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VINÍCIUS ALBANO ARAÚJO
CARACTERES MORFOLÓGICOS DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO
E DOS ESPERMATOZÓIDES DE HYMENOPTERA E HEMIPTERA (INSECTA)
E SUAS POSSÍVEIS CONTRIBUIÇÕES PARA A SISTEMÁTICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Entomologia, para
obtenção do título de “Doctor Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2009
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VINÍCIUS ALBANO ARAÚJO
CARACTERES MORFOLÓGICOS DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO
E DOS ESPERMATOZÓIDES DE HYMENOPTERA E HEMIPTERA (INSECTA)
E SUAS POSSÍVEIS CONTRIBUIÇÕES PARA A SISTEMÁTICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Entomologia, para
obtenção do título de “Doctor Scientiae”.
APROVADA: 17 de março de 2009.
Prof. Clóvis Andrade Neves
(Co-Orientador)
Prof. Sérgio Luis P. da Matta
(Co-Orientador)
Prof. Gustavo Ferreira Martins
Prof
a
. Karina Carvalho Mancini
Prof. José Lino Neto
Orientador
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“Se sua trajetória de vida é diferenciada e inspiradora,
Isto é um convite.
Pessoal e intransferível.”
Keep Walking Club
“... em especial aos que de alguma forma vendem
sonhos por meio da sua inteligência, crítica,
sensibilidade, generosidade, amabilidade. Os
vendedores de sonhos são frequentemente estranhos
no ninho social. São anormais. Pois o normal é
chafurdar na lama do individualismo, do egocentrismo,
do personalismo. O seu legado será inesquecível...”
Augusto Cury
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e ao Programa de Pós-graduação em
Entomologia, pelo ensino público e de qualidade. Ao governo brasileiro (CNPq) por
financiar meus estudos ao longo dos últimos sete anos.
Ao meu orientador durante o mestrado e doutorado, José Lino Neto, pela
confiança, grandes ensinamentos, otimismo e oportunidades concedidas.
Ao co-orientador e amigo, Clóvis Andrade Neves, pelo exemplo de Educador,
um verdadeiro mestre que sempre me incentivou. Ao Prof. Sérgio da Matta por todo
apoio, principalmente na reta final. Aos demais membros da banca, Karina Mancini
e Gustavo Ferreira Martins, pelas sugestões e críticas ao trabalho.
À coordenação do Programa de Pós-graduação em Entomologia da UFV, em
especial, Prof. Raul Guedes, pela competência e amizade. Aos professores do
Programa, principalmente, Prof. José Eduardo Serrão e Prof
a
. Terezinha Della
Lucia pela confiança e oportunidades. Ao DBA e DBG, Rosângela, Zé Chico, Dona
Paula, Miriam e Diana. Aos professores e estudantes da Biologia Estrutural.
À Prof
a
. Sônia Báo, um grande exemplo profissional, e toda sua equipe do
Laboratório de Microscopia Eletrônica da UnB, pelas acolhidas e disponibilidade
dos equipamentos, em especial, Bruno Fiorillo e Shélida!
Ao Núcleo de Microscopia e Microanálise da Universidade Federal de Viçosa
pela estrutura, em especial, à Cláudia por toda confiança e valiosos ensinamentos.
Ao Sr. Alex Behring, por ser um amigo tão fiel e verdadeiro e por estar sempre
disposto a me ajudar! Aos honrosos membros do Qualis A Cilada’s International
Group Research: Lilian, Jane, Mariana, Sabrina, Madu, Sirlene, Katiane, Léo, Dani,
João Paulo, Sílvia, Luana, Simone, Riviane, Felipe Freitas e Alípio (membro do
antigo e exonerado Alípio’s Group) pela amizade, discussões e momentos extra-
acadêmicos diferenciados e fundamentais!
iv
Ao projeto Nadar UFV-DEF, em especial ao professor Henrique Freitas. Bete
Bola pelo carinho e momentos de atletismo.
À Yasmine Antonini, amiga e orientadora durante a graduação, pela qual
carrego um grande carinho e admiração. Aos amigos republicanos de Ouro Preto
que se fazem presentes sempre em minha vida. Aos amigos das Repúblicas de
Viçosa, em especial, Lele, Ju e Camilo! A todos os amigos da Entomologia e de
Viçosa em geral, por terem contribuído para que eu vivesse dias tão felizes nesta
inesquecível cidade!
Minha amada mãe por ser a pessoa que mais acredita em mim e por ter me
ensinado a sempre deixar as portas abertas para sorte entrar! Meu pai pelo esforço
e orgulho em me ver seguir em frente! Minhas amadas irmãs, Paula, Tiça e Lu, e
cunhados Jenner e Leandro por fazerem a nossa família ser tão especial e por todo
elo de amor e energia que nos une. Em especial, minha irmã Ana Paula, por ter
dividido todos os momentos da minha vida e me ajudado a construir essa etapa. Ao
meu pequenino e amado sobrinho Gustavo, fonte de inspiração e renovação! Ao Vô
Cruz, Vó Zizinha, Tia Alci, Tia Beth e toda família materna pelo carinho!
Sempre sonhei em estudar e achava que isso bastaria para me tornar alguém
diferenciado. Hoje, após vinte e três anos de vida estudantil percebo que foram as
pessoas com as quais convivi as principais fontes do meu conhecimento. A
sabedoria que quero possuir não provém somente de teorias ou padrões científicos,
mas principalmente da importância em retribuir para o meu país todo o investimento
na minha formação. Acredito que a Educação é o melhor atalho para um novo
Brasil de oportunidades iguais, de Ordem e Progresso! Para isso, não basta sermos
professores e pesquisadores, é necessário, essencialmente, sermos Mestres!
v
BIOGRAFIA
Vinícius Albano Araújo, filho de José Antônio Lage Araújo e Maria José Araújo,
nasceu em Itabira, Minas Gerais, em 29 de janeiro de 1981.
Cursou toda sua vida estudantil na rede pública de ensino, e em agosto de
2003, graduou-se como Bacharel em Ciências Biológicas, ênfase em Ecologia, pela
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Durante o período de graduação foi
professor de alfabetização de funcionários, monitor de Zoologia dos Invertebrados e
estagiário do Laboratório de Padrões de Diversidade Animal.
Em julho de 2005 concluiu o mestrado em Entomologia pela Universidade
Federal de Viçosa (UFV). Nesta mesma instituição iniciou o curso de Doutorado em
Entomologia, defendendo a tese em março de 2009. Durante os últimos sete anos
foi bolsista do Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), e obteve, deste mesmo órgão de fomento, concessão de uma bolsa de
Pós-Doutorado para vigência em março de 2009.
vi
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................................
vii
ABSTRACT.........................................................................................................................
ix
1. Introdução Geral........................................................................................................
01
1.1. Sistemática em Insetos: A evolução do pensamento filogenético................
01
1.2. Ordem Hymenoptera ...................................................................................
09
1.3. Ordem Hemiptera.........................................................................................
14
1.3.1. Subordem Heteroptera: Pentatomorpha...........................................
16
1.3.2. Subordem Auchenorrhyncha............................................................
17
1.4. Morfologia do sistema reprodutor masculino em insetos.............................
18
1.5. Caracteres estruturais e ultra-estruturais dos espermatozóides..................
20
1.6. Referências Bibliográficas............................................................................
23
2. Objetivos.................................................................................................................
35
3. Artigos.....................................................................................................................
36
3.1. Capítulo 1: Structure and ultrastructure of the spermatozoa of Trypoxylon
(Trypargilum) albitarse Fabricius 1804 (Hymenoptera: Apoidea: Crabronidae)..................................
36
3.2. Capítulo 2: Ultra-estrutura dos espermatozóides em duas espécies de abelhas
solitárias com ênfase nos caracteres sinapomórficos compartilhados na família Apidae...............
51
3.3. Capítulo 3: Morphology of the male reproductive system of the Polistes versicolor
versicolor (Olivier, 1791) (Hymenoptera: Vespidae: Polistini): with phylogenetic considerations....
70
3.4.
Capítulo 4: Morfologia do sistema reprodutor masculino em duas espécies de
abelhas solitárias (Hymenoptera, Apidae).......................................................................................
85
3.5. Capítulo 5: Caracterização ultra-estrutural dos espermatozóides de Aethalion
reticulatum Linnaeus, 1767 (Hemiptera: Auchenorrhyncha: Aethalionidae)....................................
100
3.6. Capítulo 6: Espermatozóides polimórficos em Largus rufipennis Laporte 1832
(Heteroptera: Pyrrhocoroidea: Largidae).........................................................................................
116
4. Conclusão Geral..................................................................................................... 132
vii
RESUMO
ARAÚJO, Vinícius Albano, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de 2009.
Caracteres morfológicos do sistema reprodutor masculino e dos
espermatozóides de Hymenoptera e Hemiptera (Insecta) e suas possíveis
contribuições para a sistemática. Orientador: José Lino Neto. Co-orientadores:
Clóvis Andrade Neves e Sérgio Luís Pinto da Matta.
Os insetos constituem os organismos mais diversos na Terra, sendo seu sucesso
adaptativo atribuído a longevidade de suas linhagens, ao número de espécies, à
diversidade de suas adaptações, sua biomassa e seu impacto ecológico. Devido à
grande variedade de histórias de vida e padrões ecológicos, os insetos apresentam
grande diversidade no comportamento de cópula e nas estruturas morfológicas
associadas à reprodução. As variações interespecíficas em tais estruturas têm
gerado caracteres capazes de suportar análises filogenéticas. A inclusão de novos
caracteres, aliados aos caracteres morfológicos comumente utilizados, visam
contribuir para a sistemática de vários grupos de insetos que ainda não possuem
uma filogenia totalmente aceita. Além disso, trabalhos envolvendo sistemas
reprodutores e espermatozóides auxiliam no entendimento da biologia reprodutiva,
como as diferentes estratégias de cópula e a competição de espermatozóides.
Nesta tese, descrevemos a morfologia do sistema reprodutor masculino e dos
espermatozóides em espécies das ordens Hymenoptera e Hemiptera. Para isso,
utilizamos técnicas de microcopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão.
Os resultados apontam caracteres que suportam inferências na sistemática e que
auxiliam no entedimento da biologia reprodutiva das espécies estudadas. Alguns
caracteres sinapomórficos para os espermatozóides dos Apoidea sustentam um
padrão típico para a família Apidae e outros caracterizam espécies do seu grupo
irmão Crabronidae. Dentre os Hemiptera, a ultra-estrutura dos espermatozóides
mostra-se promissora na resolução do parafiletismo da subordem
Auchenorrhyncha. Além disso, a produção de espermatozóides polimórficos na
viii
subordem Heteroptera gera importantes discussões acerca das estratégias
reprodutivas e do fenômeno de competição de espermatozóides. Caracteres
extraídos da morfologia dos sistemas reprodutores como: (1) anatomia geral; (2)
número de espermatozóides por cisto e (3) histologia do sistema reprodutor;
indicam diferenças interespecíficas capazes de agrupar espécies ou outros táxons
superiores proximamente relacionados. Dessa forma, neste trabalho, observamos
que novos caracteres derivados dos espermatozóides sustentam o uso dessas
células em análises cladísticas (espermiocladística) e apontam os caracteres da
morfologia do sistema reprodutor com potenciais para a sistemática dos insetos.
ix
ABSTRACT
ARAÚJO, Vinícius Albano, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March, 2009.
Morphological characters of the male reproductive system and
spermatozoa of the Hymenoptera and Hemiptera (Insecta) and their
possible contributions to the systematics. Adviser: José Lino Neto. Co-
advisers: Clóvis Andrade Neves and Sérgio Luís Pinto da Matta.
The insects comprise the group of the most diverse organisms on Earth, being their
adaptive success attributed to their lineages longevity, their species number, their
adaptations diversity, their biomass and their ecological impact. Due to a large
variety of life history and ecology patterns, the insects present large diversity of
coupling behaviour and morphological structures associated to the reproduction.
The interspecific variation in such structures generates data that could support
phylogenetic analyses. The inclusion of new traits, allied to morphological traits
commonly used, can improve the systematic analysis of several insect groups that
do not have yet a totally acceptable phylogeny. Furthermore, works regarding the
reproductive systems and spermatozoa can help understanding the reproductive
biology such as the mating strategy differences and sperm competition. In this work,
we described the morphology of the male reproductive system and the spermatozoa
of the some species of the orders Hymenoptera and Hemiptera using the light and
the transmission electron microscopies. The results point to characters that support
inferences in the systematics that can help the understanding of the reproductive
biology of the studied species. Some synapomorphic traits for the Apoidea
spermatozoa support a typical pattern of the family Apidae and others are commonly
find in the species of its sister group Crabronidae. Among the Hemiptera, the
ultrastructure of the spermatozoa shows to be promising in the elucidation
paraphyletism of the suborder Auchenorrhyncha. Moreover, the production of
polymorphic spermatozoa in the suborder Heteroptera generates important
discussions concerning on the reproductive strategies and on the sperm
x
competition. Characters extracted from the morphology of the reproductive systems
such as (1) the general anatomy; (2) the number of spermatozoa per cyst, and (3)
the histology of the reproductive system show interspecific differences that allow
grouping species or other superior taxa closely related. Thus, in this work, we have
observed that new characters derived from the spermatozoa can be useful in
cladistic analyses (spermiocladistic) and indicate the reproductive system as a
potential for the insect systematics.
1
1. Introdução Geral
1.1. A evolução do pensamento filogenético: Sistemática em Insetos
A evolução ao longo de milhões de anos gerou uma grande diversidade de
espécies e a classe Insecta compreende os mais diversos organismos na história
de vida da Terra, fornecendo profundos “insights” dentro da teoria evolutiva. As
principais características atribuídas ao grande sucesso evolutivo dos insetos são a
longevidade de suas linhagens, o número de espécies, a diversidade de suas
adaptações, sua biomassa e, por conseguinte, seu impacto ecológico. O grande
desafio dos entomologistas sistematas é reconstruir a história evolutiva e explicar o
sucesso adaptativo dos insetos em uma esfera de existência de cerca de 400
milhões de anos (Grimaldi & Engel, 2005). Cerca de um milhão de espécies de
insetos já foram descritas e estimativas apontam que o número real de espécies
atuais é de aproximadamente cinco milhões (Gaston, 1991).
Ao longo dos últimos anos, vários trabalhos têm sido feitos envolvendo
aspectos da sistemática de insetos com o objetivo de reconstruir a filogenia desse
grupo (Hamilton, 1981; Carpenter, 1982; Carver et al., 1991; Alexander, 1992;
Brothers & Carpenter, 1993; Deitz & Dietrich, 1993; Hanson & Gauld, 1995;
Brothers, 1999; Kristensen, 1999; Melo, 1999; Wheeler et al., 2001; Li et al., 2005).
Tais trabalhos têm identificado várias linhagens de insetos e registrado eventos de
sucesso adaptativo e extinções. Os estudos filogenéticos também fornecem
interpretações dos padrões evolutivos e permitem predições.
O naturalista inglês Charles Darwin (1809-1882) é reconhecido como o
arquiteto do pensamento evolutivo. Entretanto, as primeiras idéias evolutivas, ainda
que simplistas, datam da Grécia Antiga. Aristóteles (384-322 a.C), além de
fundamentar a argumentação lógica, sumarizou as informações de várias espécies
2
animais no livro Historia Animalia. Também na Grécia Antiga surgiu a árvore
Porphiriana, com as primeiras idéias de identificação dicotômica e de classificação
hierárquica. Durante a queda do Império Romano (378-410 d.C) todas as
observações e documentos sobre o mundo natural foram condenados a inquisição,
na chamada Idade Escura. O pensamento sobre sistemática foi modificado e a
árvore Porphiriana do conhecimento foi alterada e expandida dentro da Scala
Naturae, representando uma hierarquia imutável que refletia a perfeição Divina.
Poucos livros sobreviveram ao colapso Romano e volumes como o Sevem Liberal
Arts formaram o fundamento do pensamento científico durante séculos (Burke,
1985). Durante as Cruzadas do século XI vários textos gregos foram redescobertos
e suas idéias expandidas pelas arábias e Índia. Durante dois séculos, monges
transcreveram textos para o latim e os divulgaram pelas escolas da Europa (Burke,
1985), difundindo o conhecimento e, principalmente, as idéias de Aristóteles.
Novas descobertas do mundo natural foram feitas com o desenvolvimento do
microscópio em 1600. Nesta época as primeiras escolas começaram a focar os
estudos com insetos e produziram importantes livros. Alguns dos mais significativos
foram, Historia Insectorum Generalis (Swammerdam, 1685) e Historia Insectorum
(Ray, 1710), sendo que este último estabeleceu uma nova era na classificação dos
insetos.
O maior impulsionador da ciência da sistemática foi o botânico sueco Karl
Linnaeus (1707-1778). Linnaeus, seguindo os pressupostos de Aristóteles, agrupou
características generalizadas dentro de gêneros e os caracteres mais distinguíveis
de um indivíduo dentro de um epíteto específico. Dessa forma, Linnaeus foi o
primeiro sistemata a categorizar o mundo biológico dentro de um sistema
hierárquico binominal. Após seu trabalho, as discussões foram focadas em
identificar um único ou uma fonte de caracteres que produzissem uma classificação
natural. Para Linnaeus, o número e a estrutura das asas dos insetos serviam para
3
nomear as ordens, como: Aptera (sem asa), Diptera (uma par de asas),
Hymenoptera (dois pares de asas membranosas) e Neuroptera (asas com muitas
nervuras). Linnaeus descreveu cerca de 3.000 espécies de insetos. Johann C.
Fabricius (1745-1808), estudante de Linnaeus, descreveu 9.776 espécies e é
considerado o primeiro especialista em entomologia e o mais original taxonomista
de insetos. Em sua principal obra, Philosophia Entomologica (Fabricius, 1778), ele
reconheceu importantes caracteres, principalmente das partes bucais e da genitália
de insetos machos.
O entomologista francês Pierre A. Latreille (1762-1833) foi contemporâneo e
impulsionou as idéias de Fabricius (Geoffroy Saint-Hilaire et al., 1833; Dupuis,
1974). Latreille recebeu uma educação formal e tornou-se padre. Entretanto,
durante as investigações civis da Revolução Francesa ele foi condenado para
execução e feito prisioneiro. Na prisão Latreille identificou uma nova espécie de
besouro, Necrobia ruficollis, e com a ajuda de dois naturalistas foi considerado
entomologista e liberado. Em seu mais notável trabalho, Précis des Caractères
Génériques des Insectes (Latreille, 1796), ele atentou para uma classificação
natural dos Arthropoda e delimitou dentro de cada ordem o que hoje seriam as
famílias. Durante todo o século XVIII vários predições das classificações modernas
foram feitas, variando do pensamento criacionista às idéias evolucionárias.
Grandes contribuições para os debates sobre classificação vieram com a
publicação da série de 44 volumes por Georges L. Leclerc, Comte de Buffon (1707-
1788). Influenciado pelas leis físicas de Isaac Newton, Buffon trabalhou na
produção da Classification of Natural Classes, baseada em caracteres da
morfologia funcional. Sua coleção animal corresponde aos primeiros depósitos do
Museu Nacional de História Natural da França. Apesar de não se interessar pelos
métodos sistemáticos do seu contemporâneo Linnaeus, as discussões de Leclerc
geraram algumas das mais críticas idéias sobre o pensamento evolutivo. O francês
4
Georges L.C.F.D. Cuvier (1769-1832) também trabalhou a classificação segundo
leis funcionais e definiu os caracteres que formam grupos naturais como
adaptativos. Ele reconheceu os fósseis como documentação de organismos
extintos, apesar de acreditar na constante criação Divina. O Museu Nacional de
História Natural da França serviu de laboratório para Etienne Geoffroy St. Hilaire
(1772-1844), que desenvolveu o conceito de homologia, e para Jean Baptiste
P.A.M. de Lamarck (1744-1829), que reformulou o conceito de homologia e aplicou
a ele as idéias de descendência com modificações.
Paralelos aos estudos sobre homologias e classificações, naturalistas e
geólogos britânicos realizavam várias descobertas sobre a Terra e sua diversidade.
Charles Lyell (1797-1875) revelou que a Terra era muito antiga e que depósitos de
várias camadas de sedimentos e erosão formam as camadas estratigráficas onde
os fósseis são depositados. Uma síntese dos padrões geológicos foi publicada em
três volumes no Principles of Geology (Lyell, 1830) que influenciou fortemente
outros cientistas britânicos. Entre eles Charles Darwin (1809-1882) e Alfred Wallace
(1823-1913), cujas idéias sobre as mudanças evolutivas através da seleção natural
são descritas no livro The origin of species (Darwin, 1859). A teoria e o mecanismo
da seleção natural explicam os padrões vistos no registro fóssil, variações entre as
espécies, distribuição de organismos, as similaridades embriológicas e a natureza
hierárquica da vida. A teoria de Darwin não modificou a prática da sistemática, mas
forneceu um arcabouço teórico sobre a diversidade de espécies. De fato, a teoria
da seleção natural explica mudanças anagênicas ou a evolução de caracteres
particulares, não a origem ou a formação de novas espécies (Darwin, 1859). Esta,
por sua vez, se tornou a principal questão biológica do século XX e os
entomologistas tiveram um impacto substancial nas discussões.
De 1905 a 1920 Thomas Morgan estudou o gênero Drosophila e recebeu o
prêmio Nobel por descobrir importantes fenômenos genéticos da mutação. Em
5
1920, os geneticistas R. Fisher, J.B.S. Haldane e S. Wright apontaram a mutação
como a causa biológica das mudanças evolutivas e a seleção natural seria a força
impulsionadora do processo, surgindo a “Nova síntese” que unia a genética e a
sistemática. Os trabalhos de Morgan também impulsionaram o sistemata
Theodosius Dobzhansky, que aplicou os estudos com variedades selvagens de
Drosophila em questões de variação genética na natureza e formação de espécies
(Dobzhansky, 1937). No Museu de História Natural da América, Ernst Mayr
conduzindo experimentos com sistemática de aves, propôs a idéia de alopatria, em
que espécies evoluem do isolamento geográfico (Mayr, 1942). Outro cientista do
Museu Americano, George G. Simpson, concluiu que as mudanças graduais
observadas no registro fóssil podem ser explicadas por pequenas mudanças
genéticas, adicionando uma perspectiva geológica à Síntese Moderna.
Entre 1940 e 1960 os biólogos preocupavam-se principalmente com os
mecanismos de mudança evolutiva e a sistemática não obteve grandes avanços.
Entretanto, o geneticista Alfred Sturtevante trabalhou durante anos com sistemática
de Drosophila (Sturtevante, 1942) e usou métodos de classificação que foi a base
para os trabalhos do grande sistemata de insetos Willi Henning. O artigo de
Sturtevante não obteve muita repercussão na época, talvez porque tenha sido
publicado no mesmo ano da obra clássica Systematics and Origin of Species (Mayr,
1942).
Nas décadas de 1950 e 1960 os estudos com sistemática retomaram força com
o objetivo de reconstruir as relações entre os táxons. Nessa época surgiu a escola
de taxonomia numérica ou fenética, desenvolvida pelos entomologistas Robert
Sokal e Charles D. Michener e pelo microbiologista Peter Sneath. A escola fenética
adotou um método para agrupar os organismos baseado na similaridade, com o
objetivo de fazer uma classificação lógica e com uma metodologia que removesse a
subjetividade (Michener & Sokal, 1957; Sokal & Sneath, 1963; Sneath & Sokal,
6
1973). A escola fenética tinha a vantagem de oferecer uma metodologia testável e
com mínimos critérios científicos. Entretanto, o valor preditivo das classificações
fenéticas era muito baixo, tornando os padrões evolutivos obscuros. Isto porque era
baseada em medidas de dissimilaridade e não nas relações entre os táxons. O
principal problema para o uso da fenética é que os biólogos se interessam por
filogenia e isso requer classificações que reflitam as relações genealógicas e
naturais. Um método que mede a similaridade fenética é falho em distinguir
similaridade evolutiva (resultado de descendência) de convergência e de
paralelismo. Atualmente, algumas análises fenéticas são erroneamente usadas
para obter o que se acredita ser relações genealógicas, principalmente em grupos
de microrganismos.
Paralelo ao desenvolvimento da escola fenética, outra resposta bem aceita ao
Neo-Darwinismo foi proposta pelo alemão Willi Hennig (1913-1976). Este sistemata
de Diptera fundamentou sua proposta dentro do princípio de que a filogenia pode
ser reconstruída e que todas as classificações deveriam ser baseadas no padrão de
genealogia de descendência, gerando classificações evolutivas e naturais,
semelhante às idéias de Darwin. Henning estabeleceu um rigoroso método para
análises das relações filogenéticas, a escola cladística (Hennig, 1965, 1966). A
idéia básica da cladística foi estabelecer um sistema de classificação filogenética
que funcionasse como um sistema geral de referência para a biologia. Em seus
pressupostos, se as classificações refletem a filogenia, então todos os táxons
classificados necessariamente precisam ser monofiléticos. Grupos parafiléticos e
polifiléticos não são aceitos como táxons sustentáveis na hierarquia de
classificação (Farris, 1974). Grupos monofiléticos são naturais porque contêm o
ancestral comum e todas as suas espécies descendentes. Grupos parafiléticos
contêm o ancestral comum e algumas, mas não todas espécies descendentes. Os
mais problemáticos dos grupos são os polifiléticos, os quais contêm alguns dos
7
descendentes de um ancestral comum, mas não o próprio ancestral comum do
grupo.
Para a escola cladística, entre o mosaico de caracteres de um organismo,
somente aqueles que são derivados e compartilhados com outras espécies são
informativos para filogenia. Hennig (1965, 1966, 1981) notou que para propor uma
reconstrução filogenética existem dois tipos de similaridades de caracteres a serem
avaliadas: as apomorfias, que são similaridades que surgem em um ancestral
comum mais recente, ou uma característica recentemente evoluída, “derivada”, que
surge somente em um grupo de espécies proximamente relacionadas; e as
plesiomorfias que são características que surgiram em um ancestral comum
distante, ou característica “basal”. O uso dos termos “derivada” e “primitivo” ou
“basal” é controverso porque eles implicam em uma escala de perfeição ou
adaptação. Plesiomorfia e apomorfia são também termos relativos, por exemplo,
asas são uma plesiomorfia para borboletas, mas uma apomorfia para os insetos
pterygota.
O reconhecimento dos grupos monofiléticos foi baseado principalmente nas
apomorfias compartilhadas (sinapomorfias) e não nas plesiomorfias compartilhadas
(simplesiomorfias). Táxons baseados em plesiomorfias podem produzir somente
grupos parafiléticos. Um grupo é monofilético se ele é caracterizado por possuir
sinapomorfias, caracteres derivados compartilhados pelos membros do grupo. Já
os grupos polifiléticos são frequentemente baseados em caracteres convergentes
que são superficialmente similares e não uma derivação evolutiva comum. Os
insetos sugadores, por exemplo, representam uma assembléia polifilética, já que o
desenvolvimento das partes bucais surgiu várias vezes em diferentes
configurações. A presença de uma apomorfia em uma única espécie e não em
outras proximamente relacionadas não é informativo das relações porque não
identifica o táxon com nenhuma outra linhagem, trata-se de uma autapomorfia. Para
8
Hennig (1981), o próximo passo foi estabelecer como definir se um caracter é
apomórfico ou plesiomórfico. O método mais amplamente aceito é o de
determinação da polaridade do caracter por comparação com o grupo externo.
Linhagens proximamente relacionadas dentro de um grupo em estudo e que
compartilham caracteres com um ancestral comum recente (o grupo externo)
compartilham plesiomorfias; características que são únicas dentro do grupo interno
são apomorfias (Hennig, 1981). Outros métodos menos usados para definir
polaridade envolvem ontogenia e desenvolvimento, frequência de caracteres e
paleontologia.
Atualmente, a reconstrução da filogenia é baseada em teste de congruência
entre identidades topológicas que são, preferencialmente, homologias morfológicas,
comportamentais ou moleculares (Grimaldi & Engel, 2005). As homologias
observadas são analisadas cladisticamente, divididas em apomorfias e
plesiomorfias para formar um padrão hierárquico, um cladograma. O cladograma é
um tipo muito geral de árvore filogenética que indica somente relações relativas e
não as relações entre ancestral-descendente. Um cladograma que incorpora o
registro fóssil e a escala de tempo geológica é considerado uma filogenia (Smith,
1994) e os padrões de mudanças em caracteres individuais podem ser
interpretados. Existem vários modelos computacionais para reconstrução da
filogenia, elaborados para resolver problemas particulares de análises baseadas em
caracteres específicos (proteínas, morfologia, sequências de DNA). Embora a
análise de dados morfológicos “tradicionais” e/ou moleculares tenha resolvido
muitas questões sistemáticas de vários grupos de insetos, ainda existem em vários
táxons, várias questões filogenéticas não elucidadas. Novos caracteres estão
sendo usados e inferidos nas análises como, por exemplo, aqueles obtidos em
estudos morfológicos do sistema reprodutor interno e dos espermatozóides
(Baccetti & Dallai, 1978; Sivinski, 1984; Quicke et al., 1992; Jamieson et al., 1999).
9
1.2. Ordem Hymenoptera
As ordens Hymenoptera, Lepidoptera e Coleoptera compreendem as quatro
maiores e mais diversas ordens de insetos. Os Hymenoptera se diferem dos
demais insetos por possuírem uma complexa mistura de caracteres basais e
numerosas autapomorfias, o que dificulta definir a qual grupo eles são mais
proximamente relacionados. As evidências atuais indicam que os holometábolos
são divididos em duas principais linhagens: Coleoptera + Neuropterida e os
Panorpida. Os Hymenoptera são relacionados aos Panorpida, hipótese sustentada
por caracteres morfológicos (Königsmann, 1976; Kristensen, 1981, 1991, 1995,
1999) e moleculares (Whiting et al., 1997; Wheeler et al., 2001).
Os primeiros Hymenoptera, reconhecidos pelo padrão de venação das asas,
datam do Triássico, na região da Austrália, Ásia central e África (Riek, 1955;
Rasnitsyn, 1964, 1969; Schluter, 2000). Diferentemente de outros holometábolos
basais, os Hymenoptera são considerados relativamente recentes, e desde o fim do
Triássico esses insetos apresentaram intensa radiação, sendo atribuído o sucesso
adaptativo principalmente ao bauplan estrutural e funcional. Estudos de
levantamento e estimativa de riqueza em escala global apontam os Hymenoptera
como a ordem mais diversa (Kristensen, 1999; Grissel, 1999), ultrapassando os
Coleoptera, até então considerada a ordem com o maior número de espécies.
Atualmente existem cerca de 125.000 espécies de Hymenoptera descritas,
entretanto até as estimativas mais conservadoras apontam que o número real seja
entre 600.000 a 1.200.000 espécies (Gaston, 1991; Grissel, 1999; Austin & Dowton,
2000a).
As espécies de Hymenoptera podem apresentar hábito fitófago, entomófago ou
uma combinação de ambos. Ainda, os entomófagos podem ser predadores ou
parasitóides com uma grande variedade de hábitos intermediários que muitas vezes
dificultam a classificação.
10
Nos insetos, com exceção dos Isoptera, a eusociabilidade está presente
apenas nos Hymenoptera e, somente nestes, existem grupos (abelhas e vespas)
que exibem todas as gradações da organização social, de solitária a eussocial
avançada.
Segundo Hanson (1995), os Hymenoptera contêm mais espécies de interesse
às atividades humanas do que qualquer outra ordem de insetos. Como a maioria é
parasitóide e/ou predadora de outros insetos, muitas espécies desempenham papel
importante no equilíbrio natural das populações de seus hospedeiros, sendo
largamente utilizadas em programas de controle biológico de pragas agrícolas e
florestais. Entre os membros fitófagos da ordem, as abelhas constituem o grupo
mais importante de polinizadores, sendo consideradas essenciais à manutenção da
diversidade das angiospermas, incluindo as espécies cultivadas (Hanson, 1995).
Embora sejam uma pequena minoria, existem espécies de Hymenoptera que
podem causar grandes prejuízos econômicos. Dentre estas, as formigas cortadeiras
(Atta e Acromyrmex) que causam os prejuízos mais severos (Cherrett, 1986).
Em função da sua grande importância, existe um considerável investimento em
pesquisas com os Hymenoptera, abordando os mais diversos aspectos. Entretanto,
por um longo tempo poucos estudos filogenéticos relacionados aos níveis
taxonômicos mais elevados foram realizados considerando essa Ordem. Estudos
filogenéticos envolvendo um maior número de táxons são fundamentais, pois
fornecem bases para uma classificação taxonômica natural, bem como para
reconstrução da evolução de importantes caracteres e no estudo de eventos
evolutivos raros (Ronquist, 1999).
Os Hymenoptera representam uma das mais bem definidas ordens de insetos
e há bastante tempo é considerado um grupo natural. O monofiletismo da ordem foi
inferido por Vilhelmsen (1997) baseado em dezesseis autapomorfias morfológicas e
corroborado por análise molecular (Whiting et al., 1997). Os Hymenoptera são
11
tradicionalmente divididos em ‘symphyta’ e Apocrita, sendo este último ainda
dividido em Parasitica (vespas parasíticas) e Aculeata (abelhas, formigas e vespas).
Enquanto os Apocrita e os Aculeata têm sido aceitos como grupos monofiléticos
(Königsmann, 1976, 1977, 1978a,b; Rasnitsyn, 1980, 1988), ainda há dúvidas
quanto as relações filogenéticas dos ‘symphyta’ e dos Parasítica. Segundo
Ronquist et al. (1999), os ‘symphyta’ são provavelmente parafiléticos em relação
aos Apocrita, e os Parasitica provavelmente parafiléticos em relação aos Aculeata,
sendo também a relação evolutiva entre ‘symphyta’ e Parasítica ainda muito
discutida.
A origem das vespas Apocrita, a partir de um ancestral ‘symphyta’, é um
capítulo especialmente controvertido e vem sendo discutido desde o início do
século. Handlirsch (1906) sugere que os apócritas tenham derivado de um
Siricoidea, enquanto Rohwer & Cushman (1917) sugerem um Orussoidea e Brues
(1921) e Malyshev (1968) um Thentredinoidea. Ross (1936, 1937), baseado em
evidências morfológicas, indicou os Cephoidea como grupo mais proximamente
relacionado às vespas apócritas, sugestão esta corroborada pelas análises com
bases Henningianas realizadas por Königsmann (1976). Atualmente, diversas
linhas apontam os Orussidae como grupo irmão dos Apocritas e atribuem tal
relação ao hábito de vida ectoparasita (Burke, 1917; Gourlay, 1951; Rawlings,
1957; Powell & Turner, 1975; Nuttall, 1980; Vilhelmsen, 2003). Além do parasitismo,
os Orussidae compartilham diversas características anatômicas com as vespas
Apocrita (Gibson, 1985; Johnson, 1988; Whitfield et al., 1989; Basibuyuk & Quicke,
1997; Schulmeister, 2003a, 2003b). Sendo assim, os Orussoidae e os Apocrita
formam um grupo denominado Euhymenoptera. Alguns trabalhos clássicos
abordam aspectos da sistemática e biologia dos Hymenoptera (Evans & Evans,
1970; Iwata, 1972, 1976; Spradberry, 1973; Krombein et al., 1979; Gauld & Bolton,
12
1988; Schedl, 1991; Goulet & Huber, 1993; LaSalle & Gauld, 1993; Godfray, 1994;
Hanson & Gauld, 1995; Quicke, 1997; Austin & Dowton, 2000b; O’Neill, 2001).
Os Aculeata (formigas, abelhas e as vespas com ferrão) compreendem os
Hymenoptera mais conhecidos. São facilmente reconhecidos por possuírem o
ovipositor modificado em um aparelho de ferrão usado para injeção de veneno. O
valor adaptativo do ferrão nos Aculeata é bem evidenciado pelo fato de milhares de
espécies de insetos mimetizarem as vespas com quais coexis
tem (Starr, 1985).
Os primeiros registros de espécies de Aculeata datam do Cretáceo, na Ásia
central (Rasnitsyn, 2002). Essas espécies sofreram intensa radiação e são
atualmente divididas em três superfamílias: Chrysidoidea, Vespoidea e Apoidea. As
relações entre as famílias de Chrysidoidea foram estudadas por Carpenter (1986,
1999), Brothers & Carpenter (1993) e Brothers (1999). Os Chrysidoidea são
considerados os mais basais e são excluídos de Vespoidea + Apoidea (Euaculeata)
por possuírem a retenção primitiva dos antenômeros idênticos em ambos os sexos.
Enquanto que nos Euaculeata existe dimorfismo de antenas, com 12 e 13
antenômeros em machos e fêmeas, respectivamente.
Os Vespoidea consistem de dez famílias atuais e duas já extintas. Embora
representem um grupo natural, são definidos principalmente por características que
foram subsequentemente modificadas dentro da superfamília ou surgiram
secundariamente nas famílias (Brothers & Carpenter, 1993; Brothers, 1999). Dentre
os Vespoidea, a família Vespidae compreende aproximadamente 4.500 espécies de
vespas, frequentemente sociais e de distribuição cosmopolita. As espécies de
Vespidae são agrupadas em seis subfamílias (Carpenter, 1982, 1991; Carpenter &
Rasnitsyn, 1990). As subfamílias mais basais: Euparagiinae, Masarinae e
Eumeninae são solitárias, enquanto os Stenogastrinae, vespas primitivamente
eussocias, são o grupo irmão das verdadeiramente eussociais Polistinae e
13
Vespinae. Por outro lado, as subfamílias eussociais são as mais estudadas. Entre
os eussociais os Polistinae possuem cerca de 800 espécies distribuídas em todas
as regiões do mundo, e os Vespinae, menos diversos, possuem cerca de 80
espécies restritas as regiões holoárticas e oriental (Spradberry, 1973; Matsuura &
Yamane, 1990; Ross & Mathews, 1991; Gadagkar, 2001).
As abelhas e vespas esfeciformes constituem a superfamília Apoidea
(Brothers, 1975; Königsmann, 1978b; Brothers & Carpenter, 1993), a qual inclui
cerca de 30.000 espécies descritas, sendo a maioria de abelhas. Até recentemente,
as abelhas eram classificadas em cinco ou seis famílias, enquanto os esfeciformes
eram agrupados em uma única família “Sphecidae”. Sphecidae nesta classificação
são sem dúvida um grupo natural e formam a linhagem da qual as abelhas
provavelmente evoluíram (Lomholdt, 1982; Alexander, 1992; Brothers, 1999).
Baseado na sua monofilia, os Sphecidae foram divididos em uma série de famílias:
Heterogynaidae, Ampulicidae, Sphecidae e Crabronidae, sendo esta última família
o grupo irmão das abelhas (Prentice, 1998; Melo, 1999). Relações filogenéticas
baseadas em representantes viventes indicam os Heterogynaidae como a família
mais basal, seguida por Ampulicidae, Sphecidae e, por último, Crabronidae
(Alexander, 1992; Prentice, 1998; Melo, 1999).
Recentemente as abelhas foram agrupadas em uma única família Apidae
(Brothers, 1999; Melo, 1999; Melo & Gonçalves, 2005) que compartilha com os
Crabronidae um ancestral comum, provavelmente uma vespa fitófaga, sustentando
a hipótese da origem monofilética para o grupo (Muller, 1872; Michener, 1944,
2000; Brothers, 1975, 1999; Lomholdt, 1982; Alexander, 1992; Brothers &
Carpenter, 1993; Alexander & Michener, 1995; Prentice, 1998; Melo, 1999; Engel,
2001).
Nos últimos trinta anos, ocorreu um progresso significativo no entendimento
das relações de parentesco entre os maiores grupos de Hymenoptera. As primeiras
14
análises cladísticas foram fundamentadas em dados morfológicos e,
eventualmente, comportamentais (Brothers, 1975; Gibson, 1985; Rasnitsyn, 1988;
Whitfield et al., 1989; Quicke et al., 1992; Brothers & Carpenter, 1993; Heraty et al.,
1994; Vilhelmsen, 1996; Basibuyuk & Quicke, 1997; Ronquist et al., 1999; Melo,
1999). Mais recentemente, dados moleculares também têm contribuído
significativamente para o entendimento do grupo (Derr et al., 1992; Cameron, 1991,
1993; Sheppard & McPheron, 1991; Baur et al., 1993; Crozier et al., 1997; Dowton
et al., 1997; Whitfield, 1998; Dowton & Austin, 1999). Ainda, alguns poucos
trabalhos foram realizados associando os caracteres morfológicos aos moleculares.
Os mais importantes foram realizados por Chavarría & Carpenter (1994), para as
abelhas sociais, Carpenter (1997), para as vespas sociais, e Carpenter & Wheeler
(1999) compreendendo representantes de todos os grandes grupos.
Apesar de diferentes abordagens considerarem a filogenia dos Hymenoptera,
na maioria dos trabalhos, independente do nível taxonômico, as árvores inferidas
com base em caracteres morfológicos não corresponderam àquelas inferidas a
partir de caracteres moleculares. Entretanto, as análises morfológicas são
freqüentemente corroboradas pelas análises de “evidência total”. Portanto, pode-se
supor que muitas controvérsias ou dúvidas a respeito da filogenia dos
Hymenoptera, poderão ser resolvidas se novos sistemas de caracteres, puderem
ser inseridos no atual contexto de bases de dados e analisados em conjunto. Como
exemplo, podemos citar aqueles caracteres obtidos a partir de estruturas menos
susceptíveis as condições ambientais.
1.3. Ordem Hemiptera
A ordem Hemiptera compreende um grande e diverso grupo de insetos que
variam consideravelmente em tamanho e forma do corpo, história de vida e hábitos
15
alimentares. Atualmente são descritas cerca de 67.500 espécies distribuídas por
todo o mundo (Triplehorn & Jonhson, 2005). Compreende um grupo claramente
monofiléico que se distingue dos outros insetos por possuírem peças bucais
adaptadas à perfuração e sucção, alojadas em uma longa tromba ou bico, tanto na
forma adulta como em ninfas (Schuh & Slater, 1995).
Frequentemente tem sido observada confusão em relação ao uso dos nomes
no grupo, especificamente os nomes Hemiptera, Homoptera e Heteroptera (Borror
et al., 1989). “Homoptera” é um nome usado no passado para todos os Hemiptera
com exceção dos Heteroptera ou percevejos verdadeiros. Os “Homoptera” formam
um grupo parafilético dividido em três subordens: Sternorrhyncha, Auchenorrhyncha
e Coleorrhyncha.
Usualmente quatro subordens de Hemiptera são agora aceitas: Heteroptera,
Sternorryncha, Coleorrhyncha, consideradas monofiléticas e Auchenorrhyncha,
parafilética (Bourgoin et al., 1997). As principais questões filogenéticas do grupo se
concentra nas relações e na monofilia dos Auchenorrhyncha. Os Sternorrhyncha
são quase sempre considerados o grupo irmão dos outros Hemiptera (Wheeler et
al., 1993), embora outros autores considerem que as relações nestas duas
subordens ainda não estão completamente resolvidas (Hennig, 1981).
A diversidade da ordem é relacionada a radiação das angiospermas. A
eficiência na alimentação em plantas é atribuída a estrutura das partes bucais, a
qual também possui algumas pré-adaptações para predação. Os Heteroptera
abrangem cerca de 25.000 espécies conhecidas como percevejos. A maioria das
espécies são fitófagos, alimentando de seiva e outros sucos produzidos por plantas,
mas existem algumas espécies hematófagas (alimentam-se de sangue) ou
entomófagas (predadores de outros insectos). Os Auchenorryncha (cigarras e
cigarrinhas) e os Sternorrhyncha (psilídeos, moscas brancas, pulgões e
cochonilhas) são fitófagos. O desenvolvimento pós-embrionário dos Hemiptera
16
ocorre por hemimetabolia (Triplehorn & Jonhson, 2005). O aparelho bucal surge na
frente da cabeça na subordem Heteroptera, de trás da cabeça em
Auchenorrhyncha e (quando presente) entre as procoxas dos Sternorrhyncha
(Schuh & Slater, 1995).
1.3.1. Subordem Heteroptera: Pentatomorpha
Os Heteroptera são um dos raros grupos que tem atraído considerável atenção
e esforço por vários entomologistas, os quais têm realizado intensas revisões sobre
a biologia e taxonomia da subordem (Poisson, 1951; Carver et al., 1991; Schuh &
Slater, 1995). Os Heteroptera são divididos em sete infraordens monofiléticas e as
relações entre elas foram amplamente discutidas por Wheeler et al. (1993)
baseando-se nos caracteres morfológicos extraídos dos trabalhos de Cobben
(1968, 1978).
Os Pentatomomorpha compreendem cerca de 15.000 espécies em todo o
mundo (Dolling, 1991; Schaefer, 1990; Schuh & Slater, 1995). Todos os taxa dessa
infra-ordem são terrestres e a grande maioria fitófagos. Dentre os Heteroptera, os
Pentatomomorpha ocupam a posição mais distal entre as sete infraordens, com os
Cimicomorpha como seu grupo irmão (Schuh, 1979; Wheeler et al., 1993).
Até mesmo as relações filogenéticas e o número de superfamílias dos
Pentatomomorpha são incertos. Dependendo dos autores são reconhecidas quatro
(Schaefer, 1964), cinco (Stys, 1961, 1967; Schaefer, 1990; Schuh & Slater, 1995),
seis (Carver, et al., 1991; Henry, 1997) ou sete (Schuh, 1986; Henry & Froeschner,
1988; Li & Zheng, 1994) superfamílias. Recentemente, Henry (1997) usando dados
morfológicos, e Li et al. (2005), dados moleculares, reconheceram seis
superfamílias (Aradoidea, Pentatomoidea, Coreoidea, Pyrrhocoroidea, Idiostoloidea
17
e Lygaeoidea), colocando os Piesmatoidea dentro de Lygaeoidea. Destas, somente
Aradoidea e Pentatomoidea são, reconhecidamente, monofiléticas.
A família Pentatomidae é uma das maiores dentre os Heteroptera, com cerca
de 4.120 espécies descritas, o que corresponde a 11% das espécies estimadas
dessa subordem (Schuh & Slater, 1995). Os Pentatominae compreendem a maior
subfamília e seus membros são fitófagos. Eles são chamados insetos fedorentos
“stink bugs” porque produzem um odor desagradável pelas glândulas de odores
que se abrem na região da metacoxa ou no caso de algumas ninfas, no dorso do
abdômen (Borror et al., 1992).
Os Pentatomidae se alimentam inserindo o estilete na fonte alimentar para
sugar os nutrientes. Dessa forma, esses insetos causam injúrias nos tecidos das
plantas, resultando em plantas murchas e, em muitos casos, aborto de frutos e
sementes. Durante a alimentação eles também podem transmitir patógenos,
aumentando o seu potencial de dano. Por isso, os membros dessa família estão
entre as principais pragas agrícolas, já que se alimentam em várias espécies de
plantas de importância econômica (Borror et al., 1992).
1.3.2. Subordem Auchenorrhyncha
A subordem Auchenorrhyncha possui aproximadamente 25.000 espécies
descritas, todas elas com hábito fitófago, alimentando-se de fluidos de plantas
vasculares e com poucas espécies alimentando de fungos. Apesar de possuir
várias características morfológicas únicas, ainda existem controversas a respeito da
monofilia do grupo. A monofilia da subordem Auchenorrhyncha tem sido suportada
por Kristensen (1975, 1981), Hennig (1981) e Carver et al. (1991). Entretanto,
Hamilton (1981, 1996) manteve os Sternorrhyncha como grupo irmão de uma
linhagem dos Auchenorrhyncha (os Cicadomorpha). Alguns caracteres morfológicos
18
e do DNA indicam relação próxima entre a outra linhagem de Auchenorrhyncha (os
Fulgoromorpha) e os Heteroptera (Bourgoin et al., 1997). Dessa forma, as
infraordens Cicadomorpha e Fulgoromorpha são consideradas monofiléticas,
entretanto, são mais proximamente relacionadas com as outras subordens de
Hemiptera, o que distancia a hipótese de monofilia para os Auchenorrhyncha.
Os Cicadomorpha são divididos em três superfamílias: Cicadoidea,
Cercopoidea e Cicadelloidea (ou Membracoidea). Essa última família tem sido a
mais estuda em termos de taxonomia e comportamento. Um completo trabalho
sobre as relações filogenéticas entre as famílias é apresentado por Deitz & Dietrich
(1993).
1.4. Morfologia do sistema reprodutor masculino nos insetos
Paralelamente a grande radiação adaptativa dos insetos, a pressão seletiva
sexual atuou gerando uma diversidade nos comportamentos de cópula, regulação
endócrina, produção de feromônios e nas estruturas anatômicas associadas à
reprodução (Borror et al., 1992; Chapmam, 1998). Com isso, variações
interespecíficas nos sistemas reprodutores podem ocorrer no tamanho ou número
das estruturas, na ausência de alguma delas ou na posição das mesmas ao longo
do trato reprodutivo (Adiyodi & Adiyodi, 1975; Grassé, 1982; Chapman, 1998).
Em geral, o sistema reprodutor masculino nos Hymenoptera é constituído por
dois testículos, duas vesículas seminais, ductos deferentes, ducto ejaculatório e,
geralmente, duas glândulas acessórias. Os testículos podem variar de esféricos a
fusiformes, sendo bem desenvolvidos nas pupas e nos adultos jovens, sofrendo,
comumente, uma degeneração gradativa até a completa regressão ao final da
maturidade sexual. Eles são constituídos por folículos, os quais podem variar em
número, forma e tamanho nos diferentes grupos taxonômicos. Por exemplo, todas
19
as espécies de vespas parasíticas já observadas têm apenas um folículo (Fiorillo et
al., 2008). Já em Vespidae, Crabronidae, Colletinae, Andreninae e Halictinae têm
sido observados três folículos (Ferreira et al., 2004; Moreira et al., 2008). Em outras
abelhas como Mellitinae, Apinae e alguns Megachilinae ocorrem quatro folículos
(Ferreira et al., 2004). Entretanto, em Formicidae este número varia de um
(Gnamptogenys striatula; observação pessoal) a onze (Wheller & Krutzsch, 1992).
Apesar desse número ser constante dentro do grupo, podem existir espécies com
número de folículos discrepantes, como, por exemplo, Apis mellifera que possui
cerca de 250 folículos (Chapman, 1998) e Hypanthidium foveolatum (Megachilinae)
que possui, em média, 28 folículos por testículo (Gracielle et al., 2009).
Nos insetos, os espermatozóides são transferidos dos testículos para as
vesículas seminais onde ficam armazenados até a cópula. As vesículas seminais
são uma porção especializada do ducto deferente, que nos Hymenoptera pode
compreender desde quase todo o ducto deferente ou apenas uma determinada
região dilatada dele. As glândulas acessórias, assim como os demais órgãos do
sistema reprodutivo, apresentam grande diversidade morfológica, podendo ser
esféricas, ovaladas, tubulares, ou mesmo estarem ausentes como nas abelhas da
tribo Meliponini (Kerr, 1969; Ferreira et al., 2004).
Há poucos trabalhos descrevendo aspectos anatômicos do sistema reprodutor
masculino de Hymenoptera e Hemiptera. Ferreira et al. (2004) estudaram 51
espécies de abelhas e as agruparam em quatro tipos de acordo com as diferenças
anatômicas das estruturas reprodutivas. Ainda dentre os Apoidea, alguns trabalhos
descreveram em detalhes a histologia do sistema reprodutor em abelhas (Dallacqua
& Cruz-Landim, 2003; Araújo et al., 2005a), vespas esfeciformes (Moreira et al.,
2008) e parasíticas (Baer & Boomsma, 2004; Damiens & Boivin, 2005; Fiorillo et al.,
2008). Dentre os Vespidae, a morfologia do sistema reprodutor masculino foi
analisada em algumas espécies (Dirks & Sternburg, 1972; Bushrow et al., 2006).
20
Boomsma et al. (2005) apresentaram uma ampla revisão sobre a evolução do trato
reprodutor masculino em insetos sociais. Os trabalhos realizados demonstram
vários caracteres morfológicos derivados dos sistemas reprodutores de machos
capazes de suportar análises comparativas entre espécies e apontados como
promissores para serem usados em estudos filogenéticos.
1.5. Caracteres estruturais e ultra-estruturais dos espermatozóides
A análise filogenética usando características morfológicas de estruturas
internas vem ganhando o interesse dos biologistas celulares e sistematas. Um
exemplo dessas estruturas é o espermatozóide. Esta célula fornece um conjunto de
dados não tradicionais, tendo seus caracteres uma natureza mais conservada que
os caracteres morfológicos comumente utilizados. Por isso a morfologia dos
espermatozóides tem sido utilizada para resolver problemas filogenéticos e
taxonômicos em vários grupos animais, incluindo os insetos (Dallai & Afzelius,
1995; Jamieson et al., 1999) e, pontualmente nos Hymenoptera (Quicke et al.,
1992; Lino-Neto et al., 2000a,b; 2008b; Zama et al., 2007).
Jamieson et al. (1999) propuseram uma filogenia para os holometabolos
utilizando caracteres morfológicos e moleculares (Kristensen, 1981; Whiting et al.,
1997), superpostos a caracteres ultra-estruturais dos espermatozóides, apomórficos
para cada ordem. Estes pesquisadores não definiram uma sinapormorfia
consistente para os Hymenoptera baseada nos espermatozóides, entretanto
sugeriram que a “inserção do perforatorium na cavidade anterior nuclear” ocorra
nos grandes grupos ‘symphyta’ e Apocrita. Este caracter é apomórfico em relação
aos holometabolos e provavelmente homoplástico em relação aos insetos, uma vez
que também foi observado em Collembola e Orthoptera (Jamieson et al., 1999).
O primeiro trabalho comparativo da morfologia dos espermatozóides nos
21
Hymenoptera foi realizado por Quicke et al. (1992) e compreende cerca de 14
famílias representando ‘symphyta’, Aculeata e Parasitica. Nesse trabalho, os
autores incluem uma matriz constituída por 13 caracteres, entretanto não sugerem
uma filogenia fundamentada neles. Recentemente, outros trabalhos descritivos da
morfologia dos espermatozóides em Hymenoptera, especialmente nos Aculeata,
têm sido realizados visando a utilização desta fonte de caracteres para análise
filogenética em diferentes níveis taxonômicos (Lino-Neto et al., 1999, Lino-Neto,
2000a,b; Lino-Neto & Dolder, 2001a,b; Zama et al., 2001, 2004, 2005, Báo et al.,
2004; Ferreira et al., 2004; Moreira et al., 2004; Araújo et al., 2005a,b; Fiorillo et al.,
2005; Zama et al., 2007; Mancini et al., 2008; Lino-Neto et al., 2008b).
O espermatozóide típico de Hymenoptera é longo, medindo, em geral, entre 40
µm e 300 µm de comprimento (Quicke et al., 1992). Medidas morfométricas dos
espermatozóides têm contribuído para a taxonomia de insetos, visto que são bem
conservadas intra-especificamente. Este é constituído de cabeça e cauda, sendo a
cabeça formada pelo acrossomo e o núcleo, enquanto que a cauda, ou flagelo,
geralmente é formada pelo axonema, de padrão 9 + 9 + 2 microtúbulos, o adjunto
do centríolo, dois derivados mitocondriais e dois corpos acessórios.
A morfologia dos espermatozóides em Hymenoptera foi descrita em detalhes
em vários grupos de Hymenoptera como em symphyta (Quicke et al., 1992;
Newman & Quicke, 1999a; Lino-Neto et al., 2008b), em Aculeata, como nas
abelhas (Rothschild, 1955; Cruz-Höfling et al., 1970; Lensky et al., 1979; Peng et
al., 1992, 1993; Lino-Neto et al., 2000b; Zama et al., 2001, 2004, 2005; Báo et al.,
2004; Araújo et al., 2005b; Fiorillo et al., 2005; 2008a) e em algumas formigas
(Thompson & Blum, 1967; Caetano, 1980; Wheeler et al., 1990; Lino-Neto & Dolder,
2002; Mancini et al., 2006; Moya et al., 2007) e nos Apocrita parasítica os estudos
dos espermatozóides concetrou-se em alguns Chalcidoidea (Hogge & King, 1975;
22
Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto & Dolder, 2001b; Fiorillo et al., 2008b), em
algumas espécies de Ichneumonoidea (Chauvin et al., 1988; Quicke et al., 1992),
em um Cynipoidea (Newman & Quicke, 1999b), em um Megalyroidea (Newman &
Quicke, 2000) e em Scelionidae (Lino-Neto & Dolder, 2001a).
Dentre os Hemiptera, algumas espécies representantes da infraordem
Cicadomorpha (Cicadidae, Cercopidae e Cicadellidae) e Fulgoromorpha, tiveram a
ultra-estrutura dos espermatozóides descrita (Folliot & Maillet, 1970; Kubo-Irie et al.,
2003; Chawanji et al., 2005, 2006).
Apesar dos trabalhos serem restritos a algumas espécies, portanto ainda pouco
representativos se considerarmos o grande número de espécies e a grande
diversidade dos Hymenoptera e Hemiptera, algumas características ultra-estruturais
possibilitaram inferências dentro de alguns grupos.
23
1.6. Referências Bibliográficas
Adiyodi KG; Adiyodi RG (1975) Morphology and cytology of the acessory sex gland in
invertebrates. Int. Rev. Cytol. 47: 353-398.
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35
2. Objetivos
Considerando a diversidade morfológica do sistema reprodutor e dos
espermatozóides na classe Insecta (especificamente nas ordens Hymenoptera e
Hemiptera), este trabalho tem como objetivos:
- Descrever a anatomia e a histologia dos sistemas reprodutores nas seguintes
espécies de Hymenoptera: Thygater (Thygater) analis, Melipona segmentaria e
Polistes versicolor versicolor;
- Caracterizar a estrutura e a ultra-estrutura dos espermatozóides em espécies de
Hymenoptera: Trypoxylon (Trypargilum) albitarse, Thygater (Thygater) analis e
Melipona segmentaria; e em espécies Hemiptera: Aethalion reticulatum e Largus
rufipennis;
- Descrever a morfologia dos espermatozóides polimórficos na família Largidae
(Hemiptera) e suas implicações na competição de espermatozóides;
- Comparar os dados de estrutura e ultra-estrutura dos espermatozóides das
espécies descritas neste trabalho, com aqueles existentes na literatura, procurando
um padrão morfológico e/ou caracteres para serem incluídos em análises
filogenéticas.
36
3.1. Structure and ultrastructure of the spermatozoa of Trypoxylon (Trypargilum)
albitarse Fabricius 1804 (Hymenoptera: Apoidea: Crabronidae)
Vinícius Albano Araújo; Jane Moreira
& José Lino-Neto
Artigo submetido à revista Micron
Capítulo 1
37
ABSTRACT. The ultrastructure of the spermatozoa of Trypoxylon (Trypargilum)
albitarse is described here for the first time within this genus. Testes and seminal
vesicles were dissected and processed for transmission electron microscopy. In the
testicular follicles, the spermatids are arranged in a maximum number of 32 for each
cyst. The spermatozoa are slender and measure approximately 150 µm in length.
The head are about 17 µm long and its is formed by the acrosome and the nucleus.
The flagellum consists in an axoneme, two mitochondrial derivatives, two accessory
bodies and, at the nucleus-flagellum transition, a symmetric centriolar adjunct. The
axoneme presents the typical insect 9+9+2 microtubule pattern. In the terminal
region, the central microtubules and nine doublets finish first, followed by the
accessory microtubules. Both mitochondrial derivatives begin together and are
inserted in the centriolar adjunct base. Along the middle region, the larger derivative
has almost twice the area of the smaller one and includes a discrete paracrystalline
region. At the tip, the smaller derivative ends before the larger one and both before
the axoneme. The characters derived from the ultrastructure of the spermatozoa of
T. albitarse show synapomorphies shared with the Apoidea and probably present
apomorphic characters for the Crabroninae subfamily.
KEYWORDS: centriolar adjunct, apomorphic, mitochondrial derivative, Crabroninae.
38
1. Introduction
The Apoidea were divided into the families Apidae, Sphecidae (Latu sensu)
and Heterogynaidae (Brothers, 1975). Lomholdt (1982), in his phylogenetic study of
Apoidea, established the proposal of Bohart & Menke (1976) that the Sphecidae
could be separated into the families, Sphecidae and Larridae (= Crabronidae). He
also suggested that the Larridae constitute a sister-group of Apidae s.l. However,
according to Ohl (1995), this hypothesis cannot be sustained, since it is supported
by a symplesiomorphy based on the form of the shape of the salivary gland opening
in the larval stages. Melo (1999) has shown more evidence that supports the
hypothesis of monophily for the Crabronidae and its relation to the sister-group
Apidae s.l. and suggested significant changes in the classification of the
Crabronidae subfamilies. This represents an important advance, since there are few
phylogenetic studies involving taxon below the family-status (Alexander, 1992;
Nemkov and Lelej, 1996; Bohart, 2000). Recently, Brothers (1999), Melo (1999) and
Melo and Gonçalves (2005) proposed a new, higher-level classification of Apoidea,
recognizing four wasp families and a single bee family.
The Apoidea phylogeny is still not clear and, probably, many questions
concerning this field will be solved with the new characters, besides those
traditionally used in the phylogeny analyses. In insects, the ultrastructural diversity
of the spermatozoa has furnished character sets, which could be used in phylogeny
inferences (Dallai, 1974; Jamieson, 1987; Wheeler et al., 1990; Quicke et al., 1992;
Dallai and Afzelius, 1993; Jamieson et al., 1999). In Aculeata, the morphology of the
spermatozoa was described in some bees (Cruz-Hofling et al., 1970; Lensky et al.,
1979; Peng et al., 1993; Lino-Neto et al., 2000a; Báo et al., 2004; Zama et al., 2001,
2004, 2005a; Fiorillo et al., 2005; Araújo et al., 2005), wasps (Lino-Neto et al., 1999,
2000b; Lino-Neto and Dolder, 2001a,b; Zama et al., 2005b) and ants (Wheeler et
al., 1990; Lino-Neto and Dolder, 2002; Moya et al., 2007). However, for the
39
spheciformes only in the genus Microstigmus (Crabronidae) (Zama et al., 2007) and
Sceliphron (Sphecidae) (Zama et al., 2005b) has the spermatozoa morphology been
described in detail, while in Trypoxylon only the nucleus-flagellum transition region
was analysed (Zama et al., 2005c).
The Trypoxylon Latreille genus has a wide geographic distribution (Bohart
and Menke, 1976) and more than 660 species have been reported (Hanson and
Menke, 1995) in the Trypoxylon and Trypargilum Richards subgenera. Its nests are
built with mud or using pre-existing cavities, such as those made in wood by other
insects, and their nests are supplied with spiders (Bohart and Menke, 1976). This
research describes, for the first time, the ultrastructure of the spermatozoa of
Trypoxylon (Trypargilum) albitarse (subfamily Crabroninae) with the intention of
indicating characters that can contribute to phylogeny analyses of the spheciformes,
mainly in the taxa below family status.
2. Material and Methods
Eight adult males of Trypoxylon (Trypargilum) albitarse were sampled in nests
collected from buildings on the campus of the Federal University of Viçosa, Minas
Gerais State, Brazil. The nests occupied were taken to the laboratory where they
were kept until the adult’s emergence.
2.1. Light microscopy: From each male, the suspension of the spermatozoa
extracted from one of the seminal vesicles was spread on clean glass microscope
slides and fixed for 20 minutes in solution 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 0.1 M
sodium phosphate buffer, pH 7.2. After drying at room temperature, the preparations
were observed with a photomicroscope (Olympus, BX-60), equipped with phase
constrast and 50 spermatozoa were photographed to be measured. To access
40
nucleus measurements, some of these preparations were stained during 15 min with
0.2 µg/ml 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in PBS, washed, and mounted in 50%
sucrose. They were examined with an epifluorescence microscope (Olympus, BX-
60), equipped with a BP 360-370 nm excitation filter and 50 nuclei were
photographed. All the measures were obtained with the software Image Pro-Plus
®
,
version 4.5 (Media Cybernetics Inc., MD, USA).
2.2. Transmission electron microscopy: From each male, one of the seminal
vesicles and one of the testes was fixed for 24 h, at 4
o
C, in a solution containing
2.5% glutaraldehyde, 3% sucrose, 0.2% picric acid and 5 mM CaCl
2
in 0.1 M
sodium cacodylate buffer at pH 7.2. After rising in buffer, they were post-fixed with
1% osmium tetroxide in the same buffer for 2 h. Dehydration was carried out in
acetone, followed by embedding in Epon 812 resin. Ultrathin sections were stained
with the 2% uranyl acetate and 0.2% lead citrate in 1 N sodium hydroxide and
observed with the LEO 906 transmission electron microscope.
3. Results
The spermatozoa of Trypoxylon albitarse are slender cells, measuring
approximately 150 µm in length (Fig. 1). They comprises the head region, formed by
an acrosome and a nucleus, and the flagellar region that includes an axoneme, the
paired mitochondrial derivatives, two accessory bodies, and the transition nucleus-
flagellum a centriolar adjunct.
The acrosome is anterior to the nucleus and are comprised by an acrosomal
vesicle and a perforatorium (Fig. 3). The acrosomal vesicle is conic shaped and
covers the perforatorium that has its base inserted into a cavity at the nucleus
anterior extremity (Fig. 3 and 7). In cross sections, the acrosomal vesicle is circular
41
(Fig. 4-6) and, anteriorly, an electron lucid layer separates it from the perforatorium
(Fig. 5). However, near the nucleus, this layer practically disappears, remaining only
two regions at the perforatorium opposite sides (Fig. 6).
The nucleus is slender, homogeneous, with electron dense chromatin, and
measured about 17 µm in length (Fig. 2). It presents a circular shape in the cross
sections (Fig. 7 and 8) and its base is laterally pointed, where it is associated side
by side with the centriolar adjunct and ends immediately above the axoneme (Fig.
9).
The nucleus-flagellum transition region is composed by the nuclear base, a
centriolar adjunct and the anterior portions of the axoneme and both mitochondrial
derivatives. The centriolar adjunct is compact and electron dense, measuring about
2 µm length, with approximately two of its anterior thirds juxtaposed to the nuclear
lateral projection (Fig. 9-10). It extendis laterally to the axoneme (Fig. 11) and is
located between the nuclear base and at the beginning of both mitochondrial
derivatives (Fig. 12), leading to this adjunct a symmetrical pattern.
The axoneme begins immediately bellow the nucleus’ projection (Fig. 9) and
follows the typical 9 + 9 + 2 pattern of microtubule arrangement. The nine single
accessory microtubules are the most external, followed by the nine doublets and a
central pair (Fig. 13). In the terminal region, the central microtubules and the nine
doublets finish first, followed by the accessory microtubules (Fig. 14-16).
The two mitochondrial derivatives begin amost together and are inserted into
the centriolar adjunct base (Fig. 12). In cross sections, in both ends they are circular
and present approximately the same diameter (Fig. 12 and 14). However, along the
middle region, the diameter of one is almost twice as big as the other’s, and at the
cross section it shows a constriction resembling the number eight, while the smaller
diameter remains circular (Fig. 13). Moreover, only the larger mitochondrial derivate
42
presents a paracrystalline core, situated distally in relation to the axoneme (Fig. 13).
In the terminal portion of the flagellum, the small mitochondrial derivative ends first,
followed by the larger one and both ends before the axoneme (Fig. 15-16).
The accessory bodies are approximately triangular, in the cross section. They
are located exclusively between the axoneme and the mitochondrial derivatives and,
therefore, they are not seen followed by the centriolar adjunct (Fig. 13).
In the testicular follicles, the spermatids are arranged with a maximum number
of 32 in each cyst (Fig. 17).
4. Discussion
In Hymenoptera, a large variation of sperm length has been observed, which
has being found even among species of same family. It can be observed in the
Crabronidae, which presents T. albitarse (Crabroninae) with spermatozoa
measuring 150 µm and therefore, smaller than those of Pemphredoninae,
Microstigmus arlei, that measure 813 µm (Zama et al., 2007). In bees, the length of
such cells varies considerably, generally from 80 to 450 µm (Baer et al., 2003; Zama
et al., 2004; Araújo et al., 2005; Fiorillo et al., 2005), but reaching up to 1500 µm, as
observed in Euglossini bees (Zama et al., 2005a).
The spermatozoa of T. albitarse share many ultrastructural characteristics
with other Hymenoptera (Wheeler et al., 1990; Peng et al., 1992, 1993; Newman
and Quicke, 1999; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b,c; Lino-Neto and Dolder, 2002).
However, there are also differences, as among the species of Crabronidae and
Sphecidae already studied. For example, in Microstigmus, the perforatorium is
paracrystalline, very long and almost entirely inserted into a nuclear cavity. The
nucleus and the perforatorium show a spiralled course (e.g. Zama et al., 2007). The
difference between the species acrosome studied here and that of Sphecidae, S.
43
fistularium (Zama et al., 2005b) consists in the acrosomal vesicle. In T. albitarse, it is
circular, while in S. fistularium it changes to ellipsoidal near to the nucleus.
The perforatorium base is inserted into a cavity at the anterior extremity of
the nucleus and occurs in all the Hymenoptera. In this sense, it may be considered a
synapomorphic character to the order. However, variations in the depth of the
insertion are observed among different species. In T. albitarse, the insertion, only 80
nm, is the shortest registered for Hymenoptera. In S. fistularium (Zama et al., 2005b)
and in the Halictinae bees (Fiorillo et al., 2005), Tapinotaspidini (Báo et al., 2004)
and Meliponini (Zama et al., 2001, 2004; Araújo et al., 2005) this insertion varies
from 100 and 300 nm. The deepest insertions were 400 nm in ants (Moya et al.,
2007), 500 nm in wasps Agelaia vicina (Mancini et al., 2006), and 630 nm in
Euglossini bees (Zama et al., 2005a).
In most insects, the nucleus is connected to the flagellum by an electron-dense
structure called the centriolar adjunct (Jamieson et al., 1999). In the Hymenoptera,
this structure has been classified as symmetric or asymmetric, based on its
association with the other components of this region. It’s called symmetric when it’s
structure is located between nuclear base (which, in general, is pointed) and the
beginning of both mitochondrial derivatives. It is considered asymmetric when the
centriolar adjunct, which usually begins at the nuclear base, extending parallel to the
axoneme and the large mitochondrial derivative and finishes just above the tip of the
smaller mitochondrial derivative. The asymmetric type is observed from ‘symphyta’
to Apoidea, including the spheciforme S. fistularium (Zama et al., 2005b). However,
as in T. albitarse, in Siricoidea Tremex sp. (Newman and Quicke, 1999), in
Chalcidoidea (Lino-Neto et al., 1999; Lino-Neto et al., 2000b; Lino-Neto and Dolder,
2001b), and in ants (Wheeler et al., 1990; Lino-Neto and Dolder, 2002; Moya et al.,
2007), the centriolar adjunct is symmetric. Possibly, the symmetric condition in this
species represents an autapomorphy and occurred independently. On the other
44
hand, no centriolar adjunct was observed in the parasitic wasp Scelionidae, (Lino-
Neto and Dolder, 2001a).
Although the microtubular arrangement pattern is largely conserved in
Hymenoptera (Jamieson et al., 1999) differences can be recognized in the
sequence of their cut-off in the terminal axonemal portion. In T. albitarse similarly to
all aculeate, the central microtubules and the nine doublets end first, followed by the
accessory microtubules (Lino-Neto et al., 2000a; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b,
2007; Báo et al., 2004, Araújo et al., 2005; Fiorillo et al., 2005, Mancini et al., 2006)
or all end approximately together, as in ants (Wheeler et al., 1990; Lino-Neto and
Dolder, 2002). A different sequence was found for parasitic wasps (Chalcidoidea)
where the nine doublets are the last microtubules to be lost at the flagellum tip (Lino-
Neto et al., 1999, 2000b; Lino-Neto and Dolder, 2001b).
The asymmetry in the mitochondrial derivatives’ diameters was observed in
Sphecidae S. fistularium (Zama et al., 2005b), in Apidae (Lino-Neto et al., 2000a;
Báo et al., 2004; Zama et al., 2001, 2004, 2005a; Fiorillo et al., 2005; Araújo et al.,
2005) and in Vespidae (Mancini et al., 2006; 2008), while in Microstigmus, the
mitochondrial derivatives are symmetrical (Zama et al., 2007). However, the
constriction observed in the biggest mitochondrial derivative can be used to differ T.
albitarse from other species.
The number of spermatozoa per cyst in testicular follicles reflects the number
of mitosis and the viability of the spermatids at the beginning of spermiogenesis
(Lino-Neto et al., 2008). In T. (Trypargilum) albitarse and T. (Trypoxylon) spp.
(Moreira et al., 2008), up to 32 spermatids were observed per cyst, indicating that
this number is possibly characteristic for the genus or, at the most, of the subfamily
Crabroninae; since in Pemphredoninae, Microstigmus showed up to 64
spermatozoa per cyst (Zama et al., 2007). Also, in Sphecidae, S. fistularium, up to
128 spermatozoa were observed per cyst (Zama et al., 2005b).
45
As can be observed, the morphology of the spermatozoa of T. albitarse
shows several synapomorphies to the Apoidea. However, there are characteristics
shared only with the subfamily while others are exclusive of the species or, possibly,
of the genus.
Acknowledgement
We are grateful to the Núcleo de Microscopia e Microanálise of the
Universidade Federal de Viçosa (UFV) and the Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). We thank Dr. Lúcio A. O. Campos (DBG-UFV) for supplying some of
the specimens and Heide Dolder for critical reading of the manuscript. This research
was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(Capes).
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49
Legends of the figures
Figure 1. Phase contrast micrograph of T. albitarse spermatozoa. Arrow indicates
the limit between the head (H) and the flagellum (F). 2. DAPI stained fluorescence
micrographs of the nucleus. 3-17. Electron micrographs of the spermatozoa. 3.
Longitudinal section of the head anterior region, showing the short cavity at the
nucleus top, in which the perforatorium is inserted (asterisk). 4-8. Transverse
sections at various levels, from the head anterior to the posterior region. (4) Detail of
acrosomal vesicle (av); (5) electron-lucid layer separating the acrosomal vesicle (av)
from the perforatorium (p); (6) acrosomal vesicle (av) posterior end and of the
perforatorium (arrow); (7) anterior extremity of the nucleus, in which the
perforatorium (arrow) is inserted; (8) anterior region of the electron-dense nucleus
(N). 9. Longitudinal section of the nucleus-flagellum transition region, showing the
nucleus (N), the centriolar adjunct (ca) and the axoneme (ax). 10-12. Transverse
section of the nucleus-flagellum transition region. The circle of broken lines indicates
the anterior tip of both mitochondrial derivatives. 13. Transverse section of the
flagellum, showing the axoneme (ax) made up of accessory, doublet and central
microtubules (am, dm and cm, respectively), two mitochondrial derivatives (md); the
paracrystalline material (asterisk); and two accessory bodies (arrows) located
between the axoneme and the mitochondrial derivative. 14-15. Transverse sections
of the posterior region of the flagellum: in (14) the mitochondrial derivatives (md)
follow the axoneme and in (15) are the larger derivative (asterisk) ends after the
smaller. 16. Transverse section of the final flagellar region showing the accessory
microtubules (arrow), which are the last ones to end. 17. Transverse section of the
spermatids nuclei in a cyst with 32 spermatids. Scale bars: (A) 20 µm; (B) 5 µm; (C,
J-L) 0.2 µm; (D) 0.5 µm; (E-F, M-P) 0.1 µm; (G-I) 0.3 µm; (Q) 1 µm.
50
51
3.2. Ultra-estrutura dos espermatozóides em duas espécies de abelhas
solitárias com ênfase nos caracteres sinapomórficos compartilhados na
família Apidae
Capítulo 2
52
RESUMO. A morfologia dos espermatozóides de abelhas tem fornecido caracteres
promissores para análises filogenéticas. Neste trabalho a estrutura e ultra-estrutura
dos espermatozóides de Thygater (Thygater) analis e Melitoma segmentaria foram
descritas e as sinapomorfias compartilhadas na família Apidae foram discutidas.
Nestas espécies, os feixes de espermatozóides que são desfeitos na vesícula
seminal, possuem, em média, 50 células. Os espermatozóides são formados por
uma região de cabeça e outra flagelar. A cabeça inclui um acrossomo contendo o
perforatorium, coberto pela vesícula acrossomal e um núcleo. O flagelo é formado
por dois derivados mitocondriais assimétricos em diâmetro e comprimento, um
adjunto do centríolo, um axonema (9 + 9 + 2) e dois corpos acessórios. O adjunto
do centríolo possui padrão assimétrico e os corpos acessórios formato triangular.
Na região final do flagelo, os derivados terminam antes do axonema e o derivado
de menor diâmetro termina primeiro. O axonema é gradualmente desorganizado e
os microtúbulos acessórios são os últimos a terminarem. Nestas duas espécies, os
espermatozóides compartilham diversas sinapomorfias com aqueles de outras
espécies de abelhas já descritas na literatura, o que possibilita estabelecer um
padrão geral morfológico típico para os espermatozóides na família Apidae.
PALAVRAS-CHAVE: adjunto do centríolo, sinapomorfia, abelhas solitárias e
Apoidea.
53
1. Introdução
A morfologia dos espermatozóides de insetos é uma importante fonte de
caracteres para análises filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos (Baccetti,
1970; Phillips, 1970; Dallai, 1974; Jamieson, 1987; Dallai & Afzelius, 1993;
Jamieson et al., 1999). O primeiro estudo comparativo da morfologia dos
espermatozóides em Hymenoptera foi feito por Quicke et al. (1992), com espécies
de 14 famílias representando “symphyta”, Aculeata e Parasitica. Jamieson et al.
(1999) propuseram uma filogenia para os holometabolos utilizando caracteres
morfológicos e moleculares, superpostos pelos caracteres apomórficos dos
espermatozóides para cada ordem. Estes autores sugeriram que o “perforatorium
inserido em uma curta cavidade na extremidade anterior do núcleo” seja a única
característica apomórfica dos espermatozóides nos Hymenoptera.
Em abelhas, a ultra-estrutura dos espermatozóides foi descrita em algumas
espécies de Apinae (Rothschild, 1955; Hoage & Kessel, 1968; Cruz-Hofling et al.,
1970; Lensky et al., 1979; Woyke, 1984; Peng et al., 1992; 1993; Quicke et al.,
1992; Lino-Neto et al., 2000; Zama et al., 2001; 2004; 2005a,b; Báo et al., 2004;
Araújo et al., 2005a), Halictinae (Fiorillo et al., 2005), Megachilinae e Andreninae
(Quicke et al., 1992). Nestas abelhas os espermatozóides apresentam em comum
uma região de cabeça curta, formada pelo acrossomo e núcleo, e a região do
flagelo formada por dois derivados mitocondriais assimétricos, um adjunto do
centríolo, um axonema com o arranjo de microtúbulos 9 + 9 + 2 e dois corpos
acessórios. Nas abelhas, assim como nos Aculeata em geral, os espermatozóides
são transferidos para as vesículas seminais em feixes (espermatodesmata), os
quais são desorganizados durante a maturação sexual (Moreira et al., 2004; Araújo
et al., 2005b; Moreira et al., 2008).
Neste trabalho, descrevemos a ultra-estrutura dos espermatozóides em duas
espécies de Apinae e comparamos com aquela das demais espécies descritas na
54
literatura, com o objetivo de investigar a existência de caracteres sinapomórficos
para as abelhas e, assim, fornecer um padrão ultra-estrutural para os
espermatozóides na família Apidae.
2. Material e Métodos
Oito machos adultos de Thygater (Thygater) analis (Lepeletier 1841) e oito de
Melitoma segmentaria (Fabricius 1804) foram coletados com redes entomológicas
enquanto visitavam as flores de Ipomoea sp. (Convolvulaceae) no campus da
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil.
2.1. Microscopia de luz - Suspensão de espermatozóides extraídos de uma das
vesículas seminais foi espalhada em lâminas histológicas e fixada por vinte minutos
em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0.1 M, pH 7.2. Após secar
em temperatura ambiente, as lâminas foram observadas em fotomicroscópio
equipado com contraste de fase e 50 espermatozóides foram fotografados para
serem medidos. Para medir os núcleos, algumas lâminas foram coradas por 15
minutos com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) 0.2 µg/ml em PBS, lavadas e
montadas em sacarose 50%. Essas lâminas foram observadas em microscópio de
epifluorescência (Olympus, BX-60) equipado com filtro BP360-370 nm e 50 núcleos
foram fotografados. Todas as medidas foram feitas usando o software Image Pro-
Plus (Media Cybernetcs) e os comprimentos foram expressos pela média do
número total de espermatozóides analisados.
2.2. Microscopia eletrônica de transmissão - De cada macho, uma das vesículas
seminais foi fixada por 24 h, a 4
o
C, em solução contendo glutaraldeído 2.5%, ácido
55
pícrico 0.2%, sacarose 3% e 5 mM CaCl
2
em tampão cacodilato de sódio, pH 7.2. O
material foi pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, desidratado em acetona e
incluído em Epon 812. Cortes ultrafinos foram contrastados com solução aquosa de
acetato de uranila 2% e citrato de chumbo 0,2% em solução de hidróxido de sódio
1N e observados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 109).
3. Resultados
Os espermatozóides de T. analis e M. segmentaria são longos, finos e medem,
em média, 500 µm e 300 µm de comprimento, respectivamente (Fig. 1A e C). Em
T. analis o núcleo mede, em média 45 µm de comprimento (Fig. 1B) com razão
núcleo/flagelo de 0,09, enquanto em M. segmentaria o núcleo mede, em média, 30
µm (Fig. 1D) e a razão núcleo/flagelo é igual a 0,1.
Os espermatozóides de Thygater (Thygater) analis e Melitoma segmentaria
saem dos testículos em feixes, sendo estes frequentemente desfeitos no lúmen da
vesícula seminal (Fig. 1E). Entretanto, algumas vezes, feixes ou seus fragmentos
são vistos na vesícula seminal (Fig. 1F-G). O arranjo dos espermatozóides nos
feixes é mantido por uma capa fibrosa de material extracelular, na qual a porção
anterior das cabeças dos espermatozóides (acrossomo e parte do núcleo) é
embebida (Fig. 1F). Os feixes possuem, em média, 50 espermatozóides (Fig. 1G).
A região da cabeça dos espermatozóides consiste de um complexo acrossomal
e do núcleo (Fig. 1H-K). O acrossomo mede aproximadamente 1,8 µm em ambas
as espécies e é formado por uma vesícula acrossomal de formato cônico que cobre
o perforatorium ao longo de todo o seu comprimento (Fig. 1I-J). A base do
perforatorium é inserida em uma cavidade na extremidade anterior do núcleo (Fig
1K). Esta cavidade mede aproximadamente 0,2 µm em T. analis (Fig. 1K) e 0,18
µm em M. segmentaria. Em seção transversal, observa-se que a vesícula
56
acrossomal é formada por estruturas lamelares (Fig. 1L-Q). A vesícula acrossomal
é circular na região anterior e, a medida que se aproxima do núcleo, ela se torna
oval (Fig. 1L-Q). Ao longo do acrossomo, uma camada elétron-lúcida separa o
perforatorium da vesícula acrossomal (Fig. 1J e 1O-P).
O núcleo é linear e apresenta-se fortemente elétron denso, com muitas lacunas
elétron lúcidas, principalmente, nas regiões periféricas ao longo de todo o seu
comprimento (Fig. 2A-B). Em seção transversal, o núcleo possui formato oval (Fig.
2B). A extremidade posterior do núcleo possui um formato coniforme assimétrico e
se posiciona paralelamente com a região anterior do axonema e o topo do derivado
mitocondrial maior (Fig. 2C-E).
O adjunto do centríolo começa na altura da base nuclear, se estende em
paralelo ao axonema e ao derivado mitocondrial maior (Fig. 2E-F) e termina
justamente acima do topo do derivado mitocondrial menor, padrão denominado
assimétrico. Em corte transversal, o adjunto do centríolo possui formato
aproximadamente triangular sendo compacto e elétron denso (Fig. 2F).
O flagelo consiste de dois corpos acessórios, um axonema e dois derivados
mitocondriais. Em cortes transversais, os corpos acessórios possuem formato
triangular (Fig. 2H-J) e estão localizados entre o axonema e os derivados
mitocondriais, mas não ocorrem entre o axonema e o adjunto do centríolo (Fig. 2F).
Na região anterior, o axonema não possui os microtúbulos centrais, sendo que
estes começam posteriores a região centriolar (Fig. 2C-E). O axonema apresenta o
padrão típico de 9 + 9 + 2 microtúbulos, sendo 9 acessórios, 9 duplas e 2
microtúbulos centrais (Fig. 2H e 3A-B). Os derivados mitocondriais são assimétricos
em tamanho e diâmetro (Fig. 2H e 3A). Anteriormente, o derivado mitocondrial
maior começa adjacente a extremidade nuclear (Fig. 2C), enquanto o derivado
menor começa imediatamente abaixo do adjunto do centríolo. Os derivados
mitocondriais são divididos em quatro regiões: (1) uma região clara, circular e de
57
localização central; (2) uma região elétron densa adjacente ao axonema; (3) uma
região de crista, a qual é restrita a borda distal em relação ao axonema e (4) uma
região de paracristalino que ocorre somente no derivado mitocondrial maior (Fig. 2H
e 3C). Em cortes longitudinais, as cristas são perpendiculares ao longo do eixo dos
derivados e com espaços em intervalos regulares que medem 25 nm em T. analis
(Fig. 2G) e 29 nm em M. segmentaria. Na região final do flagelo, os derivados
terminam antes do axonema e o derivado de menor diâmetro termina primeiro (Fig.
2I-K). O axonema é o componente mais longo do flagelo, sendo que, na sua
extremidade posterior, os microtúbulos acessórios são os últimos a terminarem
(Fig. 2K-P).
4. Discussão
Os espermatozóides de T. analis e M. segmentaria medindo 500 µm e 300 µm,
respectivamente, estão dentro do intervalo encontrado em outras abelhas, que varia
de 80 µm em Scaptotrigona xanthotricha (Araújo et al., 2005a) a 1500 µm em
Euglossa mandibularis (Zama et al., 2005a). O grande intervalo de comprimento
observado demonstra que o comprimento total dos espermatozóides pode não ser
um caracter válido em estudos filogenéticos, porque apresenta muitas homoplasias,
mas mostra-se um bom indicador taxonômico, já que possui medidas distintas em
espécies proximamente relacionadas. Quando se analisa a razão entre o núcleo e o
flagelo de T. analis (0,09) e M. segmentaria (0,1) observa-se grande similaridade
entre as espécies das tribos Eucerini e Emphorini, respectivamente. Em outras
tribos de Apinae filogeneticamente próximas, a razão núcleo/flagelo de 0,6 em
Exomalopsis auropilosa (Exomalopsini) e 0,7 em Paratetrapedia (Lophopedia) sp.
(Tapinotaspidini) também foram muito similares (Báo et al., 2004). Entretanto, é
necessário analisar a razão núcleo/flagelo em um número maior de espécies para
58
confirmar se esta razão se mantém similar dentro de grupos proximamente
relacionados.
A presença de espermatozóides mantidos em feixes na vesícula seminal tem
sido observada em todas as espécies de “symphyta” estudadas (Quicke et al.,
1992; Newman & Quicke, 1999; Lino-Neto et al., 2008a) e feixes ou fragmentos
destes também são observados na vesícula seminal dos Aculeata (Moreira et al.,
2004; Zama et al., 2004; Moreira et al., 2008). Entretanto, nas abelhas e nos
Aculeata em geral, quando os indivíduos tornam-se sexualmente maduros, os
feixes são desfeitos e raramente são observados na vesícula seminal, sendo mais
comum a presença de espermatozóides individualizados, os quais, dessa forma,
serão transferidos para a fêmea. Esta característica representa uma sinapomorfia
para as abelhas e para os Aculeata. Isto porque nos “symphyta”, considerados os
Hymenoptera mais basais, todos os espermatozóides são vistos em feixes na
vesícula seminal (Quicke et al., 1992; Newman & Quicke, 1999; Lino-Neto et al.,
2008a). Lino-Neto et al. (2008a) sugerem que, a manutenção dos feixes na vesícula
seminal dos symphyta, possivelmente esta relacionada ao conteúdo enzimático
e/ou pH dos fluidos presentes no lúmen.
Nos folículos testiculares, a organização das células germinativas em cistos é
uma característica comum para os insetos. O número de espermatozóides nos
feixes representa o número final de células que se desenvolveram em sincronia
dentro dos cistos, a partir de uma única espermatogônia (Lino-Neto et al., 2008b).
Em abelhas, os machos são haplóides e durante a espermiogênese, pelo menos
metade das espermátides são células inviáveis (Cruz-Landim & Beig 1980a,b; Cruz-
Landim 2001; Conte et al., 2005; Lino-Neto et al., 2008b). Portanto, em T. analis e
M. segmentaria, a média de 50 espermatozóides por feixe indica a ocorrência de
seis divisões celulares mitóticas, como observado para a maioria das abelhas
(Observação pessoal). Exceção para a tribo Meliponini, que possui 128
59
espermatozóides por cisto, indicando sete ciclos mitóticos, o que pode ser
considerado um caracter derivado dentro da família.
Os espermatozóides de T. analis e M. segmentaria apresentam várias
semelhanças com aqueles já descritos para outras espécies de Apidae. Em abelhas
o acrossomo mede de 1-2 µm e é formado pela vesícula acrossomal e pelo
perforatorium (Zama et al., 2001; 2004; 2005a; Báo et al., 2004; Araújo et al.,
2005a; Fiorillo et al., 2005), com exceção de Apis mellifera, onde o acrossomo é
excepcionalmente longo, medindo 5,6 µm (Hoage & Kessel, 1968; Cruz-Hofling et
al., 1970; Lensky et al., 1979; Woyke, 1984). Em corte transversal, o acrossomo,
em geral, varia de circular, na região anterior, a elipsoidal na região posterior,
exceto em Meliponini, onde na região posterior ele possui formato triangular (Zama
et al., 2001; 2004; Araújo et al., 2005a). A vesícula acrossomal formada em lamelas
em T. analis e M. segmentaria não havia sido observada em outras espécies de
abelhas. O perforatorium é compacto, assim como em outros Apini (Báo et al.,
2004) em Euglossini (Zama et al., 2005a) e em Meliponini (Zama et al., 2001; 2004;
Araújo et al., 2005). Em Halictinae (Fiorillo et al., 2005), o perforatorium é
paracristalino. A base do perforatorium inserida em uma cavidade na extremidade
anterior do núcleo é uma característica que ocorre em praticamente todos os
Hymenoptera. Por isso, pode ser considerada uma característica sinapomórfica
para a ordem.
Nos espermatozóides da maioria das abelhas, a cromatina nuclear é
fortemente elétron-densa e compacta. Entretanto, em T. analis e M. segmentaria
ela apresenta várias lacunas elétron lúcidas, como observado em Exomalopsini e
Tapinotaspidini (Báo et al., 2004) e em Halictidae ocorrem inúmeras inclusões
paracristalinas (Fiorillo et al., 2005). Em Meliponini, como Melipona marginata e M.
rufiventris, a cromatina é compactada em grumos, dando ao núcleo a aparência de
cromatina frouxa (Zama et al., 2004). A projeção assimétrica na parte posterior do
60
núcleo é uma sinapomorfia compartilhada entre as abelhas. Nesta região de
transição, o núcleo conecta-se com a extremidade anterior do derivado mitocondrial
maior por uma série de lamelas elétron-densas. Em Apidae, o adjunto do centríolo
inicia-se na base nuclear, se estende paralelamente ao axonema e ao derivado
mitocondrial maior e termina no topo do derivado mitocondrial menor (padrão
assimétrico), sendo este caracter sinapomórfico para a família. Em geral, o adjunto
do centríolo é fortemente eletrondenso e compacto, seu comprimento varia de 2-7
µm em Meliponini (Zama et al., 2001; 2004; Araújo et al., 2005a) até 30 µm em Apis
mellifera (Lino-Neto et al., 2000). Dentre os Aculeata, o adjunto do centríolo do tipo
simétrico, quando ele precede ambos os derivados mitocondriais, foi em encontrado
em vespas Crabronidae (Zama et al., 2005b), considerado grupo irmão das abelhas
e em formigas (Lino-Neto & Dolder, 2002; Moya et al., 2007).
Assimetria em comprimento e diâmetro dos derivados mitocondriais são
características sinapomórficas para os Apidae. Em outros Aculeata, como em
Microstigmus (Zama et al., 2007) e em formigas (Lino-Neto & Dolder, 2002; Moya et
al., 2007) os derivados mitocondriais são simétricos. Entretano, em abelhas a
assimetria em diâmetro dos derivados mitocondriais é bem evidente, podendo o
derivado maior exceder o menor em até três vezes, como observado em Euglossini
(Zama et al., 2005a). Em T. analis e M. segmentaria os derivados possuem formato
periforme, como em Euglossini (Zama et al., 2005a) e Meliponini (Zama et al., 2001,
2004; Araújo et al., 2005a). Em Halictidae (Fiorillo et al., 2005) eles são ovalados.
Outro caracter sinapomórfico para abelhas é a presença de material paracristalino
no derivado mitocondrial maior, na região oposta ao axonema.
Em insetos em geral, o axonema apresenta o padrão 9 + 9 + 2 microtúbulos e
se inicia como centríolo na região anterior do flagelo. No final do flagelo, o axonema
é gradualmente desorganizado, primeiro terminam o par central, seguido das nove
duplas e, por último, os microtúbulos acessórios, padrão para a maioria dos
61
Aculeata (Lino-Neto et al., 2000; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b,c, 2007; Báo et
al., 2004; Araújo et al., 2005a; Fiorillo et al., 2005; Mancini et al., 2006), sendo que
em formigas, eles terminam aproximadamente juntos (Wheeler et al., 1990; Lino-
Neto & Dolder, 2002). Já em vespas parasíticas (Chalcidoidea) os microtúbulos
acessórios terminam primeiro (Lino-Neto et al., 1999).
Os corpos acessórios possuem formato triangular e são inseridos entre os
derivados mitocondriais e o axonema, mas não entre este último e o adjunto do
centríolo, como nos Aculeata em geral (Lino-Neto et al., 2000; Zama et al., 2001,
2004, 2005a,b,c, 2007; Báo et al., 2004; Araújo et al., 2005a; Fiorillo et al., 2005;
Mancini et al., 2006, 2008; Moya et al., 2007).
As duas espécies de abelhas analisadas nesse estudo compartilham várias
características morfológicas dos espermatozóides com as demais abelhas já
descritas. Estas semelhanças permitem estabelecer um padrão geral para a família
baseado nos caracteres sinapomórficos: (1) feixes de espermatozóides desfeitos na
vesícula seminal; (2) perforatorium inserido em uma curta cavidade no topo anterior
do núcleo; (3) projeção lateral na região posterior do núcleo; (4) adjunto do centríolo
assimétrico; (5) assimetria dos derivados mitocondriais e região de paracristalino no
derivado maior; (6) seqüência de terminação dos microtúbulos e (7) formato
triangular dos corpos acessórios. As sinapomorfias além de estabelecer um padrão
geral para os espermatozóides em Apidae reforçam a proposta de Brothers (1999)
e Melo (1999) em que todas as abelhas são agrupadas em uma única família
Apidae.
Agradecimentos
Ao Núcleo de Microscopia e Microanálise da Universidade Federal de Viçosa
(UFV) e ao Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília
(UnB). Esta pesquisa foi suportada pelo CNPq (Proc. 142455/2005-9) e Capes.
62
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65
Legendas das Figuras
Figura 1. A-B. Fotomicrografia de um espermatozóide de T. analis. A. Contraste de
fase, a seta indica o limite entre a cabeça e o flagelo. B. Região da cabeça,
mostrando o núcleo corado com DAPI. C-D. Fotomicrografia de um espermatozóide
de M. segmentaria. C. Contraste de fase, a seta indica o limite entre a cabeça e o
flagelo. D. Região da cabeça, mostrando o núcleo corado com DAPI. E-Q.
Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides na vesícula
seminal de Thygater analis. E. Corte da vesícula seminal mostrando a região
epitelial (ep) e o lúmen (L) repleto de espermatozóides; as cabeças de seta indicam
espermatozóides seccionados na região do núcleo. F. Seção transversal de um
espermatodesmata, seccionados na região do núcleo (seta) e acrossomo (cabeça
de seta) embebido em uma matriz de material extracelular menos elétron denso
(m). G. Corte transversal de um espermatodesmata na altura dos núcleos, com 50
espermatozóides. H. Corte longitudinal da região anterior da cabeça mostrando o
acrossomo (ac) e o núcleo (n). I-J. Corte longitudinal do acrossomo indicando a
vesícula acrossomal (av) e o perforatorium (p). K. Corte longitudinal da região de
transição entre o acrossomo (ac) e o núcleo (n), mostrando que a base do
perforatorium se estabelece em um cavidade no topo nuclear (asterisco). L-Q.
Cortes transversais da região anterior para a posterior do acrossomo, mostrando a
vesícula acrossomal (av) e o perforatorium (p). Barras: A e C = 50 µm; B e D = 20
µm; E e G = 2 µm; F = 1 µm; H-K = 0,2 µm; L-Q = 0,1 µm.
Figura 2. Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides na
vesícula seminal de Thygater analis (A-B e D-P) e Melitoma segmentaria (C). A-B.
Corte longitudinal e transversal, respectivamente, do núcleo mostrando as lacunas
elétron lúcida ao longo da periferia (cabeça de seta). C-E. Corte longitudinal da
região de transição núcleo-flagelo. A cabeça de seta indica a base do núcleo (n).
Note a projeção posterior nuclear (n) e a inserção do axonema (ax), do derivado
mitocondrial maior (md) e do adjunto do centríolo (ca) e a região centriolar do
flagelo (asterisco). F. Corte transversal do flagelo mostrando um proeminente
adjunto do centríolo (ca) na porção anterior do flagelo, adjacente ao axonema (ax) e
ao derivado mitocondrial maior (md) e um corpo acessório (seta). G. Corte
longitudinal dos derivados mitocondriais evidenciando a região das cristas (seta). H.
Corte transversal do flagelo mostrado o axonema formado por nove microtúbulos
66
acessórios (am), nove duplas (dm) e um par central (cm). As cabeças de seta
indicam os corpos acessórios e seta indica um material central entre as estruturas
flagelares. Ambos os derivados possuem uma área central menos elétron densa
(a), uma região adjacente ao axonema mais elétron densa (b) e uma região de
crista oposta ao axonema (c). O asterisco indica a região de paracristalino presente
somente no derivado maior. I-P. Cortes transversais da extremidade posterior
flagelar. I. Mostrando o axonema (ax), os derivados mitocondriais (dm) e os corpos
acessórios (cabeças de seta). J. Mostrando o axonema (ax) e um derivado
mitocondrial (dm). Note que um derivado termina antes do outro. A seta indica um
corpo acessório. K-P. Mostrando a desorganização dos microtúbulos. As cabeças
de setas indicam os microtúbulos acessórios que são os últimos a terminarem na
extremidade posterior flagelar. Barras: A-C e G = 0,4 µm; D-F e I-K = 0,2 µm; H e L-
P = 0,1 µm.
Figura 3. A-C. Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides na
vesícula seminal de Melitoma segmentaria. Corte transversal do flagelo mostrado o
axonema (ax), os corpos acessórios (cabeças de seta) e um material central entre
as estruturas flagelares (seta). Ambos derivados possuem uma área central menos
elétron densa (a), uma região adjacente ao axonema mais elétron densa (b) e uma
região de crista oposta ao axonema (c). O asterisco indica a região de paracristalino
presente somente no derivado maior. B-C. Detalhe em maior aumento do axomena
e do derivado mitocondrial maior. Em (B) axonema formado por nove microtúbulos
acessórios (am), nove duplas (dm) e um par central (cm); em (C) derivado
mitocondrial maior mostrando as regiões de área menos elétron densa (a), mais
elétron densa (b), de crista (c) e de material paracristalino (asterisco). Barras: A =
0,2 µm; B-C = 0,1 µm.
67
Figura 1
68
Figura 2
69
Figura 3
70
3.3. Morphology of the Male Reproductive System of Polistes versicolor
versicolor (Olivier, 1791) (Hymenoptera: Vespidae: Polistini) with phylogenetic
considerations
Vinícius Albano Araújo; Jane Moreira & José Lino-Neto
Artigo submetido à revista Journal of Insect Science
Capítulo 3
71
ABSTRACT. Variations of the adult male reproductive system morphology among
different Hymenoptera groups offer characteristics that can help studies of
behaviour and the evolution of this group. The aim of this study was the description
of the adult male reproductive system of the wasp Polistes versicolor versicolor. The
reproductive system of the specimens was dissected, fixed in 2.5% glutaraldehyde
in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2 and postfixed in 1% osmium tetroxide.
The material was dehydrated and embedded for light microscopy. In P. versicolor
the reproductive system includes a pair of testes, each one with three fusiform
follicles. From each follicle emerges an efferent duct that join, forming a deferent
duct. The first half of the deferent duct is enlarged and differentiated into a
specialized region in sperm storage, the seminal vesicle. At the post-vesicular
region of each deferent duct, emerges an accessory gland. The seminal vesicle and
the accessory gland are covered with a capsule forming a vesicle-gland complex,
also observed in some species of North American Polistes. Sperms are released
from testes in bundles, which are disorganized inside the seminal vesicles. In the
testes, on average 95 spermatozoa were observed per cyst.
KEYWORDS: histology, mitotic cycles, seminal vesicle, spermatozoa, wasps.
72
1. Introduction
The Vespidae family is currently classified in 6 subfamilies which are
apparently monophyletic: Euparagiinae, Masarinae, Eumeninae, Stenogastrinae,
Vespinae, and Polistinae (Carpenter 1991). Polistinae is considered the most
derived Vespidae subfamily, because all species present eusocial behaviour. In this
subfamily, the Polistes genus is outstanding because it presents about 200 species
distributed throughout the world along the tropical region (Richards 1978; Gauld and
Hanson 1995). This genus has been widely studied and is considered the “key
genus” for understanding the social insect’s evolution and the social behaviour
among wasps (Evans 1959).
The reproductive system of Hymenoptera males presents considerable
morphological differences among the species. Such differences may be related to
presence, size or shape of the structures as well as in their position along the
reproductive tract (Dirks and Sternburg 1972; Dallacqua and Cruz-Landim 2003;
Ferreira et al. 2004; Araújo et al. 2005a; Bushrow et al. 2006; Moreira et al. 2008).
Sperm morphology has revealed a considerable number of features that differ
between taxa (Araújo et al. 2005b; Brito et al. 2005; Zama et al. 2007; Lino-Neto et
al. 2008a; Mancini et al. 2006, 2008), indicating another possible source of
characters that may contribute to understanding the systematics of these insects.
For insects, in general, during spermatogenesis, germ cell development
occurs in compartments, called cysts, surrounded by somatic cells. The number of
spermatids/spermatozoa per cyst, which is determined by the number of cell
divisions, is constant for each species, but it may vary from species to species.
Thus, this number has been used as additional information in the systematics of
Hymenoptera (Schiff et al. 2001; Zama et al. 2007; Lino-Neto et al. 2008a). The
variations in number of spermatozoa per cyst among species are, generally, the
result of the spermatogonial mitotic divisions number, and this is due to the fact that
73
meiosis is constituted, in general, of two divisions, quadrupling the number of cells
originated by the mitosis. However, in Hymenoptera since the males are haploid,
meiosis has effectively only one division and thus the number of cells resulting from
the mitosis is only duplicated. Moreover, in some bees, one of the two spermatids
produced by meiosis becomes unviable (Conte et al. 2005; Lino-Neto et al. 2008b),
not altering the number of the cells originated by the mitosis. Thus, to use the
number of spermatids and/or spermatozoa per cyst as an indicator of the mitotic
divisions number, it is necessary to know, if the meiotic divisions and the
spermiogenic stages occur as usual.
Variations in the morphology of the reproductive system in Polistes males
were observed between European (Bordas 1895) and North American species
(Dirks and Sternburg 1972). In this work, the morphology of the reproductive
system, the spermatozoa morphometry and the spermatozoa number per cyst were
described for the South America specie, Polistes versicolor. In this sense, we want
to contribute for the reproductive biology knowledge and also to reveal characters
that may be useful for future studies in taxonomy and phylogeny of Hymenoptera,
especially within Aculeata.
2. Material and Methods
Twelve adult males of Polistes versicolor versicolor were obtained from nests
sampled on a farm in the municipality of Conceição do Castelo, state of Espirito
Santo, Brazil.
2.1. Light microscopy: For the histological analysis, the reproductive systems of six
males were fixed for 12h in 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer,
pH 7.2 and post fixed in 1% osmium tetroxide. The material was dehydrated in
increasing alcoholic concentration and embedded in Historesin
®
(GMA, Leica).
74
Semithin sections were stained with 1% sodium toluidine borate and mounted in
Entelan
®
(Merck). The analysis and photographic records were made with an
Olympus BX60 microscope.
Sperm suspensions extracted from the seminal vesicles of six males were
spread on clean glass microscope slides, which were fixed for 20 minutes in solution
of 4% (w/v) paraformaldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.2. After
drying at room temperature, 100 spermatozoa, randomly observed, were
photographed in a photomicroscope (Olympus, BX60), equipped with phase
contrast.
For nuclear measurements, six slides of different males were stained during
15 minutes with 0.2 µg/ml 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in PBS, washed, and
mounted in 50 % sucrose. They were then examined in an epifluorescence
microscope (Olympus, BX60) equipped with a BP 360-370 nm excitation filter and
100 nuclei were randomly photographed. All the measures were obtained with the
Image Pro-Plus
®
software, version 4.5 (Media Cybernetics Inc., MD, USA) and the
lengths were related to the total number of spermatozoa analysed.
3. Results
The male reproductive system of Polistes versicolor consists of a pair of
testes, each one with three fusiform follicles (Figures 1A-C). The three follicles are
covered by a single capsule and are entirely filled with cysts (Figure 1C). Each cyst
has up to 95 spermatozoa on the average (Figure 1D), indicating that at least, six
mitotic cycles occur. During spermatogenesis, the cysts migrate along the follicles,
while they continue to differentiate. When the spermatozoa are formed, the cysts are
broken. The released bundles of spermatozoa (spermatodesmata) remain together,
held by extra cellular material that surrounds the anterior portion of their heads
75
(Figure 1E). The spermatodesmata migrate to the efferent duct (Figure 1E), pass
into the deferent duct and then are transferred to the seminal vesicles, where they
are disorganized (Figures 1F-H).
The deferent duct middle portion is enlarged and presents a modified
epithelium, being transformed into a seminal vesicle (Figure 1A and 1F). The
accessory glands are connected to the post-vesicular deferent ducts beginning. The
seminal vesicle and the accessory gland are surrounded by a single layer of
conjunctive tissue or capsule, forming the vesicle-accessory gland complex (Figures
1A-B).
The seminal vesicle epithelium consists of prismatic cells with spherical
basal nuclei. In the apical third of these cells, some vesicular inclusions (Figure 1G)
can be observed. In mature males, the vesicular lumen is completely filled with
spermatozoa. The epithelium is separated from the external muscular layer by a
thick basal membrane (Figures 1F-G).
The accessory glands are oval (Figures 1H-I) and their epithelium consists of
prismatic cells with spherical and basal nuclei, and large secretory vesicles in the
apical cell portion (Figures 1I and 2A). The lumen is filled with granular secretion
(Figures 1H-I).
The deferent duct epithelium is formed by cubical cells with a developed
striated border (Figures 2A-B). The deferent duct opens into the ejaculatory duct,
and its epithelium consists of cubical cells completely covered by a thin cuticle
(Figure 2C).
The spermatozoa of P. vesicolor measure about 110 µm in length (Figure
2D) and the nucleus is about 17 µm in length (Figure 2E).
76
4. Discussion
In general, the reproductive system of P. versicolor is morphologically similar
to that described for the North American species, P. metricus, P. exclamans and P.
annularis (Dirks and Sternburg 1972), as well as the European species P. gallicus
(Bordas 1895). However, the vesicle-accessory gland complex, observed in P.
versicolor, was described only for the North American species (Dirks and Sternburg
1972). These authors suggested that the geographical isolation of the ancestral
forms would have originated the anatomical pattern found in North American
species. Our results point out that P. versicolor and the species of North American
Polistes share a more recent ancestry when compared to the European species P.
gallicus.
Although the reproductive systems in the Polistes (Polistinae) are very
similar, they differ in some aspects from Ancistrocerus antilope (Eumeninae)
(Bushrow et al. 2006). In A. antilope, a single capsule involving the testicles and the
seminal vesicles was reported – a pattern also observed in several species of bees
of the subfamily Colletinae, Megachilinae, and Apinae (Ferreira et al. 2004). Many
species of bees described by Ferreira et al. (2004) have shown conspicuous
variation in the reproductive system of males, even within a single family.
The occurrence of 95 spermatozoa per cyst in P. versicolor indicates that
there are, at least, six mitotic cycles during the spermatogonial proliferation. This
number was also observed in other Polistinae such as Mischocyttarus sp. (Brito et
al. 2005) and Agelaia vicina (personal observation). However, in Eumenes sp.
(Eumeninae), we noticed five mitotic cycles (personal observation). Considering that
Eumeninae are more basal than the Polistinae, the hypothesis of Virkki (1970, 1973)
that the most derived insects tend to have less sperm per bundle cannot be applied
in this case. For instance, in the Crabronidae wasps, there are five mitotic cycles in
Pemphredoninae (Microstigmus) (Zama et al. 2007) and four cycles in Crabroninae
77
Trypoxylon (Moreira et al. 2008). In the family Sphecidae, six mitotic cycles were
observed in Sceliphrinae Sceliphron fistularium (Zama et al. 2005) and four in
Sphecinae Isodontia fuscipennis (Zama et al. 2007). Thus, in Hymenoptera at least,
the number of mitotic events during the spermatogonial proliferation phase may be
used in phylogenetic analyses between subfamilies and/or genera, but not in taxa
above these categories.
The spermatozoa bundle released from the testes to the seminal vesicles,
observed in P. versicolor, is a phenomenon common in Hymenoptera in general
(Quicke et al. 1992; Moreira et al. 2004; Lino-Neto et al. 2008a). The observation
that only mature cells at the spermiogenesis final stage and spermatozoa in the
testes of adult P. versicolor, as well as in other species of Polistes (Dirks and
Sternburg 1972) and in A. antilope (Bushrow et al. 2006), indicates that in these
insects, spermatogenesis begins in the pupal stage and that they produce
spermatozoa at once. This characteristic seems to be common among the social
Hymenoptera, because it has been observed in ants (Ball and Vison 1984) and bees
(Dallacqua and Cruz Landim 2003; Araújo et al. 2005a). In these species, the testis
degeneration begins after the spermatozoa migration to the seminal vesicles.
Possibly, the same process happens with the social wasps, however, it was not
observed because the individuals were obtained from the nests so, they were not
sexually mature. The continuous production of spermatozoa is commonly observed
in species that mate throughout the entire adult phase (Brockmann 1992; Garcia
and Adis 1995; Coville et al. 2000; Buschini 2007; Moreira et al. 2008). This phase
is longer for such species than for those that produce sperm only once.
As in most insects, the ejaculatory duct of P. versicolor is a single, median
structure and presents a cuticle, wich demonstrated its ectodermic origin. In A.
antilope (Vespidae), the presence of two ejaculatory ducts was verified. They begin
at the accessory glands base and later join to form the common ejaculatory duct
78
(Bushrow et al. 2006). However, since these authors did not mention about the
cuticle, we cannot confirm if the ducts consist entirely of an ejaculatory duct or if
they correspond to the deferent ducts posterior region, followed by the ejaculatory
duct.
In Hymenoptera, it has been observed that the spermatozoa morphology
varies even among very closely related species. The spermatozoon of P. versicolor,
as in the majority of the insects, is linear and slender. However, such cells are
spiralled in some parasitic wasps, as in Chalcidoidea and Platygastroidea (Lino-
Neto et al. 2000; Lino-Neto and Dolder 2001). The spermatozoa length of P.
versicolor (110 µm) is within the very wide range in size observed for Vespidae,
which may vary from 13 to 577 µm (Quicke et al. 1992; Bushrow et al. 2006;
Mancini et al. 2006; 2008).
This study supports the use of anatomical differences of the male
reproductive system as a tool for the phylogenetic analysis among Hymenoptera
families or higher taxa. The number of spermatozoa per cyst may be used when
compared within the levels subfamily or genus. Nevertheless, the length of the
spermatozoa may be helpful in taxonomic studies.
Acknowledgement
This research was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (Capes). We would like to thank Heidi Dolder for critical reading of
the manuscript.
79
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consideration. Arthropod Structure & Development 36: 304-316.
82
Legends of the figures
Figure 1. Photomicrograph of the anatomy (A-B) and histology (C-J) of the male
Polistes vesicolor reproductive system. A. Reproductive system showing the testes
(T), seminal vesicles (sv) and accessory glands (g) separated by the broken line,
deferent duct (dd) and the ejaculatory duct B. is showing the follicles (F) and the
vesicle-gland complex involved by a single capsule (circle of broken lines). C.
Transversal section of the testes showing six testicular follicles (F) and the testicular
capsule (arrow). D. Inset: a cyst with 95 spermatozoa. E. Longitudinal section of a
follicle (F) where the spermatozoa bundle (arrow) is observed being released from
the follicles (F) to the efferent duct (ed). F. Transverse section of the seminal vesicle
showing the thick muscular layer (m), the epithelium (ep) and the lumen (L) with
spermatozoa. G. Detail of the seminal vesicle’s wall showing the epithelium
comprised of prismatic cells with spherical and basal nuclei (white arrow) and at the
apical third, some vesicular inclusions (circle of broken lines); notice that the
epithelium is separated from the external muscular layer (m) by a thick basal
membrane (black arrow). H. Longitudinal section of the accessory gland (g) and
seminal vesicle (vs). I. Transverse section of the accessory gland completely filled
with secretion (black arrow). Note the epithelium with basal nuclei (white arrow).
Bars: A and B = 500 µm; C, F and I = 150 µm; D = 5 µm; E, G, H and J = 50 µm.
Figure 2. A-C. Histology of the Polistes vesicolor male reproductive system. D-E.
Photomicrograph of the spermatozoa and of the nucleus stained with DAPI,
respectively. A. Longitudinal section from the deferent ducts (dd) insertions into the
accessory gland (g). Note the difference between the deferent duct epithelium (dd),
with the basal and spherical nuclei (arrow) and the striated border (arrowhead) and
the accessory gland (g) epithelium with several secretory vesicles at the apical
portion (circle of broken lines). B. Transverse section of the deferent ducts (dd)
showing the striated border (arrow). C. Transverse section of the ejaculatory duct
(ej), showing the cuticle (arrow). D. Photomicrograph of the spermatozoon. E. Head
region, stained with DAPI. Bars: A and D = 10 µm; B and C = 25 µm; E = 5 µm.
83
Figura 1
84
Figura 2
85
3.4. Morfologia do sistema reprodutor masculino em duas espécies de
abelhas solitárias (Hymenoptera, Apidae)
Capítulo 4
86
RESUMO.
As abelhas compreendem espécies representativas em todos os níveis
de organização social, de solitárias à eussociais avançadas. As abelhas solitárias
compreendem cerca de 80% das espécies, entretanto a maioria dos trabalhos
enfatiza as espécies sociais. O objetivo deste trabalho foi descrever o sistema
reprodutor masculino das abelhas solitárias Thygater analis e Melitoma segmentaria
buscando caracteres que possam auxiliar em estudos de comportamento e
filogenia. Para isso, os sistemas reprodutores dos machos foram dissecados,
fixados em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2 e pós-
fixados em tetróxido de ósmio a 1%. O material foi desidratado e incluído para
microscopia de luz.
As espécies possuem características anatômicas similares do
sistema reprodutor, compreendendo um par de testículos, vesículas seminais,
ductos deferentes, glândulas acessórias e um ducto ejaculatório. Cada testículo
contém quatro folículos. Em ambas as espécies um testículo e uma vesícula
seminal são envoltos por uma cápsula comum, formando um complexo testículo-
vesícula. A duas espécies possuem glândulas acessórias com características
morfológicas bem distintas. O padrão anatômico e as características histológicas do
sistema reprodutor das espécies estudadas são semelhantes ao descritos para
outras abelhas, entretano possui caracteres capazes de diferenciar as espécies e,
ainda permitem inferências acerca da sua biologia reprodutiva.
PALAVRAS-CHAVE: Histologia, glândula acessória, biologia reprodutiva, Thygater
analis e Melitoma segmentaria.
87
1.
Introdução
A fauna de abelhas do novo mundo, especialmente na região Neotropical está
entre a mais rica do mundo (Moure et al., 2007). As abelhas têm sido extensamente
estudadas devido a sua importância econômica e ecológica, já que são
polinizadoras frequentemente exclusivas da maioria das plantas floridas, incluindo
espécies cultivadas pelo homem. Os Apidae são também reconhecidos como um
grupo diverso em relação ao comportamento social, com espécies representativas
em todos os níveis de organização social, de solitárias à eussociais avançadas
(Michener, 1974). No Brasil, das 6 mil espécies de abelhas estimadas, mais de 80%
são solitárias (Silveira et al., 2002).
Em geral o sistema reprodutor interno dos insetos é formado por um par de
testículos, dois ductos deferentes e um ducto ejaculatório. Em cada ducto deferente
ocorre uma região dilatada, com epitélio modificado, a vesícula seminal, onde os
espermatozóides ficam armazenados até a cópula e, ainda em cada ducto,
desemboca uma glândula acessória. Nos Apidae têm sido observadas variações
morfológicas do sistema reprodutor e dos espermatozóides (Duvoisin et al., 1999;
Lino-Neto et al., 2000; Cruz-Landim, 2001; Cruz-Landim & Dallacqua, 2002; Baer,
2003; Dallacqua & Cruz-Landim, 2003; Báo et al., 2004; Ferreira et al., 2004; Zama
et al., 2001, 2004, 2005; Araújo et al., 2005a,b; Fiorillo et al., 2005). Ferreira et al.
(2004), em seu trabalho envolvendo 51 espécies de abelhas (de seis famílias, de
acordo com a classificação de Michener, 1965), dividiu os sistemas reprodutores
masculinos em quatro tipos com base nas diferenças anatômicas. Um exemplo
notável dessas diferenças anatômicas em abelhas é a ausência de glândulas
acessórias associadas ao trato reprodutor em abelhas sem ferrão da tribo
Meliponini.
Trabalhos sobre a histologia do sistema reprodutor masculino de Apidae foram
realizados apenas em abelhas socias como Melipona quadrisfasciata (Dallacqua &
88
Cruz-Landim, 2003), Scaptotrigona xanthotricha (Araújo et al., 2005a) e Melipona
monduty (Lima et al., 2006). Este é o primeiro trabalho a descrever a histologia do
sistema reprodutor masculino em abelhas solitárias e tem como objetivo contribuir
para o entendimento da biologia reprodutiva deste grupo, bem como fornecer
caracteres que possam ser utilizados na sistemática dos Apoidea.
2. Material e Métodos
Oito machos adultos de Thygater (Thygater) analis (Lepeletier 1841) e oito de
Melitoma segmentaria (Fabricius 1804) foram coletados com redes entomológicas
enquanto visitavam as flores de Ipomoea sp. (Convolvulaceae) no campus da
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil.
2.1. Light Microscopy: Os sistemas reprodutores de quatro machos de cada espécie
foram fixados em glutaraldeído 2.5% em tampão cacodilato de sódio 0.1 M, pH 7.2
e pós-fixados em tetróxido de ósmio 1%. O material foi desidratado em série
alcoólica crescente e incluído em resina glicol-metacrilato (Historesin, Leica). Cortes
de 2 µm foram corados com azul de toluidina e fotografados em microscópio
Olympus BX-60. Para análise anatômica, logo após a fixação, alguns sistemas
reprodutores foram fotografados em microscópio Olympus BX-60, e em seguida,
desenhados com naquim e grafite.
3. Resultados
A anatomia do sistema reprodutor interno em machos sexualmente maduros
das abelhas solitárias T. analis e M. segmentaria compreende: um par de testículos
degenerados com volume reduzido, vesículas seminais, ductos deferentes,
glândulas acessórias e um ducto ejaculatório. Cada testículo contém quatro
89
folículos. Em ambas as espécies um testículo e a respectiva vesícula seminal são
envoltos por uma cápsula comum, formando um complexo testículo-vesícula (Figs.
1A, 1C, 2A, 3A). A anatomia geral do sistema reprodutor é bem diferenciada entre
as duas espécies. Em M. segmentaria, uma cápsula recobre cada complexo
testículo-vesícula separadamente e a vesícula seminal desemboca em uma região
dos ductos deferentes pós-glândula acessória (Figs. 1A-B). Já em T. analis a
cápsula que recobre cada complexo testículo-vesícula é contínua e se prolonga
unindo os dois complexos formados. Além disso, nesta espécie a vesícula seminal
desemboca na região da glândula acessória, que é adjacente ao complexo
testículo-vesícula (Figs. 1C-D).
Os ductos deferentes pré-vesiculares apresentam epitélio simples, formado por
células cúbicas de núcleos esféricos e basais. Em T. analis observa-se algumas
inclusões na região basal ao lado dos núcleos (Fig. 3B). A vesícula seminal é uma
região especializada que consiste em um espessamento na região anterior dos
ductos deferentes, na qual os espermatozóides ficam armazenados até a cópula. A
vesícula seminal é muito similar nas duas espécies (Figs. 2A, 2C-D, 3A, 3C-D). Ela
é tubular e apresenta uma dobra na região mediana que a divide em duas regiões,
as quais ficam em paralelo entre si e com o testículo (Figs. 2C e 3A). Nas vesículas
seminais o epitélio é simples, formado por células prismáticas com núcleos
esféricos e basais, sendo observadas várias vesículas distribuídas por toda a célula
(Figs. 2C e 3C). Uma membrana basal separa as células epiteliais de uma túnica
formada por feixes de células musculares (Figs. 2D e 3C).
O complexo testículo-vesícula se conecta aos ductos deferentes pós-
vesiculares, os quais estão repletos de secreção (Figs. 2E e 3D). Os ductos
deferentes pós-vesiculares apresentam epitélio simples formado por células cúbicas
de núcleos esféricos e basais (Fig. 2H).
90
A duas espécies possuem glândulas acessórias com características
morfológicas bem distintas. Em M. segmentaria elas são arredondadas, o epitélio é
formado por células prismáticas com núcleos esféricos, localizados na região apical
e apresenta muitos grânulos de secreção em todo o citoplasma (Figs. 2F-G). Em T.
analis as glândulas acessórias são ovais-achatadas com epitélio baixo formado por
células cúbicas com núcleos fusiformes e basais (Fig. 3A e 3E).
Posteriormente, os dois ductos deferentes desembocam no ducto ejaculatório
(Fig. 2I-J), o qual possui o epitélio cúbico revestido por uma fina cutícula.
4. Discussão
A morfologia geral do sistema reprodutor das abelhas solitárias T. analis
(Eucerini) e M. segmentaria (Emphorini) é similar ao observado em várias outras
espécies de Hymenoptera. Particularmente, se assemelha ao padrão tipo III,
observado em abelhas que também pertencem a subfamília Apinae (Ferreira et al.,
2004) e é caracterizado pela presença de uma única cápsula envolvendo um
testículo e uma vesícula seminal, glândulas acessórias bem desenvolvidas, ducto
ejaculatório calibroso e quatro folículos em cada testículo. Outras sufamílias de
abelhas como Mellitinae e alguns Megachilinae também apresentam quatro
folículos por testículo (Roig-Alsina & Michener, 1993; Ferreira et al., 2004) com
exceção de Apis mellifera com cerca de 250. A ocorrência de três folículos foi
registrada em abelhas consideradas mais basais, como Colletinae, Andreninae e
Hactinae (Ferreira et al., 2004; Araújo et al., 2005a) e em vespas Crabronidae
(Moreira et al., 2008) considerado grupo irmão das abelhas. Por outro lado, este
número varia de 1 a 11 em Formicidae (Wheeler & Krutzch, 1992) e em vespas
Chalcidoidea foi observado somente um folículo por testículo (Fiorillo et al., 2008).
As várias espécies de abelhas estudadas por Ferreira et al. (2004) mostraram
91
variações conspícuas na anatomia do sistema reprodutor, até mesmo dentro da
mesma subfamília. Neste trabalho, tal variação no arranjo anatômico das estruturas
ao longo do trato reprodutor permite fácil distinção entre as duas espécies
estudadas, o que pode ser considerado como possível caracter taxonômico.
Nas abelhas solitárias estudadas, os espermatozóides são produzidos uma
única vez e os testículos entram em processo de degeneração quando os machos
tornam-se sexualmente maduros, como foi também observado nas abelhas sociais
Melipona bicolor bicolor (Dallacqua & Cruz Landim, 2003) e Scaptotrigona
xanthotricha (Araújo et al., 2005) e na formiga Sonelopsis invicta (Ball & Vison,
1984). Nestas espécies, os espermatozóides saem dos testículos em feixes e
quando alcançam as vesículas seminais os feixes são desfeitos (Quicke et al.,
1992; Moreira et al., 2004; Lino-Neto et al., 2008). A produção contínua de
espermatozóides é comum em espécies que tem a vida adulta longa e copulam ao
longo de toda esta fase (Buschini, 2007; Moreira et al., 2008). Machos de abelhas
solitárias, em geral, emergem antes das fêmeas e patrulham as áreas de
nidificação a procura de fêmeas recém emergidas (Raw, 2002). Dessa forma,
precisam completar a maturação sexual durante a pupação, antes de emergirem.
As secreções das glândulas acessórias estão associadas com a manutenção e
ativação dos espermatozóides e a indução e aceleração da oviposição nas fêmeas
(Chen, 1984; Raina et al., 1994; Gillot, 2003). Em T. analis e M. segmentaria essas
glândulas são bem desenvolvidas e em machos sexualmente maduros elas se
encontram repletas de secreção. Tais secreções possivelmente podem estar
envolvidas em estratégias reprodutivas do macho relacionadas com mecanismos
que possam assegurar a fidelidade de cópula e a manter seus espermatozóides
viáveis na espermateca da fêmea por um período mais longo.
O ducto ejaculatório, assim como na maioria dos insetos, é único, mediano e
apresenta uma cutícula, evidenciando sua origem ectodérmica (Bushrow et al.,
92
2006; Moreira et al., 2008). O epitélio encontrado nos ductos espermáticos ao longo
do trato reprodutor nas abelhas solitárias é similar ao descrito para abelhas sociais
(Dallacqua & Cruz Landim, 2003; Araújo et al., 2005; Lima et al., 2006), formigas
(Ball & Vison, 1984; Wheeler & Krutzsch, 1992) e vespas (Dirks & Sternburg, 1972;
Bushrow et al., 2006; Moreira et al., 2008). Entretanto, algumas diferenças podem
ser evidenciadas como a grande quantidade de inclusões no epitélio da vesícula
seminal e as diferenças no tipo de epitélio das glândulas acessórias entre as duas
espécies de abelhas estudadas.
93
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95
Legenda das figuras
Figure 1. A. Sistema reprodutor masculino de Melitoma segmentaria. O asterisco
indica o complexo vesícula seminal-testículo e (B) mostra um lado do sistema
reprodutor sem a cápsula. C. Sistema reprodutor masculino de Thygater analis, o
asterisco indica o complexo vesícula seminal-testículo e em (D), mostrando um lado
do sistema reprodutor sem a cápsula. g = glândula acessória, ed = ducto
ejaculatório, dd = ducto deferente, sv = vesícula seminal, f = folículo. Barras: A-D =
100 µm.
Figura 2. Histologia do sistema reprodutor de machos sexualmente maduros de
Melitoma segmentaria. A. Corte longitudinal do complexo testículo-vesícula
mostrando o testículo em degeneração (T) e a vesícula seminal (sv) envolvidos por
uma única cápsula (setas) e o ducto deferente (dd). B. Corte transversal no nível
indicado pela linha tracejada da figura anterior, evidenciando os quatro folículos em
degeneração (F), o ducto deferente pré-vesiculares (setas brancas) e a cápsula que
recobre o complexo testículo-vesícula (seta preta). C. Corte transversal do ducto
deferente pré-vesiculares (asterisco) e da vesícula seminal, mostrando o lúmem (L)
com espermatozóides e a cápsula (seta). D. Corte transversal da vesícula seminal
mostrando o epitélio (ep) composto por células prismáticas com núcleos esféricos
basais (seta preta) e citoplasma com inclusões (círculo tracejado); o epitélio é
separado da camada muscular (asterisco) pela membrana basal (seta branca). E.
Corte longitudinal do ducto deferente na região onde desemboca a vesícula seminal
(círculo tracejado); o lúmen (L) está repleto de secreção. F. Corte transversal da
glândula acessória, mostrando o lúmen (L) repleto de secreção e a camada
muscular (seta). G. Detalhe da parede da glândula acessória. Notar o epitélio (ep)
formado por células prismáticas com núcleos esféricos localizados no terço apical
(seta branca). L = lúmen. H. Corte longitudinal do ducto deferente (dd) mostrando o
epitélio formado por células cúbicas com núcleos esféricos basais (seta) e o lúmem
(L) com secreção. I-J. Corte transversal e longitudinal, respectivamente, do ducto
ejaculatório, mostrando a parede recoberta por uma cutícula (seta). Barras: A-C, F
e I = 100 µm; D-E, H e J = 50 µm; G = 15 µm.
96
Figura 3. Histologia do sistema reprodutor de machos sexualmente maduros de
Thygater analis. A. Corte longitudinal do complexo testículo-vesícula mostrando os
testículos em degeneração (T), a vesícula seminal (sv) e o ducto deferente pré-
vesiculare (dd) envolvidos por uma única cápsula (seta) e a glândula acessória (g)
adjacente ao complexo testículo-vesícula . B. Corte transversal, em maior aumento,
do ducto deferente pré vesicular, evidenciando os núcleos esféricos basais (seta
branca) e a presença de grandes inclusões próximas aos núcleos (setas pretas). L
= lúmen. C. Corte transversal da vesícula seminal mostrando o lúmen (L) repleto de
espermatozóides; o epitélio (ep) composto por células prismáticas com núcleos
basais (seta branca) e no citoplasma observa-se inclusões (círculo tracejado); o
epitélio é separado da camada muscular (m) por uma espessa membrana basal
(seta preta). D. Corte longitudinal da região onde a vesícula seminal (sv)
desemboca no ducto deferente pré-glandular (dd). E. Corte transversal da glândula
acessória, mostrando o lúmen (L) repleto de secreção, o epitélio formado por
células pavimentosas com núcleos de formatos irregulares (círculo tracejado) e a
camada muscular (seta). Barras: A = 100 µm; B-C e E = 25 µm; D = 50 µm.
97
Figura 1
98
Figura 2
99
Figura 3
100
3.5. Caracterização ultra-estrutural dos espermatozóides de Aethalion
reticulatum Linnaeus, 1767 (Hemiptera: Auchenorrhyncha: Aethalionidae)
Capítulo 5
101
RESUMO. A ordem Hemiptera é atualmente dividida em quatro subordens, dentre
elas a Auchenorrhyncha que é considerada parafilética. Como a morfologia dos
espermatozóides fornece caracteres promissores para inferências filogenéticas,
neste trabalho os espermatozóides de Aethalion reticulatum (Aethalionidae) foram
examinados pela microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão, com
o objetivo de revelar caracteres que possam ser aplicados na sistemática da
subordem. Nesta espécie os espermatozóides permanecem em feixes na vesícula
seminal. A cabeça dos espermatozóides é formada por um acrossomo e pelo
núcleo. O núcleo é linear, preenchido por cromatina compacta, mas possui algumas
lacunas elétron lúcidas. O adjunto do centríolo está localizado anteriormente aos
derivados mitocondriais. O flagelo consiste de um axonema, dois derivados
mitocondriais e dois corpos acessórios. O axonema apresenta o padrão típico para
insetos de 9 + 9 + 2 microtúbulos. Os derivados mitocondriais são simétricos. Os
corpos acessórios são longos e possuem, em corte transversal, formato de meia
lua. Na extremidade posterior do axonema os microtúbulos acessórios são os
primeiros a terminarem, seguido do par central e das duplas. A presença dos
corpos acessórios e a sequência de terminação dos microtúbulos difere
marcadamente de outras espécies de Cicadomorpha estudadas. A morfologia dos
espermatozóides em outras famílias de Auchenorrhyncha pode revelar
sinapomorfias e contribuir para a sistemática da subordem.
PALAVRAS-CHAVE: Cicadomorpha, adjunto do centríolo, espermatodesmata e
corpos acessórios.
102
1. Introdução
Os espermatozóides são células altamente especializadas e têm sofrido
evolução morfológica, a qual não tem paralelo em outros tipos celulares (Baccetti &
Afzelius, 1976). Os trabalhos de revisão de Franzén (1970) e Wirth (1984)
apontaram o valor potencial da morfologia dos espermatozóides para estudos
filogenéticos dos invertebrados, grupo em que se observa a maior diversidade
dessas células, principalmente entre os insetos (Baccetti & Dallai, 1978; Sivinski,
1984; Quicke et al., 1992; Jamieson et al., 1999). Todas as espécies estudadas
possuem espermatozóides com características únicas, variando entre espécies na
forma, tamanho e em características ultra-estruturais.
As espécies da ordem Hemiptera são atualmente divididas em quatro
subordens: Heteroptera, Coleorryncha, Sternorrhyncha e Auchenorrhyncha. A
subordem Auchenorrhyncha é considerada parafilética e suas espécies estão
agrupadas em 31 famílias (Campbell et al., 1994, 1995; Sorensen et al., 1995; Von
Dohlen & Moran, 1995). Dentre elas, a família Aethalionidae que possui apenas três
espécies distribuídas ao longo das regiões tropicais do mundo. A espécie Aethalion
reticulatum possui hábito de sugar a seiva de plantas, prejudicando o
desenvolvimento de frutos e brotações podendo, em altas infestações, causar
grandes perdas agrícolas. Esta espécie frequentemente vive em simbiose com
formigas do gênero Camponotus atacando folhas e ramos de inúmeras plantas
cultivadas e nativas (Gallo et al., 2002).
A despeito da validade dos caracteres derivados dos espermatozóides para
análises sistemáticas em insetos, é necessário amostrar um número representativo
de táxons para que hipóteses filogenéticas possam ser inferidas. Na subordem
Auchenorrhyncha, algumas espécies representantes da infraordem Cicadomorpha
(Cicadidae, Cercopidae e Cicadellidae) e Fulgoromorpha tiveram a ultra-estrutura
dos espermatozóides descrita (Folliot & Maillet, 1970; Kubo-Irie et al., 2003;
103
Chawanji et al., 2005, 2006) e caracteres sinapomórficos foram revelados para
algumas subfamílias. Neste estudo, a ultra-estrutura do espermatozóide foi descrita
pela primeira vez para uma espécie da família Aethalionidae com o objetivo de
encontrar caracteres que possam ser aplicados na sistemática da parafilética
subordem Auchenorrhyncha.
2. Material e Métodos
Dez machos adultos de Aethalion reticulatum (Linnaeus, 1767) foram coletados
diretamente de agregações nos galhos de árvores do gênero Magnolia
(Magnoliaceae) no campus da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil.
2.1. Microscopia de luz – De cada macho, suspensão de espermatozóides
extraídos de uma das vesículas seminais foi espalhada em lâminas histológicas e
fixada por vinte minutos em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0.1
M, pH 7.2. Após secar em temperatura ambiente, as lâminas foram observadas em
fotomicroscópio equipado com contraste de fase e 200 espermatozóides foram
fotografados para serem medidos. Para medir os núcleos, algumas lâminas foram
coradas por 15 minutos com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) 0.2 µg/ml em PBS,
lavadas e montadas em sacarose 50%. Essas lâminas foram observadas em
microscópio de epifluorescência (Olympus, BX-60) equipado com filtro BP360-370
nm e 200 núcleos foram fotografados. Todas as medidas foram feitas usando o
software Image Pro-Plus (Media Cybernetcs) e os comprimentos foram expressos
pela média do número total de espermatozóides analisados.
2.2. Microscopia eletrônica de transmissão – De cada macho, uma das vesículas
seminais foi fixada por 24 h, a 4
o
C, em solução contendo glutaraldeído 2.5%, ácido
pícrico 0.2%, sacarose 3% e 5 mM CaCl
2
diluídos em tampão cacodilato de sódio,
104
pH 7.2. O material foi pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, desidratado em
acetona e incluído em Epon 812. Cortes ultrafinos foram contrastados com solução
aquosa de acetato de uranila 2% e citrato de chumbo 0,2% em solução de hidróxido
de sódio 1N e observados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 109
e JEOL 100C).
3. Resultados
Os espermatozóides de Aethalion reticulatum são longos, finos e medem, em
média, 140 µm de comprimento (Fig. 1A). Na vesícula seminal, os espermatozóides
estão organizados em feixes com a região anterior da cabeça (acrossomo e parte
do núcleo) embebida em uma matriz extracelular (Fig. 1C-G).
O acrossomo é formado por uma vesícula acrossomal cônica e,
posteriormente, possui uma invaginação para formar um espaço subacrossomal
(Fig. 1H). Inúmeros filamentos irradiam da vesícula acrossomal (Fig. 1H-I). A
extremidade anterior do núcleo é inserida na região posterior do espaço
subacrossomal (Fig. 1J).
O núcleo é linear, longo e mede, em média, 55 µm de comprimento (Fig. 1B).
Ele é preenchido por cromatina compacta (Fig. 2A-B) e possui algumas lacunas
elétron lúcidas ao longo de toda sua extensão (Fig. 2B, 2D-E). Na região anterior,
em seção transversal, o núcleo possui formato oval (Fig. 2B). Posteriormente, sua
extremidade é afilada lateralmente, na região de transição núcleo-flagelo (Fig. 2A,
2E, 2I-J). Nesta região, o núcleo se estende em paralelamente ao adjunto do
centríolo (Fig. 2A, 2C) e mais posteriormente, aos derivados mitocondriais (Fig. 2A,
2D, 2F-H). O adjunto do centríolo tem localização anterior aos derivados
mitocondriais. Em seção longitudinal, o adjunto do centríolo mostra-se alongado e
composto por um material elétron denso (Fig. 2A, 2E). A extremidade afilada
posterior do núcleo termina justamente acima da região centriolar (Fig. 2K-O).
105
O flagelo consiste de um axonema, dois derivados mitocondriais e dois corpos
acessórios (Fig. 3A). A porção anterior do axonema é formada somente pelos
microtúbulos acessórios, pelas duplas e por um material amorfo denso,
correspondendo à região do centríolo. Os microtúbulos centrais começam após á
região centriolar (Fig. 2I-J, 2O). O axomena apresenta o padrão típico de 9 + 9 + 2
microtúbulos, sendo 9 acessórios, 9 duplas e 2 microtúbulos centrais (Fig. 3A). Os
derivados mitocondriais são simétricos (Fig. 3A) e se estendem ao longo da maior
parte do flagelo estando posicionados lateralmente ao axonema e iniciando
adjacente a extremidade posterior do adjunto do centríolo (Fig. 2A, 2E, 2I). Os
derivados mitocondriais estão divididos em uma região clara, menos elétron-densa,
adjacente ao axonema, uma região de material paracristalino e a região de crista
mitocondrial, a qual é restrita a periferia dos derivados (Fig. 3A). Em cortes
longitudinais, as cristas se mostram perpendiculares ao longo do eixo dos derivados
e com espaços em intervalos regulares que medem 30 nm (Fig. 3B).
Os corpos acessórios são longos e possuem, em corte transversal, formato de
meia lua (Fig. 3A). Estas estruturas são encontradas ao lado do axonema e
paralelas aos derivados mitocondriais e possuem uma região circular de material
paracristalino ao longo de todo o seu comprimento (Fig. 3A, 3C).
Na região final do flagelo, os derivados mitocondriais terminam antes do
axonema (Fig. 3D). O axonema é o componente mais longo do flagelo, sendo que,
na sua extremidade posterior, os microtúbulos se desorganizam simultaneamente
(Fig. 3D-F).
4. Discussão
Os espermatozóides de Aethaliom reticulatum possuem apenas uma classe de
tamanho de núcleo e flagelo. O comprimento médio dos espermatozóides nesta
espécie (140 µm) está dentro do intervalo observado em outros Auchenorrhyncha,
106
que varia de 56 a 233 µm (Folliot & Maillet, 1970; Kubo-Irie et al., 2003; Chawanji et
al., 2005, 2006). Entretanto, os espermatozóides em Cicadidae apresentaram mais
de um tamanho de núcleo e de flagelo para a mesma espécie (Kubo-Irie et al.,
2003; Chawanji et al., 2005, 2006), fenômeno conhecido como polimorfismo. Dentre
as espécies de Cicadidae, o comprimento dos espermatozóides foi apontando
como um dos principais caracteres que diferem espécies das tribos Cicadettine e
Platypleurine (Chawanji et al., 2005, 2006).
A presença de espermatozóides agrupados em feixes é um fenômeno comum
em insetos (Folliot & Maillet, 1970; Quicke et al., 1992; Newman & Quicke, 1999;
Kubo-Irie et al., 2003; Lino-Neto et al., 2008). Em A. reticulatum, assim como nos
demais Auchenorrhyncha, o acrossomo e parte do núcleo estão inseridos em uma
matriz extracelular formando os feixes. Em espécies de Auchenorrhyncha esses
feixes são mantidos na vesícula seminal e, dessa forma, serão transferidos para as
fêmeas (Folliot & Maillet, 1970; Jamieson et al., 1999; Kubo-Irie et al., 2003;
Chawanji et al., 2005, 2006). Em algumas espécies de Heteroptera, como em
Nepomorpha, os feixes são desfeitos quando alcançam as vesículas seminais (Lee
& Lee, 1992).
Em trabalhos prévios com algumas famílias de Cicadomorpha (Cicadidae,
Cercopidae e Cicadellidae) e Fulgoromorpha (Folliot & Maillet, 1970; Kubo-Irie et
al., 2003) a morfologia dos espermatozóides não foi descrita completamente. Uma
completa descrição estrutural e ultra-estrutural dos espermatozóides de várias
espécies de Cicadidae foi realizada por Chawanji et al. (2005, 2006). Os
espermatozóides de A. reticulatum possuem várias características similares aos
dos Auchenorrhyncha já descritos: (1) espermatozóides agregados em uma matriz
homogênea formando um espermatodesmata (2) acrossomo cônico (3) núcleo
cilíndrico e bilateralmente simétrico e com a extremidade posterior afilada
lateralmente; (4) ausência de um perforatorium; (5) dois derivados mitocondriais em
107
posição lateral e estendidos ao longo do axonema e (6) um adjunto do centríolo que
antecede ambos os derivados mitocondriais.
O adjunto do centríolo foi primeiramente nomeado por Gatenby & Tahmisian
(1959), referindo a uma estrutura que se forma ao redor do centríolo na região de
transição núcleo-flagelo. Como proposto por Folliot & Maillet (1970) e Chawanji et
al., (2006) o nome adjunto do centríolo foi mantido para os Cicadomorpha, apesar
de ser localizado em uma posição anterior ao centríolo. Em A. reticulatum, assim
como em cigarras da subtribo Platypleurinae (Chawanji et al., 2005), o adjunto é
alongado e consiste de uma material homogêneo e moderadamente elétron denso.
Em espécies de Cicadettinae o adjunto do centríolo é relativamente grande e
possuem uma subestrutura lamelada, caracteres que foram considerados
sinapomórficos para esta subtribo (Chawanji et al., 2006).
A presença de corpos acessórios é a principal diferença em relação a outras
espécies de Cicadomorpha. Chawanji et al., (2005) sugerem que a perda dos
corpos acessórios nas famílias Cicadidae e Cercopidae apontam essas famílias
como proximamente relacionadas. De fato, tal relação está de acordo com a atual
filogenia aceita para o grupo (Campbell et al., 1995; Bourggoin & Campbell, 2002)
que também aponta as famílias Aethalionidae e Cicadellidae, que possuem corpos
acessórios, como mais proximamente relacionadas dentro da superfamília
Membracoidea.
Na extremidade posterior flagelar de A. reticulatum os microtúbulos se
desorganizam simultaneamente, diferente das espécies de Cicadidae (Chawanji et
al., 2005) em que o par central é o primeiro a terminar.
Nesse estudo, a descrição estrutural e ultra-estrutural dos espermatozóides de
A. reticulatum trata do primeiro registro para a família Aethalionidae. Alguns
caracteres, como a presença dos corpos acessórios e a sequência de terminação
dos microtúbulos, difere marcadamente de outras espécies de Cicadomorpha.
108
Chawanji et al. (2005, 2006) demonstraram caracteres sinapomórficos que
permitem separação de subtribos de Cicadidae, baseados principalmente em
características do adjunto do centríolo e em medidas do tamanho do flagelo e do
núcleo. Estudos adicionais com a morfologia dos espermatozóides dos
Auchenorrhyncha poderão revelar novas sinapomorfias e utilizar esses caracteres
em análises filogenéticas do grupo, contribuindo para elucidar o atual status de
grupo parafilético da subordem Auchenorrhyncha.
Agradecimentos
Ao Núcleo de Microscopia e Microanálise da Universidade Federal de Viçosa
(UFV) e ao Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília
(UnB). Esta pesquisa foi suportada pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq – Proc. 142455/2005-9) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes).
109
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111
Legenda das Figuras
Figura 1. Fotomicrografia de luz (A-B) e eletrônica de transmissão (C-J) dos
espermatozóides de Aethalion reticulatum. A. Fotomicrografia em contraste de fase
do espermatozóide, a seta indica o limite entre a cabeça (h) e o flagelo (f). B.
Fotomicrografia de fluorescência da região da cabeça, mostrando o núcleo corado
com DAPI. C-D. Corte de um espermatodesmata na vesícula seminal, mostrando
núcleos seccionados em posição longitudinal (setas) e tranversal (cabeça de seta)
embebidos em uma matriz de material extracelular (m). E. Corte longitudinal da
região anterior de um espermatodesmata, mostrando o núcleo (setas) e o
acrossomo (cabeças de seta) inseridos na matriz (m). F. Corte transversal de um
espermatodesmata seccionado na altura dos núcleos. G. Corte longitudinal da
região de transição entre o acrossomo (ac) e o núcleo (n) indicando uma estrutura
lamelar na extremidade anterior do núcleo (seta). H-I. Corte longitudinal e
transversal, respectivamente, do acrossomo, mostrando os filamentos (cabeças de
seta) irradiando da vesícula acrossomal (asterisco). A seta indica a região elétron
lúcida que separa a vesícula acrossomal. J. Corte transversal da região de
transição entre o acrossomo (ac) e o núcleo (seta). A cabeça de seta indica as
lacunas elétron-lúcidas na região do acrossomo. Barras: A-B = 20 µm; C-F = 3 µm;
G e J = 0,5 µm; H e I = 0,2 µm.
Figura 2. Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides de
Aethalion reticulatum. A. Corte longitudinal da região de transição núcleo-flagelo,
mostrando o núcleo (n), o adjunto centriolar (seta) e os derivados mitocondriais
(md). B-C. Cortes transversais do núcleo (n) e da região em que o adjunto do
centríolo (ca) está em paralelo com o núcleo. As cabeças de seta indicam as
inclusões elétron-lúcidas no núcleo. D. Corte transversal da região de transição
núcleo-flagelo, mostrando o núcleo (n) e os derivados mitocondriais. A seta indica a
porção final do adjunto do centríolo e a cabeça de seta à lacuna elétron lúcida no
núcleo. E. Corte longitudinal da região de transição núcleo-flagelo, mostrando o
adjunto do centríolo (ca), o núcleo (n) e os derivados mitocondriais. A seta indica a
ponta afilada do núcleo na sua extremidade posterior. F-H. Cortes transversais da
região de afilamento lateral do núcleo (n), mostrando os derivados mitocondriais
(md) adjacentes ao núcleo e a porção final do adjunto do centríolo (seta). A cabeça
de seta indica a extremidade posterior do núcleo na região que antecede a inserção
112
do axonema. I-J. Cortes longitudinais da região de transição núcleo-flagelo. I. A
cabeça de seta indica a extremidade posterior do núcleo se inserindo na região
centriolar (c). Os derivados mitocondriais (md) inicialmente se estendem em
paralelo ao núcleo (n). J. A extremidade posterior do núcleo (n) se insere no
centríolo (c) e logo abaixo se inicia o axonema (ax). As setas indicam os corpos
acessórios em cada lado do axonema. K-O. Cortes transversais da região de
transição núcleo-flagelo, mostrando a extremidade final do núcleo (n), o início dos
corpos acessórios (cabeça de seta), os derivados mitocondriais (md) e a região
centriolar (asterisco). A seta indica a extremidade final do núcleo na região de
inserção do centríolo. Barras: A, E e I = 0,5 µm; B-D e J = 0,4 µm; F-H e K-O = 0,2
µm.
Figura 3. Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides de
Aethalion reticulatum. A. Corte transversal do flagelo mostrado o axonema formado
por nove microtúbulos acessórios (am), nove duplas (dm) e um par central (cm), os
corpos acessórios com uma região de paracristalino (cabeças de seta) e os
derivados mitocondriais, com uma área central menos elétron densa, adjacente ao
axonema (a), uma região de paracristalino (p) e uma região de crista na periferia
(seta). B. Corte longitudinal dos derivados mitocondriais evidenciando a região das
cristas (seta). C. Corte longitudinal do flagelo, mostrando os derivados mitocondriais
(dm) e um dos corpos acessórios (cabeça de seta). D-F. Corte transversal da região
final do flagelo, mostrando da desorganização dos microtúbulos. As setas indicam o
par central e as cabeças de setas indicam as duplas que são os últimos a
terminarem na extremidade posterior flagelar. Barras: A, D-F = 0,2 µm; B-C = 0,4
µm.
113
Figura 1
114
Figura 2
115
Figura 3
116
3.6. Polimorfismo de espermatozóides em Largus rufipennis Laporte 1832
(Heteroptera: Pyrrhocoroidea: Largidae)
Capítulo 6
117
RESUMO. A produção de espermatozóides polimórficos tem sido registrada em
várias ordens de insetos, como Diptera, Lepidoptera e Hemiptera. Nesse trabalho,
descrevemos, pela primeira vez na família Largidae, a morfologia dos dois tipos de
espermatozóides produzidos por Largus rufipennis. Para isto, ultilizamos técnicas
de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os espermatozóides foram
extraídos das vesículas seminais e medem, em média, 260 µm e 200 µm e ambos
os tipos possuem o núcleo medindo, em média, 65 µm. Não foram observadas
diferenças ultra-estruturais entre os dois tipos de espermatozóides de Largus
rufipennis. A região da cabeça consiste de um acrossomo, um núcleo e parte do
adjunto do centríolo que inicia na região anterior ao núcleo. O núcleo é preenchido
por cromatina compacta e homogênea. O adjunto do centríolo segue em paralelo
com o núcleo e, mais posteriormente, com os derivados mitocondriais. O flagelo
consiste de um axonema (9 + 9 + 2 microtúbulos) e dois derivados mitocondriais,
não sendo observados corpos acessórios. Os derivados mitocondriais são
simétricos em tamanho e diâmetro. Na vesícula seminal foi observada quantidade
similar dos dois tipos espermatozóides (57% do tipo maior e 43% do tipo menor)
enquanto que na espermateca da fêmea os espermatozóides maiores foram
preferencialmente estocados (87%). Tais resultados permitem discussões acerca
da biologia reprodutiva da espécie, especificamente nas estratégias de competição
de espermatozóides.
PALAVRAS-CHAVE: competição de espermatozóides, ultra-estrutura, Hemiptera e
adjunto de centríolo.
118
1. Introdução
Em muitos grupos animais os machos férteis usualmente produzem
espermatozóides de estrutura uniforme, com características únicas para a espécie
(Parker, 1982). Tem sido observada uma grande variação morfológica no tamanho
e ultra-estrutura dos espermatozóides entre as espécies, principalmente nos insetos
(Sivinski, 1984; Jamieson, 1987, 1991; Jamieson et al., 1999). Em alguns táxons
ocorrem variações intra-específicas na morfologia dos espermatozóides (Hudgson,
1999), fenômeno conhecido como polimorfismo, o qual pode incluir variações no
comprimento e na estrutura dessas células (Jamieson et al., 1999).
Em insetos, espermatozóides polimórficos são bem relatados e foram descritos
pela primeira vez na vespa Eulophidae Dahlbominus fuscipennis (Lee & Wilkes,
1965). Em Lepidoptera são produzidos dois tipos de espermatozóides,
denominados eupirene e apirene, devido à presença e ausência de núcleo,
respectivamente (Friedlander & Gitay, 1972; Katsuno, 1977; Silberglied et al., 1984;
Osanai et al., 1989; Kubo-Irie et al., 1998; Mancini & Dolder, 2001, 2002, 2004).
Ambos os tipos de espermatozóides são encontrados na espermateca, mas a
função do apirene permanece incerta (Osanai et al., 1989; Friedlander, 1997). Em
várias espécies de Diptera, principalmente no gênero Drosophila, foi relatada
presença de espermatozóides polimórficos, variando no comprimento do núcleo e
do flagelo (Beatty & Sidhu, 1967; Presgraves et al., 1997, 1999; Joly & Lachaiese,
1994; Otronen et al., 1997). Dentre os Hemiptera, algumas espécies de Cicadidae e
Cicadellidae apresentam polimorfismo, também baseadas em variações no
tamanho do núcleo e do flagelo, mas ambos os tipos de espermatozóides
apresentam as mesmas características ultra-estruturais (Kato, 1956; Kubo-Irie et
al., 2003; Chawanji et al., 2005; 2006). Ainda, na família Pentatomidae a produção
de espermatozóides pode variar quanto ao complemento de cromossomos
(Schrader, 1960).
119
Existem diferentes hipóteses para explicar o polimorfismo dos espermatozóides
em insetos. Algumas delas correlacionaram a produção de espermatozóides de
diferentes tamanhos com o fenômeno da competição espermática pela fertilização
de ovócitos (Beatty & Burgoyne, 1971; Bressac et al., 1991; Pasini et al., 1996;
Snook, 1998; Swallow & Wilkinson, 2002). Em espécies de Drosophila, tem sido
demonstrado que os espermatozóides maiores são preferencialmente estocados na
espermateca (Betty & Burgoyne, 1971; Takamori & KuroKawa, 1986; Bressac &
Hauschteck-Jungen, 1996). Snook & Karr (1998) demonstraram, em seis espécies
de Drosophila, que somente espermatozóides longos foram encontrados fertilizando
os ovos das fêmeas. Entre os Hemiptera, em espécies de Cicadidae, horas após a
cópula, somente espermatozóides longos sobreviveram na espermateca e
fertilizaram os ovócitos (Kubo-Irie et al., 2003).
Nesse trabalho, descrevemos aspectos da morfologia dos dois tipos de
espermatozóides produzidos por Largus rufipennis (Largidae). Além disso,
investigamos se ambos os tipos são transferidos das vesículas seminais para a
espermateca e em que proporção eles ocorrem em cada órgão de estoque.
2. Material e Métodos
Dez indivíduos adultos de cada sexo de Largus rufipennis (Laporte, 1832)
foram obtidos em uma área de Mata Atlântica do Parque Estadual da Serra do
Brigadeiro, município de Araponga, Minas Gerais, Brasil.
2.1. Microscopia de luz - Machos e fêmeas adultos tiveram seus sistemas
reprodutores dissecados. Para medir o tamanho dos espermatozóides, gotas de
suspensão extraídas da vesícula seminal e da espermateca foram espalhadas em
lâminas histológicas e fixadas por vinte minutos em solução de paraformaldeído 4%
120
em tampão fosfato 0.1 M, pH 7.2. Após secar em temperatura ambiente, as lâminas
foram observadas em fotomicroscópio equipado com contraste de fase e todos os
campos da lâmina foram fotografados para medir os espermatozóides. Para medir
os núcleos, algumas lâminas foram coradas por 15 minutos com DAPI (4,6-
diamidino-2-fenilindol) 0.2 µg/ml em PBS, lavadas e montadas em sacarose 50%.
Essas lâminas foram observadas em microscópio de epifluorescência (Olympus,
BX-60) equipado com filtro BP360-370 nm e 200 núcleos foram fotografados. Todas
as medidas foram feitas usando o software Image Pro-Plus (Media Cybernetcs) e
os comprimentos foram expressos pela média do número total de espermatozóides
analisados. Foi feita a contagem total de cada tipo de espermatozóide presente nas
lâminas e estabelecida a proporção de ocorrência na vesícula seminal e na
espermateca.
2.2. Microscopia eletrônica de transmissão - De cada macho, uma das vesículas
seminais foi fixada por 24 h, a 4
o
C, em solução de glutaraldeído 2.5%, ácido pícrico
0.2%, sacarose 3% e 5 mM CaCl
2
diluídos em tampão cacodilato de sódio, pH 7.2.
O material foi pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, desidratado em acetona e
incluído em Epon 812. Cortes ultrafinos foram contrastados com solução aquosa de
acetato de uranila 2% e citrato de chumbo 0,2% em solução de hidróxido de sódio
1N e observados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 109 e JEOL
100C).
3. Resultados
Não foram observadas diferenças ultra-estruturais entre os espermatozóides de
Largus rufipennis. A região da cabeça consiste de um acrossomo, um núcleo e
parte do adjunto do centríolo que inicia na região anterior ao núcleo (Fig. 1A). O
121
acrossomo tem formato cônico (Fig. 1B). O topo do núcleo é inserido na região
posterior do espaço subacrossomal (Fig. 1B-D).
O núcleo é preenchido por cromatina compacta e homogênea (Fig. 1C, 1E-G).
Na região anterior, o núcleo possui formato regular (Fig. 1E) e segue paralelamente
ao adjunto do centríolo (Fig. 1E-G). Na região de transição núcleo-flagelo, o núcleo
vai se afilando e é acompanhado pelo adjunto do centríolo (Fig. 1H).
Posteriormente, o adjunto do centríolo segue em paralelo com os derivados
mitocondriais (Fig. 1H-K). O núcleo se sobrepõe à região anterior dos derivados
mitocondriais, justamente acima do axonema (Fig. 1I-K). Os derivados
mitocondriais e o axonema percorrem toda a extensão do flagelo (Fig. 1L).
O flagelo consiste de um axonema e dois derivados mitocondriais (Fig. 2A),
não sendo observados corpos acessórios. O axonema apresenta o padrão típico de
9 + 9 + 2 microtúbulos, sendo 9 microtúbulos acessórios, 9 duplas e 2 microtúbulos
centrais (Fig. 2A). Os derivados mitocondriais, simétricos em diâmetro, são
formados por duas regiões paracristalinas, uma mais elétron densa situada entre as
áreas claras e uma região de crista mitocondrial, a qual é restrita a periferia dos
derivados (Fig. 2A). Cortes longitudinais das cristas mostram que elas são
perpendiculares ao longo do eixo dos derivados e com intervalos regulares de 24
nm (Fig. 3B).
A espécie L. rufipennis produz espermatozóides de dois tamanhos. O maior
mede, em média, 260 µm e o menor 200 µm (Fig. 2C-D). Ambos os tipos de
espermatozóides apresentaram núcleos medindo, em média, 65 µm (Fig. 2E-F). Na
vesícula seminal, de um total de 1426 espermatozóides, 812 (57%) foram do tipo
maior e 614 (43%) do tipo menor. Na espermateca, de um total de 933
espermatozóides contabilizados, 811 (87%) foram do tipo maior.
122
4. Discussão
Dentre os Heteroptera a ultra-estrutura de espermatozóides foi descrita em
espécies de Pentatomidae (Trandaburu, 1973; Fernandes & Báo, 1998), Reduviidae
(Dolder, 1988; Báo & DeSouza, 1994), Heteroptera aquáticos (Afzelius et al., 1985;
Lee, 1991; Lee & Lee, 1992) Leptopodomorpha (Afzelius et al., 1976),
Cimicomorpha, Gerromorpha e Pentatomorpha (Philips, 1970; Dallai & Afzelius,
1980). Estes trabalhos apontaram a presença de dois ou três corpos cristalinos nos
derivados mitocondriais como uma sinapomorfia para a subordem Heteroptera.
Neste trabalho, a primeira descrição para a família Largidae, demonstra que a
espécie L. rufipennis, além de compartilhar esse caracter sinapomórfico com os
demais Heteroptera, ela possui o acrossomo e o longo adjunto do centríolo paralelo
ao núcleo, similares as espécies de Nepomorpha (Lee & Lee, 1992). A perda dos
corpos acessórios também foi observada em espécies de Heteroptera aquáticos da
infraordem Nepomorpha (Lee, 1991; Lee & Lee, 1992), em Cimicomorpha, família
Reduviidae (Báo & DeSouza, 1994) e na subordem Auchenorrhyncha (Chawanji et
al., 2005; 2006). Os corpos acessórios possivelmente são um caracter
homoplástico na ordem Hemiptera, isto considerando que tanto a presença quanto
a ausência desta estrutura já foram relatadas nas subordens Auchenorrhyncha e
Heteroptera. Como observado em L. rufipennis, a simetria em diâmetro dos
derivados mitocondriais tem sido amplamente conservada dentre os Hemiptera, e
pode ser considera uma sinapomorfia para ordem.
Neste estudo foi demonstrada a produção de dois tipos de espermatozóides
com diferentes comprimentos de flagelo. Estudos similares relatam a produção de
espermatozóides polimórficos em Hemiptera, como Pentatomidae (Bowen, 1922;
Schrader & Leuchtenberger, 1950) e Cicadidae (Kubo-Irie et al., 2003; Chawanji et
al., 2005, 2006). Assim como em L. rufipennis, os diferentes tipos de
123
espermatozóides produzidos nessas espécies não apresentaram diferenças nas
características ultra-estruturais.
O polimorfismo mais comum nos espermatozóides de insetos esta relacionado
com o comprimento do núcleo e do flagelo. Em várias espécies do gênero
Drosophila os machos produzem espermatozóides de dois ou mais tamanhos
(Beatty & Burgoyne, 1971; Kurokawa et al., 1974; Takamori & Kurokawa, 1986;
Hihara & Kurokawa, 1987) e as fêmeas preferencialmente estocam
espermatozóides do tipo maior na espermateca. Uma análise quantitativa dos tipos
de espermatozóides em D. subobscura mostrou que os espermatozóides de maior
comprimento foram preferencialmente estocados na espermateca para serem
utilizados na fertilização (Bressac & Hauschteck-Jungen, 1996). Similarmente,
somente espermatozóides do tipo maior foram encontrados na espermateca de seis
espécies de Drosophila (Snook & Karr, 1998). Ainda, Takamori & Kurokawa (1986)
concluíram que em D. bifasciata os espermatozóides do tipo menor não participam
da fertilização dos ovos.
A seleção pelo espermatozóide do tipo maior também ocorre na espermateca
do Cicadidae Graptopsaltria nigrofuscata (Kubo-Irie et al., 2003) e na fertilização
dos ovos. Em L. rufipennis as fêmeas estocaram preferencialmente
espermatozóides do tipo maior, apesar dos dois tipos diferirem apenas no
comprimento do flagelo.
As implicações mais intrigantes destes dados questionam as possíveis
razões para a evolução e manutenção de tipos de espermatozóides que não têm a
mesma probabilidade de fertilização. Alguns trabalhos sugerem que os
espermatozóides que não fecundam os ovócitos degeneram no trato reprodutivo da
fêmea e podem fornecer uma fonte de energia (polissacarídeos, proteínas e ácidos
nucléicos) para os espermatozóides férteis, a fêmea ou o zigoto em
desenvolvimento (Riemann & Gassner, 1973; Sivinski 1980; Snook & Markow,
124
1996). Baseado em observações em Lepidoptera, acredita-se que os
espermatozóides apirenes perfuram a membrana basal do testículo e facilitam a
migração dos feixes de eupirenes para os ductos eferentes e o deslocamento ao
longo do trato reprodutor da fêmea (Holt & North 1970; Katsuno, 1977; Etman &
Hooper, 1979). Outros autores propuseram que os espermatozóides apirenes
seriam responsáveis por iniciar a capacitação e a aquisição de motilidade nos
eupirenes, através da quebra dos feixes com a ação de endopeptidases (Kasuga &
Aigaki, 1987; Osanai & Isono, 1997). As demais hipóteses relacionam a presença
de espermatozóides que não fecundam os ovócitos com a competição para
assegurar a paternidade. Uma delas propõe um mecanismo de eliminação do
espermatozóide precedente, pela retirada do órgão do estoque ou incapacitação
por contato direto (Silberglied et al., 1984; Otronen, 1997; Cordola-Aguilar, 1999). O
polimorfismo implica em espermatozóides com diferentes custos de produção,
sendo que as células inférteis de baixo investimento serviriam para encher a
espermateca da fêmea e, dessa forma, impedir a entrada do ejaculado de machos
em cópulas subsequentes (Sugawara, 1979; Silberglied et al., 1984; Otronen,
1997). Outra hipótese propõe que os espermatozóides inférteis funcionam para
bloquear a entrada de outros ejaculados no trato reprodutor da fêmea, pela
formação de um plug de cópula (Woodward , 1940; Baker & Bellis, 1988; 1989).
O significado funcional do polimorfismo de espermatozóides ainda não foi
totalmente elucidado (Snook, 1998; Swallow & Wilkinson, 2002), sendo apontadas
as hipóteses de competição espermática para garantir a paternidade de cópula
como a mais aceita (Pitnick et al., 2003).
125
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129
Legenda das Figuras
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de transmissão dos espermatozóides de
Largus rufipennis. A. Corte longitudinal da região de transição entre o acrossomo
(ac) e o núcleo (n). Note que o adjunto do centríolo (ca) começa na região anterior
do núcleo. B. Corte longitudinal da região de transição entre o acrossomo (ac) e o
núcleo (n). A seta indica a região elétron lúcida que separa o material acrossomal
(asterisco) no interior da vesícula acrossomal. C. Corte longitudinal mostrando uma
região elétron lúcida (seta) que separa o núcleo (n) do acrossomo (ac). D. Corte
transversal da região posterior do acrossomo (ac), mostrando a inserção da
extremidade anterior do núcleo (seta) e do adjuncto do centríolo (ca). E-G. Corte
transversal (F-G) e longitudinal (H) mostrando o núcleo (n) e o adjunto do centríolo
(ca). A cabeça de seta indica a região elétron lúcida que separa o núcleo (n) do
adjunto do centríolo (ca). H-K. Cortes transversais da região de transição entre o
núcleo (n) e o flagelo. As cabeças de seta indicam o adjunto do centríolo (ca) e os
asteriscos o início dos derivados mitocondriais. L. Corte longitudinal do flagelo,
mostrando o axonema (ax) e um dos derivados mitocondriais (cabeça de seta).
Barras: A, C-E e L = 0,3 µm; B e F-K = 0,2 µm.
Figura 2. Fotomicrografia eletrônica de transmissão (A-B) e de luz (C-F) dos
espermatozóides de Largus rufipennis. A. Corte transversal do flagelo mostrado o
axonema formado por nove microtúbulos acessórios (am), nove duplas (dm) e um
par central (cm) e os derivados mitocondriais, com áreas elétron lúcidas de material
cristalino (a) circundadas por áreas elétron densas (b) e uma região de crista na
periferia (cabeça de seta). B. Corte longitudinal dos derivados mitocondriais
evidenciando a região das cristas (cabeça de seta). C-D. Fotomicrografia em
contraste de fase do espermatozóide do tipo maior e menor, respectivamente. A
seta indica o limite entre a cabeça (h) e o flagelo (f). E-F. Fotomicrografia de
fluorescência da região da cabeça do espermatozóide do tipo maior e menor,
respectivamente, mostrando núcleos corados com DAPI. Barras: A-B = 0,2 µm; C-F
= 30 µm.
130
Figura 1
131
Figura 2
132
4. Conclusões Gerais
9 A ultra-estrutura dos espermatozóides de T. albitarse demonstrou vários
caracteres sinapomórficos com os Apoidea em geral. Entretanto, há outros
caracteres que são compartilhados somente com a família Crabronidae,
outros com a subfamília Crabroninae e, ainda, alguns caracteres foram
exclusivos da espécie ou, possivelmente do gênero. Dessa forma, os
caracteres derivados da ultra-estrutura dos espermatozóides mostram-se
promissores para análises filogenéticas dos Apoidea.
9 As abelhas T. analis e M. segmentaria compartilham várias características
morfológicas dos espermatozóides com as demais abelhas já descritas.
Estas sinapomorfias compartilhadas permitiram estabelecer um padrão
ultra-estrutural para os espermatozóides da família Apidae.
9 A morfologia do sistema reprodutor masculino nas espécies de
Hymenoptera estudadas, P. versicolor (Vespidae), T. analis e M.
segmentaria (Apidae), forneceram diferentes caracteres que suportam as
seguintes inferências na sistemática do grupo: (1) as diferenças anatômicas
do sistema reprodutor fornece caracteres para análises filogenéticas entre
famílias ou táxons superiores à essa categoria; (2) o número de
espermatozóides por cistos nos folículos testiculares permite inferências em
nível de subfamília ou gênero; (3) medidas morfométricas dos
espermatozóides podem auxiliar estudos taxonômicos.
9 Os caracteres estruturais e ultra-estruturais dos espermatozóides de A.
reticulatum diferem marcadamente de outras espécies de Cicadomorpha.
Estudos prévios com Cicadidae revelaram sinapomorfias para as subtribos
desta família. A descrição morfológica dos espermatozóides em
representantes de outras famílias pode revelar novas sinapomorfias e
133
utilizar esses caracteres em análises filogenéticas do grupo, contribuindo
para confirmar o atual status de grupo parafilético da subordem
Auchenorrhyncha.
9 Os espermatozóides dimórficos de L. rufipennis não apresentaram
diferenças ultra-estruturais e alguns caracteres (inclusive a polimorfia dos
espermatozóides) são apontados como sinapomórficos para a subordem
Heteroptera. Uma maior proporção de espermatozóides do tipo maior foi
observada na espermateca da fêmea.
9 Caracteres derivados dos espermatozóides sustentam o uso dessas células
em análises cladísticas (espermiocladística) e os caracteres da morfologia
do sistema reprodutor mostram-se potenciais para a sistemática dos insetos
em geral.
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