4- Resultados e discussão
88
4.1.2.4 Modelo Estatístico
É possível se desenvolver um modelo estatístico capaz de prever todas as
respostas dos 16 ensaios.
Para a descrição completa da resposta média dos ensaios com exatidão seria
necessário um modelo com 17 termos como descrito abaixo.
y(x
1
,x
2
,x
3
,x
4
)=b
0
+b
1
x
1
+b
2
x
2
+b
3
x
3
+b
4
x
4
+b
122
x
1
x
2
+b
13
x
1
x
3
+b
14
x
1
x
4
+b
23
x
2
x
3
+b
24
x
2
x
4
+b
34
x
3
x
4
+b
123
x
1
x
2
x
3
+b
124
x
1
x
2
x
4
+b
234
x
2
x
3
x
4
+b
1234
x
1
x
2
x
3
x
4
+erro (x
1
, x
2
, x
3
, x
4
) (24)
y representa a média das respostas para cada ensaio (R
1
+ R
2
)/2, ver Tabela 4.2. O
termo b
0
expressa a média global das respostas (1,54); b
1
, b
2
, b
3
e b
4
, representam
respectivamente, a metade dos valores dos efeitos principais 1,2,3,4 e os
coeficientes b
12
, b
13
,....,b
1234
representam a metade dos efeitos das interações de 2ª,
3ª e 4ª ordem.
O último termo faz menção ao desvio entre as duas respostas obtidas e a média
de ambos os termos; x
1,
x
2
, x
3
e x
4
representam os sinais correspondentes ao nível
do respectivo fator no ensaio de estudo, ver a Tabela 4.2.
O gráfico de probabilidade acumuladas, expresso na Figura 4.4, indica que em
todo o estudo, apenas dois efeitos são importantes, o efeito principal do pH (a) e o
de interação entre pH(e) e pH(a), como previa o produto do erro padrão pelo t de
Student.
Neste caso, o modelo de 17 termos pode ser resumido para apenas 3, facilitando
bastante a interpretação do processo. O modelo resumido está representado abaixo:
y(x
3
, x
4
) = b
0
+ b
4
x
4
+ b
34
x
3
x
4
(25)
A Tabela 4.4 mostra os resultados obtidos a partir do modelo simplificado, onde
observamos que, apesar da eliminação de 14 termos da equação, as respostas
calculadas não diferem muito das encontradas experimentalmente. No entanto,
resolveu-se aperfeiçoar o modelo incluindo também as contribuições dos efeitos
cujos valores se encontram próximos ao limite de significância estabelecido pelo erro
padrão. Os termos incluídos foram os efeitos principais do glicerol, EDTA e as
Capítulo 4- Resultados e discussão
89
interações 12 e 23. Neste caso, todos os fatores passam a apresentar alguma
contribuição para a resposta. O novo modelo é representado pela equação abaixo,
agora com sete termos.
y(x
1
, x
2
, x
4
) = b
0
+b
1
x
1
b
2
x
2
+b
4
x
4
+b
12
x
1
x
2
+b
23
x
2
x
3
+b
34
x
3
x
4
(26)
A Tabela 4.4 mostra os resultados obtidos pelo novo modelo, onde se observa
que os novos valores calculados são mais coerentes com aqueles encontrados
experimentalmente. Esses resultados reforçam a idéia de que há realmente
contribuições significativas do glicerol e do EDTA na resposta do biossensor. A
Figura 4.5 mostra o gráfico de probabilidade acumulada, agora com destaque para
todos os efeitos importantes.
Figura 4.5: Gráfico de probabilidade acumulada, em destaque os efeitos que se encontram no limite
da significância
.
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2
0
20
40
60
80
100
1
2
12
23
34
4
P (%)
Efeito
Capítulo 4- Resultados e discussão
90
Tabela 4.4: Respostas dos valores obtidos experimentalmente e os calculados pelo modelo
estatístico.
Ensaio
R
Ex
p
erimental
R
1
R
2
1 1,59 1,62 1,64
2 1,71 1,62 1,62
3 1,52 1,62 1,54
4 1,69 1,62 1,67
5 1,84 1,90 1,83
6 1,77 1,90 1,81
7 1,96 1,90 1,91
8 2,05 1,90 2,04
9 1,47 1,46 1,48
10 1,47 1,46 1,46
11 1,45 1,46 1,38
12 1,48 1,46 1,52
13 1,18 1,18 1,11
14 1,07 1,18 1,09
15 1,12 1,18 1,19
16 1,36 1,18 1,32
R
exp
=
respostas experimentais
,
R
1
=respostas previstas com o modelo de 2 fatores
,
R
2
= respostas previstas pelo o modelo
com 7 termos
4.1.3 Escolha do extrato
Uma avaliação mais completa do planejamento fatorial mostra que todos os
fatores utilizados apresentam importância em algum grau, sendo o pH de análise o
fator com maior efeito principal. A Tabela 4.4 mostra que as maiores respostas são
aquelas dos ensaios 7 e 8. A matriz do planejamento apresenta pela Tabela 4.1
mostra que ambas as respostas foram obtidas a partir de um extrato preparado em
pH 7,4 e analisado em pH 6,5. As duas piores respostas foram obtidas nos ensaios
14 e 15. Esses dois ensaios têm em comum o fato de a enzima ter sido extraída e
analisada em pH 7,4. Esses resultados indicam que a atividade da enzima é maior
quando a análise é feita no pH isoeletrônico, cerca de 6,5, porém a extração é mais
eficiente em pH 7,4. Isso significa que parte da enzima extraída em pH 7,4 encontra-
se na forma desativada e pode ser reativada quando submetida ao pH isoeletrônico
durante a análise. Esta observação pode ser confirmada na Tabela 4.3 pela forte
interação entre o pH (e) e o pH (a).
Capítulo 4- Resultados e discussão
91
Baseado nesses resultados, o estudo prosseguiu obtendo-se o extrato em pH 7,4
e analisando em 6,5. Apesar do glicerol e o EDTA terem apresentado pouca
influência, ambos foram adicionados às soluções tampão usadas na extração com
objetivo de melhorar a preservação da enzima.
4.1.4 Atividade enzimática em função do pH
Como o pH se mostrou muito importante, foi feito um estudo da resposta
catalítica da enzima em função do pH, objetivando-se determinar o pH (6,5) ótimo da
urease no extrato. A Figura 4.6 mostra que a análise realizada no pH isoeletrônico
da urease realmente apresentou uma maior resposta. Os resultados também
mostram que a resposta em valores de pH acima de 8 é bem pequena,
provavelmente causada pela desativação reversível indicada no planejamento
fatorial. Esses resultados estão de acordo com alguns apresentados na literatura.
Figura 4.6: Resposta da atividade enzimática do extrato de soja em função da variação do pH
Capítulo 4- Resultados e discussão
92
4.2 CONFECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOSSENSOR
4.2.1 Comportamento Nerstiniano no eletrodo de platina
Este estudo teve por finalidade avaliar a linearidade do potencial em função do
pH, ou seja, o comportamento nernstiniano do eletrodo de platina utilizado como
transdutor. Como foi mencionado anteriormente, ver seção 2.5, o comportamento é
considerado nernstiniano quando o coeficiente angular da reta representada pelo
potencial em função do pH, varia entre 55 e 60 mV. O gráfico apresentado na Figura
4.7 mostra o comportamento do potencial em função do pH, onde um ajuste linear
dos pontos obtidos, através do método dos mínimos quadrados, nos fornece a
seguinte equação:
E= 0,8392-0,051. pH, (27)
Figura 4.7: Potencial do eletrodo de platina em tampão com diferentes valores pH
34567891011
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
Resposta (mV)
pH
Resposta
E
0
= 0,84 - 0,051. pH
Capítulo 4- Resultados e discussão
93
A inclinação da reta é aproximadamente 0,051 V ou 51 mV, indicando um
comportamento quase nernstiano do eletrodo.
Outros estudos com eletrodos de platina foram realizados onde diversas
titulações com ácidos diferentes foram realizadas.
Os resultados apresentam erros bastante elevados para valores de pH inferiores
a 3 e superiores a 12. As inclinações nesta titulação variam entre 42 e 52 mV no
intervalo de pH compreendido entre 3 e 11. Como faixa de pH de trabalho dos
biossensores está inserida neste intervalo, consideramos o eletrodo de platina como
um bom transdutor para essa finalidade. Para a montagem do sistema, fez-se a
associação de um pH-metro, handylab1 Shott, utilizando como referência um
eletrodo de Ag/AgCl e um eletrodo indicador de platina, com o intuito de adaptar o
eletrodo de trabalho para futura deposição e imobilização enzimática da urease.
A resposta foi obtida em um sistema termostatizado de acordo com a Figura 4.8.
Figura 4.8: Sistema de montagem para o eletrodo modificado
Montagem
Escolha do
transdutor
Leitura
Preparo da
mistura
enzimática
Imobilização no
eletrodo de
trabalho
Capítulo 4- Resultados e discussão
94
4.2.2 Imobilização enzimática da urease pura
Objetivando-se obter um comportamento padrão do biossensor enzimático, fez-
se um estudo prévio através da imobilização da urease pura comercial na superfície
do transdutor de platina por meio de ligações covalente cruzada proporcionada pelo
uso do glutaraldeído como agente imobilizante. O principal interesse durante a
imobilização enzimática é manter a atividade e a estabilidade sem permitir que as
enzimas imobilizadas sejam afetadas durante seu uso, em comparação à sua forma
livre. Idealmente, a enzima imobilizada deverá exibir uma boa atividade catalítica,
sem alterações estruturais ou modificações, nos sítios ativos.
Utilizando o procedimento para a montagem do biossensor descrito na seção
3.3, a resposta foi avaliada com 1,0 mL de solução de uréia a 0,1 M adicionada a
15,0 mL de solução tampão. Os pequenos valores da resposta indicam que não
houve boa aderência da membrana ao transdutor. Sabendo que a imobilização pode
inibir ou aumentar a atividade e estabilidade da enzima e que não existe uma regra
que prediga a manutenção destes parâmetros após o processo de imobilização,
surgiu a necessidade de verificar o tempo de exposição do glutaraldeído bem como
a influência da espessura do filme enzimático. A Tabela 4.5 exibe um estudo
comparativo entre membranas formadas pela deposição de 1 (-) e 2 (+) gotas, 10 μL
e 20 μL respectivamente, da solução de enzima/quitosana e o tempo de exposição
do glutaraldeído, 15 a 20 minutos (- e + respectivamente), medidos em diferentes
valores de pH, (6,5(-) e 7,4(+)). As respostas foram obtidas pela diferença entre o
potencial inicial e final após a adição de 0,065 mM de uréia
Tabela 4.5: Condições de planejamento e resultados obtidos na análise do biossensor com o uso da
enzima purificada
Filme Camada Glutaraldeído pH Resposta
1 - - - 32
2 + - - 16
3 - + - 19
4 + + - 30
5 - - + 30
6 + - + 03
7 - + + 14
8 + + + 20
Camada (10 μL ou 20 μL gotas), glutaraldeído (15 ou 20 min) e pH (6,5 ou 7,4)
Tabela 4.6: Efeitos do biossensor manufaturado pela urease pura comercial
Capítulo 4- Resultados e discussão
95
Ensaio Efeitos
Fatores
1 Camada -6,5
2 Tempo de reticulação 0,5
3 pH -7,5
Interação de 2º ordem
12 Camada e tempo de reticulação 15
13 Camada e pH -4
23 Tempo de reticulação e pH 0
Interações de 3º ordem
123 Camada, tempo de reticulação e pH 1,5
Os resultados da Tabela 4.6 mostram que, ao contrário do que esperava, o feito
principal, do fator 1, o número de camadas foi negativo indicando um decréscimo da
resposta à medida que se aumenta a quantidade de enzima imobilizada. O efeito
principal do fator 2 foi muito pequeno, portanto considerado sem significância. Por
outro lado, a interação 12 exibe maior efeito observado. Na Figura 4.9 podemos
observar esta interação, onde percebemos que a resposta diminui à medida que
aumentamos o número de camadas e fixamos o tempo no nível inferior, face frontal,
e aumenta na face posterior, quando aumentamos o número de camadas com
tempo de exposição ao glutaraldeído maior. Esse comportamento foi atribuído ao
fato do nível superior do tempo ser inadequado para a reticulação nos dois níveis de
camadas. Neste caso, o tempo de exposição é grande para a reticulação de uma
gota e pequeno quando se trabalha com duas gotas, provocando a redução da
resposta devido à lixiviação da enzima não imobilizada. O efeito principal do pH
apresentou o comportamento semelhante ao observado para o estudo realizado com
os extratos de soja, onde as maiores respostas foram em pH 6,5.
Figura 4.9: Visão geométrica das respostas do biossensor confeccionado a partir da enzima
purificada
Capítulo 4- Resultados e discussão
96
4.2.2.1 Efeito da temperatura sobre a resposta do biossensor
Para esse estudo, o biossensor foi confeccionado a partir da deposição de 2
gotas da mistura enzima/quitosana na superfície de eletrodo de platina e 30 minutos
de reticulação com o vapor de glutaraldeído. Apesar da urease usada neste estudo
não ter sido extraída da soja, observa-se que a atividade em função da temperatura
é semelhante àquela apresentada nos extratos de soja, quando comparamos as
Figuras 4.1 e 4.10. Os resultados encontrados nesse estudo estão de acordo com
alguns resultados apresentados na literatura para a urease imobilizada e outras
matrizes (ROVER JUNIOR, L., 1995, MAAREF, A. et al, 2006; MELO, J. V. et al, 2002).
20 25 30 35 40
68
70
72
74
76
78
80
82
84
86
88
Resposta (mV)
Temperatura ( °C)
Figura 4.10: Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a concentração de
uréia igual a 0,065 mM em tampão fosfato pH 6,5, em diferentes temperaturas.
4.2.2.2 Influência do pH
Como vimos anteriormente, a atividade enzimática é extremamente dependente
do pH do meio. Este estudo teve como finalidade comparar a influência do pH sobre
a atividade enzimática da urease pura imobilizada com os resultados obtidos com o
uso do extrato de soja. Confrontando os resultados da Figura 4.6 com a Figura 4.11
podemos observar que apresentam comportamentos semelhantes e estão de acordo
com o observado por Boaventura et.al
(C.LUCA, G.; F. REIS, B.,2001)
Capítulo 4- Resultados e discussão
97
5,56,06,57,07,58,0
0
5
10
15
20
Resposta (mV)
pH
Figura 4.11: Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a concentração de
uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes valores de pH
4.2.3 Imobilização enzimática do extrato de soja
Baseando-se nos resultados do planejamento fatorial da urease na soja,
utilizamos o extrato obtido no ensaio 08 para a preparação do biossensor. Portanto,
o ensaio 08 é um extrato preparado em tampão com pH 7,4, contendo EDTA e
glicerol. Como vimos no item 4.2.2, onde imobilizamos a enzima comercial, esta
etapa da preparação do dispositivo requer bastante zelo. Os Fatores mais
importantes a ser controlados para obtenção de um biossensor com boa resposta
são a quantidade de enzima e o grau de reticulação. Uma maior quantidade de
enzima proporciona uma maior resposta e, conseqüentemente, uma maior
sensibilidade à concentração do substrato. Porém, como a quantidade de urease na
soja não é muito elevada, é necessária a adição de bastante extrato para melhorar a
intensidade da resposta.
Por outro lado, uma membrana muito espessa pode aumentar o tempo de
resposta do biossensor. O controle do grau de reticulação é de extrema importância,
pois um baixo grau de reticulação pode permitir a lixiviação da enzima no filme para
a solução, tanto durante o uso quanto no período de armazenamento, provocando
uma perda na resposta. Por outro lado uma membrana muito reticulada pode sofrer
Capítulo 4- Resultados e discussão
98
bloqueio dos seus sítios ativos, causando também uma diminuição da sensibilidade
do biossensor.
Inicialmente, examinou os efeitos com tempos de reticulação da mesma ordem
usada para imobilizar a enzima comercial, porém observou-se que a membrana não
era fixada ao eletrodo. Acreditamos que este fenômeno foi causado pelo fato de soja
ser rica em outras proteínas que também sofrem reticulação. A fixação da
membrana só ocorreu após 60 minutos de reticulação. Acreditamos também que a
necessidade de uma longa exposição ao glutaraldeído seja devido a uma maior
quantidade de material usada para a formação da membrana, devido à pequena
proporção da enzima no extrato.
Outro fator importante foi a relação extrato/quitosana. A Tabela 4.7 e a Figura
4.12 mostram as respostas obtidas para diferentes proporções entre o extrato e a
solução de quitosana. Neste estudo, o biossensor só apresentou resposta
significativa a partir de uma proporção de extrato superior a 50%. Apesar de a
melhor resposta ter sido observada para proporção de 50% de extrato, o biossensor
obtido não era muito estável. Portanto, passamos a trabalhar com a imobilização
utilizando 80% de extrato de soja adicionados a 20% da solução de quitosana. Os
biossensores foram obtidos depositando-se 0,1 mL da mistura extrato/quitosana, na
proporção escolhida, na superfície do eletrodo de platina (transdutor) que,
posteriormente, foi submetido por 60 minutos ao vapor de glutaraldeído finalizando a
reticulação.
O modelo de reticulação pode ser representado pela Figura 4.14, onde
observamos a formação de uma cadeia entre a quitosana e o glutaraldeído.
Finalmente, o eletrodo foi submetido a vácuo por 30 minutos antes da realização das
análises. Após o uso os biossensores foram armazenados sob refrigeração em
solução tampão pH 6,5 contendo glicerol.
Capítulo 4- Resultados e discussão
99
Figura 4.12: Modelo de reticulação da enzima associada ao glutaraldeído e quitosana
Tabela 4.7: Avaliação da proporção extrato de soja/quitosana nas membranas enzimáticas
Filme %Soja %Quitosana Resposta Δ H
E
0
(mV)
1 80 20 109
2 70 30 106,6
3 60 40 99
4 50 50 120
5 40 60 SR
6 30 70 SR
7 20 80 111*SR
8 100 00 60*SR
SR: sem reticulação favorável /* possível apenas na primeira leitura
Capítulo 4- Resultados e discussão
100
20 40 60 80 100
60
70
80
90
100
110
120
130
Resposta (mV)
Extrato de Soja %
Figura 4.13: Média da diferença de potencial em relação a porcentagem do extrato enzimático em
filmes com diferentes quantidades do extrato de soja (8) e quitosana, análise com concentração de
uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato pH 6,5
4.2.4 Influência da temperatura sobre a resposta do biossensor com
a membrana de extrato de soja
Tomando como base o procedimento descrito no subitem 4.2.2, foi realizado um
estudo comparativo da atividade enzimática da membrana elaborada com o extrato
de soja descrito no ensaio (08), variando a da faixa de temperatura entre 25 a 40ºC.
O resultado da Figura 4.13, quando comparado aos resultados das Figuras 4.1 e
4.10, mostra semelhanças para a temperatura ótima no extrato de soja e nos
biossensores elaborados com a urease imobilizada pura e a urease proveniente da
soja imobilizada, respectivamente. O comportamento da resposta em função da
temperatura para a urease comercial imobilizada e do extrato em solução, ver Figura
4.13, mostra que a urease de soja imobilizada apresenta dois pontos de máximo,
sendo o primeiro próximo a 30ºC, concordando com os estudos anteriores, e um
segundo de maior intensidade, por volta de 40ºC. Apesar de a melhor resposta ter
Capítulo 4- Resultados e discussão
101
sido observada em 40ºC, os experimentos com os biossensores foram realizados a
30ºC para evitar a desnaturação irreversível da enzima com a seqüência de uso.
Figura 4.14: Resposta do biossensor elaborado com extrato de soja com uma concentração de uréia
igual a 0,065mM em tampão fosfato, em diferentes temperaturas.
5.2.5 Limite de detecção e faixa linear da resposta
Limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito em uma amostra, que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Para caracterizar um
procedimento analítico é importante estabelecer seu limite de detecção relacionando
o sinal de medida com a concentração do analito. O limite de detecção foi avaliado
para diversas Configurações do biossensor, onde se observou que apesar do longo
tempo de resposta é possível detectar concentrações de uréia de até 0,33 mM. A
região linear também é um fator importante no desenvolvimento dos biossensores,
pois determina a faixa de concentração do substrato que o biossensor pode
determinar com menor erro. O gráfico da Figura 4.15 mostra a curva de calibração,
obtido pela diferença de potencial após a adição de diferentes concentrações de
uréia, para a faixa de concentração do substrato compreendida entre 0,33 e 7,00
mM. Vários autores estendem a faixa linear aplicando a função logarítmica aos
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
64
66
68
70
72
74
76
78
80
Resposta (mV)
Temperatura (
0
C)
Capítulo 4- Resultados e discussão
102
dados. O gráfico da Figura 4.16 é uma representação linear da Figura 4.15, obtida
plotando a resposta em função do logaritmo da concentração.
Figura 4.15: Curva de calibração com 0,2M de uréia em pH 6,5 para o biossensor enzimático a partir
da soja imobilizada
Neste caso, podemos observar uma linearização da resposta com a concentração
na faixa de concentração compreendida entre 0,33 a 7 mM. Uma das limitações para
aplicações de biossensores de uréia na área médica é a faixa linear já que esta
muito abaixo da concentração de substrato encontrada em pacientes renais, que
pode superar 30 mM em alguns casos.
Figura 4.16: Representação linear da curva de calibração para o biossensor enzimático a partir da
soja imobilizada
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
20
30
40
50
60
70
80
90
mV
log [Uréia]
Resposta
E
0
= 35 + 71,4 mV
01234567
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Resposta (mV)
[Uréia], mM
Capítulo 4- Resultados e discussão
103
0 60 120 180 240 300 360
160
180
200
220
240
260
280
300
Resposta (mV)
Tempo (s)
terceira medida
segunda medida
primeira medida
4.2.6 Reprodutibilidade dos dados
No início do estudo com biossensores de urease, a partir do extrato de soja,
observou-se que a primeira análise apresentava uma maior intensidade na resposta
que as demais, mesmo para concentrações idênticas do substrato. Esse
comportamento está representado na Figura 4.17, em que se percebe que a
variação na resposta é bem maior na primeira leitura, apesar da concentração de
substrato ser a mesma. Um aprofundamento do estudo deste comportamento
revelou que a enzima imobilizada apresenta o mesmo comportamento observado
durante a obtenção do extrato. Durante a análise, devido à elevação de pH, parte da
enzima é desativada. Por esse motivo, as análises subseqüentes apresentam
respostas menores. A partir desses resultados, concluiu-se que a enzima necessita
de um longo tempo de permanência no pH de análise, antes de uma nova leitura,
para ser reativada, restabelecendo a linha base da medida. O tempo de resposta
longo é devido à alta espessura da membrana que dificulta a difusão tanto do
substrato e seus produtos quanto da solução tampão para o restabelecimento da
linha base.
Figura 4.17: Resposta de medidas sucessivas do biossensor confeccionado com 80% de extrato de
soja para a concentração de uréia igual a 6,25 mM em tampão fosfato pH 6,5 a 30°C.
Capítulo 4- Resultados e discussão
104
Com intenção de solucionar este problema, imergiu o eletrodo em solução tampão
pH 5,5 e em seguida em solução tampão pH 6,5 com objetivo de garantir a
reprodutibilidade de todas as respostas com a reativação enzimática. Após esse
procedimento, utilizando um único filme enzimático forma realizadas medidas
consecutivas, usando-se a nova metodologia de reativação do eletrodo, em um
único dia, como forma de avaliar a reprodutibilidade de um mesmo filme enzimático.
Para tanto, usamos uma concentração de 6 mM (condição de saturação) e
observamos uma variação na resposta do biossensor de cerca de 60 mV. Como
pode ser observado na Figura 4.18 houve uma boa reprodutibilidade na resposta
com a seqüência de experimentos. Esses resultados indicam que o biossensor
obtido é bastante estável e que as propriedades da enzima são preservadas após a
imobilização.
Figura 4.18: Relação entre o tempo da resposta e resistência após medidas sucessivas a uma
concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato pH 6,5
4.2.7 Tempo de resposta
Um baixo tempo de resposta em uma medida é fundamental em qualquer método
analítico. O tempo de resposta foi considerado como sendo o intervalo de tempo,
após a adição do substrato, cuja resposta permanece praticamente inalterada, ou
0 100 200 300 400 500 600
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
Resposta (mV)
Tempo (s)
1 medida
2 medida
3 medida
4 medida
Capítulo 4- Resultados e discussão
105
seja, o tempo que o biossensor leva para variar sua resposta para uma determinada
concentração. O tempo de resposta é um dos fatores negativos em relação ao
desenvolvimento de biossensores manufaturados a partir de extratos brutos de
vegetais, devido à baixa concentração da enzima no extrato; daí, muitas vezes, se
faz necessária a formação de uma membrana enzimática espessa para proporcionar
uma boa intensidade na resposta. Dessa forma, os processos de difusão, tanto de
entrada do substrato na membrana quanto de saída dos produtos podem tornar-se
lentos. A Figura 4.19 mostra que o tempo de resposta dos biossensores obtidos
varia bastante com a concentração do substrato, atingindo cerca de 5 minutos para
concentrações mais baixas e um pouco mais de um minuto para condições de
saturação. Estes resultados indicam que as membranas enzimáticas são espessas,
dificultando o processo de difusão, principalmente para baixas concentrações do
substrato.
Figura 4.19: Gráfico do tempo de resposta do biossensor com 80% do extrato de soja em diferentes
concentrações de uréia em tampão fosfato pH 6,5 a 30ºC
0 100 200 300 400 500
250
260
270
280
290
300
310
320
330
Resposta (mV)
Tempo (s)
0,65mM
1,31mM
1,97mM
2,63mM
3,94mM
6,57mM
Capítulo 4- Resultados e discussão
106
4.2.8 Tempo de vida dos biossensores
Uma das principais características de um bom biossensor é sua durabilidade. A
literatura, referente aos biossensores de uréia, tem revelado que bons dispositivos
duram de 3 a 4 semanas, permitindo algumas dezenas de medidas. A Figura 4.20
mostra o comportamento da resposta de três biossensores diferentes (a, b e c),
confeccionados respectivamente com 10, 5 e 15 μL da mistura do extrato de soja, na
qual podemos observar que o biossensor (a) aumenta sua resposta, porém só dura
cerca de uma semana devido ao descolamento da membrana enzimática sobre o
transdutor. Neste caso somente o biossensor (c) apresenta durabilidade de 10 dias.
Porém, o biossensor confeccionado com 15 μL da mistura enzimática, protegido
fisicamente por tubo emborrachado, com intuito de preservar melhor a membrana
dos choques ocorridos pela agitação durante a análise, além de apresentar boa
intensidade e estabilidade da resposta chegaram a durar cerca de um mês com
cerca de 50 medidas realizadas nas mais diferentes condições de uso. Logo o
principal problema observado não foi a desativação da enzima e sim o
desprendimento da membrana da superfície do transdutor.
Figura 4.20: Variação da resposta em função do tempo, para as mesmas condições de análise com
diferentes espessuras da membrana enzimática: (a) 10 μL (b) 5 μL , (c) .15 μL
0123456789101112
0
100
200
300
400
500
600
c
b
a
Resposta (%)
Dias
Capítulo 4- Resultados e discussão
107
4.2.9 Avaliação da histerese do biossensor
A investigação da histerese é importante no sentido de avaliar o retorno das
propriedades do biossensor em relação á sua linha base com a repetição das
análises. O estudo foi realizado aumentando-se a resposta em função do
crescimento da concentração e, posteriormente, com a diminuição do substrato.
O resultado apresentado na Figura 4.21 foi obtido adicionando uma pequena
quantidade de substrato e em seguida aumentando gradativamente. Após a adição
da concentração máxima o mesmo procedimento foi repetido, mais, dessa vez, no
caminho inverso com a diminuição da concentração do substrato, a resposta de
cada leitura foi à variação da potência. O resultado mostra que realmente há uma
histerese, pois as respostas, no sentido crescente da concentração, são maiores do
que as comparadas no sentido da diminuição da concentração da uréia. Esse
problema foi corrigido após o tratamento descrito no item 4.2.6.
Figura 4.21: Resposta do biossensor enzimático a base de 80% do extrato de soja utilizando
concentrações distintas do substrato em pH 6,5 a 30ºC. Nos sentido crescente e decrescente da
ordem de adição dos substratos
Capítulo 4- Resultados e discussão
108
4.3 Aplicações do biossensor na análise de fertilizantes
A idéia inicial era de se aplicar o biossensor desenvolvido para a determinação
da uréia em fluidos humanos como sangue e urina, porém, devido às dificuldades
impostas pela legislação quanto à manipulação de tais substâncias, não foi possível
a realização desse estudo. Portanto, resolvemos quantificar a uréia em fertilizantes a
base desse substrato.
Inicialmente confeccionou-se a curva de calibração, através de soluções padrões
contendo diferentes concentrações do substrato, exposta na Figura 4.22. Foram
feitas soluções em tampão fosfato pH 6,5 para as duas amostras de fertilizantes.
Após a obtenção das respostas pelo biossensor (obtidos em duplicatas), os dados
foram tratados, chegando-se aos resultados da Tabela 4.8.
Como o erro encontrado para o NPK foi muito grande, 63,5%, resolvemos
determinar o teor de nitrogênio da amostra pelo método de Kjeldahl. O teor de
nitrogênio encontrado quando convertido em uréia produziu apenas 4,5% de uréia,
portanto, um pouco mais da metade do valor esperado. Como verificamos que a
amostra não continha a quantidade de uréia prevista, calculamos o erro
considerando-se a quantidade de uréia determinada pelo método Kjeldahl, que
apresentou 35,4%, como mostra a Tabela 4.8. Neste caso, não é possível concluir
que o elevado valor do erro por interferentes da amostra ou porque apenas parte do
nitrogênio da mesma se encontre na forma de uréia. Por outro lado, não se
determinou uréia por um método mais específico para se determinar seu verdadeiro
teor.
O erro encontrado para a segunda amostra foi de apenas 8,42%, mostrando uma
boa aplicabilidade do método para este tipo de amostra.
Tabela 4.8: Porcentagem do teor de uréia contido em dois tipos de fertilizantes
Amostra % Rótulo %
Biossensor a
base de soja
Método
Kjeldahl%
Erro
relativo%
NPK 8 2,92 4,52 35,4
Uréia agrícola 95 87,00
8,42
Capítulo 4- Resultados e discussão
109
Figura 4.22: Curva de calibração utilizando o filme do extrato de soja em tampão fosfato de pH 6,5 a
30ºC
4.4 Cinética enzimática
O tratamento da cinética enzimática é, geralmente, feito através da equação de
Michaelis e Menten que expressa a velocidade da reação catalisada
enzimaticamente com um único substrato (ZANTUA e BREMNER, 1997). É uma
expressão da relação quantitativa entre a velocidade inicial, V
0
, a velocidade inicial
máxima, V
máx,
e a concentração inicial do substrato [S], todos relacionados através
da constante de Michaelis-Menten K
M
. A constante K
M
é uma dinâmica, ou de
pseudo equilíbrio, que expressa a relação entre as concentrações reais no
estacionário ao invés de concentrações no equilíbrio (VOGEL,1981).
[
]
[]
.0
.
0
2
1
máx
M
máx
VV
SK
SV
V =⇔
+
= (28)
Capítulo 4- Resultados e discussão
110
Uma relação numérica importante emerge da equação de Michaelis-Menten,
especialmente quando V
0
é exatamente a metade de V
máx.
. Neste caso, K
M
= [S], K
M
representa uma medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo.
Como a velocidade inicial da reação é, normalmente, proporcional à intensidade
da resposta para uma dada concentração do substrato, usamos a curva de
calibração na Figura 4.15 na sua forma convencional para calcularmos os
parâmetros cinéticos através da expressão linear de Lineweaver-Burt que é outra
forma de se representar a equação de Michaelis-Menten:
..0
1
][
11
máxm
m
VSK
K
V
+=
(29)
Neste caso, o gráfico de 1/V
0
versus 1/ [S] fornece uma linha reta cuja inclinação
é
.máx
m
V
K
. O coeficiente linear, intercepto com o eixo V
0,
é igual a 1/V
máx,
sendo igual a
.
1
m
K
−
quando intercepto com eixo 1/ [S]. O gráfico 4.23 mostra a representação de
Lineweaver-Burt na qual podemos observar que os dados representam
perfeitamente uma linha reta. Os valores de V
m
e K
m
, extraídos da curva, foram
respectivamente iguais a 158,5 e 3,5. Os valores encontrados na literatura para o K
m
da urease imobilizada variam entre 1,9 e 4,0.
Figura 4.23: Representação gráfica da linearização da equação de Michaelis-Menten
Capítulo 4- Resultados e discussão
111
Os valores de urease dependem de várias características do biossensor.
Portanto os resultados determinados neste estudo estão de acordo com as
características da urease.
O gráfico da Figura 4.24 mostra as curvas de calibração, experimental e teórica,
obtida a partir da equação de Michaelis-Menten, utilizando os valores de V
máx
e K
M
extraídos da Figura 4.23. Neste caso, podemos observar que os resultados teóricos
representam bem os experimentais, principalmente, para concentrações mais
baixas.
Figura 4.24: Curva de calibração a partir dos resultados experimentais modificados pela equação de
Michaelis-Menten
Capitulo 5
Mesmo que olhes para trás a flor desabrocha
[Kenji Kawai]
Capítulo 5- Conclusões
113
5 Conclusões
A partir da introdução dos resultados, chegou-se às seguintes conclusões:
• O planejamento fatorial foi fundamental para se avaliar o grau de importância
de cada fator sobre as propriedades da uréase, no extrato de soja, em que
dentre os parâmetros estudados, o pH mostra-se como sendo de extrema
importância no controle das propriedades enzimáticas.
• As propriedades da enzima extraídas do extrato de soja não diferem muito
daquelas observadas nos biossensores formados pela enzima imobilizada
pelo extrato de soja, ou da enzima pura imobilizada.
• O eletrodo de platina apresenta excelentes características para atuar como
transdutor, porém não foram feitos estudos de interferentes.
• A enzima apresenta excelente estabilidade na membrana, porém a aderência
ao transdutor diminui com o tempo, provocando uma redução no tempo de
vida do biossensor.
• Houve uma boa reprodutibilidade na análise da uréia agrícola, porém não foi
possível fazer uma avaliação mais precisa sobre a alta porcentagem no erro
para análise do fertilizante NPK, devido à falta de detalhes no rótulo.
• Os parâmetros cinéticos encontrados para a uréia imobilizada estão de
acordo com a faixa encontrada na literatura.
5.1 Perspectivas de trabalhos futuros
Visando o aprimoramento de algumas propriedades do biossensor obtido,
sugerimos alguns estudos para a continuação deste trabalho:
• Estudar e avaliar os possíveis interferentes e inibidores que prejudiquem a
atividade enzimática.
Capítulo 5- Conclusões
114
• Há a necessidade de melhorar a forma de extrair a enzima de modo a se
obter soluções mais concentradas, no sentido de se obter membranas mais
finas com maior quantidade que proporcionam maior intensidade e um menor
tempo de resposta.
• Pesquisar novas condições de armazenamento de modo a preservar a
aderência da membrana na superfície do transdutor proporcionando um maior
tempo de vida dos biossensores obtidos.
115
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