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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas
AVALIAÇÃO DE MICROQUIMERISMO POR ANÁLISE DE
MICROSSATÉLITES EM PACIENTES SUBMETIDOS À
TRANSFUSÃO SANGÜÍNEA NO
HOSPITAL DE CLÍNICAS DE PORTO ALEGRE
Ana Carolina Mardini
Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Saraiva Pereira
Dissertação de Mestrado
2006
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-graduação em Medicina: Ciências Médicas
AVALIAÇÃO DE MICROQUIMERISMO POR ANÁLISE DE
MICROSSATÉLITES EM PACIENTES SUBMETIDOS À
TRANSFUSÃO SANGÜÍNEA NO
HOSPITAL DE CLÍNICAS DE PORTO ALEGRE
Ana Carolina Mardini
Profa. Dra. Maria Luiza Saraiva Pereira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina: Ciências Médicas,
UFRGS, como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre.
Dissertação de Mestrado
2006
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3
AGRADECIMENTOS
- A minha chefe e orientadora a Prof. Drª Maria Luiza Pereira por ter me ensinado
muito sobre pesquisa e maneiras de se “comportar” em um laboratório, e de alguma
forma tentou que eu mudasse a minha maneira de me organizar, o que com certeza
iria me ajudar em futuros trabalhos;
- Ao meu colega e amigo Rodrigo Rodenbusch que me ajudou bastante nos
conhecimentos de biologia molecular e que estava “quase” sempre disponível para
me ajudar na leitura dos resultados desse trabalho;
- Aos meus colegas do laboratório de Identificação Genética, André Zoratto Gastaldo e
Hugo Bock que de uma maneira ou outra me ajudaram a diminuir o estresse no final
deste trabalho;
- A Ursula Matte, por me ajudar no início deste trabalho, e por ter me apresentado
pessoas que foram essenciais no auxílio ao desenvolvimento desta pesquisa;
- A querida “ex” colega de laboratório de Biologia Molecular, Bianca Cruz, pelas
palavras positivas, amizade e auxilio neste trabalho;
- Ao pessoal do Serviço de Genética Médica do HCPA onde trabalhei por um tempo e
principalmente ao pessoal da secretaria onde fiz minhas pesquisas no AGH;
- Ao pessoal do Serviço de Hematologia do HCPA, que me deram livre acesso ao
laboratório e pela ajuda, guardando as amostras usadas nesse trabalho;
- Ao pessoal do Banco de Sangue pela disposição, simpatia e gentileza,
principalmente da Drª Liane Rohsig, da enfermeira Angélica Ghinato e da secretária
Marilaine Sá de Castro;
- A minha querida prima Laura Mardini Davi e a minha grande amiga Fernanda
Kersting Gomes pela paciência, amizade e por me ensinar alguns segredos da
informática;
- Aos meus pais Alfredo Mardini e Diva Fernandes Mardini, pelo amor, paciência e
pelo apoio em todas as horas;
- Ao meu irmão Jorge Alexandre Mardini por sempre me ajudar e me apoiar em tudo
que eu faço, principalmente na área profissional;
A todos, muito obrigada.
4
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas..........................................................................................
Resumo..............................................................................................................................
Abstract..............................................................................................................................
1. Introdução......................................................................................................................
5
6
8
9
2. Revisão da Literatura ................................................................................................... 10
2.1 Transfusão de Sangue................................................................................................ 10
2.1.1 Histórico ............................................................................................................... 10
2.1.2 Hemoterapia ........................................................................................................ 11
a) Hemocomponentes .............................................................................................. 14
b) Hemoderivados .................................................................................................... 21
2.2 Microquimerismo ........................................................................................................ 24
2.2.1 Microquimerismo na gravidez e em doenças autoimunes ................................... 24
2.2.2 Microquimerismo associado à imunossupressão em transplantes de orgãos e
de células tronco .................................................................................................. 25
2.2.3 Quimerismo e transplante de medula óssea ....................................................... 27
2.2.4 Microquimerismo e cromossomo Y ...................................................................... 27
2.3 Análise Molecular de Microquimerismo ................................................................... 29
3. Objetivos ....................................................................................................................... 32
4. Referências ................................................................................................................... 33
5. Artigo em português .................................................................................................... 37
6. Artigo em inglês ............................................................................................................ 59
5
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACD ácido citrato dextrose
NK células natural killer
CHL concentrado de hemácias lavadas
CMV citomegalovírus
CPD citrato-fosfato-dextrose
CP2D citrato-fosfato-dextrose-dextrose
CPDA-1 citrato-fosfato-dextrose-adenina
DNA ácido desoxiribonucléico
FDA Food and Drug Administration
G-CSF fator estimulador de colônias granulocíticas
Gy gray-1joule/Kg
GVHD doença do enxerto versus hospedeiro (graft-versus-host disease)
HLA-DR antígenos leucocitários humanos D – relacionados (Human Leukocyte
antigen-DR)
HIV vírus da imundeficiência humana (Human lmunnedeficiency Virus)
HLA antígenos leucocitários humanos (Human Leukocyte Antigen)
HTLV 1,2 vírus linfotrópico de célula T humana tipo 1 e 2 (Human T cell Lymphotropic
Virus Type I,2)
ISG globulina de imunossoro humano
Kg quilograma
MHC região do complexo de histocompatibilidade (major histocompatibility complex)
mL mililitro
PCR reação em cadeia da polimerase (polimerase chain reaction)
PFC plasma fresco congelado
6
RESUMO
O microquimerismo vem sendo identificado em uma série de situações biológicas, sendo
decorrentes de procedimentos clínicos ou condições fisiológicas. A transfusão sangüínea é
um dos procedimentos que pode produzir a mistura de células do doador com as do
receptor. Na transfusão sanguínea, o maior constituinte são as hemácias, logo a
interferência microquimérica que pode ocorrer deve-se apenas aos leucócitosque são
transfundidos do doador. A admistração rotineira de produtos derivados do sangue é a
principal causa de doenças, aonde estes hemocomponente vindos de doadores alogênicos
contém leucócitos capazes de sobreviver e se expandir. Os leucócitos presentes nas bolsas
de concentrado de hemácias usados em transfusões sanguíneas podem causar a doença
do enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral e interferir na identificação genética
do receptor. Este trabalho teve como objetivo avaliar, em um primeiro momento, o limite de
detecção de microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em amostras biológicas
misturadas em proporções conhecidas e, posteriormente, verificar a presença e o tempo de
duração de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão sangüínea no Hospital
de Clínicas de Porto Alegre. A análise foi realizada a partir de amostras biológicas de três
grupos: sete misturas de DNA extraídos antes desse estudo, cinco misturas de sangue e 20
pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Todas essas amostras foram também
genotipadas individualmente. A genotipagem foi realizada através de PCR seguido por
eletroforese capilar, sendo amplificadas as seguintes regiões do genoma: D3S1358,
D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina. Os resultados obtidos no grupo
de mistura de amostras de DNA foi observada a presença de microquimerismo de 1:30 (ou
3,3%). No grupo de misturas de sangue, microquimerismo foi identificado até a proporção
de 1:10 (ou 10%). Entretanto, não foi identificada a presença de microquimerismo em
amostras coletadas nas primeiras 24 hs de pacientes submetidos à transfusão sangüínea.
Esses resultados sugerem que a metodologia utilizada é sensível para identificar
7
microquimerismo em misturas biológicas até o limite de 3,3%. Portanto, podemos
concluir que o microquimerismo em pacientes transfundidos avaliados nesse estudo não
atingiu o limite mínimo de detecção da metodologia empregada nesse trabalho.
8
ABSTRACT
Microchimerism has been identified in a series of biologic situations, being due to clinical
procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure that can
produce a mixture of donor and receptor cells. In blood transfusions, where red blood cells
are the major component, microchimeric interference is due to donor leukocytes. Even blood
cell components previously processed may contain a small portion of leukocytes. In some
cases, the routine administration of blood-derived products may be the main cause of
diseases
9
because these hemocomponents from allogeneic donors contain leukocytes
capable of surviving and expanding
10
. Leukocytes present in bags of red blood cell
concentrates used in blood transfusions may cause graft-versus-host disease (GVHD), as
well as fever and, viral transmission, and may interfere in the genetic identification of the
recipient. This work aimed to evaluate, at first, detection limit of microchimerism, using
microssatelites (short tandem repeats - STR), in mixed biological samples of controlled
proportions and, later, to verify presence and duration of microchimerism in patients post-
blood transfusion in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Analysis was performed in
biological samples from three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood
mixtures and patients submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed
individually. Allelic patterns were performed through PCR, using fluorescent primers,
followed by capillary electrophoresis, with amplification of the following genome regions:
D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. These results in the
group of DNA mixtures, microchimerism was observed up to 1:30 (or 3.3%). In the group of
blood mixtures, microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of
microchimerism was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to
blood transfusion. These results suggest that the applied methodology is sensitive to identify
microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3.3%. Therefore, we can conclude
that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this study did not
reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.
9
1. INTRODUÇÃO
A existência de outras células nucleadas em determinada amostra biológica pode significar
a existência de microquimerismo. O microquimerismo pode ser definido como uma pequena
população de células ou DNA em um indivíduo, provenientes de um outro indivíduo
geneticamente distinto
1-5
.
Na transfusão sanguínea, o maior constituinte são as hemácias, logo a interferência
microquimérica que pode ocorrer deve-se apenas aos leucócitos que são transfundidos do
doador. A administração rotineira de produtos derivados do sangue é a principal causa de
doenças
6
, aonde estes hemocomponentes vindos de doadores alogênicos contêm
leucócitos capazes de sobreviver e se expandir
7
. Os leucócitos presentes nas bolsas de
concentrado de hemácias usados em transfusões sanguíneas podem causar a doença do
enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral e interferir na identificação genética do
receptor. É estimado que existam cerca de 10
9
leucócitos/unidade de concentrado de
hemácias ou plaquetas
8
. A desleucocitação ou irradiação estão entre os procedimentos a
que são submetidos os produtos derivados de sangue (hemocomponentes) antes da
transfusão.
A análise do DNA é um procedimento de rotina em muitos laboratórios, tanto para o
diagnóstico de doenças genéticas, como para outras análises moleculares, como
procedimentos de identificação humana e análises forenses. Um dos potenciais problemas
nas rotinas desses laboratórios é a análise de DNA em pacientes que fizeram transfusão
sangüínea com sangue total, concentrado de hemácias ou outro derivado, que por sua vez
contém alguns leucócitos.
10
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 TRANSFUSÃO DE SANGUE
2.1.1 Histórico
Em 1616, Willian Harvey descreveu a circulação sangüínea, com todas as válvulas, veias e
artérias e câmaras internas do coração. Nessa ocasião, ficou comprovado que o sangue é
distribuído pelo corpo em um fluxo contínuo e em um único sentido. Inicia-se, então, a
história da transfusão sangüínea, como prática com algum suporte científico
9
.
Entre 1665 e 1795 existem registros de transfusão sangüínea de cães para cães e de
animais para seres humanos, este último proibido por causar reações transfusionais. Em
1818, James Blundel realiza a primeira transfusão de sangue humano para um paciente em
tratamento de hemorragia pós-parto. Entretanto, a medicina transfusional efetiva sua
importância no campo médico com a descoberta dos grupos sanguíneos ABO e do sistema
RH, por Karl Landsteiner em 1901
9
.
Bancos de sangue e transfusões não se tornaram procedimentos práticos até o
desenvolvimento de sistemas anticoagulantes capazes de preservar hemácias numa forma
viável. Antes da Segunda Guerra Mundial, quando o sangue era anticoagulado com citrato
tri-sódico, as hemácias podiam ser preservadas num estado viável por apenas uma semana
devido a falta de fontes de purinas e energia. O primeiro anticoagulante verdadeiramente
prático e viável foi o ácido citrato dextrose (ACD), descrito inicialmente em 1943. O ACD
contém glicose como fonte de energia e permite o armazenamento de hemácias durante até
três semanas
10
.
11
O desenvolvimento de novos anticoagulantes, conservantes sangüíneos e técnicas
estéreis permitiram a coleta e a preservação de sangue do doador para uso posterior
9
.
Nas décadas que se sucedem, acentua-se o crescimento em pesquisa e tecnologia, com o
desenvolvimento de novas formas de armazenagem do sangue coletado: substituição das
garrafas para acondicionamento do sangue por bolsas plásticas resistentes e introdução de
testes para controle do sangue coletado para fins terapêuticos
10
.
A maioria das doações de sangue hoje é processada de modo a colocar à disposição
inúmeros componentes sangüíneos, apenas na situação de uma grande perda sanguínea, é
às vezes necessário o uso de “sangue total”. O uso dos componentes do sangue para fins
terapêuticos chama-se hemoterapia.
2.1.2 Hemoterapia
A hemoterapia baseia-se na reposição de um tipo de hemocomponente ou hemoderivado
que não está presente em quantidade adequada no paciente. Os hemocomponentes e
hemoderivados são preparados a partir de sangue colhido de doação de sangue ou doação
de aférese.
Uma unidade de sangue total pode ser fracionada para se obter hemocomponentes, como
concentrado de hemácias, concentrado de plaquetas, plasma fresco congelado, plasma
simples, concentrado de granulócitos e crioprecipitado, e em hemoderivados, como a
albumina humana, imunoglobulina endovenosa, fatores de coagulação (VIII e fator IX)
11
.
A utilização correta dos hemocomponentes, associada a um maior controle de qualidade,
desde a coleta, testes laboratoriais, preparação, fracionamento e estocagem, tornou a
12
hemoterapia segura e, conseqüentemente, muitos pacientes são beneficiados com
derivados de sangue em uma única doação
10
.
No Brasil, todos os hemocomponentes e hemoderivados se originam da doação de uma
unidade de sangue por doador. Esse processo está regulamentado pela portaria nº 1.376 de
19 de novembro de 1993 do Ministério da Saúde
11
.
O fracionamento é uma forma de racionalizar a hemoterapia, embora multiplique também os
riscos transfusionais. O “sangue total” , como é conhecida à unidade de sangue antes de
ser fracionada, não encontra hoje quase nenhuma indicação clínica onde não possa ser
substituído com eficácia por seus componentes. A preservação clássica de uma unidade de
sangue total é um disperdício de componentes e fonte de efeitos indesejáveis. A razão para
fracionamento está no fato de ser possível atingir uma melhor conservação dos
hemocomponentes isoladamente
11
.
No Brasil, os testes sorológicos são obrigatórios para as doenças de Chagas, sífilis, hepatite
B e C, HIV e HTLV 1-2 e, em regiões endêmicas com transmissão ativa, para malária. Estes
testes devem ser de alta sensibilidade, quantitativos, e devem permitir, quando necessário,
a automatização do processo. Tais processos devem ser adequadamente formalizados com
manuais operacionais, auditorias periódicas e controles internos e externos, por meio de
painéis nas áreas de sorologia e imuno-hematologia
11
.
Todo sangue é coletado em uma bolsa descartável e estéril, de preferência esta bolsa deve
ser tripla ou quádrupla, permitindo o fracionamento do sangue em seus hemocomponentes,
de forma a garantir a esterilidade e a qualidade. Junto à bolsa são coletadas amostras de
sangue para tipagem sangüínea e sorologia. O sangue coletado para doação, apesar dos
testes e de todo o processo de triagem clínica, não está isento de risco infecto-contagioso
13
devido ao fenômeno da janela imunológica, período no qual não se detecta o anticorpo
contra o agente infeccioso
12
.
No Brasil, pessoas sadias entre 18 e 60 anos podem doar sangue, a não ser que pertençam
a grupo de risco para transmissão de HIV
12
. A freqüência das doações é de, no mínimo, dois
meses após a última doação para os homens e a três meses para mulheres; isto para
respeitar as necessidades individuais e perdas de ferro. O volume retirado em cada doação
é de aproximadamente 450ml, não devendo exceder 13% da volemia estimada, e, de
acordo com a norma brasileira, não poderá exceder 8ml/kg para as mulheres e 9ml/kg para
os homens
11
.
A bolsa de sangue é adaptada para receber de 405 a 495 ml de sangue e 63 ml de
anticoagulante e conservante. A solução anticoagulante-conservante serve para manter a
viabilidade e função da célula durante a estocagem. Embora as temperaturas baixas de
armazenamento retardem as atividades glicolíticas, as células vermelhas (hemácias)
mantêm suas atividades durante a estocagem, consumindo nutrientes e diminuindo a fonte
de energia intracelular
11
.
O FDA (Food and Drug Administration) indica 21 dias de estocagem na temperatura de 1 a
6ºC para hemácias de sangue total coletados em uma mistura de citrato-fosfato-dextrose
(CPD) ou de citrato-fosfato-dextrose-dextrose (CP2D) e de 35 dias para hemácias coletadas
em citrato-fosfato-dextrose-adenina (CPDA-1)
10
.
De um modo geral, as hemácias transfundidas sobrevivem por longos períodos na
circulação do receptor e menos de 1% são destruídas diariamente. A sobrevida de hemácias
alogênicas transfundidas não difere da sobrevida de hemácias autológas
13
.
14
a) Hemocomponentes
Os hemocomponentes são preparados por método de centrifugação diferencial e,
usualmente apresentam o mesmo risco de transmissão de doenças do sangue total que os
originou, com exceção do citomegalovírus (CMV) e do vírus linfotrópico de célula T humano
tipo 1 (HTLV-1). Atualmente, várias metodologias têm sido testadas no sentido de tratar
esses hemocomponentes, tendo como objetivo a inativação de patógenos e a diminuição de
risco de transmissão de algumas doenças
14
.
Dentro dos hemocomponentes (concentrado de hemácias, concentrado de plaquetas,
plasma fresco congelado, plasma simples, concentrado de granulócitos e crioprecipitado) há
diferenciação na indicação de uso, precauções e modo de armazenamento.
Os concentrados de hemácias, parte que contém os glóbulos vermelhos, são utilizados
em pessoas com anemia, com grandes hemorragias ou que passaram por cirurgias.
A decisão de transfusão de hemácias deve ser baseada em vários fatores clínicos, tais
como: idade do paciente, velocidade de instalação da anemia, história natural da anemia,
volume intravascular e a presença de co-fatores fisiológicos que afetam a função
cardiopulmonar e a circulação
13
.
O processo de seleção de hemácias para a transfusão envolve dois estágios. No primeiro, o
sangue é agrupado ou tipado, o que envolve determinação do grupo ABO e do fator RH,
tanto do receptor quanto do doador. No segundo, após a seleção de uma unidade de
doação apropriada, um teste de correspondência cruzada é realizado para determinar se as
células do doador são de fato compatíveis com o plasma do receptor
9
.
15
O concentrado de hemácias é obtido a partir de uma unidade de sangue total, da qual é
extraída a maior parte do plasma. Se preparado a partir de uma unidade de sangue total
coletada em CPD, CP2D ou CPDA-1, o hematócrito deve ser entre 70 a 80% e volume de
200 a 250ml (com 50 a 80ml de plasma). Uma unidade de concentrado de hemácias contém
cerca de 10
9
leucócitos
13
.
A dose de concentrado de hemácias vai depender das condições clínicas do paciente. Uma
unidade de concentrado de hemácias tem a mesma capacidade de transporte de oxigênio
que uma unidade de sangue total, isto é, eleva o hematócrito em 3 a 4% ou 1g/dl de
hemoglobina
13
.
No que diz respeito ao concentrado de hemácias, podemos encontrar algumas variações em
relação às unidades (bolsas), as quais são classificadas em irradiadas, lavadas ou
desleucocitadas.
No caso das bolsas irradiadas, os hemocomponentes são submetidos à irradiação gama,
visando prevenir que os linfócitos T viáveis do doador proliferem no receptor e
desencadeiem a doença do enxerto versus hospedeiro (graft-versus-host disease-GVHD). A
GVHD apresenta alta mortalidade (90%) e já foi descrita após a infusão de sangue total,
concentrado de hemácias, concentrado de plaquetas, concentrado de granulócitos e plasma
fresco não-congelado. Para ser eficaz, a dose recomendada de irradiação é de 25Gy (gray-
1Joule/Kg) na porção central do hemocomponente
12
. O ideal é que a irradiação seja
realizada no momento do uso, mas os componentes irradiados que não foram utilizados
para um determinado paciente podem ser eficazmente usados para outro. Após a irradiação,
ocorre um acúmulo de potássio no sangue irradiado, por isso recomenda-se que
hemocomponentes irradiados não sejam estocados, principalmente quando for utilizado
para transfusão intra-uterina ou em neonatos. A irradiação inviabiliza os leucócitos por lesão
do DNA, impedindo sua divisão no hospedeiro. Este processo, no entanto, é restrito a
16
pacientes imunocomprometidos, politransfundidos e pacientes pediátricos com
sorologia negativa para citomegalovírus
13
.
No caso das bolsas lavadas, o plasma ou elementos que compõem o anticoagulante foram
removidos. O uso de concentrado de hemácias lavadas (CHL) é recomendado para
pacientes com reações alérgicas graves, pacientes com história de reação anafilática a
componentes do plasma e pacientes com anticorpos e antiproteínas plasmáticas, em
especial aqueles com deficiência de IgA, que apresentem anticorpos anti-IgA. O
concentrado de hemácias lavadas é obtido a partir de um processo de lavagem manual ou
automática com 1 ou 2 litros de solução fisiológica (solução de cloreto de sódio 0,9%). Esse
processo de lavagem remove a maior parte do plasma, as proteínas plasmáticas, os
eletrólitos e os leucócitos (<5x10
8
leucócitos/ml), mas não o suficiente para evitar a
aloimunização a antígenos leucocitários. Esse procedimento pode ser realizado em qualquer
momento dentro do prazo de validade do hemocomponente. O CHL pode conter até 20% a
menos de hemácias que o concentrado original
13
.
Nas bolsas desleucocitadas, a maioria dos leucócitos do concentrado de hemácias é
removida através de filtros especialmente desenvolvidos para esse fim, restando um número
de leucócitos inferior a 5x10
6
leucócitos/unidade (quando utilizados filtros de terceira
geração) e contendo pelo menos 85% do total de hemácias do concentrado original. O
método de leucorredução pode ser feito antes de estocar o hemocomponente, denominada
pré-estocagem, ou por ocasião da liberação do concentrado de hemácias para infusão no
paciente, denominada pós-estocagem. Esta última pode ser feita no laboratório ou à beira
do leito. A transfusão a beira do leito não deve ser utilizada em pacientes que necessitam
rápida infusão de sangue, pois o filtro causa redução no fluxo sanguíneo e não é eficaz nos
casos de intolerância ao plasma. Nenhuma solução deve ser adicionada à bolsa de
concentrado de hemácias desleucocitadas. O uso destas bolsas é recomendado para as
seguintes situações: prevenir reações febris não-hemolíticas; prevenir transmissão de
17
infecção por CMV; para pacientes que realizarão transplante renal (se for indicado para
prevenir aloimunização de antígenos leucocitários humanos - HLA); para transfusão intra-
uterina; para prevenir aloimunização HLA em pacientes com doenças hematológicas
13
.
O concentrado de plaquetas é utilizado no tratamento de câncer (leucemias), nas
quimioterapias, nos transplantes (principalmente os de medula óssea), em pacientes com
baixa contagem de plaquetas (trombocitopenia), em distúrbios da função plaquetária ou em
pacientes que estão sob sério risco de apresentar sangramento (uso profilático)
14
.
As plaquetas promovem uma superfície hemostática na qual ocorrerá a formação da rede de
fibrina. Deficiências no número e/ou na função plaquetária podem causar prolongamento no
tempo de sangramento. A formação do tampão hemostático resulta da combinação dos
processos de adesão, ativação e agregação plaquetária e ativação dos fatores de
coagulação
15
.
A função plaquetária pode ser afetada por alguns fatores como drogas, doenças hepáticas ou
renais, septicemia, aumento da degradação da fibrina, derivação cardiopulmonar e distúrbios
da medula óssea. O sangue do indivíduo contém aproximadamente 150 a 400 bilhões de
plaquetas por litro e, um terço delas, é captada pelo baço. A meia-vida de uma plaqueta é de
aproximadamente nove dias, sendo que um oitavo da massa total de plaquetas é destruída e
formada por dia, em constante equilíbrio. Ao optar pela transfusão de plaquetas, vários fatores
devem ser considerados, como o grau de trombocitopenia ou disfunção plaquetária, a
presença, a intensidade e a localização de sangramento ativo. Analisando esses fatores, as
indicações podem ser classificadas em profiláticas ou terapêuticas
15
.
Existem dois tipos básicos de componentes plaquetários disponíveis para transfusão:
concentrado de plaquetas standard (50 a 70 ml) obtido a partir de uma unidade de sangue
18
total e o concentrado de plaquetas obtido pelo processo de doação exclusiva de
plaquetas, conhecidas como aférese de plaquetas ou plaquetaférese
15
.
O plasma, parte líquida do sangue, é rico em fatores de coagulação e tem a função de fazer
o transporte de sais minerais, proteínas e vitaminas para todas as partes do corpo, assim
como repor os fatores de coagulação. O plasma também é utilizado em grandes
hemorragias, em pacientes com doenças hepáticas e pacientes com queimaduras ou
sepsias
9
.
O plasma obtido a partir do fracionamento de sangue total coletado em CPD, CPDA-1 ou
CP2D ou por plasmaférese deve ser congelado em temperaturas iguais ou inferiores a -18ºC
dentro de 8 horas após a coleta de sangue total. Quando preparado em ACD, obtido por
aférese, o plasma deve ser congelado dentro de 6 horas e pode ser utilizado por até um
ano. Esse processo de congelamento nas primeiras horas de coleta assegura que os fatores
de coagulação lábeis (fator V e fator VIII) sejam preservados na concentração normal. O
fator VIII é estável em plasma ou crioprecipitado armazenado a -20°C durante um ano
16
.
O plasma pode ser classificado em plasma fresco congelado, plasma simples ou plasma em
pool, tratado com solvente-detergente
16
.
O plasma fresco congelado (PFC) é constituído basicamente por 7% de proteínas (entre
elas a albumina, as globulinas e os fatores de coagulação) e 2% de carboidratos e lipídios.
Contém fatores de coagulação (II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII), fatores anticoagulantes
(antitrombina III, proteína C e proteína S) e fibronectina, mas não contém plaquetas. Um
miligrama de plasma fresco congelado contém cerca de uma unidade de atividade do fator
de coagulação
16
.
O plasma simples é usado para a produção de hemoderivados.
19
As unidades de plasma em pool são preparadas com plasma fresco congelado e agrupadas
em lotes do mesmo tipo sanguíneo. Esses lotes são tratados com solvente (tri-n-butilfosfato)
e detergente (Triton X-100) com o intuito de inativar os vírus com envelope lipídio, como o
vírus HIV tipo 1 e tipo 2, HTLV-I/II, o vírus da hepatite B e da hepatite C. Essa técnica não
inativa outros vírus, não reduzindo o risco de transmissão de vírus não envelopados
(parvovírus b19, hepatite A) e de outros agentes
16
. Dentre as vantagens do uso de plasma
em pool em relação ao PFC está a diminuição do risco na transmissão de vírus com
envelope lipídico.
Embora não sejam necessários os testes de compatibilidade, o plasma deve ser grupo ABO
compatível.
O concentrado de granulócitos é comumente usado em pacientes que fazem uso de
quimioterapia e radioterapia agressivas, onde esses pacientes estão sujeitos a períodos
prolongados de uma completa agranulocitose. O risco de infecções bacterianas graves
aumenta quando a contagem granulocítica cai abaixo de 1,0X10
9
/L e é ainda maior quando
a contagem está abaixo de 0,5X10
9
/L
9
. Em pacientes com agranulocitose (neutropenia
grave), associada a quadro infeccioso não-responsivo ao tratamento com antibioticoterapia,
em disfunções granulocíticas, associada a quadro infeccioso não-responsivo, e em
septicemia neonatal, a transfusão de granulócitos pode representar uma arma terapêutica
adicional no controle e na prevenção de infecções
17
.
O concentrado de granulócitos é obtido por meio de aférese, no qual esse procedimento
permite a coleta de dose terapêutica de granulócitos para um paciente adulto, a partir de um
único doador. Esse doador deve receber corticosteróides e fator estimulador de colônias
granulocíticas (G-CSF) antes da doação. Devido a rápida diminuição na função dos
granulócitos durante o período de estocagem, o concentrado de granulócitos deve ser
20
infundido o mais breve possível, preferencialmente em até 6 horas e nunca após 24
horas da sua coleta.
Embora seja desejável elevar a contagem de granulócitos em tais pacientes, a transfusão
terapêutica efetiva de leucócitos humanos ficou para trás da transfusão de outros elementos
do sangue por diversas razões. Entre elas, deve-se considerar que é tecnicamente difícil
obter concentrados de granulócitos, pois estas células circulam no sangue em baixas
concentrações em comparação com outras células sanguíneas
9
.
O crioprecipitado é utilizado na prevenção ou tratamento de hemorragias devido à
deficiência ou disfunção de fibrinogênio, em pacientes hemofílicos e em pacientes com a
doença de Von Willebrand, sendo preparado por descongelamento e posterior centrifugação
de uma unidade de plasma fresco congelado, sendo formado pelo precipitado de alto peso
molecular. Uma unidade de crioprecipitado contém aproximadamente 250 mg de
fibrinogênio, sendo que o mínimo requerido pela AABB Standard é 150 mg
10
. Após seu
preparo, esse produto tem validade de 12 meses, a partir da data da coleta
18
.
O crioprecipitado não é muito usado atualmente por existirem vários produtos no mercado
para o uso no tratamento e prevenção de sangramento em pacientes portadores de
hemofilia A e hemofilia B e da doença de Von Willebrand, incluindo vários concentrados de
fator VIII derivados de pools de plasma de diferentes graus de pureza (definido como a
atividade específica de fator VIII no produto final) e concentrado de fator VIII recombinante.
Esses produtos derivados de pools de plasma são geralmente fracionados por um método
que consiste na precipitação de várias proteínas plasmáticas em misturas de água-etanol
resfriadas (método de Cohn)
18
.
21
b) Hemoderivados
Os hemoderivados são preparados a partir de processos mais complexos (industrialização),
utilizando-se pools de plasma. Dependendo do método e processamento, apresentam
diminuição significante dos riscos de transmissão de doenças. Os hemoderivados (albumina
humana, imunoglobulina, fator VIII e fator XI) possuem diferenças tanto no uso como na
forma de armazenamento.
A administração de albumina humana em situações clínicas continua controversa. O papel
da solução colóide, especificamente a infusão de albumina, no tratamento a pacientes
críticos, incluindo pacientes com queimaduras e hipoalbunemia, vem sendo debatido nos
últimos 20 anos. As razões para esse debate residem no custo significativo e limitação de
disponibilidade do produto, até os possíveis efeitos adversos que a adição de albumina pode
causar na função de órgãos críticos e na evolução dos pacientes
14
.
A albumina é responsável por 80% da pressão colóide osmótica do plasma, normalmente de
aproximadamente 27mmHg. O organismo de um indivíduo adulto de aproximadamente
70Kg armazena cerca de 300g de albumina, sendo que entre 60% e 65% é extravascular,
na pele, nos músculos e nos intestinos
14
. As funções fisiológicas da albumina são a
manutenção da pressão oncótica do plasma e a atividade de ligação e transporte é uma
proteína globular altamente solúvel sintetizada no fígado
19
. A produção de albumina é feita
pelo método de Cohn ou por cromatografia. Além dos testes de triagem sorológica de
doadores de plasma, métodos de inativação viral para produção de albumina são também
realizados.
22
A albumina tem meia-vida de 15 a 20 dias e a produção diária, em um adulto normal, é
de aproximadamente de 16g. Conseqüentemente, em caso de hemorragia, com perda de
500ml de sangue, somente 12g (4% da albumina corporal total) são perdidos, sendo
recuperados em um dia. A albumina pode ser estocada por 3 anos em temperaturas
inferiores a 37ºC e por 5 anos em temperaturas entre 2 a 10ºC
14
.
A globulina de imunossoro humano (ISG, immune serum globulin) contém um amplo
espectro de anticorpos naturalmente presentes na população de doadores. Ela apresenta
um valor comprovado na terapia profilática (de reposição) de pacientes com deficiências de
imunoglobulinas hereditária ou primária adquirida, mas seu valor na terapia ou prevenção de
infecção em pacientes com imunodeficiência humoral secundária a malignidades, como
leucemia linfocítica crônica ou mieloma múltiplo, não ficou comprovado. A ISG também tem
valor na imunização passiva contra inúmeras doenças infecciosas, como hepatite A,
sarampo e varicela, podendo apresentar um certo beneficio contra a poliomielite e rubéola
9
.
As imunoglobulinas podem ser encontradas tanto para uso intravenoso como para uso
intramuscular. As imunoglobulinas de uso intramusculares são constituídas por mais de 95%
de IgG, podendo ter alto peso molecular, o que contra-indica seu uso intravenoso. A
imunoglobulina hiperimune de uso intramuscular é utilizada para a prevenção de hepatite B,
varicela, raiva, tétano e para imunosupressão de indivíduos Rh-D-negativo que recebem
hemácias Rh-D-positivas. A administração das imuglobulinas para uso intravenoso é o
tratamento de escolha nas deficiências imunológicas humorais e tratamento alternativo ou
complementar em processos auto-imunes e patologias nas quais as alterações da
imunomodulação são partes importantes da fisiopatologia
20
.
A ISG é preparada a partir de pool de plasma, independente da presença de anticorpos
específicos. Ela é fornecida em uma solução protéica (16,5%), contendo aproximadamente
23
9% de IgG e pequenas quantidades de IgA e IgM. As imunoglobulinas podem ser
obtidas dos seres humanos, de outros animais e por técnicas de DNA recombinante. As
imunoglobulinas obtidas do ser humano podem ser indicadas tanto para o uso intramuscular
como para o uso intravenoso e ser ou não hiperimunes, ou seja, conter alto título de
anticorpos contra determinada doença
20
.
Os fatores VIII e IX são os concentrados de plasma mais utilizados e tem processamento
industrial. Os concentrados de fator VIII são utilizados basicamente no tratamento das
manifestações hemorrágicas ou na preparação para procedimentos invasivos em pacientes
com hemofilia A (deficiência congênita do fator VIII). Os concentrados de fator IX são
empregados basicamente para o tratamento da hemofilia B (deficiência congênita do fator
IX). Os concentrados que contêm ainda os fatores II (protrombina), VII e X (os chamados
concentrados de complexo protrombínico) podem ser utilizados nos pacientes que
desenvolveram inibidores (anticorpos) para os fatores VIII ou IX, nos pacientes com
deficiências congênitas da protrombina ou dos fatores VII ou X. A pureza dos concentrados
de fator IX apresenta grande importância prática, visto que está bem documentado que o
grau de pureza tem correlação inversa com o desenvolvimento de hipercoagulabilidade
21
.
No banco de sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre é comum a utilização de bolsas
de concentrados de hemácias: irradiados ou não-irradiados (usados geralmente em
cirurgias), desleucocitadas e lavadas.
24
2.2 MICROQUIMERISMO
O microquimerismo pode ser definido como uma pequena população de células ou DNA em
um indivíduo, provenientes de um outro indivíduo geneticamente distinto
1
. Em algumas
circunstâncias, como na gravidez, em casos de transfusão de sangue e em transplantes,
pode ocorrer tráfico de células de um indivíduo para outro
22
. No caso da transfusão de
sangue, as células do doador encontram-se misturadas às do receptor na circulação.
O microquimerismo vem sendo investigado em várias doenças com alguns resultados
indicativos de um papel em potencial na patogenia de doenças
2
. As descobertas de
transferência, persistência e diferenciação presumida de células microquiméricas em
diversos tecidos, introduziram uma reavaliação considerando o papel dessas células em
pessoas saudáveis e doentes. Fatores genéticos, exposições ambientais (produtos químicos
tóxicos, drogas e infecções), imunossupressão e algumas doenças são possíveis fatores
que influem no microquimerismo
22
.
2.2.1 Microquimerismo na gravidez e em doenças autoimunes
O microquimerismo ocorre durante a gravidez e pode persistir na mãe após o nascimento
4
.
A transferência natural das células microquiméricas indica que o tráfico de células que
ocorrem entre o feto e a mãe durante a gravidez é bidirecional, sendo que essa troca celular
começa a partir da 4ª semana de gestação
4
.
Alguns estudos indicam que tanto células do feto como DNA fetal livre passam para a
circulação sangüínea materna rotineiramente durante a gravidez e que microquimerismo
25
pode ser identificado na circulação materna anos após o fim da gravidez
3
. A ocorrência
de microquimerismo também pode ocorrer intra-útero entre gêmeos
1
.
Um número maior de células fetais são transferidas para circulação materna do que células
maternas para circulação fetal. O número de células fetais na circulação materna pode ser
imprescindível para estabelecer e manter a gravidez. Se for insuficiente o número de células
fetais na circulação materna pode ocorrer aborto e células fetais em excesso podem gerar
complicações na gestação e predispor a mulher a doenças autoimunes
4
.
A detecção de células fetais na circulação materna tem significado clínico, como a aplicação
em diagnósticos pré-natais não-invasivos. Essa detecção pode ser usada para determinar o
sexo fetal e como método auxiliar na investigação de doenças hereditárias
4
.
Vários estudos têm investigado o papel do microquimerismo fetal adquirido em mulheres
com doenças autoimunes, tireoidite, cirrose biliar primária, síndrome de Sjögren, Lupus
eritrematoso sistêmico e dermatomiosites
1
. O microquimerismo também está associado com
doenças não-autoimunes como erupções polimórficas na gravidez, pré-eclampsia, hepatite
infecciosa, doença da tireóide não-autoimune, leucemias e câncer cervical
22
.
Enquanto o conceito de microquimerismo contribui para explicação de algumas doenças
autoimunes, outros estudos têm mostrado que microquimerismo adquirido naturalmente
entre feto e mãe são comuns em indivíduos saudáveis
1
.
2.2.2 Microquimerismo associado à imunossupressão em transplantes de órgãos e de
células tronco
O termo quimerismo foi rapidamente introduzido na área clínica no transplante de células
tronco e os estudos nessa área tiveram a importância de avaliar a hematopoiese e/ou da
26
persistência de várias células do doador no receptor, o que foi um importante aspecto
no transplante de células tronco
23
.
A procura de microquimerismo após período pós-transfusional em receptores de
transplantes de órgãos humanos fez com que surgisse a hipótese de que este fenômeno
poderia ter uma importância significativa na indução e/ou manutenção da tolerância do
órgão transplantado. Existem ainda dúvidas se o microquimerismo é meramente um
fenômeno de importância clínica ou se está diretamente relacionado à tolerância do órgão
transplantado, o que ainda é um assunto de intenso debate
5
.
Embora diversos agentes imunossupressores tenham sido desenvolvidos, seu uso leva a
um grande número de efeitos colaterais e complicações. A identificação de estratégias para
a indução da tolerância em transplante clínico é desejável. A variedade de procedimentos,
incluindo a transfusão de sangue ou o transplante de medula óssea, foi usada para induzir
tolerância aos órgãos transplantados. Entretanto, o sucesso destes imunossupressores foi
limitado e amplamente debatido. A troca de leucócitos migratórios entre o órgão
transplantado e o receptor (microquimerismo), é uma das iniciativas de criar tolerância ao
enxerto, e isto pode levar a retirada ou a redução da imunossupressão
24
.
O mecanismo para indução de imunossupressão ainda não foi identificado, mas algumas
investigações laboratoriais demonstram várias alterações nas funções imunes após a
transfusão sangüínea alogênica. O estabelecimento de microquimerismo está sendo
considerado um possível mecanismo imunomodulatório. Isto inclui decréscimo no número
de células NK (células natural Killer), células T-citotóxicas, aumento nos níveis de células
CD4 e CD8, linfócitos B e a expressão HLA-DR nos linfócitos
7
.
O microquimerismo hematopoiético foi demonstrado após o transplante de fígado, rins,
coração e pulmão, utilizando métodos baseados na reação em cadeia da polimerase
27
(polimerase chain reaction – PCR), tanto pela amplificação do cromossomo Y como na
região HLA-DR do complexo de histocompatibilidade (major histocompatibility complex –
MHC)
25
.
2.2.3 Quimerismo e transplante de medula óssea
O transplante de medula óssea alogênica é uma modalidade de terapia para muitos
pacientes com leucemia ou anemia aplástica. O sucesso desta terapia está associado com o
estabelecimento do quimerismo
26
. O desenvolvimento do quimerismo após esse transplante
é primordial para o sucesso do mesmo
25
.
A detecção antecipada do quimerismo no transplante de medula óssea é importante para
prever a GVHD, na rejeição da medula óssea e na recaída da doença residual
27
.
Alguns trabalhos avaliaram se quimerismo poderia ser usado no prognóstico da recaída, já
que o quimerismo é freqüentemente observado após o transplante alogênico de medula
óssea. Alguns pesquisadores relataram uma boa correlação entre o quimerismo e a doença
residual mínima e, subseqüentemente, recaída, enquanto outros não acharam tantas
evidências. Portanto, os resultados obtidos foram controversos
27
.
2.2.4 Microquimerismo e o cromossomo Y
Alguns pesquisadores identificaram DNA masculino ou células masculinas em mulheres
como demonstração de microquimerismo. Os resultados desses estudos evidenciam o
microquimerismo fetal em mulheres com gravidez prévia de um feto masculino ou, em
transplantes, de doadores homens em mulheres receptoras
1
.
28
O DNA masculino pode ser detectado por reação em cadeia da polimerase (PCR) onde
é amplificada a seqüência especifica do cromossomo Y
1
. Essa identificação pode ser
realizada no sangue materno a partir da 6ª semana de gestação
22
.
O microquimerismo de células masculinas não é incomum em mulheres sem filhos. Além de
ser conhecido na gravidez, há outras fontes de microquimerismo de células masculinas
incluindo abortos espontâneos, perda de gestação gemelar de um feto do sexo masculino
ou transferência de células de um irmão mais velho através da circulação materna
28
.
Por fim, a presença de células masculinas em fígado de mulheres com cirrose hepática biliar
aumenta a possibilidade de que o microquimerismo de células fetais pode estar envolvido na
patogênese desta doença crônica de fígado
29
.
29
2.4 ANÁLISE MOLECULAR DE MICROQUIMERISMO
A análise de microquimerismo em pacientes que fizeram transfusão sangüínea é realizada
através de diversas técnicas que se baseiam na presença de células do doador na corrente
sanguínea do receptor. Análise citogenética, hibridização fluorescente in situ e metodologias
baseadas em PCR são algumas dessas técnicas utilizadas na detecção do
microquimerismo
30
. Eventualmente, a utilização de um único teste pode não ser suficiente
para a demonstração desta condição, sendo necessária a confirmação através de mais de
uma metodologia, dependendo da sensibilidade da mesma
24
.
As metodologias que utilizam PCR se baseiam, em geral, na análise de regiões polimórficas.
Essas regiões conferem a variabilidade dos organismos, em especial em seres humanos.
Quanto mais polimórficos forem os loci analisados mais informativos serão em relação à
identificação individual. Portanto, a análise destes polimorfismos constitui-se uma
ferramenta poderosa para distinguir geneticamente os indivíduos ou determinar níveis de
relacionamento familiar
31
.
Alguns polimorfismos do genoma humano podem ser decorrentes da inserção ou deleção
de nucleotídeos ou segmentos de DNA em posições aleatórias da molécula. Os
experimentos de Jeffrey’s e colaboradores (1985) descreveram a ocorrência no genoma
humano de regiões hipervariáveis caracterizadas por apresentar seqüências de
nucleotídeos repetidas consecutivamente (in tandem)
31
.
O genoma humano é formado por diferentes tipos de seqüências repetitivas, que compõem
cerca de 50% do genoma. As repetições in tandem estão espalhados por todos os
organismos desde as bactérias aos seres humanos
32
.
30
Um dos tipos de polimorfismos verificados em regiões constituintes do genoma humano
são os números variáveis de repetições in tandem (Variable Number of Tandem Repeats -
VNTRs), conhecidos como minissatélites, e as repetições curtas em seqüência (Short
Tandem Repeats - STRs) são conhecidas como microssatélites. Os VNTRs apresentam
uma unidade de repetição que varia em torno de 10 a 80 nucleotídeos com fragmentos de
tamanhos entre 350 a 1000 pares de bases (pb). Os STRs estão espalhados por todo o
genoma humano e são altamente polimórficos, curtos, com unidades de repetição entre 3 a
7 nucleotídeos
33
.
Os polimorfismos do tipo microssatélites (ou STRs) podem ser analisados através da PCR,
amplificando o DNA a partir de oligonucleotídeos situados nas regiões adjacentes (não
repetitivas) a esses polimorfismos
34
. Em geral, essas análises são desenhadas para
amplificar fragmentos entre 100 a 300 pb.
A utilização de marcadores do tipo STRs é um dos métodos de escolha na análise forense,
no mapeamento cromossômico, em testes de paternidade, no diagnóstico pré-natal e,
também, pode auxiliar no diagnóstico clínico. Nessa área, a avaliação de quimerismo pós-
transplante através dessa metodologia é de grande valia, especialmente em procedimentos
entre indivíduos do mesmo sexo
26
.
A PCR se tornou o primeiro método analítico para estudos de microquimerismo e é
conhecido por ser altamente sensível, mas essa sensibilidade pode ficar comprometida
quando o teste é usado em amostras em que o receptor tenha a base genética similar à do
doador
35
.
A sensibilidade média da detecção de populações de células em menor quantidade
(secundárias) usando diferentes marcadores de microssatélites está na faixa de 1 a 6%,
31
dependendo do marcador individual, do comprimento do fragmento de PCR e da
diversidade alélica do mesmo
36
.
Atualmente, a eletroforese capilar conduziu aplicações mais freqüentes na quantificação de
produtos de PCR para a análise de quimerismo. Demonstrando alta sensibilidade e acurácia na
detecção do microquimerismo in vitro e in vivo
36
.
32
5. OBJETIVOS
Geral
Avaliar, em pacientes transfundidos, a presença de microquimerismo do material
genético do doador em amostras de sangue periférico do receptor.
Específicos
Determinar os alelos de seis microssatélites (STRs) em amostras biológicas (DNA e
sangue), tanto individuais como em misturas em proporções conhecidas;
Estabelecer o limite de detecção de microquimerismo em amostras misturadas de
DNA e sangue em proporções conhecidas;
Verificar a presença e o tempo de duração de microquimerismo em pacientes
submetidos à transfusão sangüínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
33
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37
7. ARTIGO EM PORTUGUÊS
AVALIAÇÃO DE MICROQUIMERISMO POR ANÁLISE DE MICROSSATÉLITES EM
PACIENTES SUBMETIDOS Á TRANSFUSÃO SANGUÍNEA
Título curto: microquimerismo em pacientes transfundidos.
Ana Carolina Mardini
1
, Rodrigo Rodenbusch
1
, Maria Helena Albarus
1
, Simone Schumacher
1
,
Ursula Matte
2
, Roberto Giugliani
1,2,3
, Maria Luiza Saraiva-Pereira
1,2,4
.
1
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisas – HCPA;
2
Serviço de
Genética Médica – HCPA;
3
Depart. de Genética e
4
Depart. de Bioquímica – UFRGS – Porto
Alegre, RS.
Endereço para correspondência:
Maria Luiza Saraiva-Pereira, PhD
Laboratório de Identificação Genética - Centro de Pesquisas
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Rua Ramiro Barcelos, 2350
CEP: 90035-903, Porto Alegre, RS, Brasil
Tel: + 55 51 21018011
Tel: + 55 51 21018010
e-mail: [email protected]
Artigo redigido conforme as normas da Revista Transfusion.
38
RESUMO
Introdução: O microquimerismo vem sendo identificado em uma série de situações
biológicas, sendo decorrentes de procedimentos clínicos ou condições fisiológicas. A
transfusão sangüínea é um dos procedimentos que pode produzir a mistura de células do
doador com as do receptor. Este trabalho teve como objetivo avaliar, em um primeiro
momento, o limite de detecção de microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em
amostras biológicas misturadas em proporções conhecidas e, posteriormente, verificar a
presença e o tempo de duração de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão
sangüínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos: A análise foi realizada a partir
de amostras biológicas de três grupos: sete misturas de DNA extraídos antes desse estudo,
cinco misturas de sangue e 20 pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Todas essas
amostras foram também genotipadas individualmente. A genotipagem foi realizada através
de PCR seguido por eletroforese capilar, sendo amplificadas as seguintes regiões do
genoma: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina.
Resultados: No grupo de mistura de amostras de DNA foi observada a presença de
microquimerismo de 1:30 (ou 3,3%). No grupo de misturas de sangue, microquimerismo foi
identificado até a proporção de 1:10 (ou 10%). Entretanto, não foi identificada a presença de
microquimerismo em amostras coletadas nas primeiras 24 hs de pacientes submetidos à
transfusão sangüínea. Conclusão: Esses resultados sugerem que a metodologia utilizada é
sensível para identificar microquimerismo em misturas biológicas até o limite de 3,3%.
Portanto, podemos concluir que o microquimerismo em pacientes transfundidos avaliados
nesse estudo não atingiu o limite mínimo de detecção da metodologia empregada nesse
trabalho.
Palavras chaves: microquimerismo, transfusão sangüínea, STRs
39
ABSTRACT
Backgound: Microchimerism has been identified in a series of biologic situations, being due
to clinical procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure that
can produce a mixture of donor and receptor cells. This work aimed to evaluate, at first,
detection limit of microchimerism, using microssatelites (short tandem repeats - STR), in
mixed biological samples of controlled proportions and, later, to verify presence and duration
of microchimerism in patients post-blood transfusion in the Hospital de Clínicas de Porto
Alegre. Study design and methods: Analysis was performed in biological samples from
three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood mixtures and patients
submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed individually. Allelic
patterns were performed through PCR, using fluorescent primers, followed by capillary
electrophoresis, with amplification of the following genome regions: D3S1358, D16S539,
THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. Results: In the group of DNA mixtures,
microchimerism was observed up to 1:30 (or 3.3%). In the group of blood mixtures,
microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of microchimerism
was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to blood
transfusion. Conclusion: These results suggest that the applied methodology is sensitive to
identify microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3.3%. Therefore, we can
conclude that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this
study did not reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.
Key words: microchimerism, blood transfusion, STR
40
INTRODUÇÃO
Microquimerismo pode ocorrer em uma série de situações biológicas, tanto fisiológicas
como decorrentes de procedimentos realizados na prática clínica. Muitas vezes, em uma
determinada amostra biológica, células nucleadas provenientes de outro indivíduo,
geneticamente distinto, podem ser encontradas (microquimerismo)
1-5
. Essa situação pode
ocorrer em casos de transplantes de medula óssea, de transplante de órgãos, na gravidez e
nas transfusões sanguíneas, situações em que, durante um determinado período, existe a
co-existência de células do doador na circulação sangüínea do receptor
6
. Em casos de
transplantes de órgãos, o microquimerismo vem sendo associado à indução e/ou
manutenção da tolerância do órgão transplantado
5
, onde a troca de leucócitos migratórios
entre o órgão e o receptor é uma das iniciativas de criar tolerância ao enxerto
7
. A presença
de quimerismo após transplante de medula óssea é primordial para o sucesso do
transplante
8
. Na gravidez, as células quiméricas ocorrem pelo tráfico bidirecional entre as
células da mãe e do feto
4
. Além disso, a ocorrência de microquimerismo fetal e materno
está associada a doenças autoimunes
1
.
Na transfusão sangüínea, situação em que o maior constituinte são as hemácias, a
interferência microquimérica é decorrente dos leucócitos do doador. Mesmo os
componentes celulares sangüíneos previamente tratados podem conter uma pequena
porção de leucócitos. Em alguns casos, a administração rotineira de produtos derivados do
sangue pode ser a principal causa de doenças
9
, onde estes hemocomponentes vindos de
doadores alogênicos contêm leucócitos capazes de sobreviver e se expandir
10
. Os
leucócitos presentes nas bolsas de concentrado de hemácias usados em transfusões
sanguíneas podem causar a doença do enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral
e interferir na identificação genética do receptor. Estudos prévios estimaram a presença de
cerca de 10
9
leucócitos por unidade de concentrado de hemácias ou de plaquetas
11
.
41
A análise do DNA é uma rotina em muitos laboratórios mundialmente, sendo utilizada
não apenas em identificação humana e na medicina forense, como para a avaliação
molecular visando a identificação de predisposições genéticas e o diagnostico de doenças
hereditárias. Um dos potenciais problemas nas rotinas desses laboratórios é a análise em
pacientes que foram transfundidos recentemente, especialmente com sangue total,
concentrado de hemácias ou outro derivado que contenha uma pequena proporção de
leucócitos.
Alguns trabalhos realizados previamente avaliaram metodologias distintas de
monitoramento de microquimerismo em situações específicas. Esses trabalhos
demonstraram resultados distintos, dependendo do tipo de amostra/pacientes avaliados
bem como do grau de sensibilidade da técnica aplicada em cada situação.
Nesse trabalho, avaliamos, em um primeiro momento, o limite de detecção de
microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em amostras biológicas misturadas
em proporções conhecidas e, posteriormente, verificamos a presença e o tempo de duração
de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão sangüínea no Hospital de
Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
42
MATERIAL E MÉTODOS
Materiais biológicos
Durante o estudo, foram analisados 3 grupos distintos de materiais biológicos. Esses grupos
estão definidos abaixo:
Grupo 1: Misturas de amostras de DNA foram preparadas a partir de material biológico a ser
descartado. Foram utilizadas 14 amostras no total, sendo 7 provenientes de indivíduos do
sexo masculino e 7 provenientes de indivíduos do sexo feminino, assegurando que os
indivíduos não eram aparentados entre si. Essas amostras de DNA foram quantificadas e
misturadas (1 amostra de um indivíduo do sexo masculino com 1 amostra de um indivíduo
do sexo feminino) conforme as seguintes proporções: 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:25, 1:30. E
quatro amostras foram também misturadas nas proporções de 1:50 e 1:100.
Grupo 2: Misturas de amostras de sangue foram também obtidas a partir de material
biológico a ser descartado. Foram utilizadas 10 amostras no total, sendo 5 provenientes de
indivíduos do sexo masculino e 5 proveniente de indivíduos do sexo feminino, assegurando
que os indivíduos não eram aparentados entre si. Essas amostras de sangue foram
misturadas nas seguintes proporções: 1:1, 1:10, 1:15 e 1:20. Após a mistura, os sangues
foram submetidos à extração de DNA e, posteriormente, quantificadas.
Grupo 3: Vinte pacientes, com idades que variaram de 19 a 81 anos (média de 60 anos),
transfundidos e internados no HCPA foram selecionados. O critério de inclusão foi paciente
submetido a transfusão com uma unidade de sangue, no caso concentrado de hemácias
irradiadas ou não-irradiadas, de volume entre 248 e 392ml. Foram excluídos do estudo
pacientes que receberam concentrados de hemácias desleucocitados ou filtrados e
indivíduos menores de 18 anos. Dos pacientes incluídos no estudo, foi coletada uma
43
amostra sempre antes da transfusão e, pelo menos, uma amostra após a transfusão
dentro das primeiras 24 hs. Além disso, seis amostras, de indivíduos diferentes, foram
coletadas uma segunda amostras entre 24 e 48hs após a transfusão. Por fim, também foi
testada 1 amostra em períodos distintos, tendo como limite o período de 7 dias (ou 168 hs)
após a transfusão sanguínea. Todos os sangues das bolsas foram analisados e o padrão
alélico foi determinado separadamente.
Extração de DNA
O DNA foi extraído a partir de sangue total de todas amostras, pelo método de precipitação
de sais e por purificação em solução alcoólica utilizando o kit comercial Wizard® Genomic
DNA purification Kit (Promega). A concentração de DNA de cada amostra foi realizada pela
leitura de absorbância em 260nm e todas as amostras analisadas foram diluídas até uma
concentração de DNA de 2ng/µl.
PCR
Um microlitro de DNA de cada amostra, antes e após a realização das misturas (de DNA ou
de sangue) ou da transfusão, foram submetidas a um PCR multiplex, utilizando o kit
AmpFlSTR Cofiler Plus
TM
(Applied Biosystems
®
), o qual possibilita, pelo emprego de
primers fluorescentes, a análise dos seguintes marcadores (STRs): D3S1358, D16S539,
TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina, seguindo as instruções do fabricante. As
condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95
0
C por 11 min.,
seguidos por 28 ciclos de 94
0
C por 1 min, 59
0
C por 1 min e 72
0
C por 1 min, seguidos por
uma extensão final a 60
0
C por 45 min. A reação de PCR foi realizada em um termociclador
MJ Research – PTC-100.
44
Análise dos Produtos de PCR
Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese capilar no analisador genético ABI
Prism 3100 (Applied Biosystems
®
) utilizando o Gene Scan-500 ROX como marcador
interno. Os dados foram coletados pelo programa DataCollection
®
v.1.1 e analisados
através do programa GeneScan
®
v.3.7 (Applied Biosystems
®
). Os alelos foram identificados
através do programa Genotyper Software
®
(Applied Biosystems
®
), que determinou o
tamanho dos alelos, comparando os resultados das amostras ao do marcador AmpFlSTR
COfiler Allelic Ladder.
45
RESULTADOS
Um total de 148 análises foi realizado, sendo obtido o genótipo de todas as amostras
individuais, dos dois grupos de misturas, dos pacientes antes e depois das transfusões
assim como a genotipagem da bolsa de sangue utilizada na transfusão. Todas as análises
foram realizadas em duplicata. Os resultados obtidos nessas análises, com a identificação
dos alelos em cada STR analisado, estão nas tabelas 1, 2 e 3.
Foi observada presença de microquimerismo nas misturas de amostras de DNA até a
proporção de 1:30 (Fig 1). Nessas amostras, foi observada a presença de pelo menos dois
picos, que correspondem a indivíduos distintos na mesma análise.
Nas amostras de DNA isoladas a partir de misturas de sangue foi observada a presença de
microquimerismo nas proporções 1:1, 1:5 e 1:10 (Fig 2). Nesses casos, também foram
observados os alelos provenientes de diferentes indivíduos.
Com a análise das amostras de DNA obtidas dos pacientes transfundidos não ficou
evidenciada a presença de microquimerismo em nenhum dos pacientes nem em tempos
distintos das análises após a transfusão sanguínea, nem mesmo nas primeiras 24 horas
após esse procedimento (Fig 3).
46
DISCUSSÃO
O número de relatos com a observação de microquimerismo têm aumentando em várias
áreas da medicina nos últimos anos, mas ainda são poucos os estudos sobre este assunto,
sendo, em geral, limitados a análise de cromossomo Y em mulheres
12
. A transfusão de
sangue é uma das fontes freqüentes de ocorrência de microquimerismo e foi demonstrado
previamente em várias situações, inclusive em pacientes de trauma que fizeram múltiplas
transfusões
13
.
A hipótese que o pequeno número de células do doador possam interferir no
diagnóstico genético do receptor após uma transfusão sangüínea ainda não foi
completamente comprovada, pois após a transfusão sanguínea, o receptor tem células do
doador circulantes no seu organismo devido a presença de leucócitos em produtos e
derivados de sangue de doadores alogênicos, mesmo em casos em que as bolsas de
sangue recebidas pelo paciente tenham sido previamente irradiadas. Além disso, ainda não
existem relatos claros do limite de tempo que as células do doador permanecem na
circulação do receptor, o que acarreta dúvidas em relação ao tempo de espera para
realização de exames moleculares em pacientes transfundidos.
Devido a esses fatores, o nosso trabalho avaliou inicialmente o limite de detecção de
microquimerismo em amostras provenientes de misturas (tanto de DNA previamente
extraído como de DNA extraído após uma mistura de sangue de indivíduos distintos) nas
condições e com a metodologia do laboratório, a análise de STRs por PCR multiplex e
eletroforese capilar. Testes semelhantes a esses já foram usados para detecção de
microquimerismo
7
. Essa metodologia é altamente sensível para a avaliação do
microquimerismo e os marcadores escolhidos foram os seguintes: D3S1358, D16S539,
TH01, TPOX, CSF1PO e D7S820. Esses STRs são altamente polimórficos e apresentam
alto poder de exclusão, sendo rotineiramente usados em estudos de identificação humana.
Além do uso da PCR, a qual já foi exaustivamente empregada em análises de pequenas
47
quantidades de DNA, já ficou também demonstrado previamente que a eletroforese
capilar apresenta alta sensibilidade e precisão na detecção de misturas quiméricas, tanto
em estudos in vivo como in vitro
14
. No nosso trabalho, a sensibilidade de detecção nas
condições testadas foi avaliada através de misturas de DNA e de misturas de sangue em
proporções variadas. Os resultados obtidos demonstraram que, tanto as misturas de DNA
como as misturas de sangue antes do procedimento de extração de DNA, foram detectadas
até uma determinada proporção (1:30 e 1:10, respectivamente), o que representa 3,3% e
10%. Essas proporções são semelhantes aos dados publicados previamente
14
. Portanto, a
metodologia aplicada demonstrou sensibilidade adequada para identificar alelos da
chamada “população menor” de células até um percentual de aproximadamente 3,0%.
Utilizando a mesma metodologia, analisamos amostras provenientes de 20 pacientes que
foram submetidos a transfusão sangüínea e não observamos a presença de microquimerimo
em nenhuma das amostras coletadas até 24 hs após a transfusão. Esses resultados podem
ser explicados pela grande diluição que ocorre entre o sangue do doador e do receptor no
momento da transfusão. Uma análise mais detalhada dessa hipótese deveria ser realizada
levando em consideração o volume de sangue de cada indivíduo. Mas, considerando um
volume médio de um indivíduo adulto de 8 litros e considerando que o volume das
transfusões variaram de 248 a 392 ml, poderíamos estimar um percentual entre 3,1% e
4,9% de material do doador no receptor. Portanto, segundo os testes realizados na primeira
etapa desse trabalho, esses valores estariam abaixo do limite mínimo de detecção da
metodologia utilizada no grupo de misturas de sangue, limite esse estabelecido em 10%.
Esse estudo analisou um número limitado de indivíduos e um estudo complementar mais
amplo deve ser realizado para confirmar os resultados obtidos nesse trabalho. Entretanto,
considerando que as metodologias utilizadas para a realização de análises moleculares em
geral não apresentam, com a tecnologia disponível atualmente, maior sensibilidade que a
metodologia aplicada nesse estudo, podemos considerar que transfusões com pequeno
48
volume de hemoderivado não devem interferir em resultados moleculares. Portanto, os
resultados obtidos nesse estudo indicam que transfusões sangüíneas rotineiramente
realizadas em hospitais não representam risco de interferência em análises moleculares,
mesmo em amostras coletadas nas primeiras 24 horas após a realização desse
procedimento clínico.
49
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer a Drª Liane Rohsig, a enfermeira Angélica Ghinato e a
secretária Marilaine Sá de Castro do Banco de sangue do HCPA, pela disponibilidade e
colaboração para a realização desse trabalho. Os especiais agradecimentos aos colegas do
laboratório de Identificação Genética do HCPA, André Zoratto Gastaldo e Hugo Bock, pelo
apoio nos mais variados momentos. A colega do laboratório de Genética Molecular do
Serviço de Genética Médica, Bianca Cruz, pelo auxílio na coleta das amostras e aos demais
funcionários do Serviço de Genética Médica e do Serviço de Hematologia do HCPA.
Esse trabalho teve o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), do Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (FIPE-HCPA) e da Pró-Reitoria de Pesquisa (PROPESQ) da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul.
50
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52
Tabela 1 – Padrão alélico das amostras de DNA.
MARCADOR
Amostras
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
A
14/15 8/9 6/7 11/11 11/12 9/12 XY
B
16/17 10/13 8/9 8/8 10/10 8/9 XX
C
16/16 10/12 8/9.3 8/10 10/10 10/11 XX
D
14/17 9/9 9/9 8/11 10/12 9/9 XY
E
15/15 12/13 6/9.3 8/11 13/13 9/10 XY
F
16/18 9/12 9/9.3 10/11 12/12 11/12 XX
G
15/17 11/11 7/9.3 8/9 12/12 8/12 XX
H
16/17 12/12 6/6 8/11 11/11 10/11 XY
I
16/18 11/11 7/7 11/11 10/11 11/12 XX
J
15/16 9/9 9/9.3 8/9 10/11 8/11 XY
K
15/17 12/13 8/9.3 8/10 10/12 9/10 XY
L
16/18 11/14 6/6/ 8/8 10/11 10/11 XX
M
16/17 11/12 9.3/9.3 11/11 10/11 10/10 XY
N
16/16 11/12 8/9.3 8/12 10/11 10/13 XX
53
Tabela 2 – Padrão alélico das amostras de sangue.
MARCADOR
Amostras
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
1
15/18 11/11 6/9.3 8/11 10/11 11/11 XY
2
14/16 9/12 8/9 7/8 10/11 8/11 XX
3
15/17 11/12 9/9.3 8/12 10/12 8/9 XX
4
16/18 9/11 8/9.3 8/8 11/11 8/10 XY
5
15/17 11/11 7/9.3 8/9 12/12 8/12 XX
6
16/17 12/12 6/6 8/11 11/11 10/11 XY
7
16/18 11/11 7/7 11/11 10/11 11/12 XY
8
15/16 9/9 9/9.3 8/9 10/11 8/11 XX
9
15/17 12/13 8/9.3 8/10 10/12 9/10 XY
10
16/18 11/14 6/6 8/8 10/11 10/11 XX
54
Tabela 3 – Padrão alélico das amostras de cada transfusão.
MARCADOR
Amostras
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
Paciente 15/18 10/12 9.3/9.3 11/11 10/10 9/11 XY
Transfusão 1
Bolsa 16/16 13/13 6/9.3 8/8 11/13 11/12 XY
Paciente 16/16 13/13 7/9.3 8/8 10/13 10/11 XX
Transfusão 2
Bolsa 16/16 11/13 7/9.3 8/8 11/11 8/11 XY
Paciente 17/17 8/12 9/9.3 8/11 9/11 8/12 XX
Transfusão 3
Bolsa 17/18 9/14 9/9.3 8/11 10/12 8/11 XY
Paciente 17/17 12/13 9/9.3 8/12 10/11 11/12 XY
Transfusão 4
Bolsa 16/16 11/11 9.3/9.3 8/8 10/12 10/10 XX
Paciente 14/15 12/12 7/8 8/11 10/12 11/12 XY
Transfusão 5
Bolsa 15/17 12/13 9/9.3 8/8 10/12 10/11 XY
Paciente 15/16 12/12 6/7 8/8 10/12 8/9 XY
Transfusão 6
Bolsa 15/17 9/10 7/7 6/9 10/10 10/12 XY
Paciente 14/15 12/13 8/9 8/11 10/10 8/10 XX
Transfusão 7
Bolsa 14/16 10/13 6/7 11/11 10/10 11/12 XY
Paciente 15/18 10/12 6/9.3 9/12 11/12 9/11 XX
Transfusão 8
Bolsa 17/17 11/12 6/9.3 8/10 10/11 10/11 XY
Paciente 16/17 8/11 7/7 8/11 12/13 10/10 XY
Transfusão 9
Bolsa 14/15 11/13 6/8 9/11 10/12 11/12 XY
Paciente 15/18 12/12 7/9 8/8 10/10 11/11 XX
Transfusão 10
Bolsa 15/16 11/12 6/9.3 8/8 11/11 11/11 XY
Paciente 15/15.2 9/13 7/9.3 10/10 10/11 8/10 XX
Transfusão 11
Bolsa 15/16 11/13 9.3/9.3 9/12 11/12 8/11 XY
Paciente 14/18 9/14 7/7 8/10 11/13 8/12 XY
Transfusão 12
Bolsa 15/18 9/11 7/9 8/11 11/13 10/10 XY
Paciente 14/14 13/13 6/8 8/9 11/12 9/11 XY
Transfusão 13
Bolsa 15/16 11/11 6/9.3 8/12 12/12 10/10 XY
Paciente 14/15 9/11 7/9.3 8/8 12/12 10/12 XX
Transfusão 14
Bolsa 17/17 11/13 7/9.3 8/8 10/12 9/10 XY
Paciente 15/16 10/10 7/9.3 8/9 10/12 10/11 XX
Transfusão 15
Bolsa 15/17 11/11 9.3 9.3 8/9 10/12 XX
Paciente 15/16 9/9 9/9.3 8/11 10/12 9/10 XY
Transfusão 16
Bolsa 15/15 11/15 6/9 8/8 10/13 11/11 XX
Paciente 15/17 11/11 6/6 9/11 10/11 10/10 XY
Transfusão 17
Bolsa 15/17 10/13 6/9.3 11/11 11/12 11/12 XY
Paciente 15/15 11/12 9.3/9.3 8/8/ 10/11 10/12 XX
Transfusão 18
Bolsa 14/17 13/13 7/9 8/11 11/12 10/10 XY
Paciente 15/17 12/13 6/9.3 8/11 10/12 9/12 XX
Transfusão 19
Bolsa 15/16 9/12 7/7 7/11 8/11 9/10 XY
Paciente 16/17 10/11 7/8 7/11 8/11 10/11 XX
Transfusão 20
Bolsa 17/17 11/11 9.3/9.3 8/8 11/12 10/12 XY
55
FIGURA 1
(A)
(B)
(C)
(D)
(F)
(E)
(G)
56
FIGURA 2
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
57
FIGURA 3
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
58
Legendas das figuras
Figura 1 – Análise dos marcadores D3S1358 e D16S539 em misturas de DNA. (A) escada
alélica; (B) alelos da amostra I; (C) alelos da amostra J; (D) alelos da mistura I+J na
proporção 1:1; (E) alelos da mistura I+J na proporção 1:10; (F) alelos da mistura I+J na
proporção 1:20; (G) alelos da mistura I+J na proporção 1:30.
Figura 2 – Análise dos marcadores D3S1358 e D16S539 nas misturas de sangue. (A)
escada alélica; (B) alelos da amostra 5; (C) alelos da amostra 6; (D) alelos da mistura 5+6
na proporção 1:1; (E) alelos da mistura 5+6 na proporção 1:10; (F) alelos da mistura 5+6 na
proporção 1:15.
Figura 3 – Análise dos marcadores TH01, TPOX e CSF1PO na transfusão sangüínea 19. (A)
escada alélica; (B) alelos da unidade de concentrado de hemácias usada para a transfusão;
(C) alelos do receptor da transfusão; (D) alelos do receptor da transfusão coletada nas
primeiras 24 hs após a transfusão; (E) alelos do receptor da transfusão coletada entre 48 e
72 hs após a transfusão; (F) alelos do receptor da transfusão coletada entre 144 e 168 hs
após a transfusão.
.
59
8. ARTIGO EM INGLÊS
EVALUATION OF MICROCHIMERISM BY MICROSATELLITE ANALYSIS IN
PATIENTS SUBMITTED TO BLOOD TRANSFUSION
Running head: microchimerism in patients post-transfusion
Ana Carolina Mardini
1
, Rodrigo Rodenbusch
1
, Maria Helena Albarus
1
, Simone Schumacher
1
,
Ursula Matte
2
, Roberto Giugliani
1,2,3
, Maria Luiza Saraiva-Pereira
1,2,4
.
1
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisas – HCPA;
2
Serviço de
Genética Médica – HCPA;
3
Depart. de Genética e
4
Depart. de Bioquímica – UFRGS – Porto
Alegre, RS.
Corresponding author:
Maria Luiza Saraiva-Pereira, PhD
Laboratório de Identificação Genética - Centro de Pesquisas
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Rua Ramiro Barcelos, 2350
90035-903, Porto Alegre, RS, Brasil
Tel: + 55 51 21018011
Tel: + 55 51 21018010
E-mail: [email protected]
Manuscript according to instructions of Transfusion
60
ABSTRACT
Background: Microchimerism has been identified in a series of biological situations, being
due to clinical procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure
that can produce a mixture of donor and receptor cells. This work aimed to evaluate, at first,
detection limit of microchimerism, using microssatelites (short tandem repeats - STR), in
mixed biological samples OF controlled proportions and, later, to verify presence and
duration of microchimerism in patients post-blood transfusion in the Hospital de Clínicas de
Porto Alegre. Study design and methods: Analysis was performed in biological samples
from three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood mixtures and
patients submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed individually.
Allelic patterns were performed through PCR, using fluorescent primers, followed by
capillary electrophoresis, with amplification of the following genome regions: D3S1358,
D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. Results: In the group of DNA
mixtures, microchimerism was observed up to 1:30 (or 3,3%). In the group of blood mixtures,
microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of microchimerism
was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to blood
transfusion. Conclusion: These results suggest that the applied methodology is sensitive to
identify microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3,3%. Therefore, we can
conclude that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this
study did not reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.
Key words: microchimerism, blood transfusion, STR
61
INTRODUCTION
Microchimerism may occur in several biological situations, both in physiological conditions
as well as a result of clinical practice. In many situations, in a given biological sample,
nucleated cells from a genetically distinct individual can be found (microchimerism)
1-5
. This
situation can occur in cases such as bone marrow transplantation, organ transplantation,
pregnancy, and in blood transfusions; situations where donor cells can co-exist in the
recipient’s blood for a period of time
6
. In organ transplantation, microchimerism has been
associated with the tolerance induction and/or maintenance of the transplanted organ
5
; the
exchange of migratory leukocytes between organ and recipient can create tolerance to
graft
7
. The presence of chimerism after bone marrow transplantation is essential for
transplant success
8
. In pregnancy, chimeric cells occur as a result of the bidirectional traffic
between the mother’s cells and those of the foetus
4
. Moreover, the occurrence of fetal and
maternal microchimerism is associated to autoimmune diseases
1
.
In blood transfusions, where red blood cells are the major component, microchimeric
interference is due to donor leukocytes. Even blood cell components previously processed
may contain a small portion of leukocytes. In some cases, the routine administration of
blood-derived products may be the main cause of diseases
9
because these
hemocomponents from allogeneic donors contain leukocytes capable of surviving and
expanding
10
. Leukocytes present in bags of red blood cell concentrates used in blood
transfusions may cause graft-versus-host disease (GVHD), as well as fever and, viral
transmission, and may interfere in the genetic identification of the recipient. Previous studies
have estimated the presence of around 10
9
leukocytes per unit of red blood cells or platelet
concentrate
11
.
DNA analysis is routinely performed in many laboratories worldwide, and is used not only for
human identification and forensic medicine but also for molecular evaluation aiming at the
62
identification of genetic predispositions and diagnosis of inherited diseases. One of the
potential problems in the routine of these laboratories is the analysis of patients who have
been recently transfused, especially with total blood, red blood cell concentrate, or another
derivate that contains a small ratio of leukocytes.
Some studies published in the literature evaluated different methodologies for monitoring
microchimerism in specific situations. These studies showed different results, depending on
type of sample/patients evaluated and level of sensibility of the technique applied in each
situation.
In the present study, at first we evaluated the microchimerism detection limit trhough
microsatallite analysis in mixed biological samples in known proportions, and later
microchimerism presence and duration time was assessed in patients submitted to blood
transfusion in Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
63
MATERIAL AND METHODS
Biological Materials
During this work, three different groups of biological samples were evaluated. These groups
are defined below:
Group 1: DNA samples mixtures were prepared from biological material to be discarded.
Fourteen samples were used in total, being 7 from males and 7 from females; these
individuals were all unrelated. These DNA samples were quantified and mixed (1 sample
from a male with 1 sample from a female) according the following ratios: 1:1, 1:5, 1:10, 1:20,
1:25, and 1:30. Moreover, 4 samples were also mixed in ratios of 1:50 and 1:100.
Group 2: Blood samples mixtures were also obtained from biological material to be
discarded. Ten samples were used in total, being 5 from males and 5 from females; these
individuals were also all unrelated. These blood samples were mixed in the following ratios:
1:1, 1:10, 1:15, and 1:20. After being mixed, blood was submitted to DNA extraction and
DNA concentration was quantified in each mixture.
Group 3: Twenty patients, aged between 19 and 81 (mean 60 years), transfused and
hospitalized at Hospital de Clínicas de Porto Alegre were selected. The inclusion criterion
was patient submitted to blood transfusion with one blood unit that is a concentrate of
irradiated or nonirradiated red blood cells, in a volume varying from 248 to 392ml. Exclusion
criteria were patients that received leucorreduction red blood cells concentrates or filtrates
and individuals younger than 18 years of age. One sample before and at least one sample
within 24-h after the transfusion were collected from patients. In addition, a second sample
from six different individuals was collected within 24 and 48h after the transfusion. Finally,
64
one sample taken at different times was also collected, within 7 days (or 168h) after the
blood transfusion. All blood bags were analyzed and allelic pattern was defined separately.
DNA Extraction
DNA was isolated from total blood of all samples through salt precipitation method and
purification in alcohol solution using the Wizard® Genomic DNA purification Kit (Promega).
DNA concentration from each sample was determined by optical density (OD) reading in
260nm, and all samples analyzed were diluted to a DNA concentration of 2ng/µl.
PCR
Before and after samples (DNA or blood) mixing or transfusion, 1µl of DNA from each
sample was submitted to a PCR multiplex, using the AmpFlSTR Cofiler Plus
TM
kit (Applied
Biosystems
®
), which enables for the analysis of the following markers (STRs): D3S1358,
D16S539, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820, and Amelogenin, using fluorescent primers;
according to manufacturer’s instructions. Amplification conditions were as follows: initial
denaturation at 95
0
C for 11min, followed by 28 cycles at 94
0
C for 1min, 59
0
C for 1min, and
72
0
C for 1min, followed by a final extension at 60
0
C for 45min. PCR reaction was performed
in a thermocycler MJ Research – PTC-100.
PCR products analysis
PCR products were analyzed by capillary electrophoresis in the genetic analyzer ABI Prism
3100 (Applied Biosystems
®
) using Gene Scan-500 ROX as an internal marker. Data were
colleted by using DataCollection
®
v.1.1 program and analyzed using GeneScan
®
v.3.7
program (Applied Biosystems
®
). Alleles were identified through Genotyper Software
®
65
(Applied Biosystems
®
) that determined size of alleles, using the AmpFlSTR COfiler
Allelic Ladder as a standard reference.
66
RESULTS
A total of 148 analyses were performed, and the allelic pattern from both mixtures groups as
well as patients before and after transfusion and from blood bags were all identified. All
analyses were made in duplicates. Results of these analyses with the identification of alleles
in each STR are showed in tables 1, 2, and 3.
Microchimerism was observed in the DNA mixtures up to a ratio of 1:30 (Fig 1). In these
samples, at least two peaks were seen that can correspond to biological material from
different individuals in the same analysis. These differences were proved by comparing
results obtained from allelic pattern in the individual allelic pattern.
In the DNA samples isolated from blood mixtures, microchimerism was found in the ratios
1:1, 1:5, and 1:10 (Fig 2). In these cases, alleles from different individuals, based on their
individual allelic pattern, were also found.
Analysis of DNA samples obtained from transfused patients did not show microchimerism in
any of the patients at any time tested following blood transfusion, not even in samples
colleted within 24-hours after the blood transfusion (Fig 3).
67
DISCUSSION
The number of reports of presence of microchimerism has been increasing in various
medical areas in the past years; however, studies on this matter are still limited and are
usually restricted to the analysis of chromosome Y in women
12
. Blood transfusion is a
frequent source of microchimerism, and this has been showed in several situations, including
multi-transfused trauma patients
13
.
The hypothesis that a small number of donor cells may
interfere in the genetic diagnosis of the recipient following blood transfusion has not been
fully confirmed, since after a blood transfusion recipients have donor cells circulating in their
body due to the presence of leukocytes in blood products and derivates of allogeneic donors,
even in cases where blood bags have been previously irradiated. In addition, there are no
clear time limits as to how long donor cells remain in the recipient’s circulation, which raises
questions as to how long should one wait to perform molecular assays in transfused patients.
Due to these issues, the present study initially assessed the microchimerism detection limit in
mixed samples (both from previously extracted DNA and DNA extracted after a mixture of
blood from different individuals) under the conditions and according to our laboratory
methodology. Assays that use microsatellites (STRs) analysis have been previously used to
detect microchimerism
7
. This methodology is highly sensitive to microchimerism evaluation
and selected STR were the following: D3S1358, D16S539, TH01, TPOX, CSF1PO, and
D7S820. These STR are highly polymorphic and show high exclusion power, being routinely
used in human identification studies. Besides the use of PCR, which have been exhaustively
employed to analyze small amounts of DNA, it was also already demonstrated that capillary
electrophoresis shows high sensibility and precision in the detection of chimeric mixtures, in
both in vivo and in vitro studies
14
. In the present study, detection sensibility under the
conditions tested was evaluated by means of DNA mixtures and blood mixtures in different
ratios. The results obtained herein showed that both DNA mixtures and blood mixtures
68
before the DNA extraction were detected up to a certain ratio (1:30 and 1:10,
respectively) that represents 3.3% and 10%. These ratios are similar to data published in the
literature
14
. Therefore, the methodology applied showed adequate sensibility to identify
alleles of the so-called “smaller population” of cells up to a percentage of approximately 3%.
Using the same methodology, samples of 20 patients submitted to blood transfusions were
analyzed, and microchimerism was not seen in any of them within 24h after the transfusion.
This result may be due to the great dilution that happens between donor and recipient blood.
We are aware that a more detailed study should be performed to test this hypothesis taking
into consideration blood volume of each individual. However, considering a mean volume of
8 liters for an adult and the fact that the volume of transfusions ranged between 248 and 392
ml, a percentage between 3.1% and 4.9% of donor material in the recipient could be
estimated. Therefore, according to assays previously carried out, these values would be
below the detection limit established in the mixed blood group using the methodology
employed herein that was determined to be 10%.
We are aware that number of samples evaluated here is limited and a wider study would be
important to confirm our findings. However, considering that methodologies used to perform
molecular analyses do not usually have greater sensibility than the methodology applied
here, we can suggest that transfusions of small volumes of hemoderivates should not
interfere in molecular results. Therefore, results generated by this study indicate that blood
transfusions routinely performed in hospitals do not represent interference risk for molecular
analyses, even when a blood sample is colleted within the first 24 hours after this clinical
procedure.
69
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank Dr Liane Rohsig, Nurse Angélica Ghinato, and the secretary
Marilaine Sá de Castro for their availability and collaboration to this study. Our special thanks
to André Zoratto Gastaldo and Hugo Bock for their help at any time. We would like to also
thank our colleague from Molecular Genetics Laboratory, Bianca Cruz, for her help with
sample collection, and to the staff of Medical Genetics Service and Hematology Service
(HCPA).
This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Research Funding of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (FIPE-
HCPA) and PROPESq-UFRGS.
70
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72
Table 1 – DNA samples allelic pattern.
MARKER
Samples
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
A
14/15 8/9 6/7 11/11 11/12 9/12 XY
B
16/17 10/13 8/9 8/8 10/10 8/9 XX
C
16/16 10/12 8/9.3 8/10 10/10 10/11 XX
D
14/17 9/9 9/9 8/11 10/12 9/9 XY
E
15/15 12/13 6/9.3 8/11 13/13 9/10 XY
F
16/18 9/12 9/9.3 10/11 12/12 11/12 XX
G
15/17 11/11 7/9.3 8/9 12/12 8/12 XX
H
16/17 12/12 6/6 8/11 11/11 10/11 XY
I
16/18 11/11 7/7 11/11 10/11 11/12 XX
J
15/16 9/9 9/9.3 8/9 10/11 8/11 XY
K
15/17 12/13 8/9.3 8/10 10/12 9/10 XY
L
16/18 11/14 6/6/ 8/8 10/11 10/11 XX
M
16/17 11/12 9.3/9.3 11/11 10/11 10/10 XY
N
16/16 11/12 8/9.3 8/12 10/11 10/13 XX
73
Table 2 – Blood samples allelic pattern.
MARKER
Sample
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
1
15/18 11/11 6/9.3 8/11 10/11 11/11 XY
2
14/16 9/12 8/9 7/8 10/11 8/11 XX
3
15/17 11/12 9/9.3 8/12 10/12 8/9 XX
4
16/18 9/11 8/9.3 8/8 11/11 8/10 XY
5
15/17 11/11 7/9.3 8/9 12/12 8/12 XX
6
16/17 12/12 6/6 8/11 11/11 10/11 XY
7
16/18 11/11 7/7 11/11 10/11 11/12 XY
8
15/16 9/9 9/9.3 8/9 10/11 8/11 XX
9
15/17 12/13 8/9.3 8/10 10/12 9/10 XY
10
16/18 11/14 6/6/ 8/8 10/11 10/11 XX
74
Table 3 – Allelic patterns from samples from each blood transfusion.
MARKER
Samples
D3S1358 D16S539 TH01 TPOX CSF1PO D7S820 Amelo
Patient 15/18 10/12 9.3/9.3 11/11 10/10 9/11 XY
Transfusion 1
Bag 16/16 13/13 6/9.3 8/8 11/13 11/12 XY
Patient 16/16 13/13 7/9.3 8/8 10/13 10/11 XX
Transfusion 2
Bag 16/16 11/13 7/9.3 8/8 11/11 8/11 XY
Patient 17/17 8/12 9/9.3 8/11 9/11 8/12 XX
Transfusion 3
Bag 17/18 9/14 9/9.3 8/11 10/12 8/11 XY
Patient 17/17 12/13 9/9.3 8/12 10/11 11/12 XY
Transfusion 4
Bag 16/16 11/11 9.3/9.3 8/8 10/12 10/10 XX
Patient 14/15 12/12 7/8 8/11 10/12 11/12 XY
Transfusion 5
Bag 15/17 12/13 9/9.3 8/8 10/12 10/11 XY
Patient 15/16 12/12 6/7 8/8 10/12 8/9 XY
Transfusion 6
Bag 15/17 9/10 7/7 6/9 10/10 10/12 XY
Patient 14/15 12/13 8/9 8/11 10/10 8/10 XX
Transfusion 7
Bag 14/16 10/13 6/7 11/11 10/10 11/12 XY
Patient 15/18 10/12 6/9.3 9/12 11/12 9/11 XX
Transfusion 8
Bag 17/17 11/12 6/9.3 8/10 10/11 10/11 XY
Patient 16/17 8/11 7/7 8/11 12/13 10/10 XY
Transfusion 9
Bag 14/15 11/13 6/8 9/11 10/12 11/12 XY
Patient 15/18 12/12 7/9 8/8 10/10 11/11 XX
Transfusion 10
Bag 15/16 11/12 6/9.3 8/8 11/11 11/11 XY
Patient 15/15.2 9/13 7/9.3 10/10 10/11 8/10 XX
Transfusion 11
Bag 15/16 11/13 9.3/9.3 9/12 11/12 8/11 XY
Patient 14/18 9/14 7/7 8/10 11/13 8/12 XY
Transfusion 12
Bag 15/18 9/11 7/9 8/11 11/13 10/10 XY
Patient 14/14 13/13 6/8 8/9 11/12 9/11 XY
Transfusion 13
Bag 15/16 11/11 6/9.3 8/12 12/12 10/10 XY
Patient 14/15 9/11 7/9.3 8/8 12/12 10/12 XX
Transfusion 14
Bag 17/17 11/13 7/9.3 8/8 10/12 9/10 XY
Patient 15/16 10/10 7/9.3 8/9 10/12 10/11 XX
Transfusion 15
Bag 15/17 11/11 9.3 9.3 8/9 10/12 XX
Patient 15/16 9/9 9/9.3 8/11 10/12 9/10 XY
Transfusion 16
Bag 15/15 11/15 6/9 8/8 10/13 11/11 XX
Patient 15/17 11/11 6/6 9/11 10/11 10/10 XY
Transfusion 17
Bag 15/17 10/13 6/9.3 11/11 11/12 11/12 XY
Patient 15/15 11/12 9.3/9.3 8/8/ 10/11 10/12 XX
Transfusion 18
Bag 14/17 13/13 7/9 8/11 11/12 10/10 XY
Patient 15/17 12/13 6/9.3 8/11 10/12 9/12 XX
Transfusion 19
Bag 15/16 9/12 7/7 7/11 8/11 9/10 XY
Patient 16/17 10/11 7/8 7/11 8/11 10/11 XX
Transfusion 20
Bag 17/17 11/11 9.3/9.3 8/8 11/12 10/12 XY
75
FIGURE 1
(A)
(B)
(C)
(D)
(F)
(E)
(G)
76
FIGURE 2
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
77
FIGURE 3
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
78
Figure legends
Figure 1 – Analysis of D3S1358 and D16S539 markers in DNA mixtures. (A) allelic ladder;
(B) alleles of sample I; (C) alleles of sample J; (D) alleles of mixture I+J in the ratio 1:1; (E)
alleles of mixture I+J in ration 1:10; (F) alleles of mixture I+J in ration 1:20; (G) alleles of
mixture I+J in ration 1:30.
Figure 2 – Analysis of D3S1358 and D16S539 markers in blood mixtures. (A) allelic ladder;
(B) alleles of sample 5; (C) alleles of sample 6; (D) alleles of mixture 5+6 in the ratio 1:1; (E)
alleles of mixture 5+6 in ratio 1:10; (F) alleles of mixture 5+6 in ration 1:15.
Figure 3 – Analysis of TH01, TPOX and CSF1PO markers in transfusion 19. (A) allelic
ladder; (B) alleles from the unit of red blood cells concentrate used in the transfusion; (C)
alleles from transfusion receptor; (D) alleles from transfusion receptor of a sample collected
within first 24 hours post-transfusion; (E) alleles from transfusion receptor of a sample
collected between 48 and 72 hours post-transfusion; (F) alleles from transfusion receptor of a
sample collected between 144 and 168 hours post-transfusion.
79
M322a Mardini, Ana Carolina
Avaliação de microquimerismo por análise de
microssatélites em pacientes submetidos à transfusão
sanguínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. / Ana
Carolina Mardini; orient. Maria Luiza Saraiva Pereira – 2006.
78 f. il. col.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal Rio Grande
do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação
em Medicina: Ciências Médicas. Porto Alegre, BR-RS, 2006.
1. Transfusão de sangue 2. Quimerismo 3. Satélite I.
Pereira, Maria Luiza Saraiva II. Título.
NLM: WH 120
Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
Este trabalho teve apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), do Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre e da Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul.
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