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UNIVERSIDADE TIRADENTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E AMBIENTE
ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS VERMELHA SOBRE
Enterococcus faecalis
ANDERSON LESSA SIQUEIRA
Orientador: Profª Drª Juliana Cordeiro Cardoso
ARACAJU
ABRIL – 2008
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UNIVERSIDADE TIRADENTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E AMBIENTE
ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS VERMELHA SOBRE
Enterococcus faecalis
Dissertação de Mestrado
submetida à banca examinadora
como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Saúde e Ambiente, na área de
concentração em Saúde e
Ambiente.
ANDERSON LESSA SIQUEIRA
Orientador: Profª Drª Juliana Cordeiro Cardoso
ARACAJU
ABRIL – 2008
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ii
O AUTOR PERMITE A REPRODUÇÃO DE CÓPIAS OU PARTES DESTA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SOMENTE PARA PROPÓSITOS ACADÊMICOS E
CIENTÍFICOS DESDE QUE A FONTE SEJA CITADA.
Ficha catalográfica: Delvânia Rodrigues dos Santos Macêdo
CRB – 5/1425
S618e Siqueira, Anderson Lessa
Estudo da ação antibacteriana do extrato hidroalcoólico de própolis
vermelha sobre enterococcus faecalis / Anderson Lessa Siqueira ;
orientação [de] Juliana Cordeiro Cardoso. – Aracaju : UNIT, 2008.
51 p. : il. ; 30 cm
Inclui bibliografia.
Dissertação(Mestrado em Saúde e ambiente) – Universidade
Tiradentes
1. Própolis vermelha. 2. Ação antibacteriana. 3. Microbiota
endodôntica 4. Enterococcus faecalis I. Cardoso, Juliana Cordeiro II.
Título.
CDU: 579.61
iii
ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS
VERMELHA SOBRE Enterococcus faecalis
ANDERSON LESSA SIQUEIRA
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E
AMBIENTE DA UNIVERSIDADE TIRADENTES COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM SAÚDE E AMBIENTE.
Aprovada por:
________________________________________
Juliana Cordeiro Cardoso, D. Sc.
________________________________________
Francine Ferreira Padilha, D. Sc.
________________________________________
Sara Cuadros Orellana, D. Sc.
________________________________________
Leonardo Rigoldi Bonjardim, D. Sc.
________________________________________
Edílson Divino de Araújo, D. Sc.
________________________________________
Ricardo Luiz C. Albuquerque Júnior, D.Sc.
ARACAJU
ABRIL – 2008
iv
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS _______________________________________________ v
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES _________________________________ vi
RESUMO ________________________________________________________ 10
ABSTRACT ______________________________________________________ 11
1. INTRODUÇÃO _________________________________________________ 12
2.CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ____________________________ 15
2.1 Tratamento Endodôntico _______________________________________ 15
2.2 Própolis _____________________________________________________ 20
2.3 Referências bibliográficas ______________________________________ 25
3. CAPÍTULO 2- ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO
ETANÓLICO DE PRÓPOLIS VERMELHA SOBRE Enterococcus faecalis
34
RESUMO _______________________________________________________ 34
ABSTRACT _____________________________________________________ 34
3.1 INTRODUÇÃO ________________________________________________ 35
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ________________________________________ 37
3.3 RESULTADOS ________________________________________________ 39
3.4 DISCUSSÃO _________________________________________________ 42
3.5 CONCLUSÕES _______________________________________________ 44
3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _______________________________ 45
ANEXO A - Curva padrão de quercetina para determinação do teor de
flavonóides
52
ANEXO B - Termo de consentimento livre e esclarecido
53
ANEXO C – Parecer do Comitê de Ética 54
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Caracterização físico-química da própolis vermelha e extrato hidroalcoólico de
própolis vermelha da região de Brejo Grande/SE ____________________________ 40
Tabela 2- Média e desvio padrão dos halos de inibição (em mm) das soluções de própolis
vermelha (EEP), hipoclorito de sódio e água destilada contra Enterococcus faecalis ATCC
29212 ________________________________________________________________ 41
Tabela 3- Avaliação do crescimento bacteriano no ensaio ex vivo _____________ 41
vi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
AOAC - ASSOCIATION OF ANALYTICAL CHEMISTS
ATCC – AMERICAN TYPE CULTURE COLECTION
BHI – BRAIN HEART INFUSION
CBM – CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA
CEP – COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
CIM – CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
EDTA – ÁCIDO ETILENO DIAMINO TETRACÉTICO
EEP – EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS
ITP – INSTITUTO DE TECNOLOGIA E PESQUISA
LPNS – LABORATÓRIO DE PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS
vii
DEDICATÓRIA
A DEUS, pelo amor de Pai, pelo dom da vida, saúde e força nos momentos difíceis.
A meus pais, Antonio e Maria pelo amor, força e coragem e pela educação exemplar que me
deram durante minha vida com exemplos de honestidade, dignidade e bondade. Amo vocês.
À minha amada “Kakau” , pelo exemplo de mulher batalhadora, esposa exemplar, mãe e
profissional dedicada . Essa conquista é nossa. Obrigado pelos momentos desfrutados juntos e
pela paciência nos momentos de estresse. Amo você!
À kamille, luz de minha vida, perdoe-me pelos momentos ausentes e obrigado pelas horas de
paixão e alegria vividos ao seu lado..”Painho” te ama!
A meus irmãos Anselmo e André e suas esposas Mazinha e Izabela pela amizade e
companheirismo. Obrigado pelo apoio
À dona Lucinha e Bisa Neuflides por nos apoiarem ao cuidarem de nosso tesouro.
viii
AGRADECIMENTOS
À Juliana Cordeiro Cardoso, minha orientadora. “Ju”, obrigado por segurar em minha mão nos
meus momentos de desânimo e me guiar até o fim deste trabalho, sempre com bom humor e
ouvindo minhas constantes reclamações. Sem sua preciosa colaboração nada teria conseguido,
meu mais sincero agradecimento. Serei eternamente grato a ti.
À professora Drª Francine Ferreira meu muito obrigado pelas constantes orientações e pelo
apoio no desenvolver de todo o trabalho.
Ao Prof. Dr Ricardo Albuquerque pelas valiosas aulas, dicas, discussões, orientações que
serviram sempre para amadurecimento enquanto pesquisador. Obrigado por tudo.
Aos amigos Felipe Bittencourt, Alvaci Freitas e André Barreto pelo companheirismo, momentos
de estudo, de alegria, enfim cada momento vivenciado no decorrer deste curso. Que a amizade
verdadeira prevaleça sempre.
Aos colegas da primeira turma de Mestrado em Saúde e Ambiente da Universidade Tiradentes:
Alvaci, André, Felipe, Analu, Ana Guedes, Aglaé, Arley, Karynne, Flávia, Juciele, Marcos França
(o homem da info!), Hesmoney, Érika, Marieta, Iandra, Thiago, Simone e Mara Rúbia, pelo
companheirismo, amizade e oportunidade de convivência, meus sinceros agradecimentos.
Ao professor Dr. Leonardo Rigoldi pelo apoio, amizade, aceitação e orientação no início do
curso. você merece todo o sucesso.
Aos professores do ITP, em especial a: Prof. Dr Edílson Divino, Profª. Drª Sara Cuadros e Prof.
Dr Álvaro pelo apoio e por ter cedido as instalações de seus laboratórios bem como o
conhecimento para a execução da pesquisa.
Aos professores do curso de Mestrado em Saúde e Ambiente, por todo o ensino, dedicação e
orientação, meus sinceros agradecimentos.
À coordenação e aos funcionários do ITP.
À Universidade Tiradentes pela oportunidade de cursar este Programa de Pós-graduação.
ix
Aos estagiários do Laboratório de Produtos Naturais e Sintéticos (LPNS) pela ajuda no
desempenho dos meus trabalhos e pela constante e saudável convivência. Obrigado: Ju
Ouriques “Open Bar”, Vandinha, Tamara, Carles, Mateus “MM”, Romeu “Jet Lee”, Aldino.
Aos meus alunos da minha primeira turma de Aperfeiçoamento em Endodontia do CAP, pelo
apoio e confiança depositados em mim.
À professora Derileda, companheira de curso de aperfeiçoamento pelo apoio durante este
último ano.
Às amigas Ana Paula, Yzila Liziane e Luciana pela ajuda constante no desenvolver do trabalho
e apoio.
Aos amigos e compadres Alysson e Déa pelo carinho e amizade ao longo dos últimos 11 anos.
Aos meus amigos de trabalho (CEO) em especial aos doutores José Ubaldo e Dina Faro e às
Acds Andrezza, Joice, Eliúde, Ozória e Marise pelo incentivo constante e companheirismo.
Aos meus compadres Eduardo e Suzanne pelo apoio e palavras de incentivo, bem como pela
compreensão da ausência dos padrinhos de Vini nos últimos meses. Obrigado!
Aos amigos da 19ª CSM em especial ao MAJ Lima, Vieira, Lindaci, Spavier, Noélia, Adriana,
Otávio.
Aos professores Mirabeau, Alaíde Hermínia, Rosa Bragança, Maria Helena e Rogério pelo
apoio constante e estímulo à vida docente.
Ao Professor Celso Kenji pelo apoio, e estímulo a vida docente desde meus tempos de Bauru.
Aos amigos Hair Salas, Giovana Canova e Fábio Sene.
10
RESUMO
ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE
PRÓPOLIS VERMELHA SOBRE ENTEROCOCCUS FAECALIS
ANDERSON LESSA SIQUEIRA
A própolis é uma substância resinosa, complexa, produzida pelas abelhas a partir de
substâncias coletadas em ramos, flores, pólen, brotos e exsudatos de árvores. Nos
últimos 20 anos, houve aumento do interesse comercial no uso da própolis, devido às
suas propriedades terapêuticas, tais como, atividade antimicrobiana, antiinflamatória,
cicatrizante, anestésica e anticarcinogênica. Poucos trabalhos existem sobre a
variedade de própolis vermelha, encontrada no Estado de Sergipe. Diante de inúmeros
trabalhos relativos à própolis verde, nos quais observa-se a sua efetividade
antibacteriana, faz-se necessário avaliar se os extratos de própolis vermelha coletada
na região Norte do estado de Sergipe possuem a mesma ação. Sendo assim o trabalho
teve como objetivo: identificar e determinar a qualidade da própolis vermelha; avaliar a
eficácia antibacteriana do extrato hidroalcoólico da própolis vermelha produzida em
Brejo Grande/SE, comparando-a com o hipoclorito de sódio a 2,5% contra
Enterococcus faecalis, utilizando o método de difusão em ágar através de discos
impregnados com as soluções e em dentes humanos unirradiculares extraídos. O
Enterococcus faecalis é uma bactéria anaeróbia facultativa comumente encontrada em
infecções endodônticas recorrentes. A própolis coletada apresentou médio teor de
flavonóides (1,8%) e características físico-químicas compatíveis com os parâmetros
estabelecidos pelo Ministério da Agricultura. Apresentou boa efetividade antibacteriana
em concentrações de 7,5% e 10% quando comparada ao hipoclorito de sódio a 2,5%
contra Enterococcus faecalis .
Palavras-chave: própolis vermelha, ação antibacteriana, microbiota endodôntica,
Enterococcus faecalis.
11
ABSTRACT
STUDY OF ACTION OF ANTIBACTERIAL EXTRACT HIDROALCOHOLIC OF RED
PROPOLIS ON ENTEROCOCCUS FAECALIS
ANDERSON LESSA SIQUEIRA
Propolis is a complex, resinous substance, produced by bees from the collection of
substances found in the branches, flowers, pollen, shoots and exudates of trees. In the
last 20 years, there was an increase of commercial interest in the use of propolis, due to
its therapeutic properties. It is for their therapeutic properties, such as antibacterial
activity, antiinflammatory, healing, anticarcinogenic and anesthetic. Few studies exist on
the red variety of propolis found in the state of Sergipe. In spite of numerous work on
green propolis, which antibacterial activity has been demonstrated, little is known about
the biological activity of extracts of red propolis collected in the northern state of
Sergipe. Thus the study aimed to: identify and determine the quality of propolis red
assess the effectiveness of antibacterial extract of propolis hydro red produced in Brejo
Grande / SE, comparing it with sodium hypochlorite to 2.5% against Enterococcus
faecalis , using the method of dissemination in agar through discs impregnated with the
solutions and unirradiculares extracted human teeth. Enterococcus faecalis is a
facultative anaerobic bacterium commonly found in recurrent endodontic infections. The
inhibition halo promoted by the extract of propolis was compared with that provided by
the solution of sodium hypochlorite to 2.5%, usually used as a solution in endodontic
irrigant for disinfection of root canals. Propolis collected showed an average content of
flavonoids (1.8%) and physicochemical characteristics consistent to the requirements of
the Ministry of Agriculture. The results indicate a good effectiveness of extracts etanolics
of red propolis in concentrations of 7.5% and 10% compared to sodium hypochlorite to
2.5% against Enterococcus faecalis.
Keywords: red propolis, antibacterial action, endodontic microbiota, Enterococcus
faecalis.
12
1 INTRODUÇÃO
A Endodontia vem passando por processos de evolução técnico-científica, tentando
estabelecer procedimentos coerentes com os princípios biológicos para favorecer tratamentos
mais confortáveis, eliminando os fatores etiológicos das pulpopatias e periapicopatias, a fim de
manter o dente em função no sistema estomatognático estimulando a reparação dos tecidos
periapicais. As bactérias e seus subprodutos têm importante papel na etiopatogenia das
alterações pulpares e periapicais. O sucesso requer uma adequada limpeza e desinfecção do
sistema de canais radiculares (ESTRELA, 2000).
Com a infecção, não ocorre a deposição de cemento, podendo ocorrer formação de
tecido granulomatoso, sendo necessária a remoção das bactérias, para evitar infecção
secundária (KRONFELD, BOYLE, 1955). Em casos de necrose pulpar, observa-se a infecção
do sistema de canais radiculares, devendo promover uma adequada sanificação através do
preparo químico-mecânico, para alcançar a eliminação quase total dos microrganismos
presentes (SEN et al., 1995).
Dentre os principais requisitos para o sucesso do tratamento endodôntico, destaca-se a
completa eliminação de detritos do sistema de canais, através da neutralização químico-
mecânica, buscando esvaziá-los e alargá-los através da instrumentação associada à solução
irrigadora (BORIN et al., 2007). A redução da carga bacteriana é conseguida através da limpeza
realizada pela instrumentação associada à irrigação com soluções antimicrobianas, bem como
com o auxílio de um curativo antimicrobiano entre sessões (BYSTRÖM; SUNDQVIST, 1981).
Antes da escolha da substância química a ser utilizada na irrigação, deve-se analisar a
situação clínica presente (polpa viva ou necrose pulpar), verificando as propriedades da
solução, tais como: capacidade antimicrobiana, poder de limpeza e adequada tolerância aos
tecidos periapicais. As soluções irrigadoras auxiliam no preparo químico-mecânico, na limpeza
e na desinfecção do sistema de canais. O hipoclorito é a solução de escolha no tratamento de
dentes com polpa necrosada e infectada, por apresentar propriedades, como: atividade
antibacteriana; solvente de matéria orgânica; desodorizante; clareador; lubrificante; baixa
tensão superficial; ação detergente, saponificação (SIQUEIRA Jr, 1997).
Outras substâncias têm sido pesquisadas na intenção de preencher os requisitos de
uma solução antimicrobiana ideal, que tenham efetividade contra algumas cepas bacterianas,
como por exemplo cepas de Enterococcus faecalis. A maioria das infecções endodônticas é
mista e polimicrobiana, com predomínio de anaeróbios estritos. Todavia, tem-se verificado a
13
presença do Enterococcus faecalis, um facultativo, com certa freqüência em canais infectados,
causando infecções de difícil tratamento. Cepas clínicas de Enterococcus faecalis isoladas de
infecções endodônticas têm demonstrado resistência bacteriana ao regime terapêutico
convencional recomendado para procedimentos odontológicos. NODA et al. (2000) encontraram
cepas resistentes a cefalosporinas, aminoglicosídeos e tetraciclina. PINHEIRO et al. (2003)
encontraram cepas de Enterococcus faecalis resistentes aos macrolídeos: eritromicina e
azitromicina. Portanto, muitos antibióticos, tradicionalmente utilizados nas infecções
odontogênicas, podem ser ineficazes contra Enterococcus faecalis, e informações sobre
fármacos alternativos se tornam necessárias.
Os produtos naturais oferecem um enorme potencial já que produzem substâncias ainda
inéditas e complexas capazes de exibir diferentes atividades biológicas. A própolis já vem
sendo estudada dentro da odontologia apresentando resultados promissores.
A própolis é uma substância resinosa, elaborada pelas abelhas, a partir da coleta de
substâncias secretadas pelas plantas (GAFAR et al., 1986). É encontrada nas colméias, sendo
responsável pela impermeabilização, isolamento térmico, vedação e tratamento antisséptico
(BREYER, 1980; TREVISAN, 1983). Tem sido utilizada como anti-séptico e cicatrizante desde a
antiguidade, sendo ultimamente pesquisada quanto às suas propriedades farmacológicas
(MARCUCCI, 1995). Possui inúmeras propriedades biológicas, atribuídas aos flavonóides e aos
ácidos fenólicos. Dentre estas, destaca-se a ação antimicrobiana (bacteriostático e bactericida),
antiprotozoária, imunomoduladora, antiinflamatória, citotóxica, anticarcinogênica,
antiulcerogênica, anticariogênica, anti-hipotensiva, anestésica, cicatrizante, regeneradora de
tecido cartilaginoso e pulpar dental, hepatoprotetora e antioxidante (ACKERMANN, 1991;
CAPOTE, 2003; ISHIKAWA et al., 2004; JOHNSON et al., 1994; KEDZIA et al., 1990;
MARCUCCI, 1995).
A própolis vermelha é relatada ser típica de Cuba, onde a planta de origem é a Clusia
nemorosa (Clusiaceae) e da Venezuela onde as abelhas coletam a própolis de Clusia
scrobiculata (TRUSHEVA et al., 2006).
Embora estudos científicos tenham comprovado a atividade antibacteriana desta
variedade de própolis, tais propriedades terapêuticas tornam-se variáveis de acordo com a sua
origem botânica, localização geográfica e tonalidade. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi
avaliar a eficácia antibacteriana do extrato de própolis vermelha produzida na região norte do
estado de Sergipe sobre cepas de Enterococcus faecalis, freqüentemente isoladas de canais
radiculares infectados.
14
Dessa forma, de acordo com as normas do Programa de Pós-graduação em Saúde e
Ambiente da Universidade Tiradentes, o trabalho foi dividido em dois capítulos, onde o primeiro
apresenta uma revisão de literatura relativa ao tema e o segundo a parte experimental deste
trabalho na forma de um artigo científico.
15
2 CAPÍTULO 1- UTILIZAÇÃO DA PRÓPOLIS EM ODONTOLOGIA - REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
2.1 Tratamento endodôntico
O tratamento endodôntico tem como objetivo manter o dente em função no sistema
estomatognático, estimulando a reparação dos tecidos periapicais, após a máxima eliminação
de bactérias e de seus subprodutos do interior do sistema de canais radiculares, importantes na
produção de problemas clínicos e nos insucessos. O sucesso do tratamento requer uma
adequada limpeza e desinfecção do sistema de canais, pois bactérias localizadas em lacunas
de reabsorção cementária, no cemento, em canais laterais e deltas, em túbulos dentinários e na
lesão periapical podem ser as responsáveis pelo fracasso (ESTRELA, 2000).
A maioria das patologias de origem endodôntica tem como principal causa a presença
de microrganismos no sistema de canais radiculares. Na maioria das vezes os agentes
causadores são as bactérias, embora as leveduras e fungos também sejam relatados. O
sucesso no tratamento da patologia de origem endodôntica depende do controle da infecção
microbiana no sistema de canais radiculares, sendo assim, um entendimento detalhado da
microbiologia das infecções endodônticas é crucial para se obter êxito na terapia endodôntica.
As condições de vida da microbiota infecciosa no sistema de canais radiculares são
provavelmente dependentes do potencial redox (óxido-redução) local, da disponibilidade de
nutrientes e do sistema de defesa do hospedeiro. Em infecções persistentes, provenientes da
necrose pulpar, o teor de oxigênio no canal radicular é baixo, contribuindo para o predomínio de
bactérias anaeróbias e facultativas (LEONARDO, 2005).
Os agentes antimicrobianos, geralmente, atuam pela inibição do crescimento de
microrganismos ou pela destruição destes, tendo como critérios para a sua seleção e utilização:
a susceptibilidade do microrganismo ao método de desinfecção utilizado, o conhecimento da
inter-relação entre patógeno e hospedeiro, a baixa toxicidade do agente antimicrobiano às
células do hospedeiro, a capacidade de penetração do mesmo no sítio de infecção, e o não
desenvolvimento de resistência microbiana. Na polpa necrótica o sistema de defesa tem
possibilidades limitadas de função, devido à ausência do sistema vascular. Essa deficiência,
juntamente com a oferta de nutrientes, predispõe a localização dos microrganismos na luz do
canal principal. As bactérias presentes podem se difundir para os canalículos dentinários e
demais ramificações do canal. Estudos in vitro indicaram que algumas espécies Gram-positivas
16
penetram mais facilmente que as Gram-negativas (ORSTAVIK; PITT FORD, 2004). Entretanto,
a complexa anatomia dos canais radiculares oferece meios e condições para o crescimento,
multiplicação e interação dos microrganismos causadores de infecções pulpares (ESTRELA et
al., 1998; MARCHESAN et al., 2003; STUART et al., 2006).
A diminuição da infecção, através do preparo químico-mecânico e obturação dos canais
radiculares, propicia um ambiente favorável à manutenção da saúde periapical ou ao reparo de
lesões periapicais pré-existentes. Em alguns casos, quando o tratamento endodôntico fracassa,
o insucesso ocorre devido a procedimentos insatisfatórios de controle e eliminação da infecção
(NAIR et al., 1999). Alguns problemas, como a falta de controle asséptico durante o tratamento,
acesso incorreto à cavidade pulpar, canais não detectados, falhas na instrumentação,
obturações inadequadas, e restaurações coronárias insatisfatórias ou ausentes após o
tratamento endodôntico podem levar ao fracasso da terapia (CHEUNG, 1996).
O primeiro relato na literatura, referente ao papel de microrganismos nas doenças
pulpares e perirradiculares é de Willoughby Dayton Miller, em 1894, considerado o pai da
Microbiologia Oral. Ele demonstrou, por meio de material coletado de canais radiculares, a
associação entre bactérias e as patologias pulpares e periapicais (SIQUEIRA Jr, 1997).
KAKEHASHI et al., (1965), num estudo clássico na literatura endodôntica, expuseram
polpas de ratos convencionais e “germ-free” ao meio bucal. Enquanto nos animais
convencionais foram observadas inflamações severas ou necrose pulpar, associadas a lesões
perirradiculares, nos animais “germ-free” isso não foi observado, sendo que houve, inclusive, o
reparo do tecido pulpar por deposição de dentina neoformada (SIQUEIRA Jr, 1997).
Até os anos 70, acreditava-se que os microrganismos facultativos eram as bactérias
predominantes em canais radiculares infectados. Isso se devia às limitações dos métodos de
cultura empregados até aquela época, uma vez que as colheitas bacteriológicas eram
efetivadas somente em aerobiose. Com a introdução da câmara anaeróbia, na década de 70,
ocorreu um grande desenvolvimento nos métodos da cultura para anaeróbios, estimulando
novas pesquisas microbiológicas, utilizando-se amostras de canais radiculares infectados,
mudando-se, com isso, alguns conceitos existentes em Endodontia, assim como alterando
algumas técnicas e condutas clínicas (SUNDQVIST, 1976).
Após o desenvolvimento e aperfeiçoamento das técnicas de isolamento e cultura de
anaeróbios, verificou-se que as bactérias presentes na cavidade endodôntica dos dentes
infectados constituem um grupo restrito quando comparado com mais de 350 espécies que são
encontradas na cavidade oral; 50 dessas espécies podem sobreviver e multiplicar-se no
endodonto, mas apenas de quatro a sete espécies predominam num sistema de canais
17
radiculares infectados. Os organismos isolados nas infecções endodônticas são, em grande
parte, anaeróbios estritos, independente do quadro clínico dos dentes afetados. Atualmente,
nenhum trabalho sobre infecção endodôntica pode ser realizada sem atenção especial à cultura
anaeróbia. Infecções anaeróbias ocorrem quando existe comprometimento no suprimento
sangüíneo ou infecção antecedente pelas bactérias aeróbias, as quais irão produzir um meio
com baixo potencial de oxigênio. Os anaeróbios estão na flora normal e, assim, tornam-se
invasores secundários. Muitos fatores têm sido implicados na sobrevivência desses
microrganismos nos tecidos, incluindo adesão bacteriana, encapsulação, alterações na forma
dos neutrófilos, resistência à fagocitose (SELTZER, FABER, 1994).
Alguns indicativos para que haja uma seleção na microbiota endodôntica são: fatores
nutricionais, baixo potencial de óxido redução, pH, temperatura, interações positivas,
antagonismos entre os microrganismos e os mecanismos de defesa do hospedeiro (MARSH &
MARTIN, 1992).
Os nutrientes existentes no interior do canal radicular são provenientes dos fluidos
teciduais e da desintegração de células e componentes do tecido conjuntivo, e a sua
disponibilidade é um fator de influência na composição da microbiota nas infecções
endodônticas (SUNDQVIST, 1992).
Para o controle microbiano utiliza-se o processo de desinfecção, através do preparo do
canal radicular, realizando-se o esvaziamento, associado à dilatação, por meio de agentes
químicos e mecânicos (BYSTROM et al., 1987).
MARCHESAN et al., (2003) afirmaram que variações na anatomia interna podem influir
na terapia dos canais radiculares, uma vez que os canais não são cilíndricos, mas sim,
achatados. Por isso, podem permanecer tecidos remanescentes nos istmos, reentrâncias e
ramificações, tornando a instrumentação mais difícil.
Dentre os principais requisitos para obter-se êxito no tratamento endodôntico, destaca-
se a completa eliminação de detritos do sistema de canais radiculares, através do preparo
químico-mecânico, buscando o esvaziamento e alargamento do canal, através da
instrumentação associada à solução irrigadora (BORIN et al., 2007).
Devido à morfologia complexa e variável do sistema de canais radiculares, torna-se
difícil a eliminação completa dos microrganismos presentes, sendo necessário então após a
conclusão do preparo do sistema de canais e conseqüente colocação de curativo de demora,
realizar uma adequada obturação, a fim de impedir a multiplicação e a sobrevivência de
microrganismos que porventura tenham sobrevivido (KOPPER et al., 2007).
18
Várias substâncias químicas auxiliares têm sido propostas, sendo as mais empregadas
em Endodontia: os compostos halogenados (hipoclorito de sódio), tensoativos (aniônicos,
catiônicos, neutros), quelantes (EDTA), peróxidos, clorexidina e outros (PÉCORA et al., 1999).
As soluções irrigadoras vão atuar no auxílio do preparo químico-mecânico, na limpeza e
preferencialmente, na desinfecção do sistema de canais radiculares. O hipoclorito é a solução
irrigadora de escolha no tratamento de dentes com polpa necrosada e infectada, por apresentar
algumas propriedades, como: atividade antibacteriana; solvente de matéria orgânica;
desodorizante; clareador; lubrificante; possuir baixa tensão superficial; ação detergente,
saponificando gorduras (SIQUEIRA Jr, 1997).
HELING & CHANDLER (1998) estudaram o papel do hipoclorito de sódio, clorexidina e
peróxido de hidrogênio em várias concentrações, isoladas e combinadas, sobre o Enterococcus
faecalis, concluindo que o emprego do hipoclorito de sódio isoladamente teve uma efetividade
satisfatória diante das outras soluções testadas.
O efeito antibacteriano do hipoclorito de sódio a 0,5%, hipoclorito de sódio a 2,5%,
hipoclorito de sódio a 4%, digluconato de clorexidina a 0,2%, digluconato de clorexidina a 2%,
ácido cítrico a 10% e EDTA a 17%, sobre Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Enterococcus faecalis, Streptococcus
mutans, Streptococcus sanguis e Streptococcus sobrinus foi analisado. A análise foi realizada
por difusão em ágar, sendo que os resultados mostraram que o hipoclorito de sódio a 4%
apresentou os melhores resultados (SIQUEIRA Jr et al., 1998).
O teste de difusão em ágar é realizado em placas de Petri contendo meio de cultura
sólido, sobre o qual é semeado o microrganismo indicado para o teste. Os agentes
antimicrobianos testados são colocados em discos de papel ou mesmo em poços feitos no meio
de cultura. O raio formado da zona de inibição adjacente aos discos demonstra a difusão do
agente antimicrobiano. Contudo, o tamanho da zona de inibição estará diretamente relacionada
à solubilidade e a difusibilidade da substância testada, podendo não demonstrar o seu total
potencial (SIQUEIRA Jr et al., 1998; ESTRELA, 2001).
AYHAN et al., (1999) estudaram o efeito do hipoclorito de sódio a 5,25%, a 0,5%,
gluconato de clorexidina a 2%, álcool a 21% e cresofeno sobre Staphylococus aureus,
Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli e
Candida albicans. Os autores observaram que o hipoclorito de sódio a 5,25% foi efetivo contra
todos os microrganismos, enquanto a 0,5% apresentou menor efetividade. O álcool apresentou
halos de inibição menores que o gluconato de clorexidina, porém, sem significância estatística.
19
O cresofeno foi a substância que apresentou os maiores halos, porém é uma substância
citotóxica e possivelmente carcinogência, mutagênica e teratogênica.
SANTA CECÍLIA (1999) verificou o efeito antimicrobiano de uma solução experimental
de hipoclorito de sódio (Clor-in) e do hipoclorito de sódio a 1%, por meio de teste de difusão em
ágar, sobre os microrganismos: Porphyromonas endodontalis, Enterococcus faecalis e
Fusobacterium nucleatum. A solução experimental, tanto a estocada quanto a recém preparada,
apresentou maiores zonas de inibição microbiana quando comparada com a solução de
hipoclorito de sódio a 1%, demonstrando efetividade contra todas as cepas.
PINHEIRO et al. (2003) em um estudo bacteriológico de 30 canais de dentes com
insucesso do tratamento endodôntico concluíram que a microbiota era formada, em sua
maioria, por monoinfecções, composta por bactérias anaeróbias facultativas,
predominantemente Gram-positivas, representadas pelos gêneros Enterococcus e
Streptococcus, e, em segundo plano, por bactérias anaeróbias estritas, em especial as do
gênero Peptostreptococcus. Verificaram que o Enterococcus faecalis foi a espécie bacteriana
mais freqüente, isolada em 45,8% dos canais radiculares infectados.
LOVE (2001) relatou os possíveis mecanismos de resistência do E. faecalis após a
obturação do canal radicular, revelando ser comum aos seres humanos, apresentando-se
adaptado ao ambiente ecologicamente complexo, rico em nutrientes e esgotado de oxigênio
que são encontrados na cavidade oral, no trato gastrointestinal e na mucosa vaginal. Possui
ainda a habilidade de sobreviver como único microrganismo, não necessitando de outras
bactérias, bem como a capacidade de invadir os túbulos dentinários, podendo colonizar os
canalículos dentinários e reinfectar o canal já obturado. Outro fator importante é a capacidade
do E. faecalis aderir nas fibras colágenas desmineralizadas dos túbulos dentinários por meio da
produção de polipepitideos específicos, sendo este um dos fatores que dificultam sua
eliminação.
FIGDOR; DAVIES; SUNDQVIST (2003) estudaram a sobrevivência, o crescimento e a
recuperação do E. faecalis em soro humano, relatando que se o mesmo tiver acesso até a
pouca quantidade de soro humano ou fluido semelhante, mesmo em pequena quantidade de
células, podem obter o suporte nutricional adequado para a sobrevivência e levar a reinfecção
do canal radicular.
O E. faecalis é resistente ao tratamento endodôntico principalmente no que diz respeito
ao crescimento em pH alcalino, pois tal patógeno é capaz de sobreviver em pH na faixa de 2 a
10 (BYSTRON; SUNDQVIST, 1985; WALTIMO et al., 1999; EVANS et al., 2002), podem
sobreviver em ambientes hipotônicos, hipertônicos, ácidos, alcalinos, em ambientes com falta
20
de nutrientes, além de possuírem mecanismos de aderência nas células do hospedeiro (LOVE,
2001; FIGDOR; DAVIES; SUNDQVIST, 2003).
Além da resistência intrínseca, enterococcos têm adquirido determinantes genéticos
conferindo resistência a várias classes de antibióticos como, tetraciclina, eritromicina,
cloranfenicol e vancomicina (MUNDY et al., 2000; SHEPARD & GILMORE, 2002).
O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos tem levado à
seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a esses compostos, tornando o
uso de antimicrobianos de origem natural uma alternativa eficaz, econômica e com menos risco
de desenvolver resistência (CRISAN et al., 1995). O problema da resistência microbiana é
crescente e a perspectiva de uso de drogas antimicrobianas no futuro é incerta, devendo-se
tomar atitudes que possam reduzir este problema como, controlar o uso de antibióticos,
desenvolver pesquisas para melhor compreensão dos mecanismos genéticos de resistência e
continuar o estudo de desenvolvimento de novas drogas, tanto sintéticas como naturais
(NASCIMENTO et al., 2000).
Outras substâncias têm sido pesquisadas na intenção de preencher os requisitos de
uma solução antimicrobiana ideal, sendo algumas destes produtos naturais como por exemplo a
própolis.
2.2 Própolis
A prática das medicinas naturais mostra um grande interesse sobre produtos apícolas. A
própolis, na forma de extratos hidroetanólicos, se destaca tanto pelas suas propriedades
terapêuticas, tais como atividade antimicrobiana, antiinflamatória e anticariogênica, quanto pela
possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia (PARK et al., 1998).
Os produtos naturais possuem ampla diversidade molecular, ou seja, inúmeras
substâncias terapêuticas. Possuem similaridade ao metabolismo dos mamíferos, podendo
potencializar o efeito de uma substância natural. Entretanto, as magnitudes do mercado são
imprecisas, com dificuldades de acesso aos produtos naturais. O Brasil possui a maior
biodiversidade vegetal do mundo, em torno de 55.000 espécies, de um total mundial estimado
entre 350.000 a 550.000 espécies, e é desta que se retira a própolis, um dos muitos produtos
naturais utilizados durante séculos pela humanidade, sendo administrada sob diversas formas,
com relatos de seu emprego pelos assírios, gregos, romanos e egípcios, onde era usada para
embalsamar os mortos (SWERTS, 2002).
21
A própolis é uma substância resinosa, elaborada pelas abelhas, a partir de substâncias
secretadas pelas plantas (GAFAR et al., 1986). É encontrada nas colméias, onde é responsável
pela impermeabilização, isolamento térmico, vedação e tratamento antisséptico (BREYER,
1980; TREVISAN, 1983), sendo comercializada sob a forma de várias preparações
farmacêuticas e cosméticas, tais como, comprimidos, dentifrícios, gomas de mascar, pós,
loções, creme facial, tinturas e ungüentos (HAY e GREIG, 1990). Na odontologia é empregada
no tratamento de abcessos e gengivas hemorrágicas, bem como nos casos de candidíase bucal
e halitoses (NOTHENBERG, 1997).
A coloração da própolis é dependente de sua procedência e pode variar do marrom
escuro passando a uma tonalidade esverdeada até o marrom avermelhado, dependendo da
flora de origem e idade. Possui um odor característico que pode variar de uma amostra para
outra (MARCUCCI, 1996; BURDOCK, 1998). Em termos de composição química, sua
complexidade, foi revelada pela técnica de cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de
massa (CG/EM), o que permitiu a detecção de mais de 150 componentes (GREENAWAY,
1991). É considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas em fontes naturais,
onde mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou caracterizados em diferentes
amostras de própolis (BURDOCK, 1998).
Além de suas propriedades biológicas deve-se ressaltar a importância econômica da
atividade apícola, onde se observa um interesse global de pesquisas em própolis com duas
justificativas: a primeira devido às suas múltiplas propriedades biológicas e a segunda devido
ao seu alto valor agregado, onde, um frasco do extrato alcoólico é vendido no Brasil por cerca
de 5 a 10 reais, chegando a custar 150 dólares em Tóquio. Este alto valor justifica em parte o
interesse dos japoneses na própolis, principalmente a brasileira. Embora produza de 10 a 15%
da produção mundial, o Brasil atende a cerca de 80% da demanda japonesa (NOTHENBERG,
1997; PEREIRA et al., 2002).
Em se tratando de patentes relacionadas com própolis, em torno de 43% de todas
depositadas são japonesas, sendo que a primeira patente japonesa surgiu somente em 1987
(sobre o uso da própolis no controle de odores). Em relação ao Brasil a primeira surgiu somente
em 1995 para o uso em tratamento odontológico, na prevenção de cáries e gengivites. Até 1999
o Brasil possuía somente três patentes (menos de 2% de todas as patentes depositadas). Até o
início de 1999, em torno de quinze patentes (6,2% do total depositado) referiam-se ao uso da
própolis em tratamentos odontológicos. Essa é uma das aplicações da própolis mais estudada
em todo mundo, tendo relatos científicos desde 1952 (PEREIRA et al., 2002).
22
A apicultura é hoje considerada uma das grandes opções para a agricultura familiar por
proporcionar o aumento de renda, através da oportunidade de aproveitamento da
potencialidade natural de meio ambiente e de sua capacidade produtiva (MOREIRA, 1996).
No Brasil a colheita de própolis procede-se durante todo o ano, observando-se com isso
variações sazonais na sua composição e atividade, considerando-se a região e o local onde foi
coletada (LABBE et al., 1986). A sua composição química é bastante complexa e variada,
estando intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas.
De modo geral, contém 50-60% de resinas e bálsamos, 30-40% de ceras, 5-10% de óleos
essenciais, 5% de grãos de pólen, além de micro-elementos como alumínio, cálcio, estrôncio,
ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2, B6, C e E. A própolis é
conhecida, principalmente, por suas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória,
imunomodulatória, hipotensiva, cicatrizante, anestésica, anticâncer e anticariogênica (PARK et
al., 2002).
ROSALEN et al. (2007) e CASTRO et al. (2007) concluíram que, ao longo dos períodos de
safra apícola estudados, a sazonalidade influenciou a atividade antibacteriana das própolis dos
tipos 6 (região nordeste) e 12 (região sudeste), devido, provavelmente, à alteração na
concentração de compostos bioativos oriundos das fontes vegetais, demonstrando que a
atividade antibacteriana das própolis pode variar em função do período de coleta e da
sazonalidade local.
Os compostos fenólicos são seus constituintes principais, sendo representados pelas
agliconas de flavonóides, ácidos fenólicos e seus ésteres, os quais são responsáveis pela
bioatividade contra vários microrganismos patogênicos (BANSKOTA et al., 1998; BURDOCK,
1998). Além disso, fatores associados à técnica de extração, metodologia de condução de
ensaios e época do ano em que foi produzida podem ter influência sobre o maior ou menor grau
de atividade biológica (KOO e PARK, 1997; BANKOVA et al., 2000; BIANCHINI, 1998).
Os flavonóides podem representar uma barreira química de defesa contra
microrganismos, insetos e outros animais herbívoros, atuando também em relacionamentos
harmônicos entre plantas e insetos, atraindo e orientando esses animais até o néctar,
contribuindo enormemente para a polinização (MARCUCCI, 1998). Juntamente com os ácidos
fenólicos e ésteres, aldeídos fenólicos e cetonas são considerados os compostos
antimicrobianos mais importantes da própolis. O mecanismo de ação é complexo, podendo ser
atribuído à interação entre flavonóides, hidroxiácidos e sesquiterpenos (KROL et al., 1993;
CASTALDO & CAPASSO, 2002).
23
Alguns trabalhos mostram a similaridade ou relacionam algumas substâncias naturais
das plantas aos componentes encontrados na própolis. No caso do Brasil são descritas
propriedades biológicas e composição química distintas para diferentes amostras coletadas no
país. Essa variação é facilmente explicada pela grande biodiversidade brasileira, assim como,
até certo ponto, a habilidade das abelhas em alterar a composição nativa ou adicionar
componentes próprios à própolis (PEREIRA et al., 2002).
A capacidade da própolis em inibir o crescimento bacteriano é uma das atividades
farmacológicas mais conhecidas e comprovadas cientificamente. A despeito de suas distintas
composições, amostras de própolis da Europa são muito similares em relação à atividade
antimicrobiana quando comparadas com as amostras de própolis provenientes do Brasil
(POPOVA et al., 2004).
Em um estudo endodôntico clínico, comparou-se o uso de tintura de própolis a 50% com
a solução clássica de Walkhoff (PMCC), onde se observou que a própolis foi eficaz em quase
todos os casos resolvidos em duas sessões, enquanto no tratamento clássico necessitou de
três ou quatro sessões, não demonstrando reações alérgicas, tornando-se medicamento de
escolha para os autores nos casos de gangrena pulpar (GAFAR et al., 1986).
A atividade antimicrobiana de extratos de Arnica montana (5 e 10%) e de própolis (10%),
ambos provenientes do estado de Minas Gerais foi avaliada através do método de difusão em
ágar e medição dos halos de inibição de 14 cepas, incluindo o E. faecalis , onde observou que a
própolis inibiu todos os microrganismos testados, ao passo que os extratos de Arnica tiveram
resultados decepcionantes (GOMES et al., 1998).
FERNANDES JR. et al., (2001) comprovaram que a própolis coletada por abelhas Apis
mellifera e por várias espécies de Meliponíneos apresentaram atividade frente à S. aureus,
Escherichia coli e Enterococcus sp. VELIKOVA et al., (2000) demonstraram que 12 diferentes
amostras de própolis coletadas por Meliponíneos tiveram pouca ou nenhuma atividade contra E.
coli e algumas tiveram uma atividade pronunciada sobre Staphylococcus aureus, provavelmente
pelo alto teor de ácidos diterpênicos.
Estudos avaliando os extratos etanólicos contra 161 isolados bacterianos, demonstraram
atividade antibacteriana inibindo o crescimento de 67,7% das bactérias testadas, sendo que
92,6% dos isolados Gram positivos e 42,5% dos Gram negativos foram sensíveis ao extrato. O
extrato alcóolico de própolis avaliado foi capaz de exercer ação antibacteriana efetiva contra a
maioria dos isolados testados (VARGAS et al., 2004).
SILVA et al., (2006), avaliando a própolis produzida por abelhas Apis mellifera L. no
estado da Paraíba, determinaram a atividade antimicrobiana contra Candida albicans e
24
Staphylococcus aureus, não sendo verificada atividade antimicrobiana para os patógenos
estudados. Porém o trabalho destaca que a composição físico-química varia de acordo com o
período da colheita das amostras, onde observaram que as própolis colhidas em períodos de
maior precipitação apresentaram melhores valores para compostos bioativos.
A importância da própolis em Odontologia pode ser observada em trabalhos pertinentes
às várias especialidades. Alguns estudos mostraram resultados promissores em relação ao
efeito antiplaca e anti-cárie de extratos etanólicos brutos da própolis de Apis mellifera de
algumas regiões do Brasil, particularmente do Rio Grande do Sul e de Minas Gerais,
classificadas como tipo-3 e tipo-12, respectivamente (HAYACIBARA, 2004).
FERNANDES JÚNIOR et al. (2006) avaliaram a ação antimicrobiana de própolis obtidas
em três regiões do Brasil (Botucatu-SP, Mossoró-RN e Urubici-SC) sobre linhagens isoladas de
infecções clínicas humanas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp,
Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. Foram preparados extratos alcoólicos de
própolis (EAP) e determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) seguida do cálculo da
CIM 90%. Relataram que a própolis de Botucatu foi a mais eficiente sobre S. aureus,
Enterococcus sp e C. albicans. Para E. coli, a própolis eficiente foi de Urubici e para P.
aeruginosa a de Mossoró. Concluíram que para os microrganismos e amostras de própolis
testadas, há diferenças na atividade antimicrobiana em função do local de produção, devido a
diferença de composição química da própolis.
FARNESI (2007), estudando os efeitos da própolis de abelhas africanizadas e
meliponíneos contra cepas de: Aspergillus nidulans, Trichophyton rubrum, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Micrococcus luteus , concluindo que
nenhuma das amostras de própolis testadas apresentaram atividade anti-fúngica contra
Aspergillus nidulans e a linhagem de fungo Trichophyton rubrum apresentou sensibilidade
principalmente à própolis verde. As própolis testadas apresentaram importante atividade
antibacteriana.
Um novo tipo de própolis brasileira, conhecida popularmente como própolis vermelha foi
analisada quimicamente, observando-se atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus
e Staphylococcus mutans, mostrando também atividades citotóxicas contra células tumorais.
Sete novos compostos químicos foram observados em cromatografia gasosa/massa, sendo que
destes, quatro foram isoflavonas. Os resultados deste trabalho mostraram que a própolis
vermelha possui compostos biológicos ativos que nunca tinham sido encontrados nos doze
tipos de própolis brasileiras já citadas até a presente data (ALENCAR et al., 2007).
25
DAUGSCH et al. (2006, 2007) concluíram que a principal origem botânica da própolis
vermelha é a Dalbergia ecastophyllum. Coletaram amostras de própolis vermelha de cinco
estados do nordeste brasileiro (Bahia, Sergipe, Alagoas, Pernambuco e Paraíba) comparando-
as através de testes em Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência em Fase
Reversa (RPHPTLC) e Cromatografia Liquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RPHPLC)
com resinas da D. ecastopyllum constatando perfis muito similares. Ainda neste trabalho
testaram extratos hidro-alcoólico da própolis coletadas nos seis estados, através do método do
disco, em Staphylococcus aureus, obtendo halos de inibição favoráveis.
SILVA et al. (2007) avaliaram a origem botânica e a composição química de um tipo de
própolis brasileira, de coloração vermelha, mostrando ser provável que a mesma tenha origem
na Dalbergia ecastophyllum, bem como apresentando um alto percentual de iso-flavonóides.
Apesar da pequena oferta de trabalhos na literatura científica sobre a própolis vermelha
brasileira, os resultados obtidos relativos à suas características composicionais, têm
demonstrado um grande potencial biológico deste tipo de própolis quando comparada com
outros tipos já estudados e relatados.
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34
3 CAPÍTULO 2 -
ESTUDO DA AÇÃO ANTIBACTERIANA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS VERMELHA SOBRE Enterococcus faecalis
RESUMO
A própolis é uma substância resinosa, complexa, produzida pelas abelhas ,destacando-
se por suas propriedades terapêuticas, como atividade antimicrobiana, antiinflamatória,
cicatrizante. Poucos trabalhos existem sobre a variedade de própolis vermelha,
encontrada no Estado de Sergipe, o que faz necessário avaliar a ação antimicrobiana
do extrato de própolis vermelha coletada na região Nordeste do estado de Sergipe,
contra cepas de Enterococcus faecalis, através do método do halo de inibição por
discos impregnados com as soluções. O halo de inibição promovido pelo extrato de
própolis foi comparado com o halo da solução de hipoclorito de sódio a 2,5%, utilizado
como solução irrigadora em endodontia, verificando halos variando entre 12 e 16 mm,
demonstrando boa efetividade contra E. faecalis. A própolis coletada apresentou médio
teor de flavonóides (1,8%) e características físico-químicas coerentes às exigidas pelo
Ministério da Agricultura.
Palavras-chave: própolis vermelha, ação antibacteriana,
E. faecalis
.
ABSTRACT
Propolis is a complex resinous substance, produced by bees, such for its therapeutic properties,
such as antimicrobial activity, antiinflammatory, healing. Few studies exist on the red variety of
propolis, found in the state of Sergipe, which is necessary to evaluate the antimicrobial action of
the extract of propolis red collected in the northeastern state of Sergipe, against strains of
Enterococcus faecalis, through the halo of inhibition by discs impregnated with solutions. The
35
halo of inhibition promoted by the extract of propolis was compared with the halo of the solution
of sodium hypochlorite to 2.5%, used as a irrigation solution in endodontic checking halos
ranging between 12 and 16 mm, showing good effectiveness against E. Faecalis. Propolis
collected showed average content of flavonoids (1.8%) and physicochemical characteristics
consistent to those required by the Ministry of Agriculture.
Keywords: red propolis, antibacterial action,
E. Faecalis
.
3.1 INTRODUÇÃO
A presença de microrganismos no sistema de canais é a principal causa de infecções
endodônticas, sendo a viabilidade destes dependente do potencial de óxido-redução, da
disponibilidade de nutrientes e do sistema de defesa do hospedeiro. Em infecções persistentes,
provenientes da necrose pulpar, o teor de oxigênio no canal é baixo, contribuindo para o
predomínio de bactérias anaeróbias e facultativas (LEONARDO, 2005).
Um dos principais microrganismos envolvidos neste processo infeccioso é o
Enterococcus faecalis, classificado como anaeróbio facultativo, demonstrando mecanismos de
resistência após a obturação do canal radicular, apresentando-se adaptado ao ambiente
complexo, rico em nutrientes e pobre em oxigênio.
O Enteroccus faecalis é resistente ao tratamento endodôntico principalmente no que diz
respeito ao crescimento em pH alcalino, sendo capaz de sobreviver em pH na faixa de 2 a 10
(BYSTRON; SUNDQVIST, 1985; WALTIMO et al., 1999; EVANS et al., 2002), e em ambientes
hipotônicos, hipertônicos, falta de nutrientes, além de mecanismos de aderência nas células do
hospedeiro. A infecção se dá pela invasão do microrganismo nos túbulos dentinários,
colonizando os canalículos e reinfectando o canal já obturado. Além disso, o microrganismo
possui a capacidade de se aderir às fibras colágenas desmineralizadas dos túbulos dentinários,
dificultando sua eliminação (LOVE, 2001; FIGDOR; DAVIES; SUNDQVIST, 2003).
Para a eliminação do microrganismo do sistema de canal radicular, o hipoclorito é a
solução de escolha, principalmente quando se trata de dentes com polpa necrosada e
infectada, por ser antibacteriano, solvente de matéria orgânica, desodorizante, clareador,
lubrificante e detergente (SIQUEIRA Jr, 1997).
Outras substâncias são utilizadas como auxiliar no tratamento de infecções persistentes,
porém a literatura relata casos de resistência do Enterococcus faecalis para diversos
antibióticos, tais como: benzilpenicilina, ampicilina, clindamicina, metronidazol, tetraciclina,
cefalosporinas, aminoglicosídeos, macrolídeos (eritromicina e azitromicina) (DAHLÉN et al. ,
36
2000 ; NODA et al. , 2000 ; PINHEIRO et al. , 2003), sendo portanto necessárias informações
sobre fármacos alternativos. Diversas substâncias têm sido pesquisadas na intenção de
preencher os requisitos de uma solução antimicrobiana ideal.
A biodiversidade é uma forte aliada quando se procura novas substâncias naturais com
ação biológica, sendo que a pesquisa utilizando esta tem sido uma estratégia de sucesso na
descoberta de novos produtos medicinais como antibióticos, drogas anti tumor e outras ações.
A seleção da própolis foi baseada por se tratar de um produto natural que vem
despertando um interesse cada vez maior. Particularmente a própolis, sob a forma de extratos
hidroalcoólicos, vem se destacando tanto pelas suas propriedades terapêuticas quanto pela
possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica, alimentícia e cosmética. Dessa forma
buscou-se estudar um novo tipo de própolis, a vermelha e determinar suas reais
potencialidades em se tratando de atividade antimicrobiana para a cepa estudada, bem como
verificar uma possível alternativa econômica e biologicamente eficaz para sua utilização como
auxiliar no tratamento endodôntico, como uma solução irrigadora ou como curativo de demora.
A própolis vermelha é uma variedade pouco estudada, sendo que no Brasil é
encontrada, até o momento, somente na região Nordeste (TRUSHEVA et al., 2006; SALOMÃO
et al., 2007; ALENCAR et al., 2007; SILVA et al., 2007). A própolis já vem sendo estudada como
solução antimicrobiana, apresentando resultados promissores na área odontológica
(FERREIRA, 1999, FERREIRA et al., 2007, TRUSHEVA et al., 2006). As propriedades
biológicas da própolis são atribuídas aos flavonóides e aos ácidos fenólicos encontrados nas
mesmas, destacando-se a ação antimicrobiana, antiprotozoária, antinflamatória, citotóxica,
anticarcinogênica, antiulcerogênica, anticariogênica, anti-hipotensiva, anestésica, cicatrizante,
regeneradora de tecido cartilaginoso e pulpar dental, hepatoprotetora e antioxidante
(ACKERMANN, 1991; CAPOTE, 2003; ISHIKAWA et al., 2004; JOHNSON et al., 1994; KEDZIA
et al., 1990; MARCUCCI, 1995).
Foi observada a atividade antimicrobiana da variedade vermelha contra Staphylococcus
aureus e Staphylococcus mutans, apresentando resultados positivos, bem como atividade
citotóxica. Sete novos compostos químicos foram observados em cromatografia gasosa/massa,
sendo que destes, quatro foram isoflavonas. Os resultados mostraram que a própolis vermelha
possui compostos biológicos ativos que nunca tinham
sido encontrados nos doze tipos de
própolis brasileiras já citadas (ALENCAR et al., 2007).
Estudos recentes apontam que a sua composição química e ação biológica é
dependente da vegetação ao redor dos apiários onde é coletada pelas abelhas. Devido a estas
características peculiares há a necessidade de caracterizar quanto às propriedades físico-
37
químicas e ação biológica a própolis vermelha coletada na região de Brejo Grande/SE, a fim de
dar subsídios para impulsionar o desenvolvimento de comunidades que trabalham neste setor.
Neste contexto, o presente estudo objetivou avaliar a eficácia antibacteriana do extrato de
própolis vermelha produzida na região norte do estado de Sergipe sobre cepa de Enterococcus
faecalis (Streptococcus faecalis) – ATCC 29212, avaliando esta ação in vitro, através do método
de halos de inibição, bem como em canais radiculares de dentes extraídos.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de própolis vermelha para análise foram coletadas de colméias de Apis
mellifera L., instaladas no apiário Capivaras, Brejo Grande/SE/Brasil (S 10º26`25``; W
36º26`12``) e armazenado sob refrigeração. Durante todo o trabalho foi utilizada a mesma
amostra para evitar variações ambientais.
O material foi identificado de acordo com a Instrução Normativa nº. 3 (BRASIL, 2001),
segundo suas características sensoriais (cor, aroma, consistência e presença de materiais
estranhos), granulometria e requisitos físico-químicos (perda por dessecação e teor de cinzas).
Os requisitos físico-químicos foram determinados conforme metodologia descrita na A.O.A.C.
(1995).
A extração foi realizada por maceração sob agitação constante durante 24 horas em
temperatura ambiente (FARNESI, 2007). Foram utilizadas amostras de 5 g de própolis vermelha
em 500 mL de uma solução etanol a 70%. Após evaporação do solvente para obtenção do
extrato seco, o material foi pesado e o rendimento calculado em relação a massa inicial utilizada
e expresso em porcentagem.
O teor de flavonóides no extrato seco foi determinado segundo ADELMANN (2005),
tendo flavonas e flavonóides expressos como equivalente de quercetina.
Para a avaliação antimicrobiana, foi utilizado o meio de cultura Brain Heart Infusion
(BHI). Utilizou-se como controle positivo a solução de hipoclorito de sódio a 2,5% e como
controle negativo a água destilada estéril. A cepa bacteriana de referência utilizada foi
proveniente do Laboratório de materiais de referência da Fundação Oswaldo Cruz – INCQS
(Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde) – Enterococcus faecalis (Streptococcus
faecalis) – ATCC 29212.
A cepa liofilizada foi reativada em caldo BHI, obtendo-se uma suspensão das bactérias.
Este material foi incubado em anaerobiose, por 48 horas a 37 ºC e a cultura obtida foi semeada
em placas contendo BHI ágar (AYHAN et al., 1999 ; DOTTO et al., 2006; PAREKH & CHANDA,
2007).
38
A análise da atividade antimicrobiana dos extratos de própolis contra cepa de
Enterococcus faecalis foi realizada de acordo com o método descrito por KIM, MARSHALL,
WEI, 1995; SIVROPOULOU et al., 1995; SPONCHIADO JÚNIOR, 2006. Amostras de 30 µL de
culturas ativas de Enterococcus faecalis foram incubadas por 24 horas/37ºC de crescimento e
após este período, a turbidez foi ajustada ao tubo 0,5 da escala McFarland (1,5 x 10
8
UFC) por
diluição em solução salina, sendo em seguida semeadas em placas de BHI ágar. Discos de
papel impregnados com 2 µL de solução de própolis com diferentes concentrações foram
colocados na placa, eqüidistantes e após 24 horas de incubação em anaerobiose a 37 ºC os
resultados foram observados. A massa de própolis em cada disco variou de 20 a 150 µg.
Discos contendo hipoclorito de sódio a 2,5% e água destilada também foram testados como
controle positivo e negativo respectivamente. A atividade inibitória do crescimento foi
determinada pela medição da zona de inibição. Este experimento foi realizado em quintuplicata.
Para determinação da atividade bactericida mínima foram distribuídos 5,0 mL do caldo
BHI em tubos (FERNANDES JÚNIOR et al., 2006) e 4 mL de solução de própolis à 7,5%. Foi
realizada a diluição seriada, obtendo-se após adição de 1 mL de inóculo em cada tubo uma
concentração de própolis entre 1.645 e 34.090 µg/mL. O inóculo adicionado foi proveniente de
uma cultura de 24 horas ajustado a 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 10
8
UFC) (AYHAN et al.,
1999 ; DOTTO et al., 2006; PAREKH & CHANDA, 2007). Após o período de incubação, 100 µL
do inóculo foi transferido para placas (duplicata) contendo BHI ágar, e estas incubadas em
anaerobiose a 37ºC por 24 horas. Após o período de incubação observou-se se houve
crescimento de colônias nas placas, sendo considerada concentração bactericida mínima
(CBM), a menor concentração do produto testado que resultou em menos de sete colônias
(SCHOENKNECHT; SABATH; THORNSBERRY, 1987).
Para o estudo em dentes humanos extraídos, trinta e um dentes unirradiculares foram
utilizados. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Parecer n° 020707) da
Universidade Tiradentes/SE .
Os espécimes selecionados tiveram suas coroas seccionadas por meio de um motor de
alta rotação e broca cilíndrica diamantada número 2135,0 sob refrigeração. Com o auxílio de
uma lima tipo K número 10, cada canal foi explorado em toda a sua extensão até que a lima
fosse detectada no forame apical. A partir deste comprimento, o instrumento foi recuado um
milímetro a fim de determinar o comprimento de trabalho. Em seguida, foi iniciado o preparo
biomecânico pela técnica Crown-Down, confeccionando-se o batente apical com a lima tipo K
39
número 50. O terço cervical foi alargado com brocas Gates-Glidden dois e três. Para a irrigação
foi utilizado, 2 mL de solução salina, sendo a irrigação final realizada com 2 mL de EDTA,
seguida de 2 mL de água destilada. Após o preparo, as amostras foram impermeabilizadas,
com cianoacrilato na região do forame apical, a fim de impedir a saída da suspensão
microbiana e foram esterilizados, em autoclave por 20 minutos a 121ºC (MENEZES et al., 2004;
SPONCHIADO Jr, 2006).
Todos os dentes foram contaminados através da inoculação de amostras de 30 µL de
cultura ativa de Enterococcus faecalis ajustadas ao tubo 0,5 da escala McFarland (1,5 x 10
8
UFC) e em seguida incubados em anaerobiose por 48 horas. Os dentes contaminados foram
divididos em três grupos com 10 dentes cada. O grupo 1 foi o grupo tratado com própolis a
7,5%, o grupo 2 foi tratado com solução de hipoclorito de sódio a 2,5% e o grupo 3 foi utilizado
como grupo controle e foi tratado apenas com salina estéril.
Cada espécime foi inundado por 2 mL da solução testada por 5 minutos e em seguida
colocou-se um cone de papel estéril 50 em cada, permanecendo por 5 minutos. Após este
período os cones de papel foram distribuídos em cinco placas (dois cones por placa) contendo
o BHI ágar e incubados por 72 horas.
3.3 RESULTADOS
No presente estudo foram avaliadas as características sensoriais e físico-químicas da
própolis vermelha da região de Brejo Grande/SE e ação antimicrobiana do extrato desta
própolis in vivo e ex vivo contra Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis) – ATCC 29212,
por ser este um patógeno de elevado interesse, pois está associado a infecções endodônticas
persistentes.
Os resultados obtidos nas análises de caracterização sensorial, da própolis vermelha
estudada, indicam que a amostra apresentou aroma balsâmico característico, cor vermelha
intensa e consistência rígida à temperatura ambiente, sendo observada ausência de
substâncias estranhas na amostra ou qualquer evidência de abelhas, madeira e vegetais.
Quanto à caracterização físico-química apresentou granulação heterogênea, com fragmentos
grandes. Os resultados das análises de teor de cinzas, perda por dessecação, teor de
flavonóides e rendimento da própolis do extrato hidroalcoólico podem ser observados na Tabela
40
1, onde se verifica que os valores obtidos estão de acordo com os valores referência da
legislação vigente.
Tabela 1- Caracterização físico-química da própolis vermelha e extrato hidroalcoólico de
própolis vermelha da região de Brejo Grande/SE
Parâmetro estudado
Média ± Desvio Padrão
Requisitos do Ministério*
Teor de cinzas
4,39 ± 0,67
Máximo de 5%
Perda por dessecação
6,47 ± 1,31
Máximo de 8%
Flavonóides totais 1,87± 0,26 Mínimo de 0,25%
Rendimento 43,5 Mínimo de 35%
* Valores de referência de acordo com legislação vigente (BRASIL, 2001)
Os flavonóides foram extraídos utilizando-se uma solução hidroalcoólica 70%, pois em
estudos prévios verificou-se ser este o solvente com melhor potencial de extração. Os
resultados desta extração classificam esta própolis como de médio teor de flavonóides segundo
a legislação brasileira (BRASIL, 2001).
O extrato hidroalcoólico de própolis vermelha foi avaliado quanto à ação antimicrobiana
frente ao microrganismo Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis) – ATCC 29212. Os
resultados das médias dos halos de inibição estão apresentados na Tabela 2, que variaram
entre 12 e 16 mm em função da concentração de extrato seco de própolis vermelha que variou
de 20 a 150 µg por disco teste. Foi utilizado como controle positivo solução de hipoclorito de
sódio por ser o composto químico com melhor espectro de ação e baixo custo aplicado como
solução irrigadora no tratamento endodôntico.
A solução teste com 150 µg de própolis foi a que apresentou o maior halo de inibição (16
mm), as demais soluções de própolis tiveram o mesmo halo de inibição que a solução de
hipoclorito de sódio utilizada com controle positivo (12 mm).
41
Tabela 2 - Média e desvio padrão dos halos de inibição (em mm) das soluções de própolis
vermelha (EEP), hipoclorito de sódio e água destilada contra Enterococcus faecalis ATCC
29212
Solução testada Massa aplicada (µg) Média ± Desvio Padrão
EEP 1% 20 12±1,92
EEP 2,5% 50 12±0,89
EEP 5% 100 12±0,89
EEP 7,5% 150 16±2,68
NaOCl 2,5% 50 12±1,67
Água destilada - 0
*Valores médios ± desvio padrão
A partir dos resultados obtidos com o teste de inibição foi utilizada a solução
hidroalcoólica de própolis a 7,5% para os ensaios ex vivo. Neste ensaio foram utilizados dentes
unirradiculares selecionados e esterilizados. Os dentes foram divididos em três grupos a fim de
avaliar a ação da própolis em dentes infectados com Enterococcus faecalis simulando o
ambiente oral.
Os resultados obtidos, neste ensaio, mostram que não houve crescimento de
microrganismo quando se utilizou o extrato de própolis a 7,5% ou a solução de hipoclorito de
sódio a 2,5% como solução irrigadora nos dentes infectados (Tabela 3).
Tabela 3- Avaliação do crescimento bacteriano no ensaio ex vivo
SOLUÇÕES
PLACA 1 PLACA 2 PLACA 3 PLACA 4 PLACA 5
EEP 7,5%
- - - - -
42
NaOCl 2,5%
- - - - -
SALINA
- + + + +
- Ausência de crescimento bacteriano.
+ Presença de crescimento bacteriano.
3.4 DISCUSSÃO
O reconhecimento da etiologia microbiana das infecções endodônticas, estimulou a
busca de avanços farmacológicos e técnico-científicos, a fim de facilitar a identificação de novas
condutas terapêuticas, melhorando as perspectivas, especialmente no que se refere ao controle
microbiano no canal e tecidos periapicais. A seleção da cepa bacteriana desta pesquisa
baseou-se na observação de que, na maioria das vezes, o fracasso no tratamento endodôntico
está relacionado à presença de E. faecalis (HAAPASALO; ØRSTAVIK, 1987; ESTRELA et al.,
1999; PERIN, 2001; SUNDE et al., 2002; EVANS et al., 2003; PINHEIRO et al., 2004; GOMES
et al., 2004, SIREN et al., 2004; GOMES et al., 2006; PEREIRA, 2004; PEREIRA et al., 2005;
SEDGLEY et al., 2005; GENTIL et al., 2006; STUART et al., 2006; ZOLETTI et al., 2006).
A identificação dos microrganismos predominantes nas infecções possibilita a adoção de
medidas destinadas à sua eliminação no interior do canal. Sabe-se que a instrumentação
isoladamente, não garante a completa remoção ou inativação destes nos canais infectados,
sendo importante a irrigação e medicação, associando a limpeza mecânica com a utilização de
agentes antibacterianos, para melhorar a efetividade do tratamento (BYSTRÖM & SUNDQVIST,
1981, 1987). Inúmeras substâncias químicas vêem sendo estudadas para serem utilizadas
como soluções irrigadoras, pois estas auxiliam no preparo químico-mecânico, na limpeza e na
desinfecção do sistema de canais radiculares.
Atualmente, o hipoclorito é a solução irrigadora mais utilizada no tratamento de dentes
com polpa necrosada e infectada, por apresentar algumas propriedades, como: atividade
antibacteriana; solvente de matéria orgânica; desodorizante; clareador; lubrificante; possuir
baixa tensão superficial; ação detergente, saponificando gorduras (SIQUEIRA Jr, 1997).
Entretanto, há relatos de processos alérgicos decorrentes de sua utilização, bem como pode
causar necrose tecidual em casos de extravasamento acidental, aliado ao fator de deixar sabor
residual e odor desagradável. Devido a estes fatores, há a necessidade de buscar novas
substâncias que atuem como soluções irrigadoras e com ação antimicrobiana.
43
De acordo com CASTRO et al. 2007, em estudo da influência da sazonalidade na
atividade antibacteriana da própolis do Sudeste e Nordeste, ao longo dos períodos de safra
apícola estudados, a sazonalidade influenciou a atividade antibacteriana das própolis dos tipos
6 (região nordeste) e 12 (região sudeste), devido, provavelmente, à alteração na concentração
de compostos bioativos oriundos das fontes vegetais destas própolis, demonstrando variação
da atividade antibacteriana em função do período de coleta sazonalidade. Portanto, o teor de
flavonóides, bem como o conteúdo de cinzas e umidade, traz informações sobre a qualidade da
própolis estudada.
Os resultados obtidos, nas análises de cinzas e perda por dessecação, indicam
conformidade com a legislação brasileira, o parâmetro de teor de flavonóides a enquadra como
própolis com teor médio de flavonóides (BRASIL, 2001). A perda por dessecação a 105ºC
demonstra o teor de umidade presente na amostra. Neste caso, amostras com alto teor de
umidade podem ser menos estáveis e dificultar sua manutenção durante estocagem.
Após a evaporação do solvente observou-se um rendimento de flavonóides de cerca
1,87% no processo de extração dos constituintes da própolis. O rendimento da extração
apresentou-se maior do que o valor preconizado pela legislação. A evaporação do solvente
muitas vezes se torna difícil devido a característica resinosa e higroscópica do material,
podendo gerar uma massa maior e conseqüentemente alterando o valor do rendimento. Porém,
foi evidenciada durante o experimento a alta solubilidade do produto no solvente utilizado,
demonstrando que o rendimento esperado da extração é alto.
Entretanto, o teor de flavonóides e rendimento pode ser influenciado não somente pela
biodiversidade de onde esta própolis foi coletada, mas também pelo método de extração
aplicado (SAWAYA et al., 2004). Em estudo realizado por FARNESI (2007) foi aplicada a
extração a frio utilizando solução hidroalcoólica a 70% por ser esta condição a que proporciona
o melhor rendimento de flavonóides. Os flavonóides são os principais marcadores químicos
encontrados na própolis e diversos autores já relatam sua relação com diversas atividades
biológicas (ROSALEN et al. ,2007; CASTRO et al. ,2007).
As condições de extração também influenciam na ação biológica, sendo que alguns
estudos apontam que a própolis verde apresenta potencial antimicrobiano contra E. faecalis
podendo ser utilizada como medicamento intracanal (FERREIRA, 1999; ONCAG et al., 2006;
FERREIRA et al., 2007).
Para se avaliar o potencial dos extratos hidroalcoólicos de própolis vermelha,
primeiramente foi avaliada a ação antimicrobiana pela presença de halos de inibição. Conforme
FONTANA et al. (2004) a metodologia de difusão em disco em meio sólido, apesar de limitada
44
pela solubilidade dos compostos testados, permite a detecção de várias amostras
simultaneamente em uma mesma placa de Petri. Pela simplicidade desta metodologia, a
atividade antimicrobiana do extrato etanólico de própolis foi testada através do método de
difusão em disco.
Pode-se verificar que a solução a 7,5% de própolis (150 µg) foi a concentração que
apresentou maior halo de inibição (16 mm). O hipoclorito de sódio a 2,5%, bem como as demais
concentrações testadas apresentaram halo de inibição próximos à 12 mm. Este resultado
demonstra que a solução de própolis, mesmo em concentrações mais baixas pode ter ação
comparada à do hipoclorito de sódio, o qual neste experimento foi utilizado como controle
positivo. No trabalho de DOTTO et al. (2006), os resultados mostraram halos de inibição
variando de 0 a 13,5 mm, dependendo do tipo de medicamento utilizado contra cepa de E.
faecalis com ATCC 29212, semelhante ao estudado em nosso trabalho, demonstrando que a
própolis vermelha apresenta um maior potencial inibidor que as soluções testadas.
A concentração bactericida mínima da própolis verde, para anaeróbios como o
Clostridium perfringens, Actinomyces israelil e para Prevotella intermedia foi de 25 mg/ mL,
6,25mg/ml e 6,25 mg/mL respectivamente (FERREIRA, 1999). Os resultados mostraram que a
concentração de própolis vermelha é maior que 18 mg/mL, porém na concentração de 34,09
mg/mL inibiu totalmente o crescimento da cepa de E. faecalis.
Aliado aos resultados da ação bactericida foi realizada a avaliação destas substâncias
através de estudos ex vivo. MENEZES et al. (2004) avaliaram a efetividade do hipoclorito de
sódio e da clorexidina, bem como de medicamentos utilizados como curativo de demora contra
cepas de Cândida albicans e Enterococcus faecalis em dentes extraídos, concluindo que a
pasta de hidróxido de cálcio associada ao paramono-cloro-fenol-canforado foi o medicamento
de demora mais efetivo na eliminação dos dois microrganismos e a solução de clorexidina a
2,0% foi mais efetiva do que a de hipoclorito de sódio a 2,5% contra o Enterococcus faecalis.
No presente estudo pôde-se observar que houve a inibição total do E. faecalis utilizando
massa igual a 150 mg do produto, porém, provavelmente pela alta concentração do extrato
verifica-se a alteração cromática dos espécimes dentários estudados, o que pode ser
considerado um grande inconveniente. Outros estudos devem ser feitos com concentrações
menores para verificar a sua efetividade sem provocar manchas nos dentes.
3.5 CONCLUSÕES
45
- A própolis vermelha coletada na região de Brejo Grande-SE, apresenta características
de identidade e qualidade compatíveis com os parâmetros estabelecidos pelo Ministério da
Agricultura;
- Apresentou potencial atividade antimicrobiana contra E. faecalis, podendo com estudos
mais aprofundados se transformar em um valioso auxiliar no tratamento endodôntico,
provavelmente devido ao teor médio de flavonóides encontrado neste produto, podendo
favorecer essa atividade biológica;
- Outros parâmetros, como toxicidade aos tecidos pulpares e estabilidade do produto,
bem como a viabilidade econômica devem ser avaliados.
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52
ANEXO A
y = 0,0046x - 0,0409
R = 0,993076
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 20 40 60 80 100 120 140
Concentração (mcg/mL)
Absorvância
Curva padrão de quercetina para determinação do teor de flavonóides
53
ANEXO B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, __________________________________________, RG_______________, abaixo
qualificado, DECLARO para fins de participação em pesquisa, que fui devidamente esclarecido do Projeto
de Pesquisa intitulado: “
Avaliação da atividade antibacteriana do extrato de própolis vermelha
sobre microrganismos anaeróbios presentes na microbiota endodôntica”
desenvolvido pela Profa.
Dra. Juliana Cordeiro Cardoso do Instituto de Tecnologia e Pesquisa da Universidade Tiradentes.
Estou ciente que o meu dente após extraído com a devida indicação será utilizado
como objeto na pesquisa acima relatada sem causar nenhum prejuízo à minha integridade
física e psicológica.
Fui informado(a) que se não me sentir a vontade para participar poderei desistir
sem nenhum problema, mesmo que já tenha autorizado.
Estes procedimentos serão realizados por profissional odontólogo qualificado e
somente dentes com real indicação para exodontia serão utilizados. O responsável pela
pesquisa estará sempre disponível para eliminar qualquer dúvida. Estou ciente que não
haverá nenhuma forma de remuneração ou indenização, sendo os participantes voluntários.
Não haverá nenhuma despesa para o voluntário.
DECLARO, outrossim, que após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o
que me foi explicado, consinto voluntariamente a utilização de meu dente após a extração nesta pesquisa.
Aracaju, ___ de ________ de 200_
QUALIFICAÇÃO DO DECLARANTE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Objeto da Pesquisa (Nome):............................................................................................
RG:..................... .......Data de nascimento:........ / ........ / ...... Sexo: M ( ) F ( )
Objeto da Pesquisa (Nome):............................................................................................
RG:..................... .......Data de nascimento:........ / ........ / ...... Sexo: M ( ) F ( )
Representante legal:..........................................................................................................
Natureza da Representação:
RG:................................. Data de nascimento:......./........./...... Sexo: M ( ) F ( )
Endereço:.....................................................nº................................Apto:.......................
Bairro:....................................... Cidade:.......................Cep:..............Tel.:.....................
______________________________
Assinatura do Declarante
54
DECLARAÇÃO DO PESQUISADOR
DECLARO, para fins de realização de pesquisa, ter elaborado este Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE), cumprindo todas as exigências contidas nas alíneas acima elencadas e que
obtive, de forma apropriada e voluntária, o consentimento livre e esclarecido do declarante acima
qualificado para a realização desta pesquisa.
Aracaju, __ de _____ de 200_.
_____________________________
Assinatura do Pesquisador
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