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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas
Concentração sérica e peritoneal da interleucina-18 em
mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve.
Autora: Dra. Cristina Luce Glitz
Orientador: Prof. Dr. João Sabino Lahorgue Cunha Filho
Dissertação de Mestrado
Porto Alegre, 2006
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas
Concentração sérica e peritoneal da interleucina-18 em
mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve.
Autora: Dra. Cristina Luce Glitz
Orientador: Prof. Dr. João Sabino Lahorgue Cunha Filho
Dissertação de Mestrado
Porto Alegre, 2006
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G561c Glitz, Cristina Luce
Concentração sérica e peritoneal da interleucina-
18 em mulheres inférteis com endometriose mínima
ou leve / Cristina Luce Glitz ; orient. João Sabino
Lahorgue Cunha Filho. – 2006.
94 f. ; il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal
do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina.
Programa de Pós-Graduação em Medicina:
Ciências Médicas. Porto Alegre, BR-RS, 2006.
1. Endometriose 2. Infertilidade feminina 3.
Interleucina-18 I. Cunha Filho, João Sabino
Lahorgue II. Título.
NLM: WP 390
Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. João Sabino Cunha Filho, idealizador do trabalho, pela excelente
orientação prestada.
Prof. Dr. Fernando Monteiro de Freitas, pelo incentivo e exemplo profissional.
A Dra. Carmen Pilla pelo tempo dispensado com auxilio e orientações.
A Marta Senger pelo auxílio na realização do trabalho.
A bolsista Juliana Azevedo pelo auxilio e dedicação.
Aos médicos residentes do Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre pelo auxílio e amizade.
Ao Ricardo
pelo carinho, amor e apoio constantes.
Aos meus pais – Alfredo e Heloisa
pelo incentivo, exemplo e otimismo sempre.
Aos meus irmãos – Fernanda e Eduardo
pelo carinho e compreensão.
SUMÁRIO
1.Introdução...................................................................................................................07
2.Revisão da literatura...................................................................................................09
2.1.Aspectos hormonais na endometriose.........................................................09
2.2. Hormônios e modulação imunológica.........................................................12
2.3. Alterações imunológicas no fluido peritoneal..............................................14
2.4. Interleucina – 18 (IL-18 ).............................................................................18
3. Objetivos....................................................................................................................22
4. Referências bibliográficas.........................................................................................23
5. Interleukin-18 is not associated to infertility in women with minimal or mild
endometriosis................................................................................................................30
6. Interleucina-18 não está associada à infertilidade em mulheres com endometriose
mínima ou leve .............................................................................................................47
7. Conclusões...............................................................................................................66
8. Perspectivas.............................................................................................................67
9. Anexos......................................................................................................................68
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
1. Table 1: Results of IL-18 dosages in the peritoneal and serum fluid and hormonal
measurements in the peritoneal fluid (expressed as means and standard
deviation).......................................................................................................................41
2. Table 2: Comparison among IL-18 and endometriosis studies.................................42
3. Figure 1: Correlation of serum IL-18 levels and peritoneal IL-18
levels.............................................................................................................................43
4. Tabela 1: Resultados das dosagens de IL-18 no fluido peritoneal e sérica e das
dosagens hormonais no fluido peritoneal, médias e desvio padrão.............................60
5. Tabela 2: comparação entre os estudos com IL-18 e endometriose........................61
6. Figura 1 : Correlação de IL-18 sérica e peritoneal....................................................62
1. INTRODUÇÃO
A endometriose é uma doença benigna comum entre mulheres em idade
reprodutiva e caracteriza-se pela presença e crescimento de tecido endometrial
(glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina. Embora a endometriose permaneça
como uma das patologias ginecológicas mais investigadas, sua etiologia e patogênese
ainda não estão bem esclarecidas. Existem algumas teorias que tentam explicar sua
etiologia, entre elas implantes ectópicos, metaplasia celômica e teoria da indução
(Nisolle, 1997; Starzinski-Powitz, 1998; Olive, 2001; Freitas, 2006).
A teoria da menstruação retrógrada tem sido largamente aceita e seu
mecanismo explicaria a presença de tecido endometrial em locais ectópicos. No
entanto, essa teoria não explica a presença de endometriose em alguns locais como
sistema nervoso central, sistema respiratório, entre outros. Além disso, cerca de 90%
das mulheres que menstruam apresentam menstruação retrógrada, e, no entanto,
apenas 10% têm endometriose (Valle, 2002).
Em torno de 40% das pacientes com endometriose serão assintomáticas
(Freitas, 2001). Naquelas sintomáticas, o sintoma mais comum é a dor pélvica, que
geralmente é cíclica, e pode irradiar-se para membros inferiores ou para região
lombar, algumas pacientes se queixam de dispareunia profunda e dismenorréia (Valle,
2002). Acredita-se que a dor pélvica esteja relacionada com reação inflamatória
originada em implantes peritoneais pela liberação de prostaglandinas (Olive, 2001;
Harada, 2001; Dmowski, 2004).
O tempo para o diagnóstico definitivo de endometriose pode ser considerado
longo, principalmente em mulheres jovens e adolescentes com dor pélvica, onde
ocorre um atraso no diagnóstico considerando-se o início da sintomatologia (Arruda,
2003).
No Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre a endometriose foi o principal achado laparoscópico em pacientes com dor
pélvica e o segundo diagnóstico entre aquelas com infertilidade (Palma Dias, 1995).
A associação de endometriose e infertilidade já é bastante estudada. Sabe-se
que até 60% das pacientes com infertilidade podem apresentar implantes
endometrióticos. Pacientes com endometriose moderada ou severa (com alteração
anatômica importante) apresentam infertilidade secundária à causa anatômica.
Entretanto, para aquelas mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve a causa
da infertilidade não está totalmente esclarecida, envolvendo alterações hormonais,
imunológicas, proliferativas (endometriais) e uterinas (Muse, 1982; Bancroft, 1989;
Mahutte, 2001; Valle, 2002).
O estudo da etiologia da dor pélvica em mulheres que apresentam
endometriose também tem sido bastante investigado por inúmeros autores. A
classificação proposta pela American Society for Reproductive Medicine (ASRM,
atializada, 1996) não associa os diferentes estádios da doença com a sintomatologia.
Atualmente, a teoria mais aceita para a presença de dor neste grupo de pacientes
seria uma alteração inflamatória local, com expressão de fatores imunológicos
(citoquinas) (Harada, 2001; Valle, 2002), ou a incitação de terminais nervosos em
implantes mais profundos (Berkley, 2005).
Alguns marcadores séricos têm sido estudados para o auxílio no diagnóstico e
manejo da endometriose. Entre eles, o CA-125 que estaria presente no soro de
pacientes com endometriose severa no início do ciclo menstrual. O amilóide A sérico
(SAA) também pode estar associado em casos severos de endometriose e o anticorpo
anticardiolipina (aCL) seria encontrado em todos os estágios da doença (Abrão, 1997).
A identificação de um manejo não cirúrgico leva pesquisadores a estudarem a
fisiopatologia da endometriose. Existem amplas evidências sugerindo que o sistema
imunológico seria um dos responsáveis e a resposta imune alterada explicaria porque
algumas mulheres desenvolvem endometriose e outras não (Bedaiwy, 2002). Um
conceito importante seria relacionado a um processo inflamatório pélvico
provavelmente alterando a imunidade celular no fluido peritoneal. Vários estudos têm
demonstrado que os componentes imunológicos do fluido peritoneal de pacientes com
endometriose teriam papel essencial na patogênese e progressão da doença (Harada,
2001; Mahutte, 2002; Kyama, 2003; Dmowski, 2004).
Portanto, existem várias teorias que tentam explicar e associar os aspectos
hormonais e imunológicos da endometriose com a sintomatologia álgica ou com a
dificuldade para gestar. Entretanto, até o presente momento, nenhum resultado foi
definitivo ou conclusivo.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Aspectos hormonais na endometriose
Alterações hormonais foram descritas por vários autores em diferentes estudos,
tentando relacionar as alterações existentes e a incapacidade de gestar das
pacientes com endometriose. Foram encontradas, por exemplo, anormalidades na
secreção de progesterona, estradiol, prolactina e na função lútea das pacientes
inférteis com endometriose, porém os achados são conflitantes (Burns, 1999;
Cunha-Filho, 2001; Valle, 2002).
A endometriose foi associada com anovulação em 17% das pacientes
mediante um escore obtido de suas anamneses (Soules, 1976; Dmowski, 1994). O
estigma ovulatório foi observado em 33% das pacientes inférteis com endometriose
e esses autores acreditam haver alguma alteração hormonal em pacientes com
endometriose. Outros estudos, comparando pacientes com e sem endometriose,
observaram uma prevalência superior de folículo não roto em pacientes com
endometriose (Mio, 1992). Em estudo experimental, com ratas, sugere-se a
associação de endometriose e infertilidade com uma foliculogênese alterada (Moon,
1993). Destacam-se a associação de endometriose com anovulação, galactorréia,
síndrome de folículo não roto, secreção anômala de prolactina e insuficiência lútea
(Muse, 1982).
A síndrome do folículo não roto que pode estar associada a endometriose leva
o corpo lúteo a produzir e secretar uma menor quantidade de progesterona podendo
acarretar uma disfunção lútea (Bancroft, 1992; Koninckx, 1980).
Pacientes com endometriose teriam secreção anômala do hormônio
luteinizante (LH) (Cheesmen, 1982), o que contribuiria para o fato de que a
insuficiência lútea é mais prevalente em mulheres inférteis com endometriose do
que naquelas com causa desconhecida (Cheesman, 1983). No entanto, outros
autores não verificaram diferença significativa na prevalência de insuficiência lútea
em pacientes com endometriose (Matorras, 1985). Nessas mulheres também se
encontra diminuição da concentração de progesterona, tanto na sua concentração
sérica como aquela encontrada no líquido peritoneal (Barry-Kinsella, 1994). A
alteração na secreção de estradiol e progesterona pode ser alguma das alterações
hormonais de pacientes com endometriose mínima (Tummon, 1988).
A presença da associação entre endometriose, hiperprolactinemia e
insuficiência lútea foi descrita como possível causa de infertilidade no grupo de
pacientes com essa doença e sem dano tubário, por uma provável disfunção
ovulatória (Cunha-Filho, 2001). Nosso grupo observou que pacientes com
endometriose mínima e leve apresentam alterações na fase folicular precoce
caracterizada pela diminuição dos níveis séricos de estradiol bem como pela
prevalência de hiperprolactinemia e insuficiência lútea. Pacientes com endometriose
mínima e leve também teriam uma alteração na secreção de prolactina após estímulo
com hormônio tireotrófico (TRH), o que pode caracterizar um estado de
hiperprolactinemia oculta (Cunha-Filho, 2000, 2001).
Outro estudo do nosso grupo mostrou que pacientes inférteis com
endometriose moderada ou severa apresentam níveis diminuídos da proteína de
ligação do fator de crescimento semelhante à insulina (Insulin-like growth factor
binding protein-1 - IGFBP-1) no fluido folicular quando submetidas à fertilização in vitro
(Cunha-Filho, 2003).
Recente meta-análise que incluiu 22 estudos mostra que pacientes com
infertilidade associada a endometriose quando submetidas à fertilização in vitro
apresentam diminuição significativa dos processos reprodutivos, com uma taxa de
gestação 20% inferior do que naquelas que realizaram fertilização in vitro por outras
indicações. Os dados sugerem que o efeito da endometriose não seria exclusivamente
pela receptividade do endométrio, mas também por desenvolvimento do oócito e do
embrião (Barnhart, 2002).
2.2 Hormônios e modulação imunológica
As citoquinas interagem e podem modular a esteroidogênese glandular
(adrenais, testículos e ovários), influenciando as funções e o desenvolvimento dessas
glândulas de uma maneira sistêmica e complexa (Emre, 2003; Bosrnstein, 2004).
As glândulas adrenais, especificamente as células adrenocorticais, produzem
uma variedade de citoquinas, como fator de necrose tumoral (TNFα), interleucina-1
(IL-1), e RNA mensageiro de interleucina-6 (IL-6) (Gonzalez-Hernadez, 1994, 1996). O
RNA mensageiro de IL-1 e IL-6 é expresso predominantemente na zona reticular, mas
também na produção celular de esteróides dentro da medula e em outras zonas do
córtex (Gonzalez-Hernadez, 1994). A interleucina-18 (IL-18) tem sido encontrada em
células da zona reticular e da zona fasciculada do córtex adrenal e estimula a
imunidade celular. A produção de RNA mensageiro de IL-18 pelas células
adrenocorticais é promovida pelo estresse agudo e sugere-se que a IL-18 tenha um
papel imuno-estimulatório durante situações de estresse (Conti, 2000; Sugama, 2000).
O corpo lúteo produz progesterona, o que permite a manutenção de uma
gestação. No entanto, se não existe embrião, o corpo lúteo degenera e propicia o
crescimento de novos folículos. Existem células imunológicas dentro do corpo lúteo
(macrófagos e linfócitos T), especialmente durante a luteólise. Os macrófagos têm
papel na ingestão de remanescentes celulares que resultam da morte de células
lúteas. Acredita-se que as células imunes influenciem diretamente a destruição de
células lúteas e a diminuição da esteroidogênese (Bornstein, 2004). A inibição das
células imunes no corpo lúteo durante a gestação inicial pode ser derivada de sinais
uterinos ou embriônicos, ou pela manutenção de altas concentrações de progesterona
dentro do tecido luteal (Pate, 2001).
De outra maneira, TNF e IL-1 inibem a esteroidogênese de células ovarianas
indiferenciadas pela inibição de adenil-ciclase. Em ovários diferenciados, essas
citoquinas estimulam a síntese de progesterona ou tem pequeno efeito na
esteroidogênese (Terranova, 1997).
Outro estudo demonstra que o endométrio humano normal quando
primariamente exposto a progesterona, atua na regulação da expressão de
metaloproteinases (MMP) e também limita a habilidade das citoquinas para estimular a
expressão dessas enzimas. Em contraste, o tecido endometrial de mulheres com
endometriose demonstra uma resposta alterada a progesterona, permitindo a
expressão contínua de MMPs através da fase secretória. Mais especificamente, as
citoquinas pró-inflamatórias produzidas pelas células epiteliais endometriais opõem-se
às respostas das células estromais a progesterona inibindo a produção de fatores de
diferenciação importantes para a regulação celular das MMPs (Osteen, 2005).
Horie pela primeira vez demonstra que a progesterona e componentes
progestacionais atenuam a expressão de interleucina-8 (IL-8) pela redução da
ativação de fator nuclear kappa B (NF-κB) induzida pelo TNF-α nas células
endometrióticas estromais, sugerindo um possível mecanismo molecular na terapia
hormonal para o controle da progressão da endometriose (Horie, 2005).
Outro estudo sugere que além de outros mediadores inflamatórios, os
esteróides ovarianos também participam da produção de fator de crescimento
hepatocitário (HGF) pelos macrófagos peritoneais que podem estar envolvidos no
desenvolvimento de endometriose tanto isoladamente como em associação com
estrógeno (Khan, 2005).
Fica bem evidente e demonstrada a interação entre a ação dos esteróides
ovarianos e sua imunomodulação durante o ciclo menstrual e mesmo durante a
gestação (Emre, 2003). Alterações hormonais poderiam alterar a expressão de
diversas rotas imunológicas, alterando também a inter-relação do sistema imunológico
e comprometendo o processo reprodutivo.
2.3 Alterações imunológicas no fluido peritoneal
O fluido peritoneal normalmente contém inúmeras células, incluindo
macrófagos, células mesoteliais, linfócitos, eosinófilos e mastócitos. Em torno de 85%
dos leucócitos no fluido peritoneal são macrófagos (Harada, 2001). Os macrófagos
são encontrados na cavidade peritoneal e em vários compartimentos do corpo.
Originam-se a partir dos monócitos circulantes que ao entrarem nessa cavidade
diferenciam-se em macrófagos. Uma das funções prováveis dos macrófagos no trato
reprodutivo estaria relacionada à menstruação retrógrada, onde removeriam as células
menstruais. Considerando-se a importância da menstruação retrógrada na patogênese
da endometriose e a função dos macrófagos e outros leucócitos na manutenção da
homeostasia da cavidade peritoneal, vários estudos têm relatado a função dessas
células na endometriose (Burns, 1999, Berkknoglu, 2003).
O fluido peritoneal, geralmente visualizado na cavidade pélvica durante exames
ou cirurgias ginecológicas de mulheres com endometriose, contém um número
aumentado de macrófagos ativados que secretam vários produtos locais, como fatores
de crescimento e citoquinas. Estudos têm encontrado níveis elevados de inúmeras
citoquinas no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, implicando então essas
citoquinas no desenvolvimento e progressão da endometriose e da infertilidade
(Harada, 2001, Kyama, 2003).
Outros autores também acreditam que a ativação de macrófagos peritoneais
seria a contribuição central na patogênese da endometriose. Macrófagos ativados na
cavidade peritoneal de mulheres com endometriose são potentes produtores de
citoquinas (Halme, 1984).
As citoquinas são proteínas de baixo peso molecular ou glicoproteínas que
podem ser sintetizadas pelos macrófagos peritoneais, linfócitos, implantes
endometriais ectópicos ou células mesoteliais do peritônio (Kyama, 2003).
Desempenham papel importante na regulação da proliferação, ativação, motilidade,
adesão, quimiotaxia e morfogênese celular. São fundamentais na iniciação,
propagação e regulação da resposta inflamatória e imunológica (Bedaiwy, 2002).
Algumas citoquinas têm sido identificadas no fluido peritoneal por ensaios
altamente sensíveis. As citoquinas encontradas em mulheres com endometriose
incluem, até o presente momento: IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13,
interferon-γ, fator de necrose tumoral (TNF) entre outros (Harada, 2001; Bedaiwy,
2002; Wu, 2003). A expressão anormal de inúmeras citoquinas pela ativação de
macrófagos, como a IL-1, IL-6, IL-8 e TNF, no fluido peritoneal de mulheres com
endometriose quando comparadas ao grupo controle, pode contribuir para um
envolvimento peritoneal, favorecendo a implantação de células endometriais e o
estabelecimento da endometriose (Kyama, 2003). As citoquinas podem regular a ação
de leucócitos no fluido peritoneal ou agir diretamente no endométrio ectópico, onde
podem exercer vários papéis na patogênese e fisiopatologia da endometriose.
Citoquinas como a IL-8 e TNFα conhecidamente promovem a proliferação de
células endometriais, adesão endometrial e angiogênese. Não somente os macrófagos
peritoneais, mas também as lesões endometrióticas e as células mesoteliais do
peritônio podem secretar citoquinas como TNFα e IL-1 em mulheres com
endometriose. Essas citoquinas por sua vez modulam o estímulo de outras citoquinas,
como a IL-8, promovendo então essa proliferação celular que pode facilitar os
implantes endometrióticos ou promover uma alteração no fluido peritoneal (Kyama,
2003).
Estudos recentes sugerem que os implantes endometrióticos também
produzem citoquinas. A IL-6 é secretada por vários tipos de células, incluindo células
epiteliais endometriais, macrófagos e leucócitos. Quando a produção de IL-6 por
macrófagos e células estromais endometrióticas em pacientes com endometriose é
comparada, observam-se níveis similares de produção de IL-6 pelas células estromais
(derivadas de um endometrioma) e por macrófagos estimulados pelo TNFα. Esses
achados sugerem que o tecido endometriótico pode ser outra fonte importante dessa
citoquina mantendo o processo inflamatório (Harada, 2001).
Para desenvolverem-se, as células endometriais precisam estabelecer
interações célula-célula ou célula-matriz extracelular com a superfície peritoneal.
Estudo recente mostrou que as células do estroma endometrial são as células críticas
na ligação do endométrio com a superfície peritoneal. A IL-8 pode desempenhar papel
na ligação dos implantes endometriais na patogênese da endometriose. Em modelos
experimentais onde se aumenta a concentração de IL-8 estimula-se a capacidade das
células do estroma endometrial em aderir a matriz extracelular (Harada, 2001).
Tem sido avaliada a possibilidade de que a qualidade das células endometriais
viáveis no fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode ser diferente
daquelas com pelve normal. As citoquinas inflamatórias (TNFα, IL-8 e IL-6) produzidas
pelas células endometriais provavelmente contribuem para o processo de adesão
celular. A IL-8 parece estimular a adesão de células endometriais à fibronectina. O
TNF também promoveria proliferação de estroma endometrial in vitro e adesão do
estroma celular endometrial aos componentes da matriz extracelular (Kyama, 2003).
Ainda não está claro se as alterações imunológicas são causa ou
conseqüência da endometriose. A endometriose levaria a uma alteração inflamatória
causada por uma resposta imunológica alterada e exagerada? Ou a endometriose
seria causada por uma resposta inflamatória peritoneal alterada? Até o presente
momento ainda não temos dados suficientes para responder de forma adequada a
essas questões.
Existem estudos com babuínos tentando encontrar alguma resposta. Nesses
estudos, as evidências sugerem que a resposta inflamatória peritoneal seria uma
conseqüência e não uma causa da endometriose (Kyama, 2003). Nos babuínos, tanto
a menstruação retrógrada espontânea como a injeção experimental intrapélvica de
células endometriais foram associadas com inflamação pélvica (aumento do volume
de fluido peritoneal e aumento da concentração de leucócitos e citoquinas
inflamatórias). Esse efeito inflamatório peritoneal foi observado um mês após a injeção
intrapélvica de endométrio, mas desaparece após dois ou três meses. Demonstrou-se
também que a concentração de leucócitos e a proporção de macrófagos e células T
citotóxicas estão aumentadas no fluido peritoneal de babuínos com endometriose
espontânea (D’ Hooghe, 1996, 1999, 2001, 2002).
Mesmo a resposta inflamatória sendo uma conseqüência da endometriose, a
coexistência de endometriose e resposta inflamatória peritoneal pode oferecer novas
opções terapêuticas no tratamento da endometriose.
2.4 Interleucina-18
A IL-18 é uma citoquina que pertence à família da interleucina 1 (Okamura,
1998; Dinarello, 1999, Gracie, 2003), originariamente identificada como interferon-
gama (IFN-γ) nas células de Kupffer e macrófagos. Similar a IL-1-beta, a IL-18 é
sintetizada como um precursor biológico inativo, que requer clivagem para uma forma
ativa. A ativação da IL-18 madura está diretamente relacionada a IL-1. Atualmente a
IL-18 é reconhecida como importante regulador da resposta imune inata e adquirida.
Desde então, as funções imunológicas da IL-18 têm sido estudadas. Ela pode ativar
células Natural Killer (NK) e apresentar também papel importante na proteção contra
infecções bacterianas. Tem papel central na cascata da inflamação e no processo de
imunidade inata e adquirida em função de sua habilidade de induzir a produção de
IFN-γ em linfócitos T e células NK (Dinarello, 1999; Akinori, 2000; Sims, 2002). A IL-18
atua em sinergia com IL-12 para promover o desenvolvimento da resposta T helper
(Liew, 2003). No entanto, não existem informações conclusivas disponíveis sobre as
funções da IL-18 no sistema endócrino e reprodutivo.
O aumento da expressão da IL-18 tem sido relatado nas placas
ateroscleróticas, mediando a liberação local de INF-γ. Foi realizado um estudo
prospectivo com 1229 pacientes com doença arterial coronariana documentada onde
dosaram a concentração sérica de IL-18 e outros marcadores de inflamação. A
concentração sérica média de IL-18 estava significativamente aumentada em
pacientes que tiveram evento cardiovascular fatal quando comparado com aqueles
que não tiveram evento fatal. Identificando, então, a IL-18 como um fator preditor
independente de morte cardiovascular em pacientes com doença coronariana
(Blankenberg, 2002).
Outro estudo avaliou a IL-18 durante a gestação. Foram obtidas dosagens
séricas de IL-18 de 143 pacientes com gestação normal antes do trabalho de parto, 13
mulheres com gestação complicada, 62 mulheres durante trabalho de parto e 29
mulheres no terceiro dia do puerpério de parto normal. Não houve diferença nas
dosagens de IL-18 nos diferentes momentos da gestação. A IL-18 mostrou-se
marcadamente elevada em mulheres com dor durante o trabalho de parto do que
naquelas com contrações sem dor. Quando inicia o trabalho de parto os níveis de IL-
18 aumentam significativamente. Os níveis mais elevados de IL-18 também foram
encontrados nas gestações com algum tipo de complicação obstétrica (Akinori, 2000).
A IL-18 também foi encontrada no endométrio humano. Um estudo avaliou a
presença de IL-18, receptor de IL-18 e proteína ligadora da IL-18 no endométrio
humano através de cultura de células epiteliais e estromais do endométrio. A IL-18
apareceu em todas as fases do ciclo menstrual. Os autores acreditam que esse
achado esteja relacionado a proteção endometrial contra microorganismos
patogênicos e como mecanismo regulatório no controle da invasão trofoblástica
através da modulação de citoquinas (Yoshino, 2001).
Existem atualmente três estudos publicados que associam a concentração de
IL-18 no fluido peritoneal com endometriose. Esses trabalhos mostram resultados
diferentes e discordantes.
Alguns autores realizaram um estudo avaliando a concentração da IL-18 no
fluido peritoneal de pacientes com endometriose. Foram obtidas amostras de fluido
peritoneal de 50 mulheres com endometriose não tratada que realizaram laparoscopia
por dor pélvica ou infertilidade, 8 mulheres com endometriose em tratamento com
agonista GnRH e 18 controles com pelve normal que realizaram cirurgia para ligadura
tubária. A IL-18 no fluido peritoneal de pacientes com endometriose tratada foi
significativamente maior do que no grupo controle. A alteração estava presente em
todas as fases do ciclo menstrual. Os níveis de IL-18 em mulheres com implantes
endometrióticos superficiais e profundos estavam significativamente elevados quando
comparados com aquelas com endometriomas ovarianos (Arici, 2003).
Outro estudo relacionou a IL-18 com a patogênese da endometriose. Foram
avaliadas 39 pacientes com endometriose e 15 mulheres sem endometriose (grupo
controle). Foi realizada dosagem de IL-18 e de receptor de IL-18 nos tecidos
endometrióticos através de análise imuno-histoquímica. Houve elevação significativa
de IL-18 no fluido peritoneal de pacientes com endometriose quando comparadas com
o grupo controle. As alterações encontradas na avaliação imuno-histoquímica sugerem
fortemente que a IL-18 tem papel na patogênese da endometriose. (Oku, 2004).
Entretanto, Zhang em 2004 determinou a concentração de IL-18 no fluido
peritoneal e no soro de mulheres com endometriose e comparou com grupo controle.
O estudo avaliou 44 mulheres que realizaram laparoscopia para patologias
ginecológicas benignas (22 pacientes que realizaram ligadura tubária e 22 mulheres
com diagnóstico de endometriose em diferentes estágios). A concentração de IL-18 no
fluido peritoneal e sérica foi correlacionada com a presença de endometriose, estágio
da doença e fase do ciclo menstrual. A concentração peritoneal de IL-18 estava
significativamente mais baixa em pacientes com endometriose do que no grupo sem
endometriose. A concentração sérica de IL-18 não apresentou diferença entre os
grupos. Não houve correlação da IL-18 com o estágio da endometriose e fase do ciclo
menstrual, tanto no fluido peritoneal quanto no soro (Zhang, 2004).
Os três estudos descritos acima utilizaram diferentes kits para dosagem de IL-
18 (Bender Medsistems, Sta Cruz Biotechnology e MBL, Co.), esse poderia ser um
dos motivos para a diferença entre os resultados apresentados por esses autores. Os
valores numéricos apresentados são bastante distintos, embora a técnica empregada
seja a mesma (ELISA).
Um outro fator importante a ser levado em consideração é a composição do
grupo de pacientes em que foi realizada a dosagem de IL-18. Sabe-se que a escolha
das pacientes pode interferir bastante no resultado final, principalmente quando
trabalhamos com métodos e técnicas novas e com grande variabilidade. Um dos
trabalhos realizados utilizou pacientes que já haviam tratado endometriose com
agonista GnRH, podendo esse tratamento apresentar alguma interferência sobre os
resultados. A dor pélvica também não foi considerada ao serem distribuídos os grupos.
Ainda não sabemos se aquelas pacientes que apresentam dor pélvica somente pela
endometriose, mesmo sendo pacientes férteis, apresentariam alterações no fluido
peritoneal. Até o momento, não existem trabalhos que associem somente pacientes
com dor pélvica e IL-18.
Sabe-se que existe uma inequívoca correlação entre endometriose e sistema
imunológico, bem como com o sistema endocrinológico; além disso, os dados na
literatura são escassos e contraditórios. Teoricamente, a IL-18 por fazer parte do
grupo das interleucinas 1, pode apresentar uma correlação com o sistema hormonal e
exercer papel na imunomodulação. Por esses motivos sugerimos a realização da
pesquisa descrita a seguir.
3. OBJETIVOS:
3.1 Objetivo principal
Avaliar as concentrações sérica e peritoneal de IL-18 em mulheres inférteis
com endometriose mínima e leve.
3.2 Objetivos secundários
Avaliar a concentração peritoneal de prolactina, progesterona e estradiol em
mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve.
Correlacionar as dosagens peritoneais de prolactina, progesterona e estradiol
com as concentrações sérica e peritoneal de IL-18.
Correlacionar as concentrações sérica e peritoneal de IL-18 em mulheres
inférteis com endometriose mínima ou leve.
4. Referências Bibliográficas
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peritoneal fluid but not in serum of patients with endometriosis. Fertil Steril, 81 (5),
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Interleukin-18 is not associated to infertility in women with minimal or
mild endometriosis.
C.L. Glitz, J. Azevedo, M. Senger, F.M. Freitas, J.S. Cunha-Filho.
Ob/Gyn Department, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil, 90035-000.
E-mail: [email protected]
ABSTRACT
BACKGROUND: There is some evidence showing immunologic alterations in women
with endometriosis and infertility. Among the immunologic alterations we highlight the
role of interleukin-18 (IL-18), mainly in infertile patients with mild/minimal endometriosis
without anatomical abnormalities. We propose to evaluate the concentration of IL-18 in
serum and peritoneal fluid in women with endometriosis. METHODS: We performed a
cross-sectional study with 34 infertile patients with mild/minimal endometriosis and 22
controls (fertile patients). Serum and peritoneal dosages of IL-18 were collected.
RESULTS: The groups were not different in terms of age and BMI. There were no
differences between dosages of IL-18 in peritoneal fluid and serum of infertile women
with endometriosis and control group: 290.85 ± 173.02 pg/ml x 374.21 ± 330.15 pg/ml
and 391.07 ± 119.71 x 373.42 ± 129.11, respectively (P>0.05). However, we found a
positive association between serum and peritoneal IL-18 in patients with endometriosis
(r=0.794, P=0.0001).
CONCLUSION: The concentrations of IL-18 were not different between the groups.
We can refute the hypothesis that IL-18 is associated to infertility in women with
minimal or mild endometriosis.
Key-words: cytokines/endometriosis/IL-18/peritoneal fluid.
INTRODUCTION
The association between endometriosis and infertility is already well known. A
conservative prevalence suggests that about 20-25% of infertile women show
endometriosis (Harada et al, 2001). Patients with moderate or severe endometriosis
have secondary infertility to the anatomic cause. However, for those infertile women
with minimal or mild endometriosis, the cause of infertility is not fully explained,
involving hormonal, immunological, proliferative (endometrial) and uterine alterations.
(Harada et al, 2001, Cunha-Filho et al, 2001, Mahutte et al, 2002).
Many studies have found high levels of cytokines in the peritoneal fluid (PF) of
women with endometriosis, and these cytokines may be implied in the development
and progression of endometriosis and infertility (Harada et al, 2001, Kyama et al,
2003).
In addition, some cytokines have been identified in the peritoneal fluid through
highly sensitive essays. The cytokines found in women with endometriosis include:
interleukines (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13), interpheron-γ, tumoral
necrosis factor, among others (Harada et al., 2001, Bedaiwy et al, 2002). The abnormal
expression of several cytokines by the activation of macrophagous, such as IL-1, IL-6,
IL-8 and TNF, in the peritoneal fluid of women with endometriosis can contribute to a
peritoneal involvement, favoring the growth of endometrial cells and the establishment
of endometriosis (Kyama et al, 2003).
Interleukin-18 (IL-18) is a cytokine that belongs to the interleukin 1 family,
originally identified as interpheron (IFN)-γ in Kupffer cells and macrophagous (Okamura
et al, 1998). IL-18 activates the Natural Killer (NK) cells and also shows a relevant role
in the protection against bacterial infections. It plays a central role in the inflammatory
cascade and the process of innate and acquired immunity as a result of its ability of
inducing the production of IFN- γ in T lymphocytes and NK cells (Akinori et al, 2000).
Moreover, IL-18 acts in synergy with IL-12 to promote the development of T helper
response.
A few authors have already studied the association between IL-18 and
endometriosis. Arici et al (2003) found levels of IL-18 in the peritoneal fluid of patients
with treated endometriosis significantly higher than those of the control group; similar
result was found by Oku et al in 2004 where immuno-histo-chemical analysis was also
carried out. However, Zhang et al determined in 2004 the concentration of IL-18 in the
peritoneal fluid and serum of women with endometriosis. By this author, the peritoneal
concentration of IL-18 was significantly lower in patients with endometriosis than in the
group without endometriosis.
The results in the literature, concerning the role of IL-18 in endometriosis, are
discrepant; the studied groups are not homogeneous and most of the studies did not
focused in infertile patients with minimal/mild endometriosis. We propose to evaluate
the presence of IL-18 in serum and peritoneal fluid in infertile women with minimal and
mild endometriosis.
MATERIAL E METHODS
Design
A cross-sectional study was carried out in a total of 56 patients, who were
studied from March 2003 to December 2004 at Hospital de Clinicas de Porto Alegre for
the investigation of infertility or tubal ligation.
Patients
Thirty four patients with minimal or mild endometriosis were submitted to
laparoscopy during the investigation of infertility. The endometriosis was diagnosed
during the laparoscopy and categorized in all patients according to the classification
proposed by the American Society for Reproductive Medicine (ASRM, 1996). The
same investigator carried out all endoscopic procedures. Other causes of infertility
were excluded by hysterossapingography, sperm evaluation, FSH, PRL and TSH on
cycle day 3.
The control group comprised twenty-two patients who underwent laparoscopy
for tubal ligation. None of those patients were diagnosed with endometriosis, being all
of them fertile and healthy patients.
The samples of peritoneal fluid (3mL – 6 mL) were collected during
laparoscopic procedure under general anesthesia, immediately after the introduction of
the second trocar, and the fluid was aspirated from the anterior or posterior peritoneal
deflection. Samples were not collected when the presence of bleeding in the cavity was
detected and we did not wash the peritoneal cavity. The blood samples were collected
during the same anesthetic procedure in all patients. Samples were centrifuged and
stored at -80°C until the dosage time.
Clinical data from the menstrual cycle, obstetric history, previous surgery
procedures and history of hormone use were also obtained by means of appropriate
questionnaire. All patients who accepted to participate signed an informed consent
form. The study was approved by the Ethical Committee of Hospital de Clínicas of
Porto Alegre.
IL-18 dosage
The serum and peritoneal IL-18 dosage was made through a specific kit -
“Human IL-18 Immuno Assay ELISA kit” (MBL Co. Ltd, Nagoya, Japan), with the ability
to particularly detect IL-18 in human secretions with high sensitivity. This essay
sensitivity is 12.5 pg/ml. The minimal detection estimated would be 12.5 pg/ml ± 6.25
pg/ml.
Statistic analysis
Data with non-parametric distribution are described as median values and
confidence interval of 95% and those with parametric distribution as mean and
standard deviation. Student t test was used to compare means, Mann Whitney was
used to compare median values and Spearman test for correlation analysis. When
P<0.05 the samples were considered statistically different.
Sample size was calculated from previously published studies, being power
(Pβ) of 80% and Pα of 5% used (Oku et al, 2004). The number previously calculated
was 50 patients.
RESULTS
Clinical and demographic characteristics of the two groups did not differ. Mean
age and standard deviation found for the group with endometriosis was 31.51 ± 4.54
years and for the control group 34.23 ± 3.56 year (P=0.067). The body mass index
(BMI) did not show differences between the groups either, with mean of 24.21 ± 4.33
for the group with endometriosis and 24.69 ± 1.91 for the control group (P=0.612).
Out of 34 patients with endometriosis, 21 showed mild and 13 minimal
endometriosis.
Table I shows the results of IL-18 in the peritoneal fluid and serum. There was
no significant difference between the studied groups (P>0.05).
We evaluated the correlation between IL-18 in the serum and peritoneal and
found a strong and positive association in the correlation between serum and
peritoneal IL-18 levels (r=0.794, P=0.0001) (figure I).
Likewise, the stage of endometriosis was not associated with the dosages of IL-
18 (serum or peritoneal) (P > 0.05), data not shown.
Moreover, peritoneal fluid IL-18 concentration collected during the luteal phase
was compared to those samples collected during the follicular phase. This comparison
was not different when control group patients was compared with cases (P=0.730) and
also among endometriosis patients (P=0.897).
DISCUSSION
Our study did not find a significant difference between serum and peritoneal
levels of IL-18 in infertile women with minimal and mild endometriosis. These findings
would discard the role of IL-18 in infertile patients with mild/minimal endometriosis.
However, we did find a strong and positive correlation between the dosages of
serum and peritoneal IL-18, probably indicating a systemic immunoregulatory role of Il-
18 and not only a local (peritoneal) production of IL-18.
As seen before, several cytokines were associated with the pathogenesis of
endometriosis (Harada et al, 2001, Bedaiwy et al, 2002). It is believed that alteration in
the immunological system related to retrograde menstruation allowed the
establishment of peritoneal implants that would result in endometriosis. Some studies
suggest that endometriosis would be a kind of auto-immune disease (Dmowski et al,
2004, Arici et al, 2005). In addition, the circulating monocytes in women with
endometriosis show a state of increased activation. Under basal and stimulating
conditions these cells show higher levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 production in relation
to cells of healthy patients (Dmowski et al, 2004).
IL-18, on its turn, has already been studied in relation to several other diseases,
making the research of this interleukin important in patients with endometriosis. This
cytokine has an immunoregulatory function and is predominantly produced by activated
macrophagous. Furthermore, it shares functional properties with IL-12 and structural
similarities with the IL-1 family, its effects being, however, independent from both. IL-18
is capable also of inducing the production of interferon-γ by macrophagous, T
lymphocytes and “natural killer” cells (Blankenberg et al, 2002, Stuyt et al, 2003,
Sheng-Ming et al, 2004, Zhang et al, 2004).
Regarding the effect of menstrual cycle on IL-18 secretion, our results are in
agreement with others that exclude this association. Moreover, the strongly association
between serum and peritoneal IL-18 concentration indicates that the role and secretion
of this interleukin is systemic and not only local (peritoneal). This last finding reinforces
our main conclusion about the role of IL-18 in infertile patients with mild/minimal
endometriosis.
There are nowadays three studies that associate IL-18 dosage in the peritoneal
fluid of patients with endometriosis, with discrepant results (Arici et al, 2003, Oku et al,
2004, Zhang et al, 2004).
The study accomplished by Zhang et al (2004) did not find a correlation
between peritoneal levels of IL-18 and serum concentrations of IL-18. Other studies did
not make this correlation, and this was the reason why we were interested in dosing
both serum and peritoneal IL-18 and estimate its correlation.
Arici et al and Oku et al found high levels of IL-18 in the peritoneal fluids of
women with endometriosis when compared to the group of control patients. Zhang’s
study found, though, reduced levels of IL-18 in the peritoneal fluid of patients with
endometriosis when compared to the group submitted to tubal ligation. We questioned
whether the use of different kits for dosing IL-18 (Bender Medsistems, Sta Cruz
Biotechnology and MBL, Co.) would be one of the reasons for the diverging results
showed in these studies (table II), because the numeric values presented are very
distinct, although the technique presented was the same (ELISA).
When we compare these three studies with our results, the composition of the
study group in which the IL-18 dosage was made is different. We know that the
selection of subjects can interfere in the final result, mainly when one works with new
and variable methods and techniques.
The study of Arici et al associated the group of patients with endometriosis who
had a previous history of treatment for endometriosis with GnRH agonist compared to
patients who had no treatment. We do not know if the use of agonist could not interfere
in the peritoneal fluid, altering the IL-18 dosage result. All previous studies included
patients with endometriosis, including those with pelvic pain and/or infertility.
We only included infertile patients, and this also may be another reason for the
discrepant results between the studies already published and our study. Perhaps it
would be interesting to undertake an IL-18 peritoneal fluid study just in patients with
endometriosis and pelvic pain, for example.
Our study has enough statistic power, as well care in the composition of the
study groups (stages I and II of endometriosis) and the control group (fertile women
without endometriosis) to test the hypothesis of association between IL-18 in the serum
or peritoneal fluid in women with infertility and endometriosis.
Therefore, our objective and main focus was the investigation of mild/minimal
endometriosis and its aspects in infertility. Our research does not discard the IL-18 role
in women with endometriosis and pelvic pain.
In addition, it has been recently demonstrated that patients who are
homozygote for IL-2 and with allele C have a greater susceptibility to the development
of endometriosis. Conversely, the polymorphisms for genes of Il-18 and 12 were not
related with endometriosis. Although not studying only infertile women, those authors
have results that confirm our findings, removing IL-18 from the pathogeny of
endometriosis (Hsieh et al, 2005).
In conclusion, women with minimal or mild endometriosis do not show any
alteration in the concentration of IL-18 in the serum or peritoneal fluid. We can refute
the hypothesis that this interleukin is associated to infertility in women with minimal or
mild endometriosis.
Acknowledgements:
A special thanks to Dr Carmem Pilla and to Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Radioimmunoessay Laboratory.
We also thank HCPA-FIPE for its financial support.
Table I: Results of IL-18 dosages in the peritoneal and serum fluid (expressed
as means and standard deviation).
Endometriosis
n=34
Control
n=22
P
IL-18 in the
peritoneal fluid
(pg/ml)
290.85 ± 173.02 374.21 ± 330.15
0.987
IL-18 serum (pg/ml)
391.07 ± 119.71 373.42 ± 129.11
0.711
Table II: Comparison among IL-18 and endometriosis studies
Reference Cases
and
controls
Kit used Peritoneal fluid IL-
18-endometriosis
(pg/ml)
Peritoneal fluid
IL-18 - control
group (pg/ml)
Zhang et al,
2004
22 / 22 Bender
Medsistems,
144.8
a
653.4
a
Arici et al,
2003.
50 / 18 Santa Cruz
Biotechnology
91.1 ± 6.5
b
59.4 ± 2.0
b
Oku et al,
2004
39 / 19 MBL, Co 592.57 ± 108.27
b
260.50 ± 55.88
b
Glitz et al,
2005
34 / 22 MBL, Co 290.85 ± 173.02
b
374.21 ± 330.15
b
a=median (range)
b=mean ± standard error
Figure I: Correlation of serum IL-18 levels and peritoneal IL-18 levels,
P<0.001, r=0.794.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
IL-18 (pg/ml) in peritoneal fluid
IL-18 (pg/ml) in serum
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peritoneal fluid but not in serum of patients with endometriosis. Fertility and Sterility, 81
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Interleucina-18 não está associada à infertilidade em mulheres com
endometriose mínima ou leve.
C.L. Glitz, J. Azevedo, M. Senger, F.M. Freitas, J.S. Cunha-Filho.
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil, 90035-000.
E-mail para correspondência: [email protected]
RESUMO
INTRODUÇÃO: Endometriose é caracterizada pela presença e crescimento de tecido
endometrial fora do útero, estando associada com infertilidade. Existem evidências
mostrando uma série de alterações imunológicas em mulheres com endometriose e
infertilidade. Dentre as alterações imunológicas, destacamos o papel da IL-18 e a
imunomodulação hormonal. Propomos avaliar a concentração de IL-18 no fluido
peritoneal e sérica em mulheres com endometriose, assim como sua modulação
hormonal, pela dosagem peritoneal de prolactina (PRL), estradiol e progesterona.
MÉTODOS: Realizamos um estudo transversal com 34 pacientes inférteis com
endometriose e 22 pacientes controle. Foram coletadas dosagens sérica de IL-18 e
peritoneal de IL-18, estradiol, prolactina e progesterona. RESULTADOS: Idade e IMC
não se mostraram diferentes entre os grupos (P>0,05). Não houve diferença entre
dosagens de IL-18 no fluido peritoneal e sérica, em mulheres inférteis com
endometriose e férteis submetidas à ligadura tubária: 290,85 ± 46,24 pg/ml x 374,21 ±
88,23 pg/ml e 391,07 ± 31,99 x 373,42 ± 34,5, respectivamente. As dosagens de
estradiol, prolactina e progesterona no fluido peritoneal não foram diferentes entre os
grupos, assim como não houve uma associação destas dosagens e a dosagem de IL-
18 no peritôneo de mulheres inférteis com endometriose (P>0,05). Encontramos uma
associação positiva entre IL-18 sérica e peritoneal nas pacientes com endometriose
(r=0,794, P=0,0001). CONCLUSÃO: Mulheres com endometriose e infertilidade não
apresentam uma alteração no seu fluido peritoneal ou no soro de IL-18, não existe
evidência de que haja alguma modulação hormonal intra-peritoneal de PRL, estradiol
ou progesterona em relação a IL-18. Podemos refutar a hipótese que esta interleucina
esteja associada a infertilidade em mulheres com endometriose mínima ou leve.
Palavras-chave: citoquinas/endometriose/fluido peritoneal/IL-18.
Introdução
A associação de endometriose e infertilidade já é bem conhecida. Uma
estimativa conservadora sugere que em torno de 20-25% das mulheres inférteis
apresentam endometriose (Harada, 2001). Pacientes com endometriose moderada ou
severa apresentam infertilidade secundária à causa anatômica. Entretanto, para
aquelas mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve a causa da infertilidade
não está totalmente esclarecida, envolvendo alterações hormonais, imunológicas,
proliferativas (endometriais) e uterinas (Harada, 2001, Cunha-Filho, 2001, Mahutte,
2002).
Nosso grupo observou que pacientes com endometriose mínima e leve
apresentam alterações na fase folicular precoce caracterizada pela diminuição dos
níveis séricos de estradiol bem como pelo aumento na prevalência de
hiperprolactinemia e insuficiência lútea. Pacientes com endometriose mínima e leve
também teriam uma alteração na secreção de prolactina após estímulo com hormônio
tireotrófico (TRH), (Cunha-Filho, 2000, 2001).
Estudos têm encontrado níveis elevados de inúmeras citoquinas no fluido
peritoneal (FP) de mulheres com endometriose, implicando então essas citoquinas no
desenvolvimento e progressão da endometriose e da infertilidade (Harada, 2001,
Kyama, 2003).
Algumas citoquinas têm sido identificadas no fluido peritoneal por ensaios
altamente sensíveis. As citoquinas encontradas em mulheres com endometriose
incluem: IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, interferon-γ, fator de necrose
tumoral entre outros (Harada, 2001, Bedaiwy, 2002). A expressão anormal de
inúmeras citoquinas pela ativação de macrófagos, como a IL-1, IL-6, IL-8 e TNF, no
fluido peritoneal de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo
controle, pode contribuir para um envolvimento peritoneal, favorecendo a implantação
de células endometriais e o estabelecimento da endometriose (Kyama, 2003).
A IL-18 é uma citoquina que pertence a família da interleucina 1,
originariamente identificada como interferon (IFN)-γ nas células de Kupffer e
macrófagos (Okamura, 1998). Atualmente reconhecida como importante regulador da
resposta imune inata e adquirida. Desde então, as funções imunológicas da IL-18 têm
sido estudadas. A IL-18 ativa células Natural Killer (NK) e apresenta também papel
importante na proteção contra infecções bacterianas. Tem papel central na cascata da
inflamação e no processo de imunidade inata e adquirida em função de sua habilidade
de induzir a produção de IFN- γ em linfócitos T e células NK (Akinori, 2000). A IL-18
atua em sinergia com IL-12 para promover o desenvolvimento da resposta T helper.
Alguns autores já estudaram a associação de IL-18 e endometriose. Arici et al
(2003) encontraram níveis de IL-18 no fluido peritoneal de pacientes com
endometriose tratada significativamente maior do que no grupo controle; resultado
semelhante foi encontrado por Oku et al em 2004 que também realizou análise imuno-
histoquímica. Entretanto, Zhang em 2004 determinou a concentração de IL-18 no
fluido peritoneal e no soro de mulheres com endometriose e comparou ao grupo
controle. A concentração peritoneal de IL-18 estava significativamente mais baixa em
pacientes com endometriose do que no grupo sem endometriose.
Como os resultados na literatura são discordantes, os grupos estudados não
são homogêneos e não existem estudos avaliando o efeito dos hormônios na
concentração de IL-18, propomos avaliar a presença de IL-18 no fluido peritoneal e
sérica em mulheres inférteis com endometriose mínima e leve, bem como dosagens
hormonais de estradiol, prolactina e progesterona no fluido peritoneal.
Material e Métodos
Delineamento
Foi realizado em estudo transversal com um total de 56 pacientes estudadas
no período de março de 2003 a dezembro de 2004, no Serviço de Ginecologia e
Obstetrícia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre para investigação de infertilidade
ou para submeterem-se a ligadura tubária.
Pacientes
Trinta e quatro pacientes com endometriose mínima ou leve foram submetidas
à laparoscopia durante a investigação de infertilidade. A endometriose foi
diagnosticada durante a laparoscopia e categorizada em todas as pacientes segundo
a classificação proposta pela American Society for Reproductive Medicine (ASRM,
1985). Os procedimentos endoscópicos foram realizados pelo mesmo investigador
(CLG).
O grupo controle incluiu vinte e duas pacientes que realizaram laparoscopia
para ligadura tubária. Em nenhuma dessas pacientes foi diagnosticado endometriose e
todas eram pacientes férteis e saudáveis.
As amostras de fluido peritoneal (3mL – 6 mL) foram coletadas durante o
procedimento de laparoscopia sob anestesia geral. Realizou-se a coleta
imediatamente após a introdução do segundo trocar e o fluido foi aspirado do fundo de
saco posterior. Não foram coletadas amostras quando identificada presença de
sangramento na cavidade e não realizamos lavagem da cavidade peritoneal. As
amostras de sangue foram coletadas durante o mesmo procedimento anestésico de
todas as pacientes. As amostras foram centrifugadas e armazenadas a –80°C até o
momento das dosagens.
Dados clínicos, do ciclo menstrual e da história obstétrica também foram
obtidos por meio de questionário apropriado. Todas as pacientes que aceitaram
participar do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido pós-
informação. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de
Porto Alegre.
Dosagem de IL-18
A dosagem de IL-18 sérica e peritoneal foi realizada através de kit específico –
“Human IL-18 Immuno Assay ELISA kit” (MBL Co. Ltd, Nagoya, Japan), com
capacidade de detectar especificamente IL-18 em secreções humanas com alta
sensibilidade. A sensibilidade desse ensaio é de 12,5 pg/ml. A detecção mínima
estimada seria de 12,5 pg/ml ± 6,25 pg/ml.
Dosagens hormonais
Foram realizadas dosagens hormonais de estradiol, prolactina e progesterona
no fluido peritoneal de todas as pacientes. Os hormônios foram analisados usando
kits de quimioluminescência (Immulite Ltd., USA). A maior variação entre os kits foi de
5,45 e 13,3% para a prolactina, 15 a 16% para o estradiol e 13 % para a progesterona.
Não houve reação cruzada significativa entre os hormônios medidos.
Análise estatística
Os dados com distribuição não paramétrica são descritos com valores de
mediana e intervalo de confiança de 95% e os paramétricos com valores da média e
desvio padrão. Teste t foi utilizado para comparações de médias, Mann Whitney para
as medianas e teste de Spearman para análise de correlação. Quando P<0,05 as
amostras foram consideradas diferentes estatisticamente.
O número da amostra foi calculado a partir de estudos publicados
anteriormente, sendo utilizado poder (Pβ) de 80% e Pα de 5% (Oku, 2004). O número
calculado previamente foi de 50 pacientes.
RESULTADOS
As características clínicas e demográficas dos dois grupos não se mostraram
diferentes. A média de idade e desvio padrão encontrada para o grupo com
endometriose foi de 31,51 ± 4,54 anos e para o grupo controle foi de 34,23 ± 3,56
anos (P=0,067). O índice de massa corporal (IMC) também não apresentou diferenças
entre os grupos, com média de 24,21 ± 4,33 para o grupo com endometriose e 24,69 ±
1,91 para o grupo controle (P=0,612).
De um total de 34 pacientes com endometriose, 21 apresentavam
endometriose grau 2 (leve) e 13 com endometriose grau 1 (mínima).
A tabela 1 mostra os resultados da IL-18 no fluido peritoneal e soro, assim
como as dosagens hormonais de prolactina, estradiol e progesterona no fluido
peritoneal. Não houve diferença significativa entre os grupos estudados (P>0,05).
Avaliamos a correlação entre IL-18 no soro e peritoneal e encontramos uma
forte e positiva associação na correlação entre os níveis de IL-18 peritoneal e sérica
(r=0,794, P=0,0001) (figura 1).
Não ficou demonstrada nenhuma correlação entre IL-18 peritoneal e as
dosagens hormonais no fluido peritoneal de prolactina (r=-0,123; P=0,368), estradiol
(r=0,035; P=0,804) ou progesterona (r=0,108; P=0,446).
Da mesma forma, não houve diferença significativa nas dosagens de IL-18
peritoneais e séricas ou hormonais, ao compararmos pacientes com endometriose
mínima e endometriose leve (P > 0,05).
DISCUSSÃO
Nosso estudo não encontrou diferença significativa entre os níveis séricos e
peritoneais de IL-18 em mulheres inférteis com endometriose mínima e leve. Da
mesma forma, não encontramos diferenças significativas entre as dosagens
hormonais (estradiol, prolactina e progesterona) realizadas no fluido peritoneal de
ambos os grupos bem como na correlação com a IL-18 peritoneal. Isso descartaria a
hipótese de modulação hormonal da IL-18 no grupo de pacientes inférteis com
endometriose mínima ou leve.
No entanto, encontramos uma forte e positiva correlação entre as dosagens de
IL-18 sérica e peritoneal, indicando provavelmente uma produção sistêmica
imunorreguladora e não somente produção local (peritoneal) de IL-18 associada a
pacientes inférteis com endometriose.
Como visto anteriormente, várias citoquinas foram associadas com a
patogênese da endometriose (Harada, 2001, Bedaiwy, 2002). Acredita-se que
alterações no sistema imunológico relacionadas à menstruação retrógrada permitiriam
o estabelecimento dos implantes peritoneais que resultariam na endometriose. Alguns
estudos sugerem que a endometriose seria um tipo de doença auto-imune (Dmowski,
2004, Arici, 2005). Em mulheres com endometriose os monócitos circulantes
demonstram um estado de ativação aumentado (visto através de
quimioluminescência). Sob condições basais e de estimulação, estas células
apresentam maiores níveis de produção de TNF-α, IL-6 e IL-8 em relação a células de
pacientes sadias (Dmowski, 2004).
A IL-18, por sua vez, já foi estudada em relação a várias outras doenças, e
assim a busca de sua relação com a endometriose tornou-se importante. Esta
citoquina tem função imunorreguladora e é produzida predominantemente por
macrófagos ativados. Além disso, compartilha propriedades funcionais com a IL-12 e
similaridades estruturais com a família da IL-1, porém seus efeitos são independentes
de ambas. A IL-18 é capaz de induzir a produção de interferon-γ por macrófagos,
linfócitos T e células “natural killer” (Blankenberg, 2002, Stuyt, 2003, Sheng-Ming,
2004, Zhang, 2004).
Existem atualmente três estudos associando a dosagem de IL-18 no fluido
peritoneal de pacientes com endometriose, com resultados discordantes (Arici, 2003,
Oku, 2004, Zhang, 2004).
O trabalho realizado por Zhang et al (2004) não encontrou correlação entre os
níveis peritoneais de IL-18 e as concentrações séricas de IL-18. Os demais trabalhos
não realizaram essa correlação. Por isso tivemos o interesse em dosar tanto a IL-18
sérica como peritoneal e avaliar sua correlação.
Arici et al e Oku et al encontraram níveis elevados de IL-18 no fluido peritoneal
de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo de pacientes controle.
Já o estudo de Zhang et al encontrou níveis reduzidos de IL-18 no fluido peritoneal de
pacientes com endometriose quando comparadas àquele grupo submetido à ligadura
tubária. Questionamos se o uso de diferentes kits para dosagem de IL-18 (Bender
Medsistems, Sta Cruz Biotechnology e MBL, Co.) seria um dos motivos para os
resultados divergentes apresentados nesses estudos (tabela 2). Em nosso trabalho
utilizamos o kit de IL-18 humana ELISA fornecido pela MBL Co. Ltd, Nagóia, Japão.
Pois os valores numéricos apresentados são bastante distintos, embora a técnica
empregada seja a mesma (ELISA).
Um outro fator importante a ser levado em consideração quando comparamos
esses três trabalhos com os nossos resultados é a composição de grupo de pacientes
em que foi realizada a dosagem de IL-18. Sabemos que a escolha das pacientes pode
interferir bastante no resultado final, principalmente quando trabalhamos com métodos
e técnicas novas e com grande variabilidade.
O trabalho de Arici et al associou no grupo endometriose pacientes com
história de tratamento prévio para endometriose com agonista GnRH às pacientes sem
tratamento. Não sabemos se o uso de agonista não poderia interferir no fluido
peritoneal, alterando o resultado da dosagem de IL-18. Todos os trabalhos incluíram
pacientes com diagnóstico de endometriose independentemente do motivo para
realização da laparoscopia, isso inclui pacientes com infertilidade e pacientes com
queixa de dor pélvica.
Em nosso trabalho utilizamos somente aquelas pacientes com história de
infertilidade, podendo esse ser um outro motivo para os resultados discordantes entre
os estudos já publicados e nosso trabalho. Talvez futuramente seja interessante
realizar um estudo de IL-18 no fluido peritoneal somente em pacientes com
endometriose e dor pélvica para podermos fazer essa comparação.
Nosso estudo apresentou poder estatístico suficiente, assim como cuidado na
composição dos grupos em estudo (somente mulheres com estágio I e II de
endometriose) e controle (mulheres comprovadamente férteis sem endometriose) para
testar a hipótese da associação da IL-18 no soro ou fluido peritoneal, assim como a
modulação hormonal da IL-18 em mulheres com infertilidade e endometriose.
Portanto, nosso objetivo e foco principal do estudo foi a investigação da
endometriose em mulheres inférteis. Isso não descarta que em mulheres com
endometriose e dor pélvica anormalidades na IL-18 não possam estar associadas ao
líquido peritoneal, diferente dos autores anteriores (Arici, 2003, Oku, 2004, Zhang,
2004).
Alguns estudos atuais falam em modulação hormonal e citoquinas em
pacientes com endometriose. Arici et al em 2005 mostraram pela primeira vez que os
esteróides sexuais são capazes de regular a secreção da IL-8 e sua transcrição em
células endoteliais endometriais in vitro, sugerindo um novo papel dessas células na
fisiopatologia da endometriose (Arici, 2005). Não encontramos em nosso estudo
diferenças entre as dosagens hormonais no fluido peritoneal de pacientes com
endometriose bem como não encontramos correlação da PRL, estradiol e
progesterona com IL-18 peritoneal.
Recentemente, foi demonstrado que pacientes homozigotos para IL-2 e com o
alelo C tem maior suscetibilidade ao desenvolvimento de endometriose, ao contrário
da pesquisa de polimorfismos para os genes das IL-18 e IL-12. Estes autores, embora
não estudassem apenas mulheres inférteis tem resultados que corroboram com
nossos achados, refutando a IL-18 da patogênese da endometriose (Hsieh, 2005).
Como existe uma série de anormalidades hormonais descritas em mulheres
com endometriose (Cunha-Filho, 2000, 2001, 2002) fica evidente que futuramente,
possamos esclarecer melhor o papel da imunomodulação na endometriose.
Em conclusão, mulheres com endometriose mínima ou leve e infertilidade não
apresentam uma alteração no fluido peritoneal ou no soro de IL-18. Não
demonstramos também alguma evidência de que exista modulação hormonal intra-
peritoneal de PRL, estradiol ou progesterona em relação a IL-18. Podemos refutar a
hipótese que esta interleucina esteja associada à infertilidade em mulheres com
endometriose mínima ou leve.
Agradecimentos:
Agradecimento especial a Dra. Carmem Pilla e laboratório de
Radioimunoensaio do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
À FIPE pelo auxilio financeiro.
Tabela 1: Resultados das dosagens de IL-18 no fluido peritoneal e sérica e das
dosagens hormonais no fluido peritoneal, médias e desvio padrão.
Endometriose
n=34
Controle
n=22
P
IL-18 no fluido
290,85 ± 173,02 374,21 ± 330,15
0,987
peritoneal (pg/ml)
IL-18 sérica (pg/ml)
391,07 ± 119,71 373,42 ± 129,11
0,711
Estradiol*
217,94 ± 105,18 333,09 ± 167,86
0,256
Prolactina*
17,23 ± 2,13 25,22 ± 5,19
0,158
Progesterona*
24,57 ± 20,61 50,60 ± 29,61
0,111
* Resultados referentes à dosagem no fluido peritoneal
Tabela 2: comparação entre os estudos com IL-18 e endometriose
Referência Casos e
controles
Kit utilizado IL-18 peritoneal
endometriose
(pg/ml)
IL-18 peritoenal
- grupo controle
(pg/ml)
Zhang et al,
2004
22 / 22 Bender
Medsistems,
144,8
a
653,4
a
Arici et al,
2003.
50 / 18 Santa Cruz
Biotechnology
91,1 ± 6,5
b
59,4 ± 2,0
b
Oku et al,
2004
39 / 19 MBL, Co 592,57 ± 108,27
b
260,50 ± 55,88
b
Glitz et al,
2005
34 / 22 MBL, Co
290,85 ± 173,02
c
374,21 ± 330,15
c
a=mediana (range)
b=média ± erro padrão
c=média ± desvio padrão
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
IL-18 (pg/ml) no fluido peritoneal
IL-18 (pg/ml) no soro
Figura 1 : Correlação de IL-18 sérica e peritoneal, P<0,001, r=0,794.
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peritoneal fluid but not in serum of patients with endometriosis. Fertil Steril, 81 (5),
1229-1234, 2004.
7. CONCLUSÕES
A dosagem de IL-18 no fluido peritoneal e sérica não se mostrou diferente
quando comparado o grupo controle (mulheres férteis sem endometriose) ao grupo de
mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve.
As dosagens hormonais de prolactina, progesterona e estradiol no fluido
peritoneal não foram diferentes quando comparamos o grupo de mulheres inférteis
com endometriose mínima ou leve ao grupo controle.
Existe uma forte e positiva associação entre IL-18 sérica e peritoneal,
demonstrada pelos testes de correlação em mulheres inférteis com endometriose
mínima e leve.
Não existe correlação das dosagens peritoneais de prolactina, estradiol e
progesterona, quando correlacionadas aos valores de IL-18 peritoneal em mulheres
inférteis com endometriose mínima ou leve.
Em conclusão, mulheres com endometriose mínima ou leve e infertilidade não
apresentam uma alteração no fluido peritoneal ou no soro de IL-18. Não
demonstramos também alguma evidência de que exista modulação hormonal intra-
peritoneal de PRL, estradiol ou progesterona em relação a IL-18. Podemos refutar a
hipótese que esta interleucina esteja associada à infertilidade em mulheres com
endometriose mínima ou leve.
8. PERSPECTIVAS
Novos estudos podem ser realizados para avaliar o papel da IL-18 em
mulheres com endometriose e dor pélvica isoladamente, pois os trabalhos atuais
enfocam mulheres inférteis.
Novas citoquinas ainda poderão ser estudas em mulheres com endometriose
na tentativa de encontramos ou desvendarmos a fisiopatologia dessa doença.
Os estudos com marcadores séricos para endometriose ainda poderão ser
realizados, com o objetivo de encontrarmos uma maneira de diagnosticar
endometriose sem necessidade de expor a paciente a um procedimento cirúrgico.
9. ANEXOS
Classificação de endometriose mediante visualização dos implantes pela
laparoscopia (ASRM 1985).
PROTOCOLO DE PESQUISA
Nome:________________________________________________________________
__
Prontuário:________________________
Idade:________________
Paridade:_____________
Peso:________
Altura:________
IMC (Kg/m
2
):________________
DUM:_____________
Submetida a videolaparoscopia em _______________________ (___) CCA (___)
BC
Motivo da videolaparoscopia: LT (___) Dor pélvica (___) Infertilidade (___)
Endometriose: I (___)
II (___)
III (___)
IV (___)
MAC:____________________________________________
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO.
Gostaríamos de convidá-la para participar do estudo “Concentração sérica e
peritoneal da IL-18 em mulheres com endometriose”, tendo como objetivo principal
a realização de um trabalho científico para a avaliação da interleucina-18 (um
marcador de inflamação) no líquido peritoneal e sanguínea.
A realização de laparoscopia faz parte de sua investigação de dor ou
infertilidade e a chance de ocorrer alguma complicação é de 3 para 1033 exames
realizados. A senhora receberá uma avaliação pré-operatória cuidadosa antes de
submeter-se à laparoscopia sob anestesia geral.
O procedimento de acompanhamento da endometriose será absolutamente
igual a rotina já estabelecida, tanto para controle de dor como para infertilidade e a
Senhora não corre nenhum risco adicional.
Estes exames e testes fazem parte de sua investigação usual. Todavia
estaremos realizando coletas de sangue durante o procedimento anestésico e a coleta
de líquido peritoneal será realizada durante o procedimento cirúrgico, sem que a
senhora tenha nenhum tipo de desconforto.
Eu,__________________________________________________, fui
informada dos objetivos especificados acima e da justificativa desta pesquisa, de
forma clara e detalhada. Recebi informações específicas sobre cada procedimento no
qual estarei envolvida, dos desconfortos ou riscos previstos, tanto quanto dos
benefícios esperados. Todas as minhas dúvidas foram respondidas com clareza e sei
que poderei solicitar novos esclarecimentos a qualquer momento. Além disto, sei que
novas informações, obtidas durante o estudo, me serão fornecidas e terei liberdade de
retirar meu consentimento de participação na pesquisa, frente a estas informações.
O profissional _________________________________________________,
certificou-me de que as informações por mim fornecidas terão caráter confidencial.
Fui informada que caso existam danos à minha saúde, causados diretamente
pela pesquisa, terei direito a tratamento médico e indenização conforme estabelece a
lei. Também sei que caso existam gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo
orçamento da pesquisa.
ASSINATURA DA
PACIENTE:______________________________________________
ASSINATURA DO
INVESTIGADOR:_________________________________________
ASSINATURA DO
ORIENTADOR:___________________________________________
DATA: _________________________
Pesquisadores responsáveis: Cristina Luce Glitz e João Sabino Cunha-Filho
Telefone para contato e dúvidas: 3316-8117 / 9835-4647
Printed: February 10, 1999
Revised: July 19, 1999
For research use only. Not for use in diagnostic procedure.
Quantitative test kit for Human IL-18
Human IL-18 ELISA Kit
CODE .No. 7620
CONTENTS
1. Intended Use -------------------------------------------- 1
2. Summary and Explanation----------------------------- 1
3. Principle ------------------------------------------------ 2
4. Materials provided ------------------------------------- 2
5. Materials and equipment required -------------------- 2
6. Procedure ------------------------------------------------ 3
7. Precaution ----------------------------------------------- 5
8. Storage and Stability ----------------------------------- 6
9. Performance Characteristics --------------------------- 7
10. References ---------------------------------------------- 9
Before use, thoroughly read these Instructions.
Intended Use
The Human IL-18 ELISA Kit is based on sandwich ELISA and capable of measuring
human
IL-18.
For research use only. Not for use in diagnostic procedures.
Summary and Explanation
Interleukin 18 (IL-18) is a 18 kDa novel cytokine which is identified as a costimulatory
factor for
production of interferon-(IFN- ) in response to toxic shock. It shares functional
similarities
with IL-12. IL-18 is synthesized as a precursor 24 kDa molecule without a signal
peptide and
must be cleaved to produce an active molecule. IL-1 ß converting enzyme (ICE,
Caspase-1)
cleaves pro-IL-18 at aspartic acid in the P1 position, producing the mature, bioactive
peptide that
is readily released from the cells. It has been reported that IL-18 is produced from
Kupffer cells,
activated macrophages, keratinocytes, intestinal epithelial cells, osteoblasts, adrenal
cortex cells
and murine diencephalon.
IFN- is produced by activated T and NK cells and plays critical roles in the defense
against
micribiral pathogens. IFN- activates macrophages, enhances NK activity and B cell
maturation,
proliferation and Ig secretion, induces MHC class I and II antigens expression, and
inhibits
osteoclast activation.
IL-18 acts on T helper 1-type T (Th1) cells and in combination with IL-12 strongly
induces
production of IFN- by these cells. Pleiotropic effects of IL-18 have also been reported,
including enhancement production of IFN- and GM-CSF in peripheral blood
mononuclear
cells, production of T helper type 1 cytokines, IL-2, GM-CSF and IFN-in T cells,
enhancement
of Fas ligand expression by T helper type 1 cells.
"Human IL-18 ELISA Kit " is the reagent for measuring human IL-18 specifically with
high
sensitivity by ELISA.
1 ng/mL of various cytokines, such as human IFN-, IFN-, IL-1ß, IL-4, IL-5, IL-6, IL-
10,
IL-12, GM-CSF and murine IL-18 were measured by this ELISA. The results were all
bellow
the detection limit of 12.5 pg/mL.
-1-
Principle
The Human IL-18 ELISA Kit measures human IL-18 by sandwich ELISA. The assay
uses two
monoclonal antibodies against two different epitopes of human IL-18.
In the wells coated with anti-human IL-18 monoclonal antibody, samples to be
measured or
standards are incubated. After washing, a peroxidase conjugated anti-human IL-18
monoclonal
antibody is added into the microwell and incubated. After another washing, the
peroxidase
substrate is mixed with the chromogen and allowed to incubate for an additional period
of time.
An acid solution is then added to each well to terminate the enzyme reaction and to
stabilize the
developed color. The optical density (O.D.) of each well is then measured at 450 nm
using a
microplate reader. The concentration of human IL-18 is calibrated from a dose
response curve
based on reference standards.
Materials provided
Each kit contains;
Materials Quantity (96wells)
Microwell strips coated with anti-Human IL-18 antibody 8-well strip x 12strips
Human IL-18 calibrator (Lyophilyzed) 2 vials
Conjugate reagent (Peroxidase conjugate anti-Human IL-18
monoclonal antibody ) (x 101)
0.2 mL x 1vial
Conjugate diluent (ready to use) 24 mL x 1vial
Assay diluent (ready to use) 30 mL x 1vial
Wash concentrate (x10) 100 mL x 1vial
Substrate reagent (TMB/H2O2) (ready to use) 15 mL x 1vial
Stop solution (2N H2SO4) (ready to use) (irritant) 18 mL x 1vial
Materials and equipment required
* Microplate reader
* Plate washer or washing bottle
* Adjustable micropipette
* Multichannel micropipette
* 96-well polyvinyl plate
* Microplate holder
* Uncoated microwell strips (for using Auto washer)
* Reagent vessel
* Distilled water
-2-
Procedure
Preparation of Reagents
1. Wash solution
Dilute 100 mL of wash concentrate with 900 mL of distilled water. The diluted wash
solution is stable for 2 weeks at 4°C.
2. Conjugate solution
Peroxidase conjugated anti-human IL-18 monoclonal antibody must be diluted prior to
use.
Dilute the Peroxidase conjugated anti-human IL-18 monoclonal antibody 1:101 with
Conjugate diluent.e.g. by adding 10 µL of the Peroxidase conjugated anti-human IL-18
monoclonal antibody to 1,000 µL of the Conjugate diluent.
* Prepare only a sufficient amount of the conjugate solution for the assay because the
diluted
conjugate is not stable.
* Use disposable new pipette and vessel to avoid contamination of microbe.
3. Standards
Reconstitute with the volume of Assay diluent, and dilute the reconstituted calibrator as
indicated "Preparation of Standards" .
* If reconstituted calibrator is needed to store, prepare appropriate aliquots and freeze
them below -20°C. Avoid repeated freezing and thawing.
4. Other reagents (microwell strips coated with anti-human IL-18 antibody,
Conjugate diluent, Assay diluent, Substrate reagent and Stop solution) are
ready-to-use.
Preparation of samples
1. Sample type
Serum and EDTA plasma can be used.
Appropriate specimen collection and preparation should be established by each
investigator
for other biomedical fluid.
2. Dilution
Dilute each sample with Assay diluent.
e.g. Human Serum or EDTA Plasma
1:5 with Assay diluent e.g. by adding 50 L of sample to 200 L Assay diluent.Sample
dilution may vary between different specimens. Appropriate sample dilution should be
established by each investigator.
3. Storage
Fresh samples should be used. Aliquote each sample into new plastic tube and store
below
-20°C if necessary. Avoid repeated fleezing and thawing.
STEP 1. (Sample incubation)
Duplicate assay will be recommended.
-3-
1) Add 150 µL of prepared samples and standards to 96-well polyvinyl plate as the
same
order of assay run. Then, transfer 100 µL of each sample to the antibody coated
microwell
simultaneously using multichannel pipette.
* Reaction starts on pipetting to the antibody coated microwell. Pipetting should be
completed as quickly as possible.
2) Incubate for 60 minutes at room temperature (20 - 25°C) .
STEP 2. (Washing)
Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash solution and then
completely
aspirate or discard the contents. Wash the well 4 times with wash solution using
washing
bottle. When autowasher is used, wash 4 times.
* Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing times and
set-up.
* Washing buffer should be used at room temperature (20 - 25°C) .
STEP 3. (Conjugate incubation)
1) Pour conjugate solution into the vessel. After removing wash solution remained
completely, pipette 100 µL of Conjugate solution to each well with multichannel pipette.
2) Incubate for 60 minutes at room temperature (20 - 25°C) .
STEP 4. (Washing)
Wash the microplate again following the STEP 2 procedure.
STEP 5 (Substrate incubation)
1) Pour substrate reagent into the vessel. Add 100 µL of prepared substrate reagent to
each
well.
* Substrate reagent should be used at room temperature (20 - 25°C) .
* This vessel should be different from the one which was used for pouring conjugate
solution.
* Use disposable new pipette and vessel, as substrate reagent is easy to be oxidized
by metal
ions and be contaminated by microbe.
* If substrate reagent is pourd into the vessel from the bottle, do not return to the bottle.
2) Incubate for 30 minutes at room temperature (20 - 25°C).
STEP 6. (Stopping reaction)
Pour Stop solution into the vessel. Pipette 100 µ L of stop solution to each well with
multichannel pipette.
Reading
Read the absorbance of each well at 450 nm. If a dual wavelength plate reader is
available,
-4-
set the test wave length at 450 nm and the reference at 620 nm.
* Reading should be done within 30 minutes after Stopping reaction.
Calculation of results
Calculate the mean absorbance value of each standard. Plot on the semi-log graph
paper and
construct a standard curve [Absorbance on the vertical axis, concentration (in pg/mL)
on the
horizontal axis].
Report the IL-18 concentration of samples by multiplying the value read from the
standard
curve by dilution factor (e.g. Human sera; x 5).
* If absorbance of sample exceeds the one of the 1,000 pg/mL standard, dilute the
sample
and measure again.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
10 100 1000
IL-18 concentration (pg/mL)
absorbance at 450 nm
Exanple of Standard curve
Concentration of Human IL-18 in normal sera
Serum samples from 46 healthy blood donors were assayed by the Human IL-18
ELISA
Kit . The results were as follows.
maximum = 257.8 pg/mL
minimum = 36.1 pg/mL
mean = 126.0 pg/mL
SD = 44.5 pg/mL
mean+3SD = 259.4 pg/mL
-5-
Precaution
1. Allow all the components to come to room temperature (20 - 25°C) before use.
2. All microwell strips which are not immediately required should be returned to the
ziplock
pouch, which must be carefully resealed to avoid moisture absorption.
3. Fresh samples should be used. Aliquote each sample and store below -20°C if
necessary.
Avoid repeated freezing and thawing. Never store the samples at 4°C, as samples are
affected
by storage of this temperature.
4. When Wash concentrate is stored at 2 - 8oCsome precipitation or turbidity may
appear.
However it does not affect the reagent efficiency. Dissolve the wash concentrate
completely
when prepare the wash solution.
5. Assay diluent and Human IL-18 calibrator contain sodium azide (0.1%) as
preservative.
Azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azide.
Therefore, always flush with plenty of water into a drain when disposing materials
containing azide.
6. Stop solution is 2N sulfuric acid. As it is corrosive product, protect eyes and skin and
handle with care.
7. This kit is intended for research use only. Not for use in diagnostic
procedure.
Storage and Stability
All kit components must be stored at 2-8 °C. All reagents are stable for 6 months after
manufacturing when stored at the conditions indicated.
-6-
Performance Characteristics
Sensitivity
The sensitivity of the assay is 12.5 pg/mL.
The minimum detection limit estimated by serial dilution was 12.5 pg/mL since the
mean +2
S.D. of the 6.25 pg/mL was lower than the mean -2 S.D. of the 12.5 pg/mL.
Reproducibility
1. Intra-assay
Intra-assay reproducibility was determined by assaying the sera 8 times.
IL-18 concentrations of the serum samples were calculated as described in calculation
of
results in assay procedure.
Sample serum1 serum2 serum3 serum4 serum5
Number of determinations 8 8 8 8 8
Mean (pg/mL) 2765.5 600.7 345.5 136.1 69.7
C.V. (%) 5.03 4.93 10.80 5.61 9.92
2. Inter-assay
Inter-assay reproducibility was determined by 5 independent assays of the sera.
IL-18 concentrations of the serum samples were calculated as described in calculation
of
results in assay procedure.
Sample serum1 serum2 serum3 serum4 serum5
Number of determinations 6 6 6 6 6
Mean (pg/mL)* 2621.1 773.2 615.1 236.4 160.1
C.V. (%) 10.07 8.54 5.21 7.60 6.25
*From six (6) replicates of each serum sample in five (5) separate assays.
-7-
Recovery test
Recombinant human IL-18 was added to samples at different concentrations.
IL-18 concentrations of the serum samples were calculated as described in calculation
of results
in assay procedure.
Serum 1
(A) (B) (B/A)
Additional rhIL-18*
(pg/mL)
IL-18 concentration
observed (pg/mL) Recovery (pg/mL) Recovery (%)
0.0 940.8 - -
684.9 1583.0 642.2 94
1346.9 2179.0 1238.2 92
2354.1 3528.7 2587.9 110
*rhIL-18 is abbreviation of recombinant human IL-18.
Serum 2
(A) (B) (B/A)
Additional rhIL-18*
(pg/mL)
IL-18 concentration
observed (pg/mL) Recovery (pg/mL) Recovery (%)
0.0 868.9 - -
684.9 1418.6 549.8 80
1346.9 2035.9 1167.0 87
2354.1 3431.3 2564.2 109
*rhIL-18 is abbreviation of recombinant human IL-18.
Serum 3
(A) (B) (B/A)
Additional rhIL-18*
(pg/mL)
IL-18 concentration
observed (pg/mL) Recovery (pg/mL) Recovery (%)
0.0 629.3 - -
684.9 1334.7 705.4 103
1346.9 1913.4 1284.1 95
2354.1 3282.3 2653.1 113
*rhIL-18 is abbreviation of recombinant human IL-18.
-8-
Dilution test_
Sample was diluted with Assay diluent.
Each serum sample was serially diluted from 1/1 to 1/32 with Assay diluent, then IL-18
concentrations of the serum samples were calculated as described in calculation of
results in
assay procedure.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Dilution
conc. (pg/mL)
Serum1
Serum2
Serum3
1 1/2 0
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Okamura H., et al. Nature 378, 88-91 (1995)
Ushio S., et al. J. Immunol. 156, 4274-4279 (1996)
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MBL is an exclusive licensee ( in research field ) of the patents owned by
Hayashibara Biochemical Labs., Inc.
-9-
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
5F Sumitomoshoji Marunouchi Bldg., 5-10 Marunouchi 3 chome, Naka-ku, Nagoya
460-0002 Japan
Tel. (052)971-2081 Fax. (052)971-2337
Método: Quimiluminescente (Sistema IMMULITE)
Linha: Fertilidade
Produto Genérico: Estradiol
Produto Específico: Estradiol IMMULITE 2000
O Estradiol IMMULITE 2000 é um ensaio em fase sólida, com dois sítios, tipo enzima-
imunométrico, quimiluminescente, para ser usado com Analisador Automatizado
Immulite 2000, desenvolvido para a determinação quantitativa do estradiol no soro. É
estritamente produzido para diagnóstico in vitro, usado como um testes conjunto
auxiliar na avaliação dos pacientes com várias desordens dos hormônios sexuais.
Princípios do Procedimento
Imunoensaio Competitivo
Ciclos de Incubação: 2 ciclos de 30 minutos cada.
Automação
O sistema IMMULITE 2000 automaticamente manuseia a amostra, as adições de
reagentes, os passos de incubação, separação e a mensuração da emissão de fótons
pelo luminômetro com temperatura controlada. O sistema calcula os resultados dos
testes para amostras dos pacientes e controles em função do sinal observado, usando
uma curva padrão armazenada. Gera um relatório impresso que inclui todas as demais
informações dos pacientes previamente inseridas via computador.
Faixa de Calibração
O kit de Estradiol IMMULITE 2000, possui uma faixa de calibração de 20 a 2.000 pg/ml
(73 a 7.342 pmol/ml).
Coleta do material
O paciente não necessita estar em jejum e nenhuma preparação especial é
necessária. Coletar o sangue por punção venosa, evitando-se a hemólise, em tubos
comuns (sem anticoagulante), anotando-se a hora da coleta e separar o soro das
células. Para punção venosa, ver documento do NCCLS H3-A3, 1991. Nem a
bilirrubina ou a hemólise possuem qualquer efeito clinicamente significante no ensaio
de Estradiol IMMULITE 2000. No entanto as amostra hemolisadas podem indicar um
mal tratamento dos espécimes antes da sua recepção pelo Laboratório; daí estes
resultados devem ser interpretados com cautela. Recomenda-se o uso de
ultracentrífuga para a clarificação de amostras lipêmicas.
Sensibilidade Analítica: 10 pg/ml (37 pmol/l).
Volume Utilizado
Uma única determinação utiliza 25 µl de soro.
Valores Esperados
Baseado na sua relação com o kit de Estradiol IMMULITE da DPC (ver método de
comparação), do procedimento de Estradiol IMMULITE 2000, pode-se esperar possuir
essencialmente as mesmas faixas de referências. As faixas de referências foram
geradas usando-se o estradiol IMMULITE em um estudo multinacional, envolvendo
mulheres aparentemente saudáveis (idade: 16 - 44 anos), voluntárias e que tiveram
suas amostras de sangue coletadas em base diária, ao longo de um ciclo ovulatório
completo.
Estradiol em pg/ml
CICLOS OVULATÓRIOS n* MEDIANA
CENTRAL
95%
Fase Folicular 54 (708) 42 ND - 160
Fase Folicular Dias 2 ao 3 54 (108) 31 ND - 84
Perí Ovulatório +- 3 dias 54 (378) 133 34 - 400
Fase Lutea 54 (604) 93 27 - 246
*Número de indivíduos (número total de resultados)
Estradiol em pmol/l
CICLOS OVULATÓRIOS n* MEDIANA
CENTRAL
95%
Fase Folicular 54 (708) 154 ND - 587
Fase Folicular Dias 2 ao 3 54 (108) 114 ND - 308
Perí Ovulatório +- 3 dias 54 (378) 489 124 - 1468
Fase Lutea 54 (604) 343 101 - 905
*Número de indivíduos (número total de resultados) Um outro estudo realizado pelo
Estradiol IMMULITE gerou os seguintes resultados :
Estradiol em pg/ml
GRUPO n MEDIA MEDIANA
FAIXA DE
90%
Homens Adultos
50 30.5 29.7 ND - 56
Mulheres Adultas
Pós Menopausa
Não Tratada
27 ND ND ND - 30
Mulheres Adultas
Pós Menopausa
Tratada
27 ND ND ND - 93
Contraceptivos
Orais
61 35.2 24.5 ND - 102
ND - Não Detectável
Estradiol em pmol/l
GRUPO n MEDIA MEDIANA
FAIXA DE
90%
Homens Adultos
112 109 ND - 206
Mulheres Adultas
27 ND ND ND - 110
Mulheres Adultas
27 ND ND ND - 341
Contraceptivos
Orais
61 129 90 ND - 374
ND - Não Detectável
Os valores aqui tabulados são consistentes com o padrão geral de estradiol através da
fase ovulatória. Esta faixa de referência com os limites aqui sugeridos por este estudo,
devem ser tomados apenas como orientação. Devido as diferenças que podem existir
entre laboratórios e localidades com respeito a população, técnica laboratorial e
seleção de grupos de referência, é importante que cada laboratório estabeleça seus
próprios limites de referência para avaliação diagnóstica dos resultados dos pacientes.
Limitações
Amostras de gestantes - cuidados devem ser tomados quando ensaiar amostras de
gestantes para estradiol, pois o nível de estriol em circulação pode estar alto suficiente
para interferir.
Amostras de recém-nascidos - O procedimento Estradiol IMMULITE 2000 não foi
validado para ensaiar amostras de recém-nascidos: esteróides com reatividade
cruzada, incluindo o estriol, circulando em altas concentrações durante este período
podem causar resultados elevados espúrios.
PIL2KE2-3
Método: Quimiluminescente (Sistema IMMULITE)
Linha: Fertilidade
Produto Genérico: Progesterona
Produto Específico: Progesterona IMMULITE 2000
O Progesterona IMMULITE 2000 é um ensaio em fase sólida, tipo enzimaimunoensaio
quimiluminescente, para ser usado com Analisador Automatizado Immulite 2000,
desenvolvido para a determinação quantitativa da progesterona, no soro. É
estritamente produzido para diagnóstico in vitro, usado como um teste auxiliar na
diagnóstico e tratamento de desordens dos ovários e placenta.
Princípios do Procedimento
Imunoensaio Competitivo Sequencial
Ciclos de Incubação : 2 ciclos de 30 minutos cada.
Automação
O sistema IMMULITE 2000 automaticamente manuseia a amostra, as adições de
reagentes, os passos de incubação, separação e a mensuração da emissão de fótons
pelo luminômetro com temperatura controlada. O sistema calcula os resultados dos
testes para amostras dos pacientes e controles em função do sinal observado, usando
uma curva padrão armazenada. Gera um relatório impresso que inclui todas as demais
informações dos pacientes previamente inseridas via computador.
Faixa de Calibração
O kit de Progesterona IMMULITE 2000, possui uma faixa de calibração de 0,2 a 40
ng/ml (0.6 a 127 nmol/l)
Coleta do Material
O paciente não necessita estar em jejum e nenhuma preparação especial é
necessária. Coletar o sangue por punção venosa, evitando-se a hemólise, em tubos
comuns (sem anticoagulante), anotando-se a hora da coleta e separar o soro das
células. Para punção venosa, ver documento do NCCLS H3-A3, 1991. Recomenda-se
o uso de ultracentrífuga para a clarificação de amostras lipêmicas.
Volume Utilizado
Uma única determinação utiliza 50µl de soro.
Sensibilidade Analítica : 0.2 ng/ml (0.6 nmol/l)
Valores Esperados
Baseado em sua relação com o kit de Progesterona IMMULITE da DPC, as seguintes
faixas de referência foram estabelecidas para o procedimento do kit Progesterona
IMMULITE 2000, em ng/mL e nmol/L.
As faixas de referências foram geradas usando-se o kit de Progesterona IMMULITE
em um estudo multinacional envolvendo mulheres em aparente bom estado de saúde
(idade 16-44 anos), voluntárias, e tiveram amostras coletadas em base diária ao longo
de um ciclo ovulatório completo.
Progesterona em ng/ml
Ciclos Ovulatórios N* Mediana Central 95%
Fase Folicular 54 (762) 0.8 0.32 - 2.0
Meio de Ciclo 54 (54) 1.4 0.77 - 2.3
Fase Lutea 54 (658) 8.7 1.19 - 21.6
Meio de Fase Lutea
Dias 7 a 8 54 (108) 13.0 4.4 - 28
5 a 6 dias antes da menstruação 54 (108) 11.6 4.4 - 21
N*- Número de Indivíduos (Número Total de Resultados)
Progesterona em ng/ml
Ciclos Ovulatórios N* Mediana Central 95%
Fase Folicular 54 (762) 2.4 1.0 - 6.3
Meio de Ciclo 54 (54) 4.5 2.5 - 7.4
Fase Lutea 54 (658) 28 3.8 - 69
Meio de Fase Lutea
Dias 7 a 8 54 (108) 41 13.9 - 90
5 a 6 dias antes da menstruação 54 (108) 37 14.1 - 66
N*- Número de Indivíduos (Número Total de Resultados)
Um outro estudo realizado com a Progesterona IMMULITE® gerou os seguintes
resultados :
Progesterona em ng/ml
Unidade de Massa ( nmol/l) Mediana Faixa Absoluta N
Homens
0.52 0.27 - 0.90 63
Mulheres
Fase Folicular 0.67 0.33 - 1.2 29
Fase Lutea 4.8 0.72 - 17.8 29
Pós Menopausa 0.36 ND - 1.0 34
Contraceptivos Orais 0.70 0.34 - 0.92 19
Mulheres Grávidas
Primeiro Trimestre 22.2 9.3 - 33.2 28
Segundo Trimestre 35.4 29.5 - 50.0 18
Terceiro Trimestre 102 83.1 - 160 8
Um outro estudo realizado com a Progesterona IMMULITE® gerou os seguintes
resultados :
Progesterona em ng/ml
Unidades S.I ( nmol/l) Mediana Faixa Absoluta N
Homens
1.7 0.86 - 2.9 63
Mulheres
Fase Folicular 2.1 1.0 - 3.8 29
Fase Lutea 2.3 2.3 - 56.6 29
Pós Menopausa 1.1 ND - 3.2 34
Contraceptivos Orais 2.2 1.1 - 2.9 19M
Mulheres Grávidas
Primeiro Trimestre 70.6 29.6 - 106 28
Segundo Trimestre 113 93.8 - 159 18
Terceiro Trimestre 324 264 - 509 8
ND - Não Detectável
Na gravidez, a tendência geral é de um aumento de valores. Há uma variação
interpessoal considerável nos valores de progesterona, particularmente nos grupos
associados com níveis elevados (notar que a mensuração do nível de progesterona é
geralmente considerado inadequado para a monitoração do bem estar fetal nas
últimas semanas de gravidez). Um estudo de valores em "fertilidade" pediátrica
realizado com a progesterona IMMULITE® em uma Clínica dos EUA, gerou os
seguintes resultados :
Progesterona em ng/ml
GRUPO IDADE(Anos) N MEDIANA CENTRAL 95%
Mulheres Cordão 27 570 485 - 755
0.1 - 0.4 24 1.2 0.25 - 17.0
0.5 - 1.0 19 0.8 0.2 - 1.6
1.1 - 9.0 38 0.4 ND - 1.4
Cordão 27 520 345 - 650
0.1 - 0.4 33 1.5 0.3 - 14.0
0.5 - 1.0 33 1.5 ND - 2.0
Homens
1.1 - 9.0 42 0.4 ND - 1.3
Cordão 54 550 350 - 750
0.1 - 0.4 57 1.5 0.25 - 17.0
0.5 - 1.0 33 0.8 ND - 2.0
Combinado
1.1 - 9.0 38 103 ND - 4.5
ND - Não Detectável
Progesterona em ng/ml
GRUPO IDADE(Anos) N MEDIANA CENTRAL 95%
Cordão 27 1813 1479 - 2401
0.1 - 0.4 24 3.8 0.8 - 54>/font>
0.5 - 1.0 19 2.5 0.6 - 5.1
Mulheres
1.1 - 9.0 38 1.3 ND - 4.5
Cordão 27 1654 1097-2067
0.1 - 0.4 33 4.8 1.0 - 4.5
0.5 - 1.0 14 2.5 ND - 6.4
Homens
1.1 - 9.0 42 1.3 ND - 4.1
Cordão 54 1749 350 - 750
0.1 - 0.4 57 4.8 0.8 - 54
0.5 - 1.0 33 2.5 ND - 6.4
Combinado
1.1 - 9.0 80 1.3 ND - 4.1
ND - Não Detectável
Método: Quimiluminescente (Sistema IMMULITE)
Linha: Fertilidade
Produto Genérico: Prolactina
Produto Específico: Prolactina IMMULITE 2000
Descrição
Para uso diagnóstico in vitro com o equipamento IMMULITE 2000 para a mensuração
quantitativo da Prolactina em soro, como um auxiliar no diagnóstico e tratamento dos
distúrbios da pituitária.
Princípios do Procedimento: Ensaio Imunométrico
Ciclos de Incubação: 1 x 30min
Coleta do material:
A centrifugação de amostras de soro antes da formação completa do coágulo pode
resultar na presença de fibrina certifique-se que a formação do coágulo foi completa
antes da centrifugação das amostras. Algumas amostras, em especial as de pacientes
que recebem terapia anticoagulante podem requerer um maior tempo de formação do
coágulo.
Volume de Amostra: 25 L de soro
Valores de Referência:
Baseado na sua relação com a Prolactina IMMULITE da DPC (ver comparação de
métodos), pode esperar-se que o ensaio tenha valores de referência idênticos.
Grupo n* Mediana Central 96%
Homens
adultos
19
6,2 ng/ml
131 mIU/l
2,5 – 17
53 – 360
Um estudo realizado com a Prolactina IMMULITE forneceu os seguintes resultados:
Grupo n* Mediana Central 95%
Mulheres
adultas
115
9,4 ng/ml
199 mIU/l
1,9 – 25
40 – 530
Como sumarizado no Relatório Técnico da DPC ZB 157, este estudo acompanhou
mulheres normalmente ovulantes em base diária ao longo de um ciclo completo, nos
quais foram obtidos alguns valores altos e também consistente com aumento de stress
na coleta da amostra.
Um estudo cruzado de valores de fertilidade pediátricos realizado com a Prolactina
IMMULITE numa clínica de “parto” no sudoeste dos EUA, forneceu os seguintes
resultados.
Prolactina ng/ml
Grupo Idade (anos) n Media Central 95%
Mulheres Cordão
0,1 – 0,5
0,6 – 9
28
28
55
380
15
11
200 – 675
1 – 140
2 – 43
Homens Cordão
0,1 – 0,5
0,6 – 9
27
36
55
295
19
8
155 – 565
4 – 65
0,6 – 29
Combinado Cordão
0,1 – 0,5
0,6 - 9
55
64
110
340
117
9
160 – 665
2 – 125
1 - 40
Prolactina mIU/l
Grupo Idade (anos) n Media Central 95%
Mulheres
Cordão
0,1 – 0,5
0,6 – 9
28
28
55
8056
318
233
4240 –
14310
21 – 2968
42 – 912
Homens
Cordão
0,1 – 0,5
0,6 – 9
27
36
55
6254
403
170
3180 –
11978
85 – 1378
13 – 615
Combinado
Cordão
0,1 – 0,5
0,6 - 9
55
64
110
7208
2480
191
3392 –
14098
42 – 2650
21 – 848
Estes valores devem ser considerados apenas como diretrizes. Cada laboratório deve
estabelecer os seus próprios valores.
Limitações
Os anticorpos heterofílicos no soro humano podem reagir com as imunoglobulinas
presentes no ensaio, causando interferência com os imunoensaios in vitro.[Ver Boscato
LM, Stuart MC, Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem
1998: 34: 27 – 33]. Amostras de pacientes expostas em rotina a produtos ou soros de
animais podem demonstrar este tipo de interferência, potencial causador de resultados
anomalos. Estes reagentes foram formulados para minimizar o risco de interferência,
contudo podem ocorrer potenciais interações entre soros (raros) e componentes do teste.
Para fins de diagnóstico, os resultados obtidos neste ensaio devem ser sempre
analisados em combinação com o exame clínico, história de medicação do paciente e
outros achados que possam correlacionar.
Calibração: Até 150 ng/ml (até 3.180 mIU/L)
Sensibilidade Analítica: 0,16 ng/ml (3,4 mIU/L)
G561c Glitz, Cristina Luce
Concentração sérica e peritoneal da interleucina-
18 em mulheres inférteis com endometriose mínima
ou leve / Cristina Luce Glitz ; orient. João Sabino
Lahorgue Cunha Filho. – 2006.
94 f. ; il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio
Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-
Graduação em Medicina: Ciências Médicas. Porto
Alegre, BR-RS, 2006.
1. Endometriose 2. Infertilidade feminina 3.
Interleucina-18 I. Cunha Filho, João Sabino Lahorgue
II. Título.
NLM: WP 390
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