( PDF ) Estudo de modelo animal de [alfa]-manosidose induzida por Sida capinifolia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS

MÉDICAS

ESTUDO DE MODELO ANIMAL DE α-MANOSIDOSE INDUZIDA

POR SIDA CARPINIFOLIA

MARISETE BEDIN

Orientador: Dr. Roberto Giugliani

Tese de Doutorado

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS

MÉDICAS

ESTUDO DE MODELO ANIMAL DE α-MANOSIDOSE INDUZIDA

POR SIDA CARPINIFOLIA

MARISETE BEDIN

Orientador

: Dr. Roberto Giugliani

Tese apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas,

Mestrado e Doutorado, da Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, para obtenção do título de Doutor em

Ciências Médicas.

Tese de Doutorado

2006

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PENSAMENTO

ENQUANTO HOUVER SOL

Quando não houver saída, quando não houver mais solução.

Ainda há de haver saída, nenhuma idéia vale uma vida.

Quando não houver esperança, quando não restar nem ilusão.

Ainda há de haver esperança, em cada um de nós, algo de uma criança.

Enquanto houver sol, enquanto houver sol, ainda haverá.

Enquanto houver sol, enquanto houver sol.

Quando não houver caminho, mesmo sem amor, sem direção.

A sós ninguém está sozinho, é caminhando que se faz o caminho.

Quando não houver desejo, quando não restar nem mesmo dor.

Ainda há de haver desejo, em cada um de nós, aonde Deus colocou.

Enquanto houver sol, enquanto houver sol, ainda haverá.

Enquanto houver sol.

Titãs

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese a meu filho Guilherme, que através

de seu sorriso de criança mostra a cada dia que existe esperança e

ilusão, me dá forças para seguir em frente, seguir meu caminho,

mostrando que sempre haverá uma saída.

Eu te amo meu filho.

Marisete

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas e instituições que de forma direta ou

indireta contribuíram para que este trabalho fosse realizado e em especial:

Ao Dr. Roberto Giugliani, professor do Departamento de Genética

da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e chefe do Serviço de Genética

Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, em aceitar me orientar neste

trabalho, pela oportunidade, incentivo e exemplo de pesquisador.

Ao Dr. David Driemeier, professor do Departamento de Patologia

Clínica Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela colaboração

no trabalho e por ceder as instalações da Faculdade de Veterinária durante os

experimentos com os caprinos.

Ao Dr. Edson Moleta Colodel, professor do Departamento de

Clínica Médica Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso e professor

colaborador do Departamento de Patologia Clínica Veterinária da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, pela sua diária e incessante dedicação junto aos

caprinos durante os experimentos realizados, pela coordenação da equipe de

bolsistas que o auxiliaram nesta tarefa árdua e pela amizade.

À Marli Viapiana e Jurema De Mari, farmacêuticas/bioquímicas,

Régis Rolim Guidobono, biólogo, Christine Rachelle Prescendo Chaves e Kátia

Lazzaroni, bolsistas de iniciação científica, todos do Laboratório de Erros Inatos do

Metabolismo do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, pelo auxílio na realização das

análises enzimáticas e cromatografias, pelo apoio e principalmente pela amizade.

À Dra. Maira Burin, pela colaboração na realização deste trabalho.

Á Dra. Rossana Peres, médica pediatra, pela ajuda na realização

das análises estatísticas e pela amizade.

À Dra. Ursula Matte, bióloga do Centro de Terapia Gênica do

Hospital de Clínicas de Porto Alegre, pelo auxílio e por disponibilizar o laboratório

para o cultivo das células e à bióloga Cristina Rojas Kath pela realização do cultivo

das células.

Aos colegas do Serviço de Genética Médica do Hospital de

Clínicas de Porto Alegre, pela amizade.

À Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instituição que devo

imensa gratidão por toda minha formação acadêmica e mestrado, pela oportunidade

em obter mais este título.

Ao Curso de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul e seu corpo docente, pela minha

qualificação e obtenção deste título.

A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), ao Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação (GPPG) e ao Fundo

de Incentivo à Pesquisa e Eventos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

(FIPE/HCPA), pelo auxílio financeiro.

A meus pais Almerindo e Ivany, a minha irmã Margarete e ao meu

sobrinho Matheus Henrique, por fazerem parte da minha vida.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................13

FIGURA DA REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................13

FIGURA DO PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS.................................................................13

FIGURA DO PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS .........................................................................14

LISTA DE TABELAS ..........................................................................................................14

TABELAS DA REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................14

TABELAS DO PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS...............................................................15

TABELAS DO PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS .........................................................15

TABELAS DO SEGUNDO ARTIGO EM PORTUGUÊS.................................................16

TABELAS DO SEGUNDO ARTIGO EM INGLÊS........................................................................16

INTRODUÇÃO.....................................................................................................................17

REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................19

OLIGOSSACARIDOSES............................................................................................................19

OLIGOSSACARÍDEOS..............................................................................................................23

α- MANOSIDOSE.................................................................................................................24

ENZIMA α-MANOSIDASE...................................................................................................24

ESTRUTURA DO GENE............................................................................................................25

ASPECTOS CLÍNICOS .............................................................................................................26

DIAGNÓSTICO ........................................................................................................................27

TRATAMENTO ........................................................................................................................28

PREVALÊNCIA DA DOENÇA ...................................................................................................30

MODELO ANIMAL ..................................................................................................................32

OBJETIVOS..........................................................................................................................34

OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................34

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................34

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA REVISÃO DA LITERATURA....................35

PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS .........................................................................42

RESUMO...............................................................................................................................43

INTRODUÇÃO.....................................................................................................................44

MATERIAL E MÉTODO....................................................................................................45

ANIMAIS EXPERIMENTAIS.......................................................................................................45

AMOSTRAS ..............................................................................................................................45

SEPARAÇÃO DOS LEUCÓCITOS ................................................................................................46

ANÁLISE ENZIMÁTICA.............................................................................................................47

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA DE OLIGOSSACARÍDEOS.......................................48

ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................................48

RESULTADOS......................................................................................................................49

DISCUSSÃO..........................................................................................................................53

AGRADECIMENTOS..........................................................................................................55

BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................56

PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS...................................................................................60

ABSTRACT...........................................................................................................................61

INTRODUCTION.................................................................................................................62

MATERIALS AND METHODS..........................................................................................63

EXPERIMENTAL ANIMALS.......................................................................................................63

SAMPLES .................................................................................................................................63

LEUKOCYTE ISOLATION ..........................................................................................................64

ENZYME ASSAYS.....................................................................................................................64

THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) OF OLIGOSACCHARIDES (OLS) .............................65

TATISTICAL ANALYSIS..........................................................................................................66

RESULTS ..............................................................................................................................67

DISCUSSION........................................................................................................................71

ACKNOWLEDGEMENTS..........................................................................................................73

BIBLIOGRAPHY.................................................................................................................74

SEGUNDO ARTIGO EM PORTUGUÊS ..........................................................................78

RESUMO...............................................................................................................................79

INTRODUÇÃO.....................................................................................................................80

MATERIAL E MÉTODO....................................................................................................81

ANIMAIS EXPERIMENTAIS.......................................................................................................82

CULTURA DE FIBROBLASTOS DE CAPRINOS............................................................................82

ANÁLISE DA α-MANOSIDASE, β-MANOSIDASE E β-GALACTOSIDASE....................................83

ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................................84

RESULTADOS..........................................................................................................................85

DISCUSSÃO..........................................................................................................................87

AGRADECIMENTOS ................................................................................................................88

BIBLIOGRAFIA........................................................................................................................89

SEGUNDO ARTIGO EM INGLÊS....................................................................................92

ABSTRACT...........................................................................................................................93

INTRODUTION....................................................................................................................94

MATERIAL AND METHODS....................................................................................................95

XPERIMENTAL ANIMALS.......................................................................................................96

GOAT FIBROBLASTS CULTURE................................................................................................96

ASSAY OF α-MANNOSIDASE, β-MANNOSIDASE AND β-GALACTOSIDASE..............................97

STATISTICAL ANALYSIS..........................................................................................................98

RESULTS .................................................................................................................................99

DISCUSSION......................................................................................................................101

ACKNOWLEDGEMENTS........................................................................................................102

BIBLIOGRAPHY...............................................................................................................103

CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................................106

LISTA DE FIGURAS

FIGURA DA REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1: Rota metabólica de degradação de oligossacarídeos

FIGURA DO PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS

Figura 1: Cromatografia de camada delgada de OLS em urina de caprinos

alimentados com Sida carpinifolia (94 e 28 dias).

FIGURA DO PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS

Figure 1: Thin layer chromatography of OLS in urine of goats fed with Sida

carpinifolia (94 and 28 days).

LISTA DE TABELAS

TABELAS DA REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 1: Aspectos moleculares e bioquímicos das oligossacaridoses

Tabela 2: Freqüência estimada das oligossacaridoses

TABELAS DO PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS

Tabela 1:

Efeito da dieta com Sida carpinifolia (94 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-galactosidase em leucócitos de caprinos.

Tabela 2: Efeito da dieta com Sida carpinifolia (28 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-galactosidase em leucócitos de caprinos.

Tabela 3: Efeito da dieta com Sida carpinifolia (28 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-glactosidase em plasma de caprinos.

TABELAS DO PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS

Table 1:

Efeito da dieta com Sida carpinifolia (28 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-glactosidase em plasma de caprinos.

Table 2:

Short term effect of Sida carpinifolia diet on α-mannosidase, β-

mannosidase, and β-galactosidase activities in goat leukocytes.

Table 3:

Short term effect of Sida carpinifolia diet on α-mannosidase, β-

mannosidase, and β-galactosidase activities in goat plasma.

TABELAS DO SEGUNDO ARTIGO EM PORTUGUÊS

Tabela 1: Efeito in vivo da dieta com Sida carpinifolia em cultura de fibroblastos de

caprinos sobre a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-

galactosidase.

Tabela 2: Efeito in vitro do swainsonine em cultura de fibroblastos de caprinos sobre

a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-galactosidase.

TABELAS DO SEGUNDO ARTIGO EM INGLÊS

Table 1: In vivo effect of Sida carpinifolia diet in goat fibroblasts culture on α-

mannosidase, β-mannosidase, and β-galactosidase activities.

Table 2: In vitro effect of swainsonine in goat fibroblasts culture on α-mannosidase,

β-mannosidase, and β-galactosidase activities.

INTRODUÇÃO

As doenças lisossômicas de depósito (DLD) representam um

grupo heterogênio de quase 50 doenças genéticas, que possuem em comum um

defeito genético em uma enzima específica, receptor, proteína ativadora, proteína

de membrana ou transportador lisossomal, levando ao acúmulo progressivo de

substratos específicos e deterioração da função celular. A extensão e a severidade

das DLD dependem do tipo e da quantidade do substrato que acumulam, porém

quase todas desordens possuem manifestações clínicas e neurológicas

progressivas. Muitos pacientes com DLD morrem na infância ou na adolescência e

os que sobrevivem apresentam decréscimo no tempo de vida e morbidades

significantes.

A α- manosidose é uma DLD causada pela deficiência da α-

manosidase lisossomal e os indivíduos afetados apresentam acúmulo de

oligossacarídeos na urina e nos tecidos, originários da degradação incompleta

destas macromoléculas dentro dos lisossomos. O fenótipo clínico desta doença é

heterogêneo, variando desde a forma infantil severa até a forma juvenil moderada,

sendo o retardo mental sua principal característica. Considerando que a disfunção

neurológica é a principal característica da α-manosidose humana e que a

patofisiologia dos indivíduos afetados por esta doença ainda é pouco entendida, a

validação de um modelo animal em caprinos possibilitará estudar mecanismos

bioquímicos capazes de explicar a desordem neurológica provocada pela α-

manosidose.

REVISÃO DA LITERATURA

OLIGOSSACARIDOSES

Os lisossomos contêm numerosas hidrolases ácidas que

catabolisam proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, sulfatos, fosfatos e carboidratos

complexos. Cada enzima lisossomal é parte de uma rota metabólica complexa que

reduz macromoléculas em componentes menores, que são reutilizados ou

eventualmente eliminados pela célula. A ausência ou o mau funcionamento de uma

enzima causa o bloqueio desta rota metabólica, levando ao acúmulo progressivo de

produtos intermediários tais como triglicerídeos não degradados, esteróides,

esfingolipídeos, sulfatídeos, esfingomielina, gangliosídeos e lipofucinas, que

ocupam cada vez mais espaço no lissossomo, aumentando o tamanho dos mesmos

e interferindo na função celular.

As oligosacaridoses (glicoproteinoses ou enfermidades de

acúmulo de glicoproteínas) são doenças lisossômicas de depósito cuja causa é a

atividade deficiente de uma das enzimas que participam na degradação das cadeias

de oligossacarídeos das glicoproteínas. A tabela 1 mostra os aspectos moleculares

e bioquímicos das oligossacaridoses. As conseqüências clínicas desses defeitos

dependem do tipo e da quantidade de macromoléculas acumuladas nas células, dos

tecidos envolvidos e da influência destas alterações sobre a fisiologia celular.

Podemos destacar o retardo mental e motor, dismorfias, problemas musculares,

problemas esqueléticos e organomegalias, que ocorrem em idades diferentes,

dependendo do tipo de doença. A α-manosidose é uma doença causada pela

deficiência da enzima α-D-manosidase ácida, produzindo um acúmulo intracelular e

o aumento na excreção urinária de oligossacarídeos ricos em manose [1]. A figura 1

mostra a rota metabólica de degradação de um oligossacarídeo.

Tabela 1 – Aspectos moleculares e bioquímicos das oligossacaridoses.

DOENÇA GENE MUTAÇÃO ENZIMA DEFICIENTE

α-Manosidose MAN B 19p13.2-112 α-manosidase ácida

β-Manosidose MAN B1 4q22-25 β-manosidase

Fucosidose FUCA 1 1p34 α-fucosidase

Sialidose NEU 6p21.3 α-neuraminidase

Adaptado de: Thomas, G.H., Disorders of Glycoprotein degradation: Alpha-

Mannosidosis, Beta-Mannosidosis, Fucosidosis, and Sialidosis: In: The Metabolic

and Molecular Bases of Inherited Disease. Scriver CR, Sly WS, Valle D, editors,

McGraw-Hill, 2001: New York, p.3507-3533.

Figura 1: Rota metabólica de degradação de oligossacarídeos. SA = ácido siálico;

Gal = galactose; GlcNAc = ácido N acetil-glicosamina; Man = manose; Fuc = fucose;

Asn = asparagina. Adaptado de: Thomas, G.H., Disorders of Glycoprotein

degradation: Alpha-Mannosidosis, Beta-Mannosidosis, Fucosidosis, and Sialidosis:

In: The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. Scriver CR, Sly WS,

Valle D, editors, McGraw-Hill, 2001: New York, p.3507-3533.

OLIGOSSACARÍDEOS

Oligossacarídeos são hidratos de carbono (açúcares) pequenos

constituídos de 3 a 100 moléculas de monossacarídeos ligados à asparagina (Asn),

que fornecem diversas modificações pós-traducional às proteínas intracelulares e às

recentemente sintetizadas. A estrutura de um oligossacarídeo influencia na

bioatividade, na conformação, na localização e na imunogenecidade das proteínas,

como também define características de adesão entre glicoconjugados e outras

proteínas. Os oligossacarídeos são mediadores nos processos de reconhecimento

celular [2-5]. Diversas proteínas intra e extracelulares estão ligadas a

oligossacarídeos, incluindo enzimas, receptores de superfície celular, hormônios,

imunoglobulinas e antígenos virais. A biossíntese de oligossacarídeos ligados à Asn

é altamente compartimentalizada nas células eucarióticas e ocorre em membranas

de organelas com rotas metabólicas secretoras, incluindo o retículo endoplasmático

e o complexo de Golgi [6].

α- MANOSIDOSE

A α-manosidose (MIM 248500) foi descrita primeiramente em

1967 por Öckerman como um distúrbio metabólico resultante do defeito

geneticamente condicionado à enzima lisossomal α-manosidase (EC 3 .2.1.24),

responsável pelo catabolismo de glicoproteínas [7]. É uma doença autossômica

recessiva que afeta tanto homens quanto mulheres [8] e que se apresenta

clinicamente através de duas formas: α-manosidose tipo I ou infantil e α-

manosidose tipo II ou juvenil [1].

ENZIMA α-MANOSIDASE

A atividade normal da α-manosidase na célula resulta de ações

combinadas das α-manosidases presentes na membrana do complexo de Golgi,

com pH neutro e da forma presente nos lisossomos, com pH ácido, especificidade

restrita ao substrato, incluindo compostos sintéticos como o p-nitrofenil-α-

manosideo e sensibilidade a alcalóides indolizidínicos como o swainsonine [9]. Os

pacientes com α-manosidose possuem ausência da forma ácida da enzima, porém

mantém a forma neutra [10].

ESTRUTURA DO GENE

O gene que codifica a enzima α-manosidase em humanos foi

isolado e codificado como MANB, possui aproximadamente 22 kb e consiste de 24

exons. Mais precisamente, sabe-se que este gene está localizado no cromossomo

19p 13.2 [11]. Até hoje estão identificadas 28 mutações deste gene que codificam

para doenças de acúmulo lisossomal (DLD), sendo a maior parte delas privadas e

sem uma clara relação fenótipo-genótipo. A mutação mais freqüentemente

encontrada é a R750W, presente em 21% dos alelos de pacientes europeus [12]. O

RNAm do gene MANB possui 3443 pb [11] sendo também isolado e seqüenciado

em DNA de felinos [13] [1] e bovinos [14]. Já em felinos a semelhança é de 81%

[15]. O gene também foi purificado de fígado bovino e, da mesma forma como no

tecido humano, apresenta-se organizado em 24 exons [14]. Em ratos, o gene da α-

manosidase possui 75% da seqüência de aminoácidos semelhantes com o gene da

α-manosidase humana [16].

ASPECTOS CLÍNICOS

Os pacientes com α-manosidose tipo I e tipo II apresentam retardo

mental, face grosseira, algum grau de disostose múltipla, surdez,

hepatoesplenomegalia, hérnias, bem como cristalinos e córneas opacos.

Adicionalmente, os pacientes apresentam infecções bacterianas recorrentes. A

estrutura óssea dos pacientes apresenta configuração de aparência ovóide e

cuneiforme e a ressonância magnética cerebral pode apresentar sinais sugestivos e

ou mudança na intensidade da substância branca. Os pacientes com α-manosidose

tipo I têm deterioração mental bastante rápida e, muitas vezes vêm a falecer entre 3

e 10 anos de idade, contrastando com indivíduos com α-manosidose tipo II onde o

retardo mental torna-se aparente somente durante a adolescência. A perda da

audição é particularmente proeminente nos pacientes com α-manosidose tipo II,

enquanto que a disostose múltipla apresenta-se mais moderada que a encontrada

nos indivíduos com α-manosidose tipo I. O curso clínico desta doença é descrito

como gradual, algumas vezes com progressão imperceptível [8, 17]. Existem

indícios de que os pacientes com α-manosidose apresentam imunodeficiência

humoral e celular [18].

DIAGNÓSTICO

A investigação inicial dos pacientes com suspeita de α-

manosidose inclui o estudo radiológico da coluna lombo-sacra, com o objetivo de

confirmar ou excluir a presença de disostose múltipla, e a busca de linfócitos

vacuolados no sangue periférico. Como os pacientes apresentam um padrão típico

de excreção urinária de oligossacarídeos, faz-se necessário realizar cromatografia

destes compostos na urina. Os pacientes afetados por α-manosidose apresentam

quantidades elevadas de diversos oligossacarídeos nos tecidos e na urina,

derivados da digestão incompleta de glicoproteínas [7, 19]. Os indivíduos afetados

apresentam excreção anormal de oligossacarídeos, que podem ser detectados

através da técnica de HPLC Os indivíduos afetados apresentam excreção anormal

de oligossacarídeos, que podem ser detectados através da técnica de HPLC [20] e

da cromatografia em camada delgada. Porém, o diagnóstico de α-manosidose

somente é confirmado ou excluído através da atividade reduzida da α-manosidase

em leucócitos, podendo também ser utilizados fibroblastos e células cultivadas do

fluido amniótico [21]. A medida direta da α-manosidase em amostras de soro ou

plasma não tem mostrado a mesma confiabilidade dos níveis enzimáticos celulares

[8]. No entanto, se o pH for cuidadosamente selecionado em 4,0 , o plasma pode

ser utilizado para o diagnóstico de α-manosidose [22]. Foram registrados casos de

diagnóstico para α-manosidose no primeiro trimestre de gestação, entre a 8ª-10ª

semana, usando amostras de vilo coriônico [23], demonstrando que α-manosidose

pode ser detectada no início da gestação pela medida da enzima [24].

TRATAMENTO

O transplante de medula óssea foi realizado em um paciente com

sete anos de idade com α-manosidose, vindo a falecer 18 semanas após a cirurgia,

em decorrência de broncopneumonia. Foi realizada necropsia do paciente e a

atividade da α-manosidase em células do pulmão, fígado e cérebro foi normal e a

presença de oligossacarídeos no pulmão e fígado foi pequena, porém bastante

aumentada no tecido cerebral. Através da microscopia eletrônica, o pulmão e o

fígado apresentaram morfologia normal, entretanto o tecido cerebral apresentou

vacuolização bastante definida. Estes achados sugerem que o transplante de

medula óssea reverteu a atividade da α-manosidase, mas não conseguiu reverter o

acúmulo de oligossacarídeos no tecido cerebral [25]. A indicação primária de

transplante de medula óssea em pacientes com α-manosidose tem como objetivo

preservar a função neurocognitiva e prevenir o óbito precoce destes pacientes, uma

vez que a maior parte dos pacientes afetados manifestam a doença cedo (α-

manosidose tipo I) e somente 10-15% dos pacientes afetados manifestam a doença

mais tarde (α-manosidose tipo II) [1]. Entre janeiro de 1997 e outubro de 2003,

quatro pacientes com α-manosidose submeteram-se ao transplante de medula

óssea na Universidade de Minesota, nos Estados Unidos. Todos apresentavam

desequilíbrio neurocognitivo antes do procedimento. Em três deles, testes

neuropsicológicos realizados após o procedimento cirúrgico, demonstraram

estabilização da função intelectual para a maioria dos domínios. O estudo

demonstrou que pacientes com α-manosidose tipo II e que apresentam sinais

prematuros de déficit neurocognitivo devem ser indicados para transplante de

medula óssea [26]. A reposição enzimática da α-manosidase em fibroblastos de

pacientes com α-manosidose a partir de linfócitos demonstrou redução no depósito

lisossomal de oligossacarídeos contendo manose. No entanto, para o

prolongamento da correção enzimática há a necessidade de renovação periódica,

demonstrando que estes achados podem ser altamente relevantes à função que os

linfócitos exercem na terapia de reposição enzimática [27].

PREVALÊNCIA DA DOENÇA

Através de dados fornecidos por registros de famílias que

possuem prole de homens e mulheres afetadas com α-manosidose e através de

resultados de mapeamento molecular confiou-se que esta doença é autossômica

recessiva [8]. Deste modo, entre indivíduos hetrerozigotos, a cada gestação, o risco

de gerar uma criança afetada com α-manosidose é de 25%. A literatura registra pelo

menos 90 casos de α-manosidose [1] sendo que um caso foi diagnosticado no

Laboratório Regional de Erros Inatos do Metabolismo (Serviço de Genética Médica

do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil) entre 1982-2000 [21], sendo que até

a presente data este laboratório não diagnosticou novos casos da doença. Na

Austrália, foram diagnosticados 4 casos entre 1980 e 1996 sendo que a prevalência

da doença neste país (calculada com os casos diagnosticados nos períodos pré e

pós-natal/número de recém nascidos vivos) foi estimada em 1/1.056.000 [28]. A

tabela 2 mostra a freqüência estimada da α-manosidose.

Tabela 2 – Freqüência estimada das oligossacaridoses.

Doença

Nº de casos

diagnosticados pelo

LREIM*

(1982-2000)

Nº de casos

diagnosticados na

Austrália**

(1980-1996)

Prevalência

na Austrália**

(/RN vivo)

α-Manosidose 1 4 1/1.056.000

β-Manosidose 0 0

Fucosidose 1 0

Sialidose 6 1 1/4.222.000

*LREIM: Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo (Serviço de Genética Médica –

Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil).

**Prevalência: (casos diagnosticados no período pré-natal + casos diagnosticados

no período pós-natal/número de recém nascidos vivos)

Adaptado de: Schwartz IVD, Moura de Souza CF, Giugliani R, Oligosacaridosis y

Mucolipidosis, In: Diagnóstico e Tratamiento de las Enfermedades Metabólicas

Hereditarias, Sanjurjo P y Baldellou A, editores, 2001, Ergon, Majadahonda

(Madrid). p. 431-438.

MODELO ANIMAL

A doença α-manosidose induzida por plantas do gênero

Swainsona, Oxytropis, Astragalus e Ipomoea desenvolve um quadro clínico em

animais conhecido como “locoismo”, com vacuolização de células em diversos

tecidos [29]. Embora a doença induzida seja muito similar à α-manosidose genética,

ela não é idêntica. Estas plantas contêm o alcalóide indolizidínico swainsonine, que

inibe a enzima lisossomal α-manosidase e induz o acúmulo de oligossacarídeos

contendo manose nos lisossomos de diversas células [30-33] e a Golgi manosidase

II, enzima associada com os processos de oligossacarídeos durante a glicosilação

de glicoproteínas. A conseqüência da doença induzida em animais é o acúmulo de

oligossacarídeos contendo manose e oligossacarídeos híbridos nos lisossomos [34-

36]. Através de cromatografia líquida e gasosa, o alcalóide swainsonine foi

identificado como constituinte tóxico da planta nativa Sida carpinifolia (gênero

Swainsona) em uma concentração de 0,006% de seu peso seco [37].

A α-manosidose foi observada pela ingestão de plantas do gênero

Swainsona, Oxytropis, Astragalus e Ipomoea em cavalos, bovinos, ovinos e

caprinos, causando perturbações neurológicas ocasionadas pelo alcalóide

indolizidínico swainsonine [30-33]. Na Inglaterra, em 1980, a α-manosidose felina foi

a primeira a ser descoberta em gatos domésticos e, subseqüentemente, em gatos

Persas na Suíça, Estados Unidos e na Bélgica. Em felinos, a doença foi

caracterizada por hepatomegalia sinais neurológicos e ampla vacuolização de

hepatócitos, neurônios e células gliais. A análise bioquímica no tecido cerebral dos

felinos detectou deficiência da enzima α-manosidase e a urina apresentou grande

quantidade de oligossacarídeos ricos em manose [38-42]. Em ovelhas que ingeriram

Oxytropis sericea, Stegelmeier et al (1999) observaram diminuição da α-

manosidase no soro, vacuolização celular no pâncreas, epitélio renal, células de

Purkinje e neurônios cerebelares, entre outros tecidos [43]. Daniel et al (1984),

verificou que em ovelhas que ingeriram Astragalus lentiginosus ocorreu a presença

de oligossacarídeos na urina a partir do 3º dia após a ingestão da planta, com

declínio rápido da molécula após sua retirada da dieta [42]. Em Moçambique, num

estudo realizado por Balogh et al (1999), foi observado que caprinos que ingeriram

Ipomoea carnea apresentaram mudanças histológicas no cérebro e na medula

espinhal, com ampla vacuolização de neurônios e células gliais [45]. Em ovinos e

bovinos, a redução da α-manosidase no plasma readquiriu valores normais 4-6 dias

após a interrupção da dieta contendo Astragalus lentiginosus. As alterações na

quantidade de oligossacarídeos na urina foram observadas no primeiro dia de

tratamento e perturbações neurológicas decorrentes da dieta foram observadas 38

dias após o início da dieta [29,44]. Em trabalho de Driemeier et al (2000), a análise

ultraestrutural e histológica em tecido pancreático e cerebral de caprinos

alimentados com Sida carpinifolia, demonstrou a presença de vacúolos, com

predominância nas células de Purkinge e pancreáticas acinares [31]. Tulsiani e

Touster (1983) observaram que após 12 semanas de injeções intramusculares de

swainsonine em ratos Wistar a α-manosidase lisossomal aumentou sua atividade no

fígado e no cérebro e reduziu no plasma [46]

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Estudar um modelo animal caprino para α-manosidose humana a

partir do consumo de dieta com Sida carpinifolia

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1.1 Avaliar in vivo a atividade da α-manosidase e β-manosidase sobre

leucócitos e plasma de caprinos alimentados com Sida carpinifolia.

1.2 Avaliar in vivo a atividade da β-galactosidase em leucócitos de

caprinos alimentados com Sida carpinifolia.

1.3 Avaliar in vivo a atividade da β-glicuronidase em plasma de

caprinos alimentados com da Sida carpinifolia.

1.4 Avaliar in vivo a excreção urinária de oligossacarídeos em caprinos

alimentados com da Sida carpinifolia.

1.5 Avaliar in vivo a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-

galactosidase em fibroblastos de caprinos alimentados com Sida

carpinifolia.

1.6 Avaliar in vitro a atividade da α-manosidase em fibroblastos de

caprinos na presença de swainsonine.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA REVISÃO

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PRIMEIRO ARTIGO EM PORTUGUÊS

ALFA-MANOSIDASE LISOSSOMAL EM CAPRINOS ALIMENTADOS COM

SIDA CARPINIFOLIA

Marisete Bedin

1,4

, Edson Moleta Colodel

2,3

, Marli Viapiana

, Jurema de Mari

Christine Rachelle Prescendo Chaves

, Ursula Matte

, David Driemeier

, Roberto

Giugliani

1, 4

Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre,

Brasil

Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Mato Grosso do

Sul, Mato Grosso, Brasil.

Departamento de Patologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil.

Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil.

Palavras chave: α-manosidose, swainsonine, Sida carpinifolia, doença lisossomal,

modelo animal.

Endereço do autor:

Dra. Marisete Bedin

Serviço de Genética Médica, HCPA, Rua Ramiro Barcelos, 2350 CEP 90.035-003

Porto Alegre, RS, Brasil.

Tel.: +55 51 21018011 fax: +55 51 21018010

Endereço eletrônico: maris[email protected]

Artigo submetido para: Brazilian Journal of Medical and Biological Research.

RESUMO

A α-manosidose humana resulta a partir da deficiência da enzima

α-manosidase e acúmulo do progressivo de oligossacarídeos ricos em manose nos

lisossomos. Em modelo animal caprino, no 5º dia após a introdução da dieta com

Sida carpinifolia, a atividade da α-manosidase em leucócitos aumentou

significativamente, retornando aos níveis normais 2 dias após a retirada da planta

da dieta. A atividade da α-manosidase foi analisada no plasma e decresceu

significantemente 4 dias após a exposição dos animais à dieta com Sida carpinifolia,

retornando aos níveis normais 10 dias após a retirada da planta da dieta. As

atividades da β-manosidase e β-galactosidase em leucócitos não apresentou

alteração significativa, sendo similar para a atividade da β-glicuronidase no plasma

durante a exposição dos animais à dieta com Sida carpinifolia. Através de

cromatografia de camada delgada (CCD), foi observada uma excreção anormal de

oligossacarídeos na urina a partir do segundo dia após a exposição à dieta, que

persistiu até um dia após a retirada da planta. Os animais apresentaram

sinaisclínicos neurológicos que iniciaram no 10º dia após a ingestão da planta.

Estudos bioquímicos das conseqüências da dieta contendo Sida carpinifolia em

caprinos indicam que este modelo pode ser usado em investigações relacionadas à

α-manosidose humana.

INTRODUÇÃO

A doença humana α-manosidose resulta da deficiência da enzima

α-manosidase, levando a um acúmulo gradual de oligossacarídeos ricos em

manose nos lisossomos. O alcalóide swainsonine é conhecido como agente

causador do "locoismo", uma doença neurológica descrita em animais e que tem as

mesmas características da α-manosidose humana [1-5]. O swainsonine é um

inibidor potente da α-manosidase lisossomal (E.C. 3.2.1.24) e da Golgi manosidase

[6-8]. Este alcalóide foi isolado e identificado como constituinte da planta Sida

carpinifolia [9]. Caprinos e eqüinos que natural e experimentalmente ingeriram esta

planta apresentaram sinais clínicos da doença neurológica e vacuolização no

fígado, pâncreas, células acinares e neurônios, principalmente nas células de

Purkinje [1,3]. A disfunção neurológica é a principal caracterísitca da α-manosidose

humana [10], contudo a fisiopatologia dos indivíduos afetados por esta doença é

ainda pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um possível

modelo animal para a α-manosidose humana, através de estudos bioquímicos da α-

manosidase em leucócitos, plasma e oligossacarídeos (OLS) na urina de caprinos

alimentados com dieta contendo Sida carpinifolia.

MATERIAL E MÉTODO

ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Foram realizados dois experimentos. O primeiro experimento

incluiu 6 caprinos machos da raça Saanen com 7 meses ± 10 dias de idade e o

segundo, incluiu 3 caprinos fêmeas da raça Saanen com 4 meses ± 15 dias de

idade. Os animais foram forçados a ingerir 500 g diárias de Sida carpinifolia, por 94

dias (no primeiro experimento) ou 28 dias (no segundo experimento). Os animais

receberam também ração comercial para complementar as necessidades diárias e

livre acesso à água. Os sinais clínicos foram observador durante todo período

experimental e a contagem sangüínea foi realizada semanalmente. O protocolo dos

animais experimentais foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa e Pós-Graduação do

Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil.

AMOSTRAS

As amostras de urina foram coletadas e guardadas a -20ºC para

análise dos oligossacarídeos através de CCD. As amostras de sangue foram

coletadas em tubos com heparina e guardados a 2-8ºC para a separação dos

leucócitos. As amostras de plasma foram obtidas a partir da centrifugação do

sangue (400 x g/10 min) e guardadas a -20ºC.

SEPARAÇÃO DOS LEUCÓCITOS

Os leucócitos foram separados de acordo com Wottawa (1974)

[11]. Para cada amostra foram diluídos 5ml de sangue total com 5ml of PBS

(tampão fosfato salino). Com uma pipeta Pasteur, 5ml de sangue diluído foi

cuidadosamente transferido em um tubo limpo, sobre 1,5ml de Ficoll-Paque. As

amostras foram centrifugadas a 400 x g por 35 minutos a 20ºC. Com uma pipeta

Pasteur, foi removida a camada de leucócitos, sobre a interface, entre o Ficoll-

Paque e o plasma. Os leucócitos foram lavados com 5ml de PBS e centrifugados a

100 x g por 10 minutos a 20ºC. Para remover o excesso de eritrócitos foi adicionado

1ml de solução de sal balanceado e foi realizada uma centrifugação final (100 x g

por 10 minutos a 20ºC). A concentração de proteína foi determinada pelo método de

Lowry et al [12].

ANÁLISE ENZIMÁTICA

Todos substratos e reagentes foram adquiridos da Sigma (St.

Louis, MO, USA). A atividade da α-manosidase e β-manosidase foram determinadas

com os substratos fluorogênicos 4-metilumbeliferil-α-L-manopiranosídeo e 4-

metilumbeliferil-β-L-manopiranosídeo, respectivamente. Para o ensaio enzimático,

20 μl de leucócitos, previamente diluídos em água, e 20μl de amostra de plasma,

foram homogeneizados com 100μl da solução do substrato específico 2mM em

tampão sódio acetato 0,2M pH 4,0. A atividade da β-galactosidase foi analisada pelo

método de Suzuki (2001) [13], usando 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo como

substrato. O ensaio conteve 200μL do substrato 1.33mM dissolvido em tampão

citrato-fosfato 0,1M, 100 μL de cloreto de sódio 0,2M e 100μL de leucócitos

previamente diluídos em cloreto de sódio 0,9%. A atividade da ß-Glicuronidase foi

analisada pelo método de Beaudet et al. [14]. O plasma (30μL) com 50μL de 4-

metilumbeliferil-ß-D-glicuronídeo 2mM foi dissolvido em tampão sódio-acetato 0,5M

pH 3,0. Todas reações enzimáticas foram incubadas por 1 hora a 37˚C e

interrompidas com 1,5mL de tampão glicina-NaOH, pH 10,3. O conteúdo protéico

dos leucócitos foi obtido entre 15 e 30mg de proteína. A fluorescência foi lida com

espectrofluorômetro Hitachi F-2000 (comprimento de onda de excitação e emissão

de of 365 e 450nm, respectivamente).

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA DE

OLIGOSSACARÍDEOS

Todos solventes foram adquiridos pela Merck (Darmstadt,

Germany). As amostras foram aplicadas com seringa Hamilton a partir da parte

inferior de uma placa de alumínio de sílica gel H-60, sobre bandas de 8 mm de

largura. As placas desenvolveram duas corridas ascendentes em cuba de vidro

horizontal saurada com uma fase móvel, que consistiu de butano-ácido acético-água

(2:1:1 v/v/v). Entre as corridas, as placas foram secas em corrente de ar com ajuda

de um secador. As placas desenvolvidas foram nebulizadas com orcinol 0,2% em

20% e aquecidas em estufa por for 10 min a 250ºC.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados através do teste estatístico ANOVA,

seguido pelo teste de Duncan, quando o teste F foi significante. A análise foi

realizada com software estatístico SPSS/PC1, versão 11.0 Chicago, IL, USA), e o

nível de significância foi p < 0.05.

RESULTADOS

No dia anterior ao experimento, quando os caprinos não haviam

sido alimentados com Sida carpinifolia, a atividade da α-manosidase em leucócitos

foi 128±28 nmoles4-MU/h/mg.proteína no primeiro experimento (tabela 1) e 104±6

nmoles4-MU/h/mg.proteína, no segundo (tabela 2). Após os animais terem sido

alimentados com Sida carpinifolia, a atividade da α-manosidase permaneceu nesses

valores até o 4º dia, em ambos experimentos. No 5º dia após a introdução da Sida

carpinifolia à dieta, a atividade da enzima aumentou significativamente no primeiro

(288±13 nmoles4-MU/h/mg.proteina) como no segundo experimento (303±45

nmoles4-MU/h/mg.proteína), retornando aos níveis normais 2 dias após a retirada

da planta da dieta (114±7 nmoles4-MU/h/mg.proteína, no primeiro experimento e

108±25 nmoles4-MU/h/mg.proteína, no segundo). A atividade da α-manosidase no

plasma foi analisada no segundo experimento (tabela 3), havendo um decréscimo

significante 4 dias após a exposição dos animais à dieta com Sida carpinifolia

(769±167 nmoles4-MU/h/ml) e retornando aos valores normais 9 dias após a

retirada da dieta. As atividades da β-manosidase e da β-galactosidase em

leucócitos não apresentou mudanças significativas (tabelas 1 e 2) como a atividade

da β-glicuronidase no plasma (tabela 3) que também permaneceu invariável durante

a exposição dos animais à dieta com Sida carpinifolia.

Tabela 1 – Efeito da dieta com Sida carpinifolia (94 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-galactosidase em leucócitos de caprinos.

Dieta com Sida carpinifolia (dias)

Dieta sem

Sida

carpinifolia

(dias)

Enzimas

2 dias

antes

5º 40º 60º 94º 96º

α-manosidase 128±28 288±13* 533±103* 427±101* 369±96* 114±7

β-manosidase 1,9±0,6 1,7±0,4 1,7±0,3 2,8±0,8 1,9±0,7 2,1±0,5

βgalactosidase 59±10 54±12 53±13 51±4 58±5 56±8

As dados são médias de seis experimentos independentes realizados em duplicata.

A atividade das enzimas foi expressa em nmoles4-MU/h/mg.proteína. *p< 0.01

(teste de Duncan). 4-MU = 4-metilumbeliferil

Tabela 2 – Efeito da dieta com Sida carpinifolia (28 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-galactosidase em leucócitos de caprinos.

Dieta com Sida carpinifolia (dias)

Dieta sem

Sida

carpinifolia

(dias)

Enzimas

2 dias

antes

5º 15º 20º 28º 30º

α-manosidase 104±6 303±45* 338±38* 334±36* 326±16* 108±25

β-manosidase 1,8±0,6 2,0±0,5 2,1±0,4 1,7±0,2 2,0±0,2 1,8±0,4

β-galactosidase 68±2 57±3 68±13 79±3 59±5 63±4

Os dados são medias de três experimentos independentes realizados em duplicata

A atividade das enzimas foi expressa em nmoles4-MU/h/mg.proteína.*p< 0.01

(teste de Duncan).

Tabela 3 – Efeito da dieta com Sida carpinifolia (28 dias) sobre a atividade da α-

manosidase, β-manosidase e β-glactosidase em plasma de caprinos.

Dieta com Sida carpinifolia (dias)

Dieta sem Sida

carpinifolia (dias)

Enzimas

2 dias

antes

4º 10º 28º 37º

α-manosidase 1274±104 769±167* 463±162* 615±144* 1289±163*

β-manosidase 33±8 34±6 29±2 30±3 28±5

β-galactosidase 16±2 17±3 13±6 16±1 18±4

Os dados são media de três experimentos independentes realizados em duplicata.

A atividade das enzimas foi expressa em nmoles4-MU/h/mg.proteína.*p< 0.01 (teste

de Duncan).

1º 2º 3º 4º 5º 7º 11º 19º 26º 28º 29º 30º 31º 32º 42º

Figura 1: Cromatografia de camada delgada de OLS em urina de caprinos

alimentados com Sida carpinifolia (94 e 28 dias). As setas contínuas horizontais

indicam as bandas normalmente observadas em pacientes com α-manosidose

humana. As setas descontínuas verticais indicam o início (dia 1) e a retirada (dia 28)

da Sida carpinifolia da dieta dos animais.

Em ambos experimentos foram observadas mudanças nos sinais

clínicos à partir do 10º dia após a exposição dos animais à dieta com Sida

carpinifolia. No primeiro experimento, os sinais clínicos de doença neurológica

iniciaram no 37º dia, caracterizados por movimentos lentos evoluindo para tremores

musculares da cabeça e pescoço, ataxia cerebelar, hipermetria e dificuldade de

permanecer em pé após a posição de decúbito. Os animais apresentaram olhar fixo

e instabilidade no teste HR (levantar e soltar a cabeça rapidamente). Quando

colocados em decúbito lateral, retornavam à estação (ficar em pé) somente com

ajuda. Os animais permaneciam a maior parte do tempo deitados, em posição de

decúbito lateral ou esternal e apresentaram alterações intermitentes na consistência

das fezes (líquidas ou pastosas), que persistiram por 2 ou 3 dias. Sete dias após a

retirada da dieta com Sida carpinifolia, foi observada redução gradual nos sinais

clínicos neurológicos, embora alterações discretas ainda persistiram por mais 30

dias. No segundo experimento, no qual os caprinos ingeriram a dieta com Sida

carpinifolia durante 28 dias, não foram observados sinais neurológicos, porém no

25º dia após a exposição da planta, os animais demonstraram ligeira instabilidade

quando induzidos ao teste RH, que persistiram até 4 dias após a retirada da planta

da alimentação. Em ambos experimentos, foi observada excreção anormal de

oligossacarídeos na urina, através da cromatografia de camada delgada a partir do

2º dia após a exposição à dieta, que persistiu até um dia após a retirada da planta.

Em ambos experimentos, não observamos mudança na contagem sangüínea

durante a exposição à dieta com Sida carpinifolia (figura 1).

DISCUSSÃO

O alcalóide swainsonine, encontrado em plantas do gênero

Swainsona e identificado na planta Sida carpinifolia [9], é conhecido como agente

que causa, em animais, condição similar à α-manosidose humana, com redução na

atividade da α-manosidase ácida e acúmulo de oligossacarídeos na urina e tecidos

[15-18]. Em nossos experimentos, observamos que a exposição de caprinos a 94 e

28 dias à dieta com Sida carpinifolia aumenta em 2-4 vezes a atividade da α-

manosidase em leucócitos, enquanto que a atividade da β-manosidase e da β-

galactosidase não foram alteradas. No mesmo período experimental, a atividade da

α-manosidase no plasma diminuiu em 1,5-2 vezes. Nossos dados condordam com

Stegelmeier (1995, 1999) em bovinos e ovinos, e também por Locke (1980) em

bovinos e por Crawley (1999) em suínos, animais ingeriram plantas que contém o

alcalóide swainsonine [19-22]. Em Tulsiani (1983) a atividade da α-manosidase está

aumentada no fígado e no cérebro de ratos que foram tratados com swainsonine [5].

A atividade diminuída da α-mannosidase no plasma de caprinos alimentados com

dieta com Sida carpinifolia concorda com os achados de Bennet e Prence no

plasma de pacientes com α-manosidose [15,16]. A atividade da β-manosidase, β-

galactosidase e β-glicuronidase não alterou durante o período experimental. As

alterações observadas na atividade da α-manosidase em leucócitos iniciaram a

partir do 5º dia e no plasma a partir do 4º dia. Com a interrupção do tratamento, os

níveis da α-manosidase retornaram normal em 2 dias (leucócitos) e em 9 dias

(plasma), demonstrando que a inibição da enzima pelo swainsonine é reversível. O

aumento da atividade da α-manosidase em leucócitos e sua redução no plasma

pode estar relacionado a formação de moléculas híbridas a partir do alcalóide

swainsonine durante o mecanismo de formação das glicoproteínas. O alcalóide

swainsonine presente na Sida carpinifolia é hidrossolúvel, sendo rapidamente

absorvido pelas células e amplamente distribuído nos tecidos. No entanto, a

estrutura modificada das glicoproteínas na membrana dos leucócitos pode estar

dificultando a saída da α-manosidase da célula [23]. A análise urinária demonstrou

um modelo anormal de excreção de OLS a partir do 2º dia indicando que o acúmulo

de oligossacarídeos na célula pode estar ocorrendo mesmo antes de ser detectada

redução na atividade da α-manosidase. Estes estudos bioquímicos das

conseqüências da dieta com Sida carpinifolia em caprinos nos indicam que este

modelo pode ser usado em investigações relacionadas à α-manosidose humana.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado através da CNPq, CAPES, e GPPG-

HCPA.

BIBLIOGRAFIA

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PRIMEIRO ARTIGO EM INGLÊS

LYSOSOMAL ALPHA-MANNOSIDASE IN GOATS FED WITH

SIDA CARPINIFOLIA

Marisete Bedin

1,4

, Edson Moleta Colodel

2,3

, Marli Viapiana

, Christine Rachelle

Prescendo Chaves

, Ursula Matte

, David Driemeier

, Roberto Giugliani

1, 4

Medical Genetics Service, Hospital de Clinicas de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil

Department of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso do Sul,

Mato Grosso, Brazil.

Department of Pathology, Veterinary Faculty, Federal University of Rio Grande do

Sul, Porto Alegre, Brazil.

Post graduate Course in Medical Sciences, Federal University of Rio Grande do

Sul, Porto Alegre, Brazil.

Key-words: α-mannosidosis, swainsonine, Sida carpinifolia, lysosomal diseases,

animal models.

Corresponding author:

Dra. Marisete Bedin

Medical Genetics Service, HCPA, Rua Ramiro Barcelos, 2350 CEP 90.035-003

Porto Alegre, RS, Brazil.

Tel.: +55 51 21018011 fax: +55 51 21018010

E-mail address: marisetebedin@yahoo.com.br

Article submitted to: Brazilian Journal of Medical and Biological Research

ABSTRACT

Human α-mannosidosis results from α-mannosidase deficiency and progressive

accumulation of oligosaccharides rich in mannose in the lysosomes. In goat animal

model, in the 5

day after introduction of the Sida carpinifolia diet, the α-

mannosidase activity in leukocyte was significantly increased, returning to the normal

levels 2 days after the withdrawal of the plant from the diet. The plasma α-

mannosidase activity was analyzed, decreasing significantly 4 days after animal

exposition to the Sida carpinifolia diet, returning to normal values 10 days after the

withdrawing the plant from the diet. Activities of β-mannosidase and β-galactosidase

in leukocytes did not show significant change, being similar for β-glicuronidase

activity in plasma during animal exposition to the Sida carpinifolia diet. An abnormal

excretion of oligosaccharides in urine TLC was observed from the 2

day after the

diet exposition, which persisted until one day after the withdrawal of the plant.

Animals presented neurological clinical signs beginning in the 10

day after feeding

the plant. The biochemical study of the consequences of the Sida carpinifolia diet in

goats indicates that this model can be used in investigations related to human α-

mannosidosis.

INTRODUCTION

The human disease α-mannosidosis results from deficiency of the

enzyme α-mannosidase, leading to a gradual accumulation of rich oligosaccharide

mannose in the lysosomes. The alkali swainsonine is known as agent causing

"locoism", a neurological illness described in animals which has the same

characteristics of human α-mannosidosis [1-5]. Swainsonine is a powerful inhibitor

lysosomal α-mannosidase (E.C. 3.2.1.24) and mannosidase II of the Golgi [6-8]. This

alkali was isolated and identified as a constituent of the plant Sida carpinifolia [9].

Goats and equine that naturally and experimentally ingested this plant presented

clinical signals of the neurological illness and vacuolization in liver, pancreas and

acinar cells and neurons, mainly in Purkinje cells [1,3]. The neurological dysfunction

is the main characteristic of human α-mannosidosis [10], however the

physiopathology of the individuals affected by this illness is still poorly understood.

The aim of this work was to characterize a possible animal model to human α-

mannosidosis, through biochemical studies of α-mannosidase in leukocytes, plasma

and oligosaccharides (OLS) in urine of goats fed with Sida carpinifolia diet.

MATERIALS AND METHODS

EXPERIMENTAL ANIMALS

Two trials were carried out. The first trial included 6 male goats of

Saanen race with 7 months ± 10 days of age and the second, 3 female goats of

Saanen race with 4 months ± 15 days of age. The animals were force fed with 500 g

of Sida carpinifolia daily, for 94 days (in the first trial) or 28 days (in the second trial).

Animals received also commercial feeding to complement dietary needs and had

free access to water. Clinical signals were accessed during all experimental period

and blood counts were made every week. The protocol to animals was approved by

the Research and Post-Graduation Committee of the Porto Alegre Clinical Hospital,

Porto Alegre, RS, Brazil.

SAMPLES

Urine samples were collected and kept at -20ºC to be analyzed by

oligosaccharides thin-layer chromatography (TLC). Blood samples were collected in

heparinized vials and kept at 2-8ºC for leukocytes isolation. Plasma was obtained

from blood centrifugation (400 x g/10 min) and kept at -20ºC.

LEUKOCYTE ISOLATION

Leukocytes were isolated according to Wottawa (1974) [11]. For

each sample, 5ml of total volume blood were diluted with 5ml of PBS (phosphate

buffer saline). Using a Pasteur pipette, 5ml of diluted blood sample were carefully

transferred to a clean centrifuge tube, on 1.5ml Ficoll-Paque. The samples were

centrifuged at 400 x g for 35 minutes at 20ºC. Using a Pasteur pipette the leukocytes

layer was removed on interface between Ficoll-Paque and plasma. Leukocytes were

washed with 5ml PBS and centrifuged at 100 x g for 10 minutes at 20ºC. To remove

the excess of erythrocytes it was added 1ml balanced salt solution and a final

centrifugation (100 x g for 10 minutes at 20ºC) was performed. Protein concentration

was determined by the method of Lowry et al [12].

ENZYME ASSAYS

All reagents and substrates were purchased from Sigma (St. Louis,

MO, USA). Activities of α-mannosidase and β-mannosidase were determined with

the fluorogenic substrates 4-methylumbelliferyl-α-L-mannopiranoside and 4-

methylumbelliferyl-β-L-mannopiranoside, respectively. For assay, 20μl of the

leukocytes, previously diluted in water, and 20 μl of the plasma sample, were mixed

with 100μl of a 2mM solution of specific substrate in 0.2M sodium acetate buffer, pH

4.0. β-galactosidase activity was assayed by the method of Suzuki (2001) [13] using

4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside as substrate. The assay mixture contained

200μL of substrate at 1.33mM dissolved in 0.1M citrate-phosphate buffer, 100μL of

sodium chloride 0.2M and 100μL of leukocytes previously diluted in 0.9% sodium

chloride. ß-Glicuronidase activity was assayed by the method of Beaudet et al. [14].

Plasma (30μL) was incubated in an assay mixture contained 50μL of 4-

methylumbelliferyl-ß-D-glicuronide 2mM and dissolved in sodium acetate buffer 0.5M

pH 3.0. All reactions were incubated for 1 hour at 37˚C and stopped with 1.5mL of

0.5M glycine-NaOH buffer pH 10.3. The protein content of leukocytes was between

15 and 30mg of protein. Fluorescence was read with a Hitachi F-2000

spectrofluorometer (excitation and emission wave-length of 365 and 450nm,

respectively).

THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) OF

OLIGOSACCHARIDES (OLS)

All solvents were of analytical grade and supplied by Merck

(Darmstadt, Germany). The samples were spotted 10 mm from the bottom edge of

the plate, in the form of bands 8 mm width, with a Hamilton microlitre syringe on

silica gel aluminum plate H-60. Plates developments two linear ascendant carried

out trough horizontal glass chamber saturated with the mobile phase, witch

consisted of butane–acetic acid–water (2:1:1, v/v/v). Between subsequent

developments, plates were dried in a current of air with an air dryer for help.

Developed plates were sprayed with orcinol 0.2% in H

20% and heated for 10

min at 250ºC in an oven.

STATISTICAL ANALYSIS

Data were analyzed by 1-way ANOVA, followed by the Duncan

multiple range test, when the F test was significant. The analysis was performed

using the statistical software pack-age SPSS/PC1, version 11.0 Chicago, IL, USA),

and the level of significance was set at p < 0.05.

RESULTS

In the day before the experiment, which goats were still not fed with

the Sida carpinifolia, α-mannosidase activity in leukocytes was 128±28 nmoles4-

MU/h/mg.protein in the first trial (table 1), and 104±6 nmoles4-MU/h/mg.protein in

the second (table 2). After animals were fed with the Sida carpinifolia, α-

mannosidase activity remained in these values until the 4

day, in both trials. In the

day after the introduction of the Sida carpinifolia diet, the activity of enzyme was

significantly increased in the first (288±13 nmoles4-MU/h/mg.protein) as in the

second trial (303±45 nmoles4-MU/h/mg.protein), returning to the normal levels 2

days after the withdrawal of the plant from the diet (114±7 nmoles4-MU/h/mg.protein,

in first trial, and 108±25 nmoles4-MU/h/mg.protein, in the second). The plasma α-

mannosidase activity was analyzed in the second trial (table 3), having a significant

decrease 4 days after animal exposition to the Sida carpinifolia diet (769±167

nmoles4-MU/h/ml) and returning to normal values 9 days after withdrawal of diet.

Activities of β-mannosidase and β-galactosidase in leukocytes did not show

significant change (tables 1 and 2) as β-glicuronidase activity in plasma (table 3)

which also remained unchanged during animal exposition to the Sida carpinifolia

diet.

Table 1 – Long term effect of Sida carpinifolia diet on α-mannosidase, β-

mannosidase, and β-galactosidase activities in goat leukocytes.

Diet with Sida carpinifolia (days)

Diet without

Sida

carpinifolia

(days)

Enzymes

2 days

before

α-mannosidase 128±28 288±13* 533±103* 427±101* 369±96* 114±7

β-mannosidase 1.9±0.6 1.7±0.4 1.7±0.3 2.8±0.8 1.9±0.7 2.1±0.5

β-galactosidase 59±10 54±12 53±13 51±4 58±5 56±8

Data are mean for six independent experiments performed in duplicate. Enzyme

activity expressed in nmoles4-MU/h/mg.protein.*p< 0.01 (Duncan’s multiple range

test). 4-MU = 4-methilumbeliferil

Table 2 – Short term effect of Sida carpinifolia diet on α-mannosidase, β-

mannosidase, and β-galactosidase activities in goat leukocytes.

Diet with Sida carpinifolia (days)

Diet witout Sida

carpinifolia

(days)

Enzymes

2 days

before

α-mannosidase 104±6 303±45* 338±38* 334±36* 326±16*

108±25

β-mannosidase 1.8±0.6 2.1±0.5 2.1±0.4 1.7±0.2 2.0±0.2 1.8±0.4

β-galactosidase 68±2 57±3 68±13 79±3 59±5 63±4

Data are mean for three independent experiments performed in duplicate. Enzyme

activity expressed in nmoles4-MU/h/mg.protein.*p< 0.01 (Duncan’s multiple range

test).

Table 3 – Short term effect of Sida carpinifolia diet on α-mannosidase, β-

mannosidase, and β-galactosidase activities in goat plasma.

Diet with Sida carpinifolia (days)

Diet without Sida

carpinifolia (days)

Enzymes

2 days

before

α-mannosidase 1274±104 769±167* 463±162* 615±144* 1289±163*

β-mannosidase 33±8 34±6 29±2 30±3 28±5

β-galactosidase 16±2 17±3 13±6 16±1 18±4

Data are mean for three independent experiments performed in duplicate. Enzyme

activity expressed in nmoles4-MU/h/mg.protein.*p< 0.01 (Duncan’s multiple range

test).

1º 2º 3º 4º 5º 7º 11º 19º 26º 28º 29º 30º 31º 32º 42º

Figure 1: Thin layer chromatography of OLS in urine of goats fed with Sida

carpinifolia (94 and 28 days). The horizontal continuous arrows indicate the bands

normally observed in patients with human α-mannosidosis. The vertical

discontinuous arrows indicate begin (day 1) and withdrawal (day 28) of the Sida

carpinifolia diet

from animals.

In both trials, clinical pictures were observed from the 10

day after

animal exposition to the Sida carpinifolia diet. In the first trial, in the 37

day, began

neurological clinical signs characterized by slow movements evolving to muscular

tremors of head and neck, cerebellar ataxia, hypermetria and difficulty to get up after

decubitus position. Animals presented fixed gaze, instability on the HR test (raise

and free the head quickly). When placed in lateral decubitus position, they had

difficulty in sains back the station, standing again only with aid. Animals remaining

most of the time lying in esternal or lateral decubitus position and had presented

intermittent alterations in the consistency of feces (liquid or soft), that persisted for 2

and 3 days. Seven days after withdrawal of the Sida carpinifolia diet, it was noticed

gradual reduction of the clinical signals, although discrete alterations had still

persisted for more 30 days. In the second trial, in which goats ingested Sida

carpinifolia diet during 28 days, neurological signs were not observed, but in the 25

day after the exposition to the plant, animals had demonstrated light instability, when

induced to HR test, that persisted up to 4 days after withdrawal of the plant from

feeding. In both trials, an abnormal excretion of oligosaccharides on urinary TLC was

observed from the 2

day after the diet exposition, which persisted until one day

after withdrawal of the plant. In both trials, we did not observed changes alteration in

the blood counts during the exposition of the Sida carpinifolia diet (figure 1).

DISCUSSION

The alkali swainsonine, found in plants of the Swainsona genus

and identified in the Sida carpinifolia plant [9], has been known as an agent that

could cause a condition similar to human α-mannosidosis in animals, with reduction

in acid α-mannosidase activity and accumulation of oligosaccharides in urine and

tissues [15-18]. In our experiments, we observed that the exposition of goats to 94

and 28 days to the Sida carpinifolia diet increased 2-4 times the α-mannosidase

activity in leukocytes while β-mannosidase and β-galactosidase activities were not

affected. In the same experimental period, α-mannosidase activity in the plasma

diminished 1.5-2 times. Our dates agreement with Stegelmeier (1995, 1999) in

bovines and ovine, and also by Locke (1980) in bovines and by Crawley (1999) in

swines, animals witch ingested plants that contained the swainsonine alkali [19-22].

In Tulsiani (1983) the α-mannosidase activity increased in the liver and in the brain

of rats that were made treatment with swainsonine [5]. The diminished α-

mannosidase plasma activity in goats fed with Sida carpinifolia diet is in accordance

with the findings of Bennet and Prence in plasma of patients with α-mannosidosis

[15,16]. The β-mannosidase, β-galactosidase and β-glicuronidase activities had not

changed during the experimental period. The alterations observed in α-mannosidase

activity in leukocytes were from day 5 and in plasma from day 4. With the interruption

of the treatment, the α-mannosidase activity returned to normal levels in two days

(leukocytes) and in 9 days (plasma), demonstrating that the inhibition of the enzyme

by swainsonine is reversible. The increased α-mannosidase activity in leukocytes

and its reduction in the plasma can be related to the hybrid molecule formation from

swainsonine alkali in the mechanism of glycoproteins formation. The swainsonine

alkali present in Sida carpinifolia is hydro soluble and is quickly absorbed by the cells

and widely distributed in tissues. However, the modified structure of the glycoprotein

in leukocyte membrane can make difficult to α-mannosidase exit the cell [23]. Urine

analysis showing abnormal pattern of OLS excretion from day 2 indicates that

accumulation of oligosaccharides in cell may occur even before a reduction in α-

mannosidase activity is detected. This biochemical study of the consequences of

Sida carpinifolia diet in goats indicates that this model can be used in investigations

related to human α-mannosidosis.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from Brazilian funds CNPq,

CAPES, and GPPG-HCPA.

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SEGUNDO ARTIGO EM PORTUGUÊS

EFEITO DO SWAINSONINE SOBRE CULTURA DE

FIBROBLASTOS DE CAPRINOS

Marisete Bedin

1,4

, Edson Moleta Colodel

2,3

, Cristina Kath

, Marli Viapiana

, Jurema

de Mari

, Ursula Matte

, David Driemeier

, Roberto Giugliani

1,4

Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre,

Brasil

Departamento de Patologia Veterinária, Universidade Federal do Mato Grosso do

Sul, Mato Grosso, Brasil

Deparamento de Patologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil

Curso de Pós-Graduação em Clínica Médica, Universidade Federal do Rio Grande

do Sul, Porto Alegre, Brasil

Palavras-chave: α-manosidose, fibroblastos, swainsonine, Sida carpinifolia

Endereço do autor:

Dra. Marisete Bedin

Serviço de Genética Médica, HCPA, Rua Ramiro Barcelos, 2350 CEP 90.035-003

Porto Alegre, RS, Brasil. Tel.: +55 51 21018011; fax: +55 51 21018010

Endereço eletrônico: maris[email protected]

Artigo submetido para: Clinica Chimica Acta

RESUMO

Introdução: A ingestão de dieta com Sida carpinifolia por caprinos causa doença

neurológica conhecida como "locoismo", caracterizada por ataxia muscular,

hipermetria, hiperestesia e tremores na cabeça e pescoço. O alcalóide swainsonine

é inibidor específico da enzima lisossomal α-manosidase, enzima deficiente na

doença genética humana α-manosidose e foi identificado como constituinte tóxico

da Sida carpinifolia. Neste trabalho, nós investigamos o efeito in vivo da dieta com

Sida carpinifolia e o efeito in vitro do swainsonine em cultura de fibroblastos de

caprinos sobre a atividade da α-manosidase. Material e Método: O estudo consistiu

de seis caprinos fêmeas que ingeriram 500 g diárias de Sida carpinifolia durante 28

dias. Os fibroblastos foram obtidos de biopsias a partir da pele de caprinos e

cultivados com meio de cultura HAM-F10 contendo 10% de soro bovino fetal. Para

os estudos in vivo, as biopsias foram obtidas 02 dias antes e, 07, 14 e 28 dias após

a ingestão de Sida carpinifolia e 8 dias após a retirada da planta da dieta. Para os

estudos in vitro, os fibroblastos foram cultivados 48 horas em concentrações de

swainsonine de 0,02, 0,2, 2,0 e 5,0 μg/mL. Resultados: Nós observamos alterações

neurológicas discretas nos animais, que iniciaram entre a primeira e a segunda

semana de consumo de Sida carpinifolia. A atividade da α-manosidase em cultura

de fibroblastos de caprinos aumentou significantemente a partir do 14º dia após o

consumo da dieta com Sida carpinifolia, permanecendo alterada até o final do

experimento. No 8º dia após a retirada da dieta com Sida carpinifolia, a atividade da

α-manosidase permaneceu nos níveis normais. Em fibroblastos de caprinos

cultivados com swainsonine nas concentrações de 2,0 e 5,0 μg/mL, a atividade da

α-manosidase reduziu 52 e 72 por cento, respectivamente, em relação ao controle.

Conclusão: O alcalóide swainsonine adicionado à cultura de fibroblastos de

caprinos parece reproduzir a doença hereditária humana α-manosidose. No entanto,

a concentração de swainsonine presente na Sida carpinifolia provocou efeito

contrário sobre a α-manosidase. Os resultados estimam que a planta pode conter

substâncias que não são restritas somente à inibição da atividade da α-manosidase,

mas capazes de compensar o efeito inibitório e modificar a ação do swainsonine

sobre a enzima, ou mesmo impossibilitar o trafego da enzima na célula.

INTRODUÇÃO

A ingestão de Sida carpinifolia por caprinos causa doença

neurológica, conhecida como "locoismo” e caracterizada por ataxia, hipermetria,

hiperestesia e tremores musculares na cabeça e no pescoço e pela presença de

vacúolos nas células [1] com sintomas similares à doença genética humana α-

manosidose [2]. As características clínicas e patológicas desta doença em caprinos

que ingeriram Sida carpinifolia são similares aos animais que ingeriram plantas do

gênero Swainsona, Oxytropis, Astragalus e Ipomoea [3-5]. O swainsonie é o mesmo

alcalóide encontrado nas plantas do gênero Swainsona cenescens [6] e foi

identificado como constituinte tóxico da Sida carpinifolia, planta perene encontrada

no Sul do Brasil [7]. O swainsonine bloqueia o processamento de glicoproteínas

complexas [8] e leva ao aumento de oligossacarídeos ricos em manose na urina e

nos tecidos [9]. Neste trabalho, nós investigamos o efeito in vivo da dieta com Sida

carpinifolia e o efeito in vitro do swainsonine em cultura de fibroblastos de caprinos

sobre a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-galactosidase.

MATERIAL E MÉTODO

Os substratos 4-metilumbeliferil-α-L-manopiranosídeo, 4-

metilumbeliferil-β-L-manopiranosídeo, 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo e

swainsonine sintético foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA), o fosfato

sódico e o citrato, da Merck (Darm-stadt, Germany) e os reagentes e os meios de

cultura da Gibco BRL (Grand Island, NY, USA).

ANIMAIS EXPERIMENTAIS

O estudo experimental consistiu de seis caprinos fêmeas com 4

meses de idade da raça Saanen originários de uma fazenda livre de Sida

carpinifolia. Os caprinos foram forçados a ingerir 500g diárias de Sida carpinifolia

durante 28 dias. A alimentação dos animais foi complementada com ração

comercial e água ad libitum. Os sinais clínicos foram monitorados durante todo

período experimental e a contagem sangüínea foi realizada semanalmente. O

experimento foi ética e cientificamente aprovado pelo Comitê de Pesquisa e de Pós-

Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil.

CULTURA DE FIBROBLASTOS DE CAPRINOS

Para o estudo in vivo, as biopsias de caprinos foram obtidas 02

dias antes e, 7, 14 e 28 dias após a ingestão de dieta com Sida carpinifolia e 8 dias

após a retirada da planta da dieta. As biopsias (fragmentos de aproximadamente 1,0

x 0,5cm) foram coletadas alternativamente, na arte superior e medial das orelhas,

previamente lavadas com água corrente e detergente neutro e desinfetadas com

solução de álcool-iôdo a 5%. A área dicotomizada foi pressionada com gaze estéril

e os caprinos receberam aplicação de antibiótico e repelente. As amostras foram

transferidas para um frasco estéril contendo meio de cultura HAM-F10 adicionado

ao soro bovino fetal (SBF). Quando as culturas atingiram confluência foram

removidas com tripsina-EDTA e adicionadas a dois frascos contendo meio de

cultura HAM-F10 suplementado com SBF 10% e lavadas três vezes com tampão

sódio-fosfato. Após a centrifugação, o pelet contendo as células foi guardado em

freezer -40°C até a determinação do conteúdo protéico e atividade enzimática. Para

os estudos in vitro, os fibroblastos foram cultivados por 48 horas com concentração

de swainsonine de 0,02, 0,2, 2,0 e 5,0 μg/mL [10].

ANÁLISE DA α-MANOSIDASE, β-MANOSIDASE E β-

GALACTOSIDASE

As atividades da α-manosidase e β-manosidase foram

determinadas usando os substratos fluorogênicos 4-metilumbeliferil-α-L-

manopiranosídeo and 4-metilumbeliferil-β-L-manopiranosídeo, respectivamente.

Para os ensaios, foram misturados 20μl de fibroblastos previamente diluídos em

água com 100μl da respectiva solução do substrato 2mM em tampão fosfato-citrato

0,2 M, pH 4.0 a 37°C por 1 hora. A atividade da β-galactosidase foi analisada pelo

método de Suzuki [11] usando 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo como substrato.

O conteúdo protéico dos leucócitos foi ajustado entre 15–30 mg. Para o ensaio, os

fibroblastos foram previamente diluídos em solução de cloreto de sódio 0,9% e,

100μL foram misturados com 200μL da solução do substrato 1,33mM em tampão

fosfato-citrato 0,1M, pH 4,0 e 100μL de solução de cloreto de sódio 0,2M a 37 °C

por 1 hora. A reação foi interrompida com 3mL de tampão glicina-NaOH 0,5M, pH

10,3. A fluorescência foi lida com espectrofluorômetro Hitachi F-2000 (comprimento

de onda de excitação e emissão de 365 e 450nm, respectivamente). O conteúdo

protéico foi determinado pelo método de Lowry et al [12].

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados pelo teste estatístico ANOVA, seguido

pelo teste de Duncan quando o teste F foi significante. A análise foi realizada

usando o software estatístico SPSS/PC1, versão 11.0 Chicago, IL, USA, e o nível de

significância usado foi p < 0.01.

RESULTADOS

Tabela 1: Efeito in vivo da dieta com Sida carpinifolia em cultura de fibroblastos de

caprinos sobre a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-galactosidase.

Dieta com Sida

carpinifolia (dias)

Dieta sem Sida

carpinifolia (dias)

Enzi

mas

Dois dias

antes

7º 14º 28º 8º

α-manosidase 76±22 78±7 106±6* 148±36*

83±12

β-manosidase 1,1±0,1 0,7±0,5 1,3±0,2 0,9±0,1

0,9±0,2

β-galactosidase 254±29 204±11 283±12 260±48 235±13

Os dados são media para seis experimentos independentes realizados em triplicata.

A atividade enzimática foi expressa em in nmoles4-MU/h/mg.proteína.*p< 0.01

(teste de Duncan). 4-MU = 4-metilumbeliferona

Tabela 2: Efeito in vitro do swainsonine em cultura de fibroblastos de caprinos sobre

a atividade da α-manosidase, β-manosidase e β-galactosidase.

Swainsonine (μg/mL)

Enzimas 0,0 0,02 0,2 2,0 5,0

α-manosidase 74±2 64±11 72±5 35±5* 21±6*

β-manosidase 1,1±0,1 1,2±0,3 0,9±0,1 1,1±0,05 1±0,3

β-galactosidase 229±17 226±19 246±18 245±19 225±26

Os dados são média de seis experimentos independentes realizados em triplicata. A

atividade enzimática foi expressa em nmoles4-MU/h/mg.proteína.*p< 0.01 (teste de

Duncan).

O quadro clínico dos caprinos variou durante a fase experimental

de consumo da dieta com Sida carpinifolia e foi caracterizado por alterações nos

excrementos, redução do peso e principalmente por sinais clínicos neurológicos. As

alterações clínicas neurológicas foram discretas e iniciaram entre a primeira e a

segunda semana do consumo da dieta com Sida carpinifolia e consistiram de

depressão aparente, olhar fixo e movimentos lentos. A contagem sangüínea não

apresentou mudança significativa durante todo período experimental. A atividade da

α-manosidase em cultura de fibroblastos de caprinos aumentou significantemente a

partir do 14º dia após o consumo da dieta com Sida carpinifolia, permanecendo

modificada até o final do experimento. No 8º dia após a retirada da dieta com Sida

carpinifolia, a atividade da α-manosidase voltou aos níveis normais (83± 54

MU/h/mg.proteína) (tabela 1). No entanto, a atividade da α-manosidase em cultura

de fibroblastos de caprino com swainsonine nas concentrações de 2,0 e 5,0 μg/mL

(1,15 x 10

-8

mM e 2,88 x 10

-8

mM) reduziu 52e 72 por cento, respectivamente, em

relação ao controle(tabela 2). As atividades da β-manosidase e β-galactosidase não

apresentaram alteração em ambos experimentos (tabela 1 e 2).

DISCUSSÃO

O swainonine é inibidor específico da α-manosidase [13] e a Sida

carpinifolia contém swainsonine em concentração de 0,006% de seu peso seco [7].

Em nosso laboratório, em caprinos alimentados com dieta com Sida carpinifolia, a

atividade da α-manosidase diminuiu no plasma (dados não publicados). A atividade

da α-manosidase reduziu em cultura de fibroblastos de caprinos nas concentrações

de swainsonine de 2,0 e,5.0 μg/mL (1,15 x 10

-8

mM e 2,88 x 10

-8

mM) e aumentou em

cultura de fibroblastos de caprinos que foram alimentados com dieta com Sida

carpinifolia durante 14 e 28 dias. Em nosso trabalho, o alcalóide swainsonine

adicionado à cultura de fibroblastos de caprinos parece mimetizar a doença

hereditária humana α-manosidose, concordando com Ikeda (2003) em linfoblastos

humanos [14]. No entanto, a concentração de swainsonine presente na Sida

carpinifolia provocou efeito contrário ao esperado em fibroblastos. O efeito do

swainsonine parece restringir não somente a inibição da α-manosidase, sendo

capaz de interferir na glicosilação de macromoléculas de importante papel no

reconhecimento celular e induzir à formação de glicoproteínas híbridas, como em

fibroblastos humanos [15]. Ao mesmo tempo, os resultados da cultura de

fibroblastos em caprinos alimentados com dieta com Sida carpinifolia estimam que

ela possui substâncias que, quando metabolizadas pelo organismo, podem

compensar o efeito inibitório do swainsonine sobre a α-manosidase. Por outro lado,

é possível que a modificação de glicoproteínas, induzida pelo swainsonine presente

na Sida carpinifolia possa estar modificando o trafego e o processamento da α-

manosidase. Isto explicaria o porquê, apesar do aumento significante na atividade

enzimática da α-manosidase em leucócitos e fibroblastos, ocorre acúmulo de

oligossacarídeos na urina (dados não publicados) e sinais clínicos de doença

neurológica. Para esta hipótese seriam necessários estudos de sub-fracionamento

celular em cultura de fibroblastos de caprinos alimentados com dieta com Sida

carpinifolia.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado através de verbas dos fundos

brasileiros CNPq, CAPES e GPPG-HCPA.

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Biol Chem 258(12)7578-7585

SEGUNDO ARTIGO EM INGLÊS

SWAINSONINE EFFECT ON FIBROBLASTS CULTURE FROM

GOATS

Marisete Bedin

1,4

, Edson Moleta Colodel

2,3

, Cristina Kath

, Marli Viapiana

, Jurema

de Mari

, Ursula Matte

, David Driemeier

, Roberto Giugliani

1,4

Medical Genetics Service, Hospital de Clinicas de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil

Department of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso do Sul,

Mato Grosso, Brazil.

Department of Pathology, Veterinary Faculty, Federal University of Rio Grande do

Sul, Porto Alegre, Brazil.

Post graduate Course in Medical Sciences, UFRGS, Porto Alegre, Brazil.

Key-words: α-mannosidosis, fibroblasts, swainsonine, Sida carpinifolia

Corresponding author:

Dra. Marisete Bedin

Medical Genetics Service, HCPA, Rua Ramiro Barcelos, 2350 CEP 90.035-003

Porto Alegre, RS, Brazil. Tel.: +55 51 21018011; fax: +55 51 21018010

E-mail address: marisetebedin@yahoo.com.br

Article submitted to: Clinica Chimica Acta

ABSTRACT

Introduction: Ingestion of Sida carpinifolia diet for goats cause neurological illness

known as "locoism", characterized for muscular ataxia, hipermetria, hiperestesia and

tremors in the head and neck. The alkali swainsonine is specific inhibitor of

lysosomal α-mannosidase, deficient enzyme in human genetic illness α-

mannosidosis and it was identified as a toxic constituent of the Sida carpinifolia. In

this work, we investigated in vivo effect of Sida carpinifolia diet and in vitro effect of

swainsonine in goat fibroblasts culture on α-mannosidase activity. Material and

Methods: The study consisted of three female goats force fed with 500 g of Sida

carpinifolia daily for 28 days. Fibroblasts were obtained from skin biopsy goats and

cultured with HAM-F10 medium containing 10% fetal bovine serum. For in vivo

study, biopsies were obtained two days before and, seven, fourteen and twenty eight

days after ingestion of Sida carpinifolia diet and eight days after the withdrawal of the

plant of the diet. For in vitro study, fibroblasts were cultured for 48 hours at 0.00,

0.02, 0.2, 2.0 and 5.0 μg/mL of swainsonine concentration. Results: We observed

discrete neurological alterations in the animals, witch beginning between first and

second week of consumption of Sida carpinifolia diet. The activity of α-mannosidase

in goat fibroblasts culture increased significantly from 14

day after consumption of

Sida carpinifolia diet, remaining modified until the end of the experiment. In the 8

day after withdrawal of Sida carpinifolia diet, α-mannosidase activity was at normal

levels. In goat fibroblasts cultured on 2.0 and 5.0 μg/mL of swainsonine

concentration, α-mannosidase activity reduced 52 and 72 per cent, respectively,

from control. Conclusion: The alkali swainsonine added to goat fibroblasts cultured

seems to reproduce the hereditary human α-mannosidosis. However, the

swainsonine concentration present in Sida carpinifolia provoked contrary effect on α-

mannosidase. The results estimate that the plant may be contain substances that

are not only restricted to the inhibition α-mannosidase activity, but capable to

compensate the inhibitory effect and modify swainsonine action on the enzyme, or

even disable the traffic of the enzyme inside the cell.

INTRODUTION

Ingestion of Sida carpinifolia for goats cause neurological disease,

known as "locoism” and characterized by ataxia, hypermetria, hyperesthesia, and

muscle tremors of head and neck and present vacuoles in several cells [1] with

similar symptoms of human genetic illness α-mannosidosis [2]. The clinical and

pathological characteristics these diseases in the goats that ingest Sida carpinifolia

are similar to animals that ingested plants of the genus Swainsona, Oxytropis,

Astragalus and Ipomoea [3-5]. The swainsonine, is the same alkaloid found in plants

of the genus Swainsona cenescens [6] and was identified as a toxic constituent of

the Sida carpinifolia, perennial plant found in Brazilian south [7]. The swainsonine

blocks the processing of glycoprotein complexes [8] and leads to an increase of

oligosaccharides rich of mannose in urinary and tissues [9]. In this work, we

investigated in vivo effect of Sida carpinifolia diet and in vitro effect of swainsonine in

goat fibroblasts culture on α-mannosidase, β-mannosidase and β-galactosidase

activities.

MATERIAL AND METHODS

Substrates 4-methylumbelliferyl-α-L-mannopiranoside, 4-

methylumbelliferyl-β-L-mannopiranoside, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside and

synthetic swainsonine were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,

USA), sodium phosphate and citrate, from Merck (Darm-stadt, Germany), and the

reagents and medium culture cell from Gibco BRL (Grand Island, NY, USA).

EXPERIMENTAL ANIMALS

The experimental study consisted of six female goats with 4-month-

old age of Saanen race from a free farm of Sida carpinifolia. The goats were forced

fed 500g of Sida carpinifolia daily for 28 days. The feeding animals were

complemented with commercial ration and water ad libitum. Clinical signals were

accessed during all experimental period and blood counts were made every week.

The experiment was ethical and scientifically approved by the Research and Post-

Graduation Committee of the Porto Alegre Clinical Hospital, Porto Alegre, RS, Brazil.

GOAT FIBROBLASTS CULTURE

For in vivo study, goat biopsies were obtained two days before and,

seven, fourteen and twenty eight days after ingestion of Sida carpinifolia diet and

eight days after the withdrawal of the plant of the diet. Biopsies (fragments of

approximately 1.0 x 0.5cm) were collected alternately, in the apex and medial border

of ears previously washed with abundant running water and neutral detergent and

disinfected with alcohol-iodine 5% solution. The dichotomized area was pressured

with sterile gauze and goats received antibiotic and repellent application. Samples

were transferred for a sterile flask containing HAM-F10 middle culture added to 10%

of fetal bovine serum (FBS). When had confluence cells culture were removed with

trypsin-EDTA and added to other two flasks containing HAM-F10 medium culture

supplemented with 10% FBS and washed with phosphate buffer sodium (PBS) three

times. After centrifugation, the pellet containing the cells was kept frozen at -40°C

until protein content and enzyme activity determination. For in vitro study, fibroblasts

were cultured for 48 hours at 0.00, 0.02, 0.2, 2.0 and 5.0 μg/mL of swainsonine

concentration [10].

ASSAY OF

α-MANNOSIDASE, β-MANNOSIDASE AND β-

GALACTOSIDASE

The α-mannosidase and β-mannosidase activities were determined

using the fluorogenic substrate 4-methylumbelliferyl-α-L-mannopiranoside and 4-

methylumbelliferyl-β-L-mannopiranoside, respectively. For assay, 20μl of fibroblasts

previously diluted in water were mixed with 100μl of respectively substrate solution

2mM in phosphate citrate buffer 0.2M, pH 4.0 at 37°C for 1 hour. The β-

galactosidase activity was assayed by the method of Suzuki [11] using 4-

methylumbelliferyl-β-D-galactoside as a substrate. Protein contents of leukocytes

were between 15–30 mg. For assay, fibroblasts were previously diluted in 0.9% of

sodium chloride, and 100μL were mixed with 200μL of substrate solution 1.33mM in

citrate-phosphate buffer 0.1M, pH 4.0 and 100μL sodium chloride 0.2M, at 37 °C for

1 hour. The reaction was stopped with 3mL of glycine-NaOH buffer 0.5M, pH 10.3.

Fluorescence was read with a Hitachi F-2000 spectrofluorometer (excitation and

emission wave-length of 365 and 450nm, respectively). Protein concentration was

determined by method the Lowry et al. [12].

STATISTICAL ANALYSIS

Data were analyzed by ANOVA two-way, followed by the Duncan

multiple range test when the F test was significant. The analysis was performed

using the statistical software pack-age SPSS/PC1, version 11.0 Chicago, IL, USA,

and the level of significance was set at p < 0.01.

RESULTS

Table 1: In vivo effect of Sida carpinifolia diet in goat fibroblasts culture on α-

mannosidase, β-mannosidase, and β-galactosidase activities.

Diet with Sida carpinifolia (days)

Diet without Sida

carpinifolia (days)

Enzymes

Two days

before

α-mannosidase 76±22 78±7 106±6* 148±36*

83±12

β-mannosidase 1.1±0.1 0.7±0.5 1.3±0.2 0.9±0.1

0.9±0.2

β-galactosidase 254±29 204±11 283±12 260±48 235±13

Data are mean for six independent experiments performed in triplicate. Enzymatic

activity was expressed in nmoles4-MU/h/mg.protein.*p< 0.01 (Duncan’s multiple

range test). 4-MU = 4-methilumbelliferone

100

Table 2: In vitro effect of swainsonine in goat fibroblasts culture on α-mannosidase,

β-mannosidase, and β-galactosidase activities.

Swainsonine (μg/mL)

Enzymes 0.0 0.02 0.2 2.0 5.0

α-mannosidase 74±2 64±11 72±5 35±5* 21±6*

β-mannosidase 1.1±0.1 1.2±0.3 0.9±0.1 1.1±0.05 1±0.3

β-galactosidase 229±17 226±19 246±18 245±19 225±26

Data are mean for six independent experiments performed in triplicate. Enzymatic

activity expressed in nmoles4-MU/h/mg.protein.*p< 0.01 (Duncan’s multiple range

test).

The clinical picture in goats was varying during the experimental

phase consumption of Sida carpinifolia diet and was characterized for excrements

alterations, weight profit reduction and mainly neurological clinical signals.

Neurological alterations were discrete and beginning between the first and second

week of Sida carpinifolia diet consumption and consisted of apparent depression,

look fixture and slow movements. Blood counts did not show significant change

during all experimental period. The α-mannosidase activity in goat fibroblasts culture

was significant increased from 14

day after Sida carpinifolia diet consumption,

remaining modified until the end of the experiment. In the 8

day after withdraw of

the Sida carpinifolia diet, the α-mannosidase activity was at normal levels (83± 54

MU/h/mg.protein) (table 1). However, α-mannosidase activity in goat fibroblasts

culture at 2.0 and 5.0 μg/mL of swainsonine concentration (1.15 x 10

-8

mM and 2.88 x

101

-8

mM) reduced 52 and 72 per cent, respectively, from control (table 2). The β-

mannosidase and β-galactosidase activities did not show alteration in both

experiments (table 1 and 2).

DISCUSSION

Swainsonine is specific inhibitor of α-mannosidase [13] and Sida

carpinifolia contains swainsonine at 0.006% of dry weight [7]. In our laboratory, in

goats that fed with Sida carpinifolia diet, the α-mannosidase activity increased in

leukocytes and diminished in plasma (data not published). The α-mannosidase

activity reduced in goat fibroblasts culture at 2.0 and 5.0μg/mL (1.15 x 10

-8

mM and

2.88 x 10

-8

mM) swainsonine concentrations and increased in goat fibroblasts culture

that fed Sida carpinifolia diet for 14 and 28 days. In our work, swainsonine alkali

added to goat fibroblasts culture seems alike the hereditary illness human α-

mannosidosis, in agreement with Ikeda (2003) in human lymphoblast [14]. However,

the swainsonine concentration present in Sida carpinifolia provoked contrary effect to

wait in fibroblasts. Effect of swainsonine seems to be of restricting not only to α-

mannosidase inhibition, being it able to intervene at macromolecules glicosylation

the important roll in cellular recognition and to induce the hybrid glycoprotein

formation, as in human fibroblasts [15]. At the same time, results from goat

102

fibroblasts culture fed with Sida carpinifolia diet estimate that it possesses

substances that, when metabolized for organism can compensate the inhibitory

effect of the swainsonine on α-mannosidase. On the other hand, it is possible that

the modification of glycoprotein, induced for swainsonine present in Sida carpinifolia

can be modifying traffic and processing of α-mannosidase. This would explain why,

despite of the significant increase of enzymatic activity of α-mannosidase in

leukocytes and fibroblasts, occurs urinary oligosaccharide accumulation (date not

published) and clinical signals of the neurological illness. For this hypothesis would

be necessary studies of cellular sub fracionament in goat fibroblasts culture fed with

Sida carpinifolia diet.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from Brazilian funds CNPq,

CAPES, and GPPG-HCPA.

103

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106

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A rápida absorção do swainsonione pelas células e sua ampla

distribuição facilita sua ação modificadora na estrutura dos oligossacarídeos na

membrana dos leucócitos e de suas organelas, incluindo os lisossomos. A atividade

diminuída da α-manosidase no plasma de caprinos que ingeriram Sida carpinifolia é

uma indicação de que a estrutura dos oligossacarídeos possa estar modificada,

alterando o reconhecimento celular na membrana e bloqueando a saída da enzima

da célula. Ao mesmo tempo em que a atividade da α-manosidase nos leucócitos

dos caprinos alimentados com Sida carpinifolia aumentou a partir do 5° dia após o

consumo da planta, foi claramente observada a presença de oligossacarídeos na

urina destes caprinos a partir do 2° dia após o consumo da Sida carpinifolia,

indicando que a atividade da α-manosidase dentro dos lisossomos está diminuída,

hipótese que poderia ser testada através do subfracionamento celular em

fibroblastos de animais tratados com Sida carpinifolia.

O swainsonine nas concentrações de 2,0 e 5,0 µg/mL em

fibroblastos cultivados de caprinos diminuiu a atividade da α-manosidase,

contrastando com o estudo in vivo onde a atividade da enzima em fibroblastos

cultivados de caprinos que ingeriram Sida carpinifolia aumentou após o 14° dia de

consumo da planta. Este estudo nos sugere que a atividade aumentada da α-

manosidase em leucócitos possa ser atribuída a substâncias presentes na Sida

107

carpinifolia. Estas substâncias podem estar aumentando a expressão da α-

manosidase para compensar o efeito inibitório do swainsonine sobre a enzima.

Os caprinos alimentados com a dieta contendo Sida carpinifolia

apresentaram acúmulo de oligossacarídeos na urina, atividade da α-manosidase

diminuída no plasma e sinais clínicos neurológicos, indicando que a Sida carpinifolia

mimetiza a doença α-manosidose.

Os sinais clínicos neurológicos foram observados a partir do 10°

dia após o início da ingestão da dieta contendo Sida carpinifolia, ou seja, 6 dias

após a diminuição da α-manosidase no plasma e o acúmulo de oligossacarídeos na

urina foi imediato, no 2° dia após a ingestão da dieta contendo Sida carpinifolia,

indicando que a enzima lisossomal foi inibida pela presença do swainsonine na

planta.

Apesar de que alterações discretas no comportamento dos

caprinos ainda persistiram por 30 dias após o término do experimento, ocorreu

diminuição nos sinais clínicos neurológicos nos animais após a retirada da planta da

dieta, sugerindo que a Sida carpinifolia apresenta substâncias que se contrapõem à

ação inibitória causada pelo swainsonine sobre a enzima lisossomal α-manosidase.

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