( PDF ) Análise da influência de polimorfismos presentes nos genes APO B, CETP, LPL e LIPC em uma população dislipidêmica do Rio Grande do Sul

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA – CIÊNCIAS MÉDICAS

ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS PRESENTES NOS

GENES APO B, CETP, LPL E LIPC EM UMA POPULAÇÃO

DISLIPIDÊMICA DO RIO GRANDE DO SUL

Fernanda Goulart Lanes Chula

Orientador: Prof. Dr. Roberto Giugliani

Dissertação de Mestrado

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA – CIÊNCIAS MÉDICAS

ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS PRESENTES NOS

GENES APO B, CETP, LPL E LIPC EM UMA POPULAÇÃO

DISLIPIDÊMICA DO RIO GRANDE DO SUL

Fernanda Goulart Lanes Chula

Orientador: Prof. Dr. Roberto Giugliani

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal do Rio Grande do

Sul, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Médicas.

Dissertação de Mestrado

2008

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INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS

O presente projeto de pesquisa teve como fonte de financiamento o Programa

de Apoio de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (PADCT) da Fundação

Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) e o Grupo de Pesquisa e Pós-

Graduação (GPPG) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).

A aluna recebeu bolsa de estudos concedida pela Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais pelo apoio, confiança e carinho em qualquer momento e por

terem me ensinado os valores da vida: vocês são simplesmente maravilhosos. A

minha mãe, com seu jeito protetor e do qual herdei muitas características. Ao meu

pai, do qual herdei a força para seguir sempre em frente. Obrigado por tudo, eu amo

vocês!

Aos meus três irmãos a quem amo muito. A minha irmã Ingrid (Gorda), por ser

tão maravilhosa com seu jeito prático em ajudar todos e por ser uma amiga

inigualável. Ao meu cunhado, por se fazer de durão, mas ser uma pessoa muito

carinhosa e por arrumar meu computador nas horas de desespero.

Ao meu irmão Júlio, por ter esse jeito único que eu amo muito e do qual tenho

muito orgulho.

Ao meu irmão Marco (Totonho) por seu jeito amável que conquista a todos.

Ao meu marido Eduardo, por tudo. Essa etapa foi concluída graças ao teu

apoio incansável, obrigado pelo carinho, incentivo, companheirismo, amor, paciência

e dedicação. Eu te amo muito, essa conquista eu dedico a ti.

Ao meu orientador, Roberto Giugliani, por me ajudar nas horas de aperto e

por ser um exemplo de profissional.

À minha orientadora, Cláudia, pela confiança, compreensão, amizade e pelos

ensinamentos nesses anos.

À Lúcia Rossetti, por ter confiado no meu trabalho e por chefiar tão bem um

laboratório repleto de mulheres.

À Márcia, por seu jeito delicado, carinhoso e pela amizade.

Ao Andry, Coordenador do Ambulatório de Dislipidemia, do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre, por ter disponibilizado o acesso aos pacientes e pela ajuda

em todos os aspectos.

À Dra. Nadine Clausell, por ter viabilizado a realização desse projeto.

À Sabrina (Sá), por suas conversas empolgantes sobre genética, banco de

dados e tantas outras e pelos conselhos.

À Marilu, por todo carinho, ensinamentos e pelas tardes regadas sobre os

mais diversos assuntos e por tornar a estatística interessante.

À Tarci (Gringa), pelo seu “bom-humor” e por ser uma ótima conselheira.

Obrigado pelos almoços regados a conversas e risadas juntamente com uma nova

amiga Si, que é uma pessoa muito especial.

À Cíntia, por sempre estar disposta a ajudar, pelo seu jeito atrapalhado e pela

amizade.

À Cândi, por toda ajuda sempre que precisei, pelas conversas e pela

amizade. Ah, e por ceder material quando eu precisava.

Aos meus colegas Rodrigo e André, pela amizade.

Ao Paulo, pela ajuda e dedicação incansável nos dias de atendimento aos

pacientes.

A todas as meninas do Lab: a Rê, por suas palavras carinhosas; a Elis, por

seu jeito amigo; a Cris, por seu jeito doidinho; a Paty, por seu jeito engraçado; a Mi,

por sua sinceridade; a Rúbia, por sempre estar disposta a organizar a sala de

eletroforese; e a todas as outras por tornarem o CDCT um lugar ótimo.

RESUMO

Dislipidemia é uma desordem multifatorial causada pela interação entre fatores

ambientais e genéticos. A identificação dos componentes genéticos responsáveis por essas

características tem sido intensamente investigada nos últimos anos. Esses estudos têm

enfocado principalmente polimorfismos nos genes que codificam proteínas estruturais e enzimas

relacionadas ao metabolismo dos lipídios. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos

avaliar as freqüências dos polimorfismos EcoRI, TaqI, S447X, -250G>A dos genes APOB,

CETP, LPL e LIPC e investigar a interação desses polimorfismos com dados clínicos,

bioquímicos e antropométricos em 119 pacientes dislipidêmicos, de uma amostra da população

de Porto Alegre. Para analisar os genótipos de cada polimorfismo e sua possível influência

sobre a eficácia ao tratamento com estatinas foram analisados 48 pacientes dislipidêmicos. As

medidas dos níveis lipídicos foram verificadas ao longo do estudo. Utilizou-se a técnica de PCR-

RFLP para a realização das análises de biologia molecular. O polimorfismo -250G>A foi

associado significativamente com os níveis de HDL-C. Para análises não ajustadas, os

portadores do alelo G aumentaram mais o nível de HDL-C (P=0,004) que os indivíduos

homozigotos AA, considerando que o genótipo AA apresentou níveis de TG mais elevados

(P=0,017) que os indivíduos com genótipo GG ou GA. Para níveis de TG esses resultados

mantiveram-se para análises ajustadas, com elevados níveis de TG para indivíduos com

genótipo AA em comparação aos indivíduos com genótipo GG ou GA (P=0,073). Diferenças

entre os genótipos no percentual de variação nos níveis lipídicos foram observadas para os

polimorfismos LIPC e LPL. Depois de ajustadas por covariáveis, os indivíduos com genótipo GA

ou AA apresentaram uma redução maior do nível de CT, comparados com os indivíduos com o

genótipo GG (-26,4% ± 15,5 vs. -18,2% ± 11,8, P=0,034). Para análises não ajustadas, os

indivíduos com o alelo G do polimorfismo LPL S447X mostraram um aumento dos níveis de

HDL-C comparados com os indivíduos com o genótipo CC (13,8% VS. 3,3%, P=0,047). Depois

de ajustadas por covariáveis, a significância do efeito desse polimorfismo foi observada para o

nível de CT. O percentual da média de redução no nível de CT foi maior nos indivíduos

homozigotos CC que os indivíduos com o alelo G (-26,6% ± 13,6 vs -20,5% ±13,6, P=0,046).

Nossos dados sugerem uma associação do polimorfismo LIPC -250G>A com níveis de HDL-C e

TG, para análises não ajustadas, mas para análises não ajustadas por covariáveis a associação

manteve-se para níveis de TG. Nós também encontramos associação significante dos

polimorfismos LIPC -250G>A e LPL S447X na resposta ao tratamento com estatinas. Esses

resultados podem ser explicados através de vários fatores, tais como: gênero, estrogênio, IMC e

outras variáveis que possam interferir no efeito dos polimorfismos sobre os níveis lipídicos e

resposta ao tratamento.

Palavras-chave: Dislipidemia. Polimorfismos APOB, CETP, LPL, LIPC. Farmacogenética

ABSTRACT

Dyslipidemia is a multifactorial disorder caused by an interaction between genetic and

environmental factors. The identification of the genetic component of this traits have been

intensively investigated in the last year. These studies focused mainly on polymorphism in

genes coding for structural proteins and enzymes related to lipid metabolism. Therefore, in the

present study, we investigated the frequencies of the polymorphisms EcoRI, TaqIB, S447X

and (-250G>A) of the APOB, CETP, LPL and LIPC genes with clinical, biochemical,

anthropometrics data of the one hundred and nineteen patients with dyslipidemia in a sample

of Southern Brazilian population. To determine the genotype association with response to

statin treatment, only 48 individuals were enrolled for analysis. Plasma lipids and lipoproteins

were measured before and throughout the study. PCR-RFLP method was used for molecular

biology analysis.

Plasma lipids and lipoproteins were measured before and throughout the

study. Baseline lipid and lipoprotein parameters were compared among APOB EcoRI, CETP

TaqIB, LPL S447X (G>C) and LIPC -250G>A genotypes after genotyping by PCR and

restriction mapping. Data from forty-eight patients with statin treatment were used to

pharmacogenetic statistical analyses. The LIPC -250G>A polymorphism was significantly

associated with HDL-C. For unadjusted levels, carriers of the G allele had higher HDL-C

concentrations (P=0.004) than AA homozygotes, whereas AA genotype had higher TG

concentrations (P=0.073) than GG and GA genotypes. For TG levels the same results were

observed for adjusted data, with higher TG concentrations in AA homozygotes than GG and

GA genotypes (P=0.017). Differences among genotypes in the percentage variation in lipid

and lipoprotein concentrations for LIPC and LPL polymorphism were observed. After

adjustment for covariates, GA and AA carriers genotypes showed a greater reduction in total

cholesterol compared than GG genotype (-26.4% ± 15.5 vs. -18.2% ± 11.8, P=0.034). For

unadjusted data, G allele carriers for LPL S447X gene polymorphism showed a greater HDL-

cholesterol increase compared to CC subjects (13.8% vs. 3.3%, P = 0.047). After adjustment

for covariates, a significant effect of this polymorphism was observed for change in TC levels.

The mean percent reduction in TC was greater in CC homozygotes than in G carriers (-26.6%

± 13.6 vs. -20.5% ± 13.6, P=0.046). Our data suggest an association of LIPC -250G>A gene

polymorphism with HDL-C and TG concentrations for unadjusted data, but not after adjustment

for covariates. For TG concentrations the associations was maintained after adjustment. We

also found a significant effect dependent of covariates of LIPC and LPL polymorphisms on

statin treatment response. These results can be explained on the basis of there being several

factors such as gender, estrogens, BMI and other variables that can modulate the effect of

gene polymorphisms on the lipid in lipoprotein concentration and treatment response.

Key words: Dyslipidemia. APOB, CETP, LPL, LIPC polymorphisms. Pharmacogenetic.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Apo: apolipoproteína

Apo B: apolipoproteína B

CETP: proteína transferidora de ésteres de colesterol

CT: colesterol total

DAC: doença arterial coronariana

DCV: doenças cardiovasculares

DM: diabetes mellitus

DNA: ácido desoxirribonucléico

HA: hipertensão arterial

HAS: hipertensão arterial sistêmica

HDL: lipoproteína de alta densidade

HDL-C: colesterol ligado à lipoproteína de densidade alta

HL: lipase hepática

HMG CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A

HMGCR: 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A redutase

HPP: hiperglicemia pós-prandial

IDL: lipoproteína de densidade intermediária

IM: Infarto do miocárdio

IMC: índice de massa corporal

LDL: lipoproteína de densidade baixa

LDL-C: colesterol ligado à lipoproteína de densidade baixa

Lp (a): lipoproteína (a)

LPL: lipase lipoprotéica

nHDL: não colesterol de lipoproteínas de densidade alta

PAD: pressão arterial diastólica

PAS: pressão arterial sistólica

pb: pares de bases

PCR: reação em cadeia da polimerase

QM: quilomícrons

RFLP: polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição

SNP: polimorfismo de nucleotídeo único

TG: triglicerídeos

VLDL: lipoproteína de densidade muito baixa

VLDL-C: colesterol de lipoproteínas de densidade muito baixa

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais classes e características das lipoproteínas plasmáticas...........18

Tabela 2: Valores de referência dos lipídios plasmáticos adotados no Brasil...........18

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................11

2 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................13

2.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES E DISLIPIDEMIA........................................13

3 GENES ENVOLVIDOS COM O METABOLISMO DE LIPÍDIOS...........................21

3.1 POLIMORFISMO EcoRI DA APOLIPOPROTEÍNA B (APO B)...........................22

3.2 POLIMORFISMO TaqIB PROTEÍNA TRANSFERIDORA DE ÉSTERES DE

COLESTEROL (CETP)........................................................................................25

3.3 POLIMORFISMO S447X DO GENE DA LIPASE LIPOPROTÉICA (LPL)...........29

3.4 POLIMORFISMO -250G>A DA LIPASE HEPÁTICA (LIPC) ...............................31

4 FARMACOGENÉTICA...........................................................................................35

5 OBJETIVOS...........................................................................................................37

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................38

REFERÊNCIAS.........................................................................................................42

ARTIGO CIENTÍFICO...............................................................................................52

APÊNDICE - Tabelas Descritivas da Amostra para cada Polimorfismo............74

ANEXO A - Termo de Consentimento Informado .................................................76

ANEXO B - Questionário – Ficha de Avaliação.....................................................80

1 INTRODUÇÃO

As dislipidemias são alterações metabólicas nos níveis séricos de lipídeos

circulantes do sangue, estando diretamente relacionadas com a aterosclerose. O

depósito de lipídios desencadeia processos bioquímicos que culminam com a

formação de placas ateroscleróticas na íntima dos vasos arteriais que,

conseqüentemente, podem obstruir parcial ou totalmente um ou mais vasos.

(YAMADA, 2007; MARTINEZ, 2004).

A variação dos níveis séricos de lipídeos é uma característica de etiologia

multifatorial, pois é determinada por uma ampla gama de fatores, tanto ambientais

quanto genéticos. Variações em um grande número de genes envolvidos na síntese

de proteínas estruturais e enzimas relacionadas no metabolismo de lipídeos

poderiam responder, a princípio, por variações do perfil lipídico de cada indivíduo.

(BRESLOW, 2000; ANDRADE e HUTZ, 2002; COHEN et al., 2004; CORELLA e

ORDOVAS, 2005; ZAMBON et al., 2006).

A ocorrência de doenças cardiovasculares (DVC) varia amplamente no

mundo. Geralmente, a maior freqüência é encontrada em países ocidentais ou com

estilo de vida ocidental. No Brasil, a DCV é a primeira causa de morte por doença

não transmissível, estando o Rio Grande do Sul com o maior índice em relação aos

demais estados do país (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005)

Quando modificações nos hábitos alimentares não são suficientes para

normalizar os níveis de colesterol plasmático, se utilizam terapias medicamentosas,

Disponível em: <http://www.portal.saude.com.br>.

visando reduzir a síntese endógena de colesterol ou aumentar a sua secreção na

forma de sais biliares. No primeiro caso, utilizam-se estatinas, que são inibidores

competitivos da 3-hidroxi-3-metilgultaril coenzima A (HMG-CoA-redutase). Muitos

polimorfismos presentes em genes que codificam proteínas, os quais são alvos

diretos de medicamentos, têm sido descritos por alterar a resposta do tratamento,

especialmente as estatinas, usadas como hipolipemiantes (EVANS e MCLEOD,

2003; IV DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2007).

Nesse sentido, na área da cardiologia, vários estudos farmacogenéticos estão

sendo conduzidos, objetivando relacionar os efeitos terapêuticos das estatinas em

pacientes com doenças cardiovasculares e a variabilidade genética. Essa

promissora área do conhecimento está em pleno avanço, basicamente por ser

considerada uma das primeiras e principais aplicações da enorme quantidade de

informações geradas durante o Projeto Genoma Humano. Espera-se que a

“revolução” científica e tecnológica a que estamos presenciando possa se traduzir

em benefícios terapêuticos outrora inimagináveis (RISCH, 2000; GINSBURG, 2005).

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES E DISLIPIDEMIA

As Doenças Cardiovasculares constituem a primeira causa de morte no

mundo ocidental. De acordo com a American Heart Association cerca de 40% das

mortes são devido a problemas cardiovasculares e destas, 54% são resultados de

doença arterial coronariana (DAC) (AMERICAN HEART ASSOCIATION, 2005).

As DCV não se restringem mais aos países desenvolvidos. Cerca de 80% dos

óbitos por DCV no mundo ocorrem em países em desenvolvimento, de baixa e

média renda. Esses últimos são responsáveis por 86% das doenças

cardiovasculares. Além disso, estima-se que, até 2010, essas doenças representem

a principal causa de óbito nos países em desenvolvimento (ORGANIZAÇÃO PAN-

AMERICANA DE SAÚDE, 2003).

No Brasil e no Rio Grande do Sul, as DCV também representam a principal

causa de mortalidade. No Rio Grande do Sul, em 2005, representaram 29,6%, sendo

7391 óbitos devidos a doenças isquêmicas e 7398 a doenças cerebrovasculares, as

quais representam 70% de todas as causas de morte do grupo das DCV. As

doenças hipertensivas registram 1649 óbitos, o que equivale a 7,0% deste grupo.

Outras doenças cardíacas, com 3832 óbitos, correspondem a 17,9% (CEVS, 2005).

O projeto conhecido como “Atlas Corações do Brasil – 2005” teve como um dos

objetivos principais avaliar os fatores de risco cardiovascular na população brasileira. Os

resultados desse projeto mostram que a Região Sul está em primeiro lugar, com níveis

alterados de colesterol, acometendo mais os homens, seguido dos maiores índices de

hipertrigliceridemia, também com maior representatividade na população masculina.

Dessa forma, a identificação de fatores genéticos e ambientais, que influenciam

os níveis séricos de lipídeos no plasma, representa um grande passo no

desenvolvimento de estratégias que visam à prevenção e ao tratamento das DCV (LAI

et al., 2003). Uma melhor compreensão desses fatores de riscos tanto modificáveis,

tais como: o aumento dos níveis de colesterol total (CT), LDL-C (colesterol LDL), HDL-

C (colesterol HDL), hipertensão, diabete mellitus tipo 2 (DM2), dislipidemias quanto

aos fatores de risco não-modificáveis, tais como: a idade e a herança genética,

contribuem significativamente para a redução da mortalidade por doenças

cardiovasculares (STEINER, 2001; THIRD JOINT TASK FORCE, 2003; GARCIA et

al., 2006).

Alguns fatores de risco são manejados com medidas não-farmacológicas,

como obesidade e sedentarismo. Outros como: hipertensão, hipercolesterolemica,

hábito de fumar e intolerância aos carboidratos são tratados com medidas

medicamentosas e não-medicamentosas. Muitos estudos têm testado a hipótese de

que o controle dos fatores de risco coronariano, por meio de medidas

medicamentosas e não-medicamentosas, reduz a incidência de cardiopatia

isquêmica (HUMPHRIES et al., 2006; MANGRAVITE et al., 2006). Embora qualquer

artéria possa ser afetada, a aorta, as coronárias e os vasos cerebrais são os

principais alvos das placas de ateromas, levando ao infarto do miocárdio e ao infarto

cerebral. (YOKOYAMA, 2000; STAKOS et al., 2002; GINBURG et al., 2005).

As dislipidemias decorrem de alterações metabólicas nos níveis de lipídios

circulantes do sangue, estando diretamente relacionadas com a aterosclerose. O

depósito de lipídios desencadeia processos bioquímicos intermediários que

culminam com a formação de placas ateroscleróticas na íntima dos vasos arteriais

que, conseqüentemente, podem obstruir parcial ou totalmente um ou mais vasos

(YOKOYAMA, 2000; STANČÁKOVÁ et al., 2006).

A III Diretriz Brasileira de Prevenção de Aterosclerose classifica as

dislipidemias segundo análises laboratoriais em:

a. Hipercolesterolemia isolada – elevação isolada do CT, em geral

representada por aumento das lipoproteínas de colesterol de densidade baixa (LDL).

b. Hipertrigliceridemia isolada – elevação isolada dos triglicerídeos (TG), em

geral representada por aumento das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL),

ou dos quilomícrons (QM), ou de ambos.

c. Hiperlipidemia mista – valores aumentados do CT e dos TG.

d. HDL-C baixo – isolado ou em associação com aumento de LDL e/ou de TG.

Baseado na etiologia é possível ainda classificar as dislipidemias em

primárias ou secundárias. As primárias são conseqüências de causas genéticas e/ou

ambientais, sendo que algumas só se manifestam com influência ambiental, devido

à dieta inadequada e/ou ao sedentarismo. As hiperlipidemias englobam a

hipercolesterolemia familiar, dislipidemia familiar combinada, hipercolesterolemia

poligênica, hipertrigliceridemia familiar e síndrome da quilomicronemia (IV

DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2007; MANO, 2003;

MARTINEZ, 2004).

As dislipidemias secundárias podem ser causadas por fatores como:

hipotireoidismo, diabetes mellitus, síndrome nefrótica, insuficiência renal crônica,

obesidade, alcoolismo, icterícia obstrutiva, uso de doses altas de diuréticos,

betabloqueadores, corticosteróides e anabolizantes (WAGNER et al., 2000; III

DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2001). Essa classificação da

dislipidemia é de suma importância para o tratamento. As dislipidemias secundárias

são curáveis com o controle da doença de base, enquanto as primárias são apenas

controláveis (IV DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2007;

MANO, 2003; MARTINEZ, 2004).

Na espécie humana, o colesterol, os TG e os fosfolipídeos cumprem um papel

importante no metabolismo. O colesterol atua como componente estrutural essencial

das membranas celulares, além de ser precursor de hormônios esteróides e outras

substâncias orgânicas importantes, como os ácidos biliares. O colesterol está presente

sob duas formas, colesterol livre e ésteres de colesterol (combinação do colesterol com

ácidos graxos) (DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2007).

Como os lipídeos são insolúveis em meio aquoso, necessitam ser

transportados no organismo por proteínas, formando complexos hidrossolúveis de

alto peso molecular, denominadas lipoproteínas.

Existem cinco classes de lipoproteínas plasmáticas: quilomícron (Qm), VLDL,

LDL, HDL, lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) e lipoproteína (a) (Lp (a))

(MARTINEZ, 2004). A estrutura e a composição dessas lipoproteínas são

enzimaticamente reguladas e, de forma geral, são formadas por uma parte central

de lipídios hidrofóbicos circundadas por uma capa de lipídios polares e proteínas. As

proteínas que as constituem são chamadas de apolipoproteínas ou apoproteínas

(apo) (IV DIRETRIZES BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2007).

As apolipoproteínas têm diversas funções no metabolismo das lipoproteínas,

tais como: proporcionar estabilidade estrutural, solubilizar os lipídios altamente

hidrofóbicos, servir como ligantes para receptores celulares ou agir como co-fatores

para enzimas envolvidas no metabolismo de lipoproteínas. Os principais tipos de

apolipoproteínas são: apo A (apo A-I, apo A-II, apo A-IV e apo A-V), apo B (apo B-

100 e apo B-48), apo C (apo C-I, apo C-II, apo C-III) e apo E (E2/E3/E4). A presença

e a distribuição delas variam de acordo com a lipoproteína (III DIRETRIZES

BRASILEIRAS SOBRE DISLIPIDEMIAS, 2001). A Tabela 1 mostra as principais

classes e características das lipoproteínas plasmáticas.

A IV Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias, fornecidas pelo Departamento

de Aterosclerose, pertencente à Sociedade Brasileira de Cardiologia (2007),

recomendam a quantificação dos níveis séricos de colesterol total, HDL-C, LDL-C e

TG para a definição do perfil lipídico dos pacientes. O diagnóstico adequado é de

suma importância, de modo a identificar as alterações nas concentrações de lipídios,

objetivando ações que reduzam a morbidade e a mortalidade induzidas pela

aterosclerose. É desejável ter baixos níveis de LDL-C na circulação sangüínea e,

altos níveis de HDL-C. O papel dos lipídios como importante fator da patogênese da

DAC está solidamente estabelecido, pois, em sua maioria, os exames de avaliação

de perfil lipídico incluem análises do CT, LDL-C, HDL-C e TG.

A Tabela 2 mostra os valores de referência dos lipídios plasmáticos adotados

no Brasil, segundo as III Diretrizes Brasileiras de Dislipidemias e Prevenção da

Aterosclerose (2001).

Tabela 1: Principais classes e características das lipoproteínas plasmáticas

Principais classes e características das lipoproteínas plasmáticas

Lipoproteínas

Densidade

(g/dl)

Diâmetro

(Â)

Composição

(%)

CE CL TG FL PR

Apolipoproteínas

Quilomícrons < 0.95 800 -5.000 5 2 84

7 2 B-48; E; C A-I; A-II; A-

VLDL <1.006 30 - 800 12

7 55

8 B -100; E; C

IDL 1.006-1.019 250 - 350 23

8 32

16 B-100; E; C

LDL 1.019-1.063 180 - 280 38

9 22

21 B- 100

HDL2 1.063-1.125 90 - 120 16

6 4 30

44 A-I; A-II

HDL3 1.125-1.210 50 -90 12

3 4 26

55 A-I; A-II

CE- colesterol esterificado; CL - colesterol livre; TG- triglicerídeos; FL- fosfolípides; PR- proteínas

Fonte: III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (2001).

Tabela 2: Valores de referência dos lipídios plasmáticos adotados no Brasil

Valores de referência dos lipídios para indivíduos >20 anos de idade

Lípides Valores (*) Categorias

< 200 Ótimo

CT 200-239 Limítrofe

>240 Alto

< 100 Ótimo

LDL-C 100 -129 Desejável

130 -159 Limítrofe

160 -189 Alto

>190 Muito Alto

HDL-C < 40 Baixo

> 60 Alto

< 150 Ótimo

TG 150 - 200 Limítrofe

200 - 499 Alto

> 500 Muito alto

(*Valores em mg/dL)

Fonte: III e IV Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (2001).

Diversos estudos já demonstraram que o LDL-C é considerado fator causal e

independente de aterosclerose e sobre qual se deve agir para diminuir a

morbimortalidade. Tais estudos evidenciaram também que as concentrações séricas

de LDL-C recomendadas na prevenção da doença aterosclerótica exigem reduções

mais agressivas para atingir metas lipídicas mais baixas, em pessoas consideradas

de alto risco (COLLINS, 2003; BALLANTYNE, 2003; NISSEN, 2004; CORELLA e

ORDOVAS, 2005), quando comparadas às classificadas como de médio e baixo

risco para eventos cardiovasculares. Sendo assim, a definição da meta de LDL-C a

ser atingida depende da categoria em que se encontra o paciente (MARTINEZ,

2004).

As partículas de LDL podem se acumular na íntima das artérias coronárias,

principalmente quando as concentrações sangüíneas são altas e maiores

quantidades de partículas podem ultrapassar as células endoteliais e sofrer acúmulo

na parede do vaso. Muitas alterações ocorrem, levando ao desenvolvimento de uma

lesão aterosclerótica (BERTOLAMI, 2000).

Estudos epidemiológicos e longitudinais e transversais demonstram relação

inversa entre níveis de HDL-C e ocorrência de doença arterial coronariana (DAC).

Dados clínicos são também compatíveis com essa associação, pois doenças

genéticas com partículas HDL diminuídas (deficiência de apolipoproteína A-I)

acompanham-se por maior freqüência de DAC (MILTIADOUS et al., 2005; FRANÇA

et al., 2005; SORLI et al., 2006; GARCIA et al., 2006; LIMA et al., 2006).

As HDLs, além de realizarem o efluxo de colesterol, têm ainda propriedades

anti-aterogênicas adicionais, como antiinflamatórias, anti-agregativas e antioxidantes

(PHAN et al., 2006). As HDLs são um grupo heterogêneo de partículas que variam

em tamanho, densidade, forma e composição de lipoproteínas. As partículas de HDL

são sintetizadas no fígado e no intestino e são liberadas na corrente sangüínea por

exocitose. As formas nascentes são discóides. À medida que recebem moléculas de

colesterol e apoproteínas, sua forma se torna esférica (CAMPBELL, 2000; IZAR, et

al., 2005; LIMA et al., 2006).

Os triglicerídeos constituem aproximadamente 95% do tecido adiposo e são

as principais formas de armazenamento de lipídios no corpo. Concentrações séricas

elevadas de triglicerídeos também têm sido relacionadas com uma maior incidência

de aterosclerose. Há consenso entre os pesquisadores de que essas estruturas são

importantes marcadores metabólicos, sinalizando para outras alterações lipídicas

com potencial aterogênico (HARDMAN e LIMBIRD, 2001; SCHIAVO et al., 2003;

FREITAS, 2004).

3 GENES ENVOLVIDOS COM O METABOLISMO DE LIPÍDIOS

Os níveis séricos de lipídeos são características multifatoriais, determinadas

por um grande número de fatores genéticos e ambientais. Variações em um grande

número de genes envolvidos na síntese de proteínas estruturais e relacionados ao

metabolismo lipídico têm sido associadas às dislipidemias. Nenhum gene atua

isoladamente sobre uma característica – quando a etiologia da característica é

poligênica, o resultado no indivíduo é um somatório de pequenos efeitos de vários

genes (PALLAND et al., 2001; ANDRADE e HUTZ, 2002; ORDOVAS, 2006).

Sendo assim, qualquer gene que seja responsável pela produção de uma

proteína envolvida nesta rota metabólica poderia ser um “gene” candidato na

investigação de determinantes genéticos dos níveis lipídicos. O somatório de

variações, com pequeno efeito em cada um desses genes, poderia levar à

modificação do perfil lipídico de um indivíduo, predispondo à cardiopatia. Como

essas variantes genéticas são bastante freqüentes na população em geral (1,0% a

80,0 %), seu impacto é muito maior na saúde pública quando comparadas com

mutações de grande efeito, mas que são muito mais raras (ANDRADE e HUTZ,

2002; GINSBURG et al., 2005; CASAS et al., 2006).

No metabolismo de lipídios pode-se observar que várias proteínas, tanto

estruturais como com as atividades catalíticas, estão envolvidas no correto balanço

metabólico. Dessa forma, a identificação de alterações em genes que codificam

essas proteínas é de especial interesse para explicar a variância encontrada nos

níveis lipídicos. Tais variações genéticas, quando freqüentemente encontradas na

população estudada, são chamadas de “polimorfismos”. (ANDRADE e HUTZ, 2002;

CONSTANZA et al., 2005).

3.1 POLIMORFISMO EcoRI DA APOLIPOPROTEÍNA B (APO B)

Apolipoproteína B é uma proteína anfipática, que existe em duas formas: apo

B100 e apo B48. A apo B é a principal constituinte de LDL, sendo sintetizada no

fígado e no intestino. Essa apolipoproteína possui cinco domínios estruturais, sendo

o quarto domínio (aminoácidos 3070-4100), o responsável pela interação da apo B

com os receptores da LDL e pela manutenção da integridade desta partícula. Esses

processos modulam a remoção de LDL e regulam a biossíntese do colesterol

(SAKUMA et al., 2004; TAHRI-DAIZADEH et al., 2004).

A apo B100 é uma ligante para o receptor da LDL. A apo B100 também está

presente na Lp(a), onde se liga a um polipeptídio homólogo ao plasminogênio. A

Lp(a) é considerada um fator de risco independente para DAC (OLOFSSON, 2005;

FAERGEMAX et al., 2006).

Alguns estudos epidemiológicos mostraram que concentrações plasmáticas

aumentadas de apo B são importantes marcadores de risco para DAC. Segundo o

estudo, “Estudo de risco de mortalidade relacionado apopolipoproteínas” (AMORIS,

2001), a dosagem de apo B é considerada o melhor índice relacionado a fator de

risco para DAC, superando dosagens de LDL-C ou CT. Além disso, esse estudo

mostrou que o risco clínico da apo B não somente é determinado pelo número de

partículas LDL, mas também por serem partículas pequenas e densas (CHAN e

WATTS, 2006).

A síntese da apo B48 é devida a uma edição do RNA mensageiro do códon

2153, gerando uma alteração na seqüência de nucleotídeos CAA do gene da apo

B100 para a seqüência UAA. Essa alteração resulta no término precoce da proteína

apo B. A apo B48 representa 48% da porção amino-terminal da apo B100. A apo

B48 é sintetizada pelas células intestinais e é um importante componente no

agrupamento e na secreção dos quilomícrons. A hidrólise dos triglicerídeos pela LPL

converte este quilomícron remanescente, que é rapidamente removido da circulação

pelo processo mediado pela apolipoproteína E (MARTINEZ, 2004).

O gene APOB se localiza no braço curto do cromossomo 2 (2p24) e contém

29 exons e 28 introns. A clonagem e o seqüenciamento do gene da APOB tornaram

possível o estudo de suas variações no DNA humano. Várias mutações no gene

APOB já foram estudadas. Dentre os sítios polimórficos já descritos, destacam-se

XbaI (exon 26), EcoRI (exon 29), Ins/Del (exon 1- peptídeo sinalizador), MspI (exon

26) e região hipervariável na extremidade 3’ (VNTR) (SALAZAR et al., 2003;

SAKUMA, 2004).

O polimorfismo EcoRI do gene APOB resulta de uma alteração de uma única

base na região codificante, exon 29, ocorrendo uma substituição do aminoácido

guanina pela adenina na posição 4154 desse gene. Esse polimorfismo tem sido

investigado pela sua influência na variação dos níveis de LDL-C (MISRA, 2001). A

presença do sítio polimórfico para enzima de restrição EcoRI revela o alelo E+.

Quando ocorre a mutação, a enzima EcoRI perde o sítio de restrição, originando o

alelo E-. Essa variação determina três genótipos: E+E+, E+E- e E-E- (MISRA et al.,

2001).

Os polimorfismos XbaI e EcoRI têm sido associados com DAC em brasileiros.

O significado funcional do polimorfismo EcoRI ainda é desconhecido. A alta

freqüência do alelo E– em pacientes com DAC sugere que a mudança de

aminoácidos possa alterar o metabolismo de lipoproteínas que contêm apo B ou

resultar em uma apo B mais aterogênica. Alternativamente, é possível que essa

variação esteja em desequilíbrio de ligação com outra mutação dentro do gene

APOB ou em genes vizinhos (PURI et al., 2003; MASON et al., 2003).

Sendo assim, muitos polimorfismos presentes no gene APOB já foram

utilizados como marcadores em estudos populacionais (RFLPs de XbaI, EcoRI,

MspI), com o objetivo de correlacioná-los com os níveis lipídicos ou risco de infarto

do miocárdio. As conclusões desses estudos variam conforme a população estudada

(RIOS et al., 2003; MASON et al., 2003 SAKUMA et al., 2004; BEEN et al., 2005).

Esses estudos sugerem que o polimorfismo EcoRI do gene APOB está

associado com alterações nos níveis lipídicos. O alelo E- do polimorfismo EcoRI está

associado com níveis elevados de LDL-C e CT (FORTI et al., 2003; TAN et al., 2003;

SAKUMA et al., 2004; BEEN et al., 2005).

Da mesma forma, estudos mostram que a apo B é um ótimo marcador de

risco para DCV e um melhor preditor para a resposta a fármacos do que colesterol

LDL e o HDL (4S, 1998; AFCAPS/TexCAPS, 2000; LIPID, 2002; SNIDERMAN et al.,

2003). A metodologia para determinar os níveis de apo B no plasma apresenta

várias vantagens em relação às metodologias empregadas na determinação dos

níveis de LDL-C.

Alguns estudos têm sido feito com os polimorfismos do gene APOB e o uso

de fármacos, principalmente estatinas. Um estudo realizado por Gusmán et al (2000)

com três polimorfismos do gene APOB (Ins/Del, XbaI e EcoRI) mostrou que os

indivíduos com genótipo I/I para o polimorfismo Ins/Del com o uso de fluvastaina

diminuíram os níveis de CT e LDL, reduzindo 23% e 34% respectivamente

(GUZMÁN et al., 2003).

Outro estudo realizado com o polimorfismo XbaI mostrou que os pacientes

portadores do alelo X- reduziram mais os níveis de CT que os pacientes portadores

do alelo X+ (-23,9% VS -13,6%, respectivamente) (YE et al., 2003).

3.2 POLIMORFISMO TAQIB PROTEÍNA TRANSFERIDORA DE ÉSTERES DE COLESTEROL

(CETP)

A CETP é a proteína que promove a troca de lipídeos entre as partículas

lipoprotéicas, transferindo ésteres de colesterol das HDLs para outras lipoproteínas

para subseqüente recaptação pelo fígado. Por aumentar o conteúdo de ésteres de

colesterol de LDLs e VLDLs, a CETP aumenta a aterogenicidade das lipoproteínas.

Sugerindo, assim, um papel importante da CETP no desenvolvimento de DCV

(SORLI et al., 2006).

A deficiência da proteína CETP humana está claramente associada com

níveis elevados de HDL-C. Esta deficiência genética da CETP está associada com

hiperalfalipoproteinemia e conseqüentemente com HDL-C aumentado. Observa-se,

entretanto, a existência de uma modulação farmacológica da atividade da CETP por

drogas anti-lipidêmicas, tais como as estatinas e fibratos, usadas em hiperlipidemias,

contribuindo para atenuação do perfil lipídico aterogênico (BROSSEAU et al., 2002;

LE GOFF et al., 2004).

O gene CETP está localizado no cromossomo 16, consistindo de 16 exons. O

mRNA do gene CETP codifica uma pré-proteína de 493 aminoácidos, a qual contém

um peptídeo sinal de 17 aminoácidos. O locus da CETP é altamente polimórfico.

Numerosos polimorfismos e variantes raras no gene CETP humano já foram

identificados, entre os quais se pode citar: o polimorfismo MspI (localizado no intron

8), RsaI (localizado no exon 14) e TaqIB (localizado no intron 1); todos fortemente

associados à concentração sérica de HDL-C. (BROUSSEAU et al., 2007).

Os níveis do HDL-C são um forte preditor de risco para o desenvolvimento de

DCV. Sendo assim, vários estudos, em diferentes populações, da Ásia, Europa e

Estados Unidos têm demonstrado que variantes genéticas no gene CETP podem

influenciar as concentrações de HDL-C. Muitos estudos indicaram uma associação

inversa entre as concentrações de HDL no plasma e a atividade da CETP (LIU et al.,

2002; BARTER et al., 2003; HUMPHRIES e MORGAN, 2004; MILTIADOUS et al.,

2005; SORLI et al., 2006; DANESHPOUR et al., 2007).

Dos vários polimorfismos estudados no gene CETP humano, um em particular

tem recebido especial atenção. A atividade da CETP está associada a um

polimorfismo que cria um sítio de restrição para a enzima TaqI (polimorfismo TaqIB

ou alelo B1) no nucleotídeo 277, localizado no primeiro intron do gene CETP

(CALRQUIST et al., 2003).

Vários estudos, ainda, têm reportado que o polimorfismo TaqIB do gene

CETP está associado com níveis de HDL-C e risco para DAC, mas estes resultados

ainda são inconsistentes. Além disso, tem-se investigado a interação desta variante

genética e o uso de estatinas (KLERKX et al., 2004; HUMPHRIES e MORGAN,

2004; BOEKHOLDT et al., 2007; SVIRIDOV et al., 2007).

Uma recente meta-análise mostrou que indivíduos com o genótipo B2B2

apresentaram HDL-C mais elevado que os indivíduos com o genótipo B1B1.

Indivíduos com o genótipo B1B1 apresentam, portanto, um risco maior de

desenvolver DAC (BOEKHOLDT et al., 2005). Outro estudo mostrou que os homens

com o genótipo B2B2 (alelo B2, ausência do sítio TaqIB) parecem ter um risco

menor de desenvolver doença arterial coronariana, embora esse resultado não

pareça ser significativo em mulheres (CHASMAN et al., 2004).

Vários estudos corroboraram com esses resultados, onde os portadores do

alelo B1 deste polimorfismo estão associados com baixos níveis de HDL-C e altos

níveis de CETP no plasma (BOEKHOLDT et al., 2005; MARCHANG et al., 2006;

SVIRIDOV et al., 2007; LI et al., 2007).

A relação entre a concentração da CETP e os genótipos do polimorfismo

TaqIB é complexa Os mecanismos pelos quais, esse referido polimorfismo pode

influenciar a atividade da CETP ainda são desconhecidos. O fato dessa alteração ter

sido encontrada em um intron e de não parecer afetar o processo de splicing, não

descarta a possibilidade de que essa região tenha um papel na regulação da

atividade promotora do gene CETP. A explicação mais plausível é a de que esse

polimorfismo está em desequilíbrio de ligação com uma mutação funcional ainda

desconhecida na região reguladora do gene CETP (MARSCHANG et al., 2006;

DANESHPOUR et al., 2007).

A associação entre polimorfismos no gene CETP e risco de desenvolver

aterosclerose depende da interação destes com fatores ambientais, tais como:

consumo de álcool, dieta, fumo, obesidade e seus efeitos nos níveis de HDL-C

(HUMPHRIES e MORGAN, 2004; CORELLA e ORDOVAS, 2005). Muitos

polimorfismos correspondem a alterações em um nucleotídeo e estão localizados em

introns, exons, região promotora do gene ou ainda na região flanqueadora 3’ do

gene.

Polimorfismos no gene CETP constituem, portanto um marcador essencial da

relação entre o gene CETP, o metabolismo lipídico e as características clínicas de

doenças cardíacas (LI et al., 2007; HUMPHRIES e MORGAN, 2004; CORELLA e

ORDOVAS, 2005).

Assim como ocorrem interações entre genes e ambiente, já se observa

também a ação conjunta de diferentes polimorfismos e o uso de alguns

medicamentos. Acredita-se que haja uma interação entre o gene da CETP e as

estatinas, já que ambos afetam a concentração e a composição dos lipídios. O

polimorfismo TaqIB do gene da CETP vem sendo investigado com relação à

resposta a diferentes tratamentos (ANDRADE e HUTZ, 2002).

O estudo realizado por CALRQUIST et al. (2003) observou uma redução da

atividade da CETP e a terapia com estatinas. Neste estudo, realizado em homens

com aterosclerose coronariana e uso de pravastatinas, observou-se uma associação

significativa entre a ação farmacológica e o genótipo da CETP. O grupo que utilizou

este fármaco apresentou uma redução de 16% nas concentrações de CETP no

plasma, em relação ao grupo que utilizou placebo.

O referido estudo relatou também uma progressão mais acentuada da

aterosclerose em portadores homozigóticos para o alelo B1, ao mesmo tempo em

que indivíduos heterozigóticos para este alelo (B1/B2) apresentaram um grau

intermediário e os portadores homozigóticos do alelo B2 apresentaram um grau

inferior para a progressão aterosclerótica.

O estudo realizado por Fiegenbaum et al. (2005) mostrou que os indivíduos

homozigotos B2B2 apresentaram uma melhoria nos níveis de HDL-C que os

portadores do alelo B1, após o uso de estatinas. Resultados semelhantes foram

encontrados em outros estudos (WINKELMANN et al., 2003; KLERKX et al., 2004).

3.3 POLIMORFISMO S447X DO GENE DA LIPASE LIPOPROTÉICA (LPL)

A LPL é uma enzima que se localiza na superfície endotelial dos capilares

sanguíneos e é responsável pela hidrólise dos triglicerídeos dos Qm e das VLDL.

Desse modo inicia uma cascata lipolítica, convertendo moléculas de VLDL em LDL.

As lipoproteínas ricas em triglicerídeos ligam-se à lipase através da apolipoproteína

CII, localizada na superfície da lipoproteína, a qual também estimula a ação

enzimática. Os monoacilgliceróis e os ácidos graxos liberados da degradação são

absorvidos por tecidos como o adiposo e o muscular, onde são reesterificados e

armazenados. Esse processo possibilita o armazenamento e a disponibilização pelo

organismo da sua fonte energética mais importante, as gorduras (MIRANDA et al.,

2004; RIP et al., 2006).

Mais de 60 mutações diferentes do gene da LPL foram descritas até agora,

podendo resultar tanto na diminuição da síntese da enzima quanto na sua atividade.

A diminuição na atividade da LPL pode influenciar as concentrações de lípides

plasmáticos, causando graus variados de hipertrigliceridemia isolada ou associada à

hipercolesterolemia (MARTINEZ, 2004; WUNG et al., 2006).

O gene LPL está localizado no cromossomo 8p22, abrangendo,

aproximadamente, 30 kb no genoma. O gene da LPL apresenta muitas mutações

e/ou polimorfismos e tem sido extensivamente investigado por seu papel nas

mudanças dos níveis de lipídios plasmáticos e na predisposição da DCV. (RIOS et

al., 2003; MIRANDA et al., 2004; WUNG et al., 2006).

O polimorfismo S447X do gene LPL ocorre no exon 9, onde a substituição da

citosina (C) por Guanina (G) no nucleotídeo 1595, resulta na troca de uma serina

447(TCA) por um códon de terminação e na supressão dos dois últimos

aminoácidos, serina e glicina na posição 447 da proteína. Acredita-se que, em

algumas populações, o polimorfismo S447X possa ter um efeito protetor contrário ao

desenvolvimento da aterosclerose e conseqüentemente da DAC. (SHIMO-

NAKANISHI et al., 2001; MORABIA et al., 2003; MIRANDA et al., 2004;

NETTLETON et al., 2006; RIP et al., 2006).

O efeito do polimorfismo sobre a atividade da LPL ainda não está

estabelecido. Alguns estudos mostraram que o polimorfismo S447X parece afetar

favoravelmente o metabolismo das VLDL, porque os portadores do alelo G

apresentaram concentrações de triglicerídeos baixas e elevados níveis de HDL, se

comparados com os não indivíduos com o alelo C (ALMEIDA et al., 2003;

ANDERSSON et al., 2003; RIP et al., 2006; WUNG et al., 2006).

Porém, em alguns estudos a presença do polimorfismo S447X não teve efeito

sobre as concentrações plasmáticas de lípides em mulheres (WITTRUP et al., 2002;

RIOS et al., 2003; ALMEIDA et al., 2007). Uma razão para esses achados seria o

estrógeno, pois esse diminui a atividade da LPL pela desregulação na transcrição do

gene ou por uma possível modificação pós-transcricional da proteína (IVERIUS et

al., 1988; HOMMA et al., 2000).

Poucos estudos têm sido realizados com o polimorfismo S447X sobre a

alteração dos níveis lipídicos com o uso de estatinas. O estudo realizado por Sing et

al (1999) mostrou que os indivíduos com o genótipo GG aumentaram o nível de HDL

(46.2 ± 1,2) após o uso de fluvastatina. O estudo realizado por Thompson et al.

(2005) também mostrou que os indivíduos com o genótipo GG reduziram o colesterol

total mais que os indivíduos com o alelo C.

3.4 POLIMORFISMO -250G>A DA LIPASE HEPÁTICA (LIPC)

A LIPC é uma enzima plasmática lipolítica que tem papel importante, tanto no

metabolismo das partículas de HDL, como nas de LDL. Sua função é catalisar a

hidrólise de triacilgliceróis e fosfolipídeos de lipoproteínas. O aumento da LIPC está

associado à formação de partículas altamente aterogênicas (LDL pequenas e

densas) e diminuição dos níveis de partículas anti-aterogênicas, especialmente,

HDL

. Além desta atividade lipolítica, a lipase hepática participa como ligante para

promoção da recaptação hepática de lipoproteínas, incluindo lipoproteínas ricas em

triglicerídeos, LDL e HDL. (DEEB et al., 2003; ZAMBON et al., 2003; ELLER et al.,

2005).

O gene LIPC está localizado no cromossomo 15q21, é composto por 9 exons

e codifica uma proteína de 449 aminoácidos (ZHAO et al., 2006). Estima-se que 30 a

45% da atividade da LIPC é determinada geneticamente (ELLER et al., 2005).

Vários polimorfismos já foram descritos nesse gene, especialmente na região

promotora. Quatro polimorfismos -250G>A, -514C>T, -710T>C e -763A>G estão em

completo desequilíbrio de ligação, determinando dois haplótipos. (FERDINAND et

al., 2000; JUO et al., 2001; PERRET et al., 2002; CARR et al., 2004; ZHAO et al.,

2006).

O polimorfismo –250G>A, localizado na região promotora do gene da LIPC,

tem sido associado com níveis plasmáticos de HDL e com LDL. Estudos têm

mostrado que os polimorfismos na região promotora da LIPC controlam a atividade

da LIPC, enquanto a atividade da LIPC afeta os níveis de HDL-C (SU et al., 2002;

ZAMBON et al., 2003; ANDRADE et al., 2004; ELLER et al., 2005; NETTLETON et

al., 2006; ZHAO et al., 2006, SVIRIDOV et al., 2007).

A relação dos polimorfismos no gene LIPC com DAC ainda é controverso

(ANDRADE et al., 2004; HUMPHRIES et al., 2004; ZHAO et al., 2006). No estudo

realizado por Ji et al. (2002) e Andersen et al. (2003) observou-se um aumento da

freqüência dos alelos mais raros em pacientes com DAC, mas esses resultados não

foram confirmados por outros autores (SHOHERT et al., 1999; COUTURE et al.,

2000). No estudo realizado por Faggin et al. 2002 os indivíduos com o alelo mais

comum (alelo C do polimorfismo -514C>T do gene LIPC) aumentaram a

suscetibilidade para eventos cardiovasculares, provavelmente devido à presença de

um maior número de partículas LDL mais densas e aterogênicas que nos indivíduos

com o genótipo TT.

No estudo realizado por Zhao et al. (2006) com o polimorfismo -250G>A os

níveis de HDL-C foram mais elevados nos indivíduos com o genótipo AA ou AG que

os indivíduos com o genótipo GG. Sendo assim, acredita-se que os níveis de HDL-C

elevados, em indivíduos com o alelo A, estão associados com a atividade da LIPC

por afetar diretamente a expressão da LIPC ou outro polimorfismo que está em

desequilíbrio de ligação com esse, acarretando a diminuição da atividade da enzima.

Porém, as mudanças nos níveis lipídicos parecem mais evidentes nas mulheres

(ELLER et al., 2005; ZHAO et al., 2006).

Entretanto, no estudo realizado por Andrade et al. (2004) essa associação

dos genótipos com os níveis de HDL-C, onde os indivíduos com o alelo “A”

apresentaram níveis de HDL-C mais elevados que os indivíduos com o genótipo GG

foram encontrados apenas em homens. Resultados semelhantes foram encontrados

por Chen et al. (2003). É estabelecido que a atividade da LIPC seja mais baixa em

mulheres pré-menopausa que em homens (CARR et al., 2001; DEEB et al., 2003); e

a terapia de reposição hormonal para mulheres pós-menopausa pode interferir na

atividade da LIPC, resultando no aumento dos níveis de HDL-C (SOMEKAWA et al.,

2002; YAMAKAMA-KOBAYASHI et al., 2002).

A atividade da LIPC e a concentração dos níveis de HDL-C são influenciadas

por um grande número de fatores. Fatores hereditários e estilo de vida, tais como:

dieta (ORDOVAS et al., 2002; ZHANG et al., 2005; NETTLETON et al., 2006),

consumo de álcool (de ANDRADE et al., 2004; ZHANG et al., 2005), tabagismo

(KONG et al., 2001), atividade física, obesidade (ZHANG et al., 2005), idade

(ZHANG et al., 2005; FAN et al., 2006), etnia (CARR et al., 2001; BERK-PLANKEN

et al., 2003) hormônios sexuais e gênero (CARR et al., 2001; SOMEKAWA et al.,

2002, YAMAKAMA-KOBAYASHI et al., 2002; CHEN et al., 2003; DEEB et al., 2003;

ANDRADE et al., 2004) são conhecidos por ter um papel central na determinação da

variação interindividual nos níveis de HDL-C.

Dois estudos foram realizados com a finalidade de avaliar a influência do

polimorfismo -250G>A na resposta ao uso das estatinas. Porém, os dois estudos

realizados por Berk-Planken et al. (2003) e Fiegenbaum et al. (2005) não

encontraram variação dos níveis lipídicos entre os genótipos, nos pacientes tratados

com atorvastatinas e sinvastatinas, respectivamente.

Alguns estudos foram realizados com polimorfismo -514C>T que está em

desequilíbrio de ligação com o polimorfismo -250G>A, mas os resultados são

controversos. No estudo realizado por Zambon et al. (2001) os indivíduos com o

genótipo CC, do polimorfismo -514C>T, mostraram uma diminuição da atividade da

LIPC e conseqüentemente uma melhor densidade das partículas LDL e HDL

–C

que os indivíduos com o genótipo CT ou TT, com o uso de fluvastatina.

Porém, em um estudo realizado por Lahoz et al. (2004) com o mesmo

polimorfismo observou-se um aumento dos níveis de HDL-C nos indivíduos com o

alelo “T”; e os indivíduos com o genótipo CC não apresentaram mudança nos níveis

de HDL-C depois de tratados com pravastatinas.

4 FARMACOGENÉTICA

Quando modificações nos hábitos alimentares não são suficientes para

normalizar as taxas de colesterol plasmático, se utiliza terapias medicamentosas,

visando ou reduzir a síntese endógena de colesterol ou aumentar a sua secreção na

forma de sais biliares. No primeiro caso, se utiliza inibidores competitivos da 3-

hidroxi-3- metilgultaril coenzima A (HMGCoA-redutase), chamados estatinas. As

estatinas (atorvastatina, lovastatina, sinvastatina, pravastatina e fluvastatina) são os

agentes mais bem tolerados e mais efetivos no tratamento das dislipidemias. Esses

fármacos possuem variados graus de atividade sobre a enzima HMGCoA-redutase,

que catalisa uma etapa precoce e limitante da taxa de biossíntese do colesterol.

Doses mais altas das estatinas mais potentes (atorvastatina e sinvastatina) podem

também reduzir os níveis de triglicerídeos causados por níveis elevados de VLDL.

Algumas estatinas também são indicadas para elevar os níveis de HDL-C, embora

essa significância continue tendo de ser comprovada (MAHLEY e BERSOT, 2003;

CHASMAN et al.; 2004; MANGRAVITE et al., 2006).

Um novo ramo da ciência, denominado de Farmacogenética, tem buscado

compreender a variabilidade genética humana, associando-a as diferentes respostas

dos indivíduos aos medicamentos (STAKOS et al., 2002; HUMPHRIES et al., 2006).

O conhecimento advindo desses estudos poderá ter implicações diretas sobre a

eficácia terapêutica e os potenciais efeitos colaterais relacionados às drogas. A

expectativa é que se possa selecionar o medicamento mais seguro e eficaz para

cada tipo de paciente, de acordo com seu perfil genético. O custo-efetividade da

administração racional de medicamentos, através desse novo enfoque, trará grandes

mudanças de paradigmas na Medicina.

Nesse sentido, as estatinas diminuem os níveis LDL colesterol em 20% a

55%, dependendo da dose e da estatina empregada, sendo aceito que esta ação

promove uma maior expressão dos receptores de LDL. Estudos sobre os

mecanismos de ação dessas drogas demonstraram que elas agem alterando a

síntese e a composição das lipoproteínas, modificando seu potencial aterogênico,

bem como reduzindo a absorção intestinal do colesterol (MANGRAVITE et al., 2006).

Na área da Cardiologia, vários estudos farmacogenéticos estão sendo

conduzidos, objetivando relacionar os efeitos terapêuticos das estatinas em

pacientes com doença arterial coronariana e a variabilidade genética. Observa-se

que os níveis de diminuição dos lipídios no plasma, em resposta ao tratamento com

estatinas, variam consideravelmente entre os indivíduos (ANKE-HILSE, 2002).

Dados dos maiores estudos randomizados envolvendo estes fármacos mostram que

as estatinas são as mais eficientes em baixar os níveis de colesterol total (18 a 25%)

e LDL (25 a 55%). Além disso, também reduzem moderadamente os níveis de

triglicerídeos (10 a 15%) e aumentam da mesma forma os níveis de HDL (5 a 10%).

Esses estudos também mostram que a utilização de estatinas diminui os riscos de

eventos cardíacos fatais e não-fatais (24 a 37%), independentemente de outros

fatores como a idade, sexo, tabagismo, diabetes ou hipertensão (KREISBERG e

OBERMAN, 2002; CHASMAN et al., 2004; HERRINGTON et al., 2005).

5 OBJETIVOS

• Investigar a freqüência alélica e genotípica de polimorfismos presentes

nos genes LIPC, LPL, CETP e APOB em pacientes dislipidêmicos;

• Correlacionar as variantes gênicas encontradas com dados clínicos,

bioquímicos e antropométricos, visando contribuir para uma melhor

definição da relação entre genótipo e fenótipo da DCV;

•

Verificar a influência das variantes genéticas encontradas nos genes

investigados com a resposta aos fármacos hipolipemiantes, visando

entender a relação farmacogenética.

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Na presente dissertação de mestrado foram avaliados quatro polimorfismos

presentes nos genes APOB, CETP, LIPC e LPL em uma amostra de pacientes

dislipidêmicos do Rio Grande do Sul. Os genes estudados e suas proteínas

apresentam papel importante no metabolismo dos lipídios. Os genótipos obtidos

foram analisados quanto as suas possíveis influências sobre os níveis lipídicos e

resposta ao tratamento com estatinas.

A partir das análises feitas, foi possível encontrar uma associação da

presença do polimorfismo -250G>A, com os níveis de HDL-C e de TG. Os indivíduos

com genótipo AA apresentaram níveis de TG maiores que os indivíduos portadores

dos genótipos GA e GG, para análises ajustadas e não ajustadas. Esse resultado

está de acordo com o encontrado em outros estudos. (TAHVANAIENEN et al, 1998;

JANSEN et al, 1999; PIHLAJAMÄKI et al, 1999).

Alterações genéticas no gene LIPC têm sido muito investigadas por

influenciar os níveis de HDL-C. Diferentes estudos têm mostrado uma relação

inversa entre a atividade da LIPC e os níveis de HDL-C. Nesses estudos, os

indivíduos com o alelo A apresentam níveis elevados de HDL-C e, assim, uma baixa

atividade da LIPC, por afetar a expressão da proteína ou por estar em completo

desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos que afetam a atividade da LIPC

(HUMPHRIES et al, 2004; ELLER et al, 2005; ZHAO et al, 2006).

No presente estudo, os indivíduos com o alelo G desse polimorfismo

apresentaram níveis de HDL-C maiores que os indivíduos portadores do genótipo

AA para análises ajustadas. Como relatado no artigo, várias explicações são

possíveis para esses achados. Os indivíduos com genótipo AA apresentaram média

de IMC mais elevada que os indivíduos com genótipo GG ou GA, sendo que existe

uma relação inversa entre os níveis de IMC e os níveis de HDL-C (ZHANG et al,

2005). Outra explicação possível é a influência do gênero na atividade da LIPC e

nos níveis de HDL-C, onde os homens apresentam níveis mais baixos de HDL-C e,

conseqüentemente, uma alta atividade da LIPC. No presente estudo, os homens

também apresentaram níveis de HDL-C mais baixos e 70% dos indivíduos com

genótipo AA eram homens.

Além disso, o polimorfismo -250G>A está em completo desequilíbrio de

ligação com outros polimorfismos presentes no gene LIPC que podem afetar

diretamente a atividade da LIPC. Em suma, essa associação significativa do

polimorfismo -250G>A e variações nos níveis de HDL-C e TG sugerem que os

genótipos desse polimorfismo estão envolvidos com os níveis lipídicos.

As associações relatadas também confirmam a importância de alguns genes

na resposta ao tratamento com inibidores da HMG CoA redutase, mas também

mostram que mais estudos devem ser realizados em outras populações para que se

estabeleça sua importância clínica.

Dentre os genes investigados, trabalhos com o gene CETP tem mostrado

associações farmacogenéticas importantes, entretanto para os genes LPL, LIPC,

APOB o enfoque farmacogenético dos inibidores da HMG CoA redutase ainda é

incipiente. No presente estudo, encontramos uma associação dos genótipos do

polimorfismo -250G>A e a resposta ao uso de estatinas. Os indivíduos com o alelo A

apresentaram uma redução maior nos níveis de CT em comparação com os

indivíduos portadores do genótipo GG, depois de tratados com estatinas. Estudos

farmacogenéticos têm sido realizados com o polimorfismo -250G>A e outros

polimorfismos que estão em completo desequilíbrio de ligação com esse, tais como:

-514C>T, -480C>T, -710T>C, porém os resultados são variados. Essas diferenças

encontradas podem ser explicadas baseadas na influência de vários fatores, tais

como: gênero, níveis de estrogênio, resistência à insulina, gordura abdominal e

outros medicamentos que podem modular o efeito da LIPC nos níveis lipídicos.

Poucos estudos têm sido realizados com o gene LPL e a resposta ao uso de

estatinas. No presente estudo, encontramos uma associação dos genótipos do

polimorfismo S447X do gene LPL e os níveis lipídicos depois do uso de estatinas.

Os indivíduos com genótipo GG ou GC apresentaram um aumento nos níveis de

HDL-C, para dados não ajustados. Para dados ajustados, os indivíduos com

genótipo CC reduziram mais o CT depois de tratados com estatinas. Resultados

semelhantes foram encontrados por Sing et al (1999), onde os indivíduos com o

genótipo GG ou GC apresentaram uma elevação nos níveis de HDL-C, depois do

uso de fluvastatina e o estudo realizado por Thpmpson et al (2005) que mostrou uma

redução maior dos níveis de CT nos indivíduos com o genótipo GG ou GC.

Embora o tamanho amostral do presente estudo seja pequeno, os dados

apresentados deixam claro que a diversidade do genoma humano é um fator

importante para a variabilidade observada no tratamento com fármacos inibidores da

HMG CoA redutase. No entanto, ainda existem vários obstáculos a serem superados

que incluem a real compreensão da dinâmica do genoma humano, a compreensão

das doenças de origem multifatorial. Apesar disso, a implementação da

farmacogenética iniciará uma nova era na medicina, onde teremos a oportunidade

de experimentar o uso de medicações de acordo com o perfil genético de cada

indivíduo. Os resultados até o momento são bastante favoráveis e sugerem que o

conceito do “fármaco certo para o paciente correto” possa ser aplicado na prática

clínica. A perspectiva é a de que nas próximas décadas, ocorra a identificação de

grande parte da variabilidade genética responsável pelas diferenças interindividuais

na ação de fármacos e de que inúmeros exemplos de associação entre genoma e

resposta aos fármacos sejam compilados.

Finalmente, no presente estudo cabe ressaltar que muitos resultados com

ausência de associações podem ser devidos ao pequeno número de pacientes na

amostra. Sendo assim, sugere-se que futuros estudos sejam realizados com um

número amostral maior.

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Artigo Científico

APOB, CETP, LPL and LIPC gene polymorphisms in Southern Brazilian dyslipidemic

population.

Artigo em preparação para ser submetido à revista Brazilian Journal of Medical and

Biological Research

APOB, CETP, LPL and LIPC gene polymorphisms in Southern Brazilian

dyslipidemic population

F.G.L Chula

1,5

, A. Costa

, P.D. Picón

, M. Fiegenbaum

, C.MD. Silva

4,5

, S Almeida

N. Clausell

, R. Giugliani

Address to which proofs be sent:

Fernanda GL Chula

CDCT/FEPPS

Av. Ipiranga, 5400

CEP 90610-000, Porto Alegre, RS

FAX + 55 51 33520336

E-mail: [email protected]

Research Support by, PADCT, FEPPS.

Abstract

Objective: Our objective was to investigate the interaction between polymorphisms

in the APOB, CETP, LPL and LIPC genes with lipid parameters and with variable

response to statin treatment in the patients with dyslipidemia in a Southern Brazilian

population.

Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto

Alegre, RS.

Curso de Pós-Graduação em Cardiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS.

Centro Universitário Metodista IPA, Porto Alegre, RS.

Curso de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular, Universidade Luterana do Brasil,

Canoas, RS.

Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT), Fundação Estadual de Produção e

Pesquisa em Saúde (FEPPS), Porto Alegre, RS.

Associação Pró Ensino em Novo Hamburgo. (FEEVALE).

Methods: One hundred and nineteen patients with dyslipidemia participated in the

study. Plasma lipids and lipoproteins were measured before and throughout the

treatment. Baseline lipid and lipoprotein parameters were compared among APOB

EcoRI, CETP TaqIB, LPL S447X (G>C) and LIPC -250G>A genotypes after

genotyping by PCR and restriction mapping. Data from forty-eight patients with statin

treatment were for pharmacogenetic statistical analyses.

Results: The LIPC -250G>A polymorphism was significantly associated with HDL-C.

For unadjusted levels, carriers of the G allele had higher HDL-C concentrations

(P=0.004) than AA homozygotes, whereas individuals with the AA genotype had

higher TG concentrations (P=0.017) than individuals with the GG and GA genotypes.

For TG levels the same results were observed for adjusted data, with higher TG

concentrations in AA homozygotes than GG and GA genotypes (P=0.073).

Differences among genotypes in the percentage variation in lipid and lipoprotein

concentrations for LIPC and LPL polymorphism were observed. For unadjusted data,

GA and AA carriers genotypes showed a greater reduction in total cholesterol

compared than GG genotype (-26.4% ± 15.5 vs. -18.2% ± 11.8, P=0.034). For

unadjusted data, G allele carriers for LPL S447X gene polymorphism showed a

greater HDL-cholesterol increase compared to CC subjects (13.8% ± 22.9 vs. 3.3% ±

12.8, P = 0.047). After adjustment for covariates, a significant effect of this

polymorphism was observed for change in TC levels. The mean percent reduction in

TC was greater in CC homozygotes than in G carriers (-26.6% ± 13.6 vs. -20.5% ±

15.8, P=0.046).

Conclusion: Our data suggest an association of LIPC -250G>A gene polymorphism

with HDL-C and TG concentrations for unadjusted data. For TG concentrations the

associations was maintained after adjustment. We also found a significant effect

dependent of covariates of LIPC and LPL polymorphisms on statin treatment

response. These results can be explained on the basis of there being several factors

such as gender, estrogens, BMI and other variables that can modulate the effect of

gene polymorphisms on the lipid and lipoprotein concentration and treatment

response.

Key words: dyslipidemia, APOB, CETP, LPL, LIPC polymorphisms, pharmacogenetic.

Introduction

Dyslipidemia is a multifactorial disorder caused by an interaction between

genetic and environmental factors. Although genetic linkage analyses and candidate

gene approaches have implicated several loci and candidate genes for predisposition

to dyslipidemia, the genes that confer susceptibility to this condition remain to be

identified definitively

(1,2)

. Epidemiological and clinical studies have consistently

demonstrated that elevated concentration of low-density lipoprotein (LDL) cholesterol

in plasma is associated with increased risk of cardiovascular (DAC)

(3,4)

In the last years there has been growing evidence of the influence of genetic

variation in the determination of plasma lipid concentrations, especially for genes

involved in lipid transport and metabolism. More recently, a pharmacogenetic

approach has been applied to polymorphisms in these genes and demonstrated that

they are also associated with response to lipid-lowering drugs

(5)

The most potent and commonly prescribed lipid-lowering agents are the HMG-

Coa reductase inhibitors or statins, which function as competitive inhibitors of the 3-

hydroxy-3-methylglutaryl-Coa reductase (HMGCR), the rate-limiting enzyme for

cholesterol synthesis. Statins decrease LDL with efficacy and are able to reduce

clinical outcomes in both primary and secondary prevention of coronary artery

disease

(6,7)

In this study, we have concentrated on the gene polymorphisms of some

enzymes and proteins which play an important role in the lipid metabolism. The

examined polymorphisms included the apolipoprotein B (APOB) EcoRI

polymorphism, involved with variations in plasma lipid concentrations

(8)

; cholesterol

ester transfer protein (CETP) TaqIB polymorphism because of a key role of CETP in

the transport of cholesterol esters and triglycerides between lipoprotein particles

(9)

;

lipoprotein Lipase (LPL) S447X polymorphism, resulting in a two-amino acid

truncation of the LPL protein that affects triglyceride (TG) and HDL-C

concentrations

(10)

; and hepatic lipase (LIPC) -250G>A polymorphism, with important

role in the metabolism of several lipoprotein particles, especially HDL particles

(11)

The aim of the present study was to look for the possible associations

between the mentioned gene polymorphisms (APOB EcoRI, CETP TaqIB, LPL

S447X (C>G), and LIPC -250G>A), the lipid levels and efficacy of statin treatment in

the patients with dyslipidemia in a Southern Brazilian population.

Material and Methods

Subjects

One hundred and nineteen patients with dyslipidemia (57 men and 62 women)

were recruited in Hospital de Clínicas from Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil.

The study was approved by the Hospital Ethics Committee. On the retrospective

cohort study all patients were screened by physical examination, medical history and

clinical laboratory evaluation and were invited to participate in this study. All

participants in the study gave written informed consent. To determine the genotype

association with response to statin treatment, only 48 individuals were enrolled for

analysis. Those patients were treated with statins and show baseline plasma lipid

levels and changes of these lipids during the study.

Biochemical analysis

Blood samples were collected after 12 h fasting of subjects. Total cholesterol

(TC), triglyceride (TG) and glucose concentrations were determined by conventional

enzymatic methods. LDL cholesterol was calculated according to Friedewald

(12)

Body mass index (BMI) was calculated as weight in kg divided by square height in

meters (kg/m

DNA analysis

DNA was extracted from blood peripheral cells by the salting out method. The

PCR products were amplified using the appropriate primers and them genotyped by

standard restriction fragment length polymorphisms analysis for each gene: EcoRI for

polymorphism APOB

(13)

, TaqIB for CETP polymorphism

(14)

, MnlI for LPL S447X

polymorphism

(15)

, and DraI for LIPC -250G>A polymorphism

(16)

Statistical analysis

Allele frequencies were estimated by gene counting. The agreement of

genotype frequencies with the Hardy–Weinberg equilibrium was tested using the X

test. Continuous variables were expressed as mean ± S.D. Multiple linear regression

analyses were used to adjust lipid and lipoprotein variables. To reduce skewness, log

transformation of triglyceride concentrations was used in all analyses. Analyses were

performed separately for each polymorphism and lipid/lipoproteins parameters were

adjusted for age (years), gender, BMI, smoking (three status: current, former and

never), alcohol consumption (three status: current, former and never), diastolic blood

pressure, systolic blood pressure and diabetes. Unadjusted and adjusted mean lipid

parameters were compared among genotypes by ANOVA or Student's t-test. To

determine the genotype association with response to statin treatment, the mean

changes in plasma lipid concentrations among genotypes were compared by a

General Linear Model procedure using the type III sums of squares statistics. Age,

gender, BMI, and baseline lipid concentrations were included in each model as

covariates. Statistical analyses were carried out using the SPSS software package v.

13.0. The significance level was set at P <0.05.

Results

Demographic, biochemical, clinical characteristics and allele frequencies are

shown in Table 1. The mean age was 61.5 years, with no statistical differences

between men (60.7 ± 13.7) and women (62.1 ± 12.5). Smoking, alcohol consumption,

physical inactivity, HDL-C and systolic and diastolic blood pressure were significantly

different between men and women (P=0.001, P<0.001, P=0.034, P<0.001, P<0.001

and P=0.026, respectively). No differences were observed between men and women

in BMI, hypertension, diabetes, ischemic cardiopathy, nonHDL-C, TC, TG and

glucose levels.

Minor allele frequencies in the studied sample for the four polymorphisms

studied were: 28.2% (E-), 44.1% (B2), 21% (G) and 38.2% (A) for APOB, CETP, LPL

and LIPC, respectively. The genotype distributions for each polymorphism did not

show statistically significant differences compared to those expected under Hardy–

Weinberg equilibrium (data not shown), and no significant differences in allele

frequencies between genders were observed.

Association of each polymorphism with lipid and lipoprotein variables

Table 2 presents the unadjusted means of lipid and lipoprotein levels

according to genotypes of each polymorphism. No significant association between

genotypes of the each polymorphism examined and lipid concentrations was

observed, with the exception of LIPC. The LIPC -250G>A polymorphism was

significantly associated with HDL-C and TG. Carriers of the G allele had higher HDL-

C concentrations (P=0.004) than AA homozygotes and AA genotype had higher TG

concentrations (P=0.017) than GG and GA genotypes.

The same statistical approach was carried out with lipid and lipoprotein levels

after adjustment for covariates (Table 3) and the LIPC -250G>A polymorphism that

was significantly associated with TG levels. AA homozygotes had higher TG

concentrations (P=0.073) than GG and GA genotypes. No significant effect of

examined polymorphisms was observed on any lipid parameter

Moreover, a tendency towards higher mean values of HDL-C was observed in

B2B2 homozygotes of CETP TaqI polymorphism for adjusted and unadjusted HDL-C

levels (Tables 2 and 3).

Prediction of lipid and lipoprotein concentrations response to statin

The mean percent reductions of lipid and lipoprotein are show in table 4. Due

the small sample size, individuals with the GG genotype were grouped with those of

the GC genotype (LPL S447X polymorphism) and individuals with the AA genotype

were grouped with those of the GA genotype (LIPC-250G>A polymorphism).

After follow-up, there were no differences among genotypes in the percentage

variation in lipid and lipoprotein concentrations for APOB and CETP polymorphisms.

The LIPC -250G>A polymorphism was associated with effect statins. For unadjusted

data, GA and AA genotypes showed a greater reduction in TC compared to GG

genotype (-26.4% ± 15.5 vs. -18.2% ± 11.8, P=0.034). For unadjusted data, G allele

carriers for LPL S447X gene polymorphism showed a greater HDL-cholesterol

increase compared to CC subjects (13.8% ± 22.9 vs. 3.3% ± 12.8, P = 0.047). After

adjustment for covariates, a significant effect of this polymorphism was observed for

change in TC levels. The mean percent reduction in TC was greater in CC

homozygotes than in G carriers (-26.6% ± 13.6 vs. -20.5% ± 15.8, P=0.046).

Discussion

In this study, we examined the association of APOB, CETP, LPL and LIPC

gene polymorphisms with lipid and lipoproteins parameters in Southern Brazilian

dyslipidemic population and plasma lipid response to statin therapy.

Apolipoprotein B is essential for the synthesis and secretion of triglyceride-rich

lipoprotein in both the intestine and the liver (such as LDL) from plasma, by the LDL

receptor-mediated endocytosis present on the cell surface. Polymorphisms of the

APOB gene have been associated with hypercholesterolemia or increased risk for

CAD in Caucasian-Brazilians and other populations

(17-20)

. In the present study,

individuals bearing the APOB E- allele had higher TC concentrations than E+ allele

carriers, but not statistically significant. A similar effect was also recently found in

other populations. In Indians with CAD, the genotype EcoRI -/- was associated with

increased TC and LDL levels

(21)

CETP TaqIB polymorphism represents a silent base change affecting the

nucleotide 277 in the intron 1 of the gene

(22)

, resulting in the disruption of a restriction

site for the enzyme TaqI. The relationship between B2 allele (absence of the TaqI

restriction site) and higher levels of HDL cholesterol has been demonstrated in several

studies

(23,24)

. Individuals carrying the B2 allele showed lower CETP activity and lower

CETP mass concentration resulting in higher HDL and apoA-I levels

(25-27)

. In this study

we have observed only a tendency towards higher HDL levels in B2 allele carriers,

which did not reach statistical significance. This could be explained by a lower

statistical power of the study due to a relatively small number of included patients.

Interestingly, recent cohort studies with LPL S447X polymorphism suggest that G

allele carriers appear to have a more favorable lipid profile (lower plasma cholesterol,

lower TG and higher HDL cholesterol)

(28,29)

. Although, associations with favorable

changes in HDL-C have been reported, no association between LDL-C and this

polymorphism has been demonstrated previously

(8,30,31)

. In present study, no significant

effect of the LPL S447X polymorphism was observed on any lipid parameter.

Hepatic Lipase (LIPC) gene polymorphisms have attracted considerable interest

because they affect total HDL-C levels. There is considerable evidence that hepatic

lipase activity is an important determinant of plasma HDL-C concentrations

(27,32)

Clinical studies have consistently found an inverse relationship between hepatic lipase

activity measured in post heparin plasma and HDL-C concentrations. Previous

investigations demonstrated that the -250A allele increasing HDL-C level is associated

with low hepatic lipase activity by directly affecting LIPC expression or through linkage

disequilibrium with another polymorphism that directly decrease the enzyme activity

(33-

35)

. In present study, nevertheless, we found that HDL-C level of the 250G carriers was

higher than AA homozygotes. Several explanations are possible. First, we have

observed a tendency towards higher levels of body mass index in AA homozygotes

than in G allele carriers. Previous observations showed that high levels HDL-C are

inverse proportion BMI

(36)

. Second, gender has a significant influence on LIPC activity

and HDL-C levels. Compared with women, men have about 30% higher LIPC activity,

independently of the genotype, and lower HDL-C

(37)

. Also in our study, HDL-C levels

were lower in men than in women and 70% of AA patients enrolled were male. These

explications are corroborated by the findings that no association was found when

adjusted lipid and lipoprotein parameters are compared among LIPC genotypes. Third,

due the small sample size of our investigation, we could not exclude the possibility of a

spurious association. Finally, LIPC-250G>A polymorphism that we have studied has

been shown to be in strong linkage disequilibrium with another polymorphism that

directly decreases the enzyme activity, possibly serving only as a marker of another

causal polymorphism

(38)

. In the present study, we found an association of LIPC-

250G>A polymorphism and TG concentrations. The AA genotype demonstrated

increased TG levels compared to GG and GA genotypes. In addition to our study, the

rare allele or the rare haplotype has been associated with low LIPC activity and with

high TG levels

(39-41)

The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A (HMG-CoA) reductase inhibitors

(statins) are well established as pharmacologic agents that improve the lipid profile of

dyslipidemic patients. These drugs decrease cholesterol synthesis by competitively

inhibiting HMG-CoA reductase, the enzyme responsible for catalyzing the conversion

of HMG-CoA to mevalonate, a precursor of cholesterol

(42)

. We did not find a

significant difference among genotypes in the percentage variation in lipid and

lipoprotein concentrations for APOB (EcoRI) and CETP (TaqIB).

Recently, associations were found between lipid response to statins and

polymorphisms in genes involved in lipid/lipoprotein metabolism. In the present study,

we found significant differences in the TC response; carries of the LIPC -250A allele

had an decrease level of TC after statin treatment. Our results are in agreement with

two previous investigations

(43,44)

. In the study of Cenarro et al.

(43)

with LIPC -514C>T

gene polymorphism (in complete linkage disequilibrium with -250G>A polymorphism),

the T allele carries showed higher HDL-C concentration than the C homozygotes

after atorvastatin treatment. The study of Lahoz et al.

(44)

found similar results in

pravastatin treated patients for -514C>T polymorphism. However, for LIPC gene

polymorphisms results have been very variable. Some authors did not observe any

association between LIPC -250G>A and -514C>T gene polymorphisms and change

in lipid in lipoprotein concentration

(5,45-47)

, whereas Zambon et al.

(48)

in 49 dyslipidemic

men found that the greatest improvement in LDL density and HDL

-C with therapy

was in subjects with -514CC genotype. This important variability in the results can be

explained on the basis of there being several factors such as gender

(49)

estrogens

(50)

, abdominal fat

(51)

, insulin resistance

(52)

and other medications

(53)

that

can modulate the effect of LIPC on the lipid in lipoprotein concentration.

Small investigation addressed the effect of LPL gene variation and lipid-

lowering efficacy of statins. Our data suggest an association of LPL S447X gene

polymorphism and the efficacy of statins. In summary, our data demonstrates that

individual with GG/GC genotype appeared to have a variation in lipid and lipoprotein

concentration greater benefit than individuals with CC genotype. Sing et al.

(54)

also

reported that S447X polymorphism was associated with a modest elevation in the

HDL-C levels in the GG/GC genotype in response to fluvastatin therapy. In addition,

Thompson found results similarly with plasma levels TC

(55)

Finally, ethnic differences cannot also be excluded. The small sample size could

be responsible for the inability to reproduce some of the previously reported

associations. The above presented data suggest that the effect of examined

polymorphisms on lipid levels is small and probably not of high clinical importance.

These preliminary observations have to be verified in a larger study group. It also has to

be determined in further pharmacogenetic studies, whether the above mentioned

polymorphisms affect the response to lipid-lowering treatment in this high risk population.

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Table 1: Clinical and biological baseline characteristics of the study population

All Men Women P*

n 119 57 62

Age, years 61.5 ± 13.0 60.7 ± 13.7 62.1 ± 12.5 0.147

Smokers, % <0.001

Current, % 11.1 14.5 8.1

Never , % 48.7 30.9 64.5

Past, % 40.2 54.5 27.4

Physically inactive, % 57.8 47.2 67.8 0.034

Alcohol consumers, % <0.001

Current, % 13.9 23.6 5.0

Never , % 61.7 34.5 86.7

Past, % 24.3 41.8 8.3

Diabetes, % 37.0 35.1 38.7 0.708

Hypertension, % 79.8 77.2 82.3 0.504

Ischemic Cardiopathy, % 37.0 38.6 35.5 0.849

TC, mg/dL 245.5 ± 74.4

233.7 ± 49.5 257.2 ± 99.7

0.161

HDL-C, mg/dL 50.9 ±17.2 45.4 ± 9.3 56.2 ± 21.2 <0.001

LDL-C, mg/dL 149.5 ± 46.9

144.6 ± 45.8 154.2 ± 48.0

0.370

TG, mg/dL 226.3 ±178.6

257.2 ± 220.8 195.5± 117.2

0.280

Cholesterol non-HDL, mg/dL 194.2 ± 70.8

186.4 ± 51.6 202.1 ± 85.7

0.529

Glucose, mg/dL 124.2 ± 59.3

125.0 ± 53.6 123.4 ± 65.1

0.371

BMI**, kg/m

28.4 ± 5.0 27.5 ± 2.9 29.2 ± 6.3 0.579

Mean systolic blood pressure, mmHg

150.4 ± 56.8

142.2 ± 30.8 158.1 ± 72.7

<0.001

Mean diastolic blood pressure, mmHg

84.4 ± 14.6 85.0 ± 16.0 84.0 ± 13.2 0.026

Allele frequencies

LIPC -250A 38.2% 40.4% 36.3% 0.593

LPL S447X G 21.0% 17.5% 24.2% 0.265

CETP TaqIB B2 44.1% 43.0% 45.2% 0.794

APOB EcoRI E- 28.2% 29.8% 26.6% 0.665

Data are present as mean ± SD (standard deviation) except when indicated as percent.

Abbreviations: TC indicates total cholesterol; HDL-C high density lipoprotein cholesterol; LDL-C low-

density lipoprotein cholesterol; TG triglycerides; BMI body mass index.

* P Men vs. women. **Body mass index was calculated as weight in kilograms divided by the square

of height in meters.

Table 2: Association of each polymorphism with lipid and lipoprotein variables (unadjusted means)

n TC n HDL-C

n LDL-C n TG

n nonHDL-C

APOB EcoRI

++ 51

238.5 ± 238.5

49.7 ± 9.9 44

150.9 ± 47.0

50 207.6 ± 149.3 50 187.6 ± 50.5

+-/-- 57

240.8 ±53.2 57

49.7 ± 13.7 50

148.3 ± 47.3

55 247.2 ± 200.4 57 191.2 ± 53.3

0.821 0.985 0.789 0.286 0.720

CETP TaqIB

B1B1 33

244.2 ± 59.4 33

47.4 ± 7.9 28

154.6 ± 54.1

32 233.8 ± 123.6 32 198.8 ± 58.4

B1B2 56

232.3 ± 49.2 56

49.4 ± 13.7 48

142.3 ± 45.2

55 241.4 ± 224.9 56 182.8 ± 49.5

B2B2 19

253.8 ± 40.8 19

54.4 ± 11.7 18

161.2 ± 37.8

18 178.7 ± 50.6 19 193.6 ± 46.2

P 0.244 0.125 0.279 0.544 0.359

LPL S447X

GG 8 231.7 ± 43.3 8 52.7 ± 12.8 6 144.2 ± 34.8

6 186.5 ± 131.0 8 179.0 ± 42.4

245.8 ± 46.8 29

47.1 ± 10.6 25

153.5 ± 43.6

28 233.8 ± 193.1 29 198.7 ± 47.0

237.4 ± 54.4 70

50.4 ± 12.5 62

147.8 ± 49.7

70 229.5 ± 178.5 69 186.2 ± 54.7

0.697

0.349 0.849 0.839 0.472

LIPC -250G>A

AA 16

217.9 ± 47.2 16

40.6 ± 8.0 11

118.6 ± 39.0

14 362.5 ± 287.6 16 177.3 ± 51.5

AG 52

245.9 ± 53.8 52

51.0 ± 11.7 47

157.5 ± 50.1

52 205.3 ± 145.8 51 196.2 ± 53.0

GG 40

240.3 ± 48.7 40

51.6 ± 12.4 36

148.6 ± 41.6

39 211.0 ± 149.8 40 186.0 ± 50.4

0.163 0.004 0.045 0.017 0.386

Data is presented as mean ± standard deviation.

Unadjusted mean, statistical analyses performed on log-transformed variable.

Table 3: Association of each polymorphism with lipid and lipoprotein variables (adjusted means)

n TC n HDL-C

n LDL-C n TG

n nonHDL-C

APOB EcoRI

++ 37

235.9 ± 43.9 37 48.5 ± 10.1 43 156.0 ± 39.6

50 207.6 ± 149.3 37 142.8 ± 49.5

+-/-- 50

242.5 ± 46.9 50 50.6 ± 10.2 33 150.2 ± 39.2

55 247.2 ± 200.4 50 138.4 ± 47.8

0.509 0.349 0.863 0.476 0.434

CETP TaqIB

B1B1 28

245.7 ± 53.1 28 46.3 ± 8.0 24 157.6 ± 44.1

32 233.8 ± 123.6 28 145.8 ± 52.2

B1B2 41

235.2 ± 45.5 41 50.6 ± 11.6 35 144.6 ± 42.8

55 241.4 ± 224.9 41 130.4 ± 47.7

B2B2 18

240.5 ± 31.9 18 52.9 ± 8.2 17 148.3 ± 30.6

18 178.7 ± 50.6 18 128.3 ± 39.2

P 0.645 0.070 0.483 0.207 0.341

LPL S447X

GG 8 234.0 ± 37.2 8 51.5 ± 10.6 6 153.5 ± 29.9

6 186.5 ± 131.0 54 130.6 ± 47.1

245.2 ± 50.8 24 46.6 ± 9.6 21 150.5 ± 42.9

28 233.8 ± 193.1 24 144 ± 52.7

237.1 ± 44.6 54 50.6 ± 10.2 48 147.7 ± 41.7

70 229.6 ± 178.6 8 130 ± 35.0

0.736

0.234 0.935 0.432 0.475

LIPC -250G>A

AA 13

237.9 ± 44.8

13 46.9 ± 7.1 9 136.5 ± 36.6

12 362.5 ± 287.6 13 137.2 ± 49.8

AG 43

242.8 ± 48.9 43 49.7 ± 10.3 40 156.3 ± 46.3

52 205.3 ± 145.8 43 139.1 ± 49.2

GG 31

236.2 ± 41.9 31 50.9 ± 10.9 27 143.9 ± 31.6

39 211.0 ± 149.8 31 128.3 ± 45.4

P 0.823 0.498 0.284 0.073 0.624

Data is presented as mean ± standard deviation.

Unadjusted mean, statistical analyses performed on log-transformed variable.

Table 4: Change in lipid and lipoprotein levels after statin treatment according APOB, CETP, LPL and LIPC polymorphisms

Undajusted % Change

Adjusted % Change

n TC LDL-C HDL-C TG

APOB EcoRI

E-E-/ E+E- 31

-24.7 ± 13.8 -31.3 ± 21.9 7.1 ± 15.9 -26.5 ± 22.8

29 -25.3 ± 14.1 -31.9 ± 22.4 6.8 ± 15.8 -26.9 ± 23.3

E+E+

-20.0 ± 15.1 -18.4 ± 45.8 11.6 ± 23.6 -20 ± 25.8

19 -21.4 ± 16.1 -18.9 ± 49.9 11.2 ± 19.19 -23.6 ± 23.6

0.236 0.175 0.406 0.357

0.400 0.534 0.648 0.289

CETP TaqIB

B1B1

-23.2 ± 15.5 -30.9 ± 23.8 18.5 ± 25.5 -26.5 ± 25.4

10 -23.9 ± 17.8 -32.6 ± 25.6 15.0 ± 20.1 -24.4 ± 27.6

B1B2 30

-22.5 ± 12.8 -25.6 ± 35.8 6.7 ± 17.3 -22.2 ± 25.1

28 -22.9 ± 13.1 -25.3 ± 37.0 6.3 ± 16.9 -24.0 ± 23.9

B2B2 12

-22.5 ± 18.3 -21.1 ± 41.2 4.7 ± 15.6 -25.5 ± 21.7

10 -26.2 ± 17.6 -24.9 ± 44.2 8.2 ± 14.5 -31.4 ± 17.4

0.990 0.790 0.135 0.852

0.906 0.875 0.461 0.982

LPL S447X

GC/GG 25

-20.1 ± 14.9 -21.5 ± 30.9 13.8 ± 22.9 -26.7 ± 19.7

22 -20.5 ± 15.8 -22.2 ± 32.9 11.5 ± 19.95 -26.9 ± 20.5

CC 30

-24.8 ± 14.0 -29.5 ± 37.3 3.3 ± 12.8 -21.5 ± 27.4

26 -26.6 ± 13.6 -30.6 ± 38.6 5.0 ± 12.7 -24.5 ± 25.7

0.234 0.397 0.047 0.430

0.046 0.313 0.682 0.853

LIPC –250G>A

GG 25

-18.2 ± 11.8 -23.9 ± 17.6 12.6 ± 20.3 -26.2 ± 22.4

22 -18.2 ± 12.5 -24.0 ± 18.2 7.4 ± 18.19 -26.7 ± 23.1

GA/ AA

-26.4 ± 15.5 -27.3 ± 43.7 6.1 ± 18.8 -22.1 ± 25.6

26 -28.5 ± 15.2 -29.0 ± 46.3 9.9 ± 16.23 -24.7 ± 23.7

0.034 0.724 0.226 0.536

0.064 0.996 0.210 0.638

Data is presented as mean ± standard deviation.

APÊNDICE – Tabelas Descritivas da Amostra para cada Polimorfismo

TABELAS DESCRITIVAS DA AMOSTRA PARA CADA POLIMORFISMO

Tabela descritiva da amostra para o polimorfismo LIPC-250G>A

Variável GG GA AA P

Idade

60,1 ± 11,9 62,9 ± 12,2 59,9 ± 18,4

0,491

IMC

27,2 ± 3,8 28,6 ± 5,8 30,7 ± 4,3

0,079

Sexo

Feminino 23 (51,1%) 33 (57,9%) 6 (35,6%) 0,258

Masculino 22 (48,9%) 24 (42,1%) 11 (64,7%)

Tabela descritiva da amostra para o polimorfismo ApoBEcoRI

Variável E-E-/E+E- E+E+ P

Idade

60,5 ± 13,9 62,5 ± 11,8

0,416

IMC

28,9 ± 5,4 27,7 ± 4,5

0,272

Sexo

Feminino 32 (50 %) 30 (54,5 %) 0,378

Masculino 32 (50 %) 25 (45,5 %)

Tabela descritiva da amostra para o polimorfismo CETPTaqI

Variável B1B1 B1B2 B2B2 P

Idade

63,3 ± 9,7 62,4 ± 12,2 55,3 ± 18,0

0,054

IMC

29,1 ± 6,8 28,3 ± 4,5 27,4 ± 3,2

0,541

Sexo

Feminino 19 (54,3 %) 30 (47,6 %) 13 (61,9 %) 0,501

Masculino 16 (45,7 %) 33 (52,4 %) 8 (38,1 %)

Tabela descritiva da amostra para o polimorfismo LPLS447X

Variável CC CG GG P

Idade

61,6 ± 14,0 60,3 ± 10,7 64,5 ± 13,5

0,709

IMC

28,6 ± 5,4 28,5 ± 4,7 26,5 ± 3,6

0,559

Sexo

Feminino 35 (46,1 %) 24 (70,6 %) 3 (37,5 %) 0,040

Masculino 41 (53,9 %) 10 (29,4 %) 5 (62,5 %)

ANEXO A – Termo de Consentimento Informado

TERMO DE CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇAO NO

PROJETO DE PESQUISA

Título do Projeto

ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS PRESENTES NOS GENES APO B,

CETP, LPL E LIPC EM UMA POPULAÇÃO DISLIPIDÊMICA DO RIO GRANDE DO SUL

Objetivos do Estudo

As doenças do coração representam um problema de saúde pública no mundo.

Existem diversos fatores de risco responsáveis pelo aparecimento dessas doenças, os quais

podem ser divididos em imutáveis e mutáveis. Fatores imutáveis são aqueles que não

podemos mudar e, por isso, não podemos tratá-los, são eles: hereditariedade (herança

genética herdada de nossos pais), idade e sexo (homens têm maiores chances de ter um

ataque cardíaco). Os fatores mutáveis são aqueles sobre os quais podemos influir,

mudando, prevenindo ou tratando, são eles: fumo, colesterol elevado (HDL é o bom

colesterol e o LDL é o mau colesterol), pressão arterial elevada, dieta (ingestão de alimentos

gordurosos), vida sedentária (falta de exercícios físicos), obesidade (excesso de peso) e

estresse (tensão emocional). O colesterol elevado é um dos fatores de risco mais

importantes para o surgimento das doenças do coração e sua diminuição está

comprovadamente ligada a uma diminuição desse risco. O presente estudo tem como

objetivo conhecer uma região do seu material genético (DNA) que pode estar influenciando

o aparecimento de colesterol alto e, conseqüentemente, as doenças do coração.

Procedimentos

Durante a visita ao consultório, algumas perguntas como idade, sexo, escolaridade,

dieta serão realizadas. Serão obtidas também medidas como peso, altura e comprimento do

quadril. Após, será realizada uma coleta de sangue para dosar os níveis de colesterol e

realizar as análises genéticas. As consultas deverão ser devidamente marcadas. Essas

coletas serão feitas apenas para este estudo e em nada influenciarão o tratamento. A coleta

não vai causar nenhum problema, exceto o pequeno incômodo de dor no momento da

introdução da agulha para a retirada do sangue.

Riscos e Desconfortos

Os riscos e desconfortos aos pacientes deste estudo são aqueles associados aos

procedimentos da coleta de sangue. Essa quantidade é pequena (10 mL) e, por isso,

dificilmente causará algum mal-estar geral (1 em cada 1000 pessoas), no entanto, poderá

haver dor no local da coleta e, eventualmente, um pequeno hematoma.

Benefícios

Os benefícios da participação nesse estudo estão relacionados aos exames

oferecidos e ao acompanhado recebido para verificar as condições do coração paciente. O

paciente também estará contribuindo com informações fundamentais que ampliarão o

conhecimento da relação entre a hereditariedade e o medicamento usado no tratamento da

doença arterial coronariana.

Alternativa

Se o paciente escolher não participar, não haverá nenhuma diferença, quanto ao

acompanhamento médico.

Custos

Não será cobrado algum pagamento pela participação no estudo.

Dúvidas

Alguma dúvida referente ao estudo poderá ser esclarecida pela Dra. Nadine

Clausell, telefone 21018657 (Serviço de Cardiologia).

Confidencialidade

Todas as informações e os resultados advindos dos procedimentos realizados

serão considerados confidenciais e serão conhecidos somente da equipe envolvida. Todos

os questionários e materiais coletados serão identificados através de um código criado na

entrada do estudo. Este código será a única identificação no banco de dados, sendo

utilizado para análise dos dados e divulgação dos mesmos no meio científico. Participação

voluntária: Uma cópia desse documento será fornecida, caso desejar. Se houver desistência

em algum momento do estudo, nenhuma diferença quanto ao acompanhamento e

tratamento será observada.

Significado de sua assinatura

A sua assinatura abaixo significa que você entendeu a informação que lhe foi

fornecida sobre o estudo e sobre o termo de consentimento. Se você assinar este

documento significa que você concorda em participar do mesmo.

_______________, _____ de ______________ de _______.

Nome completo: ____________________________________________________________

Endereço completo: _________________________________________________________

Número do telefone: _________________________________________________________

Assinatura do Paciente: ______________________________________________________

Data: _____________________________________________________________________

Nome da Pessoa que obteve o consentimento: ____________________________________

Assinatura: ________________________________________________________________

ANEXO B – Questionário – Ficha de Avaliação

TÍTULO DO PROJETO

ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS PRESENTES NOS

GENES APO B, CETP, LPL E LIPC EM UMA POPULAÇÃO DISLIPIDÊMICA DO

RIO GRANDE DO SUL

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