( PDF ) Expressão do anticorpo anti-p16ink4a em citologia cervical

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-graduação em Medicina: Ciências Médicas

Alexandre da Silva Rocha

Expressão do Anticorpo Anti-p16ink

em Citologia Cervical

Porto Alegre, dezembro de 2006

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Alexandre da Silva Rocha

Expressão do Anticorpo Anti-p16ink

em Citologia Cervical

Dissertação apresentada para obtenção do

grau de Mestre em Ciências Médicas

junto ao programa de Pós-graduação em

Medicina: Ciências Médicas, Faculdade

de Medicina da Universidade Federal do

Rio Grande do Sul

Orientadora: Prof. Dra. Mary Clarisse Bozzetti

Co-orientadora: Prof. Dra. Maria Isabel Albano Edelweiss

Porto Alegre, dezembro de 2006

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R672e Rocha, Alexandre da Silva

Expressão do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical /

Alexandre da Silva Rocha ; orient. Mary Clarisse Bozzetti ; co-

orient. Maria Isabel Albano Edelweiss. – 2006.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio

Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-

Graduação em Medicina: Ciências Médicas. Porto Alegre, BR-

RS,2006. p117

1. Citodiagnóstico 2. Doenças do colo do útero 3. Técnicas de

diagnóstico obstétrico e ginecológico 4. Anticorpos monoclonais 5.

Anticorpo anti-p16ink

I. Bozzetti, Mary Clarisse II. Edelweiss,

Maria Isabel Albano III. Título.

NLM: WP 141

Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA

Dedicatória

Dedico esta dissertação àqueles que me acompanharam

dedicada e incansavelmente até este momento:

Guilherme e Maria, pais

Simone, irmã

Lísia, noiva

Agradecimentos

Agradeço a todos que perceberam minhas hesitações,

dúvidas, descrenças, indecisões e suspeitas e insistiram

para que este momento chegasse:

Dra. Maria Isabel Albano Edelweiss e Dra. Mary Clarisse

Bozzetti, incansáveis no apoio e orientação. Meu especial

muito obrigado.

Ao Corpo técnico do Laboratório de Pesquisas do Hospital

de Clínicas de Porto Alegre e do Laboratório Edelweiss.

Gentis, capazes e dedicados na assistência e resolutividade.

Aos funcionários da Unidade Básica de Saúde Bananeiras /

Gerência Distrital de Saúde Partenon – Lomba do Pinheiro

parceiros diários no front da pesquisa.

Epígrafe

“Até o mais seguro dos homens e a mais confiante das

mulheres já passaram por um momento de hesitação, por

dúvidas enormes e dúvidas mirins, que talvez nem

merecessem ser chamadas de dúvidas, de tão pequenas.

Vacilos seria melhor dizer... Em tempos em que quase

ninguém se olha nos olhos, em que a maioria das pessoas

pouco se interessa pelo que não lhe diz respeito, só

mesmo agradecendo àqueles que percebem nossas

descrenças, indecisões, suspeitas, tudo o que nos paralisa,

e gastam um pouco de sua energia conosco, insistindo”

Lia Luft.

Resumo

Introdução: Desde a introdução do exame citológico cervical, em forma de programa

de rastreamento populacional, que a morbidade e a mortalidade do câncer da cérvice vêm

decrescendo. Considerado hoje como medida fortemente recomendada para mulheres

sexualmente ativas, mostra desapontadoras sensibilidades médias no diagnóstico de alterações

neoplásicas ou pré-neoplásicas cervicais. Justificativa: Dentre as várias alternativas

diagnósticas em cérvice, o uso de anticorpos monoclonais no exame citológico cervical, como

o anti-p16ink

, vêm se mostrando útil no incremento da sensibilidade diagnóstica. Entretanto

há carência de estudos utilizando o anticorpo em citologias coletadas na forma convencional

(não meio-líquido) e associadas ao exame padrão-ouro cervical (biópsia dirigida por

colposcopia). Objetivos: Avaliar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e

negativo do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical coletada na forma convencional.

Avaliar a variação inter-observador na leitura das lâminas de citologia coradas com o

anticorpo. Método: Estudo de casos e controles realizado em ambulatório de patologia

cervical. As lâminas de citologia, para imunocitoquímica com o anticorpo, foram coletadas

com espátula de Ayre e escova tipo cytobrush. A leitura das lâminas foi realizada por dois

patologistas independentes (P1 e P2). Foram considerados casos (n=61), as investigações

cervicais que resultaram em biópsia diagnóstica compatível com lesão intra-epitelial de baixo

grau (NIC 1), alto grau (NIC 2/3) ou carcinoma (CA). Foram considerados controles (n=87), as

investigações que contavam com colposcopia normal e citologia, corada pelo método de

Papanicolaou, negativas. Resultados: A sensibilidade para o diagnóstico das NIC 2/3 (n=23)

foi de 100% (P1) e 95,7% (P2). Já o valor preditivo negativo nos diagnósticos de NIC 2 ou pior

foi de 100 (P1) e 98,9 (P2). Nos dois casos de carcinoma epidermóide, a sensibilidade foi de

100% para ambos patologistas. A sensibilidade para o diagnóstico das NIC1 foi de 77,8% (P1)

e 58,3% (P2). O valor preditivo negativo entre as NIC1 foi de 90,6 (P1) e 82,0 (P2). O índice

kappa entre os dois patologistas foi de 0,74. Entre os casos de NIC 2/3 associado à positividade

nuclear ao anticorpo, a diferença percentual entre os patologistas foi inferior a 5%; mesmo

escore encontrado entre os casos de ausência de lesão cervical e negatividade para o anticorpo.

Já entre as portadoras de NIC1, houve maior variação inter-observador. Conclusões: Os

resultados apresentados apontam o anticorpo anti-p16ink

como auxiliar no rastreamento de

lesões precursoras ou neoplásicas em citologia cervical.

Abstract

Introduction: Since the cytological cervical testing was introduced as a populational

screening program, cervical cancer morbity and mortality has decreased. Nowadays it is

considered to be a strongly recommended screening test for the diagnosis of neoplastic

abnormalities or cervical pre-neoplastic lesions. Justification: Among the various alternatives

for the diagnosis of cervical cancer, the use of monoclonal antibodies in the cytological

cervical test, such as the antibody anti-p16ink

, has shown increase the sensitivity of the

cytological examination. However, there is a lack of studies using the monoclonal antibody in

cervical cytology linked to the histological examination of the uterine cervix. Objectives: To

evaluate sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the anti-p16ink

conventional sampled cervical cytology. To evaluate the inter-observer variation in reading of

slides marked with the antibody. Method: A case-control study was carried out in a cervical

pathology reference center. The cytology slides, submitted to the immunocytochemistry for the

diagnostic antibody, were conventionally sampled with Ayre´s spatula and Cytobrush. The

slides were read by two independent pathologists (P1 and P2). Cases (n=61) were all cervical

investigations that had resulted in compatible diagnostic biopsy with CIN 1, CIN 2/3 or

carcinoma. Controls (n=87), included all investigations presenting Papanicolaou cytology and

colposcopy negative. Results: Sensitivity for the histological diagnosis of CIN 2/3 (n=23) was

100% and 95.7% for P1 and P2, respectively. The negative predictive value on the CIN 2/3

was 100% (P1) and 98.6% (P2). In two cases of squamous carcinoma, sensitivity was 100%,

for both pathologists. Sensitivity for the diagnosis of CIN 1 was 77.8% (P1) and 58.3% (P2).

The negative predictive value for CIN 1 was 90.6% (P1) and 83% (P2). The kappa index

between the two pathologists was 0.74. Among the cases of CIN 2/3 associating the nuclear

positivity to the antibody, the difference between pathologists was inferior to 5%. Exactly the

same scores were found among cases of absence of cervical lesion and negativity for the

antibody. On the other hand in CIN 1 patients there was a greater inter-observer variation.

Conclusions: Our results suggest that the antibody anti-p16ink

could contribute as an

adjuvant tool in the screenig of pre-neoplastic and neoplastic lesions in conventional sampled

cervical cytology.

Figuras

Figura 1

Ciclo celular normal pág. 26

Figura 2

Ponto de controle G1 – S pág. 27

Figura 3

Ciclo celular sob ação da proteína E7

do HR-HPV

pág. 29

Figura 4

Fluxograma do processo de seleção

da amostra

artigo inglês - pág. 53

artigo português – pág. 80

Figura 5 Performance do anticorpo anti-

p16ink

de acordo com o resultado

da investigação

artigo inglês - pág. 62

artigo português – pág. 90

Figura 6 Exemplos de positividade ao

anticorpo anti-p16ink

pág. 99

Tabelas

Tabela 1 Variáveis sócio-demográficas da amostra

artigo inglês - pág. 59

artigo português - pág. 86

Tabela 2 Resultados da colposcopia de acordo com

o diagnóstico histológico cervical

artigo inglês - pág. 60

artigo português - pág. 87

Tabela 3 Expressão do anticorpo anti-p16ink

amostra

artigo inglês - pág. 61

artigo português - pág. 89

Tabela 4 Citologia cervical com o anticorpo anti-

p16ink

: sensibilidade e especificidade

artigo inglês - pág. 63

artigo português - pág. 91

Tabela 5 Citologia cervical com o anticorpo anti-

p16ink

: valores preditivos positivo e

negativo

artigo inglês - pág. 64

artigo português - pág. 92

Tabela 6 Resultado conjunto entre as citologias

Papanicolaou e ICQ com o anticorpo

anti-p16ink

artigo inglês - pág. 65

artigo português - pág. 93

Tabela 7

Associação das citologias Papanicolaou e

ICQ para o diagnóstico de lesões cervicais

artigo inglês - pág. 66

artigo português - pág. 94

Abreviaturas e Siglas

AGC Atypical glandular cells

ASC-H

Atypical squamous cells in which a high grade lesion

cannot be excluded

ASC-US Atypical squamous cells of undertemined

significance

CA Carcinoma

CDK Ciclyn-dependent kinase

DNA Desoxirribonucleic acid

DST Doença sexualmente transmissível

Fase G1 Fase pré-síntese de DNA no ciclo celular

Fase G2 Fase pré-mitose do ciclo celular

Fase M Fase de mitose do ciclo celular

Fase S Fase de síntese de DNA no ciclo celular

HE Hematoxilina e eosina

HIV Human imunodeficience vírus

HPV Human pappilomavirus

HR-HPV High risk human pappilomavirus

H-SIL High-grade squamous intraepithelial lesion

ICQ Imuno-citoquímica

LR-HPV Low risk human pappilomavirus

LSAB Labeled streptavidin biotin

L-SIL Low-grade squamous intraepithelial lesion

NIC 1 Neoplasia intra-epitelial cervical grau 1

NIC 2 Neoplasia intra-epitelial cervical grau 2

NIC 3 Neoplasia intra-epitelial cervical grau 3

PCNA Proliferating cell Nuclear antigen

PCR Polymerase chain reaction

pRb Retinoblastoma protein

SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida

Sumário

Introdução

pág. 15

Justificativa

pág. 34

Objetivo geral

pág. 34

Objetivo específico

pág. 34

Referências bibliográficas da dissertação

pág. 36

Artigo científico em inglês

pág. 48

Referências bibliográficas do artigo científico (inglês)

pág. 70

Artigo científico em português

pág. 74

Referências bibliográficas do artigo científico (português)

pág. 101

Conclusões

pág. 105

Considerações finais e perspectivas

pág. 106

Anexos

Anexo A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

pág. 108

Anexo B - Documento de Inclusão no Estudo

pág. 110

Anexo C - Técnica LSAB para imunocitologia

pág. 111

Anexo D - Técnica de Papanicolaou

pág. 112

Anexo E - Classificação Citológica de Bethesda 2001

pág. 113

Anexo F - Classificação Colposcópica da Federação

Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia

pág. 115

Anexo G - Critérios de Richart para o diagnóstico

histopatológico cervical

pág. 117

Introdução

Desde a introdução do exame citológico cervical em forma de programa de

rastreamento populacional, que a morbidade e a mortalidade do câncer da cérvice vêm

decrescendo

. Os estudos pioneiros de George Papanicolaou (1883 - 1962) resultaram na

publicação da monografia Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear em 1941

onde

técnica simples de coleta de células cervicais, para exame sob microscopia, era sugerida como

forma diagnóstica precoce de alterações epiteliais

. A introdução do exame citológico cervical

em escala populacional, já a partir da década de sessenta

, seu grande sucesso, simplicidade e

baixo custo vem rendendo distinção de medida fortemente recomendada para mulheres

sexualmente ativas (e que possuam a cérvice) com o objetivo diagnóstico precoce de alterações

epiteliais

O exame citológico cervical, idealizado para possuir grande sensibilidade e

especificidade no diagnóstico de alterações cervicais, mostrou-se deficiente nesse objetivo já

na década de setenta. Em 1977, após investigação governamental nos Estados Unidos da

América, motivado pela baixa acurácia do exame em laboratório contratado pela Força Aérea

daquele país, resultou na primeira publicação de resultados conflitantes para a citologia

cervical

. Atualmente diversas falhas na execução do exame citológico cervical vêm sendo

descritas como determinantes da baixa acurácia: erro na coleta, fixação, transporte e na leitura

da lâmina de citologia; número inadequado de células diagnósticas, além da presença de

sangue, esperma e exsudato inflamatório no esfregaço

. A conclusão de inúmeros estudos é que

o exame citológico do colo uterino é menos sensível do que se imaginava; sua acurácia será

grandemente influenciada pela prevalência da doença cervical no grupo em avaliação. A

sensibilidade, segundo alguns autores, seria de 0,51 (IC 95% 0,37 - 0,66) e sua especificidade

0,98 (IC 95% 0,97 - 0,99), sendo mais acurado entre lesões cervicais de alto grau

8-10

Situação no Brasil

Durante os anos de 1999 a 2001 foram aplicados aproximadamente 135 milhões de

reais em ações do Programa Viva Mulher do Ministério da Saúde no Brasil (que incluíram

coleta, exames citológicos, anátomo-patológicos de biópsias do colo uterino e cirurgia de alta

freqüência). Nesse período, foram realizados 23 milhões de exames citológicos pela rede

pública nacional do Sistema Único de Saúde

. Na segunda fase de intensificação do Programa

Viva Mulher, durante o ano de 2002, houve a realização de 3.8 milhões de novos exames

(Programa Nacional de Controle de Câncer de Colo do Útero)

. No estado do Rio Grande do

Sul, durante o mesmo período, foram realizados mais de dois milhões de novos exames, sendo

que na última fase de intensificação, durante o ano de 2002, foram coletados aproximadamente

710 mil exames

. No Município de Porto Alegre, durante o período de 2000 a 2004, foram

realizados aproximadamente 795 mil exames citológicos cervicais em regime denominado de

“extra-teto” onde, mesmo que ultrapassada a quota contratada inicialmente, novos exames

foram processados. Esta medida foi adotada visando manter cobertura de coletas inalterada

durante o período

Câncer da cérvice

A prevalência do câncer cervical no continente americano, varia de noventa e quatro

casos em 100.000 mulheres Haitianas até oito casos em 100.000 mulheres Canadenses

. No

Brasil esperam-se, para o ano de 2006, aproximadamente 19.000 novos diagnósticos de câncer

cervical, tendo média de vinte casos para cada 100.000 mulheres. No estado do Rio Grande do

Sul, estimam-se, para o ano corrente, trinta e dois casos para cada 100.000 mulheres ou 1730

novos diagnósticos de câncer cervical; já no Município de Porto Alegre, 260 novos casos deste

tumor

. Quanto aos óbitos, no estado do Rio Grande do Sul por câncer da cérvice, ocorreram

aproximadamente 300 óbitos/ano nos registros de 1997 a 2003. No mesmo período, no

município de Porto Alegre houve, em média, 57 óbitos anuais por este tumor

. Quanto às

idades dos óbitos percebe-se que nos anos de 2002 e 2003 concentrou-se na faixa dos 30 aos 69

anos, abrangendo desde a menacme até peri-menopausa

O exame citológico cervical

O rastreamento populacional a partir da citologia cervical é baseado na premissa que as

lesões do colo uterino são passíveis de esfoliação, possuem desenvolvimento gradual e, na

maioria das pacientes, evoluem de lesões precursoras até o câncer da cérvice

A adequada anamnese executada previamente à coleta do exame citológico e o

estabelecimento de fatores de risco para lesão cervical, torna-se elemento adjuvante ao

rastreamento:

a) Número de parceiros sexuais na vida e nos últimos 6 meses, consumo freqüente de

álcool e promiscuidade do parceiro, na tentativa de identificação de casos expostos a agentes

sexualmente transmissíveis como o papilomavírus humano (HPV)

b) Identificação da vulnerabilidade social como baixo nível educacional e renda

familiar per capita, além da identificação de paridade elevada

c) Quanto ao hábito de fumar, a presença de substâncias derivadas da inalação do

cigarro em concentrações elevadas nos tecidos cervicais

20, 21

e a suspeita de alterações do DNA

dos mesmos tecidos entre as fumantes

, sugere o cigarro como tendo efeito aditivo ao HPV na

transformação neoplásica do colo

23, 24

d) Destacar a possibilidade de comprometimento imunitário da paciente que,

sabidamente, é fator que favorece o aparecimento de lesões precursoras na cérvice, como o uso

de drogas com efeito imunossupressor

e infecção pelo vírus da imuno-deficiência humana

(HIV)

. Desde 1993, o câncer cervical é indicador da Síndrome da Imunodeficiência Humana

(SIDA) entre aquelas portadoras do vírus HIV, havendo alta prevalência de lesões precursoras

entre as pacientes mais comprometidas na imunidade celular

A adequada exposição da cérvice e a coleta do exame citológico de forma padronizada

tornam-se elementos indispensáveis para o diagnóstico: espéculo proporcional, iluminação

apropriada e observação de contra-indicativos à coleta como exsudato inflamatório, sangue ou

esperma em fundo vaginal. Adequada amostragem de toda a zona de transformação da cérvice

é obtida com escova cytobrush (rotação de 90º) e espátula de Ayre, evitando espátulas tipo

Broom ou o cotton swab

No momento da preparação da lâmina, tentar distribuição homogênea do esfregaço e

imediata fixação, lembrando que, em média, apenas 20% das células coletadas serão

depositadas na lâmina de exame e de forma não randômica

. Fato intrínseco de algumas lesões

cervicais é a “resistência” à descamação durante a coleta, sugerindo que moléculas de adesão

tecidual tipo as e-caderinas colaborem como responsáveis, contribuindo para os falso-

negativos do exame citológico cervical

Com exames citológicos cervicais adequadamente coletados, transportados e

interpretados em intervalos de até cinco anos, poderemos prevenir o câncer da cérvice em 64%

das vezes, com adicional proteção de 18%, caso o intervalo das coletas seja reduzido para 3 a 5

anos

Os critérios morfológicos celulares serão a base para o diagnóstico das lesões cervicais

na citologia; entretanto, a anormalidade morfológica poderá não ser suficientemente distinta a

ponto de rápida identificação, podendo estar presente em raras células do esfregaço e ser

passível de confusão com alterações benignas celulares

Lâminas de citologia cervical, amostradas entre casos de lesão intra-epitelial de alto

grau, que possuam menos de cinqüenta células representativas da lesão, difusamente

distribuídas e com a perda da hipercromasia nuclear típica, possuirão significativo erro

diagnóstico associado

33-35

. Estima-se que o diagnóstico falso-negativo na citologia cervical

deva-se a erros de leitura em 20 a 50% das vezes

Verifica-se que, mesmo em países com coberturas de coletas ultrapassando 85%,

metade dos casos de câncer cervical ocorram em mulheres que não foram testadas nos últimos

cinco anos e, entre as testadas, 12 a 23% possuam falhas no rastreamento

. Estima-se que 2/3

das falhas do exame citológico cervical sejam devidos a coleta inadequada e 1/3 devidos a

erros laboratoriais

38-40

. Entre aquelas diagnosticadas como portadoras de câncer cervical, a

revisão de seus exames citológicos “normais”, ocorridos nos três últimos anos, sejam

reclassificados para lesão escamosa intra-epitelial de alto grau (H-SIL) em 40% das vezes

Em países desenvolvidos, a revisão histórica dos exames de rastreamento, entre aquelas

portadoras de câncer cervical, apontará que as mais jovens foram examinadas em intervalos

recentes ao diagnóstico da neoplasia, portanto, com falsos negativos ou com evolução rápida

da doença. Já entre as mais idosas, há longos intervalos entre o último rastreamento e o

diagnóstico neoplásico

A qualidade da leitura das lâminas de citologia cervical poderá ser grandemente

influenciada pela fadiga do examinador e a experiência no diagnóstico das alterações celulares

menores no esfregaço. Já em 1988, visando controle de qualidade e certificação dos

laboratórios nos Estados Unidos da América, foi publicado o CLIA/88 (Clinical Laboratory

Improvement Amendments of 1988), onde se destacava a quota máxima da leitura de 100

lâminas/dia além da releitura das lâminas diagnosticadas como alteradas e de 10% das lâminas

inicialmente diagnosticadas como normais.

Visava evitar o fenômeno da “habituação”, onde, após a visualização de centenas de

campos microscópicos normais, o examinador encontrava-se dessensibilizado para a

localização de células anormais no esfregaço

43, 44

Mais recentemente o College of American Pathologists lançou o programa de

acreditação dos laboratórios de patologia que associou novos itens ao controle de qualidade

para o diagnóstico em citologia cervical. Este programa enfocou a atualização da equipe de

patologistas através de exames em laboratórios externos para proficiência, seminários e

consultas intra-departamentais visando a obtenção e manutenção da acreditação

45, 46

Tais condutas, ainda pouco seguidas em países em desenvolvimento, vêm se mostrando

auxiliares na minimização de discrepâncias laboratoriais

Adjuvantes ao exame citológico cervical

Diversas tecnologias foram associadas ao rastreamento cervical visando minimização

dos falsos negativos onde se destaca a colposcopia, morfometria celular, rastreamento

computadorizado, citologia em meio líquido, tipificação viral e outras. Entretanto, todas

seguem o mesmo percurso: introdução de nova técnica, aceitação não-crítica do método e

desapontamento após seu uso populacional

Tal fato deve-se à peculiaridade da transformação neoplásica do colo uterino dar-se em

várias etapas, onde múltiplos fatores contribuem para o seu desfecho. A identificação será

determinada finalmente pela aparência histológica. Marcadores diagnósticos bioquímicos,

abordados há aproximadamente duas décadas, ainda encontram-se como adjuvantes

experimentais ao diagnóstico histológico cervical

49, 50

A colposcopia, exame de magnificação de imagem cervical foi proposta na década de

vinte por Hans Hinselmann e se tornou exame indispensável em casos de suspeita de lesão

cervical. Permite a visualização, em variados aumentos e sob diferentes filtros de luz, das

estruturas epiteliais do colo e vagina, guiando nas amostragens histológicas de lesões suspeitas

(biópsias cervicais)

É considerado exame de referência para investigação de alterações citológicas cervicais,

possuindo sensibilidade média de 95% e especificidade média de 45% quando usada na

distinção de tecidos cervicais normais de anormais. Já na distinção de L-SIL (Low-grade

squamous intraepithelial lesion) com H-SIL (High-grade squamous intraepithelial lesion) e

câncer cervical, sua sensibilidade média será de 79% e especificidade de 67%

Entretanto, é exame que exige profissional treinado, equipamento e soluções especiais

além do tempo demandado para adequado diagnóstico cervical

. Torna-se exame impeditivo

em nível de atenção primária nos países em desenvolvimento.

Sua principal limitação reside no resultado falso-positivo, onde alteração considerada

como “maior” no exame colposcópico, é encontrada na ausência de lesão epitelial ou em lesão

de baixo grau

. Tal limitação apresentou-se de forma contundente nas publicações dos

resultados das estratégias “ver-e-tratar” aplicadas em países do continente Africano, onde o

tratamento das lesões cervicais ocorreu sem a confirmação histológica prévia, proporcionada

pela biópsia cervical

. Taxas de 28% de tratamento excessivo (conização) foram relatadas em

casos de colposcopia e citologia alterada, quando o diagnóstico histológico definitivo era lesão

de baixo grau da cérvice

. Quando o diagnóstico e tratamento cervical deram-se em base

colposcópica apenas, inclusive sem o exame citológico cervical prévio, foram relatadas taxas

de tratamento excessivo em 60% das vezes

A relação do HPV com lesões precursoras e o câncer da cérvice é a muito conhecida.

Desde os trabalhos pioneiros de Shope

, que em 1933 estudou a relação entre o papilomavírus

e lesões em coelhos, até os dias atuais, que o HPV vem sendo implicado na gênese da maioria

das lesões epiteliais do colo uterino.

O HPV pertence à família dos DNA vírus, havendo mais de cento e cinqüenta genotipos

descritos com, aproximadamente, quarenta deles infectando o trato ano-genital inferior

59, 60

Entre estes, aproximadamente quinze subtipos são considerados como de alto risco para

carcinogênese na cérvix uterina, destacando-se os subtipos 16 e 18

De acordo com o comportamento biológico, os diferentes subtipos de HPV poderão ser

divididos em alto e baixo-risco oncogênico. O comportamento biológico refere-se à capacidade

do HPV em induzir a produção de fatores, pela célula hospedeira, conduzindo a um estado de

mitose desregulada e instabilidade genética. Há conseqüente mutação do DNA e precariedade

no reconhecimento imunitário celular e humoral destas células mutantes, com sua subseqüente

proliferação

A infecção genital pelo HPV é uma das mais comuns doenças sexualmente

transmissíveis

com prevalência variando de 20 a 46% das mulheres jovens nos diferentes

países, de acordo com o método de detecção empregado

. O diagnóstico da presença do HPV

de alto risco oncogênico (HR-HPV) em peças de tumores cervicais escamosos foi relatado em

cifras superiores a 90%; já entre os adenocarcinomas em cifras de 75%

64, 65

. Nas lesões

precursoras da cérvice, o encontro do HR-HPV se dará de forma variável, tendendo ao

encontro mais freqüente entre NIC 2/3 e em menor número entre NIC 1

66, 67

Por possuir sensibilidade superior à citologia cervical corada pelo método

Papanicolaou, o diagnóstico da presença do HPV tem sido proposto como teste de

rastreamento primário, permanecendo a citologia reservada para aqueles casos com o teste viral

positivo. Sua sensibilidade seria de 96% entre as lesões intra-epiteliais de alto grau comparados

com a sensibilidade de 53% da citologia convencional. Quanto à especificidade, seria menor

que na citologia, ou seja, 90.7% contra os 96.3% do método tradicional

O diagnóstico da presença do HPV no colo uterino ou vagina poderá ser feito pela

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Captura Híbrida I e II, Virapap e o Viratype

Entretanto, seu diagnóstico possui a limitação do falso-positivo, onde se espera o

encontro de partículas virais em fundo vaginal em 26% das mulheres sem a presença de lesão

cervical precursora ou neoplásica

70, 71

. Atualmente, sua utilização está indicada naqueles casos

de atipias de significado indeterminado não excludente de lesão intra-epitelial de alto grau

(ASC-H), quando houver dúvida quanto à conduta de imediata colposcopia ou observação do

caso por seis meses e repetição da citologia

Elevado custo, associado a equipamento específico de coleta e armazenagem,

relegaram, nos países em desenvolvimento, sua utilização em centros de pesquisa.

A citologia de meio líquido foi proposta em 1991 por Hutchinson

. Em 1996 a Food

and Drug Administration, nos Estados Unidos da América, aprovou para uso comercial o

ThinPrep e o Autocyte Prep como métodos alternativos à citologia cervical convencional.

A proposta era a de melhor preparo das lâminas citológicas utilizando o princípio da

centrifugação de células cervicais mantidas em solução de conservação

Tal técnica permitiria uma monocamada celular epitelial e a ausência de sangue, muco

ou grumos celulares na lâmina. A sensibilidade e a especificidade do método parecem

aumentar em 7% e 8%, em relação à citologia convencional, respectivamente, quando

comparados com o exame padrão-ouro histológico

Entretanto, como em várias novas tecnologias, a especificidade é precariamente

documentada. Acredita-se que o aumento da sensibilidade na citologia de meio líquido seja

acompanhada da diminuição da especificidade, seguindo-se um aumento dos custos do sistema

de saúde com tratamentos seriados de lesões de baixo grau e com potencial de regressão

espontânea

76, 77

Além disto, destaca-se na citologia de meio líquido a perda da morfologia tradicional

celular, má qualidade dos grupamentos de células endocervicais e a perda dos elementos

diagnósticos advindos do distanciamento entre as células, há muito familiarizados entre os

citologistas. A grande justaposição celular e diferenças na fixação dos elementos celulares são

citadas como limitadores do correto diagnóstico

Marcadores diagnósticos cervicais

Apesar de não possuirmos um marcador diagnóstico ideal para o rastreamento de lesões

cervicais precursoras ou neoplásicas, este deverá possuir alta sensibilidade, não depender de

critérios subjetivos para o seu diagnóstico, ser de custo acessível e aplicável em amostras

facilmente coletadas

Definidos como indicadores bioquímicos da presença de um tumor, os marcadores

tumorais poderão ser antígenos de superfície celular, proteínas nucleares ou citoplasmáticas

além de enzimas e hormônios

A tentativa do diagnóstico sangüíneo de tumores cervicais esbarrou no longo período de

evolução das lesões precursoras em tecidos intra-epiteliais, local desprovido de vascularização,

portanto com deficiente drenagem de elementos diagnósticos passíveis de marcação

. Além

disto, grande parte dos marcadores restringe-se ao encontro de anticorpos específicos

produzidos contra oncoproteinas da lesão. Tais anticorpos seriam dependentes do sistema

imunitário do paciente, quantidade de estímulo antigênico tumoral e da capacidade de detecção

periférica do anticorpo, fatos que retardariam o diagnóstico das lesões

82, 83

. Tais limitações

sugerem o estudo dos marcadores diagnósticos cervicais em amostras coletadas diretamente do

órgão, sob visão direta.

A influência do HPV na gênese das lesões neoplásicas cervicais vem sendo apontada

por inúmeros estudos epidemiológicos e laboratoriais nas últimas décadas

84-87

,sendo

encontrado virtualmente em todos os casos de câncer cervical, de acordo com a sensibilidade

do método de detecção empregado

A identificação de intermediários produzidos pela incorporação do genoma do HPV nas

células epiteliais cervicais, evitando o simples diagnóstico da presença do DNA viral, torna-se

promissor como elemento diagnóstico na cérvice

89-91

O processo de carcinogênese da cérvice dá-se em etapas de eventos moleculares, em

nível celular epitelial, com a produção de intermediários passíveis de marcação diagnóstica.

Não há consenso quanto ao melhor intermediário preditor da carcinogênese na cérvice, onde

seu diagnóstico poderá discriminar casos de progressão neoplásica

Vários intermediários do processo de carcinogênese cervical vem sendo descritos na

literatura como úteis para o diagnóstico em peças cervicais

93, 94

: O PCNA (Antígeno Nuclear

de Proliferação Celular) e o KI67 mostraram-se como marcadores de proliferação celular; o

KI-67 e a ciclina-E que diferenciariam as lesões dos tecidos normais cervicais

95, 96

; o p53

como marcador de proliferação celular e progressão tumoral

; o p16ink

como marcador de

lesão cervical em citologia e histologia, marcador da infecção viral em células cervicais e como

auxiliar na redução da variação inter-observador em lesões histológicas cervicais

98-116

; além de

outros

117

Carcinogênese cervical

No ciclo mitótico celular, a transição das fases de pré-síntese de DNA, síntese, pré-

mitose e mitose será controlada por processos de fosforilação protéica atuando sobre um

conjunto de pontos de controle. A transição da fase G1 (pré-síntese) para fase S (síntese de

DNA) é caracterizada pela ativação (por fosforilação) de proteínas-alvo efetuada pelas CDK

118

. Na figura 1, encontra-se a representação de alguns elementos constituintes da transição da

fase G1 para a fase S.

Figura 1 (Ciclo Celular Normal): Fases do ciclo celular normal durante a mitose com ênfase

para o ponto de controle G1-S.

Sabe-se que a perda do controle normal do ciclo celular é essencial para que haja

transformação neoplásica, ocorrendo mutação em pelo menos um dos quatro reguladores-chave

do ciclo celular (p16ink

, ciclina D, CDK

e Rb)

119

A proteína p16 é um dos representantes da expressão do locus 9p21 do gene CDKN2A

(cromossoma 9). Esta proteína interage e inibe a quinase ciclino-dependente ou CDK,

formando um complexo p16/cdk4 e p16/cdk6. A p16ink

é a proteína 16 inibidora da CDK

120

. Na figura 2 encontra-se a representação esquemática do controle do ciclo celular durante a

fase de transição G1 – S enfatizando a ação dos produtos do gene CDKN2A.

(quiescen

)

(mitose)

(pré-

síntese

(síntese

)

G2 (pré-

mitótica

)

E2F

liberado

pRb

fosforilada

(

inativa

)

Ciclina D +

CDK(quinase-ciclino-

dependente)

E2F ativa

transcrição

de genes

para entrada

na fase S

Figura 2 (Ponto de Controle G1-S): Controle do ciclo celular normal na transição da fase G1

para S, com enfoque pra os produtos do gene CDKN2A. Mecanismo de fosforilação dos

intermediários representados pelo símbolo .

As mutações no gene CDKN2A estão associadas a tumores como os melanomas

121

. Já

as deleções no mesmo gene estão associadas aos carcinomas pancreáticos, carcinomas

esofagianos, pulmão e bexiga, além dos glioblastomas e sarcomas de partes moles

118, 122, 123

Quanto a expressão da fosfoproteína nuclear pRb (proteína do retinoblastoma) que, na

forma ativa, atua como “freio” na progressão de células da fase G1 para S no ciclo celular, será

também inativada pelas CDK

, a partir do processo de fosforilação da proteína pRb

124

Considerado como um “guardião do genoma” a p53 impede a propagação de células

geneticamente danificadas que, contrariamente a pRb, não controla o ciclo celular normal. Será

solicitada como freio de emergência quando ocorrer alteração do ácido desoxirribonucléico

(DNA), levando à parada do ciclo celular e morte celular programada (apoptose), impedindo a

E2F

pRb +

pRb + E2F

CDK

Gene CDKN2A

p16

induz

p16ink4a

inativa

inibe

estimula

libera

propagação de células geneticamente danificadas. Este mecanismo de controle da adequada

replicação do DNA, também ocorrerá na fase tardia de G1 e será dependente das cdk

118

Pelo exposto, em casos de cânceres cervicais, o esperado seria a ausência do complexo

p16ink

, justificando a proliferação celular a partir da ativação das cdk

fosforiladas no ciclo

celular. Entretanto, curiosamente na avaliação de linhagens celulares derivadas de tumores

cervicais, há a presença da p16ink

e, em alguns casos, sua hiperexpressão

125-127

Ocorre que, diferentemente das demais localizações, a carcinogênese cervical está

intimamente relacionada à infecção por cepas do HPV, notadamente o de alto risco

oncogênico. Este grupo viral possui a capacidade de integração do genoma viral ao genoma da

célula epitelial cervical ou queratinócito

128-130

, com a conseqüente produção das oncoproteínas

E6 e E7 pela célula hospedeira.

A oncoproteína E6 possui a capacidade de degradação da p53; já a oncoproteína E7,

inativa (por fosforilação) a pRb

131, 132

. Há uma reciprocidade entre a inativação da pRb pela

oncoproteína E7 do HR-HPV e liberação do controle da fase G1-S do ciclo celular com a perda

do feed-back negativo entre a pRb e o gene CDKN2A seguindo-se da produção e acúmulo do

p16ink

em núcleo e citoplasma

133, 134

. Na Figura 3, encontra-se a representação gráfica da

ação do HR-HPV no ciclo celular.

A p53, que normalmente inicia mecanismo bioquímico de parada do ciclo celular e

apoptose em casos de mutação do DNA no queratinócito, agora degradada pela proteína E6 do

HPV contribui para imortalização celular e conseqüente origem da neoplasia

135

Figura 3 (Ciclo celular sob ação da proteína E7 do papilomavírus humano): Ciclo celular sob

ação da proteína E7 do papilomavírus humano de alto risco oncogênico. Intermediários da ação

do HR-HPV destacados na cor cinza.

Proteína 16 inibidora da CDK 4A (P16ink

)

Em 1994, durante estudo que visava o diagnóstico de mutações ou deleções no gene

CDKN2A e na expressão do pRb, concluiu-se que havia relação inversa entre as expressões

dos produtos protéicos do gene naqueles tecidos tumorais com pRb inativo

136

p16ink

E2F

pRb + E2F

CDK

Gene CDKN2A

p16

CDK

p16ink

estimula

E 7

HPV

pRb + E7

p16

inativa

Seguiu-se estudo em 1998 que verificou a presença da proteína p16 entre noventa e oito

peças histológicas de NIC 1, NIC 2/3 e carcinoma cervical (CA), verificando positividade

difusa entre trinta e oito de trinta e nove casos de câncer e todos os casos de NIC 2/3

137

Em 2001, Klaes e cols., estudaram cento e noventa e nove peças de histologia cervical

com diagnóstico de lesão precursora ou neoplásica e cento e onze peças sem lesão.

Encontraram expressão difusa positiva para o anticorpo anti-p16ink

em todos os casos de

NIC 2/3 (noventa e duas peças) e entre cinqüenta e oito de sessenta casos de CA

138

. No mesmo

ano, Keating e colaboradores, avaliando 99 peças de biópsia arquivadas, utilizou o anti-

p16ink

como marcador de lesões cervicais associadas com o HR-HPV onde a expressão

difusa ou focal do anticorpo associou-se fortemente com a presença do vírus em 85.5% dos

casos

139

Durante o ano de 2002, Bibbo e cols. avaliaram a presença do anti-p16ink

quarenta e sete citologias de meio líquido arquivadas e encontraram expressão para o anticorpo

entre 96% dos casos de H-SIL e 74% dos L-SIL

140

. Também em 2002, Klaes e cols.

compararam a concordância entre cinco patologistas no diagnóstico de cento e noventa e

quatro biópsias cervicais coradas com hematoxilina/eosina (HE) e após com o anticorpo anti-

p16ink

. Concluíram que o índice kappa para concordância inicial de 0,60 para HE tornou-se

0,91 na leitura com o anticorpo anti-p16ink

4a 141

No mesmo ano, o estudo de Saqi e cols. sugeriu que há estrita relação entre HPV e anti-

p16ink

entre citologias de meio líquido e que o uso do anticorpo monoclonal serve como

marcador para a "detecção citopática" da presença viral. Sugere que em laboratórios de boa

qualidade o uso do anti-p16ink

poderá substituir a captura híbrida em citologias cervicais de

meio líquido

142

Pientong e cols., durante o ano de 2003, estudaram citologias cervicais coletadas apenas

com espátulas de Ayre (sem o uso da escova cytobrush), com o anti-p16ink

que foram

distribuídas em cinco grupos de trinta lâminas: normais, ASC-US, L-SIL, H-SIL e CA.

Concluíram que há positividade para anti-p16ink

entre 97% dos CA, 93% dos H-SIL, 33%

dos L-SIL, 57% das atipias de significado indeterminado (ASC) e ausência de positividade

para anti-p16ink

entre todas as lâminas de citologia cervical normais

143

Bibbo e cols., tentando encontrar diferenças entre ASC-H e as H-SIL, utilizaram o

anticorpo anti-p16ink

em trinta lâminas de citologia cervical coletadas de meio líquido e

encontraram positividade para o anticorpo entre dezessete de dezoito casos de H-SIL,

concluindo que a expressão do anti-p16ink

mostra-se como promissor substituto no

diagnóstico em casos duvidosos de ASC-H

144

Murphy e cols, examinaram o potencial do anticorpo anti-p16ink

entre cento e trinta e

dois casos com lesão precursora ou neoplásica e vinte e um casos sem lesão cervical,

amostradas pelo método da citologia de meio líquido. Em todos os dez casos de câncer

cervical, houve forte expressão ao anticorpo; 83,5% de positividade moderada ou forte entre as

H-SIL e 92% entre as L-SIL

145

Já no estudo de Agoff e cols, examinaram-se seiscentas e quarenta e cinco peças de

histologia cervical com o objetivo de comparar o grau de expressão do anticorpo anti-p16ink

e o diagnóstico da lesão, além de relacionar os achados com a presença do HPV. Positividade

para o anti-p16ink

correlacionou-se significativamente para a presença de HR-HPV, avaliado

pela captura híbrida ou pela PCR. Entre casos de câncer cervical, houve 89% de positividade

para o anticorpo. Quanto às lesões precursoras da cérvice que foram positivas para anti-

p16ink

, havia positividade para o HR-HPV em 84% das vezes. Entretanto o encontro do vírus

de alto risco oncogênico, por captura híbrida, ocorreu entre 36% de casos negativos para lesão

e em 47% dos casos quando utilizado o PCR

146

Em 2004, Negri e cols

147

realizaram estudo entre cento e vinte sete peças arquivadas de

histologia cervical. Visava a utilização do anti-p16ink

como “marcador de tendência” para

evolução de lesões precursoras iniciais do colo uterino. Os autores utilizaram peças com

diagnóstico de NIC 1 que foram divididas em dois grupos: No primeiro, lesões que evoluíram

para regressão espontânea; no segundo, que evoluíram para NIC 2/3. A conclusão foi que, em

71% dos casos de anti-p16ink

negativos iniciais, houve regressão espontânea da doença. Já

entre 62% dos casos positivos, houve evolução para NIC 2/3. Os autores citam que o anticorpo

monoclonal pode ser um marcador de atividade oncogênica do HPV no colo uterino e que

critérios cito-morfológicos isolados não distinguem lesões precursoras iniciais que irão

progredir.

Em 2004, Wang

148

e colaboradores avaliaram o anticorpo monoclonal entre quarenta

biópsias cervicais originadas de dezessete mulheres acompanhadas de 1982 a 2000.

Concluíram que o anti-p16ink

é um indicador da progressão da doença cervical e, quando

positividade para o anticorpo, há redução no tempo para a evolução da doença. O tempo médio

de progressão entre os casos negativos para o anticorpo foi de cento e vinte e dois meses contra

os sessenta e quatro meses entre os casos positivos.

Em 2004 Kanao e cols

149

utilizaram vinte e cinco peças de CA estadiados entre T1B e

T3B e onze peças normais de colo. Visava diagnosticar a presença concomitante de

positividade para o anti-p16ink

e a infecção pelo HPV. Concluíram que a positividade para o

anticorpo foi significativamente maior entre os casos de neoplasia invasora infectadas pelo

HPV 16, 18, 58, 33 e 31 (n=21 ou 84%). Sugere que a hiper-metilação do gene CDKN2A

poderia explicar os quatro casos de negatividade para o HPV que apresentaram neoplasia

cervical.

Em 2004, Trunk e cols.

150

publicaram extensa revisão sobre a utilização do anticorpo

anti-p16ink

como um “localizador” de células discarióticas durante o exame citológico de

baixa magnificação (leitura microscópica inicial em pequeno aumento). A positividade para o

anticorpo entre células basais ou pára-basais no esfregaço poderá ser considerado como um

sinal específico da ativação do oncogene viral. Citam que a “varredura” da lâmina de citologia

em pequeno aumento destaca o contingente celular que deverá merecer atenção para as

alterações nucleares e citoplasmáticas, evitando o fenômeno da habituação. Entre estas células

marcadas, foram aplicados os critérios morfológicos tradicionais.

Em 2005 Murphy e cols.

151

, estudando cento e setenta e seis blocos de parafina obtidos

de pacientes com e sem lesão cervical, encontraram positividade para o anticorpo anti-p16ink

na histologia de todos os CA e em 98% dos NIC 2/3. Concluiu que o anticorpo é valioso

quanto à sensibilidade no diagnóstico de lesões precursoras ou neoplásicas cervicais.

Em 2005, Wentzensen e cols.

152

, utilizaram o anticorpo em citologia de meio líquido

com o objetivo aplicar um “escore nuclear” indicativo de gravidade de lesão cervical

precursora. Concluíram que, após a localização da célula a partir da positividade ao anticorpo,

a aplicação do escore nuclear facilitará o diagnóstico dos H-SIL.

Em nosso meio, no ano de 2005, duas publicações foram realizadas utilizando o

anticorpo anti-p16ink

. No Estado de São Paulo, Longatto-filho e cols.

153

, usaram o anticorpo

monoclonal e o diagnóstico do HPV, entre cento e noventa e nove citologias de meio líquido,

consideradas como normais ou com diagnóstico de ASC-US. Os casos foram acompanhados

semestralmente por três anos. Os autores concluíram que casos positivos para o anticorpo

monoclonal e HR-HPV deverão ser cuidadosamente observados para exclusão de lesão

precursora. No Estado do Rio Grande do Sul, Lambert e cols.

154

, avaliaram a expressão do

anticorpo entre cinqüenta e quatro peças de histologia arquivadas, sendo vinte e sete lesões

precursoras e igual número de carcinomas invasores. Concluíram que há associação

significativa entre gravidade da lesão histológica e positividade para o anticorpo.

Justificativa

A baixa sensibilidade do exame citológico convencional (Papanicolaou) para o

rastreamento das lesões cervicais, associado à carência de recursos humanos e materiais para

utilização de outros métodos (biologia molecular para HPV, citologia em meio líquido ou

colposcopia), apontam para a necessidade de alternativas diagnósticas. Novos métodos deverão

concatenar baixo custo, fácil aplicação e alta sensibilidade para o diagnóstico das lesões

cervicais precursoras ou neoplásicas.

Dentre as várias alternativas diagnósticas em cérvice, o anticorpo anti-p16ink

mostra promissor no aprimoramento da sensibilidade na citologia cervical. Entretanto há

carência de estudos utilizando o anticorpo em citologias coletadas da forma convencional,

associadas ao exame padrão-ouro cervical (biópsia dirigida por colposcopia e corada com

hematoxilina-eosina).

Objetivo Geral

Avaliar a expressão do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical convencional.

Objetivo Específico

Avaliar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (vp+) e negativo (vp-)

do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical para o diagnóstico de lesões precursoras ou

neoplásicas do colo uterino.

Avaliar a variação inter-observador na leitura das lâminas de citologia coradas com o

anticorpo anti-p16ink

Avaliar a factibilidade do uso do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical (tempo

demandado para preparação da lâmina e difusão do anticorpo no esfregaço, qualidade das

células diagnósticas e custo do procedimento).

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Artigo em Inglês

Antibody anti-p16ink

in cervical cytology

(1)

Alexandre da Silva Rocha

(2)

, Mary Clarisse Bozzetti

(3)

, Luciana Schmidt Kirschnick

(2)

, Maria

Isabel Albano Edelweiss

(3)

Postgraduate Course in Medicine and Medical Sciences School

of Medicine

Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil

(1) Pathology Department, Hospital de Clínicas de Porto Alegre

(2) Postgraduate Course in Medical Sciences

(3) Professor of the Postgraduate Course in Medical Sciences

Correspondence to:

Alexandre Rocha

[email protected]

Frei Germano street 200/503B

São José / Porto Alegre / RS

91530-060

Brazil

Abstract

Introduction: The use of the antibody anti-p16ink

to increase the sensitivity of the

cytological examination, has presented promising results. However, there is a lack of studies which use

the monoclonal antibody in cervical cytology linked to the histological examination of the uterine

cervix. Objectives: To evaluate sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the

anti-p16ink

in conventional collected cervical cytology. Method: A case-control study was carried out

in a cervical pathology reference center. The cytology slides, submitted to the immunocytochemistry for

the diagnostic antibody, were conventionally collected with spatula of Ayre and Cytobrush. The slides

were interpreted by two independent pathologists (P1 and P2). Cases (n=61) represented all cervical

investigations that had resulted in compatible diagnostic biopsy with CIN 1, 2 or 3 or squamous

carcinoma. Controls (n=87), included all investigations presenting Papanicolaou cytology and

colposcopy negative. Results: Sensitivity for the histological diagnosis of CIN 2, 3 (n=23) was 100%

and 95.7% for P1 and P2, respectively. The negative predictive value on the CIN 2, 3 was 100% (P1)

and 98.6% (P2). In two cases of squamous carcinoma, sensitivity was 100%, for both pathologists.

Sensitivity for the diagnosis of CIN 1 was 77.8% (P1) and 58.3% (P2). The negative predictive value

for CIN 1 was 90.6% (P1) and 83% (P2). The kappa index between the two pathologists was 0.74.

Among the cases of CIN 2, 3 associating the nuclear positivity to the antibody, the percent difference

between pathologists was inferior to 5%. Exactly the same scores were found among cases of absence

of cervical lesion and negativity for the antibody. On the other hand in CIN 1 patients there was a

greater inter-observer variation. Conclusions: Our results suggest that the antibody anti-p16ink

could

contribute as an adjuvant tool in the follow up of intra-epithelial lesions in conventional collected

cervical cytology.

Introduction

Ever since the cervical cytology exam was brought up as a tool for populational

screening program there has been a decrease on cervical cancer mortality and morbidity rate

However, an accurate sensitivity on the diagnosis of cervical alterations by this exam has been

disappointing, with a mean sensitivity of 0.51 (95%CI 0.37-0.66), showing better results

among high grade cervical lesions

2-4

Half the cases of cervical cancer in countries with screening program coverage above

85% occur in women who were not tested over the last five years and, among the ones tested,

12 to 23% did not present regular follow up

Approximately 60% of the flaws on the cervical cytological exam are due to

inappropriate sample collection, the remaining 40% are due to laboratory errors

6-8

. Among

those diagnosed with cervical cancer, a review of their “normal” cytological exams happening

within the last three years is expected to be done as well as a reclassification for high grade

intra-epithelial lesion (H-SIL) 40% of the time

Although it is not known as an accurate marker for cervical lesions, its characteristics

should be to provide high sensitivity, not to depend upon subjective criteria for the diagnosis,

to be reasonable and affordable, and specially, to be presented on easily collectable samples

The influence of the human papillomavirus (HPV) on the genesis of the precursors or

neoplastic lesions of the cervix is now well established in various studies over the last

decades

10-13

. Indeed, HPV infection has been detected in almost all cervical cancer cases

according to the sensitivity of the method used for detection

. The identification of products

produced by the incorporation of the HPV genome on the epithelial cervical cells, which avoid

a simple diagnosis of the presence of a viral DNA, becomes a promising feature as an element

of cervix diagnosis

14-16

The use of antibodies improves the reading performance of the staining from a cell even

with a slight increase on the microscopic exam. The squamous markers PCNA, ki-67 (MIB1),

cyclin-E e o anti-p16ink

; or glandular markers MN, cd44, ki-67 and the anti-p16ink

, figure

like a potential diagnostic candidate in cervix uteri

14-17

. The proposal to make use of diagnostic

markers was because of the highlight of abnormal cells during the microscope low

magnification and the reduction on the reading errors

The carcinogenesis process happens in stages of molecular events at an epithelial cell

level with the production of intermediaries which are sensible to markers. There hasn’t been a

consensus regarding the best predictive intermediary of cervix carcinogenesis and whether its

diagnosis will prevent neoplastic progression

The PCNA (proliferating cell nuclear antigen) and ki-67 has proven to be a cell

proliferation antibody; ki-67 and cyclin-E have separated normal cervical tissues from

lesions

14-15

; p53 was a cell proliferation and a progression antibody

; anti-p16ink

is an

antibody of precursory cervical lesion in cytological and histological exam, an infection marker

through HPV in cervical cells, and an assistant on the reduction of inter-observer variations on

cervical histological lesions

15,19,36

Among the various alternatives for cervical lesions diagnosis, the anti-p16ink

has

proven to be a promising aid on the improvement of cervical cytological sensitivity. However

there is a need for further studies on the use of antibody in conventional collected cytology

(non liquid-based cytology) linked to the standard cervical exam (directed biopsy staining with

hematoxilin-eosin).

The antibody anti–p16ink

is suggested to work as a cytopathic detector of the

presence of HPV together with the cervical cell genome inducing to an imbalanced mitosis and

a poor vigilance for DNA mutation. It could be a more specific test when compared to the viral

presence through a Polymerase Chain Reaction (PCR) or Hybrid Capture

Our case and control study views the assessment of the anti-p16ink

sensitivity,

specificity, positive and negative predictive value in conventional cervical cytology, in

addiction to the feasible use of the anti-p16ink

on slides of cervical cytology.

Method

A case-control study was performed recruiting women who attended the reference

clinic of Cervical Pathology in the City of Porto Alegre, Southern Brazil. The Clinic provides

assistance to suspected cases of cervical pathology screened at eleven health care units.

According to the census of IBGE (Brazilian Institute of Geography and Statistics) on the year

2000 there were 181.095 inhabitants dwelling in the area attended by the health care units, of

which 93.883 were women, with average familiar income ranging from 2.60 to 7.54 minimum

Brazilian wages

. The health units were contacted to refer all suspected cases of cervical

pathology to the Clinic Reference to the management.

The sample was selected from two different groups: the first, had patients referred to

the Reference Clinic which were recently screened and suspected of cervical lesions; the

second, had patients attended directly in the Clinic without previous screening.

The criteria of inclusion in the control group were the concurrence of negative cervical

cytology for intra-epithelial or invasive neoplastic lesion, associated with normal colposcopy

findings. Cases were defined by the presence of a positive cervical biopsy with CIN (cervical

intra-epithelial neoplasia) 1, 2 or 3 or cervical cancer.

Patients with complete hymen, absence or impossibility of exposition of the cervix,

history of cervical conization, pregnant patients, patients with vaginitis/cervicitis (according to

clinical-microscopic evaluation), disable patients and cases of rejection to participate in the

study have been excluded.

Picture 4 presents the flowchart of the selection process of the sample of the total

number of women screened (n=287) from January 2004 to July 2005.

Initial

colposcopy

(n= 287)

Unsatisfactory

colposcopy

(n=23)

Normal

colposcopy

finding /

Metaplastic

(n=114)

Low grade

lesion

suspected

(n=96)

High grade

lesion

suspected

(n=54)

Normal

cytology

(n=87)

Cytology:

AGC

(1)

(n=5)

ASC

(2)

(n=20)

L-SIL

(3)

(n=2)

Control

(no lesion)

(n=87)

Exclusion

from

study

(n=78)

Normal

cytology

(n=51)

Cytology:

AGC (n=1)

ASC (n=31)

L-SIL (n=11)

H-SIL

(4)

(n=2)

Biopsy:

Cervicitis (n=9)

Polyp (n=1)

CIN 1

(5)

(n=11)

CIN 2,3

(6)

(

n=7

)

Normal

cytology

(n=17)

Cytology:

AGC (n=1)

ASC (n=23)

L-SIL

(n=10)

H-SIL

(

n=3

)

Biopsy:

withdrawn (n=1)

Cervicitis (n=10)

CIN 1 (n=25)

CIN 2, 3 (n=16)

(7)

(n=2)

Study

group

(with

lesion)

(n=61)

Patients with

suspected

precursory or

neoplastic

cervical lesion

Patients from

the authors

gynecologic

routine

Exclusion

from study

(n=23)

Exclusion

from study

(n=38)

Figure 4: Flowchart of the sample selection process

(1)

AGC = atypical glandular cells

(2)

ASC = atypical squamous cells

(3)

L-SIL= low-grade squamous intraepithelial lesion

(4)

H-SIL = high-grade squamous intraepithelial lesion

(5)

CIN 1 = Cervical intraepithelial neoplasia grade 1

(6)

CIN2/3 = Cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3

(7)

CA = Squamous cervical carcinoma

Procedure

Between January 2004 and July 2005, two hundred eighty seven women with and

without suspicion of neoplastic or precursory cervical lesion were referred to the Clinic of

Cervical Pathology. All were invited to participate on the study and were presented with the

Term of Informed Consent (attached 1). Upon agreement to the participation, they filled a

standardized questionnaire that approached the clinic-epidemiological characteristics of the

patient (attached 2).

Samples were collected for conventional cytological exam (Papanicolaou) and a ICQ

cytological exam (immunocytochemistry) was performed with antibodies diagnostic test with

anti-p16ink

(clone G175-405 in dilution 1:100 of Pharmingen / BD Biosciences of Brazil).

The immunocytochemistry technique used was the labeled streptavidin-biotin (LSAB)

(attached 3) and the technique used for the slides of conventional cytology was Papanicolaou

(attached 4).

The samples were held in sequence, starting with the immunocytochemistry cytology

(ICQ) followed by the conventional cytology (Papanicolaou). In order to get enough material

to represent the squamous-colunar junction and the transformation zone of the uterine cervix,

the cytological examinations had been collected as usual with the use of the spatula of Ayre

(rotation of 360º in the peri-orificial region of the uterine cervix) and cervical brush cytobrush

(rotation of 90º in the endocervix) individually and disposable

The slide used for cytological ICQ was previously prepared in a standardized manner,

by the laboratory of the Research Center of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre, where the

surface for staining presented adherent layer of 3-aminopropyl(triethoxy)silane

39,40

, targeting at

the minimization of the cellular detachment during the processes of "washing up" in the

immunocytochemistry. The cellular clamp used in both slides was alcohol 96% with

poliethilenoglicol. The colposcopy was carried out with maximization equipment of binocular

image DFV

with a seven times fixed increase of and with the usual solutions: acetic acid 5%,

Schüller iodine-iodetad solution and physiological solution.

The cytological classification used on the conventional reading of the slides was

Bethesda 2001 (attached 5)

. The colposcopic classification used was the International

Federation of Cervical and Colposcopy Pathology approved in 2002 and recommended by the

Brazilian Association of Genytoscopy (attached 6).

According to the initial conventional cytological and colposcopic evaluation a

diagnostic biopsy of the uterine cervix was carried following the consensual indications of the

American Society of Cervical Colposcopy and Pathology

42,43

: cytology compatible with H-SIL

and satisfactory colposcopy compatible with lesion of high grade, were forwarded to early

cervical biopsy. The cases of L-SIL, ASC-US, ASC-H, AGC and normal colposcopy or

colposcopy compatible with metaplastic alteration, had been followed in semester intervals and

biopsy in case there was a worsening of the cyto-colposcopical setting. In this group, the initial

presence of satisfactory colposcopy compatible with lesion of low or high grade, in the initial

evaluation, was followed by early cervical biopsy. The cases of unsatisfactory colposcopies

had been excluded from the study.

The biopsies had occurred under local infiltrative anesthesia with lidocayne 2% and

drill Baliú type with fragment(s) preserve in formalin 10% and read under hematoxilin-eosin

standard staining. The diagnosis of the biopsy parts followed the Richart´s criteria, where were

diagnosed as absence of precursory lesion, CIN 1, CIN 2 and CIN 3 besides the cervical

carcinoma (attached 7)

43, 44

The criterion for ICQ slides positivity was adapted from Bibbo, Pientong and Saheballi

studies

3, 45, 46

. The presence of cervical epithelial cells with brown positivity characteristics in

number ≥ 10, was considered as positive slide. Among these, three categories were divided: 1)

weak cytoplasmatic positivity, 2) strong cytoplasmatic positivity and 3) nuclear positivity. The

ICQ slides had been evaluated by two “blinded” and independent pathologists (P1 and P2) and

the results were compared to cytological, colposcopical and histological findings.

Sample Size Estimation

The sample size calculation was based on previous studies that had approached the

performance of the antibody anti-p16ink

in cytology, linked to the cervical standard exam or

diagnosed biopsy stain with hematoxilin and eosin.

Considering the maximum positivity found among individuals without lesion in 18% of

times

, the minimum positivity found among cases of CIN 1 in 60% of times

and minimum

positivity found among cases of CIN 2 or 3 in 80% of times

, the use of statistical package

PEPI version 4.0 (Computer Programs for Epidemiologists) resulted in minimum sample size

of 31 cases of CIN 1, 15 cases of CIN 2 or 3 and 46 controls. The parameters used were 95%

alpha, 10% beta (90% study power) with 1:1 control-case ratio.

Statistical Analysis

The epidemiological characteristics of the sample were described regarding quantitative

(age, sexarca, number of sexual partners in the life and over the last 12 months, schooling and

gestations) and qualitative variables (contraceptive method used, history of HIV serum

positivity and history of sexual transmitted disease, post-menopause state and reason for

further investigation).

The quantitative variables with symmetrical distribution were described as mean and

standard-deviation and with asymmetrical distribution, with median and inter-quartile range.

The statistical package SPSS 13,0 (Statistical Package for the Social Sciences) was

used to perform the analysis. Comparisons using the Student "t" Test were done for variables

with normal distribution and the Wilcoxon-Mann-Whitney test "U" for those asymmetrically

distributed. The Pearson chi-square test was used for categorical variables. Contingency tables

(2 x 2) were created for the calculation of sensitivity, specificity, positive and negative

predictive value and ploted on the computer program Epi-info 6.0 (95% CI).

Diagnostic test was considered positive when cytology ICQ resulted positive for the

anti-p16ink

in nucleus or cytoplasm and a negative test, on the absence of positivity. Present

of disease was the investigation which resulted in positive cervical biopsy for CIN 1, 2, 3 or

cervical carcinoma and, absent disease, the investigation which resulted in negative

conventional (Papanicolaou) cytology and colposcopy with normal findings.

Ethical Issues

The study was approved by the Ethical research committee of Hospital de Clinicas de

Porto Alegre (Federal University) and Porto Alegre City Hall under the numbers 04-241 and

001.010889.04.3.

Results

The samples resulted were composed by eighty seven patients considered free of

precursory or neoplastic cervical lesion (controls) and sixty one patients presenting the lesion

(cases). Table 1 shows the main socio-demographic variables among cases and controls.

The variable "number of sexual partners in the life", showed a statistically significant

difference among the groups. The average was three partners (2 to 5) in the study group and

two partners (1 to 3) in the control group. When only the cases with uterine cervix histological

lesion were assessed, the average age for the intraepithelial lesion diagnosis of CIN 1 was 32.9

± 10.9 years and among CIN 2 or 3 was 26.8 ± 6.3 years, without significant difference

between the two groups. The carcinoma cases occurred in the sixth and seventh decades of life.

The combined oral contraceptive was the main reported contraceptive method, being

65.6% (n=40) in the study group and 50.6% (n=44) in the control group. It was reported a low

preference to the exclusive use of masculine condoms 9.8% (n=6) in the study group and

11.5% (n=10) in the control group. The clinical diagnosis of post-menopause state (history of

amenorrhea for one year or more associated with typical symptoms such as flushes, reduction

of the libido, secondary dispareunia and vaginal epithelium atrophy alterations)

, occurred in

9.8% (n=6) in the study group and 21.8% (n=19) in the control group. Patients referred to the

Clinic of Cervical Pathology upon abnormal cytological examination were 37.8% (n=56) and

clinical suspected cervical lesion were 25.7% (n=38). History of HIV serum-positivity

occurred in two cases on the study group and one case on the control group.

Investigation

results

Variable

cervical lesion

(n=87)

CIN 1, 2, 3

(1)

or CA

(3)

(n= 61)

p-value

Age (years)

33.8 ± 14.4 30.4 ± 9.7 0.09

Sexarca (age of 1st sexual

intercourse)

16.7± 2.4 16.5 ± 2.5 0.66

sexual partners in life

≤ 2

54% (n=47) 36.1% (n=22)

3 a 5

39.1% (n=34) 44% (n=27)

<0.05

≥ 6

6.9% (n=6)

19.7% (n=12)

sexual partners over the

last 12 months

1.0 (1-1) 1.0 (1-1) 0.79

Schooling (years of study)

8.4 ± 3.0 8.8 ± 2.7 0.42

Pregnancies

2.0 (1-3) 2.0 (1 - 2.5) 0.73

History of STD (sexually

transmitted disease)

(2)

11.5% (10 casos) 9.8% (6 casos) 0.8

Table 1: Socio-demographic variables of studied (n=148)

(1)

CIN = Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

(2)

STD = Refers to clinical information collected compatible with sexually transmitted diseases

such as genital condilomatosis, vesiculations, ulcerations and vulvo-vaginal cancros.

(3)

CA = Cervical carcinoma

Table 2 presents the results of a colposcopic investigation carried out with 148 patients

included on the study.

From the patients with colposcopy suspected low grade lesions (n=96), twenty eight

were biopsed: eighteen confirmed cervical lesions, nine presented inflammatory diagnosis

(chronic cervicitis) and one cervical polyp. For the patients with suspected high grade lesions

on colposcopy (n=54), forty three biopsed women presented histological lesion. In this group,

of the eleven remaining patients, ten were biopsed and presented chronic inflammatory

processes (chronic cervicitis) and one patient did not attend the procedure. Positive predictive

value of the suspected lesion of high grade colposcopy for cervical histological lesion was

0.80.

Investigation

results

Colposcopy

Non

biopsed

Cervicitis/

Polyp

CIN* 1

CIN* 2 or

CIN* 3

Squamous

carcinoma

total

Normal finding

or metaplastic

87 0 0 0 0 87

Compatible low

grade lesion

68 10 11 7 0 96

Compatible

high grade

lesion

1 10 25 16 2 54

Table 2: Results of the colposcopy according to the cervical histological

diagnosis (n=148)

(*)CIN: Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

The description of the cytological findings with the anti-p16ink

between the two

pathologists in the different histological diagnostic can be found on table 3.

It is shown that the positivity to antibody was less frequent among patients without

lesion and higher among those with cervix histological lesion. It is highlighted that the nuclear

positivity was only found among cases of CIN 2, 3 and the strong cytoplasmatic positivity only

among patients with cervix histological lesion (CIN 1, 2, 3). The two cases of squamous

carcinoma presented strong cytoplasmatic positivity between the two pathologists. Among

those with absence of histological lesion, the antibody had, at most, a weak cytoplasmatic

positivity and in a small percentage of patients.

The Inter-observer variation (kappa index), found for cytology with the antibody, was

0.65 when data was evaluated globally (without positivity, weak and strong cytoplasmatic

positivity besides the nuclear one). When data was evaluated in detail excluding the subjective

criterion (strong or weak of the cytoplasmatic positivity) and keeping only three groups

(without positivity, cytoplasmatic positivity and nuclear positivity), Kappa index was 0.74.

When the percentile difference was evaluated between the pathologists, scores of less than 5%

are shown on the extreme groups of the investigation: CIN 2, 3 associated with nuclear

positivity for the antibody and absence of lesion associated with an absence of positivity for the

antibody.

Among patients with CIN 2, 3, there is a low Inter-observer variation when there is

nuclear positivity (percentile difference 4.3%) and, when there is an absence of histological

lesion and absence of positivity for the anti-p16ink

, the difference in the Inter-observer

variation is 4.6%. However among CIN 1 patients, there is an important inter-observer

variation.

No lesion

(n=87)

CIN 1

(1)

(n=36)

CIN 2 e 3

(n=23)

squamous

carcinoma

(n=2)

Investigation

results

cytology

ICQ

(3)

(2)

P2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

No positivity

(88.5%)

(83.9%)

(22.2%)

(41.7%)

(4.3%)

Weak

cytoplasmatic

positivity

(11.5%)

(16.1%)

(77.8%)

(38.9%)

(13%)

(30.4%)

Strong

cytoplasmatic

positivity

(19.4%)

(56.5%)

(39.1%)

(100%)

Nuclear

positivity

(30.4%)

(26.1%)

Table 3: Performance of the anti-p16ink

antibody on the sample (n=148)

(1)

CIN: Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

(2)

P1 = pathologist one, P2 = pathologist two

(3)

ICQ = Immunocytochemistry with anti-p16ink

The graphic representation of the performance of antibody anti-p16ink

is presented in

figure 5. The investigation results are dichotomized between absent of lesion (negative

Papanicolaou cytology plus normal or metaplastic colposcopic view) and lesion (diagnostic

biopsy with CIN 1,2,3 or cervical cancer).

88,5

11,5

83,9

16,1

13,1

50,8

24,6

11,4

26,2

34,4

29,5

9,8

50%

100%

P1(*)

without

lesion

without

lesion

P1 with

lesion

P2 with

lesion

Pathologist

(+)Nuclear

(+)Cytop. strong (**)

(+)Cytop. weak

Negative

Figure 5: Performance of the antibody anti-p16ink

in cervical cytology according to

investigation results and pathologist

(*) P1 = pathologist 1, P2 = pathologist 2

(**) (+) Citop. = Positivity of antibody anti-p16ink

in cytoplasm

The performance of the antibody regarding sensitivity and specificity is seen on table 4,

data is presented according to histological diagnosis and a pathologist.

The greater sensibility and the lower inter-observation variation between CIN 2, 3 and

cervical squamous carcinoma is highlighted. Nonetheless among CIN 1 cases, there is less

sensitivity and greater inter-observation variation.

CIN

(2)

(n=36)

CIN 2 e 3

(n=23)

CIN 1, 2 e 3

(n=59)

squamous

carcinoma

(n=2)

Histo-

pato-

logy

Measure

(IC 95%)

P 1

(1)

P 2 P 1 P 2 P 1 P 2 P 1 Pt 2

Sensitivity

77.8%

(60.4–89.3)

58.3%

(40.9–74.0)

100.0%

(82.2–100)

95.7%

(76.0–99.8)

86.4%

(74.5–93.6)

72.9%

(59.5–83.3)

100.0%

(19.8– 100)

100.0%

(19.8 –100)

Specificity

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1–90.6)

88.5%

(79.4-94.1)

83.9%

(74.1– 90.6)

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1–90.6)

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1– 90.6)

Table 4: Diagnostic antibody anti-p16ink

in cervical cytology

(1)

P1 = pathologist one, P2 = pathologist two

(2)

CIN: Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

The performance of the antibody regarding positive and negative predictive values is

presented in table 5, according to histological diagnosis and pathologist. For the probability of

cervical lesion after positive cytological ICQ test (predictive positive values) and absence of

cervical lesion after negative cytological ICQ test (predictive negative values), the study group

was divided into CIN 1 or worse (CIN1 + CIN 2 + CIN 3 + carcinoma), CIN 2 or worse (CIN 2

+ CIN 3 + carcinoma) and cervical squamous carcinoma. The predictive negative value, of the

antibodies in cervical cytology, was from 82% up to 100% between the pathologists and

different histological diagnosis.

CIN 1ou >

(1)

(n=61)

CIN 2 ou >

(2)

(n=25)

(3)

(n=2)

Histopa-

tology

Measure

(IC 95%)

(4)

P2 P1 P2 P1 P2

Positive

predictive

value

84.1%

(72.3 – 91.7)

76.3%

(63.1 – 86.0)

39.7%

(27.8 – 52.8)

40.7%

(28.3 – 54.2)

3.2%

(0.6 - 12)

3.4%

(0.6 – 12.7)

Negative

predictive

value

90.6%

(81.8 – 95.6)

82%

(72.1 – 89.1)

100%

(94.6 - 100)

98.9%

(93 – 99.9)

100%

(94.6 - 100)

100%

(94.8 - 100)

Table 5: Cervical cytology with antibodies anti-p16ink

: positive and negative predictive

values

(1) CIN 1 + CIN 2 + CIN 3 + Carcinoma

(2) CIN 2 + CIN 3 + Carcinoma

(3) CA = Squamous cervical carcinoma

(4) P1= Pathologist 1, P2 = Pathologist 2

The description of the joint findings of conventional (Papanicolaou) and ICQ

cytologies, according to histological results, are seen on table 6 where cytology ICQ was

dichotomized in negative and positive (weak and strong cytoplasmatic positivity besides

nuclear positivity). The conventional cytology was grouped into two categories: normal

(negative and atrophy) and atipy (ASC-US, ASC-H and AGC).

The analysis of the table shows that, when the conventional cytology was negative, the

use of the diagnostic test with the antibody was an aid to the diagnosis of five CIN 2 or 3 and

an cervical carcinoma according to pathologist 1 and four CIN 2 or 3 and cervical carcinoma

according to pathologist 2. For CIN 1 cases, the use of the diagnostic test with the antibody

aided ten cases between the two pathologists. In the conventional cytology atipy group, the use

of the antibody, aided the diagnosis of eight CIN 2 or 3 and a case of cervical carcinoma

between the two pathologists.

Table 6: Association of conventional cytologies (Papanicolaou) and ICQ cytologies

(anti-p16ink

)

(1)

P1 = pathologist one, P2 = pathologist two

(2)

ICQ = Immunocytochemistry

(3)

CIN: Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

Based on the data presented in table 5, sensitivity and specificity had been recalculated

using both diagnostic methods. In this case, it was considered as negative test only those on

negative conventional cytology associate to also negative cytology ICQ. All the other tests

were considered positive, such as conventional cytology with atipy, L-SIL or H-SIL or

cytological ICQ, with any degree of cytoplasmatic or nuclear positivity.

Data can be found on table 7, presenting the increase on sensitivity as well as on the

negative predictive value among cervical lesion cases, especially in the L-SIL cases.

Investigation results

Cytology

cervical

lesion

(n=87)

CIN 1

(3)

(n=36)

CIN 2, 3

(n=23)

squamous

carcinoma

(n= 2)

Conventional

cytology

(

Papanicolaou)

ICQ

(2)

(anti-

p16ink

)

(1)

P 2

P 1

P 2

P 1

P 2

P 1

P 2

Negative - 62 58 4 4 0 1 0 0

+ 4 8 10 10 5 4 1 1

Atipy - 14 14 2 6 0 0 0 0

+ 5 5 12 8 8 8 1 1

(4)

CIN 1

(2)

(n=36)

CIN 2 e 3

(n=23)

CIN 1, 2 e 3

(n=59)

squamous carcinoma

(n=2)

Histo-

patho-

logy

Measure

(IC 95%)

(1)

P2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

Sensitivity

88.9%

(73.0-96.4)

88.9%

(73.0-96.4)

100.0%

(82.2-

100.0)

95.7%

(76.0-99.8)

93.2%

(82.7-97.8)

91.5%

(80.6-96.8)

100.0%

(19.8-

100.0)

100.0%

(19.8-

100.0)

Specificity

71.3%

(60.4-80.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(55.7-76.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(60.4-80.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(60.4-80.2)

66.7

(55.7-76.2)

Table 7: Association of conventional cytology and ICQ for the diagnosis of

cervical lesion:

(1)

P1 = pathologist 1, P2 = pathologist 2

(2)

CIN: Cervical intra-epithelial neoplasia grade 1, 2 or 3

Discussion

In the present study, the sensitivity and the negative predictive value with the used

diagnostic method showed an appropriate performance on CIN 2, 3 and CA cases with results

superior to 70%. Such results reproduce the findings of literature that had approached the

cervical cytology with the antibody proposed

32-34, 47

- On precursory cervix lesion patients, when evaluated together (CIN 1, 2 or 3),

the study reproduces literature findings with sensitivity ranging from 75,4%

up to 92,3%

- On CIN 1, sensitivity of the diagnostic test was 77.8% and 58.3% between

pathologists 1 and 2 respectively, partially following literature findings where

there is variation from 54,3%

up to 74,1%

- Pientong and cols, published in 2003, found 33% sensitivity among CIN 1

cases, however, the study presented methodology mistakes, since the

collections occurred only with spatula of Ayre, the dilution of the antibody was

1:400 and there wasn’t a histological confirmation of the cases

On cases of strong cytoplasmatic positivity or nuclear positivity, verified mainly with

CIN 2, 3 or cervical cancer, same findings of literature are seen. When positivity to the

antibody was evaluated of distinctively between cytoplasm and nucleus, study of Saqi and cols

were: 90% sensitivity among CIN 2, 3 and 100% among invasive lesion

. Bibbo and cols,

found a 94.4% sensitivity between CIN 2, 3

cases.

As for the inter-observer variation, using the proposed methodology on the study

(absence of positivity, weak and strong cytoplasmatic positivity and nuclear positivity), an

agreement only on cases of CIN 2, 3 and nuclear positive diagnostic test is found. Similarly,

there is an agreement between the absence of lesion and the negative diagnostic test, besides

the strong cytoplasmatic positivity between the two cases of invasive lesion. In these

extremities, the percentile difference between the pathologists was inferior to 5%.

However, on CIN 1 cases and mainly when using the subjective criterion of the

cytoplasmatic evaluation there was an important inter-observer variation.

The kappa index of the study reached only 0.74 when the subjective criterion of the

cytoplasmatic evaluation was removed. Such results were reproduced on a recent study of

Negri and cols

, published in 2006 which found 66.6% sensitivity between CIN 1 cases and

kappa index of 0.77. It highlights the exiguities of the sample used by the researcher, who

found six cases of CIN 1.

Among the two cases of carcinoma, which occurred on the sixth and seventh decades of

life, therefore in hypostrinic state, positivity was found on the cytoplasm between the two

pathologists. This finding is predictable on medical literature, since the considered antibody

does not react with deteriorate cells including those of neoplastic origin

. Probably the

positivity mentioned referred to circumjacent tissues to the invasive lesion, still in precursory

state.

The use of the joint findings of conventional Papanicolaou cytologies and ICQ was

proposed in order to understand false-negative cases of the former. The two cases of carcinoma

were found on normal conventional cytologies or with atypical alterations (ASC, AGC). On

this exact group there were thirteen and twelve CIN 2, 3 lesions according to pathologists 1 and

2 respectively. All these groups had something in common which is the positivity for antibody

anti-p16ink

. In a recent revision of literature, a similar association for comparisons was not

found.

As for the negative predictive values in the study, the variation was 82% (CIN 1 or

worse) up to 100% (CIN2 or worse). This measure is essential for population screening test

where high values for negative predictive values are secure for diagnostic of illness absence.

Trunk and cols.

, found negatives predictive values higher than 90% between CIN 1 (or

worse) and CIN2 (or worse). Saqi and cols.

found negative predictive values as 74,2%

between CIN 1 or worse and 96,8% between CIN 2 or worse.

The present study did not evaluate the presence of HPV on the selected sample, which

would elucidate the understanding of doubtful cases:

- The cytoplasmatic positivity found on 10 to 14 patients without cervical lesion

according to pathologist one and two respectively;

- The cases of CIN 1 presented with greater discrepancy among observers

associated to the inferior sensitivity of the method.

Authors claim that contrary to what is cited on the medical literature, the use of the

antibody anti-p16ink

did not present difficulties of diffusion in staining, during the process of

immunocytochemistry, cited as threshold on studies that had not used liquid-base cytology

So, the antibody anti-p16ink

was considered, by the authors, as a feasible test for the

following up of cervical lesions.

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Artigo em Português

Expressão do Anticorpo Anti-p16ink

em Citologia Cervical

Alexandre da Silva Rocha, Mary Clarisse Bozzetti, Luciana Schmidt Kirschnick, Maria Isabel

Albano Edelweiss

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas

Endereço para correspondência:

Alexandre da Silva Rocha

[email protected]

Rua Frei Germano n

200/503B

Bairro São José CEP 91530-060

Porto Alegre / RS

Brasil

Resumo

Introdução: O uso do anticorpo anti-p16ink

, visando aumento da sensibilidade no

exame citológico, tem apresentado resultados promissores; entretanto há carência de estudos

utilizando o anticorpo monoclonal em citologia cervical associado ao exame histológico do

colo uterino. Objetivos: avaliar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e

negativo do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical. Método: Estudo de casos e controles

realizado em ambulatório de patologia cervical. As lâminas de citologia, para

imunocitoquímica com o anticorpo, foram coletadas com espátula de Ayre e escova tipo

cytobrush. A leitura das lâminas foi realizada por dois patologistas independentes (P1 e P2).

Foram considerados casos (n=61), as investigações cervicais que resultaram em biópsia

diagnóstica compatível com lesão intra-epitelial de baixo grau (NIC 1), alto grau (NIC 2/3) ou

carcinoma invasor (CA). Foram considerados controles (n=87), as investigações que contavam

com colposcopia normal e citologia, corada pelo método de Papanicolaou, negativas.

Resultados: A sensibilidade para o diagnóstico das NIC 2/3 (n=23) foi de 100% (P1) e 95,7%

(P2). Já o valor preditivo negativo nos diagnósticos de NIC2 ou pior foi de 100 (P1) e 98,9

(P2). Nos dois casos de carcinoma epidermóide, a sensibilidade foi de 100% para ambos

patologistas. A sensibilidade para o diagnóstico das NIC1 foi de 77,8% (P1) e 58,3% (P2). O

valor preditivo negativo entre as NIC1 foi de 90,6 (P1) e 82 (P2). O índice kappa entre os dois

patologistas foi de 0,74. Entre os casos de NIC 2/3 associado à positividade nuclear ao

anticorpo, a diferença percentual entre os patologistas foi inferior a 5%. Mesmo escore

encontrado entre os casos de ausência de lesão cervical e negatividade para o anticorpo. Já

entre as portadoras de NIC1, houve maior variação inter-observador. Conclusões: Os

resultados apresentados apontam o anticorpo anti-p16ink

como auxiliar no rastreamento de

lesões precursoras ou neoplásicas em citologia cervical.

Introdução

Desde a introdução do exame citológico cervical em forma de programa de

rastreamento populacional, que a morbidade e a mortalidade do câncer da cérvice vêm

decrescendo

. Idealizado para possuir grande sensibilidade no diagnóstico de alterações

cervicais, vem apresentando sensibilidades desapontadoras médias de 0,51 (IC 95% 0,37 -

0,66), sendo mais acurado entre lesões cervicais precursoras de alto grau

2-4

Verifica-se que, em países com coberturas de coletas ultrapassando 85%, metade dos

casos de câncer cervical ocorram em mulheres que não foram testadas nos últimos cinco anos

e, entre as testadas, 12 a 23% possuam falhas no rastreamento

Aproximadamente 60% das falhas do exame citológico cervical são devidas à coleta

inadequada e o restante, a erros laboratoriais

6-8

. Espera-se que, entre aquelas diagnosticadas

como portadoras de câncer cervical, a revisão de seus exames citológicos “normais”, ocorridos

nos últimos três anos, sejam reclassificados para lesão escamosa intra-epitelial de alto grau (H-

SIL) em 40% das vezes

Apesar de não possuirmos um marcador diagnóstico ideal para o rastreamento de lesões

cervicais, sabe-se que este deverá possuir alta sensibilidade, não depender de critérios

subjetivos para sua leitura, ser de custo acessível e aplicável em amostras facilmente

coletadas

A influência do papilomavírus humano (HPV) na gênese das lesões precursoras ou

neoplásicas cervicais vêm sendo apontada por inúmeros estudos nas últimas décadas

10-13

, sendo

encontrado virtualmente em todos os casos de câncer cervical, de acordo com a sensibilidade

do método de detecção empregado

A identificação de intermediários produzidos pela incorporação do genoma do HPV nas

células epiteliais cervicais, evitando o simples diagnóstico da presença do DNA viral, torna-se

promissor como elemento diagnóstico em cérvice

14-16

O uso dos marcadores moleculares têm sido citados como adjuvantes na leitura do

esfregaço durante o exame microscópico

14, 17

. Para as lesões de origem escamosa o PCNA, ki-

67 (MIB1), ciclina-E e o anti-p16ink

; entre as glandulares, o MN, cd44, ki-67 e o anti-

p16ink

, além de outros, são potenciais candidatos a marcador diagnóstico de células

precursoras ou neoplásicas no exame citológico cervical

14, 17

. A proposta do uso dos

marcadores diagnósticos, seria a de destaque das células alteradas, já durante o exame

microscópico de baixa magnificação, minimizando a habituação na leitura dos esfregaços

O processo de carcinogênese da cérvice dá-se em etapas de eventos moleculares, no

nível celular epitelial, com a produção de intermediários passíveis de marcação diagnóstica.

Não há consenso quanto ao melhor intermediário preditor da carcinogênese na cérvice, onde

seu diagnóstico poderá discriminar casos de progressão neoplásica

O PCNA (Antígeno Nuclear de Proliferação Celular) e o ki67 mostraram-se como

marcadores de proliferação celular; a ciclina-E e o ki67 que diferenciariam as lesões dos

tecidos normais cervicais

14, 15

; o p53 como marcador de proliferação celular e progressão

tumoral

; o anti-p16ink

como marcador de lesão cervical precursora em citologia e

histologia, marcador da infecção pelo HPV em células cervicais e como auxiliar na redução da

variação inter-observador em lesões histológicas cervicais

15, 19-36

Dentre as várias alternativas diagnósticas em cérvice, o anticorpo anti-p16ink

mostra promissor no aprimoramento da sensibilidade na citologia cervical. Entretanto há

carência de estudos utilizando o anticorpo em citologia convencional, associado ao exame

padrão-ouro cervical (biópsia dirigida por colposcopia e corada com hematoxilina-eosina).

Sugere-se que, em amostras citológicas ou histológicas cervicais, o anticorpo anti-

p16ink

funcione como um “detector citopático” da presença do HPV integrado ao genoma

celular, induzindo mitose desregulada e precária vigilância para mutações do DNA. Seria teste

mais específico quando comparado com o diagnóstico da presença viral por reação em cadeia

da polimerase (PCR) ou captura híbrida

Com o presente estudo de casos e controles, visa-se avaliar a sensibilidade,

especificidade, valor preditivo positivo (vp+) e negativo (vp-) do anticorpo anti-p16ink

citologia cervical, além da factibilidade do uso do anticorpo em lâminas de citologia cervical

coletadas de forma convencional.

Método

Estudo de casos e controles desenvolvido em ambulatório de Patologia Cervical

localizado na Sede da Gerência Distrital de Saúde 06 do Município de Porto Alegre / RS e

conveniado ao Sistema Único de Saúde.

Pacientes suspeitas de lesão precursora ou neoplásica do colo uterino e atendidas nas

Unidades de Saúde dos bairros São José, Intercap, Agronomia, Lomba do Pinheiro e Partenon

foram encaminhadas ao referido ambulatório após triagem clínica e citológica inicial.

Conforme o censo do IBGE (instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) do ano de 2000

residiam na área descrita, 181.095 habitantes, sendo 93.883 mulheres, com renda familiar

média variando de 2.60 a 7.54 salários-mínimos regionais

As Unidades de Saúde Bananeiras, Esmeralda, Mapa, Morro da Cruz, Murialdo,

Panorama, Pequena Casa da Criança, Pitinga, São José, São Pedro e Viçosa foram recrutadas,

por meio de cartazes e comunicação direta, ao encaminhamento de casos suspeitos de patologia

cervical ao referido ambulatório.

A amostra foi selecionada a partir de dois grupos distintos de pacientes atendidas na

sede da Gerência Distrital de Saúde: o primeiro contava com pacientes do Ambulatório de

Patologia Cervical que foram recentemente rastreadas nas Unidades de Saúde citadas e,

portanto, suspeitas de lesão cervical; o segundo, contava com pacientes atendidas na própria

sede da Gerência Distrital de Saúde, sem rastreamento cervical recente.

Os critérios de inclusão no grupo controle foram a concomitância de citologia cervical

negativa (corada pelo método de Papanicolaou) para lesão intra-epitelial ou neoplasia

invasora, associado a achados colposcópicos normais. Foram considerados casos, as

investigações que resultaram em biópsia cervical positiva para lesão escamosa intra-epitelial de

baixo grau (NIC 1), alto grau (NIC 2/3) ou câncer cervical (CA).

Foram excluídas aquelas pacientes com hímen íntegro, ausência ou impossibilidade de

exposição da cérvice, histórico de conização cervical, gestantes, portadoras de

vaginites/cervicites (conforme avaliação clínico-microscópica), incapazes e casos de negativa

na participação no estudo.

A figura 4 apresenta o fluxograma do processo de seleção da amostra a partir do

número total de triagens ocorridas (n=287) no período de janeiro de 2004 a julho de 2005.

Figura 4: Fluxograma do processo de seleção da amostra

(1)

AGC = Atipia glandular cervical

(2)

ASC = Atipia escamosa cervical

(3)

L-SIL= lesão escamosa intra-epitelial de baixo grau

(4)

H-SIL = lesão escamosa intra-epitelial de alto grau

(5)

NIC 1 = Neoplasia intra-epitelial cervical grau 1

(6)

NIC2/3 = Neoplasia intra-epitelial cervical grau 2 ou 3

(7)

CA = Carcinoma epidermóide cervical

Colposcopia

inicial

(n= 287)

Colposcopia

insatisfatória

(n=23)

Achado

colposcópico

normal /

Metaplásico

114)

Sugestiva de

lesão de baixo

grau

(n=96)

Sugestiva de

lesão de alto

grau

(n=54)

Citológico

normal

(n=87)

Citológico:

AGC

(n=5)

ASC

(n=20)

L-SIL

(n=2)

Grupo

Controle

(s/ lesão)

(n=87)

Exclusão

estudo

(n=78)

Citológico

normal

(n=51)

Citológico:

AGC (n=1)

ASC (n=31)

L-SIL (n=11)

H-SIL

(n=2)

Biópsia:

Cervicite (n=9)

Pólipo (n=1)

NIC 1

(n=11)

NIC 2/3

(

n=7

)

Citológico

normal

(n=17)

Citológico:

AGC (n=1)

ASC (n=23)

L-SIL (n=10)

H-SIL

(

n=3

)

Biópsia:

Desistência (n=1)

Cervicite (n=10)

NIC 1 (n=25)

NIC 2/3 (n=16)

(n=2)

Grupo

Estudo

(c/ lesão)

(n=61)

Pctes. com

suspeita de

lesão cervical

neoplásica ou

precursora

Pctes. da

rotina

ginecológica

auto

Exclusão

estudo

(n=23)

Exclusão

estudo

(n=38)

Durante o período compreendido entre janeiro de 2004 a julho de 2005, foram

realizadas duzentas e oitenta e sete triagens citológicas e colposcópicas entre pacientes com e

sem suspeita de lesão cervical neoplásica ou precursora.

Pacientes atendidas no Ambulatório de Patologia Cervical ou na rotina ginecológica da

Gerência Distrital de Saúde foram convidadas a participar do estudo e apresentadas ao Termo

de Consentimento Informado (anexo 1). Em concordando na participação, a triagem ocorria a

partir do preenchimento de Documento Padrão que abordava as características clínico-

epidemiológicas da paciente (anexo 2).

Seguiu-se a coleta do exame citológico ICQ (imunocitoquímica) para o teste

diagnóstico proposto com anticorpos anti-p16ink

(clone G175-405 em diluição 1:100 da

Pharmingen / BD Biosciences do Brasil). A técnica de imunocitoquímica utilizada foi a

Complexo Estreptavidina-Biotina (LSAB) (anexo 3).

A próxima etapa contou com a coleta de citologia cervical visando utilização da técnica

de coloração preconizada por Papanicolaou (anexo 4).

Visando a representatividade da junção escamo-colunar e zona de transformação do

colo uterino, os exames citológicos foram coletados da forma habitual com a utilização da

espátula de Ayre

(rotação de 360º na região peri-orificial do colo uterino) e escova cervical

tipo citobrush

(rotação de 90º na endocérvice) individuais e descartáveis

Objetivando-se a redução do desprendimento celular durante os processos de

“lavagens” na imunocitoquímica, a lâmina utilizada para citologia ICQ contava com camada

aderente de 3-aminopropyl(triethoxy)silane

39, 40

. Tal preparo prévio é rotineiramente

preconizado pelo laboratório do Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

O fixador celular, utilizado em ambas as lâminas, foi o álcool 96% com polietilenoglicol.

A colposcopia foi realizada com equipamento de magnificação de imagem binocular

marca DFV

com aumento fixo de sete vezes e com soluções habituais: ácido acético a 5%,

solução iodo-iodetada de Schüller e solução fisiológica a 0,9%.

A classificação citológica utilizada para leitura das lâminas convencionais foi a de

Bethesda 2001 (anexo 5)

A classificação colposcópica utilizada foi a da Federação Internacional de Patologia

Cervical e Colposcopia aprovada em 2002 e recomendada pela Associação Brasileira de

Genitoscopia (anexo 6).

De acordo com a avaliação citológica convencional e colposcópica inicial foi realizada

biópsia diagnóstica do colo uterino que seguiu as indicações consensuais da Sociedade

Americana de Colposcopia e Patologia Cervical

42, 43

Citologia compatível com H-SIL e colposcopia satisfatória compatível com lesão de

alto grau eram orientadas a biópsia cervical precoce.

Casos de L-SIL, ASC-US, ASC-H, AGC e colposcopia normal ou com alteração

metaplásica, foram seguidas em intervalos semestrais e biopsiadas se agravamento do quadro

cito-colposcópico. Neste grupo, a presença de colposcopia satisfatória compatível com lesão de

baixo ou alto grau, na avaliação inicial, foi seguida de biópsia cervical precoce.

Os casos de colposcopias insatisfatórias foram excluídos do estudo.

As biópsias ocorreram sob anestesia infiltrativa local com lidocaína

a 2% sem vaso-

constritor e broca tipo Baliu

com o fragmentos conservados em formalina a 10% e lido sob

coloração-padrão de hematoxilina-eosina. O diagnóstico das peças de biópsia seguiu os

critérios de Richart, onde foram diagnosticadas como ausência de lesão precursora, lesão

histológica intra-epitelial de baixo grau ou NIC 1, lesão histológica intra-epitelial de alto grau

ou NIC 2/3 além de carcinoma invasor (CA)

43, 44

(anexo 7).

O critério de positividade das lâminas ICQ foi adaptado dos estudos de Bibbo, Pientong

e Saheballi

3, 45, 46

. A presença de células epiteliais cervicais com positividade amarronada

característica em número igual ou superior a 10 no esfregaço, era considerada como lâmina

positiva. Entre estas, discriminou-se três categorias: 1) positividade citoplasmática fraca, 2)

positividade citoplasmática forte e 3) positividade nuclear. As lâminas de citologia ICQ foram

lidas por dois patologistas independentes e “cegados” para os diagnósticos citológicos

convencionais, colposcópicos e histológicos.

Cálculo amostral

O cálculo amostral foi baseado em estudos prévios que abordaram a performance do

anticorpo anti-p16ink

em citologia, associado ao exame padrão-ouro cervical ou biópsia

diagnóstica corada com hematoxilina e eosina.

Considerando a máxima positividade encontrada entre indivíduos sem lesão em 18%

das vezes

, a mínima positividade encontrada entre casos de NIC 1 em 60% das vezes

mínima positividade encontrada entre casos de NIC 2/3 em 80% das vezes

, o uso do pacote

estatístico PEPI versão 4.0 (Computer Programs for Epidemiologists) resultou em tamanho

amostral mínimo de 31 casos de lesão de baixo grau, 15 casos de lesão de alto grau, e 46

controles.

Os parâmetros utilizados foram alfa de 95%, beta de 10% (poder do estudo de 90%)

com proporção de um controle para cada caso.

Análise estatística

As características clinico-epidemiológicas da amostra foram descritas a partir de

variáveis quantitativas (idade, sexarca, número de parceiros sexuais na vida e nos últimos doze

meses, escolaridade e gestações) e qualitativas (método contraceptivo utilizado, relato de

soropositividade ao vírus da imunodeficiência humana e histórico de doenças sexualmente

transmissíveis, estado pós-menopáusico e motivo do encaminhamento para investigação).

As variáveis quantitativas com distribuição simétrica foram descritas com médias e

desvios-padrão e as com distribuição assimétrica, com medianas e amplitude inter-quartil.

As variáveis categóricas foram descritas com freqüências absolutas e porcentagens.

O pacote estatístico SPSS 13.0 (Statistical Package for the Social Sciences) foi

utilizado para o cálculo da significância estatística a partir do valor-p.

O teste “t” de Student foi usado para variáveis que apresentaram distribuição normal e o

teste “U” (Wilcoxon-Mann-Whitney) para o cálculo entre aquelas que se distribuíram de forma

assimétrica.

Para as variáveis categóricas foi utilizado o teste chi-quadrado de Pearson.

Para o cálculo da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo

foram utilizados tabelas de contingência “2 x 2” plotadas no programa de informática Epi-info

6.0 com intervalos de confiança de 95%. Foi considerado teste diagnóstico positivo aquele em

que a citologia ICQ resultou positiva para o anticorpo anti-p16ink

em núcleo ou citoplasma e

teste negativo, a ausência da positividade. Já doença presente foi a investigação que resultou

em biópsia cervical positiva para NIC 1, NIC 2/3 ou CA e, doença ausente, a investigação que

resultou em citologia convencional negativa e colposcopia com achados normais ou

metaplásicos.

Pareceres Éticos

Estudo aprovado pelos comitês de ética em pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto

Alegre e Prefeitura do Município de Porto Alegre/RS sob pareceres números 04-241 e

001.010889.04.3.

Resultados

O processo de seleção da amostra identificou oitenta e sete pacientes consideradas

como livres de lesão cervical precursora ou neoplásica e sessenta e uma pacientes como

portadoras de lesão.

A tabela 1 destaca as principais variáveis sócio-demográficas aferidas pelo

investigador durante a amostragem dos casos e controles.

O item “número de parceiros sexuais na vida”, apresentou diferença estatisticamente

significativa entre os grupos. A mediana foi de três parceiros (2 a 5) no grupo estudo e dois

parceiros (1 a 3) no grupo controle.

Avaliando apenas os casos com lesão histológica do colo uterino, a idade média para o

diagnóstico de lesão intra-epitelial de baixo grau foi 32,9 ± 10,9 anos e entre as lesões de alto

grau foi de 26,8 ± 6,3 anos, não havendo diferença estatisticamente significativa entre os dois

grupos. Os casos de carcinoma ocorreram na sexta e sétima décadas de vida e foram da

variante epidermóide.

O contraceptivo oral combinado foi o principal método anticoncepcional citado,

perfazendo 65,6% (n=40) no grupo estudo e 50,6% (n=44) no grupo controle. Destaca-se a

baixa adesão ao uso exclusivo do condom masculino entre 9,8% (n=6) no grupo estudo e

11,5% (n=10) no grupo controle.

O diagnóstico clínico de estado pós-menopáusico (histórico de amenorréia há um ano

ou mais associado a sintomas típicos como fogachos, diminuição da libido e dispareunia

secundária a alterações atróficas do epitélio vaginal)

ocorreu em 9,8% (n=6) no grupo estudo

e 21,8% (n=19) no grupo controle.

O encaminhamento ao ambulatório de patologia cervical foi por exame citológico

anormal em 37,8% (n=56) e suspeita clínica de lesão cervical em 25,7% (n=38).

Relato de soropositividade para o vírus da imunodeficiência humana ocorreu em dois

casos do grupo estudo e um caso do grupo controle.

Resultado

Investigação

Variável

Sem lesão

cervical

(n=87)

NIC 1

(2)

, NIC 2/3

(3)

(4)

(n= 61)

valor-P

Idade em anos

33.8 ± 14.4

30.4 ± 9.7

0.09

Sexarca 16.7± 2.4 16.5 ± 2.5 0.66

parceiros sexuais (na

vida)

2 ou <

54% (47 casos) 36.1% (22 casos)

3 a 5

39.1% (34 casos) 44% (27 casos)

<0.05

6 ou >

6.9% (6 casos)

19.7% (12 casos)

parceiros sexuais (nos

últimos 12 meses)

1.0 (1-1) 1.0 (1-1) 0.79

Escolaridade (anos de

estudo)

8.4 ± 3.0 8.8 ± 2.7 0.42

Gestações

2.0 (1-3) 2.0 (1 - 2.5) 0.73

Histórico de DST

(1)

11.5% (10 casos) 9.8% (6 casos) 0.80

Tabela 1: Variáveis sócio-demográficas da amostra de casos e controles (n=148)

(1) Doença Sexualmente Transmissível

(2) Lesão intra-epitelial de baixo grau

(3) Lesão intra-epitelial de alto grau

(4) Carcinoma epidermóide cervical

A tabela 2 apresenta os resultados da investigação colposcópica efetuada nas 148

pacientes incluídas no estudo.

Das pacientes com colposcopia sugestiva de lesão de baixo grau (n=96), vinte e oito

foram biopsiadas, sendo diagnosticadas dezoito lesões cervicais além de nove diagnósticos

inflamatórios (cervicite crônica) e um caso de pólipo.

Para as pacientes com colposcopia sugestiva de lesão de alto grau (n=54), quarenta e

três biópsias resultaram em lesão histológica cervical. Neste grupo, das onze pacientes

restantes, dez biópsias resultaram em processo inflamatório crônico (cervicite crônica) e uma

paciente não compareceu ao procedimento.

O valor preditivo positivo da colposcopia sugestiva de lesão de alto grau para o

encontro de lesão histológica cervical foi de 0.80.

Resultado

investigação

Aspecto

Colposcópico

Não

biopsiado

Cervicite/

pólipo

NIC 1

(1)

NIC 2/3

(2)

(3)

epidermóide

Total

Normal/

metaplásico

87 0 0 0 0 87

Lesão de baixo

grau

68 10 11 7 0 96

Lesão de alto grau 1 10 25 16 2 54

Tabela 2: Resultados da colposcopia de acordo com o diagnóstico histológico cervical

(n=148)

(1) Lesão intra-epitelial de baixo grau

(2) Lesão intra-epitelial de alto grau

(3) CA = Carcinoma

A descrição dos achados citológicos com o anticorpo anti-p16ink

entre os dois

patologistas nos diferentes diagnósticos histológicos encontra-se na tabela 3 e exemplos de

positividade ao anticorpo na figura 6.

Verifica-se que a positividade para o anticorpo foi menos freqüente entre as pacientes

sem lesão e alta entre aquelas com lesão histológica do colo.

Ressalta-se que a positividade citológica nuclear foi encontrada somente entre casos de

NIC 2/3 e a positividade citológica citoplasmática forte somente entre pacientes com lesão

histológica do colo (NIC 1 e NIC 2/3).

Os dois casos de CA epidermóide apresentaram positividade citoplasmática forte entre

os dois patologistas.

Entre aquelas com ausência de lesão histológica do colo, o anticorpo teve, no máximo,

positividade fraca citoplasmática e em pequena porcentagem de pacientes.

A variação inter-observador (índice de kappa), encontrada para a citologia com o

anticorpo, foi de 0.65 quando avaliados os dados de forma global (sem positividade,

positividade fraca e forte citoplasmática além da nuclear).

Quando avaliados os dados de forma pormenorizada excluindo-se o critério subjetivo

(forte ou fraco) da positividade citoplasmática e mantendo apenas três grupos (sem

positividade, positividade citoplasmática e positividade nuclear), o índice Kappa foi de 0,74.

Quando avaliada a diferença percentual entre os patologistas, verificam-se escores

inferiores a 5% nos grupos extremos da investigação: NIC 2/3 associada à positividade nuclear

citológica para o anticorpo e ausência de lesão cervical associada à negatividade citológica

para o anticorpo .

Nos casos de pacientes portadoras de NIC 2/3, a leitura das lâminas ICQ apresenta

baixa variação inter-observador, quando há positividade citológica nuclear (diferença

percentual de 4.3%). Quando há ausência de lesão cervical e ausência de positividade

citológica para o anticorpo, a variação inter-observador é de 4.6%. Já entre as portadoras de

NIC 1, há importante variação inter-observador.

Sem lesão

(n =87)

NIC 1

(1)

(n=36)

NIC 2/3

(2)

(n=23)

(3)

(n=2)

Resultado

investigação

citologia ICQ

(5)

(anti-p16ink

)

(4)

Ausência

positividade

(88.5%)

(83.9%)

(22.2%)

(41.7%)

(4.3%)

Positivo citoplasma

(fraco)

(11.5%)

(16.1%).

(77.8%)

(38.9%)

(13%)

(30.4%)

Positivo citoplasma

(forte)

(19.4%)

(56.5%)

(39.1%)

(100%)

Positivo

nuclear

(30.4%)

(26.1%)

Tabela 3: Expressão do anticorpo anti-p16ink

em citologia cervical (n=148)

(1) Lesão intra-epitelial de baixo grau

(2) Lesão intra-epitelial de alto grau

(3) Carcinoma epidermóide

(4) P1 = patologista 1, P2 = patologista 2

(5) Imuno-citoquímica

A representação gráfica da performance do anticorpo na citologia cervical encontra-se

na figura 5. O resultado da investigação está dicotomizado entre sem lesão cervical (citologia

Papanicolaou negativa e colposcopia com achados normais) e com lesão histológica cervical

(biópsia diagnóstica do colo com NIC 1, NIC 2, NIC 3 ou carcinoma invasor).

88,5

11,5

83,9

16,1

13,1

50,8

24,6

11,4

26,2

34,4

29,5

9,8

50%

100%

P1(*)

sem

lesão

P2 sem

lesão

P1 com

lesão

P2 com

lesão

Patologista

(+)Nuclear

(+)Citop. forte (**)

(+)Citop. fraco

Negativo

Figura 5: Performance do anticorpo anti-p16ink

na citologia cervical de

acordo com o resultado da investigação e por patologista

(*) P1 = patologista 1, P2 = patologista 2

(**) (+)Citop. = Positividade ao anticorpo anti-p16ink

em citoplasma

A performance do anticorpo, na citologia cervical, quanto à sensibilidade e

especificidade encontra-se na tabela 4, estando os dados apresentados de acordo com o

diagnóstico histológico e por patologista.

Destaca-se a maior sensibilidade do teste diagnóstico entre os casos de lesão precursora

de alto grau e carcinoma. Nestes grupos há baixa variação inter-observador na leitura das

lâminas de citologia entre os patologistas.

Já entre os casos de lesão precursora de baixo grau, há menor sensibilidade e maior

variação inter-observador.

NIC 1

(1)

(n=36)

NIC 2/3

(2)

(n=23)

NIC 1 + NIC 2/3

(n=59)

(3)

(n=2)

Histopa-

tologia

Medida

(IC 95%)

(4)

P2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

Sensibi-

lidade

77.8%

(60.4–89.3)

58.3%

(40.9–74.0)

100.0%

(82.2–100)

95.7%

(76.0–99.8)

86.4%

(74.5–93.6)

72.9%

(59.5–83.3)

100.0%

(19.8– 100)

100.0%

(19.8 –100)

Especifi-

cidade

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1–90.6)

88.5%

(79.4-94.1)

83.9%

(74.1– 90.6)

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1–90.6)

88.5%

(79.4–94.1)

83.9%

(74.1– 90.6)

Tabela 4: Citologia cervical com o anticorpo anti-p16ink

: sensibilidade e especificidade

(1) NIC 1 = Lesão intra-epitelial de baixo grau

(2) NIC 2/3 = Lesão intra-epitelial de alto grau

(3) CA = Carcinoma epidermóide cervical

(4) P1= Patologista 1, P2 = Patologista 2

A performance do anticorpo, na citologia cervical, quanto aos valores preditivos

positivo e negativo encontra-se na tabela 5, estando os dados apresentados de acordo com o

diagnóstico histológico e por patologista. Para a probabilidade de lesão do colo uterino após o

teste citológico positivo ou ausência de lesão do colo após o teste negativo, o grupo estudo foi

dividido em NIC 1 ou pior (NIC 1 + NIC 2 + NIC 3 + carcinoma), NIC 2 ou pior (NIC 2 + NIC

3 + carcinoma) e, por fim, o grupo carcinoma. Destacam-se os elevados valores preditivos

negativos do teste diagnóstico com o anticorpo proposto, fato indispensável para testes

diagnósticos de rastreio populacional.

NIC 1ou >

(1)

(n=61)

NIC 2 ou >

(2)

(n=25)

(3)

(n=2)

Histopa-

tologia

Medida

(IC 95%)

(4)

P2 P1 P2 P1 P2

Valor

preditivo

positivo

84.1%

(72.3 – 91.7)

76.3%

(63.1 – 86.0)

39.7%

(27.8 – 52.8)

40.7%

(28.3 – 54.2)

3.2%

(0.6 - 12)

3.4%

(0.6 – 12.7)

Valor

preditivo

negativo

90.6%

(81.8 – 95.6)

82%

(72.1 – 89.1)

100%

(94.6 - 100)

98.9%

(93 – 99.9)

100%

(94.6 - 100)

100%

(94.8 - 100)

Tabela 5: Citologia cervical com o anticorpo anti-p16ink

: valor preditivo positivo e

negativo

(1) NIC 1 + NIC 2 + NIC 3 + Carcinoma

(2) NIC 2 + NIC 3 + Carcinoma

(3) CA = Carcinoma epidermóide cervical

(4) P1= Patologista 1, P2 = Patologista 2

A descrição dos achados conjuntos das citologias convencional e ICQ, de acordo com

os resultados histológicos, são representadas na tabela 6.

Aqui, a citologia ICQ foi dicotomizada entre negativa e positiva (positividade fraca e

forte citoplasmática além da positividade nuclear). A citologia convencional foi agrupada em

quatro categorias: normal (negativa e atrofia), atipia (ASC-US, ASC-H e AGC), L-SIL ou H-

SIL.

Pela observação da tabela, verifica-se que, quando a citologia convencional era

negativa, o uso do teste diagnóstico com o anticorpo “auxiliou” para o diagnóstico de cinco

NIC 2/3 e um CA epidermóide conforme o patologista um e quatro NIC 2/3 e um CA

epidermóide conforme o patologista dois.

Para os casos de NIC 1, o uso do teste diagnóstico com o anticorpo “auxiliou” em dez

casos entre os dois patologistas.

No grupo atipia da citologia convencional, o uso do anticorpo identificou oito NIC 2/3

e um caso de CA epidermóide entre os dois patologistas.

Tabela 6: Resultado conjunto entre as citologias cervicais Papanicolaou e ICQ (imuno-

citoquímica) com o anticorpo anti-p16ink

(1) NIC 1 = Lesão intra-epitelial de baixo grau

(2) NIC 2/3 = Lesão intra-epitelial de alto grau

(3) CA = Carcinoma

(4) Imuno-citoquímica

(5) Patologista 1 e Patologista 2

Baseados nos dados apresentados na tabela 6 foram recalculadas a sensibilidade e a

especificidade utilizando-se os dois métodos diagnósticos em conjunto.

Neste caso, foi considerado como teste negativo somente aqueles que contavam com

Sem lesão

cervical

(n=87)

NIC 1

(1)

(n=36)

NIC 2/3

(2)

(n=23)

(3)

epidermóide

(n= 2)

Resultado da

investigação

Citologia

P 1

(5)

P 2 P 1 P 2 P 1 P 2 P 1 P 2

convencional

Papanicolaou

ICQ

(

anti-p16ink

Negativo - 62 58 4 4 0 1 0 0

+ 4 8 10 10 5 4 1 1

Atipia - 14 14 2 6 0 0 0 0

+ 5 5 12 8 8 8 1 1

L-SIL - 1 1 2 5 0 0 0 0

+ 0 0 6 3 6 6 0 0

H-SIL - 0 0 0 0 0 0 0 0

+ 1 1 0 0 4 4 0 0

citologia convencional negativa associada à citologia ICQ também negativo. Foi considerado

teste positivo, todos os demais, ou seja, citologia convencional com atipia, L-SIL ou H-SIL ou

citologia ICQ, contando com qualquer grau de positividade, citoplasmática ou nuclear.

Os dados encontram-se na tabela 7, destacando o incremento na sensibilidade na

associação dos dois métodos diagnósticos em conjunto, citologia convencional Papanicolaou e

citologia ICQ com anticorpos anti-p16ink

NIC 1

(1)

(n=36)

NIC 2/3

(2)

(n=23)

NIC 1 + NIC 2/3

(n=59)

(3)

Epidermóide

(n=2)

Histopa-

tologia

Medida

(IC 95%)

(4)

1 P2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

Sensibi-

lidade

88.9%

(73.0-96.4)

88.9%

(73.0-96.4)

100%

(82.2-100)

95.7%

(76.0-99.8)

93.2%

(82.7-97.8)

91.5%

(80.6-96.8)

100.0%

(19.8-100.0)

100%

(19.8-100)

Especifi-

cidade

71.3%

(60.4-80.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(55.7-76.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(60.4-80.2)

66.7%

(55.7-76.2)

71.3%

(60.4-80.2)

66.7%

(55.7-76.2)

Tabela 7: Associação das citologias convencional e ICQ (imuno-citoquímica) para o

diagnóstico de lesões cervicais

(1) NIC 1 = Lesão intra-epitelial de baixo grau

(2) NIC 2/3 = Lesão intra-epitelial de alto grau

(3) CA = Carcinoma

(4) Patologista

Discussão

No presente estudo, a sensibilidade e o valor preditivo negativo do método

diagnóstico utilizado mostraram adequado desempenho entre casos de NIC 2/3 e CA.

Tais resultados reproduzem os achados da literatura que abordaram a citologia cervical

com o anticorpo proposto

32-34, 47

• Entre portadoras de lesão precursoras da cérvice, quando avaliadas em

conjunto (NIC 1 + NIC 2/3), o estudo reproduz os achados da literatura

com sensibilidades variando entre 75.4%

até 92.3%

• Entre casos de NIC 1, a sensibilidade do teste diagnóstico foi 77.8% e

58.3% entre os patologistas um e dois respectivamente, acompanhando

parcialmente os achados da literatura onde há variação de 54.3%

até

74.1%

• Estudo de Pientong e cols, publicado em 2003, encontrou sensibilidade

de 33% entre casos de NIC 1, entretanto, foi estudo com limitações

metodológicas, onde as coletas ocorreram apenas com espátula de Ayre,

a diluição do anticorpo foi de 1:400 e não houve confirmação histológica

dos casos

Entre casos de positividade citoplasmática forte ou positividade nuclear, aqui

verificada principalmente entre NIC 2/3 ou CA epidermóide, reproduz os achados da

literatura. Quando a positividade ao anticorpo foi avaliada de forma distinta entre

citoplasma e núcleo, os achados de Saqi e cols foram: sensibilidade de 90% entre NIC

2/3 e 100% entre lesões invasoras

. Já Bibbo e cols, encontraram sensibilidade de

94.4% entre casos de NIC 2/3

Quanto à variação inter-observador, utilizando a metodologia proposta pelo

estudo (ausência de positividade, positividade citoplasmática fraca, forte e positividade

nuclear), há elevada concordância entre casos de NIC 2/3 e teste diagnóstico positivo

nuclear. Da mesma forma, há elevada concordância entre a ausência de lesão e teste

diagnóstico negativo, além da positividade citoplasmática forte entre os dois casos de

lesão invasora. Nestes extremos, a diferença percentual entre os patologistas foi inferior

a 5%.

Já entre casos de NIC 1 e, principalmente utilizando o critério subjetivo da

avaliação citoplasmática, houve importante variação inter-observador. O índice kappa

do estudo alcançou 0.74 apenas quando o critério subjetivo da avaliação citoplasmática

foi afastado. Tais resultados são reproduzidos em recente estudo de Negri e cols

publicado em 2006 que encontrou sensibilidade de 66.6% entre casos de NIC 1 e índice

kappa de 0.77. Destaca-se a exigüidade da amostra utilizada pelo pesquisador citado,

que contou com seis casos de NIC 1.

Entre os dois casos de CA epidermóide, ocorridos na sexta e sétima décadas de

vida, portanto em estado hipoestrínico, a positividade encontrada foi no citoplasma

entre os dois patologistas. Este achado é previsível pela literatura médica, pois o

anticorpo proposto não reage com células degeneradas inclusive de origem neoplásica

Provavelmente a positividade verificada referia-se a tecidos circunjacentes à lesão

Invasora, estando estes ainda em estado precursor.

Quanto aos valores preditivos encontrados no estudo, destaca-se que a ausência

de lesão após o teste diagnóstico negativo ou valor preditivo negativo, variou de 82%

(NIC1 ou >) a 100% (NIC 2 ou >). Para testes diagnósticos de rastreio populacional é

medida indispensável, visto que testes com alto valor preditivo negativo serão seguros

no diagnóstico da ausência de doença em curso. No estudo de Trunk e cols

, o valor

preditivo negativo foi superior a 90% tanto entre casos de NIC 1 (ou superior) quanto

em NIC 2 (ou superior). Já Saqi e cols

, encontraram valores preditivos negativos de

74,2% entre casos de NIC 1 (ou superior) e 96,8% entre casos de NIC 2 (ou superior).

A utilização dos achados conjuntos das citologias convencional e ICQ foi

proposta com o objetivo da elucidação de casos falso-negativos da primeira:

• Verifica-se que os dois casos de carcinoma epidermóide encontravam-se

entre citologias convencionais diagnosticadas como normais ou com

alterações atípicas de origem escamosa / glandular.

• No mesmo grupo (citologias convencionais diagnosticadas como

normais ou atípicas escamosas / glandulares) também se encontravam

treze NIC 2/3 conforme o patologista um e doze NIC 2/3 conforme o

patologista dois.

• Em comum, todos estes casos possuíam positividade para o anticorpo

anti-p16ink

• Em recente revisão da literatura, não se encontra associação semelhante

para comparações.

O presente estudo não avaliou a presença do HPV na amostra selecionada, que

colaboraria para a elucidação de casos duvidosos:

• A positividade citoplasmática encontrada entre 10 e 14 pacientes sem

lesão cervical conforme o patologista um e dois respectivamente;

• Os casos de NIC 1 que se apresentaram com maior discordância entre os

observadores e associado à sensibilidade inferior do método.

Importante destacar que, contrariamente ao citado na literatura médica, o uso do

anticorpo anti-p16ink

não apresentou dificuldades de difusão no esfregaço, citado

como limitador entre estudos que não empregaram a citologia de meio líquido

. Ou

seja, o anticorpo anti-p16ink

foi considerado, pelos autores, como teste factível para o

rastreamento de lesões cervicais precursoras ou neoplásicas.

Figura 6 : Exemplos de positividade ao anticorpo anti-p16ink

Figura 6B: Citologia cervical em

grande aumento com positividade

citoplasmática para o anti-p16ink

célula epitelial cervical com

macronucleose.

Figura 6C: Citologia cervical em

grande aumento com grupamento

celular positivo para o anti-p16ink

discariose

Figura 6A: Citologia cervical em

médio aumento com célula positiva

para o anticorpo anti-p16ink

100

Figura 6D: Citologia cervical em

médio aumento com célula epitelial

positiva para o anti-p16ink

Figura 6E: Citologia cervical em

grande aumento com célula epitelial

positiva para o anti-p16ink

discariose.

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105

Conclusões

Respondendo aos objetivos propostos nesta pesquisa:

• O anticorpo anti-p16ink

, avaliado quanto a sua expressão em

citologia cervical, revelou-se adequado para o estudo proposto. Não

foi verificado inadequação para difusão do anticorpo nas lâminas de

citologia cervical coletadas da forma convencional (não-meio

líquido).

• O uso do anticorpo em citologia cervical permitiu a elucidação de

casos falso-negativos rastreados pela citologia Papanicolaou.

• Obteve adequada sensibilidade e valor preditivo negativo

principalmente entre lesões intra-epiteliais de alto grau e carcinomas

epidermóides cervicais, seguindo os achados da literatura médica.

• Verificou-se menor sensibilidade quando utilizado entre casos de

NIC 1.

• Quanto à variação inter-observador na leitura das lâminas, o uso do

anticorpo proposto apresentou-se com adequado índice kappa

principalmente entre as lesões intra-epiteliais de alto grau e

carcinomas epidermóides cervicais.

106

Considerações finais e perspectivas

O presente estudo abordou uma lacuna da literatura médica quanto ao uso

do anticorpo anti-p16ink

. Citologia cervical coletada de forma convencional e a

confirmação dos achados a partir do exame padrão-ouro: biópsia diagnóstica

dirigida pela colposcopia.

A grande dificuldade logística em realizar rastreamento populacional para o

câncer cervical, associada à carência de recursos públicos e a baixa adesão às

campanhas governamentais, deverá motivar os pesquisadores nos estudos futuros.

Vislumbramos a auto-coleta domiciliar do exame de rastreamento cervical e

a sua interpretação utilizando métodos de alta sensibilidade e especificidade, como

o futuro para o diagnóstico das lesões precursoras ou invasoras do colo uterino.

Os autores desejam que este estudo sirva de estímulo para a reflexão dos

objetivos desejados por todos: Diagnóstico precoce das lesões precursoras

cervicais, tratamento não mutilador e, finalmente, redução da mortalidade entre os

casos de neoplasia cervical.

O presente trabalho foi exposto na forma de Pôster no II Simpósio Regional

de Genitoscopia, com resultados preliminares, nos dias 25 a 29 de outubro de 2006.

Recebeu titulação de Menção Honrosa na Classificação Geral dos Painéis

pela abordagem inovadora no rastreamento cervical utilizando citologia

convencional.

Com a grande base de dados obtida, a partir da amostragem de duzentas e

oitenta e sete pacientes, e os resultados promissores encontrados, duas novas

publicações estão previstas:

107

1. “Anticorpo anti-p16ink

em Atipias Escamosas de Significado

Indeterminado (ASC-US)”

2. “Variação inter-observador em biópsias cervicais coradas com o

anticorpo anti-p16ink

”

108

Anexo A: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido:

Consentimento Informado

Título do Projeto: Pesquisa do Anticorpo anti-p16ink

em Citologia Cervical

Investigador: Alexandre Rocha – Médico Ginecologista e Obstetra da Secretaria da Saúde

do Município de Porto Alegre, Matrícula 77373-9 e CRM 21858, aluno da pós-graduação

em Ciências Médicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Orientadoras: Prof. Dra. Maria Isabel Edelweiss e Prof. Dra. Mary Clarisse Bozzetti.

Eu, ___________________________________ fui informada dos objetivos da

pesquisa acima identificada de maneira clara e detalhada. Recebi informações a respeito da

minha inclusão na referida e esclareci minhas dúvidas. Fui informada que, a qualquer

momento, poderei solicitar novas informações e modificar minha decisão. O investigador

Dr. Alexandre Rocha CRM 21858 – médico Ginecologista e Obstetra certificou-me que

todos os dados desta pesquisa serão confidenciais, bem como o seguimento de minha

doença cervical (colo uterino), se presente, não sofrerá alteração pela minha inclusão ou

exclusão no grupo estudo ou grupo controle.

Justificativa do estudo: Melhorar a capacidade de detecção das alterações cervicais

(colo uterino) a partir do exame “preventivo” ou citopatológico;

Procedimento utilizado: Coleta do exame “preventivo” do colo uterino da forma

tradicional que envolve uma “raspagem” da região cervical, utilizando espátula de madeira

e escova tipo cytobrush individuais e descartáveis; Para tanto será utilizado espéculo

vaginal. O material assim obtido será encaminhado a laboratório para avaliação

microscópica. Casos especiais de suspeita de lesões no colo uterino será indicado a

realização de biópsia local que consta de retirada, por meio de cirurgia (de pequeno porte

com broca tipo “Baliu”), de um fragmento do colo uterino que medirá aproximadamente

0,4cm de diâmetro (menos da metade de um centímetro) com o objetivo de diagnóstico da

lesão suspeita. Tal procedimento se efetuará sob anestesia local com lidocaína a 2%

infiltrativa sem vasoconstritor.

Riscos dos procedimentos: Poderá haver desconforto momentâneo pelo uso do

espéculo vaginal. A coleta do citopatológico (“preventivo”), poderá ocasionar sangramento

no local de “raspagem”. A retirada do fragmento de biópsia poderá ocasionar dor local e

sangramento após a realização do procedimento, geralmente de pequena monta e revertidos

com analgesia (remédios para dor) e compressão local (bucha de gazes estéreis no fundo

vaginal para evitar sangramento no local de biópsia). Não há evidências na literatura

médica atual de riscos a longo prazo com estes procedimentos, tipo: infertilidade

(dificuldade em engravidar), aumento no número de abortos (“perdas” de gravidez no

futuro), dispareunia (dor nas relações sexuais), diminuição da libido (diminuição da

vontade de manter relações sexuais).

Benefícios esperados: Reavaliar o exame “preventivo” com uma substância corante

especial (marcador) durante a interpretação no laboratório e definir sua possível utilização

rotineira no futuro; com a biópsia do colo uterino (fragmento), temos o exame “de certeza”

para a presença ou não de lesões malignas ou pré-malignas do colo uterino.

Métodos alternativos existentes: Não há na literatura médica atual, método eficaz

para melhorar a resolução do exame “preventivo”, as técnicas atualmente sugeridas são de

109

caráter experimental. Não há substituto para as biópsias do colo uterino quanto ao

diagnóstico “de certeza” das lesões.

Formas de acompanhamento: As pacientes serão seguidas por demanda espontânea

(volta à unidade voluntariamente conforme orientado) ou busca ativa (chamamento da

paciente a unidade) principalmente quando suspeita de doença no colo do útero);

Compensação Financeira: Não haverá nenhum tipo de pagamento às mulheres que

concordarem em participar do estudo.

Custos para paciente: Não haverá custo monetário para as participantes do estudo.

Todos os materiais utilizados estão discriminados no protocolo do estudo e foram quitados

pelo patrocinador.

Perguntas e dúvidas relacionadas ao estudo: Este termo de consentimento explica

de forma clara o estudo que estamos propondo e convidando as mulheres a participar; no

entanto, se houver alguma dúvida, estas serão esclarecidas diretamente pelo investigador,

Dr. Alexandre Rocha pelo telefone 33363284 e pela pesquisadora responsável, Dra. Maria

Isabel Edelweiss pelo telefone 21018000 ramal 8013 ou 8334.

Em casos de danos à paciente: Se a participante do estudo acha que teve algum

problema de saúde relacionado com a sua participação, deverá contatar o investigador, Dr.

Alexandre Rocha pelo telefone 33363284.

Recebi segunda via assinada, de igual teor desta, no dia de hoje.

______________________ _______________________

Assinatura da paciente Assinatura do investigador

Carimbo

Porto Alegre, _____ de ______________de 20____

110

Anexo B: Documento de Inclusão no Estudo:

Documento de Inclusão

Anticorpo anti-P16ink

em citologia cervical

Nome_________________________________________ DN____/____/_____

Endereço_______________________________________Bairro____________

Sexarca__________anos, DSTs no Passado: □ não, □ sim qual__________

Gesta____/Parto____/Aborto_____/Cesariana_______

Menopausada: □ não, □ sim, terapia de reposição hormonal?_________

Método contraceptivo Atual______________________,

Escolaridade___________________

No de parceiros sexuais na vida:_________, nos últimos 12 meses_______

Tabagismo: □ não, □ sim, quantos/dia__________

Motivo do encaminhamento_____________________________________

Último CP do colo uterino_____________________, data____/____/____

Outros:_____________________________________________________

1) Colposcopia em ____/____/____

2) Coleta do Citopatológico em ____/____/____

Lâmina de citopatológico Papanicolaou número________________

Diagnóstico ____________________

Lâmina de citopatológico ICQ número____________________

Diagnóstico patologista 1___________________________________

Diagnóstico patologista 2__________________________________

3) Exame Histológico do colo uterino em ____/____/____

Diagnóstico______________________________________________________

_____________________________________________

111

Anexo C: Técnica LSAB para Imunocitoquímica:

1) Lâminas coletadas com preparo prévio de aminopropil-triephosy-silane (Sigma

Chemical Corporation);

2) Amostra submetida à rehidratação com álcool etílico absoluto (quatro banhos) e

lavagem com solução salina tamponada (SST) em pH 7,4 por cinco minutos;

3) Recuperação de epítopos pelo calor úmido (SST de citrato em pH 6,4 por três

minutos em forno de microondas);

4) Bloqueio de reações inespecíficas com leite desnatado diluído em água destilada;

5) Tratamento com peróxido de hidrogênio a 3% diluído em SST por cinco minutos,

para bloqueio da peroxidase endógena;

6) Incubação com o anticorpo monoclonal anti-p16ink

clone G175-405 fornecido

pela Pharmingen / BD Biosciences do Brasil diluição 1:100, por tres horas;

7) Incubação por trinta minutos com complexo ligação-imunoglobulinas biotiniladas

anti-coelho, anti-camundongo e anti-carneiro pré-diluidas em SST;

8) Incubação por trinta minutos com complexo estreptavidina peroxidase;

9) Tratamento das lâminas para visualização da reação com solução 3,3-tetra-

hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) na concentração de 1mg/ml em SST de

citrato e solução de H2O2 a 5% por duas vezes de 20 minutos. As lâminas são

contra-coradas com hematoxilina de Harris por 20 segundos;

10) Desidratação com banhos de álcool etílico absoluto (cinco banhos) e xilol (3

banhos);

11) Montagem das lâminas com bálsamo e lamínula;

(*) Todos os passos da reação ICQ são realizados à temperatura ambiente com exceção

da etapa de recuperação antigênica, realizada em forno de microondas. Entre cada

passo da reação, antes do uso do DAB, as lâminas são lavadas varias vezes com SST

(pH 7,4) e, após o uso do DAB, as lavagens são feitas com água comum.

(*) Controle positivo para o anticorpo anti-p16ink

: Peça de histologia de carcinoma

cervical sabidamente positivo para o anticorpo . Controle negativo: Mesma lâmina

anterior sem a incubação do anticorpo primário.

112

Anexo D: Técnica de Papanicolaou

1. Hidratação: Deslocamento gradual do álcool de fixação no esfregaço pelo uso de

álcool em solução diluída a 80%, 70% e 50% em água destilada, seis a oito

mergulhos.

2. Coloração nuclear: Hematoxilina de Harris não acidificada por seis minutos

(corante com afinidade pela cromatina), pelo método regressivo

3. Remoção do excesso de hematoxilina com acido hidroclórico

4. Desidratação: Etanol 50% até 95% em quatro banhos

5. Coloração citoplasmática com contra-corantes: utilizar o Orange G (corante da

queratina na cor laranja) seguindo-se do EA36 (cora o citoplasma de células

metabolicamente ativas).

6. Clareamento: xilol que resultará na transparência celular

7. Montagem: Bálsamo do Canadá

113

Anexo E: Classificação Citológica de Bethesda 2001

1) Tipo da amostra: convencional, meio líquido.

2) Avaliação da amostra:

2.1) Satisfatória: com representação da zona de transformação, sem representação

da zona de transformação, parcialmente obscurecida por sangue ou inflamação,

artefatos.

2.2) Não satisfatória: rejeitada, não processada por (...); processada e examinada,

não satisfatória por (...)

3) Negativa para lesão intraepitelial ou neoplasia maligna: Alterações celulares

reativas associadas a inflamação, radiação DIU e outras; microorganismos tipo

tricomonas, fungos, sugestivo de vaginose bacteriana, actinomyces, alterações

sugestivas do herpes simplex; atrofia; células glandulares pós-histerectomia

4) Anomalias em células epiteliais:

4.1) Anomalias em células pavimentosas: células pavimentosas atípicas de

significado indeterminado (asc-us), células pavimentosas atípicas não se podendo

excluir lesão intraepitelial de alto grau (asc-h), lesão intraepitelial de baixo grau l-Sil

(inclui: HPV, displasia “suave”, nic 1) e lesão intraepitelial de alto grau h-Sil (inclui:

114

displasia moderada e grave, nic II, nic III ou carcinoma in-situ); carcinoma pavimento–

celular (epidermóide)

4.2) Anomalias em células glandulares: células atípicas (agc), endocervicais,

endometriais ou “sem outra especificação” (SOE); células atípicas sugestivas de

neoplasia, endocervicais ou SOE; provável adenocarcinoma in-situ do endocolo (AIS)

e adenocarcinoma, SOE, endocervical, endometrial, extra-uterino.

5) Outra neoplasia maligna: especificar

6) Ausência de lesão intraepitelial, com presença de células endometriais.

115

Anexo F: Classificação Colposcópica da Federação Internacional de Patologia

Cervical e Colposcopia aprovada em 2002:

I. Achados Colposcópicos Normais: Epitélio Escamoso Original, Epitélio Colunar, Zona

de Transformação;

II. Achados Colposcópicos Anormais:Epitélio acetobranco plano, Epitélio acetobranco

denso, Mosaico fino, Mosaico grosseiro, Pontilhado fino, Pontilhado grosseiro, Iodo

Parcialmente positivo, Iodo Negativo, Vasos atípicos;

III. Alterações colposcópicas sugestivas de câncer invasivo:

IV. Colposcopia insatisfatória: Junção Escamo-colunar não visível, Inflamação severa,

atrofia severa, trauma, Cérvice não visível;

V. Miscelânea: Condiloma, Queratose, Erosão, Inflamação, Atrofia, Deciduose, Pólipo;

Características colposcópicas sugestivas de alterações metaplásicas: superfície lisa com vasos

finos, de calibre uniforme, alterações acetobrancas leves, iodo negativo ou parcialmente positivo

com solução de Lugol.

Características colposcópicas sugestivas de alterações de baixo grau (alterações menores):

superfície lisa com borda externa irregular. Alteração acetobranca leve, que aparece lentamente e

desaparece rapidamente. Iodo negativo, freqüentemente com parcial captação de iodo positivo.

Pontilhado fino e mosaico fino regular.

Características colposcópicas sugestivas de alterações de alto grau (alterações maiores):

Superfície lisa com borda externa bem marcada. Alteração acetobranca densa, que aparece

rapidamente e desaparece lentamente; podendo apresentar um branco nacarado que lembra o de

ostra. Iodo negativo (coloração amarelo-mostarda) em epitélio densamente

116

acetobranco. Pontilhado grosseiro e mosaico de campos largos e irregulares e de tamanhos

diferentes. Acetobranqueamento denso no epitélio colunar pode indicar doença glandular.

Características colposcópicas sugestivas de câncer invasivo: Superfície irregular, erosão, ou

ulceração. Acetobranqueamento denso. Pontilhado grosseiro e irregular e mosaico grosseiro de

campos largos desiguais. Vasos atípicos.

117

Anexo G: Critérios de Richart para o diagnóstico histopatológico cervical:

NIC 1 (lesão intra-epitelial de baixo grau):

A maturação está presente nos 2/3 superiores do epitélio, embora núcleos anormais possam

existir em toda a espessura epitelial. As células superficiais poderão apresentar efeito

citopático viral (coilócito). Há alteração nuclear no epitélio principalmente no terço basal.

Mitoses poderão estar presentes, porém restritas a camada basal e serão típicas. Poderá

haver disceratose

NIC 2 e NIC 3 (lesão intra-epitelial de alto grau):

NIC 2: A maturação estará presente na parte superior do epitélio. As mitoses poderão estar

presentes nos dois terços inferiores epiteliais. A presença de coilócitos é menos freqüente e

as atipias nucleares mais pronunciadas, além da disceratose.

NIC 3: a maturação poderá estar presente apenas na porção superior do epitélio. As

alterações nucleares serão intensas e distribuídas por toda a extensão epitelial. As mitoses

serão numerosas, sendo encontradas em toda espessura do epitélio. Poderá haver mitoses

atípicas.

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