( PDF ) Aspergilose em pingüins em cativeiro: diagnóstico, prevenção e controle em centro de recuperação de animais marinhos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VETERINÁRIA

Dissertação

Aspergilose em Pingüins em Cativeiro: Diagnóstico, Prevenção e Controle em

Centro de Recuperação de Animais Marinhos

Melissa Orzechowski Xavier

Pelotas, 2007.

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Melissa Orzechowski Xavier

Aspergilose em Pingüins em Cativeiro: Diagnóstico, Prevenção e Controle em

Centro de Recuperação de Animais Marinhos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Veterinária da Universidade

Federal de Pelotas, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências (área

do conhecimento: Veterinária Preventiva).

Orientador: Mário Carlos Araújo Meireles

Co-orientadora: Márcia de Oliveira Nobre

Pelotas, 2007.

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Banca Examinadora:

Prof. Dr. Luiz Carlos Severo - UFRGS

Prof

. Dra. Cristina Gevehr Fernandes - UFPel

Prof

. Dra. Márcia de Oliveira Nobre - UFPel

Prof. Dr. Mário Carlos Araújo Meireles – UFPel

Orientador

Agradecimentos

À todo o Grupo de Pesquisa em Micologia, que além de transmitir o

conhecimento técnico-científico sempre teve a integração, amizade e carinho de

uma grande e valiosa equipe.

Em especial neste grupo agradeço ao meu orientador Prof. Mário pelo

esforço em disponibilizar todo o necessário para realização do trabalho, a minha co-

orientadora Márcia pela colaboração e ensinamento técnico. À Loren pelo incentivo

na etapa inicial e auxílio na elaboração do projeto. Às pós-graduandas Eme, Raquel,

Isabel, Ane, Rê, Tati e Paty pela amizade, incentivo e incondicional auxílio nas horas

e horas de trabalho juntas. E, às alunas de graduação que contribuíram muito com a

execução do experimento, especialmente às Bolsista de Iniciação Científica do

projeto, Luíza pela colaboração, esforço e dedicação contínuos dispensados a este

trabalho, e Ângela pela paciência e dedicação empregadas como auxílio final para

identificação das espécies fúngicas.

Ao Lauro Barcellos, diretor do Museu Oceanográfico “Prof. Eliézer de

Carvalho Rios” da Fundação Universidade Federal do Rio Grande, e à todo o

pessoal do Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM), especialmente ao

Neneco, pela oportunidade concedida, conhecimento transmitido e confiança

depositada em meu trabalho, e à Andréa, Alice e Fabiano pela amizade e

colaboração.

Ao Mauro, pelo auxílio nos exames pos-mortem dos pingüins durante o

experimento.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pelas

bolsas de estudo concedidas.

À empresa Chemitec Agro-Veterinária pela gentileza no fornecimento do

produto Clorexidina-Cetrimida® para uso no experimento.

E, com muita gratidão à minha família, mãe, pai, Nena, Ieiê e ao meu

coração, Nogueira, pelo amor, compreensão, apoio incansável e auxílio

indispensável durante este período.

À todos,

MUITO OBRIGADO!!!

"Quando uma criatura humana desperta

para um grande sonho e sobre ele lança

toda a força de sua alma... Todo o universo

conspira a seu favor!"

Goethe

Resumo

XAVIER, Melissa Orzechowski. Aspergilose em Pingüins em Cativeiro:

Diagnóstico, Prevenção e Controle em Centro de Recuperação de Animais

Marinhos. 2007. 92f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

A aspergilose é uma doença frequentemente associada com mortalidade de

pingüins em cativeiro e geralmente adquirida por inalação dos conídios anemófilos.

O trabalho objetivou avaliar a freqüência desta micose em pingüins em um centro de

reabilitação de animais marinhos (CRAM), bem como pesquisar a presença de

espécies de Aspergillus no local de cativeiro e desenvolver medida de controle

microbiológico no ambiente, buscando a prevenção da doença. Para isso, foram

realizados exames post-mortem nos animais que vieram a óbito, colheita de fungos

do ar por sedimentação com Agar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol,

testes “in vitro” para escolha do desinfetante mais adequado para o estudo, e

emprego de rotina de desinfecção ambiental. Durante os dois anos de experimento

12 pingüins foram a óbito sendo cinco por aspergilose. Dos 81 dias de colheita de

amostras de ar 33,3% foram positivas para Aspergillus spp., com isolamento de sete

espécies distintas, totalizando 43 isolados, dos quais a espécie A. fumigatus foi

predominante correspondendo a 27,9%. O teste “in vitro” de microdiluição em caldo

demonstrou a eficácia da amônia quaternária e da clorexidina frente a diferentes

espécies de Aspergillus, e a ação “in loco” da clorexidina reduziu o isolamento de

fungos do gênero Aspergillus das instalações internas do CRAM. O experimento

demonstrou a importância da aspergilose em pingüins em cativeiro no CRAM

determinando uma alta taxa de mortalidade, e a presença de propágulos fúngicos de

distintas espécies patogênicas de Aspergillus no ambiente interno de reabilitação.

Os resultados obtidos permitiram também concluir que a contaminação ambiental

por Aspergillus spp. no CRAM pôde ser parcialmente controlada pelo emprego de

uma rotina de desinfecção ambiental com o agente químico de melhor ação "in

vitro”.

Palavras-chave: Aspergillus, aspergilose, pingüins, prevenção, desinfecção.

Abstract

XAVIER, Melissa Orzechowski. Aspergillosis in Captive Penguins: Diagnosis,

Prevention and Control in a Rehabilitation Center of Marine Animals. 2007. 92f.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade

Federal de Pelotas, Pelotas.

Aspergillosis is a disease often associate with mortality of captive penguins

and frequently acquired by the conidia inhalation of the air. The aim of the study was

to evaluate the frequency of this mycosis in captive penguins in a rehabilitation

center of marine animals (CRAM), to search the presence of Aspergillus species on

the ambient of captivity, and to introduce methods of a microbiology control in the

indoor air, wishing a prevention of the disease. To this, post-mortem examinations

was done in all penguins died, samples of the fungal air was collected by

sedimentation in Agar Sabouraud dextrose added to cloramphenicol, “in vitro” tests

was made to choose the more appropriated disinfectant to use on the local, and a

routine of environmental disinfection was established. During the two years of the

experiment 12 penguins died, and in five of them the cause was aspergillosis. In the

81 days of air samples collection, 33,3% were positive to Aspergillus spp. isolation,

classified in seven distinct species totalizing 43 isolates, with A. fumigatus the

predominant specie corresponding to 27,9%. The “in vitro” test of microdilution

demonstrated the quaternary ammonia and chlorexidine efficacy against different

Aspergillus species, and the “in loco” chlorexidine action reduced the fungal

Aspergillus isolation on the indoor ambient of the CRAM. The study demonstrated

the aspergillosis importance in captive penguins on CRAM, corresponding to

elevated rates of mortality, and the presence of different pathogenic species

Aspergillus fungal propagules on indoor environment of rehabilitation. This results

obtained also permit to conclude that the environmental Aspergillus contamination on

the CRAM could be partially controlled with the establishment of a disinfection routine

with the chemic agent that had the better activity “in vitro”.

Keywords: Aspergillus, aspergillosis, penguins, prevention, disinfection.

Lista de Figuras

Figura 1 –

Distribuição das colônias reprodutivas de Pingüins-de-magalhães e

correntes marítimas que auxiliam sua rota migratória.......................

Figura 2 –

Pingüim-de-magalhães juvenil contaminado por petróleo

encontrado na praia do Cassino, RS, Brasil......................................

Figura 3 –

Localização de alguns centros de reabilitação de animais marinhos

na América do Sul..............................................................................

Figura 4 –

Exemplares de três diferentes espécies de pingüins no CRAM. (A)

pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus) adulto e (a)

juvenil; (B) pingüim de penacho amarelo (Eudyptes chrysocome);

Figura 5 –

Vista aérea das instalações do CRAM, à beira da Lagoa dos Patos

– Rio Grande, RS, Brasil....................................................................

Figura 6 –

Taxas de mortalidade relacionadas à infecção por fungos do

gênero Aspergillus em pingüins em distintos locais de cativeiro.......

Artigo 3.1

Figura 1 –

Estruturas de reprodução de diferentes subgêneros de fungos

Aspergillus. [A] Subgênero Circumdati; [B] Subgênero Fumigati; [C]

Subgênero Nidulantes, detalhe dos aleuroconídios encontrados na

espécie A. terreus; [D] Subgênero Aspergillus, setas demonstrando

estrutura de reprodução assexuada e sexuada.................................

Figura 2 –

Espécies de Aspergillus isoladas do ar das instalações de um

Centro de Recuperação de Animais Marinhos.................................. 43

Artigo 3.2

Figura 1 –

Radiografia do trato respiratório do pingüim-de-magalhães,

demonstrando aumento da radiopacidade na região da siringe e

lesão multifocal nos sacos aéreos torácicos......................................

Figura 2 –

Lesões macroscópicas em pingüim-de-magalhães. (A) Nódulo de

aproximadamente dois centímetros na região da siringe. (B)

Colônias fúngicas de coloração branca com centro esverdeado no

saco aéreo torácico esquerdo. (C) Colônias fúngicas de coloração

branca com centro esverdeado no lobo direito do fígado.................. 51

Figura 3 –

(A) Hifas septadas, ramificadas e bifurcadas em ângulo agudo,

visualizadas no exame histopatológico (Grocott, 400X) do pulmão

do pingüim-de-magalhães. (B) Estrutura de frutificação completa

do Aspergillus fumigatus visualizada no exame histopatológico

(PAS, 400X) da siringe do pingüim-de-magalhães............................ 52

Artigo 3.3

Figura 1 –

Resultado do teste de microdiluição em caldo demonstrando

isolados de A. niger resistentes a todas as concentrações do

iodóforo (linhas 3, 4, 9 e 10), e sensíveis a todas as concentrações

de amônia quaternária (linhas 1, 2, 7 e 8) e digluconato de

clorexidina (linhas 5, 6, 11 e 12)........................................................ 63

Artigo 3.4

Figura 1 –

Variação climática de temperatura (ºC), umidade (%) e precipitação

(mm) da cidade de Rio Grande no primeiro ano do experimento...... 69

Figura 2 –

Variação climática de temperatura (ºC), umidade (%) e precipitação

(mm) da cidade de Rio Grande no segundo ano do experimento..... 69

Artigo 3.5

Figure 1 –

Macroscopic lesions of aspergillosis in Magellanic penguins: (A) air

sacs thickness with abundant caseous and nodules; (B) nodules

white-yellowish externally on esophagus; (C) fungal colonies in the

air sacs...............................................................................................

Figure 2 –

Conidial heads of Aspergillus spp. (black arrows) and septate and

branching hyphae (blue arrows), in air sacs of the Magellanic

penguins at histological examination with HE (100X)........................ 81

Lista de Tabelas

Artigo 3.3

Tabela 1 – Resultados do teste de suscetibilidade “in vitro” de diferentes

espécies de Aspergillus a três desinfetantes/anti-sépticos

comerciais..................................................................................

Artigo 3.4

Tabela 1 – Resultados das amostras de ar colhidas durante dois anos,

quanto ao isolamento de fungos do gênero Aspergillus de

instalações utilizadas para reabilitação de pingüins..................

Lista de abreviaturas e siglas

CB – Cloreto de benzalcônio

CIM – Concentração inibitória mínima

CRAM – Centro de Recuperação de Animais Marinhos

DC – Digluconato de clorexidina

DNA – Ácido desoxirribonucléico

ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

FV – Faculdade de Veterinária

GM-CSF – Fator estimulante de colônias de granulócitos e monócitos

HE – Hematoxilina-eosina

Ht – Hematócrito

IF – Iodóforo

IFN – Interferon

IBRRC – (International Bird Rescue Research Center’s) Centro Internacional de

Pesquisa e Salvamento de Aves

IL – Interleucina

KOH – Hidróxido de potássio

MIP – (Macrophage inflammatory protein) Proteína inflamatória de macrófagos

MCP – (Monocyte chemotactic protein) Proteína quimiotáxica de monócitos

MO – Museu Oceanográfico “Prof. Eliézer de Carvalho Rios”

NCCLS – (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Comitê nacional

para padronização de procedimentos clínicos laboratoriais

PAS – (Periodic Acid Schiff) Ácido Periódico de Schiff

PDA – (Potato dextrose Agar) Agar batata dextrose

RNA – Ácido ribonucléico

TNF – Fator de necrose tumoral

UFC – Unidades formadoras de colônias

ZOO – Zoológico

Sumário

1 Introdução geral................................................................................................

2 Revisão Bibliográfica........................................................................................

2.1 Aspergillus spp.................................................................................................

2.1.1 Fatores de patogenicidade............................................................................

2.2 Aspergilose.......................................................................................................

2.2.1 Resposta imune do hospedeiro.....................................................................

2.2.2 Formas e Sinais Clínicos...............................................................................

2.2.3 Diagnóstico....................................................................................................

2.2.4 Tratamento e Prevenção...............................................................................

2.3 Pingüins............................................................................................................

2.3.1 Centros de reabilitação.................................................................................

2.3.2 Aspergilose em pingüins...............................................................................

3 Artigos

3.1 Contaminação do ar quanto ao gênero Aspergillus em ambiente de

reabilitação de animais marinhos...........................................................................

3.2 Aspergilose em Pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus). Relato

de Caso...................................................................................................................

3.3 Atividade “in vitro” de três agentes químicos frente a diferentes espécies de

Aspergillus.............................................................................................................. 54

3.4 Eficácia da Clorexidina-Cetrimida na desinfecção ambiental contra

Aspergillus spp........................................................................................................

3.5 Aspergillosis: a limiting factor during the recovery of captive Magellanic

penguins.................................................................................................................

4 Conclusões........................................................................................................

5 Considerações finais........................................................................................

Referências ..........................................................................................................

NTRODUÇÃO

ERAL

Embora a preocupação com a fauna e flora dos nossos ecossistemas tenha

aumentado consideravelmente, a interferência humana no habitat dos animais

continua acarretando sérios prejuízos ambientais e ecológicos gerando mortes

diretas e indiretas que chegam a culminar com ameaças de extinção em diversas

espécies animais (CUBAS; SILVA; CATÃO-DIAS, 2007).

Em se tratando especialmente da poluição dos mares, a descarga ilegal de

petróleo, caracterizada pela lavagem de tanques cargueiros e/ou pelo descarte

deliberado de conteúdo contaminado de embarcações, tem diminuído

consideravelmente a população de pingüins-de-magalhães (Spheniscus

magellanicus) (GANDINI et al., 1994).

Dezenas a centenas de exemplares desta espécie de pingüim são

encontradas anualmente nas praias brasileiras, devido à contaminação por petróleo,

doenças, fraqueza, ferimentos e/ou separação do grupo. Os animais capturados em

monitoramentos e encaminhados ao Centro de Recuperação de Animais Marinhos

(CRAM) geralmente são juvenis e devido à debilidade em que se encontram, são

extremamente suscetíveis a doenças oportunistas como a aspergilose (RUOPPOLO

et al., 2004). Esta predisposição é ainda agravada pelo próprio processo de

reabilitação, durante o qual os animais são mantidos em cativeiro com manejos

diários para hidratação, alimentação e administração de fármacos, procedimentos

estes que cursam com estresse do animal agravando a imunossupressão.

O freqüente aparecimento de casos suspeitos de aspergilose entre os

pingüins em reabilitação no CRAM instiga a pesquisa sobre a casuística desta

micose, bem como sobre a presença e o controle de fungos do gênero Aspergillus

nos locais de recuperação. Em vista desta realidade, o trabalho teve como objetivos:

determinar a freqüência de aspergilose em pingüins recebidos pelo Centro de

Recuperação de Animais Marinhos; isolar fungos do gênero Aspergillus spp. das

instalações utilizadas para a reabilitação de pingüins no CRAM; classificar a espécie

de Aspergillus isolada do ambiente e dos animais; realizar testes de suscetibilidade

“in vitro” de Aspergillus spp. frente a desinfetantes; e estabelecer protocolo de

desinfecção das instalações como medida de controle microbiológico no ambiente

onde os pingüins são mantidos para recuperação.

Com isso, espera-se determinar o diagnóstico definitivo e a freqüência de

aspergilose em pingüins no CRAM e interferir no ambiente de cativeiro reduzindo a

concentração de conídios de Aspergillus spp., minimizando a inalação destes

propágulos fúngicos pelos pingüins, e conseqüentemente reduzindo os casos de

aspergilose que interferem no processo de reabilitação destes animais.

EVISÃO DE

ITERATURA

2.1 Aspergillus spp.

O gênero Aspergillus foi assim designado no ano de 1729, pelo padre

micologista italiano Micheli, o qual fez uma alusão da micromorfologia do fungo com

o instrumento utilizado durante o culto católico para aspergir a água benta,

denominado aspersório, do latim aspergillium (RAPER; FENNELL, 1965; KLICH,

2002; LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004). Este gênero pertence à sub-

divisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem Moniliales, família

Moniliaceae (LACAZ et al., 2002). As mais de 100 espécies descritas foram divididas

por Raper e Fennell (1965) em 18 grupos, os quais atualmente foram substituídos

por seis subgêneros, com uma ou mais seções, seguindo as normas do código

internacional de nomenclatura botânica (ABARCA, 2000; KLICH, 2002).

Aspergillus spp. são fungos ubíquos e anemófilos, com capacidade de suprir

sua necessidade nutricional facilmente através dos mais variados substratos devido

a capacidade de produção de grande número de enzimas, que se inserem em

diferentes rotas bioquímicas para assimilação final dos nutrientes. Estão

classificados entre os microrganismos mais abundantes, além de mundialmente

distribuídos, podendo ser isolados do solo, ar, água, alimentos, plantas, material em

decomposição e superfícies (RAPER; FENNELL, 1965; SIDRIM; ROCHA, 2004,

WARD et al, 2006).

Este gênero compreende fungos anamórficos que se reproduzem de forma

assexuada através de fialoconídios. Algumas espécies de Aspergillus possuem a

fase sexuada conhecida, podendo se propagar através de ascósporos. Estas

espécies são classificadas como teleomorfas, pertencem a sub-divisão

Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Eurotiales, família Aspergillaceae, se

dividem em dez gêneros e recebem nomenclaturas distintas dos seus anamorfos,

como por exemplo, A. nidulans na fase sexuada passa a ser denominado Emericella

nidulans (KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002).

Morfologicamente, todas as espécies de Aspergillus possuem colônias

filamentosas que apresentam hifas septadas com aproximadamente 4µm de

espessura. A estrutura de frutificação, típica do gênero, é caracterizada por um

conidióforo com uma célula pé e uma dilatação no ápice chamada de vesícula, onde

se inserem as métulas em espécies bisseriadas, ou as fiálides em espécies

unisseriadas, as quais dão origem aos conídios (RAPER; FENNELL, 1965;

ABARCA, 2000; KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Para caracterização das espécies de Aspergillus, se faz necessário a

utilização de uma chave de identificação, onde são confrontadas as características

macro e micromorfológicas do fungo (RAPER; FENNELL, 1965; ABARCA, 2000;

KLICH, 2002). Macroscopicamente as colônias de Aspergillus spp. variam quanto à

textura, topografia, diâmetro, coloração do anverso e reverso, presença de

esclerócios, exsudato e pigmento solúvel. Microscopicamente as espécies podem

ser uni ou bisseriadas, com métulas e/ou fiálides que variam quanto à disposição na

superfície da vesícula, comprimento e diâmetro. Além destas características, a

vesícula varia em forma e tamanho, os conídios em forma, textura e diâmetro, e o

conidióforo em comprimento, textura e coloração. Algumas espécies ainda

apresentam células de Hülle, cleistotécios e ascósporos, dos quais devem ser

observadas características como forma, textura, coloração, tamanho e ornamentos

(RAPER; FENNELL, 1965; ABARCA, 2000; KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002;

SIDRIM; ROCHA, 2004).

O gênero Aspergillus além de desempenhar um papel essencial na natureza,

fazendo parte da reciclagem do carbono e do nitrogênio (LATGÉ, 2001), se destaca

positivamente no âmbito econômico, à medida que produz enzimas e substâncias

muito utilizadas nas indústrias alimentícias, químicas e farmacêuticas, como

amilases, proteases e ácido cítrico. Algumas espécies geram diversos metabólitos

com ação benéfica, como a “Lovastatina” produzida pelo A. terreus, utilizada por

humanos para redução do colesterol; a “Ciclosporina A” fármaco antineoplásico

produzido por esta mesma espécie, ou ainda, a “Anidulina”, fármaco antifúngico

produzido a partir do A. nidulans (KLICH, 2002; WARD et al, 2006).

Em contrapartida, os fungos do gênero Aspergillus podem ser causadores

de sérios prejuízos, afetando o setor agrícola antes e pós-colheita, e demonstrando

seu grande impacto na saúde humana e animal através da produção de micotoxinas

(micotoxicoses) e principalmente através da capacidade de infecção do organismo

causando a aspergilose, doença com uma ampla diversidade de apresentações

clínicas (KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002).

2.1.1 Fatores de patogenicidade

A patogenicidade de fungos do gênero Aspergillus, que determina a

capacidade de causar danos à saúde dos indivíduos, é multifatorial, provinda desde

fatores físico-estruturais a metabólicos. Muitos destes fatores ainda estão em estudo

e suas funções são apenas hipóteses, no entanto, outros já possuem papel

comprovado no desenvolvimento da micose (LATGÉ, 1999, 2001).

Dentre os fatores de virulência físico-estruturais do gênero Aspergillus,

podem ser citados: o pequeno diâmetro dos conídios, que permite sua penetração

no trato respiratório inferior; a presença de proteínas hidrofóbicas e melanina na

parede, que conferem proteção a fagócitos; e a termotolerância, que permite sua

resistência e rápido crescimento na temperatura corporal do hospedeiro (LATGÉ,

1999, 2001). A espécie A. fumigatus se destaca neste contexto, por resistir e se

desenvolver em temperaturas acima de 55

C, apresentar crescimento rápido, e

ainda por possuir os conídios de menor diâmetro do gênero, com 2 a 3µm (LATGÉ,

1999, 2001).

Em se tratando de patogenicidade por fatores metabólicos, a maioria dos

estudos com A. fumigatus, demonstram a participação de diversos componentes,

como as adesinas, as toxinas e as enzimas no desencadeamento da doença

(BLANCO et al., 1998; LATGÉ, 1999, 2001). As adesinas promovem a interação do

fungo com a célula do hospedeiro, em especial, os fatores de aderência do A.

fumigatus possuem afinidade pelo fibrinogênio, glicoproteína plasmática da cascata

de coagulação e das reações inflamatórias, e pela laminina que é o principal

componente estrutural da membrana basal pulmonar (BLANCO et al., 1998; LATGÉ,

1999).

Dentre as toxinas produzidas pelo fungo, estão as hemolisinas que são

responsáveis pela lise de eritrócitos; as ribonucleases que levam à destruição de

células; a fumagilina e principalmente a gliotoxina, responsáveis pela

imunossupressão do hospedeiro, através da redução funcional de macrófagos e

neutrófilos, da indução de apoptose de células do sistema imunitário, do bloqueio da

ativação de linfócitos e da inativação do sistema mucociliar (LATGÉ, 1999, 2001;

LEWIS et al., 2005; SHOHAM; LEVITZ, 2005). As aflatoxinas produzidas por A.

flavus e A. parasiticus, possuem ação hepatotóxica, carcinogênica, teratogênica e

mutagênica, e as ocratoxinas produzidas pelo A. ochraceus, apresentam ação

teratogênica e carcinogênica, tendo o tecido renal como principal sítio de atuação

(KLICH, 2002).

Dentre as enzimas, as proteases elastinolíticas do A. fumigatus, têm sido

consideradas de grande importância na virulência do agente, por degradar não só

elastina, como também colágeno, laminina, fibrinogênio e outros componentes

principais da matriz pulmonar (BLANCO et al., 1998). As peptidases produzidas pelo

gênero Aspergillus, promovem degradação dos fatores humorais; as catalases e as

dismutases agem como antioxidantes durante a fagocitose; e as fosfolipases

danificam o tecido epitelial (LATGÉ, 1999, 2001).

2.2 Aspergilose

O termo aspergilose foi utilizado pela primeira vez por Fresenius, em 1850,

ao descrever a forma respiratória da doença em aves após o isolamento do A.

fumigatus. Esta micose, na forma pulmonar, foi uma das primeiras micoses viscerais

descritas na literatura médica (LACAZ et al., 2002).

Considerada oportunista, a aspergilose ocorre raramente como doença

primária em indivíduos imunocompetentes, e pode acometer a pele, os olhos, o trato

digestório e o Sistema Nervoso Central, porém a infecção geralmente se localiza no

trato respiratório como sítio primário, podendo se disseminar para outros órgãos

(LATGÉ, 1999; LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Das diversas espécies reconhecidas do gênero Aspergillus, cerca de 20 são

consideradas patogênicas, sendo o A. fumigatus o mais importante, e responsável

por 90 a 95% dos casos de aspergilose. Espécies como A. flavus, A. terreus, A.

niger e A. nidulans, também possuem potencial patogênico e ocasionalmente são

relatadas como agentes etiológicos da doença (SEVERO et al., 1997; LATGÉ, 1999;

ABARCA, 2000; STEVENS et al., 2000; KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002; SIDRIM;

ROCHA, 2004).

A aspergilose acomete uma grande variedade de animais, desde mamíferos

à alguns répteis, mas sua grande importância é observada em humanos e aves

tanto domésticas como silvestres (GEORGE, 1997; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003;

TELL, 2005).

Nos últimos 10 anos esta enfermidade adquiriu enorme importância na área

médica pelo aumento do número de indivíduos imunossuprimidos, devido aos

avanços nas cirurgias de transplantes e nos fármacos utilizados para tratamento de

pacientes oncológicos. A aspergilose invasiva, é considerada hoje em dia a segunda

micose mais freqüente em diagnósticos, e a maior causa de mortalidade em

pacientes imunossuprimidos, principalmente nos centros de tratamento de leucemia

e de transplante de medula óssea, e nas unidades de transplantes de órgãos sólidos

(LATGÉ, 1999; STEVENS et al., 2000; WANKE; LAZÉRA; NUCCI, 2000).

Em medicina veterinária, a aspergilose tem destaque especial na produção

avícola, sendo responsável por grandes perdas econômicas. Nestes

estabelecimentos, a aspergilose é considerada a infecção fúngica de maior

ocorrência, levando à altos índices de mortalidade, que podem ultrapassar 50% do

lote em aves jovens nos primeiros dias de vida, podendo também acometer

embriões no interior dos ovos (REDIG, 1993; KEARNS; LOUDIS, 2003; SIDRIM;

ROCHA, 2004; TESSARI et al., 2004; TELL, 2005). As aves silvestres e marinhas,

algumas com elevado valor ecológico, são especialmente suscetíveis à infecção por

Aspergillus spp., o que acarreta sérios prejuízos em zoológicos e centros de

reabilitação (CORK et al., 1999; GARCIA; BLANCO, 2000; MARTINÉZ;

CERECERO; CERVANTES, 2000; STONE; OKONIEWSKI, 2001; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

A aspergilose não é considerada contagiosa por transmissão horizontal e/ou

vertical, e a infecção ocorre através dos conídios infectantes, que se disseminam

pelo ar e penetram no organismo, principalmente por via inalatória (LATGÉ, 1999;

LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004). Pesquisas ambientais indicam que o A.

fumigatus está presente em altas concentrações (1-100 conídios/m

) no ar, tanto de

ambientes internos como externos, demonstrando que todos os indivíduos inalam

centenas destes propágulos fúngicos por dia, os quais são eliminados pela resposta

imune inata do hospedeiro sadio, não causando dano algum ao organismo (LATGÉ,

1999, 2001, RIVERA; HOHL; PAMER, 2006).

A infecção fúngica com conseqüente desencadeamento da doença é

decorrente do tamanho do inóculo, e principalmente da imunossupressão do

hospedeiro que o torna incapaz de eliminar do organismo os conídios inalados.

Estes conídios penetram no trato respiratório inferior, germinam e formam hifas

iniciando uma invasão tecidual e endotelial, causando lesão, infarto hemorrágico e

trombose (LATGÉ, 1999; WANKE; LAZÉRA; NUCCI, 2000; SIDRIM; ROCHA, 2004;

MENDES-GIANNINI et al., 2005; SHOHAM; LEVITZ, 2005; RIVERA; HOHL;

PAMER, 2006). A germinação dos conídios e o crescimento das hifas do A.

fumigatus são ainda significativamente facilitados pela presença da albumina,

indicando que em hospedeiros com alta concentração desta proteína no soro, seja

pela administração exógena ou pelo desequilíbrio de proteínas plasmáticas, o fungo

consegue se desenvolver mais rapidamente facilitando o desencadeamento de uma

forma invasiva mais grave (RODRIGUES; ARAUJO; PINA-VAZ, 2005).

2.2.1 Resposta imune do hospedeiro

A primeira linha de defesa do hospedeiro ao fungo Aspergillus spp. são as

barreiras mecânicas, caracterizadas no trato respiratório pelo sistema mucociliar e o

reflexo de tosse (LATGÉ, 2001). Muitas proteínas e peptídeos secretados pelo

epitélio do trato respiratório, ou pelas células fagocíticas, possuem atividade

antimicrobiana além de imunomoduladora e participam da defesa inata contra esses

agentes pulmonares agressores, como lactoferrina, lisozima, defensina e proteínas

do surfactante (SHOHAM; LEVITZ, 2005; ROGAN et al., 2006).

Sob um ponto de vista geral, a resposta imune do hospedeiro contra

Aspergillus spp. é basicamente celular. Assim, os conídios que não são eliminados

pelas barreiras mecânicas e conseguem atingir o trato respiratório inferior, ativam

uma resposta inflamatória inespecífica, sendo eliminados pelas células fagocíticas

do trato respiratório, principalmente através de mecanismos não-oxidativos. Os

conídios que conseguem resistir à fagocitose germinam formando hifas, as quais

são destruídas através de mecanismos oxidativos, provenientes da degranulação de

neutrófilos com a liberação de enzimas líticas na superfície da estrutura fúngica

(LATGÉ, 1999; GAFA et al., 2005; SHOHAM; LEVITZ, 2005; SINGH; PATERSON,

2005).

As células dendríticas possuem um papel fundamental na modulação da

resposta imune contra a aspergilose. Esse efeito imunomodulatório está

determinado pela liberação de citocinas inflamatórias como TNF-

α, IL-6 e IL-1 no

sítio inicial da infecção, pela apresentação de antígenos aos linfócitos locais, e pela

internalização do agente, carreando-o até o baço e aos linfonodos regionais, para

apresentá-lo e transmitir a informação aos linfócitos T (LATGÉ, 2001; GAFA et al.,

2005; SHOHAM; LEVITZ, 2005; RIVERA; HOHL; PAMER, 2006). Estas células de

defesa específica (linfócitos T) por sua vez, são direcionados à uma resposta Th1

(imunidade celular), com produção de quimiocinas e citocinas, como IL-12, IL-18,

IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, MIP-1, MIP-2 e MCP-1, para recrutar e ativar as células

inflamatórias, auxiliando na eliminação do agente (LATGÉ, 2001; GAFA et al., 2005;

SHOHAM; LEVITZ, 2005; RIVERA; HOHL; PAMER, 2006). Esse estímulo a Th1

ocorre na resposta contra conídios, no entanto, ao germinar e formar hifas há uma

mudança no padrão de resposta ao agente, que passa a Th2, com produção de IL-4

e IL-10, as quais inibem a resposta celular facilitando a progressão da doença

(SINGH; PATERSON, 2005).

A resposta humoral também é ativada. As imunoglobulinas participam da

eliminação fúngica através da ativação do sistema complemento, o que resulta em

deposição de seus componentes na superfície do microrganismo, desencadeando

quimiotaxia e opsonização. No entanto esta linha de defesa não é a mais importante

na resposta contra aspergilose, tendo em vista que defeitos na imunidade humoral,

não aumentam a suscetibilidade do indivíduo à infecção por Aspergillus spp.

(SHOHAM; LEVITZ, 2005).

Desordens qualitativas e quantitativas da função fagocítica, são os fatores

de risco mais importantes na predisposição de indivíduos a aspergilose, sendo esta

suscetibilidade diretamente proporcional à severidade e duração da neutropenia. As

principais causas destas desordens nas células de defesa são neoplasias

(leucemias), quimioterapia e altas doses ou uso continuado de corticosteróides. Este

último acarreta redução da atividade de macrófagos e neutrófilos, com diminuição da

produção de oxidantes reativos e óxido nítrico, assim como supressão da produção

de citocinas da resposta Th1, como TNF-α e IL-1, que auxiliam na proteção contra a

aspergilose, e estimulam a produção de citocinas da resposta Th2 (HO; YUEN,

2000; SHOHAM; LEVITZ, 2005; SINGH; PATERSON, 2005).

A maior suscetibilidade das aves à aspergilose em comparação com os

mamíferos se dá inicialmente por características anatômicas como a falta de

epiglote, que facilita a passagem de partículas para o trato respiratório inferior, falta

de diafragma que resulta em ausência do reflexo da tosse, distribuição limitada de

epitélio ciliar ao longo do trato respiratório e presença de sacos aéreos, estruturas

ricas em oxigênio e pouco vascularizadas (BAUCK, 1994; TELL, 2005).

Em relação à resposta celular, alguns fatores também contribuem para maior

predisposição das aves à aspergilose respiratória, como a falta de macrófagos de

superfície para fagocitose de conídios de Aspergillus spp., e a substituição de

neutrófilos por heterófilos, que utilizam proteínas catiônicas, hidrolases e lisozimas

ao invés de mieloperoxidase e mecanismos oxidativos para destruição das hifas

fúngicas (TELL, 2005).

Outros fatores como transporte, superlotação, má nutrição, ventilação pobre,

antibioticoterapia, administração de corticosteróides, doenças concomitantes e

irritantes respiratórios (ex.: amônia, fumaça, desinfetantes voláteis) são

considerados importantes e aumentam a suscetibilidade das aves à aspergilose

(BAUCK, 1994; TELL, 2005). A hipovitaminose A tem sua importância estabelecida à

medida que modifica o epitélio escamoso estratificado da região da siringe,

causando hipertrofia e hiperqueratose, que facilitam a colonização por conídios de

Aspergillus spp. (BAUCK, 1994).

2.2.2 Formas e Sinais Clínicos

Em humanos, a aspergilose respiratória pode determinar um processo

alérgico conhecido como aspergilose broncopulmonar alérgica, um processo fixo

caracterizado por granulomas intracavitários conhecidos como “bola fúngica”, e/ou

um quadro de aspergilose invasiva que geralmente é fatal (LATGÉ, 1999; STEVENS

et al., 2000; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Em pequenos animais ocorre principalmente em cães, e acomete a cavidade

e seios nasais, determinando descarga nasal seropurulenta e destruição dos

cornetos nasais, que pode levar à despigmentação e erosão do focinho (GARCIA;

BLANCO, 2000; TELL, 2005). Os exemplares desta espécie acometidos geralmente

não apresentam uma imunossupressão sistêmica e, na maioria das vezes, as hifas

não invadem a mucosa, permanecendo uma infecção local (sino-nasal) sem

disseminação (PEETERS et al., 2006).

Abortos em eqüinos, ovinos e bovinos podem ser decorrentes de infecção

por Aspergillus spp., bem como mamite, ceratomicose, sinusite e comprometimento

de bolsa gutural (ANDREATTI FILHO, 2000, GANCEDO; GRANDES; DÍEZ, 2000;

GARCIA; BLANCO, 2000; CORBELLINI et al., 2003; MACHADO et al., 2005; TELL,

2005).

Em se tratando especificamente da aspergilose em aves, a apresentação

clínica pode ser diversa, dependendo do sítio anatômico inicial da infecção. A

doença pode ocorrer no cérebro levando à sinais clínicos neurológicos como ataxia

e torcicolo, na pele causando dermatite necrótica granulomatosa, e nos olhos

desencadeando ceratite geralmente unilateral. No entanto, o trato respiratório inferior

é o principal sítio anatômico da micose, levando à sinais como apatia, dispnéia,

ruídos respiratórios, alteração na vocalização e emaciação (REDIG, 1993; BAUCK,

1994; ANDREATTI FILHO, 2000; MARTINÉZ; CERECERO; CERVANTES, 2000;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003, TELL, 2005).

Nesta espécie, a doença pode ser classificada como aguda ou crônica e

localizada ou sistêmica. A forma aguda ocorre principalmente em aves domésticas

jovens, aves silvestres e marinhas, a partir da germinação de conídios em um órgão

vital, ou da formação de múltiplas lesões simultaneamente. Esta forma causa uma

rápida e massiva colonização fúngica, com formação de granulomas miliares e curso

clínico geralmente menor que uma semana, podendo ocorrer morte aguda em 48h.

Já a forma crônica acomete principalmente aves adultas e se caracteriza por

granulomas no trato respiratório que tendem a disseminação para órgãos

adjacentes, apresentando um curso clínico de semanas a meses de duração

(BAUCK, 1994; MARTINÉZ; CERECERO; CERVANTES, 2000; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

A siringe ou bifurcação da traquéia é um local freqüentemente acometido

pelo fungo, devido ao estreitamento do lúmen e ao padrão de turbulência do ar que

permite que os conídios escapem do fluxo expiratório (BAUCK, 1994). Esta forma

traqueal da aspergilose é caracterizada por lesão localizada (granulomas) ou pelo

acúmulo de secreção e restos necróticos na região da siringe levando à obstrução

parcial ou total da via aérea, com dispnéia evidente e morte aguda (REDIG, 1993;

BAUCK, 1994; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

Em casos de aspergilose sistêmica, a disseminação fúngica geralmente

ocorre via sacos aéreos ou via hematógena, com a formação de trombos vasculares

contendo hifas fúngicas, e as lesões são comumente encontradas em trato

respiratório, fígado, serosa do trato gastrointestinal e vísceras abdominais, podendo

ou não ter sinais clínicos aparentes, como redução gradual da função respiratória,

plumagem eriçada, apatia e anorexia (REDIG, 1993; ABUNDIS-SANTAMARIA,

2003; KEARNS; LOUDIS, 2003; BEYTUT; ÖZCAN; ERGINSOY, 2004).

2.2.3 Diagnóstico

O diagnóstico definitivo da aspergilose respiratória é de difícil realização “in

vivo” devido à rápida evolução da doença. Muitas vezes não há sinais clínicos

aparentes, sendo frequentemente realizado diagnóstico pós-morte, através da

necropsia e colheita de amostras de tecidos para exame direto, cultura micológica e

exame histopatológico (REDIG, 1993; BLANCO et al., 1998; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; TESSARI et al., 2004).

No exame pós-morte, macroscopicamente as lesões da aspergilose são

caracterizadas por nódulos branco-amarelados, isolados ou agrupados variando de

um milímetro a mais de sete centímetros de diâmetro. Junto a estas lesões podem

ser observados exsudato amarelado caseoso, fibrose, colônias fúngicas brancas a

verde-azuladas, hiperemia e congestão pulmonar, espessamento de sacos aéreos e

hepatomegalia (BAUCK, 1994; ANDREATTI FILHO, 2000; BEYTUT; ÖZCAN;

ERGINSOY, 2004; TESSARI et al., 2004; TELL, 2005).

O exame histopatológico pode ser realizado pela coloração de Hematoxilina-

Eosina (HE), Gomori-Grocott (Prata) ou Ácido Periódico de Schiff (PAS), e os

achados histopatológicos de aspergilose em aves correspondem principalmente à

pneumonia granulomatosa, seguida de aerosaculite fúngica, broncopneumonia,

micetomas traqueobrônquicos, e trombose com necrose aguda (BAUCK, 1994;

STEVENS et al., 2000; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

Nos cortes histológicos dos tecidos acometidos pelo fungo observam-se

granulomas com foco necrótico circundado de macrófagos e heterófilos, e em casos

crônicos há presença de células gigantes e cápsula de tecido conjuntivo (BAUCK,

1994; BEYTUT; ÖZCAN; ERGINSOY, 2004). Hifas hialinas, septadas e dicotômicas

com bifurcações em ângulo agudo (45º) podem ser visualizadas nos tecidos. No

lúmen das cavidades aeradas observa-se a presença de estruturas de frutificação

aspergilar completa, com conidióforos e numerosos conídios produzidos pelas

fiálides (BAUCK, 1994; STEVENS et al., 2000; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003;

BEYTUT; ÖZCAN; ERGINSOY, 2004). A presença da fase reprodutiva anamórfica

do fungo nos tecidos é um achado comum da aspergilose em aves, devido à

presença dos sacos aéreos cavernosos, a temperatura corporal e a sensibilidade

das aves à gliotoxina. Estes fatores promovem um ambiente ideal para germinação

fúngica, caracterizado por pouca vascularização, poucas células de defesa, e ainda

condições ideais de temperatura, oxigênio e nutrientes (TELL, 2005).

Os métodos mais utilizados para diagnóstico “in vivo” de aspergilose

respiratória em aves compreendem, juntamente com histórico e sinais clínicos,

exame direto, cultura fúngica, endoscopia e/ou sorologia, além dos exames

complementares como radiologia e hematologia (REDIG, 1993; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; TELL, 2005).

A colheita de amostra do trato respiratório de aves, para exame direto,

cultivo e isolamento fúngico deve ser realizada sob anestesia, através de aspirado

transtraqueal, lavado traqueal ou bronco-alveolar (0,5 a 1ml/Kg de salina estéril),

sendo este último de grande valor para diagnóstico laboratorial devido a alta

especificidade da amostra (REDIG, 1993; BAUCK, 1994; STEVENS et al., 2000;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

O exame direto deve ser realizado com adição de hidróxido de potássio

(KOH) e/ou coloração de lactofenol azul de algodão dependendo da natureza da

amostra, para visualização das estruturas fúngicas. Já o cultivo micológico pode ser

realizado em meio ágar Sabouraud dextrose, acrescido de cloranfenicol, sem

cicloheximida, incubado por até sete dias com observação diária (BAUCK, 1994;

LACAZ, et al., 2002). A temperatura de incubação deve se assemelhar à

temperatura corporal do hospedeiro, mimetizando o ambiente em que o fungo

estava habitando, visto que este microrganismo se adapta às condições do

hospedeiro para garantir sua sobrevivência (TARRAND et al., 2005).

Contudo, a interpretação de um resultado positivo para Aspergillus spp. no

cultivo micológico deve ser realizada com muita cautela, à medida que este é um

fungo ubíquo considerado um dos principais contaminantes de laboratório, e que

pode estar presente na pele e no trato respiratório superior de todos animais sadios.

Portanto, exames complementares, como histopatologia, hematologia ou sorologia,

devem ser realizados concomitantemente, sempre que possível, para confirmação

do diagnóstico desta enfermidade (BAUCK, 1994; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

O hemograma das aves com aspergilose revela leucocitose, com heterofilia

em estágio inicial, monocitose com heterófilos tóxicos em estágios mais avançados

da doença, e linfopenia (REDIG, 1993; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS;

LOUDIS, 2003). Em infecções crônicas, anemia não regenerativa pode estar

presente, e a eletroforese das proteínas do soro pode detectar a presença de

inflamação crônica compatível com a enfermidade, caracterizada por

hiperproteinemia com hipergamaglobulinemia (BAUCK, 1994; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

Dentre os exames de imagem mais utilizados no auxílio ao diagnóstico de

aspergilose destacam-se a endoscopia, a radiologia e a tomografia

computadorizada. A endoscopia permite examinar, de imediato, a traquéia e os

sacos aéreos torácicos, sendo a presença de manchas esbranquiçadas de

elementos fúngicos nos tecidos, e a visualização de granulomas na siringe bastante

característica na doença. O exame endoscópico também é útil para monitoramento

da evolução da doença na ave após início do tratamento, assim como para colheita

de amostra clínica para exame direto e cultura (REDIG, 1993; BAUCK, 1994;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

Os achados radiológicos podem ser negativos, bem como demonstrar

aumento da radiopacidade assimétrica no trato respiratório e perda da definição da

parede dos sacos aéreos. Estas lesões são sugestivas de aspergilose, e nestes

casos em que há alteração radiológica, o prognóstico da doença é desfavorável e

geralmente não há tratamento eficiente (REDIG, 1993; STEVENS et al., 2000;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003).

Na medicina humana, a tomografia computadorizada é muito utilizada e

caracteriza um excelente método complementar de diagnóstico, demonstrando

sinais sugestivos de aspergilose tanto em estágios iniciais como em estágios tardios

da doença. No entanto, este exame apresenta um alto custo não sendo atualmente

viável para utilização de rotina em aves (WANKE; LAZÉRA; NUCCI, 2000).

Sorologicamente o teste de ELISA é indicado e muito utilizado para

diagnóstico da aspergilose em aves silvestres e marinhas, detectando anticorpos

uma semana pós-infecção pelos conídios, e semanas antes da presença de

qualquer sinal clínico da micose. Os títulos de anticorpos começam a declinar

conforme ocorre a remissão da doença, de duas a três semanas de tratamento,

contudo amostras seriadas podem determinar a duração do tratamento e monitorar a

evolução deste. A desvantagem deste teste é que o resultado pode demorar até

uma semana, e que a grave imunossupressão do paciente pode determinar

resultados falso-negativos (REDIG, 1993; BAUCK, 1994; STEVENS et al., 2000;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

Diversos estudos têm sido realizados na tentativa de estabelecer o

diagnóstico precoce desta enfermidade, com testes baseados na identificação de

antígenos ou metabólitos fúngicos em amostras clínicas (SINGH; PATERSON, 2005;

TELL, 2005). Um dos antígenos mais estudados é a galactomanana, componente da

parede celular de fungos do gênero Aspergillus, liberado na circulação sanguínea

durante o crescimento fúngico nos tecidos do hospedeiro. Este antígeno pode ser

detectado em diferentes amostras clínicas, como soro, fluido cérebro-espinhal,

lavado bronco-alveolar e urina, apresentando alta sensibilidade e especificidade. A

desvantagem é a sua rápida eliminação do sangue circulante pela formação de

complexos imunes e ainda por endocitose pelas células de kupffer no fígado

(BLANCO et al., 1998; SINGH; PATERSON, 2005).

As técnicas moleculares também têm sido estudadas na tentativa de

estabelecer o diagnóstico precoce da aspergilose, através da amplificação de

seqüências específicas de DNA ou de RNA do fungo a partir de diferentes amostras

clínicas, como sangue, urina, lavado bronco-alveolar, entre outros. No entanto,

algumas desvantagens são descritas como contaminação da amostra devido à

característica anemófila deste gênero fúngico e reação cruzada com outros fungos

filamentosos, resultando em falso-positivos (BLANCO et al., 1998; LOEFFLER et al.,

2001).

Recentemente, Beytu, Özcan e Erginsoy (2004) comprovaram a eficácia da

imuno-histoquímica com o uso de anticorpo monoclonal para diagnóstico de

aspergilose em casos atípicos desta micose em aves, diferenciando-a de outras

doenças causadas por fungos filamentosos como as zigomicoses ou fusariomicoses.

E ainda, Lewis et al. (2005) comprovaram a presença da gliotoxina em soro de

animais experimentalmente infectados com A. fumigatus, e em 80% dos humanos

com aspergilose invasiva estudados, sugerindo que esta pode vir a ser uma

ferramenta útil para o diagnóstico da micose.

Apesar de muitos métodos em estudo, ainda não existe um teste que realize

o diagnóstico de aspergilose precocemente, com alta especificidade e alta

sensibilidade. Este teste seria extremamente útil, à medida que eliminaria

tratamentos desnecessários e aumentaria a eficácia dos tratamentos realizados

(BLANCO et al., 1998).

2.2.4 Tratamento e Prevenção

O tratamento eficaz da aspergilose é difícil de ser efetuado, devido ao

estágio avançado em que a doença normalmente é diagnosticada e à característica

progressiva da enfermidade. A terapia deve ser feita a partir da remoção cirúrgica da

lesão, quando possível, associada ao emprego de fármacos antifúngicos, sendo

geralmente efetiva para a forma localizada e ineficaz em casos de aspergilose

disseminada (REDIG, 1993; BAUCK, 1994; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

Em aves de produção, o tratamento individual não é realizado devido à

relação custo-benefício não compensatória, porém em algumas aves marinhas e

silvestres em cativeiro a terapia é viável, sendo preconizada a remoção cirúrgica do

aspergiloma e/ou de administração de antifúngicos (BAUCK, 1994; ROCHETTE;

ENGELEN; BOSSCHE, 2003).

Os fármacos antifúngicos para aves podem ser administrados por

nebulização, via oral, intratraqueal, e/ou endovenosa, podendo ser utilizados

diversas substâncias ativas isoladamente, ou de preferência associadas. A

nebulização com antifúngicos é indicada no tratamento da aspergilose respiratória,

de três a quatro vezes por dias durante 10-15 minutos por sessão, e deve ser

continuada por no mínimo três dias após a cura clínica (BAUCK, 1994).

Esta terapia inalatória é realizada principalmente com anfotericina B ou

ainda com enilconazol. Ambos os fármacos possuem também uma excelente

atividade antifúngica por contato direto via intratraqueal, e a anfotericina B ainda

pode ser administrada por via endovenosa ou diretamente no saco aéreo infectado.

Esta droga em aves é eliminada mais rapidamente e apresenta menor toxicidade

quando comparada com os mamíferos (REDIG, 1993; BAUCK, 1994; ABUNDIS-

SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003, ROCHETTE; ENGELEN;

BOSSCHE, 2003). Por via oral, o itraconazol é o antifúngico mais utilizado e

considerado o medicamento de eleição para terapia da aspergilose em aves,

demonstrando bons resultados e raramente apresentando efeitos colaterais e

reações adversas (BAUCK, 199; KEARNS; LOUDIS, 2003)

Apesar dos fármacos antifúngicos estarem padronizados para aves tanto

quanto à dosagem, como quanto à duração do tratamento e via de administração, na

maioria dos casos a terapia não é eficaz, devido a inúmeros fatores, especialmente

àqueles ligados à suscetibilidade do hospedeiro, sendo a prevenção a melhor forma

de controle da aspergilose nesta espécie (ANDREATTI FILHO, 2000; FOWLER;

FOWLER, 2001).

Em hospitais humanos, a prevenção da aspergilose é realizada nas áreas

críticas, ou seja, áreas de internação de pacientes de alto-risco, através do controle

da temperatura, umidade e higiene, sendo ainda preconizado o uso de filtros de ar

de alta-eficiência (HEPA), ambientes selados, ventilação com pressão positiva, e

freqüente trocas de ar. Estas medidas são realizadas para que seja mantida uma

contagem de no máximo 5 UFC/m

de Aspergillus, com a quantidade desejável de

0,1 UFC/m

nestes locais (MORRIS et al., 2000; AFONSO et al., 2004).

Nos mais distintos locais de cativeiro de animais, principalmente de aves,

desde aviários a zoológicos e centros de recuperação, a presença de matéria

orgânica é inevitável, sendo crucial para a prevenção da aspergilose nestes

ambientes, um programa disciplinado e específico de limpeza, higiene e desinfecção

constantes das instalações e equipamentos, visando a manutenção da qualidade do

ar que minimiza a proliferação fúngica e o número de conídios aos quais o animal

está sendo exposto (BAUCK, 1994; CORK et al., 1999; KEARNS; LOUDIS, 2003;

TESSARI et al., 2004).

Dentre as substâncias químicas eficazes mais utilizadas na desinfecção de

ambientes avícolas está o enilconazol, sob a forma de aerossóis e fumigação, e os

produtos a base de fenol e amônia quaternária por fricção mecânica ou pulverização

(ROCHETTE; ENGELEN; BOSSCHE, 2003; SANCHEZ; GARRET; SANCHEZ,

2006).

O monitoramento do ambiente quanto à presença de Aspergillus deve ser

realizado rotineiramente, com exames da qualidade do ar através de

aerobiocoletores ou pela técnica de sedimentação, com periodicidade mínima

quinzenal (ANDREATTI FILHO, 2000). As técnicas de colheita de ar por métodos

volumétricos, apesar de requererem aparelhos de alto custo e pouca praticidade,

conferem resultados mais fidedignos que permitem a contagem de UFC/m

enquanto que os métodos não-volumétricos, como a técnica de sedimentação, são

práticos e de baixo custo, porém resultam em análise somente qualitativa do ar, e

cujo resultado sofre interferência de diversos fatores ambientais, como turbulência e

velocidade do vento (MORRIS et al., 2000; AFONSO et al., 2004).

O resultado dos exames da qualidade do ar serve como indício da

contaminação ambiental, porém, mesmo que apresentem valores dentro dos

parâmetros desejados não descartam nunca a necessidade de medidas de controle

do fungo, visto que fornecem dados microbiológicos momentâneos que facilmente

se modificam caso não haja uma vigilância constante, devido a característica

anemófila e ubíqua de alguns microrganismos como os fungos do gênero Aspergillus

(MORRIS et al., 2000).

Além da manutenção da qualidade do ar, alguns autores sinalizam ainda, a

possibilidade da imunoprofilaxia nos indivíduos suscetíveis, assim, diversos estudos

têm sido realizados na elaboração de vacinas contra a aspergilose, com inúmeros

antígenos de Aspergillus spp. administrados por diferentes vias, desde intranasais a

endovenosas. Apesar de alguns resultados serem insatisfatórios, muitos são

promissores na estimulação da resposta imune para prevenção da micose

(RICHARD et al., 1982; RICHARD et al., 1984; RICHARD; PEDEN; SACKS, 1991;

BAUCK, 1994; GRACZYK et al., 1998; CENCI et al., 2000; STEVENS, 2004).

2.3 Pingüins

Os pingüins pertencem a Ordem Sphenisciformes que contem uma única

família, Spheniscidae, dividida em seis gêneros com 17 espécies. Essas aves

marinhas habitam o hemisfério Sul, mas apesar de serem consideradas um símbolo

Antártico, a maioria das espécies se distribui nas ilhas subantárticas e costa sul da

América do Sul (SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006). São aves adaptadas ao

mergulho, com corpo fusiforme, sem ossos pneumáticos e com asas diferenciadas

em nadadeiras, chamadas de aletas. Para termorregulação, além de uma camada

espessa de tecido adiposo no subcutâneo, apresentam peculiaridades do sistema

circulatório que auxiliam nas trocas de calor (FOWLER; FOWLER, 2001).

Atualmente, 10 das 17 espécies encontram-se na lista vermelha da União

Internacional de Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN),

classificadas como vulnerável ou até mesmo ameaçadas de extinção (IUCN, 2006).

Em especial o pingüim-de-magalhães (S. magellanicus) se destaca em

nosso contexto, pela sua distribuição e rota migratória, que permitem o freqüente

aparecimento de exemplares desta espécie durante o inverno no litoral do Rio

Grande do Sul (PETRY; FONSECA, 2002, SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006).

Os pingüins-de-magalhães se reproduzem na costa da Argentina, Chile e

Ilhas Malvinas durante os meses de setembro a março, e posteriormente migram em

direção ao Brasil seguindo uma corrente de água fria vinda das ilhas em busca de

alimento, percorrendo áreas de intenso tráfego de petróleo (Fig.1) (GARCIA-

BORBOROGLU et al., 2006; SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006). Durante este

período de migração de aproximadamente sete meses, muitos exemplares são

contaminados ao cruzar com manchas de óleo nos mares, o que lhes confere a

perda da impermeabilidade das penas e consequentemente uma hipotermia,

levando-os para o litoral. Em terra firme estes animais não obtém alimento

ocorrendo um agravamento do quadro geral que cursa com desnutrição

(hipoglicemia e hipoproteinemia) e desidratação (MAZET et al., 2002).

AMÉRICA

SUL

Figura 1 – Distribuição das colônias reprodutivas de Pingüins-de-magalhães e

correntes marítimas que auxiliam sua rota migratória.

Fonte: CRAM

Esta espécie de pingüins não está ameaçada de extinção nem classificada

como vulnerável, no entanto, em função da poluição dos mares e da pesca

comercial que acarreta escassez de alimento, está atualmente considerada como

“quase ameaçada” pela IUCN. Isto porque sua população tem diminuído

drasticamente nas últimas décadas, demonstrando um declínio de 76% da

população total nas Ilhas Malvinas desde o período de 1989-1990 a 2001-2002, e

ainda um declínio anual de 1,1% da população de pingüins adultos e 6% da

população de juvenis na costa Argentina (GANDINI et al., 1994; BINGHAM, 2002;

IUCN, 2006), comprovando que este cenário pode mudar em alguns anos.

Nas praias brasileiras, desde o Rio de Janeiro ao litoral gaúcho, também são

encontradas anualmente dezenas a centenas de exemplares de pingüins-de-

magalhães contaminados por petróleo e debilitados (Fig.2) (PETRY; FONSECA,

2002; GARCIA-BORBOROGLU et al., 2006; SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006). Em

estudos realizados no período de 1985 a 1989 e no ano de 1998, a quantidade de

pingüins oleados correspondeu a 29% (82/282) e 55% (77/140), respectivamente,

dos exemplares de S. magellanicus encontrados na praia do Cassino, costa do Rio

Grande do Sul (BARBIERI; VOOREN, 1993; SILVA-FILHO comunicação pessoal

Figura 2 – Pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus) juvenil contaminado

por petróleo encontrado na praia do Cassino, RS, Brasil.

Na tentativa de frear as conseqüências destes danos causados pelos

homens, diversas organizações têm sido formadas no sentido de auxiliar a

reabilitação dos animais. Reabilitar significa restituir a um indivíduo sua capacidade

perdida, e proporcionar sua liberação e reintegração satisfatória ao ambiente natural.

Esta tarefa começou a ser realizada na América do Sul no ano de 1980, com um

grupo formado na Argentina (Mar del Plata), e hoje em dia é realizada por Centros

de Reabilitação que desempenham um papel importante na conservação e

preservação de diferentes espécies animais, atuando com infra-estrutura específica

e profissionais capacitados na área (GARCIA-BORBOROGLU et al., 2006).

Informação recebida por Rodolfo Pinho da Silva Filho, médico veterinário responsável pelo CRAM e membro

da International Fund for Animal Welfare (IFAW), em Rio Grande, em dezembro de 2006.

2.3.1 Centros de Reabilitação

Entre as cidades de Salvador no Brasil (12º58’S, 38º29’W) e Santo Antônio

do Oeste na Argentina (40º43’S, 64º55’W) existem 6.800km de costa que contam

atualmente com 25 grupos desempenhando a tarefa de reabilitação de pingüins

(Fig.3). Destes, dois estão situados ao norte do Rio de Janeiro, 11 entre o Rio de

Janeiro e Santos, apenas cinco entre Santos (Brasil) e Uruguai, e sete entre Uruguai

e Argentina (Mar del Plata) (GARCIA-BORBOROGLU et al., 2006).

Figura 3 – Localização de alguns centros de reabilitação de animais marinhos na

América do Sul.

Fonte: IBRRC, 2006. http://www.ibrrc.org/penguin_network.html.

Na cidade de Rio Grande (32º03’S, 52º08’W) foi projetado e estruturado o

Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM) para ser referência no sul do

Brasil em atividades de reabilitação da fauna marinha com ênfase para a

despetrolização. Desde a sua construção em 1996, o CRAM já recebeu mais de 500

pingüins-de-magalhães, além de dois exemplares de pingüim-rei (Aptenodytes

patagonica) e dois pingüins de penacho amarelo (Eudyptes chrysocome) (Fig.4).

Nos últimos dois derrames registrados na costa do Rio Grande do Sul, em 1998 e

2002, aproximadamente 140 e 115 aves marinhas, respectivamente, foram

encaminhadas ao CRAM, que atingiu um percentual de reabilitação superior a 70%

(RUOPPOLO et al., 2004; SILVA-FILHO comunicação pessoal

Informação recebida por Rodolfo Pinho da Silva Filho, médico veterinário responsável pelo CRAM e membro

da International Fund for Animal Welfare (IFAW), em Rio Grande, em dezembro de 2006.

Bra

Uruguay

Argentina

FMM

MDP Aq

Profauna

CRAM

CEM

Aquário

Municipal

de Santos and

Aq. Ubatuba

GEMM

Lagos/ENSP/FIOCRUZ

Figura 4 – Exemplares de três diferentes espécies de pingüins no CRAM. (A)

pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus) adulto e (a) juvenil; (B) pingüim

de penacho amarelo (Eudyptes chrysocome); (C) pingüim-rei (Aptenodytes

patagonica).

As instalações do CRAM (Fig. 5) estão localizadas à beira da Lagoa dos

Patos, e compreendem uma área de 308m² que abrange um prédio com ambulatório

e unidade de despetrolização, e uma área externa onde estão localizados dois

tanques com 2,5 metros de profundidade e capacidade para 180.000 litros de água,

além de quatro áreas secas de piso de cimento, duas com 36m

e outras duas com

52m

. Os tanques são equipados com um sistema de circulação de água através de

bombas que permitem a renovação de até 100% da água em 24 horas retirando-a

do estuário para os tanques e drenando-a no sentido inverso.

Figura 5 – Vista aérea das instalações do CRAM, à beira da Lagoa dos Patos – Rio

Grande, RS, Brasil.

O protocolo utilizado pelo CRAM para reabilitação de pingüins, bem como

outros protocolos estabelecidos para utilização pelos profissionais que atuam nesta

área, detêm um item de grande importância relacionado à prevenção da aspergilose.

Este foi estruturado com base nos requisitos para manutenção de aves marinhas em

zoológicos e aquários, e após comprovação da importância desta doença através

dos resultados de necropsias de aves em centros de reabilitação (DIEBOLD;

BRANCH; HENRY, 1999; CARRASCO et al., 2001; MAZET et al., 2002; SANCHEZ;

GARRET; SANCHEZ, 2006; SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006).

2.3.2 Aspergilose em pingüins

A aspergilose é uma enfermidade rara em pingüins de vida livre, que

apresenta pouca relevância nas colônias reprodutivas conhecidas como

pingüineiras. Em um estudo realizado por Hocken (2000) na Nova Zelândia, esta

micose foi relatada como responsável por sete mortes de um total de 213 pingüins-

azul (Eudyptula minor) analisados, correspondendo a uma pequena taxa de 3,3%

dos animais.

No entanto, esta doença caracteriza uma situação bem distinta quando

relacionada a locais de cativeiro destas aves marinhas. Nestes estabelecimentos, a

aspergilose já foi descrita em diversas espécies de pingüins, e geralmente ocorre em

decorrência de fatores estressantes, como mudança de ambiente e manejo, injúria

ou outras doenças concomitantes, que conferem a estas aves uma alta

suscetibilidade à infecção primária por Aspergillus spp. (REDIG, 1993; GRACZYK;

COCKREM, 1995; ROCHETTE; ENGELEN; BOSSCHE, 2003; SILVA-FILHO;

RUOPPOLO, 2006).

A predisposição dos pingüins a aspergilose é ainda agravada pelo esforço

físico proveniente da sua migração que desencadeia um significativo grau de

imunossupressão, além das peculiaridades pertencentes às aves, como anatomia e

fisiologia do trato respiratório e resposta imune celular. Outras situações

frequentemente encontradas em centros de reabilitação que aumentam a

imunossupressão dos pingüins e consequentemente aumentam a chance de

infecção por Aspergillus spp. é o acometimento por petróleo e o uso de

corticosteróides e antibióticos (RUSSEL; HOLCOMB; BERKNER, 2003; TELL,

2005).

88,9%

87,5%

79%

52,4%

50%

100

Mortalidade

Zoo Michigan Zoo India IBRRC Zoo Londres Zoo Escócia

Cativeiro

Assim, nos pingüins mantidos em zoológicos, aquários ou centros de

reabilitação a aspergilose é comumente associada a altas taxas de mortalidade,

acarretando sérios prejuízos ecológicos e econômicos para os estabelecimentos

(REDIG, 1993; GRACZYK; CRANFIELD, 1995; FOWLER; FOWLER, 2001;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003; SANCHEZ; GARRET;

SANCHEZ, 2006; SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006). Esta situação é documentada

desde a década de 40 em zoológicos (AINSWORTH; REWELL, 1949), e teve sua

importância reconhecida a partir dos anos 70 em centros de reabilitação, após o

primeiro grande acidente ecológico com derramamento de petróleo registrado

(“Oregon Standard”, São Francisco, Califórnia, EUA), que acometeu

aproximadamente 7.000 aves das quais 6.700 morreram, sendo a maioria por

aspergilose (RUSSEL; HOLCOMB; BERKNER, 2003; IBRRC, 2006).

A Figura 6 demonstra dados referentes a estudos realizados em zoológicos

na Inglaterra (Londres e Escócia), Índia (Nova Delhi) e nos EUA (Michigan)

publicados respectivamente, nos anos de 1949, 1990, 1977 e 2003, que descrevem

a mortalidade por aspergilose em distintas espécies, como pingüins-de-magalhães

(S. magellanicus), pingüins Gentoo (Pygoscelis papua), pingüim de barbicha

(Pygoscelis antarctica) e pingüim-rei (Aptenodytes patagonica) (AINSWORTH;

REWELL, 1949; KHAN et al., 1977; FLACH; STEVENSON; HENDERSON, 1990;

KITTLE, 2003). Ainda nesta mesma figura está representada a taxa de mortalidade

de aves marinhas por aspergilose, em um centro de reabilitação (International Bird

Rescue Research Center - IBRRC), após desastre ecológico com derramamento de

petróleo na costa de Washington (EUA) no ano de 1991 (RUSSEL; HOLCOMB;

BERKNER, 2003).

Figura 6- Taxas de mortalidade relacionadas à infecção por fungos do gênero

Aspergillus em pingüins em distintos locais de cativeiro.

A principal forma clínica da aspergilose em pingüins é caracterizada por uma

enfermidade difusa do trato respiratório inferior, com comprometimento de sacos

aéreos e pulmões. A forma traqueal, bem como a disseminação para órgãos como

fígado, serosa do trato digestório e rins é comum, e o animal apresenta sinais

clínicos como dispnéia, emaciação, letargia, anorexia e/ou morte aguda

(AINSWORTH; REWELL, 1949; KHAN et al., 1977; CARRASCO et al., 2001;

KEARNS; LOUDIS, 2003).

O conhecimento da alta suscetibilidade desta espécie, e de sua

predisposição em adquirir a enfermidade frente a fatores estressantes deve ser

levado em consideração para realização do diagnóstico presuntivo precocemente

(REDIG, 1993; ROCHETTE; ENGELEN; BOSSCHE, 2003).

Apesar do tratamento eficaz da aspergilose em pingüins já ter sido descrito

por Kummerfeld e Temme (1985 apud REDIG, 1993) com o uso de cetoconazol, e

por Shannon (1992) com a utilização do itraconazol, sua aplicabilidade é

questionável tendo em vista que apresenta muitos insucessos terapêuticos, e que

muitos animais apresentam morte súbita sem sinais clínicos aparentes.

Em vista desta realidade, medidas de prevenção da aspergilose são

fundamentais para manutenção de pingüins em cativeiro. Dentre estas medidas

destaca-se o controle da temperatura e da ventilação adequada (aproximadamente

15 trocas de ar por hora), da limpeza e higiene do local com retirada da matéria

orgânica, e da desinfecção do ambiente (REDIG, 1993; ANDREATTI FILHO, 2000;

ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS; LOUDIS, 2003; MAZET et al., 2002;

RUSSEL; HOLCOMB; BERKNER, 2003; SANCHEZ; GARRET; SANCHEZ, 2006;

SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006).

Estas medidas utilizadas para minimizar a proliferação fúngica e o número

de conídios aos quais os animais estão sendo expostos, são freqüentemente

adotadas em zoológicos, porém em relação a centros de reabilitação são difíceis de

serem realizadas. Isto porque em muitos casos o número de animais enfermos

excede a capacidade das instalações existentes, o que acaba acarretando um maior

acúmulo de matéria orgânica e uma maior dificuldade no controle das condições

ambientais (RUSSEL; HOLCOMB; BERKNER, 2003).

Para facilitar o controle do microrganismo, o piso das instalações do cativeiro

de pingüins, e o fundo das gaiolas de contenção não devem ser porosos, e sim de

material de fácil limpeza e desinfecção. E ainda, esta desinfecção deve ser realizada

semanalmente em todas as superfícies das instalações com rotatividade periódica

de agentes químicos, evitando o desenvolvimento de mecanismos de resistência

pelo fungo (SANCHEZ; GARRET; SANCHEZ, 2006).

Concomitantemente, é preconizada a redução máxima do estresse através

da mínima manipulação da ave, manutenção do ambiente tranqüilo, e colocação de

barreira visual ao redor das gaiolas de contenção (REDIG, 1993; ANDREATTI

FILHO, 2000; FOWLER; FOWLER, 2001; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003; KEARNS;

LOUDIS, 2003). Além disso, a nutrição adequada dos animais é de extrema

importância, a fim de evitar alterações no trato respiratório que podem predispor a

infecção por Aspergillus spp. (FOWLER; FOWLER, 2001).

Devido à suscetibilidade desta espécie à aspergilose, os protocolos de

reabilitação preconizam também o uso de antifúngico profilático, principalmente em

pingüins juvenis, e/ou muito debilitados (abaixo do peso de referência para espécie

ou petrolizado), com administração de itraconazol (15-25mg/Kg VO, SID) por

aproximadamente uma semana (MAZET et al., 2002; RUSSEL; HOLCOMB;

BERKNER, 2003; RUOPPOLO et al., 2004; SILVA-FILHO; RUOPPOLO, 2006). Este

mesmo procedimento está descrito nos protocolos de manutenção de pingüins em

zoológicos, porém nestes locais a administração do antifúngico profilático é

recomendada em períodos de pré e pós-transferência de animais (DIEBOLD;

BRANCH; HENRY, 1999).

Em zoológicos é indicada ainda, a realização de um programa de

monitoramento sorológico trimestral, pelo teste de ELISA para as diferentes

espécies de pingüins, com a finalidade de detectar potenciais problemas de

aspergilose precocemente, e assim obter uma maior chance de sucesso terapêutico

(REDIG, 1993; DIEBOLD; BRANCH; HENRY, 1999).

3.1 A

RTIGO

“Contaminação do ar quanto ao gênero Aspergillus em ambiente de

reabilitação de animais marinhos”

Artigo sob as normas da revista “Ciência Animal Brasileira”

Contaminação do ar quanto ao gênero Aspergillus em ambiente de reabilitação

de animais marinhos*

Melissa Orzechowski Xavier

, Isabel Martins Madrid

, Lorena Leonardo de Souza

Marlete Brum Cleff

, Ângela Leitzke Cabana

, Luiza da Gama Osório

, Rodolfo Pinho

da Silva Filho

, Mário Carlos Araújo Meireles

Depto. de Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas,

Campus Universitário, s/nº, CEP: 96010-900.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul.

Médico Veterinário, Centro de Recuperação de Animais Marinhos de Rio Grande, Fundação

Universidade Federal de Rio Grande.

Resumo

Espécies fúngicas do gênero Aspergillus são frequentemente associadas

com alta mortalidade de aves marinhas em cativeiro. Tendo em vista que a

aspergilose geralmente é adquirida pela inalação dos propágulos fúngicos presentes

no ar, o estudo objetivou avaliar a qualidade do ar quanto às espécies de

Aspergillus, das instalações internas de um centro de reabilitação de animais

marinhos que frequentemente recebe pingüins, gaivotas, albatrozes e petréis

acometidos por alguma moléstia. Oitenta e um dias de colheitas foram realizados

distribuídos em um período de aproximadamente dois anos, através da exposição de

placas de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol no

ambiente, as quais foram posteriormente incubadas a 25ºC. As colônias

identificadas como pertencentes ao gênero Aspergillus, foram classificadas quanto à

espécie através da avaliação macro e micro morfológica associada a uma chave de

identificação. Foram obtidos 43 isolados classificados em sete espécies distintas,

sendo A. fumigatus a predominante correspondendo a 27,9%, seguida de A. niger,

A. flavus e outras quatro espécies de Aspergillus sp., demonstrando que as aves

marinhas estão expostas a espécies fúngicas com potencial patogênico, o que

enfatiza a necessidade de um controle microbiológico no ambiente onde são

mantidos os animais em cativeiro.

Palavras-chave

Aspergillus, espécies, ambiente interno, aves marinhas.

Summary

Aspergillus species are often associated with high rates of seabirds mortality

in captivity. Showing that aspergillosis is frequently acquired by inhalation of fungal

conidia presents in the air, this study evaluated the air quality associated to

Aspergillus species, on the indoor environment of a rehabilitation center of marine

animals that continuous receive injuried’s penguin, seagull, albatross and petrel.

* Parte integrante da Dissertação de Mestrado da primeira autora

Eighty one samples were collected in around two years, by the exposition of Petri

dishes with Agar Sabouraud dextrose added cloranphenicol that were incubated in

25ºC. The fungal colonies identified as Aspergillus were classified in species by the

evaluation of the macro and micro morphology associated to a classification key. It

was obtained seven different species totalizing 43 isolates, and the A. fumigatus was

the predominant corresponding to 27,9% followed by A. niger, A. flavus and four

other Aspergillus sp., demonstrating that the seabirds are exposed to pathogenic

species of Aspergillus, what emphasize the necessity of a microbiology control of the

indoor captivity environment.

Keywords

Aspergillus, species, indoor, seabirds.

Introdução

Os microrganismos do gênero Aspergillus estão distribuídos mundialmente e

são considerados os fungos filamentosos anemófilos de maior importância quanto à

contaminação do ar de recintos fechados. Este gênero na forma anamorfa pertence

à divisão Eucomycota, subdivisão Deuteromicotina, classe Hyphomycetes, ordem

Moniliales, família Moniliaceae e apresenta mais de cem espécies, as quais são

identificadas conforme características morfológicas, sendo atualmente divididas em

seis subgêneros, Aspergillus, Fumigati, Ornati, Clavati, Nidulantes e Circumdati, com

uma ou mais seções (ABARCA, 2000; KLICH, 2002; LACAZ et al., 2002).

Todas as espécies de Aspergillus formam colônias filamentosas de

diferentes características que microscopicamente apresentam hifas septadas de

aproximadamente 4µm de diâmetro, e estruturas de frutificação típica formada por

célula-pé, conidióforo, vesícula, métula e/ou fiálide que promovem a reprodução

assexuada do fungo através da produção de fialoconídios. Algumas espécies de

Aspergillus apresentam a forma sexuada caracterizada pela presença de

cleistotécios, ascos e ascósporos. Nestes casos, o fungo é classificado como

teleomorfo e pertencente a um dos oito gêneros Emericella, Eurotium,

Chaetosartorya, Neosartorya, Petromyces, Hemicarpenteles, Sclerocleista ou

Fennellia (RAPER & FENNELL, 1965; ABARCA, 2000; KLICH, 2002; LACAZ et al.,

2002).

Cerca de 20 espécies do gênero Aspergillus são consideradas patogênicas,

com capacidade de causar a aspergilose, doença freqüentemente associada à alta

mortalidade de pingüins e outras aves marinhas em cativeiro. Esta micose

geralmente é adquirida por inalação dos propágulos fúngicos presentes no

ambiente, podendo caracterizar uma infecção nosocomial (AINSWORTH &

REWELL, 1949; KHAN et al., 1977; FLACH et al., 1990; BRETAGNE et al., 1997;

CORK et al., 1999; MARTINÉZ, et al., 2000; LAIR-FULLERINGER, et al., 2003). A

suscetibilidade das aves a esta micose é determinada, principalmente, por

peculiaridades do seu trato respiratório, como ausência de diafragma e presença de

sacos aéreos que proporcionam um excelente local de colonização fúngica, com

ótimas condições de temperatura e oxigênio e pouca vascularização (TELL, 2005).

Em centros de recuperação de animais marinhos os quais recebem

constantemente aves para reabilitação, como gaivotas, pingüins, albatrozes e

petréis, a predisposição à aspergilose é ainda maior, à medida que frequentemente

estas aves são recebidas com alguma injuria primária, e submetidas ao stress do

cativeiro, o que agrava sua imunossupressão (REDIG, 1993; CORK et al., 1999;

CARRASCO et al., 2001; RUSSEL et al., 2003). Em vista desta realidade, o trabalho

teve como objetivo avaliar a qualidade do ar quanto à presença de espécies de

Aspergillus no ambiente interno de reabilitação de um centro de recuperação de

animais marinhos, localizado na cidade de Rio Grande, RS, Brasil.

Material e Métodos

A avaliação da presença de espécies de Aspergillus foi realizada por um

período de aproximadamente dois anos, onde foram colhidas amostras das

instalações internas do Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM) da

Fundação Universidade Federal de Rio Grande e realizadas as identificações

taxonômicas dos microrganismos no Setor de Micologia da Faculdade de Veterinária

da Universidade Federal de Pelotas (FV-UFPel), com confirmação no Departamento

de Micologia da Fundação Oswaldo Cruz.

As colheitas das amostras foram realizadas a cada 10 dias através da

técnica de sedimentação. As placas de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose

acrescido de cloranfenicol foram abertas por 15 minutos em três pontos distintos do

ambiente de cativeiro interno a uma distância de aproximadamente 1,5m do solo,

sendo posteriormente encaminhadas ao Setor de Micologia (FV-UFPel).

As placas foram incubadas em estufa a temperatura de 25ºC por até sete

dias com observação diária do crescimento fúngico. Depois de decorrido este

período todas as colônias filamentosas foram submetidas a exame direto com

Lactofenol azul de algodão, e observadas ao microscópio ótico em um aumento de

100 a 400X. Das colônias identificadas como pertencentes ao gênero Aspergillus

foram realizados repiques em tubos de ensaio contendo Agar Batata (PDA) para

obtenção da cultura pura.

Todas as amostras foram armazenadas na micoteca em tubos de ensaio

contendo PDA acrescido de óleo mineral estéril, e sob refrigeração (4°C) em frascos

fechados contendo 10ml de solução salina 0,9% tamponada estéril (PBS).

A classificação das espécies de Aspergillus foi realizada conforme protocolo

e chave de identificação propostos por Klich (2002), e confirmada pela descrição de

Rapper e Fennel (1965). Para isso, foram utilizados quatro meios de cultivo

diferentes (Agar Malte, Agar Czapek, Agar Czapek acrescido de extrato de levedura,

Agar Czapek acrescido de extrato de levedura e 20% de sacarose), e sete dias de

incubação em temperaturas de 37°C e/ou 25°C. Após este período foram avaliadas

características macro morfológicas como coloração do anverso e reverso, diâmetro,

presença de esclerócios, exsudato e/ou pigmento solúvel das colônias nos quatro

meios semeados. O cultivo em lâmina foi realizado para avaliação da micro

morfologia do fungo observando características do conidióforo, vesícula, métula e/ou

fiálide, conídios, presença de aleuroconídios, cleistotécios, ascos, ascósporos e/ou

células estéreis (células de Hülle) circundando os cleistotécios.

Resultados e Discussão

Durante o experimento foram efetuados 81 dias de colheitas, dos quais 27

(33,3%) foram positivos para o isolamento de uma ou mais espécies de fungos do

gênero Aspergillus, obtendo-se um total de 43 isolados de Aspergillus spp..

Dos 43 isolados, vinte e dois pertenciam ao subgênero Circumdati,

apresentando características como vesícula globosa e fértil em toda superfície,

disposta de forma radiada, com métula frequentemente presente (Fig.1A). Doze

isolados apresentaram conidióforos lisos, vesículas piriformes a clavadas, ausência

de métula e conídios verde-acizentados a azul-acizentados, características

referentes ao subgênero Fumigati (Fig.1B). Seis isolados do subgênero Nidulantes

se caracterizaram por conidióforo liso, vesícula subglobosa a clavadas férteis na

metade superior, com a presença de métulas de distribuição colunar ou radiada e

alguns com aleuroconídios (Fig.1C). E três isolados foram identificados como

pertencentes ao subgênero Aspergillus, caracterizado por conidióforo de paredes

lisas, vesículas subglobosas com fiálides na porção superior, ausência de métula,

conídios geralmente em tons de verde, e presença de cleistotécios com ascos e

ascósporos (Fig.1D).

Figura 1 – Estruturas de reprodução de diferentes subgêneros de fungos Aspergillus.

[A] Subgênero Circumdati; [B] Subgênero Fumigati; [C] Subgênero Nidulantes,

detalhe dos aleuroconídios encontrados na espécie A. terreus; [D] Subgênero

Aspergillus, seta preta e vermelha demonstrando, respectivamente, estrutura de

reprodução assexuada e sexuada.

Quanto à classificação por espécies, do total de isolados de Aspergillus spp.,

12 (27,9%) foram identificados como pertencentes ao subgênero Fumigati, seção

Fumigati, espécie A. fumigatus; 11 (25,6%) ao subgênero Circumdati, seção Nigri,

espécie A. niger; sete (16,3%) ao subgênero Circumdati, seção Flavi, espécie A.

flavus; quatro (9,3%) ao subgênero Circumdati, seção Circumdati, espécie A.

candidus; três (6,9%) ao subgênero Nidulantes, seção Terrei, espécie A. terreus;

três (6,9%) ao subgênero Nidulantes, seção Versicolores, espécie A. versicolor; e

três (6,9%) ao subgênero Aspergillus, seção Aspergillus, espécie teleomorfa

Eurotium chevalieri (Fig.2).

Diversos estudos da qualidade do ar de ambientes internos têm sido

realizados, porém muitos enfocam a classificação taxonômica dos microrganismos

somente até gênero fúngico, sem identificação de espécie. Nestes trabalhos o

gênero Aspergillus se destaca como um dos principais fungos anemófilos presentes

em ambientes internos, o qual foi encontrado em 33,3% das amostras do presente

estudo (REN et al., 2001, GIGLI et al., 2005; WU et al., 2005; LEE et al., 2006).

27,9%

6,9%

9,3%

16,3%

25,6%

A. fumigatus A. niger A. flavus A. candidus

A. terreus A. versicolor Eu. Chevalieri

Figura 2 – Espécies de Aspergillus isoladas do ar das instalações de um Centro de

Recuperação de Animais Marinhos (CRAM, RS, Brasil).

Quanto às espécies de Aspergillus, as três principais isoladas foram

previamente documentadas como as mais freqüentes em ambientes hospitalares por

Leenders et al. (1999) na Holanda, e Panagopoulou et al. (2002) na Grécia. Neste

último trabalho, a espécie mais prevalente foi o A. niger (39,2%) seguido do A. flavus

(17,5%) e A. fumigatus (7,7%), sendo que os autores isolaram também em menor

quantidade (6,6%) A. nidulans e A. terreus (PANAGOPOULOU et al., 2002).

Já nos EUA, Cooley et al. (1998) em estudo da qualidade do ar de escolas

encontraram somente três espécies de Aspergillus, A. flavus, A. glaucus e A.

versicolor, diferindo consideravelmente do ambiente avaliado no CRAM, onde foram

isoladas sete diferentes espécies com predominância de A. fumigatus que não foi

isolada em nenhuma colheita realizada nas escolas pelos referidos autores. E em

um amplo trabalho de Shelton et al. (2002) quanto à presença de fungos anemófilos

em 1.717 prédios, incluindo escolas, hospitais, residências e indústrias, resultados

similares foram encontrados em relação a algumas espécies como A. fumigatus, A.

niger e A. flavus, porém os autores encontraram A. versicolor como espécie

predominante, isolada em alta freqüência, distinguindo das colheitas realizadas no

CRAM.

Estas diferenças podem ser explicadas pelo tipo de ambiente estudado, bem

como pelas variações geográficas e regionais que estão diretamente relacionadas à

concentração fúngica nos ambientes internos (SHELTON et al., 2002), a qual pode

ainda ser influenciada por fatores climáticos e sazonais (REN et al., 2001; LEE et al.,

2006).

Outros trabalhos semelhantes, de fungos anemófilos em centros de

reabilitação, zoológicos ou aviários não foram encontrados, por isso os dados do

presente estudo foram confrontadas com resultados descritos em distintos

ambientes internos, apesar da grande diferença entre estes locais, principalmente no

que se refere a presença de matéria orgânica.

A espécie com maior percentual de isolamento foi A. fumigatus, cuja

importância está relacionada à sua alta patogenicidade. Esta espécie é considerada

o principal agente etiológico da aspergilose, responsável por 90 a 95% dos casos

clínicos, e frequentemente relacionada à alta mortalidade de pingüins e outras aves

marinhas em cativeiro (AINSWORTH & REWELL, 1949; KHAN et al., 1977; LATGÉ,

1999; MARTINÉZ et al., 2000; CARRASCO et al., 2001; XAVIER et al., 2006).

Dentre os fatores de patogenicidade do A. fumigatus pode-se destacar a

termotolerância, a velocidade de crescimento, o pequeno diâmetro de seus conídios,

e a produção de enzimas e toxinas. Todas estas características facilitam a

penetração e o desenvolvimento fúngico no organismo do hospedeiro, que

desencadeiam a aspergilose (LATGÉ, 1999).

Os estudos da qualidade do ar vêm sendo realizados com o intuito de

contribuir com a saúde dos indivíduos à medida que fornecem dados sobre

comportamento, sobrevivência e distribuição dos microrganismos fúngicos no

ambiente. Tendo em vista que estes microrganismos anemófilos são

constantemente inalados e podem causar danos à saúde, desde uma leve alergia

respiratória a uma doença grave e invasiva, os resultados colaboram para

elaboração de medidas de prevenção por fornecer dados sobre as possíveis fontes

de contaminação e a presença de determinados fungos nas instalações.

Conclusões

A presença de fungos do gênero Aspergillus no local de reabilitação de

animais marinhos, com predominância de A. fumigatus, a qual é a principal espécie

relacionada com quadros clínicos geralmente fatais, em aves marinhas em cativeiro,

fundamenta a necessidade de um controle microbiológico no ambiente à medida que

grande parte dos animais em reabilitação encontra-se imunossuprimida, podendo

desenvolver a aspergilose pela inalação dos conídios anemófilos.

Referências Bibliográficas

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Agradecimentos:

À Dra. Aurea Maria Lage de Moraes, Pesquisadora do Departamento de

Micologia da Fundação Oswaldo Cruz (Instituto Oswaldo Cruz), pelo auxílio na

identificação das espécies de Aspergillus.

3.2 A

RTIGO

“Aspergilose em Pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus)

Relato de Caso”

Artigo publicado na revista “Veterinária e Zootecnia”, v.13, n.1, p.28-32,

2006.

Aspergilose em Pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus)

Relato de Caso*

Melissa Orzechowski Xavier

1**

, Alice Teixeira Meirelles Leite

, Mauro Pereira

Soares

, Luiza da Gama Osório

, Anelise Martins

, Ana Paula Albano

, Luiz

Paiva Carapeto

, Márcia de Oliveira Nobre

, Rodolfo Pinho da Silva Filho

Mário Carlos Araújo Meireles

Resumo

A aspergilose é causada por fungos do gênero Aspergillus, acometendo

principalmente o trato respiratório. O trabalho relata um caso de aspergilose em um

pingüim-de-magalhães em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais

Marinhos (CRAM) de Rio Grande (RS, Brasil). A ave foi encaminhada ao CRAM

debilitada, permanecendo em cativeiro durante 28 dias. Devido à gravidade do

quadro clínico, o animal foi submetido à eutanásia e necropsia, onde foram

observados nódulos branco-amarelados nos pulmões e siringe, e colônias fúngicas

nos sacos aéreos, fígado e rins. O diagnóstico de aspergilose por Aspergillus

fumigatus foi confirmado por exame micológico e histopatológico. Este relato alerta

para a importância da aspergilose como fator limitante na reabilitação de pingüins.

Palavras-chave: Aspergilose; Aspergillus fumigatus; reabilitação; pingüins; cativeiro;

Aspergillosis in a Magellan’s Penguin (Spheniscus magellanicus)

Case Report

Abstract

Aspergillosis is caused by Aspergillus spp., attacking mainly the respiratory

system. This paper reports a case of aspergillosis in a Magellan’s penguin in the

Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM) of Rio Grande (RS, Brazil).

The seabird was directed to CRAM weakened, staying in captivity for 28 days. Due to

gravity of the clinical signs, the animal was submitted to euthanasia and necropsy,

where white-yellowish nodules were observed in the lungs and in the windpipe, and

fungal colonies in the air sacs, liver and kidneys. The diagnosis of aspergillosis for

Aspergillus fumigatus were confirmed for mycology and histopathology. This case

alert to the importance of the aspergillosis in the penguins rehabilitation.

Key words: Aspergillosis; Aspergillus fumigatus; rehabilitation; penguins; captivity;

Parte integrante da dissertação de mestrado do primeiro autor.

1**

Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Setor de Micologia, Departamento de Medicina Veterinária

Preventiva, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brasil, Campus

Universitário s/nº, Cep 96.010.900. Telefone: (53) 32757496 / (53) 32230993 / (53) 91229266. E-mail:

[email protected]u.br.

Centro de Recuperação de Animais Marinhos, Museu Oceanográfico “Prof. Eliézer de C. Rios”, Fundação

Universidade Federal do Rio Grande – FURG, Rio grande, RS, Brasil.

Laboratório Regional de Diagnósticos, Faculdade de Veterinária, UFPel.

Graduação em Medicina Veterinária, UFPel.

Departamento de Clínicas Veterinária, Faculdade de Veterinária, UFPel.

Aspergilosis en Pingüino Patagónico (Spheniscus magellanicus)

Relato de un Caso

Resumen

La aspergilosis es causada por hongos del género Aspergillus, atacando

principalmente el tracto respiratorio. El trabajo relata un caso de aspergilosis en un

pingüino patagónico en rehabilitación en el Centro de Recuperação de Animais

Marinhos (CRAM) de Rio Grande (RS, Brasil). El ave fue conducida al CRAM

debilitada, permaneciendo en cautiverio durante 28 dias. Debido a la gravedad del

cuadro clínico, el animal fue sometido a eutanasia y necropsia, donde fueran

observados nódulos blanco-amarillentos en los pulmones y siringe, y colonias

fúngicas en los sacos aéreos, hígado y riñones. El diagnóstico de aspergilosis por

Aspergillus fumigatus fue confirmado por examen micológico e histopatológico. Este

relato alerta para la importancia de la aspergilosis como factor limitante en la

rehabilitación de los pingüinos.

Palabras-clave: Aspergilosis; Aspergillus fumigatus; rehabilitación; pingüinos;

cautiverio;

A aspergilose, micose oportunista causada principalmente pelo Aspergillus

fumigatus, se destaca por ser a principal causa de mortalidade de pingüins mantidos

em cativeiro, tanto em zoológicos quanto em centros de recuperação. A doença

geralmente é secundária a condições de estresse, traumatismos, ingestão de óleo

proveniente da poluição dos mares, má nutrição, deficiência de vitamina A e/ou

outras enfermidades (KHAN et al., 1977; FLACH et al., 1990; REDIG, 1993;

GRACZYK e CRANFIELD, 1995; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003).

Os pingüins pertencem à ordem Sphenisciformes, família Spheniscidae, a

qual contém 17 espécies divididas em seis gêneros, destacando-se, no Brasil, o

pingüim-de-magalhães (Spheniscus magellanicus) cujos exemplares são

freqüentemente encontrados nas praias apresentando sintomas de intoxicação por

petróleo, desnutrição, alterações músculo-esqueléticas, desidratação e

imunossupressão (WILLIAMS, 1995; RUOPPOLO et al., 2004).

No inverno do ano de 2004 foi encaminhado ao CRAM um pingüim-de-

magalhães macho, juvenil, apresentando alteração no membro pélvico direito,

manifestada por posicionamento incorreto, claudicação e aumento de volume na

região lombo-sacra. A ave foi identificada com anilha provisória nº.1081, e no 28º dia

de cativeiro foi encaminhada para exame radiográfico da lesão músculo-esquelética.

O exame demonstrou luxação na articulação coxofemoral direita. Durante o

procedimento, o animal apresentou dispnéia evidenciada por respiração com o bico

aberto, pescoço esticado e ruídos inspiratórios, sendo submetido de imediato, à

avaliação radiográfica do trato respiratório, que revelou aumento da radiopacidade

na região da siringe e lesão multifocal nos sacos aéreos torácicos (Figura 1).

Figura 1. Radiografia do trato respiratório do pingüim-de-magalhães, demonstrando

aumento da radiopacidade na região da siringe e lesão multifocal nos sacos aéreos

torácicos.

Devido à gravidade do quadro clínico, o pingüim foi encaminhado ao

Laboratório Regional de Diagnósticos (FV-UFPel) para eutanásia, realizada através

da administração de lidocaína 1% por via intracelomática, e posterior necropsia onde

foi observada a presença de um nódulo de dois centímetros de diâmetro com

consistência firme na região da siringe (Figura 2A) e nódulos de aproximadamente

0,5cm de diâmetro, com coloração branco-amarelada sobre a superfície pulmonar.

Colônias fúngicas filamentosas, de coloração branca com centro esverdeado, foram

observadas nos sacos aéreos torácicos (Figura 2B) e abdominais, no fígado (Figura

2C) e rins. Para confirmação do diagnóstico, foram colhidos fragmentos dos órgãos

alterados, encaminhados para exame micológico e histopatológico.

No Setor de Micologia do Laboratório de Doenças Infecciosas (FV-UFPel) foi

realizado exame direto de pequenos fragmentos das amostras, utilizando hidróxido

de potássio a 20%, e, posteriormente, o material foi cultivado em ágar Sabouraud

dextrose acrescido de cloranfenicol e Ágar Czapek. A incubação foi realizada a 30ºC

com observação diária durante sete dias.

Figura 2. Lesões macroscópicas em pingüim-de-magalhães. (A) Nódulo de

aproximadamente dois centímetros na região da siringe. (B) Colônias fúngicas de

coloração branca com centro esverdeado no saco aéreo torácico esquerdo. (C)

Colônias fúngicas de coloração branca com centro esverdeado no lobo direito do

fígado.

No exame direto foram encontradas hifas septadas e bifurcadas no fígado,

pulmão e siringe. Os cultivos apresentaram colônias fúngicas filamentosas com

crescimento rápido (48 horas), superfície de cor azul-esverdeada a cinzenta, reverso

não-pigmentado e textura pulverulenta. Microscopicamente as colônias

caracterizavam-se por hifas septadas, conidióforos curtos com vesículas de

extremidade piriforme, fiálides unisseriadas dispostas de forma colunar cobrindo dois

terços da superfície da cabeça aspergilar e conídios equinulados. O exame direto, a

macroscopia e microscopia dos cultivos permitiram o diagnóstico de aspergilose,

com a classificação do agente como sendo A. fumigatus.

No Setor de Patologia (FV-UFPel) foi realizado o exame histopatológico dos

tecidos pela fixação em formol a 10%, inclusão em parafina, e coloração de

Hematoxilina-eosina, Periodic Acid-Schiff e Grocott. Foram encontradas hifas

septadas e ramificadas com bifurcação em ângulo agudo (Figura 3A) nos pulmões e

fígado, áreas de necrose caseosa delimitadas por infiltrado granulomatoso nos

pulmões e sacos aéreos, e estruturas completas de esporulação do Aspergillus

(Figura 3B) na siringe, caracterizadas por conidióforos, vesículas, fiálides e conídios,

confirmando o diagnóstico de aspergilose disseminada invasiva.

A B C

Figura 3. (A) Hifas septadas, ramificadas e bifurcadas em ângulo agudo,

visualizadas no exame histopatológico (Grocott, 400X) do pulmão do pingüim-de-

magalhães. (B) Estrutura de frutificação completa do Aspergillus fumigatus

visualizada no exame histopatológico (PAS, 400X) da siringe do pingüim-de-

magalhães.

O sexo e a idade do pingüim acometido neste caso estão de acordo com

Flach et al. (1990) ao relatarem que os pingüins machos e juvenis foram

significativamente mais acometidos por aspergilose que as fêmeas e os adultos. As

alterações clínicas e patológicas, além da identificação do agente etiológico estão de

acordo com aquelas descritas por Khan et al. (1977), Martínez et al. (2000) e

Carrasco et al. (2001), que relataram casos de aspergilose com lesões difusas,

causadas por A. fumigatus, em pingüins e gaivotas, embora não tenha sido

observado espessamento dos sacos aéreos, provavelmente pela característica

aguda da infecção deste caso.

As alterações radiológicas sugestivas de aspergilose, descritas por Redig

(1993) e Kearns e Loudis (2003) são compatíveis com as observadas no exame do

trato respiratório do pingüim-de-magalhães. Entretanto, a radiologia não é um

método auxiliar de diagnóstico comumente utilizado para aspergilose em aves, não

havendo outros relatos, na literatura consultada, de exames radiológicos em

pingüins acometidos por aspergilose.

A aspergilose no pingüim-de-magalhães em reabilitação confirma a

predisposição destas aves, principalmente quando se encontram debilitadas e/ou

quando é necessário um período prolongado de permanência do animal em

cativeiro.

A B

Referências Bibliográficas

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WILLIANS, T. D. The Penguins, Spheniscidae, Oxford University Press, 1995.

3.3 A

RTIGO

“Atividade “in vitro” de três agentes químicos frente a diferentes

espécies de Aspergillus”

Artigo submetido para publicação na revista “Arquivos do Instituto Biológico”,

registrado como Arq.063/06

Atividade “in vitro” de três agentes químicos frente a diferentes espécies de

Aspergillus

Melissa Orzechowski Xavier

, Isabel Martins Madrid

, Ana Raquel Mano

Meinerz

, Marlete Brum Cleff

, Luiz Filipe Damé Schuch

, Márcia de Oliveira

Nobre

, Mário Carlos Araújo Meireles

Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Veterinária, Laboratório de

Doenças Infecciosas, Setor de Micologia. Campus Universitário s/nº, CEP: 96010-

900, Pelotas, RS, Brasil. E-mail: [email protected]

RESUMO

A aspergilose é causada por fungos ubíquos e oportunistas do gênero

Aspergillus, que liberam milhares de conídios no ar, contaminando o ambiente,

sendo de extrema importância a utilização de filtros de ar e programas corretos de

anti-sepsia e desinfecção para prevenção da enfermidade. Este estudo avaliou a

eficácia “in vitro” dos agentes químicos, iodóforo, amônia quaternária e clorexidina,

frente a isolados de A. fumigatus (8), A. niger (8), A. flavus (6) e A. terreus (1). Para

o teste foram preparadas diluições sucessivas dos desinfetantes/anti-sépticos (log

)

em caldo RPMI, e os inóculos foram ajustados até uma concentração final de

5x10

UFC/ml. Foi realizada a técnica de microdiluição em caldo de acordo com

NCCLS M-38, adaptada para agentes químicos, com incubação das microplacas a

35°C em agitação constante. A leitura visual dos resultados foi realizada após 96

horas, e os isolados de Aspergillus spp. utilizados foram resistentes ao iodóforo nas

concentrações testadas. A amônia quaternária e a clorexidina mostraram-se

eficazes contra os isolados de Aspergillus spp., com exceção de um A. fumigatus e

um A. terreus. Com estes resultados indica-se a utilização da amônia quaternária e

da clorexidina na prevenção da aspergilose, questionando-se o uso de iodóforos

para este fim.

PALAVRAS-CHAVE: Aspergilose; Aspergillus spp.; Desinfetantes e Anti-sépticos;

ABSTRACT

“IN VITRO” ACTIVITY OF THREE CHEMICAL AGENTS AGAINST

DIFFERENT SPECIES OF ASPERGILLUS. The aspergillosis caused by ubiquitous

and opportunists moulds of genus Aspergillus, that liberate thousands of conidia’s in

the air contaminating the atmosphere, being of extreme importance use of air filters

Parte integrante da dissertação de mestrado do primeiro autor

Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas

Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul

and correct programs of antisepsis and disinfection for the disease prevention. This

study evaluated “in vitro” effectiveness of the chemical agents, iodophor, quaternary

ammonia and chlorexidine, against A. fumigatus (8), A. niger (8), A. flavus (6) and A.

terreus (1). Successive dilutions of disinfectants/antiseptics (log2) were prepared in

RPMI for the test and the suspension was adjusted until a final concentration of

5x10

UFC /ml. The microdilution test was done in agreement with NCCLS M-38

adapted for chemical agents, with microplates incubation at 35°C in constant

agitation. The visual results were evaluated after 96 hours, and all Aspergillus spp

isolated used were resistant to iodophor in all concentrations tested. The quaternary

ammonia and chlorexidine showed effectiveness against Aspergillus spp. isolated,

except for one A. fumigatus and one A. terreus. With these results the use of the

quaternary ammonia and chlorexidine is indicated to aspergillosis prevention and

iodophor use is questionable.

KEYWORDS: Aspergillosis; Aspergillus spp.; Disinfectants and Antiseptics;

As micoses oportunistas, como a aspergilose, adquiriram uma grande

importância em saúde pública nas últimas décadas, devido à incidência da Síndrome

da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), o desenvolvimento de novas terapias para

pacientes oncológicos, e os avanços nas técnicas cirúrgicas de transplantes de

órgãos, que culminaram com o aumento do número de pacientes

imunocomprometidos (B

RETAGNE

et al., 1997; L

ATGÉ

, 1999; S

TEVENS

et al., 1999;

ARTINS

-D

INIZ

et al., 2005). Em medicina veterinária, esta micose se destaca por

causar sérios prejuízos à produção avícola, acometendo principalmente aves jovens

e ovos embrionados, e por determinar altas taxas de mortalidade em pingüins e

outras aves silvestres mantidas em cativeiro, em zoológicos e/ou centros de

reabilitação (F

LACH

et al., 1990; A

NDREATTI

, 2000; A

BUNDIS

-S

ANTAMARIA

, 2003; L

AIR

ULLERINGER

, 2003).

As espécies comumente envolvidas com quadros clínicos tanto em humanos

quanto em animais são principalmente o A. fumigatus, seguido do A. flavus, A. niger

e A. terreus (L

ATGÉ

, 1999;

BUNDIS

-S

ANTAMARIA

2003). Como o Aspergillus spp. é

um fungo ubíquo, milhares de conídios são desprendidos das fiálides diariamente e

dispersos no ar, contaminando o ambiente (L

ATGÉ

, 1999). Neste contexto, é de

extrema importância, além da utilização de filtros de ar, o emprego correto de

programas de anti-sepsia e desinfecção, à medida que auxilia na prevenção da

enfermidade através da redução do nível de contaminação por microrganismos

fúngicos em tecidos vivos, superfícies e objetos inanimados (L

ATGÉ

1999;

ONNEL

;

USSEL

1999;

BUNDIS

-S

ANTAMARIA

2003;

ESSARI

et al., 2004).

A escolha de um agente químico desinfetante não é uma tarefa fácil frente a

grande variedade de produtos existentes no mercado, devendo ser levado em

consideração fatores como espectro de atividade desejada, toxicidade, poder

residual, custo, estabilidade, e natureza do material a ser tratado. Os principais

desinfetantes utilizados são álcoois, formaldeído, glutaraldeído, compostos

liberadores de cloro ativo (como hipoclorito de sódio), compostos quaternários de

amônia (como cloreto de benzalcônio), iodóforos e biguaninas (como clorexidina).

Dentre esta gama de opções, não existe um produto que apresente todas as

características desejadas, cada um possui vantagens e desvantagens que devem

ser avaliadas no momento da seleção para o uso (B

RASIL

1994;

ONNEL

;

USSEL

1999).

A ação de desinfetantes e anti-sépticos tem sido testada contra bactérias e

leveduras, no entanto poucos estudos foram encontrados na literatura consultada

confrontando estes agentes com fungos filamentosos. Visto que os fungos

filamentosos em geral são mais resistentes que leveduras e bactérias não

esporuladas, testes realizados com microrganismos unicelulares não servem de

parâmetro ou indício para sua utilização contra fungos chamados “bolores” de

importância médica e veterinária, como Aspergillus spp (T

ERLECKYJ

;

XLER

1987;

RASIL

1994;

ONNEL

;

USSEL

, 1999). Assim, este estudo objetivou testar a

eficácia “in vitro” de três agentes químicos de baixa toxicidade contra diferentes

espécies de fungos do gênero Aspergillus.

A atividade dos desinfetantes e anti-sépticos, iodóforo, cloreto de

benzalcônio (amônia quaternária) e digluconato de clorexidina, foi testada frente a

23 amostras de Aspergillus spp. isoladas do ambiente e de casos clínicos, sendo

oito A. fumigatus, oito A. niger, seis A. flavus, e um A. terreus.

A técnica de microdiluição em caldo utilizada para testes “in vitro” de

antifúngicos foi realizada de acordo com NCCLS M-38, porém com adaptação para

agentes químicos. Foram utilizadas 12 placas de microdiluição (96 orifícios) estéreis,

as quais foram preenchidas com o inóculo fúngico e com os desinfetantes/anti-

sépticos previamente diluídos e ajustados em meio RPMI líquido. Todas as amostras

de Aspergillus spp. foram testadas em duplicata frente aos três desinfetantes/anti-

sépticos.

Para preparação dos inóculos fúngicos as amostras foram previamente

semeadas em placa de Petri contendo Agar Batata (Potato Dextrose Agar – PDA) e

incubadas à 35ºC por sete dias, obtendo-se culturas jovens e puras. Após o

crescimento fúngico foi adicionado às culturas, 1ml de salina estéril com 1% de

Tween 20, e em seguida os conídios e hifas foram coletados da superfície da colônia

com auxílio de pipeta estéril e transferidos para um tubo de ensaio estéril. Decorrido

o tempo de sedimentação de cinco minutos, o sobrenadante foi transferido para

outro tubo de ensaio estéril, e então homogeneizado em agitador de tubos vortex por

15 segundos, e sua concentração final foi ajustada a 5x10

UFC/ml. Esta suspensão

foi diluída a 1:50 em caldo RPMI, alcançando duas vezes a concentração

necessária, para ser adicionada a cada orifício da microplaca em volume igual ao do

agente químico, conforme o protocolo padrão. Para confirmação da concentração do

inóculo foi realizada a técnica de Pour-plate em Agar Sabouraud Dextrose, e

contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC).

Foram preparadas seis diluições sucessivas dos três agentes químicos em

log

utilizando-se caldo RPMI como diluente, os quais foram identificados como: IF

(iodóforo), CB (cloreto de benzalcônio) e DC (digluconato de clorexidina). As

concentrações finais dos desinfetantes IF e CB referiram-se a 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25

vezes a concentração de uso recomendada pelo fabricante do produto, e do

desinfetante DC variaram de 2 a 0,05 vezes a concentração de uso indicada.

A primeira coluna das microplacas (coluna A) foi utilizada como controle de

crescimento sendo preenchida com 200µl do inóculo, e a última coluna (coluna H)

correspondeu ao controle de esterilidade onde os orifícios foram preenchidos com

200µl da maior diluição do desinfetante. As demais colunas (colunas de B a G)

foram preenchidas com 100µl do inóculo e 100µl da diluição do agente químico em

seqüência, da maior para menor diluição do produto.

As microplacas foram incubadas em uma estufa “shaker” (Certomat® BS-1)

regulada a uma temperatura de 35ºC e constante agitação (40ciclos/min), e a leitura

visual dos resultados foi realizada após 96 horas, sendo a Concentração Inibitória

Mínima (CIM) determinada pela maior diluição do agente químico capaz de inibir o

crescimento fúngico.

Das 23 amostras de Aspergillus spp., os oito isolados de A. niger e os seis

de A. flavus foram sensíveis ao DC e CB, e resistentes ao IF. O A. terreus foi

sensível ao CB e resistente ao IF e DC, e os oito isolados de A. fumigatus foram

sensíveis ao DC e resistentes ao IF, sendo que destes, sete foram sensíveis ao CB.

Os resultados estão descritos na tabela 1.

Todos os isolados de Aspergillus spp. foram resistentes ao iodóforo nas

diluições testadas (Fig.1). O cloreto de benzalcônio mostrou atividade “in vitro” no

controle das quatro espécies de Aspergillus, com exceção de uma amostra de A.

fumigatus, que apresentou resistência a este agente químico mesmo em uma

concentração duas vezes a recomendada. O digluconato de clorexidina apresentou

eficácia frente a todos os isolados de A. fumigatus, A. niger e A. flavus, no entanto, a

amostra de A. terreus foi considerada resistente a todas as diluições testadas.

Não foram detectadas diferenças na sensibilidade em relação à origem dos

isolados, caso clínico ou ambiente, porém, o número de isolados de casos clínicos

correspondeu a apenas 17% das amostras.

A toxicidade é um dos principais fatores a ser levado em consideração no

momento da escolha de um agente químico para uso na presença de humanos e/ou

animais. Isto se deve ao fato de que o processo de desinfecção pode acarretar

desde irritação de mucosas e pele, até intoxicações, e com isso embora diminua a

concentração de microrganismos, aumenta a predisposição do indivíduo à

enfermidades (B

RASIL

1994;

ONNEL

;

USSEL

1999).

Tendo em vista isto, foram

selecionados para o teste “in vitro” digluconato de clorexidina, cloreto de benzalcônio

e iodóforo, que apresentam baixa toxicidade.

ELLY

;

RLOFF

(2001) realizaram um estudo sobre a sobrevivência de

microrganismos em materiais hospitalares e encontraram uma maior sobrevida de

cepas de Aspergillus spp. isoladas de casos clínicos que isoladas de ambientes, o

que não foi observado neste trabalho em relação à resistência dos isolados aos

diferentes agentes químicos.

A resistência de A. fumigatus e A. niger encontrada frente ao iodóforo já foi

descrita previamente por T

ERLECKYJ

;

XLER

(1987), no experimento sobre a atividade

de diferentes agentes químicos contra diversos gêneros e espécies fúngicas. Os

autores obtiveram resultados diferentes dos descritos neste trabalho, em relação à

ação da amônia quaternária que se apresentou ineficaz na inibição do crescimento

de ambas as espécies.

A atividade da amônia quaternária e do digluconato de clorexidina “in vitro”

em diluições quatro vezes e dezesseis vezes maiores que a recomendada,

respectivamente, sugere a ação efetiva destes produtos no ambiente, os quais

devem ser utilizados em concentrações maiores que a CIM “in vitro” por sofrerem

influência dos fatores externos, como temperatura, pH e presença de matéria

orgânica (B

RASIL

1994;

ONNEL

;

USSEL

1999).

Segundo M

ONNELL

;

USSEL

(1999), o A. niger é sensível à concentração

de 200µg/ml de clorexidina e 100-200µg/ml de cloreto de benzalcônio. Os resultados

do presente estudo estão de acordo com os autores em relação à amônia

quaternária, porém demonstram que 40µg/ml de digluconato de clorexidina podem

inibir o crescimento deste microrganismo.

A resistência do A. terreus à clorexidina, deve ser considerada com cautela,

visto que somente foi utilizado um isolado desta espécie, podendo a resistência ser

um fator intrínseco e individual do isolado testado (M

ONNEL

;

USSEL

1999;

ELLY

;

RLOFF

, 2001). No entanto, é sabido que a maioria dos isolados de A. terreus são

resistentes à Anfotericina B (S

TEINBACH

et al., 2004), o que geralmente não ocorre

com as outras espécies de Aspergillus associadas a quadros clínicos. Este dado é

importante à medida que a sensibilidade fúngica à Anfotericina B está relacionada

com as glucanas da parede celular, as quais também desempenham um papel

importante na suscetibilidade do microrganismo à clorexidina (M

ONNEL

;

USSEL

1999).

Não foram encontrados na literatura consultada estudos “in vitro” de agentes

químicos desinfetantes e anti-sépticos frente a isolados de A. flavus, no entanto esta

espécie não apresentou característica peculiar em relação às outras três espécies

testadas em nosso estudo.

Como a atividade antimicrobiana dos desinfetantes depende de vários

fatores, como temperatura, pH, diluição, presença de matéria-orgânica, entre outros,

os testes “in vitro” não determinam necessariamente a real capacidade de

desinfecção de um ambiente, porém resultados favoráveis e desfavoráveis nestes

testes devem ser levados em consideração, sendo um indício da atividade destes

produtos contra microrganismos específicos (T

IMENETSKY

1990).

Os resultados obtidos após a condução deste experimento permitem concluir

que a amônia quaternária e o digluconato de clorexidina foram eficazes contra as

diferentes espécies de Aspergillus. Em contrapartida, a ineficácia “in vitro” do

iodóforo neste estudo torna questionável seu uso em superfícies e tecidos vivos para

controle de fungos do gênero Aspergillus.

Tabela 1: Resultados do teste de suscetibilidade “in vitro” de diferentes espécies de Aspergillus a três desinfetantes/anti-sépticos

comerciais.

Espécie Isolado Origem

Produto IF

(CI: 0,05µg/ml)

Ação

do IF

Produto CB

(CI: 0,6mg/ml)

Ação

do CB

Produto DC

(CI: 0,67mg/ml)

Ação

do DC

A. fumigatus 1 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 2 CC CIM: >0,4µg/ml I CIM: 1,2mg/ml I CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 3 CC CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 4 CC CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 5 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 6 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 7 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. fumigatus 8 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 9 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 10 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 11 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 12 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 13 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 14 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 15 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. niger 16 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. flavus 17 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. flavus 18 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. flavus 19 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. flavus 20 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: <0,04mg/ml E

A. flavus 21 CC CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: 0,16mg/ml E

A. flavus 22 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: 0,08mg/ml E

A. terreus 23 A CIM: >0,4µg/ml I CIM: <0,15mg/ml E CIM: >1,33mg/ml I

Eficácia (%)

0 96 96

IF: iodóforo; CB: cloreto de benzalcônio; DC: digluconato de clorexidina

A: ambiente CC: caso clínico

CI: concentração de uso do produto indicada pelo fabricante;

E: eficaz; I: ineficaz;

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Figura 1 – Resultado do teste de microdiluição em caldo demonstrando isolados de

A. niger resistentes a todas as concentrações do iodóforo (linhas 3, 4, 9 e 10), e

sensíveis a todas as concentrações de amônia quaternária (linhas 1, 2, 7 e 8) e

digluconato de clorexidina (linhas 5, 6, 11 e 12).

3.4 A

RTIGO

“Eficácia da Clorexidina-Cetrimida na desinfecção ambiental contra

Aspergillus spp.”

Artigo submetido para publicação na Revista “Arquivos Brasileiros de

Medicina Veterinária e Zootecnia” registrado como REG.: 2275/06.

Eficácia da Clorexidina-Cetrimida na desinfecção ambiental contra Aspergillus

spp.

Clorexidina-Cetrimida efficacy in ambient disinfection against Aspergillus spp.

Melissa Orzechowski Xavier

, Ana Raquel Mano Meinerz

, Marlete Brum Cleff

;

Luiza da Gama Osório

; Luiz Filipe Damé Schuch

; Márcia de Oliveira Nobre

Rodolfo Pinho da Silva Filho

, Mário Carlos Araújo Meireles

Faculdade de Veterinária - Universidade Federal de Pelotas (UFPel);

Faculdade de Veterinária – Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS);

Centro de Recuperação de Animais Marinhos – Fundação Universidade Federal de

Rio Grande (FURG)

Endereço: R. Paul Harris, 537, Bairro: Areal, CEP.: 96077-200, Pelotas/RS, Brasil.

Tel.: (53) 91229266, (53)32289620. E-mail: melissaxavier@bol.com.br

RESUMO

A aspergilose é uma das maiores causas de morte de pingüins em cativeiro,

e requer diversas medidas de prevenção. Dentre estas medidas, a desinfecção de

instalações é essencial no controle de Aspergillus spp., reduzindo os conídios

inalados pelas aves suscetíveis. A clorexidina como agente químico se destaca pela

baixa toxicidade, o que permite sua utilização em presença de animais. Neste

sentido, o trabalho testou a ação in loco da Clorexidina-Cetrimida® no controle de

Aspergillus spp., avaliando a influência de fatores climáticos e populacionais, em um

centro de recuperação de animais marinhos. Para isso foram realizadas por um

período de dois anos, colheitas de amostras de ar através da técnica de

sedimentação, sendo implantado no segundo ano um programa de desinfecção com

Clorexidina-Cetrimida®. Os resultados foram comparados estatisticamente pelo

programa Epinfo 8.0., demonstrando que o isolamento fúngico não apresentou

relação significativa com fatores climáticos e populacionais, e que a diminuição da

concentração de conídios de Aspergillus spp. do ambiente ocorreu devido ao

programa eficaz de desinfecção com a Clorexidina-Cetrimida®, sendo este agente

químico indicado para desinfecção de ambientes internos, auxiliando na prevenção

da aspergilose em aves em cativeiro.

PALAVRAS-CHAVES

Clorexidina, desinfetante, prevenção, aspergilose.

ABSTRACT

Aspergillosis is one of the major causes of deaths in captivity penguins, and

requires a diversity of precautions to prevent. The indoor disinfection is essential to

Aspergillus air concentration control, reducing the number of inhalant conidia to

susceptible penguins. The chlorexidine is a extremely safety chemical agent to use in

the indoor disinfection on the presence of animals because have low toxicity. In this

context, this work tested in loco activity of Clorexidina-Cetrimida® in the Aspergillus

spp. control considering the climatic influence and population variations, on the

recuperation center of marine animals. Samples of the air were collected for two

years, by the sediment method, and the disinfection program were established in the

second year. The dates of the two years were statistically compared, and

demonstrate that population and climate had no significance on the fungal isolation,

and that the disinfection program with Clorexidina-Cetrimida® was considered

effective in the reduction of conidia Aspergillus concentration indoor, and

recommended to indoor disinfection contributing to the aspergillosis prevention in

susceptible captivity animals.

KEYWORDS

Chlorexidine, disinfectant, prevention, aspergillosis.

INTRODUÇÃO

Os programas de higiene e desinfecção são essenciais no controle

ambiental de microrganismos potencialmente patogênicos aos animais. Dentre estes

patógenos, em relação à aves em cativeiro, destacam-se os fungos anemófilos e

ubíquos do gênero Aspergillus, que causam uma micose respiratória geralmente

fatal chamada de aspergilose (Redig et al., 1993; Bauck, 1994; Garcia e Blanco,

2000; Lagneau e Houtain, 2001; Tessari et al., 2004).

Os fungos do gênero Aspergillus se reproduzem através de fialoconídios

pequenos e leves, facilmente veiculados pelo ar, que se depositam em qualquer

objeto ou superfície contaminando todo o ambiente (Latgé, 1999; Lacaz et al., 2002;

Warris e Verweij, 2005). Assim, para o controle da aspergilose, é preconizada a

manutenção correta da ventilação, temperatura e umidade do local, assim como a

higiene e a desinfecção ambiental rotineira (Bauck, 1994; Kearns e Loudis, 2003;

Warris e Verweij, 2005).

A desinfecção ambiental deve ser realizada com rodízio periódico de

agentes químicos capazes de inibir o crescimento fúngico ou eliminar estes

microrganismos, visando à redução na concentração de conídios inalados pelas

aves (Bauck, 1994; Kearns e Loudis, 2003). Dentro dos agentes desinfetantes as

biguanidas, como a clorexidina, se destacam principalmente pela baixa toxicidade,

amplo espectro e suas propriedades inodoras, incolores e não corrosivas (McDonnell

e Russell, 1999).

Tendo em vista que a aspergilose é uma das principais causas de

mortalidade de pingüins em cativeiro (Ainsworth e Rewell, 1949; Khan et al., 1977;

Flach et al., 1990; Redig et al., 1993; Kittle, 2003; Xavier et al., 2006) e considerando

a presença destas aves marinhas no local da desinfecção, assim como a

importância na prevenção da micose em centros de reabilitação, o trabalho teve por

objetivo testar a ação da Clorexidina-Cetrimida®

, no controle de fungos do gênero

Aspergillus das instalações de um Centro de Recuperação de Animais Marinhos,

avaliando a influência dos fatores climáticos e populacionais no isolamento fúngico.

MATERIAL E MÉTODOS

Durante um período de dois anos foi avaliada a qualidade do ar, quanto à

presença de Aspergillus spp., das instalações internas utilizadas para reabilitação de

pingüins no Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM) localizado no

município de Rio Grande, Rio Grande do Sul. Estas instalações eram caracterizadas

por dois ambientes de 12m de comprimento, 4m de largura e 4m de altura, com

paredes azulejadas, e portões grandes (2x2m) nas duas extremidades que

permaneciam abertos durante os turnos de trabalho permitindo o fluxo de ar, para

manutenção da ventilação do local.

As amostras do ar foram colhidas pela técnica de sedimentação, realizada a

partir da exposição por 15 minutos de placas de Petri contendo agar Sabouraud

dextrose acrescido de cloranfenicol. A colheita foi realizada em intervalos de 10 dias

no primeiro ano e semanalmente no segundo ano do experimento, coletando-se uma

amostra referente ao horário de abertura do CRAM (08h00min) e uma segunda

amostra no final do expediente matinal (11h30min) após higienização e ventilação

natural do local, totalizando 160 amostras.

As placas foram imediatamente incubadas em estufa à 25ºC durante um

período de sete dias com observação diária. As colônias fúngicas filamentosas foram

avaliadas macro e micromorfologicamente para identificação taxonômica, sendo

realizada sub-cultura em agar Czapek para obtenção da cultura pura dos isolados de

Aspergillus spp.

Clorexidina – Cetrimida Chemitec ®. Chemitec Agro-Veterinária, São Paulo, SP.

Durante o segundo ano do experimento foi realizado um programa de

desinfecção das instalações a partir do emprego da Clorexidina-Cetrimida®

diariamente nos locais de contaminação por matéria orgânica, e semanalmente em

todos os objetos e superfícies, incluindo paredes e teto. A desinfecção era realizada

ao encerramento das atividades diárias, após limpeza prévia e retirada da matéria

orgânica, através da utilização por fricção mecânica do produto comercial, em

diluição indicada pelo fabricante (100mL/L de água), e posterior enxágüe com água

corrente. Logo em seguida o ambiente era mantido fechado por um período de

aproximadamente 14 horas, até a manhã do dia seguinte.

A densidade populacional do local no momento das colheitas das amostras

foi obtida junto ao CRAM, e os dados meteorológicos da cidade de Rio Grande, RS,

como temperatura média mensal, umidade relativa do ar média mensal e

precipitação total mensal, foram gentilmente cedidos pelo 8º Distrito de Meteorologia

(DISME).

Os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste de qui-quadrado

através do programa Epinfo 8.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ao final do experimento o número total de amostras colhidas foi 160, sendo

64 provenientes do primeiro ano e 96 relativas ao segundo ano do estudo, com

resultado positivo para Aspergillus spp. em 22,5% (36) das amostras, sendo 17

amostras positivas no ano inicial e 19 no ano final do estudo (Tab. 1).

Tabela 1 – Resultados das amostras de ar colhidas durante dois anos, quanto ao

isolamento de fungos do gênero Aspergillus de instalações utilizadas para

reabilitação de pingüins.

Amostras

Positivas

08h00min

Positivas

11h30min

Negativas Total de amostras

1° Ano 14 (21,9%) 3 (4,7%) 47 (73,4%) 64

2° Ano 10 (10,4%) 9 (9,4%) 77 (80,2%) 96

Total 24 (15,0%) 12 (7,5%) 124 (77,5%) 160

O pequeno número de isolados de Aspergillus spp. observado no

experimento é devido ao método utilizado para colheita das amostras, cujo princípio

se baseia na ação da gravidade do ar, sofrendo influência da velocidade e

turbulência do vento que podem carrear os propágulos fúngicos dificultando que se

depositem na placa (Morris et al., 2000).

Durante os dois anos do estudo, a temperatura média mensal variou entre

13°C e 24,2ºC, a umidade relativa do ar média entre 68 e 91% e a precipitação

média mensal entre 17,2 e 355,1mm (Fig. 1, 2). Apesar da grande variação dos

dados, os três fatores climáticos não apresentaram relação significativa com o

isolamento de Aspergillus spp. das instalações, obtendo-se valores estatísticos de

p=0,996 para temperatura, p=0,794 para umidade e p=0,224 para precipitação.

100

200

300

400

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

(mm)

100

(%)

(ºC)

Precip (mm) Temp (ºC) Umid (%)

Fig.1 – Variação climática de temperatura (ºC), umidade (%) e precipitação (mm) da

cidade de Rio Grande no primeiro ano do experimento.

100

150

200

250

300

350

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

(mm)

(%)

(ºC)

Precip (mm) Temp (ºC) Umid (%)

Fig.2 – Variação climática, de temperatura (ºC), umidade (%) e precipitação (mm) da

cidade de Rio Grande no segundo ano do experimento.

A relação não significativa entre temperatura e isolamento fúngico já foi

descrita previamente por diversos autores (Ren et al., 2001; Panagopoulou et al.,

2002; Wu et al., 2005; Lee et al., 2006), assim como a não significância da

precipitação em amostras positivas (Lee et al., 2006). Já a influência da umidade no

isolamento fúngico tem tido resultados contraditórios entre os estudos sendo que

alguns autores acreditam que exista uma relação (Lee et al., 2006), enquanto outros

estudos demonstram que este fator não é determinante para o isolamento fúngico

(Ren et al., 2001; Panagopoulou et al., 2002; Wu et al., 2005).

A densidade populacional do CRAM no momento das colheitas variou de

zero a 17 animais entre aves, mamíferos e répteis, e não apresentou relação

significativa com o isolamento de Aspergillus spp.. De acordo com estudo realizado

por Wu et al. (2005), o número de ocupantes nas instalações está relacionado com o

aumento na concentração de fungos leveduriformes, não apresentando relação com

a concentração de fungos filamentosos no ambiente, o que confirma os resultados

obtidos no presente estudo.

O isolamento de Aspergillus spp. no segundo ano foi significativamente

menor (p=0,025; p<0,05) nas colheitas das 08h00min em relação ao ano inicial,

enquanto que nas amostras das 11h30min não houve diferença significativa

(p=0,168) entre os dois anos.

Tendo em vista que fatores climáticos e densidade populacional não

interferiram no isolamento de Aspergillus spp. do ambiente, a diminuição significativa

dos isolados na primeira colheita da manhã foi atribuída ao programa de desinfecção

empregado, que conseguiu minimizar a proliferação fúngica durante o período

crítico, em que o CRAM permanecia fechado, após expediente de trabalho interno

diário. Outros estudos da ação in loco deste agente químico frente a fungos

anemófilos, como o Aspergillus spp. não foram encontrados na literatura, no entanto,

testes in vitro da ação antifúngica do digluconato de clorexidina demonstraram

resultados positivos contra fungos do gênero Aspergillus (dados em publicação

Agentes químicos a base de digluconato de clorexidina são amplamente

utilizados na prática odontológica e anti-sepsia, porém sua aplicação como

desinfetante ambiental é limitada. No presente experimento, este agente químico foi

escolhido principalmente devido a necessidade de aplicação em instalações com a

presença de animais, tendo em vista que os produtos mais frequentemente

utilizados para desinfecção de ambientes internos, como hipoclorito de sódio e

amônia quaternária, são irritantes para mucosas e pele, e a amônia quaternária

Artigo “Atividade in vitro de três agentes químicos frente a diferentes espécies de Aspergillus”, submetido e

devidamente adequado às correções dos revisores científicos da Revista “Arquivos do Instituto Biológico”.

ainda é passível de contaminação, podendo carrear e disseminar microrganismos

para o ambiente (McDonnell e Russell, 1999).

Em contrapartida, nas colheitas das 11h30min não ocorreu redução do

isolamento fúngico entre os dois anos estudados, provavelmente devido à ventilação

natural utilizada no CRAM, que permite a veiculação de propágulos fúngicos do ar

externo para o interior das instalações, re-contaminando o ambiente. Esse fato

também foi observado em estudos envolvendo ambientes hospitalares, residências e

prédios comerciais (Leenders et al., 1999; Shelton et al., 2002; Martins-Diniz et al.,

2005; Wu et al., 2005; Lee et al., 2006), os quais comprovaram que o ar externo é a

maior fonte de contaminação fúngica para as instalações internas.

CONCLUSÃO

Os fatores climáticos e populacionais não desempenharam influência

significativa no isolamento de Aspergillus spp. das instalações internas do CRAM.

No entanto, o uso da Clorexidina-Cetrimida® em programas de desinfecção

ambiental demonstrou eficácia no controle de fungos do gênero Aspergillus,

podendo ser utilizado “in loco” no rodízio de substâncias ativas, para desinfecção de

instalações de cativeiro de pingüins, auxiliando na prevenção da aspergilose nestas

aves marinhas suscetíveis mantidas em ambientes fechados.

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associated with ventilation performance in Taiwan’s air-conditioned office buildings.

Indoor air, v.15, p.19-26, 2005.

AGRADECIMENTOS

À Empresa Chemitec Agro-Veterinária pela gentileza no fornecimento do

produto Clorexidina-Cetrimida® para uso neste experimento.

3.5 A

RTIGO

“Aspergillosis: a limiting factor during the recovery of captive Magellanic

penguins”

Artigo submetido para publicação na revista “Brazilian Journal of

Microbiology” registrado como 241/06

ASPERGILLOSIS: A LIMITING FACTOR DURING RECOVERY OF CAPTIVE

MAGELLANIC PENGUINS*

Melissa O. Xavier

*, Mauro P. Soares

, Ana Raquel M. Meinerz

, Márcia O. Nobre

Luiza G. Osório

, Rodolfo P. da Silva Filho

, Mário Carlos A. Meireles

Depto. de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, Universidade

Federal de Pelotas (FAVET, UFPel), Campus Universitário, s/nº, CEP: 96010-900.

Laboratório Regional de Diagnóstico – FAVET, UFPel.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Depto. de Clínicas Veterinária – FAVET, UFPel.

Graduação em Veterinária (FAVET, UFPel).

Centro de Recuperação de Animais Marinhos de Rio Grande – CRAM, MO-FURG.

* Parte integrante da dissertação de mestrado da primeira autora. E-mail: [email protected]u.br, tel: (53)

32757496.

ASPERGILLOSIS: A LIMITING FACTOR DURING RECOVERY OF CAPTIVE

MAGELLANIC PENGUINS

ABSTRACT

The article describes the epidemiology, macroscopic and histological lesions

as well as the isolation of Aspergillus flavus and A. fumigatus from Magellanic

penguins (Spheniscus magellanicus) during recovery in the Center for Recovery of

Marine Animals (CRAM - 32°S/52°W), over a period of two years. From January

2004 to December 2005 the Center received 52 Magellanic penguins, and 23%

(12/52) died. Necropsies were performed and tissue samples were collected for

histological and microbiological examination. From 12 dead animals, aspergillosis

was confirmed in five animals, corresponding to 42% of the mortality. Granulomatous

nodules were observed mainly on air sacs and lungs. Histologically, septate and

branching hyphae, measuring 3-5 µm and PAS positive were found. Two of these

cases were caused by A. fumigatus, two other by A. flavus, and in one the diagnostic

was established by macroscopic lesions observed in the necropsy without sample

collection for fungal isolation and identification. The five aspergillosis cases occurred

in the first year of the study, when a disinfection program was not yet established in

the CRAM. This paper points out the importance of aspergillosis in the rehabilitation

process of captive penguins, and emphasize the necessity of an environmental

disinfection on the aspergillosis prevention, mycosis that caused a high rate of

mortality of the seabirds found on the Brazilian coast and admitted in the CRAM.

KEYWORDS: aspergillosis, rehabilitation, penguins, captivity.

ASPERGILOSE: UM FATOR LIMITANTE NA REABILITAÇÃO DE PINGÜINS-DE-

MAGALHÃES

RESUMO

O trabalho descreve fatores epidemiológicos, achados de necropsia,

histológicos e o isolamento de Aspergillus flavus e A. fumigatus em pingüins-de-

Magalhães (Spheniscus magellanicus) em reabilitação no Centro de Recuperação

de Animais Marinhos (CRAM - 32°S/52°W), durante um período de dois anos. De

janeiro de 2004 a dezembro de 2005 foram recebidos no Centro, 52 pingüins-de-

Magalhães, dos quais 23% (12/52) morreram. Esses animais foram necropsiados e

amostras de tecidos foram coletadas para exame histológico e microbiológico. De 12

animais necropsiados, aspergilose foi diagnosticada em 42% (5/12). Granulomas

foram observados principalmente em sacos aéreos e pulmões e hifas septadas,

hialinas e dicotômicas em ângulo agudo foram encontradas na histologia. Dois casos

foram ocasionados por A. fumigatus, outros dois por A. flavus e em um caso o

diagnóstico foi estabelecido pelas lesões macroscópicas observadas na necropsia,

sem a coleta de amostra para isolamento e identificação fúngica. Os cinco casos da

micose ocorreram no primeiro ano, período em que não havia um programa de

desinfecção no Centro. Este trabalho ressalta a importância da aspergilose

interferindo no processo de reabilitação de pingüins em cativeiro no CRAM, e

enfatiza a necessidade da desinfecção ambiental na prevenção da micose, doença

que causa uma alta taxa de mortalidade de aves marinhas encontradas na costa

brasileira e encaminhadas ao CRAM.

PALAVRAS-CHAVE: aspergilose, reabilitação, pingüins, cativeiro

INTRODUCTION

Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) live on the southern coasts

of South America, in the Pacific and Atlantic Oceans, in the Falkland Islands and in

Tierra del Fuego [18]. Usually they migrate in the direction of Argentina and Brazil to

feed on fish. During this migratory route many of these birds are exposed to adverse

environmental conditions and some of them are found on beaches, generally

showing poor body conditions with dehydration, hypothermia, skin lesions, traumatic

process or oiled and then, they are sent to rehabilitation [5; 6; 7; 14; 16; 18].

In Brazil, there are 14 institutions, distributed in different states of the country

that promote rehabilitation of marine animals [6]. The unique specific center for the

rehabilitation of marine fauna in Brazil, with emphasis on oiled animals is situated in

the South of Brazil in the city of Rio Grande, RS (32°S/52°W). In this center, named

‘Centro de Reabilitação de Animais Marinhos (CRAM), all the necessary procedures

for the animals to acquire good conditions to be reintroduced in the environment are

carried out [16].

During the period that penguins stay in captivity, many of them are affected

by diseases that cause death hindering the process of rehabilitation and

reintroduction to the environment. Among these diseases aspergillosis stands out, an

opportunist mycosis caused by the Aspergillus genus, which affects mainly the

respiratory system and is considered one of the most important causes of mortality in

captive penguins [1; 4; 8; 11; 15].

Avian aspergillosis could be classified into acute or chronic disease. The

acute presentation is usually a flock problem with juveniles that are exposed to high

spore levels, progressing rapidly and causing death within 48 hours. In many cases it

is severe and includes dyspnea, with high morbidity and mortality rates. The main

route of dissemination of the fungi is through the respiratory system with only minor

spread by blood circulation. The chronic presentation usually appears in individual

adults that have been exposed to low spore levels but are immunosuppressed due to

stress, disease, antibiotic or steroidal therapy. The bird becomes unable to effectively

eliminate a normal inhalation of Aspergillus spores, which colonize local tissue and

can cause focal and/or disseminated form of aspergillosis. The most frequent site of

chronic focal form of the disease on marine avian is the trachea while the

disseminated form generally starts in the lungs and air sacs and spreads to other

tissues like bones, liver, spleen and kidney. The chronic presentation progresses

slowly for weeks or months, with low rates of morbidity and mortality [1; 10; 13].

Several preventive measures are used against the disease, nevertheless in

some occasions these preventive measures can not avoid outbreaks of aspergillosis.

Among several preventive measures we can highlight the administration of antifungal

therapy to susceptible penguins [9; 16], the control of air quality with laminar flow, the

use of air filters and programs for disinfection of the surroundings [1; 3; 10].

This report describes some epidemiologic factors of the aspergillosis in

Magellanic penguins received on CRAM over a two-year period.

MATERIALS AND METHODS

During the period of January 2004 to December 2005 the routine of

recovering penguins at CRAM was attended. In this center, all admitted penguins

were identified, weighted, and evaluated for the amount of oil and the hematocrit

value (Ht), according to the protocol described by Ruoppolo et al. [16]. With the aim

of evaluating the clinical evolution of the recovering penguins, all birds were weighted

weekly, clinically examined and blood sample was collected to determine the

hematocrit level.

The preventive measure used against aspergillosis in CRAM is the

administration of oral itraconazole

(15 mg/kg/day, during 15 days), for newly-arrived

penguins with body weight less than 2.5 kg. This preventive therapy was made

during the two years, and started in the arrival after the clinical examination of the

birds.

Since January 2005, a disinfection program was established in the CRAM to

increase the air quality, reducing airborne conidia concentration in the facilities of the

captive penguins. This disinfection program consisted of cleaning daily the indoor

equipments and objects with the use of a chemical agent (chlorexidine-cetrimida

The penguins that died were sent to necropsy to determine the cause of

death. In the necropsy macroscopic alteration was evaluated and fragment of tissues

were collected for histology and mycology.

Sporanox® - Janssen-Cilag Farmacêutica Ltda. – São Paulo, SP.

Clorexidina-Cetrimida Chemitec® - Chemitec Agro-Veterinária, São Paulo, SP.

Samples collected for histology were fixed in 10% buffered formalin and

embedded in paraffin. Sections (3-4 µm) were stained with haematoxylin and eosin

(HE), periodic acid-Schiff (PAS) and Grocott’s methanamine silver (GMS).

For mycology, the samples were submitted to direct examination with KOH

20%, and to culture in triplicate in Sabouraud dextrose agar with cloranfenicol,

incubated at 37ºC for seven days with daily observation of the culture.

RESULTS

During the period of study 52 Magellanic penguins, 47 juveniles and 5 adults

were received. The birds had body weight ranging from 1.8 to 3.2 kg, values situated

below the normal reference for the species (approximately 4 kg). A total of 18

penguins had oiled feathers and 11 had low Ht value (<35%). Over the two-year

period 40 birds (77%) were recovered and 12 (23%) died. Among these dead

penguins, two died with less than 24 hours after the arrival, three with less than

seven days, four with approximately 20 days in captivity, two after 30 days of the

arrival and one after 90 days.

The necropsy, histological and mycological examination established the

aspergillosis diagnostic in 42% (5/12) of the dead animals during the two years of the

study. However, all the deaths were registered in the first year, resulting in a rate of

83% of death caused by aspergillosis in 2004 and 0% in 2005. Seven other penguins

died from other causes as cachexia or pododermatitis with secondary septicemia.

All the animals that had aspergillosis were juveniles and had poor body

conditions, the hematocrit value was low and only one was oiled. All the deaths

occurred as isolated cases, causing penguins deaths in distinct months, June, July,

September and October.

Macroscopic alterations in five birds with aspergillosis were varied. Although

all penguins showed lesions in the respiratory system, the acute aspergillosis

presentation, characterized by miliary white-yellowish granulomatous nodules in the

lung, was found in three penguins that had sudden death, and the chronic

presentation, with the wall of air sacs thickened and disseminated to the other organs

was observed in two penguins that had respiratory clinical signs such as dyspnea

and pulmonary stertors, loss of appetite and lethargy preceding the death.

The necropsy of the three penguins with the acute presentation revealed

lungs with congestion and small white-yellowish nodules with 1-3 mm. Two penguins

with chronic presentation (Fig. 1) presented thickened air sacs with abundant

caseous and necrotic debris and grayish-green fungal colonies and nodules with 1

mm to 1 cm in the air sacs and lungs. One penguin had white-yellowish nodules with

approximately 0.5 cm, disseminated throughout the thoracic cavity and externally in

the esophagus. Another penguin showed also nodules and fungal colonies in the

kidneys and liver and the syrinx had a nodule measuring approximately 7 cm, with

caseous material in the center and recovered with whitish plaques.

One bird with a chronic presentation did not have material sent to the fungal

culture, but the macroscopic and histological lesions were typical of aspergillosis.

Figure 1- Macroscopic lesions of aspergillosis in Magellanic penguins: (A) air sacs

thickness with abundant caseous and nodules; (B) nodules white-yellowish externally

on esophagus; (C) fungal colonies in the air sacs;

Histologically, penguins with acute presentation had lungs with necrotic areas

with septate and branching hyphae, measuring 3-5 µm and PAS positive growing in a

radial pattern rimmed by cell debris, hemorrhage and infiltrates of heterophilic,

mononuclear and multinuclear cells. In the chronic presentation it was observed in

the lungs, liver, kidneys and syrinx a necrotic foci surrounded by macrophages,

heterophils and giant cells, sometimes within a fibrous tissue proliferation at the

periphery. The air sacs presented thickness and abundant caseous material. Septate

and branching hyphae, giant cells, mononuclear and multinuclear cells and the

characteristic conidial head of Aspergillus were also present (Fig.2).

Figure 2 – Conidial heads of Aspergillus spp. (black arrows) and septate and

branching hyphae (blue arrows), in air sacs of the Magellanic penguins at histological

examination with HE (100X).

Direct examination with KOH of the samples in mycology revealed septate

and branching hyphae in tissues and conidial heads in air sacs. Culture allowed to

identify the etiologic agent as A. fumigatus in two cases and as A. flavus in two other

animals, represented, respectively, by grayish turquoise colonies with rapidly growing

and uniseriate phialides over upper half to two-thirds of the pyriform vesicle, and by

yellow-green colonies with rough-walled stipes, spherical vesicles and metulae

covering three quarters of the entire surface of the vesicle.

DISCUSSION

The importance of aspergillosis in different species of captive penguins is

reported since the 40s, causing mortality rates between 50-100% in marine birds in

different regions of the world [2; 4; 9; 11; 12; 17]. In our work the high frequency of

aspergillosis was reaffirmed and it corresponded to approximately 50% of the

mortality in recovering penguins. This numbers can be explained by the difficulty in

prophylaxis and early diagnosis of this disease and consequent inefficacious

treatment, which results in death of the majority of the affected birds.

The acute presentation of aspergillosis was observed in 60% of the

Magellanic penguins affected, differing from the values found by Hocken [9], who

observed only 14% of acute presentation in Eudyptula m. minor species. However

the work of Hocken was carried out with wild penguins that had only nutritional stress

as an immunosuppressant factor, while the recovering penguins at CRAM went

through stress factors like: manipulation, transport, habitat changing, among others,

increasing even further the immunosuppression which predisposes to this mycosis

with more serious injuries and more rapidly [9].

The corporal debilitation, characterized by malnutrition, dehydration and

hypothermia, captivity stress, antibiotic or steroidal therapy and the oil toxicity are

factors that predispose recovering penguins to aspergillosis [1; 17]. In spite of the oil

being considered an important factor to induce a serious immunosuppression, in our

work this factor was not characterized as an important factor to predispose the

penguins to aspergillosis, because from 18 oiled penguins treated during this period

only one had aspergillosis.

Young birds have immature immune system that increases the avian

susceptibility to aspergillosis [1, 4]. In our cases all penguins that died with this

mycosis were juveniles, but with our results we can not affirm that this category is

more susceptible, because in this study juvenile penguins represented 90% of the

total birds received in CRAM.

In spite of A. fumigatus being the fungal specie more frequently involved on

penguins aspergillosis [2; 11], in our work, this specie was found at the same

frequency as A. flavus, that is also considered a pathogenic species associated to

clinical cases of aspergillosis in marine and domestic birds [2; 3]. Therefore it has to

be consider that the values obtained could be different if the number of animals was

increased.

The aspergillosis in captive penguins does not have a constant annual

prevalence, occurring frequently as outbreaks that cause high mortality rates in some

years and in others the mortality tend to nullity [4]. In CRAM the occurrence of

aspergillosis was not an outbreak, but occurred as isolated cases. This fact is

justified by the opportunistic characteristic of this mycosis, that usually occur when

there is host immunossupression associated or not with the increase inhalation of

spores [1; 3; 15].

The mortality decrease in the second year of the study was attributed to the

establishment of a disinfection program in CRAM. The cleaning and disinfection

program is the basis of a good sanitary program because it decreases the quantity of

spores in the environment and increases the air quality [1; 3; 10].

CONCLUSION

This work shows that the aspergillosis is an important disease that causes

mortality during the recovering process of rehabilitation of penguins in captivity. To

the best of our knowledge this is the first report of epidemiology of aspergillosis in

penguins found on Brazilian beaches and sent to CRAM, showing high levels of

mortality, and emphasize the necessity of an environmental disinfection on this

mycosis prevention.

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4 C

ONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente estudo permitiram concluir que:

- A freqüência da aspergilose em pingüins no CRAM foi relevante,

demonstrando a interferência da micose no processo de reabilitação destes animais

que geralmente encontram-se imunossuprimidos;

- Os casos de aspergilose em pingüins durante o período do estudo

apresentaram uma redução significativa entre os dois anos, com taxas de

mortalidade passando de 83% no primeiro ano (5/6) para 0% no segundo (0/6).

- Fungos do gênero Aspergillus estão presentes no ambiente de reabilitação

do CRAM;

- A. fumigatus foi a espécie predominante nas amostras obtidas das

instalações de cativeiro do CRAM, seguido de A. niger e A. flavus, todas com

potencial patogênico;

- Os casos de aspergilose em pingüins no CRAM foram causados por A.

fumigatus e A. flavus;

- Os agentes químicos que obtiveram melhor resultado “in vitro” frente a

espécies patogênicas de Aspergillus foram o digluconato de clorexidina e a amônia

quaternária;

- A contaminação por fungos do gênero Aspergillus no ambiente interno do

CRAM pôde ser parcialmente controlada pelo programa de desinfecção ambiental

estabelecido com o uso rotineiro da Clorexidina-Cetrimida®;

5 C

ONSIDERAÇÕES FINAIS

Ao final do experimento sugere-se que a melhora na qualidade do ar em

relação à concentração de Aspergillus spp. beneficiou a reabilitação de pingüins no

CRAM, sem o aparecimento de nenhum caso de aspergilose durante o período de

controle microbiológico do ambiente. Isto comprova a importância da desinfecção

ambiental como uma medida eficaz dentro de um conjunto de ações necessárias

para a prevenção da enfermidade.

Deve-se ter em mente que todas as ações que objetivam o controle fúngico

nos ambientes são benéficas, e que apesar de não anularem a possibilidade de

ocorrência de casos isolados e esporádicos de aspergilose em pingüins no CRAM,

devem ser adotadas no sentido de reduzir ao máximo os casos da micose,

garantindo que na difícil tarefa de reabilitação de pingüins, um fator importante seja

amenizado, sendo um a menos a interferir neste processo.

A redução significativa do isolamento fúngico que ocorreu de forma parcial,

demonstra que além da desinfecção, a alteração da ventilação natural para

ventilação controlada com emprego de filtros de ar, que reduziriam a re-

contaminação das instalações pelo ar externo, são outras medidas de prevenção

que devem ser estudadas no CRAM. Assim como métodos para diagnóstico precoce

da enfermidade, uso de novos fármacos antifúngicos tanto para prevenção como

para tratamento, ou ainda uso de substâncias imunoestimulantes e

imunomoduladoras que auxiliariam a resposta imune dos pingüins. Este último se

destaca à medida que a maioria dos animais recebidos pelo CRAM apresenta

imunossupressão o que agrava sua predisposição à aspergilose.

Todos os pontos devem ser estudados considerando a relação custo -

beneficio assim como a aplicabilidade a nível populacional e não individual. Isto

porque a grande maioria dos estabelecimentos que trabalham com reabilitação de

pingüins atua como organizações não-governamentais, com poucos recursos

financeiros, e em muitos casos recebem centenas de animais enfermos em um

mesmo período, o que torna difícil e inviável a clínica individual destes animais que

geralmente necessitam de cuidados imediatos e emergenciais, sendo tratados como

uma população.

Este período de trabalho proporcionou a integração interinstitucional, e a

inter-relação da micologia laboratorial com a micologia prática aplicada, na área de

clínica e reabilitação de animais, bem como a participação efetiva diária na área da

pesquisa com desenvolvimento de projetos, rotina laboratorial e orientação de

alunos em diferentes níveis da graduação, fatores fundamentais para crescimento e

aperfeiçoamento profissional.

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