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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Comunidades de fungos micorrízicos arbusculares no solo e raízes de
cana-de-açúcar
Lucas Carvalho Basilio de Azevedo
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Solos e Nutrição de
Plantas
Piracicaba
2008
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Lucas Carvalho Basilio de Azevedo
Engenheiro Agrônomo
Comunidades de fungos micorrízicos arbusculares no solo e raízes de cana-de-açúcar
Orientador:
Prof. Dr. MÁRCIO RODRIGUES LAMBAIS
Tese apresentada para a obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Solos e Nutrição de
Plantas.
Piracicaba
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Azevedo, Lucas Carvalho Basilio de
Comunidades de fungos micorrízicos arbusculares no solo e raízes de cana-de-açúcar /
Lucas Carvalho Basilio de Azevedo. - - Piracicaba, 2008.
110 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Cana-de açúcar 2. Ecologia do solo 3. Micorriza 4. Raízes 5. Sequenciamento genétic
o
I. Título
CDD 633.61
A994c
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
DEDICO
A Deus;
Aos meus pais, Marlene e Erasmo, aos meus irmão, Mateus, Ana Julia e Maria Luiza;
Aos meus avós, tios e tias;
Pelo apoio e incentivos recebidos, sendo essenciais para essa etapa de minha vida.
4
AGRADECIMENTOS
Eu gostaria de agradecer ao CNPq pela bolsa no início do Curso, à FAPESP pela bolsa
concedida no restante do curso, e à CAPES pela concessão da bolsa de estudo para estágio no
exterior por 5 meses.
Ao Prof. Dr. Márcio Rodrigues Lambais, pela orientação e incentivo ao longo do curso.
Ao Dr. Prof. Ari Jumpponen (Kansas State University, Manhattan, KS, USA), por ter me
acolhido e me recebido nos EUA, pela amizade, pela sua constante confiança em nosso trabalho e
pelo seu incentivo à vida profissional.
Ao Dr. Prof. Sidney Luiz Stürmer por ter realizado o árduo trabalho de identificação dos
esporos de FMAs, parte essencial desse trabalho.
Ao Dr. Prof. Francisco de Sousa, por disposição em ajudar com discussões e
esclarecimentos sobre os trabalhos pela internet.
À Prof. Dra. Elke J.B.N. Cardoso pela concessão do material do laboratório de
Microbiologia do Solo e material da Coleção de FMAs, além do constante apoio, disposição para
atender aos alunos e pela confiança depositada em mim.
À parte essencial de minha vida, portanto, desse trabalho também:
Meu Pai Erasmo, minha Mãe Marlene, meus irmãos Mateus, Ana Julia e Maria Luiza, aos
meus avós Florinda, Naziozeno (in memorian) e Quitéria, aos meus tios Maria Elena, Malu,
Ismael (in memorian), Raquel, Israel e Maria Aparecida que sempre me incentivaram,
acreditando e investindo em mim.
Agradeço especialmente à Simone, por sua confiança, apoio, paciência e por sua
companhia e incentivo.
Aos técnicos dos laboratórios de Microbiologia Luis Fernado Baldesin, Wladimir
Rosignolo e, especialmente, à Denise de Lourdes C. Mescolotti pela ajuda nos experimentos em
laboratório.
Ao Dr. José Pereira Silva Júnior, pela amizade, esclarecimentos e ajuda na elaboração do
projeto.
Aos colegas e amigos durante a jornada de doutorado: Adriano Lucheta, Alessandra de
Paula, Alexandre Martines, André Nakatani, Carolina Baretta, Christie Monteiro, Daniel
Lammel, Daniele Takahashi, Denise Santos, Dilmar Baretta, Eduardo Armas, Elaine Malosso,
5
Flávio Alves, Flávio de Paula, Gisele Lopes, Giselle Gomes, Hélio, Jackson Lange, Juliano Cury,
Karina Cenciani, Luiz Fernando Romanholo, Magnus, Marcela Arnaldo, Márcio Morais, Pablo
Hardoim, Rafael Armas, Rafael Leal, Rafaela, Robinson Moresca, Simão Lindoso, Sandra,
Soraya Kiriachek, Winston, todos estagiários e demais amigos não mencionados aqui.
Aos amigos que encontrei e que me acolheram em Manhattan: Adelaide, Altair, Ana,
Anand, Daniel, Dave, David, Fellipe, Flávia, German, Greg, Keerthi, Lia, Leila, Lorena, Maria,
Michael, Nicolas, Renata, Thais, William
6
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................ 8
ABSTRACT .................................................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 10
2 DESENVOLVIMENTO ............................................................................................................. 12
2.1 Revisão bibliográfica ............................................................................................................... 12
2.1.1 Micorrizas Arbusculares ....................................................................................................... 12
2.1.2 Estudo de comunidades de fungos micorrízicos arbusculares.............................................. 13
2.1.3 Taxonomia e identificação molecular de fungos micorrízicos arbusculares ........................ 16
2.2 Material e métodos .................................................................................................................. 19
2.2.1 Comparação dos métodos de extração de DNA das raízes .................................................. 19
2.2.2 Amplificação do gene rRNA 18S de grupos específicos de FMAs ..................................... 24
2.2.3 Estrutura da comunidade de FMAs em raízes e solo rizosférico de cana-de-açúcar sob
diferentes manejos de colheita ....................................................................................................... 27
2.2.3.1 Análises químicas do solo ................................................................................................. 28
2.2.3.2 Extração de esporos de FMAs do solo .............................................................................. 29
2.2.3.3 Colonização micorrízica intrarradicular ............................................................................ 29
2.2.3.4 Análise do gene rRNA 18S fúngico em raízes de cana-de-açúcar .................................... 30
2.2.3.4.1 Amplificação do gene rRNA 18S de fungos gerais e FMAs .......................................... 30
2.2.3.4.2 Amplificação do gene rRNA 18S de grupos específicos de FMAs em cana-de-açúcar 31
2.2.3.4.3 Purificação dos amplicons .............................................................................................. 32
2.2.3.4.4 Clonagem dos amplicons do gene rRNA 18S ................................................................ 33
2.2.3.4.5 Extração do DNA plasmidial .......................................................................................... 33
7
2.2.3.4.6 Sequenciamento dos clones do gene rRNA 18S ............................................................ 34
2.2.3.4.7 Análise de sequências do gene rRNA 18S ..................................................................... 35
2.3 Resultados e Discussão ............................................................................................................ 36
2.3.1 Comparação dos métodos de extração de DNA das raízes .................................................. 36
2.3.2 Desenho e validação de iniciadores específicos para grupos de FMAs ............................... 41
2.3.3 Estrutura da comunidade de FMAs em raízes e solo rizosférico de cana-de-açúcar sob
diferentes manejos de colheita ....................................................................................................... 56
2.3.3.1 Atributos químicos do solo ................................................................................................ 56
2.3.3.2 Produtividade da cana-de-açúcar ....................................................................................... 59
2.3.3.3 Fungos micorrízicos arbusculares no solo ......................................................................... 60
2.3.3.4 Colonização micorrízica intrarradicular ............................................................................ 70
2.3.3.5 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS7e F1Ra em raízes de
cana-de-açúcar ............................................................................................................................... 73
2.3.3.6 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS31 e AM1 em raízes de
cana-de-açúcar ............................................................................................................................... 78
2.3.3.7 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores específicos para grupos de
FMAs em raízes de cana-de-açúcar ............................................................................................... 83
3 CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 100
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 101
8
RESUMO
Comunidades de fungos micorrízicos arbusculares no solo e raízes de cana-de-açúcar
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs, filo Glomeromycota) formam associações
simbióticas com a maioria das plantas vasculares. Normalmente, as hifas dos FMAs crescem no
solo e colonizam o interior das raízes. No entanto, não se sabe se as espécies mais abundantes
detectadas no solo, por meio da identificação com base na morfologia dos esporos assexuais, são
também as mais abundantes no interior das raízes, devido às dificuldades para a identificação dos
FMAs com base nas estruturas intrarradiculares. Assim, o objetivo do presente trabalho foi
avaliar a estrutura da comunidade de FMAs em cana-de-açúcar sob dois manejos de colheita por
meio da identificação das espécies que estão no solo na forma de esporos assexuais e aquelas que
estão nas raízes usando o sequenciamento de clones do gene rRNA 18S. Amostras de solo e
raízes de cana-de-açúcar de três variedades e dois manejos de colheita: SEM QUEIMA prévia e
COM QUEIMA prévia à colheita, foram coletadas em um experimento localizado no município
de Novo Horizonte, SP. Foram utilizadas três abordagens para a identificação dos FMAs no
interior das raízes: emprego de (1) iniciador específico para fungos em geral, (2) iniciador
específico para FMAs e (3) iniciadores específicos para grupos de FMAs. O número de esporos
por 50 g de solo, a riqueza de espécies observada e estimada e a diversidade de esporos não
diferiram significativamente entre os manejos SEM QUEIMA e COM QUEIMA. Efeitos
significativos de variedades de cana-de-açúcar ou na interação dos fatores manejo e variedade
não foram observados. A análise de ordenação com base nos esporos identificados também não
indicou separação das amostras em função dos tratamentos. Entretanto, plantas do tratamento sob
manejo SEM QUEIMA apresentaram as maiores taxas de colonização micorrízica arbuscular,
quando comparadas às plantas do tratamento sob manejo COM QUEIMA. Esses dados indicam
que a taxa de colonização micorrízica arbuscular é um indicador mais sensível à mudança de
manejo de colheita da cana-de-açúcar do que os outros indicadores avaliados. Após a extração de
DNA das raízes, o uso dos iniciadores específicos para fungos em geral, para FMAs e iniciadores
específicos para grupo de FMAs não resultou em sequências de Glomeromycota. Mesmo assim, a
comunidade de fungos associados às raízes detectada por sequenciamento do gene rRNA 18S foi
avaliada. Os resultados indicam que a estrutra da comunidade fúngica associada às raízes de
cana-de-açúcar diferiu significativamente entre os manejos de colheita SEM QUEIMA e COM
QUEIMA prévia, apesar de não haver diferenças na riqueza e índices de diversidade de unidades
taxonômicas operacionais observadas. Em geral, estudos adicionais devem ser feitos para
otimizar as condições para amplificação do gene rRNA 18S de FMAs para melhor entender a
ecologia dos mesmos.
Palavras-chave: Micorriza arbuscular, rRNA18S, Ecologia, Fungos
9
ABSTRACT
Arbuscular mycorrhizal fungi communities in soil and sugarcane roots
Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF, Glomeromycota) form mutualistic symbioses with
most land plants. AMF hypha generally grow through the soil and colonize the cortical tissue of
the plant roots. However, it is not known whether the most abundant species in the soil,
determined based on the morphology of asexual spores are the most abundant inside the roots,
due the difficulties in identifying AMF based on intraradical structures. Therefore, the aim of this
study was to evaluate the AMF community structure in sugarcane rhizosphere and roots under
two harvesting managements, based on spores in the soil and sequencing of 18S rRNA gene
clones, respectively. Sugarcane rhizosphere soil and roots were sampled from three varieties,
under two harvesting managements: without pre-harvesting burning and with pre-harvesting
burning, at an experimental field located in Novo Horizonte (São Paulo, Brazil). Three
approaches were used to identify AMF inside the roots: (1) using fungi-specific primers, (2)
using AMF-specific primers and (3) using AMF group-specific primers. The number of spores in
the soil, the observed and estimated species richness and the diversity of AMF spores in the
treatments without and with pre-harvesting burning were not statistically different. Statistically
significant effects of sugarcane varieties or the interaction of the factors Harvesting Management
and Varieties were not observed. Ordination analysis based on the identified spores did not show
clustering by treatments. However, intraradical root colonization rates were higher in the
treatment without pre-harvesting burning, as compared to the treatment with pre-harvesting
burning. These data indicate that intraradical colonization rate may be used as a more sensitive
indicator of environmental changes due to harvesting management, as compared to the other
indicators evaluated. The use of fungi-specific, AMF-specific and AMF group-specific primers
did not allow the detection of Glomeromycota in the sugarcane roots sampled from the field
experiment. Nonetheless, the fungal communities associated with sugarcane roots detected by
18S rRNA gene clone sequencing were evaluated. The results indicate that the fungal
communities associated with sugarcane roots from the treatments without and with pre-harvesting
burning were statistically different, even though no differences in operational taxonomic unit
richness and diversity indices were observed. In general, additional studies are necessary to
optimize AMF 18S rRNA gene amplification for a better understanding of their ecology.
Keywords: Arbuscular mycorrhiza; 18S rRNA; Ecology; Fungi
10
1 INTRODUÇÃO
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) formam associações simbióticas com a
maioria das plantas vasculares terrestres (SMITH; READ, 1997), incluindo algumas de
importância econômica para o homem (O’CONNOR; SMITH; SMITH, 2002). A associação
micorrízica geralmente propicia melhor desenvolvimento vegetal devido ao aumento de absorção
de água e nutrientes, principalmente fósforo (P) pelas hifas do FMA. O fungo recebe, em troca,
fotoassimilados e fatores de crescimento necessários para completar o seu ciclo de vida (SMITH;
BARKER, 2002).
Entre as plantas que formam micorrizas arbusculares, está a cana-de-açúcar, uma cultura
de grande importância econômica no Brasil (MAPA, 2008). A expansão das áreas cultivadas com
cana-de-açúcar tem sido incentivada pelo interesse na produção de álcool para uso como
combustível alternativo. Previamente à colheita, parte dessa área cultivada é queimada, podendo
contribuir para o aumento de gases poluentes e responsáveis pelo efeito estufa. Assim, a prática
de colheita da cana-de-açúcar sem queima vem ganhando interesse, por causar menores impactos
ambientais. No entanto, os efeitos dessa alteração do manejo da cultura de cana-de-açúcar sobre a
microbiota dos solos são poucos conhecidos.
O uso da microbiota edáfica como indicador de impactos ambientais tem sido
extensivamente discutidos (NIELSEN; WINDING, 2002; LAMBAIS et al., 2005; BUNEMANN;
SCHWENKE, G.D.; VAN ZWIETEN, 2006; FLIEßBACH et al., 2007; FRANCHINI et al.,
2007). Nesse contexto, alterações na estrutura da comunidade de FMAs poderiam ser indicadores
de estresses ambientais. No entanto, para o eficiente uso dos FMAs como indicadores de
estresses ambientais, é necessário identificar as espécies presentes no ecossistema, tanto em
associação com o vegetal como no solo. A identificação dos FMAs é normalmente feita com base
na morfologia dos esporos, pois as estruturas intrarradiculares de diferentes espécies não podem
ser diferenciadas morfologicamente. O uso de técnicas moleculares é uma alternativa para
superar essas dificuldades e viabilizar o estudo da ecologia dos FMAs. Para a investigação de
comunidades de FMAs, iniciadores específicos para amplificar fragmentos do gene rRNA e/ou
espaços intergênicos têm sido usados (HIJRI et al., 2006; SANTOS-GONZÁLEZ; FINLAY;
TEHLER, 2007; LEE; LEE; YOUNG, 2008).
Entretanto, a amplificação de fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs por PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase) ainda é limitada, pois os iniciadores existentes não amplificam o DNA
11
de todos os organismos do filo Glomeromycota. Essa ineficiência pode ser resultado do baixo
número de sequências do gene rRNA 18S disponíveis para o desenho de iniciadores específicos.
Alternativamente, se iniciadores mais genéricos fossem usados, a aplicação dos métodos de
sequenciamento em larga escala do gene rRNA 18S (rDNA) de amostras ambientais poderia
contornar o problema de especificidade dos iniciadores.
Assim, os objetivos deste estudo são: (1) avaliar métodos de extração de DNA e
desenvolver métodos de amplificação por PCR e sequenciamento de clones de fragmento do gene
rRNA 18S para a análise de comunidades de FMAs; (2) investigar a diversidade e a estrutura das
comunidade de FMAs no solo rizosférico e raízes de cana-de-açúcar, utilizando a técnica
desenvolvida neste estudo em condições de campo e, (3) determinar os efeitos da queima da
cana-de-açúcar prévia à colheita na diversidade e estrutura das comunidades de FMAs.
12
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão bibliográfica
2.1.1 Micorrizas Arbusculares
As micorrizas arbusculares (MAs) são associações entre certos fungos do solo e uma
grande parte das plantas vasculares. Esta associação é encontrada em cerca de 70% de espécies
vegetais, e está distribuída em vários ecossistemas terrestres (SMITH; READ, 1997). As MAs
têm importância para a nutrição vegetal, e ocorrem na maioria das espécies cultivadas pelo
homem (BURROWS; PFLEGER, 2002; O’CONNOR; SMITH; SMITH, 2002).
Os FMAs pertencem ao filo Glomeromycota, classe Glomeromycetes, a qual possui 4
ordens, 10 famílias e 13 gêneros, com aproximadamente 180 espécies descritas (SCHÜSSLER,
2008). Esses fungos colonizam o córtex das raízes crescendo inter- e intracelularmente. Em certo
momento da simbiose há uma intensa divisão dicotômica do ápice da hifa no interior de células
corticais, formando o arbúsculo, estrutura possivelmente responsável pela troca de nutrientes
entre os simbiontes (BONFANTE-FASOLO, 1984). Em estádios mais tardios da colonização há
formação de vesículas, estruturas intrarradiculares com suposta função de reserva de lipídios, e
formação de esporos no solo ou no interior das raízes.
Os FMAs, em associação com o vegetal, conectam o solo com as raízes, aumentando o
volume de solo explorado, e ultrapassando a zona de depleção de alguns nutrientes. Assim, os
benefícios nutricionais são proporcionados pela maior absorção de elementos minerais,
especialmente aqueles pouco móveis no solo, como P, além de Zn e Cu (COLOZZI-FILHO;
BALOTA, 1994; SIQUEIRA, 1996). Dessa forma, em consequência da melhoria do estado
nutricional da planta, a associação micorrízica pode trazer uma série de benefícios para o
hospedeiro vegetal, como a redução dos estresses de origem biótica e abiótica (QUILAMBO et
al., 2005; COLLA et al., 2008) e aumento da taxa fotossintética (SHENG et al., 2008). Há
evidências de que as MAs aumentam também a absorção de água (ALMEIDA, 1985; AL-
KARAKI; MCMICHAEL; ZAK, 2004; AUGÉ et al., 2004), conferindo às plantas maior
tolerância ao estresse hídrico. O micélio crescendo no solo contribui para o aumento da
agregação das partículas do solo, por meio do enovelamento das hifas e produção de glomalina
(NÓBREGA et al., 2001). A intensidade e a qualidade dos efeitos das MAs nas plantas e solo
13
dependem da interação entre os genomas da planta, do fungo, e destes com o ambiente. Porém,
em condições de baixa disponibilidade de nutrientes, principalmente P, a maior eficiência
simbiótica promove uma maior conservação de nutrientes no agroecossistema. Sendo a simbiose
mutualista, os FMAs também se beneficiam, recebendo fotoassimilados que necessitam para
completar seu ciclo de vida. Dessa forma, a base do mutualismo das MAs é a transferência
bidirecional de nutrientes entre os simbiontes (SMITH; BARKER, 2002).
As MAs são especialmente importantes nos ecossistemas de regiões tropicais, uma vez
que nos solos dessas regiões, boa parte do P está fortemente associada a óxidos de ferro e
alumínio, acarretando uma baixa disponibilidade para as plantas. O estudo da ecologia dos FMAs
nos solos apresenta, no entanto, uma série de limitações, impostos principalmente pela
impossibilidade de se cultivar os FMAs in vitro.
2.1.2 Estudo de comunidades de fungos micorrízicos arbusculares
Os estudos de comunidades de FMAs tem aumentado ao longo dos anos (KOYDE;
MOSSE, 2004) em face dos efeitos benéficos das MAs para a nutrição das plantas e para a
conservação de ecossistemas. Segundo demonstrado por Heijden et al. (1998), o aumento da
riqueza de espécies de FMAs no solo aumenta a diversidade vegetal, a entrada de nutrientes e a
produtividade do ecossistema. Por outro lado, existem indicativos de que a comunidade vegetal
também pode influenciar as comunidades de FMAs (JOHNSON et al., 2003). Por suas funções
nos ecosistemas, as comunidades de FMAs podem ser usadas para monitorar alterações na
qualidade do solo em função de eventos de práticas de manejo agrícola (NIELSEN; WINDING,
2002; LAMBAIS et al., 2005; FLIEßBACH et al., 2007).
Alguns dos distúrbios impostos ao ambiente podem causar alterações nas comunidades de
FMAs que perduram durante anos, dependendo de como ela é manejada. Moreira et al. (2007)
utilizaram atributos ecológicos, com base nas comunidades de FMAs na forma de esporos no
solo, para distinguir uma floresta nativa de uma área reflorestada com Araucária há 18 anos, e
tendo pasto sob as árvores. As duas áreas foram discriminadas com base em análise discrimante
canônica, sendo que o índice de Diversidade de Shannon de FMAs foi o atributo ecológico que
mais contribuiu para a distinção da área de floresta nativa e a área reflorestada. Foram
identificadas 27 espécies de FMAs nas duas áreas, sendo que a área natural apresentou maior
14
diversidade e número total de esporos do que a área reflorestada. Os autores sugerem que a
ausência de distúrbios e a maior diversidade de plantas tenha contribuído para a maior
diversidade e abundância de FMAs.
As práticas agrícolas podem influenciar de forma significativa a composição da
comunidade de FMAs na forma de esporos no solo. Mathimaran et al. (2007) avaliaram os efeitos
de cinco anos de rotação de culturas sobre a comunidade de FMAs em um Ferralsol no Kenya.
Haviam dois tratamentos de plantio: rotação de milho com crotalária, e plantio contínuo de
milho; e dois tratamentos de adubação: com ou sem adubação fosfatada. Os autores acessaram a
comunidade por meio da extração e identificação de esporos e por sequenciamento da subunidade
maior do gene rRNA de esporos de cultura armadilha. A diversidade de FMAs não foi afetada
pelos manejos de plantio ou pela adubação de P. No entanto, a abundância relativa de espécies foi
maior para o tratamento com rotação de cultura.
Em determinadas situações, a mudança do manejo da lavoura pode não levar a mudanças
na comunidade de FMAs. O efeito do manejo de cultivo convencional e orgânico de pomares e
viveiros de citros sobre as comunidades de FMAs foi avaliado por Focchi et al. (2004). Em 36
amostras de 6 pomares, dois viveiros e uma área de mata nativa, foram recuperadas 26 espécies
de FMAs. Os autores não encontraram diferenças nas comunidades de FMAs em função do
manejo adotado, embora práticas conservacionistas, como rotação de culturas, possam contribuir
para o aumento da diversidade e riqueza de FMAs no solo (DOUDS; JANKE; PETERS, 1993;
ROSALES; VALDÉZ, 1996).
Outro fator que pode causar alterações da estrutura da comunidade de FMAs é a queima
da biomassa vegetal. Eom et al. (1999) estudaram a comunidade fúngica em uma pradaria dos
EUA de 9 anos sob diferentes tratamentos: regimes de queima, corte da cobertura vegetal e
adubações nitrogenadas e/ou fosfatadas. Os autores coletaram esporos para identificação
morfológica e raízes para determinação da colonização micorrízica e verificaram que a queima
anual diminuiu a diversidade de FMAs, mas não a abundância de esporos e a colonização
intrarradicular. As interações dos tratamentos de queima, roçagem da cobertura vegetal e
adubação resultaram em mudanças de diversidade e abundância de FMAs, mostrando que essas
práticas influenciam os fatores do solo, como teor de N e umidade, os quais podem alterar a
comunidade de FMAs (EOM et al., 1999).
15
Poucos trabalhos existem na literatura que tenham estudado a interação de FMAs com
cana-de-açúcar. Paula et al. (1991) estudaram a interação de Gluconacetobacter diazotrophicus
com Glomus clarum em três culturas, incluindo a cana-de-açúcar. Os autores verificaram que a
inoculação do FMA junto com uma mistura de bactérias diazotróficas resultou em maior
colonização micorrízica e maior população de G. diazotrophicus na parte aérea da cana-de-
açúcar, o que evidencia um sinergismo entre os dois microrganismos. Gosal, Gupta e Gosal
(2001) verificaram que a inoculação com FMAs em cana-de-açúcar micropropagada aumentou a
sobreviência após transplante das plantas para o solo em relação às plântulas não micorrizadas.
Alguns trabalhos investigaram a influência dos FMAs no desenvolvimento da cana-de-
açúcar em condições de campo. Foi observada que a resposta dessa cultura à MA, aos 83 dias
após o plantio, é baixa (KELLY et al., 2001; 2005). Por outro lado, Reddy et al. (2004)
verificaram aumento do crescimento da cana-de-açúcar com inoculação de alguns FMAs, aos 40
e 80 dias após o plantio. Em outro estudo, foi observado que a produção de cana-de-açúcar é
maior com a inoculação de FMAs somente em tratamentos com adubação inferior de nitrogênio,
fósforo e potássio, comparada à cana-de-açúcar sem inoculação (QUILLOY; LANSANG, 1992)
Apesar desses trabalhos com cana-de-açúcar, nenhum deles avaliaram os efeitos dos
FMAs na produção final e na qualidade do produto, como os teores de açúcar. Além do que na
maior parte dos estudos foi aplicada apenas uma variedade de cana-de-açúcar. Existe apenas um
artigo (REIS; PAULA; DÖBEREINER, 1999) e uma dissertação de mestrado (ANDREOLA,
1982) investigando a comunidade de FMAs em cana-de-açúcar em condições de campo. Reis,
Paula e Döbereiner (1999) estudaram 14 variedades de cana-de-açúcar em diversas lavouras no
estado do Rio de Janeiro e em Pernambuco. Esses autores encontraram um total de 18 espécies de
FMAs na forma de esporos e indicações de que a prática da queima do canavial antes da colheita
pode reduzir a diversidade de FMAs. Andreola (1982) analisou um ensaio de adubação
nitrogenada e fosfatada e aplicação de vinhaça em cana-de-açúcar, sobre um Latossolo no
município de Araras, SP, ao longo de 13 meses. O autor verificou maiores números de esporos e
taxa de colonização micorrízica arbuscular nos meses com maior precipitação pluviométrica. Já a
aplicação de vinhaça e a adubação nitrogenada e fosfatada não mudaram o número de eporos no
solo e a taxa de colonização micorrízica arbuscular. Assim, os resultados de Andreola (1982)
mostram variação de esporos e taxa de colonização micorrízica em função da pluviosidade, e
ausência de resposta à aplicação de vinhaça ou adubos fosfatados e nitrogenados.
16
Portanto, considerando os poucos trabalhos no assunto, e a importância da cultura para o
Brasil, é também importante o conhecimento sobre a comunidade de FMAs associada à cana-de-
açúcar e os efeitos sofridos por essa comunidade em razão de mudanças de manejo ou alterações
do ambiente.
2.1.3 Taxonomia e identificação molecular de fungos micorrízicos arbusculares
A taxonomia dos FMAs é feita com base na morfologia e ontogenia de esporos assexuais,
como tamanho, cor, forma, número de paredes, características da hifa de sustentação, etc (Figura
1). Devido à semelhança das estruturas fúngicas intrarradiculares não é possível a identiicação de
espécies com base nas mesmas. Assim, existem vários limitantes para o estudo da ecologia dos
FMAs em condições de campo. A morfologia e a produção dos esporos são dependentes do
estádio fisiológico da planta hospedeira e das condições ambientais. A magnitude da esporulação
no solo pode não refletir o grau de colonização das raízes. Assim, uma espécie de FMA pode
esporular abundantemente no solo, mas colonizar uma pequena proporção do sistema radicular da
planta. Em contraste, uma espécie que colonize uma grande proporção do sistema radicular pode
não produzir um grande número de esporos (REDECKER; HIJRI.; WIEMKEN, 2003). Essas
informações sugerem que as espécies mais abundantes na forma de esporos no solo podem não
representar as mais abundantes no interior das raízes (CLAPP et al., 1995 e ROSENDAHL;
STUKENBROCK, 2004). As dificuldades nos estudos de ecologia de FMAs tornam-se ainda
maiores devido ao fato dos mesmos serem biotróficos obrigatórios e não serem passíveis de
cultivo in vitro. O uso de culturas armadilhas ou raízes transformadas para a multiplicação de
FMAs seria uma alternativa, mas essa abordagem é trabalhosa e geralmente demanda longo
tempo, além de existir a possibilidade de seleção de espécies de FMAs pela planta hospedeira
usada (CARRENHO; TRUFEM; BONONI, 2002).
Os esforços para identificar espécies, conhecer a diversidade e a dinâmica de comunidades
de FMAs são cada vez maiores devido aos seus impactos na organização e produção de
ecossistemas, incluindo agroecossistemas. Para contornar tais problemas, uma alternativa seria o
uso de técnicas moleculares independentes de cultivo (REDECKER; HIJRI.; WIEMKEN, 2003;
STUKENBROCK; ROSENDAHL, 2005; HEMPEL; RENKER; BUSCOT, 2007). Por meio da
análise de certas regiões do DNA de FMAs é possível estabelecer relações filogenéticas entre
17
diferentes filotipos encontrados em amostras de solo e/ou raízes e definir a dinâmica populacional
da área de estudo, por exemplo. Com o emprego da técnica da PCR, é possível produzir
relativamente grandes quantidades de DNA para análise, a partir de amostras com concentrações
ínfimas de DNA total. Assim, o uso da PCR revolucionou os estudos de filogenia e diversidade
genética de FMAs, já que os mesmos não podem ser cultivados axenicamente. Análises genéticas
têm permitido a identificação de FMAs em raízes colonizadas, bem como a definição das
relações filogenéticas de isolados de FMAs na forma de esporos (RENKER et al., 2003;
SHEPHERD et al., 2007; CROLL et al., 2008).
Figura 1 – Características morfológicas utilizadas para a identificação taxonômica de FMAs. A, esporo de Glomus
etunicatum, mostrando a hifa de sustentação (“subtending hypha”) e uma camada da parede do esporo
(“L2”); B, esporos de Glomus clavisporum em esporocarpo, mostrando a rede de hifas (“hyphal plexus”);
C, placa (ou escudo) de germinação presente em esporo de Scutellospora scutata; D, detalhe de
ornamentação da parede externa de um esporo de Acaulospora denticulata. Fonte: INVAM (2008)
Sequências do gene rRNA 18S têm sido utilizadas para a identificação taxonômica de
FMAs (HELGASON et al., 1998; ROSENDAHL; STUKENBROCK, 2004), a qual,
A Fonte: INVAM, 2008
B Fonte: INVAM, 2008
D Fonte: INVAM, 2008
C Fonte: INVAM, 2008
18
normalmente, coincide com a taxonomia baseada em morfologia dos esporos (MORTON;
REDECKER, 2001; SCHWARZOTT; WALKER; SCÜSSLER, 2001; WALKER et al., 2004).
Alternativamente, os espaçadores internos transcritos (ITS, do inglês Internal Transcribed
Spacer), sequências que separam os genes rRNA 18S, 5.8S e 25S/28S, também podem ser
utilizados para estudos filogenéticos. Porém, as sequências dos ITS de FMAs são altamente
variáveis devido à grande variabilidade genética dos núcleos dos esporos (SANDERS et al.,
1995; LLOYD-MACGILP et al., 1996), o que pode inviabilizar a identificação de espécies com
base nessas sequências.
O uso de PCR para amplificar fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs ainda é limitado.
O iniciador AM1 (HELGASON et al., 1998), geralmente utilizado nos estudos de comunidades
de FMAs, não amplifica o DNA de todas as espécies de FMAs, e pode amplificar o DNA de
alguns fungos que não pertencem ao filo Glomeromycota (REDECKER, 2000; DOUHAN et al.,
2005 LEE; LEE; YOUNG, 2008). Outro iniciador utilizado para estudos de ecologia/filogenia de
FMAs é o VANS1. Porém esse iniciador é complementar a uma região não muito conservada do
gene rRNA 18S de Glomeromycota (SIMON; LALONDE; BRUNS, 1992; SCHÜSSLER et al.,
2001) e pode não amplificar o DNA de todas as espécies de Glomeromycota. A eficiência dos
iniciadores para PCR depende do número de sequências de diferentes espécies usadas para definí-
los. De acordo com as bases de dados integradas pelo Centro Nacional de Informação para
Biotecnologia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), no ano de 2006 existiam cerca de 3.800
sequências do gene rRNA 18S de fungos Glomeromycota depositadas, e aproximadamente
49.000 sequências de fungos de outros filos. Já em 2008, aproximadamente 6.500 sequências do
gene rRNA 18S de Glomeromycota e 86.000 sequências de fungos de outros filos estavam
disponíveis.
Uma vez que as informações sobre sequências do gene rRNA 18S na base de dados do
NCBI têm aumentado constantemente, com maior número tanto de sequências alvo como não-
alvo, o desenho de novos iniciadores específicos mais eficientes se torna possível. No entanto,
como o filo Glomeromycota é bastante diverso para os genes rRNA, uma alternativa seria o
desenho de iniciadores para grupos específicos de FMAs, com menor diversidade genética.
19
2.2 Material e métodos
2.2.1 Comparação dos métodos de extração de DNA das raízes
Para o estudo de comunidades de FMAs colonizando as raízes das plantas é necessária a
extração do DNA total das raízes colonizadas, o qual é composto de DNA da planta e DNA de
fungos e outros microrganismos associados às raízes. Os métodos de extração de DNA de plantas
utilizam diferentes processos para a lise de membranas, para a liberação e a purificação desses
ácidos nucléicos da amostra. Considerando-se a complexidade do DNA total extraído de raízes
coletadas no campo, os diferentes métodos de extração de DNA podem apresentar eficiências
variáveis. Dessa forma, foram testados cinco métodos de extração de DNA de raízes visando a
análise de FMAs a elas associadas. Foi avaliada a concentração, pureza e a viabilidade de
amplificação do DNA total obtido, utilizando-se raízes de Brachiaria sp. inoculadas com
diferentes espécies de FMAs.
As plantas foram previamente inoculadas com diferentes espécies de FMAs e cultivadas
em vasos contendo solo esterilizado em autoclave. Os FMAs utilizados foram:
- Acaulospora scrobiculata
- Glomus clarum
- Gigaspora rosea
- Paraglomus brasilianum
- Glomus etunicatum
- Gigaspora rosea e Scutellospora heterogama
Foram utilizados cinco métodos para extração de DNA das raízes colonizadas por FMAs
(Quadro 1), sendo dois deles com kits comerciais e outros três adaptados de procedimentos
documentados na literatura, conforme descrito abaixo.
Antes da extração de DNA, as raízes foram lavadas quatro vezes com água destilada para
remoção de impurezas mais grosseiras, homogeneizadas e maceradas em nitrogênio líquido com
o uso de almofariz e pilão de porcelana. Cada amostra foi dividida em 5 alíquotas, de mesma
massa fresca (200 a 500 mg), e transferidas para tubos de polietileno. Assim, foi utilizada a
mesma quantidade de material vegetal de cada amostra de raízes para cada um dos 5 métodos de
extração de DNA.
20
Métodos
1
Kit FastDNA Spin (Bio 101, Vista, Califórnia)
2
Kit UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA USA)
3
Método adaptado de Edwards et al. (1997)
4
Método adaptado de Doyle e Doyle (1990)
5
Método adaptado de Redecker (2000)
Quadro 1 – Métodos utilizados para extração de DNA de raízes de braquiária
colonizadas por FMAs
Método 1: kit FastDNA Spin (Bio 101, Vista, Califórnia). O DNA total da amostra de
raízes foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. No microtubo de lise foram
adicionadas as raízes maceradas e 800 μL de solução de lise para tecidos vegetais (CLS-VF) mais
100 μL da solução PPS. Cada microtubo de lise continha granada finamente moída e 2 esferas de
cerâmica. O microtubo foi agitado em um homogeneizador FP120Fast Prep Cell Disruptor (Bio
101, Vista, Califórnia) por 20 segundos com velocidade de 4m.s
-1
. As amostras foram
centrifugadas por 10 minutos a 13.000 g. 600 μL da fase superior foram transferidos para novos
microtubos de 1,5 mL. Foram adicionados 600 μL da solução com matriz de ligação e
prosseguiu-se com inversão dos tubos por 20 vezes e incubação a temperatura ambiente com leve
agitação. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 13.000 g por 1 minuto e o sobrenadante
foi descartado. O pélete foi ressuspendido em 500 μL da solução de lavagem SEWS. A solução
foi transferida para o filtro Spin Filter ®, o qual foi acoplado a um microtubo. Este conjunto foi
centrifugado por duas vezes a 13.000 g por 1 minuto. O filtrado foi descartado. O filtro foi, então,
transferido para novo tubo e adicionaram-se 50 μL da solução DES sobre a matriz de ligação
contida no tubo. A matriz foi ressuspendida cuidadosamente para hidratação e solubilização do
DNA. Essa mistura foi incubada por 5 minutos a temperatura ambiente, e centrifugou-se a 13.000
g por um minuto para recuperar o DNA eluído com DES. O DNA obtido foi armazenado a -20
ºC.
Método 2: Kit UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA
USA). O DNA foi extraído de acordo com o manual do fabricante, com modificações, conforme
descrito a seguir. As raízes maceradas foram transferidas para tubo contendo a solução de lise
21
Bead. A mistura foi agitada gentilmente e adicionaram-se 60 L da Solução 1. Depois de inverter
o tubo por várias vezes, este foi incubado a 70
o
C por 10 minutos. Adicionaram-se 200 L de
Solução IRS (Solução de Remoção de Inibidor) e a solução foi homogeneizada no
homogeneizador FP120Fast Prep Cell Disruptor (Bio 101, Vista, Califórnia) por 20 segundos
com velocidade de 4 m.s
-1
. O tubo foi centrifugado a 10.000 g por 30 segundos e o sobrenadante
transferido para um novo tubo, onde foram adicionados 250 L da Solução 2. A solução foi
homogeneizada em vortex por 5 segundos e o tubo incubado a 4
o
C por 5 minutos para depois ser
centrifugado a 10.000 g por 1 minuto. Todo o sobrenadante foi transferido para um novo tubo,
onde se adicionaram 1,3 mL da Solução 3 e a solução foi homogeneizada em vortex por 5
segundos, 700 L foram transferidos para o filtro do kit, e o conjunto filtro-tubo foi centrifugado
à 10.000 g por 1 minuto. O filtrado foi descartado e adicionaram-se mais 700 L de solução ao
mesmo filtro. Em seguida, o tubo foi centrifugado à 10.000 g por 1 minuto. O processo foi
repetido até que todo o sobrenadante fosse filtrado. Foram adicionados, então, 300 L da Solução
4 sobre o filtro, centrifugou-se a 10.000 g por 30 segundos. O filtrado foi descartado e
centrifugou-se novamente por 1 minuto. Para recuperar o DNA, o filtro foi transferido para um
novo tubo e adicionaram-se 50 l da Solução 5 no centro do filtro. O conjunto filtro-tubo foi
centrifugado a 10.000 g por 30 segundos e, depois, o filtro foi descartado. A solução de DNA
obtida foi armazenada a –20
o
C.
Método 3: Método adaptado de Edwards (1997). Às raízes maceradas, foram
adicionados 800 μL de solução tampão de Etil Xantana de Potássio (6,25 mM de Etil Xantana de
Potássio - PEX; 100 mM de tris-HCl, pH 7,5; 700 mM NaCl; 10 mM EDTA, pH 8,0). As
suspensões foram homogeneizadas em vortex e incubadas a 65 ºC por uma hora. Depois da
incubação, foram adicionados 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1; v:v:v) e a
mistura foi emulsificada em vortex. Os microtubos foram centrifugados a 12.000 g por 5 minutos.
Uma alíquota de 650 μL do sobrenadante foi coleta e transferida para um novo tubo. A essa
solução, foram adicionados mais 650 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. A mistura foi
emulsificada e centrifugada a 12.000 g por 2 minutos. A fase aquosa sobrenadante foi transferida
para novo tubo e misturada com 650 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1; v:v). As misturas
foram homogeneizadas novamente em vortex e centrifugadas a 12.000 g por 5 minutos. Um
volume de 500 μL do sobrenadante foi transferido para novo tubo, onde foi adicionado 1/10 do
volume de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e igual volume (500 μL) de isopropanol, para
22
precipitação do DNA. A precipitação do DNA foi feita por uma hora a 4
o
C. Em seguida, os
tubos foram centrifugados por 15 minutos a 12.000 g e a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e
adicionaram-se 500 μL de etanol 70% ao pélete formado. Os microtubos foram centrifugados a
12.000 g por 5 minutos. O DNA precipitado foi seco em câmara de fluxo, ressuspendido em 100
μL de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM de EDTA, pH 8,0) e armazenado a -20 ºC.
Método 4: Método adaptado de Doyle; Doyle (1990). Em cada microtubo de 1,5 mL,
contendo as raízes maceradas, foram adicionados 650 μL da solução tampão de extração (2 % de
brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB); 1,4 M de NaCl; 100 mM deTris-HCl, pH 8,0; 20 mM de
EDTA, pH 8,0; 1 % de polivinilpirrolidona, PVP). Os microtubos foram agitados em vortex e
incubados em banho-maria a 55º C por 50 minutos. Foram adicionados 650 μL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v:v) e agitou-se em vórtex até formar uma emulsão.
Centrifugaram-se as amostras por 5 minutos a 12.000 g para separação do sobrenadante. A fase
aquosa de cada amostra foi transferida para um novo microtubo, onde se adicionou o mesmo
volume de isopropanol para precipitação de DNA. Em seguida, os tubos foram centrifugados por
5 minutos a 12.000 g. Os péletes formados foram lavados duas vezes com etanol 70 %, com
centrifugação a 12.000 g por 2 minutos, para remoção de sais. O DNA precipitado foi seco em
câmara de fluxo, ressolubilizado em 50 μL de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM de EDTA, pH 8,0) e
armazenado a -20 ºC.
Método 5: Método adaptado de Redecker (2000). A cada alíquota de raízes maceradas,
foram adicionados 300 μL de NaOH 0,25M. Os microtubos foram incubados a 90 ºC por 10
minutos. Em seguida, adicionaram-se 150 μL de Tris-HCl 0,5 M e 300 μL de HCl 0,25 M e
procedeu-se a incubação por 10 minutos a 90 ºC. As amostras foram centrifugadas a 12.000 g por
5 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo microtubo. O DNA foi precipitado
adicionando-se o mesmo volume de isopropanol. Em seguida, os tubos foram centrifugados por 5
minutos a 12.000 g. Os péletes de DNA foram lavados por duas vezes com etanol 70 %, seguido
de centrifugação a 12.000 g por 2 minutos, para remoção de sais. O DNA precipitado foi seco em
câmara de fluxo, ressolubilizado em 50 μL de água ultrapura e armazenado a -20 ºC.
O DNA extraído por diferentes métodos foi quantificado em gel por meio de comparação
com marcador de massa Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) após eletroforese. A imagem do gel
de agarose (1%) foi analisada com o programa FragmeNT Analysis Application version 1.1
(Molecular Dynamics, GE Healthcare). O DNA também foi quantificado por espectrofotometria
23
à 260 nm (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATS, 1989). O cálculo da concentração de DNA na
amostra foi feito de acordo com a equação
[DNA] = (50 ng.μL
-1
x D) x (A
260
- A
320
),
Onde,
D = fator de diluição da amostra;
A
260
= absorbância a 260 nm;
A
320
= absorbância a 320 nm.
A pureza do DNA foi determinada pela relação das absorbâncias a 260 e 280 nm
(SAMBROOK; FRITSCH; MANIATS, 1989).
As amostras de DNA de raízes de braquiária foram adicionalmente submetidas à PCR,
com o objetivo de determinar se o DNA era amplificável. Para isso, foram utilizados os pares de
iniciadores NS1 e NS8, complementares ao gene rRNA 18S (WHITE et al., 1990), e os
iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1, complementares à região ITS (RENKER et al., 2003). A
amplificação do DNA foi feita em solução contendo 0,4 M de cada iniciador, 200 M de cada
um dos nucleotídeos (dNTPs), 1,5 mM de MgCl
2
(para o par de iniciadores NS1 e NS8) ou 2,0
mM de MgCl
2
(para o par de iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1), 1,5 U de DNA polimerase
Taq e 1x o tampão de reação, totalizando um volume de 30 l. Os fragmentos de rDNA 18S
(iniciadores NS1 e NS8) foram amplificados, após a desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos,
em 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, pareamento do iniciador a 53ºC por 1
minuto, extenção a 72 ºC por 2 minutos, seguidos de um período final de extensão de 10 minutos
a 72º C. A região ITS (iniciadores SSU-Glom1 e LSU-Glom1) foi amplificada após desnaturação
inicial a 94 ºC por 10 minutos, em 40 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 40 segundos, 54 ºC por
30 segundos, 72 ºC por 40 segundos, seguidos de extensão a 72 ºC por 10 minutos. Para todos os
ensaios, empregou-se uma reação controle negativo, sem DNA. Os amplicons obtidos foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) e visualizados após coloração com SYBR
Green.
O experimento para comparação dos métodos de extração de DNA teve um delineamento
inteiramente aleatorizado. Para cada método, as repetições constituíram-se das 6 amostras de
raízes com diferentes espécies de FMAs inoculadas. Os dados de concentração de DNA, e da
24
relação da absorbância a 260 e 280 nm foram analisados por ANOVA e as médias comparadas
pelo teste de Tukey. Os dados foram transformados para x
0,5
para normalização.
2.2.2 Amplificação do gene rRNA 18S de grupos específicos de FMAs
Esta etapa do trabalho foi desenvolvida no laboratório do Professor Ari Jumpponnen
(Division of Biology, Kansas State University, USA).
Com o objetivo de se desenhar iniciadores para amplificar DNA de FMAs, sequências do
gene rRNA 18S foram obtidas da base de dados do NCBI. Nessa etapa, não foram utilizadas
sequências de origem ambiental, pois o desenho dos iniciadores deveria se basear em organismos
identificados. Para que os iniciadores fossem discriminatórios contra outros grupos de fungos,
também se utilizou sequências do gene rRNA 18S de fungos dos filos Basidiomycota,
Ascomycota, Zygomycota e Chytriodiomycota. Essas sequências foram utilizadas como não-alvo
na validação dos iniciadores. A entrada para a busca no NCBI foi “(Glomeromycota AND 18S)
NOT (environmental OR uncultured)” para as sequências de FMAs, e “(Grupo de Fungo AND
18S AND AFTOL) NOT (internal)” para cada um dos 4 grupos citados acima, como:
“(Basidiomycota AND 18S AND AFTOL) NOT (internal)” para Basidiomycota. O termo
“internal” foi utilizado para se excluir sequências da região ITS no banco de dados. Foram
coletadas 100 sequências do gene rRNA 18S de FMAs e 59 sequências de fungos não-
micorrízicos arbusculares.
Todas as sequências foram importadas para o programa Sequencher 4.6 para o
alinhamento e formação de contigs. A formação desses contigs permitiu a separação em grupos
baseados nas diferenças das sequências dos organismos, portanto, baseado na filogenia.
Inicialmente, os parâmetros de alinhamento foram ajustados da seguinte forma: o algoritmo de
agrupamento (Assembly Algorithm) utilizou os dados impuros (Dirty Data) para haver mais rigor
na formação de agrupamentos e para evitar a inserção de grandes “gaps”. Foi utilizado o
ReAligner (ANSON; MYERS, 1997) para otimizar “gaps” como pequenos insertos. A
percentagem mínima de coincidência das sequências (Minimum Match Percentage) foi 100 %,
enquanto a cobertura mínima (Minimum Overlap) foi 100 %. A percentagem mínima de
similaridade das sequências foi iniciada com o maior valor para se detectar e se eliminar as
sequências idênticas, visando a formação de um banco de dados com sequências únicas apenas.
25
Depois do primeiro alinhamento com 100 % de similaridade, séries de alinhamentos foram feitos
com o parâmetro de percentagem mínima de similaridade diminuindo um ponto percentual a cada
alinhamento. O valor da cobertura mínima permaneceu a 100 % para excluir a possibilidade de
alinhamento de regiões incorretas. Assim, os contigs para os grupos de sequências de
Glomeromycota, Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomus grupo A e Glomus grupo B foram
usados para o desenho dos iniciadores que amplificassem o seu DNA alvo.
Para a obtenção das sequências consenso de cada grupo, fez-se o alinhamento no
programa Multalin (CORPET, 1988). No desenho dos iniciadores, empregaram-se as sequências
consenso dos grupos de FMAs nos programas Beacon Designer 7.02 (Premier Biosoft
International, Palo Alto, CA, EUA) e Primer3 v.0.4.0 (ROZEN; SKALETSKY, 2000), além da
busca manual dos iniciadores. Na busca manual, procuraram-se as regiões consenso para os
grupos de FMAs e que fossem dissimilares às sequências não-alvo.
Após se encontrarem os possíveis iniciadores específicos, eles foram validados quanto à
especificidade, utilizando o BLAST. Nessa etapa, a especificidade foi considerada quando a
similaridade e a cobertura para sequências alvo foram de 100 %, e quando esses valores foram
menores para sequências não-alvo. Assim, a análise de similaridade foi feita utilizando-se as
seguintes entradas para busca no BLAST: Glomeromycota, o grupo de espécies de cada iniciador
e Eucariotos sem Glomeromycota. Os iniciadores ainda foram alinhados com as sequências alvo
e não-alvo para confirmar a especificidade, a similaridade e a posição de alinhamento no
programa Multialin. Depois, avaliou-se a temperatura de desnaturação (melting temperature), o
tamanho do oligonucleotídeo, a formação de grampos e o autopareamento utilizando-se o
programa Oligo Analyzer (Copyright (C) 2000-2002 Teemu Kuulasmaa). Por fim, procedeu-se os
ensaios de amplificação de DNA alvo por meio de PCR, utilizando-se os iniciadores grupo-
específicos como Forward e um iniciador modificado de Borneman e Hartin (2000) como
Reverse (Tabela 1). Após a verificação em alinhamentos com sequências de Glomeromycota, o
iniciador nu-SSU-1196 (BORNEMAN; HARTIN, 2000) foi alterado com degeneração de uma
base “C” por “C ou T” (Y). Essa degeneração permitiu obter 100 % de similaridade entre as
sequências de FMAs testadas.
26
Tabela 1 – Iniciadores grupo-específicos para FMAs
Iniciador
Sequência (5’ 3’)
Especificidade
Referência
ACAU220
GGG GTT TCC CAT TGG TGR ATC AT
Acaulosporaceae
Esse estudo
GLOMB652
TAA GGG GTA TGA ACT GGT GTA G
Glomus Grupo B
Esse estudo
GLOMB673
GTC AAT TTC TCA CCT TCT GGA G
Glomus Grupo B
Esse estudo
GIGA202
AAA CCA ATA RCC TTC GGG TTT C
Gigasporaceae
Esse estudo
GIGA615
TAG TTG AAT TTC GGG GTT CTA C
Gigasporaceae
Esse estudo
GLOMA189
TTA GAT AAA AAA CCA ATA TCG GG
Glomus Grupo A
Esse estudo
GLOMA690
CGT AAT GCC ATT AAT TTG GTG T
Glomus Grupo A
Esse estudo
nu-SSU-1196
modificado
TCT GGA CCT GGT GAG TTT YC
Fungi
Modificado de
Borneman;
Hartin (2000)
Para validação dos iniciadores, utilizaram-se amostras de DNA de FMAs provenientes de
vasos de multiplicação obtidos de culturas do INVAM (West Virginia University). As espécies
de FMAs utilizadas pertencem aos 4 grupos de FMAs: Acaulospora lacunosa e A. longula
(Acaulosporacea), Glomus claroideum (Glomus grupo B), Glomus caledonium (Glomus grupo
A), Scutellospora castanea e S. calospora (Gigasporaceae). O DNA total foi extraído a partir do
substrato dos vasos de multiplicação, que continham esporos e raízes colonizadas, utilizando-se o
Ultra Clean Soil DNA Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, EUA).
Para otimizar as condições da amplificação do DNA alvo para cada iniciador desenhado,
foram testados os gradientes de: concentração de DNA, temperatura de pareamento dos
iniciadores, concentração de MgCl
2
, concentração de dNTPs, concentração de iniciadores,
concentração da enzima DNA Polimerase Taq, além da presença ou ausência de BSA (Albumina
de Soro Bovino). As condições da PCR otimizadas foram: 5,0 ng de DNA, 1,5 mM de MgCl
2
,
200 µM de cada dNTP, 0,4 µM de cada iniciador, 1,25 U da DNA polimerase Taq, 1x tampão
para a DNA polimerase, sem o uso de BSA, para um volume final de 25 µL. O programa de
amplificação foi 94 ºC por 2 minutos para a desnaturação inicial, seguido por 30 ciclos de 94 ºC
por 1 minuto, 61 ºC por 1minuto e 72 ºC por 2 minutos, e um passo de extensão final a 72 ºC por
8 minutos.
Previamente aos ensaios com amostras ambientais, a habilidade dos iniciadores em
amplificar o DNA alvo foi testada em amostras de DNA extraídos de raízes de cana-de-açúcar e
27
Brachiaria sp. inoculadas com FMAs e cultivadas em casa-de-vegetação. Amostras de DNA de
raízes de uma pradaria dos Estados Unidos também foram utilizadas para verificar a eficiência e a
especificidade dos iniciadores em amostras do campo. Essas amostras foram coletadas de um
experimento em pradaria conduzido na Konza Prairie Biological Station (estação de estudos
biológicos da Kansas State University em Manhattan, KS - http://www.konza.ksu.edu/konza/),
com comunidade vegetal dominada por espécies nativas, como Andropogon gerardii, Panicum
virgatum e Sorghastum nutans. As amostras são de dois tratamentos: sem adubação nitrogenada e
com aplicação de 10 g de N por m
2
(JUMPPONEN et al., 2005). O DNA dessas amostras foi
extraído com o kit MoBio Ultra Clean Soil DNA Kit.
Foi necessário utilizar a nested PCR para a amplificação do DNA alvo nas amostras
provenientes da pradaria. Na primeira PCR foram utilizados os iniciadores NS1 e NS8 (WHITE,
1990). A amplificação foi feita com desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos; 25 ciclos de 94
ºC por 1 minuto, 58 ºC por 1 minuto e 30 segundos e 72 ºC por 2 minutos; e extensão final a 72
ºC por 8 minutos. Na segunda PCR, utilizaram-se os iniciadores grupos específicos desenhados
nesse trabalho com as mesmas condições descritas acima para o DNA de raízes de vasos de
multiplicação. Os produtos de PCR das amostras ambientais, amplificados com o uso dos
iniciadores grupo-específicos, foram ligados em vetor TOPO (Invitrogen) e clonados em
Escherichia coli. Para o sequenciamento do DNA alvo, os insertos foram amplificados a partir
das colônias de E. coli e foram selecionados a partir do padrão de bandas após a digestão com as
endonucleases AluI e HinfI. Os clones que apresentaram os mesmos padrões de bandas foram
considerados iguais. Escolheram-se apenas 1 a 3 representantes para o sequenciamento,
dependendo do número de clones com o mesmo padrão. As sequências foram obtidas utilizando-
se sequenciador capilar de alta capacidade da High-Throughput Sequencing Solutions, empresa
administrada pela Universidade de Washington, EUA.
2.2.3 Estrutura da comunidade de FMAs em raízes e solo rizosférico de cana-de-açúcar sob
diferentes manejos de colheita
As amostras de solos e raízes de cana-de-açúcar foram coletadas para a extração de
esporos, para a determinação da colonização intrarradicular e para a identificação de sequências
do gene rRNA 18S de FMAs nas raízes. Para tanto, utilizou-se uma área experimental do Centro
28
de Tecnologia Canavieira (CTC), localizada na Usina São José da Estiva (21º30’45”S e
49º13’08”W), no município de Novo Horizonte, SP. O experimento foi instalado em 16/04/2004,
sobre um latossolo vermelho-amarelo, com dois tratamentos de manejo de colheita: SEM
QUEIMA e COM QUEIMA prévia; e três variedades de cana-de-açúcar: (1) SP813250, (2)
SP801842 e (3) RB72454. As variedades foram plantadas com espaçamento de 1,5 m entre
linhas, com seis repetições em blocos aleatorizados. Anteriormente à implantação do experimento
na área, houve o cultivo de cana-de-açúcar variedade SP711406, com 10 cortes e queima
previamente à cada colheita, seguido de um cultivo de soja. A amostragem foi feita aos 84 dias
após a primeira colheita da cana-de-açúcar, em 15/12/2005, na profundidade de 0-10 cm, sob as
três variedades de cana-de-açúcar. A produtividade, em toneladas de colmos por hectare (TCH),
também foi calculada para as três variedades.
2.2.3.1 Análises químicas do solo
As amostras de solo coletadas foram secas ao ar para a análise de pH, H+Al, Al, Ca, Mg,
K, P, Carbono orgânico (CO), soma de bases (SB), capacidade de troca catiônica a pH 7,0 (CTC)
e saturação da CTC por bases (Quadro 2).
Atributo
Método ou extrator
Referência
pH
Medido em CaCl
2
0,01M
Raij et al., 2001
H+Al
pH em SMP
Raij et al., 2001
Al trocável
KCl 1M e titulação com NaOH 0,025M
Raij et al., 2001
Ca, Mg trocáveis e P
Resina trocadora de íons
Raij et al., 2001
K trocável
Melich 1
Silva, 1999
Carbono orgânico (CO)
Colorimetria
Raij et al., 2001
Soma de bases (SB)
Somatória de Ca, Mg, K
-
CTC (pH 7,0)
Somatória de H+Al, Ca, Mg, K
-
Saturaçãopor bases da
CTC (V%)
Saturação = (Ca, Mg, K)*100/CTC
-
Quadro 2 – Metodologias utilizadas para a análise química do solo
A CTC a pH 7,0 foi calculada somando-se os teores de H + Al, Ca, Mg e K. Depois,
29
foram calculadas as porcentagens da saturação da CTC por Ca, Mg, K e por Al (m) da seguinte
forma: Saturação do Elemento (%) = (teor do Elemento/CTC)*100.
2.2.3.2 Extração de esporos de FMAs do solo
Os esporos dos FMAs foram extraídos do solo por peneiramento úmido (GERDEMANN;
NICOLSON, 1963) e centrifugação por duas vezes em solução de sacarose 70 %, a 560 g por 2
minutos. Os esporos foram identificados conforme descrito no International Culture Collection
of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhiza Fungi (INVAM, 2007). Para a análise estatística, o número
de esporos foi transformado para (x + 0,5)
0,5
. O índice de diversidade de Shannon, o recíproco do
índice de Simpson, as estimativas de riqueza de espécies e a estimativa de cobertura de
amostragem foram realizadas com o uso do programa SPADE (CHAO; SHEN, 2003). O índice
de equitabilidade de Pielou foi calculada de acordo com Magurran (1988).
Para determinar a influência das variáveis ambientais na variabilidade de ocorrência das
espécies de FMAs sob cana-de-açúcar, foi realizada uma análise de redundância canônica (RDA),
utilizando-se o programa “Canoco for windows 4.5”, com transformação dos dados para log x e
avaliação da análise por meio do teste de permutação de Monte-Carlo. Na RDA a ordenação das
amostras é condicionada diretamente pelas variáveis ambientais e, assim, permite medida direta
da relação entre as variáveis ambientais e as espécies detectadas. Para eliminar a colinearidade de
dados e selecionar as variáveis que melhor explicaram de forma significativa a variabilidade dos
dados, utilizou-se "Forward selection" na RDA. Dados de presença e ausência de espécies de
FMAs foram utilizados para os cálculos.
2.2.3.3 Colonização micorrízica intrarradicular
Para a avaliação da colonização intrarradicular pelos FMAs, as raízes de cana-de-açúcar
foram lavadas e imersas em KOH 10% por uma noite. Depois, foram aquecidas a 60ºC em KOH
10% por 10 minutos para clarificação. Após a clarificação, as estruturas fúngicas foram coradas
por 3 minutos a 90ºC com tinta de caneta comercial Parker® 5% diluída em solução de ácido
acético 5% e lactoglicerol 10%. A colonização das raízes foi analisada sob microscópio
estereoscópio pelo método da placa reticulada, segundo Giovannetti e Mosse (1980). Os dados
30
foram transformados para arcsen(x + 1)
0,5
para as análises estatísticas.
2.2.3.4 Análise do gene rRNA 18S fúngico em raízes de cana-de-açúcar
O DNA das amostras de raízes do campo foi extraído com o objetivo de amplificar e
clonar fragmentos do gene rRNA 18S de FMAs. O DNA foi extraído com kit comercial Fast
DNA (Bio101, Vista) após a lavagem das raízes com água desionizada e maceração em
nitrogênio líquido. A clonagem do gene rRNA 18S de FMAs foi realizada usando três
abordagens. A primeira abordagem foi com a utilização de iniciadores específicos para um
segmento do gene rRNA 18S conservado em fungos (NS7 e F1Ra). Assim, após o
sequenciamento de clones, poderíamos detectar as populações de fungos em geral, incluindo as
populações de FMAs. A segunda abordagem teve como objetivo amplificar parte do gene rRNA
18S de fungos do filo Glomeromycota, utilizando-se o iniciador AM1, descrito como específico
para FMAs (HELGASON et al., 1998). A terceira abordagem foi desenhar iniciadores específicos
para amplificar fragmentos do gene rRNA 18S de grupos específicos de FMAs nas amostras de
raízes de cana-de-açúcar do campo. Para o desenho dos iniciadores, inicialmente procurou-se
obter sequências de FMAs mantidos em vasos de multiplicação. As abordagens e métodos
utilizados estão descritos em detalhes abaixo.
2.2.3.4.1 Amplificação do gene rRNA 18S de fungos gerais e FMAs
O gene rRNA 18S fúngico foi amplificado por nested PCR com os iniciadores universais
para eucariotos NS1 e NS8 (WHITE et al., 1990) na primeira reação de amplificação. Os
produtos da primeira PCR foram diluídos 50 vezes e utilizados em uma segunda reação de
amplificação com o par de iniciadores NS7 e F1Ra (SOUZA et al., 2004) para amplificar DNA
de fungos em geral, e os iniciadores NS31 e AM1 para amplificar DNA de Glomeromycota. A
primeira reação de amplificação foi realizada com DNA total extraído das raízes em solução
contendo 0,4 M de cada um dos iniciadores (NS1 e NS8), 200 M de cada um dos nucleotídeos
(dNTPs), 1,5 mM de MgCl
2
, 1 U da enzima (DNA polimerase Taq) e 1x o tampão de reação,
totalizando um volume de 30 l. Após desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos, os fragmentos
de rDNA 18S foram amplificados em 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos,
31
pareamento do iniciador a 53ºC por 1 minuto, extenção a 72 ºC por 2 minutos, seguidos de um
período final de extensão de 10 minutos a 72º C.
A segunda reação de amplificação foi realizada com o produto de amplificação da
primeira reação diluído em solução contendo 0,4 M de cada um dos iniciadores (NS7 e F1Ra ou
NS31 e AM1), 200 M de cada um dos nucleotídeos (dNTPs), 1,0 mM de MgCl
2
, 2 U da enzima
(DNA polimerase Taq) e 1x o tampão de reação, totalizando um volume de 20 l. A
amplificação com os iniciadores NS7 e F1Ra foi feita após desnaturação inicial a 94 ºC por 2
minutos, em 30 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 62ºC por 28 segundos, 72 ºC por 1 minuto,
seguidos de 5 minutos a 72º C para extensão final. A amplificação com os iniciadores NS31e
AM1 foi feita após desnaturação inicial a 94º C por 2 minutos em 35 ciclos de 94º C por 30
segundos, 60º C por 30 segundos, 72º C por 45 segundos (aumentando 1segundo por ciclo), e
seguido de extensão final a 72º C por 5 minutos. Os amplicons, corados com SYBR Green, foram
visualizados em gel de agarose 1%, após eletroforese.
2.2.3.4.2 Amplificação do gene rRNA 18S de grupos específicos de FMAs em cana-de-
açúcar
Os iniciadores desenhados foram utilizados para avaliar a estrutura das comunidades de
FMAs em raízes de cana-de-açúcar sob os manejos SEM QUEIMA e COM QUEIMA prévia à
colheita. O DNA total extraído das raízes usando o método 1 (kit Bio101) foi amplificado com os
iniciadores NS31 e AM1 para comparação da eficiência dos mesmos. As condições para a
amplificação utilizando os iniciadores aqui desenhados foram as mesmas descritas acima para as
raízes da pradaria. A ligação dos amplicons, transformação de E. coli, clonagem e extração de
DNA plasmidial foi feita conforme descrito acima para os inciadores NS7 e F1Ra e para NS31 e
AM1. Para as raízes de cana-de-açúcar, 20 clones obtidos com cada iniciador e de cada um dos
tratamentos de colheita foram sequenciados. O sequênciamento de ampliconsobtidos de raízes de
cana-de-açúcar foi feito em sequenciador automático ABI 3100, utilizando-se o DYEnamic ET
Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Prism 3100, Applied Biossystems). As sequências foram
analisadas para detecção de quimeras no programa Chimera Check utilizando o mesmo método
descrito acima.
32
Na análise de BLAST, as sequências obtidas de cada iniciador foram avaliadas
separadamente. Tanto as sequências obtidas do NCBI para o desenho de iniciadores, como as
sequências de cana-de-açúcar do campo foram alinhadas por meio do ClustalW, no programa
MEGA 4.0 (TAMURA et al., 2007), e manualmente ajustadas para a análise filogenética. As
sequências ambientais obtidas com o emprego do iniciador ACAU220 foram alinhadas em 624
posições, sendo 304 parsimônia-informativas. As sequências do iniciador GIGA202 foram
alinhadas em 586 posições, sendo 313 parsimônia-informativas. Alinharam-se as sequências de
GLOMA690 em 298 posições, com 115 parsimônia-informativas. Por fim, as sequências do
iniciador GLOMB673 foram alinhadas em 498 posições, sendo 239 parsimônia-informativas. As
relações filogenéticas entre as sequências fúngicas foram inferidas por meio da análise de
neighbor joining (NJ) (SAITOU; NEI, 1987) no programa MEGA 4.0. Sequências do gene rRNA
18S de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e Homo sapiens foram utilizadas como outgroup.
Na análise de NJ, os “Gaps” e “missing data” sofreram deleção completa, o modelo de
substituição foi o de Jukes-Cantor com taxas uniformes entre sites. A robustez da topologia
inferida foi testada com 1000 replicatas de “bootstrap”.
As sequências obtidas com todos os iniciadores em raízes de cana-de-açúcar foram
alinhadas em 256 posições, sendo 124 parsimônio-informativas. Utilizou-se o programa DOTUR
para o agrupamento de sequências em unidades taxonômicas operacionais (UTOs), para a análise
de diversidade e para a obtenção da curva de rarefação de sequências. As sequências com uma
similaridade > 99 % foram consideradas pertencentes à mesma UTO. Foi feita comparação entre
as bibliotecas de sequências por meio do programa webLIBSHUFF (SINGLETON et al., 2001),
utilizando-se as matrizes de distâncias evolutivas calculadas.
2.2.3.4.3 Purificação dos amplicons
Os amplicons foram purificados dos géis de agarose com o kit GFX PCR DNA and Gel
Band Purification (GE Healthcare), conforme instruções do fabricante.
As bandas de DNA foram excisadas do gel de agarose e colocadas em microtubo de 1,5
mL, adicionando-se 1 µL de uma solução tampão de captura (GE Healthcare) por mg de gel. O
microtubo foi agitado vigorosamente em vortex e incubado a 60
o
C até que a agarose estivesse
completamente dissolvida. Após a dissolução total da agarose, a amostra foi centrifugada por 30
33
segundos a 12.000 g e incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Uma alíquota de
aproximadamente 300 µL da amostra foi transferida para a coluna de purificação, incubada
durante 10 minutos a temperatura ambiente, e centrifugada por 30 segundos a 12.000 g. Este
processo foi então repetido com o volume restante da amostra. O líquido que passou pela coluna
durante a centrifugação foi descartado e adicionou-se à coluna 500 µL de tampão de lavagem
(GE Healthcare), seguido de uma incubação durante 10 minutos a temperatura ambiente, e
centrifugação por 30 segundos a 12.000 g. A coluna foi então transferida para um microtubo de
1,5 mL. Para eluição do DNA adicionou-se 50 µL de TE (pH 8,0) diretamente na matriz da
coluna, incubando-se por 10 minutos, e em seguida centrifugou-se por 30 segundos a 8.000 g. O
DNA recuperado no microtubo foi novamente centrifugado por 90 segundos a 8.000 g, para
remover a resina remanescente. A solução de DNA foi então transferida para novo microtubo de
1,5 mL. A qualidade do DNA foi determinada após eletroforese em gel de agarose 1% (TBE 0,5
X) e coloração com SYBR-Green I (Moleculat Probes). O marcador de massa Low DNA Mass
Ladder (Invitrogen) foi utilizado como padrão de tamanho e quantidade de DNA.
2.2.3.4.4 Clonagem dos amplicons do gene rRNA 18S
Os amplicons de parte do gene rRNA 18S foram clonados no vetor pGEM-T Easy
(Promega), segundo as instruções do fabricante. A reação de ligação dos amplicons ao plasmídeo
foi feita utilizando-se tampão de ligação rápida 1X (30 mM Tris-HCl pH 7,8; 10 mM DDT; 1
mM ATP; 5% polietilenoglicol, PEG) e 3 U de DNA ligase T4. A solução foi incubada a 4 ºC
durante 16 horas. Em seguida, células competentes de E.coli DH5α foram transformadas por
meio de choque térmico utilizando-se os produtos da reação de ligação. As células transformadas
foram plaqueadas em meio Luria Bertani (LB-ágar) contendo ampicilina (50 µg mL
-1
) e X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactosideo, 20 µg mL
-1
). As bactérias contendo plasmídeos
recombinantes foram selecionadas para cultivo em meio LB líquido contendo ampicilina (50 µg
mL
-1
) durante 22 horas a 38 ºC, sob agitação horizontal a 300 rpm.
2.2.3.4.5 Extração do DNA plasmidial
Após o cultivo das bactérias contendo o plasmídeo recombinante em microplacas, as
34
suspensões celulares foram centrifugadas por 6 minutos a 4.000 g, a 20
o
C. O sobrenadante foi
descartado, e o pélete obtido foi lavado com 240 µL de uma solução tampão contendo 25 mM
Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0) e 50 mM de glicose, centrifugado a 20
o
C por 6
minutos e 4.000 g. Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 80 µL da solução tampão, e em
seguida, as células foram ressuspendidas por agitação. Para uma microplaca de fundo “U”
contendo 1 µL de RNAse em cada cavidade (10 mg mL
-1
) foram transferidos 60 µL de cada
suspensão de células. Em cada poço da placa foram adicionados 60 µL da solução de lise (NaOH
0,2 N e SDS 1%), a placa foi selada, a suspensão homogeneizada por inversão e incubada a
temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, foram adicionados 60 µL de solução
contendo 3M de acetato de potássio, 10% de ácido acético glacial, misturando por inversão. A
placa foi mantida por 10 minutos à temperatura ambiente, e então incubada aberta em estufa a
90
o
C por 30 minutos. Após esse tempo a placa foi resfriada em gelo por 10 minutos e
centrifugada por 4 minutos (4.000 g, 20
o
C). O sobrenadante foi transferido para uma placa de 96
poços Millipore (MAGV N22) fixada sobre uma placa de fundo “V” de 250 µL, e o conjunto
centrifugado (sem a tampa) por 4 minutos a 4.000 g e 4
o
C. Ao filtrado adicionou-se 110 µL de
isopropanol gelado e em seguida centrifugou-se por 45 minutos a 4.000 g a 4
o
C. O precipitado
de DNA foi então lavado com 180 µL de etanol 70%. Centrifugou-se novamente a 4.000 g por 5
minutos a 4
o
C. Após o descarte do sobrenadante, inverteu-se a placa sobre papel absorvente e
centrifugou-se por 1 minuto a 900 g e 4
o
C. Após secar durante 1 hora a temperatura ambiente, o
DNA foi ressolubilizado em 80 µL de água ultrapura esterilizada, durante toda a noite, e
armazenado a -20
o
C. O DNA foi quantificado através de espectrofotometria a 260 nm, e sua
integridade determinada por eletroforese em gel de agarose 1% (TBE 0,5 X).
2.2.3.4.6 Sequenciamento dos clones do gene rRNA 18S
Para o sequenciamento dos clones de fragmentos do gene rRNA 18S utilizou-se 200-500
ng de DNA plasmidial, 10 pmol do iniciador M13f (5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3’), 2 µL
de DYEnamic ET Terminator (GE Healthcare), 2 µL de solução tampão Save Money (200 mM
Tris-HCl pH 9,0; 5 mM MgCl
2
.6H
2
O) e água ultrapura para um volume final de 10 µL. A
amplificação por PCR foi realizada em um termociclador Mastercycler Gradiente (Eppendorf),
com as seguintes condições: 25 ciclos de 20 segundos a 95
o
C, 15 segundos a 50
o
C e 1 minuto a
35
60
o
C. Os produtos de PCR foram precipitados com 1/10 de volume de uma solução de acetato de
sódio 1,5 M e EDTA 250 mM e 6 volumes de etanol 95% gelado. As suspensões foram
centrifugadas a 4.000 g por 45 minutos, e o pélete lavado com etanol 70%, a temperatura
ambiente. O pélete foi seco no escuro por no mínimo 2 horas, ressuspendido em formamida e
desnaturado a 96
o
C por 5 minutos. O sequenciamento foi realizado em um sequenciador capilar
automático ABI 3100 (Applied Biosystems), de acordo com as recomendações do fabricante.
2.2.3.4.7 Análise de sequências do gene rRNA 18S
A similaridade com sequências de DNA existentes no banco de dados do GenBank foi
determinada pelo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) no NCBI (ALTSCHUL et al.,
1990). A existência de quimeras foi determinada usando o Chimera Check version 2.7 do
"Ribosomal Database Project" (RDP) (MAIDAK et al., 1999). Foi considerado que as sequências
são potencialmente quiméricas se elas têm um ponto de quebra de quimera distinto >20 no
Chimera Check. Para se confirmar a indicação do programa Chimera Check, as sequências foram
re-analisadas usando-se o BLAST depois da exclusão dos nucleotídeos anteriores e posteriores ao
ponto de quebra da quimera. Se um dos dois seguimentos, isto é, o anterior ou o posterior ao
ponto de quebra, foi mais similar a outro organismo do que o organismo mais similar à sequência
original completa, então a sequência foi considerada como quimera.
Para a análise filogenética, as sequências foram agrupadas por UPGMA, com distância-p.
Cada grupo foi formado com valor de corte de 0,4 % de distância entre as sequências. Uma
sequência representativa de cada grupo formado foi utilizada para construção da árvore
filogenética por neighbor-joining (NJ), utilizando-se o programa MEGA versão 3.1(KUMAR;
TAMURA; NEI, 2004), após alinhamento das sequências no programa ClustalW e ajuste manual.
O alinhamento das sequências foi feito com deleção completa dos “gaps” e a matriz de distância
foi calculada utilizando-se o parâmetro Jukes-Cantor como modelo de substituição, assumindo
taxa uniforme de substituição para sítios variáveis. A robustez da topologia inferida por NJ foi
testada por 1000 repetições de bootstrap (PEER; WACHTER, 1994).
Para o agrupamento de sequências em unidades taxonômicas operacionais (UTOs),
empregou-se o programa DOTUR (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2005). Para isso, foi utilizada
uma matriz de distância evolutiva calculada com o programa DNADIST, com algoritmo de
36
Jukes-Cantor, após alinhamento das sequências dos clones das bibliotecas da amostra de raízes de
cana-de-açúcar SEM QUEIMA e da amostra COM QUEIMA prévia à colheita. As sequências
com uma similaridade > 99 % foram consideradas pertencentes à mesma UTO. A estimativa de
riqueza de UTOs, pelos métodos não-paramétricos ACE-1 (CHAO; LEE, 1992) e e Chao1
(CHAO, 1984), dos índices de diversidade de Shannon, recíproco do índice de Simpson e a
cobertura de amostragem foram realizadas com o programa SPADE (CHAO; SHEN, 2003). A
comparação estatística das bibliotecas de clones foi feita por meio do programa webLIBSHUFF
(SINGLETON et al., 2001), utilizando as matrizes de distâncias evolutivas calculadas
anterormente.
2.3 Resultados e Discussão
2.3.1 Comparação dos métodos de extração de DNA das raízes
O DNA total extraído das raízes de braquiária inoculadas com FMAs após a eletroforese
pode ser visto na Figura 2. As amostras extraídas com o método adaptado de Redecker (2000)
foram as únicas a não apresentar bandas no gel. As concentrações de DNA obtidas com cada
método são apresentadas na Figura 3. Pode-se observar com base no desvio padrão, que o método
que apresenta menor variação na quantidade de DNA extraída entre amostras é o kit MoBio,
seguido pelo kit Bio101. Os métodos adaptados de Edwards et al. (1997), de Doyle e Doyle
(1990) e de Redecker (2000) apresentaram maior variabilidade entre as amostras. Porém, a
concentração dada pela comparação com marcador molecular diferiu em ordem e em magnitude
da concentração determinada com base na absorbância.
37
Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose (2%) do DNA total extraído de raízes de braquiária colonizadas com
FMAs, usando 5 diferentes métodos de extração. A espécie de FMA inoculada nas raízes de braquiária
está descrita acima do grupo de amostras. LM - marcador de massa Low DNA Mass Ladder; 1 –
extração de DNA com kit FastDNA Spin (Bio 101, Vista, Califórnia); 2 – extração de DNA com kit
UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA USA); 3 – extração de DNA com
método adaptado de Edwards et al. (1997); 4 – extração de DNA com método adaptado de Doyle &
Doyle (1990); 5 – extração de DNA com método Adaptado de Redecker (2000)
As amostras extraídas pelos métodos do kit Bio101, adaptado de Edwards et al. (1997) e
adaptado de Doyle e Doyle (1990) apresentaram DNA de melhor qualidade, com base na relação
A
260
/A
280
(Figura 4). Na Figura 4 é possível observar maior variabilidade na relação A
260
/A
280
para as amostras do kit MoBio, seguidas do kit Bio101, protocolo adaptado de Edwards (1997),
Doyle e Doyle (1990) e de Redecker (2000). Apesar disso, as amostras do kit Bio101 foram as
que apresentaram maior eficiência na amplificação do gene rRNA 18S por PCR (Tabelas 2 e 3).
A eficiência na amplificação não seguiu a ordem de concentração de DNA inicial de qualquer um
dos meios de quantificação, tampouco apresentou maior frequência de amplificação as amostras
com valores de A
260
/A
280
mais próximos a 1,8. Apesar de menor quantidade de DNA em relação
ao extraído pelos métodos adaptados de Edwards et al. (1997) e de Doyle e Doyle (1990), a
eficiência de amplificação foi maior para as amostras obtidas com o Kit Bio101. Utilizando-se o
par de iniciadores NS1 e NS8 não foi possível amplificar o DNA das amostras extraídas com o
método adaptado de Redecker (2000) ou com o adaptado de Edwards et al. (1997) (Tabela 2). A
Massa (ng)
100
60
40
20
10
5
Massa (ng)
100
60
40
20
10
5
38
maior freqüência de amplificação foi obtida com o DNA extraído com kit Bio101 (83 %),
seguida pelo DNA extraído com o método adaptado de Doyle e Doyle (1990) (67 %) e,
finalmente, pelo DNA extraído com o kit MoBio (50 %). A avaliação do gel de agarose após
eletroforese do DNA extraído sugere que esses resultados podem estar relacionados a impurezas
presentes na amostra. Após a eletroforese, nota-se um efeito de arraste nas amostras mais
concentradas, sendo mais intenso nas amostras de DNA obtidas com os métodos adaptados de
Edwards et al. (1997) e de Doyle e Doyle (1990).
Quando se utilizou o par de iniciadores SSU Glom1 e LSU Glom1, o mínimo de 3
amostras de DNA de um total de 5 de cada método apresentou amplificação positiva (Tabela 3).
Novamente, a maior frequência de amplificação foi observada com as amostras de DNA extraído
pelo kit Bio101 (100 %), seguidas do método adaptado de Edwards et al. (1997) e de Doyle e
Doyle (1990) (83 %), e pelo kit MoBio e o método adaptado de Redecker (2000) (67 %). Sendo
assim, o método usando o kit Bio101 foi o escolhido para as extrações de DNA das raízes de
cana-de-açúcar em condições do campo.
Figura 3 – Concentração de DNA de raízes de braquiária extraído com os 5 métodos. A - concentração determinada
por comparação com marcador de massa; B - concentração medida a partir da absorbância a 260 nm. As
barras verticais indicam o desvio padrão. Médias seguidas de letras iguais não diferem estatisticamente
pelo Tukey (p < 0,05). O DNA extraído com o método adaptado adaptado de Redecker (2000) não foi
visualizado no gel após a eletroforese
A
B
a
a
b
b
c
a
b
b,c
c
39
Figura 4 – Valores da relação entre as absorbâncias a 260 e 280 nm (A260/A280) do DNA extraído de raízes de
Brachiaria sp. As barras representam o desvio padrão
Pode-se concluir que as quantificações de DNA por comparação com marcador de massa
e por espectrofotometria nem sempre refletem a quantidade e a viabilidade de amplificação do
DNA em amostras ambientais, com uma comunidade microbiana diversa. Sendo assim, em
estudos de amostras ambientais não é adequado se fazer generalizações sobre a metodologia mais
eficiente para a quantificação do DNA ou para a avaliação de sua qualidade. O ideal seria um
estudo prévio para determinar as melhores condições de extração e quantificação para a
investigação pretendida.
A
260
/A
280
40
Tabela 2 - Amplificação do fragmento do gene rRNA 18S de amostras de DNA extraído de raízes de braquiária utilizando
os iniciadores NS1 e NS8
FMA inoculado
Método
A.
scrobiculata
G.
rosea
G.
clarum
G.
etunicatum
P.
brasilianum
G. rosea e S.
heterogama
FA (%)
Kit Bio101
+
+
+
+
-
+
83
Kit MoBio
-
+
+
-
-
+
50
Adaptado de Edwards et al. (1997)
-
-
-
-
-
-
-
Adaptado de Doyle & Doyle (1990)
+
+
-
+
-
+
67
Adaptado de Redecker (2000)
-
-
-
-
-
-
-
FA (%)
40
60
40
40
-
60
FA - Frequência de amplificação.
Tabela 3 - Amplificação do fragmento do gene rRNA 18S de amostras de DNA extraído de raízes de braquiária utilizando os
iniciadores SSU Glom1 e LSU Glom1
FMA inoculado
Método
A.
scrobiculata
G.
rosea
G.
clarum
G.
etunicatum
P.
brasilianum
G. rosea e S.
heterogama
FA (%)
Kit Bio101
+
+
+
+
+
+
100
Kit MoBio
-
+
+
-
+
+
67
Adaptado de Edwards et al. (1997)
+
+
+
+
-
+
83
Adaptado de Doyle & Doyle (1990)
-
+
+
+
+
+
83
Adaptado de Redecker (2000)
+
-
+
+
-
+
67
Freq (%)
60
80
100
80
60
100
FA - Frequência de amplificação.
41
2.3.2 Desenho e validação de iniciadores específicos para grupos de FMAs
Para a obtenção de sequências do gene rRNA 18S de FMAs comuns a ecossistemas
brasileiros, inicialmente foram utilizadas espécies isoladas da coleção de FMAs do Departamento
de Ciência do Solo da ESALQ, mantidas em plantas multiplicadoras em casa-de-vegetação. A
amplificação com os pares de iniciadores NSF4 e NSR1787 ou NS1 e NS8 do DNA extraído de
esporos das espécies Gigaspora margarita, Gigaspora rosea, Scutellospora heterogama, Glomus
intraradices, Glomus formasanum, Acaulospora scrobiculata e Paraglomus brasilianum
apresentou aproximadamente 30% de eficiência. No entanto, a clonagem desses fragmentos em
E. coli não foi possível. Considerando-se que existe um bom número de sequências do gene
rRNA 18S de espécies de FMAs comuns em ecossistemas brasileiros depositadas nos bancos de
dados públicos, e que o dispêndio de recursos e tempo para otimização da técnica não é
compensador, decidiu-se usar tais sequências depositadas para desenho de iniciadores específicos
para grupos de FMAs. Desse modo, nesse trabalho, foram desenhados iniciadores específicos
para os grupos de FMAs mais frequentes em amostras ambientais: Acaulosporaceae,
Gigasporaceae, Glomus Grupo A e Glomus Grupo B.
As sequências utilizadas para o desenho dos iniciadores são apresentadas na Tabela 4.
Essas foram alinhadas e agrupadas em função de sua similaridade usando-se o programa
Sequencher 4.6. A família Acaulosporaceae formou um agrupamento a 96 % de similaridade, o
Glomus Grupo B formou um agrupamento a 95 %, Gigasporaceae a 94 % e Glomus Grupo A a
93 % de similaridade.
A formação de um agrupamento somente com as sequências de Glomeromycota não foi
possível, porque a diversidade de sequências entre os FMAs é alta ao ponto de o agrupamento
apresentar sequências de outros fungos. Isto é uma das limitações para se desenhar um iniciador
que seja específico para todos os fungos de Glomeromycota. A razão para isso é a divergência
dos grupos basais de Archaeosporaceae e Paraglomeraceae. A Figura 5 apresenta a análise
filogenética das sequências do gene rRNA 18S representativas dos gupos e que foram utilizadas
para o desenho de iniciadores.
42
Tabela 4 – Sequências de fungos alvo e não-alvo obtidas do banco de dados do NCBI para o desenho de iniciadores
específicos para amplificarem o gene rRNA 18S de Glomeromycota
(continua)
Organismo
Grupo
Filo
Acesso
Acaulospora laevis
Acaulosporaceae
Glomeromycota
[AJ250847.1]
Acaulospora laevis
Acaulosporaceae
Glomeromycota
[Y17633.2]
Acaulospora longula
Acaulosporaceae
Glomeromycota
[AJ306439.1]
Acaulospora scrobiculata
Acaulosporaceae
Glomeromycota
[AJ306442.1]
Entrophospora colombiana
Acaulosporaceae
Glomeromycota
[AB220170.1]
Gigaspora albida
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852600.1]
Gigaspora albida
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852599.1]
Gigaspora decipiens
Gigasporaceae
Glomeromycota
[U96146.1]
Gigaspora gigantea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852602.1]
Gigaspora gigantea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852601.1]
Gigaspora gigantea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[EF014362.1]
Gigaspora margarita
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852605.1]
Gigaspora margarita
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852604.1]
Gigaspora margarita
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852603.1]
Gigaspora margarita
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AM181144.1]
Gigaspora margarita
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AM181143.1]
Gigaspora rosea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852608.1]
Gigaspora rosea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852607.1]
Gigaspora rosea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852606.1]
Gigaspora rosea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[X58726.1]
Scutellospora aurigloba
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ276093.2]
Scutellospora aurigloba
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ276092.2]
Scutellospora calospora
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306446.1]
Scutellospora calospora
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306445.1]
Scutellospora calospora
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306443.1]
Scutellospora castanea
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AF038590.1]
Scutellospora cerradensis
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AB041345.1]
Scutellospora cerradensis
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AB041344.1]
Scutellospora fulgida
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306435.1]
Scutellospora gilmorei
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ276094.2]
Scutellospora gregaria
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ871275.1]
Scutellospora gregaria
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ871274.1]
Scutellospora heterogama
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306434.1]
Scutellospora heterogama
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AY635832.1]
Scutellospora heterogama
Gigasporaceae
Glomeromycota
[U36593.1]
Scutellospora heterogama
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ852609.1]
Scutellospora nodosa
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306437.1]
Scutellospora projecturata
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ242729.1]
Scutellospora reticulata
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ871273.1]
Scutellospora spinosissima
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306436.1]
Scutellospora weresubiae
Gigasporaceae
Glomeromycota
[AJ306444.1]
Glomus caledonium
Glomus grupo A
Glomeromycota
[Y17653.2]
Glomus caledonium
Glomus grupo A
Glomeromycota
[Y17635.3]
Glomus clarum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ276084.2]
Glomus clarum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ852597.1]
Glomus coremioides
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ249715.1]
Glomus coronatum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ276086.2]
Glomus fasciculatum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[Y17640.2]
Glomus fragilistratum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ276085.2]
Glomus geosporum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ245637.2]
Glomus intraradices
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ301859.1]
43
Tabela 4 – Sequências de fungos alvo e não-alvo obtidas do banco de dados do NCBI para o desenho de iniciadores
específicos para amplificarem o gene rRNA 18S de Glomeromycota
(continuação)
Organismo
Grupo
Filo
Acesso
Glomus intraradices
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ852526.1]
Glomus intraradices
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AY635831.1]
Glomus intraradices
Glomus grupo A
Glomeromycota
[DQ322630.1]
Glomus intraradices
Glomus grupo A
Glomeromycota
[X58725.1]
Glomus manihotis
Glomus grupo A
Glomeromycota
[U36590.1]
Glomus manihotis
Glomus grupo A
Glomeromycota
[Y17648.3]
Glomus mosseae
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ306438.1]
Glomus mosseae
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AY635833.1]
Glomus mosseae
Glomus grupo A
Glomeromycota
[U96143.1]
Glomus mosseae
Glomus grupo A
Glomeromycota
[U96144.1]
Glomus mosseae
Glomus grupo A
Glomeromycota
[U96145.1]
Glomus sinuosum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ133706.1]
Glomus verruculosum
Glomus grupo A
Glomeromycota
[AJ301858.1]
Glomus etunicatum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ852598.1]
Glomus cf. etunicatum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[Y17644.2]
Glomus luteum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[U36591.1]
Glomus claroideum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AF139732.1]
Glomus viscosum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[Y17652.2]
Glomus etunicatum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[Y17639.2]
Glomus luteum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276089.3]
Glomus lamellosum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276087.2]
Glomus claroideum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276080.2]
Glomus claroideum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276079.2]
Glomus claroideum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276075.2]
Glomus lamellosum
Glomus grupo B
Glomeromycota
[AJ276083.3]
Archaeospora leptoticha
Ambisporaceae
Glomeromycota
[AB015052.1]
Archaeospora leptoticha
Ambisporaceae
Glomeromycota
[AB220172.1]
Archaeospora leptoticha
Ambisporaceae
Glomeromycota
[AJ006466.1]
Archaeospora leptoticha
Ambisporaceae
Glomeromycota
[AJ301861.1]
Acaulospora trappei
Archaeosporaceae
Glomeromycota
[AJ006800.1]
Acaulospora trappei
Archaeosporaceae
Glomeromycota
[AJ006801.1]
Archaeospora trappei
Archaeosporaceae
Glomeromycota
[AM114274.1]
Archaeospora trappei
Archaeosporaceae
Glomeromycota
[Y17634.3]
Diversispora spurca
Diversisporaceae
Glomeromycota
[AJ276077.2]
Diversispora spurca
Divesisporaceae
Glomeromycota
[Y17650.2]
Glomus versiforme
Diversisporaceae
Glomeromycota
[AJ276088.3]
Glomus versiforme
Diversisporaceae
Glomeromycota
[X86687.3]
Glomus fulvum
Glomeraceae
Glomeromycota
[AM418543.1]
Pacispora scintillans
Pacisporaceae
Glomeromycota
[AJ619955.1]
Pacispora scintillans
Pacisporaceae
Glomeromycota
[AJ619954.1]
Pacispora scintillans
Pacisporaceae
Glomeromycota
[AJ619953.1]
Glomus occultum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[AJ006798.1]
Glomus occultum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[AJ006799.1]
Paraglomus brasilianum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[AJ301862.1]
Paraglomus occultum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[AJ276081.3]
Paraglomus occultum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[AJ276082.2]
Paraglomus occultum
Paraglomeraceae
Glomeromycota
[DQ322629.1]
Geosiphon pyriformis
não-alvo
Glomeromycota
[AJ276074.2]
Geosiphon pyriformis
não-alvo
Glomeromycota
[AM183923.1]
Geosiphon pyriformis
não-alvo
Glomeromycota
[X86686.2]
Geosiphon pyriformis
não-alvo
Glomeromycota
[Y15904.3]
44
Tabela 4 – Sequências de fungos alvo e não-alvo obtidas do banco de dados do NCBI para o desenho de iniciadores
específicos para amplificarem o gene rRNA 18S de Glomeromycota
(continuação)
Organismo
Grupo
Filo
Acesso
Geosiphon pyriformis
não-alvo
Glomeromycota
[Y15905.3]
Buellia dialyta
não-alvo
Ascomycota
[DQ973009.1]
Capnodium coffeae
não-alvo
Ascomycota
[DQ247808.1]
Capnodium salicinum
não-alvo
Ascomycota
[DQ677997.1]
Capronia munkii
não-alvo
Ascomycota
[EF413603.1]
Capronia pilosella
não-alvo
Ascomycota
[DQ823106.1]
Cladonia caroliniana
não-alvo
Ascomycota
[AY584664.1]
Diaporthe eres
não-alvo
Ascomycota
[DQ471015.1]
Geoglossum nigritum
não-alvo
Ascomycota
[AY544694.1]
Ophioparma lapponica
não-alvo
Ascomycota
[DQ973005.1]
Orbilia auricolor
não-alvo
Ascomycota
[DQ471001.1]
Orbilia vinosa
não-alvo
Ascomycota
[DQ471000.1]
Peziza proteana f. sparassoides
não-alvo
Ascomycota
[AY544703.1]
Peltula umbilicata
não-alvo
Ascomycota
[DQ782887.1]
Peziza vesiculosa
não-alvo
Ascomycota
[DQ470995.1]
Taphrina wiesneri
não-alvo
Ascomycota
[AY548293.1]
Xylaria acuta
não-alvo
Ascomycota
[AY544719.1]
Xylaria hypoxylon
não-alvo
Ascomycota
[AY544692.1]
Amanita brunnescens
não-alvo
Basidiomycota
[AY707096.1]
Lactarius lignyotus
não-alvo
Basidiomycota
[DQ457626.1]
Pleurotus ostreatus
não-alvo
Basidiomycota
[AY657015.1]
Puccinia poarum
não-alvo
Basidiomycota
[DQ831029.2]
Rhodotorula glutinis
não-alvo
Basidiomycota
[DQ832194.1]
Rhodotorula hordea
não-alvo
Basidiomycota
[AY657013.1]
Rhodotorula mucilaginosa
não-alvo
Basidiomycota
[DQ832199.1]
Sphenospora kevorkianii
não-alvo
Basidiomycota
[DQ354520.1]
Tilletiaria anomala
não-alvo
Basidiomycota
[AY803752.1]
Trechispora sp.
não-alvo
Basidiomycota
[AY803753.1]
Tremella aurantia
não-alvo
Basidiomycota
[DQ836000.1]
Udeniomyces puniceus
não-alvo
Basidiomycota
[DQ836006.1]
Uromyces appendiculatus
não-alvo
Basidiomycota
[DQ354510.1]
Ustilago tritici
não-alvo
Basidiomycota
[DQ846895.1]
Chytriomyces hyalinus
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ536487.1]
Cladochytrium replicatum
não-alvo
Chytridiomycota
[AY546683.1]
Cyllamyces aberensis
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ536481.1]
Gaertneriomyces semiglobiferus
não-alvo
Chytridiomycota
[AF164247.2]
Olpidium brassicae
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ322624.1]
Physoderma maculare
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ536489.1]
Polychytrium aggregatum
não-alvo
Chytridiomycota
[AY601711.1]
Rhizidium endosporangiatum
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ536484.1]
Rhizophlyctis harderi
não-alvo
Chytridiomycota
[AF164272.2]
Rhizophlyctis rosea
não-alvo
Chytridiomycota
[AY635829.1]
Rhizophydium elyensis
não-alvo
Chytridiomycota
[DQ536479.1]
Rozella allomycis
não-alvo
Chytridiomycota
[AY635838.1]
Spizellomyces punctatus
não-alvo
Chytridiomycota
[AY546684.1]
Basidiobolus ranarum
não-alvo
Zygomycota
[AY635841.1]
Coemansia reversa
não-alvo
Zygomycota
[AY546685.1]
Cokeromyces recurvatus
não-alvo
Zygomycota
[AY635843.1]
Endogone lactiflua
não-alvo
Zygomycota
[DQ536471.1]
Endogone pisiformis
não-alvo
Zygomycota
[DQ322628.1]
Entomophthora muscae
não-alvo
Zygomycota
[AY635820.1]
45
Tabela 4 – Sequências de fungos alvo e não-alvo obtidas do banco de dados do NCBI para o desenho de iniciadores
específicos para amplificarem o gene rRNA 18S de Glomeromycota
(conclusão)
Organismo
Grupo
Filo
Acesso
Mortierella sp.
não-alvo
Zygomycota
[AY635828.1]
Orphella haysii
não-alvo
Zygomycota
[DQ322626.1]
Phycomyces blakesleeanus
não-alvo
Zygomycota
[AY635837.1]
Rhizopus stolonifer
não-alvo
Zygomycota
[DQ536474.1]
Rhopalomyces elegans
não-alvo
Zygomycota
[AY635834.1]
Umbelopsis ramanniana
não-alvo
Zygomycota
[DQ322627.1]
Nessa análise, verifica-se que membros das classes Archaeoporales e Paraglomerales
formam clades mais distantes filogeneticamente dos demais Glomeromycota, o que está de
acordo com outros estudos filogenéticos com base no gene rRNA 18S desses fungos
(REDECKER; MORTON; BRUNS, 2000). Além disso, com as sequências desse estudo e
utilizando o programa Sequencher 4.6, foi observado que esses dois grupos basais de FMAs estão
associados com outros fungos em um agrupamento a 90 % de similaridade, enquanto as
sequências restantes de FMAs formam um agrupamento distinto. Há formação de um
agrupamento com todos as sequências de FMAs a 89 % de similaridade, mas esse também inclui
sequências de vários outros fungos. Ainda assim, uma sequência consenso formada somente por
Glomeromycota foi obtida após alinhamento das sequências com o programa Multalin e utilizada
para o desenho de iniciadores. No entanto, não há uma região conservada no gene rRNA 18S de
Glomeromycota que exclua outros fungos. Portanto, a divergência de sequências do gene rRNA
18S dentro do grupo de Glomeromycota impossibilita o desenho de iniciadores específicos para
amplificar uma região do gene rRNA 18S comum a todos os FMAs.
Ao contrário do presente trabalho, Lee, Lee e Young (2008) desenharam os iniciadores
AML1 e AML2, específicos para todos os fungos de Glomeromycota, inclusive os grupos basais
Archaeosporales e Paraglomerales. No entanto, verifica-se 100 % de similaridade quando alinha-
se o iniciador AML1 com sequências de fungos não-alvo do banco Genbank, tais como as
sequências do gene rRNA 18S de Taphrina wiesneri (Ascomycota, acesso AY548293.1),
Amanita brunnescens (Basidiomycota, acesso AY707096.1), Rhizidium endosporangiatum
(Chytridiomycota, acesso DQ536484.1) e Endogone pisiformis (Zygomycota, acesso
DQ322628.1) (dados não mostrados). O AML2 pode ser usado alternativamente como o segundo
iniciador (reverso) na reação de amplificação, apesar de ele apresentar as 7 primeiras bases na
extremidade 3’ similar a alguns fungos não-alvo (dados não mostrados).
46
Figura 5 – Relações filogenéticas entre os diferentes fungos micorrízicos arbusculares determinadas por neighbor-
joining, com base nas sequências dos genes rRNA 18S. Essas são sequências representativas dos grupos
utilizados para o desenho de iniciadores. Os números sobre os ramos indicam a percentagem de 1000
repetições da análise de bootstrap. A barra representa duas substituições a cada 100 nucleotídeos. Os
nomes dos iniciadores desenhados nesse trabalho estão grafados em itálico e negrito, abaixo do nome dos
seus grupos – Gigasporaceae, Acaulosporaceae, Glomus grupo A e Glomus grupo B. As linhas
transversais tracejadas indicam famílias ou grupos e as linhas cheias indicam os filos
47
O baixo número de sequências e espécies de Diversisporaceae e Pacisporaceae
disponíveis nos bancos de dados públicos é insuficiente para o desenho de iniciadores
específicos, por essa razão, esses dois grupos de FMAs não foram considerados para o desenho
dos iniciadores grupo-específicos.
Desenho de iniciadores grupo-específicos. Utilizando os programas Beacon Designer
7.02, Primer3 e a busca manual, foram encontradas por volta de 150 sequências de
oligonucleotídeos com potencial para serem usadas como iniciadores. Para os ensaios de PCR,
sete desses oligonucleotídeos foram selecionados com base na avaliação de especificidade
utilizando o BLAST e o alinhamento com sequências alvo e não-alvo, e segundo as propriedades
dos iniciadores avaliadas no programa Oligo Analyzer. O programa Beacon Designer 7.02 não
possibilitou o desenho de iniciadores específicos. As sequências dos sete iniciadores selecionados
são apresentadas na Tabela 5, juntamente com suas respectivas temperaturas de desnaturação
(Tm), calculada com o programa Oligo Analyzer, e tamanho esperado dos amplicons quando
utilizados com o iniciador nu-SSU-1196 modificado.
Nas Figuras 6 a 11 são mostrados os alinhamentos dos iniciadores com as sequências alvo
e diversas sequências não-alvo, representadas pelos grupos filogenéticos Glomeromycota,
Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota, Fanerógamas e Homo sapiens.
Tabela 5 – Iniciadores selecionados e suas respectivas temperaturas de desnaturação (Tm) e
tamanho de amplicons esperados quando utilizados com o iniciador nu-SSU-1196
modificado
Iniciador
Sequência (5' → 3')
Especificidade
Tm (ºC)
Tamanho
esperado do
amplicon (pb)
ACAU220
GGG GTT TCC CAT TGG TGR ATC AT
Acaulosporaceae
64.6
995
GLOMB652
TAA GGG GTA TGA ACT GGT GTA G
Glomus Grupo B
60.3
565
GLOMB673
GTC AAT TTC TCA CCT TCT GGA G
Glomus Grupo B
60.3
544
GIGA202
AAA CCA ATA RCC TTC GGG TTT C
Gigasporaceae
60.3
987
GIGA615
TAG TTG AAT TTC GGG GTT CTA C
Gigasporaceae
58.4
574
GLOMA189
TTA GAT AAA AAA CCA ATA TCG GG
Glomus Grupo A
55.7
1018
GLOMA690
CGT AAT GCC ATT AAT TTG GTG T
Glomus Grupo A
56.5
517
48
ACAU220 GGGGTTTCCCATTGGTGRATCAT
Acaulospora longula TTTTGGGGTTTCCCATTGGTGGATCATAATAACTTT
Acaulospora scrobiculata GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT
Acaulospora laevis GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT
Entrophospora colombiana GCAAGGGGTTTCCCATTGGTGAATCATAATAACTTT
Scutellospora heterogama -CTTCGGGTTTCAC-TTGGTGATTCATGATAACTTT
Pacispora scintilans TTCG-GGGTTTC-CTTTGGTGATTCATGATAACTTT
Glomus intraradices GCAACCGA-TTC-CCTTGGTGATTCATAATAACTTT
Glomus etunicatum GCAACCAACTAAACCTTGGTGATTCATGATAACTTT
Paraglomus brasilianum TATGCCGG--AA-CTGTGGTGAATCATGATAACTTG
Archaeospora leptoticha TTCGGGCGAGTCCC-TTGGTGATTCATGGTAACTTT
Pleurotus ostreatus -CTCGCCGCTCCC--TTGGTGATTCATAATAACTTC
Rhizidium endosporangiatum -GCAACCGGTTCT--TTGGTGATTCATGGTAACTTT
Chytriomyces hyalinus ---AAACGGTTCT--TTGGTGATTCATAGTAACTTT
Capnodium coffeae -CCCTTCGGGGCTCAATGGTGAATCATAATAACTTA
Ustilago tritici -CTCCTCGGAGTT---TGGCGATTCATAATAACTTC
Rhizopus stolonifer TAAAACCTGTTTC--TTGGTGAATCATAATAATTAA
Endogone pisiformis -AACCACTCATC----TGGTGATTCATAATAACTTT
Cladonia caroliniana -CCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTC
Zea mays TCTGCCCGCCGAT--CCGATGATTCATGATAACTTG
Glycine max TCTGCCTGTTGCT--TTGATGATTCATGATAACTCG
Figura 6 – Local de ancoramento do iniciador ACAU220 (5’→ 3’) nas sequências do gene rRNA 18S de FMAs e
outros organismos. O iniciador e o local de iniciação nas sequências alvo são mostrados em negrito.
Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador estão marcadas em cinza
GIGA202 AAACCAATARCCTTCGGGTTTC
Scutellospora heterogama AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora calospora AGAT-GAAAACCAATAGCCTTCGGGTTTCCAC----TTGGTG
Scutellospora projecturata AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCCAC----TTGGTG
Gigaspora gigantea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG
Gigaspora margarita AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG
Gigaspora rosea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG
Scutellospora gilmorei AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora fulgida AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora spinosissima AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora gregaria AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora weresubiae AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AT----ATGGTG
Scutellospora cerradensis AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Gigaspora albida AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCC-C----TTGGTG
Scutellospora nodosa AGGT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTCCAG----TTGGTG
Scutellospora castanea AGAT-AAAAACCAATAACCTTCGGGTTTC-AC----TTGGTG
Scutellospora aurigloba AGAT-AAAAACCAATAGCCTTCGGGTTTCAAC----TTGGTG
Pacispora scintillans AGATAAAAAACCAATAGCCCTTCGGGGTT--TCCT-TTGGTG
Glomus intraradices AGATAAAAAACCAATATCGGGCAACCGAT--TCCC-TTGGTG
Acaulospora longula AGATAAAAAACCAATAACTCCTTTTGGGGTTTCCCATTGGTG
Glomus etunicatum AGATAAAAAACCAACAGTTGGGCAACCAACTAAACCTTGGTG
Paraglomus brasilianum AGATAAAAAGCCAACCCGGCTTATGCCGGAACT---GTGGTG
Archaeospora leptoticha AGATACAAAACCAATCTCGTCTTCGGGCGAGTCCC-TTGGTG
Capnodium coffeae AGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCAA-----T-GGTG
Cladonia caroliniana AGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCC------TTGGTG
Pleurotus ostreatus AGATAAAAAACCGACGCGGCTCGCCGCTCCC-----TTGGTG
Endogone pisiformis AGATAAAAAACCAACGTGGGCAACCACTCAT-----CTGGTG
Ustilago tritici AGAT-AAAAACC-ATCCTCCTCGGAGT---------TTGGCG
Chytriomyces hyalinus AGATAAAAAACCAACCCGGAAACGGTT-C-T-----TTGGTG
Rhizidium endosporangiatum AGATAAAAAACCAACCCGGGCAACCGGTTCT-----TTGGTG
Rhizopus stolonifer AGAT--AAAACCAACGCGGGGTAAAACCTGTTTC--TTGGTG
Zea mays AGATAAAAGGCTGACGCGGGCTCTGCCCGCCGAT--CCGATG
Glycine max AGATAAAAGGTCAACACAGGCTCTGCCTG-TTGCT-TTGATG
Homo sapiens AGAT-CAAAACCAACCCGGTCAGCCCCTCTCCGGCCCCGGCC
Figura 7 – Local de ancoramento do iniciador GIGA202 (5’→ 3’) nas sequências do gene rRNA 18S de FMAs e
outros organismos. O iniciador e o local de iniciação nas sequências alvo são mostrados em negrito.
Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador estão marcadas em cinza
49
GIGA615 TAGTTGAATTTCGGGGTTCTAC
Scutellospora heterogama GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCCACCGTTG
Scutellospora calospora GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora projecturata GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCATTG
Gigaspora gigantea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Gigaspora margarita GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Gigaspora rosea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora gilmorei GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora fulgida GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora spinosissima GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora gregaria GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora weresubiae GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora cerradensis GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Gigaspora albida GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTCTACCGTTG
Scutellospora nodosa GCTCGTAGTTGAATTTCGGAATTTTACCGTTG
Scutellospora castanea GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTTTACCGTTG
Scutellospora aurigloba GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTCTACCGTCG
Pacispora scintillans GCTCGTAGTTGAATTTCGAAATTTTTTTATCG
Glomus intraradices GCTCGTAGTTGAATTTCGGGGTTAGTAGGTTG
Acaulospora longula GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTTGTCAGTTG
Glomus etunicatum GCTCGTAGTTGAATTTCGGGATTGACACATCG
Paraglomus brasilianum GCTCGTAGTTGAACTTCAGGCCTGGCTGGACG
Archaeospora leptoticha GCTCGTAGTTGAATTTTGGGTCTGGCCGGGCG
Capnodium coffeae GCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCG
Cladonia caroliniana GCTCGTAGTTGAAACTTGGGCCTGGCTGACCG
Pleurotus ostreatus GCTCGTAGTTGAACTTCAGACCTGGCTGGGCG
Endogone pisiformis GCTCGTAGTTGAATTTTAGCTCTGGCTGGGCG
Ustilago tritici GCTCGTAGTTGAAGTTTGGTCTCGGACGCTGG
Chytriomyces hyalinus GCTCGTAGTTGAATTTTGGGCCGGGTTTGAAG
Rhizidium endosporangiatum GCTCGTAGTTGAATTTTGGGCTGGGCTGGGCG
Rhizopus stolonifer GTCCGTAGTCAAACTTTAGTCTT--ACTGGCG
Zea mays GCTCGTAGTTGGACCTTGGGCCGGGCCGGGTG
Glycine max GCTCGTAGTTGGACCTTGGGTTGGGTCGATCG
Homo sapiens GCTCGTAGTTGGATCTTGGGAGCGGGCGGGCG
Figura 8 – Local de ancoramento do iniciador GIGA615 (5’→ 3’) nas sequências do gene rRNA 18S de FMAs e
outros organismos. O iniciador e o local de iniciação nas sequências alvo são mostrados em negrito.
Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador estão marcadas em cinza
GLOMB652 TAAGGGGTATGAACTGGTGTAG
Glomus luteum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACG
Glomus lamellosum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGNTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC
Glomus etunicatum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTCAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC
Glomus viscosum TGCCTTAAGGGGTATGAACTGGTGTAGTGAATTTCTCACCTTCTGGAG-AACC
GLOMB673 GTCAATTTCTCACCTTCTGGAG
Pacispora scintilans AATCAACAGG--TTCGTACTGATTTTAAGAATTTCT-ACCTTCTGGAG-AACC
Glomus intraradices ATGCCTCTGG--TATGTACTGGTCTCACTGATTCCT--CCTTCCTTATGAACC
Acaulospora longula GGCTTAACTG--TCCGTATTGACTTGATGGATTCTT-ACCTTC-TGAGTAACC
Scutellospora heterogama GGG-CTATTG--TCTGTACTGGTGTGTGGAATTTCT-ACCTTCTGGGG-AACT
Paraglomus brasilianum GCCTTCCGGG--TGAGTACTGTCTGTGGTCGGGTCCTACCTTCTGGCG-AAGC
Archaeospora leptoticha ACCT-TCTGG--TGAGCACTGTTCCGACGCCGGGCCTATCCTTCTGGTGAGAC
Pleurotus ostreatus_ CG-CTTAACGG-CGTGTACTGT-CT-GGCTGGGCCTTACCTCTTGGTG-AGCC
Rhizidium endosporangiatum CGCCGCAA-GG-TGAGCACTGCT-C-CGGTCTGG-TCTTTCCTTCTGGGGATC
Chytriomyces hyalinus TGCC--AATGG-CATGTACT--T-TCGGCC-TGG-TCTTTCCTTGTGGGGAAC
Endogone pisiformis TGCCTTTACGG-TGGGTACTACT-TTGGCTGGGGTTCACCTTCTGGTG-AGCT
Rhizopus stolonifer GGTCTTCATTGACC-AAGCTCATTGC-TGCCGGAGACTCCATGTTCATTA-GG
Cladonia caroliniana CGCCTCACCGCGT--GCACTGGC-TCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGG-AACC
Ustilago tritici TGCTTCATTG--CATGTACTTG-GC-GGTCCGAGACTTCCTTCCTGGTGAACG
Capnodium coffeae CGCCTCACCGCGT--GTACTGGT-CCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGG-AACC
Zea mays CGCCGTACGGG-CA-GAACCGA--CCGGCTCGA---C--CCTTCTGCCGGCGA
Glycine max CGCC-TCCGGTGT--GCACCGGT-CGGCTCGTCCCTTCTGCCGGCGAT-GCGC
Homo sapiens CGCCGCGAGGCGAGCCACCGCCCGT-CCCCGCCCCTTGCCT-CTCGGCGCCCC
Figura 9 – Locais de ancoramento dos iniciadores GLOMB652 e GLOMB673 (5’→ 3’) nas sequências do gene
rRNA 18S de FMAs e outros organismos. Os iniciadores e os locais de de iniciação nas sequências alvo
são grafados em negrito. Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador GLOMB652 estão
marcadas em cinza, e marcadas em preto para o iniciador GLOMB673
50
GLOMA189 TTAGATAAAAAACCAATATCGGG
Glomus manihotis TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-AAACCGA
Glomus clarum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-AAACCGA
Glomus intraradices TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus verruculosum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus caledonium TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus fragislistratum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus mosseae TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus coronatum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus geosporum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Glomus sinuosum TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGGGCAACCTG
Glomus coremioides TATTTATTAGATAAAAAACCAATATCGGG-CAACCGA
Acaulospora longula TATTTATTAGATAAAAAACCAATAACTCC-TTTTGGG
Glomus etunicatum TATTTATTAGATAAAAAACCAACAGTTGGGCAACCAA
Paraglomus brasilianum TATTTATTAGATAAAAAGCCAACC-C-GG-CTTA-TG
Archaeospora leptoticha TATTTATTAGATACAAAACCAATCTCGT--CTTCGGG
Scutellospora heterogama TATTTATTAGATAAAAA-CCAATAAC----CTTCGGG
Pacispora scintilans TATTTATTAGATAAAAAACCAATA--GCC-CTTCGGG
Pleurotus ostreatus TATTTATTAGATAAAAAACCGACGC--GG-CT-CGCC
Rhizidium endosporangiatum TATTTATTAGATAAAAAACCAACC-CGGG-CAACCGG
Chytriomyces hyalinus TATTTATTAGATAAAAAACCAACC-CGG---AAACGG
Endogone pisiformis TATTTATTAGATAAAAAACCAACGT-GGGC-AACCAC
Zea mays CATTTATTAGATAAAAGGCTGACG-CGGG-CTCTGCC
Glycine max CATTTATTAGATAAAAGGTCAACA-CAGG-CTCTGCC
Rhizopus stolonifer CACTTATTAGATAAAA--CCAACG-CGGG-GTAAAAC
Cladonia caroliniana TATTTATTAGATAAAAAACCAAT---GCC-CTTCGGG
Ustilago tritici TATTTATTAGATAAAAA-CCA-TC-CTC--CTCGGAG
Capnodium coffeae TATTTATTAGATAAAAAACCAAT---GCC-CTTCGGG
Figura 10 – Local de ancoramento do iniciador GLOMA189 (5’→ 3’) nas sequências do gene rRNA 18S de FMAs e
outros organismos. O iniciador e o local de iniciação nas sequências alvo são mostrados em negrito.
Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador estão marcadas em cinza
51
GLOMA690 CGTAATGCCATTAATTTGGTGT
Glomus manihots GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Glomus clarum (1) GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Glomus clarum (2) GAACTGTAATGTCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Glomus intraradices GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Glomus verruculosum AAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG
Glomus caledonium GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG
Glomus fragilistratum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACCGGG
Glomus mosseae GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTACGGGG
Glomus coronatum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG
Glomus geosporum GAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTCACGGGG
Glomus sinuosum GAGCCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Glomus coremioides GAGCCGTAATGTCATTAATTTGGTGTTGCGGGG
Acaulospora longula TAACCAGCATGCTATTAAGTTAGTGCGTTGGGG
Pacispora scintilans GAACCTTAATGTCATTTATTTGATGTTTTGGGA
Glomus etunicatum GAACCGCGATGCCCTTAATTGGGTGTCACGGGG
Paraglomus brasilianum GAAGCGTCATGGCCTTAACCGGCCGTGGCGGGG
Archaeospora leptoticha GAGACGGCATGCCCTTCGCTGGGTGTGTCGGGG
Scutellospora heterogama GAACTATCATGTTATTAATTTAGCGTGGTAGGA
Pleurotus ostreatus GAGCCGGCGTGCCCTTTATT-GGTGTGCGTTGG
Rhizidium endosporangiatum GATCTAGCGTGCGCTTCACT--GTGTGCGTTAG
Chytriomyces hyalinus GAACACGTGTGCACTTTACTGTGTGTGCGTGGG
Endogone pisiformis GAGCTGGCATGTTCTTAACTGGATGTGTCAGGG
Ustilago tritici -GAACGGCCG--CCTTCG---GGTGGTCC---G
Capnodium coffeae GAACCG-CATGCCCTTCACTGGGCGTGTGTGGG
Cladonia caroliniana -AACCG-CATGGCCTTCATT-GGTCGTGTTGGG
Rhizopus stolonifer GTTCATTAGGGGAAAATCTCTAGGGGTTTTTTT
Zea mays ATGCGCTCCTGGCCTTAACTGGCCGGGTCGTGC
Glycine max ATGCGCTCCTGTCCTTAACTGGCCGGGTCGTGC
Homo sapiens GCCCCCTCGATGCTCTTAGCTGAGTGTCCCGCG
Figura 11 – Local de ancoramento do iniciador GLOMA690 (5’→ 3’) nas sequências do gene rRNA 18S de FMAs e
outros organismos. O iniciador e o local de iniciação nas sequências alvo são mostrados em negrito.
Similaridades das sequências dos organismos e do iniciador estão marcadas em cinza
Utilizando-se as amostras de DNA de FMAs provenientes de vasos de multiplicação em
casa-de-vegetação, verificou-se que a temperatura de 61 ºC foi adequada para o pareamento dos
iniciadores desenhados e para a eficiente amplificação do gene rRNA 18S (Figura 12). Quando
testados com amostras de DNA de FMAs não-alvo, os iniciadores utilizados não permitem a
amplificação do DNA (Figura 13). O iniciador ACAU469 mostrou-se inespecífico (Figura 13) e
o iniciador GLOMA348 apresentou pouca repetibilidade nas reações de amplificação. Em razão
disso, esses dois iniciadores foram excluídos das análises posteriores. Foram feitas tentativas para
a amplificação por meio de PCR multiplex, onde todos os 4 iniciadores foram usados ao mesmo
tempo. Entretanto, não foi possível a amplificação.
Nas amostras de raízes de Brachiaria sp. e de cana-de-açúcar inoculadas com FMAs em
casa-de-vegetação, os iniciadores também amplificaram especificamente o DNA alvo (Figura
12). No entanto, em amostras de raízes ambientais do experimento com gramíneas em pradaria
dos EUA, foi necessária a utilização de nested PCR para a amplificação do gene rRNA 18S
usando os iniciadores grupo-específicos. Sugere-se que esse fato seja decorrente da baixa
52
concentração do DNA alvo em relação ao DNA total das amostras. Com exceção dos iniciadores
para Gigasporaceae, todos os outros iniciadores amplificaram DNA de amostras de raízes da
pradaria. No entanto, a concentração de amplicons obtida com o iniciador ACAU220 foi baixa e
não foi possível sua clonagem e sequenciamento. Os produtos de PCR usando DNA das amostras
de raízes de pradaria foram clonados e sequenciados para verificar a especificidade dos
iniciadores e determinar a estrutura da comunidade de FMAs. Pela análise de similaridade e
filogenética, os iniciadores GLOMA189 e GLOMA690 amplificaram especificamente o DNA de
Glomus grupo A em raízes de pradaria (Figuras 14 e 15).
Figura 12 – Amplificação por PCR do DNA de raízes de plantas cultivadas em casa-de-vegetação e inoculadas com
FMAs. 1, Brachiaria sp. inoculada com Acaulospora scrobiculata (Acaulosporaceae); 2, Brachiaria sp.
inoculada com Gigaspora rosea (Gigasporaceae); 3, Brachiaria sp. inoculada com Glomus clarum
(Glomus grupo A); 4, Brachiaria sp. inoculada com Glomus etunicatum (Glomus grupo B); 5,
Brachiaria sp. inoculada com G. rosea e Scutellospora heterogama; 6, cana-de-açúcar inoculada com
mistura de FMAs (G. clarum, Glomus intraradices, G. rosea, Paraglomus sp., Acaulospora sp.); 7,
cana-de-açúcar não-inoculada; 8, Controle negativo da primeira reação de PCR; 9, Controle negativo da
segunda reação de PCR; 10, DNA de Glomus caledonium (Glomus grupo A) de vaso de multiplicação;
11, DNA de Acaulospora longula (Acaulosporaceae) de vaso de multiplicação; 12, DNA de
Scutellospora calospora (Gigasporaceae) de vaso de multiplicação; 13, DNA de Glomus claroideum
(Glomus grupo B) de vaso de multiplicação; M, marcador molecular PCR markers (Promega); pb,
tamanho, em pares de base, dos fragmentos do marcador molecular
Iniciador
Iniciador:
Iniciador:
Amostra:
Amostra:
1000
750
500
300
150
50
pb
1000
750
500
300
150
50
pb
53
Figura 13 – Amplificação do gene rRNA 18S por PCR em soluções contendo mistura de DNA não-alvo para cada
iniciador. Canaletas 1 – Iniciador ACAU220 e 2 – Iniciador ACAU469, específicos para
Acaulosporaceae, em DNA de Glomus claroideum, G. caledonium, Scutellospora calospora, Agaricus
sp., Saccharomyces sp.; Canaletas 3 – Iniciador GLOMB652 e 4 – Iniciador GLOMB673, específicos
para Glomus grupo B, em DNA de Acaulospora longula, G. caledonium, S. calospora, Agaricus sp.,
Saccharomyces sp.; Canaletas 5 – Iniciador GLOMA189, 6 – Iniciador GLOMA348 e 7 – Iniciador
GLOMA690, específicos para Glomus grupo A, em DNA de A. longula, G. claroideum, S. calospora,
Agaricus sp., Saccharomyces sp.; Canaletas 8 – Iniciador GIGA202 e 9 - Iniciador GIGA615,
específicos para Gigasporaceae, em DNA de A. longula, G. claroideum, G. caledonium, Agaricus sp.,
Saccharomyces sp. M – Marcador molecular PCR Markers (Promega). pb, tamanho, em pares de base,
dos fragmentos do marcador molecular
pb
1000
750
500
300
150
50
54
Figura 14 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de raízes de pradaria,
utilizando o iniciador GLOMA189 e sequências de FMAs, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. A barra
representa uma substituição a cada 100 nucleotídeos. As sequências de raízes com adubação
nitrogenada estão grafadas em preto e negrito, e das raízes sem adubação estão grafadas em vermelho e
negrito
55
Figura 15 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de raízes de pradaria,
utilizando o iniciador GLOMA690 e sequências de FMAs, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. A barra
representa uma substituição a cada 100 nucleotídeos. As sequências de raízes com adubação
nitrogenada estão grafadas em preto e negrito, e das raízes sem adubação estão grafadas em vermelho e
negrito
Dessa forma, confirma-se a especificidade dos iniciadores GLOMA189 e GLOMA690
para amplificação do grupo alvo Glomus grupo A. No entanto, os iniciadores GLOMB652,
GLOMB673 e AM1 apresentaram viés de especificidade, amplificando apenas sequências
relacionadas a Ascomycota, segundo as análises por BLAST (dados não mostrados). Esses
resultados corroboram os resultados obtidos por Jumpponen et al. (2005), os quais amplificaram
as mesmas amostras de DNA, utilizando os iniciadores NS31 e AM1. Nesse primeiro trabalho,
verificou-se que todas as sequências obtidas do referido gene eram relacionadas a Glomus grupo
56
A.
Portanto, na análise final após o sequênciamento dos amplicons de raízes da pradaria, os
iniciadores GLOMA189 e GLOM1690 foram confirmados como específicos e funcionais em
amostras ambientais. Os iniciadores GLOMB652, GLOMB673, GIGA202 e GIGA615 foram
funcionais com amostras de raízes inoculadas com um único FMA, em condições de casa-de-
vegetação, mas em amostras ambientais, os iniciadores GLOMB652 e GLOMB673 foram
inespecíficos e os iniciadores GIGA202 e GIGA615 não amplificaram o DNA. Como não foi
possível a clonagem e sequenciamento do fragmento amplificado com o iniciador ACAU220, não
se pode afirmar se esse iniciador é funcional ou não.
2.3.3 Estrutura da comunidade de FMAs em raízes e solo rizosférico de cana-de-açúcar sob
diferentes manejos de colheita
2.3.3.1 Atributos químicos do solo
Dos atributos químicos do solo avaliados, os valores de pH foram os que apresentaram
diferenças significativas entre os manejos de colheita avaliados, enquanto a soma de bases (SB) e
saturação por Mg foram afetados pela interação dos fatores manejo e variedade de cana-de-açúcar
(Tabela 6). O solo sob o manejo SEM QUEIMA apresentou valor de pH ligeiramente maior (5,9
versus 5,8) (Tabela 7). Com relação à SB, o solo sob a variedade RB72454 SEM QUEIMA e sob
a variedade SP801842 COM QUEIMA apresentaram valores 1,13 e 1,11 vezes maiores,
respectivamente, em relação ao solo sob RB72454 COM QUEIMA (Tabela 8). O solo sob a
variedade SP801842 SEM QUEIMA apresentou valor de % Mg 1,13 vezes maior em relação ao
solo sob SP813250 SEM QUEIMA.
Apesar de maior aporte de material vegetal ao solo, os teores de carbono orgânico no solo
não diferiram entre os tratamentos sob os dois manejos de colheita. Tal resultado pode ser devido
ao pouco tempo decorrido após a colheita, sendo que a palhada ainda estava sobre o solo na
época de amostragem. Provavelmente, parte do carbono não foi incorporado à matéria orgânica
do solo mesmo 84 dias após a colheita. Nenhuma das 36 amostras apresentou Al trocável. Isso se
deve ao fato de o pH estar próximo de 6,0, onde todo o Al se precipita, e também aos altos teores
das bases Ca, Mg e K, sendo que a saturação da CTC por esses elementos variou de 68 % a 72 %.
57
Tabela 6 - Teste de F na análise da variância dos atributos químicos do solo para os
fatores Manejo, Variedade e Interação Manejo x Variedade
Variáveis
Manejo
Variedade
Manejo*Variedade
Solo
pH
*
ns
ns
H+Al (mmol
c
.kg
-1
)
ns
ns
ns
Ca (mmol
c
.kg
-1
)
ns
ns
ns
Mg (mmol
c
.kg
-1
)
ns
ns
ns
K (mmol
c
.kg
-1
)
ns
ns
ns
P (mg.kg
-1
)
ns
ns
ns
C orgânico (g.kg
-1
)
ns
ns
ns
CTC (mmol
c
.kg
-1
)
ns
ns
ns
Soma de Bases
ns
ns
**
Saturação por bases
(V%)
ns
ns
ns
Saturação por Ca (%)
ns
ns
ns
Saturação por Mg (%)
ns
ns
**
Saturação por K (%)
ns
ns
ns
Saturação por Na (%)
ns
ns
ns
ns – não significativo. * - p < 0,05; ** - p < 0,01
Tabela 7 - Valores médios das variáveis analisadas sob os manejos SEM
QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA (CQ) prévia à colheita
Variáveis
SQ
CQ
Solo
pH
5,9 ± 0,22 A
5,8 ± 0,21 B
H+Al (mmol
c
.kg
-1
)
12,2 ± 1,0 A
12,8 ± 1,00 A
Ca (mmol
c
.kg
-1
)
18,5 ± 1,8 A
18,3 ± 2,97 A
Mg (mmol
c
.kg
-1
)
7,6 ± 0,86 A
7,5 ± 0,92 A
K (mmol
c
.kg
-1
)
4,1 ± 0,86 A
3,8 ± 0,75 A
P (mg.kg
-1
)
12,1 ± 4,56 A
13,7 ± 4,09 A
C orgânico (g.kg
-1
)
8,6 ± 1,99 A
9,1 ± 1,16 A
SB (mmol
c
.kg
-1
)
30,2 ± 2,53 A
29,7 ± 3,89 A
CTC (mmol
c
.kg
-1
)
42,4 ± 2,55 A
42,5 ± 3,88 A
Saturação por bases
(V%)
71,0 ± 2,76 A
69,4 ± 3,28 A
Saturação por Ca (%)
43,6 ± 1,87 A
42,8 ± 1,83 A
Saturação por Mg (%)
17,8 ± 2,39 A
17,6 ± 3,55 A
Saturação por K (%)
9,6 ± 1,58 A
9,0 ± 1,16 A
Os valores correspondem à Média ± Desvio Padrão (seis repetições).
Letras iguais dentro da linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey-Krumer (P≤0.05).
SB - Soma das bases Ca
+
, Mg
+
e K
+
.
58
Tabela 8 - Valores médios dos atributos químicos do solo na interação dos fatores Manejo de Colheita e Variedade
Atributo
SQ
CQ
SP813250
SP801842
RB72454
SP813258
SP801842
RB72454
pH
5,9 ± 0 ,23 a
6,0 ± 0,17 a
6,0 ± 0,25 a
5,8 ± 0,15 a
5,7 ± 0,23 a
5,8 ± 0,26 a
H+Al (mmol
c
.kg
-1
)
12,8 ± 1,17 a
11,7± 0,82 a
12,2 ± 0,75 a
12,5 ± 0,55 a
13,0 ± 1,26 a
12,8 ± 1,17 a
Ca (mmol
c
.kg
-1
)
18,2 ± 0,98 a
18,0± 1,10 a
19,3 ± 2,73 a
18,3 ± 3,14 a
19,7 ± 2,07 a
16,8 ± 3,31 a
Mg (mmol
c
.kg
-1
)
7,0 ± 0,63 a
7,8± 0,41 a
7,8 ± 1,17 a
7,7 ± 0,82 a
7,5 ± 0,55 a
7,3 ± 1,37 a
K (mmol
c
.kg
-1
)
4,0 ± 0,90 a
3,7± 0,72 a
4,5 ± 0,88 a
3,8 ± 0,84 a
3,8 ± 0,85 a
3,8 ± 0,68 a
P (mg.kg
-1
)
11,2 ± 0,98 a
11,7± 6,68 a
13,3 ± 4,68 a
13,3 ± 3,61 a
13,2 ± 3,76 a
14,5 ± 5,32 a
C orgânico (g.kg
-1
)
9,1 ± 0,60 a
7,4± 2,40 a
9,4 ± 2,12 a
8,3 ± 0,70 a
9,9 ± 1,00 a
8,9 ± 1,20 a
SB (mmol
c
.kg
-1
)
29,2 ± 1,47ab
29,7± 1,21ab
31,7 ± 3,72 a
30,0 ± 4,15ab
31,2 ± 2,32 a
28,0 ± 4,77 b
CTC (mmol
c
.kg
-1
)
42,0 ± 1,41 a
41,3± 1,63 a
43,8 ± 3,66 a
42,5 ± 4,14 a
44,2 ± 2,32 a
40,8 ± 4,71 a
Saturação por bases
(V%)
69,4 ± 3,26 a
71,5± 1,27 a
72,2 ± 2,91 a
70,0 ± 3,20 a
70,1 ± 3,23 a
68,1 ± 3,60 a
Saturação por Ca (%)
43,3 ± 1,85 a
43,5 ± 1,79 a
44,0 ± 2,02 a
42,9 ± 1,83 a
44,5 ± 1,99 a
41,0 ± 1,95 a
Saturação por Mg (%)
16,7 ± 2,37 b
18,9 ± 1,72 a
17,8 ± 3,25ab
18,0 ± 3,08ab
17,0 ± 3,53ab
17,9 ± 3,68ab
Saturação por K (%)
9,4 ± 1,61 a
8,9 ± 1,01 a
10,4 ± 1,31 a
9,1 ± 0,63 a
8,7 ± 1,03 a
9,3 ± 1,53 a
Os valores correspondem à Média ± Desvio Padrão (seis repetições).
Letras iguais dentro da linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey-Krumer (P≤0.05).
SB - Soma das bases Ca
+
, Mg
+
e K
+
.
59
A palhada deixada sobre o solo em manejo de colheita de cana-de-açúcar sem queima
prévia pode influenciar os atributos físicos, químicos e biológicos do solo. No entanto, os
trabalhos sobre alteração dos atributos químicos em função apenas da palhada aplicada no solo
são escarços na literatura. Por isso, essa área de pesquisa carece de estudos mais aprofundados
para se conhecer os esfeitos da aplicação de palhada sobre os processos bioquímicos e físicos no
solo.
2.3.3.2 Produtividade da cana-de-açúcar
O uso ou não da prática da queima previamente à colheita da cana-de-açúcar pode mudar
o equilíbrio do agrossistema, por afetar, entre outras coisas, a estrutura da comunidade
microbiana, afetando alguns processos bioquímicos importantes. O depósito de palha sobre o solo
pode também interferir na produtividade da cana-de-açúcar (RESENDE et al., 2006). No entanto,
no presente estudo, a produtividade da cana-de-açúcar não diferiu entre os dois manejos de
colheita, entre as variedades ou entre as interações dos fatores manejo e variedade (p>0,05). No
primeiro corte, a cana-de-açúcar colhida com manejo SEM QUEIMA apresentou uma
produtividade de 127,4 Mg.ha
-1
, enquanto que a colhida COM QUEIMA prévia apresentou uma
produtividade de 138,6 Mg.ha
-1
(Tabela 9).
Tabela 9 - Produtividade, em Mg.ha
-1
, das três variedades de cana-de-açúcar sob
os dois manejos de colheita
Variedade
Manejo
Média
SEM QUEIMA
COM QUEIMA
SP813250
135,0 7,3
134,1 14,2
134,6 10,1
SP801842
122,6 9,5
143,5 14,1
133,0 15,7
RB72454
124,7 1,7
138,4 13,8
131,5 11,5
Média
127,4 8,3
138,6 12,8
133,0 12,0
Os dados representam média de três repetições desvio padrão da média.
Apesar de maior aporte de material orgânico na forma de palhada, o qual pode variar de 7
a 15 Mg.ha
-1
.ano
-1
na colheita mecanizada (CAMPOS, 2003), isso não foi suficiente para causar
60
mudanças no sistema de modo a aumentar a produção pelo menos no período avaliado. Tal
resultado pode ser devido ao pouco tempo com manejo SEM QUEIMA, tendo havido apenas
uma colheita após implantação do experimento e, desse modo, havendo pouca influência da
palhada que foi depositada sobre o solo. Isso é demonstrado pela ausência de diferença no teor de
carbono orgânico do solo entre o cultivo COM QUEIMA e o SEM QUEIMA prévia da cana-de-
açúcar (Tabela7). Além do teor de carbono, a maioria dos atributos químicos também não
respondeu com os tratamentos de manejo de colheita. Mudanças de produtividade também não
foram encontradas no primeiro corte da cana-de-açúcar em um ensaio de longa duração, em que
Resende et al. (2006) mostram que aumentos na produtividade de cana-de-açúcar COM
QUEIMA em relação à SEM QUEIMA apareceram somente na terceira colheita de um ciclo de
produção de sete cortes e a partir da segunda colheita no segundo ciclo de seis cortes. Segundo os
autores, as diferenças de produtividade dos dois manejos foram mais fortes no segundo ciclo,
indicando que essas diferenças devem-se ao efeito cumulativo do aporte de material orgânico no
solo ao longo dos anos, a partir do primeiro ciclo.
2.3.3.3 Fungos micorrízicos arbusculares no solo
O número de esporos no solo rizosférico nos diferentes tratamentos é apresentado na
Figura 16. Não houve diferenças significativas (Tukey, p > 0,05) na densidade de esporos entre
os dois manejos de colheita, entre as variedades de cana-de-açúcar ou na interação dos fatores
manejo e variedade. O número médio de esporos por 50 g de solo variou de 23 no tratamento da
variedade RB72454 COM QUEIMA a 34 no tratamento da variedade SP813250 SEM QUEIMA.
O número médio de esporos está dentro da ampla faixa (19 a 815 esporos.50ml
-1
) encontrada
por Reis, Paula e Döbereiner (1999) em um estudo sobre comunidades de FMAs na forma de
esporos no solo sob diversas lavouras de cana-de-açúcar.
61
Figura 16 – Número de esporos de FMAs no solo sob as variedades SP813250, SP801842 e RB72454 de cana-de-
açúcar sob manejo SEM QUEIMA (barras cinzas) e COM QUEIMA (barras pretas). Tratamentos com
mesma letra não diferiram pelo teste de Tukey (p > 0,05)
No presente trabalho, foram observados 33 morfotipos de FMAs no solo rizosférico de
cana-de-açúcar, sendo 26 no manejo SEM QUEIMA e 24 no manejo COM QUEIMA. Destes, 18
morfotipos são comuns aos dois tratamentos. Dentre os esporos, foram recuperadas espécies dos
gêneros Acaulospora, Archaeospora, Gigaspora, Glomus (inclusive Glomus grupo A – Glomus
mosseae e Glomus clarum; e Glomus grupo B – Glomus lamellosum), Paraglomus e
Scutellospora (Figura 17). Dentre o gênero Archaeospora, houve apenas esporos de A. Trappei
em uma amostra de solo sob a variedade RB72454 no tratamento SEM QUEIMA. O tratamento
com a variedade SP813250 SEM QUEIMA foi o único a não apresentar espécies do gênero
Paraglomus. Alguns dos esporos são mostrados na Figura 18. Do filo Glomeromycota, não foram
encontrados esporos dos gêneros Ambispora, Diversispora, Entrophospora, Intraspora,
Kuklospora e Pacispora.
O número de 33 espécies encontradas sob cana-de-açúcar está dentro da faixa encontrada
em ecossistemas naturais ou manejados, de acordo com os trabalhos levantados por Douds e
Millner (1999). Porém, a maior abrangência de espécies vegetais pode resultar em maior número
de espécies de FMAs no solo. Blaszkowski (1994) recuperou 34 espécies de FMAs em
ecossistema com 20 espécies de plantas hospedeiras. Andreola (1982), por outro lado, recuperou
7 espécies de FMAs em canaviais no município de Araras, SP. Em outro estudo, Reis, Paula e
Döbereiner (1999) encontraram 18 espécie em 35 amostras coletadas sob 14 variedades de cana-
Esporos por 50 g de solo
Variedade
Manejo
62
de-açúcar em três diferentes localidades. Andreola (1982) recuperou 7 espécies em cana-de-
açúcar de um ensaio com tratamentos de aplicação de vinhaça e adubação nitrogenada e
fosfatada. Portanto, as espécies recuperadas no presente trabalho podem indicar uma alta riqueza
de espécies de FMAs no solo sob cana-de-açúcar do experimento avaliado.
Figura 17 – Número de morfotipos de FMAs por gênero recuperados de solo sob três variedades de cana-de-açúcar
(SP813250, SP801842 e RB72454) com manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA prévia
As espécies de FMAs identificadas na forma de esporos e a frequência relativa de
ocorrência nas amostras de solo são mostradas na Tabela 10. As espécies exclusivas do manejo
SEM QUEIMA são Acaulospora sp. 3, Acaulospora sp. 6, Glomus clarum, Glomus lamellosum,
Glomus mosseae, Glomus sp. 10, Scutellospora sp. e S. verrucosa. Já as espécies que ocorrem
apenas no manejo COM QUEIMA são Acaulospora sp. 2, Acaulospora sp. 5, Acaulospora sp. 7,
Glomus coremioides, Glomus sp. 8, Glomus sp. 9 e Paraglomus occultum. As espécies com
maior média de frequência (> 50 %) nas amostras de solo sob a cana-de-açúcar, em ordem
decrescente, são S. pellucida, A. morrowiae, Glomus sp. 1, A. scrobiculata, G. macrocarpum e
Glomus sp. 6. Pode-se notar que as espécies com frequências maiores do que 50 % nas amostras
de cana-de-açúcar também apresentam as maiores médias de densidades de esporos (Tabela 11).
São elas, em ordem decrescente: Glomus sp. 6, Glomus macrocarpum, Glomus sp.1, S. pellucida,
A. scrobiculata e A. morrowiae. Essas 6 espécies dominam a comunidade, pois representam 79 %
Variedade
Número de morfotipos
63
dos esporos recuperados do solo sob cana-de-açúcar. Assim, essas espécies mais abundantes e
frequentes nas amostas indicam que há a dominância de poucas espécies na comunidade de
esporos de FMAs no solo.
No levantamento de Reis, Paula e Döbereiner (1999), foram encontradas espécies dos
gêneros Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Glomus, Paraglomus e Scutellospora, sendo
que as espécies predominantes nas três localidades estudadas foram: Acaulospora sp. 1
(denominação dos autores), S. heterogama, Glomus etunicatum, Paraglomus occultum e
Gigaspora margarita. Provavelmente os diferentes históricos e características das áreas onde as
35 amostras foram coletadas por Reis, Paula e Döbereiner (1999) influenciaram na estrutura da
comunidade de FMAs na forma de esporos, a qual diferiu daquela reportada no presente trabalho.
É provável que a cana-de-açúcar não promova a seleção de espécies de FMAs no solo, já que as
estruturas de comunidades de FMAs nos diferentes solos sob cana-de-açúcar não estão
relacionadas. No entanto, tanto no presente estudo como no de Reis, Paula e Döbereiner (1999) e
de Andreola (1982), há o predomínio de espécies do gênero Glomus dentre os gêneros de FMAs
econtrados nas amostras.
64
Tabela 10 – Frequência de ocorrência (%) de espécies de FMAs em amostras de solo coletadas sob três variedades de
cana-de-açúcar (SP813250, SP801842 e RB72454) com manejo SEM QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA
prévia (CQ)
SQ
CQ
Espécies
SP813250
SP801842
RB72454
SP813258
SP801842
RB72454
Média
1
Acaulpospora mellea
25
66
25
40
-
25
30,2
Acaulospora morrowiae
25
66
50
100
66
100
67,8
Acaulospora scrobiculata
75
33
50
80
33
75
57,7
Acaulospora sp. 1
25
33
-
-
33
25
19,3
Acaulospora sp. 2
-
-
-
-
33
-
5,5
Acaulospora sp. 3
-
-
25
-
-
-
4,2
Acaulospora sp. 4
-
33
25
20
-
-
13,0
Acaulospora sp. 5
-
-
-
-
33
-
5,5
Acaulospora sp. 6
-
-
25
-
-
-
4,2
Acaulospora sp. 7
-
-
-
-
-
25
4,2
Archaeospora trappei
-
-
25
-
-
-
4,2
Gigaspora sp.
25
33
25
60
33
25
33,5
Glomus clarum
25
-
-
-
-
-
4,2
Glomus coremioides
-
-
-
20
-
-
3,3
Glomus lamellosum
-
-
25
-
-
-
4,2
Glomus macrocarpum
50
33
50
60
66
75
55,7
Glomus mosseae
-
33
-
-
-
-
5,5
Glomus sinuosum
25
-
-
40
-
25
15,0
Glomus sp. 1
50
100
50
80
66
50
66,0
Glomus sp. 2
-
33
-
40
33
-
17,7
Glomus sp. 3
50
33
-
20
-
-
17,2
Glomus sp. 4
50
33
25
20
33
25
31,0
Glomus sp. 5
25
33
25
-
33
-
19,3
Glomus sp. 6
50
66
50
80
33
50
54,8
Glomus sp. 7
-
-
50
20
-
-
11,7
Glomus sp. 8
-
-
-
-
33
-
5,5
Glomus sp. 9
-
-
-
20
-
-
3,3
Glomus sp. 10
25
-
-
-
-
-
4,2
Paraglomus laccatum
-
33
25
-
33
50
23,5
Paraglomus occultum
-
-
-
20
-
-
3,3
Scutellospora pellucida
75
100
25
100
66
50
69,3
Scutellospora sp.
-
33
-
-
-
-
5,5
Scutellospora verrucosa
25
-
-
-
-
-
4,2
Média
1
18,94
24,06
17,42
24,85
19,00
18,18
1
– Média das frequências de ocorrência de espécies de FMAs.
65
Tabela 11 – Número de esporos de FMAs em solo sob as variedades SP813250, SP801842 e RB72454 com manejo
SEM QUEIMA (SQ) e COM QUEIMA prévia (CQ)
SQ
CQ
Espécies
SP813250
SP801842
RB72454
SP813258
SP801842
RB72454
Média*
Acaulpospora mellea
0,50
1,33
0,50
0,40
-
4,75
1,25
Acaulospora morrowiae
0,50
2,33
1,50
2,80
3,67
1,75
2,09
Acaulospora scrobiculata
8,25
1,33
1,50
5,00
0,67
0,75
2,92
Acaulospora sp. 1
0,50
0,33
-
-
1,67
0,25
0,46
Acaulospora sp. 2
-
-
-
-
0,67
-
0,11
Acaulospora sp. 3
-
-
0,50
-
-
-
0,08
Acaulospora sp. 4
-
0,67
0,50
0,40
-
-
0,26
Acaulospora sp. 5
-
-
-
-
0,33
-
0,06
Acaulospora sp. 6
-
-
0,25
-
-
-
0,04
Acaulospora sp. 7
-
-
-
-
-
0,25
0,04
Archaeospora trappei
-
-
0,50
-
-
-
0,08
Gigaspora sp.
0,25
0,33
0,25
0,60
0,67
0,25
0,39
Glomus clarum
0,25
-
-
-
-
-
0,04
Glomus coremioides
-
-
-
0,40*
-
-
0,09*
Glomus lamellosum
-
-
0,25
-
-
-
0,04
Glomus macrocarpum
3,25
0,67
9,75
3,20
7,67
2,25
4,46
Glomus mosseae
-
0,33
-
-
-
-
0,06
Glomus sinuosum
0,25*
-
-
0,40*
-
0,25*
0,17*
Glomus sp. 1
2,75
9,00
1,00
8,40
2,67
2,00
4,30
Glomus sp. 2
-
1,00
-
0,40
0,67
-
0,34
Glomus sp. 3
1,25
0,33
-
0,20
-
-
0,30
Glomus sp. 4
0,75
1,00
1,00
0,40
1,00
0,25
0,73
Glomus sp. 5
1,25
1,33
0,25
-
0,67
-
0,58
Glomus sp. 6
9,25
4,00
2,75
3,60
4,00
5,00
4,77
Glomus sp. 7
-
-
2,00
0,60
-
-
0,43
Glomus sp. 8
-
-
-
-
1,00
-
0,17
Glomus sp. 9
-
-
-
0,20
-
-
0,03
Glomus sp. 10
0,25
-
-
-
-
-
0,04
Paraglomus laccatum
-
0,33
0,50
-
0,67
0,50
0,33
Paraglomus occultum
-
-
-
0,20
-
-
0,03
Scutellospora pellucida
5,00
4,00
0,50
3,80
4,33
4,75
3,73
Scutellospora sp.
-
0,33
-
-
-
-
0,06
Scutellospora verrucosa
0,25
-
-
-
-
-
0,04
Dados representam as médias (seis repetições) do número de esporos por 50 g de solo.
* - Média do número de esporocarpos por 50 g de solo.
66
Figura 18 – Esporos de FMAs coletados sob cana-de-açúcar. (A) Acaulospora scrobiculata; (B) Glomus
macrocarpum.; (C) Scutellospora pellucida; (D) Glomus sp. 6.; (E) Acaulospora morrowiae
A riqueza observada, as estimativas de riqueza de espécies determinadas pelos métodos
de ACE (CHAO; LEE, 1992) e CHAO-1 (CHAO, 1984), e os índices de diversidade não
diferiram entre os manejos de colheita, entre as variedades de cana-de-açúcar ou na interação dos
fatores manejo e variedade (Tabela 12). O número de espécies dentro de cada tratamento da
interação manejo e variedade variou de aproximadamente 6 a 8, e a estimativa média de espécies
por tratamento foi de aproximadamente 12 (ACE) e 10 (CHAO-1). Considerando-se todas as
amostras, a cobertura de amostragem foi de aproximadamente 98 %.
Pela análise de RDA, as variáveis CO, P, H+Al, % Bases, CTC e Mg foram escolhidas
com o uso do Forward Selection do programa “Canoco fo Windows 4.5” (Figura 19). Essas
variáveis explicam significativamente e se relacionam à variabilidade dos dados pelos teste de
permutação de Monte-Carlo. As relações são significativas entre as espécies de FMAs e as
variáveis químicas do solo no primeiro eixo canônico (p = 0,038) e em todos os eixos canônicos
(p = 0,034). Os dois primeiros eixos explicam 16,9 % da variabilidade dos dados, sendo 10,1 %
no primeiro eixo e 6,8 % no segundo. As variáveis químicas do solo explicam 4,2 % da
variabilidade, sendo que 25,9 % desse valor é explicado nos dois primeiros eixos. Outros autores
encontraram valores de correlações significativos abaixo de 0,60 entre variáveis do solo e as
C
B
A
D
E
67
espécies de FMAs na forma de esporos (CUENCA; MENESES, 1996; CARRENHO et al.,
2001), sugerindo que os atributos do solo afetam a distribuição de espécies de FMAs na forma de
esporos no solo, porém em menor magnitude do que outros fatores desconhecidos.
A RDA não indicou separação das amostras de acordo com o manejo de colheita ou com
variedades de cana-de-açúcar. Pelas variáveis do solo, verifica-se que a maioria das espécies
estão relacionadas positivamente com o teor de carbono orgânico (CO) ou com a saturação da
CTC por bases. As espécies relacionadas positivamente com a saturação por bases têm relação
negativa com o teor de H+Al, o que é coerente, uma vez que quanto maior o teor de bases na
CTC, menor a quantidade de H e Al trocáveis. A relação positiva de apenas algumas espécies de
FMAs com o teor de P é devido, provavelmente, pelo fato de que altas concentrações desse
elemento inibem a colonização micorrízica e, posteriormente, diminuiriam a esporulação das
outras espécies não relacionadas positivamente com o teor de P. Dentre as espécies mais
abundantes e frequentes (Tabelas 10 e 11): Glomus sp. 6, Glomus sp. 1 e S. pellucida são
relacionadas positivamente à saturação de bases, G. macrocarpum e A. morrowiae estão
relacionadas positivamente com o teor de P, mas negativamente com a saturação de bases e teor
de CO, e A. scrobiculata está relacionada positivamente com o teor de CO. Assim, a RDA mostra
que há relação da variabilidade das espécies com as variáveis do solo, mas não permite a
separação de amostras de acordo com os tratamentos.
68
Tabela 12 – Média da riqueza observada, estimativas de número de espécies, índices de diversidade e cobertura de amostragem
da comunidade de FMAs calculadas a partir dos esporos coletados e identificados sob as variedades SP813250,
SP801842 e RB72454 com manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA prévia
Índices de diversidade
Estimativa de riquezas de UTOs
Comunidade
S
FMAs
a
Shannon
b
1/D
b,c
Equitabilidade
d
ACE-1
Chao1
ECA
e
SEM QUEIMA
SP813250
6,25
1,38
3,48
0,80
11,08
9,45
0,88
SP801842
8,00
1,71
4,52
0,82
14,07
11,5
0,88
RB72454
5,75
1,39
3,73
0,81
6,53
6,1
0,93
COM QUEIMA
SP813258
8,20
1,76
4,94
0,85
12,32
11,66
0,90
SP801842
6,67
1,57
4,45
0,87
7,07
6,9
0,98
RB72454
6,00
1,36
3,20
0,81
18.93
12,25
0,61
Todos os
tratamentos
f
33
2,48
8,78
0,71
56,2
48,1
0,983
Os valores correspondem à Média ± Desvio Padrão (seis repetições).
a
– Riqueza de espécies de FMAs na forma de esporos;
b
– Estimador de máxima semelhança;
c
– Recíproco do índice de Simpson;
d
– Equitabilidade de
Pielou;
e
-
Estimativa de Cobertura da Amostragem;
f
– Dados representam os valores obtidos de todas as amostras.
69
Figura 19 – Triplot de espécies de FMAs, amostras, e variáveis do solo sob cana-de-açúcar da Análise de
Redundância (RDA). Realizou-se a análise com Forward Selection, selecionando teor de C orgânico
no solo (CO), H+Al, saturação de bases, P, CTC e toer de Mg, em amostras sob cana-de-açúcar com
colheita SEM QUEIMA e COM QUEIMA prévia. (P = 0.038 para o primeiro eixo canônico, P = 0,034
para a soma dos eixos, segundo o teste de Monte Carlo)
Ao contrário do que foi observado neste trabalho, Reis, Paula e Döbereiner (1999)
verificaram que a área com manejo SEM QUEIMA da cana-de-açúcar apresentou maior riqueza
de espécies de FMAs no solo. No entanto, esses autores compararam lavouras SEM QUEIMA e
COM QUEIMA com diferentes históricos, o que dificulta a comparação direta das amostras.
Por fim, esse é um dos primeiros levantamentos de FMAs em solo sob cana-de-açúcar a
campo no Brasil e os dados aqui apresentados servirão como base de comparação para futuros
estudos sobre a contribuição das MAs para a cultura. Os indicadores de diversidade de FMAs na
forma de esporos: densidade de esporos, riqueza, diversidade e estimativa de número de espécies
não apresentam diferenças entre os manejos de colheita, entre as variedades ou na interação dos
fatores manejo e variedade. A RDA, utilizada para a ordenação dos dados, foi significativa,
70
porém não permitiu qualquer discriminação com base nos tratamentos. O pouco tempo decorrido
desde a implantação da cultura até a avaliação das amostras de solo (20 meses) pode ter
contribuído para que essas diferenças na comunidade de FMAs na forma de esporos entre os
tratamentos não fosse observada. Como alguns esporos podem ficar em estado de dormência
(TOMMERUP, 1983; GEMMA; KOSKE, 1988), parte das espécies de FMAs na forma de
esporos presentes nas amostras pode ser reflexo dos cultivos anteriores à instalação do
experimento. Assim, novas amostragens devem ser feitas após ter passado um período de tempo
maior desde a implantação do experimento, pois é possível que efeitos significativos da alteração
do manejo possam ser observados somente a longo prazo.
2.3.3.4 Colonização micorrízica intrarradicular
Todas as amostras de raízes de cana-de-açúcar analisadas apresentaram colonização
micorrízica arbuscular. Foi possível visualizar e identificar várias estruturas de FMAs, incluindo
hifa extrarradicular, apressório nas células da epiderme, hifas intercelulares e intracelulares,
arbúsculos e hifas intracelulares enoveladas (pelotões) (Figura 20). A presença de arbúsculos
típicos e de pelotões foram observados simultaneamente na mesma amostra tanto em raízes sob
manejo SEM QUEIMA como COM QUEIMA.
A taxa de colonização variou de 30 % a 52 % e não foi significativamente diferente entre
as variedades, mas variou significativamente (p < 0,05) entre os manejos SEM QUEIMA e COM
QUEIMA prévia à colheita (Tabela 13). As raízes de plantas sob manejo SEM QUEIMA
apresentaram as maiores taxas de colonização. A maior colonização micorrízica pode ser devido
ao maior teor de umidade no solo, assegurada pela quantidade de palhada depositada após a
colheita. Como visto em outros trabalhos, a umidade está positivamente correlacionada com a
colonização intrarradicular (HE; MOURATOV; STEINBERG, 2002; LINGFEI; ANNA;
ZHIWEI, 2005).
71
Figura 20 - Colonização micorrízica arbuscular em cana-de-açúcar (A a H). ap – apressório; hi – hifa intercelular;
pe – ponto de entrada de hifa na raiz; ar – arbúsculo; en – hifa enovelada; ve – vesícula
A
hi
hi
ap
ap
he
B
ap
F
en
G
ve
ve
ve
ve
H
ar
ar
ar
ar
ar
ar
E
ar
D
hi
hi
hi
C
pe
hi
hi
72
Tabela 13 - Colonização micorrízica arbuscular (%) em raízes de cana-de-
açúcar sob manejo SEM QUEIMA prévia e COM QUEIMA
prévia à colheita
Manejo
Variedade
SEM QUEIMA
COM QUEIMA
SP813250
51,87 10,85 aA
36,23 10,44 aB
SP801842
45,20 15,11 aA
30,10 3,94 aB
RB72454
49,33 6,43 aA
31,24 10,88 aB
Os valores correspondem à Média ± Desvio Padrão (seis repetições).
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (p > 0,05).
A colonização micorrízica é pouca estudada em cana-de-açúcar e poucos trabalhos sobre o
assunto foram publicados. Kelly et al. (2001) verificaram que plantas de cana-de-açúcar
cultivadas em casa-de-vegetação possuem taxas de até 60 % de colonização em baixos níveis de
fósforo no solo (entre 2,7 e 8,2 mg P.kg
-1
). No entanto, a micorrização não trouxe ganhos na
massa seca das plantas. Takahashi (2005) e Souza (2006) estudaram a colonização micorrízica
intrarradicular em mudas micropropagadas de cana-de-açúcar inoculadas e crescidas em casa-de-
vegetação, em condições de baixo teor de P (20 mg.Kg
-1
) e alto teor (200 mg.Kg
-1
) no solo. A
taxa de colonização intrarradicular variou de 10 a 34 % nos tratamentos com alto teor de P, e de
40 a 60 % nos tratamentos com baixo teor de P, sendo que Takahashi (2005) não observou
alteração da produção de biomassa das plantas inoculadas em relação às não-inoculadas.
De acordo com a análise de correlação de Pearson e RDA das espécies de esporos no solo,
não há correlação da taxa de colonização micorrízica arbuscular em cana-de-açúcar e a
distribuição de esporos no solo. Porém, uma vez que a comunidade de FMAs medida pela
ocorrência, densidade e diversidade de esporos no solo não apresentou diferenças entre os
manejos após 20 meses de implantação do experimento, a colonização micorrízica arbuscular, a
qual foi diferente entre os manejos e variedades, pode ser um parâmetro mais sensível às
alterações que ocorrem no ambiente. Assim, a colonização micorrízica arbuscular poderia ser
utilizada como um indicador de mudanças ambientais.
73
2.3.3.5 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS7e F1Ra em raízes de
cana-de-açúcar
Da biblioteca de clones dos fragmentos do gene rRNA 18S amplificados com o par de
iniciadores NS7 e F1Ra, de raízes de cana-de-açúcar sob manejo SEM QUEIMA e COM
QUEIMA prévia à colheita, foram sequenciados 128 clones das amostras. Das sequências obtidas
duas do tratamento SEM QUEIMA foram consideradas quiméricas e excluídas das demais
análises. A comparação por BLAST das sequências obtidas com sequências conhecidas (Tabela
14) e análise filogenética (Figura 21) possibilitam a afiliação das mesmas ao reino Fungi. Todas
as sequências obtidas de raízes de cana-de-açúcar do tratamento COM QUEIMA e a maioria do
tratamento SEM QUEIMA são representadas por fungos do Filo Ascomycota. Em raízes do
tratamento sob manejo SEM QUEIMA, 4 sequências (8,7 %) pertencem ao filo Zygomicota.
Nenhum dos 126 clones apresentou similaridade elevada com sequências de FMAs, apesar de as
amostras apresentarem colonização micorrízica intrarradicular considerável.
As sequências relacionadas à Phoma sp. apresentam dominância tanto na biblioteca de
raízes provenientes de manejo SEM QUEIMA (68,1 % das sequências), como COM QUEIMA
(80,2% das sequências). Depois dessas sequências, as maiores frequências observadas são de
sequências relacionadas à Leptosphaeria (10,6 %) e à Pleosporales (4,3 %) em manejo SEM
QUEIMA e relacionadas à Fusarium (7,9 %) em manejo COM QUEIMA. Membros das classes
Eurotiomycetes e Sordariomycetes foram detectados apenas em raízes do tratamento sob manejo
COM QUEIMA (clones B Scane D0408, B Scane E0909 e B Scane B0703), enquanto que os
Zygomycetes (clones UB Scane C1105 e UB Scane G0814) foram detectados somente em raízes
do tratamento sob manejo SEM QUEIMA. Dos 13 acessos com maior similaridade às sequências
obtidas, determinada utilizando-se o BLAST, apenas três (N. quadriseptata, Phoma sp. e
Pleosporales sp.) foram comuns às duas bibliotecas (Tabela 14).
As estimativas de riqueza, os índices de diversidade de UTOs e a estimativa de cobertura
de amostragem são apresentados na Tabela 15. O número de UTOs detectadas foi de 10 para
cana-de-açúcar do tratamento sob manejo SEM QUEIMA e 11 para a amostra do tratamento sob
manejo COM QUEIMA. Não houve diferença significativa entre as estimativas de riqueza e
índices de diversidade de UTOs dos dois sistemas de manejos de colheita. A estimativa de
riqueza de UTOs relacionadas à raízes foi de 18 e 34 (segundo os índices ACE-1 e Chao1,
74
respectivamente) para o manejo SEM QUEIMA, e de 23 e 51 para o manejo COM QUEIMA
prévia à colheita. Apesar de não apresentar diferenças de riqueza e de diversidade de UTOs entre
os dois manejos, a comparação de curvas de cobertura homóloga e heteróloga, utilizando o
webLIBSHUFF, mostrou que as comunidades fúngicas das raízes de cana-de-açúcar dos dois
tratamentos são significativamente diferentes (p < 0,05) (Figura 22). Para as duas bibliotecas de
clones, o tamanho da amostra analisada foi suficiente para cobrir a maioria dos grupos
filogenéticos. A taxa de cobertura homóloga foi aproximadamente 82 % em Distâncias
Evolutivas maiores do que 0,01, que é o valor adotado para definir espécie em estudos com
fungos (WALDROP et al., 2006; JUMPPONEN; JOHNSON, 2005; ANDERSON et al., 2003).
Tabela 14 – Similaridade das sequências dos clones do gene rRNA 18s obtidas por amplificação do DNA total
de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por FMAs e utilizando os iniciadores NS7 e F1Ra em
relação a sequências de bancos de dados públicos
Manejo
Clone
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
Freq.
(1)
SEM QUEIMA
UB SCane B0103
Candida xylopsoci [AY488128.1]
99 %
2,1 %
UB SCane D0707
Cladosporium cladosporioides [DQ678004.1]
100 %
2,1 %
UB SCane D0208
Heteromita globosa [AY496043.1]
99 %
2,1 %
UB SCane F0911
Leptosphaeria korrae [AF486626.1]
100 %
10,6 %
UB SCane G0814
Mucor circinelloides f. lusitanicus [AF113427.1]
99 %
6,4 %
UB SCane C1105
Mucor circinelloides f. lusitanicus [AF113427.1]
99 %
2,1 %
UB SCane D0907
Neophaeosphaeria quadriseptata [AF250826.1]
99 %
2,1 %
UB SCane H0915
Phoma sp. [AB252869.1]
99 %
68,1 %
UB SCane E1010
Pleosporales sp. [AB195631.1]
99 %
4,3 %
COM QUEIMA
B SCane A0101
Debaryomyces mycophilus [AF440017.1]
98 %
1,3 %
B SCane D1208
Debaryomyces mycophilus [AF440017.1]
98 %
1,3 %
B SCane D0408
Eupenicillium javanicum [U21298.1]
100 %
1,3 %
B SCane B0703
Fusarium sp. [AB245442.1]
99 %
7,9 %
B SCane B1204
Galactomyces geotrichum [U00974.1]
100 %
1,3 %
B SCane C0705
Neophaeosphaeria quadriseptata [AF250826.1]
99 %
1,3 %
B SCane A0202
Phoma sp. [AB252869.1]
98 %
77,6 %
B SCane A1002
Phoma sp. [AB252869.1]
98 %
2,6 %
B SCane E1010
Pleosporales sp. [AB195631.1]
99 %
1,3 %
B SCane E0909
Talaromyces flavus [M83262.1]
99 %
2,6 %
As sequências foram comparadas usando-se o BLAST. Cada clone representa um dos grupos formados por
UPGMA. A coluna de frequência se refere à proporção dos clones do grupo em cada biblioteca.
(1)
Frequência de sequências representadas pelo clone em cada um dos manejos.
(2)
Classe “Dothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedis”.
75
Figura 21 – Relações filogenéticas entre a sequências do gene rRNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar com o
par de iniciadores NS7 e F1Ra, e sequências de fungos determinadas usando-se neighbor-joining.
Números sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. Cada clone
representa um dos grupos formados por UPGMA. Os valores entre parênteses representam a
percentagem do clone em cada biblioteca. A barra representa uma substituição a cada 100 nucleotídeos.
Clones grafados em negrito em preto são referentes às raízes de cana-de-açúcar colhida SEM QUEIMA,
enquanto os grafados em vermelho se referem às raízes de cana-de-açúcar COM QUEIMA prévia à
colheita
* - Classe “Dothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedis”
76
Tabela 15 - Estimativas de UTOs, índices de diversidade e cobertura de amostragem, determinadas com base no sequenciamento de
clones do gene rRNA 18S de fungos associados a raízes de cana-de-açúcar com ou SEM QUEIMA prévia à colheita,
obtidos utilizando-se o par de iniciadores NS7 e F1Ra
Comunidade
NS
NU
Estimativa de riquezas de UTOs
Índices de diversidade
ECA
c
ACE-1
Chao1
Shannon
a
1/D
a,b
SEM QUEIMA
50
10
34 (14; 165)
18 (11; 53)
1,34 (0,99; 1,69)
2,33 (1,32; 9,09)
0,880
COM QUEIMA
76
11
51 (18; 246)
23 (13; 79)
0,99 (0.67; 1,31)
1,64 (0,78; 14,29)
0,908
Valores entre parênteses representam o intervalo com 95% de confiança. NS – número de sequências. NU – número de UTOs.
a
Estimador de máxima
semelhança;
b
– Recíproco do índice de Simpson;
c
– Estimativa de Cobertura da Amostragem; Distância evolutiva usada para as estimativas foi 0,01.
77
Figura 22 - Análise de LIBSHUFF de comunidade de fungos associados às raízes de cana-de-açúcar sob dois manejos de colheita quando empregado o par de
iniciadores NS7 e F1Ra. A, manejo SEM QUEIMA (homólogo) x manejo COM QUEIMA; B, manejo COM QUEIMA (homólogo) x manejo SEM
QUEIMA. As comunidades são diferentes significativamente, com P < 0,05. A distribuição de (Cy-Cyx)
2
como uma função de D indica a diferença
entre as duas comunidades
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Distância Evolutiva (D)
Cobertura
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
(Cx-Cxy)
2
Homólogo
Heterólogo
(Cx-Cxy)2
95%XY
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Distância Evolutiva (D)
Cobertura
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
(Cy-Cyx)
2
Homólogo
Heterólogo
(Cy-Cyx)2
95%YX
A
B
78
2.3.3.6 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores NS31 e AM1 em raízes de
cana-de-açúcar
Das bibliotecas de clones do gene rRNA 18S de raízes de cana-de-açúcar SEM QUEIMA
e COM QUEIMA prévia à colheita, foram sequenciados 47 e 42 clones, respectivamente. Das
sequências obtidas 9 foram consideradas quimeras, com base nas análises feitas utilizando o
Chimera Check e BLAST. Assim, para as análises posteriores, foram utilizadas 41 e 39
sequências dos tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA, respectivamente.
Todas as sequências foram mais similares ao Filo Ascomycota e não foi possível
discriminar espécies a partir dessas sequências, de acordo com as comparações feitas utilizando-
se o BLAST (Tabela 16) e a análise filogenética (Figura 23). Em uma das clades, há o
agrupamento de diferentes classes de fungos: uma sequência de um clone do manejo COM
QUEIMA (B AM1 D1107), duas sequências de Phoma (Ascomycota Mitospórico), e uma
sequência de Didymella (Dothideomycetes). Esses resultados mostram que a região sequenciada
não é informativa filogeneticamente. Nenhuma sequência apresentou alta similaridade com
sequências de FMAs, apesar do iniciador AM1 ser, supostamente, específico para essse grupo de
fungos. Assim mesmo, as riquezas de UTOs e os índices de diversidade foram estimados (Tabela
17). Da mesma forma, a comparação das bibliotecas por meio do programa webLIBSHUFF foi
feita (Figura 24). Assim como no Brasil, os amplicons obtidos com o uso dos iniciadores NS31 e
AM1 em amostras de DNA de cana-de-açúcar durante o estágio na Universidade do Estado do
Kansas, EUA, resultou em sequências relacionadas somente à Ascomycota (dados não
mostrados), mesmo fazendo-se a seleção de raízes finas e claras para a extração de DNA, não
houve a amplificação do DNA de FMAs.
Não houve diferenças entre as estimativas de UTOs entre os dois manejos, utilizando-se
sequências obtidas com ambos conjuntos de iniciadores. No entanto, o índice de diversidade de
Shannon foi significativamente maior no manejo SEM QUEIMA, usando-se o par de iniciadores
NS31 e AM1. Assim como no uso do conjunto de iniciadores NS7 e F1Ra, o emprego do par
NS31 e AM1 resultou em uma taxa de cobertura elevada (Figura 24). De acordo com as análises
de Libshuff, as duas bibliotecas foram significativamente diferentes (P < 0,05).
79
Tabela 16 – Similaridade das sequências dos clones do gene rRNA 18s obtidas por amplificação do DNA total
de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por FMAs e utilizando os iniciadores NS31 e AM1 em
relação a sequências de bancos de dados públicos
Manejo
Clone
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
Freq.
(1)
SEM QUEIMA
UB AM1 G0414
Fusarium oxysporum [DQ916150.1]
99 %
12,2 %
UB AM1 C0406
Fusarium cerealis [AF141947.1]
98 %
2,4 %
UB AM1 H0315
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
99 %
53,7 %
UB AM1 B0204
Penicillium glabrum [AF548090.1]
99 %
4,9 %
UB AM1 D0107
Phialophora verrucosa [EF413614.1]
99 %
14,1 %
UB AM1 B0303
Phialophora verrucosa [EF413614.1]
100 %
12,2 %
COM QUEIMA
B AM1 F0812
Fusarium oxysporum [DQ916150.1]
99 %
94,8 %
B AM1 H0715
Fusarium oxysporum [DQ916150.1]
98 %
2,6 %
B AM1 D1107
Phoma sp. [EU826481.1]
100 %
2,6 %
As sequências foram comparadas usando-se o BLAST. Cada clone representa um dos grupos formados por
UPGMA. A coluna de frequência se refere à proporção dos clones do grupo em cada biblioteca.
(1)
Frequência de sequências representadas pelo clone em cada um dos manejos.
(2)
Classe “Dothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedis”.
80
Figura 23 – Relações filogenéticas entre a sequências do gene rRNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar com o
par de iniciadores NS31 e AM1, e sequências de fungos determinadas usando-se neighbor-joining.
Números sobre os ramos indicam a porcentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. Cada clone
representa um dos grupos formados por UPGMA. Os valores entre parênteses representam a
percentagem do clone em cada biblioteca. A barra representa uma substituição a cada 100 nucleotídeos.
Clones grafados em negrito em preto são referentes às raízes de cana-de-açúcar colhida SEM QUEIMA,
enquanto os grafados em vermelho se referem às raízes de cana-de-açúcar COM QUEIMA prévia à
colheita
* - Classe “Dothideomycetes et Chaetothyriomycetes incertae sedis”
81
Tabela 17 - Estimativas de UTOs, índices de diversidade e cobertura de amostragem, determinadas com base no sequenciamento de
clones do gene rRNA 18S de fungos associados a raízes de cana-de-açúcar com ou SEM QUEIMA prévia à colheita,
obtidos utilizando-se o par de iniciadores NS31 e AM1
Comunidade
NS
NU
Estimativa de riquezas de UTOs
Índices de diversidade
ECA
c
ACE-1
Chao1
Shannon
a
1/D
a,b
SEM QUEIMA
41
6
6,4 (6,0; 11,6)
6,5 (6,0; 14,4)
1,366 (1,103; 1,630)
2,92 (2,09; 4,84)
0,976
COM QUEIMA
39
3
4,0 (3,1; 14,1)
3,5 ( 3,0; 11,4)
0,320 (0,058; 0,583)
1,17 (0,49;-3,20)
0,974
Valores entre parênteses representam o intervalo com 95% de confiança. NS – número de sequências. NU – número de UTOs.
a
Estimador de máxima
semelhança;
b
– Recíproco do índice de Simpson;
c
– Estimativa de Cobertura da Amostragem; Distância evolutiva usada para as estimativas foi 0,01.
82
Figura 24 - Análise de LIBSHUFF de comunidade de fungos associados às raízes de cana-de-açúcar sob dois manejos de colheita quando empregado o par de
iniciadores NS31 e AM1. A, manejo SEM QUEIMA (homólogo) x manejo COM QUEIMA; B, manejo COM QUEIMA (homólogo) x manejo SEM
QUEIMA. As comunidades são diferentes significativamente, com P < 0,05. A distribuição de (Cy-Cyx)
2
como uma função de D indica a diferença
entre as duas comunidades
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Distância Evolutiva (D)
Cobertura
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
(Cy-Cyx)
2
Homólogo
Heterólogo
(Cx-Cxy)2
95%XY
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Distância Evolutiva (D)
Cobertura
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
(Cx-Cxy)
2
Homólogo
Heterólogo
(Cy-Cyx)2
95%YX
A
B
83
2.3.3.7 Análise do gene rRNA 18S amplificado com os iniciadores específicos para grupos
de FMAs em raízes de cana-de-açúcar
Para determinar a estrutura da comunidade de FMAs por meio do sequenciamento dos
amplicons, os iniciadores aqui desenhados e validados foram testados em amostras de raízes de
cana-de-açúcar do campo. Após a amplificação de fragmentos do gene rRNA 18S com os
iniciadores ACAU220, GIGA202, GLOMA690 e GLOMB673 e o sequenciamento dos
amplicons, foram obtidas 161 sequências. Dessas, 35 foram retiradas das análises por
consistirem quimeras ou sequências de baixa qualidade. Verificou-se que nenhum dos
iniciadores desenhados foi específico para FMAs, de acordo com a comparação das sequências
obtidas com sequências de bancos de dados por meio de BLAST (Tabelas 18, 19, 20 e 21). As
sequências de parte do gene do rRNA 18S obtidas foram alinhadas para a análise filogenética
(Figuras 25, 26, 27 e 28). As sequências obtidas não se agruparam com as sequências de fungos
do filo Glomeromycota do banco de dados (GenBank). Os amplicons obtidos com o iniciador
ACAU220, em sua maioria, foram mais similares a Cladosporium (Dothideomycetes,
Ascomycota) (Tabela 18 e Figura 25). A maioria dos amplicons obtidos com o iniciador
GIGA202 foram mais similares à Fusarium (Sordariomycetes, Ascomycota) (Tabela 19 e
Figura 26). Quando utilizou-se o iniciador GLOMA690, a maioria dos amplicons foram mais
similares a Monodictys (Sordariomycetes, Ascomycota) e a Cryptococcus (Tremellomycetes,
Basidiomycota) (Tabela e Figura 27). Já com o uso do iniciador GLOMB673, a maioria dos
amplicons foram mais similares a Phoma (Ascomycota mitospórico) (Tabela 21 e Figura 28).
Com exceção de um amplicon obtido com o iniciador ACAU220 e alguns amplicons obtidos
com o iniciador GLOMB673, os quais foram mais similares à Basidiomycota, todas os outros
amplicons obtidos com o emprego dos iniciadores desenhados foram mais similares a
Ascomycota. Portanto, uma vez que nenhuma sequência obtida está relacionada ao filo
Glomeromycota, ao qual pertencem os FMAs, os iniciadores desenhados foram inespecíficos
para identificação desses fungos nas raízes de cana-de-açúcar em condição de campo.
Mesmo assim, foram estimadas a riqueza de UTOs e os índices de diversidade de
Shannon e recíproco de Simpson com os dados obtidos. Pelo programa Spade, foram estimadas
um total de 49 UTOs, sendo 26 do tratamento SEM QUEIMA e 25 do tratamento COM
QUEIMA (Tabela 22). A estimativa de riqueza de fungos variou de 64 no manejo COM
84
QUEIMA, 216 no manejo SEM QUEIMA a 265 espécies de fungos considerando-se as
amostras dos dois tratamentos de colheita. Os dois tratamentos também não apresentaram
diferenças quanto aos índices de diversidade. A estimativa de cobertura da amostragem foi de
68,3 % no tratamento sob manejo COM QUEIMA e 70,1 % no tratamento sob manejo SEM
QUEIMA. Verifica-se que a curva de rarefação não atinge a assíntota, isto é, somente uma
porção da riqueza de fungos associados às raízes de cana-de-açúcar foi amostrada (Figura 29).
As sequências obtidas não se agrupam, com base em suas relações filogenéticas, em
função do tratamento (SEM QUEIMA ou COM QUEIMA). Existem apenas 7 UTOs (5,6 % do
total de UTOs) em comum entre os tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA. As UTOs
em comum são as identificadas pelos números 1, 2, 3, 4, 7, 16 e 23 nas Tabelas 18 a 21. Esse
número reduzido de UTOs em comum aos dois tratamentos indicaram diferença na comunidade
de fungos associados às raízes de cana-de-açúcar. A análise de Libshuff mostrou que as
comunidades de fungos dos dois tratamentos são significativamente diferentes (p < 0,05)
(Figura 30).
Muitas sequências do gene rRNA 18S amplificadas de raízes de cana-de-açúcar com o
uso dos iniciadores desenhados podem representar novos taxa. Um total de 52 (41,6 %)
sequências apresentam similaridade menor do que 96 % às sequências disponíveis no banco de
dados do NCBI. Essas sequências foram verificadas como não quiméricas e são mais similares
a sequências de Ascomycota e Basidiomycota, com base na análise filogenética. Empregando-
se os iniciadores aqui desenhados, as seis UTOs mais frequentes representam 56,8 % do total
de sequências, enquanto as UTOs contendo um única sequência (singletons) representam 73,5
% do total de UTOs, mostrando a existência de dominância de algumas espécies fúngicas na
comunidade associada às raízes.
As sequências obtidas com os iniciadores grupo-específicos de FMAs, desenhados no
presente trabalho, não tem região em comum com as sequências de clones das bibliotecas
obtidas utilizando os iniciadores da primeira abordagem (NS7 e F1Ra). No entanto, a região
amplificada do gene rRNA 18S obtida com uso dos iniciadores da segunda abordagem (NS31 e
AM1) é comum à parte da região amplificada com o uso dos iniciadores grupo-específicos.
Pela análise filogenética usando neighbor joining, as sequências da segunda abordagem
mostraram-se relacionadas a algumas sequências obtidas com os iniciadores específicos (dados
não mostrados). Isso mostra a consistência do método de PCR e sequenciamento para o
85
levantamento populacional dos fungos associados às raízes de cana-de-açúcar em condições de
campo, apesar de o número de UTOs recuperadas ser menor com o uso do iniciador AM1.
Tabela 18 - Análise do BLAST de sequências obtidas das bibliotecas de raízes de cana-de-açúcar, COM
QUEIMA e SEM QUEIMA prévia à colheita, utilizando o iniciador ACAU220
Manejo
Clone, iniciador
UTO
(1)
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
%
(2)
SEM QUEIMA
A01, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
100
G01, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
96
F02, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
95
G02, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU723484.1]
94
B03, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
93
C03, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
93
D03, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU723484.1]
93
E01, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
93
D02, ACAU220
UTO 2
Penicillium brevicompactum [EU263608.1]
98
H01, ACAU220
UTO 2
Penicillium freii [AY640998.1]
98
A03, ACAU220
UTO 2
Phialocephala fortinii [EU382070.1]
96
B02, ACAU220
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]]
93
C01, ACAU220
UTO 4
Penicillium purpurogenum [DQ365947.1]
96
C02, ACAU220
UTO 5
Hypocrea koningii [EU722404.1]
92
D01, ACAU220
UTO 6
Pseudocolus fusiformis [AF026623.1]
98
E02, ACAU220
UTO 7
Fusarium oxysporum [EU710821.1]
98
Com Queima
H03, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
96
H04, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
96
D05, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
95
G04, ACAU220
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
93
B04, ACAU220
UTO 2
Penicillium glabrum [AF548090.1]
93
A04, ACAU220
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
G03, ACAU220
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
97
E05, ACAU220
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
94
D04, ACAU220
UTO 3
Didymella exitialis [EU167564.1]
91
B05, ACAU220
UTO 4
Penicillium purpurogenum [DQ365947.1]
96
C05, ACAU220
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
93
F03, ACAU220
UTO 28
Paraconiothyrium brasiliense [EU295651.1]
91
F05, ACAU220
UTO 29
Alternaria sp. [EU826479.1]
97
G05, ACAU220
UTO 30
Lithothelium septemseptatum [AY584662.1]
96
Os E-values de todas as comparações foram iguais a zero.
(1)
Identidade das Unidades Taxonômicas Operacionais, determinadas pelo programa DOTUR ao nível de 99 % de
similaridade.
(2)
Similaridade da sequência ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela análise de BLAST.
86
Tabela 19 - Análise do BLAST de sequências obtidas das bibliotecas de raízes de cana-de-açúcar, COM
QUEIMA e SEM QUEIMA prévia à colheita, utilizando o iniciador GIGA202
Manejo
Clone, iniciador
UTO
(1)
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
%
(2)
SEM QUEIMA
A06, GIGA202
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
96
D07, GIGA202
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
95
H06, GIGA202
UTO 4
Penicillium purpurogenum [AF245257.1]
97
B08, GIGA202
UTO 4
Penicillium purpurogenum [DQ365947.1]]
93
A08, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
96
A07, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
95
F07, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
94
E06, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
93
F06, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
93
C07, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
92
D06, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
92
B06, GIGA202
UTO 8
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
90
C06, GIGA202
UTO 9
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
90
C08, GIGA202
UTO 10
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
90
E07, GIGA202
UTO 11
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
91
G06, GIGA202
UTO 12
Monodictys arctica [EU686519.1]
87
G07, GIGA202
UTO 13
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
91
COM QUEIMA
A09, GIGA202
UTO 1
Cladosporium cladosporioides [EU375523.1]
97
D09, GIGA202
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
E10, GIGA202
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
99
F09, GIGA202
UTO 3
Phaeosphaeria nodorum [EU189213.1]
99
G09, GIGA202
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
99
B09, GIGA202
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
C09, GIGA202
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
96
H08, GIGA202
UTO 3
Phaeosphaeria nodorum [EU189213.1]
96
B10, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
95
G10, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
94
F08, GIGA202
UTO 7
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
93
E09, GIGA202
UTO 30
Paraconiothyrium variabile [EU295653.1]
95
A10, GIGA202
UTO 31
Monodictys arctica [EU686519.1]
89
C10, GIGA202
UTO 32
Penicillium purpurogenum [DQ365947.1]
92
E08, GIGA202
UTO 33
Pyrenochaeta nobilis [DQ898287.1]
98
F10, GIGA202
UTO 34
Fusarium oxysporum [EF590326.1]
94
H09, GIGA202
UTO 35
Monodictys arctica [EU686519.1]
95
Os E-values de todas as comparações foram iguais a zero.
(1)
Unidades Taxonômicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao nível de 99 % de similaridade.
(2)
Similaridade da sequência ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela análise de BLAST.
87
Tabela 20 - Análise do BLAST de sequências obtidas das bibliotecas de raízes de cana-de-açúcar, COM
QUEIMA e SEM QUEIMA prévia à colheita, utilizando o iniciador GLOMA690
Manejo
Clone, iniciador
UTO
(1)
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
%
(2)
E-value
SEM QUEIMA
A11, GLOMA690
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
0,0
B11, GLOMA690
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
8e-167
B12, GLOMA690
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
6e-163
D11, GLOMA690
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
8e-162
F11, GLOMA690
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
97
5e-159
A01, GLOMA690
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
C01, GLOMA690
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
B01, GLOMA690
UTO 14
Phoma sp. [EU826481.1]
98
0,0
A12, GLOMA690
UTO 14
Monodictys arctica [EU686519.1]
97
3e-151
E11, GLOMA690
UTO 14
Monodictys arctica [EU686519.1]
94
2e-142
C11, GLOMA690
UTO 15
Cryptococcus vishniacii [AB032657.1]
99
1e-164
H12, GLOMA690
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
1e-159
G11, GLOMA690
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
97
4e-155
D12, GLOMA690
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
96
4e-150
E12, GLOMA690
UTO 17
Cryptococcus aerius [EU847662.1]
96
6e-148
F12, GLOMA690
UTO 18
Monodictys arctica [EU686519.1]
96
1e-150
G12, GLOMA690
UTO 19
Monodictys arctica [EU686519.1]
90
4e-120
H11, GLOMA690
UTO 20
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
8e-162
D01, GLOMA690
UTO 21
Cryptococcus gastricus [DQ645513.1]
97
0,0
COM QUEIMA
C02, GLOMA690
UTO 3
Phoma medicaginis [EU167575.1]
97
0,0
A03, GLOMA690
UTO 36
Cryptococcus terreus [AB032649.1]
97
0,0
E02, GLOMA690
UTO 36
Cryptococcus terreus [AB032649.1]
98
0,0
B03, GLOMA690
UTO 36
Cryptococcus terreus [AB032649.1]
96
0,0
B02, GLOMA690
UTO 37
Cryptococcus terreus [AB032649.1]
93
0,0
D03, GLOMA690
UTO 38
Dothidotthia aspera [EU673228.1]
88
1e-139
E01, GLOMA690
UTO 39
Phoma sp. [EU826481.1]
93
0,0
E03, GLOMA690
UTO 40
Phoma sp. [EU826481.1]
92
0,0
F01, GLOMA690
UTO 41
Cryptococcus terreus [AB032649.1]
93
0,0
G02, GLOMA690
UTO 42
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
H02, GLOMA690
UTO 43
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
(1)
Unidades Taxonômicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao nível de 99 % de similaridade.
(2)
Similaridade da sequência ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela análise de BLAST.
88
Tabela 21 - Análise do BLAST de sequências obtidas das bibliotecas de raízes de cana-de-açúcar, COM
QUEIMA e SEM QUEIMA prévia à colheita, utilizando o iniciador GLOMB673
Manejo
Clone, iniciador
UTO
(1)
Sequência mais similar [Acesso]
Similaridade
%
(2)
e-value
SEM QUEIMA
A05, GLOMB673
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
0,0
A06, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
99
0,0
D06, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
99
0,0
B05, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
98
0,0
E04, GLOMB673
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
0,0
B04, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
C06, GLOMB673
UTO 3
Leptosphaeria doliolum [U43457.1]
97
0,0
D05, GLOMB673
UTO 3
Monodictys arctica [EU686519.1]
96
0,0
D04, GLOMB673
UTO 16
Phoma sp. [EU826481.1]
98
0,0
A04, GLOMB673
UTO 22
Phoma medicaginis [EU167575.1]
92
7e-156
C04, GLOMB673
UTO 23
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
0,0
F04, GLOMB673
UTO 24
Rhytidhysteron rufulum [AF201452.1]
95
0,0
F05, GLOMB673
UTO 25
Monodictys arctica [EU686519.1]
94
0,0
G05, GLOMB673
UTO 26
Pleosporales [FJ176844.1]
99
0,0
H05, GLOMB673
UTO 27
Phoma sp. [EU826481.1]
96
0,0
COM QUEIMA
G08, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
99
0,0
C08, GLOMB673
UTO 3
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
C07, GLOMB673
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
98
0,0
G07, GLOMB673
UTO 16
Monodictys arctica [EU686519.1]
96
0,0
A07, GLOMB673
UTO 23
Monodictys arctica [EU686519.1]
99
0,0
D07, GLOMB673
UTO 23
Phoma sp. [EU826481.1]
98
0,0
B07, GLOMB673
UTO 34
Trichocladium asperum [EU263613.1]
94
0,0
E06, GLOMB673
UTO 34
Trichocladium asperum [EU263613.1]
94
3e-174
F06, GLOMB673
UTO 35
Phoma sp. [EU826481.1]
99
0,0
A08, GLOMB673
UTO 39
Phoma sp. [EU826481.1]
99
0,0
E07, GLOMB673
UTO 44
Dothidotthia aspera [EU673225.1]
90
1e-162
F07, GLOMB673
UTO 45
Monodictys arctica [EU686519.1]
91
2e-180
F08, GLOMB673
UTO 46
Phoma sp. [EU826481.1]
90
8e-170
G06, GLOMB673
UTO 47
Coniothyrium palmarum [AY642514.1]
95
0,0
H06, GLOMB673
UTO 48
Pleosporales sp. [FJ176844.1]
92
2e-161
H08, GLOMB673
UTO 49
Phoma sp. [EU826481.1]
97
0,0
(1)
Unidades Taxonômicas Operacionais determinadas pelo programa DOTUR ao nível de 99 % de similaridade.
(2)
Similaridade da sequência ambiental com o respectivo acesso do NCBI dada pela análise de BLAST.
89
Figura 25 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar,
utilizando o iniciador ACAU220 e sequências de fungos, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a percentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. O
comprimento da barra representa duas substituições a cada 100 nucleotídeos. As sequências do
tratamento SEM QUEIMA estão grafadas em preto e negrito, e as do tratamento COM QUEIMA
estão em vermelho e negrito
90
Figura 26 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar,
utilizando o iniciador GIGA202 e sequências de fungos, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a percentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. O
comprimento da barra representa duas substituições a cada 100 nucleotídeos. As sequências do
tratamento SEM QUEIMA estão grafadas em preto e negrito, e as do tratamento COM QUEIMA
estão em vermelho e negrito
91
Figura 27 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar,
utilizando o iniciador GLOMA690 e sequências de fungos, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a percentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. O
comprimento da barra representa duas substituições a cada 100 nucleotídeos. As sequências do
tratamento SEM QUEIMA estão grafadas em preto e negrito, e as do tratamento COM QUEIMA
estão em vermelho e negrito
92
Figura 28 – Relações filogenéticas entre as sequências do rDNA 18S obtidas de raízes de cana-de-açúcar,
utilizando o iniciador GLOMB673 e sequências de fungos, determinadas usando neighbor joining.
Números sobre os ramos indicam a percentagem de 1000 repetições da análise de bootstrap. O
comprimento da barra representa duas substituições a cada 100 nucleotídeos. As sequências do
tratamento SEM QUEIMA estão grafadas em preto e negrito, e as do tratamento COM QUEIMA
estão em vermelho e negrito
93
Figura 29 – Curvas de rarefação para bibliotecas de clones do gene rRNA 18S obtidas usando os iniciadores
FMAs grupo-específicos em amostras DNA de raízes de cana-de-açúcar sob tratamento SEM
QUEIMA e COM QUEIMA. A curva de rarefação foi gerada com o programa DOTUR (SCHLOSS;
HANDELSMAN, 2005), utilizando o nível de 99 % de similaridade
94
Tabela 22 - Estimativas de UTOs, índices de diversidade e cobertura de amostragem, calculadas a partir de bibliotecas de rDNA 18S
de fungos associados a raízes de cana-de-açúcar com ou SEM QUEIMA prévia à colheita, utilizando os iniciadores
ACAU220, GIGA202, GLOMA690 e GLOMB673
Valores entre parênteses representam o intervalo com 95% de confiança. NS – número de sequências. NU – número de UTOs.
a
Estimador de máxima
semelhança;
b
– Recíproco do índice de Simpson;
c
– Estimativa de Cobertura da Amostragem; Distância evolutiva usada para as estimativas foi 0,01.
Comunidade
NS
NU
Estimativa de riquezas de UTOs
Índices de diversidade
ECA
c
ACE-1
Chao1
Shannon
a
1/D
a, b
SEM QUEIMA
67
26
177,7 (62,1; 664,5)
216,0 (106,6; 473,8)
d
2,544 (2,242; 2,845)
6,79 (4,47; 14,12)
0,701
COM QUEIMA
58
28
108,0 (51,1; 305,7)
64,1( 39,1; 145,7)
2,808 (2,520; 3,096)
9,04 (6,31; 19,53)
0,683
Todas as sequências
125
49
213,0(107,7; 507,2)
265,0(114,5; 761,6)
3,134 (2,898; 3,370)
10,83 (7,15; 22,32)
0,712
95
Figura 30 - Análise de LIBSHUFF de comunidade de fungos associado às raízes de cana-de-açúcar sob dois manejos de colheita, utilizando o conjunto de
iniciadores desenhados ACAU220, GIGA202, GLOMA690 e GLOMB673. A, manejo SEM QUEIMA (homólogo) x manejo COM QUEIMA; B,
manejo COM QUEIMA (homólogo) x manejo SEM QUEIMA. As comunidades são diferentes significativamente, com P < 0,05. A distribuição de
(Cy-Cyx)
2
como uma função de D indica a diferença entre as duas comunidades
B
A
96
Os estudos de comunidades de FMAs são importantes devido aos efeitos das MAs para as
plantas e para os ecossistemas terrestres (HEIJDEN et al., 1998). Porém, a principal dificuldade
nas investigações do ciclo de vida, da filogenia, organização genética, dinâmica e estrutura das
comunidades dos FMAs é o seu biotrofismo obrigatório. As abordagens moleculares,
principalmente a caracterização de genes do rRNA, têm contribuido para a elucidação da
ecologia dos FMAs. Esses genes são muito utilizados por suas características evolutivas, as quais
permitem a investigação em diferentes níveis de resolução filogenética (HILLIS; DIXON, 1991).
Além disso, é um gene que ocorre em múltiplas cópias no genoma, sendo a sua detecção mais
fácil em relação a outros genes. Segundo Öpik et al. (2006), de 26 trabalhos, 23 investigaram
comunidade de FMAs utilizando o gene rRNA 18S, 7 investigaram regiões ITS e 4 avaliaram o
gene rRNA 28S, sendo que alguns dos trabalhos utilizaram mais de um locus gênico.
O desenho de novos iniciadores para a amplificação de DNA dos organismos pertencentes
ao filo Glomeromycota é importante para evitar o viés causado pelo uso do tradicional iniciador
AM1 (HELGASON, 1998). Esse iniciador tem sido usado em inúmeros estudos de comunidades
de FMAs em campo (ÖPIK et al., 2006), no entanto, ele não amplifica o DNA dos grupos basais
de Glomeromycota, como Archaeosporales (REDECKER, 2000; SANTOS; FINLAY; TEHLER,
2006; SANTOS-GONZÁLEZ et al., 2007). Além disso, o iniciador AM1 pode amplificar
sequências de fungos não-micorrízicos arbusculares (DOUHAN et al., 2005). Já o emprego de
iniciadores específicos para fungos em geral pode não cobrir toda a comunidade fúngica e, dessa
forma, não refletir a comunidade de FMAs da amostra ou não identificar sequer uma sequência
de fungo do filo Glomeromycota (Tabela 14 e Figura 21). Por essa razão, o desenho de
iniciadores específicos para os principais grupos de Glomeromycota é de suma importância.
Mesmo com a colonização micorrízica variando de 30 % a 52 %, não foi possível a
detecção de FMAs nas raízes utilizando-se as três abordagens: (1) aplicação do iniciador AM1,
(2) iniciador F1Ra específico para fungos em geral e (3) uso dos iniciadores aqui desenhados. A
ausência de sequências clonadas que fossem mais similares às sequências de Glomeromycota,
mesmo utilizando iniciadores específicos e funcionais em amostras de casa-de-vegetação e em
amostras de campo (raízes da pradaria Konza), pode indicar um ambiente com uma comunidade
fúngica diversa e complexa nas raízes de cana-de-açúcar do campo. Com os iniciadores
desenhados neste estudo, houve um maior número de UTOs detectadas em relação aos
iniciadores AM1 ou F1Ra. O número de 49 UTOs sequenciadas e 265 UTOs estimadas somente
97
nas raízes da cana-de-açúcar (Tabela 22) indicam alta diversidade fúngica em relação à outros
ambientes. Waldrop et al. (2006), avaliaram a diversidade de fungos do solo, empregando-se o
par de iniciadores ITS1F e ITS4 e o sequenciamento dos clones provenientes de amostras de
áreas com diferentes números de espécies vegetais no estado de Minnesota, EUA. Esses autores
obtiveram um total de 149 UTOs de fungos do solo em 7 diferentes tratamentos, com um número
máximo de 40 UTOs quando se sequenciaram 72 clones de um tratamento. Mas esses resultados
foram obtidos de amostras de DNA extraído do solo, o qual geralmente apresenta maior
diversidade fúngica do que aquela associada às raízes. Neubert et al. (2006) avaliaram a estrutura
da comunidade de fungos nos diferentes órgãos de caniço e verificaram que as raízes são os
órgãos com maior diversidade. A alta diversidade poderia ser a causa do viés na amplificação nos
experimentos deste trabalho, no entanto, Vandenkoornhuyse et al. (2002) estudaram a
diversidade de fungos em raízes da Poaceae Arrhenatherum elatius com o uso de iniciadores
específicos para fungos em geral e encontraram 49 filotipos, sendo 3 relacionados à
Glomeromycota. Husband et al. (2002) amplificaram o DNA de FMAs de raízes de floresta
tropical do Panamá, empregando os iniciadores NS31 e AM1, e mostram que a
“hiperdiversidade” pode não ser a explicação para o problema.
Por outro lado, considerando que quanto maior a diversidade vegetal, maior o número de
nichos e, portanto, maior a diversidade de fungos (LODGE, 1997), a diversidade em raízes de
uma lavoura de cana-de-açúcar não seria alta ao ponto de mascarar a presença de FMAs. Em
áreas de monocultura, como as de cana-de-açúcar, haveria uma dominância de um pequeno grupo
de fungos, resultando em amostras de DNA com prevalência desses organismos, os quais se
sobrepujariam em relação aos FMAs nas amostras de DNA total. Como foi mostrado pelo
sequenciamento de clones do gene rRNA 18S e análise pelo DOTUR, aproximadamente 60 %
das sequências pertencem a apenas seis UTOs, de um total de 49 UTOs. Desse modo, pode haver
uma razão DNA alvo : DNA não-alvo desfavorável à amplificação específica.
Considerando que os iniciadores desenhados obtiveram resultados positivos nos testes in
silico e em amostras controle de casa-de-vegetação, é possível que o problema resida nas
condições subótimas de PCR. Assim, parâmetros como temperatura de pareamento dos
iniciadores, concentrações de cloreto de magnésio e diluição da primeira PCR podem estar em
níveis não ideais. Os testes para esses e outros parâmetros, tais como presença ou ausência de
BSA ou DMSO (Dimetil Sulfóxido), foram feitos nas amostras controle provindas de casa-de-
98
vegetação e não nas raízes de cana-de-açúcar do campo. É possível que as amplificações
inespecíficas com o emprego dos iniciadores desenhados usando DNA de raízes de cana-de-
açúcar poderiam ser evitadas com a otimização das condições de PCR. O BSA é um adjuvante
que pode aumentar a eficiência da amplificação. O DMSO é um agente desnaturante que inibe
formação de estruturas secundárias e é utilizado para melhorar a eficiência e a especificidade de
amplificação (KITADE et al., 2003). Entretanto, o problema pode ter mais de uma origem, em
razão de o emprego dos iniciadores Glomus grupo A (GLOMA189 e GLOMA690) em raízes da
pradaria Konza resultar em amplicons específicos e em ausência de sequências não-alvo (Figuras
14 e 15). Esses resultados nos mostra que há um problema específico com as amostras de raízes
de cana-de-açúcar, onde pode haver um inibidor não universal, uma vez que a síntese de
amplicons, apesar de serem inespecíficos, ocorre. Um possível fator para a não detecção de
FMAs nas raízes é a incapacidade do método de extração de homogeneizar completamente o
tecido vegetal, o que deixaria as hifas dos FMAs protegidas ou ligadas aos tecidos da cana-de-
açúcar. Essa proteção diminuiria a eficiência da extração do DNA de FMAs nas amostras de
raízes de cana-de-açúcar.
Esses problemas podem contribuir para a amplificação do DNA de determinados fungos
em função do ambiente. Esse viés já foi constatado em outros trabalhos (ANDERSON et al.,
2003; JUMPPONEN, 2007) e pode ser decorrência do fato de os iniciadores terem sido
desenhados com base em sequências de espécimes mantidas em coleções de culturas e em
laboratórios e não em sequências de organismos que ocorrem naturalmente no campo. Uma vez
que os FMAs são simbiotróficos obrigatórios, a obtenção desse tipo de sequência é dificultada.
Assim, a inespecificidade dos iniciadores pode ter origem na baixa relação DNA alvo :
DNA não-alvo, nas condições subótimas de PCR ou em problemas inerentes às amostras ou ao
método de extração de DNA de raízes de cana-de-açúcar. A solução para a validação dos
iniciadores específicos e para o acesso à comunidade de Glomeromycota nas raízes de cana-de-
açúcar pode ser alcançada por meio de experimentos para se testar esses parâmentros. Outro
ponto a ser observado é que é preciso ser cauteloso para conclusões tiradas sobre comunidades de
FMAs quando se emprega o par de iniciadores NS31 e AM1 sem o uso do sequenciamento, como
nas análises de T-RFLP e DGGE. Os resultados podem não refletir a real da comunidade de
FMAs nas amostras.
99
Apesar de a detecção de FMAs não ser possível, as sequências obtidas são informativas
quanto ao que ocorre com a estrutura da comunidade fúngica nas raízes. A alta frequência de
sequências de Ascomycota nas bibliotecas obtidas com os iniciadores F1Ra (específico para
fungos), AM1 (específico para FMAs), e os específicos para grupos de FMAs ACAU220,
GIGA202, GLOMA690 e GLOMB673 indicam uma dominância de fungos desse filo nas raízes
de cana-de-açúcar.
Com o emprego do iniciador F1Ra foi estimada uma riqueza de até 51 UTOs (Tabela 15)
e do AM1 uma riqueza de até 6,5 UTOs (Tabela 17) em duas amostras de cana-de-açúcar, sob
manejo SEM QUEIMA e COM QUEIMA. A razão para a diferença é que o iniciador F1Ra é
universal para Fungi, enquanto o segundo é específico para um grupo de fungos. No entanto, com
o uso dos iniciadores grupo-específicos aqui desenhados foi estimada uma riqueza de até 265
UTOs nas 36 amostras de raízes de cana-de-açúcar. Com relação à estrutura da comunidade
fúngica, o uso dos iniciadores F1Ra ou AM1 e dos iniciadores específicos aqui desenhados
indicam diferenças entre as comunidades fúngicas nos tratamento SEM QUEIMA e COM
QUEIMA pela análise de Libshuff. Esses resultados podem indicar que o uso de apenas um par
de iniciadores, mesmo universal para fungos, e poucas repetições de amostras, pode resultar em
baixa cobertura de amostragem da comunidade fúngica.
Os índices estimados de riqueza e de diversidade de UTOs com o uso dos iniciadores
específicos para fungos, FMAs e FMAs grupo-específico não foram diferentes entre os dois
manejos de colheita, sugerindo que a comunidade fúngica não é afetada em número e diversidade
de organismos pelo sistema de colheita adotado, pelo menos na época avaliada. Isso pode ser
explicado pelo pouco tempo de manejo SEM QUEIMA, em que o teor de C no solo ainda não foi
alterado (Tabela 7), indicando que a deposição de palha sobre o solo ainda não afeta
significativamente as propriedades químicas e biológicas do solo.
100
3 CONCLUSÕES
A abundância, riqueza e diversidade de FMAs determinadas com base na presença de
esporos assexuais no solo não diferiu entre os tratamentos SEM QUEIMA e COM QUEIMA
prévia à colheita, nem entre as variedades de cana-de-açúcar e na interação dos fatores Manejo de
Colheita e Variedades de cana-de-açúcar.
O manejo de colheita SEM QUEIMA prévia estimulou a colonização micorrízica
arbuscular em cana-de-açúcar em relação ao manejo com colheita COM QUEIMA prévia, logo
após a primeira colheita.
O uso de iniciadores específicos para fungos em geral (Reino Fungi), do iniciador AM1 e
dos iniciadores específicos para grupos de FMAs não permitiu a detecção de FMAs nas raízes de
cana-de-açúcar.
Os índices de riqueza e diversidade, e a estrutura da comunidade fúngica associados às
raízes de cana-de-açúcar, determinados por meio dos dados de sequenciamento do gene rRNA
18S, não diferiram entre os manejos de colheita SEM QUEIMA e COM QUEIMA prévia.
O manejo da cana-de-açúcar e colheita COM QUEIMA prévia à colheita alterou a
estrutura da comunidade fúngica associada às raízes, logo após a primeira colheita.
101
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