( PDF ) Resistência à meticilina mediada pelo gene mecA nos Staphylococcus spp coagulase negativa

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências

Médicas

Resistência à meticilina mediada

pelo gene mecA nos Staphylococcus spp

coagulase negativa

Alice Beatriz Mombach Pinheiro Machado

Orientador: Prof. Dr. Afonso Luis Barth

Dissertação de Mestrado

2007

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências

Médicas

Resistência à meticilina mediada

pelo gene mecA nos Staphylococcus spp

coagulase negativa

Alice Beatriz Mombach Pinheiro Machado

Orientador: Prof. Dr. Afonso Luis Barth

Dissertação de Mestrado

2007

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“A permanência é uma ilusão

Só a mudança é real

É impossível pisar duas vezes no mesmo rio “

Heráclito

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Afonso Luis Barth pela sua orientação em todos os momentos da

execução deste trabalho, pela grande paciência e generosidade. Sobretudo pelo

incentivo e equilíbrio nas horas difíceis.

A Dra. Susana Hoffmeister Barcellos (in memorium) primeira pessoa a julgar

esta dissertação uma realidade.

Agradeço especialmente a sorte de ter como bolsista a aluna Keli Cristine

Reiter com sua presença constante na execução deste trabalho, amizade, carinho,

dedicação, disponibilidade e principalmente competência.

A todos os colegas da Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular pela

amizade, estímulo e auxílio técnico.

Ao Leandro Réus Rodrigues Peres pelo apoio técnico.

A Ana Lúcia Souza Antunes por ceder gentilmente os primers para realização

do PCR para o gene tuf.

Ao Rodrigo Minuto Paiva e a Cristiane Piccinini Maurer que auxiliaram na

coleta das amostras e no início da execução técnica do projeto.

Especialmente às minhas colegas Fernanda de Paris e Maria del Carmen

Parareda Mur pela amizade e auxilio na rotina do laboratório sempre que tive que

me afastar.

A minha amiga e colega de Laboratório de Biologia Molecular Daniela

Ferreira Passos por indicar os caminhos corretos para realização do projeto, pelo

incentivo e carinho.

A minha mãe Ilse Oppermann Mombach, pelo apoio incondicional, carinho e

incentivo.

Ao meu filho Dulphe pela impaciência e auxílio nas traduções. E aos meus

filhos Thiago e Bruna pelo carinho e incentivo e compreensão em todas as horas

que me afastei deles. A meu marido sou grata pela eterna e terna paciência.

Aos funcionários do Laboratório de Patologia Clínica, Unidade de

Bacteriologia do Grupo Hospitalar Conceição pelo apoio e auxílio técnico para

utilização do equipamento de semi-automação para identificação das espécies dos

estafilococos.

A bioMèrieux, pelos insumos laboratoriais gentilmente cedidos para

identificação das espécies dos estafilococos.

Nenhum caminho é trilhado solitariamente, nossos acompanhantes, muitas

vezes são pessoas surpreendentes e que não escolhemos. Estes agradecimentos

são na maioria para estas pessoas que nos acompanham e auxiliam

inesperadamente e outras que ajudam por generosidade e amizade. Muito obrigada

a todos que me acompanharam e auxiliaram durante estes anos, na execução deste

trabalho.

Dedico esta conquista a meus filhos

muito amados Dulphe, Thiago e Bruna,

a meu marido Dulphe e à minha mãe que

incondicionalmente me incentivou.

ABREVIATURAS

AAP – proteína associada a acumulação

ATCC – American Type Culture Collection

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute

C-MRSA - S.aureus comunitário resistente a meticilina

MRS – Staphylococcus spp resistente a meticilina

MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina

MR-SCoN – Staphylococcus spp coagulase negativa resistente a meticilina

MS-SCoN- Staphylococcus spp coagulase negativa sensível a meticilina

NCCLS- National Cometee of Clinical and Laboratory Standards

PBP – Penicillin Binding Protein (Proteína ligadora de Penicilina)

PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

PIA - adesina polissacarídica intercelular

PVL – Panaton-Valentine leucocidin

SCCmec – Staphylococcal cassette chromosome mec

SCoN – Staphylococcus spp coagulase-negativa

UTI - Unidade de Terapia Intensiva

VPN - valor preditivo negativo

VPP - valor preditivo positivo

TABELAS

TABELA 1. Descrição dos tipos I a VI de SCCmec..............………..………………..44

TABELA 2. Elementos genéticos associados à resistência do SCCmec tipo II ...... 48

TABELA 3. Elementos genéticos associados à resistência do SCCmec tipo III...... 49

FIGURAS

FIGURA 1. Organização genética do complexo mec em estafilococos e suas

diferentes classes..................................................................................................... 38

FIGURA 2. Exemplo esquemático do elemento genético SCCmec tipo II com

estruturas do complexo ccr e do complexo mec...................................................... 41

FIGURA 3. Representação esquemática dos SCCmec I a VI com os principais

elementos gênicos (ccr, IS431, IS1272, mecA, mecI, mecRI, orfX, pI258, pT181,

pUB10 e Tn554) e com os quatro lócus A, B, D e E, indicados pelas letras utilizados

para identificação dos tipos de SCCmec.................................................................. 50

SUMÁRIO

RESUMO... ………………………………………………………………………….……..12

ABSTRACT…………………………………………………………………………………13

INTRODUÇÃO...........................................................................................................14

REVISÃO DA LITERATURA………………………………………………………..........18

Staphylococcus spp coagulase negativa: peculiaridades da bactéria…………….....18

Patogenicidade dos Staphylococcus spp coagulase negativa……………………….. 21

Importância clínica das infecções por Staphylococcus spp coagulase negativa…....24

Epidemiologia da resistência Staphylococcus spp coagulase negativa……………...26

Mecanismos de resistência dos Staphylococcus spp coagulase negativa aos aos

antibióticos β-lactâmicos…………………………………………………………………...28

Regulação da expressão gênica do gene mecA e interferência do operon bla da β-

lactamases…………………………………………………………………………………..32

Resistência mediada pelo gene mecA e cassetes SCCmec………………..............34

Descrição do complexo do gene mec ....................................................................... 36

Descrição do complexo dos genes ccr.......................................................................39

Estrutura dos principais tipos de SCCmec…………………………………………........42

A resistência codificada nos SCCmec e descrição atual……………………………...45

Métodos de detecção da resistência à meticilina………………………………….…….51

OBJETIVOS…………………………………………………............................................54

REFERÊNCIAS DA REVISÃO DA LITERATURA…………………………...................55

ARTIGOS

Are there discrepancies between detection mecA gene in coagulase-negative

staphylococci by PCR and by cefoxitin and oxacillin discs? What’s the role of β-

lactamse hyperprodution?.........................................................................................73

“Versão em português do artigo: Are there discrepancies between detection mecA

gene in coagulase-negative staphylococci by PCR and by cefoxitin and oxacillin

disc? What’s the role of β-lactamse hyperprodution?..............................................95

Distribution of staphylococcal cassette chromosome (SCCmec) types I, II, III and IV

in coagulase negative Staphylococcus spp in a tertiary care hospital in southern

Brazil ……………………………………………………………………………………..118

Versão em português do artigo “Distribution of staphylococcal cassette chromosome

(SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase negative Staphylococcus spp in a

tertiary care hospital in southern Brazil"……………………………………………...139

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS...................................................161

ANEXO………………………………………………………………............................163

RESUMO

Os Staphylococcus spp coagulase negativa (SCoN) são reconhecidos como

agentes etiológicos importantes de infecções humanas. A maioria dos países

desenvolvidos relata um aumento de infecções nosocomiais por SCoN resistentes a

meticilina e outros antibióticos. A resistência a meticilina é uma característica

importante destas bactérias, porém difícil de detectar pelos métodos convencionais

de suscetibilidade. Esta resistência é devido à presença de um elemento genético

chamado staphylococcal cassette chromosome (SCCmec), que codifica o gene

mecA. A identificação dos tipos de SCCmec é relevante para epidemiologia da

resistência a meticilina dos Staphylococcus spp. Este estudo prospectivo teve como

objetivo determinar a prevalência do gene mecA e a distribuição dos tipos de

SCCmec nos SCoN. Também foi avaliada a eficiência do teste de disco difusão com

cefoxitina e oxacilina para caracterizar a resistência a meticilina mediada pelo gene

mecA. Foram analisadas um total de 181 SCoN de hemoculturas. A prevalência do

gene mecA entre estes isolados foi de 71,3%. A sensibilidade dos discos de

cefoxitina e oxacilina para todas as espécies de SCoN foi de 100% e 98,4%,

respectivamente, enquanto que a especificidade foi de 93% e 89,3%. As espécies

mais prevalentes de SCoN foram S. epidermidis (64%), seguido pelo S. hominis

(10%), S. haemolyticus (8,8%) e S. capitis (7,7%). A percentagem de isolados

positivos para o gene mecA foi maior para S. haemolyticus (98,3%), seguido pelo S.

epidermidis (75%) e S. hominis (72,2%). Entre os 129 isolados resistentes, 36

(27.9%) foram identificados com o SCCmec tipo I, 4 (3.0%) com o SCCmec tipo II,

67 (52%) com o SCCmec tipo III, 1 (0.8%) com o SCCmec tipo IV e 4 (3.0%) com os

SCCmec tipos I e III. Dezessete isolados foram não tipáveis. O SCCmec tipo III foi o

mais prevalente entre os isolados de S. epidermidis (52%). Entre estas cepas, 30

(23%) apresentaram um SCCmec tipo III modificado, que amplificou uma região dcs

adicional. Os SCoN meticilina resistentes (MR-SCoN) mostraram um nível de

resistência aos antibióticos não β-lactamicos maior quando comparados aos SCoN

meticilina suscetíveis (MS-SCoN). Os isolados com o SCCmec tipo III foram mais

resistentes aos antibióticos não β-lactamicos do que os isolados com SCCmec tipos

I, II, e IV.

ABSTRACT

Coagulase negative staphylococci (CoNS) are now recognized as important

etiological agents of infections in humans. Most developed countries have reported

an increase in CoNS infection in hospitalized patients, which are resistant to

methicillin and other antibiotics. The methicillin resistance is an important

characteristic of these bacteria. Moreover, the resistance to methicillin may not be

easily detected by conventional susceptibility methods. Methicillin resistance is due

to the acquisition of a large DNA element termed staphylococcal cassette

chromosome mec (SCCmec), which harbored the mecA gene. The SCCmec typing

is essential for understanding the molecular epidemiology of methicillin resistant

Staphylococcus spp. This prospective study was aimed to determine the prevalence

of mecA gene and the distribution of SCCmec types in CoNS. Also was evaluated

the efficiency of the cefoxitin and oxacilin disk diffusion test to characterize the

meticillin resistance mediated by the gene mecA. A total of 181 CoNS from

bloodstream isolate were available for the study. The prevalence to mecA gene was

71.3%. The sensivity of oxacillin and cefoxitin disks for all CoNS species were 100%

and 98.4% respectively, whereas the specificity were 93% and 89,3 %. The most

prevalent SCoN species were: S. epidermidis 116 (64%) followed by S. hominis 18

(10%), S. haemolyticus 16 (8.8%) and S.capitis 14 (7.7%). The percentage of mecA-

positive isolates was highest for S. haemolyticus (93.8%), followed by S. epidermidis

(75%) and S. hominis (72.2%). Among the 129 bloodstream isolates witch mecA

gene, 36 (27.9%) harbored SCCmec type I, 4 (3.0%) harbored SCCmec type II, 67

(52%) harbored SCCmec type III, 1 (0.8%) harbored SCCmec type IV and 4 (3.0%)

harbored SCCmec type I and III. Seventeen isolates were not typeable. The

SCCmec type III was the most prevalent among the isolates of S. epidermidis (52%).

Among these strains, 30 (23%) harbored a modified SCCmec type III, which

contained, in contrast to regular type III, an additional dcs region. Methicillin resistant

CoNS showed higher level of resistance to all non beta lactamics antimicrobials as

compared to methicillin susceptible. The isolates with SCCmec type III were more

resistant to non-beta lactamics antimicrobials than the isolates harboring SCCmec

type I, II and IV.

INTRODUÇÃO

O gênero Staphylococcus é composto de 33 espécies, 17 das quais podem

ser isoladas de amostras biológicas humanas, sendo dividido em dois grandes

grupos: os Staphylococcus coagulase positiva, cujo principal representante é o S.

aureus e os Staphylococcus spp coagulase negativa (SCoN). Os SCoN mais

freqüentes associados a infecções humanas são S. epidermidis, S. haemolyticus, S.

lugdunensis, S. warneri e S. saprophyticus (1).

Os SCoN são bactérias importantes na composição da microbiota normal da

pele e da mucosa humana, mas em condições apropriadas podem causar infecções

oportunistas nosocomiais e comunitárias. Quando a barreira cutânea natural é

rompida por trauma, esses organismos podem entrar nos tecidos do hospedeiro e

se desenvolver como um patógeno. Além disso, os SCoN apresentam mecanismos

de virulência complexos que tornam difícil a sua erradicação (1) Nas últimas

décadas houve um aumento dos casos de infecções devido ao SCoN,

principalmente bacteremias nosocomiais que podem apresentar altos índices de

morbidade e mortalidade. Esta bactéria é freqüentemente isolada em neonatos, em

pacientes imunocomprometidos, pacientes portadores de válvulas cardíacas e

pacientes de unidades de tratamento intensivo onde é freqüente a utilização de

processos invasivos (10, 70).

Os S. aureus tornaram-se resistentes às penicilinas logo após o início do uso

sistemático da penicilina G em 1941, registrando-se em 1944 e 1945 índices de

resistência de 12 a 22%. Em 1950, cerca de cinco anos após a disponibilidade da

penicilina G para o tratamento da população, a resistência já atingia cerca de 30%

das amostras hospitalares americanas. Ao final da década de 1950, cerca de 80%

dos Staphylococcus aureus isolados em hospitais americanos mostravam-se

resistentes às penicilinas, devido à produção de penicilinases (β-lactamase) que

inativam estas drogas (34, 63).

Atualmente, em praticamente todas as partes do mundo, os Staphylococcus

spp comunitários, sejam coagulase positiva ou coagulase negativa, mostram

elevada resistência (acima de 60%) a benzilpenicilina (penicilina G) bem como a

penicilina V, ampicilina, amoxicilina e carbenicilina. Para combater os estafilococos

produtores de β-lactamase foram criadas as penicilinas semi-sintéticas como a

oxacilina, meticilina, nafcilina e dicloxacilina, que possuem radicais que as protegem

da ação das β lactamases. Porém já em 1961 surgiram bactérias resistentes a estas

novas penicilinas, na Europa, comprovando a plasticidade do genoma desta

bactéria e a capacidade dos Staphylococcus spp em se adaptar à pressão seletiva

dos antibióticos (34, 63).

O aparecimento de cepas de SCoN resistentes à meticilina ou oxacilina, que

é um análogo mais estável da meticilina, tornou-se um problema clínico grave, nas

últimas décadas. Esta resistência é determinada pela alteração da enzima alvo dos

antibióticos β-lactâmicos. A alteração produz uma nova enzima com baixa afinidade

pelo antibiótico, codificada pelo gene mecA. Os isolados de MR-SCoN, pela

presença do gene mecA, podem representar em torno de 75% das cepas de SCoN

isoladas de pacientes hospitalizados (9, 57). Os Staphylococcus spp resistentes à

meticilina (MRS) são resistentes a todas as penicilinas, penicilinas semi-sintéticas,

penicilinas resistentes a penicilinases, aztreonam, carbapenens e cefalosporinas,

restando poucas opções terapêuticas e levando à emergência de cepas

mutiresistentes (6, 41).

O gene mecA tem origem cromossômica, está localizado em um elemento

genético móvel chamado “staphylococcal cassete chromossome mec” (SCCmec).

Este elemento genético móvel é amplamente distribuído entre os Staphylococcus

aureus e entre as espécies de Staphylococcus coagulase negativa (25). Porém o

fenótipo de resistência à meticilina é determinado, não só pela expressão do gene

mecA, mas também pelos elementos genéticos próximos ao gene mecA no

cromossomo como transposons e seqüências de inserção (40).

O tipo de SCCmec é definido pela combinação do tipo de gene das ccrs,

recombinases responsáveis pela mobilidade do elemento e a classe do complexo

do gene mecA. Foram identificados seis diferentes tipos do elemento SCCmec (25,

28, 33, 54). Quatro tipos de elementos SCCmec (tipo I, II, III e VI) são associados a

infecções nosocomiais. Os tipos de SCCmec IV e V são amplamente disseminados

entre cepas comunitárias (21).

Estudos recentes sobre o SCCmec tipo IV demonstraram que os SCoN são

reservatórios de resistência e que a transmissão ocorreu dos SCoN para os

S.aureus. Quando avaliados em relação à presença do SCCmec, isolados clínicos

de S.epidermidis da década de 70, apresentavam o SCCmec tipo IV enquanto que

os S.aureus desta mesma época ainda não apresentavam este tipo de elemento

móvel. Apenas na década de 80 foi encontrado o isotipo IV em isolados clínicos de

S.aureus (87).

Atualmente a detecção molecular do gene mecA é considerada padrão ouro

para determinar a resistência à meticilina, isso se deve ao fato de que os métodos

fenotípicos podem ser difíceis de interpretar e de que alguns isolados de

estafilococos não expressam o gene mecA sem que exista a pressão seletiva via

tratamento com o antibiótico (5, 23, 41).

REVISÃO DA LITERATURA

Staphylococcus spp coagulase negativa: peculiaridades da bactéria

Os Staphylococcus spp são bactérias Gram positivas de forma cocoide, se

apresentam em pares ou tétrades ou mesmo cadeias curtas, produzem a enzima

catalase e algumas espécies produzem enzimas e toxinas como: coagulase,

hialuronidase, enterotoxinas, toxinas, hemolisinas e leucocidinas. Estes fatores de

virulência são indicativos de potencial capacidade de produzir doenças e alguns são

marcadores de espécie (1). Em 1894 Van de Valde observou que os S. aureus

produziam uma enzima que ele denominou de leucocidina, quase quatro décadas

após Valentine conseguiu esboçar o mecanismo de ação desta toxina (3). Esta

leucocidina hoje denominada Panton-Valentine leucodidin (PVL) é conhecida em

todo mundo devido a sua disseminação em cepas virulentas de estafilococos

comunitárias. Aparentemente a patogenicidade dos estafilococos continuará

despertando interesse da comunidade científica pela sua capacidade toxigênica e

capacidade plástica em desenvolver resistência (77).

Estudos recentes da composição do DNA, hibridização DNA-rRNA, e análise

comparativa de oligonucleotídeos da região 16S do rRNA, revelaram que o gênero

Staphylococcus é estreitamente relacionado com o recente gênero descrito

Macrococcus, contudo, ele também tem uma relação muito forte com os gêneros

Bacillus, Salinicoccus, Gamela, Listeria, Planococcus e Brochothrix. Atualmente

estes gêneros estão sendo agrupados com o Staphylococcus e muitos outros

gêneros da Família Bacillacea (34). A classificação filogenética demonstrada pela

análise da seqüência do 16S ribossomal evidencia uma relação evolucionaria a

partir de um ancestral comum entre os dois gêneros Bacillus e Staphylococcus.

Comparando o genoma do S. aureus com o do Bacillo subtilis foi encontrado 52%

de homologia entre os genes destas bactérias (30).

A parede celular das batérias Gram positivas, como os estafilococos, tem

como principal função a proteção contra lise osmótica. Pela sua natureza confere

forma, rigidez e funciona como uma barreira em relação ao meio externo. O

principal componente da estrutura química da parede celular dos estafilococos é

formado pelo peptideoglicano, um polímero que consiste em longas cadeias de

glicídios com ligações cruzadas flexíveis de peptídeos que forma uma estrutura

forte, mas elástica (66). Desta maneira, o peptideoglicano forma uma rede

covalentemente fechada, como um corpo oco, ao redor da bactéria (22). Esta rede

é formada por um precursor que consiste em um dissacarídeo formado por

alternância de beta-1-4-N-acetilglucosamina e ácido N-acetilmuramico, ligado ao

peptideo L-alanina, D-glutamina, L-lisina e D-alanina que permite a ligação cruzada

com um grupamento de pentaglicinas. Os peptídios são ligados um ao outro por

reações de transpeptidação e os dissacarídeos são polimerizados ao longo da

cadeia de glicano por reações de transglicolização (12).

Esta estrutura é o principal componente do peptideoglicano. O processo da

ligação cruzada é catalizada por enzimas transpeptidases, as proteínas ligadora de

penicilina PBPs (22). Cerca de 50% do total da massa da parede celular consiste de

ácido teicoico, um polímero covalentemente ligado ao ácido murâmico do

peptideoglicano por pontes fosfodiester. Esta estrutura compacta na parede celular

da bactéria evidencia a necessidade de um complexo de hidrolases para dividir e

separar as células durante a fase de crescimento. O distúrbio do controle deste

mecanismo leva a lise celular, esta é a razão pela qual estas hidrolases endógenas

são chamadas de autolisinas (12).

O conceito de que a parede celular das bactérias Gram positivas é uma

estrutura compacta, começa a mudar. A análise detalhada desta estrutura por

microscopia eletrônica nos S. aureus sugere fortemente a existência de um espaço

periplásmico composto principalmente de constituintes solúveis de baixa densidade,

confinado entre a membrana plasmática e a estrutura do peptideoglicano-ácido

teicoico. Este nova descoberta pode vir a elucidar mecanismos até hoje

desconhecidos (43).

Patogenicidade dos Staphylococcus spp coagulase negativa

O S. epidermidis é o principal patógeno oportunista entre os SCoN, é o

microorganismo recuperado com maior freqüência representando entre 50% a 80%

dos isolados clínicos (34). Um estudo recente sobre a evolução da virulência e

resistência com análise completa do genoma sugere que esta bactéria contenha o

cap operon, que codifica a cápsula de poliglutamato, o principal fator de virulência

do Bacillus anthracis. Também foi descrita a. descoberta de uma ilha genômica a

νSeγ que pode estar associada a um potencial fator de virulência. A análise de todo

genoma indica a existência de outras regiões que podem estar associadas à

virulência como SCCmec, seqüências de inserção (IS), transposons e plasmídeos

integrados (13).

Os S. haemolyticus, entre os SCoN, são a segunda espécie mais isolada em

hemoculturas e frequentemente resistentes a um grande número de

antimicrobianos, com predisposição de resistência aos glicopeptídeos (76). As

infecções causadas pelos S. lugdunensis em termos de virulência e destruição

tecidual têm o mesmo curso clínico que infecções causadas por S.aureus, pois

ambas as espécies parecem ter os mesmos determinantes de virulência. Estas

bactérias causam endocardite de válvula natural e outras infecções quase sempre

clinicamente significativas (42, 78, 80). Os S. saprophyticus estão freqüentemente

associados a infecções do trato urinário em pacientes jovens e também em

infecções nososcomiais Outras espécies de SCoN associados a infecções

nosocomiais, porém, menos frequentemente são os S. Schleiferi e S. Warneri e

formam uma variedade de produtos extraceluares (DNAse, lípase, protease, e α-

hemolisina e β-hemolisinas) (34).

Porém, o principal fator de virulência dos SCoN está associado a formação

do biofilme que propicia a adesão às superfícies plásticas (biomateriais) a corpos

estranhos. A aderência é mediada por uma adesina intracelular polissacarídica

(polímero de galactose-arabinose), codificada pelo operon icaADBC cujo nível de

expressão influencia a expressão da resistência a meticilina (38). Os genes do ica

operon foram identificados em 85% dos S. epidermidis e em 6% de S.saprophyticus

isolados em hemoculturas (51).

O desenvolvimento do biofilme ocorre em duas etapas à primeira fase é uma

rápida adesão da bactéria a superfície. A segunda fase de acumulação é mais

prolongada e envolve a proliferação e adesão intercelular formando várias camadas

de bactérias. A autolisina AtlE parece estar associada à adesão primária por

interação hidofóbica com a superfíce abiótica (17). A segunda etapa envolve a

produção das moléculas polissacaridica PIA (polysacaride intercellular adhesin) e a

AAP (accumulation-associated protein). A PIA é codificada pelo ica operon, (ica

ADBC) que parece ser o principal componente da adesão intercelular

O ica operon

é composto pelos genes estruturais icaADBC e pelo icaR que está envolvido na

regulação destes genes. Parece que a co-expressão do gene icaD e icaA

potencializa a atividade de transferase do produto de expressão do gene (51).

O biofilme completamente formado é constituído por várias camadas de

bactéria embebida em um material extracelular amorfo (slime) que consiste da

complexa mistura de vários açúcares, constituintes da parede celular e proteínas

extracelulares e ácido teicóico. Plasma e proteínas do tecido conectivo como

fibronectina, fibrinogênio, vitronectina, laminina, colágeno e o fator Von Willebrand

têm sido descritos por estarem envolvidos nesse processo (84). Essa matriz

extracelular pode atuar protegendo os microorganismos de agentes antimicrobianos

administrados para tratar essas infecções, o que torna necessária a remoção do

corpo estranho para que seja alcançada a cura (34).

A quantidade de biofilme produzida pode estar relacionada com a habilidade

dos SCoN causar infecções. Clones endêmicos de SCoN que foram associados a

doenças e que produzem biofilme podem persistir por longos períodos (dez anos)

em unidades hospitalares como UTIs pediátricas (69).

Outra característica dos SCoN envolvida na patogênese e considerada

importante fator de virulência é a alta taxa de resistência aos agentes

antimicrobianos apresentada por estes microrganismos, principalmente a meticilina

(6, 86).

Importância clínica das infecções por Staphylococcus coagulase negativa

O papel das espécies de SCoN como agentes de infecções nosocomiais tem

sido reconhecido e bem documentado ao longo das duas últimas décadas,

especialmente para a espécie S. epidermidis. O aumento no índice de infecção tem

sido correlacionado com o aumento no uso de materiais implantados e com o

número crescente de pacientes imunocomprometidos nos hospitais (1, 83).

Os tipos de infecções mais graves e com alta morbidade e mortalidade,

associadas aos SCoN são bacteremias relacionadas a cateter e endocardites de

válvula protética e natural. Porém estas bactérias podem causar uma infinidade de

outras infecções, tais como: infecções associadas a dispositivos permanentes

(próteses articulares, implantes de bombas intratecais, derivações para hemodiálise

e cerebrospinais, marca passos, cateteres para diálise peritoneal, bacteremias em

hospedeiros imunocomprometidos, osteomielite, endoftalmite pós-cirurgica)(34).

Os SCoN são os microrganismos mais frequentemente isolados de culturas

de cateteres, estas bactérias foram encontrados em 64% das culturas desse

material em um hospital de Madri (82). Por esta razão, são também a causa mais

comum de infecções relacionadas a cateter, entre elas a infecção da corrente

circulatória (9). Porém, alguns destes isolados podem ser contaminantes, a

contaminação ocorre na hora da coleta da hemocultura com os estafilococos da

microbiota normal da pele. Mesmo considerando o papel relevante da contaminação

os SCoN tornaram-se importantes patógenos nosocomiais (32, 38).

Relaciona-se a contaminação uma hemocultura positiva e duas ou mais

hemoculturas do mesmo paciente a bacteremias verdadeiras. Porém estudos

recentes demonstraram dados contrários a este padrão, encontraram a mesma taxa

de mortalidade em uma hemocultura positiva e em duas ou mais (16,2% e 10,8%

respectivamente P= 0,3). As bacteremias por SCoN têm taxa de mortalidade

significativa mesmo em uma única cultura positiva. Na presença de sinais de sepse

a cultura única deve ser considerada clinicamente relevante (10).

Os Staphylococcus coagulase negativa são a maior causa de septicemias em

recém nascidos pré-termo. Aproximadamente 16,6% de neonatos com baixo peso

(<1500g) desenvolvem um episódio de bacteremia por SCoN. A bacteremia impacta

negativamente na recuperação do neonato e é um evento que está associado a um

aumento significativo da mortalidade e morbidade, bem como um aumento do

tempo de internação e custos (69).

São duas as espécies de SCoN comumente envolvidas em endocardites o

S. epidermidis é a espécie mais freqüente e pode causar endocardite de válvula

nativa porém, causa prevalentemente endocardite de válvula protética (55, 70). Os

S. lugdunensis pelas suas características virulentas podem causar endocardite de

válvula nativa com sérias complicações clínicas (80).

Epidemiologia da resistência dos Staphylococcus coagulase negativa

Um estudo do “Programa de vigilância antimicrobiana SENTRY” para

monitorar a prevalência dos patógenos e os padrões de resistência aos

antimicrobianos realizado nos Estados Unidos, Canadá, América Latina e Europa,

relatam que os SCoN são a terceira causa em infecções sistêmicas nosocomiais e

comunitárias e que são a segunda causa de infecções nosocomiais (9, 56, 57).

A distribuição das bacteremias mudou durante as últimas décadas. Um

estudo realizado por Wisplinghoff e colaboradores (2004) mostrou a análise de

24.179 casos de infecções nosocomiais da corrente circulatória nos Estados

Unidos, onde o isolado mais comum foi SCoN (31%) (86).

A resistência à meticilina nos Staphylococcus spp é um fenômeno mundial

com marcadas variações geográficas, e com prevalências crescentes apesar dos

esforços para conter o aumento da disseminação de cepas resistentes. Em algumas

áreas da Europa a prevalência da resistência a meticilina já era descrita em 2002

como 60 a 70% para os SCoN (72).

Na Noruega apenas 2% dos S. aureus são resistentes à meticilina, porém os

MR-SCoN são prevalentes. Nos isolados de hemoculturas 80% dos SCoN são

resistentes a meticilina e esta prevalência é similar à relatada na Escandinávia (16).

Na Espanha, um estudo feito para avaliação da resistência à meticilina para

os SCoN relatou um aumento de 32,5% em 1986 para 61,3% em 2002 (7). Neste

mesmo país, em 2006, um estudo denominado “Vigilancia de resistencias a los

antimicrobianos: VIRA” relata uma prevalência de resistência à meticilina de 70,6%

(58).

A prevalência da resistência à meticilina em hemoculturas, segundo o

programa de vigilância SENTRY, encontrou uma taxa de resistência para os SCoN

de 74% nos Estados Unidos, 73% no Canadá, 77% na América Latina, 73% na

Europa e 77% no Japão (9). Sader e colaboradores em um estudo feito na Europa

entre 2002 e 2004 para o Programa de Vigilância a Daptomicina também avaliaram

resistência a meticilina em 1.942 SCoN. Encontraram taxas de resistência para

meticilina bastante variadas. A maior resistência foi encontrada em Israel (94,7%) e

a menor na Suécia (63%). Taxas intermediárias foram encontradas na França

(77%), Espanha (76%) e Alemanha (69%) (65).

Segundo levantamento do SENTRY feito em hospitais brasileiros e da

América Latina entre 1997 e 2001 a resistência para à meticilina dos SCoN em

hemoculturas é de 80,8% e 76,2% respectivamente (64).

Mecanismos de Resistência dos Staphylococcus spp coagulase negativa aos

antibióticos β

ββ

β-lactâmicos

Os antibióticos β lactâmicos produzem um efeito bactericida pela inibição das

enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do

peptideoglicano, principal componente da parede celular das bactérias Gram

positivas (12).

Esta inibição é o resultado de uma ligação covalente formando um complexo

estável do antibiótico com uma ou mais destas enzimas denominadas PBPs (36).

Quando o peptídeoglicano não pode ser formado, ocorre um distúrbio do

mecanismo de controle das hidrolases (autolisinas), a bactéria entra em ciclo lítico e

este processo pode levar a morte celular (12). Passados mais de 60 anos após o

início da utilização sistemática da penicilina, seu mecanismo de ação ainda não foi

esclarecido completamente. Porém, muito cedo se descobriu que altas

concentrações de penicilina inibem o sistema autolítico da bactéria, causando um

efeito apenas bacteriostático havendo perda do efeito bacteriolítico (12).

A resistência apresentada pelos estafilococos aos antibióticos β-lactâmicos

deve-se principalmente a dois mecanismos distintos, porém não dissociados, pois

ambos podem interagir. O primeiro mecanismo desenvolvido pela bactéria foi à

produção da enzima β-lactamase que hidrolisa o antibiótico. O segundo mecanismo

está associado à alteração do sítio de ação do antibiótico β-lactâmico pela produção

de uma proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a (também denominada

PBP 2’), que está ausente nos Staphylococcus spp sensíveis a meticilina (15).

O primeiro mecanismo se deve as β-lactamases produzidas pelos

Staphylococcus spp que são enzimas extracelulares, codificadas por plasmídeos, e

baseado em testes sorológicos e cinéticos, podem ser divididas em quatro tipos (A a

D). Diferentemente das enzimas β-lactamases produzidas pelas bactérias Gram

negativas, que são genericamente expressas de maneira constitutiva, as β-

lactamases dos estafilococos, com exceção do tipo D, são expressas em altos

níveis somente na presença dos indutores, como a penicilina ou seus análogos (11,

36). A regulação da expressão do gene blaZ das β-lactamases está sob controle de

dois genes regulatórios adjacentes, o indutor blaRI e o gene repressor blaI. A

inibição ocorre quando o produto do gene blaI, supostamente um tetrâmero, se liga

ao operador do gene estrutural blaZ bloqueando a transcrição do gene. Por outro

lado à transcrição ocorre quando o produto da clivagem do BlaR1 que funciona

como uma protease cliva a proteina BlaI permitindo a transcrição do gene (89).

Algumas cepas de estafilococos produzem grandes quantidades de β-

lactamase (hiperprodutoras) que rapidamente hidrolisam a penicilina este excesso

de enzima pode ainda hidrolisar parcialmente as penicilinas resistentes as

penicilinases (44).

O segundo mecanismo é mediado pela produção da PBP 2a que é uma

enzima carboxipeptidase extra, cuja função é ligar resíduos de D-alanina do amino

ácido terminal da cadeia lateral do ácido N-acetil murâmico do peptideoglicano. Esta

nova proteína tem baixa afinidade pelos antibióticos β-lactâmico e é codificada pelo

gene mecA (12), porém a resistência à penicilina não depende só da expressão

desta nova enzima. O mecanismo é mais complexo e depende também da

expressão de altas concentrações de PBP2 sensível. Quando a meticilina inativa a

PBP2, a PBP2a sozinha não pode sintetizar peptideoglicano funcional. Parece que

o segundo domínio enzimático, sítio da transglicolisação da PBP2, nativa e

bifuncional, é necessário para cooperar com a atividade de transpeptidase da

PBP2a. O domínio da transglicolização da PBP2 permanece funcional e ativo

enquanto o domínio da transpeptidase é inativado pela meticilina (22, 59, 60, 66)

Outros mecanismos de resistência dos estafilococos aos β-lactâmicos já

foram descritos, porém com menor importância clínica. São alguns fatores

cromossômicos, cuja atividade afeta o nível da resistência, muitos destes genes

estão envolvidos na biosíntese da parede celular (12,14). Como por exemplo, a

hiperprodução da PBP4, esta enzima de baixo peso molecular, está envolvida em

uma ligação cruzada secundária da cadeia de peptideoglicano. A PBP4 possui

atividades de transpeptidase e DD-amino carboxipeptidase. A hiperprodução de

PBP4 e ou PBP2, bem como mudanças na afinidade pelos antibióticos beta

lactâmicos, aumenta a resistência intrínseca em cepas suscetíveis (19, 67).

Alguns genes independentes do lócus mec contribuem para expressão da

resistência aos β-lactamicos. Estes genes designados fem (fatores essenciais para

expressão da resistência) estão presentes no cromossomo de MRSA

(Staphylococcus aureus meticilina resistente) e MRS (Staphylococcus spp meticilina

resistente) (18).

Dois destes genes femA e femB, não tem envolvimento na síntese da PBP2a,

mas estão envolvidos na formação da ligação cruzada dos precursores da cadeia

do peptídeoglicano-pentaglicina. A disfunção do femA ou femB diminui o conteúdo

de glicina nos precursores do peptídeoglicano e confere susceptibilidade à

meticilina. A presença do femA é também necessária para o aumento da atividade

autolítica observada nas cepas contendo mecA (2, 18).

Regulação da expressão gênica do gene mecA e interferência do operon bla

das β

ββ

β-lactamases

A expressão gênica do gene mecA pode ter basicamente dois fenótipos de

resistência, associados a diferenças na regulação, resultando em fenótipo induzível

ou constitutivo. A PBP2a é induzível pela presença dos antibióticos beta lactâmicos,

mas esta proteína também pode ser produzida constitutivamente (15).

O fenótipo induzível está associado à presença do plasmídio contendo o

operon bla da β lactamase regulado pelos genes codificados pela penicilinase

plasmidial. O fenótipo constitutivo ocorre quando há eliminação ou perda do

plasmídeo ou da β-lactamase plasmidial convertendo a cepa de um fenótipo

induzível para constitutivo (15).

Os estafilococos com fenótipo induzível contém um locus regulatório com os

genes mecI e mecRI, que são homólogos aos genes reguladores blaI e blaRI,

respectivamente e que regulam a produção de β-lactamases. Estudos têm

demonstrado a capacidade do complexo blaR1-blaI em regular a expressão do gene

mecA. Os genes reguladores bla ou mec podem ambos controlar a produção da

PBP 2a e da β-lactamase devido ao alto grau de homologia dos dois sistemas (6,

35, 85).

Isolados que possuem uma disfunção na região regulatória, dos genes mecI

e mecRI, podem expressar mecA constitutivamente. Mas, também podem usar os

genes reguladores da β-lactamase para melhor expressar mecA, principalmente

porque BlaR1 é um forte indutor do mecA e BlaI é um fraco repressor. Entretanto a

regulação em isolados clínicos é feita principalmente pelos genes bla porque

ocorrem deleções ou mutações no gene mecI que exerce atividade repressora.

Estas cepas são clinicamente importantes porque elas são desreprimidas

lentamente tornando a detecção da resistência difícil. São necessárias 48 horas

para expressão total da resistência (1, 29, 89).

Resistência mediada pelo gene mecA e os cassetes SCCmec

O estudo da resistência a meticilina mediada pelo gene mecA não pode mais

estar dissociado da análise dos tipos de elemento cromossômico móvel que contém

este gene que é denominado Staphyloccocal chromossome cassete mec

(SCCmec). Este complexo gênico foi descoberto e elucidado recentemente.

Atualmente são conhecidos seis tipos de SCCmec, os quais podem apresentar

alguns subtipos (28, 33, 54). Os SCCmec têm importância fundamental na

transmissão da resistência e na epidemiologia da bactéria. Inicialmente este cassete

cromossômico era denominado como uma ilha de resistência, porém não se pode

limitar a função deste elemento cromossômico à transferência da resistência aos β-

lactâmicos. Parece que o SCCmec serve como veículo para trocas úteis a uma

melhor sobrevivência dos estafilococos em vários ambientes, além de conter

também genes de resistência a outros antibióticos e outros genes e pseudogenes

que codificam enzimas com diversas funções (20, 25).

Estudos de Ito e colaboradores descreveram todo elemento o SCCmec,

ainda conhecido como DNA mec, em uma cepa de MSSA a N315, nomeada como

pré-MRSA. Esta cepa, apesar de apresentar o gene mecA, era sensível à meticilina.

A explicação deste fato é que a expressão do gene mecA estava fortemente

reprimida na cepa N315 pelo produto de um gene regulador denominado mecI (24,

26).

Com a evolução das técnicas de clonagem e sequenciamento toda região do

cromossomo em torno do gene mecA, em poucos anos, foi analisada, descrita e

classificada. Foram encontradas duas regiões essenciais e comuns a todos os

estafilococos resistentes à meticilina. Estas regiões foram denominadas como

complexo do gene mec e complexo do gene ccr. As seqüências entre os complexos

ou depois deles foram classificadas como regiões “junkyard” (sobras) ou região J

(29, 30).

Descrição do complexo do gene mec

Quatro classes principais do complexo do gene mec foram identificadas com

o uso de primers específicos através da técnica de PCR utilizando o DNA

cromossômico, de cepas de várias espécies de estafilococos meticilina resistente,

como alvo (29). O complexo mec contem os genes reguladores da expressão do

gene mecA, que são o mecI e mecRI. Estes genes reguladores também estão

situados no elemento SCCmec do cromossomo bacteriano, logo após o promotor do

gene mecA. Estes genes podem estar íntegros ou truncados (∆mecRI) esta

característica pode estar associada a alterações estruturais do complexo mec que

ocorreram pelo movimento ou inclusão de seqüências de inserção (IS) (29).

O gene mecR1 codifica um indutor transmembrana do mecA constituído dos

domínios atravessador de membrana (MS) e ligador de penicilina (PB) (85. Estudos

na região mecR1 e mecI têm mostrado que há uma considerável diversidade

genômica no complexo mec (Figura 1). O complexo classe A possui os genes

mecR1 e mecI intactos: classe A- IS431-mecI-mecR1- mecA -IS431. No complexo

classe B o domínio PB do mecR1 e o gene completo mecI estão truncados por uma

cópia parcial de IS1272: classe B – IS1272-∆mecR1-mecA-IS431. O complexo

classe C tem duas variantes, C1 e C2. No complexo classe C1, o domínio PB do

mecR1 e o mecI inteiro estão truncados pelo IS431, e no complexo classe C2,

ambos os domínios MS e PB do mecR1 bem como o mecI estão truncados por

IS431: classe C-IS431 -∆mecR1- mecA IS431. No complexo classe D, mecI está

deletado e o domínio PB do mecR1 está truncado: classe D-∆mecR1- mecA -IS431

(28, 35).

Dickisnson e Archer demonstraram que em algumas cepas de S. epidermidis,

com a seqüência intacta do gene mecI, apresentavam baixos níveis de resistência à

meticilina. Seus experimentos também sugerem que a inativação por deleção (ou

mutação in vivo) do gene mecI pode tornar a cepa capaz de expressar altos níveis

de resistência à meticilina, indicando claramente o papel do gene mecI na repressão

da resistência (8, 73). Além disso, o complexo do gene mec contem a seqüência de

inserção IS431 descrita como um sítio para depósito de múltiplos genes de

resistência (25, 29).

Caracterizou-se que os S. haemolyticus tem uma cópia da estrutura IS431,

chamada IS431L, localizada acima do complexo mec (Figura 1, segundo exemplo).

A estrutura total IS431-mecA-IS431 lembra a estrutura de um transposon, mas não

há evidências para sustentar esta hipótese. Entre os SCoN esta estrutura é

reconhecida preferencialmente em isolados S. haemolyticus, porém não é exclusiva

desta espécie, pois já foi identificada em Staphylococcus sciuri (29).

O gene mecA apresenta altos níveis de homologia entre as espécies de

MRSA (Staphylococcus aureus meticilina resistente) e de MR-SCoN. Sua origem

ainda é obscura. Um gene mecA homólogo com 88% de similaridade entre os 37

aminoácidos com o gene mecA dos estafilococos meticilina resistentes foi

identificado no Staphylococcus sciuri. Um fato interessante é que este gene

homólogo é ubíquo nesta espécie, mas seu genótipo é sensível. Este e outros

dados sustentam a hipótese de que o gene mecA é originário de espécies de SCoN,

possivelmente uma espécie evolucionariamente próxima do S. sciuri (6).

FIGURA 1. Organização genética do complexo mec em estafilococos e suas

diferentes classes. FONTE: KATAYAMA, Y; ITO, T e HIRAMATSU, K. Genetic

organization of the chromosome region surrounding mecA in clinical staphylococcal

strains: role of IS 431-mediated mecI deletion in expression of resistance in mecA-

carrying, low level methicillin resistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrobial

Agents Chemotherapy, v 45, 1955-1963, 2001

Descrição do complexo dos genes ccr

A outra região gênica que é comum a todos os SCCmec é o complexo do

gene ccr que codifica as enzimas recombinases (crrA e ccrB ou ccrC). A função

destas enzimas é garantir a mobilidade dos SCCmec excisando precisamente o

elemento do cromossomo e integrando em um sitio específico de um cromossomo

receptor. O SCCmec é integrado no genoma no sítio attB

SCC

localizado na ofrX,

uma seqüência aberta de leitura (OFR) com função desconhecida (16, 25, 27, 31).

O complexo do gene ccr é composto por quatro tipos de gene de cada

enzima recombinase. A enzima ccrA do complexo apresenta os alótipos: ccrA1,

ccrA2, ccrA3 e ccrA4; e a enzima ccrB os alotipos ccrB1, ccrB2, ccrB3 e ccrB4. Os

tipos de SCCmec são classificados de acordo com a combinação entre o complexo

do gene mecA e o complexo do gene ccr. Os principais tipos de SCCmec

apresentam as seguintes combinações:

SCCmec tipo I, complexo do gene mec classe B e complexo do gene ccr 1

(ccrAB1);

SCCmec tipo II, complexo do gene mec classe A e complexo do gene ccr 2

(ccrAB2), (Figura 2);

SCCmec tipo III, complexo do gene mec classe A e complexo do gene ccr 3

(ccrAB3),

SCCmec tipo IV, complexo do gene mec classe B e complexo do gene ccr 2

(ccrAB2),

SCCmec tipo V, complexo do gene mec classe C e complexo do gene ccrC

SCCmec tipo VI, complexo do gene mec classe B e complexo do gene ccr 4

(ccrAB4), (25, 27, 30, 33, 37, 54).

Finalmente cada SCCmec é classificado em subtipos baseado na

constituição da seqüência das regiões J que não pertence ao complexo do gene

mec nem ao complexo do gene ccr (25, 27, 30, 37).

Experimentos demonstraram que os genes das recombinases codificados no

elemento SCCmec, ccrA e ccrB são suficientes para transferir o elemento de um

plasmídeo para o cromossomo em um sitio específico e com orientação específica

(30). No entanto o mecanismo preciso da transferência do SCCmec na natureza

ainda é desconhecido (63).

FIGURA 2 Exemplo esquemático do elemento genético SCCmec tipo II com estruturas

do complexo ccr (rosa) e do complexo mec (branco) Fonte Adaptado de Hisata K,

Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, Ito T, Nakatomi Y, Cui L, Baba T, Terasawa M, Sotozono

C, Kinoshita S, Yamashiro Y, Hiramatsu K. Dissemination of methicillin-resistant

staphylococci among healthy Japanese children. J Clin Microbiol. 2005 Jul; 43(7): 3364-

72.

SCCmec tipo II

Complexo ccrAB2 Complexo mec

Estrutura dos principais tipos de SCCmec

Até o momento seis principais tipos de SCCmec foram descritos. Os

elementos SCCmec tipos I, II, III e VI estão mais associados a infecções causadas

por estafilococos de origem nosocomiais, enquanto que os tipo IV e V são

encontrados com maior freqüência em estafilococos de infecções comunitárias (21,

33).

Estudos de Ito e colaboradores elucidaram a estrutura completa dos três

maiores tipos de SCCmec. O tipo I (34Kb) foi identificado na primeira cepa de

MRSA isolado em 1961 no Reino Unido (cepa NCTC104442). O tipo II (52Kb) foi

identificado em uma cepa PRE-MRSA isolada no Japão em 1982 (cepa N315), e o

tipo III (66Kb) foi identificados em uma cepa MRSA isolada em 1985 na Nova

Zelândia (25, 26). Mais recentemente foi identificado um quarto elemento SCCmec

tipo IV, (20 a 24Kb) isolado do Clone Pediátrico de um MRSA adquirido da

comunidade. O SCCmec tipo V (28 Kb) foi isolado na Austrália da cepa WIS

[WBG8318] de um MRSA comunitário (27). Em todos os tipos de SCCmec

estudados, a seqüência do gene mecA é altamente conservada, sejam cepas de S.

aureus ou de Staphylococcus spp coagulase negativa (37, 85). O SCCmec tipo VI,

isolado de uma cepa MRSA do Clone pediátrico, a cepa HDE288. Contém o

complexo ccrAB4 e o complexo mec classe B. Esta cepa é dominante nos hospitais

de Portugal, porém ainda é pouco descrita (33, 54).

A observação de que o elemento menor, SCCmec tipo IV, pode ser adquirido

mais freqüentemente pode ser explicado porque a eficiência da transferência é

maior quanto menor o DNA. Hiramatsu e colaboradores (2001) sugerem que o

SCCmec tipo IV tem um baixo custo metabólico para transferência, pois carrega

apenas as recombinases e os genes que regulam a expressão do mecA. A

combinação entre o pequeno tamanho do DNA e o baixo custo metabólico torna o

SCCmec tipo IV um elemento seletivamente favorecido para transferência entre os

Staphylococcus spp (25). Esta observação sugere que a prevalência de doenças

causadas por clones que contém o SCCmec tipo IV tende a aumentar. Se

considerarmos que o Sccmec tipo V apresenta as mesmas vantagens seletivas do

SCCmec tipo IV, podemos inferir que a sua presença nas infecções comunitárias

também se tornem cada vez mais freqüentes. Em contraste os SCCmec tipos II e III

podem carregar genes adicionais como os que codificam a resistência aos

antibióticos não β lactâmicos e metais pesados (52, 63).

Tabela 1. Descrição dos tipos I a VI de SCCmec

SCCmec

Cepa

Origem ou Descrição Tamanho

Complexo

ccr

Complexo

mec

Tipo I MRSA NCTC 104442

Reino Unido, 1961 34 kb ccrAB1 Classe B

Tipo II Pré-MRSA N315

Japão, 1982 52 kb ccrAB2 Classe A

Tipo III MRSA 85/2082

Nova Zelândia, 1985 66 kb ccrAB3 Classe A

Tipo IV MRSA CA05

Estados Unidos, 2001 20-24 kb ccrAB2 Classe B

Tipo V WIS [WBG8318]f Austrália, 2002 28 kb ccrC Classe C

Tipo VI HDE288

Portugal, 1992

∼25 Kb

ccrAB4 Classe B

Cepas de referência de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank AB033763 National collection of type cultures

(NTTC)

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank D86934

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank AB037671

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank AB063172

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank AB121219 C-MRSA (Staphylococcus

aureus meticilina resisitente comunitário meticilina resisitente comunitário

Número de acesso DDBJ/EMBL/Gene Bank AF11935

A resistência codificada nos SCCmec e descrição atual

O SCCmec tipo I não contém outra resistência a antimicrobianos além dos β-

lactâmicos. Porém uma ORF (open reading frame) codifica uma proteína de

superfície plasmina-sensível que pode ser danosa às células hospedeiras porque

interfere na propriedade de ligação da fibronectina e do fibrinogênio (81).

Os dois maiores elementos SCCmec, tipo II e tipo III têm a estrutura mais

variável, isto pode ser explicado pelo fato de que estes elementos contêm mais

cópias das seqüências de repetição IS431 e do transpossomo Tn544. A atividade

destes dois elementos pode ter um papel importante na remodelação da estrutura

do SCCmec e levar a um maior número de variantes estruturais. Isolados recentes

de MRSA são resistentes a muitos antibióticos além dos β-lactâmicos (25, 29).

O SCCmec tipo II o segundo maior elemento gênico tem codificado a

esquerda do complexo mec uma cópia do transpossomo Tn554 onde está inserido o

gene spc que codifica a resistência a espectinomicina, e o gene ermA, que codifica

a resistência a macrolideos, lincosaminas e streptogramíneas (MLS). À direita do

complexo mec está integrada uma cópia do plasmídeo pBU110 com os genes para

resistência a kanamicina e tobramicina (aadD) e para bleomicina (ble) um

anticarcinogênico. Shore e colaboradores (2005) identificaram seis variantes do

SCCmec tipo II (26, 68) (Tabela 2).

Entre os elementos gênicos o maior, mais complexo e que codifica o maior

número de genes de resistência e, portanto o mais virulento é o SCmec tipo III. O

SCCmec III contém um plasmídeo pequeno, à direita do gene mecA, o pT181, e

neste plasmídeo o gene tetK que codifica a proteína que promove o efluxo da

tetraciclina. Ao lado deste plasmídeo, outro denominado pT258 que é pouco

descrito (53). Foi também identificado à esquerda do gene mecA, o transposon

Tn554, neste transposon ainda encontram-se os genes para resistência aos MLS e

o gene spc. À direita do gene mecA encontra-se o ψ Tn554 (é um pseudo

transpossomo, pois não possui as transposases tnpA e tnpB) que codifica a

resistência ao cádmio através do gene cadC. Além destes genes, o operon do

mercúrio também está presente conferindo resistência à bactéria para este metal

pesado (28) (Tabela 3). O SCCmec tipo III é subdividido em tipo IIIa e IIIb, o

primeiro difere do tipo SCCmec III pela ausência do pT181 e seus elementos IS431.

O SCCmec tipo IIIb não apresenta integradas cópias de Tn554, pT181 e do operon

mer com suas seqüências de inserção associadas (28, 53).

O SCCmec tipo IV tem uma nova combinação do complexo mec e do

complexo ccr 2, muito menor que os SCCmec descritos anteriormente. Ambos

SCCmec I e IV têm o complexo mec com a seqüência de inserção IS1272 inserida

no mesmo ponto de junção, isto sugere que a recombinação ocorreu entre o

SCCmec I e outras seqüências para gerar o SCCmec tipo IV, porém o complexo ccr

tem maior identidade com o complexo ccr 2 característico do SCCmec tipo II (37).

O SCCmec tipo V, não codifica outra resistência além do gene mecA, porém

já foram descritos MRSA multiresisitentes com este tipo de elemento genético (50).

O SCCmec tipo V codifica um gene de uma nova recombinase, responsável por sua

mobilidade, a ccrC, mas com uma única cópia do gene, diferente dos outros tipos de

SCCmec que têm duas recombinases. Entretanto, neste elemento novo, está

codificado um sistema de restrição modificado que pode ter importância na

estabilização do elemento no cromossomo (27). O tipo VI recentemente descrito é

um lemento menor, porém identificado em cepas nosocomiais. Sua estrutura se

resume ao complexo ccrAB2 e ao complexo mec tipo B. A única resistência

codificada neste tipo de SCCmec é aos antibióticos β-lactâmicos (54) (Figura 2).

Boyle-Vavra e colaboradores (2005) descreveram um novo subtipo de

SCCmec tipo V designado como SCCmec V

contendo uma nova variante de ccrC

(ccrC2), os mesmos autores também detectaram um novo SCCmec que contém

todas as características do SCCmec IV e também a ccrC (4).

As cepas comunitárias têm vantagens seletivas como ter uma taxa de

crescimento mais alta que as cepas nosocomiais e são mais aptas a colonizar

humanos do que aquelas com fenótipo de multiresistência (37).

Os Staphylococcus spp comunitários, principalmente os S. aureus

comunitários meticilina resistentes (C-MRSA) tornaram-se, nos últimos anos, de

grande importância nos EUA, Austrália, países da Europa e América Latina (21, 50,

56, 62, 88). Algumas cepas podem conter o gene de virulência Panton-Valentine

leucocidin (PVL) que pode causar pneumonia necrotizante, sepse severa entre

outras infecções graves (4, 77).

Notadamente o diagnóstico rápido das infecções nosocomiais e comunitárias

causadas por estas bactérias é importante pela gravidade das doenças que

desenvolvem o que se torna difícil, pela grande plasticidade do genoma dos

Staphylococcus spp comprovada pela grande diversidade de SCCmec detectada

em isolados clínicos.

Tabela 2. Elementos genéticos associados à resistência do SCCmec tipo II.

Elementos genéticos

Genes de Resistência Função

Tn554

ermA

Resistência MLS

spc

Resistência a espectinomicina

pUB110

aadD

ble

Resistência tobra. e kanamicina

Resistência a bleomicina

complexo mec mecA

Resistência aos β lactamicos

Resistência a macrolídeos, licosaminas e estreptogramineas

Tabela 3. Elementos genéticos associados à resistência do SCCmec tipo III.

Elementos genéticos

Genes de Resistência Função

Tn554

ermA

Resistência MLS

spc

Resistência a espectinomicina

mer operon mer

Resistência ao mercúrio

pT181

tetK

Efluxo da tetraciclina

complexo mec mecA

Resistência aos β lactâmicos

ψTN554

cad

Resistência ao cádmio

Resistência a macrolídeos, licosaminas e estreptogramineas

Métodos de detecção da Resistência à Meticilina

Nos Staphylococcus spp coagulase negativa resistentes à meticilina a

expressão da proteína PBP2’, muitas vezes, é heterogênea, devido a complexidade

dos mecanismos de expressão, dificultando sua detecção por métodos fenotípicos.

A detecção genotípica do gene mecA por PCR é considerada o padrão ouro. Nos

casos de infecções severas, é clinicamente útil detectar rapidamente a

suscetibilidade e identificação da bactéria (5, 23, 39, 41). Poucos laboratórios,

entretanto, têm a técnica e a capacidade econômica para aplicar testes de PCR em

todos isolados de estafilococos, então, o teste de disco difusão permanece sendo o

método de escolha para detectar a resistência à meticilina (49). O ideal, para

detecção rápida e acurada da sensibilidade ou resistência é que se combinem os

métodos fenotípicos e genotípico (71).

Na população heteroresistente, tipicamente 99,9% das bactérias são

suscetíveis a baixas concentrações de antibióticos β-lactâmicos (1 a 5 µg/mL de

meticilina), e uma pequena proporção de células cresce em altas concentrações de

meticilina (≥50 µg/mL). O nível de expressão da resistência varia de acordo com as

condições da cultura e com o tempo de utilização dos antibióticos β-lactâmicos. A

maioria dos isolados clínicos exibe melhor este padrão de heteroresistência sob

condições de cultura hipertônica (suplementada com NaCl) e incubada a 35ºC por

24 horas (5, 6).

Com a intenção de aumentar a sensibilidade do teste de detecção dos

isolados de Staphylococcus spp coagulase negativa resistentes à meticilina, o

CLSI/NCCLS recomendou a redução do breakpoint de oxacilina para a

Concentração Inibitória Mínima (MIC) de ≥4 para ≥0,5 µg/mL (46).

Quando Monsen e Tenover testaram o novo ponto de corte para oxacilina

preconizado pelo CLSI/NCCLS os resultados indicaram que para triagem da

resistência o novo breakpoint é melhor quando correlacionado com o padrão ouro

de detecção do gene mecA, a PCR. Mas segundo Tenover os resultados da MIC e

do teste de disco difusão embora consistentes entre si, ainda falham em detectar

SCoN sensíveis a meticilina com exceção S. epidermidis, que não possuem o gene

mecA (45, 79).

O teste de aglutinação em látex para detecção da proteína PBP 2a, produto

da expressão do gene mecA, foi recomendado para caracterização de isolados de

SCoN resistentes a meticilina outros que não S. epidermidis envolvidos em

infecções de sítios estéreis no documento do CLSI/NCCLS em 2002. Essa foi a

alternativa apresentada para os laboratórios que não possuem a técnica de PCR

para detecção do gene mecA (47).

O teste de aglutinação em látex também pode ser utilizado como método

diagnóstico, porém modificações na técnica são necessárias para se obter

resultados mais consistentes. Foi testada e confirmada a necessidade da indução

da expressão do gene mecA, expondo a bactéria a um disco de oxacilina de 1 µg na

semeadura primária. Também foi alterado o inóculo, utilizando-se quantidade maior

de bactérias que as especificações do teste. Para melhorar a sensibilidade do teste

de 68% para 95,7% foi aumentando o tempo do teste de 3 minutos para 10 minutos

Estas modificações podem induzir resultados falsos positivos e devem ser utilizadas

com cautela (75).

Para melhorar a sensibilidade do teste de disco difusão o CLSI/NCCLS a

partir de janeiro de 2004 recomendou o uso do disco de cefoxitina para detectar a

resistência à meticilina. O teste de disco difusão é feito nas condições usuais da

determinação do antibiograma. Segundo o CLSI/NCCLS, prediz melhor a presença

do gene mecA do que o teste com o disco de oxacilina realizado anteriormente. A

cefoxitina é um indutor mais eficiente do mecR1 do que a oxacilina ou meticilina (2,

48). O teste com a cefoxitina parece ter melhor sensibilidade em relação à presença

ou não do gene mecA, para todos os Staphylococcus spp e com uma vantagem

para os S. aureus (61, 74,79). A precisão e a rapidez na detecção da resistência à

meticilina em estafilococos é importante para o controle endêmico dos MRSA e MR-

SCoN conseqüentemente implicando no sucesso do controle de infecção hospitalar

(71).

OBJETIVOS

Objetivos gerais

Determinar a prevalência da resistência à meticilina nos Staphylococcus spp

coagulase negativa, mediada pelo gene mecA, em isolados de hemocultura de

pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

Comparar a eficiência (sensibilidade e especificidade) dos métodos de disco

difusão de oxacilina com o disco difusão de cefoxitina, para diagnóstico da

resistência à meticilina em Staphylococcus spp coagulase negativa, utilizando a

detecção do gene mecA como padrão ouro (PCR).

Objetivos específicos

Identificar na população dos SCoN que apresentam o gene mecA os tipos de

SCCmec (tipos I, II, III e IV).

Identificar as espécies dos SCoN e relacionar a distribuição do gene mecA

para estabelecer correlação entre espécie e resistência a meticilina.

Comparar os testes de suscetibilidade aos antibióticos não β-lactâmicos dos

SCoN com gene mecA (resistentes à meticilina) com os testes dos SCoN sem o

gene mecA (sensíveis à meticilina).

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Alice Beatriz Mombach Pinheiro Machado* ,

Keli Cristine Reiter, Rodrigo Minuto

Paiva, Afonso Luis Barth

Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular, Hospital de Clínicas de Porto Alegre,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil.

Running Title: Resistance to methicillin in SCoN

* Corresponding author. Mailing address:

Hospital de Clinicas de Porto Alegre

Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular

Rua Ramiro Barcelos 2350

Porto Alegre – RS

Brasil -90.035.-903

Phone/FAX: +55 5121018860

E-mail: abma[email protected]rgs.br

ABSTRACT

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are a common cause of nosocomial

infections and they have the tendency to develop resistance to methicillin (MR-

SCoN) and to multiple antibiotics. Moreover the resistance to methicillin may not be

easily detected by conventional susceptibility methods. The MR-CoNS are

considered resistant to all β-lactamics antibiotics. This prospective study was aimed

to determine the prevalence of mecA gene and the efficiency of the cefoxitin and

oxacillin disk diffusion test to characterize the methicillin resistance mediated by the

gene mecA in CoNS. The mecA gene distribution among the species of CoNS

isolates and the antimicrobial resistance profile were also characterized. A total of

181 CoNS from bloodstream culture were analyzed and the global prevalence of

mecA gene was 71.3%. The sensitivity of oxacillin and cefoxitin disks for all CoNS

species was 100% and 98.4% respectively, whereas the specificity was 93% and

89.3 %. It was not possible to detect mecA gene in four (2.2%) isolates which were

resistant to both cefoxitin and oxacillin. These isolates regained methicillin sensitive

in the presence of clavulanic acid. Among the CoNS the commonest species was

the S. epidermidis which 64% of the isolates followed by S. hominis 10%, S.

haemolyticus 8.8% and S. capitis 7.7%. The percentage of mecA-positive isolates

was highest for S. haemolyticus (93.8%), followed by S. epidermidis (75%) and S.

hominis (72.2%). The MR-CoNS showed higher level of resistance to all non beta-

lactamics antimicrobials as compared to methicillin sensitive CoNS and the

difference were statistically significant except in regard to doxycycline.

Keywords: Coagulase negative staphylococci, methicillin resistant, PCR,

antimicrobial profile

Há discrepâncias entre a detecção do gene mecA nos Staphylococcus spp

coagulase negativa por PCR e por disco difusão com cefoxitina? Qual o

envolvimento da hiperprodução de of β

ββ

β-lactamase na resistência à meticilina?

RESUMO

Os estafilococos coagulase-negativa (SCoN) são causa comum de bacteremias

nosocomiais e tem a tendência de desenvolver resistência a meticilina (MR-SCoN) e

a múltiplos antibióticos. Os MR-SCoN são considerados resistentes a todos

antibióticos β-lactâmicos. Entretanto nem sempre é fácil detectar a resistência a

meticilina pelos métodos convencionais de suscetibilidade. Este estudo prospectivo

foi realizado para determinar a prevalência do gene mecA e a eficiência dos discos

de cefoxitina e oxacilina para caracterizar a resistência a meticilina mediada pelo

gene mecA em SCoN. Além disso, também foi caracterizada a distribuição do gene

mecA entre as espécies de SCoN e o perfil de resistência aos antimicrobianos. Um

total de 181 SCoN de hemoculturas foram analisadas. A prevalência do gene mecA

entre estes isolados foi de 71,3%. A sensibilidade do teste de dico difusão (DD) de

cefoxitina e oxacilina para todas espécies de SCoN foi de 100% e 98,4%,

respectivamente, enquanto a especificidade foi de 93% e 89,3%. Não foi possível

detectar o gene mecA em quatro (2,2%) isolados resistentes a ambos os discos de

cefoxitina e oxacilina. Estes isolados tiveram redução da resistência em presença

do ácido clavulanico. As espécies prevalentes de SCoN foram o S. epidermidis com

64% dos isolados, seguido pelo S. hominis com 10%, S. haemolyticus com 8,8%, S.

capitis com 7,7%. A percentagem de isolados positivos para o gene mecA foi maior

para S. haemolyticus (98,3%), seguido pelo S. epidermidis (75%) e S. hominis

(72,2%). Os MR-SCoN apresentaram um nível de resistência maior a todos os

antibióticos não β-lactamicos quando comparados com os SCoN sensíveis a

meticilina e a diferença foi estatisticamente significativa, exceto para doxiciclina.

Keywords: Estafilococos coagulase negativa, resistência a meticilina, PCR.

INTRODUCTION

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) have emerged as important

nosocomial pathogens during the last few decades. The CoNS represent an

important etiology of nosocomial bloodstream infections especially in neonate, in

immunocompromised individuals and in patients with implanted medical devices

(29).

Methicillin resistant and multi-drug-resistant CoNS are commonly isolated in

hospitalized patients, probably reflecting the adaptation of nosocomial clones to the

selective pressure caused by widespread use of antibiotics in hospitals (17, 28).

Methicillin resistance is due to the acquisition of a large DNA element termed

staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), which integrates into the

chromosome of Staphylococcus aureus and CoNS (12). Methicillin resistance is

mediated by the mecA gene harbored in the SCCmec (13).

Nowadays MR-CoNS strains are highly prevalent and may reach, as many as

70% of the CoNS identified from blood culture in Europe, Latin America and the

United States (7, 29) In Switzerland, however, the level of methicillin resistance

among CoNS is lower 44% (28). In Brazil, methicillin resistance may be presented in

over 80% of bloodstream infections (21). The SCOPE Surveillance Program ranks

CoNS as the leading cause of nosocomial bloodstream infections and the SENTRY

program report the SCoN as the second most common cause of nosocomial

bloodstream infections (7, 15, 19).

Resistance to methicillin is often difficult to detect by conventional

susceptibility testing methods. A characteristic of methicillin resistance is usually

heterogeneous expression, which means that the growth in the presence of β

lactamics select highly resistant subclones from a population with low methicillin

MICs. The causes of heteroresistance are a number of chromosomal factors whose

activity affects the level of resistance; many of these genes are involved in cell wall

biosynthesis (3).

However, the major causes of resistance to methicillin seem to be the

expression of the mecA gene, and beta lactamase hyperprodution, though the

resistance mediated by the beta lactamase hyperproduction is less frequent. These

two factors have been shown to be important in clinical isolates (9). The resistance

to methicillin is difficult to detect due to the complexity of the regulatory system of

mecA and blaZ genes. The beta lactamase (bla gene) and PBP2a (mecA gene) are

genetically and biochemically distinct, but both are regulated by a similar sensor

transducer and repressor proteins. Therefore either bla or mec genes can control

production of PBP2a and β-lactamase because of the high degree of homology of

the two systems (32).

Detection of a mecA gene by PCR is considered the “gold standard” (1).

Considering that in most clinical laboratories it is not possible to characterize

methicillin resistance by genotypic methods, the use of phenotypic methodologies

has to be optimized. The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

proposed the use of cefoxitin disks (30 µg) as a screening method for the prediction

of resistance mediated by the mecA gene in all CoNS species (5).

The aim of this work was to evaluate the prevalence of methicillin resistance

mediated by the mecA gene among CoNS, obtained from patients at a terciary

hospital in southern Brazil Also was evaluate the efficiency of the cefoxitin disk and

oxacillin disk to characterize the methicillin resistance mediated by the mecA gene in

CoNS. The distribution of resistance to methicillin (mecA gene) among staphylococci

species was also characterized. Also was the aim of this work the comparison of the

resistance to non β-lactamics antimicrobials among CoNS which harbored the meA

gene and the CoNS which not harbored the mecA gene.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial Isolates. A total of 181 clinical isolates of CoNS were obtained from

blood cultures from patients hospitalized at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre,

between August 2004 and December 2005. The study included only one isolate per

patient, or more than one isolated when they were obtained in a three days interval.

The blood cultures were performed using Bact Alert

(bioMérieux, Marcy L’Etoile,

France). The colony morphology, the Gram stain reaction, the catalase test and the

absence of the coagulase enzyme were used to screen for CoNS identification.

Antimicrobial susceptibility test. The antimicrobial susceptibility test was

performed by the disk diffusion method on Mueller Hinton Agar (bioMérieux, Marcy

L’Etoile, France), according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI

2006), with the following antimicrobial: oxacillin (1 µg), cefoxitin (30 µg), vancomycin

(30 µg), gentamicin (10 µg), clindamycin (2 µg), chloramphenicol (30 µg), doxaciclin

(30 µg), erythromycin (15 µg), levofloxacin (5 µg), rifampin (5 µg) and trimethoprim-

sulfamethoxazole (25 µg). S. aureus ATCC 25923 was used for quality control.

β-Lactam antimicrobial inativation test. The resistance decrease test with

clavulânic acid (DTCA) was performed according to a protocol previously described

(17).

DNA extraction and quantification. The isolates were cultured on Mueller

Hinton Agar and incubated at 35ºC for 18 to 24 hours. A bacterial suspension

equivalent to 1.0 McFarland was prepared in 500 µl of 10mM TRIS – 1mM EDTA

(pH 8.0). The suspension was homogenized in vortex and heated at 100ºC for 10

minutes (30). Afterwards, the suspension was frozen at -20ºC for two hours and then

centrifuged at 9,000 g for 3 min. The DNA from 20 random isolates was quantified

using GeneQuant RNA/DNA Calculator (Amersham Pharmacia Biotec’s,

Pistacaway, USA).

Species identification. The molecular identification of S. epidermidis was

performed by Polymerase Chain Reaction (PCR), with primers from a species-

specific probe for the identification of tuf gene (16). The isolates that were not

identified as S. epidermidis were submitted to the API ID 32 STAPH (bioMérieux,

Marcy L’Etoile, France) semi-automated system.

Determination of mecA gene. The PCR procedure was used to verify the

presence of the mecA gene. Primers F1 (5’-CTTACTTACTGGCTGTACCTG) and F2

(5’-ATGT CGCTTGTTATGTGC), which amplified a 310-bp fragment of the mecA

gene, (26), that was visualized under ultraviolet light by the addition of ethidium

bromide (0.5 µg/ml) in agarose gel at 2.0%. S. epidermidis ATCC 12228 and S.

aureus ATCC 33591 were used as negative and positive controls.

Sequencing and computer analysis of sequences: The DNA fragments

amplified by PCR (310pb) of the mecA gene were sequenced. A homology search

was performed with de BLAST and Chromas programs and DDBJ/EMBL/GeneBank

databases.

Statistical analysis: The descriptive statistical analysis was undertaken by

the EPI INFO 6 program to determine de sensitivity, specificity, positive predictive

value and negative predictive value. The Qui-Square test was also performed by

SPSS-11 to compare the non β-lactamics resistance among CoNS methicillin

resistant and CoNS methicilin susceptible.

RESULTS

The 181 CoNS clinical isolates of blood cultures were submitted to the disk

diffusion test (DD) with cefoxitin and oxacillin disk, and the results were compared to

the presence of the mecA gene by PCR (Figure 1). Overall 129 isolates contained

the mecA gene among the SCoN indicate a prevalence of 71.3% (IC of 95%: 64.0 to

77.7).

All mecA positive CoNS were resistant to cefoxitin DD test. There were no

false negatives results. Therefore, the sensitivity for the DD test with cefoxitin was

100% (IC of 95%: 96.3 to 100). Considering that the 48 isolates were sensitive for

the DD test and 52 were negative for PCR, four false-positive results were obtained.

Thus the specificity was 93% (IC of 95%: 81.9 to 97.7). For the DD test with

cefoxitin, the positive predictive value (PPV) was 96.9% (IC of 95%: 91.8 to 99.0)

and the negative predictive value (NPV) was 100% (IC 91.4 to 100) (Table 1).

The DD test with oxacillin detected 127 resistant isolates out of 129 positive

results by PCR, being that there were two false-negative results. Thus the sensitivity

of the test with oxacillin was 98% (IC of 95%: 93.8 to 99.7). From the 52 negative

results by PCR, the DD test with oxacillin indicated only 46 isolates susceptible. It

was concluded that 6 isolates had false-positive results. Therefore the specificity for

the test was 89% (IC of 95%: 77.4 to 95.6). Evaluating the results of the DD test with

oxacillin, the PPV was 95.3% (IC of 95%: 89.7 to 98.1) and the NPV was 96.2% (IC

of 85.7 to 99.3) (Table 1).

The four isolates that were resistant to the DD test for both oxacillin and

cefoxitin but that presented negative PCR for the mecA gene were submitted to

DTCA for the detection of hyperproduction of beta lactamase. The test was positive

for all isolates. Among the 6 isolates resistant to DD with oxacillin, 4 had positive

result for the decrease test with clavulanic acid. The other two isolates were

sensitive for the DD test with cefoxitin and presented negative PCR for the mecA

gene.

A total of 116 out of 181 isolates were identified by PCR for the species-

specific tuf gene as S. epidermidis (64% of all CoNS). The other 65 isolates were

identified phenotypically, resulting in 18 (10%) S. hominis, followed by 16 (8.8%) of

S. haemolyticus, 14 (7.7%) S. capitis, 3 (1.6%) S. warneri, 2 (1.1%) S.

saprophyticus, 1 (0.5%) S. lugdunensis and 1 (0.5%) S.sciuri. We have not obtained

the phenotypically identification of 10 (5.5%) isolates, the fenotipic test result in very

small or no information about this isolates.

The only one isolate of S. sciuri presented the mecA gene. The highest

prevalence of mecA gene was for S. haemolyticus with 93.8%, S. capitis with 85.7%,

S. epidermidis with 75% and S. hominis with 72.2% resistance. Among the 10 CoNS

not identified, only one presented the mecA gene. None of the S. warneri, S.

saprophyticus and S. lugdunensis presented the mecA gene (Table 2).

The resistance to non-beta lactamics antibiotics to the CoNS isolates with the

mecA gene was higher in relation to the isolates without the mecA gene, proved to

be statistically significant for ciprofloxacin (66.4 vs. 15.6%, p = 0,000), cloranfenicol

(38.7 vs. 13.3%, p = 0,001), eritromicin (73.6 vs. 34.1%, p = 0,000), levofloxacin

(56.4 vs. 9.5%, p = 0,000), gentamicina (87.2 vs. 16.3%, p = 0,000), rifampin (28 vs.

2.2%, p = 0,000) and trimethoprim-sulphametoxazole (72 vs. 28.9%, p = 0,000),

except for doxycyclin (21.1 vs. 15.6%, p = 0,514) (Table 3).

Among the 129 isolates who harbored the mecA gene, 66 isolates were

multidrug resistant (resistant to five or more antimicrobials) The overall range of

multiresistance among these SCoN is 51%.

DISCUSSION

The result of the mecA gene detection demonstrated that 129 isolates

presented the mecA gene considered gold standard for the detection of resistance to

methicillin, but 52 did not present the mecA gene (1). In this context, we have a

prevalence of 71.3% of resistance to methicillin mediated by the mecA gene among

nosocomial isolates of CoNS. A similar prevalence is referred by a multicentric study

in Spain. Among the clinically significant CoNS isolates of this study, 70.6% were

resistant to methicillin (20). In a study undertaken in Europe between 2002 and 2004

for the Daptomicine Vigilance Program, Sader and collaborators also evaluated the

resistance to methicillin of 1.942 CoNS isolates. The resistance found for these

isolates was of 77% (22). Moreover results from the United States, Canada, Latin

America, Europe and Japan, indicated that resistance to methicillin varies between

73 to 77%, being that the highest values are reported in Japan (7).

The general distribution of the species of CoNS identified in this study

demonstrated that the main pathogen associated to the bacteremias was the S.

epidermidis (14, 27). Although, S.hominis and S.haemolyticus were also present in

blood cultures in considerable rate. The S. haemolyticus is considered an important

pathogen due to its ability to develop multiresistance (25). The distribution of the

mecA gene among the species of staphylococcus is quite distinct. The percentage of

mecA-positive strains was highest for S. haemolyticus (93%), followed by S.

epidermidis (75%) and S. hominis (72.2%). These results are concordant with the

Hussan and collaborators (2001) (11). The S. sciuri are known as initial reservatory

for the mecA gene, therefore it is expected that they present resistance; this was

also found in this study (6, 23).

The sensitivity and specificity of the cefoxitin DD test for the evaluation of

methicillin resistance, was higher than the sensitivity and specificity of the DD test

with oxacillin for all the CoNS (100, 98% and 93, 89% respectively). Using cefoxitin

30 µg, all mecA positive CoNS isolates were adequately characterized, while

oxacillin 1µg disk presented 1.5% (2/129) of false-negative results. Test with

cefoxitin 30 µg also presented 7.7% (4/52) of false-positive results. The oxacillin 1µg

disk presented 11.5% (6/52) of false-positive results (24). Detection of oxacillin

resistance among CoNS isolates is difficult mainly due to heterogeneity of the control

of repressor-promoter expression (4). Cefoxitin is therefore considered to be a better

predictor than oxacillin for the detection of oxacillin heteroresistance because it is a

stronger inducer of PBP2a (8). The cefoxitin DD test can be used to predict the

presence of mecA gene in CoNS with a high degree of sensitivity and specificity

when compared to mecA detection using PCR (24). Above all, the halos are easier

to visualize with the cefoxitin discs than with the oxacillin discs (5).

Four (2.2%) of the false positive isolates (for oxacillin and cefoxitin) had

positive DTCA (30) being therefore possible to suppose that these isolates

presented hyperproduction of β-lactamase. In the present study, beta-lactamase

hyperproduction appeared to be the major cause of false-positive detection of

oxacillin resistance in CoNS by phenotypic methods (9). Two isolates, identified as

S. epidermidis, had complete reduction of resistance. Thus, with the use of

clavulanic acid the isolate could be considered sensitive according with the standard,

when compared with the test without clavulanic acid. With these results was

supposed that for these isolates, the main mechanism of resistance involved is the

hyperproduction of beta lactamase (9).

The other two isolates had a reduction of resistance with the clavulanic acid

without however becoming susceptible. It can be concluded that there must be more

than one type of mechanism involved in the resistance expression of these isolates.

Hiramatsu and colleagues reported that mecA independent methicillin resistance

occurs in more or less 3% in methicillin resistant strains of CoNS) (31).

Methicillin resistant CoNS showed a higher level of resistance to all

antimicrobials when compared to methicillin sensitive CoNS, except doxaciclin. It is

known that the mecA gene is inserted in a mobile genetic element (SCCmec) that

contains other resistance genes, became the isolates that harbored this gene

resistant to several antibiotics (12). Because of this, a high level of multidrug

resistance was expected among CoNS that harbored the mecA gene. The

percentage was 51%, although the resistance rate to multiple antibiotics finding in

other study was higher (10).

It can be concluded that the β-lactamase hyperproduction appears to be the

major reason for the discordance between phenotypic and genotypic methods for the

detection of methicillin resistant CoNS mediated by the mecA gene. In addition, the

results of DD with cefoxitin 30 µg disk showed that this is the best single test for the

evaluation of oxacillin resistance mediated by the mecA gene for all CoNS species

iisolated in the blood stream of patients in our institution.

ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful to FIPE – Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos at

Hospital de Clínicas de Porto Alegre for the support to this work.

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32. Zhang, H.Z.; Hackbarth, C.J.; Chansky, K.M.; Chambers, H.F. A proteolytic

transmembrane signaling pathway and resistance to beta-lactamics in

staphylococci. Science. 9; 291(5510):1915-6, 2001.

Table 1. Results of DD test witch oxacillin, cefoxitin and results of PCR of 181 CoNS

isolates

PCR mecA gene

Oxacilin Positive Negative

Total Cefoxitin Positive Negative

Total

Resistante

123 6 129 Resistante

125

129

Sensível 2 50 52 Sensível 0

Total 125 56 181 Total 125

181

Table 2. Distribution of CoNS species and mecA gene among the species.

Nº(%) Resistance among theCoNS species

S.epiderm

S.hominis

S.haemol

S.capitis S.sciuri S.warneri

S.saprop

S.lugdun

Total

116 18 16 14 1 3 2 1 10 181

mecA

pos

87 (75) 13(72,2) 15 (93,8)

12(85,7)

1(100) 0 0 0 1 (10)

129

(71,3)

mecA

neg

29 (25) 5 (27,8) 1 (6,2) 2 (14,3)

0 (0) 3 (100) 2 (100) 1 (100) 9 (90)

(28,7)

S. epidermidis;

S. haemolyticus;

S. saprophyticus;

S. lugdunensis;

NI não identificado

Table 3. Comparison of resistance to non β-lactamics antimicrobials among the

CoNS which harbored the mecA gene and the CoNS which not harbored the mecA

gene.

Nº (%) isolates with and without mecA gene x resistance to non β-lactamics

antimicrobials

CLIN CLOR DOXI

ERITRO

GENTA LEVO RIFAM

SULFA VANCO

mecA

positive

81 (66,4)

48 (38,7)

26 (21,1)

92 (73,6)

109 (87,2)

66 (56,4)

35 (28)

90 (72) 0

mecA

negative

7 (15,6) 6 (13,3) 7 (15,6) 15 (34,1)

7 (16,3) 4 (9,5) 1 (2,2) 13 (28,9)

CLIN: clindamicin; CLOR: cloranfenicol; DOXI; doxycyclin; ERITRO: erythromycin; GENTA:

gentamicin; LEVO: levofloxacin; RIFA: rifampicin; SULFA: sulphamethoxazol; VANCO: vancomicin

The diference of resistance to doxycycline to non β-lactamics antimicrobials among the CoNS which

harbored the mecA gene and the CoNS which not harbored the mecA gene was not statistically

significative.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figure 1: PCR for mecA gene. Lane 1: molecular weight standard (100pb); lines 2: positive

control S. aureus ATCC 33591; lane 3: negative control S. epidermidis ATCC 12228; Lanes

4, 5 and 6: isolate number 173 (S. epidermidis) harboring mecA gene; lane 7: negative

control; lanes: 8, 9 and 10: isolate number 110 (S. capitis) harboring mecA gene

Há discrepâncias entre a detecção do gene mecA nos Staphylococcus spp

coagulase negativa por PCR e por teste de disco difusão com cefoxitin e

oxacillin? Qual o papel da hiperprodução de β

ββ

β-lactamase?

Alice Beatriz Mombach Pinheiro Machado* ,

Keli Cristine Reiter, Rodrigo Minuto

Paiva, Afonso Luis Barth

Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular, Hospital de Clínicas de Porto

Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil.

Running Title: Resistência a meticilina nos SCoN

* Corresponding author. Mailing address:

Hospital de Clinicas de Porto Alegre

Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular

Rua Ramiro Barcelos 2350

Porto Alegre – RS

Brasil -90.035.-903

Phone/FAX: +55 5121018860

E-mail: abma[email protected]rgs.br

ABSTRACT

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are a common cause of nosocomial

infections and they have the tendency to develop resistance to methicillin (MR-

SCoN) and multiple antibiotics. Moreover the resistance to methicillin may not be