( PDF ) Análise da colagenização de feridas cirúrgicas em pele de ratos submetidos à aplicação de óleo da semente de Azadirachta indica

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

LYVYAM LOSS DOS REIS

ANÁLISE DA COLAGENIZAÇÃO DE FERIDAS CIRÚRGICAS EM

PELE DE RATOS SUBMETIDOS À APLICAÇÃO DE ÓLEO DA

SEMENTE DE Azadirachta indica

Mogi das Cruzes, SP

2008

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

LYVYAM LOSS DOS REIS

ANÁLISE DA COLAGENIZAÇÃO DE FERIDAS CIRÚRGICAS EM

PELE DE RATOS SUBMETIDOS À APLICAÇÃO DE ÓLEO DA

SEMENTE DE Azadirachta indica

Orientador: Prof. Dr. Jean Jacques Bonvent

Mogi das Cruzes, SP

2008

Dissertação apresentada à Universidade de

Mogi das Cruzes, como pré-

requisito para

obtenção do Título de Mestre no Programa

de Pós-Graduação em Engenharia

Biomédica.

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Financiamento:

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Elza Auxiliadora Loss dos Reis e

Douglas Castro dos Reis, que dedicaram suas vidas

ao futuro de seus filhos. Mostraram ser os educadores

mais brilhantes que até hoje conheci.

AGRADECIMENTOS

Ao meu pai, Douglas, por incentivar, insistir e acreditar no conhecimento. Suas críticas e

correções foram valiosas para a conclusão da dissertação.

À minha mãe, Elza, um agradecimento especial. Seu amor me ensinou a amar mais e melhor

tudo o que faço e a todos que amo. Você é fantástica.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Jean Jacques Bonvent, pela atenção, dedicação e pelos valiosos

ensinamentos científicos.

À minha irmã Lyllyam e meu cunhado Evandro, por perdoarem minha ausência, pelo apoio,

companheirismo e amizade. À vocês eu agradeço também os melhores presentes que recebi:

meus amados afilhados, Arthur e Matheus, motivos de alegria, gargalhadas e alguns

hematomas e arranhões.

Ao meu irmão Wyllyam, pelo carinho e ensinamentos na área médica – meu desempenho

acadêmico foi aflorado com sua ajuda - e à Geórgia, pelo incentivo dado à iniciação científica,

pela dedicação à nossa família e pelas proveitosas conversas sobre saúde.

Á Daniel da Rocha Ramos. Sua presença neste momento fez toda a diferença. Você me

incentivou ao mestrado e apoiou minha vinda a Mogi das Cruzes. Não encontro forma escrita

de agradecer amor, companheirismo, amizade e generosidade. Amo você!

Às grandes amigas: Aline Eccher, Anamaria Pinheiro, Bianca Peruchi, Camila Nico, Fernanda

Altoé, Ludmilla Aguiar, Mariana Paraíso, Marina Vivacqua, Tatiana Soares e Rubia

Gianordoli. A presença de vocês foi essencial para o bom andamento da dissertação. Amigos

são como anjos.

À família Rocha Ramos, na qual fui acolhida calorosamente, pela amizade, carinho e

incentivo.

Aos amigos do doutorado em Engenharia Biomédica do Núcleo de Pesquisas Tecnologias

(NPT): Andréia Miranda Rodrigues, Jaqueline Botelho da Ponte, Helio Martucci Neto,

Alessandro Pereira da Silva, Terigi Scardovelli, Maria Lúcia Nana Ebisawa, Gabriela

Alejandra Fernandez e Ivan Teodoro Costa pela colaboração com a pesquisa.

Aos amigos que Mogi das Cruzes me proporcionou: Ana Maria Fonseca Abreu - por fazer os

dias ficarem mais divertidos, por me ensinar afazeres da vida diária, pela amizade e

companheirismo - e Válber Lúcio Silva.

Aos técnicos do Biotério da Universidade de Mogi das Cruzes, Douglas Moreira de Jesus e

Paulo Gomes da Silva pelo auxílio na manipulação dos animais.

Ao veterinário responsável pelo Biotério da Universidade de Mogi das Cruzes e amigo, Dr.

Maurício Marques de Oliveira, pelas incontáveis conversas a respeito da pesquisa, pelo

auxílio no procedimento cirúrgico dos animais, pelas críticas, colaborações e amizade.

Ao técnico responsável pelo Laboratório de Técnicas Cirúrgicas, Sr. Roque José do

Nascimento, pelo empréstimo dos materiais para a realização do trabalho.

À amiga Michelly Toscano, pela colaboração com a pesquisa e companheirismo no

laboratório.

À Sr

. Terezinha Lorena, zeladora e amiga, pelo carinho, amizade e por muito se preocupar

não apenas com o meu bem estar, mas com o bem estar de todos do NPT.

À amiga e competente secretária do NPT, Fabiane Silva, pelos conselhos, apoio, auxílio e

pela companhia.

Aos amigos do mestrado em Engenharia Biomédica do NPT: Juliana Miranda, Maria Carolina

F. Mauro, Jefferson Marques, José Gustavo Tavares, Ivan dos Santos Vivas, Wolley Willians

Silva, Willian Watanabe, Eliza Yumi Sonoda, Tatiany Marcondes, Tatiana Bolletini e Miucha

Gomes pela colaboração indispensável.

Aos pesquisadores do NPT: Dr

. Silvia Rodrigues, Dr. Luciano Mercadante, Dr

. Annie

France Frère Slaets, Dr. Wagner Wuo, Dr. Henrique J. Q. Oliveira e Dr. Daniel Gustavo

Goroso por estarem sempre a disposição para possíveis dúvidas, discussões e ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Carlos Marcelo Gurjão de Godoy, pela generosidade em fornecer conhecimento.

Ao Prof. Dr. Afonso Caricati Neto, pela disposição em colaborar com a pesquisa, pelos

ensinamentos fisiológicos e farmacológicos e por acreditar em seus alunos.

Ao Prof. Dr. Tiago Rodrigues, do Centro Integrado de Investigação Bioquímica (CIIB), pela

colaboração indispensável com a pesquisa e pela disposição em ajudar.

Ao professor colaborador do Laboratório de Estudos do Movimento e Estimulação de Tecido

(LeMoveTec), Prof. Dr. Cláudio Saburo Shida, pela grande colaboração no trabalho e pelas

proveitosas discussões a respeito da análise de colágeno.

Aos alunos de Iniciação Científica da Universidade de Mogi das Cruzes, em especial, à amiga

Kassia Karoline Rosa do Valle e Zaiane Meneses Camillo, pelo companheirismo e preciosa

colaboração em toda a metodologia.

Aos estagiários do NPT: Rizieri Pizzolitto Santos, Jéssica Marques de Siqueira e Eric

Angelim Dario pelo auxílio na conclusão da dissertação.

Os meus sinceros agradecimentos.

“De fato não existe uma só ciência capaz, sozinha, de suprir a demanda humana por

conhecimento. Virtuoso aquele que compreende a condição de pluralidade dos diversos

corpos de conhecimento e deles faz uso para compor o seu próprio. De nada valem conceitos

e técnicas, separados do cotidiano da sociedade e restritos somente a seus pares; conhecer

deve pressupor integrar e, sobretudo, compartilhar.”

Daniel da Rocha Ramos, 2008

RESUMO

As cicatrizes hipertróficas e quelóides, decorrentes de um ineficiente reparo tecidual, têm

repercussões não apenas no aspecto estético, mas sintomáticas e funcionais, podendo levar o

indivíduo acometido a limitações em suas atividades diárias normais. Várias técnicas e

medicamentos podem ser empregados a fim de evitar este quadro e favorecer a qualidade do

tecido cicatricial. Dentre as formas de tratamento, a fitoterapia tem atraído cada vez mais o

interesse da comunidade científica. A Azadirachta indica, também conhecida como nim, é

uma árvore oriunda da Índia e utilizada há séculos como planta medicinal, sendo publicado

seu possível efeito no tratamento de feridas cutâneas. O objetivo deste trabalho foi quantificar

os efeitos da A. indica sobre a densidade de colágeno tipo I e tipo III no reparo tecidual de

pele de ratos, no pós-operatório com sutura. Para a realização do estudo foram utilizados 12

ratos Wistar, que foram submetidos a dois cortes cirúrgicos, sendo um considerado controle e

outro para aplicação do óleo puro da semente de nim. Os ratos foram divididos em dois

grupos de seis animais. O grupo 1 (G1) foi tratado com óleo da semente de nim (G1-T) e óleo

mineral (G1-C) do 1º ao 3º dia pós-cirúrgico, e o grupo 2 (G2) foi tratado nas mesmas

condições de G1 (G2-T e G2-C) do 1º ao 7º dia pós-cirúrgico. Amostras de tecido de pele da

região da lesão foram analisadas a partir de lâminas histológicas coradas com picrosirius red e

com HE, cujas imagens foram capturadas por uma câmera digital acoplada a um microscópio

óptico com luz polarizada. A quantificação do colágeno tipo I e III e do número de células

inflamatórias foi feita mediante o software Image Pro Plus, v. 6.0. Os resultados obtidos

mostraram que, por meio de testes estatísticos t-student e ANOVA one-way (teste de Tukey),

nenhuma diferença estatisticamente significativa foi encontrada entre a densidade de colágeno

do grupo tratado e controle, quer seja para G1, quer seja para G2. Entretanto, ao analisar as

células inflamatórias nas amostras de G1 e G2, observou-se que o número dessas células em

G2 mostrou-se superior no grupo tratado (G2-T) em relação ao grupo controle (G2-C). Os

resultados sugerem que o óleo da semente da planta, usado topicamente, em feridas cirúrgicas

de ratos, não induz a aceleração ou retardo da síntese de colágeno, mas pode atuar como

modulador ou como agente pró-inflamatório no processo de reparo tecidual dessas feridas.

Palavras-chave: colágeno, cicatrização, Azadirachta indica, microscopia de luz polarizada.

ABSTRACT

The keloids and hypertrophic scars are a manifestation of an inefficient wound healing that

gives rise to an excessive deposition of collagen. Both types of fibrous tissue can have a high

negative psychological and functional toll on the person, if they are too large or disfiguring,

with discomfort, tenderness and irritation, affecting the normal daily activities. Several wound

treatments can be used in order to prevent the occurrence of abnormal scars. Among these

treatments, the herb therapy has attracted an increased interest of the scientific community.

The Azadirachta indica, also known as neem, is a native tree from India, and where it has

been used during centuries as a medicinal plant, with positive results for wound healing. The

aim this study was to quantify the effects of A. indica on the synthesis of type I and III

collagen, during the healing process of surgical skin wounds of rats. 12 Wistar rats were

submitted to two surgical incisions in the dorsal region; one was considered as control and the

other was treated topically with seed oil of neem. The rats were divided in two groups of 6

animals. The group 1 (G1) was treated with neem extract from the 1

to 3

day, after the

incision; the group 2 (G2) was treated in the same conditions from the 1

to 7

day.

Histological cuts of wound tissues were colored with picrosirius red and HE, in order to

express type I and III collagen as well as the inflammatory cells, which digital images were

obtained under an optical microscope, between crossed polarizers. The quantification of

collagen type I and III was performed using software Image Pro Plus, v. 6.0. A statistics

analysis was done with ANOVA one way (Tukey test). No significant difference was found in

the collagen density between the treated and the control groups, as well as for the two

different phases of the healing process investigated (G1 and G2). With regards to the

inflammation process, a surprising result was found; indeed, a significant increase of the

inflammatory cells number was observed in the G2T group compared to the G2C one. The

result suggest that the seed extract of neem, when topically applied on a sutured wound (first

intention healing), does not promote or delay the collagen production, but may act as a

modulator or a pro-inflammatory factor in the wound healing process.

Keywords: collagen, wound healing, Azadirachta indica, polarized light microscopy.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: A pele e suas divisões anatômicas: epiderme, derme e hipoderme. Modificado de:

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/images/ency/fullsize/8912.jpg. Acesso em

Fevereiro/2008..........................................................................................................................14

Figura 2: Epiderme e as suas divisões, (a) Representação esquemática; (b) Imagem obtida

num microscópio óptico, com aumento de 50x, de uma lamina histológica, corada com

Tricrômio de Azan-Mallory......................................................................................................16

Figura 3: Estrutura em tripla hélice, mostrando a conformação das cadeias do colágeno.

Adaptado de: http://www.thenewmath.com/uploads/collagen-enlarged.jpg............................21

Figura 4: Estrutura em tripla hélice do colágeno. a) imagem de duas fibrilas de colágeno,

adquirida em microscopia de força atômica. b) ilustração da tripla hélice do colágeno.

Extraído de: http://www.eastman.ucl.ac.uk/staff/academic/bozecl/pic1.jpg, acesso em

02/09/2008 (a) e L. Stryer, Bioquímica – 4ª edição, desenhado de coordenadas relatadas por

K. Okuyama, K. Okuyama, S. Arnott, M. Takayanagi e M. Kakudo. J. Mol. Biol. 152 (1981):

427 (b).......................................................................................................................................22

Figura 5: Imagens, obtidas num microscópio óptico com luz polarizada, do colágeno da

derme corado com picrosirius red. a) as fibras vermelhas correspondem ao colágeno de tipo I;

b) as pequenas fibras verdes são as fibras de colágeno tipo III................................................24

Figura 6: Fases da cicatrização em reação ao tempo (dias).....................................................28

Figura 7: Frutos da árvore da nim............................................................................................37

Figura 8: Fórmula estrutural da azadiractina. Disponível em:

www.iapar.br/arquivos/Image/nim. Acesso em: 02/10/2007....................................................38

Figura 9: Tricotomia com lâmina n

40 sem lesionar a pele do animal...................................45

Figura 10: Imagem das lesões após a sutura. a) fotografia mostrando lesão superior e inferior;

b) fotografia em maior aumento mostrando as lesões...............................................................46

Figura 11: Esquema ilustrativo da retirada de tecido para preparação das lâminas

histológicas: 1 – tecido lesado; 2 – tecido não lesado...............................................................48

Figura 12: Lâmina histológica com dois cortes histológicos contendo a lesão e um esquema

ilustrando os dois cortes: (a) região periférica e (b) região central...........................................48

Figura 13: Esquema demonstrativo dos locais fotografados de cada lesão: 1 – borda lateral

esquerda; 2 – borda lateral direita; 3 – borda inferior...............................................................49

Figura 14: Esquema de sistema de captura de imagens para análise das lâminas

histológicas................................................................................................................................50

Figura 15: Interface do programa de análise de imagem (Image Pro Plus v. 6.0), com imagem

histológica em aumento de 20x entre polarizadores cruzados. A sobreposição da imagem para

controle dos parâmetros determinados para reconhecimento dos tons de vermelho e verde na

imagem em pixel.......................................................................................................................51

Figura 16: Lâmina histológica corada com HE, em aumento de 50x......................................52

Figura 17: Lâmina histológica corada com HE, em aumento de 500x....................................52

Figura 18: Imagens digitais das lesões dos grupos G1 e G2 no último dia de tratamento:

a)lesão G1 controle; b)lesão G1 tratada; c)lesão G2 controle; d)lesão G2 tratada...................54

Figura 19: Imagens obtidas em microscópio óptico (aumento de 100x), de três diferentes

tipos de coloração: a)HE; b)Azan-Mallory; c)Picrosirius Red. A propriedade de

birrefringência do colágeno se expressa na imagem em forma de brilho em tons de vermelho

verde, caracterizando os tipos I e III, respectivamente, de colágeno........................................56

Figura 20: Imagens obtidas com aumento 200x, no microscópio óptico, das lâminas

confeccionadas com Picrosirius Red. a) entre polarizadores paralelos; e b) com polarizadores

cruzados....................................................................................................................................57

Figura 21: Imagem obtida através do microscópio óptico com luz polarizada, com aumento

de 100x, mostrando área da lesão na região do corte. Em a) o tecido apresenta menor

porcentagem de fibras verdes em relação ao tecido da imagem b)...........................................57

Figura 22: Percentual de fibras vermelhas (%R) das amostras de G1 e G2, na região (a)

lateral, (b) funda e a (c) média das regiões estudadas...............................................................61

Figura 23: Média das células inflamatórias nas amostras de G1-C, G1-T, G2-C, G2-T, após 3

e 7 dias de corte cirúrgico.........................................................................................................63

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais tipos de colágeno, com a localização e a função.....................................23

Tabela 2: Dose administrada aos animais de acordo com peso e o respectivo tempo de ação

do anestésico.............................................................................................................................45

Tabela 3: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região lateral da lesão, no 3º dia, para as

amostras controles (G1-C) e tratadas (G1-T)............................................................................58

Tabela 4: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região lateral da lesão, no 7º dia, para as

amostras controles (G2-C) e tratadas (G2-T)............................................................................58

Tabela 5: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região de fundo da lesão, no 3º dia, para as

amostras controles (G1-C) e tratadas (G1-T)............................................................................58

Tabela 6: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região de fundo da lesão, no 7º dia, para as

amostras controles (G2-C) e tratadas (G2-T)............................................................................58

Tabela 7: Média percentual de colágeno tipo I das três regiões analisadas (laterais e fundo),

no 3º dia, para as amostras controles (G1-C), tratadas (G1-T) e não lesionadas (GNL)..........59

Tabela 8: Média percentual de colágeno tipo I das três regiões analisadas (laterais e fundo),

no 7º dia, para as amostras tratadas (G2-T), controles (G2-C) e não lesionadas (GNL)..........59

Tabela 9: Média e desvio padrão da análise de colágeno das regiões laterais, fundo e das

médias das três regiões no 3º e 7º dias......................................................................................59

Tabela 10: Média e desvio padrão da análise de colágeno de G1 e G2 nos tecidos lesionados

(controle e tratado) e não lesionado..........................................................................................60

Tabela 11: Média e desvio padrão da análise do número de células inflamatórias na região da

lesão, no 3º e 7º dias, para os grupos controle e tratado...........................................................62

Tabela 12: Valor p da comparação entre grupos tratados e controles, referentes a %R..........63

Tabela 13: Valor p da comparação entre grupos lesionados (tratado e controle) e não

lesionados, referentes à %R......................................................................................................63

Tabela 14: Valos p da comparação entre grupos tratados e controles de G1 e G2, referente à

contagem de células inflamatórias............................................................................................64

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5–HT – 5-hidroxitriptamina

ADN – ácido desoxirribonucléico

AGE – Ácidos Graxos Essenciais

FCE – fator de crescimento epidérmico

FCF – fator de crescimento fibroblástico

g/mol – grama por mol

HE – hematoxilina-eosina

FCI – fator de crescimento de insulina

IL - interleucina

FCQ – fator de crescimento queratinócito

mg – miligrama

mg/kg – miligrama por quilograma

mg/kg/dia – miligrama por quilograma por dia

m – metro

ml – mililitro

mm – milímetro

– número

nm – nanômetro

OMS – Organização Mundial de Saúde

FCDP – fator de crescimento derivado de plaqueta

PGE – prostaglandina

pH – potencial hidrogeniônico

PMN - Polimorfonucleares

UMC – Universidade de Mogi das Cruzes

v. – versão

FCVE - fator de crescimento vascular endotelial

FTC – fator transformador de crescimento

FNT – fator de necrose tumoral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................

2 OBJETIVO......................................................................................................

3 JUSTIFICATIVA............................................................................................

4 CONCEITOS TEÓRICOS ASSOCIADOS AO PROJETO.......................

4.1

A PELE

..................................................................................................

4.1.1 A Epiderme.............................................................................................21

4.1.2 A Derme..................................................................................................23

4.1.3 Vascularização da pele...........................................................................23

4.1.4 A Hipoderme...........................................................................................24

4.1.5 O Tecido Conjuntivo..............................................................................24

4.1.6 Fibroblastos.............................................................................................25

4.1.7 Fibras Colágenas....................................................................................26

4.1.7.1 Colágeno tipo I

..............................................................................

4.1.7.2 Colágeno tipo III

...........................................................................

4.2 OBSERVAÇÃO DO COLÁGENO NO MICROSCÓPIO COM LUZ

POLARIZADA........................................................................................................................31

4.3 O

REPARO TECIDUAL DA PELE...................................................................33

4.3.1 Fase inflamatória....................................................................................34

4.3.2 Fase de formação do tecido de granulação com depósito de matriz

extracelular..................................................................................................................36

4.3.3 Fase de maturação e remodelagem.......................................................38

5 CONTEXTUALIZAÇÃO

............................................................................................39

5.1 SUBSTÂNCIAS CICATRIZANTES...................................................................39

5.2 NIM (Azadirachta indica)......................................................................................42

5.2.1 Efeitos farmacológicos do nim...............................................................45

5.2.2 Toxicidade...............................................................................................47

5.2.3 Efeito anti-séptico, antifúngico e cicatrizante do nim.........................49

6. METODOLOGIA

.........................................................................................................50

6.1 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO.......................................................................50

6.2 APLICAÇÃO TÓPICA DO NIM........................................................................52

6.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS HISTOLÓGICAS........................................53

6.3.1 Coloração com picrosirius red..............................................................55

6.3.2 Observação no microscópio óptico com luz polarizada......................55

6.3.3 Processamento das imagens..................................................................56

6.3.4 Análise de células inflamatórias durante o processo de reparo

tecidual da pele............................................................................................................57

6.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................................58

7 RESULTADOS.

..............................................................................................................60

7.1

ANÁLISE QUALITATIVA DO PROCESSO CICATRICIAL.......................60

7.2

ANÁLISE HISTOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL

...

....................61

7.3

ANÁLISE QUANTITATIVA DAS CÉLULAS INFLAMATÓRIAS

DURANTE O PROCESSO DE REPARO TECIDUAL DA PELE...................................68

7.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................................69

8 DISCUSSÃO

....................................................................................................................71

9 CONCLUSÃO

................................................................................................................75

10 PERSPECTIVAS FUTURAS

..................................................................................76

REFERÊNCIAS....................................

.......................................................................77

ANEXOS.

..............................................................................................................................88

1 INTRODUÇÃO

As tentativas de intervir no processo de cicatrização de feridas ocorrem desde a

antiguidade, demonstrando que já nesta época se reconhecia a necessidade de cuidados a fim

de evitar complicações, podendo levar a danos locais ou gerais aos pacientes.

Embora tenham sido verificados grandes avanços tanto na compreensão dos processos

do reparo tecidual como no desenvolvimento de recursos e tecnologias para favorecer esses

processos, a incidência de úlceras crônicas ainda é alta. Os acometidos desenvolvem com

freqüência seqüelas que podem levar à perda de membros ou de suas funções, ocasionando

afastamento do trabalho e de suas atividades diárias, o que implica em conseqüências sociais

negativas (MORYSON, 1998).

Apesar da falta de dados precisos, encontram-se na literatura trabalhos demonstrando

que o impacto psíquico, social e econômico da cronificação de lesões, em especial as úlceras

crônicas de pés e pernas, representa a segunda causa de afastamento do trabalho no Brasil

(ERENO, 2003). Isto mostra que, embora no mercado existam recursos e tecnologia em

grande escala, muitas pesquisas são ainda necessárias não somente para aperfeiçoar estes

recursos, mas também para torná-los acessíveis a um maior número de pessoas. Neste

contexto, meios simples e economicamente viáveis, aproveitando-se de matérias-primas

encontradas em regiões menos desenvolvidas, poderiam ser investigados (ERENO, 2003).

Grande parte das publicações sobre recursos e procedimentos para o tratamento de

feridas é fragmentada, consistindo em relatos isolados sobre alguns tipos de agentes tópicos

ou cobertura em feridas. Esses estudos são freqüentemente descontinuados, e os resultados

não trazem evidencias precisas sobre a relação custo/benefício de cada um deles (DANTAS,

2003).

Plantas medicinais têm sido utilizadas para tratar distúrbios dermatológicos há

milhares de anos nos países do oriente e na Índia, e, desta maneira, a fitoterapia é um

tratamento cada vez mais utilizado pele medicina. Encontram-se comercializadas plantas com

princípios ativos para tratamento de várias doenças, inclusive as de pele. Por estes motivos, há

interesse por parte da OMS em investigações a respeito dos princípios ativos, toxicidade e

mecanismo de ação de extratos vegetais e substâncias isoladas extraídas de plantas.

Existem drogas com ação profilática para o tratamento de cicatrizes a fim de evitar o

aparecimento de patologias como as quelóides e as cicatrizes hipertróficas. Dentre os

medicamentos estão a heparina, a alantoína e o Extractum cepae (cepalin), que atuam,

respectivamente, inibindo a polimerização do colágeno, favorecendo maior elasticidade à

cicatriz e prevenindo infecções na região da ferida e a formação excessiva do tecido cicatricial

(HEINE, 1983,1989; FIELDER, 1985, BREU & DORSCH, 1994; MAJEWSKI &

CHDZYNSKA, 1987; AVUSO & SAENZ, 1985; WEISMANN, 1991).

A Azadirachta indica A. Juss (abreviada como A. indica), também conhecida como

nim (ou neem), é uma árvore oriunda da Índia e utilizada há séculos como planta medicinal,

sendo constatado sua interferência de modo positivo no processo de reparo tecidual de feridas

da pele (TANDAN et al., 1995; CHATTOPADHYAY, 1998).

2 OBJETIVO

O objetivo do presente estudo foi observar e quantificar os possíveis efeitos do óleo da

semente de Azadirachta indica sobre a densidade de colágeno tipo I e tipo III no reparo

tecidual da pele de ratos, submetidos à lesão cirúrgica.

3 JUSTIFICATIVA

Existe um forte interesse na investigação do efeito de algumas plantas, como A. indica,

sobre o processo cicatricial. Vários trabalhos publicados sugerem que o óleo da semente pode

representar uma alternativa ao tratamento de lesões de pele. Entretanto, até o presente

momento, não foram encontrados na literatura pesquisas científicas analisando o efeito do

extrato das folhas e do óleo da semente de nim sobre a síntese de colágeno tipo I e tipo III em

feridas de pele.

4 CONCEITOS TEÓRICOS ASSOCIADOS AO PROJETO

4.1 A PELE

A pele é um órgão do organismo animal, formado por tecidos de diferentes origens

dispostos e inter-relacionados de forma a desempenhar da melhor maneira as suas funções.

Também chamada de cútis, a pele é uma camada de revestimento do organismo que isola os

componentes orgânicos do meio exterior. Dentre suas funções estão a proteção imunológica,

regulação térmica, sensibilidade, armazenamento de energia, revestimento e proteção dos

órgãos internos, excreção e absorção.

A pele compõe-se, essencialmente, de três camadas de tecidos: uma camada superior –

a epiderme, uma camada intermediária – a derme ou córneo, e uma camada profunda – a

hipoderme ou tecido celular subcutâneo (Figura 1). Com mais de 15% do peso corpóreo, a

pele apresenta grandes variações ao longo de sua extensão, sendo ora mais flexível e elástica,

ora mais rígida.

Em relação as suas camadas, a epiderme é constituída por epitélio estratificado cuja

espessura apresenta variações topográficas desde 0,04 mm, nas pálpebras, até 1,6 mm, nas

Figura 1: A pele e suas divisões anatômicas: epiderme, derme e hipoderme. Modificado de:

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/images/ency/fullsize/8912.jpg. Acesso em

Fevereiro/2008.

Epiderme

Derme

Hipoderme

regiões palmo-plantares. Por outro lado, a derme se localiza abaixo da epiderme e

compreende denso estroma fibro-elástico no qual se situam as estruturas vasculares, nervosas

e estruturas anexas da pele (glândulas sebáceas, sudoríparas e folículos pilosos). A terceira

camada da pele, a hipoderme, compõe-se de tecido adiposo (SAMPAIO, 2000).

A derivação embriológica da pele vem dos folhetos ectodérmicos e mesodérmicos. As

estruturas epiteliais – epiderme, folículos sebáceos, glândulas apócrinas, glândulas écrinas e

unhas – derivam do ectoderma. Os nervos e melanócitos (células que produzem a melanina)

originam-se do neuroectoderma e as fibras colágenas e elásticas, vasos sanguíneos, músculos

e tecido adiposo do mesoderma (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).

Histologicamente o tecido epitelial é formado por células poliédricas, justapostas,

apresentando pouca substância extracelular. Essas células se aderem firmemente umas as

outras, formando camadas celulares que revestem a superfície externa e as cavidades do corpo

(mucosas), conferindo ao tecido maior resistência. Além dos epitélios de revestimento

existem, também, os epitélios glandulares, formados por células especializadas em produção

de secreção e neuroepitélios (ZELICKSON, 1967).

De acordo com o número de camadas, o epitélio de revestimento pode ser simples ou

estratificado. O epitélio simples se classifica de acordo com a forma de suas células em

pavimentoso, cúbico ou prismático. No caso dos epitélios estratificados, a classificação é feita

através da forma da camada mais superficial do epitélio (pavimentoso, prismático ou de

transição). Existe ainda um tipo especial de epitélio chamado pseudo-estratificado, constituído

por uma só camada de células com alturas diferentes, tendo também, núcleos dispostos em

diferentes níveis (ZELICKSON, 1967; LEVER & SCHAUMBURG-LEVER, 1975).

4.1.1 A Epiderme

A epiderme é um epitélio estratificado pavimentoso e queratinizado, composto por três

tipos de células: os melanócitos, responsável pela síntese do pigmento melanina, as células de

Langerhans, relacionadas com o sistema imune e as células de Merkel, tidas como mecano-

receptores para alguns autores e como secretoras de hormônios para outros autores

(ZELICKSON, 1967; LEVER & SCHAUMBURG-LEVER, 1975; SAMPAIO, 2000). São

reconhecidas quatro camadas distintas na epiderme (Figura 2a e 2b):

1 – camada germinativa ou basal: é a mais profunda das camadas da epiderme,

constituída por dois tipos de células, as células basais e os melanócitos. As células basais têm

forma cilíndrica e se dispõem com seu maior eixo perpendicular à linha formada pela junção

epiderme-derme. A camada basal é essencialmente germinativa, originando as demais

camadas da epiderme através de progressiva diferenciação celular. Por esse motivo, observa-

se, sempre nesta camada, intensa atividade mitótica. Abaixo da camada basal existe uma fina

estrutura constituída por mucopolissacarídeos neutros, a membrana basal.

2 - camada Malpighiana: é também chamada camada espinhosa ou corpo mucoso de

Malpighi. É formada pelas células escamosas ou espinhosas, que têm configuração poliédrica,

achatando-se progressivamente em direção à superfície.

3 – camada granulosa: é formada pelas células granulosas assim denominadas pela

presença de grânulos nessas células. Esses grânulos são de tamanho e forma irregulares e

compõem-se de queratohialina. São compostos de profilagrina, proteína que origina a

filagrina, e por citoqueratinas.

4 – camada córnea: é formada por células epidérmicas anucleadas, com membrana

celular espessa e cujo citoplasma corresponde a um sistema bifásico de filamento de

queratina, encerrado em uma matriz amorfa contínua, provavelmente composta por filagrina.

Figura 2: Epiderme e as suas divisões, (a) Representação esquemática; (b) Imagem obtida num microscópio

óptico, com aumento de 50x, de uma lamina histológica, corada com Tricrômio de Azan-Mallory.

Existe uma variação na espessura da epiderme, onde a camada córnea apresenta-se

mais evidente quando comparada a regiões de pele mais delgada como as mucosas. Em geral,

a epiderme apresenta-se mais espessa na palma da mão e planta do pé, onde atinge cerca de

1,5 mm.

Camada córnea

Camada granulosa

Camada espinhosa

Camada basal

(a)

(b)

4.1.2 A Derme

A derme é um tecido conjuntivo não modelado, sobre o qual se apóia a epiderme. Rico

em mucopolissacarídeos, substância fundamental e material fibrilar de três tipos: fibras

colágenas (95% do tecido conectivo da derme), fibras elásticas e fibras reticulares.

Com espessura variável ao longo do organismo (desde 1 mm até 3 mm), a derme

compõe-se de três porções: derme papilar, derme perianexial e derme reticular. A derme

papilar constitui uma camada fina de fibras colágenas, fibras elásticas, numerosos fibroblastos

e abundante substância fundamental, formando papilas dérmicas, que se amoldam aos cones

epiteliais da epiderme, aumentando a área de contato derme-epiderme trazendo, desta forma,

maior resistência à pele. A derme periaxial é estruturalmente idêntica à derme papilar,

dispondo-se, porém, em torno dos anexos. Compõe-se, juntamente com a derme papilar, a

unidade anatômica denominada derme adventicial. A derme reticular compreende o restante

da derme. É sua porção mais espessa, constituída por tecido conjuntivo denso, que se estende

até o subcutâneo. É composta por feixes colágenos mais espessos dispostos, em sua maior

parte, paralelamente à epiderme. Há, proporcionalmente, menor quantidade de fibroblastos e

de substância fundamental em relação à derme adventicial.

A substância fundamental é composta essencialmente por mucopolissacarídeos e

participa da resistência mecânica da pele às compressões e estiramentos.

Além de fibroblastos e das fibras supracitadas, encontram-se na derme, também,

células de defesa do organismo, como linfócitos, mastócitos, além de glândulas sudoríparas,

sebáceas, folículos pilosos, terminações nervosas livres, músculos eretores dos pelos e vasos

sanguíneos e linfáticos (LEVER & SCHAUMBURG-LEVER, 1975; ZELICKSON, 1967;

ODLAND, 1958; LEWIS, 1927).

4.1.3 Vascularização da Pele

Em relação à vascularização, raramente os vasos sanguíneos penetram no epitélio, de

modo que a nutrição é feita por difusão através do tecido conjuntivo, da membrana basal e de

um número variável de camadas celulares, para atingir as células mais superficiais dos

epitélios estratificados.

O sistema linfático, por outro lado, se constitui de vasos revestidos por uma única

camada de células endoteliais, dispostos em alças ao longo da derme papilar, reunindo-se em

um plexo linfático subpapilar que, através da derme, desemboca em um plexo linfático

profundo, de localização dermo-hipodérmica.

4.1.4 A Hipoderme

A hipoderme é denominada de tela subcutânea, formada por tecido conjuntivo frouxo

e une a derme aos órgãos subjacentes. Desta forma, a hipoderme se responsabiliza pelo

deslizamento da pele sobre as estruturas na qual se apóia. A espessura do tecido adiposo varia

de acordo com a região estudada e o grau de nutrição do organismo, constituindo o panículo

adiposo. Proporciona proteção contra choques mecânicos, proteção térmica e armazenamento

de energia através dos adipócitos (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; SAMPAIO, 2000).

4.1.5 O Tecido Conjuntivo

O tecido conjuntivo apresenta diversos tipos de células separadas por abundante

material extracelular sintetizado por elas. Sua estrutura é definida por duas partes: a matriz

extracelular, também conhecida como substância fundamental, e as fibras do tecido

conjuntivo. A matriz extracelular representa um gel viscoso de macromoléculas alongadas

(glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas adesivas) muito hidratadas, que formam

um arcabouço entrelaçado e ligado às fibras e a receptores celulares denominados integrinas;

as fibras do tecido conjuntivo são constituídas por proteínas que se polimerizam formando

estruturas alongadas e se dividem em três tipos principais: colágenas, reticulares e elásticas.

Como as fibras reticulares e colágenas são constituídas por proteínas da família dos

colágenos, passamos, então, a ter dois sistemas de fibras: sistema colágeno e o sistema

elástico.

O colágeno é a única proteína do organismo que mostra mudanças definidas conforme

a idade, uma mudança direta com o processo de envelhecimento (DEBESSA et al, 2001).

Essa proteína faz parte de um grupo que se diferencia durante a evolução para exercer funções

diversificadas, com graus variáveis de rigidez e de resistência às trações; é encontrado na

pele, ossos, cartilagem, músculo liso e lâmina basal.

Existem vários tipos de colágeno, produzidos por diversas células. O exemplo mais

comum de célula produtora de colágeno é o fibroblasto; distinguem-se pela composição

bioquímica, características morfológicas, distribuição, função e patologia.

As fibras elásticas são formadas pela proteína elastina e por microfibrilas de fibrilina.

São responsáveis pela elasticidade do tecido, prendendo a pele aos músculos subjacentes.

Encontram-se três tipos de fibras elásticas: as fibras oxitalânicas, as fibras elaunínicas

e as fibras elásticas maduras, sendo cada uma delas atuantes em fases distintas da

elastogênese (formação de fibras elásticas). As fibras oxitalânicas são as precursoras do

fenômeno da elastogênese, formadas por microfibrilas de fibrilina que são secretadas por

fibroblastos e que se dispõem paralelamente entre si. As fibras elaunínicas são fibras mais

espessas que as precedentes, resultando da junção de elastina às microfibrilas (SAMPAIO,

2000).

A elastina acumula-se, formando fibras mais espessas, que são as fibras elásticas

maduras. A quantidade dos três tipos de fibras varia nos diferentes tecidos e parece depender

da função e do processo de envelhecimento.

4.1.6 Fibroblastos

Trata-se da célula mais comum do tecido conjuntivo, e é responsável pela síntese das

fibras colágenas e elásticas, como também pelo material intercelular amorfo. A forma ativa do

fibroblasto apresenta prolongamentos citoplasmáticos irregulares; o seu núcleo tem uma

forma ovóide, e o seu citoplasma é basófilo devido à intensa atividade de síntese protéica. A

forma inativa chama-se fibrócito; é uma célula fusiforme de menor tamanho e com ínfimos

prolongamentos, com núcleo alongado e um citoplasma acidófilo. Na cicatrização, os

fibrócitos são estimulados pelas citocinas e assumem a forma ativa; eles se dividem por

mitose, e migram por quimiotaxia para a lesão, onde estimulam a síntese de colágeno,

substancia fundamental amorfa e citoquinas, a fim de formar o novo tecido, o tecido

conjuntivo fibroso característico da cicatriz.

As citocinas fazem partes dos fatores de crescimento que são essenciais para a

cicatrização. Outros fatores de crescimento são: o fator de crescimento epidérmico (FCE), o

fator de crescimento fibroblasto (FCF-

β e FCF-α), o fator de crescimento de insulina (FCI), o

fator de crescimento queratinócito (FCQ), o derivado de plaquetas (FCDP), o transformador

do crescimento (FTC-β, FTC-α) e o fator de crescimento vascular endotelial (FCVE).

O fator transformador do crescimento beta (FTC-β) é produzido por células

endoteliais, macrófagos, neutrófilos, plaquetas, linfócitos T e B. O FTC-β estimula células em

repouso e inibe células ativadas; sua ação pró-inflamatória inclui quimiotaxia para

macrófagos e fibroblastos. Além disso, o fator beta também possui ação angiogênica e

promove a proliferação de colágeno.

O fator transformador alfa (FTC-α) é um fator polipeptídico de crescimento para

células epiteliais e mesenquimais, sendo produzido por queratinócitos, macrófagos e

plaquetas. O fator de crescimento epidérmico (FCE) é um polipeptídio que estimula a

proliferação de células epidérmicas, fibroblastos e células endoteliais.

A ativação do fibroblasto se faz por fatores de crescimento derivados de plaqueta

(FCDP), fator de crescimento fibroblástico (FCF), interleucinas 1 (IL-1), fator de necrose

tumoral alfa (FNT-α) e fator beta transformador do crescimento (FTC-β) (ROCHA; 2004).

4.1.7 Fibras Colágenas

As fibras colágenas são proteínas fibrosas insolúveis, de função estrutural, encontradas

na matriz extracelular. São as mais freqüentes em todo o corpo. Os colágenos podem ser

classificados em diferentes grupos, segundo a seqüência de aminoácidos.

Bioquimicamente, o colágeno é uma glicoproteína composta por três cadeias

polipeptídicas em conformação de tríplice hélice, constituídas pelos aminoácidos glicina

(Gly), alanina (Ala), lisina (Lys), prolina (Pro), hidroxilisina (Hyp) e hidroxiprolina (VOET,

2000). Cada cadeia helicoidal é composta por uma tripla seqüência repetitiva de Gly - X- Y,

onde X e Y pode ser qualquer aminoácido (LINGENMAYER, 1985), mas freqüentemente X

é prolina e Y é hidroxiprolina (van der REST & GARRONE, 1991; LINSENMAYER, 1985).

As moléculas de colágeno são glicosiladas, e a glicosilação ocorre nos resíduos de

hidroxilisina (HAY, 1991).

A reação prolilhidroxilase transforma a prolina em hidroxiprolina, que passa a ser um

aminoácido exclusivo do colágeno. A hidroxiprolina está presente em concentrações elevadas

no colágeno, sendo indispensável para a estabilidade da tríplice hélice da proteína

(FORREST, 1983). Estas propriedades permitem a quantificação do conteúdo de colágeno em

uma amostra tecidual a partir da dosagem da concentração de hidroxiprolina. A dosagem do

conteúdo do colágeno reflete apenas a concentração desta proteína no tecido, sem fornecer

informações acerca da qualidade do colágeno analisado.

A unidade protéica que se polimeriza para formar fibrilas colágenas é denominada

tropocolágeno, que mede cerca de 280 nm de comprimento por 1,5 nm de espessura. A

molécula de tropocolágeno é formada pelas três cadeias polipeptídicas, citadas no parágrafo

anterior, dispostas em hélice. É a diferença na estrutura química dessas cadeias que dá origem

aos diversos tipos de colágeno (Figura 3).

Dos fatores que podem influenciar na produção do colágeno, temos:

• A deficiência de vitamina C, ou ácido ascórbico, que atua na regulação da formação

de colágeno e de substância intercelular normal do tecido conjuntivo (Fenske, 1986;

Yaar & Gilchrest, 1990), o que leva a deficiência na síntese de colágeno;

• A deficiência de oxigênio. Para a síntese de colágeno pelos fibroblastos, bem como

para concretizar a mitose dessas células e sua efetiva migração, é necessário uma

Figura 3: Estrutura em tripla hélice, mostrando a conformação das cadeias do colágeno. Adaptado de:

http://www.thenewmath.com/wp-content/uploads/collagen-enlarged.jpg. Acesso: 03/03/2008.

Aminoácidos

~1 nm

Tropocolágeno

~300

Fibrila

~1 µm

Fibra

~10 µm

tensão tissular de oxigênio de 30 a 40 mmHg. Desta forma, a hiperóxia permite a

estimulação da atividade fibroblástica no tecido isquêmico, com conseqüente

desenvolvimento da matriz de colágeno, como realizado nos tratamentos com câmera

hiperbárica, São requeridos níveis mínimos de oxigênio para que a síntese de

colágeno seja viável e eficiente.

• A participação ineficiente do fator de crescimento local, a interferência na ativação da

colagenase, a interferência no fluxo de íons sódio e cálcio nos fibroblastos e as

alterações hormonais.

A biossíntese do colágeno pode ser dividida em duas etapas, a intrafibroblástica e a

extrafibroblástica. Na intrafibroblástica, ou seja, dentro do fibroblasto, no retículo

endoplasmático rugoso, ocorre a síntese de cadeias polipeptídicas, como a união por ligação

das cadeias por pontes de hidrogênio e por ligação tipo van der Walls dos aminoácidos glicina

com prolina e hidroxiprolina ou com lisina e hidroxilisina. O pro - colágeno sofre a ação da

enzima pro - colágeno peptidase transformando-se em tropocolágeno.

Na etapa extrafibroblástica ocorre o alinhamento das moléculas de tropocolágeno e

atração das extremidades formando as cadeias entrelaçadas em tripla hélice (Figura 4). Essa

polimerização é dependente do equilíbrio eletrolítico da substância fundamental amorfa, e

produz um arranjo regular e paralelo das moléculas regulares, o que as torna muito resistente

às proteases.

Figura 4: Estrutura em tripla hélice do colágeno. a) imagem de duas fibrilas de colágeno, adquirida em

microscopia de força atômica. b) ilustração da tripla hélice do colágeno. Extraído de:

http://www.eastman.ucl.ac.uk/staff/academic/bozecl/pic1.jpg, acesso em 02/09/2008 (a) e L. Stryer, Bioquímica

– 4ª edição, desenhado de coordenadas relatadas por K. Okuyama, K. Okuyama, S. Arnott, M. Takayanagi e M.

Kakudo. J. Mol. Biol. 152 (1981): 427 (b).

O papel atribuído ao colágeno é estrutural, mas também está envolvido direta ou

indiretamente em processos de adesão e diferenciação celular, como agente quimiotático para

macrófagos e fibroblastos e como antígeno nos processos imunológicos (LINSENMAYER,

1985).

Atualmente são conhecidos vinte e quatro tipos de colágenos, sendo que a diferença

entre eles reside na composição de aminoácidos, nos domínios de cada molécula e nos

diferentes arranjos estruturais (van der REST & GARRONE, 1991). Na Tabela 1, são

mostrados alguns dos tipos de colágenos, com as respectivas localizações.

Tabela 1: Principais tipos de colágeno, com a localização e a função.

Tipo Localização Função

Pele, tendão, osso, dentina Resistência à tensão

II Cartilagem, corpo vítreo Resistência à pressão

III

Pele, músculo, vasos observado junto

com o tipo I

Manutenção da estrutura

de órgãos expansíveis

V Tecidos fetais, pele, osso, placenta

Participa na função do

tipo I

IX Cartilagem

Participa na função do

tipo II

No estudo da cicatrização da pele, em geral, investiga-se principalmente os tipos

colágenos I e III, que apresentam as moléculas de tropocolágeno agregadas em unidades

microfibrilares que se juntam para formar fibrila. Essas estruturas são unidas por pontes de

hidrogênio, interações hidrofóbicas e ligações covalentes. Quando ocorre uma lesão do tecido,

as fibras do tipo III são predominantes na fase de granulação e sofrem remodelagem, sendo

substituídas pelas fibras do tipo I em longo prazo, no tecido fibroso cicatricial. As fibras de

colágeno na derme reticular se apresentam entrelaçadas, e são constituídas por 90% do tipo I,

e 10% do tipo III, no tecido de pele sadia.

Nas Figuras 5a e 5b, são mostradas a título ilustrativo as imagens do colágeno dos

tipos I e III, respectivamente. Essas imagens foram obtidas mediante um microscópio óptico

com luz polarizada, que possibilita a discriminação entre esses dois tipos de colágeno numa

lâmina histológica corada com picrosirius Red. Em decorrência das propriedades de

birrefringência do colágeno, colorações distintas podem ser observadas para os tipos I e III,

sendo avermelhada-laranjada e esverdeada, respectivamente. Além disso, o tipo I tem um

tamanho maior que o tipo III, como mostra as figuras 5a e 5b.

(a) (b)

Figura 5: Imagens, obtidas num microscópio óptico com luz polarizada, do colágeno da derme corado com

picrosirius red. a) as fibras vermelhas correspondem ao colágeno de tipo I; b) as pequenas fibras verdes são as

fibras de colágeno tipo III.

Baranauskas, Vidal e Parizotto (1998) estudaram o colágeno através de microscopia de

força atômica e observaram que a molécula do colágeno sofre um auto arranjo que é

influenciado por forças físico-químicas que, por sua vez, influenciam na ordenação e

organização padrão das fibras no processo estrutural.

As fibras colágenas são estruturas delgadas e alongadas, com diâmetro variável (entre

20 e 90 nm), com estriações transversais características. No colágeno tipo I e III as fibrilas

formam fibras e, no tipo I, as fibras podem formar feixes.

A seguir é descrito, com maior detalhe, os tipos I e III de colágeno.

4.1.7.1 Colágeno Tipo I

O colágeno do tipo I forma fibras espessas que se dispõem em rede ortogonal na

derme reticular. É composto por fibras mecanicamente estáveis, que apresentam periodicidade

de 68 nm e representa 80 a 90% do colágeno da derme (SAMPAIO, 2000).

Essas fibras são birrefringentes por ter em sua composição moléculas alongadas e

paralelas. Desta forma, quando examinadas ao microscópio óptico, entre polarizadores

cruzados, essas fibras aparecem brilhantes, contra um fundo escuro, em feixes longos de

trajetos tortuosos, de cor aproximada ao vermelho.

4.1.7.2 Colágeno tipo III

O colágeno tipo III corresponde 8 a 12% do colágeno da derme e compõe-se de

fibrilas de menor diâmetro, comparativamente ao colágeno tipo I. Os feixes formados pelo

colágeno tipo III dispõe-se por toda derme, concentrando em áreas de contato com outras

estruturas, como os vasos sanguíneos. As fibras reticulares são constituídas principalmente

por colágeno tipo III.

Assim como o colágeno tipo I, o tipo III mostra birrefringência quando observado em

microscópio óptico com luz polarizada. Desta forma, usando lâminas histológicas coradas

com picrosirius red, as fibras colágenas do tipo III mostram-se, ao microscópio óptico com

luz polarizada, amarelo-esverdeadas, menos alongadas que as fibras do tipo I.

4.2 OBSERVAÇÃO DO COLÁGENO NO MICROSCÓPIO COM LUZ POLARIZADA

A análise da densidade de fibras de colágeno durante o processo de cicatrização foi feita

por microscopia de luz polarizada. As fibras de colágeno apresentam uma propriedade

conhecida como anisotropia óptica ou birrefringência. Este material biológico faz parte dos

materiais que exibem comportamentos que dependem fortemente do estado de polarização da

luz incidente. Nesses materiais, as propriedades ópticas não são as mesmas em todas as

direções da amostra. A organização das fibras introduz certa assimetria espacial que implica

na presença de dois índices de refração: extraordinário (n

) e ordinário (n

), definidos na

direção paralela e perpendicular ao eixo da fibra, respectivamente. Esta característica é

fundamental para distinguir, mediante a propagação de um feixe de luz polarizada, as fibras

de colágeno do resto do tecido conjuntivo, que é considerado como substância amorfa ou

isotrópica, que apresenta um único índice de refração.

A birrefringência (∆n) das fibras de colágeno é expressa pela diferença dos dois índices

de refração, ou seja:

nnn −=∆

Quando o tecido biológico está inserido entre dois polarizadores cruzados (com as

direções de polarização perpendiculares entre si), é possível distinguir as regiões amorfas das

regiões anisotrópicas pela passagem de um feixe de luz. Se a observação é feita num

microscópio óptico, pode-se determinar também a direção de orientação das fibras de

colágeno numa escala microscópica (em pequenos domínios).

Após passagem pelo primeiro polarizador, o campo elétrico do feixe de luz (onda

eletromagnética transversal) oscila na direção imposta pelo polarizador. Quando este feixe de

luz polarizada atravessa um meio isotrópico, ocorre uma refração do feixe e ao emergir do

segundo polarizador (denominado analisador e orientado a 90º em relação ao primeiro), a

amostra aprece escura. Enquanto, se o meio for anisotrópico, como no caso das fibras de

colágeno ocorre o fenômeno de dupla refração, quando a direção de orientação das fibras é

diferente da dos dois polarizadores. Ressalta-se que se o feixe penetra com a direção da

polarização paralela à direção das fibras, ocorre uma simples refração, como num meio

isotrópico, ou seja, o feixe se propaga com uma única velocidade, e as fibras aparecem

escuras, o que possibilita a determinação da direção dessas fibras.

A dupla refração é uma propriedade intrínseca dos meios birrefringentes. Num material

birrefringente, a luz polarizada se propaga em dois caminhos ópticos distintos, sendo um na

direção do raio ordinário e outro na direção do raio extraordinário, com velocidades

diferentes. Essa diferença de caminho óptico ou retardo óptico (Γ) depende da birrefringência

(∆n) e da espessura (d) do meio, como mostra a expressão seguinte:

(

)

nndn

−

∆

O retardo óptico faz com que o material apresente um brilho característico, cuja

intensidade é máxima quando o eixo óptico (eixo principal das fibras) é orientado a 45º em

relação aos dois polarizadores (VIDAL, 1987; VIDAL & CARVALHO, 1990).

Segundo Pimentel (1981), quando nos encontramos frente a diferentes processos

fisiológicos, podemos conseguir maiores informações a cerca dos aspectos de birrefringência

da molécula de colágeno. Um exemplo disto seria o processo fisiológico de reparo tecidual.

4.3 O REPARO TECIDUAL DA PELE

O minucioso processo de reparo tecidual ocorre para que seja retomada a estrutura

anatômica e funcional da pele depois de submetida a uma lesão. As fases do reparo devem

acontecer de maneira eficaz e ordenada, a fim de evitar complicações como, por exemplo, a

produção exacerbada de colágeno que leva a formação de cicatriz hipertrófica.

Segundo Majno & Joris (1996), o que caracteriza o processo cicatricial é o

preenchimento de um espaço que tem como resultado a formação de uma cicatriz. No entanto,

esse quadro pode ser alterado, por exemplo, pela presença ou ausência de bactéria, tipo de

ferida (fechada ou aberta), situação de suprimento sanguíneo e o tipo de tecido lesado. É

importante salientar que a presença de isquemia, a deficiência de oxigenação no tecido e o

aporte de fatores angiogênicos de crescimento influenciam diretamente no resultado final na

da cicatriz (McKINNEY & CUNNINGHAM, 1989).

Hess (2002) classifica a cicatrização por primeira, segunda e terceira intenção. Na

cicatrização por primeira intenção ocorre aproximação das bordas e epitelização rápida, como

nas feridas cirúrgicas suturadas. Já a cicatrização por segunda intenção ocorre sem

aproximação das bordas, como feridas crônicas, abertas ou inflamadas que não podem ser

suturadas. E a cicatrização por terceira intenção é referida por alguns autores como uma

cicatrização de primeira intenção tardia.

O evento da reparação do tecido pode ser dividido em três fases distintas, porém

sobrepostas: a fase inflamatória, a formação do tecido de granulação e a remodelação tecidual

(ROBBINS, 1996). A figura 6 mostra um esquema das fases de cicatrização em função do

tempo.

Figura 6: Fases da cicatrização em relação ao tempo (dias).

4.3.1 Fase inflamatória

Ao ser submetido a uma lesão de qualquer natureza, o organismo responde com a

inflamação. Ocorrendo a ruptura de vasos sanguíneos, há um extravasamento de sangue (ou

apenas de plasma) para as áreas circunjacentes, o que impede maior perda sanguínea.

Imediatamente, a partir daí, ocorre contração dos vasos lesados, o que leva a uma aderência e

agregação das plaquetas no local lesionado, ativando, então, a cascata de coagulação. O

resultado final desse processo é a formação do trombo, que tem por objetivo limitar a perda

sanguínea subseqüente e fornecer uma matriz preliminar que será a base para o posterior

reparo do tecido.

As plaquetas extravasadas aderem ao colágeno no espaço perivascular, usando

receptores na membrana celular plaquetária específicos para proteínas de matriz extracelular.

O contato com o colágeno fibrilar ativa as plaquetas e, assim, ocorre a indução das

proteínas adesivas IIb/IIIa, específicas da membrana plaquetária e da integrina β. As plaquetas

liberam o conteúdo de seus grânulos, que contém fibrinogênio, fibronectina, fator Von

Willebrand e trombospondina, assim que se tenham ligado ao colágeno ou a outras proteínas

de matriz extracelular. As moléculas adicionais da matriz celular se juntam à massa agregada

de plaquetas e fibrina, interagindo com as moléculas de adesão das plaquetas, através da ação

da glicoproteína plaquetária IIb/IIIa. As interações estabilizam e fortalecem a nova matriz

provisória. O gel extravascular que ocupa provisoriamente a cavidade criada pela ferida

inicial é composto de material proveniente do sangue e por uma matriz extracelular fraca,

formada por fibrinogênio, fibronectina e fator Von Willebrand.

A reação inflamatória aguda é estimulada pela ativação do fator de Hageman, uma

molécula do sistema de coagulação derivada do plasma, que inicia o sistema de cininas, para a

geração das bradicininas, um peptídeo ativo, que induz a produção de metabólitos

aracdônicos, que são potentes moléculas pró-inflamatórias. A bradicinina foi descoberta pelo

farmacologista brasileiro Maurício Rocha da Silva, na década de 60, ao observar que um tipo

de cininas, formado pelo metabolismo de peptídeos endógenos e degradadas por cininases,

produzia inibição da contração da musculatura intestinal. Por esta razão, em 1962, este grupo

de cininas, foi denominado de bradicininas, ou seja, bradi em alusão a ação relaxante da

musculatura intestinal. Mais tarde descobriu-se que a bradicinina estava envolvida em outros

processos fisiológicos e patológicos, como a inflamação.

O sistema fibrinolítico, que degrada a fibrina, é composto por agentes quimiotáticos

para neutrófilos; os componentes do sistema complemento clivados também participam da

indução primária da inflamação, por meio de anafilatoxinas, que desagregam os mastócitos e

fornecem importantes substancias quimiotáticas para os leucócitos (BRASILEIRO-FILHO,

2000).

Neutrófilos e macrófagos respondem rapidamente a essa nova e abundante fonte de

agentes quimiotáticos e estímulos ativadores. A matriz extracelular recém-formada também

proporciona um substrato para a subseqüente migração dos leucócitos. Os neutrófilos são os

primeiros leucócitos a chegar ao local da lesão e sua função é fagocitar e matar qualquer

bactéria presente na região (VENGE, 1993).

Em contraste, como papel desempenhado pelos neutrófilos nos processos de reparo, o

subseqüente influxo de macrófagos até a área da lesão é, isoladamente, o elemento mais

crítico na indução dos mecanismos de reparo.

Macrófagos derivados de monócitos começam a acumular entre 2 e 5 dias após a

lesão, sendo suas funções ajudar os neutrófilos na fagocitose de microorganismos e remover

os neutrófilos inativos. Alem disso, vale ressaltar que os macrófagos liberam diversos fatores

de crescimento e citocinas, relevantes na manutenção da reação inflamatória e na iniciação do

processo de cura da ferida (THOMAS & LIPSKY, 1996).

Os sinais responsáveis pela produção de fatores de crescimento pelos macrófagos para

o reparo tecidual são exclusivamente governados pelo microambiente local. Com o

comprometimento da microvasculatura no local lesado, e com a formação de um trombo

avascular, o tecido situado no centro da ferida fica relativamente isquêmico. A presença de

neutrófilos e macrófagos ativados nessa área aumentam a demanda metabólica pelo oxigênio.

Como conseqüência, a disponibilidade de oxigênio reduz e, assim, o pH diminui no espaço da

lesão (ROBBINS, 1996).

Essa combinação de hipóxia, acidez e concentração de lactato ativa os macrófagos da

ferida para enviar sinais quimiotáticos, que se manifestam pela elaboração de fatores de

crescimento. Os fatores de crescimento derivados do macrófago são coletivamente

responsáveis pela seqüência de alterações que caracterizam a fase seguinte do reparo da

ferida.

A angiogênese é um processo que pode ser creditado aos macrófagos que migram ao

interior da ferida tornando-se anóxicos, o que estimula o crescimento dos capilares.

4.3.2 Fase de formação do tecido de granulação com depósito de matriz extracelular.

Com a ativação de macrófagos na ferida e com a síntese de fatores de crescimento

específicos, a matriz extracelular começa a ser substituída por um tecido conjuntivo mais forte

e mais elástico.

O colágeno é o principal componente da cicatriz de tecido conjuntivo maduro. Na

ferida em processo de cura, fibroblastos são recrutados das margens da ferida e induzidos a

sintetizar o colágeno, num processo conhecido como fibroplasia. Ocorre uma

neovascularização concorrentemente com fibroplasia, de modo que novos capilares brotam

dos tecidos viáveis na borda da ferida, migrando até esta região. A contração da ferida faz

com que suas margens se aproximem e, se o tecido original estava revestido por uma

superfície epitelial, a reepitelização começa a cobri-la (SAMPAIO, 2000).

O tecido de granulação é um leito denso de macrófagos, fibroblastos e vasos

neoformados, suportados por uma matriz de fibronectina, composta de colágeno, além de

ácido hialurônico (GUIDUGLI-NETO, 1992).

Segundo Guidugli-Neto (1987), o tecido de granulação começa a ser formado por

volta do quarto dia após a lesão e, nesta etapa, os novos fibroblastos acumulados misturam-se

a neoformações de capilares, dando início ao tecido de granulação.

Os fibroblastos, principais componentes do tecido de granulação, são células fibrilares

alongadas que contêm núcleos hipercromáticos e ovóides. Os novos capilares formam fileiras

paralelas, perpendiculares à superfície da ferida. O tecido é edematoso e caracteriza-se por

muitos espaços vazios, em decorrência dos novos capilares, que tende a exsudar fluidos.

Quando observadas a olho nu, as superfícies da ferida parecem conter muitos grânulos

vermelhos que, na verdade, são as extremidades das alças dos novos capilares, que avançam

perpendicularmente em relação à superfície. Tipicamente o tecido tem uma cor vermelho-

escura e sangra com facilidade (ROBBINS, 1996).

A matriz extracelular, formada por constituintes plasmáticos, plaquetas, macrófagos e

fibroblastos, proporciona um meio para a aderência, migração e orientação das células que

irão formar o tecido de granulação em desenvolvimento.

Com o crescimento dos fibroblastos a partir das margens da ferida, ocorre

simultaneamente angiogênese. Tal crescimento é mediado principalmente pelos macrófagos.

As células endoteliais no interior dos capilares intactos nas margens da ferida irrompem

através da membrana basal da parede vascular, mediante a secreção de colagenase e do

ativador do plasminogênio. Em seguida, essas células migram na direção do espaço ocupado

pela ferida, utilizando como substrato a matriz extracelular ali presente. Essas células

migratórias diferenciam-se para formar novos tubos capilares, do que resulta que a maior

parte da neovascularização ocorrente na ferida é secundária a diferenciação das células

endoteliais migratórias (BRASILEIRO-FILHO, 2000).

Em geral, a proliferação das células endoteliais ocorre apenas no vaso genitor, para a

devida substituição das células que migraram. O broto capilar une-se ao capilar genitor, para

que se estabeleça o fluxo sangüíneo. Nesse estágio, a neovascularização é fundamental para

que ocorra a troca de gases e a nutrição das células metabolicamente ativas (ECKERSLEY &

DUDLEY, 1988).

A fibronectina juntamente com o ácido hialurônico são os componentes predominantes

da matriz durante as primeiras fases do reparo de uma ferida. A medida que ocorre a

cicatrização da ferida, há redução da concentração do ácido hialurônico e aumento da

concentração dos proteoglicanos ou glicosaminoglicanos sulfatados. Essa alteração na

composição dos proteoglicanos favorece a fixação das células. Com a diminuição do

movimento, as células se diferenciam em fenótipos mais maduros. As células endoteliais

maturam e resultam em capilares funcionais para as células de revestimento e os fibroblastos

dão início à formação do colágeno. Com a maturação do processo de cicatrização da ferida, os

proteoglicanos e a fibronectina são cada vez mais substituídos pelo colágeno, o principal

componente estrutural da cicatriz (LINGENMAYER, 1985).

O colágeno é a proteína mais comumente encontrada em animais, e sua produção

envolve diversos eventos pró-translacionais. Cada molécula de colágeno compõe-se de três

cadeias polipeptídicas enroladas uma as outras, em forma de hélice, manufaturadas nos

ribossomas dos fibroblastos. Após a formação da hélice, as moléculas passam a ser

conhecidas como tropocolágeno. Uma vez fora da célula, a molécula de tropocolágeno é

clivada de seus domínios não helicais terminais por procolágeno-peptidases específicas, sendo

então designada tropocolágeno. Sem os domínios não helicais terminais, essas moléculas

podem polimerizar, formando fibrilas que comporão as fibras de colágeno, ou seja, a coluna

estrutural do colágeno maduro. Os tipos de I a III de colágeno são fibrilares, os tipos IV e V

não sofrem clivagem proteolítica dos domínios terminais do procolágeno, que impedem a

polimerização para formação de fibrilas (VOET, 2002).

Ao mesmo tempo em que ocorre a síntese de colágeno há diferenciação de alguns

fibroblastos em células contráteis chamadas miofibroblastos, que apresentam contração

similar às células do músculo liso. Essa contração é garantida por dois mecanismos distintos,

sendo o primeiro em conseqüência do ressecamento da crosta que se dá nos primeiros dias e o

segundo pela ação dos miofibroblastos. (GABBIANI et al, 1970).

Em relação aos miofibroblastos, Majno e Joris (1996) relataram que são células

intermediárias entre fibroblastos e células musculares lisas e que há seguramente um

alinhamento dos miofibroblastos ao longo dos novos depósitos de matriz extracelular,

formando união de célula a célula, gerando forças de tensão que produzem a contração da

ferida.

Nesta fase, o leito da ferida está preenchido com tecido de granulação, sendo

atravessado por uma rede de capilares neoformados, e a rede linfática começa a regenerar.

Lentamente o tecido de granulação adquire mais fibras colágenas e começa a ter aparência de

cicatriz, por causa do acúmulo de massa fibrosa (GUIDUGLI-NETO, 1987).

4.3.3 Fase de maturação e remodelagem da matriz extracelular

A cura de uma ferida tem por final a fase de maturação e remodelagem da matriz

extracelular. É durante essa fase que a cicatriz adquire sua máxima resistência tênsil, mas esse

processo é consideravelmente lento, variando de meses até anos. Ainda assim, uma cicatriz

cutânea matura tem apenas 70% da resistência da pele normal (ROBBINS, 1996).

Essa resistência se deve ao acúmulo de colágeno e, com menor influência, mas não

menos importante, à remodelagem das fibras de colágeno, de modo que sejam formados

feixes maiores dessas proteínas, com maior número de ligações covalentes transversais entre

as fibrilas.

A remodelagem da cicatriz envolve a contínua produção, digestão, agregação e

orientação das fibras de colágeno. É mantido um equilíbrio entre a síntese e a degradação de

colágeno realizada pela enzima colagenase, de modo que, mesmo com uma produção elevada

de colágeno na cicatriz, não ocorra fibrose. O depósito de colágeno acontece, a princípio, de

forma desordenada, o que deixa a cicatriz pouco resistente à força tênsil. A medida que ocorre

a remodelagem, as fibras ficam orientadas paralelamente às forças aplicadas sobre a cicatriz.

Gradativamente os feixes de fibras colágenas tornam-se mais espessos, resultando em uma

configuração mais regular, que está diretamente relacionada a forças mecânicas a qual o

tecido está sujeito durante a atividade normal. Desta forma, a cicatriz adquire resistência tênsil

e, portanto, integridade funcional (LINGENMAYER, 1985).

Para que ocorra a cura de uma ferida, existe uma complexa interação de células,

fatores de crescimento, componentes da matriz extracelular e oxigênio, existindo, entre esses

componentes, relações dinâmicas e freqüentemente recíprocas. Qualquer debilidade em algum

desses componentes é determinante para um processo de formação cicatricial deficiente.

Os anexos da pele, como os folículos pilosos e as glândulas, sofrem uma regeneração

limitada. A coloração da cicatriz é pálida, o que se relaciona com a regeneração deficitária dos

melanócitos.

5 CONTEXTUALIZAÇÃO

5.1 SUBSTÂNCIAS CICATRIZANTES

As substâncias utilizadas para o tratamento de feridas agem reduzindo o efeito

inflamatório, inibindo dor e edema, prevenindo infecções ou, quando necessário, tratando as

infecções. Além disso, têm ação profilática e no tratamento de cicatrizes patológicas, como as

cicatrizes queloideanas e as hipertróficas.

Alguns estudos observaram o efeito do uso tópico da heparina em alterações cutâneas

inflamatórias e edematosas. A heparina se infiltra via transdérmica no tecido conjuntivo,

exercendo ação antiflogística, antiedematosa e regeneradora de células e tecidos. Fixa-se à

superfície do colágeno, inibindo a progressão de sua polimerização (HEINE, 1983, 1989).

A alantoína, produto final do metabolismo das purinas, vem sendo utilizada por suas

propriedades cicatrizantes mesmo antes de ter sido comprovadas experimentalmente suas

propriedades queratolínicas, hidratantes e epitelizantes. A queratólise branda atua na

cicatrização com retenção de umidade, o que torna a superfície cutânea mais lisa e, com isso,

favorece uma maior elasticidade da cicatriz (FIEDLER, 1985; HEINE, 1983, 1989).

No Brasil, são utilizados diversos produtos para o tratamento de feridas em seres

humanos. Dentre eles:

• Os ácidos graxos essenciais (AGE), que podem ser categorizados em

subgrupos - derivados do ácido linoléico (Dersani

, Ativoderm

, AGE

Derm

), e derivados do ácido ricinoléico (Hig Med

) – promovem a

quimiotaxia e a angiogênese, além de manter o leito da ferida úmido e acelerar

o processo de granulação tecidual (HAMÚ et al, 1999; MANDELBAUM et al,

2003);

• O digluconato de clorexidina (clorexidina), que exerce atividade germicida,

destruindo a membrana plasmática das bactérias;

• A colagenase clostridiopeptidase A é uma enzima proteolítica (Colagenase

Iruxol

, Iruxol-mono

, Kollagenase

, Santyl

), atuante na degradação do

colágeno nativo da ferida (JORGE & DANTAS, 2003; IRON, 2005);

• A associação de fibrinolisina, desoxirribonuclease e cloranfenicol (Fibrase

que consiste em uma pomada de origem bovina, favorece o desbridamento pela

ação lítica da fibrinolisina sobre a fibrina e da desoxirribonuclease sobre o

ácido desoxirribonucléico, além de apresentar ação anti-bacteriana pelo

cloranfenicol (JORGE & DANTAS, 2003);

• O Dermagraft, que consiste em um substituto de derme humana (Dermagraft

Dermagraft-TC

, TransCyte

) criopreservado, derivado de fibroblastos do

tecido de prepúcio de neonatos, cultivados in vitro em uma lâmina de

polyglactin bio-absorvível. É composto, portanto, de fibroblastos, matrix

extracelular e lâminas bio-absorvível. Durante o processo de fabricação, os

fibroblastos são semeados dentro das lâminas de polyglactin; a partir daí,

proliferam-se para preencher os intertícios e secretam colágeno dérmico

humano, matriz protéica, fatores de crescimento e citoquinas para criar um

substituto de pele humana tri-dimensional contendo células vivas,

metabolicamente ativas. Embora os mecanismos precisos pelo qual esse tecido

afeta a cicatrização ainda não sejam bem conhecidos, acredita-se que os

componentes da matriz dérmica e citiquinas, produzidas pelos fibroblastos,

podem promover um estímulo para a rápida e completa cicatrização

(GENTZKOW, 1996; HANSBROUGH, 1997; PARENTE, 1997; PURDUE,

1997; SPIEVOLGEL, 1997);

• A matriz de queratinócitos composta por matriz bilaminar de colágeno bovino

(C.C.S

, Composite

cultured skin). A matriz superficial é constituída de

colágeno e queratinócitos, enquanto a matriz profunda é constituída de

colágeno e fibroblastos. Possuem queratinócitos geneticamente modificados,

capazes de produzir fatores de crescimento. Atuam na produção ou liberação

de fatores de crescimento, favorecendo a cicatrização de feridas (GOMEZ &

PALAO & DOMÉNECH, 2002).

O número de publicações científicas, tanto nacionais quanto internacionais,

envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais, cresceu

consideravelmente nos últimos anos, com a finalidade de obter novos compostos com

propriedades terapêuticas. A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de

alguns de seus constituintes, tais como flavanóides, alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos,

taninos, lignanas, entre outros, é de grande relevância devido ao potencial farmacológico /

toxicológico destas substâncias (HAVSTEEN, 1983; SAMUELSSON, 1992).

A pesquisa com fitoterápicos é estimulada desde a década de 70 pela OMS, com o

objetivo de compreender efetivamente a atividade das plantas medicinais, visando a

elucidação de seus potenciais terapêuticos por meio da caracterização de seu mecanismo de

ação e investigação de parâmetros clínicos, como posologia e dosagem, para uma possível

utilização de forma mais eficiente, sem oferecer riscos (YUNES & CALIXTO, 2001).

O cepalin (Extractum cepae) é um exemplo de fitoterápico que pode ser usado para

múltiplas atividades terapêuticas. A identificação de seu mecanismo é muito difícil em razão

da multiplicidade das substâncias contidas nos extratos de vegetais, sendo seu efeito

terapêutico atribuído à ação conjunta dos diversos componentes. Seus efeitos mais relevantes

são antiinflamatório, antialérgico, antiproliferativo, antimitótico, inibição da quimiotaxia de

fibroblastos, redução de componentes matriciais extracelulares, como os proteoglicanos e o

colágeno e efeitos antimicrobianos. Os efeitos antiinflamatórios e antimicrobianos previnem

distúrbios da cicatrização e assim promovem a cicatrização fisiológica. A inibição da

proliferação excessiva de fibroblastos e da liberação de componentes matriciais extracelulares

combate à formação excessiva do tecido cicatricial, ou seja, a cicatriz hipertrófica (BREU &

DORSCH, 1994; MAJEWSKI & CHDZYNSKA, 1987; AVUSO & SAENZ, 1985;

WEISMANN, 1991).

5.2 NIM (Azadirachta indica)

O Nim (Azadirachta indica A. Juss), também conhecido como “neem” nos países de

língua inglesa, é uma árvore milenar, nativa da Índia, utilizada há séculos no oriente como:

planta medicinal, repelente, material para construção, combustível, lubrificante, adubo e mais

recentemente como praguicida (MARTINEZ, 2002; SCHMUTTERER, 1990). Pertence à

família Meliaceae e pode atingir 30 m de altura e perdurar por até 200 anos. A árvore de nim

cresce em solos secos, pobres e até mesmo bastante ácidos. A figura 7 mostra os frutos da

árvore de nim.

Figura 7: Frutos da árvore do nim. (Fonte: IAPAR)

A árvore possui mais de 135 compostos isolados e divididos em duas classes

principais: isoprenóides e outros. Os isoprenóides incluem diterpenóides e triterpenóides

(nimbin, salanin e azadiractina). Os compostos não-isoprenóides incluem proteínas,

carboidratos, compostos sulfuroses, polifenólicos (flavanóides), cumarinas e taninos,

compostos alifáticos, dentre outros (BISWAS et al, 2002). A azadiractina, extraído da

semente de nim, é o único composto comercialmente explorado, sendo empregado como

inseticidas, por possuir atividade fagoinibidora, ocasionando mortalidade e bloqueando a

metamorfose de insetos (PURI, 1999). Sua fórmula molecular é expressa por C

tendo massa molecular de 720,7 g/mol. A figura 8 mostra a fórmula estrutural da azadiractina.

Nimbin e salanin são dois triterpenóides identificados e isolados de nim, porém não muito

conhecidos. O interesse nesses triterpenóides deve-se à sua ocorrência substancial na planta,

além de serem relativamente estáveis e terem potencial para melhorar as propriedades dos

pesticidas.

Salanin (C

), extraída do óleo de nim, apresenta forte efeito pesticida

(MEISNER et al., 1981; REED et al., 1982; KUBO & KLOCKE, 1986). Em 1986, Kraus

observou que sua bio-atividade é comparável à da azadiractina. Enquanto nimbin (C

outro princípio amargo isolado do óleo de nim, demonstra ter efeito anti-inflamatório,

antipirético (OKPANYI & EZEUKWU, 1981), anti-reumático (PILLAI &

SANTHAKUMARI, 1981).

Em estudos realizados com óleo essencial de sementes da A. indica, isolado através da

hidrodestilação das amostras, Kurose e Yatagai (2005) observaram que dentre os

componentes do óleo da semente de nim, os que aparecem em maior evidência são ácidos

graxos (ácido hexadecanóico – 34,0%), com menor expressão de ácido oléico (15,7%). Ainda

no mesmo estudo, é relatada a presença de compostos nitrogenados no óleo da semente de

nim, com grande quantidade de 5,6–dihidro–2,4,6-trietil-(4H)-1,3,5-ditiazina.

Existe incentivo por parte da OMS em desenvolvimento de pesquisas voltadas à

compreensão dos mecanismos de ação, efeitos e toxicidade dos fitoterápicos no organismo, a

fim de obter formas alternativas de tratamento de distúrbios do organismo, bem como a

investigação de formas de utilização segura e eficaz dos compostos. Os estudos sobre os

efeitos da A. indica sugerem que a planta seja uma alternativa economicamente viável no

combate a enfermidades e suas complicações.

Figura 8: Fórmula estrutural da azadiractina. Disponível em:

http://www.iapar.br/arquivos/Image/nim/nim2.JPG

5.2.1 Efeitos farmacológicos do nim

Grandes variedades de atividades farmacológicas e aplicações medicinais são

conhecidas a partir de várias partes da planta. Relatos na literatura têm exibido diferentes

funções biológicas a partir de um grupo de compostos presentes nas plantas. Apesar da exata

composição do extrato de nim ser ainda indeterminada, os componentes da folha solúveis em

água têm provado ser eficazes no controle de várias doenças, incluindo câncer (BARAL,

2004; BALASENTHIL, 1999). Na literatura, têm sido descritas atividades anti-sépticas,

curativas, antiúlcera, antiinflamatória, antifertilizante, redutora da taxa sanguínea de lipídeos e

hepatoprotetora relacionadas ao extrato da folha de nim (CHATTOPADHYAY, 1999). O

efeito hepatoprotetor das folhas foi demonstrado por meio de sua administração como pré-

tratamento ao uso de paracetamol. O extrato estabilizou os níveis séricos das enzimas

marcadoras de dano hepático, resultados confirmados por análises histopatológicas

(YANPALLEWAR, 2003). O extrato aquoso de folhas da A. indica tem demonstrado

capacidade em prevenir e reverter significativamente o dano hepatotóxico induzido por drogas

antituberculares em ratos (KALE, 2003).

Atividades hipoglicemiantes foram investigadas em ratos normais e diabéticos,

revelando redução significativa nos níveis de glicose sanguínea (KAR, 2003;

CHATTOPADHYAY, 1999). Atividades sobre o sistema cardiovascular de gatos e rãs,

resultando em efeitos hipotensivos e redutores da atividade cardíaca com o uso de extrato

hidroalcoólico de folhas, também têm sido relatadas (CHATTOPADHYAY, 1997).

Killare & Shrivastan (2003) realizaram estudos sobre o efeito do extrato de folhas em

espermatozóides humanos e constataram potente ação espermicida, sendo que

aproximadamente 3 mg de extrato é a quantidade suficiente para imobilizar e matar 100% de

1 milhão de espermatozóides, em 20 segundos.

Potente atividade citotóxica contra um grupo de células humanas cancerígenas foi

obtida in vitro (NANDURI, 2004). Extrato de folhas administrado em hamsters, com

carcinoma bucal induzido por 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA) promoveu supressão do

câncer. Estudos sugerem que o mecanismo de ação ocorre por meio de modulação da

peroxidação lipídica, antioxidantes e sistemas de detoxificação (BALASENTHIL, 1999).

Resultados de investigações envolvendo a ação quimiopreventiva, possivelmente mediada

pela modulação da peroxidação lipídica, antioxidantes e detoxificação de enzimas, são

altamente promissores na terapia do câncer, incrementando os mecanismos antioxidantes de

defesa do hospedeiro (BALASENTHIL, 1999; ARIVAZHAGAN, 2000; SUBAPRIYA,

2005). Flavonas isoladas de flores de nim mostraram efeitos antimutagênicos baseados na

inibição da ativação enzimática de aminas heterocíclicas (NAKAHARA, 2003).

Folhas de nim podem atuar como mediador na ativação da resposta imune. Baral &

Chattopadhyay (2004), estudando, em ratos, o efeito profilático e terapêutico das folhas sobre

carcinoma de Ehrlich e melanoma B16, verificaram que o extrato é capaz de proteger o

animal contra o crescimento do tumor e assim atuar como agente quimiopreventivo, mediante

a ativação imune e/ou outros mecanismos de defesa do hospedeiro.

Existem vários relatos quanto à eficácia da atividade do extrato aquoso de folhas

contra grande número de viroses como poxvírus, poliomielite, herpesvírus (SAIRAM, 2000).

O composto azadiractina e o extrato aquoso de folhas também demonstram ação inibitória in

vitro e in vivo sobre a replicação do vírus da Dengue tipo 2, confirmada por ensaios de

inibição viral e RT-PCR (Reação em cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa)

(PARIDA, 2002).

Óleo das sementes e extrato das folhas, administrados oralmente, possuem

imunomoduladores que induzem reações imunocelulares, causando interrupção completa da

gestação antes do estágio de implantação em roedores e primatas, de forma reversível, sendo a

fertilidade restaurada nos ciclos subseqüentes. Os efeitos imunomoduladores têm recebido

grande atenção, devido às suas propriedades diuréticas, antimicrobianas, antiinflamatórias,

antipiréticas, anti-tumorais, e indutoras de interferon (MUKHERJEE, 1999; SAIRAM, 2000).

Produtos à base de óleo da semente de nim têm demonstrado efeitos antifertilizantes

(KAUSHIC, 1995; RIAR, 1991), ação espermicida direta e atividade antimicrobiana

significativa contra patógenos sexualmente transmissíveis (GARG, 1998). O efeito

contraceptivo pós-coital do óleo da semente de nim não envolve estrogênio ou progesterona,

podendo ser considerado como efeito não-hormonal, portanto, não ocasionando os efeitos

colaterais dos contraceptivos esteróides (PRAKASH, 1988). Em adição à esta ação

contraceptiva, têm sido descritas ações antimicrobianas associadas (antibacteriana,

antifúngica e antiviral), úteis na prevenção de doenças (SAIRAM, 2000).

Azadirachta indica mostrou atividade antiinflamatória, mediante a supressão da

capacidade do patógeno Propionibacterium acnes em induzir espécies oxigênio reativas e

citocinas pró-inflamatórias (JAIN, 2003). A ação antibacteriana do óleo da semente de nim

também foi demonstrada in vitro contra bactérias patogênicas por meio da inibição da síntese

da membrana celular bacteriana (BASWA, 2001).

O estudo de Gupta (2004) mostrou efeito protetor do óleo da semente de nim em ratos

com diabetes induzido por estreptozotocina; os resultados indicam prevenção do estresse

oxidativo no coração e nos eritrócitos, poupando os animais das complicações cardíacas

características do diabetes mellitus.

O componente bioativo azadiractina, extraído da semente, tem demonstrado afetar o

desenvolvimento do protozoário parasita Trypanosoma cruzi em diferentes espécies do vetor

triatomíneo (DHAR, 1998; GONZALEZ, 1992).

Nim tem sido descrita como possuindo atividade antimalárica: estudos relatam efeitos

do óleo da semente sobre o crescimento e desenvolvimento dos estágios sexual e assexual do

parasita humano da malária Plasmodium falciparum. O efeito anti-plasmodial ocorre também

sobre parasitas já resistentes a outras drogas antimaláricas (cloroquina e pirimetamina), sendo

ativo não apenas contra as formas do parasita responsáveis pelos aspectos clínicos da doença,

mas também contra as formas responsáveis pela transmissão da malária (DHAR, 1998;

JONES, 1994). Isah et al (2003) avaliaram as propriedades antimaláricas e a padronização do

uso de tabletes de nim em ratos, evidenciando a existência de atividade antimalárica em

tabletes preparados a partir da casca e folhas.

Efeitos gastroprotetores (anti-secretor e antiúlcera) têm sido observados com o uso de

extrato da casca, com potência equivalente à ranitidina e ao omeprazol

(BANDYOPADHYAY, 1997).

5.2.2 Toxicidade

Extrato aquoso de folhas de nim, a 10%, administrado via oral por 24 horas, mostrou

leve efeito diurético. Em cães, a administração intravenosa causou diurese, já a administração

intramuscular não demonstrou efeitos indesejáveis. Atividades mutagênicas e relacionadas a

possíveis danos cromossômicos, investigadas in vivo e in vitro, forneceram resultados

negativos (MARTINEZ, 2002; SCHMUTTERER, 1990). Testes avaliando irritação ocular e

cutânea primárias, inalação aguda, resposta imune e sensibilização não forneceram resultados

preocupantes do ponto de vista toxicológico (SCHMUTTERER, 1990).

Em estudos sobre a função tireoidiana em ratos machos, o extrato de folhas exibiu

diferentes efeitos: em altas doses se mostrou não-seguro quanto à função tireoidiana, com

decréscimo dos níveis séricos de triiodotironina (T3) e aumento dos níveis de tiroxina (T4);

além disso, promoveu aumento na peroxidação lipídica hepática e decréscimo na atividade da

glicose-6-fosfatase. Enquanto em doses baixas nenhum efeito foi observado (PANDA, 2000).

Raji et al (2004) verificaram que a administração intraperitonial do extrato das folhas

de Azadirachta indica (1000 mg/kg de extrato) não produziu sinal de toxicidade em ratos,

nem alteração significante no peso corpóreo ou de órgãos durante 3 semanas de aplicação, não

sendo observados sintomas como diarréia, comportamento estereotípico ou morte durante esse

período. Entretanto, a administração oral de 3200 mg/kg de extrato causou 100% de

mortalidade.

Raizada et al (2001) revelam ausência de efeitos adversos com administração de

azadiractina 12% via oral, em ratos machos e fêmeas até 1500 mg/kg/dia durante 90 dias, não

produzindo sinais de toxicidade, mortalidade, alterações de peso ou dos parâmetros

sanguíneos.

Os extratos podem causar fitotoxicidade quando em altas concentrações, dependendo

da espécie, idade e fase de desenvolvimento da planta sobre a qual são aplicados com

finalidade inseticida. Todavia, quando utilizados no campo, nas doses recomendadas, não têm

demonstrado tal efeito. Além disso, a azadiractina é totalmente biodegradável e sua meia vida

no solo é de cerca de 20 dias (MARTINEZ, 2002).

Segundo estudos realizados por Khan & Awasthy (2003) o composto azadiractina

pode ser considerado um carcinógeno genotóxico devido à presença do grupo (-O-CH=) no

anel furano do composto, como ocorre em muitos carcinógenos, incluindo aflatoxinas. Além

disso, a eletronegatividade do composto é da mesma magnitude que ocorre nas moléculas de

DNA. A alta incidência de alterações sinápticas e variações numéricas em cromossomos

confirmam a citotoxidade do extrato, em concordância com observações realizadas em

cromossomos mitóticos. O estudo revela também um aumento na freqüência de

espermatozóides aberrantes, juntamente com uma diminuição da produção. Dessa forma, os

danos potenciais do extrato não podem ser ignorados, tendo em vista o longo período de risco

genético ao homem.

Raizada et al (2001) realizaram estudos toxicológicos administrando azadiractina via

oral em ratos machos e fêmeas, nas doses de 500, 1000 e 1500 mg/kg/dia por 90 dias. Não

foram observados sinais de toxicidade, mortalidade, alterações patológicas ou séricas, sendo a

dose de 1500 mg/kg indicada como dose basal para determinação do nível de ausência de

efeitos do composto para calcular sua margem de segurança.

5.2.3 Efeito anti-séptico, antifúngico e cicatrizante do nim

Estudos mostram que a planta vem sendo usada no tratamento de feridas. Alem disso,

é relatado que o óleo de nim mostra-se como não irritante à pele de coelhos (TANDAN et al,

1995). A ausência da toxicidade subdérmica caracteriza o óleo de nim como sendo seguro

para aplicações tópicas em feridas.

Thaker e Anjaria (1985) observaram atividade séptica, antimicrobiana e cicatrizante

das plantas Azadirachta indica, Annona squamosa, Ocimum sanctum e Bergia odorata, em

tratamentos de feridas de roedores infectadas por Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes, Corynebacterium spp., Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Diante dos

experimentos, constataram que os ferimentos tratados topicamente com os quatro extratos das

folhas das plantas revelaram progressiva cicatrização no sexto e décimo segundo dias de

tratamento. Foi observada grande proliferação de tecido conjuntivo fibroso e pequeno número

de monócitos. As plantas mostraram efeito inibidor sobre o desenvolvimento da microbiota

dos organismos patogênicos em estudo.

Chattopadhyay et al (1993) estudaram o efeito anti-inflamatório do extrato da folha da

planta através de edema inflamatório induzido em ratos, mostrando que o nim apresenta efeito

inibitório da ação da 5-hidroxitriptamina (5-HT) e prostaglandina (PGE1).

Observou-se, em ratos, atividade anti-nociceptiva do extrato das folhas de A. indica,

usada na dose de 500 mg/kg de peso corporal (KOSHLA et al, 2000).

Estudos in vitro mostram importante atividade antifúngica de nim. Desta forma, o

extrato de suas folhas pode ser usado como um agente antidermatófico (VENUGOPAL &

VENUGOPAL, 1994).

Vale ressaltar que os estudos acima relatados possuem dados não conclusivos,

devendo ser mais fortemente investigados pela comunidade científica.

6 METODOLOGIA

Os animais envolvidos nos experimentos, procedentes do Biotério da Universidade de

Mogi das Cruzes, foram alojados em gaiolas individuais, onde foram supridos adequadamente

de dieta e água pelo técnico responsável, sob supervisão veterinária, e mantidos em

fotoperíodo de 12 horas, com temperatura e umidade mantidas por ar condicionado, ficando

sob observação por um período de uma semana antes da sua utilização.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Manipulação e

Experimentação Animal (CEMEA/UMC), em 14 de setembro de 2007 (prot. 035/2007).

Foram utilizados 12 ratos albinos da raça Wistar, machos, com idade variando entre 5

e 6 meses, e peso corporal médio de 360 gramas. Cada rato foi submetido a dois cortes

cirúrgicos na região dorsal, que foram em seguida suturados. Este procedimento permite ter o

controle no mesmo animal submetido ao tratamento. Os ratos foram divididos em 2 grupos

que, por sua vez, foram agrupados em dois subgrupos (tratado e controle), como descrito

abaixo:

• Grupo 1 (GI): uma lesão de cada rato desse grupo foi submetida à tratamento

desde o primeiro até o terceiro dia pós cirúrgicos com o óleo da semente da

nim (G1-T), enquanto a outra foi considerada como controle (G1-C);

• Grupo 2 (G2): uma lesão de cada rato desse grupo foi submetida à tratamento

com óleo da semente da nim do primeiro até o sétimo dia pós-cirúrgico (G2-

T), enquanto a outra foi considerada como controle (G2-C).

Cada um dos grupos foi composto por 6 animais. Vale ressaltar que nas lesões

consideradas como controle (G1-C e G2-C), foi feita a aplicação de óleo mineral com a

mesma freqüência das lesões tratadas e na mesma quantidade.

6.1 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

Para realização do ato cirúrgico, após identificação, os animais foram pesados a fim de

aplicar uma dose anestésica de cloridrato de Xilazina (Vetbrands TM) associado ao cloridrato

de Cetamina (Vetbrands TM). No caso de ratos de laboratório, a dose recomendada para

aplicação intramuscular é de 1 ml/kg de peso do animal para Cetamina e 0,1 ml/kg de peso do

animal para a Xilazina. A Tabela 2 mostra a dose anestésica pelo peso do rato e o tempo de

ação do anestésico.

Tabela 2: Dose administrada aos animais de acordo com peso e o respectivo tempo de ação do anestésico.

Animal Peso (g)

Dose (ml/kg)

(Cetamina/Xilazina)

Tempo de ação do

anestésico (h)

1 370 0,37/0,037 2,5

2 310 0,31/0,031 2,5

3 350 0,35/0,035 3,0

4 350 0,35/0,035 2,5

5 390 0,39/0,039 3,0

6 390 0,39/0,039 2,5

7 370 0,37/0,037 2,5

8 310 0,31/0,031 2,5

9 350 0,35/0,035 3,0

10 350 0,35/0,035 2,5

11 390 0,39/0,039 3,0

12 390 0,39/0,039 2,5

Uma vez o animal anestesiado, foram iniciados os procedimentos de preparação do

campo cirúrgico (tricotomia e assepsia). A tricotomia foi realizada com lâmina elétrica

veterinária pré-cirúrgica n

40, para evitar lesão e irritação da pele do rato (Figura 9).

Figura 9: Tricotomia com lâmina n

40 sem lesionar a pele do animal.

Todos os cortes foram padronizados, utilizando um “punch” de 5 mm de diâmetro, que

é um instrumento projetado para a realização de coleta de material de superfícies cutânea para

diagnóstico histopatológico. Após a produção dos cortes, foi realizada a sutura, utilizando um

fio nylon agulhado 4.0, com auxílio de porta-agulha controlando o nó pata evitar o

estrangulamento do tecido, a fim de induzir uma cicatrização de primeira intenção. Abaixo, a

Figura 10 mostra as lesões após a sutura. Os cortes foram realizados na região dorsal, de

modo que o animal não os alcançasse com a pata ou a boca, interferindo negativamente na

cicatrização das lesões.

Figura 10: Imagem das lesões após a sutura. a) fotografia mostrando lesão superior e inferior; b) fotografia em

maior aumento mostrando as lesões.

Após os procedimentos cirúrgicos, como cautela para evitar morte do animal por

hipotermia, os ratos foram alojados em ambiente aquecido com temperatura aproximadamente

de 30º C, até que o efeito anestésico cessasse.

6.2 APLICAÇÃO TÓPICA DO NIM

Nos dois grupos, a aplicação foi feita 3 vezes ao dia, e o intervalo de tempo entre as

aplicações foi de 8 horas. Cada aplicação foi realizada com o uso de uma seringa, de forma

que cada animal recebesse 0,2 ml do óleo da semente da A. indica puro. No G1-T, as

aplicações foram realizadas durante 3 dias, enquanto o G2-T, recebeu o óleo da semente por 7

dias.

(a)

(b)

Lesão superior

Lesão inferior

Com a mesma freqüência, as lesões consideradas controle dos dois grupos receberam

tratamento com óleo mineral, a fim de eliminar a interferência da umidificação da lesão

provocada pelo óleo da planta.

Os cortes foram considerados tratados e controles, segundo o seguinte protocolo: dos

seis animais que constavam em cada grupo (G1 e G2), três deles possuíram o corte superior

considerado como tratado e o corte inferior considerado controle. Os três animais restantes

dos grupos tiveram o corte superior denominado controle e o corte inferior denominado

tratado. Esta metodologia nos permitiu excluir a influência do segmento corporal submetido à

lesão na análise do processo cicatricial.

O óleo da semente foi preparado no CIIB (Centro Integrado de Investigação

Bioquímica), na UMC, sob supervisão do pesquisador Dr. Tiago Rodrigues, da seguinte

forma:

O óleo resultante da primeira prensagem a frio das sementes de Azadirachta indica

foi adquirido comercialmente. Para sua purificação, o óleo foi colocado em banho seco a

40°C por 30 min para aumentar sua fluidez, e em seguida distribuído em tubos plásticos de

centrífuga e três etapas de centrifugação foram realizadas. Após a primeira centrifugação

a 3.800xg, o sobrenadante foi submetido a duas centrifugações subseqüentes a 6.800xg,

todas por 15 minutos a 25°C. O sobrenadante resultante foi mantido a 25ºC ao abrigo da luz

em frasco vedado.

6.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS HISTOLÓGICAS

Para a retirada das amostras das lesões de pele dos animais, os ratos foram

anestesiados com cloridrato de Cetamina e cloridrato de Xilazina, nas mesmas doses

anteriormente citadas. Usando tesouras e bisturis, as regiões da pele estudada foram retiradas

e introduzidas em uma solução de formaldeído 10%, para conservação e posterior envio ao

laboratório responsável pela confecção das lâminas histológicas (Histotech Lâminas Didáticas

Ltda.).

As amostras foram retiradas de três diferentes regiões da pele do animal em

experimentação: região tratada (lesão tratada); região controle (lesão não-tratada) e região não

lesionada (Figura 11). A análise da pele não lesionada permitirá uma comparação das

amostras submetidas às lesões com as amostras de pele do mesmo animal não lesada. Após a

retirada da pele dos dois grupos, os animais foram eutanasiados por meio de sobre-dose

anestésica, ainda utilizando os anestésicos anteriormente citados.

Figura 11: Esquema ilustrativo da retirada de tecido para preparação das lâminas histológicas: 1 – tecido lesado;

2 – tecido não lesado.

Cortes de 4 µm de espessura foram feitos a fim de obter uma lâmina fina e

transparente, para melhor observação das fibras colágenas no microscópio óptico de luz

polarizada. Os cortes no micrótomo foram padronizados para proporcionar uma análise da

secção transversal da lesão, tendo o ponto de sutura como referência da região da lesão. A

reprodutibilidade do corte em relação à localização da região central da lesão é fundamental

para a análise das lâminas histológicas, uma vez que a densidade de colágeno e de células

inflamatórias depende da área da lesão (periférica ou central), como mostra a Figura 12.

Figura 12: Lâmina histológica com dois cortes histológicos contendo a lesão e um esquema ilustrando

os dois cortes: (a) região periférica e (b) região central.

(a)

(

)

6.3.1 Coloração com picrosirius red

Para observação do colágeno, optamos por utilizar o picrosirius red, em detrimento ao

HE (Hematoxilina-Eosina) e Tricrômio de Azan-Mallory, devido ao fato que uma

diferenciação do tipo de fibras de colágeno pode ser obtida com luz polarizada associado ao

corante. De fato, em decorrência da birrefringência das fibras de colágeno, a coração com

picrosirius red possibilita a observação discriminada das fibras de colágeno tipo I (colágeno

maduro) e tipo III (colágeno imaturo), e conseqüentemente a análise do amadurecimento das

fibras.

6.3.2 Observação no microscópio óptico com luz polarizada

As lâminas histológicas coradas com picrosirius red foram observadas mediante um

microscópio óptico da marca Leica, modelo DMLP, entre polarizadores cruzados, com um

aumento de 100x. As imagens foram capturadas por uma câmera acoplada ao microscópio e

analisadas através de um software de imagens, o Image Pro Plus v.6.0, que possibilita uma

quantificação do colágeno tipo I e III. Cada lâmina histológica foi fotografada 3 vezes de

forma a capturar imagens das regiões laterais e inferior da lesão, como ilustra a figura 13.

Desta maneira, é possível analisar o reparo tecidual em todas as paredes envolvidas com a

ferida. A Figura 14 mostra o esquema de captura das imagens.

Figura 13: Esquema demonstrativo dos locais fotografados de cada lesão: 1 – borda lateral esquerda;

2 – borda lateral direita; 3 – borda inferior.

Figura 14: Esquema de sistema de captura de imagens para análise das lâminas histológicas.

Vale ressaltar que a bandeja do microscópio foi fixada, o ambiente foi adequado com

iluminação e um mesmo examinador realizou as fotografias e o processamento de imagens a

fim de favorecer maior padronização durante a aquisição das imagens.

6.3.3 Processamento das imagens

Para realização do processamento das imagens histológicas foi utilizado o software

Image Pro Plus v. 6.0, que permite uma quantificação das tonalidades dos pixels e o cálculo

da área correspondente às fibras de colágeno no tipo I (avermelhadas) e III (verdes). Este

programa conta com a execução de um algoritmo que varre toda a imagem e conta a

quantidade de pixels correspondente às cores verde e vermelha, conforme parâmetros

inseridos no programa. O resultado do processamento é exibido em uma janela que mostra as

marcações feitas em verde e vermelho pelo examinador e em uma tabela, mostrando o

percentual das cores vermelha e verde, referentes às áreas ocupadas pelas fibras dos tipos I e

III, respectivamente, presentes na imagem (Figura 15).

Câmera de

vídeo

Microscópio

óptico

Monitor de Imagem

Figura 15: Interface do programa de análise de imagem (Image Pro Plus v. 6.0), com imagem histológica em

aumento de 20x entre polarizadores cruzados. A sobreposição da imagem para controle dos parâmetros

determinados para reconhecimento dos tons de vermelho e verde na imagem em pixel.

6.3.4 Análise de células inflamatórias durante o processo de reparo tecidual da pele

Foi realizada uma análise histológica das lâminas da região lesionada da pele dos

ratos, utilizando a coloração Hematoxilina – Eosina (HE). Esta coloração possibilita a

diferenciação das porções basófilas e acidófilas do tecido estudado, ou seja, de núcleos

celulares, citoplasma e fibras colágenas.

As lâminas foram observadas no microscópio óptico, entre polarizadores paralelos.

Primeiramente, o local da lesão de cada lâmina foi identificado utilizando um aumento de 50x

(Figura 16). Em seguida, imagens de três diferentes regiões da lesão foram capturadas com o

aumento de 500x para posterior contagem das células inflamatórias. Ressalta-se que os

parâmetros de iluminação no microscópio foram padronizados para aquisição das imagens

digitais. A contagem das células inflamatórias da derme da pele lesionada foi realizada

utilizando o software Image Pro Plus, v. 6.0. Na Figura 17 é mostrada, a título ilustrativo, uma

imagem da região da lesão (Figura 17a), com o procedimento adotado para a contagem das

células (Figura 17b).

Figura 16: Lâminas histológicas coradas com HE, em aumento de 50x. A região da lesão é evidenciada pela

grande densidade de células inflamatórias quando comparada à região não lesada. O corante evidencia os

núcleos das células inflamatórias.

Figura 17: Lâmina histológica corada com HE, em aumento de 500x. Em a), a fotografia da lâmina sem

processamento. Em b), a mesma lâmina após análise e contagem de célula utilizando o software Image Pro Plus.

6.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para interpretar os dados experimentais, uma análise estatística foi realizada mediante

o software MINITAB

, que permite a execução de vários testes de hipótese, a fim de verificar

a igualdade entre duas médias, para um nível de significância. O teste t-student foi escolhido

devido ao reduzido tamanho da amostra do presente trabalho, além de sua simplicidade. Na

mesma análise, um teste de analise de variância ANOVA one-way, o pós-teste Tukey, foi

conduzido a fim de comparar também as médias em relação às regiões da lesão e os dias

correspondentes as fases da cicatrização. Foi considerado um nível de significância de p <

0,05, ou seja, para um pequeno valor p (menor ou igual a 0,05), a hipótese nula da igualdade

das médias é rejeitada. No caso contrário, para um grande valor p (maior que 0,05), as médias

podem ser consideradas estatisticamente iguais (hipótese nula aceita).

7 RESULTADOS

7.1 ANÁLISE QUALITATIVA DO PROCESSO CICATRICIAL

As imagens digitais das lesões, obtidas no final do tratamento dos grupos G1 e G2, ou

seja, 3º e 7º dias respectivamente, evidenciaram ausência de processo infeccioso em todos os

animais, quer seja na lesão tratada ou controle. Além disso, o aspecto do processo

inflamatório (rubor e edema) nas lesões G1-T, G1-C, G2-T e G2-T mostrou-se semelhante

durante o experimento. No que diz respeito à extensão da cicatriz, nenhuma diferença

significante foi observada ao comparar as lesões tratada e controle (Figura 16).

Figura 18: Imagens digitais das lesões dos grupos G1 e G2 no último dia de tratamento dos grupos (3º e 7º dias,

respectivamente): a)lesão G1 controle; b)lesão G1 tratada; c)lesão G2 controle; d)lesão G2 tratada.

7.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL

A fim de quantificar os efeitos do óleo da semente da A. indica no processo cicatricial,

as lâminas histológicas foram observadas por meio de um microscópio óptico com luz

polarizada e analisadas por imagens digitais.

A determinação da densidade e do tipo de colágeno (I e III) é importante para analisar

o processo de maturação da cicatriz. Vale ressaltar que os corantes HE e Azan-Mallory,

mesmo sendo bastante utilizados na literatura para o estudo do reparo tecidual, não permitem

uma diferenciação das fibras de colágeno. Portanto, a escolha do Picrosirius Red como

corante pode ser justificada pelo fato de possibilitar a distinção entre tipos I e III de colágeno,

por meios de microscopia óptica com luz polarizada, devido à propriedade birrefringente das

fibras de colágeno. As figuras 17a, 17b e 17c mostram, respectivamente, a coloração HE,

Azan-Mallory e Picrosirius Red, com o intuito de demonstrar a eficiência de diferenciação do

colágeno usando o Picrosirius Red como coloração.

Figura 19: Imagens de lâminas histológicas da derme obtidas em microscópio óptico (aumento de 100x), de três

diferentes tipos de coloração: a)HE; b)Azan-Mallory; c)Picrosirius Red. A propriedade de birrefringência do

colágeno se expressa na imagem em forma de brilho em tons de vermelho e verde, caracterizando os tipos I e III,

respectivamente, de colágeno.

Nas figuras 18a e 18b são mostradas as imagens de lâminas coradas com Picrosirius

Red, obtidas no microscópio óptico, com os polarizadores paralelos e cruzados (ângulo entre

polarizadores de 90º), respectivamente.

Figura 20: Imagens do tecido cicatricial obtidas com aumento 200x, no microscópio óptico, das lâminas

confeccionadas com picrosirius red. a) entre polarizadores paralelos; e b) com polarizadores cruzados.

Para a identificação das fibras de colágeno do tipo I e III, foram consideradas

imagens com 100x de aumento da área da lesão, baseando-se nos tons de cores verde e

vermelho dessas fibras, como ilustrado nas figuras 19a e 19b. A quantificação das fibras foi

feita utilizando o software Image Pro Plus v. 6.0, que permite o cálculo de áreas na imagem

correspondendo às fibras avermelhadas (tipo I), consideradas como %R, e verdes (tipo III).

Figura 21: Imagem do tecido cicatricial obtida através do microscópio óptico com luz polarizada, com aumento

de 100x, mostrando área da lesão na região do corte. Em a) o tecido apresenta menor porcentagem de fibras

verdes em relação ao tecido da imagem b).

Nas tabelas 3 a 8 é apresentado o percentual de colágeno tipo I (%R) referente às

amostras colhidas nos experimentos. Os valores de %R obtidos, na região lateral da lesão, no

3º dia (grupo G1) e no 7º dia (grupo G2), para as amostras tratadas e controles, são mostrados

nas tabelas 3 e 4, respectivamente. As tabelas 5 e 6 mostram os valores de %R nos 3º e 7º

dias, na região de fundo da lesão, para amostras tratadas e controles, respectivamente. Os

valores de %R referentes à região total (laterais e fundo), para amostras tratadas, controles e

não lesionadas são apresentados nas tabelas 7 e 8.

Tabela 3: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região lateral da lesão, no 3º dia, para as amostras controles

(G1-C) e tratadas (G1-T).

Rato G1-C (%)

G1-T (%)

1 84,5134 76,8726

2 79,0629 82,0462

3 83,1111 86,0733

4 83,2541 73,2629

5 77,3653 75,2885

6 64,9781 84,6817

Tabela 4: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região lateral da lesão, no 7º dia, para as amostras controles

(G2-C) e tratadas (G2-T).

Rato

G2-C (%) G2-T (%)

1 86,5668 79,9838

2 69,7874 87,1422

3 79,2879 79,3452

4 74,8331 79,8551

5 79,9568 84,1311

6 76,6282 81,4365

Tabela 5: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região de fundo da lesão, no 3º dia, para as amostras controles

(G1-C) e tratadas (G1-T).

Rato

G1-C (%) G1-T (%)

1 89,5467 71,7943

2 67,1168 91,9145

3 71,2029 81,602

4 80,9352 72,8712

5 73,4657 74,4602

6 69,6506 89,255

Tabela 6: Percentual de colágeno tipo I (%R) na região de fundo da lesão, no 7º dia, para as amostras controles

(G2-C) e tratadas (G2-T).

Rato

G2-C (%) G2-T (%)

1 77,2759 61,8801

2 64,3284 70,1903

3 78,5619 69,8441

4 70,375 79,2763

5 62,5434 76,5645

6 73,9337 69,7652

Tabela 7: Média percentual de colágeno tipo I das três regiões analisadas (laterais e fundo), no 3º dia, para as

amostras controles (G1-C), tratadas (G1-T) e não lesionadas (GNL).

Rato

G1-C (%) G1-T (%)

GNL (%)

1 86,19 75,18

89,3575

2 75,0809 85,3356

91,8651

3 79,1417 84,5829

89,482

4 82,4811 73,1324

89,5795

5 76,0654 75,0124

89,21

6 66,5356 86,2061

90,2429

Tabela 8: Média percentual de colágeno tipo I das três regiões analisadas (laterais e fundo), no 7º dia, para as

amostras tratadas (G2-T), controles (G2-C) e não lesionadas (GNL).

Rato

G2-C (%) G2-T (%)

GNL (%)

1 83,4699 73,9493

89,1389

2 67,9677 81,4916

90,6146

3 79,0459 76,1782

89,962

4 73,347 79,6622

91,2124

5 74,1524 81,6089

89,0174

6 75,7301 77,546

91,9374

Na tabela 9 são apresentadas as médias e os desvios padrões do percentual de

colágeno utilizado na elaboração dos gráficos. A tabela 10 expõe a média e o desvio padrão

da análise de colágeno de G1 e G2 nos tecidos lesionados (laterais e fundo) e não lesionados.

Tabela 9: Média e desvio padrão da análise de colágeno das regiões laterais, fundo e das médias das três regiões

no 3º e 7º dias.

Região lateral Região de fundo Média das regiões

controle

Tratado

Controle

tratado controle

tratado

Média

78,71

79,70

75,32

80,31

77,60

79,90

3º dia

Despad

7,27

5,29

8,41

8,70

6,80

6,05

Média

77,84

81,98

71,17

71,25

75,62

78,40

Despad

5,62 3,06 6,65 6,10 5,27 3,06

7º dia

Tabela 10: Média e desvio padrão da análise de colágeno de G1 e G2 nos tecidos lesionados (controle e tratado)

e não lesionado.

Controle Tratado

Não

lesionado

Média

77,60

79,90

89,95

3º dia (G1)

Despad

6,80

6,05

1,00

Média

75,61

78,40

90,31

7º dia (G2)

Despad

5,27

3,06

1,16

Na figura 20, são apresentados os gráficos da média da concentração de colágeno

tipo I (%R) nas amostras de G1-C, G1-T, G2-C, G2-T e não lesionado, no 3º e 7º dias, nas

regiões lateral e fundo.

3 dias 7dias

% R

Dias

Controle Tratado

3 dias 7 dias

Dias

Controle Tratado

3 dias 7 dias

100

% R

Dias

Controle Tratado N_lesionado

Figura 22: Percentual de fibras vermelhas (%R) das amostras de G1 e G2, na região (a) lateral, (b) fundo e a (c)

média das regiões estudadas.

Nota-se que, nas análises de região de fundo e laterais, G2 apresentou concentração

de fibras de colágeno tipo I, tanto para lesão tratada, quanto para lesão controle, semelhante

no 7º dia. Este comportamento é diferente em G1, onde o percentual de fibras do tipo I é

discretamente superior no grupo tratado em relação ao grupo controle. Vale ressaltar que na

análise estatística esses valores mostraram-se não estatisticamente significante (p < 0,05).

Tanto os grupos tratados quanto os controles apresentaram %R significantemente menor que

as amostras não lesionadas, sendo a diferença entre a percentagem de fibras das amostras dos

grupos tratados e a percentagem das amostras não lesionadas ligeiramente menor que a

análise feita pelas amostras controles.

7.3 ANÁLISE QUANTITATIVA DAS CÉLULAS INFLAMATÓRIAS DURANTE O

PROCESSO DE REPARO TECIDUAL DA PELE

Na Tabela 11, são apresentados os resultados obtidos referentes à média de células

inflamatórias para os grupos investigados, junto com o desvio padrão associado (despad).

Tabela 11: Média e desvio padrão da análise do número de células inflamatórias na região da lesão, no 3º

e 7º dias, para os grupos controle e tratado.

Controle

Tratado

Média

247

280

3º dia

Despad

152

106

Média

136

7º dia

Despad

10 30

Na figura 23 são apresentados os gráficos da média de células inflamatórias nas

amostras de G1-C, G1-T, G2-C, G2-T, após 3 e 7 dias do corte cirúrgico.

3 dias 7 dias

100

150

200

250

300

350

400

Densidade de células (

-2

)

Controle

Tratado

Figura 23: Média das células inflamatórias nas amostras de G1-C, G1-T, G2-C, G2-T, após 3 e 7 dias do corte

cirúrgico.

7.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados utilizando a estatística t-student, a fim de comparar a

porcentagem de colágeno total entre os grupos. Nas tabelas 12 e 13 são apresentados os

valores p obtidos para colágeno de região lateral da lesão, fundo e para a média das regiões.

Tabela 12: Valor p da comparação entre grupos tratados e controles, referentes a %R.

Lateral Fundo Média das regiões

3º dia

0,79 0,33 0,54

7º dia

0,15 0,98 0,29

Tabela 13: Valor p da comparação entre grupos lesionados (tratado e controle) e não lesionados, referentes a

%R.

Não lesionado x Controle Não lesionado x Tratado

0,007 0,010

3º dia

7º dia

0,001 0,000

Destaca-se desta análise estatística que não se obteve diferença significativa ao

comparar grupo tratado com A. indica e controle, independente da região da lesão analisada.

A diferença estatisticamente significante encontrada, ao analisar grupos lesionados (tratado e

controle) e grupos não lesionados, é esperada, uma vez que tanto a lesão tratada quanto a

controle foram submetidas ao procedimento cirúrgico, o que ocasiona destruição das fibras

colágenas induzindo o tecido à produção destas fibras. Entretanto, 3 e 7 dias após a lesão não

é esperado um reparo completo do tecido lesionado.

A análise estatística da contagem do número de células inflamatórias das lesões no 3º

dia mostra que não existe uma diferença significativa entre o grupo tratado (G1-T) e o grupo

controle (G1-C), em relação ao número de células inflamatórias no tecido (p

≥ 0,05).

Enquanto, no 7º dia após a lesão, uma diferença estatisticamente significativa (p ≤ 0,05) do

número de células inflamatórias é obtida entre os grupos tratado e controle. O grupo tratado

com nim apresentou uma quantidade de células superior em relação ao grupo controle (Tabela

14).

Tabela 14: Valor p da comparação entre grupos tratados e controles de G1 e G2, referente à contagem de células

inflamatórias.

Tratado x Controle

3º dia

0,37

7º dia

0,04

8 DISCUSSÃO

Neste trabalho foi investigado o efeito da A. indica sobre o processo cicatricial da pele

de ratos no pós-operatório, por meio de análise quantitativa da reposição de fibras colágenas

nas fases inflamatória e proliferativa. Como modelo experimental, escolheu-se o rato Wistar,

considerando sua fácil obtenção e manuseio, além de ser amplamente aceito na literatura para

investigações do reparo tecidual. Os animais foram distribuídos em dois grupos a fim de

proporcionar uma análise nas duas fases do reparo acima mencionadas. Cada animal foi

submetido a duas lesões, sendo uma considerada controle e a outra tratada com nim.

Após indução cirúrgica das lesões cutâneas, acompanhou-se o reparo no terceiro e

sétimo dias para verificação das alterações de colágeno. As amostras de tecido retiradas dos

grupos experimentais foram coradas com picrosirius red, considerando-se um método

bastante empregado por ser confiável, de fácil acesso que permite a quantificação total de

colágeno no tecido para estudos clínicos e experimentais (TASKIRAN et al, 1999). Este

método de coloração das lâminas histológicas foi utilizado por Rich & Whittaker (2005) para

analisar colágeno de tecido arterial de coelhos. Cruz (2007) utilizou o método para analisar o

reparo tecidual pós-tratamento com micro-corrente elétrica, de ratos submetidos à lesão

cirúrgica suturada. Para estudar a resposta inflamatória e deposição de colágeno após implante

intramuscular de polimetilmetacrilato (PMMA) em camundongos, Sousa et al (2008)

utilizaram, além da coloração HE, o picrosirius red; os autores concluíram que o PMMA

promove deposição de colágeno e não induz inflamação crônica.

Para a quantificação das áreas representativas de colágeno foram digitalizadas imagens

de três campos por lâmina histológica. Todas as imagens foram padronizadas quanto à

intensidade de luz do microscópio óptico e altura do condensador. A escolha de três campos

neste tipo de trabalho proporciona uma margem de segurança maior em relação aos

resultados, considerando que o método de captura de imagens para a quantificação de

colágeno pode não ser representativo quando da utilização de apenas um campo.

Para o processamento das imagens, foi utilizado o software Image Pro Plus, v.6.0,

devido a seu amplo emprego em trabalhos disponibilizados na literatura científica. Biondo-

Simões et al (2005) utilizou o mesmo programa para analisar cicatrização de feridas cutâneas

de ratos, com foco em colagenização. Carneiro et al (2005) utilizaram o software para avaliar

a concentração de colágeno após enxerto microcirúrgico de fáscia muscular e gordura na

prega vocal de coelho. Além dos autores citados, Cuttle et al (2005) fizeram uso do Image Pro

Plus para analisar a colagenização em feridas induzidas em fetos de cordeiros, usando como

corantes das lâminas histológicas o picrosirius red.

Até o momento, existem na literatura especializada poucos estudos do efeito da

aplicação tópica de drogas sobre o reparo tecidual envolvendo a quantificação do colágeno.

Camargo et al (2006) realizaram uma investigação sobre o efeito da mitomicina C tópica na

cicatrização de prega vocal em modelo suíno utilizando picrosirius red como coloração para

análise histológica. Pela quantificação do colágeno total, os autores concluíram que o uso

tópico da minomicina C diminui significativamente o depósito de colágeno total durante o

reparo tecidual.

Chattopadhyay et al (1993) fez um estudo pioneiro sobre o efeito do extrato das folhas

da Azadirachta indica na ocorrência de edema inflamatório induzido em ratos por mediadores

químicos como 5-HT (5-hidroxitriptamina, também conhecido como serotonina), histamina,

bradicinina e PGE1. Este estudo mostrou que o extrato das folhas de nim apresenta efeito

inibitório da ação da 5-HT e PGE1, caracterizando atividade antiinflamatória da planta. O

mesmo autor, em 1998, observou que o extrato das folhas administrado via oral na dose de

200 mg/kg exerceu importante atividade antiinflamatória, que se deve a estabilização da

membrana lisossomal e a efeitos antiproliferativos (CHATTOPADHYAY, 1998).

Em estudos comparativos entre efeito antiinflamatório do extrato das folhas de nim e

de dexametasona, conhecido antiinflamatório, observou-se significativo efeito

antiinflamatório da planta, entretanto, sua eficácia mostra-se menor que a droga comparada

(MOSADDEK & RASHID, 2008).

Os estudos citados mostram ação antiinflamatória da planta, entretanto, o efeito

relacionado às fases mais avançadas do reparo tecidual e, especificamente, a colagenização,

não foram tratados por esses autores; até o presente momento, não foram encontrados na

literatura científica estudos voltados especificamente ao efeito de nim sobre a colagenização

in vivo.

Os estudos de Natarajan et al (2003) mostram atividade antidermatófica do óleo da

semente de A. indica, com uma distorção significante da curva de crescimento in vitro dos

fungos Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum nanum do grupo

tratado com óleo da semente em relação ao grupo controle.

Estudos in vivo mostram que a administração intraperitoneal de NIM-76 (dose única),

fração volátil do óleo da semente de nim, resultou em um aumento de leucócitos

polimorfonucleares (PMN) com uma concomitante redução da taxa linfocitária. A ação

imunomoduladora de NIM-76 mostra-se como dependente da concentração usada. Deste

modo, com 120 mg/kg de peso corporal, ocorre um estímulo à ativação de macrófagos e uma

resposta proliferativa de linfócitos. Em maiores concentrações (300 mg/kg de peso corporal),

há proliferação de linfócitos enquanto a atividade de macrófagos não se altera (SAIRAM et al,

1997).

Em estudo in vitro de cultura de fibroblastos, Bonincontro et al (2007) observaram que

os princípios ativos presentes no óleo da semente de nim, mais especificamente em sua fração

não-terpenóide, definido como extrato metanólico (MEX), apresentaram efeito citotóxico,

levando as alterações nas propriedades biofísicas da membrana celular e conseqüente

sofrimento e apoptose celular. Neste estudo é observado que a ação tóxica não se deve, em

nenhuma hipótese, as substâncias presentes na fração terpenóide do óleo, como a azadiractina.

No presente estudo, o efeito da planta é focado nas fases de reparo com maior

atividade fibroblástica, não evidenciando os mediadores químicos do processo inflamatório,

mas enfatizando a síntese de colágeno in vivo. Vale ressaltar que, com a aplicação tópica de

nim, não podemos sugerir efeito citotóxico da planta sobre fibroblastos, o que ocasionaria

redução da produção de colágeno.

A análise do número de células inflamatórias para o G1 mostra uma diferença não

significativa entre grupo tratado (G1-T) e grupo controle (G1-C). Este resultado indica que o

uso do óleo da semente de nim não afeta diretamente a presença de células inflamatórias

durante esta fase do reparo tecidual (processo inflamatório). Uma densidade elevada de

células foi observada tanto no grupo controle como no grupo tratado.

Enquanto, no 7º dia após a lesão, uma diferença estatisticamente significativa (p

≤ 0,05) do número de células inflamatórias é obtida entre os grupos tratado e controle. O

grupo tratado com nim apresentou uma quantidade de células superior em relação ao grupo

controle. Este resultado pode estar relacionado à ação moduladora do processo inflamatório

proporcionado pelo óleo da semente de nim (SAIRAM et al, 1997). Pode-se supor, além

disso, uma proliferação das células inflamatórias decorrente de efeito deletério ao tecido

ocasionado pelo óleo da semente de nim, como por exemplo, a ação sobre os fibroblastos,

ocasionando apoptose celular (BONINCONTRO et al, 2007).

Vale ressaltar que esta análise da densidade de células inflamatórias não é conclusiva e,

portanto, torna-se necessário um estudo mais aprofundado do efeito da Azadirachta indica no

processo inflamatório, seja como anti-inflamatória ou moduladora deste processo, além de

possíveis efeitos indesejáveis.

No presente estudo, o efeito da planta é focado nas fases de reparo com maior

atividade fibroblástica, não evidenciando os mediadores químicos do processo inflamatório,

mas enfatizando a síntese de colágeno in vivo. É importante salientar que, com a aplicação

tópica do óleo da semente de nim, e de acordo com os experimentos feitos, não podemos

comprovar o efeito citotóxico da planta sobre fibroblastos, o que ocasionaria redução da

produção de colágeno.

9 CONCLUSÃO

Os resultados obtidos sugerem que o óleo das sementes da planta, usado topicamente

em feridas suturadas de pele de ratos, nas condições de nossos experimentos, não interfere na

síntese de colágeno, uma vez que a análise estatística revelou diferença não significativa na

densidade de colágeno entre lesão tratada com o óleo da semente da planta e lesão controle,

independentemente da região da lesão analisada.

No que diz respeito ao efeito da aplicação tópica do óleo da semente de nim sobre o

processo inflamatório, foi observada um aumento significativo de células inflamatórias no

sétimo dia após a lesão no grupo tratado em comparação com o grupo controle. Este resultado

pode ser interpretado como uma ação moduladora do óleo da semente da planta no processo

inflamatório ou numa ação pró-inflamatória por uma possível apoptose de fibroblastos.

10 PERSPECTIVAS FUTURAS

Como já enfatizado, existem estudos que mostram o efeito anti-séptico da A. indica, o

que nos leva à dúvida de uma suposta resolução final mais favorável ao tecido, não só em

relação à quantidade de colágeno, mas principalmente em relação a sua organização, em caso

de lesão aberta (cicatrização por segunda intenção), onde o risco de contaminação é

consideravelmente maior que na lesão suturada (cicatrização por primeira intenção).

Em etapas futuras tornam-se viáveis experimentos que foquem o tratamento de ferida

aberta com óleo da semente e extrato das folhas de nim. Além disso, a concentração usada do

óleo da semente da planta, que em nosso experimento foi de 100%, deve ser mais

detalhadamente investigada, ao se estudar o efeito do óleo da semente e do extrato das folhas

na ferida aberta.

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ANEXO A – Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Manipulação e

Experimentação Animal da Universidade de Mogi das Cruzes.

ANEXO B – Análise estatística

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado

Two-sample T for Controle vs Tratado

N Mean StDev SE Mean

Controle 6 77,58 6,80 2,8

Tratado 6 79,91 6,05 2,5

Difference = mu (Controle) - mu (Tratado)

Estimate for difference: -2,32554

95% CI for difference: (-10,73254; 6,08147)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,63 P-Value = 0,547 DF = 9

One

OneOne

One-

-way ANOVA: Controle; Tratado

way ANOVA: Controle; Tratado way ANOVA: Controle; Tratado

way ANOVA: Controle; Tratado

Source DF SS MS F P

Factor 1 16,2 16,2 0,39 0,545

Error 10 414,3 41,4

Total 11 430,6

S = 6,437 R-Sq = 3,77% R-Sq(adj) = 0,00%

Individual 95% CIs For Mean Based on

Pooled StDev

Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--------

Controle 6 77,583 6,799 (--------------*--------------)

Tratado 6 79,908 6,053 (--------------*-------------)

-+---------+---------+---------+--------

72,0 76,0 80,0 84,0

Pooled StDev = 6,437

Fisher 95% Individual Confidence Intervals

All Pairwise Comparisons

Simultaneous confidence level = 95,00%

Controle subtracted from:

Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--

Tratado -5,955 2,326 10,606 (----------------*---------------)

-------+---------+---------+---------+--

-5,0 0,0 5,0 10,0

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7 Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7

Two-sample T for Controle7 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Controle7) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: -2,78720

95% CI for difference: (-8,53172; 2,95732)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,12 P-Value = 0,296 DF = 8

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3; Controle7

Test and CI: Controle3; Controle7 Test and CI: Controle3; Controle7

Test and CI: Controle3; Controle7

Two-sample T for Controle3 vs Controle7

N Mean StDev SE Mean

Controle3 6 77,58 6,80 2,8

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Difference = mu (Controle3) - mu (Controle7)

Estimate for difference: 1,96383

95% CI for difference: (-5,98465; 9,91231)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,56 P-Value = 0,590 DF = 9

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7 Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7

Two-sample T for Tratado3 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Tratado3 6 79,91 6,05 2,5

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Tratado3) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: 1,50217

95% CI for difference: (-5,04708; 8,05142)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,54 P-Value = 0,604 DF = 7

Results for: Fundo

Results for: FundoResults for: Fundo

Results for: Fundo

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Two-sample T for Controle3F vs Tratado3F

N Mean StDev SE Mean

Controle3F 6 75,32 8,41 3,4

Tratado3F 6 80,32 8,70 3,6

Difference = mu (Controle3F) - mu (Tratado3F)

Estimate for difference: -4,99658

95% CI for difference: (-16,17212; 6,17895)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,01 P-Value = 0,338 DF = 9

Results for: Latera

Results for: LateraResults for: Latera

Results for: Lateral

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Test and CI: Controle3L; Tratado3L Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Two-sample T for Controle3L vs Tratado3L

N Mean StDev SE Mean

Controle3L 6 78,71 7,27 3,0

Tratado3L 6 79,70 5,29 2,2

Difference = mu (Controle3L) - mu (Tratado3L)

Estimate for difference: -0,990016

95% CI for difference: (-9,291726; 7,311694)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,27 P-Value = 0,793 DF = 9

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Two-sample T for Controle7F vs Tratado7F

N Mean StDev SE Mean

Controle7F 6 71,17 6,65 2,7

Tratado7F 6 71,25 6,10 2,5

Difference = mu (Controle7F) - mu (Tratado7F)

Estimate for difference: -0,083689

95% CI for difference: (-8,417746; 8,250369)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,02 P-Value = 0,982 DF = 9

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Two-sample T for Controle7L vs Tratado7L

N Mean StDev SE Mean

Controle7L 6 77,84 5,62 2,3

Tratado7L 6 81,98 3,07 1,3

Difference = mu (Controle7L) - mu (Tratado7L)

Estimate for difference: -4,13896

95% CI for difference: (-10,32179; 2,04387)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,58 P-Value = 0,157 DF = 7

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Mean of Controle3

Mean of Controle3 Mean of Controle3

Mean of Controle3

Mean of Controle3 = 77,5827

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 Mean of Tratado3

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 = 79,9082

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7 Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Variable Mean StDev

Controle7 75,62 5,28

Tratado7 78,41 3,06

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3 Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Variable Mean StDev

Controle3 77,58 6,80

Tratado3 79,91 6,05

Results for: Fundo3

Results for: Fundo3Results for: Fundo3

Results for: Fundo3

Descri

DescriDescri

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

ptive Statistics: Controle3F; Tratado3F ptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

ptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

Variable Mean StDev

Controle3F 75,32 8,41

Tratado3F 80,32 8,70

Results for: Lateral3

Results for: Lateral3Results for: Lateral3

Results for: Lateral3

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Variable Mean StDev

Controle3L 78,71 7,27

Tratado3L 79,70 5,29

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

Variable Mean StDev

Controle7F 71,17 6,65

Tratado7F 71,25 6,10

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Variable Mean StDev

Controle7L 77,84 5,62

Tratado7L 81,98 3,07

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado

Two-sample T for Controle vs Tratado

N Mean StDev SE Mean

Controle 6 77,58 6,80 2,8

Tratado 6 79,91 6,05 2,5

Difference = mu (Controle) - mu (Tratado)

Estimate for difference: -2,32554

95% CI for difference: (-10,73254; 6,08147)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,63 P-Value = 0,547 DF = 9

One

OneOne

One-

-way ANOVA: Controle; Tr

way ANOVA: Controle; Trway ANOVA: Controle; Tr

way ANOVA: Controle; Tratado

atado atado

atado

Source DF SS MS F P

Factor 1 16,2 16,2 0,39 0,545

Error 10 414,3 41,4

Total 11 430,6

S = 6,437 R-Sq = 3,77% R-Sq(adj) = 0,00%

Individual 95% CIs For Mean Based on

Pooled StDev

Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--------

Controle 6 77,583 6,799 (--------------*--------------)

Tratado 6 79,908 6,053 (--------------*-------------)

-+---------+---------+---------+--------

72,0 76,0 80,0 84,0

Pooled StDev = 6,437

Fisher 95% Individual Confidence Intervals

All Pairwise Comparisons

Simultaneous confidence level = 95,00%

Controle subtracted from:

Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--

Tratado -5,955 2,326 10,606 (----------------*---------------)

-------+---------+---------+---------+--

-5,0 0,0 5,0 10,0

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7 Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7

Two-sample T for Controle7 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Controle7) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: -2,78720

95% CI for difference: (-8,53172; 2,95732)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,12 P-Value = 0,296 DF = 8

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Two

TwoTwo

Two-

-Sa

SaSa

Sample T

mple Tmple T

mple T-

-Test and CI: Controle3; Controle7

Test and CI: Controle3; Controle7 Test and CI: Controle3; Controle7

Test and CI: Controle3; Controle7

Two-sample T for Controle3 vs Controle7

N Mean StDev SE Mean

Controle3 6 77,58 6,80 2,8

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Difference = mu (Controle3) - mu (Controle7)

Estimate for difference: 1,96383

95% CI for difference: (-5,98465; 9,91231)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,56 P-Value = 0,590 DF = 9

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7 Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7

Two-sample T for Tratado3 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Tratado3 6 79,91 6,05 2,5

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Tratado3) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: 1,50217

95% CI for difference: (-5,04708; 8,05142)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,54 P-Value = 0,604 DF = 7

Results for: Fundo

Results for: FundoResults for: Fundo

Results for: Fundo

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Two-sample T for Controle3F vs Tratado3F

N Mean StDev SE Mean

Controle3F 6 75,32 8,41 3,4

Tratado3F 6 80,32 8,70 3,6

Difference = mu (Controle3F) - mu (Tratado3F)

Estimate for difference: -4,99658

95% CI for difference: (-16,17212; 6,17895)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,01 P-Value = 0,338 DF = 9

Results for: Lateral

Results for: LateralResults for: Lateral

Results for: Lateral

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle

Test and CI: ControleTest and CI: Controle

Test and CI: Controle3L; Tratado3L

3L; Tratado3L 3L; Tratado3L

3L; Tratado3L

Two-sample T for Controle3L vs Tratado3L

N Mean StDev SE Mean

Controle3L 6 78,71 7,27 3,0

Tratado3L 6 79,70 5,29 2,2

Difference = mu (Controle3L) - mu (Tratado3L)

Estimate for difference: -0,990016

95% CI for difference: (-9,291726; 7,311694)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,27 P-Value = 0,793 DF = 9

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Two-sample T for Controle7F vs Tratado7F

N Mean StDev SE Mean

Controle7F 6 71,17 6,65 2,7

Tratado7F 6 71,25 6,10 2,5

Difference = mu (Controle7F) - mu (Tratado7F)

Estimate for difference: -0,083689

95% CI for difference: (-8,417746; 8,250369)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,02 P-Value = 0,982 DF = 9

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Two-sample T for Controle7L vs Tratado7L

N Mean StDev SE Mean

Controle7L 6 77,84 5,62 2,3

Tratado7L 6 81,98 3,07 1,3

Difference = mu (Controle7L) - mu (Tratado7L)

Estimate for difference: -4,13896

95% CI for difference: (-10,32179; 2,04387)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,58 P-Value = 0,157 DF = 7

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Mean of C

Mean of CMean of C

Mean of Controle3

ontrole3 ontrole3

ontrole3

Mean of Controle3 = 77,5827

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 Mean of Tratado3

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 = 79,9082

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7 Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Variable Mean StDev

Controle7 75,62 5,28

Tratado7 78,41 3,06

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3 Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Variable Mean StDev

Controle3 77,58 6,80

Tratado3 79,91 6,05

Results for: Fundo3

Results for: Fundo3Results for: Fundo3

Results for: Fundo3

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

F F

Variable Mean StDev

Controle3F 75,32 8,41

Tratado3F 80,32 8,70

Results for: Lateral3

Results for: Lateral3Results for: Lateral3

Results for: Lateral3

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Variable Mean StDev

Controle3L 78,71 7,27

Tratado3L 79,70 5,29

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Desc

DescDesc

Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

riptive Statistics: Controle7F; Tratado7F riptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

riptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

Variable Mean StDev

Controle7F 71,17 6,65

Tratado7F 71,25 6,10

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Variable Mean StDev

Controle7L 77,84 5,62

Tratado7L 81,98 3,07

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado Test and CI: Controle; Tratado

Test and CI: Controle; Tratado

Two-sample T for Controle vs Tratado

N Mean StDev SE Mean

Controle 6 77,58 6,80 2,8

Tratado 6 79,91 6,05 2,5

Difference = mu (Controle) - mu (Tratado)

Estimate for difference: -2,32554

95% CI for difference: (-10,73254; 6,08147)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,63 P-Value = 0,547 DF = 9

One

OneOne

One-

-way ANOVA: Controle; Tratado

way ANOVA: Controle; Tratado way ANOVA: Controle; Tratado

way ANOVA: Controle; Tratado

Source DF SS MS F P

Factor 1 16,2 16,2 0,39 0,545

Error 10 414,3 41,4

Total 11 430,6

S = 6,437 R-Sq = 3,77% R-Sq(adj) = 0,00%

Individual 95% CIs For Mean Based on

Pooled StDev

Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--------

Controle 6 77,583 6,799 (--------------*--------------)

Tratado 6 79,908 6,053 (--------------*-------------)

-+---------+---------+---------+--------

72,0 76,0 80,0 84,0

Pooled StDev = 6,437

Fisher 95% Individual Confidence Intervals

All Pairwise Comparisons

Simultaneous confidence level = 95,00%

Controle subtracted from:

Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--

Tratado -5,955 2,326 10,606 (----------------*---------------)

-------+---------+---------+---------+--

-5,0 0,0 5,0 10,0

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7 Test and CI: Controle7; Tratado7

Test and CI: Controle7; Tratado7

Two-sample T for Controle7 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Controle7) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: -2,78720

95% CI for difference: (-8,53172; 2,95732)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,12 P-Value = 0,296 DF = 8

100

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3; Control

Test and CI: Controle3; ControlTest and CI: Controle3; Control

Test and CI: Controle3; Controle7

e7 e7

Two-sample T for Controle3 vs Controle7

N Mean StDev SE Mean

Controle3 6 77,58 6,80 2,8

Controle7 6 75,62 5,28 2,2

Difference = mu (Controle3) - mu (Controle7)

Estimate for difference: 1,96383

95% CI for difference: (-5,98465; 9,91231)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,56 P-Value = 0,590 DF = 9

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7 Test and CI: Tratado3; Tratado7

Test and CI: Tratado3; Tratado7

Two-sample T for Tratado3 vs Tratado7

N Mean StDev SE Mean

Tratado3 6 79,91 6,05 2,5

Tratado7 6 78,41 3,06 1,3

Difference = mu (Tratado3) - mu (Tratado7)

Estimate for difference: 1,50217

95% CI for difference: (-5,04708; 8,05142)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,54 P-Value = 0,604 DF = 7

Results for: Fu

Results for: FuResults for: Fu

Results for: Fundo

ndondo

ndo

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Test and CI: Controle3F; Tratado3F

Two-sample T for Controle3F vs Tratado3F

N Mean StDev SE Mean

Controle3F 6 75,32 8,41 3,4

Tratado3F 6 80,32 8,70 3,6

Difference = mu (Controle3F) - mu (Tratado3F)

Estimate for difference: -4,99658

95% CI for difference: (-16,17212; 6,17895)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,01 P-Value = 0,338 DF = 9

Results for: Lateral

Results for: LateralResults for: Lateral

Results for: Lateral

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Test and CI: Controle3L; Tratado3L Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Test and CI: Controle3L; Tratado3L

Two-sample T for Controle3L vs Tratado3L

N Mean StDev SE Mean

Controle3L 6 78,71 7,27 3,0

Tratado3L 6 79,70 5,29 2,2

101

Difference = mu (Controle3L) - mu (Tratado3L)

Estimate for difference: -0,990016

95% CI for difference: (-9,291726; 7,311694)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,27 P-Value = 0,793 DF = 9

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Test and CI: Controle7F; Tratado7F

Two-sample T for Controle7F vs Tratado7F

N Mean StDev SE Mean

Controle7F 6 71,17 6,65 2,7

Tratado7F 6 71,25 6,10 2,5

Difference = mu (Controle7F) - mu (Tratado7F)

Estimate for difference: -0,083689

95% CI for difference: (-8,417746; 8,250369)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,02 P-Value = 0,982 DF = 9

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Two

TwoTwo

Two-

-Sample T

Sample TSample T

Sample T-

-Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Test and CI: Controle7L; Tratado7L

Two-sample T for Controle7L vs Tratado7L

N Mean StDev SE Mean

Controle7L 6 77,84 5,62 2,3

Tratado7L 6 81,98 3,07 1,3

Difference = mu (Controle7L) - mu (Tratado7L)

Estimate for difference: -4,13896

95% CI for difference: (-10,32179; 2,04387)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,58 P-Value = 0,157 DF = 7

Results for: Global

Results for: GlobalResults for: Global

Results for: Global

Mean of Controle3

Mean of Controle3 Mean of Controle3

Mean of Controle3

Mean of Controle3 = 77,5827

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 Mean of Tratado3

Mean of Tratado3

Mean of Tratado3 = 79,9082

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 7 dias

7 dias 7 dias

7 dias

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7 Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

Descriptive Statistics: Controle7; Tratado7

102

Variable Mean StDev

Controle7 75,62 5,28

Tratado7 78,41 3,06

Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R Results for: Dados Média %R

Results for: Dados Média %R -

- 3 dias

3 dias 3 dias

3 dias

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3 Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Descriptive Statistics: Controle3; Tratado3

Variable Mean StDev

Controle3 77,58 6,80

Tratado3 79,91 6,05

Results for: Fundo3

Results for: Fundo3Results for: Fundo3

Results for: Fundo3

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

Descriptive Statistics: Controle3F; Tratado3F

Variable Mean StDev

Controle3F 75,32 8,41

Tratado3F 80,32 8,70

Results for: Lateral3

Results for: Lateral3Results for: Lateral3

Results for: Lateral3

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Descriptive Statistics: Controle3L; Tratado3L

Variable Mean StDev

Controle3L 78,71 7,27

Tratado3L 79,70 5,29

Results for: Fundo7

Results for: Fundo7Results for: Fundo7

Results for: Fundo7

Descriptive Sta

Descriptive StaDescriptive Sta

Descriptive Statistics: Controle7F; Tratado7F

tistics: Controle7F; Tratado7F tistics: Controle7F; Tratado7F

tistics: Controle7F; Tratado7F

Variable Mean StDev

Controle7F 71,17 6,65

Tratado7F 71,25 6,10

Results for: Lateral7

Results for: Lateral7Results for: Lateral7

Results for: Lateral7

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Descriptive Statistics: Controle7L; Tratado7L

Variable Mean StDev

Controle7L 77,84 5,62

Tratado7L 81,98 3,07

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