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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Atributos microbiológicos do solo em área de pastagem irrigada com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado
Alessandra Monteiro de Paula
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Solos e Nutrição de
Plantas
Piracicaba
2008
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Alessandra Monteiro de Paula
Engenheiro Agrônomo
Atributos microbiológicos do solo em área de pastagem irrigada com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado
Orientadora:
Prof
a
.Dra. ELKE JURANDY BRAN NOGUEIRA CARDOSO
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Solos e Nutrição de
Plantas
Piracicaba
2008
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Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Paula, Alessandra Monteiro de
Atributos microbiológicos do solo em área de pastagem irrigada com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado / Alessandra Monteiro de Paula. - -
Piracicaba, 2008.
120 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Águas residuárias 2. Análise multivariada 3. Capim Tifton 4. Irrigação 5.
Microbiologia do solo 6. Pastagens I. Título
CDD 633.2
P324a
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
DEDICO
Aos que se empenham em aplicar a ciência
para melhorar a qualidade de vida de todos os seres vivos
4
AGRADECIMENTOS
Há quem diga que o acaso não existe. Ou mesmo que o destino já está traçado. Ainda
tem os que confiam nos desígnios de Deus. Fato é que nessa vida tive muitos
encontros agraciados, predestinados ou simplesmente ao acaso. Gostaria de aqui
registrar minha gratidão as pessoas que encontrei nessa minha caminhada, durante o
doutorado no programa de pós-graduação em Solos e Nutrição de Plantas, da ESALQ/
USP:
- À Professora Dra. Elke Jurandy Bran Nogueira Cardoso, orientadora presente e
exemplo de profissionalismo, sempre disposta a debater idéias e a compartilhar o seu
conhecimento, declaro aqui meu sincero agradecimento e admiração.
- Ao Professor Dr. Adolpho José Melfi, Coordenador do projeto Temático da FAPESP
(Uso de efluentes de esgotos tratados por processos biológicos (lagoas de estabilização
e reatores UASB/lodos ativados) em solos agrícolas) e a Professora Dra. Célia Regina
Montes, pelo apoio logístico e contribuições para o trabalho, durante as reuniões do
grupo do projeto temático.
- Aos Professores Dr. Marco Antônio Nogueira, Dr. Carlos Eduardo Pellegrino Cerri e
Dra. Brigitte Josefine Feigl, avaliadores no exame de qualificação, pelo o que
contribuíram para o refinamento do trabalho.
- Ao Professor Dr. David E. Crowey, pela orientação e oportunidade oferecida para
realização do estágio no exterior, no Laboratório de Microbiologia Ambiental, da
Universidade da Califórnia, Riverside.
- Aos meus pais, Vera Lúcia Monteiro de Paula e Antônio Gonzaga de Paula, minha avó
Maria Dolores Monteiro, meu irmão Vlademir Monteiro de Paula e meus sobrinhos
Gabriel e Amanda, minha querida família, pela compreensão durante as ausências,
apoio e carinho, nos momentos mais necessários.
- À família do Laboratório de Microbiologia do Solo, da Esalq/USP: Os técnicos Denise
L.C. Mescolotti e Luis Fernando Baldesin, altamente competentes e simpáticos, são
como padrinhos dessa tese! Aos amigos e colegas, irmãos e irmãs de orientadora:
Fernanda de Carvalho, José Pereira, Maria Elda César, Rafaela Neroni, Daniel Lammel,
Dilmar Baretta, Alexandre Martines, Pilar Mariani, Sandra Cardoso, André Nakatani,
Simone Bertini, Mylenne Pinheiro, Rafael Vasconcellos, Rafael Valadares, Carlos
Ribeiro, Priscila Azevedo, Priscila Petterman, André Cicolin, Leandro Tizato, Maurício
Dagui, Henrique Robortella, Júlia Lima, Fabiana Brandão, Gabriela Gerônimo, Sara
Hirata e Caroline Garcia.
- Aos amigos e colegas da pós-graduação: Isabeli Bruno, Sayonara Moreno, Adriana
Silva, Caronlina Maluche Baretta, Gisele Nunes, Giselle Monteiro, Lucas Azevedo,
Rafael D’Armas, Gabriel Barth, Magnus Deon, Bruno Pereira, Sandra Nogueira, Márcio
Morais, Adriel da Fonseca, Tamara Gomes.
- Ao Dr. Dilmar Baretta pelas sugestões e auxílio na análise estatística multivariada, a
Dra. Carolina R. D. Maluche-Baretta pelo auxílio na análise estatística do perfil
metabólico da comunidade microbiana, ao Msc. Magnus Dall’Igna Deon pelo auxílio na
estatística univariada e a Dra. Sandra Furlan Nogueira pelas discussões e sugestões
que enriqueceram este trabalho.
- Aos colegas do estágio na Universidade da Califórnia, em Riverside: Rosario Peneda,
Richard Belcher, J.P. Baquiran, Azeen Khalid e Guntram von Kiparski.
5
- Ao funcionário James, pelo auxílio no campo experimental, em Lins, SP.
- Aos funcionários do Departamento de Ciência do Solo, da Esalq/USP.
Às instituições:
- Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal do ensino superior, Capes, pela bolsa
concedida.
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pela bolsa
SWE concedida para estágio no exterior.
- FAPESP, pelo apoio financeiro.
- Núcleo de Pesquisas em Geoquímica e Geofísica na Litosfera, NUPEGEL.
- Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo, SABESP.
- Programa de Pós-graduação em Solos e Nutrição de Plantas, da Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, da Universidade de São Paulo.
- Universidade da California, em Riverside, Estados Unidos.
A todos que colaboraram para a realização desse trabalho, muito obrigada.
6
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................................... 8
ABSTRACT ...................................................................................................................... 9
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... 10
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 12
2 DESENVOLVIMENTO ................................................................................................ 14
2.1 Hipótese ................................................................................................................... 14
2.2 Revisão Bibliográfica ................................................................................................ 14
2.2.1 Atributos microbianos indicativos de distúrbios no sistema solo-planta ................ 14
2.2.1.1 Atividade microbiana no solo .............................................................................. 16
2.2.1.2 Grupos funcionais de microrganismos ............................................................... 20
2.2.1.3 Avaliação de grupos funcionais de microrganismos ........................................... 23
2.2.2 Efeito da irrigação com esgoto tratado nos atributos microbiológicos do solo ...... 27
2.3 Objetivos .................................................................................................................. 32
2.3.1 Objetivos específicos............................................................................................. 32
2.4 Material e Métodos ................................................................................................... 33
2.4.1 Descrição da área de estudo ................................................................................. 33
2.4.2 Condução do experimento .................................................................................... 35
2.4.3 Amostragens e análises de efluente e solo ........................................................... 37
2.4.4 Análise estatística dos dados ................................................................................ 43
2.4.4.1 Efeito de lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado na
pastagem de capim Tifton 85 sobre os atributos químicos e microbiológicos do solo ... 43
2.4.4.2 Efeito da irrigação com efluente na pastagem de Tifton 85 sobre os atributos
microbiológicos comparado com área de pastagem não-irrigada .................................. 45
2.4.4.3 Perfil do consumo de fontes de carbono pela comunidade microbiana de uma
área de pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas excedentes de efluente de
esgoto tratado ................................................................................................................ 46
3 Resultados .................................................................................................................. 48
3.1 Precipitação e irrigação com efluente ...................................................................... 48
3.2 Adição de carbono e nitrogênio via efluente ............................................................. 50
7
3.3 Efeito de lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado na
pastagem de capim Tifton 85 sobre os atributos químicos e microbiológicos do solo ... 51
3.3.1 Parâmetros químicos e de atividade microbiana ................................................... 52
3.3.2 Densidade populacional de grupos funcionais de microrganismos ....................... 65
3.3.3 Análises estatísticas multivariadas ........................................................................ 70
3.3.3.1 Análise de curva de resposta principal (PRC) .................................................... 70
3.3.3.2 Análise de Redundância (RDA) .......................................................................... 73
3.3.4 Fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) ............................................................ 76
3.4 Efeito da irrigação com efluente na pastagem de Tifton 85 sobre os atributos
microbiológicos comparado com área de pastagem não-irrigada .................................. 78
3.5 Perfil do consumo de fontes de carbono pela comunidade microbiana de uma área
de pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto
tratado ............................................................................................................................ 83
3.6 Diversidade genética de bactérias oxidantes de amônio ......................................... 93
3.7 Síntese dos resultados ............................................................................................. 97
4 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 98
Considerações Finais ..................................................................................................... 99
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 101
ANEXOS ...................................................................................................................... 119
8
RESUMO
Atributos microbiológicos do solo em área de pastagem irrigada com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado
A irrigação de áreas agrícolas com efluentes de esgoto tratado (EET) é
interessante e atrativa, quando realizada de forma controlada, pois além de possibilitar
a liberação de recursos hídricos de melhor qualidade para outras atividades humanas,
serve como uma forma de polimento dos efluentes provenientes do tratamento de
esgoto por meio do “filtro biológico” constituído pelo sistema solo-planta. Entretanto, o
reuso agrícola de efluentes é recente no Brasil e são poucos os estudos relacionados
aos possíveis impactos dessa prática na qualidade dos solos tropicais. O presente
estudo foi elaborado com o objetivo de avaliar o efeito de lâminas excedentes de
irrigação de pastagem com capim Tifton, com efluente de esgoto tratado por 18 meses,
na atividade microbiana, densidade de grupos funcionais, no potencial metabólico dos
microrganismos e na estrutura da comunidade de bactérias oxidantes de amônio do
solo. O experimento foi conduzido numa área de pastagem com capim-Bermuda Tifton
85 (Cynodon dactylon Pers. X C. niemfuensis Vanderyst) no município de Lins (SP), ao
lado da estação de tratamento de esgoto operada pela Sabesp. Os tratamentos foram
definidos a partir da lâmina de irrigação considerada adequada para a demanda hídrica
da cultura (controle) e mais três lâminas com excesso de irrigação, sendo elas: 0% de
excesso (controle), 25%, 50% e 100% de excesso de irrigação com efluente. Para
avaliação do efeito do efluente sobre os atributos químicos e microbiológicos do solo,
também foi avaliada uma área de pastagem de capim Tifton 85, localizada próxima à
área experimental e não irrigada com efluente. A aplicação de lâminas excedentes de
efluente de esgoto tratado durante um ano e meio promoveu alterações nas
propriedades químicas e microbiológicas do solo. Quando as lâminas de irrigação foram
avaliadas em conjunto com o efeito promovido pela precipitação, constatou-se redução
da acidez ativa, dos teores de magnésio e potássio trocáveis e, aumento nos teores de
cálcio e sódio trocáveis do solo. A colonização radicular do capim Tifton 85 por fungos
micorrízicos arbusculares não foi afetada pela irrigação com lâminas excedentes de
efluente de esgoto tratado, pelo período de 18 meses. A análise de curva de resposta
principal possibilitou constatar que dos grupos funcionais de microrganismos avaliados,
os amonificantes e os desnitrificantes foram os mais influenciados pelo excesso de
irrigação com efluente e, a lâmina com 25% de excesso foi a que promoveu a menor
variação nos grupos funcionais de microrganismos, em relação à lâmina controle. O
potencial metabólico dos microrganismos foi estimulado pela irrigação com efluente,
sendo que a lâminas excedente em até 100% não modificou significativamente o
potencial metabólico da comunidade microbiana em relação à lâmina controle. As áreas
irrigadas com efluente de esgoto tratado apresentam dominância de bactérias oxidantes
de amônio do gênero Nitrosospira sp.
Palavras-chave: Irrigação com efluentes: Amonificantes: Desnitrificantes; Potencial
metabólico; Biolog; Sódio; Fungos micorrízicos arbusculares; análise
multivariada
9
ABSTRACT
Microbiological soil attributes of a pasture area with surplus irrigation of
wastewater effluent
Crop irrigation with treated sewage effluent (STE) is an interesting and attractive
practice, when applied in a controlled manner, as well as it makes possible the release
of water of better quality for other human activities and serves as a way to polish the
STE through the "biological filter" comprising the soil-plant system. However,
wastewater irrigation is a recent practice in Brazil and little is known about its effects on
the quality of tropical soils. The aim of this work was to evaluate the effects of surplus
irrigation with STE of a pasture area cultivated with BermudagrassTifton 85 for 18
months, on the microbial activity, functional groups of microorganisms, on the
community-level physiological profile and on the community structure of ammonia
oxidizing bacteria. The experiment was carried out at the municipal district of Lins, São
Paulo State, close to the sewage treatment plant (STP), operated by Sabesp
(Companhia de saneamento básico do Estado de São Paulo), cultivated with bermuda
grass Tifton 85 (Cynodon dactylon Pers. X C. niemfuensis Vanderyst). The treatments
were based on the amount of irrigation required for the adequate water amount
necessity for this pasture grass, and other 3 surplus irrigation treatments, as follow: 0%
of excess (control), 25%, 50% and 100% of excess of STE irrigation. Surplus STE
pasture irrigation for 18 months changed soil chemical and microbiological parameters.
The evaluation of surplus STE irrigation and also the precipitation effects decreased the
soil pH and exchangeable magnesium and potassium, while it increased the
exchangeable calcium and sodium. The root colonization of Bermudagrass by arbucular
mycorrhizal fungi was not affected by surplus STE irrigation, after 18 months. The
principal response curve analysis demonstrated that the functional groups of
microorganisms: ammonifiers and denitrifiers, were the most affected by surplus STE
irrigation. The treatment with 25% of surplus irrigation caused only minor variation on the
functional groups of microorganisms, compared to the control irrigation. The soil
microorganisms’ metabolic potential, evaluated by the kinetic of carbon substrates
consumption, using Biolog Ecoplates, was stimulated by STE irrigation. Even 100%
surplus STE irrigation did not cause a significant modification of the the microbial
communities metabolic potential, when compared to the control STE irrigation. STE
irrigated pasture areas presented dominance of the genus Nitrosospira, among
ammonium oxidizing bacteria.
Keywords: wastewater irrigation; ammonifiers; denitrifiers; metabolic potential; Biolog;
sodium; arbuscular mycorrhizal fungi; multivariate analysis
10
LISTA DE ABREVIATURAS
EET – Efluente de esgoto tratado
Cmic – Carbono microbiano
qMIC – Quociente microbiano
qCO
2
– Quociente metabólico
C:N – Relação carbono: nitrogênio
BAC – Bactérias totais
FGO – Fungos totais
AMO – Amonificantes
NIT-NH
4
+
- Nitrificantes, oxidantes de amônio
NIT-NO
2
-
- Nitrificantes, oxidantes de nitrito
DESN - Desnitrificantes
PCR – Reação da polimerase em cadeia
DGGE – Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação
RIS – Respiração induzida por substrato
FMA – fungo micorrízico arbusculares
ETE – Estação de tratamento de esgoto
pH – Acidez ativa do solo
Ca
2+
– Cálcio trocável
Mg
2+
– Magnésio trocável
K
+
– Potássio trocável
Na
+
– Sódio trocável
CTC – Capacidade de troca catiônica do solo
CT – Carbono total do solo
NT – Nitrogênio total do solo
NMP – Número mais provável de microrganismos
RDA – análise de redundância
PRC – análise de curva de resposta principal
11
AWCD – média do desenvolvimento de cor do poço da placa de Biolog
‘K’ – parâmetro cinético de consumo que representa o potencial de substrato utilizado
‘R’ – parâmetro cinético de consumo que representa a taxa exponencial de utilização do
substrato
‘S’ – parâmetro cinético de consumo que representa o tempo para alcançar o ponto
médio da curva de consumo de substrato.
NMDS – Análise em escala multidimensional
ANOSIM – análise de similaridade
12
1 INTRODUÇÃO
Em todo o mundo, devido a sua escassez, existe uma crescente competição pelo
uso de água entre diversos setores da sociedade. O consumo de água na agricultura é
grande em relação a outros tipos de uso, podendo afetar a disponibilidade deste
recurso para a população urbana se este não for bem administrado. No Brasil, a
agricultura consome cerca de 61% da água doce total (ANA, 2004). Portanto, é
desejável uma realocação dos recursos hídricos usados na agricultura para outros
setores.
Desde que realizada de forma controlada, a irrigação com efluente de esgoto
tratado (EET) é altamente atrativa, pois além de possibilitar a liberação de recursos
hídricos de melhor qualidade para outras atividades humanas, serve como uma forma
de polimento dos efluentes provenientes do tratamento de esgoto por meio do “filtro
biológico” constituído pelo sistema solo-planta. O uso de EET também pode ser
considerado como recurso econômico de grande valor, pois contêm nutrientes e sua
utilização pode levar à diminuição de fertilizantes minerais adicionados aos
agrossistemas, reduzindo os custos variáveis de produção e aumentando a
competitividade do produtor, contribuindo ainda para a preservação do meio ambiente.
Dos sistemas de tratamento de esgoto doméstico disponíveis atualmente, o
sistema de lagoas de estabilização é o mais utilizado nas cidades de pequeno e médio
porte (FEIGIN et al., 1991), sobretudo, no interior do Estado de São Paulo. Este sistema
gera efluentes que apresentam sólidos inorgânicos e mateial orgânico em suspensão
ou dissolvido, características de um tipo de água residuária, segundo Pescod (1992).
Embora o processo de tratamento por lagoas de estabilização seja capaz de
reduzir consideralvemente as concentrações de nutrientes e matéria orgânica, os
efluentes de lagoas de estabilização normalmente apresentam concentrações,
principalmente de fósforo e nitrogênio, acima do permitido pela legislação para a
disposição em cursos d’água. Dessa forma, alternativas para a disposição dos efluentes
são discutidas em diversos trabalhos (BOUWER; CHANEY, 1974; FEIGIN et al., 1991;
CAMERON et al., 1997).
13
O reuso agrícola de efluentes destaca-se como alternativa mais econômica para
a disposição ambiental desse resíduo (ASANO et al., 1996), utilizado em diversos
países (FILIP et al., 1999). Contudo, a utilização extensiva e continuada de efluentes na
agricultura resulta em alta carga de sais minerais dissolvidos e sólidos suspensos,
alterando as características químicas, físicas e biológicas do solo (FILIP et al., 1999;
BALKS et al., 1998; BOND, 1998; FRIEDEL et al., 2000) e também o ambiente (AL-
NAKSHABANDI et al., 1997). As variações nas condições locais de solo, cobertura
vegetal e composição do efluente são fatores determinantes da extensão dessas
alterações, modificando (MOHAMMAD; MAZAHREH, 2003) ou não (MANCINO;
PEPPER, 1992; WANG; CHANG; CROWLEY, 2003) a qualidade do solo.
O reuso agrícola de efluentes é recente no Brasil. Em estudo realizado em área
de pastagem de capim Tifton 85 (Cynodon dactylon Pers. X C. niemfuensis Vanderyst)
no município de Lins-SP, próxima à área de estudo do presente projeto, Fonseca et al.
(2007a) observaram que a irrigação com efluente de esgoto tratado foi eficiente em
substituir a água potável e ainda promoveu benefícios econômicos, associadas à
fertilização com nitrogênio. De acordo com os autores, a irrigação com efluente foi
capaz de suprir de 32 a 81% da necessidade de nitrogênio mineral requerida pelo
capim para sua máxima produtividade.
Nesta mesma área, Nogueira et al. (2005) constataram que após um ano e meio
de aplicação de efluente de esgoto tratado na irrigação do capim Tifton 85, a atividade
microbiana, avaliada pelo quociente metabólico, aumentou somente na estação seca,
devido ao estímulo desta atividade ocasionado pela umidade e adição de nitrogênio, via
irrigação com efluente. Entretanto, neste período, não houve variação significativa na
relação entre carbono microbiano:carbono orgânico do solo (Cmic/COT) para os
tratamentos com efluente e com água potável, indicando a capacidade da microbiota
em se adaptar às mudanças do solo ocasionadas pela irrigação.
Estes estudos anteriores comprovaram a eficiência da utilização de efluente de
esgoto tratado em suprir o capim Tifton 85 em água e, parcialmente, em nutrientes
(FONSECA et al., 2007a) e indicaram que a microbiota possui a capacidade de adaptar-
se às mudanças no solo advindas da aplicação do efluente, em comparação à irrigação
com água potável (NOGUEIRA et al., 2005).
14
A utilização de águas residuárias para irrigação de culturas certamente promove
alterações na atividade microbiana, bem como na composição da comunidade edáfica
(SPEIR, 2002; GELSOMINO et al., 2006) . Sendo a atividade microbiana do solo
responsável em grande parte pela decomposição de resíduos orgânicos, ciclagem de
nutrientes, síntese de substância húmicas e conseqüentemente, estabilidade estrutural
do solo, é fundamental a avaliação da influência da disposição de efluentes de esgoto
tratado sobre as transformações bioquímicas necessárias à qualidade do solo e seu
efeito na comunidade microbiana.
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Hipótese
A aplicação de lâminas excedentes de irrigação do capim Tifton 85 com efluente
de esgoto tratado (EET) em até 50% da evapotranspiração da área não causará
alterações negativas na qualidade química e microbiológica do solo, devido à alta
produtividade e capacidade de remoção de nutrientes apresentada pelo capim Tifton
85.
2.2 Revisão Bibliográfica
2.2.1 Atributos microbianos indicativos de distúrbios no sistema solo-planta
O solo é um meio complexo e heterogêneo, resultado da alteração do material de
origem (rochas, sedimentos ou outro solo) sob a ação de organismos, do clima e do
relevo, ao longo do tempo. Constituído por quantidades variáveis de minerais, matéria
orgânica, água, gases e organismos, este meio vivo e dinâmico pode ser considerado
um recurso natural finito, limitado e não renovável.
15
A sua condição limitada e não renovável está baseada na relação
desproporcional existente entre as taxas de formação e de degradação do solo. Do
ponto de vista pedológico, a velocidade de aprofundamento de uma camada de solo é
em média de 20 a 50 m por milhão de anos (BUOL; HOLE; McCRACKEN, 1973). Em
contrapartida, as taxas de degradação do solo são mais rápidas. Considerando-se
apenas o fenômeno da erosão dos solos, estima-se que cerca de 1,2 bilhões de
hectares foram erodidos, a partir do final da Segunda Guerra Mundial (STOCKING,
2000). Além da erosão, o processo de degradação envolve também a contaminação
dos solos, inutilizando-os tanto para a agricultura como para atividades urbanas e
industriais. Atualmente, 24% dos solos encontram-se poluídos, pobres em nutrientes ou
erodidos ao ponto de serem incapazes de sustentar plantas (Pesquisa FAPESP, 2008).
A preocupação com a conservação deste recurso é decorrente das funções que
este apresenta para o ecossistema e para a sociedade. As principais funções do solo se
caracterizam pela habilidade de servir como meio de sustento de vegetais e de
edificações, regularizar e compartimentalizar o fluxo de água no ambiente, estocar e
promover a ciclagem de nutrientes, além de decompor materiais orgânicos (LAVELLE;
SPAIN, 2005)
Em função do conhecimento dessa habilidade dos microrganismos do solo em
decompor os materiais orgânicos, desenvolveu-se o conceito de que o solo é capaz de
absorver todo material orgânico nele adicionado. Entretanto, essa premissa não é
verdadeira porque há uma série de substâncias orgânicas que não são degradáveis ou
são de lenta degradação, denominadas recalcitrantes (MOREIRA; SIQUEIRA, 2007).
Dessa forma, a disposição de resíduos no solo deve ser estudada com cautela,
principalmente focando avaliações relacionadas com a atividade dos microrganismos
edáficos. A utilização de microrganismos e processos microbianos para avaliar
alterações no ambiente edáfico se justifica pela capacidade que a microbiota possui de
responder prontamente às mudanças no solo (STENBERG, 1999).
16
2.2.1.1 Atividade microbiana no solo
A atividade dos microrganismos do solo, também denominada respiração
microbiana, é considerada um indicador sensível da decomposição de resíduos, do giro
metabólico do carbono orgânico do solo e de distúrbios no ecossistema (TÓTOLA;
CHAER, 2002).
Altas taxas de respiração microbiana podem indicar tanto um distúrbio ecológico,
como a adição de grande quantidade de matéria orgânica prontamente disponível, ou
ainda um alto nível de produtividade do ecossistema (TÓTOLA; CHAER, 2002). Dessa
forma, a relação da taxa de respiração com outros parâmetros microbiológicos tende a
fornecer uma interpretação mais adequada dos fenômenos que possam interferir na
atividade da comunidade microbiana do solo, como a ação antrópica ou mesmo
mudanças climáticas naturais.
Dentre esses parâmetros, destaca-se a biomassa microbiana, definida como a
fração viva da matéria orgânica do solo (JENKINSON; LADD, 1981) e composta
principalmente por bactérias e fungos. Sua aplicação como indicador de mudanças nos
processos que ocorrem no ambiente edáfico é atribuída a sua rápida ciclagem, em
comparação com a matéria orgânica do solo, além de sua importância como
reservatório temporário de nutrientes (SPARLING, 1992).
O carbono da biomassa microbiana, ou carbono microbiano (Cmic), tem sido
utilizado em diversos estudos sobre o impacto de diferentes manejos no solo (ARAÚJO
et al., 2003; KAUR et al., 2008; TRASAR-CEPEDA et al., 2008) e no monitoramento da
recuperação de solos degradados e poluídos (COLODRO et al., 2007; SILVEIRA;
MELLONI; PEREIRA, 2004; ZHANG et al., 2008). Entretanto, as comparações entre
diferentes áreas devem ser feitas com cautela, levando em consideração a textura e o
teor de carbono orgânico do solo (Corg), características que influenciam diretamente a
biomassa microbiana (ROSCOE et al., 2006).
Para contornar as dificuldades de interpretação de resultados, alguns autores
sugeriram a relação entre o carbono microbiano e o carbono orgânico do solo
(Cmic:Corg), ou quociente microbiano (qMIC). Esta relação representa a proporção do
17
carbono orgânico total que corresponde à biomassa microbiana, o que também reflete o
carbono disponível para crescimento da biomassa (ANDERSON; DOMSCH, 1985).
Segundo Jenkinson e Ladd (1981), o qMIC abrange valores de 1 a 5%, variando em
função da classificação do solo.
Por se tratar de uma relação e não um valor absoluto, o qMIC possibilita a
comparação de dados entre solos com diferentes teores de matéria orgânica. De modo
geral, a exploração intensiva do solo, assim como a presença de condições
estressantes (contaminação do solo por metais pesados ou poluentes orgânicos,
deficiências nutricionais, etc) promovem um declínio mais rápido no reservatório de
carbono microbiano do que no carbono total do solo, que pode ser observado em
menores taxas de qMIC (WARDLE, 1997).
Outra relação amplamente estudada e discutida inclui a taxa de respiração e o
carbono microbiano (Cmic) e é também denominada de quociente metabólico (qCO
2
).
Proposta por Anderson e Domsch (1993), esta relação tem sido empregada como
indicador ecofisiológico na avaliação da qualidade do solo (ANDERSON, 2003).
Utilizando-se de conceitos ecológicos, como o desenvolvido por Odum (1969), no
qual o autor considera que existe uma tendência ao uso mais eficiente de energia com
o aumento da diversidade de produtores primários, durante os estádios de sucessão
ecológica, menores valores de qCO
2
estariam relacionados com áreas de maior
diversidade vegetal (ANDERSON, 2003).
Em estudos comparando áreas agrícolas cultivadas por longo tempo e florestas
em clímax, com solos apresentando pH neutro, Anderson (2003) verificou valores de
2,0 a 4,4% de Cmic:Corg (qMIC), dependendo do manejo e da fertilidade do solo, e
para o qCO
2
os valores variaram de 0,5 a 2,0 mg CO
2
-C g
-1
Cmic h
-1
. A partir desses
resultados, o autor sugere que em solos neutros, valores de Cmic:Corg (qMIC) menores
que 2% e de qCO
2
maiores que 2,0 mg CO
2
-C g
-1
Cmic h
-1
podem ser considerados
críticos para a atividade microbiana e a manutenção das funções do solo relacionadas
aos microrganismos.
Entretanto, estes valores críticos e a avaliação do qCO
2
como índice capaz de
discriminar efeitos de distúrbio (mudanças rápidas nas condições ambientais) ou de
estresse (condições limitantes ao crescimento e manutenção da comunidade
18
microbiana por longos períodos) no solo têm sido questionada por diversos autores
(ALVAREZ et al., 1998; BILGO et al., 2006; RABARY et al., 2008; WARDLE, GHANI,
1995).
Comparando dados compilados de diversos trabalhos, Wardle e Ghani (1995)
verificaram a inconsistência da avaliação do qCO
2
como indicador de distúrbio no
ecossistema. Segundo os autores, este índice mostrou-se relevante no estudo de áreas
sob estresse severo, como a contaminação por metais pesados.
Para obter uma informação mais consistente e confiável, Anderson (2003)
recomenda a interpretação do qCO
2
conjuntamente com o qMIC, bem como a avaliação
ao longo do tempo, a fim de avaliar também as variações desses parâmetros para a
área em estudo.
Outra forma de investigar os impactos causados por manejos que adicionam
resíduos ao solo, sobre a comunidade microbiana, é a avaliação da capacidade da
comunidade em responder à adição de fontes de carbono altamente energéticas e de
fácil degradação, como a respiração induzida por substrato (RIS) (ANDERSON;
DOMSCH, 1978).
Considerando a dinâmica de crescimento dos microrganismos, conceitos de
ecologia podem ser aplicados para compreender o comportamento dos organismos do
solo, em função de uma pressão de seleção (MORRIS; BLACKWOOD, 2007), como no
caso da análise da RIS. A adição de glicose a uma amostra de solo sob condições
controladas, uma fonte de carbono simples, poderia representar uma seleção do tipo r,
ou seja, relacionada com abundância de substratos, onde há a dominância de
microrganismos de crescimento rápido e hábeis no consumo de substratos simples e
disponíveis (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
A avaliação de padrões de utilização de fontes de carbono pelos microrganismos
do solo possibilita o estudo do potencial metabólico da comunidade microbiana. Dessa
forma, a análise do potencial metabólico dos microrganismos em um solo pode expor
diferenças quanto ao padrão de utilização de substratos, sendo de grande interesse
para estratégias de aplicação de efluentes no solo a maior diversidade metabólica
possível encontrada na comunidade microbiana.
Dentre as metodologias existentes para estudos do potencial metabólico, uma
19
das mais empregadas envolve a incubação de suspensões de solo em placas Ecoplate,
da empresa Biolog (BIOLOG Inc., HAYWARD, CA.), contendo 31 diferentes fontes de
carbono. A utilização da fonte de carbono é facilmente detectada através da presença
de um indicador, ocorrendo uma mudança de coloração quando um substrato é
utilizado pelo microrganismo durante o processo de respiração. As informações podem
ser analisadas automaticamente e podem ser comparadas em um banco de dados.
O método desenvolvido por Garland e Mills (1994), com a proposta de um
sistema capaz de identificar bactérias com habilidade de metabolizar variadas fontes
individuais de carbono, possibilita avaliar o potencial heterotrófico de uma comunidade
microbiana em condições de cultivo. Para este tipo de avaliação, estão disponíveis
comercialmente vários tipos de placas (Biolog GN2, GP2, ECO, SFN2 e SFP2). As
placas Ecoplate foram desenvolvidas para a avaliação de comunidades bacterianas
presentes em amostras ambientais, contendo 31 fontes de carbono em triplicata e um
controle sem substrato (INSAM, 1996). Estudos publicados recentemente sugerem que
o número e a diversidade de substratos presentes nas Ecoplates são suficientes para
representar comunidades microbianas presentes em diferentes e contrastantes
amostras ambientais (CLASSEN et al. 2003).
Embora alguns trabalhos já tenham discutido as limitações do método
(PRESTON-MAFHAM et al., 2002), bem como as precauções a serem tomadas com
relação à densidade de inóculo inicial, ao tempo e à temperatura de incubação das
placas (CLASSEN et al., 2003) e ao método de extração dos microrganismos presentes
na amostra (CALBRIX et al., 2005) a análise do padrão de consumo de substrato pela
comunidade microbiana tem fornecido informações úteis na avaliação da diversidade
funcional de microrganismos em amostras ambientais (CRECHIO et al., 2004).
Além de parâmetros microbiológicos relacionados à atividade dos
microrganismos e sua participação na ciclagem da matéria orgânica do solo, a
avaliação da comunidade microbiana e de grupos funcionais de microrganismos
também possibilitam monitorar mudanças no manejo do sistema solo-planta.
20
2.2.1.2 Grupos funcionais de microrganismos
Os microrganismos do solo apresentam alta diversidade metabólica,
característica que os torna versáteis para ocupar diversos nichos ecológicos
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2007). Os quimiorganotróficos, ou heterotróficos, utilizam
compostos orgânicos para obter carbono e energia e são os mais abundantes no solo
em densidade e diversidade, atuando principalmente na degradação da matéria
orgânica do solo. A atividade de decomposição de materiais orgânicos depositados no
solo é realizada por diversos microrganismos, destacando-se fungos e bactérias
(LAVELLE; SPAIN, 2003).
As bactérias são capazes de realizar uma grande variedade de transformações
químicas, e por conseqüência, fundamentais no processo de degradação de materiais
orgânicos. Os fungos, considerados como organismos decompositores primários,
também são reconhecidos pela capacidade de decompor substâncias complexas como
a lignina (LAVELLE; SPAIN, 2005).
Dentre as etapas de degradação de resíduos orgânicos realizados pelos
microrganismos heterotróficos destaca-se a amonificação. Este é o processo de
transformação do nitrogênio presente nos compostos orgânicos em amônia ou amônio,
conforme o pH do solo. Mediado por enzimas que são produzidas por microrganismos e
animais do solo, o processo inicia com quebra primária dos polímeros orgânicos que
contém nitrogênio, como proteínas, açúcares aminados e ácidos nucléicos, pela ação
das enzimas extracelulares (CARDOSO; TSAI; NEVES, 1992).
Os monômeros resultantes desta reação inicial transpassam a membrana celular
onde são metabolizados no citoplasma dos microrganismos amonificantes, resultando
na produção de amônio, que por fim é liberado para a solução do solo. Na maioria das
situações a degradação microbiana de aminoácidos, açúcares aminados e nucletídeos
é governada pela demanda de carbono e energia requerida pelos amonificantes
(CARDOSO; TSAI; NEVES, 1992).
A produção líquida de amônio no solo é influenciada não apenas pelas condições
ambientais e relação Carbono:Nitrogênio (C:N) dos substratos orgânicos e
microrganismos, mas também por outros fatores bióticos. Os protozoários e
21
nematóides, são responsáveis por cerca de 30% da mineralização líquida de nitrogênio
(SYLVIA et al., 2005). De acordo com os autores, no processo de predação de
bactérias por protozoários geralmente ocorre liberação de amônio como produto
residual. Isto porque ambos possuem relações C:N similares, o que resulta em excesso
de nitrogênio, devido à perda de carbono na forma de CO
2
durante o metabolismo do
protozoário.
Uma vez na solução do solo, o amônio pode ter vários destinos. Dentre eles,
destacam-se a absorção pelas plantas, a assimilação microbiana, também considerada
imobilização temporária e a oxidação a nitrato pelas bactérias nitrificantes.
A produção microbiana de nitrato, ou nitrificação, é realizada no ambiente edáfico
principalmente por bactérias quimioautotróficas. Este processo é composto por duas
etapas: a oxidação do amônio a nitrito, por bactérias do gênero Nitrosomonas; em
seguida, a oxidação do nitrito a nitrato, por bactérias do gênero Nitrobacter
(ROBERTSON; GROFFMAN, 2007).
O processo de nitrificação no solo também pode ocorrer via nitrificação
heterotrófica (NURK et al., 2005; SU et al., 2006) e as comunidades microbianas
envolvidas nesse processo também são capazes de desnitrificar, utilizando o nitrato e o
nitrito formados durante a nitrificação como aceptores de elétrons, reduzindo-os a óxido
nitroso (MCLAIN; MARTENS, 2006).
Em solos que não receberam fertilização nitrogenada, as populações de
nitrificantes variam de 10
3
a 10
4
células g
-1
de solo, mas, após fertilização, observa-se
aumento das populações para valores superiores a 10
6
células g
-1
de solo (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2007).
Os principais fatores que regulam o crescimento das populações de nitrificantes
são a condição de aeração, umidade do solo, disponibilidade de substrato e o pH do
solo. Outros fatores como temperatura, salinidade e disponibilidade de nutrientes além
do nitrogênio também afetam a atividade dos nitrificantes (ROBERTSON; GROFFMAN,
2007).
O nitrato resultante do processo de nitrificação, uma vez na solução do solo,
pode ser prontamente utilizado por outros microrganismos ou absorvido pelas raízes
das plantas. Entretanto, por se tratar de um ânion, esta forma de nitrogênio é altamente
22
móvel no solo (CANTARELLA, 2007) e as perdas por lixiviação são de grande risco
econômico e ambiental, em função do potencial de contaminação de águas
subterrâneas.
Em condições de redução e limitação de oxigênio no meio, o nitrato exerce a
função de aceptor de elétrons em diferentes espécies bacterianas, também
denominadas de desnitrificantes. A desnitrificação respiratória é geralmente a principal
rota de perda de nitrogênio para a atmosfera (ROBERTSON, 2000).
As bactérias desnitrificantes compreendem de 0,1 a 5% do total da comunidade
bacteriana do solo e apresentam uma grande variação de grupos taxonômicos (TIEDJE,
1988). Essa grande participação se deve à capacidade desses microrganismos em
atuar também como heterotróficos aeróbios, alternando o receptor de elétrons conforme
a varia a disponibilidade de oxigênio no solo (ROBERTSON; GROFFMAN, 2007).
Na maioria dos solos, a formação de condição anaeróbia é o principal fator que
controla a atividade dos desntrificantes, seguido da disponibilidade de nitrato e carbono.
O estabelecimento de sítios anaeróbios no solo varia grandemente, em função da sua
estrutura e da umidade do solo. Devido a esses fatores, a desnitrificação também varia
muito no tempo e no espaço. Mudanças de curto prazo, como fortes chuvas e irrigação,
além da adição de nutrientes, são fenômenos que estão associados com aumentos
temporários nas taxas de desnitrificação em um determinado solo (ROBERTSON,
2000).
Outro grupo importante de microrganismos compreende os Fungos Micorrízicos
Arbusculares (FMAs) que, em simbiose com as raízes das plantas, formam as
micorrizas arbusculares. Estas são conhecidas pelos benefícios que promovem à planta
hospedeira, sobretudo em condições de baixa disponibilidade de nutrientes (SMITH;
READ, 1997).
Juntamente com a melhoria na aquisição de nutrientes, em especial daqueles
que apresentam baixa mobilidade no solo, como o fósforo, a rede de hifas formada pela
associação micorrízica proporciona uma maior agregação e estabilização dos
agregados do solo, além da deposição de material orgânico, como as proteínas
denominadas glomalinas, que também contribuem para a agregação (CARDOSO;
TSAI; NEVES, 1992).
23
Plantas micorrizadas em geral apresentam alterações fisiológicas, com o
favorecimento da relação água-planta, destacando-se maior taxa de transpiração e
abertura estomatal e alterações nas raízes em comprimento e profundidade e nas
características de absorção, fatores que auxiliam a planta em condições de excesso de
sais no solo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2007).
Estudos sobre o impacto da disposição de rejeitos de mineração (LINS et al.,
2007), contaminação com resíduos derivados de petróleo (PAULA et al., 2006) e uso
intensivo de herbicidas (VIEIRA et al., 2007) apontam uma redução na colonização
micorrízica e na diversidade desses fungos, resultando na seleção de espécies menos
eficientes no estabelecimento da associação simbiótica com as plantas.
Bem desenvolvidas, inteiramente funcionais, as simbioses já foram reconhecidas
como fundamentais para a estabilidade do ecossistema e sua sustentabilidade (ODUM,
1959). As micorrizas arbusculares estão presentes na maioria das plantas
(BRUNDRETT, 1991) e, em vista dos benefícios promovidos pela simbiose e sabendo
da inibição da associação em condições de excesso de nutrientes, a avaliação da
ocorrência desses fungos, bem como o status de colonização da planta são
informações importantes para se obter uma acurada avaliação da eficiência da
aplicação de efluente em culturas agrícolas.
2.2.1.3 Avaliação de grupos funcionais de microrganismos
A contagem ou densidade populacional de grupos funcionais de microrganismos
é um método bastante utilizado e conhecido no estudo da comunidade microbiana do
solo (ACEA; CARBALLAS, 1999; FILIP et al., 1999; BARROTI; NAHAS, 2000;
SANOMIYA; NAHAS, 2003; LAVELLE; SPAIN, 2005). O uso do método de diluição em
série a partir de uma suspensão de solo, seguido de inoculação em meios de cultivo
líquidos ou sólidos e posteriores contagens são técnicas simples e reproduzíveis, não
necessitando de equipamentos caros.
Devido à complexidade das populações microbianas e seus diferentes processos
é difícil fazer comparações entre diferentes solos, sob diferentes condições de manejo e
24
uso, baseando-se no tamanho das populações ou em funções específicas da
comunidade microbiana. Dessa forma, o uso de parâmetros como a contagem de
microrganismos e a avaliação de seus processos é mais aplicável no estudo de uma
área em particular, quando se pretende analisar a mudança de uso do solo ou o efeito
de um determinado manejo (ROPER, OPHEL-KELLER, 1997).
Baseados em numerosos estudos sobre a influência de agroquímicos como fator
de distúrbio do solo sobre a comunidade microbiana, Domsch et al. (1983) propuseram
a seguinte classificação:
Grupo altamente sensível: bactérias nitrificantes, actinomicetos e bactérias do
gênero Rhizobium e as funções de degradação da matéria orgânica e a nitrificação;
grupo moderadamente sensível: bactérias totais, fungos totais e algas e, as funções de
desnitrificação e amonificação; grupo pouco sensível: bactérias amonificantes e
microrganismos proteolíticos e a função de fixação biológica de nitrogênio.
Brookes et al. (1995) também ressaltaram que os grupos de microrganismos e
suas funções que podem ser indicativas de um distúrbio ou mudança de uso do solo
deveriam ser facilmente distinguíveis daqueles de uma medida controle ou referência
(área não sujeita ao distúrbio).
Embora a avaliação da densidade populacional por meio do método do número
mais provável forneça dados interessantes, este método apresenta vários fatores que
contribuem para o número relativamente baixo de bactérias ou fungos detectados.
Apenas as espécies capazes de crescer utilizando os nutrientes contidos no meio de
cultura e nas condições de incubação produzirão colônias. Em conseqüência disso,
apenas uma fração muito pequena da comunidade microbiana do solo pode ser
estimada (KANDELER, 2007).
Para contornar essas limitações foram desenvolvidos métodos de avaliação de
grupos funcionais de microrganismos que independem de cultivo, como: a quantificação
e identificação de ácidos graxos, componentes das membranas celulares; perfil de
quinonas, componentes do sistema de transporte de elétrons da maioria dos
organismos e, a quantificação de moléculas-assinatura, como ergoesterol para fungos,
lipossacarídeos e glicoproteínas, para variados grupos de bactérias, dentre outros
métodos (KANDELER, 2007).
25
Embora esses métodos ofereçam informações mais detalhadas sobre os grupos
funcionais de microrganismos, muitos deles apresentam elevados custos de execução e
demandam treinamento adequado para a condução das análises. Dada essas
características peculiares, esses métodos podem ser empregados como ferramentas
para estudos complementares, após uma análise da área de estudo, utilizando medidas
mais abrangentes, como a contagem de grupos funcionais de microrganismos.
As comunidades microbianas do solo em equilíbrio dinâmico são geralmente
constituídas por poucas espécies contendo muitos indivíduos e por muitas espécies
com poucos indivíduos. Embora as populações dominantes sejam as maiores
responsáveis pelos fluxos de matéria e de energia na comunidade, as espécies menos
abundantes são as que mais contribuem para a diversidade biológica (ATLAS;
BARTHA, 1997).
Dessa forma, a alta diversidade de organismos está geralmente associada à
elevada estabilidade da comunidade, onde cada população desempenha papel
funcional que determina a manutenção normal dos fluxos de matéria e de energia em
cada nível trófico de um ecossistema particular (MOREIRA; SIQUEIRA, 2007).
Considerando o ambiente edáfico, o estabelecimento de uma condição desfavorável
poderia resultar na inibição de algumas populações que desempenham papéis vitais
dentro da comunidade (TÓTOLA; CHAER, 2002).
A diversidade microbiana do solo é usualmente analisada em nível de espécie ou
diversidade genética, mais do que em nível de diversidade estrutural e funcional
(HOBEN; HARRIS, 1995; VAN BRUGGEN; SEMENOV, 2000).
Estudos moleculares de ecologia microbiana dependem da extração e
caracterização de ácidos nucléicos (ácido desoxirribonucléico – DNA; ácido ribonucléico
– RNA) de organismos do solo. Uma vez extraídos, os ácidos nucléicos ou outras
moléculas também consideradas biomarcadores podem ser diretamente analisados
(THIES, 2007).
A partir dos extratos de DNA de amostras de solo, têm-se disponíveis diversos
métodos moleculares de análise, que podem ser diretos ou dependentes da reação em
cadeia da polimerase (em inglês, polimerase chain reaction – PCR), utilizada para
aumentar o número de cópias de um gene de interesse, que seja de fácil detecção.
26
(NAKATSU, 2007).
A reação de PCR envolve a separação da dupla-fita de DNA molde em duas fitas
(desnaturação), seguido da hibridização (anelamento) de oligonucleotídeos iniciadores
(fitas curtas de nucleotídeos com uma seqüência conhecida) às fitas de DNA
separadas, sendo um iniciador e outro finalizador de uma dada seqüência de interesse.
Por fim, ocorre a elongação do híbrido iniciador-fita molde de DNA pela enzima
TaqDNA polimerase. Este ciclo é então repetido de 25 a 30 vezes, dobrando o número
de produtos (amplicons) em cada ciclo (THIES, 2007).
Os iniciadores utilizados para estudos de ecologia do solo podem ter várias
finalidades, dependendo da informação que se deseja. Estes podem buscar seqüências
específicas do DNA molde, como aqueles que codificam genes de uma pequena
subunidade do rRNA (THIES, 2007), ou podem também enfocar seqüências de genes
com uma função conhecida.
O gene amoA enquadra-se nos genes de interesse que codificam funções
ecológicas significantes, como a nitrificação (ROTTHAUWE et al., 1997). Este gene
codifica a unidade α da enzima amônia monooxigenase, que catalisa a primeira etapa
da nitrificação: a oxidação da amônia à hidroxilamina (KLOTZ; NORTON, 1995). As
técnicas moleculares têm sido utilizadas com mais freqüência no estudo desse grupo de
microrganismos, as bactérias oxidantes de amônio (CHU et al., 2007; SCHMIDT et al.,
2007), em função das limitações da avaliação em meios de cultivo, ocasionadas pela
taxa de crescimento lento e baixa produção de biomassa desse grupo de bactérias em
meios de cultivo (PROSSER, 1989).
Das técnicas moleculares dependentes das reações de PCR atualmente
disponíveis, a eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (em inglês,
denaturing gradient gel electrophoresis – DGGE) é a mais comumente utilizada. De
modo geral, técnicas genéticas de identificação da comunidade microbiana, como o
DGGE, possibilitam a comparação de grande número de amostras, o que facilita a
análise temporal e espacial das comunidades nos variados ecossistemas (NAKATSU,
2007).
No DGGE, o gel possui um gradiente de desnaturação geralmente composto de
uréia e formamida, que funciona como a matriz e fornece resistência para a
27
movimentação das cópias de DNA molde, obtidas na PCR, durante a eletroforese.
Esses compostos desnaturantes têm efeito diferenciado sobre as pontes de hidrogênio
formadas entre as bases nitrogenadas, sendo necessária uma maior concentração de
desnaturante para romper as pontes entre as bases Guanina e Citosina (NAKATSU,
2007).
As variações nas seqüências de fragmentos de DNA com até 500 pares de base
podem ser detectados pela técnica PCR-DGGE. A eficiência na detecção de diferentes
seqüências pode ser ampliada com a adição de um fragmento rico em
Guanina+Citosina, em um dos lados do fragmento de DNA a ser analisado
(SHEFFIELD et al., 1989). Essa técnica, associada ao seqüenciamento tem sido
empregada com sucesso no estudo das comunidades microbianas, em diferentes
condições de manejo e atividades impactantes no solo (BRIONES et al., 2002; CHU et
al., 2007; NICOLAISEN; RAMSING, 2002;).
Segundo Nakastu (2000), a avaliação de comunidades microbianas que respondem
a estresses externos, utilizando iniciadores de grupos específicos, como aqueles menos
abundantes da microbiota do solo, que provavelmente exercem uma função ecológica
chave na manutenção da fertilidade, possibilita explorar melhor a complexidade da
comunidade.
2.2.2 Efeito da irrigação com esgoto tratado nos atributos microbiológicos do
solo
A utilização agrícola de efluentes de esgoto doméstico tratado é uma prática
comum e antiga em diversos países (FILIP et al., 1999; RAMIREZ-FUENTES et al.,
2002; WANG et al., 2003), entretanto, no Brasil, as pesquisas sobre esta prática são
recentes (NOGUEIRA et al., 2005; GLOAGUEN et al., 2007; HERPIN et al., 2007;
FONSECA et al., 2007a).
O interesse sobre este tema é atual e relevante, visto a crescente preocupação
com a disponibilidade dos recursos hídricos existentes, bem como os aspectos
ambientais da prática, entre eles, o alívio dos corpos receptores e a reutilização de
28
nutrientes presentes nas águas residuárias (HEIDARPOUR et al., 2007). O Brasil
apresenta potencial para essa prática, pois possui grandes áreas agricultáveis e clima
favorável para a irrigação com efluente (FONSECA et al., 2007b).
A irrigação de forrageiras com águas residuárias, assim como a de outras
culturas anuais ou perenes, fornece ao solo, junto com a água, sais minerais e
compostos orgânicos, que modificam as condições ambientais, podendo afetar a
estrutura da comunidade edáfica, a atividade microbiana, a atividade bioquímica, a
densidade de grupos funcionais de microrganismos e a qualidade sanitária (OVED et
al., 2001; SPEIR, 2002; IBEKWE et al., 2003; MANTIS et al., 2005; GELSOMINO et al.,
2006), além das propriedades químicas e físicas do solo (CANDELA et al., 2007;
HEIDARPOUR et al., 2007; WARRINGTON et al., 2007).
A capacidade do solo em remover diferentes compostos presentes nos efluentes
inclui reações químicas, como trocas iônicas, sorção química, precipitação,
complexação e reações bioquímicas, mediadas por microrganismos. As transformações
bioquímicas da matéria orgânica e a liberação de nutrientes no solo irrigado com
efluentes, através de rotas de mineralização, são conduzidas por microrganismos
autóctones e introduzidos no solo, junto com o efluente. Dessa forma, os
microrganismos e suas atividades bioquímicas podem ser úteis não apenas para avaliar
a capacidade depuradora, mas também sua atividade biológica como parte da
qualidade do solo (FILIP et al., 1999).
Os trabalhos relacionados com disposição de efluente no solo e parâmetros
microbianos têm focado principalmente na caracterização e mudanças na estrutura da
comunidade edáfica, atividade microbiana, atividade bioquímica, densidade de grupos
funcionais de microrganismos, qualidade sanitária e ecotoxicidade (SPEIR, 2002;
IBEKWE et al., 2003; MANTIS et al., 2005)
A aplicação de efluente tem proporcionado efeito benéfico sobre o crescimento
de culturas e promovido incrementos significativos na atividade bioquímica do solo,
avaliada através da respiração basal, da sua relação com a biomassa microbiana, ou
seja, respiração específica da biomassa ou quociente metabólico e, atividade de
diversas enzimas hidrolíticas (SPEIR, 2002). Estes parâmetros, de acordo com o autor,
29
mostraram-se sensíveis a alterações como mudanças drásticas na composição e na
quantidade de efluente aplicado ao solo.
Em estudo do perfil de utilização de substratos de carbono, utilizando
microplacas Biolog
®
, Gelsomino et al. (2006) observaram que a constante inundação de
áreas agrícolas com efluentes alterou a diversidade funcional da comunidade
microbiana, de forma que esta se apresentou mais homogênea, em comparação à área
agrícola não impactada pela inundação com efluente.
Outros autores observaram que a irrigação com efluente promoveu um aumento
significativo no consumo de fontes de carbono em comparação a áreas irrigadas com
água potável, utilizando placas Ecoplate, da Biolog (ZHANG et al., 2008). Entretanto,
esses autores não observaram diferença significativa entre as áreas irrigadas com
efluente e com água para o índice de diversidade de Shannon (H).
Em conformidade ao estímulo à atividade microbiana, a utilização de efluentes na
irrigação de culturas tende a aumentar a densidade de grupos de microrganismos como
bactérias totais, actinomicetos e fungos (FILIP et al., 1999; MEKKI et al., 2006),
nitrificantes e desnitrificantes (TAM, 1998) e as bactérias amonificantes, que refletem a
mineralização do nitrogênio orgânico (KERN; IDLER, 1999).
Em pastagens irrigadas com EET foi constatado aumento das concentrações de
amônio na solução do solo e, principalmente, de nitrato (FONSECA, 2005) que, em
excesso, pode ser perdido por lixiviação, contaminando lençóis freáticos e cursos
d’água, além de estimular a desnitrificação.
O amônio da solução do solo pode ser utilizado por microrganismos
quimiolitotróficos atuantes na nitrificação, sendo que ainda são poucos os estudos
relacionados ao efeito da disposição de efluentes no solo sobre esses microrganismos
(OVED et al., 2001; IBEKWE et al., 2003; MEKKI et al., 2006). Estes microrganismos se
encontram em desvantagem competitiva pela adição de compostos orgânicos, que
favorecem a atividade dos heterotróficos, apresentando em geral, reduções na
densidade populacional dos nitrificantes autotróficos devido ao incremento de material
orgânico disponível via efluente ou resíduos orgânicos (ACEA; CARBALLAS, 1999).
Ainda com relação ao nitrato, a sua formação nessas condições pode ocorrer via
nitrificação heterotrófica (NURK et al., 2005; SU et al., 2006) e as comunidades
30
microbianas envolvidas nesse processo também são capazes de desnitrificar, utilizando
o nitrato e o nitrito formados durante a nitrificação como aceptores de elétrons,
reduzindo-os a óxido nitroso (MCLAIN; MARTENS, 2006). As perdas de nitrogênio para
a atmosfera, principalmente na forma de óxidos de nitrogênio, são indesejáveis em
função da contribuição potencial dos óxidos de nitrogênio para o aquecimento global, e
também pela redução na eficiência de utilização desse nutriente nas culturas irrigadas.
Em estudo investigando os fatores limitantes das populações desnitrificantes em
uma área florestal irrigada com efluente de esgoto tratado, na Nova Zelândia, foi
constatado que, em condição de baixo oxigênio, os microrganismos desnitrificantes da
área irrigada com efluente produziram enzimas que atuam no processo de
desnitrificação antes e em maior taxa do que na área controle, que não recebia
efluente, embora ambas as áreas apresentassem populações semelhantes de
desnitrificantes (BARTON et al., 2000). Este fato evidencia um efeito seletivo da
irrigação com efluente sobre as populações de desnitrificantes, contudo, sem alterar a
sua densidade.
A avaliação do impacto da irrigação com efluente de esgoto sobre a comunidade
de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) foi pouco estudada (ORTEGA-LARROCEA
et al., 2001; ORTEGA-LARROCEA et al., 2007), sendo praticamente restrita aos
trabalhos desenvolvidos no Vale do Mezquital, no México. Esta região recebe o efluente
da Cidade do México por mais de 100 anos, sendo utilizada para a produção agrícola
(SIEBE, 1998).
No ano de 2001, Ortega-Larrocea et al. investigaram o efeito da disposição do
efluente da Cidade do México por longos períodos, mais de 90 anos e com pouco
tempo de irrigação, 5 anos, sobre as populações de FMAs em dois tipos de solos
diferentes. Os autores constaram que o acúmulo de fósforo e de metais pesados,
principalmente nos solos irrigados por longos períodos, contribuiu para a diminuição no
número de esporos recuperados do solo.
Aprofundando os estudos sobre o impacto da irrigação com efluente sobre os
FMAs, Ortega-Larrocea et al. (2007) verificaram que o tempo de irrigação com efluente
promoveu uma pressão de seleção nas espécies, com a predominância do gênero
Glomus nas áreas com maior tempo de irrigação. Os autores sugeriram que a irrigação
31
com efluente por longos períodos tende a reduzir a diversidade de espécies e a
abundância de esporos de FMAs.
Outro enfoque interessante é a avaliação do efeito do uso de efluente de esgoto
em áreas agrícolas sobre a diversidade genética dos microrganismos. A avaliação de
comunidades microbianas que respondem a estresses externos, utilizando iniciadores
de seqüências de grupos específicos, como aqueles menos abundantes da microbiota
do solo, que provavelmente exercem uma função ecológica chave na manutenção da
fertilidade, possibilita explorar melhor a complexidade da comunidade (NAKATSU et al.,
2000).
O impacto da irrigação com efluente de esgoto tratado em pomar de citros sobre
a composição do grupo específico das bactérias oxidantes de amônio, foi avaliado por
Oved et al. (2001), por meio da amplificação de fragmentos específicos do DNA
presente no solo através de reação em cadeia da polimerase (PCR) e posteriormente,
avaliando o produto da reação através de eletroforese em gel com gradiente
desnaturante (DGGE). Os autores constataram uma mudança consistente e significante
na composição das populações de bactérias oxidantes de amônio, sendo dominante o
gênero Nitrosomonas no solo irrigado com efluente, enquanto no solo não irrigado o
predomínio foi do gênero Nitrosospira.
Mudanças marcantes na estrutura da comunidade bacteriana total foram
observadas em área agrícola constantemente alagada com efluente, com redução da
diversidade genética na comunidade de bactérias oxidantes de amônio, avaliada por
análise de restrição (GELSOMINO et al., 2006).
Apesar de ser conhecida a capacidade dos grupos de microrganismos em
metabolizar os diversos compostos orgânicos e de suprimir patógenos presentes nos
efluentes (IBEKWE et al., 2003), estudos avaliando o impacto da disposição de
efluentes sobre os grupos funcionais de microrganismos e sua diversidade metabólica
em solos tropicais se fazem necessários para a avaliação da viabilidade desta prática.
32
2.3 Objetivos
Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito de lâminas excedentes de
irrigação do capim Tifton 85 com efluente de esgoto tratado, por um período de um ano
e meio sobre a comunidade microbiana e alguns atributos químicos e microbiológicos
do solo.
2.3.1 Objetivos específicos
a) Avaliar o efeito das lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto
tratado sobre a densidade de grupos funcionais de microrganismos, fungos micorrízicos
arbusculares, atributos microbiológicos e químicos do solo.
b) Verificar a participação dos atributos microbiológicos e químicos do solo na
variabilidade dos grupos funcionais de microrganismos, em função das lâminas
excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado.
c) Avaliar o efeito da irrigação de pastagem de capim Tifton 85 com efluente de
esgoto tratado sobre a densidade de grupos funcionais de microrganismos,
comparando com área de pastagem não irrigada e não manejada, verificando também a
a participação dos atributos microbiológicos e químicos na variabilidade dos grupos
funcionais de microrganismos.
d) Avaliar o efeito da irrigação de pastagem de capim-Bermuda (Tifton 85) com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses sobre o padrão de
consumo de substratos da comunidade microbiana do solo, avaliando a diversidade e a
cinética de consumo de substrato.
e) Avaliar o efeito da irrigação de pastagem de capim-Bermuda (Tifton 85) com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses sobre a estrutura das
populações de bactérias oxidantes de amônio.
33
2.4 Material e Métodos
2.4.1 Descrição da área de estudo
O estudo foi realizado no município de Lins, no Estado de São Paulo. O
experimento foi instalado em dezembro de 2005 (Figura 1a), no Campo Experimental
de Lins-SP, ao lado da estação de tratamento de esgoto (ETE) operada pela Sabesp
(Figura 1b) (Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo).
Figura 1 - Campo experimental (a) e estação de tratamento de esgoto (b) operada pela Sabesp, no
município de Lins, SP
O solo, classificado como Argissolo Vermelho distrófico latossólico de textura
média-argilosa e caracterizado por uma baixa fertilidade natural (Tabela 1), é cultivado
com capim-Bermuda Tifton 85 (Cynodon dactylon Pers. X C. niemfuensis Vanderyst) e
anteriormente encontrava-se em pousio. O plantio do capim foi realizado 3 anos antes
da instalação do experimento, em janeiro de 2002, quatro meses após a aplicação de
aproximadamente 2,0 t ha
-1
de calcário dolomítico (contendo 30,8% de CaO e 19,8% de
MgO), visando a elevação da saturação de bases para 60% na camada de 0-20 cm.
Após o plantio não foi realizada correção de acidez, bem como fertilização do solo até o
b)
ETE Sabesp (Lins)
a)
Área
Experimental
34
momento da instalação do experimento, mesmo tendo ocorrido dois cortes anuais do
capim.
Tabela 1- Características químicas e físicas do solo por ocasião da instalação doexperimento. Média de
16 amostras
pH
(1)
H + Al Al Ca Mg K Na CTC
(3)
V
(4)
--------------------------------- mmol
c
Kg
-
1
--------------------------------- %
4,90 15,17 1,00 10,26 5,61 1,45 ND
(2)
32,49 53,31
P CT
(5)
NT
(6)
Areia Silte
Argila
Classe text.
(9)
AT
(7)
ADA
(8)
mg Kg
-
1
------------------------------g Kg
-
1
--------------------------------
6,23 5,97 0,46 740 60 200 21 MAre
(1)
pH em solução de CaCl
2
0,01 mol L
-1
;
(2)
ND: elemento químico não detectado;
(3)
CTC: capacidade de troca catiônica a pH 7,0,
Na
K
Mg
Ca
Al
H
CTC
+
+
+
+
+
=
;
(4)
V: saturação por bases, 100*
CTC
NaKMgCa
V
+
+
+
= ;
(5)
CT: carbono total;
(6)
NT: nitrogênio total.
(7)
AT: concentração total de argila;
(8)
ADA: concentração de argila dispersa em água;
(9)
Classe text.: classe textural (MAre: textura média-arenosa).
O clima da região caracteriza-se como mesotérmico de inverno seco, com
temperaturas médias variando de 18 a 26°C e uma precipitação anual entre 1100 a
1300 mm (CIIAGRO, 2007) (Figura 1).
Figura 2 - Precipitação mensal (mm) e temperatura média (Tmédia), mínima (Tmín) e máxima (Tmáx)
mensal (°C) do município de Lins, SP, no período de dezembro de 2005 a julho de 2007
0
5
10
15
20
25
30
35
0
100
200
300
400
500
600
D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J
meses (2005-2007)
chuva Tmédia Tmín Tmáx
Precipitação (mm)
Temperatura (°C)
35
2.4.2 Condução do experimento
Os tratamentos constituíram-se em lâminas excedentes em relação a uma lâmina
controle de irrigação com efluente de esgoto tratado, baseando-se na capacidade de
água disponível para a cultura. A lâmina controle, também denominada 0% de excesso,
foi considerada como a quantidade de efluente adequada para suprir a demanda hídrica
do capim Tifton 85, admitida como a quantidade suficiente para manter a tensão de
água no solo em 20 kPa (valor admitido como sendo capacidade de campo para solo de
textura média).
As demais lâminas foram calculadas a partir da quantidade de efluente aplicado
na lâmina controle, de forma a corresponder a 25, 50 e 100% de excesso de irrigação
em relação à lâmina controle, a fim de avaliar a capacidade máxima de suporte de
efluente pelo sistema solo-planta.
Dispostos em um delineamento experimental em faixas, as quais foram
separadas por curvas de nível, os quatro tratamentos: controle (0% de excesso), 25, 50
e 100% de excesso de irrigação com efluente, foram repetidos quatro vezes. Cada
parcela, com o tamanho de 7,0 x 12,0 m, totalizou uma área de 84 m
2
, sendo delimitada
uma bordadura de 1 m de cada lado da parcela, o que reduziu a área útil para 50 m
2
,
em cada unidade experimental.
Para a aplicação das lâminas foi utilizado o sistema de irrigação por aspersão
convencional (Figura 3). O manejo da irrigação foi realizado com base na umidade
crítica do solo na camada 0 a 60 cm. O potencial mátrico (
ψ
m
) foi monitorado a cada
dois dias, a partir de leituras de tensiômetros instalados no meio das camadas 0-20, 20-
40 e 40-60 cm, nas parcelas do tratamento controle. A capacidade de água disponível
(CAD) para o capim-Bermuda Tifton 85 foi estimada no tratamento controle (0% de
excesso) para a camada de 0-60 cm, a partir da diferença entre a umidade volumétrica
em
ψ
m
-20 kPa e
ψ
m
-1500 kPa. O início da irrigação ocorria sempre que a umidade
volumétrica do solo correspondia a 70% da CAD no tratamento controle.
36
Figura 3 - Detalhe do sistema de irrigação por aspersão do capim Tifton 85, para a aplicação das lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado
O efluente utilizado era originário da estação de tratamento de esgoto doméstico
operada pela Sabesp, localizada adjacente ao experimento. O sistema de tratamento
empregado é o de lagoas de estabilização, passando por lagoas anaeróbia e
facultativa, com tempo de retenção hidráulica de aproximadamente 5 e 15 dias,
respectivamente, em que são produzidos em média 500 m
3
h
-1
de efluente.
O capim foi cortado bimestralmente, durante o período de avaliação, a uma altura
de aproximadamente 5,0 cm, com roçadora costal mecanizada e o material vegetal
retirado manualmente da parcela. Partindo-se dos estudos anteriores de fertilização
mineral e irrigação com efluente de esgoto tratado em capim-Bermuda Tifton 85
(FONSECA, 2005), tem-se que apenas 50% da dose de fertilizante nitrogenado mineral
sugerida por Werner et al. (1996) seria o suficiente para obtenção de alta produtividade
(acima de 30 t ha
-1
ano
-1
de massa de matéria seca) de capim em áreas irrigadas com
efluente. Considerando um sistema de produção de forragem para fenação (WERNER
et al., 1996), foram aplicados fertilizante mineral fosfatado (superfosfato simples), à taxa
de 100 kg ha
-1
, a cada 6 meses; 50 kg ha
-1
de fertilizante mineral nitrogenado (nitrato de
amônio) e 80 kg ha
-1
de fertilizante mineral potássico (cloreto de potássio), aplicados
imediatamente após cada corte do capim (PREMAZZI et al., 2003).
37
2.4.3 Amostragens e análises de efluente e solo
Amostras de efluente foram coletadas mensalmente durante o período
experimental, junto à saída da tubulação do sistema de irrigação, para caracterização
(Tabela 2) e monitoramento das adições de carbono e nitrogênio via efluente. As
amostras coletadas foram acondicionadas em caixas térmicas com gelo e
encaminhadas para o laboratório do Núcleo de Pesquisa em Geoquímica e Geofísica
da Litosfera da USP (NUPEGEL/USP) onde foram preparadas para as determinações
analíticas, segundo metodologia da APHA – AWWA (1999).
Tabela 2 - Características do efluente de esgoto tratado utilizado para irrigação e valores de orientação
para irrigação agrícola de acordo com WHO (2006)
Unidade EET Graus de restrição de uso
(1)
Características baixo
baixo a
moderado
Severo
SST
(2)
mg L
-
1
127,8 ± 20,4 <50 50-100 >100
Salinidade
CE
(3)
dS m
-
1
0,85 ± 0,1 < 0,7 0,7 – 3,0 > 3,0
SDT
(4)
mg L
-
1
691 ± 70 < 450 450-2000 > 2000
Infiltração
CE
RAS
(5,6)
de
6-12 (mmol L
-
1
)
0,5
11,9 ± 2,9 > 1,9 1,9 – 0,5 < 0,5
Toxicidade
Na
+
mg L
-
1
131,7 ± 6,6 < 69 > 69
Cl
-
mg L
-
1
63,4 ± 7,9 < 106 > 106
B
(6)
mg L
-
1
0,17 ± 0,08 < 0,7 0,7 – 3,0 > 3,0
N-NO
3
-
mg L
-
1
0,30 ± 0,43 < 5 5 - 30 > 30
HCO
3
-
mg L
-
1
449,0 ± 79,1 < 92 92 - 519 > 519
pH 7,5 Intervalo normal 6,5 – 8,0
Demais elementos
Valores limites
P-H
2
PO
4
-
mg L
-
1
4,3 + 1,1
N-NH
4
+
mg L
-
1
23 + 3,5
Ca mg L
-
1
8,1 + 1,1
Mg mg L
-
1
1,9 + 0,5
K mg L
-
1
17 + 1,8
Al mg L
-
1
0,03 ± 0,02 5,0
Cd
(7)
mg L
-
1
Nd 0,01
Cr
(7)
mg L
-
1
Nd 0,1
Cu mg L
-
1
0,002 ± 0,001 0,2
F mg L
-
1
0,48 ± 0,32 1,0
Fe mg L
-
1
0,08 ± 0,06 5,0
Mn mg L
-
1
0,015 ± 0,006 0,2
Ni
(7)
mg L
-
1
Nd 0,2
Zn mg L
-
1
0,02 2,0
(1)
AYERS; WESTCOT (1985);
(2)
Sólidos suspensos totais;
(3)
Condutividade elétrica;
(4)
Sólidos dissolvidos totais
(GLOAGUEN et al, 2006);
(5)
Razão de adsorção de sódio;
(6)
FONSECA (2005),
(7)
Concentração abaixo do limite de
detecção
38
Amostras de solo foram coletadas ao acaso na profundidade de 0-10 cm, com a
coleta de 6 subamostras simples para compor uma amostra composta. Na instalação do
experimento, em dezembro de 2005, foi realizada uma coleta de amostras para
avaliação da área antes de iniciar a aplicação e, utilizada também para a análise do
efeito da irrigação ao longo do tempo, para cada tratamento, denominada de coleta de
referência.
As coletas seguintes foram organizadas de forma a acompanhar o efeito da
irrigação do efluente no início e no final das estações chuvosa (novembro a abril) e seca
(maio a outubro). Dessa forma, as coletas, a partir da coleta de referência, ocorreram
com 3 meses (março/2006), 7 meses (julho/2006), 9 meses (setembro/2006), 12 meses
(dezembro/2006), 13 meses (janeiro/2007), 15 meses (abril/2007) e 18 meses
(julho/2007), totalizando 8 tempos de avaliação.
Para comparação do efeito do efluente sobre as propriedades microbiológicas do
solo, foi selecionada uma área de pastagem de capim Tifton 85, não irrigada e não
manejada, próxima a área experimental, denominada ‘não irrigada com efluente (NE)’.
Foram coletadas amostras nessa área aos 7, 12, 13, 15 e 18 meses de condução do
experimento.
Após coletadas, as amostras foram colocadas em caixas de isopor com gelo, até
a chegada ao Laboratório de Microbiologia do Solo, do Departamento de Ciência do
Solo, da ESALQ/USP, em Piracicaba, SP. No laboratório, as amostras foram
peneiradas em peneira de 2 mm, para então proceder as avaliações microbiológicas e
químicas do solo.
Para a caracterização química, uma parte das amostras acima citada foi seca e
peneirada para se obter terra fina seca ao ar (TFSA), conforme metodologia proposta
por Raij et al. (2001). Posteriormente foram determinados: acidez ativa, por pH em
solução de cloreto de cálcio 0,02 M; Ca
2+
e Mg
2+
trocáveis, por extratos de TFSA em
solução de cloreto de potássio 1 M, quantificados por espetrofotometria de absorção
atômica; Na
+
, K
+
e P disponível por extratos de TFSA em solução Mehlich 1 (HCl 0,05
M + H
2
SO
4
0,025 M), sendo o Na
+
e K
+
quantificados em fotômetro de chama e o P por
colorimetria, utilizando solução de molibdato de sódio; CT e NT, por combustão à seco.
39
Para avaliação da atividade microbiana foram realizadas as seguintes análises: a
biomassa microbiana, estimada pelo método da fumigação-extração (VANCE et al.,
1987), que apresenta como princípio básico a extração do carbono microbiano após a
morte dos microrganismos e lise celular pelo ataque do clorofórmio e liberação dos
constituintes celulares, os quais são degradados por autólise enzimática e
transformados em componentes orgânicos extraíveis, expresso em µg g
-1
s.s. (solo
seco) (JOERGENSEN, 1995). A partir dos resultados de carbono microbiano e carbono
total, foi estimada a relação entre o carbono microbiano e o carbono total do solo,
denominada quociente microbiano, ou qMIC.
O quociente metabólico (qCO
2
), expresso em mg C-CO
2
g
-1
CBM h
-1
,
foi obtido
pela relação entre a quantidade de carbono liberada na respiração basal e a quantidade
de carbono quantificada na biomassa microbiana. O ensaio de respirometria foi
executado pela estimativa do CO
2
liberado durante a incubação do solo, expresso em
mg C-CO
2
kg
-1
h
-1
, conforme metodologia descrita por Anderson (1982). Para a análise
se respiração induzida por substrato (RIS), foi adicionado 0,05% de glicose (p/p) ao
solo, nos mesmos frascos onde foi avaliada a respiração basal. Após a adição de
glicose, foram feitas leituras diárias, por 7 dias. Os resultados foram expressos em mg
C-CO
2
kg
-1
h
-1
,conforme metodologia descrita por Anderson e Domsch (1978). Para
todos esses parâmetros, a umidade do solo foi corrigida para 60% do volume total de
poros (VTP).
A densidade de grupos funcionais de microrganismos (bactérias totais, fungos
totais, amonificantes, nitrificantes, desnitrificantes) foi avaliada pela técnica do número
mais provável (NMP). As amostras de solo foram suspensas em solução salina (NaCl
0,55%) esterilizada e, então, diluídas para 0,1 g mL
-1
. A seguir, foram feitas diluições
sucessivas na magnitude de 10 vezes para se obter concentrações de 10
-2
a 10
-9
g de
solo mL
-1
de cada amostra. A partir das diluições foram inoculadas alíquotas de 100 µL
em meio de cultivo para amonificantes (SARATHCHANDRA, 1978), nitrificantes (SAAD;
CONRAD, 1993) e desnitrificantes (TIEDJE, 1982), com 4 repetições. O meio de cultivo
utilizado para bactérias totais foi o ágar-nutriente e o meio de MARTIN (1950) para
40
fungos totais, pelo método do plaqueamento por gotas, com 5 repetições (JAHNEL et
al., 1999).
Após doze meses de aplicação das lâminas de efluente foi avaliada a
abundância de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e a colonização micorrízica do
capim Tifton 85. A ocorrência de FMAs foi analisada por contagem de esporos,
conforme método descrito por Gerdemann e Nicolson (1963). Para a avaliação da
porcentagem de colonização micorrízica, foram coletadas raízes até a profundidade de
10 cm. Depois de lavadas, aproximadamente 1g de raízes frescas, separadas de vários
pontos, foram coloridas, segundo Phillips e Haymann (1970) e avaliada a porcentagem
de colonização micorrízica, de acordo com Giovannetti e Mosse (1980).
Para a avaliação do perfil de consumo de fontes de carbono, de microrganismos
foi utilizado o kit Ecoplate
®
da empresa BIOLOG (Biolog, Hayward, CA, USA), para a
coleta realizada aos 18 meses de aplicação de efluente. Cada placa continha 31 fontes
de carbono, em triplicata, totalizando 96 poços por placa e um controle sem fonte de
carbono. Previamente à inoculação, a concentração do inóculo foi estimada com a
determinação do número mais provável de bactérias totais, em meio ágar-nutriente,
incubado por 48 horas, a 25° C.
Uma alíquota de 120 µL de suspensão do solo diluída correspondente a uma
concentração em torno de 10
3
células mL
-1
foi injetada em cada um dos 96 poços, com
o auxílio de uma pipeta multicanal. As placas foram incubadas a 28°C e analisadas com
12h e depois dessa leitura, a cada 24 horas, por 7 dias, medindo-se a absorbância a
590ηm, usando um leitor de placas automático (Model 550, Biorad Laboratories,
Hercules, CA, USA). A densidade ótica foi corrigida pelo branco para cada leitura e, em
seguida, corrigido para a primeira leitura feita logo após a inoculação das placas.
As fontes de carbono presentes nas placas Ecoplate
®
podem ser agrupadas em
função do grupo químico, como: aminas (feniletilamina e putrescina), aminoácidos (L-
arginina, L-asparagina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina e ácido glicil-L-glutâmico),
carboidratos (D-celobiose, α-D-lactose, β-metil-D-glucosídeo, D-xilose, i-eritritol, D-
manitol e N-acetil-D-glucosamina), ácidos carboxílicos (ácido D-galacturônico γ-
Lactona, ácido D-galacturônico, ácido 2-hidroxibenzóico, ácido 4-hidroxibenzóico, ácido
41
γ-hidroxibutírico, ácido itacônico, ácido α−cetobutírico, ácido D-málico e ácido D-
glicosamínico), polímeros (tween 40, tween 80, α-ciclodextrina e glicogênio) e
miscelânea de compostos (ácido pirúvico, glicose1-fosfato e D,L α−glicerolfosfato).
A diversidade genética de bactérias oxidantes de amônio também foi analisada
em amostras de solo coletadas em julho de 2007, após 18 meses de aplicação de
efluente, no Laboratório de Microbiologia Ambiental, na Universidade da Califórnia, em
Riverside, Estados Unidos. Para a extração do DNA do solo foi utilizado o kit FastDNA
SPIN kit for soil (QBIOgene, BIO 101 systems). O DNA extraído foi quantificado com o
auxílio do aparelho Nanodrop (ND-1000 Spectrophotometer).
A partir do DNA extraído do solo, uma região de aproximadamente 500 pares de
bases do gene amoA, que codifica a subunidade α da enzima amônia monooxigenase,
relacionado com as bactérias oxidantes de amônio, foram amplificados utilizando-se os
iniciadores: amoAf-i (Clamp-GGGGITTITACTGGTGGT) e amoAr-f
(CCCCTCIGIAAAICCTTCTTC), descritos em Hornek et al. (2006).
A reação de amplificação foi conduzida num volume final de 50 µL, contendo 1
µL de DNA molde, 2 mM de MgCl
2
, 0,5 µM dos primers, 0,25 mM do mix de dNTP,
0,05M da solução tampão Tris-KCl (pH 8,3), 0,12 mg L
-1
de BSA, e 1 U de TaqDNA
polimerase. O perfil térmico para a amplificação foi de 95° C por 5 minutos, 35 ciclos de
94°C por 30 segundos; 47°C por 40 segundos; 72°C por 40 segundos; finalizando com
72°C por 2 minutos (HORNEK et al., 2006). Confirmação da eficiência da reação com a
visualização do produto em gel de agarose 1%, após eletroforese de 25 minutos, a
100V, após coloração do gel com brometo de etídio, na concentração de 0,5 µg/mL,
visualização após a exposição do gel a transiluminação com ultra-violeta (UV).
Os produtos de amplificação foram posteriormente separados por eletroforese
em gel com gradiente desnaturante (DGGE). O gel foi confeccionado na concentração
de 8% de poliacrilamida (37:1 acrilamida: bis,acrilamida em tampão TAE 0,5X). O
gradiente de desnaturação foi de 45-60%, utilizando-se as soluções desnaturantes de 7
M de uréia e 40% de formamida. Após confeccionado, foi realizada a aplicação dos
produtos das reações de amplificação e a eletroforese do gel foi conduzida por 14
horas, a 50V, na temperatura de 60°C, em tampão TAE 1X.
42
Para visualização das bandas, o gel foi corado em solução de brometo de etídio,
na mesma concentração descrita previamente, por 10 minutos e, visualização após a
exposição do gel a transiluminação com UV. A partir do resultado obtido, foi
selecionada uma amostra de cada tratamento, para nova amplificação e posterior
seleção de bandas para seqüenciamento.
As amostras selecionadas (amostras números: 2, 8, 11 e 15, dos tratamentos 0,
25, 50 e 100% de excesso, respectivamente) foram novamente amplificadas, utilizando
os mesmos iniciadores, contudo, o iniciador amoAf-i foi utilizado sem o grampo
necessário apenas para a análise de DGGE. Esses produtos de amplificação foram
novamente conduzidos a análise de DGGE, conforme descrito anteriormente. Do gel de
DGGE resultante, foram cortadas 6 bandas.
Para a excisão das bandas, foi utilizada uma pipeta específica para essa
atividade. O material foi disposto em microtubos de 1,5 mL, contendo 10 microlitros de
água nanopura. Os fragmentos de DNA das bandas selecionadas foram utilizados para
a condução de nova reação de amplificação, utilizando os mesmos primers sem o
grampo necessário para a análise de DGGE. O produto da reação de amplificação foi
visualizado após eletroforese em gel de agarose 1% por 25 minutos, a 100V, corando-
se o gel em brometo de etídio por 10 minutos e expondo a transiluminação com UV.
Após confirmação da eficiência da reação de amplificação das bandas, o produto
da reação foi então purificado, utilizando-se o kit de purificação do produto de PCR
(QIAquick, QIAGEN Science, Inc.). O produto purificado foi encaminhado para para
seqüenciamento, no centro de genômica (Genomic Core), da Universidade da
California, em Riverside, Estados Unidos.
As seqüências obtidas foram analisadas utilizando-se o programa Phred/Phrap
(EWING; GREEN, 1998), para a remoção das extremidades de baixa qualidade.
Posteriormente, as seqüências foram alinhadas, usando o programa ClustalW e
construídas as árvores de similaridade, após seleção de seqüências disponíveis no
banco de dados do GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/genbank), utilizando os métodos
“Neighbor-joining”, “Minimum evolution” e “Maximum parsimony”, com o auxílio do
programa Mega 3.1 (método UPGMA, p-distance), com as configurações padrões do
programa e 1000 amostras bootstrap.
43
2.4.4 Análise estatística dos dados
2.4.4.1 Efeito de lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado
na pastagem de capim Tifton 85 sobre os atributos químicos e microbiológicos do
solo
Os resultados foram submetidos à análise estatística univariada, aplicando o
procedimento ‘general linear model’, considerando como fontes de variação a lâmina de
irrigação acumulada e a precipitação acumulada no período de 18 meses de avaliação,
utilizando o programa SAS Versão 7.1 (SAS Institute Inc., 2002). Também foi conduzida
a análise de correlação simples (correlação de Pearson) entre as variáveis analisadas.
As parcelas foram fixadas como classificatórias, com a finalidade de isolar para o
estudo apenas as alterações observadas pela medição repetida em cada parcela,
devidas às condições ambientais ou provocadas pela irrigação. Para os resultados
apresentados, não houve interação significativa entre as parcelas e as fontes de
variação.
Para testar a existência de relações significativas entre os atributos
microbiológicos e químicos do solo, em função das lâminas de irrigação aplicadas
durante os 18 meses, foram utilizadas análises estatísticas multivariadas. A análise
multivariada é uma ferramenta útil para a análise de muitas variáveis, pois possibilita
analisar vários atributos ao mesmo tempo (MALUCHE-BARETTA; AMARANTE;
KLAUBERG-FILHO, 2006; BARETTA, 2007).
Foi realizada uma análise de redundância (RDA), utilizando os dados de 8
tempos de aplicação de efluente (com 3, 7, 9, 12, 13, 15 e 18 meses de irrigação). Esta
análise é compreendida como um método de ordenação condicionada ou canônica,
baseada na distribuição normal, no qual as variáveis explicativas ou ambientais
(atributos químicos e microbiológicos) condicionam a resposta das variáveis a serem
analisadas. Dessa forma, os eixos da ordenação condicionada correspondem às
direções da maior variabilidade explicada pelas variáveis ambientais (LEPŠ;
ŠMILAUER, 2003). Nesta análise, as variáveis foram transformadas [Log (x+1)] e foi
empregado o método de seleção das variáveis ambientais (Forward Selection), o qual
44
permite selecionar e introduzir no modelo somente as variáveis que foram significativas
(P < 0,05) e que mais contribuíram para a variabilidade dos grupos funcionais.
Posteriormente, foram conduzidas novas RDAs, com o objetivo de efetuar a
partição da variabilidade. Os atributos químicos e microbiológicos do solo foram
utilizados como variáveis ambientais e a densidade de grupos funcionais de
microrganismos como variáveis resposta, para determinar o quanto da variabilidade
total dos dados eram explicados pelas variáveis ambientais. Posteriormente, análises
de redundância adicionais foram realizadas para determinar a participação individual
dos atributos químicos e dos microbiológicos na variabilidade total, bem como a parte
da variabilidade que é influenciada por ambos os atributos.
Para testar a hipótese de que as lâminas excedentes à lâmina controle para o
capim-Bermuda Tifton 85 promovem alterações significativas na densidade de grupos
funcionais de microrganismos do solo ligados ao ciclo do nitrogênio, foi empregada a
análise de curva de resposta principal (principal response curve, PRC), para 8 tempos
de avaliação dos tratamentos 0, 25, 50 e 100% de excesso de irrigação com efluente de
esgoto tratado (com 0, 3, 7, 9,12, 13, 15 e 18 meses de irrigação), utilizando o software
CANOCO 4.5 (ter BRAAK, 1988), desenvolvido pela empresa Microcomputer Power
(Ithaca, NY, USA).
A PRC (Van den BRINK; Ter BRAAK, 1999) é um método de ordenação
conhecido como análise de redundância parcial (pRDA), indicada para avaliar o efeito
de um determinado fator sobre uma comunidade ao longo do tempo. Este método
possibilita resumir os efeitos de cada tratamento em relação ao controle sobre os
grupos funcionais de microrganismos e exibi-los em um único diagrama. A PRC extrai
informação de apenas parte da variância que é explicada pelo fator empregado como
tratamento (as lâminas de irrigação com efluente) e o tempo (épocas de amostragem do
solo), que é utilizado como co-variável (LEPŠ; ŠMILAUER, 2003). Na PRC, o tempo é
disposto no eixo X e o coeficiente canônico, também denominado como coeficiente
canônico padronizado, relativo ao tratamento controle (0% de excesso), no eixo Y. Os
coeficientes canônicos dos demais tratamentos são apresentados como desvios em
relação ao tratamento controle, para cada tempo avaliado.
45
Junto ao gráfico da PRC é apresentado um diagrama, no qual estão plotados os
pesos (valores positivos ou negativos) dos grupos funcionais de microrganismos
avaliados. O peso dos grupos funcionais pode ser interpretado como o peso de cada
grupo funcional único para a resposta dos tratamentos observada na PRC. No presente
trabalho, o maior valor de peso para um determinado grupo funcional de microrganismo
indica uma maior contribuição desse grupo para a variação das lâminas de irrigação na
PRC. Complementarmente, é fornecida uma estatística, que corresponde a uma medida
da qualidade do ajuste e do poder explicativo da RDA. São obtidos uma razão F e um
valor P de significância, determinados por meio do teste de permutação de Monte Carlo
e um teste F (LEPŠ; ŠMILAUER, 2003).
2.4.4.2 Efeito da irrigação com efluente na pastagem de Tifton 85 sobre os
atributos microbiológicos comparado com área de pastagem não-irrigada
O efeito da irrigação com efluente de esgoto tratado sobre os grupos funcionais
de microrganismos foi avaliado comparando-se com área de pastagem não irrigada.
Para este estudo, foram coletadas amostras da pastagem não irrigada junto com as
coletas realizadas aos 7, 12, 13, 15 e 18 meses de aplicação de efluente nas áreas
irrigadas.
Para testar a existência de relações significativas entre os atributos
microbiológicos e químicos do solo com a resposta dos grupos funcionais de
microrganismos aos tratamentos, foi realizada uma RDA utilizando os dados de 5
coletas, as quais foram coletadas amostras nas áreas não irrigadas com efluente (com
7, 12, 13, 15 e 18 meses de irrigação). Esta análise foi conduzida conforme descrito no
item 2.4.4.1.
46
2.4.4.3 Perfil do consumo de fontes de carbono pela comunidade microbiana de
uma área de pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas excedentes de
efluente de esgoto tratado
As leituras de absorbância obtidas das placas Ecoplate, conforme descrito no
item 2.4.3, avaliadas durante os 7 dias, foram corrigidas para a absorbância medida no
tempo zero, e em seguida, corrigidas também para a leitura dos poços com ausência de
fonte de carbono.
Com os dados corrigidos foi calculada a média do desenvolvimento de cor dos
poços (average well color development, AWCD): (L – B)/[ ∑(L – B)/31}, sendo L – a
leitura das fontes de carbono, B – leitura do branco, contendo apenas a suspensão de
solo (GARLAND; MILLS, 1991). O AWCD foi calculado para cada fonte de carbono em
cada placa.
A parir do AWCD foram avaliados dois parâmetros: o padrão de consumo de
fontes de carbono e o estudo da cinética de consumo de fontes de carbono.
No estudo da cinética de consumo de fontes de carbono foi empregado o modelo
de crescimento logístico (LINDSTRÖM; BARRY; BRADDOCK, 1998), no qual foram
estimados os parâmetros cinéticos, em função do ajuste da curva de absorbância a 590
ηm em relação ao tempo de incubação das placas:
DO
590 ηm
= K/( 1 + e
-
R(T
-
S)
),
(1)
sendo ‘K’ a assíntota ou o máximo desenvolvimento de cor (A
590 ηm
), ‘R’ a taxa
exponencial de mudança de A
590 ηm
(h
-1
) , ‘T’ o tempo de incubação (h) e ‘S’ o tempo
para alcançar o ponto central da fase exponencial da curva, quando se tem K/2 (h).
Cada um destes parâmetros fornece informações sobre o consumo das fontes de
carbono, onde o ‘K’ estima a quantidade potencial de substrato utilizado, o ‘R’
representa a taxa exponencial de consumo de substrato, que indica a rapidez com que
a fonte de carbono é consumida pela comunidade e o ‘S’ é a taxa de crescimento
relativo dos microrganismos capazes de consumir as fontes de carbono e está
relacionado com a densidade inicial de inóculo (ROS et al., 2006).
Os parâmetros cinéticos estimados gerados a partir da aplicação dos dados no
modelo logístico, para o metabolismo heterotrófico médio e para os grupos de
47
substratos, o índice de diversidade de Shannon (H) e a riqueza de substratos foram
submetidos à análise de variância, e as médias foram comparadas pelo teste LSD (P <
0,05). Estes parâmetros também foram correlacionados com os atributos químicos do
solo e com os conteúdos das frações de C e N particuladas e dissolvidas, adicionadas
ao solo via efluente, utilizando-se a análise de correlação de Pearson, com o auxílio do
programa SAS 7.1 (SAS Institute Inc. 2002).
A análise em escala multidimencional (Non-metric Multidimensional Scaling –
NMDS) foi utilizada na ordenação das amostras, baseadas na similaridade entre as
mesmas. Os parâmetros cinéticos estimados foram transformados [Log (x+1)] e
utilizados no cálculo da “Distância Euclidiana normalizada”, a partir da qual foi
elaborada a matriz de similaridade. Posteriormente, uma análise de similaridade
(ANOSIM) foi aplicada para verificar a existência de diferenças significativas entre os
tratamentos, com o auxílio do programa Primer 5 (Primer-E Ltda., 2001).
48
3 Resultados
3.1 Precipitação e irrigação com efluente
No período de dezembro de 2005 a julho de 2007 a quantidade de irrigação
acumulada variou de 1254,23 a 2296,60 mm, na menor e maior lâmina de irrigação
respectivamente e, a precipitação acumulada no mesmo período foi de 2422,45 mm. A
precipitação ocorreu de acordo com o esperado para a região de Lins, SP, com chuvas
concentradas nos meses de outubro a março e estiagem de abril a setembro (Figura 2).
Os maiores volumes de efluente foram aplicados nos períodos de novembro de
2006 a janeiro de 2007 (Figura 4), período que concentra as maiores temperaturas
médias, o que colabora com o crescimento e com o aumento da evapotranspiração do
capim Tifton 85. Nos meses de maio a agosto, nos quais são observadas as menores
temperaturas médias do ano (Figura 2), a taxa de crescimento do capim Tifton 85 é
menor (NOGUEIRA, 2008), bem como sua evapotranspiração, exigindo menores
volumes de água.
49
Figura 4 - Precipitação (p) e lâminas excedentes de irrigação com efluente, aplicadas na área de
pastagem de capim Tifton 85 (0, 25, 50 e 100% de excesso) por 18 meses, no período de
dezembro (D) de 2005 a julho de 2007 (J), em Lins, SP
Nos últimos meses de avaliação da área experimental, a aplicação das lâminas
de efluente foi afetada por fatores de ordem operacional. A irrigação da área
experimental foi interrompida durante o período de 29 de janeiro a 20 de fevereiro de
2007, totalizando 23 dias. Neste período os equipamentos de irrigação permaneceram
parados para manutenção, devido a um dano causado pelo excesso de sobrenadante
na lagoa de captação do efluente. Na primeira semana de março de 2007 a irrigação foi
novamente interrompida durante 7 dias, devido ao baixo nível de efluente na lagoa de
captação. Possivelmente estes fatos interferiram nos resultados observados, para as
avaliações realizadas aos 15 e aos 18 meses de condução do experimento.
0
150
300
450
600
J F M A M J J A S O N D J F M A M J
Período experimental 2005-2007 (meses)
P 0 25 50 100
Quantidade de água (mm)
50
3.2 Adição de carbono e nitrogênio via efluente
A aplicação de efluente proporcionou a adição de material orgânico, que variou
de 78,4 kg ha
-1
para a menor lâmina e 144,1 kg ha
-1
para a maior (Tabela 3). Deste
material orgânico, 35% correspondem ao carbono (carbono particulado total, CPT) e
6,6% ao nitrogênio (nitrogênio particulado total, NPT). A fase particulada dos efluentes
de lagoas de estabilização é composta principalmente por algas (SNOW et al., 1999;
VON SPERLING, 2002), que possui uma baixa relação C:N (Carbono:Nitrogênio).
Tabela 3 - Caracterização do efluente quanto aos conteúdos de frações particuladas e dissolvidas de C e
N; quantidade adicionada pela aplicação das lâminas de irrigação com efluente (0, 25, 50 e
100% de excesso de irrigação) ao solo destas frações no período de janeiro de 2006 a julho
de 2007, de N via fertilizante, carbono orgânico, N total e relação C:N
Irrig.
SST
(1)
CPT
(2)
NPT
(3)
CID
(4)
COD
(5)
NO
2
+
NO
3
-
NH
4
+
COT
(6)
NT
(7)
COT:N
T
(8)
mg L
-
1
Efluente
128 44,9 8,5 88,3 17,8 3,8 23,1
Lâminas m
3
ha
-
1
kg ha
-
1
0%
12542,2 160,5 56,1 10,6 110,7 22,3 4,8 28,9 78,4 44,3 1,77
25% 15094,0 193,2 67,7 12,8 133,3 26,9 5,7 34,9 94,6 53,4 1,77
50% 17722,9 226,8 79,6 15,1 156,5 31,6 6,7 40,9 111,2 62,7 1,77
100% 22966,0 293,9 103,2 19,5 202,8 40,9 8,7 53,1 144,1 81,3 1,77
(1)
Sólidos solúveis totais;
(2)
Carbono particulado total;
(3)
Nitrogênio particulado total;
(4)
Carbono inorgânico dissolvido;
(5)
Carbono orgânico dissolvido;
(6)
Carbono orgânico total;
(7)
Nitrogênio total;
(8)
Relação carbono orgânico total (via
efluente): nitrogênio total.
A adição de nitrogênio via efluente na forma mineral (NH
4
+
, NO
2
-
+ NO
3
-
) foi de
33,7 kg ha
-1
para a lâmina controle e de 61,8 kg ha
-1
na lâmina com 100% de excesso
de irrigação. Esses valores, somados ao nitrogênio mineral fornecido via fertilizante
(390 kg ha
-1
ano
-1
), proporcionaram uma entrada de nitrogênio da ordem de até 471,3
kg ha
-1
na lâmina com 100% de excesso de irrigação.
O capim Tifton 85 apresenta alta capacidade de produção de massa seca em
função da adubação nitrogenada, respondendo linearmente até a aplicação de 600 kg
ha
-1
ano
-1
, em cultivo sem irrigação (ALVIM et al., 1999). Na presença de irrigação com
efluente de esgoto tratado, o capim Tifton 85 teve aumento linear em seu rendimento
para adição de até 856 kg N ha
-1
ano
-1
, sendo 520 kg N ha
-1
ano
-1
na forma de
nitrogênio mineral e 336 kg N ha
-1
ano
-1
de nitrogênio do efluente (FONSECA et al.
51
2007a). Estes fatos demonstram a capacidade do capim Tifton 85 em utilizar o
nitrogênio disponível pela adubação e pela irrigação com efluente, mesmo na maior
lâmina, com 100% de excesso.
A disponibilidade de nitrogênio no solo é favorecida pela adição de materiais
com baixa relação C:N (BUCHANAM; GLIESSMAN, 1991). Dessa forma, a adição ao
solo do efluente, de baixa relação C:N (1,77:1), somada à entrada de massa seca de
alta relação C:N do capim-Bermuda Tifton 85 (21:1), e à relação C:N do solo, em torno
de 14:1 (Tabela 4), em conjunto com as condições favoráveis de umidade e
temperatura configuram um cenário propício ao metabolismo microbiano.
3.3 Efeito de lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado na
pastagem de capim Tifton 85 sobre os atributos químicos e microbiológicos do
solo
A aplicação de lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado e
o tempo de irrigação promoveram efeito diferenciado nas propriedades químicas e
microbiológicas do solo, considerando a lâmina de irrigação acumulada em cada
tratamento e a precipitação acumulada no período de 18 meses de avaliação. A
precipitação acumulada foi adicionada ao modelo, pois, tratando-se de uma variável
independente e com oscilação ao longo do período avaliado, influenciou diretamente os
tratamentos.
Os parâmetros químicos: carbono e nitrogênio total e os grupos funcionais de
microrganismos: desnitrificantes e fungos totais tiveram sua variação influenciada
significativamente (P < 0,05) pelas lâminas excedentes de irrigação.
O efeito conjunto da irrigação e precipitação acumulada promoveu variação
significativa (P < 0,05) nos parâmetros químicos: pH, cátions trocáveis (K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
e
Na
+
), relação C:N, nos parâmetros microbiológicos: Cmic e, nos grupos funcionais de
microrganismos nitrificantes (oxidantes de amônio e de nitrito).
A precipitação acumulada promoveu variação significativa (P < 0,05) apenas na
densidade populacional de bactérias totais do solo.
52
As variações observadas na densidade populacional de amonificantes, no qCO
2
e na respiração basal do solo não foram influenciadas apenas pela irrigação com
efluente e precipitação acumulada no período analisado. Possivelmente outro fator não
controlado e não determinado, somado ao efeito da precipitação e irrigação acumuladas
durante a avaliação do experimento, ocasionaram essas variações.
3.3.1 Parâmetros químicos e de atividade microbiana
Considerando a variação do pH ao longo dos 18 meses de irrigação com efluente
(Figura 5), observaram-se os maiores valores no período de 9 a 12 meses (5,8 e 5,7,
média das 4 lâminas de irrigação). Aos 18 meses o pH diminuiu para valores em torno
de 5,5. Essa redução pode estar relacionada com a redução na lâmina de irrigação
aplicada entre 13 a 18 meses de avaliação e também pela maior precipitação (Figura
2), em comparação com o período de 9 a 12 meses, conforme comentado no item 3.1.
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 3 7 9 12 13 15 18
pH
Tempo de irrigação (meses)
0
25
50
100
Figura 5 - Acidez ativa (pH) do solo de área de pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado por um período de 18 meses, no município de Lins,
SP, Brasil. Barras representam o erro-padrão da média
53
O modelo estimado para a variação da acidez ativa do solo em função das
lâminas excedentes de efluente e, também, da precipitação acumulada no período de
18 meses de avaliação, indicou uma diminuição da acidez ativa com o aumento da
lâmina de irrigação acumulada, considerando uma precipitação acumulada de até 1500
mm (Figura 6). Fixando um valor de lâmina de irrigação acumulada acima de 1000 mm,
o comportamento observado indicou que a precipitação teve um efeito acidificante,
reduzindo os valores de pH (Anexo A).
Figura 6 - Acidez ativa do solo (isolinhas) em função da lâmina acumulada (eixo x) de irrigação com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0%: 1254 mm; 25%: 1509 mm; 50%: 1772
mm e 100% excesso: 2296 mm) e precipitação acumulada (eixo y), durante o período de 18
meses (8 tempos de avaliação), em área de pastagem de capim Tifton 85, no município de
Lins, SP
Dentre os fatores que influenciam a variação do pH do solo na área estudada,
destacam-se o manejo bimestral de corte e fertilização nitrogenada da pastagem, a
precipitação pluviométrica e a irrigação com efluente. O manejo da pastagem tende a
promover um efeito acidificante no solo, pela ação do fertilizante nitrogenado (nitrato de
amônio) e também da atividade microbiana na decomposição do material vegetal
depositado naturalmente sobre o solo ou proveniente do corte do capim, após a retirada
da biomassa vegetal, para a simulação de produção de feno.
Precipitação acumulada (mm)
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
5,2
5,4
5,4
5,6
5,6
5,6
5,6
5,6
5,8
5,8
5,8
5,8
6,0
6,0
6,0
6,2
6,2
6,4
6,4
6,6
6,8
5,6
5,4
5,4
0 500 1000 1500 2000 2500
0
500
1000
1500
2000
2500
54
A precipitação pluviométrica também apresenta um efeito acidificante no solo,
uma vez que a água da chuva, ainda que isenta de poluentes, possui um pH em torno
de 5,4 (SIMON; DEFRIES, 1992), devido a reação do vapor de água com o gás
carbônico presente na atmosfera (HUMERES, 1992).
O efluente de esgoto tratado do município de Lins apresenta pH em torno de 7,5
e elevada concentração de íons bicarbonato (HCO
3
-
), em média 449 + 79 mg L
-1
(Tabela 2) que, em conjunto com seus demais constituintes, tendem a estimular o
aumento do pH do solo irrigado.
Considerando estes três fatores como as principais interferências no ambiente
em estudo, a irrigação com efluente destaca-se como a mais freqüente, em relação ao
manejo da pastagem e os eventos de chuva. Dessa forma, os maiores valores
observados no período de 3, 7 e 9 meses, nas maiores lâminas de irrigação,
possivelmente estão relacionados com as características do efluente.
Por outro lado, a diminuição no pH a partir da avaliação realizada aos 12 meses,
considerando a média das lâminas de irrigação, pode ter relação com a redução no
volume de efluente aplicado nesse período e também com as características do solo da
área experimental, que apresentava inicialmente condições de acidez, baixa CTC e teor
de matéria orgânica que, somadas à sua classe textural médio-arenosa, conferiam ao
solo uma baixa capacidade de tamponamento ou de resistência à mudança de pH
(SABATTI et al., 2003).
De forma semelhante ao constatado nesse trabalho, Nogueira (2008), avaliando
o efeito do manejo de corte e adubação com diferentes doses de nitrogênio, do capim
Tifton 85 irrigado com água potável e com efluente, verificou que todos os tratamentos
apresentaram elevação de pH, sendo que os tratamentos irrigados e fertilizados
apresentaram aumento de pH temporariamente após a adição de N mineral (3 e 15 dias
após o manejo) e, que o tratamento sem irrigação apresentou maior pH em virtude da
maior entrada de resíduos vegetais (corte) e conseqüente decomposição. Nogueira
(2008) também constatou que a freqüência da irrigação foi o fator mais relevante nas
variações de pH do solo, visto que a diminuição do pH seguida da aplicação do adubo
nitrogenado foi temporária, com os valores de pH das avaliações antes do manejo não
diferindo entre as épocas avaliadas, para um mesmo tratamento.
55
Elevações no pH do solo cultivado com variadas culturas, irrigadas com efluentes
de esgotos domésticos, foram relatadas em diversos trabalhos (SCHIPPER et al, 1996;
FONSECA et al., 2005; HERPIN et al., 2007). Entretanto, essas variações tendem a ser
de pequena amplitude, como as constatadas neste trabalho, não representando grande
influência na disponibilidade de nutrientes para as culturas (SPEIR et al., 1999).
Com relação aos cátions trocáveis, o efeito da irrigação com efluente acumulada
somado ao efeito da precipitação acumulada proporcionou ajustes para todos os
cátions avaliados (Anexo A). Observou-se aumento nos teores de Ca
2+
com o aumento
da lâmina acumulada e, com o aumento da precipitação esse efeito é reduzido (Figura
7a). Considerando apenas o efeito da irrigação, o aumento da lâmina acumulada tende
a diminuir o teor de Mg
2+
(Figura 7b). Para uma lâmina acumulada variando de 1250 a
1750 mm, o aumento da precipitação acumulada praticamente não interfere no teor de
Mg
2+
, mantendo-se entre 4 a 5 mmol
c
kg
-1
. Para o K
+
, a combinação de precipitação e
lâmina de irrigação acumulada acima de 1000 e 1500 mm, respectivamente,
proporcionou redução em seus teores (Figura 7c).
A área experimental apresentava um teor de Na
+
praticamente irrelevante
(Tabela 1). A irrigação com efluente adicionou este cátion ao solo e o aumento na
precipitação atuou reduzindo o seu teor no solo (Figura 7d).
O aumento nos teores de Ca
2+
com o aumento da lâmina de irrigação com
efluente provavelmente está relacionado com a substituição de cátions trocáveis no
complexo de troca do solo, principalmente o K
+
, em condições de alta precipitação, e
em menor intensidade o Mg
2+
, em condições de menor precipitação.
O elevado aporte de Na
+
via efluente também pode ter influenciado a presença
de Mg
2+
e K
+
no solo, promovendo a substituição de parte do Mg
2+
e K
+
, presentes no
complexo de troca, deslocando-os para a solução do solo, o que tornaria possível a
perda desses nutrientes por lixiviação.
Além desse cenário, cabe ressaltar a elevada demanda do capim Tifton 85 por
K
+
, como observado no acúmulo desse nutriente na avaliação da concentração de
nutrientes na parte áerea do capim Tifton 85 durante o primeiro ano de condução desse
experimento (FONSECA et al., 2008, dados não publicados).
56
Figura 7 - Ca
2+
(a), Mg
2+
(b), K
+
(c) e Na
+
(d) trocáveis (mmol
c
kg
-1
) do solo de área de pastagem de
capim Tifton 85, em função das lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto
tratado [0%: 1254 mm; 25%: 1509 mm; 50%: 1772 mm e 100% excesso: 2296 mm] e da
precipitação acumuladas durante o período de 18 meses (8 tempos de avaliação), no
município de Lins, SP
Considerando uma precipitação acumulada de 1500 mm, em torno da média
anual observada no município de Lins, aplicação de uma lâmina de irrigação com
efluente acumulada de até 1750 mm promove uma adição anual de aproximadamente
4,5 mmol
c
kg
-1
de Na
+
(Figura 8).
6
5
5
4
4
3
4
4
4
5
5
3
6
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
14
14
14
15
15
16
13
13
13
13
12
12
12
12
11
11
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
4
4
4
4
4
6
6
6
6
8
8
8
4
4
4
2
2
0
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
1,0
1,0
0,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
2,0
2,0
2,0
2,5
1,0
1,0
0,5
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
a)
c)
d)
b)
57
Figura 8 - Na
+
trocável em área de pastagem de capim Tifton 85, em função da lâmina de irrigação com
efluente, considerando a precipitação acumulada de 1500 mm anuais, para o município de
Lins, SP
Este aumento no teor de Na
+
está relacionado com o efluente proveniente da
estação de tratamento de esgoto do município de Lins, que apresenta uma
concentração de Na
+
em torno de 131 mg L
-1
. Este valor, avaliado em conjunto com a
razão de adsorção de sódio e a condutividade elétrica do efluente (Tabela 2), possibilita
inferir sobre suas restrições de uso, quanto aos possíveis impactos na qualidade de
solo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2006), o efluente de Lins
enquadra-se na classe de grau de risco baixo a moderado para a qualidade do solo.
O capim Tifton 85 apresenta a capacidade de tolerar elevadas concentrações de
Na
+
no sistema (GRATTAN et al., 2004; GRIEVE et al., 2004) e também apresenta uma
elevada taxa de absorção de água e nutrientes (FAGERIA et al., 1997). Essas
características são favoráveis para que a cultura receba irrigação com efluente,
entretanto, a disposição dessa água residuária tende a promover um acúmulo gradual
de Na
+
no solo e, com isso, a possibilidade de sodificação do solo. Este processo pode
inviabilizar esse tipo de manejo a médio e longo prazo, devido à redução na infiltração
de água no solo e limitação do crescimento vegetal (BISSANI; MEURER; BOHNEN,
y = -1E-06**x
2
+ 0,0049**x + 0,157*
R² = 0,98
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 500 1000 1500 2000 2500
Lâmina de irrigação com efluente (mm)
Na trocável (mmol
c
kg
-
1
)
58
2004). O aumento na concentração de sais no solo tem sido observado principalmente
em áreas áridas e semi-áridas, irrigadas com efluentes (BARGARELLO et al., 2006).
Herpin et al. (2007) estudaram o efeito da irrigação de uma área de café com
efluente de esgoto tratado sobre as propriedades químicas do solo, no campo
experimental da Sabesp, em Lins, SP. Neste trabalho, os autores verificaram aumento
nos teores de K
+
após um ano de irrigação com efluente e nos teores de Ca
2+
e Na
+
,
após 3 anos de irrigação com efluente, não sendo observada variação significativa para
o Mg
2+
, para a camada de 0-10 cm de solo. Os resultados de Herpin et al (2007)
diferiram do observado neste trabalho apenas para K
+
, que teve seus teores reduzidos
com a irrigação com efluente ao longo dos 18 meses.
Avaliando um Latossolo cultivado com cana-de-açúcar irrigado com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado por 16 meses, no campo experimental da
Sabesp, em Lins, SP, Leal (2007) também verificou um pequeno aumento no pH do
solo e incrementos significativos nos teores de Na
+
trocável.
O carbono (CT) e o nitrogênio total (NT) apresentaram uma resposta quadrática
para as lâminas de irrigação com efluente de esgoto tratado, com ajustes abaixo de
60% (Figuras 9a e 9b).
Figura 9 - Carbono (a) e nitrogênio total (b) em função de lâminas excedentes de irrigação com efluente
[0%: 1254 mm; 25%: 1509 mm; 50%: 1772 mm e 100% excesso: 2296 mm], acumuladas
durante o período de 18 meses (8 tempos de avaliação), em área de pastagem de capim
Tifton 85, no município de Lins, SP
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
N total (g kg
-1
)
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
C total (g kg
-1
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
a)
b)
y = -0.00000459**x
2
+ 0.0092**x + 7.99**
R
2
= 0,54
y = -0.00000147**x
2
+ 0.00032**x + 0,66**
R
2
= 0,28
59
O carbono total apresentou um aumento no intervalo de 500 a 1500 mm de
irrigação acumulada com efluente, acima de 2000 mm os teores observados ficaram
próximos aos encontrados no início da condução do experimento. A variação do
nitrogênio total em função das lâminas acumuladas de efluente dificulta a interpretação
do efeito, o que se reflete no baixo coeficiente de determinação da equação (0,28).
A relação C:N variou principalmente em função da lâmina de irrigação aplicada,
sendo pequeno o efeito da precipitação acumulada (Figura 10a). Embora o modelo
sugira um aumento quase que linear da relação C:N em função da lâmina de irrigação
acumulada no período de 18 meses, sua interpretação deve ser feita com cautela.
Observou-se um aumento médio em torno de 33% entre a coleta referência (13:1) e a
avaliação aos 8 meses de aplicação do efluente (18:1) e, esta relação de 18:1 manteve-
se praticamente constante, entre todas as lâminas, até os 18 meses de aplicação do
efluente de esgoto tratado.
Nogueira (2008), ao monitorar a dinâmica do CT e NT do solo em uma área de
pastagem de capim-Bermuda Tifton 85, irrigada com efluente de esgoto tratado e
adubada com diferentes doses de nitrogênio, no campo experimental da Sabesp, em
Lins, SP, observou reduções no estoque de CT do solo nas áreas irrigadas tanto com
água como com efluente de esgoto tratado, quando comparado com o tratamento sem
irrigação e adubação nitrogenada, após 3 anos de manejo da área. Para o NT, a autora
observou redução no estoque apenas para o tratamento irrigado com água.
Firme (2007), estudando um Latossolo cultivado com cana-de-açúcar irrigado
com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 16 meses, no campo
experimental da Sabesp, em Lins, SP, diferente do observado neste trabalho, não
encontrou variação significativa nos teores de CT e NT do solo.
Mudanças expressivas no CT, NT e C:N, ocasionadas pela irrigação com
efluente de esgoto tratado têm sido observadas em áreas irrigadas, porém em
condições de longos períodos de aplicação, como descrito nos estudos realizados por
Friedel et al. (2000), Ramirez-Fuentes et al (2002) e Walker e Lin (2008).
O carbono microbiano (Cmic) apresentou os maiores valores associado à maior
precipitação e lâmina de irrigação acumulada (Figura 10b). Considerando a média das
lâminas de irrigação com efluente, o Cmic variou em torno de 141,34 (coleta de
60
referência) a 300 µg g
-1
s.s. (aos 8 e aos 12 meses de aplicação do efluente). No
período de 18 meses, considerando apenas a coleta de referência e a última coleta
realizada, o Cmic teve um aumento médio de aproximadamente 34%.
O modelo obtido para o Cmic, a partir da precipitação e da lâmina de irrigação
acumulada durante o período de 18 meses possibilita inferir que a aplicação de uma
lâmina de efluente de até 2300 mm acumulados, somados a uma precipitação
acumulada de cerca de 2500 mm não teve efeito negativo sobre o Cmic, pelo contrário,
estimulou o acúmulo de carbono na biomassa microbiana do solo.
Figura 10 - Relação C:N (a) e carbono microbiano, em mg g
-1
s.s. (de área de pastagem de capim Tifton
85, em função da precipitação e das lâminas excedentes de irrigação com efluente de
esgoto tratado [0%: 1254 mm; 25%: 1509 mm; 50%: 1772 mm e 100% excesso: 2296 mm],
acumuladas durante o período de 18 meses de avaliação
A disposição de efluente no solo por longos períodos tem promovido diferentes
efeitos no carbono da biomassa microbiana. Constatou-se, em concordância com o
observado neste trabalho, em relação à média das lâminas aplicadas ao longo de 18
meses, aumento do Cmic em diversos estudos (MELI et al., 2002; RAMIREZ-FUENTES
et al., 2002; GELSOMINO et al., 2006), bem como a ausência de efeito (SCHIPPER et
al, 1996; WANG et al., 2003). O efeito da disposição de efluente no solo sobre o
carbono da biomassa microbiana está principalmente relacionado com a adição de
400
300
300
300
200
200
200
200
100
100
100
0
0
400
300
300
300
200
200
100
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
24
24
24
24
22
22
22
2220
20
20
2018
18
18
1816
16
16
16
14
14
14
14
12
12
12
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
a)
b)
61
carbono dissolvido no efluente e o favorecimento das condições ambientais que
propiciam o crescimento da microbiota.
O quociente microbiano (qMIC), que representa a participação do carbono
microbiano no carbono total do solo, aumentou aos 4 meses de aplicação do efluente, e
após esse período, manteve-se entre 2 e 3% (Figura 11), semelhante ao observado por
Nogueira (2008), em área de Tifton 85 irrigada com efluente de esgoto tratado e com
doses de adubação nitrogenada e, em áreas de pastagem de braquiária e capim-
mombaça (SILVA et al., 2007). Valores muito baixos, próximos de zero, para o qMIC
são observados em áreas sob severo estresse, como a contaminação por metais
(BANNING et al., 2008; BHATTACHARYYA et al., 2008).
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 3 7 9 12 13 15 18
qMIC (%)
Tempo de irrigação (meses)
0
25
50
100
Figura 11 - Quociente microbiano (qMIC) da área de pastagem de capim-Bermuda Tifton 85, irrigada
com lâminas excedentes de efluente de esgoto (0, 25, 50 e 100% de excesso), no período de
dezembro de 2005 (tempo 0) a julho de 2007 (18 meses), no município de Lins, SP. As
barras representam o erro padrão da média
A respiração induzida por substrato respondeu negativamente ao efeito da
lâmina acumulada de efluente de esgoto tratado. Observou-se uma redução na RIS em
torno de 28% entre o período de 4 e 18 meses de aplicação do efluente, no qual o valor
observado na última avaliação para a RIS foi de 4,5 mg C-CO
2
g
-1
h
-1
, considerando a
média das lâminas de irrigação (Figura 12).
62
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 3 7 9 12 13 15 18
RIS (mg C-CO
2
g
-1
h
-1
)
Tempo de irrigação (meses)
0
25
50
100
Figura 12 - Respiração induzida por substrato (RIS) da área de pastagem de capim-Bermuda Tifton 85,
irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto (0, 25, 50 e 100% de excesso), no
período de dezembro de 2005 (tempo 0) a julho de 2007 (18 meses), no município de Lins,
SP. As barras representam o erro padrão da média
A respiração basal, representada como C-CO
2
e o quociente metabólico (qCO
2
),
que corresponde à fração ativa da biomassa microbiana, não apresentaram variação
significativa em função das lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto
tratado e da precipitação, acumuladas no período de 18 meses (Tabela 4).
Tabela 4 - Respiração basal (C-CO
2
) e quociente metabólico (qCO
2
) de área de pastagem irrigada com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0, 25, 50 e 100% de excesso). Média de
oito tempos de avaliação, seguidas do erro-padrão
Tratamentos
C-CO
2
(mg g
-
1
h
-
1
)
Coeficiente de
variação (%)
qCO
2
(mg C-CO
2
g
-
1
Cmic h
-
1
)
Coeficiente de
variação (%)
0 1,56 + 0,28 76 5,86 + 1,14 69
25 1,14 + 0,26 73 5,69 + 1,51 74
50 1,25 + 0,22 49 5,05 + 0,97 57
100 1,23 + 0,22 49 6,28 + 1,02 71
A respiração basal apresentou grandes variações ao longo dos 18 meses, com
os maiores valores aos 4 (1,9 mg kg
-1
h
-1
) e 8 meses (2,4 mg kg
-1
h
-1
) e os menores no
período dos 12 aos 15 meses de aplicação do efluente (em torno de 0,8 mg kg
-1
h
-1
). Na
última avaliação a respiração basal tornou a aumentar, aos 18 meses de irrigação (2 mg
kg
-1
h
-1
), considerando a média das 4 lâminas excedentes de irrigação.
63
A resposta da atividade microbiana à aplicação de lâminas de irrigação com
efluente também foi avaliada em outros estudos, como o trabalho realizado por
Schipper et al. (1996), em área de floresta de Pinus irrigada com efluente. Os autores
testaram lâminas de 49 e 74 mm semana
-1
de efluente e de água, pelo período de 3
anos e observaram que a atividade e a biomassa microbiana não apresentaram
mudanças significativas, tanto entre as fontes de irrigação (efluente e água), como entre
as lâminas testadas (de 49 e 74 mm semana
-1
). Embora em condições diferentes
daquelas presentes neste trabalho, os autores também não constataram variação
significativa na atividade dos microrganismos do solo.
Após longo período de aplicação de efluente para a produção de várias culturas
anuais, em torno de 70 anos, também não foram constatadas alterações significativas
na atividade microbiana, em parcelas irrigadas com efluente e com água potável
(WANG et al., 2003). Os autores atribuem esse efeito à capacidade adaptativa da
microbiota do solo.
Refletindo o comportamento da respiração basal, o qCO
2
apresentou grande
variação ao longo dos 18 meses de aplicação do efluente (Tabela 4). Aos 4 e 8 meses
de avaliação, o qCO
2
praticamente dobrou em relação aos valores observados antes de
iniciar a aplicação de efluente, alcançando os maiores valores aos 9 meses de
aplicação do efluente, com média de 10 mg C-CO
2
g
-1
Cmic h
-1
para as 4 lâminas de
irrigação.
Nos meses seguintes, que compreendem o período de chuvas, o quociente
metabólico retornou a valores próximos aos observados antes de iniciar a irrigação com
efluente. Na última avaliação, aos 18 meses de irrigação, o qCO
2
alcançou valores
próximos ao observado aos 9 meses (10 mg C-CO
2
g
-1
Cmic h
-1
). Este fato está
possivelmente relacionado com o efeito da irrigação, uma vez que este período
corresponde à estação seca, caracterizada por poucas chuvas e baixas temperaturas
(Figura 2). Nestes períodos (aos 9 e aos 18 meses de irrigação), o carbono da
biomassa microbiana diminuiu e a respiração basal do solo manteve-se constante (aos
9 meses) ou aumentou (aos 18 meses de irrigação), o que pode indicar a existência de
um período desfavorável aos microrganismos.
64
O comportamento observado para o qCO
2
foi semelhante ao descrito por
Nogueira et al. (2005), em um experimento conduzido numa área próxima à deste
trabalho. Os autores observaram que após 18 meses de aplicação de EET em área
cultivada com capim Tifton 85, o qCO
2
aumentou somente na estação seca, devido ao
estímulo desta atividade ocasionado pela umidade e a adição de nitrogênio, via
irrigação com efluente, sendo que o mesmo comportamento também foi observado nas
parcelas que receberam água potável.
Embora alguns autores sugiram valores como limite para determinar uma
condição de estresse sobre a comunidade microbiana, como o valor de 2 mg C-CO
2
g
-1
Cmic h
-1
, proposto por Anderson (2003), a interpretação de índices como o qCO
2
deve
ser conduzida em conjunto com a avaliação do cenário o qual se está estudando,
utilizando outros parâmetros microbiológicos de atividade microbiana, como a atividade
de enzimas no solo (NOGUEIRA et al., 2006).
Os altos valores de qCO
2
observados nesse trabalho possivelmente estão
relacionados com a alta atividade metabólica dos microrganismos, desencadeada pelo
manejo do capim e a irrigação com efluente. O manejo do capim realizado
bimestralmente representava uma entrada de carbono, do cisalhamento do corte do
capim e de nitrogênio, proveniente da adubação mineral. Essa interferência, somada a
irrigação com efluente, indicou um cenário favorável à atividade microbiana.
De forma geral, mudanças nos atributos químicos e microbiológicos em áreas
irrigadas com efluente por curtos períodos de tempo, como neste trabalho, têm sido
pouco observadas. Avaliando o efeito da irrigação com efluente de esgotos de
tratamento terciário, Pollice et al. (2004) não constataram mudanças nas propriedades
químicas do solo, após dois anos de irrigação. Ao comparar áreas agrícolas irrigadas
com efluente e áreas irrigadas com água tratada, na Califórnia, Wang et al. (2003)
observaram diferenças apenas na porosidade total e no teor de magnésio, dentre vários
atributos químicos, físicos e microbiológicos avaliados.
As principais alterações têm sido observadas nos estudos em longo prazo. No
estado da Pensilvânia, nos Estados Unidos, a Universidade da Pensilvânia mantém
uma área experimental por 40 anos, com culturas anuais e arbóreas irrigadas com
efluente municipal. Ao avaliar o efeito desse manejo, sob a perspectiva da paisagem,
65
Walker e Lin (2008) verificaram que a irrigação com aproximadamente 2400 mm anuais
de efluente, somadas a precipitação da região, fornecia ao solo em torno de 3350 mm
anuais de água. Essa quantidade de água promoveu períodos de saturação localizada
e transporte de materiais no solo nas áreas mais baixas da paisagem e, na área como
um todo, aumentos consideráveis no teor de matéria orgânica e no pH do solo.
No México, a irrigação de culturas com efluente urbano tem sido utilizada no Vale
do Mezquital, por mais de 90 anos (ORTEGA-LARROCEA et al., 2001). Nos trabalhos
realizados, diversos autores observaram aumento nos teores de carbono e nitrogênio
total, carbono e atividade microbiana (FRIEDEL et al., 2000; RAMIREZ-FUENTES et al.,
2002). Entretanto, os autores também evidenciam o acúmulo de sais e de metais
pesados, em conseqüência da utilização de efluentes de áreas urbanas e industriais.
3.3.2 Densidade populacional de grupos funcionais de microrganismos
As lâminas excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado promoveram
efeito na densidade populacional de desnitrificantes e fungos totais, considerando as
lâminas acumuladas no período de 18 meses (Figuras 13a e 13b). Efeito conjunto da
precipitação acumulada e das lâminas de irrigação acumuladas no período avaliado foi
observado para as bactérias nitrificantes, oxidantes de amônio (Figura 13c) e de nitrito
(Figura 13d).
Para as populações de desnitrificantes, embora o ajuste ao modelo linear tenha
sido baixo (R
2
= 0,25), o aumento da lâmina de irrigação acumulada proporcionou
aumento da ordem de mais de 100 vezes na densidade populacional desse grupo, que
era de 4,89 Log NMP antes de iniciar a aplicação de efluente e passou para 6,15 Log
NMP, considerando a média das lâminas de irrigação.
De acordo com alguns autores, a desnitrificação é um processo importante em
áreas que recebem efluente de esgoto tratado, uma vez que remove do solo o nitrato
antes que este alcance o lençol freático (BARTON et al., 2000). Entretanto, neste
processo são emitidos gases potencialmente danosos que contribuem para o efeito
estufa e, conseqüentemente, para o aquecimento global (HALL; MATSON, 1999).
66
Aumento na população de desnitrificantes, como verificado neste trabalho, pode estar
relacionado com a diminuição na concentração de O
2
no ambiente edáfico (BOUWER;
CHANEY, 1974; POLGLASE et al., 1995; SCHIPPER et al., 1996). A alta concentração
de nitrato na solução do solo, aliada à baixa concentração de O
2
, explica os aumentos
na desnitrificação em solos irrigados com efluente, como observado por Schipper et al.
(1996) e por Friedel et al. (2000).
Figura 13 - Densidade populacional de desnitrificantes (a), fungos totais (b), bactérias oxidantes de
amônio (c) e oxidantes de nitrito (d) (Log NMP – Logaritmo do número mais provável) do
solo de área de pastagem de capim Tifton 85, em função da precipitação e das lâminas
excedentes de irrigação com efluente de esgoto tratado [0%: 1254 mm; 25%: 1509 mm;
50%: 1772 mm e 100% excesso: 2296 mm], acumuladas durante o período de 18 meses de
avaliação
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Desnitrificantes (Log NMP)
0
2
4
6
8
2,0
2,0
2,0
1,5
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
2,5
2,5
2,5
2,5
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,5
3,5
3,5
2,5
2,5
3,0
3,0
2,0
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
2,5
2,5
0,0
2,5
2,0
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Fungos totais (Log NMP)
0
2
4
6
8
1,5
1,5
1,5
1,0
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,5
2,5
2,5
2,5
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
2,5
2,5
2,0
2,0
2,0
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
2,5
2,5
0,0
Lâmina de irrigação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500
Precipitação acumulada (mm)
0
500
1000
1500
2000
2500
a)
b)
c) d)
y = 0,00164**x + 4,86**
R
2
= 0,25
y = -0,00173**x + 4,10**
R
2
= 0,51
67
As populações de fungos totais do solo diminuíram com o aumento da lâmina
acumulada de irrigação com efluente, com valores em torno de 4 Log NMP antes de
iniciar a aplicação do efluente, passando para 2,3 Log NMP aos 18 meses de irrigação
com efluente, uma redução de mais de 100 vezes no período avaliado. A redução na
população de fungos está possivelmente relacionada com o aumento do pH do solo e o
favorecimento do crescimento das populações de bactérias. A formação de sítios
anaeróbios no solo, devido a fatores como a intensa atividade respiratória de bactérias
aeróbias ou locais com alta viscosidade que dificultam a difusão de oxigênio, também
pode limitar a população de fungos, que em sua maioria são aeróbios estritos,
excetuando-se algumas leveduras (GALVAGNO; FORCHIASSIN, 2004).
Para o grupo dos microrganismos nitrificantes, o comportamento foi semelhante
para as oxidantes de amônio e de nitrito. As lâminas de irrigação acumuladas, acima da
lâmina que representa o tratamento controle, ou seja, acima de 1250 mm, tendeu a
diminuir a densidade populacional desse grupo, somando-se também o efeito da
precipitação acumulada acima de 1250 mm. Este resultado é coerente com a ecologia
desse grupo de microrganismos, reconhecidos como aeróbios obrigatórios
(ROBERTSON; GROFFMAN, 2007). Tanto as lâminas excedentes de irrigação
acumulada, acima de 1700 mm ou a lâmina com 50% de excesso, como um evento de
chuva intenso, podem favorecer a formação temporária de condições anaeróbicas,
limitando o crescimento desse grupo de microrganismos.
Para as bactérias totais do solo, observou-se efeito quadrático da precipitação
acumulada no período de 18 meses (Figura 14), com os maiores valores observados
com a precipitação acumulada em torno de 800 mm, que corresponde a avaliação
realizada aos 9 meses de condução do experimento, relativa ao período seco na região
de Lins, SP (Figura 2).
As variações observadas na densidade populacional de amonificantes não foram
afetadas significativamente pela precipitação e lâmina de irrigação com efluente
acumuladas. Observou-se que as populações de amonificantes aumentaram em
relação à avaliação realizada antes de iniciar a irrigação com efluente (5 Log NMP), até
os 8 meses de aplicação de efluente (6 Log NMP), considerando a média das lâminas
de irrigação). Nos períodos seguintes, a densidade populacional diminui a valores
68
próximos aos observados no início do experimento, com destaque para a avaliação aos
13 meses de irrigação, no qual a maior lâmina de irrigação (100% de excesso)
apresentou a menor densidade populacional registrada (3,3 Log NMP). A partir dos 15
meses de irrigação, os amonificantes apresentaram um aumento, mantendo-se em
torno de 10
5
unidades formadoras de colônias (5 Log NMP).
Figura 14 - Bactérias totais (Log NMP – Logaritmo do número mais provável) do solo de área de
pastagem de capim Tifton 85, em função da precipitação acumulada durante o período de
18 meses de avaliação
Aumentos na densidade de bactérias copiotróficas (de alto requerimento de
nutrientes para crescimento) e oligotróficas (de baixo requerimento de nutrientes para
crescimento) foram observados em áreas que receberam aplicação de efluentes por
longos períodos (FILIP et al., 1999; FILIP et al., 2000). As bactérias totais, que também
podem ser consideradas como bactérias copiotróficas, pois são cultivadas em meio rico
em nutrientes, diferente do observado pelos autores, foram afetadas principalmente
pela precipitação acumulada no período de 18 meses de avaliação.
A análise das relações existentes entre as variáveis químicas e de atividade
microbiana com a densidade populacional de grupos funcionais de microrganismos foi
estudada por meio das correlações de Pearson (Tabela 5). Grupos funcionais de
microrganismos que contribuem para o carbono da biomassa microbiana, como as
bactérias e fungos totais e, também as oxidantes de amônio, apresentaram relação
positiva com esse parâmetro (r = 0,21; 0,29 e 0,49, respectivamente). A respiração
Precipitação acumulada (mm)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Bactérias totais (Log NMP)
3
4
5
6
7
8
y = -0.000000632**x
2
+ 0.00189**x + 5.49**
R
2
= 0,51
69
basal do solo teve correlação positiva com os grupos de microrganismos avaliados,
excetuando-se os desnitrificantes e os fungos totais.
A respiração induzida por substrato correlacionou-se positivamente com as
bactérias (r = 0,24) e os fungos totais (r = 0,55), que compreendem os microrganismos
atuantes na decomposição dos materiais orgânicos presentes no solo e com habilidade
de consumir fontes de carbono prontamente disponíveis. Já os grupos que representam
as bactérias nitrificantes tiveram relação inversa com esse parâmetro.
Reconhecidamente, as bactérias nitrificantes utilizam CO
2
como fonte de carbono e
amônio e nitrito como fonte de elétrons para suas atividades vitais, dessa forma, um
aumento na RIS indica uma predominância de bactérias heterotróficas em detrimento
as autotróficas. Correlação negativa também foi observada para o grupo dos
desnitrificantes (r = -0,39), como esperado, pois o processo de desnitrificação é
anaeróbico.
Tabela 5 - Correlação de Pearson entre a densidade populacional de grupos funcionais de
microrganismos e parâmetros químicos e de atividade microbiana de área de pastagem
irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0, 25, 50 e 100% de
excesso). Coeficientes com *, significativos a 5% e com ** significativos a 1%
DESN NIT-NH
4
NIT-NO
2
AMO BAC FGO
Cmic - 0,215** 0,496** 0,135 0,135 0,208* 0,295**
C-CO
2
- 0,053 0,172* 0,289** 0,179* 0,243** 0,092
RIS - 0,391** - 0,496** - 0,436** 0,101 0,217** 0,557**
qCO
2
0,079 0,181 0,179 0,105 0,088 -,0,370
qMIC 0,041 0,016 - 0,030 - 0,117 0,217* 0,014
CT 0,104 0,400* 0,444** 0,024 0,128 - 0,132
NT - 0,021 0,034 0,091 - 0,071 0,237* 0,079
C:N 0,213** 0,696** 0,698** 0,142 - 0,104 0,142
pH 0,003 0,280** 0,243* - 0,061 0,442** 0,029
Na
+
0,176* 0,597** 0,434** 0,194* - 0,003 - 0,286**
N (efluente)
1
- 0,018 0,427** 0,252** 0,222* 0,514** 0,348**
Acidez ativa (pH), sódio trocável (Na
+
), carbono (CT) e nitrogênio total (CT), relação carbono e
nitrogênio total de solo (C:N), carbono da biomassa microbiana (Cmic), respiração basal (C-CO
2
),
respiração induzida por substrato (RIS), quociente microbiano (qMIC), quociente metabólico (qCO
2
),
bactérias totais (BAC), fungos totais (FGO), amonificantes (AMO), bactérias oxidantes de amônio (NIT-
NH
4
), bactérias oxidantes de nitrito (NIT-NO
2
) e desnitrificantes (DESN);
1
N (efluente) – nitrogênio
adicionado na irrigação com efluente.
O carbono total (CT) apresentou relação positiva com os nitrificantes e o
nitrogênio total (NT) correlacionou-se positivamente com as bactérias totais. Assim
como para o CT, também foi observada correlação positiva entre os grupos de
70
microrganismos nitrificantes e a relação C:N, este comportamento também foi notado
para os desnitrificantes.
O pH do solo também apresentou relação positiva com os grupos de nitrificantes
(r = 0,28) e também com as bactérias totais (r = 0,44). O aumento do pH até valores
próximos ou superiores a neutralidade favorece o crescimento de nitrificantes, dentre
outros grupos de microrganismos (ROBERTSON; GROFFMAN, 2007).
Relações positivas foram observadas entre alguns grupos funcionais de
microrganismos e o teor de Na
+
no solo. Entretanto, o teor de Na
+
também apresentou
relação positiva altamente significativa com o nitrogênio adicionado via irrigação com
efluente (0,52). Como o nitrogênio é adicionado ao solo na mesma proporção que o
Na
+
, porém em quantidades bem menores (Tabela 2), é esperado que o efeito positivo
ocasionado pelo nitrogênio adicionado sobre os grupos funcionais seja confundido com
o efeito do Na
+
acumulado no solo, durante o período avaliado.
Entretanto, o aumento no teor de Na
+
no solo tende a causar efeito adverso na
comunidade microbiana (RIETZ; HAYNES, 2003; WICHERN; WICHERN;
JOERGENSEN, 2006). Assim sendo, a relação positiva observada entre o teor de Na
+
e
a densidade populacional de alguns grupos de microrganismos não pode ser
considerada real.
3.3.3 Análises estatísticas multivariadas
3.3.3.1 Análise de curva de resposta principal (PRC)
A análise da PRC, para a avaliação do efeito da irrigação excedente sobre a
densidade de grupos funcionais de microrganismos ligados ao ciclo do nitrogênio,
revelou que 32,5% da variabilidade total está representada no primeiro eixo canônico
(Figura 15) (499 permutações do teste de Monte Carlo; F = 10,556; P = 0,012).
Aos quatro meses de irrigação com efluente observou-se que a lâmina de 50%
de excesso de irrigação se distanciou das demais, com diminuição das populações de
microrganismos amonificantes (AMO) e aumento dos desnitrificantes (DESN) (Figura
71
15). As maiores diferenças foram observadas aos 13 meses de aplicação do efluente,
período no qual a lâmina de 100% de excesso de irrigação apresentou a maior redução
na densidade de microrganismos amonificantes (AMO) e maior crescimento de
desnitrificantes (DESN).
Figura 15. - Curvas de resposta principal do efeito da irrigação de pastagem de capim Tifton 85 com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado [0(controle), 25, 50 e 100% de excesso]
durante 15 meses, sobre a densidade de grupos funcionais de microrganismos ligados ao
ciclo do nitrogênio (Cdt – Coeficiente canônico padronizado da RDA parcial) e o peso dos
grupos funcionais (Bk) (BAC, bactérias totais; FGO, fungos totais; AMO, amonificantes; NIT-
NH
4
, oxidantes de amônio; NIT-NO
2
, oxidantes de nitrito; DESN, desnitrificantes), no
município de Lins, SP, Brasil
Os grupos funcionais de microrganismos nitrificantes (NIT-NH
4
; NIT-NO
2
),
bactérias (BAC) e fungos (FGO) totais apresentaram pouca variação em suas
populações para todas as lâminas avaliadas, ao longo dos 15 meses de aplicação do
efluente, com valores de Bk próximos a zero. As duas maiores lâminas, de 50 e de
100% de excesso de irrigação, mantiveram-se abaixo da lâmina controle, aos 15 meses
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 3 7 9 12 13 15 18
C
d
t
Tempo (meses)
Controle 25 50 100
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
DESN
NIT-NO
2
AMO
NIT-NH
4
BAC
FGO
Cdt
Bk
Bk
72
de disposição do efluente. A lâmina de 25% de excesso mostrou-se como a lâmina com
menor variação ao longo do tempo, em relação ao tratamento controle.
A análise de curva de respostas principais possibilita resumir as mudanças na
comunidade microbiana, avaliadas pela densidade populacional de grupos funcionais
de microrganismos ligados ao ciclo do nitrogênio, de forma a projetar os efeitos de uma
variável em relação a uma referência, neste trabalho, as lâminas excedentes de
efluente em relação à lâmina controle (LEPŠ; ŠMILAUER, 1999).
A partir da transformação exponencial do produto entre o coeficiente canônico
padronizado (Cdt) em um dado tempo de avaliação, representado no eixo y e, o peso
do grupo funcional de microrganismo (Bk) que se pretende estudar, conforme a fórmula:
exp(cdt*Bk), é possível prever o tamanho relativo da densidade populacional desse
grupo em comparação ao tratamento controle (1 - exp(cdt*Bk)) (LEPŠ; ŠMILAUER,
1999). Dessa forma, para a avaliação realizada aos 13 meses de aplicação de efluente,
a densidade populacional de amonificantes (AMO) na lâmina com 100% de excesso de
irrigação foi cerca de 200% menor que na lâmina controle. Já para os desnitrificantes
(DESN), neste mesmo tempo de avaliação, a lâmina com 100% de excesso promoveu
um aumento de aproximadamente 45% na densidade populacional desse grupo. Para a
lâmina com 25% de excesso, a densidade populacional de desnitrificantes (DESN) foi
aproximadamente 19% menor que a lâmina controle.
Com esta análise foi possível constatar que os desnitrificantes e os amonificantes
foram os grupos funcionais mais influenciados pela aplicação de lâminas excedentes de
irrigação com efluente ao longo de 18 meses. Esta informação não foi obtida
procedendo-se a análise univariada, considerando como fontes de variação as lâminas
de irrigação com efluente e a precipitação acumuladas, na qual apenas foi observado
efeito para o grupo dos desnitrificantes. A PRC mostrou-se de grande utilidade e
eficiência na previsão do efeito das lâminas excedentes de irrigação com efluente sobre
a densidade de grupos funcionais de microrganismos.
73
3.3.3.2 Análise de Redundância (RDA)
A aplicação das lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado afetou a
densidade de grupos funcionais de microrganismos, conforme constatado na análise
univariada e na análise de PRC. Adicionalmente, este efeito foi observado para
determinados atributos químicos e microbiológicos do solo. Entretanto, a relação entre
esses atributos e a densidade de grupos funcionais de microrganismos também pode
ser testada, utilizando-se a RDA.
A RDA foi empregada para avaliar as possíveis relações existentes entre os
atributos químicos e microbiológicos, considerados como variáveis ambientais, com a
densidade de grupos funcionais de microrganismos, considerados como variáveis
respostas, em área de pastagem irrigada com lâminas excedentes de efluente de
esgoto tratado. Aplicou-se também a seleção de variáveis ambientais com o teste de
permutação de Monte Carlo, que fornece um teste de significância para as variáveis. Na
seleção de variáveis, a respiração basal e o quociente metabólico foram eliminados por
apresentarem efeito de colinearidade, ou seja, estas variáveis apresentaram alta
correlação com outras variáveis ambientais e, portanto, não contribuiriam para o
resultado da análise.
Para os tratamentos irrigados com lâminas excedentes de efluente de esgoto
tratado, a RDA representou 42,8% da variabilidade dos dados (F-ratio = 39,11; P value
= 0,002). Desta variabilidade, sem considerar a influência das variáveis ambientais
(atributos químicos e microbiológicos), 37,1% estão representados nos dois primeiros
eixos, sendo 24,7% representada pelo eixo 1 e 12,4% pelo eixo 2 (Figura 16). Com a
participação das variáveis ambientais a representação da variabilidade pelos eixos
canônicos 1 e 2 aumenta para 57,9% e 28,9%, respectivamente, totalizando 86,8% da
variabilidade dos dados.
74
-1.0 1.5
-1.0
1.5
DESN
NIT-NH
4
NIT-NO
2
AMO
FGO
BAC
Cmic
qMIC
RIS
pH
Ca
2+
Mg
2+
K
+
Na
+
PA
Eixo canônico 1 (24,7% da variabilidade total)
Eixo canônico 2 (12,4% da variabilidade total)
Figura 16 - Análise de redundância da densidade de grupos funcionais de microrganismos ligados ao
ciclo do nitrogênio (BAC: bactérias totais; FGO: fungos totais; AMO: amonificantes; NIT-
NH
4
: oxidantes de amônio; NIT-NO
2
: oxidantes de nitrito; DESN: desnitrificantes), de área
de pastagem de capim Tifton 85 irrigado com lâminas excedentes de efluente de esgoto
tratado (0, 25, 50 e 100% de excesso) no município de Lins, SP, Brasil. (setas tracejadas
representam as variáveis ambientais: carbono da biomassa microbiana (Cmic), respiração
induzida por substrato (RIS), quociente microbiano (qMIC), acidez ativa do solo (pH),
potássio trocável (K
+
), cálcio trocável (Ca
2+
), magnésio trocável (Mg
2+
); sódio trocável (Na
+
);
precipitação acumulada (PA)
No diagrama da RDA a proximidade entre os vetores que representam as
variáveis ambientais e as variáveis respostas fornece informações a respeito das
relações existentes entre elas, portanto, vetores apontando para a mesma direção
indicam uma relação positiva entre as variáveis (LEPŠ; ŠMILAUER, 1999). Os grupos
de bactérias e fungos totais encontram-se relacionados com a maior respiração
induzida por substrato, relação também constatada pela análise de correlação simples
75
(Tabela 5), que representa uma medida de atividade dos microrganismos denominados
zimógenos, ou seja, os responsáveis pela degradação dos compostos orgânicos
simples e também são considerados de rápido crescimento. Estes grupos também se
relacionaram com os maiores teores de potássio e magnésio trocáveis no solo. O
quociente microbiano ficou próximo ao centro do gráfico, com valores baixos, não se
relacionando fortemente com nenhum grupo funcional de microrganismo.
Os microrganismos amonificantes apresentaram relação positiva com o aumento
do carbono da biomassa microbiana e do pH do solo, o que não foi observado pela
análise de correlação simples (Tabela 5), e em menor intensidade com os teores de
cálcio e sódio trocáveis. Já os nitrificantes relacionaram-se fortemente com o aumento
dos teores de sódio, como observado na análise de correlação simples (Tabela 5), e em
menor intensidade com o cálcio.
A precipitação acumulada no período de 18 meses, também considerada como
variável ambiental nesta análise, teve maior relação com o aumento na densidade
populacional de desnitrificantes, mas também influenciou o aumento da densidade de
amonificantes e nitrificantes.
A partição da variabilidade dos dados influenciada pelos atributos químicos (pH,
K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, Na
+
e PA) e microbiológicos (Cmic, RIS e qMIC) indica uma maior
participação dos atributos microbiológicos (Tabela 6).
Tabela 6 - Análise de variância multivariada com partição da variabilidade do efeito dos tratamentos (0,
25, 50 e 100% de excesso de irrigação com efluente e área não irrigada) na densidade de
grupos funcionais de microrganismos ligados ao ciclo do nitrogênio (bactérias e fungos totais,
amonificantes, nitrificantes e desnitrificantes). RDA testada por 499 permutações
Fonte de variação % da variância F P
Explicada 41,8 34,95 0,002
**
Atributos químicos 12,1 14,71 0,002
**
Atributos microbiológicos 16,8 16,84 0,002
**
Atributos químicos e microbiológicos 12,1 26,73 0,002
**
Não explicado 58,2 - -
**
Significante a 1% para o teste de permutação de Monte Carlo.
A participação dos atributos químicos e microbiológicos na variabilidade total dos
dados indica que a interação desses atributos promove efeito semelhante ao observado
76
apenas para os atributos químicos sobre a resposta dos grupos funcionais de
microrganismos a aplicação das lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado.
A análise de redundância possibilitou inferir que há relação entre os atributos
químicos e microbiológicos do solo e, estes afetam em proporções relativamente
próximas a densidade de grupos funcionais de microrganismos em área de pastagem
irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado.
3.3.4 Fungos micorrízicos arbusculares (FMAs)
A taxa de colonização micorrízica do capim Tifton 85, avaliada após doze meses
de aplicação de efluente, não variou em função das lâminas excedentes de irrigação
com efluente de esgoto tratado (Tabela 7). O número de esporos variou entre as
lâminas, sendo os maiores valores observados nas lâminas de 25% e 100% de excesso
e, na área de pastagem não irrigada com efluente.
Tabela 7 - Taxa de colonização micorrízica, número de esporos de fungos micorrízicos arbusculares e
fósforo disponível em área de pastagem de capim Tifton 85 irrigado com lâminas excedentes
de efluente de esgoto tratado por 18 meses, no município de Lins, SP
Lâmina de
irrigação
(% de excesso)
Taxa de colonização
(%)
Número de esporos
(50g
-1
solo)
Fósforo disponível
(mg kg
-1
)
0 47,3 a
*
58 b 19,45 a
25 40,2 a 113 a 19,29 a
50 44,6 a 34 b 19,31 a
100 48,5 a 78 a 27,25 b
NE 39,0 a 112 a 22,01 a
* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não variaram entre si, pelo teste LSD (P < 0,05).
Este resultado difere do observado por Buratti (2007), que avaliou a colonização
micorrízica de pastagem de capim Tifton 85 no município de Jóia, RS, sob diferentes
condições de fertilidade do solo. Os autores verificaram que a colonização variou de
15% para a área com teor de fósforo de 7 mg dm
-3
, a apenas 4% para a área com 24
mg dm
-3
de fósforo. A colonização observada por esses autores foi bem inferior a
encontrada neste trabalho, tanto para as áreas irrigadas com o efluente (Tabela 7),
77
como para a área não irrigada com efluente, onde a colonização micorrízica foi de 39%,
para o teor de fósforo foi de 22 mg kg
-1
.
No período de 18 meses de irrigação, a área experimental recebeu 131 kg ha
-1
de fósforo, na forma de superfosfato simples. Embora seja esperada uma menor
colonização micorrízica em áreas com fertilidade adequada para a cultura (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2007), a porcentagem de colonização observada na área pode ser
considerada elevada. Este fato indica que a disponibilidade de nutrientes não está
inibindo a presença do fungo micorrízico, tão pouco a colonização micorrízica e,
possivelmente, a associação contribuiu para a nutrição da planta.
A colonização micorrízica de gramíneas do gênero Cynodon estimula a
produção de pêlos radiculares pela planta, contribuindo na aquisição de nutrientes e
também na agregação do solo, principalmente em solos de textura arenosa (MORENO-
ESPÍNDOLA et al., 2007).
Outra função importante que as micorrizas arbusculares exercem é de proteção a
condições adversas, como a presença de sais no solo (GARCÍA; MENDONZA, 2007) e
metais pesados (LEUNG; YE; WONG, 2007). A maior tolerância à presença de sais
pelas plantas micorrizadas pode estar relacionada com a aquisição de nutrientes,
principalmente fósforo e nitrogênio (GRAHAM, 1986) e mudanças em processos
fisiológicos, como a taxa de transpiração e eficiência no uso da água (RUIZ-LOZANO;
AZCÓN, 2000). Esse benefício promovido pela associação micorrízica é de grande
interesse para áreas que recebem efluentes, devido à alta carga de sais adicionada ao
solo nessas áreas (Tabela 2) e, em regiões com parques industriais, onde se tende
também a adicionar metais pesados, como no México (ORTEGA-LARROCEA et al.,
2001) e na China (ZHANG et al., 2008).
Os estudos avaliando o efeito da irrigação com efluentes de esgoto tratado sobre
os fungos micorrízicos arbusculares são muito restritos (ORTEGA-LARROCEA et al.,
2001; ORTEGA-LARROCEA et al., 2007; HUANG et al., 2005). Avaliando o efeito da
irrigação com esgoto tratado, em dois tipos de solo, no vale do Mezquital, no México,
Ortega-Larrocea et al. (2001) observaram que, independentemente do tipo de solo, a
irrigação com esgoto tratado pelo período de 90 anos reduziu o número de esporos de
FMAs em comparação com áreas irrigadas por apenas 5 anos. Os autores relacionaram
78
esse efeito com o aumento do fósforo e do teor de metais pesados, devido às
características do esgoto tratado utilizado para a irrigação.
A escolha de uma cultura para receber irrigação com efluentes de esgoto tratado,
considerando também os benefícios da associação micorrízica, como a tolerância a
presença de sais no solo e melhor aproveitamento dos nutrientes podem auxiliar no
planejamento do manejo da área irrigada, de forma a promover o crescimento da
cultura e também a aplicação prática do reuso de água.
3.4 Efeito da irrigação com efluente na pastagem de Tifton 85 sobre os atributos
microbiológicos comparado com área de pastagem não-irrigada
Os grupos funcionais de microrganismos ligados ao ciclo do nitrogênio
responderam ao aporte de nutrientes e de material orgânico, presentes no efluente
aplicado ao longo dos 18 meses de avaliação, conforme o resultado do teste de média
(Tabela 8) e da RDA, com seleção de variáveis ambientais.
A densidade populacional de grupos funcionais de microrganismos foi maior nas
áreas irrigadas do que na área de pastagem não irrigada, exceto para fungos totais. A
irrigação com efluente promoveu aumento no Cmic, entretanto, não foi constatado efeito
significativo nos parâmetros de atividade microbiana, como a respiração basal e o
qCO
2
, possivelmente, devido à alta variação desses parâmetros (coeficientes de
variação de 60 e 56,7%, respectivamente). Embora tenha sido observado aumento do
Cmic, a participação deste no carbono total do solo, avaliado pela determinação do
qMIC, não diferiu entre as áreas. Este resultado tem relação com o aumento observado
para o carbono total do solo, apesar diferir da área não irrigada apenas na lâmina com
50% de excesso, o aumento ocasionado pela irrigação foi suficiente para manter a
participação do Cmic no carbono total entre 2,15 a 2,45%.
A acidez ativa do solo diminuiu com a aplicação de efluente, para todas as
lâminas avaliadas (média das quatro lâminas de irrigação: 5,5), diferindo apenas da
área não irrigada com efluente (4,9). Para os cátions trocáveis, as lâminas de irrigação
promoveram aumento significativo no teor de Ca
2+
, reduziu o teor de Mg
2+
na lâmina
com 25% de excesso e o teor de K
+
nas lâminas com 0 e 100% de excesso de
79
irrigação. O teor de Na
+
foi significativamente maior nas áreas irrigadas com efluente,
devido ao aporte desse elemento exclusivamente pelo efluente. Para a relação C:N,
observou-se uma redução nas áreas irrigadas, o que se justifica pela adição de
nitrogênio tanto pela adubação mineral como pela irrigação com efluente.
O aumento no teor de Ca
2+
nas áreas irrigadas é conseqüência do aporte desse
nutriente via efluente (Tabela 2). Para o potássio, embora as áreas irrigadas também
recebessem adubação potássica (item 2.4.2), não apresentaram diferença da área de
pastagem não irrigada e não manejada, exceto a lâmina com 100% de excesso, que
apresentou o menor teor. O manejo aplicado às áreas irrigadas favoreceu a utilização
desse nutriente pelo capim Tifton 85, que apresenta grande demanda por esse
nutriente, conforme comentado no item 3.3.1, o que pode ter contribuído para a
manutenção do teor desse nutriente em valores próximos ao observado na área que
não é manejada nem irrigada.
80
Tabela 8 - Densidade de grupos funcionais de microrganismos, atributos microbiológicos e químicos de
área de pastagem irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0, 25, 50 e
100% de excesso) por 18 meses e área de pastagem não irrigada (NE), no município de Lins,
SP.
Densidade populacional de grupos de microrganismos (Log NMP)
Tratamentos DESN NIT-NH
4
NIT-NO
2
AMO BAC FGO
0% 5,34 a 3,93 a 4,20 a 5,65 a 5,59 a 3,03 a
25% 5,18 a 3,90 a 4,00 a 5,55 a 5,54 ab 3,13 a
50% 5,65 a 3,92 a 3,95 a 5,38 a 5,31 ab 3,19 a
100% 5,41 a 3,89 a 3,98 a 5,18 ab 5,47 ab 3,12 a
NE 3,91 b 2,99 b 3,07 b 4,75 b 5,16 b 2,97 a
CV (%) 8,76 10,52 11,39 6,72 9,30 8,81
Atributos microbiológicos e químicos do solo
Cmic C-CO
2
qMIC qCO
2
NT CT
(mg g
-
1
) (mg kg
-
1
h
-
1
) (%) (mg C-CO
2
g
-
1
Cmic h
-
1
) (g kg
-
1
) (g kg
-
1
)
0% 252,72 a 1,66 a 2,45 a 6,02 a 0,68 ab 10,52 ab
25% 253,63 a 1,64 a 2,41 a 6,78 a 0,69 a 10,73 ab
50% 256,09 a 1,33 a 2,36 a 5,35 a 0,72 a 11,09 a
100% 228,22 ab 1,20 a 2,22 a 5,60 a 0,67 ab 10,44 ab
NE 204,58 b 1,28 a 2,17 a 5,50 a 0,60 b 9,71 b
CV (%) 11,31 60,00 16,69 56,70 14,95 11,12
Atributos químicos do solo
pH (CaCl
2
) Ca
2+
Mg
2+
K
+
Na
+
C:N
- mmol
c
kg
-
1
-
0% 5,54 a 12,30 a 4,27 a 1,55 ab 4,28 a 15,4 a
25% 5,45 a 11,32 a 4,17 b 1,73 a 4,89 a 15,4 a
50% 5,60 a 13,21 a 4,70 a 1,97 a 4,87 a 15,5 a
100% 5,51 a 13,17 a 4,87 a 1,30 b 4,55 a 15,4 a
NE 4,93 b 8,82 b 4,80 a 1,90 a 0,65 b 16,2 b
CV (%) 1,92 14,70 12,83 19,59 10,18 14,33
[CV(%): coeficiente de variação; DESN: desnitrificantes; NIT-NH
4
: oxidantes de amônio; NIT-NO
2
:
oxidantes de nitrito; AMO: amonificantes; BAC: bactérias totais; FGO: fungos totais; Cmic: carbono
microbiano; C-CO
2
: respiração basal do solo; qMIC: quociente microbiano; q CO
2
: quociente metabólico;
NT: nitrogênio total; CT: carbono total; pH: acidez ativa; Ca
2+
: cálcio trocável; Mg
2+
: magnésio trocável;
K
+
: potássio trocável; Na
+
: sódio trocável; C:N: relação carbono:nitrogênio]. Médias seguidas de mesma
letra, na coluna, não diferem entre si, pelo teste LSD (P < 0,05)
A RDA, utilizada para avaliar se há relação entre os atributos microbiológicos e
químicos sobre a densidade populacional de grupos de microrganismos, de áreas de
pastagem irrigada com efluente de esgoto tratado, comparadas com as áreas de
pastagem não irrigada, revelou relações significativas entre eles. Da variabilidade
explicada pelos dois primeiros eixos canônicos, 21% está explicada pelo eixo canônico
1 e 15% pelo eixo canônico 2, totalizando 36% da variabilidade dos dados (Figura 17).
Considerando a influência das variáveis ambientais (atributos químicos e
microbiológicos), a porcentagem da variabilidade representada pelos eixos canônicos 1
e 2 aumenta para 94%, ou seja, correspondendo por grande parte da variabilidade
explicada pelos eixos canônicos. O teste de permutação de Monte Carlo indica que a
relação entre os atributos químicos e microbiológicos sobre a densidade de grupos
81
funcionais de microrganismos é mais forte que a esperada ao acaso (F-ratio = 24,51; P
value = 0,002).
Figura 17 - Análise de redundância (RDA) da densidade de grupos funcionais de microrganismos ligados
ao ciclo do nitrogênio (BAC, bactérias totais; FGO, fungos totais; AMO, amonificantes;
Namo, oxidantes de amônio; Nnit, oxidantes de nitrito; DESN, desnitrificantes), de área de
pastagem de capim Tifton 85 irrigado com lâminas excedentes de efluente de esgoto
tratado (0, 25, 50 e 100% de excesso) e área não-irrigada com efluente (NE) no município
de Lins, SP, Brasil; (setas tracejadas representam as variáveis ambientais: respiração basal
(C-CO
2
), quociente metabólico (qCO
2
), acidez ativa do solo (pH), potássio trocável (K
+
),
cálcio trocável (Ca
2+
), magnésio trocável (Mg
2+
), sódio trocável (Na
+
)
Na seleção de variáveis, o carbono microbiano (Cmic), o quociente microbiano
(qMIC) e os atritubos químicos: Ca
2+
trocável, carbono e nitrogênio total, bem como a
relação C:N foram retiradas da análise por apresentarem efeito de colinearidade (LEPŠ;
ŠMILAUER, 1999).
-1.5 1.5
-1.5 1.5
DESN
Namo
Nnit
FGO
BAC
AMO
pH
Mg
K
Na
CCO2
qCO2
0
25
50
100
NE
Eixo canônico 1 (21% da variabilidade total)
Eixo canônico
2
(
15
% da variabilidade total)
82
A área de pastagem não irrigada (NE) mostrou-se relacionada com os menores
valores de pH, atributos de atividade microbiana, como a respiração basal (C-CO
2
) e
quociente metabólico (qCO
2
) e, teor de Na praticamente irrelevante. As áreas irrigadas
com efluente estão relacionadas com os maiores teores de Na
+
, pH e de atributos
microbiológicos, como qCO
2
e C-CO
2
. As áreas irrigadas com efluente de esgoto
tratado apresentaram maiores valores de densidade de microrganismos, para todos os
grupos avaliados.
A partição da variabilidade dos dados afetada pelos atributos químicos e
microbiológicos mostra que a densidade de grupos funcionais de microrganismos nas
áreas irrigadas com efluente de esgoto tratado e na área de pastagem não irrigada
foram fortemente influenciados pelas variações dos atributos químicos, sendo pouco
expressiva a participação dos atributos microbiológicos e da interação entre ambos
(Tabela 9).
Tabela 9 - Análise de variância multivariada com partição da variabilidade do efeito dos tratamentos (0,
25, 50 e 100% de excesso de irrigação com efluente e área não irrigada) na densidade de
grupos funcionais de microrganismos ligados ao ciclo do nitrogênio (bactérias e fungos totais,
amonificantes, nitrificantes e desnitrificantes). Análise de redundância (RDA) testada por 499
permutações
Fonte de variação % da variância F P
Explicada 38,4 24,51 0,002
**
Atributos químicos 29,3 21,14 0,002
**
Atributos microbiológicos 3,7 9,194 0,002
**
Atributos químicos e microbiológicos 5,4 17,82 0,002
**
Não explicado 61,6 - -
**Significante a 1% para o teste de permutação de Monte Carlo
A densidade dos grupos funcionais de microrganismos é estimulada pela
irrigação com efluente, sendo que as variações dos atributos químicos do solo
ocasionadas pela irrigação, como o pH e os cátions trocáveis, contribuíram
consideravelmente para a resposta dos grupos de microrganismos, observada nas
áreas irrigadas. As lâminas excedentes de irrigação com efluente apresentaram
comportamento semelhante, diferindo apenas da área de pastagem não irrigada.
83
3.5 Perfil do consumo de fontes de carbono pela comunidade microbiana de uma
área de pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas excedentes de efluente
de esgoto tratado
O consumo das fontes de carbono, avaliado pelo metabolismo heterotrófico
médio, não variou entre as lâminas excedentes de efluente, entretanto, as áreas
irrigadas apresentaram maiores valores do que os observados na área de pastagem
que não recebeu irrigação (Figura 19). A fase lag, de crescimento inicial, se concentrou
nas primeiras 20 horas, para todos os tratamentos e, a partir desse ponto, inicia-se a
fase exponencial de crescimento, praticamente igual para as áreas irrigadas com
efluente, que diferiram da área não irrigada. Esta última apresentou uma fase
exponencial mais longa que as áreas irrigadas com efluente. A lâmina controle (0%
excesso) distanciou-se das demais lâminas de irrigação apenas na fase estacionária.
O nível de consumo de substrato, representado pelo parâmetro K, foi mais
elevado na lâmina controle, semelhante às demais áreas irrigadas com efluente,
diferindo apenas da área não irrigada com efluente, que apresentou o menor nível de
consumo de substrato (Tabela 10).
Tempo (horas)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
AWCD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
0%
25%
50%
100%
NE
Figura 19 - Metabolismo heterotrófico médio (média do desenvolvimento de cor do poço - AWCD) de
áreas de passagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0, 25,
50 e 100% de excesso) e área não irrigada com efluente (NE) no município de Lins, SP,
Brasil. As linhas representam o ajuste ao modelo logístico e os pontos representam a média
de cada tratamento
84
Já o parâmetro R, que reflete a taxa de crescimento exponencial da comunidade
bacteriana heterotrófica (ROS et al., 2006), evidencia o efeito diferenciado da aplicação
das lâminas excedentes de efluente, em relação à lâmina controle e à área de
pastagem não irrigada com efluente. O maior tempo para alcançar o ponto médio da
fase exponencial de consumo dos substratos, indicado pelo parâmetro S (ROS et al.,
2006), foi verificado na área de pastagem não irrigada com efluente, sendo que para as
áreas irrigadas, o comportamento foi semelhante ao verificado para o nível de consumo
de substratos, parâmetro K.
Tabela 10 - Parâmetros cinéticos da curva de ajuste do metabolismo heterotrófico médio (K= quantidade
potencial de substrato utilizado, R = taxa de crescimento exponencial e S = tempo para
alcançar o ponto médio da fase exponencial), para área de pastagem irrigada com lâminas
excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses [0 (controle), 25, 50 e 100% de
excesso] e área de pastagem sem irrigação com efluente (NE) no município de Lins, SP,
Brasil. Valores médios e desvio-padrão
Tratramento K R S
0 1,557 + 0,06 a
*
0,082 + 0,014 b 37,079 + 3,01 b
25 1,438 + 0,04 ab 0,098 + 0,015 a 34,910 + 2,27 b
50 1,464 + 0,05 ab 0,096 + 0,027 a 36,856 + 2,77 b
100 1,465 + 0,05 ab 0,097 + 0,016 a 35,579 + 2,55 b
NE 1,353 + 0,08 b 0,053 + 0,099 c 57,679 + 5,01 a
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, pelo teste LSD (P < 0,05)
A análise em escala multidimensional dos parâmetros cinéticos obtidos do ajuste
aos dados de metabolismo heterotrófico médio pode ser observada na Figura 20. O
valor de estresse (0,01) informa que a representação gráfica apresenta baixa
probabilidade de interpretação dos dados de forma errônea.
85
Estresse: 0,01
Figura 20 - Análise em escala multidimensional (NMDS) dos parâmetros cinéticos do MHM de áreas de
pastagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (0, 25, 50
e 100% excesso) e área não irrigada com efluente ( NE), no município de Lins, SP
A análise de similaridade baseada nos parâmetros cinéticos estimados para o
metabolismo heterotrófico médio indicou diferença significativa (R global = 0,468, P <
0,001) e o resultado do teste Pairwise revela que as áreas de pastagem irrigadas com
efluente foram significativamente diferentes da área não irrigada, não sendo observada
variação entre as lâminas excedentes de efluente (Tabela 11).
Tabela 11 - Resultado do teste Pairwise (Estatística R) para os parâmetros cinéticos do metabolismo
heterotrófico médio das áreas de pastagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente
de esgoto tratado [0 (controle), 25, 50 e 100% de excesso] e para a área de pastagem não
irrigada (NE), no município de Lins, SP, Brasil (
**
P < 0,001)
Tratamentos Estatística R
0, 25 0,177
0, 50 0,292
0, 100 0,406
0, NE 1,000
**
25, 50 -0,031
25, 100 -0,067
25, NE 1,000
**
50, 100 -0,146
50, NE 1,000
**
100, NE 1,000
**
A correlação dos parâmetros cinéticos com os atributos químicos do solo e com o
material adicionado via efluente mostrou algumas relações significativas (Tabela 12). O
86
nível de consumo de substrato (K) correlacionou-se positivamente com o carbono
particulado total (CPT) e nitrogênio particulado total (NPT) adicionado via efluente. A
baixa relação C:N (C:N) do efluente foi provavelmente o principal fator que estimulou o
aumento no nível de consumo de substrato.
Tabela 12 - Correlação de Pearson entre os parâmetros cinéticos (K= potencial de substrato utilizado, R
= taxa de crescimento exponencial e S = tempo necessário para alcançar o ponto médio
exponencial) do ajuste ao metabolismo heterotrófico médio com os atributos químicos do
solo [acidez ativa (pH), alumínio trocável (Al), capacidade de troca catiônica (CTC), sódio
trocável (Na), carbono (CT) e nitroênio total (NT)], carbono particulado total (CPT) e
nitrogênio particulado total (NPT) adicionados via efluente
pH CTC Na CT NT CPT NPT
K 0,290 -0,010
0,226 0,103 0,127 0,480
*
0,480
*
R 0,840
**
0,499
*
0,803
**
0,546
*
0,587
**
0,643
**
0,643
**
S -0,841
**
-0,339
-0,940
**
-0,608
**
-0,661
**
-0,818
**
-0,818
**
Coeficientes com *, significativos a 5% e com ** significativos a 1%
A taxa de crescimento exponencial dos microrganismos (R) apresentou
correlação positiva com todos os atributos. A aplicação de efluente promoveu aumento
no pH do solo (média das 4 lâminas de irrigação = 5,5) em comparação a área de
pastagem não irrigada (4,8), fato que, em conjunto com o aumento da capacidade de
troca catiônica, tendem a estimular o crescimento microbiano. A adição de carbono e
nitrogênio via efluente (CPT e NPT), assim como o aumento do CT e NT e o Na trocável
também se relacionaram com o aumento da taxa de crescimento exponencial dos
microrganismos.
A análise de correlação entre os atributos químicos do solo e do efluente com o
tempo necessário para alcançar o ponto médio de crescimento exponencial (S) teve um
comportamento oposto ao apresentado pela taxa de crescimento exponencial (R), o que
reflete a relação inversa entre esses dois parâmetros, ou seja, uma maior taxa de
crescimento exponencial corresponde a um menor tempo para alcançar o ponto médio
de crescimento microbiano.
Com relação aos diferentes grupos de substrato, os parâmetros cinéticos dos
ajustes obtidos apresentaram comportamento variado para as áreas irrigadas com
lâminas excedentes e para a área de pastagem não irrigada. Os grupos de substratos
que indicaram as maiores diferenças entre os tratamentos foram: as aminas e as
87
miscelânias, para os parâmetros K e R, e também os carboidratos, para o parâmetro S.
Os maiores valores de K foram observados para o grupo amina, onde apenas a lâmina
com 25% de excesso diferiu das demais e, os menores para o grupo de miscelâneas,
com a lâmina controle diferindo apenas da área de pastagem não irrigada com efluente
(Tabela 13).
Os valores da taxa de crescimento exponencial (R) dentro de cada grupo de
substrato foram influenciados pelas lâminas de irrigação com efluente, exceto o grupo
dos aminoácidos. A maior variação entre os tratamentos ocorreu no grupo das
miscelâneas, que também apresentou as menores taxas de utilização de substratos (K).
O parâmetro S, que representa o tempo necessário para alcançar o ponto médio
exponencial, variou significativamente em função das lâminas de efluente aplicadas
para os grupos: carboidratos, aminas e miscelâneas, com os maiores valores
observados para o grupo dos carboidratos e os menores para o grupo das miscelâneas.
88
Tabela 13 - Parâmetros cinéticos da curva de ajuste (K: potencial de substrato utilizado, R: taxa de
crescimento exponencial e S: tempo necessário para alcançar o ponto médio exponencial)
dos grupos de substratos (AAS: aminoácidos, CHO: carboidratos, COOH: ácidos
carboxílicos, -NH
2
: aminas, POL: polímeros e MISC: miscelâneas), para área de pastagem
irrigada com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses [0 (controle),
25, 50 e 100% de excesso] e área de pastagem sem irrigação com efluente (NE), no
município de Lins, SP, Brasil
Tratamentos AAS CHO COOH -NH
2
POL MISC
K
0% 1,170a 1,121a 1,002a 1,130a 0,993a 0,896a
25% 1,177a 1,058ab 0,944a 0,940 b 0,997a 0,796ab
50% 1,062a 0,915 b 0,972a 1,137a 0,933a 0,632ab
100% 1,050a 1,101ab 0,942a 1,175a 1,073a 0,577ab
NE 1,054a 1,252 a 0,912a 1,183a 1,071a 0,465 b
R
0% 0,868a 1,076 bc 1,076 bc 0,627 bc 1,352a 0,768 bc
25% 1,018a 0,941 bc 0,941 bc 1,434a 0,971ab 1,132 abc
50% 0,960a 0,789 c 0,789 c 0,795 b 1,394a 1,393 ab
100% 1,651a 1,243 ab 1,243ab 0,601bc 0,355 b 1,707 a
NE 1,338a 1,473 a 1,473a 0,408 c 0,333 b 0,669 c
S
0% 1,431a 1,342ab 0,949a 0,823 bc 1,065a 0,749a
25% 1,360a 0,966ab 1,105a 0,393 c 0,905a 0,511 b
50% 0,986a 0,714 b 0,849a 0,727 b 0,852a 0,710a
100% 0,900a 1,312ab 0,972a 0,692 b 1,145a 0,376 c
NE 1,022a 1,612a 0,850a 1,058a 1,186a 0,409 bc
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, pelo teste LSD (P < 0,05)
Diferente do observado neste trabalho, Bossio e Scow (1995), avaliando o efeito
do aumento do teor de água no solo e da adição de palha de arroz como resíduo
orgânico, verificaram maior utilização de carboidratos associado com a adição de
resíduos orgânicos e uma menor utilização de carboidratos e ácidos carboxílicos com o
aumento no teor de água no solo. Para o grau de consumo de substrato ou parâmetro
K, observou-se que a aplicação de lâminas de efluente promoveu diferenças apenas na
utilização do grupo de miscelâneas de substratos, em relação à área de pastagem não
irrigada, diferença que também se manteve nos demais parâmetros cinéticos avaliados.
Este resultado indica uma possível relação com os compostos orgânicos adicionados
via efluente com os compostos que representam o grupo de miscelânias, como os
polímeros (tween 40 e tween 80), favorecendo o consumo desses compostos pela
comunidade microbiana presente nas áreas irrigadas.
Na avaliação da diversidade funcional da comunidade microbiana heterotrófica,
baseada na capacidade de utilização dos diferentes substratos, constatou-se que a
89
disposição de efluente de esgoto teve efeito significativo sobre a riqueza de substratos
(Ss) e a diversidade de consumo de substratos, estimada pelo índice de diversidade de
Shannon (H). A riqueza de substratos foi maior para as áreas irrigadas do que para a
área de pastagem não irrigada, a partir das 48 horas de incubação (Figura 21a), com
maior Ss consumidos nas áreas irrigadas com efluente, destacando-se a lâmina com
25% de excesso após 120 horas de incubação.
Já para o índice H, observou-se efeito significativo a partir das 12 horas de
avaliação até o período de 96 horas de incubação (Figura 21b), com os maiores valores
para as áreas irrigadas (3,22) com efluente e o menor valor para a área não irrigada
(2,43). Apenas na avaliação realizada após 144 horas de incubação a área não irrigada
com efluente apresentou H maior que as demais áreas.
O solo é reconhecido como um ambiente oligotrófico, ou seja, um meio com
disponibilidade restrita de substratos para os organismos que nele habitam (LAVELLE;
SPAIN, 2005). A incubação de suspensões de solo em meios ricos em substratos de
fácil degradação, como na avaliação do consumo de substratos com placas Ecoplate,
favorece o crescimento de microrganismos copiotróficos, capazes de crescer
rapidamente (BUYER; ROBERTS; RUSSEK-COHEN, 2002) em detrimento aos
oligotróficos, que consomem substratos mais complexos e apresentam uma taxa de
crescimento mais lenta.
Esse conceito pode estar relacionado com os aumentos observados no índice H,
para a área de pastagem não irrigada, em relação às áreas irrigadas com lâminas
excedentes de efluente. O favorecimento dos microrganismos copiotróficos ficou mais
evidente nas áreas irrigadas, que apresentaram uma taxa de crescimento exponencial
significativamente maior que a área de pastagem não irrigada (Tabela 10). Este rápido
crescimento pode ter resultado no esgotamento dos substratos mais disponíveis nas
amostras das áreas irrigadas com efluente, o que provavelmente não ocorreu para a
área de pastagem não irrigada.
90
Figura 21 - a) Riqueza (Ss) e b) Índice de diversidade de Shannon (H) das áreas de pastagem irrigadas
com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado [0 (controle), 25, 50 e 100% de
excesso] e para a área de pastagem não irrigada (NE), no município de Lins, SP, Brasil (P <
0,001)
O uso de placas Ecoplate em estudos da comunidade microbiana tem sido pouco
explorado na avaliação do impacto da irrigação com efluentes (GELSOMINO et al.
2006; ZHANG et al. 2008). O potencial funcional da comunidade microbiana, avaliado
a)
b)
ab
ab
b
b
b
c c
b
a
a
a
a
ab ab
a
ab
a
a
a
a
a
ab
b
a
a
a
bc
bc
ab
b
a
a
a
bc
bc
0
5
10
15
20
25
12 24 48 72 96 120 144
Riqueza (Ss)
Tempo de incubação (horas)
NE
0
25
50
100
b
b
b
b
b
a
a
a
a
a
a
a
a
ab
a
a
a
a
a
a
b
a
a
a
a
a
a
b
a
a
a
a
a
a
bc
0
1
2
3
4
12
24
48
72
96
120
144
Índice de diversidade de Shannon (H)
Tempo de incubação (horas)
NE 0 25 50 100
91
com Ecoplates, tem sido considerado rápido e útil para a obtenção de informações
sobre a dinâmica fisiológica de microrganismos em diferentes solos (CLASSEN et al.,
2003; GOBERNA et al., 2005), em solos sob diferentes condições de manejo
(GOVAERTS et al., 2007) e sob o impacto de potenciais contaminantes do solo (ROS et
al. 2006).
Em estudo avaliando o efeito de recorrentes inundações de áreas agrícolas com
efluentes sobre a comunidade microbiana, Gelsomino et al. (2006) utilizaram a análise
do perfil fisiológico da comunidade com placas Ecoplate, além de um conjunto de
técnicas moleculares (DGGE, ARDRA). Estes autores verificaram que, conforme o
observado neste trabalho, a avaliação da comunidade com as placas Ecoplate foi capaz
de discriminar as áreas sob recorrente inundação daquelas áreas não-inundadas.
Neste trabalho, a avaliação do metabolismo heterotrófico médio possibilitou
observar que a aplicação de efluente modificou a resposta fisiológica da comunidade
microbiana em comparação à área de pastagem não irrigada, resultado diretamente
ligado ao carbono e nitrogênio adicionado via efluente nessas áreas. Este fato também
foi observado por Zhang et al. (2008). Estes autores verificaram que a irrigação com
efluente proporcionou aumento significativo na utilização de fontes de carbono, avaliada
por placas Ecoplate, em comparação com áreas irrigadas com água subterrânea,
entretanto, não observaram diferença significativa entre as áreas para o índice de
diversidade de Shannon, embora a área irrigada tenha apresentado um maior valor
(3,15) em comparação à área irrigada com água subterrânea (2,85).
O comportamento observado para o metabolismo heterotrófico médio se refletiu
nas análises em escala multidimensional e de similaridade, baseadas nos parâmetros
cinéticos. Na avaliação da diversidade funcional, estimada pela riqueza de substratos e
pelo índice de diversidade de Shannon, também se constatou o efeito da irrigação com
efluente, onde não só a quantidade de carbono adicionado, como também a qualidade
desse material pode ter contribuído para o efeito significativo nestes parâmetros.
O uso da análise em escala multidimensional (NMDS), seguida da análise de
similaridade (ANOSIM) possibilitaram constatar diferenças significativas entre as áreas
irrigadas com efluente e a área de pastagem não irrigada. A NMDS empenha-se em
posicionar os dados em uma representação gráfica em duas dimensões, combinando
92
as similaridades calculadas a partir de uma matriz triangular de similaridade, para cada
par de amostras (MANLY, 2005). De forma diferente da análise de componentes
principais (ACP), que permite observar as associações entre as áreas em estudo e uma
ou mais variáveis, esta análise apresenta a vantagem da aplicação do teste estatístico
Pairwise, que calcula a estatística R e compara os pares de tratamentos, fornecendo a
significância da relação entre os mesmos.
O aumento no pH do solo observado após 18 meses de aplicação de efluente
está de acordo com o observado por Fonseca et al. (2007a). Esse fato que pode estar
relacionado com o alto pH do efluente e com o estímulo à atividade de mineralização,
proporcionada pelas condições favoráveis de umidade e de disponibilidade de substrato
no solo. Entretanto, a ausência de efeito também pode ser observada (RUSAN et al.,
2007), devido ao poder tampão do solo. Esta prática também promoveu aumento na
capacidade de troca catiônica e diminuição do alumínio trocável, em comparação com a
área de pastagem não irrigada (dados não apresentados), corroborando com as
observações anteriores em áreas irrigadas com efluente (FONSECA et al., 2007a,
2007b).
A correlação positiva do Na
+
com a taxa de crescimento exponencial dos
microrganismos é um resultado conflitante com o que é relatado na literatura (RIETZ;
HAYNES, 2003). Esses autores verificaram efeito negativo do aumento dos níveis de
Na
+
trocável sobre a atividade dos microrganismos, avaliada pela taxa de amonificação
e da hidrólise do diacetato de fluoresceína. Esse fato está possivelmente relacionado a
um efeito de ‘confundimento’ com o efeito observado tanto para o NT, como para o
nitrogênio particulado total (NPT), adicionado via efluente. Esses dois parâmetros
apresentaram correlação positiva altamente significativa (0,77 para NT e 0,87 para
NPT) com o Na
+
. Dessa forma, o efeito positivo observado sobre a taxa de crescimento
exponencial dos microrganismos não pode ser considerado um efeito real, pois o Na
+
é
adicionado ao solo na mesma proporção que o nitrogênio particulado total.
A pesquisa sobre prática de irrigação com efluente de esgoto tratado tem
ganhado estímulo em face da crescente preocupação com a disponibilidade de
recursos hídricos para a agricultura (MARRIS, 2008) e, além de fatores relacionados
aos atributos químicos (RUSAN et al., 2007) e físicos do solo (WARRINGTON et al.
93
2007), o estudo do impacto dessa atividade sobre a comunidade microbiana e seu
potencial fisiológico tende a somar informações que podem futuramente fornecer
parâmetros como diretrizes do potencial de reuso agrícola de efluentes de esgoto
tratado.
O interesse agrícola nessa atividade de reuso é conseqüência dos ganhos
econômicos com o suprimento parcial de nutrientes através da irrigação com efluentes
(FONSECA et al., 2007b), mas esta atividade também representa uma ação de
interesse ambiental, pois tende a aliviar a pressão sobre os recursos hídricos
disponíveis, por ser o efluente de esgoto tratado uma fonte de água de reuso constante,
podendo inclusive, ser considerada na determinação do valor de mercado do produto
final (TOZE, 2006).
As avaliações das mudanças nos atributos do solo, em curtos períodos de
condução de um determinado manejo, como a irrigação com águas residuárias, é
crucial para determinar a viabilidade desta atividade e, a escolha das variáveis a serem
avaliadas deve levar em consideração não só atributos relacionados com a fertilidade
do solo e com a sua estrutura, mas também apresentar uma capacidade de rápida
resposta a mudanças de uso no solo, como os parâmetros microbiógicos (BENDING et
al., 2004). Todavia, o acompanhamento da prática de irrigação com águas de reuso
deve ser executado em longo prazo, a fim de avaliar a capacidade de suporte do
sistema solo-planta-ambiente. Áreas bem manejadas e monitoradas demonstram a
viabilidade do reuso agrícola (RUSAN et al., 2007) e estimulam o desenvolvimento de
modelos e ferramentas que auxiliem na tomada de decisão (HIDALGO et al., 2007),
sem deixar de considerar os riscos que esta prática envolve, concernentes com a saúde
humana (SALGOT et al., 2006).
3.6 Diversidade genética de bactérias oxidantes de amônio
Os produtos da amplificação do gene amoA, de DNA de amostras de solo das
áreas de pastagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado: 0,
25, 50 e 100% de excesso, foram separados na análise de DGGE. Uma vez que o
94
padrão de bandas obtido para as repetições de cada tratamento foi bastante similar,
apenas uma amostra representativa de cada tratamento foi utilizada na análise. A partir
desse gel, foram cortadas as bandas selecionadas para posterior seqüenciamento
(Figura 22).
A análise do gel de DGGE mostra que o padrão de bandas obtido para as
amostras das áreas de pastagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente de
esgoto tratado foram similares para a lâmina com 25 (número 8) e com 50% (número
11) de excesso de irrigação. Um padrão de banda diferente foi observado na amostra
do tratamento controle (número 2), com 0% de excesso de irrigação (Figura 22).
Figura 22 - DGGE de amplicons do gene amoA de amostras de solo de área de pastagem irrigada com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado; marcador (M); Nitrosospira multiformis
(controle positivo); 15: 100% de excesso; 11: 50% de excesso; 8: 25% de excesso; 2: 0% de
excesso de efluente de esgoto tratado
As seqüências de DNA do gene amoA das bandas selecionadas foram alinhadas
com seqüências de bactérias oxidantes de amônio pertencentes ao gênero Nitrosospira
sp., sendo construídas as árvores filogenéticas para “Neigbour-joining” (Figura 23),
“Minimum evolution” (Figura 24) e “Maximum parsimony” (Figura 25).
1
3
4
5
6
2
1
95
Figura 23 - Árvore filogenética baseada na seqüência do gene amoA de amostras de solo irrigado com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (bandas 1, 2, 3, 4, 5 e 6) e isolados
disponíveis no GenBank, construída pelo método “Neigbour-joining”, árvore consenso de
bootstraps, utilizando 1000 replicações
Figura 24 - Árvore filogenética baseada na seqüência do gene amoA de amostras de solo irrigado com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (bandas 1, 2, 3, 4, 5 e 6) e isolados
disponíveis no GenBank, construída pelo método “Minimum evolution”, árvore consenso de
bootstraps, utilizando 1000 replicações
96
Figura 25 - Árvore filogenética baseada na seqüência do gene amoA de amostras de solo irrigado com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado (bandas 1, 2, 3, 4, 5 e 6) e isolados
disponíveis no GenBank, construída pelo método “Maximum parsimony”, árvore consenso
de bootstraps, utilizando 1000 replicações
A análise das seqüências revelou que as bandas 2 e 6, que se encontravam na
mesma posição no gel de DGGE, referentes as áreas irrigadas com 0 e com 100% de
excesso, foram filogeneticamente associadas (94% de similaridade) com o clone AP-54,
seqüenciado por Dell et al. (2006), isolado de área de capim-Bermuda (Cynodon
dactylon × transvalensis) (Figura 23).
Essas duas bandas também se relacionaram, com 80% de similaridade, com a
banda 1, da lâmina com 0% de excesso de irrigação (Figura 23). As demais bandas (3,
4 e 5), referentes a área com 25% de excesso de irrigação com efluente, formaram um
grupo separado, com 86% de similaridade (Figura 23) com o grupo das bandas 1, 2 e 6.
As amostras das áreas de pastagem irrigada com efluente de esgoto tratado
apresentaram 79% de similaridade com o isolado Nitrosospira sp., obtido por Aakra et
al. (2001), em um solo de textura médio-arenosa no Zâmbia, África.
As seqüências obtidas neste estudo estão relacionadas filogeneticamente com
bactérias do gênero Nitrosospira, conhecido como o mais comum entre as bactérias
oxidantes de amônio encontradas no solo (OVED et al., 2001). Dentre os fatores que
97
determinam a estrutura das populações de bactérias oxidantes de amônio destacam-se
o pH e a concentração de sais no ambiente. Diferentes espécies de Nitrosospira têm
sido encontradas em solos neutros e ácidos (STEPHEN et al., 1998; STEPHEN et al.,
1996).
Diferente do observado neste trabalho, no qual todas as amostras das áreas
irrigadas com efluente apresentaram similaridade com espécies de Nitrosospira, Oved
et al. (2001) encontraram dominância do gênero Nitrosomonas em solos cultivados com
milho e irrigados com efluente por um ano, enquanto o gênero Nitrosospira foi
dominante nos solos irrigados e com adição de fertilizante mineral.
Em estudo avaliando a irrigação de campos de golfe cultivados com Cynodon
dactylon e Lolium perenne com diferentes fontes de água (água de poço, efluente de
tratamento terciário de esgoto e água do rio Colorado), na Califórnia, constatou-se que
a atividade e a diversidade de bactérias oxidantes de amônio foram reduzidas pela
salinidade da água utilizada na irrigação, durante um período de mais de 10 anos
(CANTERA; JORDAN; STEIN, 2006). Os autores afirmaram que a reduzida diversidade
desse grupo de bactérias indica o seu potencial como parâmetro sensível para
avaliação do efeito da salinidade e recomendam o efluente de esgoto tratado como
fonte de irrigação menos prejudicial, dentre as fontes disponíveis, a esse grupo e a sua
atividade no solo.
3.7 Síntese dos resultados
A avaliação durante o período de 18 meses da prática de irrigação com efluente
de esgoto tratado, aplicando lâminas excedentes em até 100% da capacidade de água
disponível para a pastagem, buscou informações a respeito do impacto dessa prática
na comunidade microbiana, em especial nos grupos funcionais de microrganismos
ligados ao ciclo do nitrogênio, bem como o potencial metabólico dessa comunidade,
estudado com as placas Biolog.
Quando comparados os tratamentos neste curto período de avaliação, a
aplicação da lâmina excedente acima de 25% de excesso de irrigação promoveu
98
redução na densidade populacional de bactérias amonificantes e estimulou o
crescimento de bactérias desnitrificantes. Uma vez mantido esse cenário, este resultado
implica em um monitoramento das funções relacionadas a esses grupos: a
amonificação e a desnitrificação, a fim de avaliar o impacto dessas práticas nessas
funções e possíveis efeitos adversos ocasionados por esse manejo.
As mudanças nos atributos químicos e microbiológicos do solo, promovidos pela
aplicação das lâminas excedentes de irrigação com efluente, também influenciaram na
densidade de grupos funcionais de microrganismos. A aplicação de lâminas excedentes
de efluente no período de 18 meses estimulou a capacidade metabólica da comunidade
microbiana, avaliada pelas placas Biolog.
4 CONCLUSÕES
A irrigação da área de pastagem de capim Tifton 85 com lâminas excedentes de
efluente de esgoto tratado durante 18 meses promoveu alterações nas características
químicas, na atividade microbiana, na capacidade metabólica e na densidade de grupos
funcionais de microrganismos.
Com relação aos atributos químicos, a aplicação das lâminas excedentes de
efluente de esgoto tratado, avaliada em conjunto com o efeito promovido pela
precipitação, diminuiu a acidez ativa do solo e aumentou os teores de cálcio e sódio
trocáveis, ainda reduziu os teores de magnésio e potássio trocáveis na maior lâmina de
irrigação.
A análise de curva de resposta principal possibilitou constatar que os grupos
funcionais dos amonificantes e desnitrificantes foram os mais influenciados pela
aplicação das lâminas excedentes de efluente, sendo a lâmina com 25% de excesso a
que apresentou as menores variações na densidade dos grupos funcionais, em
comparação à lâmina controle.
Os atributos químicos: pH, Ca
2+
, Mg
2+
, K
+
e Na
+
, os atributos microbiológicos:
carbono microbiano, respiração induzida por substrato e quociente microbiano
99
contribuíram para a variabilidade da densidade de grupos funcionais de microrganismos
de áreas de pastagem irrigadas com lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado.
A irrigação com efluente promoveu um estímulo na densidade populacional dos
grupos funcionais de microrganismos, comparada com a área de pastagem não
irrigada.
O potencial metabólico, avaliado pela cinética de consumo de substrato, foi
estimulado pela irrigação da área de pastagem com lâminas excedentes de efluente de
esgoto tratado, comparado com o potencial da área de pastagem não irrigada.
Entretanto, as lâminas excedentes não apresentaram diferença no potencial metabólico.
Não existem indícios de mudanças na estrutura das populações de bactérias
oxidantes de amônio do solo de área de pastagem de capim Tifton 85, irrigado com
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses, com dominância de
bactérias do gênero Nitrosospira.
A colonização micorrízica do capim Titfton 85 não foi afetada pela aplicação de
lâminas excedentes de efluente de esgoto tratado por 18 meses.
Analisando os resultados como um todo, concluiu-se que a aplicação de lâminas
excedentes de irrigação com efluente em até 25% não promove grandes alterações na
comunidade microbiana do solo e lâminas acima desse valor, podem promover acúmulo
de sódio no solo, estimular o crescimento de bactérias desnitrificantes e inibir o
crescimento de bactérias amonificantes, para solos com características semelhantes.
Considerações Finais
Nas condições estudadas, a irrigação com efluente de esgoto tratado, excedente
em até 25% da lâmina de irrigação recomendada para o capim Tifton 85 pode ser
considerada adequada para suprir a demanda hídrica da cultura sem ocasionar
variações significativas nos atributos microbiológicos e químicos avaliados. Entretanto,
a definição da aplicação de uma lâmina de irrigação excedente com efluente de esgoto
tratado, para uma determinada cultura, deve levar em consideração não só a avaliação
dos atributos químicos e microbiológicos da camada superficial do solo, mas também
100
um estudo em longo prazo dos atributos químicos e físicos, ao longo do perfil do solo, o
monitoramento do lençol freático da área, bem como a produtividade da cultura que se
pretende irrigar. Dessa forma, após uma análise conjunta de todos esses parâmetros é
possível partir-se para um posicionamento sobre viabilidade econômica e ambiental
dessa prática.
101
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2008.
119
ANEXOS
120
ANEXO A - Equações de regressão múltipla para as variáveis do solo de área de
pastagem de capim Tifton 85 irrigada com lâminas excedentes de efluente
de esgoto tratado por 18 meses, no município de Lins, SP (LA = lâmina
acumulada; PA = precipitação acumulada).
Equações de regressão R
2
Parâmetros químicos
pH = 5,12 + 0,00034*LA + 0,00072*PA - 0,00000033*LA
2
– 0,00000041*PA
2
0,581
Ca = 11,22 + 0,00201199*LA - 0,00016062*PA - 0,00000040*PA*LA 0,543
Mg = 7,03 * 0,0014*LA – 0,00503*PA + 0,000001073*PA
2
0,445
K = 2,69 - 0,000000383*LA
2
- 0,001010871*PA + 0,000000589*PA
2
0,281
Na = 9,03 - 0,0072*PA + 0,0017*LA + 0,000001591*PA*LA +0,000001362*PA
2
-
0,000001477*LA
2
0,506
C:N = 12,13 + 0,00617*LA – 0,0000035*LA
2
+ 0,0000248*LA*PA – 0,00000103*PA
2
0,643
Parâmetros microbiológicos
Cmic = 122,35 -0,099*LA + 0,295*PA + 0,000102*LA*PA – 0,0001296*PA
2
0,431
Grupos funcionais de microrganismos
NIT-NH
4
= 2,31 + 0,002*LA – 0,00001533*LA
2
+ 0,000001358*LA*PA – 0,000000654*PA
2
0,566
NIT-NO
2
= 2,33 + 0,0019*LA – 0,000001598*LA
2
+ 0,000001378*LA*PA – 0,000000654*PA
2
0,533
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