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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
Ocorrência e caracterização morfológica de
Blastocystis sp. em três espécies de aves
comercializadas em mercados municipais do
Rio de Janeiro
Wyslaine Costa da Cruz
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE
Blastocystis sp. EM TRÊS ESPÉCIES DE AVES COMERCIALIZADAS
EM MERCADOS MUNICIPAIS DO RIO DE JANEIRO
WYSLAINE COSTA DA CRUZ
Sob a Orientação da Professora
Teresa Cristina Bergamo do Bomfim
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Veterinária
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2008
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96
7o
T
o /
da cruz – 2008.
56f. : il.
resa Cristina
m.
Graduação
Bibliografia: f. 39-44.
Ciências Veterinárias.
. Título.
636.508
C83
Cruz, Wyslaine Costa da, 1977-
Ocorrência e caracterização
morfológica de Blastocystis sp. Em
três espécies de aves
comercializadas em mercados
municipais do Rio de Janeir
Wyslaine Costa
Orientador: Te
Bergamo do Bomfi
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Curso de Pós-
em Ciências Veterinárias.
1. Ave doméstica – Parasito –
Teses. 2. Blastocystis – Teses. 3.
Ave doméstica – Doenças - Teses. I.
Bomfim, Teresa Cristina Bergamo do.
II. Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro. Curso de Pós-
Graduação em
III
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os dois homens que me ensinaram a ser
udo que sou hoje e que serei sempre.
E
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c
xemplos de caráter, dignidade,
edicação, força de vontade e
umplicidade.
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o meu pai Cícero e meu “pai” Delcimar,
edico todo esse trabalho.
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starão sempre guardados em minha
ente e meu coração.
Aos dois homens que me ensinaram a ser
tudo que sou hoje e que serei sempre.
Exemplos de caráter, dignidade,
dedicação, força de vontade e
cumplicidade.
Ao meu pai Cícero e meu “pai” Delcimar,
dedico todo esse trabalho.
Estarão sempre guardados em minha
mente e meu coração.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS, responsável pela vida e por todas as coisas e por permitir que
desfrutemos de tudo isso.
À minha grande amiga Raquel Saucier, a quem muito devo por ter chegado a este
ponto, me auxiliando e me ensinando os caminhos. Tenho-te sempre como meu espelho de
virtudes profissional e pessoal.
À professora e minha orientadora Teresa Cristina, que desde a graduação sempre teve
muita atenção e dedicação, o que permitiu que se criassem elos profissionais e de amizade.
À minha família, base forte de sustentação. Minha mãe Neuma, uma mulher de fibra e
garra que, incondicionalmente, sempre esteve comigo me dando amor, carinho e sua
dedicação. Ao meu querido pai, Cícero Canuto (in memorian), meu maior incentivador, do
qual sempre teve muito orgulho em dizer que eu era seu filho.
À minha irmã Estherlaine, que, ao meu lado, dividiu momentos alegres e tristes e que
sempre tive como exemplo de pessoa briosa. Ao meu cunhado Ronison e ao meu sobrinho
Vítor Luís, que chegou para preencher e encher de alegria minha vida.
À minha amiga e namorada Talita, que, com sua alegria contagiante, apareceu em um
momento delicado de minha vida e, mesmo estando longe nesse momento, me deu forças,
incentivo e me ajudou a caminhar.
Aos meus grandes amigos Elaine Bandeira, Felipe Marques, Renata Scarlato, Rodrigo
Neves e Vanessa Santana, que sempre me proporcionaram bons momentos na vida acadêmica
e agora na vida pessoal. Eu nunca os esquecerei.
Ao sexteto que me adotou como parte de suas famílias: Alcione, Allan, Paula, Pedro,
Rosângela e Victor; me dando sempre a imensa alegria de estar com vocês.
A todos meus amigos e companheiros da turma de mestrado, nos quais dividimos e
compartilhamos dois anos de estudo, trabalho e um pouco de diversão.
A todos os professores e funcionários do curso de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias pela convivência quase que diária.
À dona Marlene e a todas as meninas da cantina, que sempre tiveram muito carinho e
atenção comigo, além de um cafezinho descontraído no meio da tarde para relaxar.
E por último, a todas as pessoas que me auxiliaram, de forma direta e indireta, nesse
trabalho e ao curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro.
RESUMO
CRUZ, Wyslaine Costa da. Ocorrência e caracterização morfológica de Blastocystis sp.
em três espécies de aves comercializadas em mercados municipais do Rio de Janeiro.
2008. 44 p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária).
Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Veterinária, Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Blastocystis hominis é um dos parasitos de maior prevalência no trato gastrintestinal de
humanos, porém seu papel patogênico ainda permanece incerto. Alguns organismos
semelhantes à B. hominis têm sido descritos em uma variedade de hospedeiros não-humanos
sendo denominado Blastocystis sp., mas seu potencial zoonótico não está esclarecido. O
objetivo desse trabalho foi verificar a ocorrência de infecção natural de Blastocystis sp. em
três espécies de aves domésticas comercializadas em dois mercados municipais do Rio de
Janeiro, caracterizando morfologicamente esses organismos encontrados em material fecal
para a emissão de um diagnóstico preciso. Foram adquiridas 214 aves, sendo 35 patos (Anas
platyrhynchos) do mercado A e 38 do mercado B, 35 codornas (Coturnix japonica) do
mercado A e 36 do mercado B, e 35 pintos (Gallus gallus)do mercado A e 35 do mercado B.
Das aves pesquisadas no mercado A, 8 (22,9%) pintos, 15 (42,9%) codornas e 13 (37,1%)
patos apresentaram formas biológicas de Blastocystis sp. nas fezes, enquanto que no mercado
B, 15 (42,9%) pintos, 2 (5,56%) codornas e 21 (55,3%) patos apresentaram tais formas nas
fezes. Não houve uma diferença estatisticamente significativa em relação à ocorrência de
infecção em patos e pintos dos dois mercados municipais pesquisados, ocorrendo essa
diferença somente entre as codornas dos dois mercados. Ao considerarmos o número de aves
infectadas nos dois mercados, independentemente da espécie, observou-se que não houve uma
diferença estatisticamente significativa entre os dois mercados. Das observações de esfregaço
de fezes coradas com Giemsa daqueles animais que apresentaram positividade para
Blastocystis sp., foi possível caracterizar seis formas do organismo, sendo estas: vacuolar,
granular, amebóide, císticas, avacuolar e multivacuolar. Também foi possível caracterizar as
formas reprodutivas de Blastocystis sp. como: divisão binária, endodiogenia, brotamento,
plamatomia e esquizogonia. Mesmo não tendo estudos que confirmem o potencial zoonótico e
patogênico de Blastocystis sp., tanto para hospedeiros humanos quanto para animais, sugere-
se que nesses mercados de comercialização pode ocorrer a contaminação ambiental, devido às
condições higiênicas e sanitárias serem de péssima qualidade, sendo um risco para os animais,
assim como para a população humana que comumente freqüentam esses ambientes. O
conhecimento das formas evolutivas que foram encontradas e caracterizadas no presente
trabalho é de grande importância para que se tenha um diagnóstico preciso e confiável de
Blastocystis sp. em material fecal.
Palavras-chave: Caracterização morfológica, Blastocystis sp., Aves domésticas.
ABSTRACT
CRUZ, Wyslaine Costa da. Occurrence and morphological characterization of
Blastocystis sp. in three bird species sold at cooperative markets in Rio de Janeiro. 2008.
44 p. Dissertation (Masters in Veterinary Sciences with Specialization in Veterinary
Parasitology). Veterinary Institute, Department of Veterinary Parasitology, Rio de Janeiro
Federal Rural University, Seropédica, RJ, 2008.
Blastocystis hominis is one of the most prevalent parasites of the human gastrointestinal tract,
but its pathogenic role still remains uncertain. Some organisms similar to B. hominis have
been described in a range of non-human hosts and are denominated Blastocystis sp., but their
zoonotic potential still needs clarification. The objective of this work was to investigate the
occurrence of natural infection by Blastocystis sp. in three species of domesticated birds sold
at cooperative markets (with individual vendor stalls) in two districts of the city of Rio de
Janeiro and to characterize the morphology of these organisms found in bird droppings, to
enable a precise diagnosis. A total of 214 birds were purchased: 35 ducks (Anas
platyrhynchos) from market A and 38 from market B, 35 quails (Coturnix japonica) from
market A and 36 from market B and 35 chicks (Gallus gallus) from market A and 35 from
market B. Of the birds studied from market A, 8 chicks (22.9%), 15 quails (42.9%) and 13
ducks (37.1%) presented biological forms of Blastocystys sp. in their droppings, while at the
market B, the respective figures were 15 chicks (42.9%), 2 quails (5.56%) and 21 ducks
(55.3%). There was no statistically significant difference in relation to the occurrence of
infection in ducks and chicks between the two markets studied, but there was between the
quails at the two markets. Considering the number of infected birds at the two markets
irrespective of species, the difference was statistically significant. From the observations of
the stained fecal smears of the animals that were positive for Blastocystis sp., it was possible
to characterize six forms of organisms, namely vacuolar, granular, ameboid, cystic, avacuolar
and multivacuolar. It was also possible to characterize the reproductive forms of Blastocystis
sp. as binary division, endodyogeny, budding, plamotomy and schizogeny. Even though there
are no studies confirming the zoonotic and pathogenic potential of Blastocystis sp., either to
human or animal hosts, we suggest that environmental contamination can be occurring at
these markets, due to the poor hygienic and sanitary conditions, thus posing a risk to both the
animals and the people who circulate there. The knowledge of evaluative forms that were
found and characterized in this work is important to gives a precise and faithful diagnosis of
Blastocystis sp. in dropping.
Key words: Morphological characterization, Blastocystis sp., domesticated birds.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Ocorrência de Blastocystis sp. em pintos (Gallus
gallus) provenientes de dois mercados municipais do Rio de
Janeiro 14
Tabela 2 – Ocorrência de Blastocystis sp. em patos (Anas
platyrhynchos) provenientes de dois mercados municipais do Rio
de Janeiro 15
Tabela 3 – Ocorrência de Blastocystis sp. em codornas (Coturnix
japonica) provenientes de dois mercados municipais do Rio de
Janeiro 16
Tabela 4 – Ocorrência de Blastocystis sp. em patos, pintos e
codornas comercializados nos mercados municipais do Rio de
Janeiro 17
Tabela 5 – Ocorrência de Blastocystis sp. em aves
comercializadas nos dois mercados municipais do Rio de Janeiro 17
Tabela 6 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas vacuolares (n=100) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro 19
Tabela 7 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas granulares (n=100) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro 22
Tabela 8 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas amebóides (n=17) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas nos mercados municipais do Rio de Janeiro 22
Tabela 9 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas císticas (n=200) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas nos mercados municipais do Rio de Janeiro 24
Tabela 10 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas avacuolares (n=60) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro 27
Tabela 11 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das
formas multivacuolares (n=25) de Blastocystis sp. em aves
comercializadas nos mercados municipais do Rio de Janeiro 27
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma vacuolar de
Blastocystis sp.: A – Presença de um vacúolo central (→), B –
Apresentando sete núcleos em seu citoplasma (─ = 10 µm). 20
Figura 2 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma granular de
Blastocystis sp. possuindo citoplasma com algumas inclusões: A – B,
com um único núcleo, C – D com mais de um núcleo (─ = 10 µm). 21
Figura 3 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma amebóide
de Blastocystis sp.: A - B possuindo projeções semelhantes à
pseudópodes que são emitidas do seu citoplasma (─ = 10 µm). 23
Figura 4 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, formas císticas de
Blastocystis sp.: A – observa-se nitidamente uma camada fibrilar
envolvendo os cistos que contém núcleos, B e C – possuindo vestígios
de camada fibrilar e cistos contendo núcleos, D – cistos dispersos em
fezes, contendo núcleos e alguns “vacúolos” podem ser observados em
seu interior (─ = 10 µm). 25
Figura 5 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma avacuolar
de Blastocystis sp.: A, B e C – Formas possuindo tamanhos variados e
sem a presença de vacúolos em seu citoplasma (─ = 10 µm). 26
Figura 6 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma
multivacuolar de Blastocystis sp.: A, B e C – Formas possuindo
tamanhos variados com a presença de vários vacúolos em seus
citoplasmas (─ = 10 µm). 28
Figura 7 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por
divisão binária de Blastocystis sp.: A – Início da divisão binária, onde
observamos um alongamento da célula e núcleos em pólos opostos, B –
Célula com a divisão do seu citoplasma, C – Uma possível célula
proveniente da divisão binária (─ = 10 µm). 30
Figura 8 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por
endodiogenia de Blastocystis sp.: A, B e C – Formas possuindo a
internalização do seu citoplasma para que ocorra a divisão, D – Forma
onde observa-se a divisão do núcleo e do citoplasma (─ = 10 µm). 31
Figura 9 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por
brotamento de Blastocystis sp.: A – Aumento em um dos lados da
célula, dando origem a uma nova célula de tamanho menor, B – Mais
de uma célula filha de tamanhos diferentes sendo originadas de uma
maior (─ = 10 µm). 32
Figura 10 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por
plasmatomia de Blastocystis sp.: observamos o prolongamento da
membrana citoplasmática que originará uma outra célula (─ = 10 µm).
33
Figura 11 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por
esquizogonia de Blastocystis sp.: A e B – Cistos com um a dois
núcleos, C – Cistos onde observa-se a multiplicação nuclear (→) e
posterior liberação de formas alongadas semelhantes a esporozoítas
( ►) (─ = 10 µm). 35
Figura 12 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa: A, B, C e D –
Formas não identificadas de Blastocystis sp. 36
Figura 13 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa: A, B e C -
Formas não identificadas de Blastocystis sp. 37
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1
2 REVISÃO DE LITERATURA
3
2.1 Histórico 3
2.2 Classificação Taxonômica 3
2.3 Espécies Consideradas Como Válidas 4
2.4 Diagnóstico 4
2.4.1 Diagnóstico clínico 4
2.4.2 Diagnóstico parasitológico 4
2.4.3 Diagnóstico sorológico/imunológico 5
2.4.4 Diagnóstico por genotipagem 5
2.5 Características Biológicas 6
2.5.1 Formas evolutivas 6
2.5.2 Formas reprodutivas 7
2.5.3 Ciclo biológico 7
2.6 Infecção Por Blastocystis 8
2.6.1 Infecção em humanos 8
2.6.2 Infecção em aves 8
2.6.3 Infecção em outras espécies de animais 9
2.7 Epidemiologia 9
3 MATERIAL E MÉTODOS
11
3.1 Procedência Dos Animais 11
3.2 Descrição Dos Mercados Municipais 11
3.3 Descrição Dos Alojamentos E Comercialização Das Aves 11
3.4. Acondicionamento Das Aves No Laboratório 12
3.5 Coleta Das Amostras De Fezes 12
3.6 Procedimentos Laboratoriais 12
3.7 Observação De Formas Evolutivas De Blastocystis sp. 13
3.8 Preparo E Montagem De Lâminas Para Caracterização
Morfológica De Blastocystis.sp.
13
3.9. Caracterização Morfológica 13
3.10 Análise Estatística 13
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
14
4.1 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp.
Em Pintos (Gallus gallus) Dos Mercados Municipais 14
4.2 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp.
Em Patos (Anas platyrhynchos) Dos Mercados Municipais 15
4.3 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp.
Em Codornas (Coturnix japonica)Dos Mercados Municipais 15
4.4 Verificação Geral Da Ocorrência Da Infecção Natural De Blastocystis sp.
Entre Patos, Pintos e Codornas Pesquisados Nos Dois Mercados Municipais 16
4.5 Caracterização Morfológica De Blastocystis sp. 19
4.5.1 Morfometria de Blastocystis sp. 19
4.5.2 Formas reprodutivas de Blastocystis sp. 29
5 CONCLUSÕES
38
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
39
1 INTRODUÇÃO
É muito conhecida a relação entre o ser humano e os animais, explorando várias
espécies como fonte de alimento, força de tração para o trabalho e também para desfrutar de
sua companhia. Mas essa relação sempre teve vantagens e desvantagens. Devido à
convivência com os animais domésticos houve o surgimento de várias doenças em humanos,
originando-se assim as zoonoses.
Muitos animais são portadores de patógenos com potencial zoonótico e eles têm
contribuído para o aumento de infecções já conhecidas e também outras cuja importância
como zoonose ainda é contestada.
Dentre esses patógenos está Blastocystis hominis, um organismo descrito pela primeira
vez no início do século XX, mas que até o momento causa muita controvérsia a respeito de
seu papel como patógeno e mesmo sobre o seu potencial zoonótico. Nas últimas décadas foi
dedicada grande atenção à Blastocystis hominis, principalmente devido ao aumento no
número de ocorrências em diagnósticos de rotina e também por estar sendo considerado como
patogênico para humanos.
Blastocystis hominis é a única espécie do gênero reconhecida na literatura que é
encontrada no trato gastrintestinal de humanos. Porém vários autores o descreveram em
muitas outras espécies de hospedeiros animais denominando-o Blastocystis sp. Dentre os
hospedeiros animais, as aves domésticas e silvestres têm se destacado como sendo de grande
relevância, devido às similaridades genéticas de isolados desses animais com os isolados de
humanos, enfatizando-se o aspecto zoonótico nesses hospedeiros.
No Estado do Rio de Janeiro existem vários locais onde há a comercialização de aves
domésticas vivas ou mortas. Dentre esses se destacam as feiras livres, aviários na periferia de
vários municípios e os grandes mercados municipais. No município do Rio de Janeiro essa
comercialização é, na maioria das vezes, realizada em mercados municipais onde há grande
quantidade e variabilidade de espécies de aves, além de outras espécies de animais. Nesses
ambientes existe a comercialização diversificada de mercadorias que geralmente são dispostas
próximas às lojas onde são comercializados esses animais, além disso, há a movimentação
intensa de pessoas na busca de produtos de baixo custo financeiro.
Muitas das aves adquiridas nesses locais são destinadas para o abate no domicílio, para
criações de subsistência, com a exploração de seus produtos para o consumo e também,
algumas vezes como animais de estimação.
A prática de adquirir animais vivos desses locais, onde não se tem um conhecimento
sobre a origem e um histórico dos fornecedores, onde não há um controle e um cuidado em
abrigar esses animais separados de outros, pode constituir um risco de disseminação de vários
patógenos, expondo tanto as pessoas que habitualmente freqüentam esses ambientes quanto às
várias espécies de animais que compartilham esses locais.
Nessa última década as pesquisas com Blastocystis têm sido intensificadas, porém
ainda não há um consenso sobre a real condição se Blastocystis tem um papel patogênico ou
mesmo se seus isolados de hospedeiros não-humanos possuem potencial zoonótico. No
entanto, Blastocystis vem sendo considerado como um dos organismos de alta prevalência no
trato gastrintestinal de humanos e em várias espécies de animais. Devido à escassez de
informações sobre Blastocystis sp. em várias espécies de hospedeiros não-humanos, torna-se
de grande relevância o conhecimento dos aspectos biológicos e morfológicos das várias
formas do seu ciclo de vida encontradas em material fecal para a obtenção de um diagnóstico
preciso e confiável.
1
O presente trabalho teve como propósito verificar a ocorrência de Blastocystis sp. em
três espécies aves domésticas, patos (Anas platyrhynchos), codornas (Coturnix japonica) e
pintos (Gallus gallus), naturalmente infectadas comercializadas em mercados municipais do
Rio de Janeiro, identificando e caracterizando morfologicamente as formas biológicas
encontradas em material fecal.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico
A primeira descrição que propôs Blastocystis como um gênero distinto foi feito por
Alexeieff em 1911 que nomeou a espécie Blastocystis enterocola como sendo uma levedura.
Porém, Brumpt em 1912 propôs o nome B. hominis para o organismo isolado de material
fecal humano, sendo essa a denominação atual na literatura para isolados obtidos de humanos.
Após essa primeira descrição, poucos trabalhos foram realizados com B. hominis e
alguns pesquisadores erroneamente atribuíam certas doenças ao organismo. Em 1927,
Rosembusch, em um erro de diagnóstico, colocou B. hominis como causa da doença da
cabeça negra, em perus e, por um erro similar, a patologia hepática em humanos também foi
atribuída ao B. hominis (ZIERDT, 1991).
Muitas publicações classificavam B. hominis como uma levedura (BRUMPT, 1912;
CIFERRI; REDAELLI, 1938; WOLYNSKA; SOROCZAN, 1972), pesquisadores,
equivocadamente, descreviam-no como um cisto de um flagelado, material vegetal, leveduras
e também como fungos (ZIERDT, 1991), mas Zierdt et al. em 1967, descreveram as
características de protozoário do organismo.
Nas décadas de 1970 e 1980 os trabalhos de Charles Zierdt chamaram a atenção de
biólogos e clínicos (TAN et al., 2002) e, a partir daí, muitos trabalhos foram realizados,
principalmente enfocando os aspectos morfológicos de B. hominis (STENZEL; BOREHAM,
1996).
Hoje B. hominis é provavelmente o protozoário mais comum do trato gastrintestinal de
humanos em várias partes do mundo (STENZEL; BOREHAM, 1996) e também é encontrado
em uma grande variedade de hospedeiros como suínos, macacos, cobaias, aves, répteis e ratos
(BOREHAM; STENZEL, 1993) sendo fortemente considerado como um organismo
potencialmente zoonótico (TAN, 2004).
2.2 Classificação Taxonômica
Apesar de ter sido descrito no inicio do século XX, atualmente ainda há controvérsias
na classificação taxonômica de Blastocystis.
Inicialmente foi classificado como uma levedura (ALEXEIEFF, 1911; BRUMPT,
1912; CIFERRI; REDAELLI, 1938). Suas características de protozoário foram
posteriormente descritas por Zierdt et al. (1967), baseadas em critérios morfológicos e
fisiológicos. Em 1991, Zierdt classificou o organismo inicialmente como sendo um
Sporozoário, levando em consideração suas características morfológicas, de cultivo e seu
modo de divisão, e posteriormente o reclassificou como pertencente ao grupo Sarcodina.
Com o advento da biologia molecular, a taxonomia, associando as afinidades
filogenéticas de Blastocystis, foi comparada com diferentes Eukaryotos. As análises das
seqüências parciais de SSUrRNA mostraram que B. hominis não é monofilético com
leveduras, fungos, sarcodinas ou esporozoários (JOHNSON et al., 1989), levando a conclusão
de que B. hominis não está relacionado às leveduras e poderia ser colocado em um grupo
mais distante da classe que liga Ciliados e Apicomplexos.
Em um outro estudo, Cavalier-Smith (1997), indicou que Blastocystis era
filogeneticamente relacionado ao flagelado Proteromonas, sendo que Blastocystis não possuía
flagelo e nem tubos capilares. De acordo com a classificação, Blastocystis não é nem um
fungo e nem um protozoário como anteriormente suposto, e, pelo fato dele não possuir cílios,
3
foi criada uma nova classe Blastocystea no Subfilo Opalinata, Infra-reino Heterokonta,
Subreino Chromobiota, Reino Chromista, fazendo com que Blastocystis seja o primeiro
chromista conhecido parasitando humanos (CAVALIER-SMITH, 1998).
2.3 Espécies Consideradas Como Válidas
Dados indicam que diferentes grupos de isolados de Blastocystis podem ser
diferenciados em humanos e isso levantou a hipótese de haver mais de uma espécie de
Blastocystis infectando humanos (STENZEL; BOREHAM, 1996).
Outros pesquisadores propuseram espécies de Blastocystis para hospedeiros não-
humanos, sendo: B. galli para frangos (BELOVA; KOSTENKO, 1990), B. anatis para patos
domésticos (BELOVA, 1991), B. anseri para gansos domésticos (BELOVA, 1992) e B.
lapemi para cobra-do-mar (Lapemis hardwickii) (TEOW et al., 1991), porém, a maioria dos
isolados de Blastocystis é indistinguível morfologicamente, através da observação em
microscopia óptica e eletrônica (NOËL et al., 2005). Mas enquanto não houver confirmações
posteriores usando dados moleculares disponíveis, B. hominis será definido como parasita
isolado de humanos e Blastocystis sp. será definido como aquele isolado de outros animais
(NOËL et al., 2005).
2.4 Diagnóstico
2.4.1 Diagnóstico clínico
O diagnóstico clínico ainda é discutido e relacionado com várias controvérsias e
indefinições, entre elas, se B. hominis é ou não patogênico, já que este organismo demonstra
não invadir tecidos. Porém é prudente considerá-lo como potencialmente patogênico.
Os sinais clínicos da infecção por Blastocystis observados em humanos não são
específicos e incluem diarréia, dores abdominais, náuseas e, em casos agudos, diarréia aquosa
profusa e febre (TAN, 2004). Fadiga, anorexia, flatulência e outros distúrbios gastrintestinais
não específicos também podem ser associados à infecção por B. hominis (STENZEL;
BOREHAM, 1996).
Num estudo de infecção experimental de B. hominis em camundongos, Moe et al.
(1997) relataram que alguns animais apresentaram edema de ceco, perda de peso e os animais
apresentavam-se letárgicos e com fezes pastosas.
Quilez et al. (1995) também relataram diarréia em suínos com seis semanas de idade
que, em exame parasitológico de fezes, apresentaram pequenas quantidades de formas de
Blastocystis sp.
A falta de um modelo experimental adequado e a dificuldade de se excluir todas as
outras causas dos sinais clínicos faz com que o papel do Blastocystis como um agente
causador de patogenia em humanos e animais permaneça indefinido (TAN, 2004).
2.4.2 Diagnóstico parasitológico
O diagnóstico de Blastocystis é normalmente feito através de exame
coproparasitológico em microscópio óptico (ZIERDT, 1991) com a observação, normalmente,
das formas vacuolares (GARCIA; BRUCKNER, 1993).
Os métodos mais usados para diagnóstico de protozoários e outros parasitas
intestinais, como os métodos de concentração, não são eficazes para Blastocystis, pois
promovem a destruição das formas vacuolar, multivacuolar e granular do organismo
(MILLER; MINSHEW, 1988).
4
A sedimentação espontânea é sugerida como o método mais adequado para separar
Blastocystis do material fecal (GUIMARÃES; SOGAYAR, 1993), porém a adição de água
destilada nesse processo leva a lise da célula. É recomendada a adição de solução fisiológica
para o preparo da amostra para o seu diagnóstico (GARCIA; BRUCKNER, 1993; ZAMAN et
al., 1995).
O uso de corantes também pode ser utilizado para o diagnóstico em microscópio
óptico, onde os esfregaços de fezes podem ser corados pelo Trichomio (GARCIA;
BRUCKNER, 1993), Hematoxilina férrica (GUIMARÃES; SOGAYAR, 1993), Giemsa
(DAWES et al., 1990), Gram (ZIERDT, 1991) e corante de Wright (VANNATTA et al.,
1985) não existindo um método que seja mais eficiente que outro. Estes métodos parecem ser
o procedimento de escolha para o diagnóstico de B. hominis por causa da dificuldade de
identificação do organismo em material fecal fresco.
2.4.3 Diagnóstico sorológico/imunológico
Os testes sorológicos foram usados para identificar pacientes com B. hominis, porém
com pouco sucesso devido à falta de resposta imune (CHEN et al., 1987).
Garavelli et al. (1992) relataram que o teste ELISA detectou anticorpos séricos para B.
hominis em quatro pacientes e Zierdt et al. (1995) usaram teste ELISA e detectaram
anticorpos de imunoglobulina G no soro de 28 pacientes. No entanto, anticorpos apropriados
não estão disponíveis para a utilização em diagnóstico clínico (STENZEL; BOREHAM,
1996).
2.4.4 Diagnóstico por genotipagem
Estudos moleculares indicaram que B. homins não é uma simples espécie, pois vários
isolados têm demonstrado genótipos distintos, porém idênticos morfologicamente (CLARK,
1997; YOSHIKAWA et al., 1998, 2000).
Trabalhos considerando a caracterização molecular de isolados de Blastocystis têm
demonstrado seu potencial zoonótico através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), da
analise do Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP) e da
seqüência dos genes de pequenas-subunidades de rRNA (SSUrRNA) e rDNA (SSUrDNA). A
caracterização molecular tem se tornado uma ferramenta valiosa para elucidar esse potencial
zoonótico.
Abe et al. (2003), estudando isolados de Blastocystis pela PCR e análise do RFLP da
SSUrRNA, demonstraram que os genótipos de Blastocystis sp. isolados de bovinos e suínos
apresentaram-se geneticamente similares aos isolados de B. homins, considerando desta
forma, como sendo uma fonte potencial de infecção para humanos.
Arisue et al. (2003) e Noël et al. (2003) relataram nove isolados, sendo um de suíno,
três de roedores, quatro de aves e um de macaco, todos como tendo potencial zoonótico
baseando-se na comparação das seqüências do gene da SSUrRNA.
Noël et al. (2005) basearam-se em dados de classificação genotípica da PCR e
relacionaram seis grupos de isolados de Blastocystis, tanto de humanos quanto de animais,
como sendo de baixa especificidade por hospedeiros e sugeriram a existência de vários
isolados com freqüente transmissão de animal para o homem e do homem para o animal,
sendo este um grande reservatório potencial para infecção em humanos.
Num estudo conduzido por Abe (2004) que seqüenciou a SSUrDNA inteira de 19
isolados de Blastocystis de vários espécies de animais e analisou a relação filogenética desses
isolados com os isolados de humanos, verificou-se que os isolados provenientes de animais
poderiam ser classificados em sete grupos e que muitos desses apresentavam potencial
5
zoonótico devido as similaridades gênicas existentes entre animais e humanos e, com isto,
sugeriu a capacidade de realização de infecção cruzada entre os animais e humanos e vice-
versa.
2.5 Características Biológicas
2.5.1 Formas evolutivas
As descrições e as características morfológicas apresentadas são baseadas em B.
hominis que é a espécie reconhecida e considerada como válida na literatura.
Blastocystis é um organismo polimórfico que apresenta várias formas evolutivas
sendo descritas na literatura seis formas: vacuolar, granular, amebóide e a cística que são
comumente observadas (TAN et al., 2002) e as formas avacuolar e multivacuolar, que
ocorrem em menor freqüência. Nestas podemos encontrar filamentos semelhantes a inclusões
que também foram descritas na forma granular (STENZEL; BOREHAM 1996).
Existem poucas informações na literatura sobre a transição de uma forma evolutiva de
Blastocystis para a outra e a maioria dos dados morfológicos disponíveis enfatiza somente a
descrição dos seus estágios individualmente (TAN, 2004).
Forma vacuolar - Essa forma também é denominada como vacuolada ou forma de
“corpo central” do B. hominis (ZIERDT, 1991). É geralmente reconhecida para o diagnóstico
de B. hominis, sendo comumente encontrada em amostras fecais (GARCIA; BRUCKNER,
1993) e é também predominante em cultivo (ZIERDT, 1967; MATSUMOTO et al.,1987).
Essa forma apresenta um tamanho de 2 a 200 μm de diâmetro, com média variando entre 4 e
15 μm (STENZEL; BOREHAM, 1996). É caracterizada por conter um corpo central,
assemelhando-se a um vacúolo, que ocupa, aproximadamente, 90% do volume celular, com
uma fina camada de citoplasma periférico. Organelas como núcleos e estruturas similares à
mitocôndrias e complexo de Golgi estão localizadas nesse citoplasma periférico (TAN, 2004).
De modo não muito freqüente, o citoplasma dessas formas invagina para o vacúolo central
resultando na deposição dessas organelas citoplasmáticas para essa região.
Forma granular - Morfologicamente semelhante à forma vacuolar, compartilhando
muitas similaridades como formato e tamanho. Tem uma ultraestrutura similar à forma
vacuolar, apesar de os conteúdos do vacúolo central serem morfologicamente e
citoquimicamente diferentes. Esses grânulos, que se apresentam por toda a célula, podem ser
inclusões semelhantes à mielina, pequenas vesículas, grânulos cristalinos, pequenas porções
em forma de pontos de lipídios e também podem ser observados fragmentos de bactérias em
compartimentos semelhantes à lisossomas dentro do vacúolo central (TAN et al., 2002; TAN,
2004). Esses grânulos são encontrados no citoplasma e, mais comumente, em um maior
número de estruturas, dentro do vacúolo central (STENZEL; BOREHAM, 1996; TAN, 2004;
ZHANG et al., 2007).
Forma amebóide - Esta forma tem sido referida com pouca freqüência e foi também
observada em culturas mais velhas, culturas tratadas com antibióticos e, ocasionalmente, em
amostras fecais (TAN et al., 2002). Apresenta morfologia irregular com um ou dois
prolongamentos semelhantes à pseudópodes e ausência de um vacúolo central (STENZEL;
BOREHAM, 1996). No entanto, Tan e Zierdt (1973) descreveram a forma amebóide um
pouco diferente, como sendo organismos ovais com um ou dois grandes pseudópodes e com
vacúolo central. Por esse motivo, a forma amebóide tem tido relatos morfológicos confusos e
conflitantes (DUNN et al., 1989; ZIERDT, 1991; STENZEL; BOREHAM, 1996; TAN,
2004).
Forma cística - Vários estudos referem-se a uma pequena e resistente forma de B.
hominis, que possui um tamanho menor em relação às outras formas, variando de 2 a 5 μm, de
6
forma arredondada a ovóide, não possuindo um vacúolo central. As estruturas internas
incluem de 1 a 4 núcleos que aparecem como estruturas puntiformes escuras após a coloração
com iodo e também depósitos de glicogênio e de lipídio (TAN, 2004; ZHANG et al., 2007).
Forma multivacuolar – Ao invés de um único vacúolo grande, múltiplos vacúolos
pequenos de diferentes tamanhos e formas são verificados nas células de B hominis de
material fecal, sendo que também são observados em material cultivado (STENZEL et al.,
1991). Estas formas são menores comparando-se com as formas granulares ou vacuolares
típicas e possuem aproximadamente 5-8 μm de diâmetro.
Forma avacuolar – São formas pequenas quando observadas em material fecal em se
comparando com as mesmas obtidas de culturas (DUNN et al., 1989), não apresentam
vacúolo central e possuem aproximadamente 5 μm de diâmetro.
2.5.2 Formas reprodutivas
Zhang et al. (2007) descrevem cinco modos de reprodução de Blastocystis que foram
observados em material fecal e em meios de cultivo. Segue abaixo a descrição de cada modo
reprodutivo.
Divisão binária – Foi a forma de reprodução mais comumente observada em amostras
fecais, onde uma célula mãe se divide dando origem a duas células filhas de igual forma e
tamanho.
Endodiogenia – Foi ocasionalmente observada em amostras fecais, onde o vacúolo
central de uma célula mãe se divide em duas células menores e há a formação de uma nova
membrana entre os vacúolos das células filhas.
Brotamento ou Gemação – Foi observado em amostras frescas de fezes. É
caracterizado por um aumento em um dos lados da célula, onde dá origem a uma célula
menor. Às vezes podem ser observadas células originando duas ou três outras células.
Plasmatomia – Observada em cultura in vitro, onde há o prolongamento da
membrana citoplasmática que dá origem a outra célula.
Esquizogonia – Foi considerada como a forma reprodutiva de menor freqüência e só
observada em meio de cultivo. Onde uma grande célula, em média quatro vezes maior que a
forma vacuolar e granular, dando origem a outras células menores contendo estruturas
semelhantes à núcleos e grânulos refráteis.
Embora haja a descrição desses modos de reprodução, mais estudos são necessários
para o entendimento de sua biologia básica.
2.5.3 Ciclo biológico
Há consideráveis controvérsias em relação ao ciclo biológico e aos modos de divisão
ou tipos reprodutivos de Blastocystis.
Segundo Singh et al. (1995), os cistos, presente no ambiente, são ingeridos pelos
hospedeiros através da rota fecal-oral em água e alimentos contaminados. Após a ingestão
penetram nas células epiteliais do trato gastrintestinal e multiplicam-se assexuadamente.
Através da mitose ocorre a multiplicação das formas vacuolares, dando origem às formas
multivacuolares e formas amebóides. A forma multivacuolar desenvolve para pré-cisto que,
através da esquizogonia, dá origem aos cistos de parede fina responsáveis pela auto-infecção
interna do hospedeiro. A forma amebóide dará origem à pré-cisto, através da esquizogonia,
desenvolvendo cistos de parede grossa, que são excretados juntamente com as fezes e
liberados no meio ambiente.
No ciclo biológico proposto por Tan (2004), a infecção em humanos e animais é
iniciada quando uma forma cística, presente nas fezes, é ingerida com água e alimentos
7
contaminados. No trato gastrintestinal, esse cisto se desenvolve para a forma vacuolar que,
subsequentemente, se reproduz por divisão binária. Algumas formas vacuolares se encistam e
são excretados nas fezes do hospedeiro e, através da rota fecal-oral, são transmitidas à
humanos e animais. As fases em que as outras formas biológicas aparecem no ciclo ainda não
estão muito bem elucidadas.
2.6 Infecção Por Blastocystis
2.6.1 Infecção em humanos
A rota de infecção de Blastocystis é a fecal-oral, porém outras rotas de transmissão são
mencionadas, sendo que essas foram raramente conduzidas com estudos controlados
(YOOVA, 2004).
Estudos têm associado infecções por Blastocystis com indivíduos imunodeficientes,
principalmente portadores da imunodeficiência adquirida humana (AIDS), como sendo a
causa de distúrbios gastrintestinais, na maioria diarréia (CIRIONI et al., 1999; PRASAD et
al., 2000). No entanto outros trabalhos sugerem que não há essa associação (CIMERMAN et
al., 1999; LEDER et al., 2005).
Amato Neto et al. (2004) relataram a presença deste organismo em população infantil,
com uma taxa de prevalência de 38,3% em crianças com idade escolar entre 6 e 10 anos,
sendo esta percentagem expressiva e predominante para B. hominis.
Em uma área rural na comunidade de Tamarindo na Venezuela, a prevalência da
infecção por Blastocystis em crianças e adultos com idade de até 60 anos foi de 66,7%
(DEVERA et al., 2003).
Recentes pesquisas moleculares têm associado Blastocystis como possuindo um
potencial zoonótico (ABE et al., 2003; NOËL et al., 2005; RIVERA; TAN, 2005), porém não
há evidências desse potencial como também não há um consenso entre os pesquisadores se B.
hominis é um agente causador de distúrbios gastrintestinais como diarréia e dor abdominal em
humanos (YOOVA, 2004) ou ainda se este organismo é patogênico, comensal ou um
organismo oportunista (TAN, 2004).
2.6.2 Infecção em aves
Muitos organismos semelhantes à Blastocystis têm sido isolados de diversos animais,
principalmente de várias espécies de aves e mamíferos, como também répteis, anfíbios e,
ocasionalmente, em insetos (TANIZAKI et al., 2005).
Novas espécies de Blastocystis foram propostas para aves, dentre estas, B. galli
infectando frango (BELOVA; KOSTENKO, 1990), B. anatis infectando pato (BELOVA,
1991) e B. anseri infectando ganso (BELOVA, 1992). No entanto, essas espécies propostas de
Blastocystis não são consenso entre os pesquisadores.
Tanizaki et al. (2005) demonstraram que isolados de frangos, codornas e gansos foram
capazes de infectar frangos, demonstrando a infecção cruzada entre espécies de aves. Além
disso, um frango não infectado, ao ser introduzido e criado juntamente com outros
parasitados, adquiriu a infecção, enfatizando que a transmissão de Blastocystis acontece
facilmente entre a mesma espécie ou entre diferentes espécies de aves.
Lee e Stenzel (1999), estudando a prevalência de Blastocystis em 227 frangos
domésticos de cinco granjas comerciais e verificaram uma alta taxa de infecção,
aproximadamente 95%, em quatro das cinco granjas estudadas sendo que uma dessas granjas
não apresentou infecção nos frangos.
8
Em uma pesquisa de Blastocystis sp. em animais de zoológico, Abe et al.(2002)
encontraram uma prevalência de infecção da ordem de 80% em faisões e 56% em patos,
sendo que, dentre as espécies infectadas, oito espécies de faisão e quatro espécies de pato não
havia sido identificado Blastocystis sp. anteriormente.
Em um outro trabalho, Stenzel et al. (1997) relataram a presença de formas císticas de
Blastocystis sp. em 31% das amostras fecais dos frangos pesquisados.
Infecção experimental em ratos e frangos com quatro subtipos isolados de humanos
confirmou que alguns isolados de humanos poderiam infectar ratos e/ou frangos indicando o
potencial zoonótico de alguns isolados de humanos, fazendo com que ratos e frangos possam
ser modelos animais adequados para esses estudos (IGUCHI et al., 2007).
A maioria das infecções naturais de Blastocystis pode ser causada pela ingestão de
cistos em água e alimento contaminado, caracterizando a rota fecal-oral de transmissão,
porém há controvérsia quanto a patogenicidade de Blastocystis em aves (TANIZAKI et al.,
2005).
2.6.3 Infecção em outras espécies de animais
Estudos revelam que há uma alta prevalência de infecção por Blastocystis sp. em
diversas espécies de hospedeiros.
Duda et al. (1998) detectaram Blastocystis sp. em amostras fecais de 72 cães e 52
gatos domésticos, uma taxa de prevalência considerada alta, com 70,8% para cães e 67,3%
para gatos.
Em uma pesquisa de Blastocystis sp. em animais de produção, animais de estimação e
animais de zoológico, Abe et al. (2002) verificaram que as taxas de prevalência foram
variadas entre os grupos estudados. Uma alta prevalência de infecção nos animais de
produção onde dos 61 suínos e 55 bovinos pesquisados houve uma taxa de infecção em 95% e
71% dos animais respectivamente, porém nenhum dos 54 cães estudados apresentou a
infecção. Já dos 34 primatas do zoológico, 85% apresentaram infecção, enquanto que vários
carnívoros e herbívoros apresentaram-se negativos.
Yoshikawa et al. (2004) pesquisaram a infecção de Blastocystis sp. em anfíbios e
relataram uma taxa de 47,8% das 23 Rana nigromaculata (rã leopardo) pesquisadas, 92% das
25 Rana catesbeiana (rã touro) pesquisadas e 100% das 24 Bufo japonicus japonicus (sapo)
pesquisados.
Quilez et al. (1995) detectaram a presença de Blastocystis sp. em 7,5% dos 360 suínos
pesquisados na Espanha, encontrando positividade em nove das 17 fazendas estudadas.
Blastocystis sp. estava presente em animais de todas as faixas etárias, a partir de um mês de
idade a adultos. Dentre estes, a faixa etária com maior prevalência foi em suínos com idade de
um a dois meses, com 18,4% dos animais infectados, e com idade de dois a seis meses, com
15,4 % dos animais infectados.
2.7 Epidemiologia
Blastocystis hominis é um dos mais freqüentes organismos relatados em amostras
fecais de humanos (WINDSOR et al., 2002), apresentando uma prevalência que varia entre 30
e 50% em alguns países em desenvolvimento (STENZEL; BOREHAM, 1996) e uma
prevalência de 1,5% a 10 % nos paises desenvolvidos, sendo um dos parasitos de maior
freqüência nos Estados Unidos (VALLE et al., 2006).
Alguns estudos indicaram que a infecção de B. hominis é comum em moradores de
países tropicais e subtropicais em desenvolvimento (ZAKI et al., 1991; TORRES et al., 1992;
DEVERA et al., 2003) e em pessoas que viajaram para países em desenvolvimento
9
(STENZEL; BOREHAM, 1996), como também em imigrantes e refugiados desses países
(TAN, 2004).
Segundo Carbajal et. al. (1997), há um maior índice de parasitismo em adultos que em
crianças e um pequeno predomínio no sexo feminino, ainda que na maioria dos estudos não se
tem encontrado diferenças em relação ao sexo.
Sanad et al. (1991) e Torres et al. (1992) relataram transmissão de Blastocystis entre
membros da mesma família e em comunidades com precárias condições sanitárias.
Martin et al. (1990) analisaram a freqüência de Blastocystis em diferentes grupos
infantis e relataram a presença do parasito em crianças hospitalizadas, em creches e em
escolas primárias.
Uma das rotas de transmissão mais freqüente é a via fecal-oral, o que contribui para
uma maior prevalência de Blastocystis em locais onde há uma precária condição sanitária.
Porém, outros estudos apontam outras fontes potenciais de veiculação, como por via hídrica
(YOOVA, 2004) e por alimento contaminado (NOLLA; CANTOS, 2005).
Moura et al. (1989) sugeriram que a ocorrência de B. homins poderia acontecer entre
portadores do HIV onde o mecanismo de transmissão não parece contribuir para o aumento da
ocorrência de infecções parasitárias e sim os mecanismos clássicos de transmissão de
parasitos associado às condições do meio onde vivem.
Blastocystis sp. tem sido descrito em uma ampla variedade de espécies de animais,
tem sido assinalado em quatro classes de vertebrados, sendo estas a dos mamíferos, aves,
répteis e anfíbios, na classe dos mamíferos incluem animais domésticos, silvestres, de
estimação ou companhia (TANIZAKI et al., 2005).
Trabalhos experimentais de infecção cruzada utilizando isolados de B. hominis foram
relatados com sucesso em cobaias, ratos e em aves domésticas (SURESH et. al., 1995;
STENZEL; BOREHAM, 1996; IGUCHI et. al., 2007). A caracterização molecular de
isolados de hospedeiros animais também tem sido relatada e obtendo como resultado, isolados
muito próximos aos isolados que infectam humanos (ABE et al., 2003; RIVERA; TAN, 2005;
NOËL et al., 2005). Se espécies de Blastocystis têm baixa especificidade por hospedeiros ou
se os isolados de animais são capazes de infectar outros animais, incluindo o homem, o
grande número de animais que se encontram infectados naturalmente, podem funcionar como
reservatórios, apresentando um potencial zoonótico (ABE, 2004).
10
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedência Dos Animais
Para a realização deste trabalho, foram adquiridas 214 aves domésticas vivas em dois
mercados municipais do Rio de Janeiro, sendo 71 codornas (Coturnix japonica), 73 patos
(Anas platyrhynchos) e 70 pintos (Gallus gallus). Foram obtidos, na totalidade, 105 animais
do mercado municipal que foi considerado como A, sendo destes, 35 patos, 35 codornas e 35
pintos e 109 animais do mercado municipal considerado como B, sendo destes 38 patos, 36
codornas e 35 pintos. Os patos e pintos adquiridos apresentavam, aproximadamente, uma
semana de idade, já as codornas um mês, sendo que esta idade era a ideal, segundo os
comerciantes, para a comercialização dessa espécie de ave, por coincidir com a fase de
postura de ovos, sendo mais facilmente vendidas.
A escolha dos mercados foi feita por conveniência, pela facilidade de obtenção dos
animais e por serem próximos ao local da realização dos diagnósticos.
3.2 Descrição Dos Mercados Municipais
Os mercados municipais do Rio de Janeiro possuem um tipo estrutural de
comercialização que é caracterizado pelo grande número de lojas com uma vasta variedade de
produtos, como in natura, manufaturados, industrializados e animais vivos e mortos. Existe
uma estreita proximidade entre as lojas de comercialização de todos os produtos. Por serem
ambientes de comercialização de produtos de baixo custo, a movimentação de pessoas é
intensa.
Nesses mercados é observada a comercialização de animais vivos, tais como várias
espécies de aves, pequenos mamíferos e peixes. Era possível observar a comercialização de
alimentos, como verduras, vários tipos de carnes e também restaurantes bem próximos dessas
lojas de animais.
No mercado municipal A, as lojas se encontram em um espaço de dois andares onde
no primeiro, que é o subsolo, são comercializados produtos como verduras, carnes, frutas,
laticínios, brinquedos e animais. Dentre essas lojas, cinco destinavam-se à comercialização de
animais vivos e possuíam a mesma estrutura na disposição de todas as lojas destinadas a
outros tipos de comercialização.
O acesso a essas lojas de animais às vezes era dificultado pelo fato de haver uma
grande quantidade de pessoas para adquirir e outras vezes somente para observar os animais
como uma forma de entretenimento, principalmente as crianças cujos pais adquiriam
pequenos esses animais para serem utilizados como de estimação.
O mercado municipal B se diferenciava do anterior pelo tamanho. Possuía somente um
andar e as lojas eram em menor quantidade. Mas a diversidade de produtos para a
comercialização era a mesma, o que é característico desses ambientes. Dentre essas lojas,
duas eram destinadas à venda de animais, com a mesma estrutura e organização para o
alojamento e comercialização dos animais que o mercado anterior.
3.3 Descrição Dos Alojamentos E Comercialização Das Aves
Os animais eram alojados em gaiolas de arame galvanizado, dispostas em baterias de
três a quatro andares e separadas apenas por um fundo removível sob a forma de bandejas
recobertas por folhas de jornais onde se acumulavam as fezes. A higienização dessas gaiolas
11
era feita uma vez por dia. Nessas gaiolas encontravam-se várias espécies de aves, como
codornas, pintos, patos, periquitos e pombos; pequenos mamíferos, como porquinhos da Índia
e coelhos. Às vezes era observada na mesma gaiola mais de uma espécie de ave e a
superpopulação era uma constante nas mesmas. Observava-se também a presença de caprinos
em algumas lojas com instalações improvisadas para alojá-los.
Nessas gaiolas observavam-se bebedouros e comedouros localizados na parte interna,
e em alguns era comum a presença de fezes devido ao habito de certas espécies em ciscar no
ato da alimentação e conseqüentemente defecarem nesses locais.
A maioria dessas gaiolas possuía uma alta densidade populacional, onde era fácil
observar animais pisoteados e muitas das vezes mortos, e esses não eram, imediatamente,
retirados ou separados do local.
3.4 Acondicionamento Das Aves No Laboratório
Após a aquisição aleatória das aves nas gaiolas de comercialização dos mercados
municipais, as mesmas foram imediatamente encaminhadas à Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro para isolamento no Laboratório de Protozoologia do Departamento de
Parasitologia Animal. As aves foram alojadas individualmente em gaiolas com um fundo
aramado onde recebiam água e ração à vontade.
As aves eram adquiridas em lotes de cinco exemplares por espécie, conforme
disponibilidade nos mercados. Antes da aquisição de um novo lote de animais era realizada,
no local destinado ao isolamento, a desinfecção de superfícies e de todos os utensílios onde as
aves eram acondicionadas, utilizando água sanitária e posteriormente era utilizada a vassoura
de fogo. Esses procedimentos foram realizados para se evitar ao máximo a contaminação das
novas aves adquiridas.
As aves permaneciam isoladas por um período de uma semana para a realização de
exames coproparasitológicos para o diagnóstico da infecção natural de Blastocystis sp. com a
confecção de lâminas. Após esse período, as aves eram doadas a pessoas interessadas em sua
criação pra fins de consumo de ovos e carne.
3.5 Coleta Das Amostras De Fezes
As coletas das amostras fecais eram realizadas diariamente para o diagnóstico de
Blastocystis sp. e após a sedimentação espontânea, aquelas que apresentavam positividade do
material fecal, lâminas eram confeccionadas.
As aves eram isoladas por um período de, aproximadamente, 3 horas, onde as
amostras fecais desse período eram recolhidas individualmente e acondicionadas em
recipientes plásticos, previamente identificados, sem a adição de nenhum tipo de produto ou
conservantes. No ato da coleta era observada a consistência de cada material fecal. Após a
coleta, essas amostras eram levadas para o laboratório para serem processadas.
3.6 Procedimentos Laboratoriais
Para o processamento, foram pesadas 4g de cada amostra fecal individualmente, que
eram homogeneizadas com 14 mL de solução fisiológica e filtradas em tamis plástico
descartável contendo uma gaze sobre o mesmo. O material fecal processado e filtrado era
acondicionado em tubo plástico cônico de 15 mL onde permanecia em repouso por duas horas
em temperatura ambiente para que ocorresse a sedimentação espontânea. Após esse período,
era retirada, com uma pipeta Pasteur, uma pequena alíquota desse sedimento onde era
colocada entre lâmina e lamínula para observação em microscopia óptica.
12
3.7 Observação De Formas Evolutivas De Blastocystis sp.
Para se verificar as formas evolutivas de Blastocystis sp., as amostras fecais
processadas das aves foram submetidas à análise em microscopia óptica, com e sem contraste
de fase, utilizando objetiva com um aumento de 40 vezes e confirmando a positividade
utilizando objetiva com um aumento de 100 vezes.
3.8 Preparo E Montagem De Lâminas Para Caracterização Morfológica De
Blastocystis sp.
As amostras fecais analisadas com resultado positivo para Blastocystis sp. onde eram
encontradas, pelo menos, cinco formas biológicas por campo de observação microscópica em
um aumento de 40 vezes, eram imediatamente separadas e preparadas lâminas que eram
coradas para a caracterização morfológica dessas formas biológicas encontradas.
Das amostras fecais positivas, era retirada, com uma pipeta Pasteur, uma pequena
alíquota do sedimento do material fecal processado. Essa alíquota era colocada em uma
lâmina onde era realizado um esfregaço fino de fezes, que após secagem ao ar em temperatura
ambiente, era fixada com metanol por, no máximo, três a cinco minutos. Após esse
procedimento, as lâminas eram coradas pelo Giemsa, onde permaneciam nesse corante por 60
minutos. Logo após esse período, as lâminas eram lavadas em água filtrada, secas ao ar em
temperatura ambiente e montadas com uma lamínula usando-se balsamo do Canadá.
As lâminas montadas eram visualizadas em microscopia óptica utilizando objetivas
com aumento de 40 e de 100 vezes. As formas biológicas encontradas foram fotografadas
utilizando-se uma câmera acoplada a um microscópio Olympus BX-51 usando-se filme
fotográfico de alta sensibilidade (ISO 400).
3.9 Caracterização Morfológica
A morfometria das formas biológicas de Blastocystis sp. encontradas nas fezes das
aves que foram submetidas à coloração foi realizada utilizando uma ocular micrométrica PZO
com um aumento de 15 vezes, acoplada a um microscópio Olympus CH 20. As células
encontradas foram analisadas quanto ao seu tamanho, sua forma, o número de núcleos e a
proporção do vacúolo central, quando presente, em relação ao tamanho total da célula.
3.10 Análise Estatística
Para a análise estatística dos dados quantitativos obtidos, utilizou-se o teste Qui-
quadrado e o Fisher exato, quando recomendado. Para a análise estatística desses dados, foi
utilizado o programa estatístico Statcalc do Epinfo, programa de análises epidemiológicas do
Center of Disease Control and Prevention (DEAN et al., 2000).
13
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp. Em Pintos (Gallus gallus)
Dos Mercados Municipais
Dentre os 35 pintos provenientes do mercado A, 8 (22,9%) apresentaram formas
biológicas de Blastocystis nas fezes, enquanto que dos 35 animais provenientes do mercado
B, 15 (42,9%) apresentavam tais formas em suas fezes.
Apesar do número maior de animais positivo no mercado B, estes resultados
apresentados demonstraram que não houve uma diferença estatisticamente significativa
(p=0,74) entre os dois mercados pesquisados conforme observado na tabela 1.
Tabela 1 – Ocorrência de Blastocystis sp. em pintos (Gallus gallus) provenientes de dois
mercados municipais do Rio de Janeiro.
Mercado Animais Positivos Animais Positivos (%) *p
A (n=35) 8 22,90
0,074
B (n=35) 15 42,90
* Não Significativo pelo teste Qui-quadrado
A taxa de Blastocystis encontrada nesse trabalho, infectando naturalmente pintos é
semelhante à encontrada por Stenzel et al. (1997) que relatou taxa de 31 % de infecção.
Lee e Stenzel (1999) estudando a prevalência de infecção em frangos domésticos
encontraram uma taxa de aproximadamente 95% em quatro das cinco fazendas pesquisadas e
em uma dessas cinco fazendas não encontraram nenhuma ave com infecção por Blastocystis.
No estudo de Stenzel et al. (1997), os frangos estavam dispostos em gaiolas com duas
ou três aves, diferentemente do que ocorria no presente trabalho, onde as aves eram
acondicionadas em gaiolas com grande densidade populacional.
As condições sanitárias das gaiolas onde eram comercializadas as aves também
possivelmente poderiam auxiliar nessa transmissão, pois uma das rotas de infecção de
Blastocystis sp. é a fecal-oral, modo similar de vários protozoários gastrintestinais.
Associando-se ao fato de que as instalações dos animais nos mercados não apresentavam
condições higiênico-sanitárias de boa qualidade, não se deve descartar a hipótese de
contaminação no local de comercialização e conseqüentemente podendo infectar aves da
mesma espécie ou de espécies diferentes, assim como também para outras espécies de animais
que são comercializados nesses mesmos ambientes.
Lee e Stenzel (1999) apontam, como muito boa, as condições sanitárias das instalações
onde nenhuma das aves pesquisadas apresentou infecção. Nessas instalações o piso e os
equipamentos eram regularmente lavados para a remoção de fezes, os comedouros
encontravam-se constantemente limpos e a temperatura ambiente apropriada para a criação.
Tais condições de higiene inibiriam a contaminação do ambiente e, subseqüentemente, a
14
transmissão de organismos fecais. Essas condições descritas pelos autores acima não foram
observadas no presente trabalho.
Tanizaki et al. (2005) relatam que Blastocystis sp. é passível de transmissão para
hospedeiro de uma mesma espécie e de espécies diferentes convivendo em ambientes
similares. Nesse trabalho a alta densidade de animais por gaiolas e a proximidade das mesmas
poderia favorecer a disseminação de Blastocystis sp. para várias espécies de animais que
comumente são comercializados nesses ambientes.
4.2 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp. Em Patos (Anas
platyrhynchos) Dos Mercados Municipais
Das 35 aves provenientes do mercado municipal A, 13 (37,14%) apresentaram formas
biológicas de Blastocystis nas fezes, enquanto que dos 38 animais provenientes do mercado
municipal B, 21 (55,26%) apresentavam tais formas em suas fezes.
Neste caso, como ocorreu com os pintos, mesmo havendo um número maior de
animais positivos no mercado B, os resultados apresentados apontam que não houve uma
diferença estatisticamente significativa (p=0,121) entre os dois mercados pesquisados
conforme observado na tabela 2.
Tabela 2 – Ocorrência de Blastocystis sp. em patos (Anas platyrhynchos) provenientes de
dois mercados municipais do Rio de Janeiro.
Mercado
Animais Positivos
(infectados / examinados)
Animais Positivos (%) *p
A 13 / 35 37,14
0,121
B 21 / 38 55,26
* Não Significativo pelo teste Qui-quadrado
Tanizaki et al. (2005) estudando a infectividade de isolados de Blastocystis de patos,
pintos e codornas, relataram que a transmissão de Blastocystis ocorre facilmente entre aves de
mesma espécie ou de espécies diferentes, não havendo especificidade por hospedeiros e que
esses isolados também apresentaram a transmissão por via fecal-oral.
Os valores encontrados nos dois mercados municipais são muito semelhantes aos que
Abe et al. (2002) encontraram em patos pertencentes ao zoológico da cidade de Osaka, no
Japão, onde essa taxa de infecção foi da ordem de 56 %.
Mais uma vez o local dos alojamentos dos patos nesses mercados onde são
comercializados, que são similares para todos os animais que neles são alojados, não
apresentavam condições adequadas, possivelmente propiciando facilidade na contaminação
entre animais da mesma espécie e de espécies diferentes.
4.3 Ocorrência Da Infecção Natural Por Blastocystis sp. Em Codornas (Coturnix
japonica) Dos Mercados Municipais
Dentre os 35 animais provenientes do mercado A, 15 (42,85%) apresentaram formas
biológicas de Blastocystis nas fezes, enquanto que dos 36 animais provenientes do mercado
15
B, apenas 2 (5,56%) apresentaram positividade nos exames coproparasitológicos, como
podemos visualizar na tabela 3.
Tabela 3 – Ocorrência de Blastocystis sp. em codornas (Coturnix japonica) provenientes de
dois mercados municipais do Rio de Janeiro.
Mercado
Animais Positivos
(infectados / examinados)
Animais Positivos (%) *p
A 15 / 35 42,85
< 0,001
B 2 / 36 5,56
* Significativo pelo teste Qui-quadrado
Do mesmo modo que em pintos e patos, a transmissão em codornas também é de fácil
ocorrência entre estas e outras aves domésticas (TANIZAKI et al., 2005). Porém o fato de
apenas duas das codornas pesquisadas do mercado municipal B terem apresentado infecção
por Blastocystis sp. pode ser entendido pela diferença de idade em que essas aves são
comercializadas em relação aos pintos e patos.
Geralmente, as codornas são comercializadas após 30 dias de idade por apresentarem
alta mortalidade em idade menor. Essas aves são muito sensíveis quando jovens, ficando
susceptíveis a vários agentes patogênicos onde se tem um índice de mortalidade alto. Na faixa
de 30 dias de idade esses animais também já estão na fase de postura de ovos facilitando a sua
comercialização.
Já pintos e patos são comercializados com, no máximo, uma semana de idade, e
possivelmente são mais suscetíveis a várias infecções, dentre estas Blastocystis sp., mas a
mortalidade desses animais é menor comparando-se com as codornas.
Tanizaki et al. (2005) em seu estudo de infectividade em patos, pintos e codornas,
trabalharam com aves de uma semana de idade.
O fato das codornas serem comercializadas com 30 dias de idade, imunologicamente
já estariam preparadas e capazes de combater várias infecções, dentre estas Blastocystis.
O que pode ter ocorrido também, é que as codornas poderiam ter adquirido a infecção
no local de origem de suas criações e, na época da comercialização, já não estarem mais
eliminando formas de Blastocystis nas fezes. Desse modo, as codornas do mercado municipal
B poderiam estar passando por esse período, enquanto que as do mercado municipal A não.
Essas codornas também poderiam estar sendo comercializadas com idades diferentes
nos dois mercados estudados, no mercado A poderiam estar com idade abaixo de 30 dias ao
serem comercializadas, enquanto que as do mercado B poderiam estar sendo comercializadas
aproximadamente com 30 dias idade ou mais, sendo desta forma, mais resistentes à infecções.
4.4 Verificação Geral Da Ocorrência Da Infecção Natural De Blastocystis sp.
Entre Patos, Pintos e Codornas Pesquisados Nos Dois Mercados Municipais.
Dentre as 214 aves pesquisadas nos dois mercados municipais do Rio de Janeiro, 74
(34,6%) apresentaram formas biológicas de Blastocystis sp. nas fezes, nas quais 34 (15,9%)
foram de patos, 23 (10,7%) foram de pintos e 17 (7,9%) de codornas (Tabela 4).
16
Tabela 4 – Ocorrência de Blastocystis sp. em patos, pintos e codornas comercializados nos
mercados municipais do Rio de Janeiro.
Aves
Animais Positivos
(n=214)
Animais Positivos (%)
(n=214)
*p
Patos 34 15,90
a
Pintos 23 10,70 a b
Codornas 17 7,90 b
Total
74 34,60
*p – Teste Qui-quadrado, onde letras iguais indicam que não houve diferença significativa.
Através dos resultados obtidos, verificamos que não houve diferença estatisticamente
significativa de infecção entre patos e pintos e nem entre pintos e codornas, porém essa
diferença ocorreu entre patos e codornas.
Com relação aos dados obtidos da infecção das três espécies de aves comercializadas
nos dois mercados municipais, podemos sugerir que os patos são mais sensíveis à infecção
por Blastocystis, visto que pintos e codornas também são comercializados com idades
diferentes e não houve diferença entre eles. Ressaltando que codornas e pintos pertencem a
ordem Galliformes e patos a Anseriformes, estes poderiam também possuir resposta
imunológica diferentes por pertencerem a ordens distintas.
Em relação às aves positivas pesquisadas nos dois mercados municipais, 36 (34,3%)
eram do mercado municipal A e 38 (34,9%) eram do mercado municipal B (Tabela 5).
Tabela 5 – Ocorrência de Blastocystis sp. em aves comercializadas nos dois mercados
municipais do Rio de Janeiro.
Mercado
Animais Positivos
(infectados / examinados)
Animais Positivos (%)
(n=90)
*p
A 36 /105 34,3
0,92
B 38 /109 34,9
*Não significativo pelo Teste Qui-quadrado
Com esses resultados, verificamos que não houve diferença estatisticamente
significativa (p=0,92) em relação à infecção de Blastocystis sp., independentemente da
espécie de ave analisada entre os mercados municipais. Podemos, deste modo, entender que
os mercados não têm uma grande influência nas taxas de infecção dessas aves
comercializadas, já que as condições higiênico-sanitárias desses ambientes são similares.
17
Como nesses mercados também há a comercialização vários tipos de produtos
alimentares, associado ao fato de que a infecção de Blastocystis sp. ocorre pela rota fecal-oral,
a contaminação nesses ambientes de comercialização de aves seria possível ocorrer, tanto para
alimentos destinados a humanos quanto para animais, constituindo, desta forma, um risco não
só para a população humana, como também para aqueles consumidores que adquirem os
animais levando-os para seus domicílios. Mas também não se deve descartar a hipótese de
contaminação para outras espécies de animais que são comercializados vivos nesses
ambientes assim como também para outras espécies de animais que estejam sendo criadas em
domicílio.
Mesmo ainda existindo controvérsias e incertezas em relação à Blastocystis quanto a
sua patogenicidade e ao seu papel como um agente zoonótico, seria prudente que se atentasse
para uma melhor forma de alojar, manter e comercializar esses animais nesses mercados, pois
sabe que estes possuem outros patógenos com potencial zoonótico, como exemplo
Cryptosporidium (GOMES, 2006) que apresenta a mesma via de infecção de Blastocystis sp.
O simples hábito dos comerciantes de animais desses mercados observarem
freqüentemente o comportamento dos animais alojados, tais como, letargia, falta de apetite e
fadiga, separando-os após os primeiros sinais, poderia ser uma medida que preveniria a
infecção para outras aves, pois esses sinais foram observados por Stenzel e Boraham (1996) e
Moe et al. (1997) em aves infectadas por Blastocystis.
Outro importante aspecto a ser observado é a consistência das fezes apresentadas pelas
aves. No presente trabalho, grande parte das amostras fecais positivas para Blastocystis
apresentava fezes pastosas, muco-pastosa, diarréicas e, às vezes, de coloração sanguinolenta
com muco. Não é possível fazer uma correlação entre o aspecto das fezes e a presença de
infecção por Blastocystis, pois, segundo Tan (2004) é difícil descrever os sinais clínicos de
Blastocystis isoladamente como uma causa real da doença. Por outro lado, vários autores
mencionam a ocorrência de fezes pastosas e diarréicas na infecção por Blastocystis. Quilez et
al. (1995) relataram fezes pastosas em suínos; Stenzel e Boreham (1996) diarréicas em
humanos e Moe et al. (1997) pastosas em ratos de laboratório. Portanto, evitando a aquisição
ou separando aves sintomáticas das aparentemente assintomáticas, evitaria a disseminação de
formas infectantes desse organismo.
Um outro hábito dos comerciantes que poderia auxiliar, tanto em relação aos animais
quanto à população que se utiliza desses mercados, já que a movimentação é intensa, é a
higienização dos locais onde os animais são alojados. Manter as gaiolas sempre livres de
fezes, comedouros e bebedouros limpos, estes providos de água fresca e limpa, além de uma
boa ventilação nesses ambientes, ajudaria para a manutenção dos animais sadios. Esse tipo de
prática não só ajudaria a impedir a disseminação de Blastocystis, mas também outros
patógenos.
Lee e Stenzel (1999) apontaram o alto padrão das condições higiênico-sanitárias,
como piso, utensílios e equipamentos regularmente lavados, remoção de fezes e os locais dos
comedouros e bebedouros bem limpos e livres de resto de excrementos, como possíveis
inibidores da contaminação ambiental na transmissão fecal-oral da infecção por Blastocystis
em frangos. Na propriedade estudada pelos autores, o padrão higiênico-sanitário foi
considerado ótimo e nenhuma das aves pesquisadas apresentou positividade para Blastocystis.
Segundo Tanizaki et al. (2005) a transmissão de Blastocystis acontece facilmente entre
uma mesma espécie ou entre espécies diferentes de aves. Além disso, em seu estudo, foi
observado que com a introdução de um frango não infectado e criado juntamente com outros
parasitados, este foi capaz de desenvolver a infecção.
18
4.5 Caracterização Morfológica De Blastocystis sp.
4.5.1 Morfometria de Blastocystis sp.
Das formas biológicas de Blastocystis sp. encontradas em esfregaços fecais de aves
corado pelo Giemsa, foram observadas seis formas: vacuolar, granular, amebóide, cística,
avacuolar e multivacuolar, sendo estas assinaladas por vários autores.
A forma mais comumente observada foi a vacuolar, que se apresenta de forma
arredondada, contendo corpo central, que se assemelha a um grande vacúolo, ocupando,
aproximadamente, 90% do volume celular, com uma fina camada de citoplasma periférico,
onde podem ser observadas estruturas semelhantes à organelas que, segundo Tan (2004) são
mitocôndrias e complexo de Golgi. Porém essas estruturas só são bem visualizadas em
microscopia eletrônica de transmissão. Nessa fina camada de citoplasma também podem ser
observados os núcleos periféricos, que foram visualizados em numero de até sete por célula,
porém numa média de dois núcleos por células dispostos em pólos opostos. Na figura 1,
encontram-se imagens dessa forma. As medidas das formas vacuolares de Blastocystis estão
descritas na tabela 6.
Tabela 6 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas vacuolares (n=100) de
Blastocystis sp. em aves comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro.
Medidas
(n=100)
Tamanho (µm) Número de Núcleos
Diâmetro Maior 20,3 ± 4,2
Diâmetro Menor 18,3 ± 3,9 1 a 7
Índice Morfométrico 1,11 ± 0,02
Os dados morfométricos apresentados são condizentes com àqueles descritos por Lee
e Stenzel (1999) num estudo em frangos domésticos. As medidas das formas vacuolares de
Blastocystis sp. foram bastante variadas, com uma medida mínima de 10,9µm e a máxima
de 32,1µm, considerando esses valores como sendo do diâmetro maior das células
mensuradas. Porém não foram encontrados na literatura dados referentes ao índice
morfométrico das células de Blastocystis sp. A forma granular de Blastocystis sp. é muito
semelhante à forma vacuolar, sendo que elas apresentam vários grânulos, em sua maioria no
vacúolo central. Dunn et al. (1989) propuseram que essas estruturas poderiam ser inclusões
semelhantes à mielina, pequenas vesículas, grânulos cristalinos e gotículas lipídicas.
Conforme observado na forma vacuolar, também encontramos mais de um núcleo em
seu restrito citoplasma, que no máximo pode conter até quatro. Na figura 2 encontram-se
algumas formas granulares. As medidas estão representadas na tabela 7.
As formas granulares de Blastocystis sp. se apresentaram ligeiramente menores que as
formas vacuolares, porém semelhantes às relatadas por Stenzel e Boreham (1996).
19
Figura 1 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma vacuolar de Blastocystis sp.:
A – Presença de um vacúolo central (→), B – Apresentando sete núcleos em seu citoplasma
(─ = 10 µm).
20
Figura 2 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma granular de Blastocystis sp.
possuindo citoplasma com algumas inclusões: A – B, com um único núcleo, C – D com mais
de um núcleo (─ = 10 µm).
21
Tabela 7 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas granulares (n=100) de
Blastocystis sp. em aves comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro.
Medidas
(n=100)
Tamanho (µm) Número de Núcleos
Diâmetro Maior 16,9 ± 4,1
Diâmetro Menor 15,3 ± 3,9 1 a 4
Índice Morfométrico 1,11 ± 0,03
O tamanho das células variou entre 9,0 e 28,3 µm, sendo que estes valores se referem
ao diâmetro maior das células mensuradas. As células apresentaram de um a quatro núcleos
sendo uma média de dois núcleos por célula.
Algumas dessas células da forma granular apresentaram uma quantidade maior ou
menor de grânulos em seu interior e possivelmente essa quantidade seria responsável pela
variação de coloração observada, o que pode ser explicado por uma afinidade maior ou menor
ao corante utilizado nesse estudo.
Assim como a forma vacuolar, a granular também estava presente em grande número
no material preparado para a análise, sendo também muito comum em amostras fecais frescas.
Essas duas formas de Blastocystis sp. são bem fáceis de serem visualizadas e caracterizadas
em esfregaço corado de material fecal fresco, sendo um bom parâmetro para apontar a
positividade do material examinado.
A forma amebóide presente em material fecal corado nesse estudo foi encontrada em
pequena quantidade. Eram formas que se apresentavam com bordas irregulares, muitas das
vezes assemelhando-se a prolongamentos parecidos com pseudópodes e não possuíam o
vacúolo central característico. Na figura 3 encontram-se imagens da forma amebóide. As
medidas das células amebóides de Blastocystis estão descritas na tabela 8.
Tabela 8 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas amebóides (n=17) de
Blastocystis sp. em aves comercializadas nos mercados municipais do Rio de Janeiro.
Tamanho Médio (µm)
22,0 ± 7,7
Tamanho Máximo (µm)
45,5
Tamanho Mínimo (µm)
13,4
Número de Núcleos
1 a 4
22
Figura 3 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma amebóide de Blastocystis sp.:
A - B possuindo projeções semelhantes à pseudópodes que são emitidas do seu citoplasma
(─ = 10 µm).
23
O tamanho médio da forma amebóide foi de 22 µm com medidas que variaram de 13,4
µm a 45,5 µm. Esses valores são semelhantes àqueles encontrados por Tan e Suresh (2006),
que encontraram medidas que variaram de 5 a 50 µm.
Em relação à forma amebóide de Blastocystis, ainda há muito relato conflitante e
confuso sobre a sua caracterização morfológica. Dunn et al. (1989) relataram células de 2.6 a
7.8 µm de diâmetro, de forma irregular, com ausência de um vacúolo central e apresentando
pseudópodes extendidos. Já Tan e Zierdt (1973) relataram células amebóides como ovais,
contendo um ou dois grandes pseudópodes e também um grande vacúolo central.
A forma cística de Blastocystis encontrada no material fecal corado apresentou-se
geralmente grupadas, mas também foram observadas isoladamente. Cistos quando agrupados
apresentavam-se envolvidos por uma membrana ou vestígio da mesma. Zaman et al. (1999)
observaram que os cistos poderiam estar envolvidos por uma camada fibrilar que poderia
aparecer intacta ou fragmentada. Segundo Stenzel et al. (1997) após observarem cistos
isolados de fezes de frangos domésticos, utilizando a microscopia eletrônica de transmissão,
concluíram ser constituída por uma camada fibrilar. Nesse estudo foi observada a presença de
um a quatro núcleos dentro dos cistos.
No presente trabalho, os cistos foram caracterizados por apresentarem-se de aspecto
arredondados a ovóides, com uma boa afinidade tintorial pelo Giemsa e apresentavam em seu
interior estruturas semelhantes núcleos, que variaram, em média, de um a dois. Na figura 4
podemos observar os cistos. Os dados morfométricos das formas císticas são apresentados na
tabela 9.
Tabela 9 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas císticas (n=200) de
Blastocystis sp. em aves comercializadas nos mercados municipais do Rio de Janeiro.
Tamanho Médio (µm)
4,2 ± 0,5
Tamanho Máximo (µm)
5,5
Tamanho Mínimo (µm)
2,1
Índice morfométrico
1,4 ± 0,03
Número de Núcleos
1 a 4
As medidas das formas císticas de Blastocystis variaram de 2,1 µm a 5,5 µm, o que vai
de encontro às medidas descritas por Stenzel e Boreham (1996).
As formas avacuolar e a multivacuolar também foram encontradas, porém em
pouquíssima quantidade.
A forma avacuolar apresentou-se arredondada sem a presença de um vacúolo central,
com estruturas semelhantes a núcleos e parecia possuir algumas inclusões citoplasmáticas, as
mesmas citadas para as formas granulares. Na figura 5 observamos essa forma. Porém Stenzel
e Boreham (1996) relatam essas células avacuolares em material fresco de humanos como
24
Figura 4 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, formas císticas de Blastocystis sp.:
A – observa-se nitidamente uma camada fibrilar envolvendo os cistos que contém núcleos, B
e C – possuindo vestígios de camada fibrilar e cistos contendo núcleos, D – cistos dispersos
em fezes, contendo núcleos e alguns “vacúolos” podem ser observados em seu interior(─ = 10
µm).
25
Figura 5 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma avacuolar de Blastocystis sp.: A, B
e C – Formas possuindo tamanhos variados e sem a presença de vacúolos em seu citoplasma
(─ = 10 µm).
26
tendo um tamanho médio de 5 a 8 µm e no presente estudo apresentaram média de 21 µm
com células que variaram de 13 a 29,8 µm como apresentado na tabela 10.
Tabela 10 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas avacuolares (n=60) de
Blastocystis sp. em aves comercializadas em dois mercados municipais do Rio de Janeiro.
Medidas
(n=60)
Tamanho (µm) Número de Núcleos
Diâmetro Maior 21,0 ± 4,3
Diâmetro Menor 18,4 ± 4,1 1 a 4
Índice Morfométrico 1,1 ± 0,04
Já a forma multivacuolar aparentemente possuía várias vesículas internas que se
assemelhavam a pequenos vacúolos. Continham estruturas semelhantes à núcleos e também
possuíam estruturas internas que poderiam ser diversas organelas presente nas células. Na
figura 6 observamos imagens dessa forma.
As medidas apresentadas das células multivacuolares (Tabela 11) não são semelhantes
àquelas relatadas por Stenzel e Boreham (1996) que descrevem essas células como sendo
menores que as típicas formas vacuolares encontradas em material fecal de humanos e se
apresentaram com uma média de 5 a 8 µm de diâmetro.
Tabela 11 – Dados morfométricos (média e desvio padrão) das formas multivacuolares
(n=25) de Blastocystis sp. em aves comercializadas nos mercados municipais do Rio de
Janeiro.
Tamanho Médio (µm)
28,2 ± 3,1
Tamanho Máximo (µm)
34,3
Tamanho Mínimo (µm)
22,8
Número de Núcleos
1 a 2
27
Figura 6 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, forma multivacuolar de Blastocystis sp.:
A, B e C – Formas possuindo tamanhos variados com a presença de vários vacúolos em seus
citoplasmas (─ = 10 µm).
28
Devemos considerar as diferenças das medidas das células avacuolares e
multivacuolares, pois os isolados estudados no presente trabalho referem-se à material obtido
de fezes de aves domésticas e os autores citados acima referem-se a material obtido de
humanos. Para tais esclarecimentos, seriam necessários maiores estudos em relação à
morfologia das formas biológicas de Blastocystis em diferentes hospedeiros.
Stenzel e Boreham (1996) sugerem que esta forma multivacuolar pode ser uma forma
intermediária do estágio de desenvolvimento para a forma cística que sofre essa diferenciação
dentro da forma vacuolar. Porém como há um número muito reduzido de estudos que relatem
esse tipo de forma, são necessários futuros estudos para tal confirmação.
4.5.2 Formas reprodutivas de Blastocystis sp.
Em relação às formas reprodutivas de Blastocystis sp. encontradas no presente estudo,
estas estão de acordo com as formas descritas no trabalho de Zhang et al. (2007) no qual
descreveram cinco formas reprodutivas, sendo elas: divisão binária, endodiogenia,
brotamento, plasmatomia, e esquizogonia.
A forma reprodutiva mais comumente observada no presente trabalho foi a reprodução
por divisão binária. A divisão é caracterizada pela partição do citoplasma de uma célula mãe
originando duas células filhas de igual forma e tamanho.
Nessa forma reprodutiva nota-se que o citoplasma se comprime para o centro da célula
e há um aumento nas duas extremidades da célula mãe, até que ela se rompe dando origem a
duas células. A figura 7 apresenta a caracterização dessa reprodução.
Outra forma reprodutiva observada foi a reprodução por endodiogenia. Esta forma se
assemelha com a divisão binária, sendo que ocorre no interior da célula, onde o vacúolo
central da célula mãe se divide em dois pequenos vacúolos no qual se originam duas células
filhas. Na figura 8 podemos observar esse tipo de reprodução.
A outra forma reprodutiva observada em material fecal foi a reprodução por
brotamento. Nesse tipo de reprodução, a célula mãe aumenta formado em um dos lados uma
nova célula filha de tamanho menor. Às vezes essa célula mãe pode dar origem a duas ou até
três células filhas, sendo sempre de menor tamanho que a célula que a originou. Na figura 9
encontramos esse tipo de reprodução.
A plasmatomia é uma outra forma reprodutiva, mas foi considerada de rara observação
no presente estudo em material fecal corado. Zhang et al. (2007) conseguiram observar esta
forma somente em cultura in vitro. A plasmatomia se caracteriza pelo prolongamento da
membrana citoplasmática e da superfície da célula, onde esta continua seu crescimento. A
célula filha vai se formando a partir da extensão citoplasmática e da superfície da célula mãe.
(figura 10).
A esquizogonia, uma outra forma reprodutiva, foi observada por Zhang et al. (2007)
em meio de cultivo. Os autores caracterizaram esta forma reprodutiva como sendo uma célula
bem maior que uma célula de forma vacuolar e granular. Dentro dessa célula maior
observaram várias células menores com formato aparentemente vacuolar e que possuíam
estruturas semelhantes à núcleos e também outras inclusões citoplasmáticas semelhantes às
observadas nas células de forma granular.
Tan et al. (2002) alertam para o fato de poder haver confusão em relação à reprodução
por esquizogonia, pois essas células podem ser confundidas com a forma multivacuolar. Os
múltiplos vacúolos presentes nessa forma de Blastocystis podem ser confundidos com a
progênie das células em reprodução por esquizogonia. Futuros estudos seriam necessário para
elucidar esse fato.
29
Figura 7 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por divisão binária de
Blastocystis sp.: A – Início da divisão binária, onde observamos um alongamento da célula e
núcleos em pólos opostos, B – Célula com a divisão do seu citoplasma, C – Uma possível
célula proveniente da divisão binária (─ = 10 µm).
30
Figura 8 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por endodiogenia de
Blastocystis sp.: A, B e C – Formas possuindo a internalização do seu citoplasma para que
ocorra a divisão, D – Forma onde observa-se a divisão do núcleo e do citoplasma (─ = 10
µm).
31
Figura 9 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por brotamento de
Blastocystis sp.: A – Aumento em um dos lados da célula, dando origem a uma nova célula de
tamanho menor, B – Mais de uma célula filha de tamanhos diferentes sendo originadas de
uma maior (─ = 10 µm).
32
Figura 10 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por plasmatomia de
Blastocystis sp.: observamos o prolongamento da membrana citoplasmática que originará uma
outra célula (─ = 10 µm).
33
Zaman et al. (1999) observaram no interior de cistos, cellulas filhas. Em algumas
células filhas era possível visualizar a formação de vacúolos, com o rompimento desses cistos
ocorria a emergência dessas células filhas.
Nesse trabalho foi observado que os cistos apresentavam estruturas internas
semelhantes às descritas por Zaman et al. (1999), sendo que era visível a presença de um ou
mais núcleos em alguns cistos. Essa variação no numero de núcleos no interior dos cistos,
provavelmente estaria relacionada ao estágio de amadurecimento dos mesmos. Também
foram observados estruturas semelhantes à um vacúolo acompanhando cada núcleo, o mesmo
sendo observados por Zaman et al. (1999). Se a esquizogonia é caracterizada inicialmente
pela divisão nuclear, não acompanhada imediatamente pela divisão do citoplasma celular, foi
possível observar que alguns cistos possuíam essas células filhas que foram mais nitidamente
observadas quando houve a emergência das mesmas do interior dos cistos (Figura 11-C). Este
fato nos leva a especular que existe a reprodução por esquizogonia no interior desses cistos.
Partindo-se desta hipótese, podemos observar que essas estruturas oriundas do interior
desses cistos se assemelham a “esporozoítas”, morfologicamente sendo alongadas com uma
das extremidades mais afiladas que a outra e nucleadas, que poderiam sustentar, teoricamente,
o ciclo biológico proposto por Singh et al. (1995) onde esses autores citam que existe a fase
de penetração de cistos na mucosa intestinal, sendo que pelas observações realizadas no nosso
trabalho, esta penetração na mucosa intestinal poderia ser proveniente dos “possíveis
esporozoítas” liberados dessas formas císticas. Porém, diferentemente do que foi relatado por
Zhang et al. (2007) onde relacionaram a esquizogonia ocorrendo em células vacuolares, sendo
que estas apresentavam bem maiores que as células vacuolares normalmente encontradas,
sendo conflitante com as nossas observações.
Além de todas as formas biológicas observadas e caracterizadas nesse trabalho, outras
formas também foram observadas, mas não foram caracterizadas morfologicamente. Até o
momento não há nenhuma descrição na literatura e também as já descritas não são muito bem
caracterizadas morfologicamente. Na figura 12 e 13, observamos algumas dessas formas,
onde ficam muitas duvidas se são ou não precursoras de formas já conhecidas ou se são novas
células. Estudos deverão ser conduzidos para maiores esclarecimentos sobre as formas
biológicas de Blastocystis, assim como também para elucidar o seu ciclo biológico.
34
Figura 11 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa, reprodução por esquizogonia de
Blastocystis sp.: A e B – Cistos com um a dois núcleos, C – Cistos onde observa-se a
multiplicação nuclear (→) e posterior liberação de formas alongadas semelhantes a
esporozoítas ( ►) (─ = 10 µm).
35
Figura 12 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa: A, B, C e D – Formas não identificadas
de Blastocystis sp.
36
Figura 13 – Esfregaço de fezes coradas pelo Giemsa: A, B e C - Formas não identificadas de
Blastocystis sp.
37
5 CONCLUSÕES
1- Ocorreu a infecção natural por Blastocystis sp. em pintos, codornas e patos em dois
mercados municipais estudados no Rio de Janeiro, não havendo diferença estatisticamente
significativa entre eles.
2- Foi caracterizado morfologicamente as seis formas evolutivas de Blastocystis sp. em
material fecal de aves domésticas, sendo elas: vacuolar, granular, amebóide, cística, avacuolar
e multivacuolar.
3- Também foi possível observar as formas reprodutivas de Blastocystis sp. em material
fecal de aves domésticas, sendo estas: divisão binária, endodiogenia, brotamento,
plasmatomia e esquizogonia.
4 - É possível que a infecção de Blastocystis sp. nessas aves estudadas poderia está
relacionada às condições higiênico-sanitárias inadequadas de seus alojamentos no local de
comercialização, o que poderia propiciar a contaminação entre animais da mesma espécie ou
de espécies diferentes.
38
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