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MACKELLY SIMIONATTO
ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS DE CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
PARA CONTROLE DE QUALIDADE
CURITIBA
2009
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MACKELLY SIMIONATTO
ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS DE CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
PARA CONTROLE DE QUALIDADE
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre
em Ciências Farmacêuticas, Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Setor de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Aguinaldo José do
Nascimento
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Suely
Soares
CURITIBA
2009
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AGRADECIMENTOS
A Deus.
À minha família.
À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Marilis Dallarmi Miguel, pelo incentivo e apoio em um momento especial.
Aos meus orientadores, que me acolheram de braços abertos e sempre
compreensivos: o prestativo professor Aguinaldo, pela sua atenção, seus
conhecimentos fabulosos em estatística e informática e seu espírito bem humorado;
a pacienciosa professora Maria Suely, pela sua preocupação, carinho e seus
conhecimentos em hematologia.
À toda equipe do Laboratório Pontagrossense de Análises Clínicas.
À Michele Ana Flores Chaves pela grande ajuda, disponibilidade e dedicação.
Às colegas de pós-graduação, Adélia Grzybowski, Débora Regina Daga e Luciane
Tucholski, pela amizade e hospitalidade em minhas passagens por Curitiba.
À Regina Montrezol, pelo seu dinamismo.
A todos que cooperaram para a realização do trabalho.
MACKELLY SIMIONATTO
Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal do Paraná, Farmacêutica da Prefeitura Municipal de
Carambeí, atuou como Farmacêutica Bioquímica no Laboratório Pontagrossense de
Análises Clínicas de 1999 a 2007 e, professora colaboradora do Departamento de
Análises Clínicas da Universidade Estadual de Ponta Grossa de 2000 a 2005.
Especialista em Microbiologia Clínica pela Universidade Estadual de Ponta Grossa
em 1999, Graduada em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Estadual de
Ponta Grossa em 1998.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO........................................................................................14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................17
2.1 RETICULÓCITOS ...................................................................................18
2.2 ERITROPOIESE .....................................................................................20
2.3 CONTAGEM DE RETICULÓCITOS........................................................22
2.3.1 Aplicações da determinação de reticulócitos para o diagnóstico e
monitoração de doenças hematológicas.................................................22
2.3.2 Metodologias empregadas para a contagem de reticulócitos..................24
2.3.2.1 Contagem de reticulócitos através de metodologia manual....................25
2.3.2.2 Contagem de reticulócitos por métodos eletrônicos................................29
2.3.3 Formas de apresentação dos resultados das contagens de reticulócitos...
................................................................................................................33
2.4 CONTROLE DE QUALIDADE EM LABORATÓRIO CLÍNICO................35
2.4.1 Controle de qualidade interno e externo .................................................37
2.4.2 O Emprego da estatística no controle de qualidade em hematologia..... 40
2.4.3 Importância do estudo dos erros e do controle de qualidade em
contagens de reticulócitos......................................................................41
3 OBJETIVOS............................................................................................43
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................44
3.2 OBJETIVOS SECUNDÁRIOS.................................................................44
4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................45
4.1 MATERIAL ..............................................................................................46
4.2 MÉTODOS..............................................................................................47
4.2.1 Local de realização dos procedimentos ..................................................47
4.2.2 Reagentes...............................................................................................48
4.2.3 Preparo das soluções corantes...............................................................48
4.2.4 Coleta de amostras.................................................................................49
4.2.5 Métodos empregados..............................................................................49
4.2.5.1 Eritrograma..............................................................................................49
4.2.5.2 Contagem manual de reticulócitos..........................................................49
4.2.5.2.1 Padronização do corante ........................................................................50
4.2.5.2.2 Padronização da técnica de preparo de extensões em lâmina...............52
4.2.5.2.3 Padronização da contagem de reticulócitos em microscópio
óptico......................................................................................................53
4.2.5.3 Metodologia automatizada ......................................................................55
4.2.6 Experimentos ..........................................................................................56
4.2.6.1 Estudo da variação inter-observadores para a contagem manual de
reticulócitos .............................................................................................56
4.2.6.2 Estudo comparativo da contagem de reticulócitos pelos métodos
manual e automatizado...........................................................................57
4.2.6.3 Estudo comparativo entre contagens de reticulócitos automatizadas
com o emprego de reagentes do fabricante do aparelho e de diluentes-
corantes preparados no laboratório.........................................................57
4.3 ANALISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS................................. ......58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................59
5.1 ESTUDO DAS ANÁLISES INTER-OBSERVADORES............................60
5.2 ESTUDO DE COMPARAÇÃO ENTRE METODOLOGIA MANUAL E
AUTOMATIZADA ....................................................................................68
5.3 ESTUDO DE COMPARAÇÃO ENTRE CORANTES DA
METODOLOGIA AUTOMATIZADA.........................................................75
6 CONCLUSÕES.......................................................................................83
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................85
ANEXOS.................................................................................................92
ANEXO 1. MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E
ESCLARECIDO ENTREGUE A PACIENTES PARTICIPANTES DO
ESTUDO ..............................................................................................93
ANEXO 2. APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA ENVOLVENDO SERES
HUMANOS PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DO SETOR
DA SAÚDE DA UFPR...........................................................................95
ANEXO 3. PLANILHA DE ORIENTAÇÃO E TRANSCRIÇÃO DE RESULTADOS
APLICADA AOS LABORATÓRIOS DE CLÍNICAS PARTICIPANTES 96
ANEXO 4. PLANILHA DE AVALIAÇÃO APLICADA AOS LABORATÓRIOS DE
ANÁLISES CLÍNICAS PARTICIPANTES DA ANÁLISE INTER-
OBSERVADORES PARA A CONTAGEM MANUAL DE
RETICULÓCITOS ................................................................................97
ANEXO 5. DADOS OBTIDOS POR MEIO DE INSTRUMENTO DE AVALIAÇÃO
SOBRE A PARTICIPAÇÃO EM PROGRAMAS DE CONTROLE DE
QUALIDADE, A CERTIFICAÇÃO, UTILIZAÇÃO DE
PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO E REALIZAÇÃO DE
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS POR MÉTODO DE
AUTOMATIZAÇÃO DE 10 LABORATÓRIOS PARTICIPANTES NA
REGIÃO DOS CAMPOS GERAIS (PR). ..............................................98
ANEXO 6. INFORMAÇÕES QUANTO AOS CRITÉRIOS DE EXECUÇÃO,
IDENTIFICAÇÃO E CONTAGENS DE RETICULÓCITOS
FORNECIDOS PELOS OBSERVADORES DO TRABALHO E DOS
LABORATÓRIOS PARTICIPANTES....................................................99
ANEXO 7. PARECER DE ACEITAÇÃO PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGO........100
ANEXO 8. ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA BRASILEIRA
DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA (pdf) ....................................101
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. ESQUEMA DE HEMOPOIESE..........................................................22
FIGURA 2. FÓRMULAS ESTRUTURAIS DOS CORANTES AZUL DE
METILENO NOVO E AZUL DE CRESIL BRILHANTE.......................50
FIGURA 3. ASPECTO MORFOLÓGICO DE RETICULÓCITOS PELAS
COLORAÇÕES AZUL DE CRESIL BRILHANTE (ACB) E AZUL DE
METILENO NOVO (AMN) EM MICROSCOPIA ÓPTICA DE
IMERSÃO (x1000).............................................................................52
FIGURA 4. CORRELAÇÃO PARA AS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%)
ENTRE OS EXAMINADORES K E L.................................................64
FIGURA 5. PERFIL DA AVALIAÇÃO DAS 25 LÂMINAS PARA A CONTAGEM
DE RETICULÓCITOS (%) DOS 12 AVALIADORES PELOS
GRÁFICOS DE CONTROLE DE QUALIDADE..................................65
FIGURA 6. GRÁFICO DE DISPERSÃO PARA OS VALORES DE CONTAGENS
DE RETICULÓCITOS (%) DE TODOS EXAMINADORES PARA
TODAS AS LÂMINAS........................................................................66
FIGURA 7. GRÁFICO DAS MÉDIAS DAS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS
(%) ENTRE METODOLOGIA MANUAL E AUTOMATIZADA ............70
FIGURA 8. HISTOGRAMA DE FREQÜÊNCIA DOS DADOS OBTIDOS PELO
MÉTODO MANUAL E AUTOMATIZADO PARA A CONTAGEM DE
RETICULÓCITOS(%) ........................................................................71
FIGURA 9. HISTOGRAMA DE FREQÜÊNCIA COM TODOS OS RESULTADOS
OBTIDOS PELAS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%) ............72
FIGURA 10. GRÁFICO DE DISPERSÃO DE COMPARAÇÃO ENTRE OS
DADOS DA METODOLOGIA MANUAL E AUTOMATIZADA PARA
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%)............................................73
FIGURA 11. GRÁFICO DA ANÁLISE DE REPETIÇÕES DOS DADOS OBTIDOS
PELA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%) COM O CORANTE
AZUL DE METILENO NOVO 1:10 EM 50 AMOSTRAS.....................77
FIGURA 12. GRÁFICO DA DISPERSÃO DA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
DE AMOSTRAS DE PACIENTES COM O USO DOS CORANTES
COMERCIAL E AZUL DE METILENO NOVO NA DILUIÇÃO 1:10 ...78
FIGURA 13. GRÁFICO DAS MÉDIAS DA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
DOS PACIENTES COM O USO DO CORANTE COMERCIAL E
AZUL DE METILENO NOVO ............................................................79
FIGURA 14. CORRELAÇÃO PARA AS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%)
EM ANÁLISE DE COMPARAÇÃO ENTRE OS DADOS OBTIDOS
COM O CORANTE COMERCIAL E O AZUL DE METILENO NOVO
1:10.....................................................................................................80
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. CONTAGEM MANUAL DE RETICULÓCITOS: INFLUÊNCIA DA
PORCENTAGEM DE ERRO E NÚMERO DE ERITRÓCITOS NA
EXATIDÃO DAS CONTAGENS............................................................26
TABELA 2. CONTAGEM MANUAL PELO MÉTODO DE MILLER:
PORCENTAGEM DE RETICULÓCITOS EM FUNÇÃO DO NÚMERO
DE ERITRÓCITOS CONTADOS..........................................................27
TABELA 3. VOLUME GLOBULAR EM FUNÇÃO DO TEMPO DE MATURAÇÃO
DOS RETICULÓCITOS NO SANGUE PERIFÉRICO...........................35
TABELA 4. COMPARAÇÃO DE RESULTADOS DE CONTAGENS
RELATIVAS DE RETICULÓCITOS ENTRE CORANTES DE
METODOLOGIA MANUAL..................................................................51
TABELA 5. CONTAGEM RELATIVA DE RETICULÓCITOS EM FUNÇÃO DO
TEMPO DE LEITURA..........................................................................53
TABELA 6. ANÁLISE DE COMPARAÇÃO POR ESTATÍSTICA DE
CORRELAÇÃO INTRA-CLASSE ENTRE OS EXAMINADORES “K”
E “L” E OS DEMAIS, PARA A CONTAGEM DE
RETICULÓCITOS (%).........................................................................63
TABELA 7. ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA, MODELO INTEIRAMENTE
CASUALISADO) PARA COMPARAÇÃO DE MÉDIAS ENTRE A
METODOLOGIA MANUAL E AUTOMATIZADA PARA A
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS.....................................................69
TABELA 8. CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%) PELOS MÉTODOS MANUAL
E AUTOMATIZADO..............................................................................69
TABELA 9. ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA, MODELO FATORIAL) PARA
COMPARAÇÃO DE MÉDIAS ENTRE O USO DO CORANTE
COMERCIAL E AZUL DE METILENO NOVO 1:10..............................76
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards
CFU-GEMM – unidade formadora de colônias específica para a formação de
granulócitos, eritrócitos, monócitos e macrófagos
CFU-GMM – unidade formadora de colônias específica para a formação de
granulócitos, monócitos e macrófagos
CFU-E – unidade formadora de colônias específica para a formação de
eritrócitos
BFU-E – unidade formadora de explosão eritróide “Burst”
CSF – fatores estimulantes de colônia
EPO – eritropoetina
IL-1 – interleucina 1
IL-3 – interleucina 3
HCG – gonadotrofina coriônica humana
DNA – ácido desoxirribonucléico
RNA – ácido ribonucléico
ICSH – International Committee for Standards in Haematology
CAP – College of American Pathologists
IRF – Índice de reticulócitos imaturos
CRC – Contagem de reticulócitos corrigida
IR – Índice de reticulócitos
RPI – Índice de produção de reticulócitos
VG – volume globular
RBC – eritrócitos
VCM – volume corpuscular médio
HCM – hemoglobina corpuscular média
CHCM – concentração de hemoglobina corpuscular média
PS – procedimento sistêmico
POP – procedimento operacional padrão
ITR – instrução de trabalho
EPI – equipamento de proteção individual
NBR ISO – Norma brasileira aprovada pela ABNT
ABNT – Associação Brasileira de Normas e Técnicas
SBAC – Sociedade Brasileira de Análises Clínicas
SBPC – Sociedade Brasileira de Patologia Clínica
PICC – Programa Interlaboratorios de Control de Calidad
G-EQUAS – External Quality Assessment Scheme
TEQUAS – Trace Elements External Quality Assessment Scheme
JCAHO – Joint Commision on Acreditation of Healthcare Organizations
JCCLS – Joint Commision for Clinical Laboratory Standards
CLIA´88 – Clinical Laboratory Improvement Amendment of 1988
IFCC – International Federation of Clinical Chemistry
WHO – World Health Organization
BPL – Boas práticas laboratoriais
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
LAPAC – Laboratório Pontagrossense de Análises Clínicas
UEPG – Universidade Estadual de Ponta Grossa
HUOP – Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário do Oeste
do Paraná
UNIOESTE – Universidade do Oeste do Paraná
CR – contagem de reticulócitos
RESUMO
A contagem dos reticulócitos é usada extensamente na rotina laboratorial para avaliar
a atividade eritropoiética da medula óssea, sendo de grande importância para o diagnóstico,
prognóstico e terapia de anemias. Em pacientes com quadro de anemia que apresentam
reticulocitose, a eritropoiese na medula óssea mostra-se eficaz contra um processo
hemolítico ou hemorragia acelerados, ou responde a terapias específicas. Por outro lado, a
reticulocitopenia demonstra pouca atividade eritropoiética. A contagem de reticulócitos
promove o monitoramento da regeneração da atividade da medula óssea após
quimioterapia ou transplante de medula óssea. Os reticulócitos são corados com o azul de
metileno novo ou o azul de cresil brilhante, evidenciando o aspecto característico de retículo
a fragmentos de RNA, ao microscópio óptico. As metodologias manual e automatizada, para
a contagem de reticulócitos em laboratório clínico, seguem o protocolo de normas técnicas
H44-A do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) e ao International
Committee for Standards in Haematology (ICSH). A metodologia manual é muito utilizada
em laboratórios de pequeno e médio porte, devido ao baixo custo em relação ao método
automatizado. No entanto, mesmo laboratórios de médio porte que contam com aparelhos
eletrônicos para a contagem de reticulócitos, nem sempre os utilizam, devido ao alto custo
dos reagentes específicos. As contagens de reticulócitos feitas em contadores eletrônicos,
que empregam a metodologia de citometria de fluxo, são mais rápidas e precisas, devido ao
maior número de células contadas e da redução das fontes de erros. Alguns equipamentos
determinam volume, concentração de hemoglobina e grau de maturidade dos reticulócitos,
compondo o reticulocitograma, o qual reflete o tipo de produção eritrocitária da medula
óssea. Os objetivos do presente trabalho foram os de avaliar a variação inter-observadores
para contagem manual de reticulócitos; comparar metodologias de execução manual e
automatizada para contagem de reticulócitos; testar alternativas para a metodologia
automatizada; bem como analisar os seus erros estatísticos. Foram selecionadas 446
amostras de sangue total de pacientes, obtidas por punção venosa na rotina laboratorial
para hemograma e ou contagem de reticulócitos do Laboratório Pontagrossense de Análises
Clínicas, Ponta Grossa – PR, e do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário
da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, com idades entre 0 e 89 anos, sendo 102 do
sexo masculino, 120 do sexo feminino e 224 recém-natos. A análise de correlação inter-
observadores e intra-classes, para valores baixos, médios e altos, segundo Bartko (1974) foi
usada para avaliar a concordância entre 12 observadores, que realizaram a contagem
manual de reticulócitos em 25 preparações de sangue, com contagens variadas. Os
resultados das análises estatísticas indicam que o erro casual (1-R
2
) variou de 4 a 60%
entre os observadores. Apesar da imprecisão detectada, o perfil geral entre os observadores
foi similar. Na comparação entre as metodologias manual e automatizada (ABBOTT Cell
Dyn 3500 SL), utilizando-se amostras de sangue de 341 pacientes, a análise de variância
(ANOVA) dos resultados não demonstrou diferenças entre as médias obtidas com as duas
metodologias (p = 0,21), sendo que os valores de tendência central e de dispersão foram
muito próximos entre ambas. A análise de variância dos valores obtidos com o emprego de
azul de metileno novo 1g/dl diluído 1:10 em NaCl 0,85 g/dl como corante-diluente
alternativo, em comparação aos obtidos com o fornecido pelo fabricante do aparelho, para
contagem de reticulócitos automatizada, não mostrou diferenças entre as médias obtidas
(p = 0,9) e entre as repetições (p = 0,63). Entretanto, foi detectado um erro sistemático, com
valores 0,4% maiores para as determinações com o corante-diluente alternativo em relação
ao comercial, bem como um erro casual (1- R
2
) de 19%, dentro do erro apresentado pela
metodologia. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que: no estudo inter-
observadores, o coeficiente de correlação intra-classes indicou resultados clinicamente
úteis; a comparação entre as metodologias manual e automatizada indicou precisão entre os
dados obtidos; o corante-diluente alternativo apresentado pode substituir o corante-diluente
comercial, por apresentar resultados estatisticamente idênticos.
ABSTRACT
Reticulocyte countings is extensively used in laboratorial routine to evaluate the bone
marrow erythropoietic activity, being of great importance for the diagnosis, prognostic and
therapy of anemia. In patients with signs and symptoms of anemia presenting reticulocitose,
the bone marrow erythropoiese is quite efficient against increased hemolytic process, or
answers to specific therapies, but shows little erythropoietic activity for reticulocytopenia.
Reticulocyte counting’s monitorate activity of the bone marrow regeneration after
chemotherapy or bone marrow transplantation. Reticulocytes are supravitally stained with
new methylene blue or brilliant cresyl blue, which confer the characteristic aspect of the RNA
fragments to their organelles, at light microscopy. The manual and automated methodologies
for reticulocyte countings follows the protocol, as suggested by the H-44 technique norms of
the National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS) and of the International
Committee for Standardization in Hematology (ICSH). The manual methodology is quite
used in laboratories of small and average size, due to the low cost in relation to the
automated method. However, even average size laboratories possessing electronic devices,
not always use them, due to the high cost of the specific reagents. Reticulocyte counting’s in
electronic equipments, which use the cytometry flow methodology, are faster and precise
due to high number of cells counted and reduction in the sources of errors. Some equipment
determines volume, hemoglobin concentration and degree of maturity of the reticulocytes, as
reticulocytogram, which reflects the type of erythrocyte production of the bone marrow. The
aims of the present work were to evaluate Inter-observer variations for reticulocyte manual
countings; to compare manual and automated methodologies for reticulocyte counting; and
to test alternatives stains for the automated methodology; and its statistical errors. Samples
of venous blood of 446 patients in the laboratorial routine for hemogram and/or reticulocyte
countings of the Pontagrossense Laboratory of Clinical Analyses, Ponta Grossa - PR, and of
the Laboratory of Clinical Analyses of the University Hospital of Universidade Estadual do
Oeste do Paraná, Cascavel - PR, with ages between 0 and 89 years, being 102 males, 120
females, and 224 new-borns. The Inter-observers and intra-class correlation analyses, for
low, average and high values, according to Bartko (1974) was used to evaluate the
agreement between 12 technologists, who had carried through the reticulocyte manual
counting in 25 preparations of blood, with varied countings. The results of the statistical
analyses indicate that the random error (1-R
2
) varied from 4 - 60% among technologists, but
the general profile among technologists was quite similar. In the comparison on manual and
automated methodologies (ABBOTT Cell Dyn 3500 SL), using samples of blood of 341
patients, the results of the analyses of variance (ANOVA) did not demonstrate differences
between the averages of the two methodologies (p = 0.21), and the measures of central
tendency and variability was quite close. The analyses of variance for the data obtained with
the new methylene blue stain 1g/dl diluted 1:10 in 0.85 g/dl NaCl, as alternative stain against
the one supplied for automated reticulocyte countings, by the device manufacturer, did not
show differences either for averages (p = 0,9) or replicates (p = 0.63). However, a bias
quality control was detected, with values 0.4% graters for the alternative stain, as well as
random error (1 - R
2
) of 19%, as expected for the methodology. From the observed results it
can be concluded that: for inter-observer studies, the intra-class correlation coefficient
indicated clinically useful results; the comparison on the manual and automated
methodologies indicated precision between them; the alternative stain studied can substitute
commercial stain, since they present statistically similar results.
1 INTRODUÇÃO
Introdução
___________________________________________________
15
1 INTRODUÇÃO
A contagem de reticulócitos do sangue periférico é realizada para avaliar a
integridade funcional da medula óssea. Em pacientes com quadro de anemia que
apresentam reticulocitose, ou seja, aumento do número de reticulócitos, a
eritropoiese na medula óssea mostra-se eficaz e responde às terapias específicas.
Entretanto, em pacientes com quadro de anemia que apresentam um número
diminuído de reticulócitos na circulação, ou reticulocitopenia, a eritropoiese é ineficaz
e pode estar associada a outros fatores. Além de avaliar a evolução desses
pacientes, a contagem de reticulócitos promove o monitoramento da regeneração da
atividade da medula óssea após quimioterapia ou transplante de medula óssea
(VAN HOVE et al., 2001).
O método manual para contagens de reticulócitos é o mais comumente
utilizado em laboratório clínico e está baseado na observação microscópica dos
restos de RNA ribossomal, evidenciados por colorações supra-vitais. A metodologia
de referência é baseada no protocolo H44-A do National Committee for Clinical
Laboratory Standards – NCCLS (FERNÁNDEZ et al., 2007).
Nos últimos anos, a metodologia automatizada vem sendo incorporada na
rotina laboratorial, como alternativa ao método manual, visando a praticidade e a
obtenção de maior precisão. No método automatizado, além de se contar maior
número de células, elimina-se muitas fontes de erro, apesar de algumas limitações
devidas a alguns interferentes e ao custo elevado (STIENE-MARTIN et al., 1998).
A técnica manual é mais demorada e trabalhosa em relação à automação e
seus resultados podem ser pouco confiáveis se não forem seguidos critérios
rigorosos para a sua execução e avaliação. Os fatores de erro mais comuns
encontrados nos resultados são: baixo número de células contadas, artefatos de
coloração, variação na coloração dos reticulócitos devido ao tempo de incubação,
discriminação visual entre os reticulócitos e alta variabilidade dos resultados entre
observadores (RILEY et al., 2001).
Considerando a relevância da qualidade da contagem de reticulócitos para a
detecção de doenças hematológicas e o controle de seu tratamento, esse trabalho
propõe avaliar as contagens de reticulócitos através da comparação dos critérios
Introdução
___________________________________________________
16
empregados em sua execução e dos resultados obtidos pela técnica manual, além
de comparar esses resultados com os obtidos em automação. Além do estudo
proposto, será avaliada uma alternativa de adaptação da metodologia automatizada,
para possibilitar a laboratórios de pequeno e médio porte, resultados confiáveis com
o uso de uma técnica viável, com um custo mais baixo e aplicável na rotina do
laboratório clínico.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 RETICULÓCITOS
Os eritrócitos maduros, células responsáveis pelo transporte de oxigênio aos
tecidos, são anucleados, apresentam a forma de disco bicôncavo, possuem de 7 a
8 µm e são desprovidos de mitocôndrias e ribossomos. Os reticulócitos são seus
precursores imediatos e são também anucleados, porém 20% maiores em volume.
Na microscopia eletrônica, os reticulócitos se apresentam como células
arredondadas, com a superfície tortuosa e, além dos grânulos de ribossomos,
apresentam mitocôndrias e “vacúolos autofágicos” (autofagossomos ou lisossomos
secundários), estes últimos representam um mecanismo de descarte da célula
(WICKRAMASINGHE et al., 1986; LEE et al., 1999).
A presença do “retículo” levou ao termo reticulócito, porém o retículo
plasmático verdadeiro não está mais presente na célula. Os grânulos ou filamentos,
que são restos de RNA ribossomal, podem aparecer distribuídos em bandas estreitas
ou compactados de maneira densa, simulando um núcleo. Células com grandes
quantidades de retículo são consideradas mais jovens ou imaturas e, à medida que o
retículo diminui, os reticulócitos são considerados mais velhos ou maduros (LEE et
al., 1999). Alguns autores especificam o grau de maturidade do reticulócito em
estágios como, por exemplo, Lewis et al. (2006) que classifica o reticulócito em 4
grupos; ou ainda, autores como Pierre e Riley et al. (2002) que citam em seus
estudos a classificação de 1932 de Heilmeyer e Westhaeuser, os quais definiram os
estágios em: grupo 0 – célula vermelha nucleada com retículo perinuclear denso;
grupo I – após a extrusão do núcleo, o reticulócito muito jovem possui uma massa
coesa e densa de RNA ou outras organelas; grupo II – o RNA torna-se menos denso
com maturação mais rápida e o sistema reticular aparece nessa região da célula;
grupo III – o RNA espalha-se e diminui em quantidade; grupo IV – reticulócito maduro
com pouca quantidade de restos de RNA espalhados, que tendem a desaparecer ao
tornar-se o eritrócito.
A forma e a densidade do reticulócito também dependem de alguns fatores
físicos. Assim, variações de temperatura destroem os retículos gradualmente, ao
passo que se formam filamentos ou grânulos. Em uma preparação corada de forma
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
19
supra-vital, a mudança de pH para um meio mais ácido resulta em uma aparência
granular fina do retículo, enquanto em um meio mais alcalino, a forma é pontilhada.
A resistência do reticulócito pode variar também frente a soluções hipotônicas. Após
centrifugação in vitro, os reticulócitos ocupam posição superior aos eritrócitos
maduros, por apresentarem menor densidade (LEE et al., 1999). A falta de
homogeneização da suspensão amostra-corante nas técnicas de contagem de
reticulócitos pode levar ao erro e diminuir a precisão do teste.
Os reticulócitos ativos sintetizam hemoglobina e outras proteínas, como as
enzimas metabólicas, além de pentoses-fosfato, podendo liberar energia por via
aeróbica mitocondrial através da degradação do piruvato a gás carbônico (CO
2
) e
água (H
2
O), no ciclo do ácido tricarboxílico (WICKRAMASINGHE et al., 1986).
Os grânulos de RNA dos reticulócitos podem ser evidenciados através de
colorações supra-vitais com o uso, por exemplo, de azul de cresil brilhante, de azul
de metileno novo e de certos marcadores fluorescentes (BANFI, 2008). As
colorações supra-vitais, por não necessitarem de fixação prévia, evitam a indução de
artefatos. As lâminas preparadas para este tipo de coloração não são permanentes
(LEE et al., 1999). Os corantes de Romanowsky, amplamente empregados na rotina
laboratorial para a coloração de extensões sanguíneas, evidenciam os reticulócitos
apenas através de leve basofilia, não permitindo a sua quantificação de forma
precisa (STIENE-MARTIN et al., 1998).
Na microscopia eletrônica, as mitocôndrias são encontradas agrupadas e os
ribossomos distribuídos de forma difusa, enquanto vesículas pinocíticas e moléculas
de ferritina não são vistas. Na fase de reticulócito, ainda ocorrem 20% restantes da
síntese da hemoglobina necessária para o funcionamento dos eritrócitos normais e,
à medida que a célula amadurece, várias organelas diminuem em número, levando à
redução do volume. Assim, primeiro desaparecem as mitocôndrias e, mais tarde, os
ribossomos, sendo que os vacúolos autofágicos, que podem ser encontrados,
representam um mecanismo de destruição de componentes desnecessários para a
célula. Como propriedade de células mais jovens, a aderência de reticulócitos é
maior do que a de eritrócitos, o que faz com que os mesmos circulem mais
lentamente no sangue. Em condições nas quais haja uma redução da concentração
de hemoglobina ou de eritrócitos, ou seja, quando há anemia, os reticulócitos
tendem a ser liberados precocemente da medula óssea. (LEE et al., 1999).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________
20
2.2 ERITROPOIESE
Em estudos datados de 1924, Maximow postulou a existência de uma célula
progenitora para as células sanguíneas. Acredita-se que a linhagem eritróide tenha
origem de uma célula tronco pluripotente, comum para todas as células sanguíneas,
como representado esquematicamente na Figura 1. A partir da 16ª semana de
gestação, a medula óssea produz a célula tronco, que origina uma unidade
formadora de colônias – granulócito, eritrócito, macrófago, monócito (CFU-GEMM)
indiferenciada e multipotente, a qual se diferencia em unidades de colônias
específicas para a formação de granulócitos, macrófagos-monócitos (CFU-GMM),
bem como unidades formadoras de explosão eritróides “Burst” (BFU-E), as quais são
progenitoras das unidades específicas para a formação de eritrócitos (CFU-E). Para
o desenvolvimento dessas unidades de colônias, são necessários fatores
estimulantes de colônia (CSF), componentes biológicos, como cálcio e glicose,
anticorpos, citocinas, interleucinas e eritropoetina (EPO), responsáveis pela
regulação da hematopoiese. A eritropoetina é um hormônio glicoprotéico, com peso
molecular de 34.000 Da, e que induz o progenitor celular eritróide a se dividir e
diferenciar em pronormoblastos ou proeritroblastos. A presença de grandes
quantidades de receptores para a EPO, existente nessas células, pode levar a outro
efeito, que é a manutenção da vida celular, por retardamento da clivagem do DNA,
que ocorre normalmente na CFU-E. Assim, na ausência de eritropoetina, a célula
evoluirá para o processo de apoptose ou morte celular (LEE et al., 1999).
Segundo McKenzie (1996) e Lee et al. (1999), os vários estágios de
maturação dos eritroblastos em ordem crescente são: pronormoblasto, normoblasto
basófilo, normoblasto policromatófilo e normoblasto ortocromático; células
precursoras que evoluem para reticulócito e, finalmente, para eritrócito. A maturação
nuclear evolui até o desaparecimento dos nucléolos e a condensação da cromatina
quando, através da cariopicnose, cessa a atividade nuclear. A maturação e a
proliferação celular acontecem simultaneamente, sendo que as células são
incapazes de promover automanutenção. O processo de maturação dura em torno
de 12 a 15 dias, até as células do estágio de unidade formadora de explosão
eritróide “burst” (BFU-E) chegarem a eritroblastos. Em 6 a 8 dias, a BFU-E prolifera e
se diferencia em unidade formadora de colônia eritróide (CFU-E), cujas células
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proliferam em 5 a 7 dias, para formar o pronormoblasto. Ocorrem de 3 a 5 divisões
celulares da CFU-E até formar o eritroblasto basófilo. Portanto, cada pronormoblasto
origina de 8 a 32 eritrócitos e a divisão cessa no estágio de eritroblasto
policromatófilo. Os eritroblastos ortocromáticos não podem mais sintetizar DNA ou
RNA. A anucleação, após a degradação nuclear, é um processo semelhante ao da
citocinese. Quando a maturação adicional e a composição da membrana lipídica são
alteradas, os reticulócitos são lançados à corrente sanguínea pela medula óssea e
seqüestrados pelo baço por 1 ou 2 dias ou, em sua ausência, pelo fígado. As
frações de RNA ribossomal aparecem pela ação das ribonucleases ou RNAases. Os
oligonucleotídeos resultantes serão mais tarde degradados pelas fosfodiesterases e
fosfatases, sendo que a pirimidina-5´nucleotidase específica encontrada nos
reticulócitos desfosforila os nucleotídeos e libera as bases pirimídicas para o exterior
da célula. A síntese de hemoglobina inicia nos pronormoblastos, ocorrendo em um
nível baixo nos reticulócitos e, não mais ocorre no eritrócito maduro. A hemoglobina
acumulada é evidenciada pelos corantes de Romanowsky, conferindo a
característica acidófila do citoplasma.
Na circulação, os reticulócitos maduros evoluem para eritrócitos em um
período de 1 ou 2 dias, onde há uma degradação progressiva dos ribossomos e
mitocôndrias até adquirir a forma bicôncava, forma esta que otimiza a transferência
de gases (WICKRAMASINGHE et al., 1986).
Revisão Bibliográfica
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22
FIGURA 1. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA HEMOPOIESE
(Fonte:http://www.umn.edu/hema)
2.3 CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
2.3.1 Aplicações da determinação de reticulócitos para o diagnóstico e monitoração
de doenças hematológicas
Por muitos anos, a contagem de reticulócitos tem sido considerada a prova
executada em laboratório clínico mais sensível para avaliar a atividade eritropoética
(FERNÁNDEZ et al., 2007). A utilidade da contagem dos reticulócitos é de avaliar a
eritropoiese ou a diminuição da formação de eritrócitos. São considerados como
valores de referência em seres humanos para a contagem de reticulócitos: homens e
crianças – 0,5 a 2,5%, mulheres – 0,5 a 4,0%, recém-natos – 2,0 a 5,0%, para
contagens relativas (LEE et al., 1999). Para Lewis et al. (2006), os valores relativos
são de 0,5 a 2,5% e em números absolutos, os valores ficam entre 50 e 100 x 10
9
/l.
Sua elevação indica produção eficaz de eritrócitos frente ao estímulo e é um
dado importante nas respostas terapêuticas. Os índices estarão aumentados após
perda de sangue aguda ou aumento da destruição dos eritrócitos, como resposta
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normal ou aumento de 3 a 6 vezes; após terapia com ferro para anemia ferropriva;
após terapia com folato ou vitamina B
12
para anemias megaloblásticas e,
possivelmente, em condições de policitemia, carcinoma metastático na medula
óssea, doença de Di Guglielmo, etc. Em casos extremos de estímulo, a eritropoiese
poderá estar aumentada em até 10 vezes. Na anemia falciforme, em geral os
reticulócitos estão aumentados, com valores de 5 a 30%. Os índices estarão
diminuídos na eritropoiese ineficiente ou na formação diminuída de eritrócitos como
em doença hemolítica do tipo auto-imune grave, crises não regenerativas, alterações
megaloblásticas e ainda, alcoolismo e mixedema (WALLACH, 1999).
Freqüentemente, a contagem de reticulócitos estará normal ou diminuída em anemia
de doença crônica, doenças mieloproliferativas, doenças linfoproliferativas e
carcinoma metastático para pacientes sem tratamento (SIMMONS, 1997). A
contagem de reticulócitos serve de parâmetro na anemia associada ao câncer
(FELICIANO et al., 2003) bem como, auxilia a monitorização da EPO para esses
pacientes (CANÇADO, 2007). Uma possível confirmação de uma contagem elevada
de reticulócitos é a sua correlação com a presença de eritrócitos policromatófilos na
lâmina do sangue periférico (WALLACH, 1999).
De acordo com Pasquini (2000), a diminuição de reticulócitos está associada
às anemias aplásicas, com valores que não excedem a 1%. Davis (1996) definiu a
fração de reticulócitos imaturos como um parâmetro capaz de avaliar a regeneração
medular por transplante de medula óssea e quimioterapia em situações de intensa
reticulocitopenia. Noronha e Grotto (2002) afirmam que o reticulócito jovem é o
indicador precoce da recuperação medular.
A utilização de automação por metodologia de citometria de fluxo para a
contagem de reticulócitos vem sendo estudada como uma análise rápida, específica
e reprodutiva para avaliar a atividade da EPO, como em estudos relatados de
Barbone et al. (1994), que empregou eritrócitos de camundongo. Os autores
observaram com a contagem automatizada e manual de reticulócitos, uma resposta
rápida ao tratamento com a EPO recombinante humana e também com outros
agentes, como Interleucina 1 (IL-1), Interleucina 3 (IL-3), dexametasona e
Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG).
Recentemente, em estudos como o de Molina et al. (2007), utilizou-se a
contagem de reticulócitos para avaliar a reposição das células hematológicas após
transplantes de células tronco com enxertos alogênicos em uma série de pacientes
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com quadros clínicos variados de alterações hematológicas, como leucemia aguda,
leucemia mielóide crônica, mieloma múltiplo, aplasia de medula óssea e linfoma
Não-Hodgkin. Geralmente, esses pacientes apresentavam em seus tratamentos
usuais anteriores ao enxerto, decréscimo do número de reticulócitos. Após o
enxerto, 92,6% dos 136 pacientes estudados apresentaram o aumento do número
destas células, das porcentagens das frações imaturas e de outros parâmetros em
um período de 14 dias em média, uma vez que o enxerto neutrofílico padrão leva em
média 18 dias para ser detectado e era considerado o marcador mais importante
anteriormente avaliado. Portanto, a análise conjunta dos parâmetros reticulócitários
pode ser utilizada para determinar precocemente o sucesso ou a rejeição do
transplante.
Em outro estudo, como o de Weimann et al. (2007) buscou-se assimilar a
contagem da fração imatura de reticulócitos e a determinação da concentração de
EPO como auxiliares na detecção precoce de episódios de rejeição aguda em
pacientes transplantados renais, devido ao fato de serem marcadores de
eritropoiese. Era esperado que as contagens fossem reduzidas no quadro da
rejeição, mas o estudo em 25 pacientes demonstrou que tais valores não se
alteraram, dificultando o emprego prático de tal relação.
Alguns estudos em camundongos e coelhos, como os de Rapoport et al.
(1985) e Minich et al. (1989), utilizaram métodos de biologia molecular para
evidenciar a diferença na produção da fração jovem e madura dos reticulócitos pela
síntese da enzima de RNA mensageiro, 15-lipoxigenase, promovendo a lise da
membrana mitocondrial e inibição da cadeia respiratória. No último estudo, ocorreu
indução de anemia pela administração de fenil-hidrazina para promover o estresse
reticulocitário e observou-se a recorrência posterior da produção dos reticulócitos. A
perda de receptores de insulina na membrana do reticulócito durante a sua
maturação também pode ser observada (THOMOPOULOS et al., 1978).
2.3.2 Metodologias empregadas para a contagem de reticulócitos
Atualmente, existem metodologias manual e automatizada para a contagem
de reticulócitos em laboratório clínico. Ambas as técnicas seguem o protocolo de
normas técnicas H44-A do National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS) e às recomendações do International Committee for Standards in
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Haematology (ICSH), sendo a metodologia manual muito utilizada em laboratórios
de pequeno e médio porte, devido à falta de equipamento apropriado e ao baixo
custo em relação ao método automatizado (BAIN, 1997). No entanto, mesmo em
laboratórios de médio porte que contam com um aparelho eletrônico para a
contagem de reticulócitos, nem sempre o utilizam devido ao custo de reagentes
específicos do equipamento, fornecidos pelo fabricante.
A identificação dos reticulócitos, tanto através da metodologia manual, quanto
da automatizada, deve ser feita de acordo com a padronização do College of
American Pathologists (CAP) que em 1986 definiu o reticulócito como “qualquer
célula vermelha anucleada que após fixada por corante supra-vital, contenha um
mínimo de duas partículas de material corado, correspondendo à precipitação de
ácidos nucléicos” (PIERRE, 2002; NASCIMENTO, 2004).
2.3.2.1 Contagem de reticulócitos através de metodologia manual
A contagem manual de reticulócitos através do microscópio de luz foi
desenvolvida em 1940 e continua a ser a metodologia mais empregada para a
determinação de tais células (BUTARELLO et al., 2001; PIERRE, 2002; RILEY et al.,
2002).
A técnica se fundamenta na propriedade em que o corante supra-vital
precipita restos de RNA ribossomal. Uma gota de corante é misturada com um
volume equivalente de sangue periférico coletado com anticoagulante e
posteriormente, incubada geralmente a quente, por alguns minutos. Lâminas de
microscopia são preparadas com essa suspensão e secas à temperatura ambiente
(RILEY et al., 2002).
Após a coloração, são os filamentos de RNA que se coram, portanto, é
essencial que, na preparação, os reticulócitos estejam bem corados e que, as
contagens sejam feitas em áreas nem muito espessas ou nem muito finas da
extensão. Outros fatores importantes para as contagens são, o discernimento visual
do observador, a contagem do número suficiente de células e o poder de resolução
do microscópio. As contagens dos reticulócitos devem ser feitas em aumento de
1.000 vezes ao microscópio óptico. A contagem ideal, para se obter um grau
aceitável de reprodutibilidade, ocorre quando a maior quantidade de campos com
eritrócitos for observada e os reticulócitos, contados. Pode-se considerar que o
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método se torna mais preciso na medida em que aumenta o número de células
contadas. Para tanto, devem ser contados campos consecutivos e não ao acaso.
Deve-se ainda, prosseguir a contagem quando os reticulócitos estiverem em número
diminuído e, observados mais cuidadosamente, quando apresentarem poucos
grânulos. Um método alternativo para a contagem manual é o emprego do chamado
disco de Miller calibrado, adaptado na ocular na forma de dois quadrados, um dentro
do outro, sendo que o menor ocupa aproximadamente um nono da área do
quadrado maior. Os reticulócitos devem ser contados no quadrado maior e os
eritrócitos, no quadrado menor. A contagem relativa de reticulócitos será a razão do
total do número de reticulócitos pelo total do número de eritrócitos contados ou
observados, multiplicada por 100. Com o uso do disco de Miller, o número de
eritrócitos deverá ser multiplicado por 9. Os resultados obtidos poderão ser
corrigidos ou ainda, a partir deles, se calcular o índice de produção de reticulócitos
(LEWIS et al., 2006).
A Tabela 1 indica o número de eritrócitos a serem contados em relação a
diferentes porcentagens de reticulócitos obtidas. Pode-se observar índices de erro
de acordo com números de eritrócitos contados e % de reticulócitos obtidas, até
20%, coeficiente de variação máximo para um grau de exatidão aceitável (DACIE e
LEWIS, 1965).
TABELA 1. CONTAGEM MANUAL DE RETICULÓCITOS: INFLUÊNCIA DA
PORCENTAGEM DE ERRO E NÚMERO DE ERITRÓCITOS NA
EXATIDÃO DAS CONTAGENS
Reticulócitos (%)
Grau de
exatidão
desejado
Erro (%)
1 2 5 10 25 50
20% 2.525 1.225 475 225 100 25
10% 10.100 4.900 1.900 900 400 100
5% 40.400 19.600 7.600 3.000 1.600 400
Os dados referem-se ao número de células a serem contadas.
Fonte: DACIE e LEWIS (1965).
Segundo Bain (1997), como se observa na Tabela 2, do mesmo modo, pode-
se relacionar o número de células contadas com a contagem relativa de reticulócitos
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encontrados, para se obter um grau de reprodutibilidade aceitável, de acordo com as
especificações do ICSH.
TABELA 2. CONTAGEM MANUAL PELO MÉTODO DE
MILLER: PORCENTAGEM DE RETICULÓCITOS
EM FUNÇÃO DO NÚMERO DE ERITRÓCITOS
CONTADOS
Contagem de
reticulócitos (%)
Número aproximado
de eritrócitos a
contar nos
quadrados pequenos
para um erro de 10%
Equivalente à
contagem total de
células
1 – 2 1.000 9.000
2 – 5 500 4.500
6 – 10 200 1.800
20 - 25 100 900
Fonte: BAIN (1997).
Em outras palavras, o erro padrão de contagem de reticulócitos pode ser
avaliado através da porcentagem de reticulócitos encontrada, assim como, do total
de células observadas no quadrado menor de contagem no método de Miller. O
coeficiente de variação para o número de células contadas entre resultados
aceitáveis deve ser menor do que 20%. Quando a contagem de reticulócitos exceder
a 10%, uma contagem relativamente menor de células resulta em um desvio padrão
de 10% (LEWIS et al., 2006).
A contagem relativa de reticulócitos pode induzir ao erro se o grau de anemia
ou a estimulação intensa eritropoética não forem considerados. Assim, o volume de
amostra de sangue a ser empregado depende do resultado do volume globular
sanguíneo do paciente, para garantir que a intensidade de coloração seja adequada.
Resultados de contagens de reticulócitos discrepantes são de extrema importância
para o Controle de Qualidade e, podem ocorrer devido à variação inter-observadores
nas técnicas manuais. Como causas de erros, devem ser considerados os critérios
morfológicos para o reconhecimento do reticulócito, inclusive a sua diferenciação
com o eritrócito maduro e com grânulos de corpúsculos de Pappenheimer, Howell-
Jolly ou mesmo, corpos de Heinz; o número de células avaliadas; o preparo da
lâmina para as contagens; a padronização da área de contagem; o emprego de
corantes de Romanowsky como contra-corantes; a preparação da suspensão da
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amostra e do corante; a diferença de gradiente de densidade entre reticulócitos e
eritrócitos durante a incubação; a inibição da coloração em hiperglicemia (STIENE-
MARTIN et al., 1998).
Muitas diferentes inclusões podem ser vistas nos eritrócitos em várias
alterações patológicas em hematologia, que poderiam ser confundidas com
reticulócitos em uma preparação supra-vital: (McKENZIE, 1996; STIENE-MARTIN et
al., 1998; LEWIS et al., 2006).
i) Corpos de Pappeinheimer - aparecem, em geral, como um único grânulo
corado em azul escuro, como os filamentos ou grânulos dos reticulócitos. Trata-se
de lisossomos secundários, variáveis em sua composição de ferro e proteínas, ou
mitocôndrias com micelas de ferro, que aparecem como depósitos basofílicos
irregulares na periferia da célula. A matriz protéica do grânulo é corada por
Romanowsky, enquanto a porção de ferro se cora pela coloração de Perls, pelo azul
da Prússia.
ii) Corpos de Heinz - podem ser vistos em coloração supra-vital, em azul
claro, como inclusões discretas em contraste com o material filamentoso reticular do
reticulócito. Eles são compostos de agregados de hemoglobina desnaturada e
aparecem como massas ligadas à superfície interna da membrana celular. Quando
únicos, os corpos de Heinz são grandes, mas quando diversos estão presentes em
uma célula, são pequenos.
iii) Corpos de Howell-Jolly - são grânulos presentes no eritrócito, púrpura ou
violeta escuros, esféricos, usualmente únicos e raramente mais que dois por célula,
constituídos por fragmentos de DNA.
iv) Ponteados basófilos – são grânulos azul-negros distribuídos no interior do
eritrócito, compostos de agregados de RNA ribossomal, algumas vezes associados
com mitocôndrias e siderossomos.
v) Inclusões de protozoários como os agentes da malaria e da babesiose –
aparecem como anéis azuis com “pedra” vermelha e outras formas dos vários
estágios de evolução dos protozoários, sendo que os eritrócitos parasitados podem
ser confundidos com os reticulócitos.
A contagem de reticulócitos por microscopia de fluorescência foi descrita por
Kozenow e Mai antes de 1950, que utilizou um fluorocromo RNA e DNA específico.
A técnica ofereceu poucas vantagens em relação à contagem de reticulócitos ao
microscópio de luz e nunca foi amplamente utilizada (RILEY et al., 2002).
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2.3.2.2.Contagem de reticulócitos por métodos eletrônicos
O emprego de contadores eletrônicos para a contagem de reticulócitos em
laboratório permite determinações mais rápidas e precisas, devido ao maior número
de células contadas e por eliminarem grande parte das fontes de erros. Os
contadores eletrônicos utilizam a metodologia de citometria de fluxo, com sistema de
softwares adequado para classificar discrepâncias de diferentes sistemas pré-
analíticos (BANFI, 2008). Alguns equipamentos oferecem uma variedade de
informações relacionadas aos reticulócitos, como volume, concentração de
hemoglobina e maturidade, os quais não são avaliados ao microscópio de luz
(ZANDECKI et al., 2006). O conjunto dos exames reticulocitários efetuados nestes
aparelhos denomina-se reticulocitograma e a análise dos mesmos reflete o tipo de
produção eritrocitária da medula, informando as modificações da atividade
eritropoiética (NASCIMENTO, 2004).
O RNA ribossomal dos reticulócitos pode ser evidenciado através de
coloração supra-vital, utilizando-se corantes com características básicas que
simultaneamente coram o retículo (ácido), ou formam complexos enzimáticos,
através de enzimas específicas, com um marcador fluorescente (STIENE-MARTIN et
al., 1998). Portanto, os reagentes mais empregados em automação são: os
corantes supra-vitais, como o azul de metileno novo usado em equipamentos
comerciais das marcas ABBOTT e BECKMAN COULTER; e a oxazina, em
equipamentos da BAYER e ainda; os marcadores fluorescentes, como: thiazole
orange para o equipamento HORIBA ABX; auramina O, em equipamentos da
SYSMEX; ou corifosfina O, para o BECKMAN COULTER (ZANDECKI et al., 2007).
A metodologia é compreendida como semi-automatizada quando a
preparação da amostra é realizada manualmente por meio da diluição da alíquota de
sangue total diretamente no tubo de reagente específico do equipamento, após a
reação completa que ocorre em determinado período de tempo, a amostra é então
processada no equipamento. Em equipamentos automáticos onde a amostra de
sangue é diretamente inserida sem a necessidade de preparo prévio, o aumento da
eficiência do analisador é maior por eliminar erros pré-analíticos de diluição,
coloração e incubação. Essa metodologia é chamada de automatizada (PIERRE,
2002).
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Segundo Bain (1997) e Van Hove et al. (2001), muitos equipamentos de
automação em hematologia utilizam quatro medidas independentes para a obtenção
dos parâmetros hematológicos: a) Contagem do número total de leucócitos,
eritrócitos e plaquetas em canais de impedância elétricos. O método se fundamenta
na medida de corrente elétrica que é produzida por uma partícula suspensa em um
líquido condutor e que, pela passagem através de um orifício, gera pulsos que
indicam o número de células que atravessaram a abertura, sendo que, a amplitude
de cada pulso é proporcional ao volume da célula que o produziu; b) Determinação
da concentração de hemoglobina em um canal espectrofotométrico através do
método modificado da cianometahemoglobina; c) Contagem do número total e
diferencial de leucócitos medida em um canal de fluxo óptico ou citômetro de fluxo.
Neste processo, as células individuais diluídas em um fluido passam através de um
ou mais sensores a laser, os quais medem suas características químicas ou físicas.
Essa medida está fundamentada no espalhamento, absorção ou emissão da luz
pelas células, que a espalham ou emitem em diferentes ângulos e intensidades,
gerando informações sobre seu próprio tamanho, estrutura interna, granularidade e
morfologia superficial. Em geral, o espalhamento da luz é analisado em quatro
ângulos: ângulo 0
°
, usado para a determinação da medida do tamanho das células;
ângulo de 10°, para a medida da complexidade das células; 90°, para avaliar a
superfície e a estrutura interna ou lobularidade das células; e 90° D de luz
despolarizada, para determinar certos tipos de granularidade.
A contagem de reticulócitos, entretanto, pode ser determinada de duas
maneiras dependendo do tipo de equipamento: pela dispersão de luz através de
canal de raios laser, que utiliza corante supra-vital e; pela emissão de fluorescência
em canal espectrofotométrico que utiliza fluorocromos (VAN HOVE et al., 2001).
Para os reticulócitos, a análise no grau 0 é suficiente para diferenciá-los da
maioria das plaquetas, enquanto os dados do histograma (gráficos de dispersão)
são utilizados para diferenciar reticulócitos de eritrócitos, aglomerados plaquetários e
células nucleadas. Os reticulócitos apresentam uma dispersão de luz em 10°,
semelhante à ocasionada pelos eritrócitos, mas diferem muito em relação à sua
dispersão em 90°. Os reticulócitos imaturos são separados dos reticulócitos mais
maduros na linha discriminatória de dispersão de luz entre 0 e 10° e dependem de
intervalos de referência preliminares em função de desvios padrões que, em geral,
para equipamentos que utilizam corantes supra-vitais, são maiores em relação
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àqueles que utilizam fluorescência. Isto ocorre devido à baixa sensibilidade de
identificação e discriminação de reticulócitos pelos corantes supra-vitais. A emissão
de fluorescência requer filtros de espectro ultravioleta com comprimentos de onda
maiores que 457 nm e 500 nm, para a excitação e emissão de luz, respectivamente.
A intensidade de fluorescência emitida pelo alto ou baixo conteúdo de RNA do
reticulócito o identifica, enumera e fornece dados ao seu respeito (RILEY et al.,
2002). Portanto, o emprego de corante fluorescente define melhor o nível de
maturidade do reticulócito (BUTTARELLO et al., 2002).
Equipamentos que utilizam, principalmente, marcadores fluorescentes
separam os reticulócitos pela quantidade de granulações, em três grupos,
relacionados ao grau de maturidade: alta maturidade, que possuem a menor
quantidade de granulações; baixa maturidade, com a maior quantidade de
granulações; média maturidade, com quantidade intermediária de granulações.
Considera-se ainda que, reticulócitos com baixa e média maturidade compõem a
fração de reticulócitos imaturos (IRF). Estes aparelhos fornecem também o volume
reticulocitário médio, que representa o tamanho dos reticulócitos circulantes, dado
importante em casos de anemias microcítica e macrocítica (NASCIMENTO, 2004).
Portanto, equipamentos que combinam citometria de fluxo com técnicas de emissão
de fluorescência aumentam a possibilidade de uma maior precisão nos resultados
dos índices de produção dos eritrócitos, por utilizar critérios de reconhecimento
padrão, assegurando a avaliação do grau de maturação da população de
reticulócitos. Tais informações podem auxiliar na detecção precoce da rejeição após
transplante de medula óssea (BRUGNARA et al., 1997) e em quimioterapia
(D´ONOFRIO et al., 1995). A concentração de hemoglobina nos reticulócitos pode
ser determinada a partir das concentrações conhecidas de hemoglobina total no
eritrócito e seu uso pode ser útil para identificar a deficiência de ferro e monitorar a
terapia em pacientes que fazem uso de ferro intravenoso, EPO humana
recombinante ou hidroxiuréia (BRUGNARA et al., 1997). Em estudos recentes como
os de XU e CHAUDHURI (2005); e de CROMER et al. (2006), utilizou-se as técnicas
de coloração fluorescente para a contagem de reticulócitos, na tentativa de
relacionar o aumento do parasitismo por agentes causadores da malária e a
diminuição da produção de reticulócitos, devido ao tropismo acentuado para estas
células, pela presença de receptores de membrana específicos e,
conseqüentemente, a ocorrência de hemólise. Técnicas de citometria de fluxo para
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reticulócitos estão sendo empregadas para quantificar os receptores de transferrina
na superfície do reticulócito, com o objetivo de avaliar o nível de ferro das células,
segundo Ervasti et al. (2000).
Contagens relativas de reticulócitos obtidas por metodologia manual e
automatizada se correlacionam bem. Entretanto, valores absolutos da concentração
de reticulócitos podem diferir entre si ao se considerar as duas metodologias, porque
dependem das condições de incubação e dos métodos de calibração dos
equipamentos empregados, o que pode contribuir para a inexatidão dos aparelhos
automatizados em algumas situações (LEWIS et al., 2006).
Entre os potenciais interferentes que diminuem a precisão da metodologia
automatizada para contagem de reticulócitos, e que exigem cuidados, estão as
possíveis combinações do RNA de plaquetas e leucócitos ou mesmo do DNA de
células nucleadas com corantes ou marcadores dos aparelhos. Assim, o
equipamento pode englobar na contagem, plaquetas gigantes ou agrupadas,
leucócitos anormais ou fragmentados. Precursores eritrocitários normalmente não
são contados pelos analisadores eletrônicos, mas poderiam hipoteticamente duplicar
o aumento da fração de reticulócitos imaturos levando a uma contagem de
reticulócitos anormal. Inclusões eritrocitárias como corpúsculos de Howell-Jolly,
corpos de Pappenheimer, corpos de Heinz ou ponteado basófilo, podem ser
confundidas com as granulações dos reticulócitos, como ocorre na metodologia
manual. Eventualmente, também esferócitos e eritrócitos com hemoglobina H podem
ser contados como se fossem reticulócitos. Entretanto, esse tipo de interferência
pode variar de acordo com o equipamento utilizado. Com equipamentos que utilizam
marcadores fluorescentes, outros interferentes podem também ser relatados na
contagem de reticulócitos, tais como: inclusão de parasitas como Babesia sp e
Plasmodium spp, podendo ocorrer um aumento de até 6 vezes em relação à
contagem manual para pacientes com cerca 70% dos eritrócitos infectados por
Plasmodium falciparum. Diferenças na intensidade de fluorescência dos reticulócitos
observadas entre os analisadores eletrônicos, tal qual o brilho de reticulócitos mais
imaturos, levam aos índices típicos da fração imatura. Entretanto, foram reportados
erros nos índices dos reticulócitos maduros, devido à confusão com leucócitos
intensamente corados ou aos poucos grânulos corados vistos em alguns
reticulócitos maduros de recém-natos. Este fato ocorre em conseqüência da baixa
concentração do marcador usado em alguns equipamentos. De acordo com as
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instruções da maior parte dos fabricantes, a estabilidade da suspensão de células
constituída por amostra de sangue e corante empregada para a determinação da
contagem de reticulócitos, é de 72 horas a 4°C e de 24 a 48 horas a temperatura
ambiente. Porém, alguns estudiosos observaram estabilidade somente durante 8
horas a 4°C e 6 horas a temperatura ambiente para a fração de reticulócitos imatura.
Outras situações ainda são mencionadas podendo ocasionalmente, serem causa de
interferência na contagem automatizada de reticulócitos, como a presença de
aglutininas frias, paraproteínas e hemólise na amostra (ZANDECKI et al., 2007).
Algumas contagens poderão estar falsamente aumentadas quando houver
autofluorescência ou quando a fluorescência for produzida pela ligação com RNA ou
DNA de outras células (BAIN, 1997). Mesmo assim, a automatização pode auxiliar
na eliminação dos elementos subjetivos de reconhecimento visual dos reticulócitos
(LEWIS et al., 2006). É fundamental a análise do esfregaço sanguíneo por
hematologista experimentado nas determinações automáticas.
O processamento de imagens na área de microscopia óptica vem sendo cada
vez mais utilizado para o reconhecimento e contagens automatizados de células e
visa permitir a aferição, melhorar a precisão eliminando o erro na identificação de
artefatos e reduzir custos. Entretanto, a detecção automática de reticulócitos, em
geral, ainda é insatisfatória e a falta de disponibilidade de equipamentos dificulta o
seu emprego (PIERRE, 2002). Recentemente, estudos realizados com técnica
modificada por um sistema de decisão de lógica difusa resultou em 100% de
detecção de reticulócitos presentes nas amostras utilizadas para teste, apresentando
apenas dois falsos positivos em 1280 células avaliadas (FIGUEIRÓ et al., 2006).
Estudos de comparação entre corantes, equipamentos e técnicas realizados
para determinar a melhor metodologia para contagem de reticulócitos são de grande
importância em controle de qualidade.
2.3.3 Formas de apresentação dos resultados das contagens de reticulócitos
Sabe-se que a concentração de reticulócitos no sangue periférico reflete a
atividade eritropoiética, uma vez que os mesmos são liberados normalmente da
medula óssea ou ficam circulantes por um período de tempo. No entanto, não é
regra que o aumento da eritropoiese leve à retirada prematura dos reticulócitos da
circulação. O tempo de duração desse estímulo, também chamado de estresse,
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34
pode durar 3 dias. Sendo assim, pode-se deduzir que o tempo de maturação e a
contagem de reticulócitos corrigida podem ser utilizados para avaliar também, a
circulação de ferro no sangue. Essa informação é relatada pela contagem de
reticulócitos relativa ou em porcentagem e ainda, expressa em valores absolutos
representada pelo número de reticulócitos em um litro de sangue (STIENE-MARTIN
et al., 1998; RILEY et al., 2002).
Segundo Stiene-Martin et al. (1998), a contagem de reticulócitos corrigida
(CRC) pode ser referida como um índice de reticulócitos (IR), por uma correção
através do volume globular (VG) ou hematócrito. A CRC corrige a contagem dos
reticulócitos observados, considerando-se um volume globular normal de 45%, com
a finalidade de corrigir o grau de anemia em que o indivíduo se encontra. Isto é feito
porque as porcentagens de reticulócitos podem parecer aumentadas quando os
reticulócitos são retirados precocemente da circulação ou quando aumenta o número
de eritrócitos na mesma. Assim, os valores esperados para o CRC dependem do
grau de anemia. A CRC pode ser calculada através da seguinte fórmula:
% de Reticulócitos x % de VG
CRC =
45%
Em pacientes que apresentam valores de VG nos limites normais ou
próximos, o número de reticulócitos condiz com a realidade e tende a ser
aproximadamente 1%. Entretanto, à medida que o VG diminui, a medula óssea
normalmente responde ao estímulo com uma maior produção de eritrócitos, através
do aumento do número de reticulócitos. Portanto, o cálculo da CRC permite
encontrar um valor real para o número de reticulócitos e através da RPI, avaliar a
eficácia da eritropoiese. Para os pacientes que apresentarem um volume globular de
35%, espera-se um valor de CRC de 2 a 3%. Para aqueles pacientes cujo volume
globular for menor ou igual a 25%, espera-se que a contagem corrigida de
reticulócitos seja maior que 3%.
Quando a CRC é conhecida, o índice de produção de reticulócitos (RPI) pode
ser calculado. O tempo de vida do reticulócito na circulação corresponde ao grau de
anemia. Normalmente, o tempo de maturação dos normoblastos na medula é de 3-5
dias e a meia vida no reticulócito no sangue periférico é de 1 dia, entretanto, em
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anemias, o tempo de maturação na medula é relativamente curto e os reticulócitos
permanecem por um período maior no sangue periférico.(LEE et al., 1999; RILEY et
al., 2002). Assim, o RPI será corrigido quando o VG e o tempo de maturação do
reticulócito no sangue periférico forem considerados. O RPI pode ser calculado
através da fórmula abaixo:
CRC
RPI =
Tempo de maturação de reticulócitos no sangue periférico
O tempo de maturação no sangue periférico varia com o volume globular.
Aproximadamente, os valores da Tabela 3 são utilizados no cálculo do RPI:
TABELA 3. VOLUME GLOBULAR EM FUNÇÃO DO TEMPO DE
MATURAÇÃO DOS RETICULÓCITOS NO SANGUE
PERIFÉRICO
VG (%)
Tempo
(dias)
40 – 45 1
35 – 39 1,5
29 – 34 2
15 – 24 2,5
<15 3
VG – volume globular
Fonte: STIEN avaliar a variação interobservadores e analisar o erro
estatístico da contagem manual dos reticulócitos E-MARTIN et al. (1998).
A interpretação do RPI pelos comitês de padronização em hematologia
geralmente sugere que resultados maiores que 3 indicam resposta adequada da
medula óssea a um quadro de anemia. Entretanto, índices menores que 2
representam uma resposta insuficiente (STIENE-MARTIN et al., 1998).
2.4 CONTROLE DE QUALIDADE EM LABORATÓRIO CLÍNICO
O Controle de Qualidade em Laboratórios de Análises Clínicas visa estudar o
erro para, desta forma, tentar minimizá-
lo e aumentar a probabilidade de se obter
resultados adequados para o diagnóstico e a terapêutica; ou seja, resultados
válidos, que possam ser usados com confiabilidade. O emprego de amostras
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controle, de calibração de equipamentos, de padronização de técnicas, assim como,
de outras medidas de controle de qualidade interno e externo, são importantes para
tal avaliação. Esses fatores contribuem sobremaneira para um diagnóstico mais
preciso e eficiente, bem como para uma melhoria na qualidade dos produtos
oferecidos pelos laboratórios clínicos, que acarreta, conseqüentemente, uma
melhoria no atendimento e um retorno mais eficiente à população (HAUSER, 2003).
Nesse sentido, é importante haver um treinamento adequado dos
observadores que irão efetuar a contagem de reticulócitos, conhecer a variação
inter-observadores, estabelecer critérios morfológicos adequadamente e estudar a
variabilidade, tanto do método manual quanto do automatizado (STIENE-MARTIN et
al., 1998). Em termos gerais, o analista de um laboratório deve entender o porquê da
mudança de uma técnica, antes que essa técnica seja implantada. A familiaridade
do analista com detalhes de dados dos cálculos estatísticos, construção de gráficos
e regras para interpretação dos resultados, ajuda o profissional no entendimento dos
mecanismos para utilização de um novo procedimento para controle de qualidade
em laboratórios (WESTGARD, 1984).
De acordo com HOXTER (1986) “para a otimização do diagnóstico, a
qualidade do resultado liberado pelo profissional no laboratório depende da pureza
dos reagentes, da exatidão dos padrões, da precisão da aparelhagem, da limpeza
do material, da calibração dos aparelhos, da perícia técnica e do estado emocional
dos técnicos”; portanto “a qualidade precisa ser atingida, antes que possa ser
controlada”.
A calibração, cuja definição é qualquer ajustamento feito em um instrumento
para corrigir os resultados obtidos de modo a torná-los “verdadeiros”. O padrão
primário é definido como aquele preparado a partir de substância química pura, não
higroscópica, que possa ser pesada e mantida em solução estável; e padrão
secundário é aquele preparado a partir de um padrão primário e é usado para
calibrar instrumentos (STIENE-MARTIN et al., 1998). No caso de contagem de
células, não é possível preparar padrões primários ou secundários, mas pode-se
empregar amostras controle e calibradores, cujos valores foram obtidos através de
exaustivas contagens manuais e determinações repetidas em aparelhos de
laboratórios de referência.
Revisão Bibliográfica
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37
2.4.1 Controle de qualidade interno e externo
Como exigências de Controle de Qualidade Interno, antes que um laboratório
seja certificado, precisa ter todas as suas técnicas documentadas e registradas.
Esses documentos são mais freqüentemente chamados de procedimento sistêmico
(PS), procedimento operacional padrão (POP) e instrução de trabalho (ITR). O PS é
o procedimento que define de forma geral o fluxograma do setor, desde o
recebimento do material até a entrega do laudo. O POP é o documento que define
detalhadamente a técnica empregada para cada análise realizada no setor. A ITR é
o documento que define o preparo dos reagentes e o manuseio correto dos
equipamentos para que o POP possa ser executado, bem como a utilização de
equipamentos de proteção individual (EPI) como luvas, jalecos e outros, e é de
fundamental importância, sendo que os cuidados a serem tomados para se evitar
acidentes com sangue e com objetos perfuro-cortantes, bem como a atenção ao se
utilizar substâncias tóxicas no laboratório, são requisitos para garantir a segurança
dos profissionais desta área.
As informações contidas nesses documentos devem estar vinculadas umas
às outras, de forma que qualquer alteração deve ser informada para que os
documentos sejam atualizados.
A certificação de produtos ou serviços e de sistemas de gestão e de pessoal
é, por definição, realizada por uma organização independente e credenciada para
executar a modalidade de Avaliação da Conformidade. A certificação dos Sistemas
de Gestão atesta a conformidade do modelo de gestão de fabricantes e prestadores
de serviço em relação a requisitos normativos. Os sistemas clássicos na certificação
de gestão são os de gestão de qualidade, baseado nas normas NBR ISO 9000 e os
sistemas de gestão ambiental, conforme as normas NBR ISO 14000 (INMETRO,
2008).
O Manual da Qualidade é o documento que descreve todos os passos
inerentes à obtenção de um programa para garantir a qualidade em laboratórios e
inclui os seguintes itens: organograma do laboratório, responsabilidades, descrição
do laboratório, política da qualidade, instalação do laboratório, recursos humanos,
auditorias internas e treinamentos (DICQ e PALC, 2008). Os programas de controle
de qualidade interno podem ser estabelecidos em cada laboratório, que deve definir
critérios para sua implantação (HOWANITZ, 1997).
Revisão Bibliográfica
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38
As avaliações obtidas pelos programas de controle de qualidade externo são
importantes para se implementar o sistema de controle interno de forma mais
adequada. Mesmo quando todas as precauções possíveis são tomadas para
assegurar a exatidão e a precisão nos laboratórios, certos erros são detectados
apenas através de uma avaliação externa (LEWIS et al., 2006).
A característica mais importante desses programas é de que a mesma
amostra é enviada de uma entidade regional ou nacional para um grande número de
laboratórios. Todos os laboratórios enviam seus dados de volta para a entidade,
cujos resultados serão comparados a um valor considerado correto (LEWIS et al.,
2006). Os programas brasileiros de controle de qualidade externo são
implementados pela Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC) e pela
Sociedade Brasileira de Patologia Clínica (SBPC). Os programas internacionais mais
conhecidos são: o americano, College of American Pathologists (CAP); o espanhol,
Programa Interlaboratorios de Control de Calidad (PICC); o alemão, German –
External Quality Assessment Scheme (G-EQUAS); os ingleses, Trace Elements
External Quality Assessment Scheme (TEQAS) e St George’s Hospital Medical
School. Esses programas apresentam características próprias, que visam a
avaliação de cada laboratório participante. Anualmente são fornecidos certificados
de participação e de adequação para os laboratórios que atingirem níveis de
excelência.
Segundo ENGLAND et al. (1998), a garantia da qualidade inclui todos os
passos, sob a orientação do responsável pelo laboratório, para assegurar a
confiabilidade dos resultados, mantendo a acurácia e a reprodutibilidade, bem como
a comparabilidade entre vários laboratórios.
Dentre os métodos usados incluídos em um “Programa de Garantia da
Qualidade” para assegurar a obtenção de resultados reais, estão as boas práticas
laboratoriais (BPL), a padronização de técnicas, os sistemas de controle de
qualidade interno e externo, as análises estatísticas e os demais aspectos que
garantam a qualidade dos resultados levados aos clínicos, ou seja, é a soma de
todos os sistemas designados para assegurar a qualidade do resultado final. As
normas das BPL cobrem todas as técnicas envolvidas no processo, transporte e
armazenamento de material, treinamento de pessoal, espaço e equipamento
adequados. O controle de qualidade assegura as normas das BPL através de
Revisão Bibliográfica
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inspeções, auditorias e análises estatísticas (STIENE-MARTIN et al.; 1998;
WAGSTAFF, 1998).
Um programa completo para garantia da qualidade em laboratório de análises
clínicas deve envolver as fases pré-analítica, analítica e pós-analítica. A fase pré-
analítica inclui a coleta adequada da amostra, a identificação correta do paciente e
do material, bem como a conservação e transporte adequados do material, além de
outros passos que antecedem a fase analítica, que é a própria análise da amostra. A
fase pós-analítica inclui todos os passos após a execução da técnica, como
transcrição e digitação dos resultados, o estabelecimento de correlações com os
dados clínicos e a liberação do laudo por um profissional responsável, após a sua
verificação final (ZARBO, 2000; LEWIS et al., 2006).
O método analítico é um conjunto de instruções que define material e
equipamentos necessários, bem como ações para a obtenção dos resultados.
Através do chamado controle de qualidade analítico, seleciona-se os métodos e os
instrumentos considerados confiáveis. Para tanto, antes da implantação de um
método ou equipamento, são analisadas suas confiabilidade e viabilidade. A
viabilidade está relacionada com a rapidez e o custo para desenvolver a
metodologia, com a infra-estrutura e a segurança no trabalho. A confiabilidade
depende da variabilidade introduzida pelos erros randômicos e erros sistemáticos
(STIENE-MARTIN et al.; 1998).
Existem organizações responsáveis pela segurança da qualidade em
laboratórios, como: College of American Pathologists (CAP), National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS), International Committee for Standards in
Haematology (ICSH), Joint Commition on Accreditation of Healthcare Organizations
(JCAHO), Joint Commition for Clinical Laboratory Standards (JCCLS), Clinical
Laboratory Improvement Amendment of 1988 (CLIA´88), International Federation of
Clinical Chemistry (IFCC) e World Health Organization (WHO) (STIENE-MARTIN et
al., 1998; LEWIS et al., 2006).
Revisão Bibliográfica
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40
2.4.2 O Emprego da estatística no controle de qualidade em hematologia
O emprego de cálculos estatísticos é de fundamental importância para o
estudo dos erros e o estabelecimento de sistemas de controle de qualidade. Quando
a variabilidade resulta de uma soma de fatores não-controlados, é chamada variável
aleatória porque é influenciada pelo acaso, variando mesmo se determinada no
mesmo dia, mesma hora e pelo mesmo equipamento. Atribuiu-se variação aleatória
às causas acidentais e indetermináveis, e variação intermitente às causas
determináveis. Enquanto as causas determináveis podem ser descobertas e
eliminadas com um controle de qualidade eficiente, as causas aleatórias não podem
ser removidas sem que se façam mudanças básicas no sistema (SHAININ e
SHAININ, 1993; VIEIRA, 1998).
Dentre os métodos estatísticos aplicados à qualidade, estão os gráficos de
controle para medir e analisar a variação nos processos, visando aprimorar a
qualidade dos processos analíticos. Os chamados gráficos de controle são utilizados
para avaliar o controle de qualidade. Esses gráficos apresentam uma linha central
esboçada como a média geral, e os limites de confiança superior e inferior, em geral
estabelecidos como 3 desvios-padrão em torno da média (BICK, 1993; SHAININ e
SHAININ, 1993).
Ao se estudar os erros em laboratório, cada resultado deve ser considerado,
de acordo com a fase pré-analítica, levando-se em conta a coleta adequada, as
variações fisiológicas, como sexo, idade, gravidez, efeitos hormonais, repouso ou
exercício físico, etc; bem como a diferenciação entre normal e patológico. Deve-se
considerar que pode ocorrer superposição entre valores de referência e valores
obtidos durante determinada condição patológica (NARAYANAN, 2000).
No que se refere ao erro analítico, pode-se afirmar que o erro representa a
variabilidade das medidas e que depende de fatores diversos, previsíveis ou não. O
resultado obtido com um determinado método não pode ser comparado com o
obtido com outro método, cuja especificidade seja diferente. Assim, dentro dos
Laboratórios de Análises Clínicas, o estudo dos erros deve ser feito exclusivamente
para comparar os resultados obtidos com o mesmo método analítico, ou com
métodos equivalentes (HENRY, 1980).
Revisão Bibliográfica
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41
Deve-se realizar análises periódicas dos dados obtidos nas diversas áreas
que constituem um Laboratório de Análises Clínicas, aplicando ações preventivas ou
corretivas quando necessário. Estes procedimentos são fundamentais para se
reconhecer e minimizar os erros. Portanto, a obtenção de coeficientes de variação
entre as metodologias empregadas constitui um estudo estatístico para estabelecer
a comparação entre as mesmas e é recomendada para a contagem de reticulócitos
pela NCCLS (1997).
2.4.3 Importância do estudo dos erros e do controle de qualidade em contagens de
reticulócitos
A contagem de reticulócitos, como qualquer determinação em laboratório
clínico, está sujeita a erros, que devem ser conhecidos para a implantação de
sistemas de controle de qualidade. A contagem manual de reticulócitos está sujeita a
uma série de variáveis, como a falta de homogeneização ou cuidados com o tempo
e a temperatura de incubação da suspensão de amostra-corante, bem como, as
inclusões em eritrócitos quando confundidas com o reticulócito, as quais podem
acabar conduzindo a elevados coeficientes de variação, com perda da exatidão e da
precisão.
Obtem-se índices de erro, de acordo com números de eritrócitos contados e
% de reticulócitos obtidas, até 20% de coeficiente de variação máximo para um grau
de exatidão aceitável, conforme descrito na Tabela 1. O erro padrão de contagem de
reticulócitos pode ser avaliado através da porcentagem de reticulócitos encontrada e
do número de células observadas com o emprego do método de Miller.
A metodologia de citometria de fluxo empregada nos contadores eletrônicos
para a contagem de reticulócitos em laboratório permite determinações mais rápidas
e precisas, devido ao maior número de células contadas e por eliminarem grande
parte das fontes de erros. Entre as vantagens estão uma variedade de informações
do reticulocitograma. Entretanto, dependem das condições de incubação e dos
métodos de calibração dos equipamentos empregados, o que pode contribuir para a
inexatidão dos aparelhos automatizados em algumas situações como as possíveis
combinações do RNA de plaquetas e leucócitos ou mesmo do DNA de células
nucleadas com corantes ou marcadores dos aparelhos, englobar na contagem,
plaquetas gigantes ou agrupadas, leucócitos anormais ou fragmentados, e outras
Revisão Bibliográfica
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42
inclusões que podem ser confundidas com as granulações dos reticulócitos, como
ocorre na metodologia manual.
Tendo em vista a importância da contagem de reticulócitos para a detecção
de doenças hematológicas e o controle de seu tratamento, esse trabalho propõe
uma série de estudos em controle de qualidade através da comparação inter-
observadores, dos critérios empregados em sua execução e dos resultados obtidos
pela técnica manual e em automação.
3. OBJETIVOS
Objetivos
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OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Estudar comparativamente métodos de contagem de reticulócitos.
OBJETIVOS SECUNDÁRIOS
Avaliar a variação inter-observadores na contagem manual dos reticulócitos.
Comparar metodologias de execução manual e automatizada para contagem
de reticulócitos.
Testar alternativas para a metodologia automatizada de contagem de
reticulócitos.
Testar a aplicabilidade e a confiabilidade das metodologias estudadas.
4. MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
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4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
Foram selecionadas amostras de sangue total de pacientes obtidas por
punção venosa na rotina laboratorial para exames hematológicos. O critério para a
seleção das amostras foi a solicitação clínica para a realização do hemograma e ou
da contagem de reticulócitos. Não houve restrições quanto a sexo, idade ou história
clínica de cada paciente atendido. A seleção das amostras dependeu também da
assinatura, dos mesmos ou de seus responsáveis, de um Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE), obtido por ocasião da coleta e aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos do Setor de Saúde da UFPR (CAAE
0026.0.091.000-08-HC, UFPR), conforme o Anexo 1.
Para a realização de uma avaliação inter-observadores de acordo com a
metodologia manual, a seleção dos grupos de amostras ocorreu de forma que, entre
as mesmas, de acordo com os resultados do eritrograma, se pudesse contemplar
tanto aquelas dentro da normalidade quanto da anormalidade para a contagem de
reticulócitos, independente de haver ou não solicitação médica para esta contagem.
Foram selecionados 25 pacientes de diferentes idades, entre 0 e 87 anos, sendo 13
do sexo masculino e 12 do sexo feminino. As amostras foram classificadas em três
grupos, de acordo com a contagem de reticulócitos obtida pelos autores: Grupo B
para valores relativos abaixo de 0,5%; Grupo M para valores de 0,5 a 2,5%; e Grupo
A para valores acima de 2,5%, valores estes considerados baixos, médios e altos,
respectivamente, para efeito de estudo de variabilidade, sem levar em conta sexo ou
idade.
Para um estudo de comparação entre as metodologias manual e
automatizada, selecionou-se 341 amostras de pacientes, sendo 51 do sexo
masculino, 66 do sexo feminino, e apresentavam idades entre 0 e 89 anos, e 224
recém-natos.
Para o estudo de um corante alternativo ao corante comercial na contagem
automatizada de reticulócitos, utilizou-se 80 amostras, sendo 30 para os testes
Material e Métodos
___________________________________________________
47
preliminares de seleção do melhor corante, concentração através da diluição e
reprodutibilidade e outras 50, para determinações de testes de comparação entre o
corante comercial e o preparado para a automação. Estas 80 amostras eram de 42
pacientes do sexo feminino e 38 do sexo masculino, com idades entre 0 e 75 anos.
4.2 MÉTODOS
Os experimentos foram realizados em 3 etapas:
a) Estudo inter-observadores para a contagem manual de reticulócitos;
b) Estudo comparativo da contagem de reticulócitos pelos métodos manual e
automatizado;
c) Estudo comparativo entre contagens de reticulócitos automatizadas
realizadas com o emprego de diluente-corante fornecido pelo fabricante do
aparelho e de um diluente-corante alternativo, preparado no laboratório.
4.2.1 Local de realização dos procedimentos
Os procedimentos técnicos de preparo de reagentes e execução das
determinações foram realizados no Laboratório Pontagrossense de Análises Clínicas
(LAPAC), no Laboratório de Produtos Farmacêuticos da Universidade Estadual de
Ponta Grossa (UEPG), no Laboratório de Citologia e Hematologia Clínica do Curso
de Farmácia da Universidade Federal do Paraná, no Laboratório de Análises
Clínicas do Hospital Universitário do Oeste do Paraná (HUOP) da Universidade do
Oeste do Paraná (UNIOESTE) e em outros laboratórios, cujos responsáveis técnicos
foram convidados a participar do estudo inter-observadores para a contagem manual
de reticulócitos.
Material e Métodos
___________________________________________________
48
4.2.2 Reagentes
Corantes: azul de cresil brilhante (SIGMA); azul de metileno novo (INC
BIOMEDICALS INC.); corante comercial pronto para uso para contagem de
reticulócitos (LABORCLIN).
Soluções: tampão fosfato de sódio iso-osmótico 150 mmoles/l, pH 6,48;
tampão citrato-NaCl, (citrato de sódio 3 g/dl + cloreto de sódio 0,85 g/dl) de pH
7,04.
Os reagentes necessários para o funcionamento do equipamento Cell-Dyn
3500 SL (Abbott Diagnostics) e realização das contagens de reticulócitos: diluente;
detergente; solução leucoprotetora; lisante; kit para reticulócitos com solução corante
constituída de: azul de metileno novo (<0,2%), oxalato de potássio (<3,0%), fosfato
de sódio dibásico (0,3%), fosfato de potássio monobásico (0,05%), EDTA dissódico
(0,03%), cloreto de sódio (0,1%), tensoativo (0,001%) e conservante (0,05%) em 3,7
ml de solução; e controles comerciais para a metodologia automatizada: Retic Plus
Control I e II (Abbott Diagnostics), com valores conhecidos de 1,2% (desvio padrão
de ±0,8) e 3,4% (desvio padrão de ±1,2) respectivamente, para a contagem de
reticulócitos.
4.2.3 Preparo das soluções corantes
Foram preparados os corantes supra-vitais: azul de cresil brilhante e azul de
metileno novo, de acordo com a metodologia preconizada por Willians et al. (1976) e
por LEWIS et al. (2006), respectivamente. Dissolveu-se azul de metileno novo (1g/dl)
em tampão fosfato 150 mmoles/l, pH 6,48. Dissolveu-se azul de cresil brilhante
(1g/dl) em salina citratada 3,8%, pH 7,04. Os corantes preparados foram
acondicionados em embalagens de vidro âmbar, mantidos em maceração por 24
horas, e filtrados em papel de 8 µm de porosidade.
Material e Métodos
___________________________________________________
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4.2.4 Coleta das amostras
As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa em EDTA K
3
(1,5 mg/ml de sangue), conforme os procedimentos de coleta descritos por
LEWIS et al. (2006) e homogeneizadas por rotação (Homogeneizador de sangue
AP 22 PHOENIX).
4.2.5 Métodos empregados
4.2.5.1 Eritrograma
Foram analisados os parâmetros do eritrograma em equipamento multicanal
de Hematologia CELL DYN 3500 SL: eritrócitos (RBC), hemoglobina (HGB), volume
globular (VG), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média
(HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), para fornecer
dados relevantes sobre os pacientes aos participantes do estudo inter-observadores
para contagens de reticulócitos.
4.2.5.2 Contagem manual de reticulócitos
A técnica para contagem de reticulócitos foi realizada de acordo com
LEWIS et al. (2006), modificada. Alíquotas de 100 µl da solução corante foram
misturadas a 200 ou 250 µl de sangue, incubando-se a 37ºC por 20 a 25 min. O
volume de sangue adicionado ao corante dependeu da contagem global de células
vermelhas, ou seja, 200 µl de amostra para volume globular igual ou superior a 30%
e 250 µl de amostra para volume globular igual ou inferior a 29%. Após a incubação
com o corante, foram feitas finas extensões em lâmina para as contagens.
Material e Métodos
___________________________________________________
50
4.2.5.2.1 Padronização do corante
Para o estudo inter-observadores utilizou-se como corante da técnica manual,
o azul de cresil brilhante comercial pronto para uso. Posteriormente, para o estudo
de comparação entre metodologia manual e automatizada, foram utilizados o azul de
cresil brilhante e o azul de metileno novo preparados no laboratório.
A presença do elemento oxigênio na fórmula estrutural do azul de cresil
brilhante provavelmente pode aumentar a força de ligação da reação química com o
reticulócitos, formando compostos mais insolúveis em relação ao emprego do azul
de metileno novo de acordo com as noções fundamentais em química (SOLOMONS,
et al. 2005/2006). As fórmulas estruturais de ambos os corantes estão ilustradas na
Figura 2.
FIGURA 2. FÓRMULAS ESTRUTURAIS DOS CORANTES AZUL
DE METILENO NOVO E AZUL DE CRESIL BRILHANTE
A
B
A - Azul de metileno novo; B – Azul de cresil brilhante
Material e Métodos
___________________________________________________
51
Padronizou-se a coloração através de um estudo da técnica manual com
ambos os corantes preparados para a contagem de reticulócitos e verificou-se que
as lâminas confeccionadas, quando observadas ao microscópio óptico,
apresentavam diferenças de coloração. Os valores obtidos na contagem de
reticulócitos realizada em preparações feitas com 5 amostras diferentes não
apresentaram diferenças significativas (Tabela 4). Assim, o azul de cresil brilhante foi
o corante eleito para as demais determinações de metodologia manual e a Figura 3
ilustra comparativamente amostras preparadas com as duas colorações. A escolha
foi devido ao fato que, o azul de cresil brilhante era de fácil obtenção comercial e de
custo mais baixo.
TABELA 4. COMPARAÇÃO DE RESULTADOS DE CONTAGENS
RELATIVAS DE RETICULÓCITOS ENTRE CORANTES
DE METODOLOGIA MANUAL
Contagem de reticulócitos
(%)
PACIENTE
ACB AMN
1 4,1 4,5
2 1,7 1,5
3 6,5 6,5
4 0,5 0,6
5 1 0,9
Os resultados são as médias de 2 leituras para cada amostra do paciente.
ACB – azul de cresil brilhante; AMN – azul de metileno novo.
Material e Métodos
___________________________________________________
52
FIGURA 3. ASPECTO MORFOLÓGICO DE RETICULÓCITOS
PELAS COLORAÇÕES AZUL DE CRESIL BRILHANTE
(ACB) E AZUL DE METILENO NOVO (AMN) EM
MICROSCOPIA ÓPTICA DE IMERSÃO (x1000)
Coloração com ACB Coloração com AMN
4.2.5.2.2 Padronização da técnica de preparo de extensões em lâmina
Estendeu-se 5 µl de suspensão de células e corante em lâmina com o auxílio
de lâmina extensora, para se obter campos sem sobreposição de eritrócitos. Em
seguida, as lâminas foram mantidas em estufa a 37ºC por 30 min, para acelerar a
secagem das preparações e evitar, desta forma, que a umidade provocasse o
desbotamento dos reticulócitos e dificultasse a sua identificação; e acondicionadas
em recipiente hermético.
Padronizou-se o tempo máximo para a contagem manual de reticulócitos nas
extensões em lâmina, utilizando-se 3 amostras de sangue colhidas de um único
paciente em dias consecutivos. As leituras em duplicata das lâminas foram
realizadas até 72 h após a sua preparação, e os resultados obtidos estão
representados na Tabela 5.
Material e Métodos
___________________________________________________
53
TABELA 5. CONTAGEM RELATIVA DE RETICULÓCITOS EM
FUNÇÃO DO TEMPO DE LEITURA
Amostras (%)
Leitura
(dias)
1 2 3
0,9 1,1 1
0
0,9 0,9 1,1
0,7 1,1 1
1
0,5 0,9 1,2
0,8 0,8 0,9
2
1 1 1
0,9 1 0,8
3
0,7 0,8 0,9
As extensões foram lidas durante 3 dias para avaliar a estabilidade.
Foram realizadas duas leituras em 3 extensões independentes
4.2.5.2.3 Padronização da contagem de reticulócitos em microscópio óptico
Critérios morfológicos para o reconhecimento dos reticulócitos – Os critérios
morfológicos foram seguidos de acordo com os princípios preconizados por
LEWIS et al. (2006). As extensões em lâmina devem ser analisadas em microscópio
óptico com a objetiva de imersão (1000x). Pode-se observar a presença de
conjuntos de filamentos ou grânulos de RNA corados em azul intenso, dispostos ao
acaso no interior dos reticulócitos. Os reticulócitos mais maduros são caracterizados
pela presença de poucos filamentos ou grânulos de RNA, enquanto os mais jovens,
pela maior quantidade de grânulos ou massa densa reticular, são mais bem
definidos, conforme a classificação em 4 estágios de maturação (item 4.1).
Reticulócitos que ainda apresentem ao menos dois pequenos corpúsculos ou
filamentos corados ainda devem ser considerados como reticulócitos. A
diferenciação entre reticulócitos e outras inclusões eritrocitárias, ou mesmo de
artefatos deve ser criteriosa.
Região da extensão adequada para a contagem de reticulócitos - A área da
preparação analisada não foi de campos com superposição de células, ou mesmo
de campos muito finos, ou seja, com muito poucas células ou que apresentassem
extensos espaços vazios entre as células.
Material e Métodos
___________________________________________________
54
Padrão da coloração supra-vital - A técnica de coloração foi realizada de
maneira que a mesma estivesse adequada, ou seja, nem muito fraca a ponto de não
se ver os retículos, nem muito forte, a ponto de tornar os retículos borrados ou
espessos.
Número de células a serem contadas – De acordo com Dacie et al. (1973), o
erro médio encontrado nas contagens pode ser significativo quando a concentração
encontrada for inferior a 10%. De um modo geral, recomenda-se examinar campos
sucessivos até a contagem de 100 reticulócitos e no mínino 10 campos, para obter a
média do número por campo. Quando o número de reticulócitos exceder a 10%, o
exame de um número pequeno de células será suficiente para se obter um erro-
padrão menor que 10%. Assim, a determinação do número de células a serem
contadas deve se basear na porcentagem de reticulócitos encontrados na contagem
das primeiras 1.000 a 2.000 células. Um grande número de células deve ser contado
quando o número de reticulócitos for baixo. Portanto, o número de células a ser
contado, para se obter um grau aceitável de reprodutibilidade, é tanto maior quanto
menor for a porcentagem de reticulócitos, de acordo com a Tabela 1 do item 2.3.2.1.
Por exemplo, para uma concentração de reticulócitos obtida nas primeiras 1000
células contadas, foi estabelecido que, considerando-se campos com cerca de 200
eritrócitos, deveriam ser contados os reticulócitos de 20 a 50 campos, totalizando
4.000 a 10.000 eritrócitos. Este critério foi seguido rigorosamente pelos
examinadores K e L.
Valores considerados controles - As contagens de todas as amostras foram
realizadas em duplicata por dois examinadores com 10 anos de experiência, em
média, em rotina laboratorial para contagem de reticulócitos (K e L), de forma
independente, sendo que os resultados médios obtidos foram considerados
controles, por apresentarem valores muito próximos.
Forma de se expressar os resultados – Os resultados das contagens de
reticulócitos somente foram expressos em percentagens. As contagens absolutas
estão vinculadas a outro dado do eritrograma do paciente, o número total de
eritrócitos no sangue e, não foram utilizadas para as análises estatísticas.
Material e Métodos
___________________________________________________
55
4.2.5.3 Metodologia automatizada
A técnica empregada para a metodologia automatizada seguiu as instruções
do fabricante. A contagem de reticulócitos foi realizada no equipamento semi-
automatizado Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics) por dispersão de luz a 0°, 10° e
90°, no qual o corante supra-vital tem propriedade catiônica e precipita o RNA
ribossômico do reticulócito, com propriedade aniônica, formando uma rede. A alta
concentração do corante no reagente de reticulócitos produz um efeito estabilizador
nos eritrócitos e a leitura do espalhamento de luz é realizada em 30.000 células em
cada determinação. Empregou-se como solução corante-diluente, 3,7 ml do azul de
metileno novo comercial (Abbott Diagnostics), previamente incubada em temperatura
ambiente, ao abrigo da luz por 15 min a 2 h, com 20 µl de amostra de sangue. Após
a incubação, a suspensão de sangue-corante-diluente foi homogeneizada e
processada no aparelho por aspiração de 200 µl de amostra.
No manual de uso do equipamento, o fabricante explicita que o tempo
máximo de processamento da amostra após a coleta é de 8 h em temperatura
ambiente e que, a preparação da amostra-corante é estável por 1 ou 2 dias em
temperatura ambiente ou 3 a 5 dias a 4ºC. Os resultados são expressos em valores
relativos e absolutos, não fornecendo outras informações a respeito do reticulócito.
Para a calibração do equipamento, foram utilizados os controles comerciais
Retic Plus Control I e II, com valores conhecidos para a contagem de reticulócitos,
específicos para este aparelho. Para o início das determinações com o uso de cada
corante, foi feita uma contagem de reticulócitos empregando-se apenas o próprio
corante, no chamado teste de background ou recontagem da leitura de fundo, no
qual se espera que a contagem de reticulócitos não exceda a 100. Este processo
tem objetivo, avaliar a qualidade do corante quando se utiliza tubos de lotes
diferentes de reativos de reticulócitos. O coeficiente de variação para esta
metodologia é menor ou igual a 15% e o coeficiente de correlação é maior ou igual a
0,9.
Material e Métodos
___________________________________________________
56
Segundo o fabricante, a linearidade da metodologia automatizada do aparelho
é de 0 a 30% (±7%) de reticulócitos e os valores de referência de 0,88 a 2,37% para
adultos.
4.2.6 Experimentos
4.2.6.1 Estudo da variação inter-observadores para a contagem manual de
reticulócitos
Foram realizadas parcerias com 10 Laboratórios de Análises Clínicas,
públicos e privados na região dos Campos Gerais (PR) para o estudo da variação
inter-observadores para a contagem de reticulócitos. Para que a avaliação fosse
confidencial e a identificação dos laboratórios participantes, mantida em sigilo, os
examinadores dos laboratórios receberam a denominação de A a J e os
observadores responsáveis pelos resultados considerados corretos, K e L.
As lâminas preparadas com as amostras de sangue dos 25 pacientes, foram
acondicionadas em porta-lâminas e distribuídas em duplicata, aos observadores A a
J para o estudo da variação inter-observadores, recomendando-se que fizessem a
contagem de reticulócitos em até 48 horas, de acordo com um roteiro explicativo que
seguiu os critérios preconizados no item 4.2.5.2, deste trabalho, de 2 a 3 vezes por
semana e a transcrever os resultados médios obtidos nas contagens de reticulócitos
em valores relativos. Foram enviados, ainda, aos laboratórios, os dados do
eritrograma de cada paciente enumerados de 1 a 25, bem como orientações sobre a
leitura das lâminas (Anexo 2).
As preparações foram analisadas, em duplicata, também pelos examinadores
K e L com experiência rotineira de dez anos em contagem de reticulócitos, e de
acordo com os critérios preconizados por LEWIS et al. (2006), de acordo com o item
4.2.5.2.3.
Foi distribuído ainda um instrumento de avaliação na forma de questionário
aos responsáveis pelos laboratórios participantes, para se obter informações a
respeito de seus procedimentos usuais para a contagem de reticulócitos, incluindo a
metodologia de preparo do material, os critérios morfológicos, de seleção de campos
Material e Métodos
___________________________________________________
57
microscópicos e de número de células contadas empregados; ao emprego de
Controle de Qualidade interno e externo; e à sua certificação pela NBR ISO 9002
(Anexo 3).
4.2.6.2 Estudo comparativo da contagem de reticulócitos pelos métodos manual e
automatizado
A análise de comparação entre as metodologias manual e automatizada
(Cell Dyn 3500 SL, Abbott Diagnostics) foi realizada com 341 amostras de pacientes
indiscriminadamente, através do preparo de 2 lâminas para cada amostra e o
resultado obtido foi a média das contagens microscópicas de acordo com os
princípios preconizados por LEWIS et al. (2006). A contagem de reticulócitos por
metodologia automatizada ocorreu seguindo as instruções técnicas do fabricante.
4.2.6.3 Estudo comparativo entre contagens de reticulócitos automatizadas com o
emprego de reagente do fabricante do aparelho e de diluentes-corantes preparados
no laboratório
Para o estudo de uma adaptação da metodologia automatizada, baseada no
emprego de uma solução corante-diluente alternativa, foram testados os dois
corantes de emprego usual para a contagem de reticulócitos, o azul de cresil
brilhante e o azul de metileno novo, em meio isotônico e tamponado, em pH 7,0 e
6,5 respectivamente, nas mesmas proporções do corante do fabricante, de
concentração incerta, no método convencional automatizado e em diluições em NaCl
0,85 g/dl, equivalentes a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:100. Utilizou-se o volume de 1,85
ml de corante puro ou diluído para um volume de 10 µl de amostra. As amostras
foram agitadas cuidadosamente para evitar a formação de bolhas. Após as
respectivas contagens de reticulócitos, foi determinada a menor diluição de corante
com o qual se obteve resultados comparáveis aos resultados da contagem
automatizada obtida com o corante do fabricante.
Todas as análises com o corante comercial e com o corante preparado para a
seleção da melhor diluição foram realizadas em duplicata e, após a escolha da
Material e Métodos
___________________________________________________
58
diluição mais apropriada, foram realizadas de 2 a 10 determinações para avaliar a
estabilidade e a reprodutibilidade. Para tanto, o estudo foi realizado separadamente,
30 amostras para testes de seleção e adequação do produto e 50 amostras para a
realização da análise de comparação com o corante comercial.
O produto caseiro foi mantido sem a presença de aditivos ou conservantes e
as determinações realizadas num período de até 2 h do preparo da suspensão
amostra-corante após a incubação, sem a realização de provas de estabilidade após
este tempo. A validação do método foi realizada por métodos estatísticos.
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
A comparação entre os resultados pela análise estatística de concordância
inter-obsevadores foi realizada por correlação intra-classe para dados paramétricos,
com mais de dois examinadores (BARTKO, 1974; PORTNEY e WATKINS, 1993)
com utilização do pacote estatístico “on-line” da Universidade de Hong Kong (2008).
Os dados obtidos foram também analisados com o uso dos gráficos cartesianos de
dispersão, gráficos de controle de qualidade (SHAININ e SHAININ, 1993), pelo teste
de correlação de Pearson, e pela Análise de Variância (ANOVA), modelos
inteiramente casualisados ou fatoriais. Os dados foram analisados com o auxílio da
planilha Excel (Microsoft) ou pacote de estatística Statistica 8.0 (StatSoft). A
significância estatística foi considerada para p < 0,05.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados e Discussão
___________________________________________________
60
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos estão apresentados de acordo com os experimentos
realizados, conforme os itens abaixo.
5.1 ESTUDO DAS ANÁLISES INTER-OBSERVADORES
No instrumento de avaliação distribuído aos responsáveis pelos laboratórios
participantes do estudo na região dos Campos Gerais (PR) (Anexo 3) foi relatado
que, somente um dos 10 laboratórios não participam de Programas de Controle de
Qualidade Externo; 5 laboratórios realizam os procedimentos e normas para o
Controle de Qualidade Interno; apenas um laboratório é certificados pela ISO; todos
realizam POP para a contagem de reticulócitos e; apenas um único laboratório
possui equipamento para metodologia automatizada, conforme os dados do Anexo
4.
Todas as informações quanto aos critérios de execução, identificação e
contagens de reticulócitos realizados rotineiramente em Laboratório de Análises
Clínicas, fornecidas pelos observadores do trabalho e dos laboratórios participantes
estão ilustradas no Anexo 5. Dentre os observadores, o G não obedece ao critério
de variar o volume de sangue em relação ao resultado do VG; o D executa
rotineiramente a contra-coloração das lâminas preparadas para a contagem
microscópica com May Grünwald-Giemsa; os observadores A, E, F, H, K e L fizeram
a leitura de todas as lâminas recebidas no tempo preconizado nas orientações
contida na planilha para o estudo, os observadores B, C, D, G e J leram parte das
lâminas no tempo preconizado e o observador I não seguiu esta orientação; os
observadores C, K e L relataram que analisam a interrelação entre as contagens de
reticulócitos, os dados do eritrograma e a observação das lâminas coradas com May
Grünwald-Giemsa, como forma de controle de qualidade; apenas o observador G
adiciona aos resultados o cálculo da CRC; os observadores C e G contam todas as
células em todos os campos de contagem, K e L contam todas as células em alguns
campos de contagem, estabelecendo o número médio de células por campo e, os
demais observadores, estabelecem o número de células por campo de acordo com
Resultados e Discussão
___________________________________________________
61
sua experiência e contam apenas os reticulócitos; os observadores A, C, D, E, F, G,
I, K e L contam um maior número de campos com células quando o número de
reticulócitos for baixo; todos os observadores utilizam microscópio de alta resolução
com objetiva de imersão; todos utilizam, entre os critérios de identificação, a
inclusão de reticulócitos com poucos e muitos filamentos ou grânulos; nenhum
observador relata a contagem de reticulócitos em campos com sobreposição de
células e para todos os observadores, a quantidade média de células contadas por
campo é, em geral, 200. A quantidade média de células contadas ou avaliadas na
lâmina é variada: os observadores A, I e J contam reticulócitos entre 1.000 a 2.000
células (5 a 10 campos), D e G contam entre 2.000 e 4.000 células (10 a 20
campos), C conta todas as células do campo até mais ou menos 2.500 células, H
conta 2.000 células (10 campos), E conta 4.000 células (20 campos) e os
observadores K e L contam de 4.000 a 10.000 células (20 a 50 campos).
Todos os participantes relataram desconhecer ou não utilizar a técnica de
contagem manual por porcentagem de erro encontrada na Tabela 1, ou mesmo a
ocular de Miller (Tabela 2).
Os resultados dos examinadores K e L foram considerados como exatos, para
efeito de comparação, por serem experientes, por serem responsáveis pela
pesquisa, preparação e exame minucioso das lâminas recém-preparadas, e por
seguirem estritamente os critérios preconizados para este trabalho, baseados nas
recomendações de LEWIS et al. (2006).
Os dados da Figura 4 indicam que o erro sistemático entre os examinadores
K e L foi praticamente zero. O erro casual (1-R
2
) entre as duas avaliações foi de
apenas 4,1%, o que significa grande precisão entre as contagens dos examinadores.
Portanto, pode-se considerar que os dois examinadores estavam padronizados de
acordo com os critérios estabelecidos.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
62
FIGURA 4. CORRELAÇÃO PARA AS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%) ENTRE OS
EXAMINADORES K E L
n = 25 amostras; o coeficiente de correlação de Pearson (R) foi de 0,98;
Linha sólida – regressão linear estimada (y = 1.018x); linhas pontilhadas
– 95% limite de confiança para os resíduos. Linhas cruzadas – valores
médios para x e y.
A comparação entre os resultados pela análise estatística de concordância
por correlação intra-classe para dados paramétricos, com mais de dois
examinadores (PORTNEY e WATKINS, 1993), utilizando o pacote estatístico “on-
line” da Universidade de Hong Kong (2008), está ilustrada na Tabela 6.
Exceto para leituras baixas, as maiores concordâncias foram obtidas com os
examinadores K e L.
Considerando o erro casual (1-R²) para leitura de todas as lâminas
examinadas, os examinadores G, B, C e F apresentaram erro < 20%, os
examinadores D, J, H e A apresentaram entre 20 – 40% de erro e os examinadores
E e I, erro > 40%.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
63
TABELA 6. ANÁLISE DE COMPARAÇÃO POR ESTATÍSTICA DE
CORRELAÇÃO INTRA-CLASSE ENTRE OS EXAMINADORES
“K” E “L” E OS DEMAIS, PARA A CONTAGEM DE
RETICULÓCITOS (%)
Geral Baixo (<0,5%) Médio (0,5-2,5%)
Alto (>2,5%)
Lab R Lab R Lab R Lab R
KL 0,9796 KL 0,5119 KL 0,9571 KL 0,8410
K L G 0,9365 K L D 0,5414 K L G 0,7249 K L B 0,8268
K L B 0,9289 K L F 0,4754 K L B 0,6583 K L C 0,7584
K L C 0,9130 K L A 0,3827 K L D 0,6411 K L G 0,6584
K L F 0,9056 K L G 0,2373 K L I 0,5940 K L A 0,3973
K L D 0,8810 K L B 0,1426 K L F 0,5726 K L D 0,3837
K L J 0,8415 K L J 0,0944 K L C 0,5493 K L J 0,3709
K L H 0,8134 K L E 0,0812 K L J 0,4717 K L F 0,3489
K L A 0,8010 K L I 0,0567 K L A 0,4314 K L E 0,1233
K L E 0,7610 K L C 0,0544 K L H 0,3586 K L I 0,1072
K L I 0,6395 K L H -0,1850 K L E 0,0537 K L H 0,0791
Para a concordância por correlação intra-classes, de contagem de reticulócitos,
foram consideradas todas as contagens, contagens baixas (<0,5%), médias
(0,5-2,5%) e altas (>2,5%). N = 25 pacientes e 12 examinadores.
Apenas o examinador I apresentou discrepância maior (R= 0,64).
Com o fracionamento em contagem de reticulócitos (CR) baixos, médios e
altos, o tamanho amostral ficou pequeno, comprometendo a análise de correlação.
Entretanto, observa-se certa dificuldade na concordância para CR baixos para todos
os examinadores e uma maior concordância numérica para CR médios do que para
CR altos.
O perfil das observações das 25 lâminas feito pelos 12 observadores está
ilustrado na Figura 5. Pode-se facilmente observar que o examinador I apresenta um
perfil bastante destoante dos demais examinadores. Já os examinadores K, L e G
apresentaram perfis quase idênticos.
As contagens de reticulócitos acima da média nas lâminas, 6, 8, 10, 11 e 15
foram detectadas como altos CR para quase todos exceto o examinador A que
considerou a lâmina 8 normal e I que apresentou um perfil destoante. As contagens
de reticulócitos abaixo da média nas lâminas 9, 14, 16 e 17 foram observadas para
Resultados e Discussão
___________________________________________________
64
quase todos examinadores exceto o E que foi discordante em relação às lâminas 16
e 17 (resultados não mostrados).
Os resultados entre observadores podem também ser analisados na Figura 6,
pelo gráfico de dispersão. Apesar de alguma discordância numérica ao rigor da
análise estatística, observa-se que o perfil entre os examinadores é bastante
semelhante, no que diz respeito à ocorrência de contagens altas, baixas e médias,
exceto o examinador I. Esses resultados indicam uma tendência a baixos índices de
erros diagnósticos, ou seja, não afetando o diagnóstico, uma vez que os valores de
referências encontrados na maior parte das literaturas são amplos e podem diferir
em relação ao sexo e idade dos pacientes. Em relação às contagens manuais de
reticulócitos deve-se levar em consideração, que, para o diagnóstico em laboratório
clínico, o limite de erro máximo entre observadores é de 20%. Portanto, o erro entre
os observadores desta etapa da pesquisa foi elevado.
Os resultados do examinador I apresentaram variação maior que a esperada,
fato este que poderia ser causado por diversos fatores analíticos, entre eles, não ter
seguido os critérios preconizados para a contagem dos reticulócitos, ou mesmo não
ter realizado as leituras nos prazos estabelecidos. Esse resultado pode ser relevante
como alerta ao fato que as lâminas coradas não são permanentes, e que o prazo de
leitura deve ser rigorosamente observado para se evitar um erro sistemático.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
65
FIGURA 5. PERFIL DA AVALIAÇÃO DE 25 PREPARAÇÕES PARA A CONTAGEM
DE RETICULÓCITOS (%) DOS 12 OBSERVADORES EM GRÁFICOS
DE CONTROLE DE QUALIDADE
Gráficos de controle de qualidade para os 12 avaliadores (SHAININ e SHAININ, 1993)
Eixo dos x – números das preparações; Eixo dos y – contagem de reticulócitos (%).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
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FIGURA 6. GRÁFICO DE DISPERSÃO PARA OS VALORES DE
CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%) DE TODOS
EXAMINADORES PARA TODAS AS LÂMINAS
- Examinadores K, L e G; - demais examinadores; linha grossa – Valores
médios entre 0,5 e 2,5 % de CR; linha fina – Valor médio de todos os dados
(1,7%). Os dados do examinador I não foram incluídos nesse gráfico. N = 25
pacientes e 11 examinadores.
Em termos de Controle de Qualidade, os resultados apresentaram
discrepâncias, com alta variabilidade inter-observadores, o que era esperado, devido
às diferenças na padronização dos critérios de identificação e número de células
contadas para a determinação dos reticulócitos, conforme informado nas respostas
do instrumento de avaliação, seguindo suas próprias padronizações e não as
preconizadas por Lewis et al. (2006). Como os observadores convidados a participar
do estudo realizaram as leituras das lâminas já preparadas, pode-se afirmar que os
possíveis erros pré-analíticos de execução da amostra foram minimizados.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
67
Desta forma, os fatores inerentes à variabilidade inter-observadores podem
estar entre os mesmos já conhecidos e discutidos por outros autores, porém apenas
aos analíticos. As amostras foram de população bem diversificada, resultando em
contagens baixas, médias e altas de modo a ficarem bem distribuídas. O atraso das
contagens, para os observadores que cometeram esta impropriedade foi
considerado, uma vez que, a qualidade do material em lâminas preparadas sem
fixação prévia, após alguns dias, diminui e resulta no desbotamento dos reticulócitos
a ponto de desaparecerem na observação microscópica. Os observadores devem
estar treinados e padronizados por que erros de reconhecimento de reticulócitos
acontecem quando inclusões eritrocitárias em alterações patológicas em
hematologia se coram com corantes supra-vitais, bem como, artefatos ou restos de
corante. Entre as diversas inclusões eritrocitárias, os corpos de Heinz,
potencialmente, podem levar a mais erros na contagem de reticulócitos, por serem
evidenciados em azul claro. (McKENZIE, 1996; STIENE-MARTIN et al., 1998;
LEWIS et al., 2006). A identificação de reticulócitos com poucos grânulos ou
retículos e o número de células contadas são potenciais fatores de variabilidade.
Observadores que não seguem os critérios podem deixar de contar os reticulócitos
mais maduros e geralmente, contam apenas 1.000 células.
Peebles et al. (1981) encontraram um coeficiente de variação (CV) inter-
observadores superior a 30% utilizando ANOVA. Estes autores relataram a
variabilidade de distribuição da amostra na lâmina, variações de coloração, número
limite de células contadas e diferenças na identificação morfológica pelos
observadores como as causas de erro, bem como, a dificuldade de contagem
daqueles reticulócitos que possuem poucos grânulos pelos observadores.
Fernández (2007) descreve outros erros relacionados com a metodologia manual,
como os artefatos de coloração, a variação da coloração dos reticulócitos devido ao
tempo decorrido entre a preparação da lâmina e a contagem e mesmo, à fadiga do
observador ao realizar a contagem, resultando em CV inter-observadores entre 15 e
20% para contagens elevadas de reticulócitos e aproximadamente 40% para
contagens que estão dentro dos valores de referência biológicos. Segundo Davis
(1994), a alta imprecisão da metodologia manual é de CV de 25 a 50% ou mais, e se
deveria seguir as padronizações mundiais que sugerem o uso do disco ocular de
Miller.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
68
Riley et al. (2002) descreveram a preocupação dos comitês internacionais
como o CAP, por exemplo, com a realização de estudos em 1971, 1972 e 1974
visando analisar o coeficiente de variação inter-observadores em técnicas manuais
preparadas com 3 corantes diferentes, nos quais se obteve variações de 25 a 48%.
Em outro estudo semelhante, feito pelo CAP em 1984 foi observado um CV de 26,2
a 32,4%. A partir daí, o CAP adotou as recomendações do NCCLS de se utilizar o
disco de Miller, bem como, minimizar fontes de erros pré-analíticos, através da
padronização da homogeneização da amostra, da coloração e da preparação das
lâminas. Riley et al. (2002) também citam estudos em que a maior causa de
imprecisão na contagem de reticulócitos é a identificação morfológica destas células
e apontam outros, em que o CV ultrapassou 30% para cada observador,
considerando que, especialmente os reticulócitos mais maduros ou grupo IV da
classificação de Heilmeyer, que possuem apenas dois ou mais retículos e
compreendem aproximadamente 60% dos reticulócitos da circulação, são as células
mais dificilmente reconhecíveis. Os grupos I e II da classificação de reticulócitos
normalmente não estão presentes na circulação e são chamados reticulócitos de
transição.
5.2 ESTUDO DE COMPARAÇÃO ENTRE METODOLOGIA MANUAL E
AUTOMATIZADA
Foram realizados estudos para a comparação entre as metodologias manual
e automatizada, utilizando-se amostras de sangue de 341 pacientes. A comparação
de médias entre os resultados obtidos através das duas metodologias, realizada
pela análise de variância (ANOVA), está apresentada nas Tabelas 7 e 8. Os valores
obtidos demonstram que não houve diferenças entre ambas (p=0,21).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
69
TABELA 7. ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA, MODELO INTEIRAMENTE
CASUALISADO) PARA COMPARAÇÃO DE MÉDIAS ENTRE A
METODOLOGIA MANUAL E AUTOMATIZADA PARA A
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
SQ GL QM F P
Intercepto 30128,76 1 30128,76
1371,65
0,000
Tratamento 33,98 1 33,98 1,55 0,21
Erro 14936,45 680
21,97
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia automatizada:
Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); SQ - soma de quadrados; GL - grau
de liberdade; QM - quadrado médio; F - teste de variâncias; p: probabilidade
para a hipótese de nulidade. N = 341 pacientes em duas repetições
independentes.
Pode-se observar que ambos os métodos apresentaram desvios padrões
(DP) bastante próximos, sendo de 4,6 e 4,7 para as contagens manual e
automatizada, respectivamente, como pode ser observado na Tabela 8.
TABELA 8. CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%) PELOS MÉTODOS
MANUAL E AUTOMATIZADO
Lim. Confiança
Métodos
N Média DP EP -95% ´+95% Min Máx
Total 682 6,65 4,69 0,18 6,29 7,00 0,40 21,10
Manual 341 6,42 4,62 0,25 5,93 6,92 0,40 18,60
Auto 341 6,87 4,75 0,26 6,36 7,38 0,82 21,10
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia automatizada: Cell
Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); N – número de amostras; DP – desvio padrão; EP
– erro padrão da média; Min menor valor; Máx – maior valor. N= 341 pacientes em
duas repetições independentes.
Pode-se verificar, pelos dados da Tabela 8, que a medida da amplitude dos
valores de reticulócitos da amostragem analisada, pelo coeficiente de variação de
Pearson (CV) é de 70% (0,4 a 21,1% reticulócitos). Essa variabilidade ilustra que a
amostra era constituída de uma ampla faixa de valores de reticulócitos.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
70
A Figura 7 ilustra a comparação de médias entre os métodos manual e
automatizado. Os valores de tendência central e de dispersão, que ilustram a
amplitude de valores da amostra, foram muito próximos para a metodologia manual
e para a metodologia automatizada.
FIGURA 7. GRÁFICO DAS MÉDIAS DAS CONTAGENS DE
RETICULÓCITOS (%) ENTRE METODOLOGIA MANUAL E
AUTOMATIZADA
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia
automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Os pontos
representam os valores médios e a barra de erro representa 95% dos
limites de confiança. F – teste de variâncias para comparações de
médias; p – probabilidade para a hipótese de nulidade; Auto – método
automatizado; N= 341 pacientes em duas repetições independentes.
A Figura 8 ilustra o histograma de freqüência de dados para as metodologias
manual e automatizada. Observa-se que o perfil de distribuição de freqüência dos
dados de ambos é muito semelhante, e que existem duas populações diferentes,
uma com média entre 2 e 6%, e outra com média entre 10 e 14%.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
71
FIGURA 8. HISTOGRAMA DE FREQÜÊNCIA DOS DADOS OBTIDOS
PELO MÉTODO MANUAL E AUTOMATIZADO PARA A
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS(%)
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia
automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Cont. Ret. (%) –
Contagem de reticulócitos (%). N – 341 pacientes em duas repetições
independentes.
A existência de grupos fica facilmente compreendida através do histograma de
freqüência com todos os dados, conforme a Figura 9, onde fica evidente a existência
de duas modas, com 5 e 13% de reticulócitos.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
72
FIGURA 9. HISTOGRAMA DE FREQÜÊNCIA COM TODOS OS
RESULTADOS OBTIDOS PELAS CONTAGENS DE
RETICULÓCITOS (%)
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia automatizada:
Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Cont. Ret. (%) – Contagem de
reticulócitos; N – 341 pacientes em duas determinações independentes.
As amostras para o estudo apresentaram praticamente 2 populações distintas:
65,4% de recém-natos (RN) e 34,6% de crianças e adultos, o que explica a maioria
dos resultados muito altos para as determinações. Riley et al. (2002) relata que os
efeitos da idade e outras variações fisiológicas devem ser considerados nas
contagens de reticulócitos.
Na Figura 10, o gráfico de dispersão denota todos os resultados percentuais
obtidos de reticulócitos para a comparação entre as metodologias manual e
automatizada. Calcula-se, pela regressão obtida, um erro sistemático constante de
0,4% para mais, em média, nas determinações em automação em relação às
contagens manuais. O erro casual (1-R
2
) foi de 3,9%.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
73
FIGURA 10. GRÁFICO DE DISPERSÃO DE COMPARAÇÃO ENTRE OS
DADOS DA METODOLOGIA MANUAL E AUTOMATIZADA
PARA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%)
Metodologia manual segundo Lewis et al. (2006); Metodologia
automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Cont. Ret. (%) –
Contagem de reticulócitos (%). N – 682; R = 0,980; R² = 0,961; Linha
sólida – regressão linear estimada (Auto = 0,3917 + 1,0085 x Manual);
linhas pontilhadas – 95% de limite de confiança para os resíduos. N =
341 pacientes em duas repetições independentes.
A metodologia automatizada exigiu cuidados com a realização da técnica por
dificuldades que refletiram em variações maiores de resultados nos testes
preliminares; por exemplo, ao agitar a amostra no frasco de reagente de modo a
evitar a formação de bolhas, ao incubar a suspensão de amostra-corante-diluente
em temperatura ambiente ao abrigo da luz. Tais informações não são relatadas de
forma criteriosa no manual do fabricante. Assim, para este trabalho, a reação
ocorreu após 15 min e a determinação foi realizada dentro de 2 h no equipamento,
que levou aproximadamente 1 min para cada leitura e o grande número de amostras
foi processado em séries para não exceder o tempo limite padronizado para as
Resultados e Discussão
___________________________________________________
74
determinações e evitar erros, mesmo que a suspensão apresentasse estabilidade
conforme informa o fabricante.
No estudo de comparação, a variação entre as metodologias foi muito baixa,
o que mais uma vez confirma que, se forem seguidos critérios de execução,
identificação e avaliação de reticulócitos em um maior número de células contadas
em campos adequados na microscopia da metodologia manual; bem como, critérios
de execução e emprego tanto de calibração em equipamentos, quanto o uso de
controle comercial na metodologia automatizada, refletem em resultados de
contagens de reticulócitos mais precisos e confiáveis para o diagnóstico e
monitoramento de terapias de pacientes com doenças hematológicas, promovendo
qualidade ao laboratório clínico.
Davis et al.(1994) defende a grande precisão analítica de contadores
eletrônicos pela análise rápida de 20.000 a 50.000 eritrócitos na amostra e a
exclusão da subjetividade de reconhecimento do reticulócito pelos observadores da
técnica manual e que a padronizações dos comitês, como por exemplo, o NCCLS
devem ser seguidas.
Riley et al. (2002) apontaram, em seus estudos, os primeiros relatos da
utilização clínica da contagem de reticulócitos por citometria de fluxo (EPICS C)
através de fluorescência em comparação com a metodologia manual, que resultou
em uma correlação excelente (R=0,984). No entanto, os CV obtidos foram de 1,3% a
6,4% entre métodos, para a mesma amostra. Com a metodologia manual, estes
autores encontraram CV de 17,1% para contagens de reticulócitos acentuadamente
elevadas, e de 47,3% para contagens normais.
Alguns estudos de comparação entre a metodologia manual e a
automatização para contagem de reticulócitos, realizados com diversos
equipamentos, resultaram em: coeficientes de determinação (R
2
) com variações
entre 0,902 a 0,967 para o reticONE (COULTER) por Rabesandratana et al. (1998);
R
2
= 0,9916 para o XE-2100 (SYSMEX) por Briggs et al. (1999); CV – 6,5-24,1%, CV
– 3,5-18,1%, CV – 5,1-15,1%, CV – 4,3-15,0% e CV – 6,9-18,9% para o ADVIA 120,
o CELL DYN 4000 (ABBOTT), o GEN-S (COULTER), o SE 9500 RET e o VEGA
RETIC, respectivamente, por Buttarello et al. (2001); e R
2
= 0,774 e CV – 0,8-4,4%
para o GEN-S (COULTER) por Fernández et al. (2007). Portanto, há boa correlação
entre metodologia manual e automatizada. Estes autores observaram também, que
Resultados e Discussão
___________________________________________________
75
o coeficiente de variação para todos os métodos é menor quando o número de
reticulócitos está aumentado nas contagens e que, em situações de
reticulocitopenia, o CV é no mínimo de 11% e com certeza, apresentam os maiores
índices de discrepância entre as análises.
Em contrapartida, Nascimento e da Silva (1999) avaliaram 724 amostras com
resultados de leituras microscópicas de reticulócitos entre 0,5 e 1,5%, considerados
normais. No entanto, por metodologia automatizada, 11,2% dos pacientes
apresentaram reticulocitopenia.
Tabata et al. (1997), estudando contagens de reticulócitos em laboratório de
animais com ratos, cachorros e macacos, relacionaram a metodologia manual e
automatizada (Sysmex R-3000) e encontraram entre as 3 espécies, CV de 9,7-
20,5% para as contagens manuais e CV de 4,4-9,4% para a automatização. A
citometria de fluxo vem sendo cada vez mais empregada em estudos animais.
5. 3 ESTUDO DE COMPARAÇÃO ENTRE CORANTES DA METODOLOGIA
AUTOMATIZADA
Para o estudo de uma adaptação da metodologia automatizada empregando-
se um corante alternativo ao comercial, foram necessários vários testes até se obter
resultados aproximados aos das contagens relativas de reticulócitos aos
encontrados com o diluente-corante comercial fornecido pelo fabricante e que,
portanto, pudessem ser confiáveis. A concentração exata de corante azul de
metileno novo no reagente para reticulócitos Abbott é incerta.
Inicialmente, utilizou-se os dois corantes empregados na técnica manual, o
azul de cresil brilhante e o azul de metileno novo, isoladamente, sem a presença de
conservantes ou aditivos para as determinações da contagem automatizada de
reticulócitos, com as mesmas diluições e com volume constante de amostra,
conforme preconiza a técnica do fabricante. Nesta situação, não houve leituras de
reticulócitos pelo equipamento, provavelmente, devido à alta concentração do
corante para os retículos. Em seguida, testou-se diluições 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e
1:100 do azul de cresil brilhante e azul de metileno novo. Avaliando-se os resultados
sempre em comparação aos encontrados com o corante comercial do equipamento.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
76
Os resultados obtidos com o corante azul de cresil brilhante em todas as
diluições, embora reprodutíveis, foram discrepantes em relação aos do diluente-
corante do aparelho, tendo-se excluído o mesmo das próximas análises. O mesmo
ocorreu com os resultados obtidos com o azul de metileno novo, quando se
empregou as diluições 1:1, 1:80 e 1:100.
Assim, realizou-se novos testes com o corante azul de metileno novo com as
diluições 1:10, 1:20 e 1:40, com o objetivo de selecionar a melhor diluição, de forma
criteriosa. Testou-se a contagem de reticulócitos (%) em 10 repetições seriadas de
10 amostras com a finalidade de analisar a precisão dos resultados. Os melhores
valores das contagens de reticulócitos para a metodologia automatizada foram
obtidos com a diluição 1:10 (resultados não mostrados).
Uma vez eleito o azul de metileno novo 1:10 para a utilização na contagem
automatizada, realizou-se um estudo sistemático para comparação de médias com
o uso do corante comercial e azul de metileno novo 1:10, com maior número de
amostras (Tabela 9). A análise de variância mostrou que não foi observada diferença
entre as médias obtidas nas determinações com o corante comercial e com azul de
metileno novo 1:10 (p=0,9) e entre as repetições (p=0,63). O intercepto foi menor
que 0,05, indicando que existe certo grau de erro sistemático entre os dois métodos.
TABELA 9. ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA, MODELO FATORIAL) PARA
COMPARAÇÃO DE MÉDIAS ENTRE O USO DO CORANTE
COMERCIAL E AZUL DE METILENO NOVO 1:10
F. variação SQ GL QM F p
Intercepto 1659,28 1 1659,28
7770,44
0,000
Pacientes 357,50 49 357,50 34,17 0,000
Corantes 0,003 1 0,003 0,02 0,90
Repetição 0,052 1 0,052 0,24 0,62
Resíduo 31,60 148 0,21
Metodologia automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics);SQ - soma de
quadrados; GL - grau de liberdade; QM - quadrado médio; F - teste de variâncias;
p - probabilidade para a hipótese de nulidade; N = 50 pacientes com dois corantes
e em duas repetições independentes.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
77
A partir dos resultados de comparações de médias e dispersão, pode-se
inferir que: i) não houve diferença entre as repetições, indicando precisão nas
medidas. O gráfico de média das repetições está ilustrado na Figura 11; ii) houve
diferenças entre os resultados obtidos, indicando que a amostra era heterogênea. O
gráfico de dispersão da contagem de reticulócitos da Figura 12 confirma que a
amostra é heterogênea. Os valores das contagens variaram de 1,5 a 9%; iii) as
médias obtidas com os corantes são semelhantes. O gráfico de médias das
contagens está ilustrado na Figura 13.
FIGURA 11. GRÁFICO DA ANÁLISE DE REPETIÇÕES DOS DADOS
OBTIDOS PELA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS (%) COM
O CORANTE AZUL DE METILENO NOVO 1:10 EM 50
AMOSTRAS
Metodologia automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); rep -
Repetições das determinações de reticulócitos; as barras de erros indicam
95% de limite de confiança dos dados. N= 50 pacientes com dois corantes
em duas repetições independentes.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
78
FIGURA 12. GRÁFICO DA DISPERSÃO DA CONTAGEM DE
RETICULÓCITOS DE AMOSTRAS DE PACIENTES COM O
USO DOS CORANTES COMERCIAL E AZUL DE METILENO
NOVO NA DILUIÇÃO 1:10
Metodologia automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Cont.
Ret. – contagem de reticulócitos; as barras de erros indicam 95% de limite
de confiança dos dados. N = 50 pacientes com dois corantes em duas
repetições independentes.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
79
FIGURA 13. GRÁFICO DAS MÉDIAS DA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
DOS PACIENTES COM O USO DO CORANTE COMERCIAL E
AZUL DE METILENO NOVO NA DILUIÇÃO 1:10
Metodologia automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Cont. Ret. –
contagem de reticulócitos (%); com - corante comercial; amn - corante azul de
metileno novo preparado na diluição 1:10; as barras de erros indicam 95% de limite de
confiança dos dados. N = 50 pacientes com dois corantes em duas repetições
independentes.
O gráfico de dispersão ilustrado na Figura 14 mostra todos os resultados
obtidos de reticulócitos em percentagem de todas as amostras para a comparação
entre os dois tipos de corantes. Calcula-se, pela reta de regressão obtida, um erro
sistemático constante com valores aproximadamente 0,4% maiores para as
determinações com o corante azul de metileno novo (1:10) em relação ao comercial.
O erro casual (1- R
2
) é de 19%. Observando-se a distribuição de dados, fica claro
que há uma correlação entre os dois métodos. O erro de precisão não está muito
além do erro apresentado pela metodologia (±15%).
Resultados e Discussão
___________________________________________________
80
Podemos concluir que a adaptação de um corante preparado de forma
alternativa ao comercial, o azul de metileno novo 1 g/dl na diluição 1:10, substitui o
corante comercial apresentando resultados estatisticamente idênticos, (R= 0,9;
p=0,0000). Conseqüentemente, se calcularmos a concentração do corante
alternativo, o resultado será 0,1 g/dl, o que pode ser comparada com a concentração
relatada na fórmula do fabricante do equipamento, que é inferior a 0,2% ou 0,2 g/dl.
FIGURA 14. CORRELAÇÃO PARA AS CONTAGENS DE RETICULÓCITOS (%)
EM ANÁLISE DE COMPARAÇÃO ENTRE OS DADOS OBTIDOS
COM O CORANTE COMERCIAL E O AZUL DE METILENO NOVO
1:10
Metodologia automatizada: Cell Dyn 3500 SL (Abbott Diagnostics); Linha
Sólida – regressão linear estimada (amn = 0,3698 + 0,8821 x com); linhas
pontilhadas – 95% de limite de confiança para os resíduos. N = 50 pacientes
com dois corantes e em duas repetições independentes.
O desenvolvimento de técnicas com corantes supra-vitais estão sempre em
estudo. Sugihara et al. (2000) desenvolveram um procedimento de preparação em
Resultados e Discussão
___________________________________________________
81
colorações, utilizando a associação de azul de metileno novo e laranja de acridina
para aumentar o tempo de preservação de reticulócitos nas preparações. O teste
comparou as contagens de reticulócitos de ratos com o emprego de azul de
metileno novo, laranja de acridina e a associação de ambos os corantes obtida
através dos seguintes passos: a) a amostra foi tratada com 0,5% de azul de
metileno novo; b) misturada com metanol por 10 min para fixação e remoção do
azul de metileno novo e após a secagem; c) coloração com 0,007% de laranja de
acridina por 3 min, seguida de lavagem com tampão Sörensen (pH 6,8). A
freqüência de reticulócitos não foi afetada durante 95 dias.
Foi observado que, durante o processo de lavagem dos tubos contendo as
suspensões de corante e amostra utilizados para a determinação das contagens de
reticulócitos em automatização, para aqueles que continham o azul de metileno
novo, o processo de remoção com água e detergente foi fácil e mais rápido,
enquanto para aqueles que continham o azul de cresil brilhante, o processo foi mais
demorado, e visivelmente, apresentou um depósito (precipitado) mais resistente no
fundo do tubo, considerando-se, inicialmente, para o uso no equipamento, os
corantes foram filtrados várias vezes antes das determinações. Provavelmente, a
maior dificuldade de empregar o azul de cresil brilhante na metodologia
automatizada é a sua propriedade de solubilidade que exige maiores cuidados e
novos estudos, principalmente, para prevenir a formação de crostras do corante em
tubulações dos equipamentos e evitar entupimentos, uma vez que a força de
ligação com os restos de RNA parece ligeiramente maior que com o azul de
metileno novo.
Sabendo-se que os reagentes para a contagem de reticulócitos são
importados, em relação ao custo entre os corantes azul de metileno novo comercial
(Abbott Diagnostics) e azul de metileno novo preparado (INC. BIOMEDICALS INC.)
utilizados no estudo de comparação de metodologia automatizada, a diferença foi
de 87%. Um levantamento de preços foi realizado e, observou-se que, uma única
determinação com o reagente comercial custa em média, R$ 9,50, enquanto, com o
corante preparado na diluição que corresponde aos mesmos resultados, US$ 0,53
(R$ 1,22), para o corante a 70% ou de US$ 0,11 (R$ 0,25), para o corante a 90%,
deve-se considerar a cotação atual das moedas citadas.
Resultados e Discussão
___________________________________________________
82
A contagem de reticulócitos é, sem dúvida, um exame de grande importância
na rotina laboratorial para o acompanhamento de muitas condições clínicas. O fato
de que os laboratórios trabalham com metodologias diversas exige um controle de
qualidade rigoroso no sentido de se estudar os resultados obtidos e, especialmente,
a padronização das metodologias empregadas, para se diminuir as variações inter-
laboratórios e, assim, permitir a valorização das interpretações clínicas possíveis.
Neste trabalho, contribuiu-se com o estudo do erro na contagem de
reticulócitos, especialmente em relação à sua contagem manual, e com a proposta
de uma alternativa mais acessível à maioria dos laboratórios clínicos para a
contagem automatizada.
É relevante a continuidade dos estudos relativos à padronização e ao controle
de qualidade da contagem de reticulócitos, especialmente no que se refere ao
controle de qualidade externo, com comparações inter-laboratórios, envolvendo
contagens manuais e automatizadas, inclusive entre aparelhos eletrônicos de
diversas marcas e modelos. Novos estudos devem contemplar maior número de
amostras com valores abaixo do normal, que são os mais críticos do ponto de vista
clínico, e que, evidentemente, podem levar a maiores coeficientes de variação ou
mesmo, o preparo do corante azul de metileno novo 1 g/dl na diluição 1:10 com
outras soluções, como o oxalato de potássio por exemplo, visando aumentar a
estabilidade da suspensão.
6 CONCLUSÕES
Conclusões
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6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos em estudos realizados com a metodologia manual e
automatizada (ABBOTT Cell Dyn 3500 SL) para a contagem dos reticulócitos, em
amostras de sangue venoso do Laboratório Pontagrossense de Análises Clínicas,
Ponta Grossa – PR e do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário
da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, permitem concluir que:
Houve variações entre 12 observadores na contagem manual de 25
preparações, com erro casual (1-R
2
) de 4 a 60%, com perfil geral
similar entre os observadores, e sem diferenças intra-classes para
valores considerados baixos, médios e altos;
Na comparação entre metodologias manual e automatizada, com
amostras de 341 pacientes, a análise de variância (ANOVA) dos
resultados não demonstrou diferenças entre as médias obtidas com
as duas metodologias (p = 0,21), com valores de tendência central e
dispersão muito próximos.
No emprego de azul de metileno novo 1g/dl diluído 1:10 em NaCl
0,85 g/dl como corante-diluente alternativo, em comparação ao
fornecido pelo fabricante do aparelho, para contagem automatizada,
a análise de variância não mostrou diferenças entre as médias
obtidas (p = 0,9) e entre as repetições (p = 0,63), porém houve um
erro sistemático, com valores 0,4% maiores para as determinações
com o corante-diluente alternativo, bem como um erro casual (1- R
2
)
de 19%, dentro do erro apresentado pela metodologia.
Desta forma, conclui-se que: no estudo inter-observadores, o coeficiente de
correlação inter-observadores indicou resultados clinicamente úteis; a comparação
entre as metodologias manual e automatizada indicou precisão entre os dados
obtidos; e o corante-diluente alternativo apresentado pode substituir o corante-
diluente comercial, por apresentar resultados estatisticamente idênticos.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
___________________________________________________
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7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Anexo
__________________________________________________
93
ANEXO 1. MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ENTREGUE A PACIENTES PARTICIPANTES DO ESTUDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado a participar de um estudo intitulado “Estudo
comparativo de Métodos de contagem de Reticulócitos para Controle de Qualidade”.
Seu médico solicitou um Hemograma Completo e ou Contagem de Reticulócitos
para detectar algum quadro diagnóstico ou monitorização terapêutica. Solicitamos
sua autorização para ceder pequena quantidade de sangue para o estudo da
contagem de reticulócitos.
O objetivo desta pesquisa é estudar comparativamente os métodos de
contagem de execução manual e automatizado de reticulócitos, visando o Controle
de Qualidade laboratorial.
a) Caso você participe da pesquisa, não será necessário nada mais além da sua
autorização.
b) Como em qualquer tratamento, você poderá experimentar algum desconforto,
principalmente relacionado à entrada de uma agulha para a coleta de sangue.
No entanto, a punção de sangue é a mesma que será feita para a realização
dos seus exames, solicitados por seu médico.
c) Não há riscos para o seu tratamento ou para a sua saúde.
d) Contudo os benefícios esperados são: melhorar a qualidade dos exames
realizados em laboratórios de análises clínicas.
e) A pesquisadora e seus orientadores poderão esclarecer eventuais dúvidas a
respeito desta pesquisa.
f) A sua participação neste estudo é voluntária. Você tem a liberdade de se
recusar a participar ou, se aceitar participar, retirar o seu consentimento a
qualquer momento. Este fato não implicará na interrupção do seu atendimento,
que está assegurado.
g) As informações relacionadas ao estudo poderão ser inspecionadas pelos
médicos que executam a pesquisa e pelas autoridades legais. No entanto, se
qualquer informação for divulgada em relatório ou publicação, isto será feito sob
forma codificada, para que a confidencialidade seja mantida.
Anexo
__________________________________________________
94
h) Todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não são da sua
responsabilidade. Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer
valor em dinheiro.
Eu,_________________________________ li o texto acima e compreendi a
natureza e objetivo do estudo do qual fui convidado a participar. A explicação que
recebi menciona que não há nenhum risco envolvido. Eu entendi que sou livre para
interromper minha participação no estudo a qualquer momento sem justificar minha
decisão. Eu concordo voluntariamente em participar deste estudo.
_______________________________ __________________ _______________
NOME DO PACIENTE OU ASSINATURA LOCAL, DATA
RESPONSÁVEL LEGAL
_______________________________ __________________ _______________
NOME DO PESQUISADOR ASSINATURA LOCAL, DATA
Anexo
__________________________________________________
95
ANEXO 2. APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA ENVOLVENDO SERES
HUMANOS PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DO SETOR DE
CIÊNCIAS DA SAÚDE DA UFPR
Anexo
__________________________________________________
96
ANEXO 3. PLANILHA DE ORIENTAÇÃO E TRANSCRIÇÃO DE RESULTADOS
APLICADA AOS LABORATÓRIOS DE ANÁLISES CLÍNICAS PARTICIPANTES
RECOMENDAÇÕES
As amostras são processadas para a análise, perante o Consentimento Livre
e Esclarecido dos pacientes.
Estamos encaminhando duas lâminas de microscopia com extensões da
mistura de sangue e corante, para a contagem de reticulócitos em duplicata, dos
pacientes.
Seguem junto ao material de análise, os resultados do eritrograma de cada
paciente, para se efetuar cálculo de valores absolutos.
As leituras deverão ser realizadas no máximo até 48 horas após o preparo da
lâmina, sendo o ideal, logo após a sua confecção. Os resultados poderão ser
escritos na planilha abaixo conforme a numeração das lâminas de cada paciente,
informando a data da realização desta contagem.
PACIENTE
DATA DA LEITURA DA LÂMINA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS %
CONTAGEM ABSOLUTA
1
2
3
4
5
6
.
.
Anexo
__________________________________________________
97
ANEXO 4. PLANILHA DE AVALIAÇÃO APLICADA AOS LABORATÓRIOS DE
ANÁLISES CLÍNICAS PARTICIPANTES DA ANÁLISE
INTEROBSERVADORES PARA A CONTAGEM MANUAL DE
RETICULÓCITOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Nome do Laboratório:
Cidade/Estado:
Responsável pelo preenchimento:
1) Com relação à certificação:
1.1) O laboratório apresenta um programa definido e documentado que vise o Controle de
Qualidade das amostras analisadas? Qual?
2) Com relação ao Controle de Qualidade Externo:
2.1) O laboratório está inscrito em algum programa externo de Controle de Qualidade?
Qual?
2.2) O laboratório apresenta alguma sugestão para a melhoria nas avaliações do programa
de Controle de Qualidade Externo?
3) Com relação ao Controle de Qualidade Interno:
3.1) O laboratório apresenta um sistema interno de Controle de Qualidade?
3.2) Existe padronização para as técnicas executadas por esses profissionais na realização
da contagem de reticulócitos?
3.3) As técnicas utilizadas na execução da contagem de reticulócitos: preparo de reagentes;
suspensão de amostra e corante; extensão; microscopia ou contagem automatizada;
apresentam Procedimento Operacional Padrão (POP) já estabelecido? Quais os cuidados
básicos descritos no POP?
3.4) Se a contagem de reticulócitos é automatizada, qual o equipamento utilizado no setor
de hematologia para a contagem de reticulócitos ?
Anexo
__________________________________________________
98
ANEXO 5. DADOS OBTIDOS POR MEIO DE INSTRUMENTO DE AVALIAÇÃO
SOBRE A PARTICIPAÇÃO EM PROGRAMAS DE CONTROLE DE
QUALIDADE, A CERTIFICAÇÃO, UTILIZAÇÃO DE PROCEDIMENTOS
OPERACIONAIS PADRÃO E REALIZAÇÃO DE CONTAGEM DE
RETICULÓCITOS POR MÉTODO DE AUTOMAÇÃO DE 10
LABORATÓRIOS PARTICIPANTES NA REGIÃO DOS CAMPOS
GERAIS (PR).
Laboratório
CQE CQI Certificação POPs Automação
A SBAC nr Nc r nr
B nr nr Nc r nr
C SBAC r Nc r nr
D SBAC nr Nc r nr
E SBAC r Nc r nr
F SBAC nr Nc r nr
G SBAC r C
r nr
H CONTROL LAB r Nc r nr
I SBPC r Nc r r
J SBAC nr Nc r nr
r - realizado; nr - não realizado; c - certificado; nc - não certificado; CQE –
Controle de Qualidade Externo; CQI – Controle de Qualidade Interno; SBPC –
Sociedade Brasileira de Patologia Clínica; SBAC – Sociedade Brasileira de
Análises Clínicas; CONTROL LAB – empresa particular de Controle de Qualidade.
Anexo
__________________________________________________
99
ANEXO 6. INFORMAÇÕES QUANTO AOS CRITÉRIOS DE EXECUÇÃO,
IDENTIFICAÇÃO E CONTAGENS DE RETICULÓCITOS FORNECIDOS
PELOS OBSERVADORES DO TRABALHO E DOS LABORATÓRIOS
PARTICIPANTES
Critérios
Observador 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A s n s s s n nm n 1.000 - 2.000 200 n s
B s n s s p n nm n 1.000 - 4.000 200 n n
C s n s s p n s n 1.076 - 2.600 200 s s
D s s s s p n nm n 2.000 - 4.000 200 n s
E s n s s s n nm n 4.000 200 n s
F s n s s s n nm n 4.000 - 10.000 200 n s
G n n s s p n nm s 2.000 - 4.000 200 s s
H s n s s s n nm n 2.000 200 n n
I s n s s n n nm n 1.000 - 2.000 200 n s
J s n s s p n nm n 1.000 - 2.000 200 n n
K s n s s s n s n 4.000 - 10.000 200 p s
L s n s s s n s n 4.000 - 10.000 200 p s
1 - Critério de execução – o volume de amostra na preparação depende do volume globular do
paciente; 2 - Emprego de contra-coloração – corante hematológico May Grünwald Giemsa; 3 -
Microscopia óptica de alta resolução – aumento de 100x; 4 - Critérios de identificação – contagem de
reticulócitos com poucos e muitos grânulos de RNA; 5 - Tempo de leitura das lâminas – na data
prevista conforme orientação; 6 - Critérios de contagem – campos com sobreposição de células; 7 -
Cruzamento de dados com lâminas coradas May Grünwald Giemsa do hemograma; 8 - Realização de
contagem corrigida de reticulócitos – CRC; 9 - Quantidade média de células contadas na lâmina; 10 –
Quantidade média de células contadas ou avaliadas por campo; 11 - Realização de contagem total
de células por campo; 12 - Contagem de maior número de células quando o número de reticulócitos
for baixo.
s: sim; n: não; nm: não menciona; p: parcialmente.
Anexo
__________________________________________________
100
ANEXO 7. PARECER DE ACEITAÇÃO PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGO
Artigo Aprovado SGP/ RBHH
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia
Av. Nossa Sra. de Copacabana, 1.059 sala 1.201 -
Copacabana
Rio de Janeiro - RJ - Brazil
CEP 22060-001
Tel/Fax: (21) 2521-6905
email: brazilbloodjournal@yahoo.com.br
Rio de Janeiro, segunda-feira, 16 de fevereiro de 2009
Ilmo(a) Sr.(a)
Prof(a), Dr(a) Aguinaldo José do Nascimento
Referente ao manuscrito: 351
Classificação: Artigo Original
Temos o prazer de informar que o manuscrito Contagem manual de reticulócitos em
laboratórios de Análises Clínicas de Ponta Grossa e Campos Gerais, PR, Brasil foi aprovado
pelo Conselho Editorial da Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia e está na pauta
para publicação. Lembramos que algumas modificações poderão ser solicitadas até a
publicação do artigo.
Obrigado por submeter seu trabalho a RBHH e esperamos continuar merecendo sua
preferência para divulgação de suas pesquisas.
Atenciosamente,
Milton Artur Ruiz
Editor
Anexo
__________________________________________________
101
ANEXO 8. ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA BRASILEIRA DE
HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA (pdf)
Anexo
__________________________________________________
102
Analysis of manual reticulocyte counting in Clinical
Laboratories of Ponta-Grossa and Campos Gerais, PR,
Brazil
Contagem manual de reticulócitos em laboratórios de Análises Clínicas de
Ponta Grossa e Campos Gerais, PR, Brasil
Mackelly Simionatto
1
; Josiane Padilha de Paula
1
; Domenic Cicchetti
2
; Maria
Suely Soares Leonart
1
; Aguinaldo Jose do Nascimento
1*
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do
Paraná. Av. Lothário Meissmer, 632, Jardim Botânico
802210-170, Curitiba, PR
2
Department of Biometry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06512
Author for correspondence:
Aguinaldo José do Nascimento
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Universidade Federal do Paraná
Av. Lothário Meissmer, 632,
Jardim Botânico
802210-170, Curitiba, PR
ajnasc@ufpr.br
Running title: Analysis of manual reticulocyte counting
Anexo
__________________________________________________
103
RESUMO
A contagem do reticulócitos é usada extensamente na rotina laboratorial para avaliar
a atividade eritropoiética da medula óssea, e é de grande importância no diagnóstico e no
prognóstico na terapia de anemias hemolíticas. São coradas com o azul de metileno novo e
o azul cresil brilhante, o que conferem o aspecto característico de retículo quando
observado ao microscópio ótico. Critérios conhecidos foram observados para um bom
desempenho da contagem manual de reticulócitos, principalmente, atenção especial nas
películas do sangue durante a montagem das lâminas; contagem nos campos que não
contém sobreposição celular; e também no número de células avaliadas. O objetivo deste
estudo foi avaliar a variação interobservadores, analisar o erro estatístico da contagem
manual dos reticulócitos, e demonstrar as limitações deste método. A análise de correlação
intraclasses segundo Bartko [Psychol Rep 19:3,1966; 34:418,1974] foi usada para avaliar a
concordância entre 12 observadores em um total de 25 lâminas do sangue, com contagens
variadas de reticulócitos. Os resultados das análises estatísticas indicam que o erro casual,
calculado como (1-r
2
) variou de 4 a 60% entre os observadores. Embora ocorra imprecisão
entre os observadores, o perfil geral entre eles é similar, e o coeficiente de correlação
intraclasse indicou que os resultados obtidos são clinicamente úteis.
Palavras-chave: Hematologia, métodos estatísticos, contagem manual de reticulócitos
Anexo
__________________________________________________
104
ABSTRACT
Reticulocyte counting is widely used in the laboratory to evaluate bone marrow
erythropoietic activity, and has great diagnostic and prognostic importance for the therapy of
anemias. Reticulocytes are supravitally stained with new methylene blue or brilliant cresyl
blue, which confer the characteristic aspect of reticulum to their organeles, at light
microscopy. Known criteria were observed for a good performance of the reticulocyte manual
counting, with special attention paid to reticulocyte slides preparation; in counting in fields
that do not contain overlapping cells; and also in the number of evaluated cells. The aim of
this study was to evaluate the amount of interobserver variation and also to analyze the
statistical error of manual reticulocyte counting. The Intraclass correlation coefficient (ICC),
due to Bartko [Psychol Rep 19:3,1966; 34:418,1974] was used to evaluate the level of
agreement or concordance among 12 technologists who each evaluated the same 25 blood
smears, with variable reticulocyte counts. The results of statistical analyses showed that the
amount of random error, defined as (1-r
2
), varied from 4% to 60% among the technologists.
Although imprecision occurred, the overall profiles were quite similar, and intraclass
correlation coefficients indicated that the results obtained have clinical significance.
KEY-WORDS: Haematology, statistical methods, manual reticulocytes count
Anexo
__________________________________________________
105
INTRODUCTION
Reticulocytes are precursory to the erythrocyte cells in the blood. They are
anucleated cells, more rounded in shape and 20% greater, in volume, than the erythrocytes.
However, when stained with panoptic dyes (Romanowsky stain) they produce polychromatic
slides, due to the presence of mature red blood cells with hemoglobin, synthesized during
maturation, and reticulocytes with ribonucleic acid residues. These residues are stained with
new methylene blue or brilliant cresyl blue dyes which confer the characteristic aspect of
reticulum, when observed in optic microscopy. Such staining is not permanent¹. The
reticulocytes can be classified as mature or immature depending on the amount of granules
or reticula they contain².
Reticulocyte counting is routinely and widely used in the laboratory to evaluate bone
marrow erythropoietic activity. It is of great diagnostic and prognostic value in hemolytic
anemias, in acute hemorrhage, in response to iron, folic acid and vitamin B12 therapy
3
, as
well as, after chemotherapy or bone marrow transplant
4
. The manual method of reticulocyte
counting, described in 1930, is still very frequently used today due to its low cost in
comparison to the automated method that has seen widespread application since 1990.
However, manual counting presents some factors that cause great variation.
Peebles et al.
4
reported interobserver variation coefficients between 25% and 50%,
considered higher than would be expected. Therefore, manual counting must follow
standardized criteria of execution and identification in order to produce more precise results.
As suggested by the H-44 technique norms of the National Committee of Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) and of the International Committee for Standardization in Hematology
(ICSH), some criteria must be observed for a good performance of reticulocyte manual
counting. These would include paying special attention to the differentiation among
reticulocyte granules, Pappenheimer, Heinz, and Howell-Jolly bodies, or remaining dyes;
taking special care in the preparation of the reticulocyte slides; restricting the counting to
fields that do not contain overlapping cells; and also taking into account the number of
evaluated cells
5
.
Automated reticulocyte counting is based on the rapidly expanding technology of flow
cytometry that makes the determination fast, accurate, and efficient by counting a great
number of blood cells; and the methodology also provides information regarding the
reticulocytes. Parameters such as amount of hemoglobin and degree of reticulocyte maturity
Anexo
__________________________________________________
106
allow more trustworthy diagnostic and therapeutic monitoring, mainly for patients with lower
reticulocyte counts
6
. However, this methodology is still expensive, and this limits its routine
use in small and medium size laboratories.
Considering the relevance of the quality control of reticulocyte countings for the
detection of hematologic illnesses, the aim of this study was to evaluate interobserver
variations; to determine the amount of statistical error in manual reticulocyte counting, using
known criteria for its determination; and also to demonstrate the limitations of this method.
MATERIALS AND METHODS
Manual reticulocyte counting - Manual reticulocyte counting was carried out in accordance
with Lewis et al.
7
modified. A new methylene blue or brilliant cresyl blue solution (100µl) was
added to 200 - 250µl of blood, and incubated at 37ºC for 20-25 min. The blood volume to be
added to the dye depends on the volume of packed red blood cells volume (PCV), 200µl for
PCV equal or superior to 30% and 250µl for less than 30% PVC. After the incubation with the
dye, blood smears on glass slides were prepared for reticulocyte counting, for up to 72
hours.
Criteria for adequate blood smear counts - Blood smear was observed under optic
microscope objective immersion (100x). Both mature erythrocytes and well defined
reticulocytes could then be observed. The mature reticulocyte possesses few RNA filaments
or granules, while the youngest possess a great amount of granules. Erythrocytes that
present at least two small corpuscles or stained filaments are still considered to be
reticulocytes.
Adequate supravital staining should not be very weak at the point of not seeing the
reticule, nor very strong, at the point of becoming blurred or with thick reticule. The area to be
analyzed cannot have cells overlapping, or very fine fields, so that very few cells are
observed that show empty spaces between the cells.
According to Lewis et al.
7
, when the count is less than 10% a convenient method is to
survey successive fields until at least 100 reticulocytes have been counted; and to count total
Anexo
__________________________________________________
107
cells in at least ten fields in order to obtain an average number of cells per field. So, when the
percentage of reticulocytes decreases, the examiner must count more cells to obtain an
acceptable error. When the reticulocyte number exceeds 10%, the examination of a small
number of cells will be enough to get a standard error of less than 10%. It is consensual that
there must be about 200 erythrocytes in each field so that 20-50 fields are counted with less
than 1% reticulocytes.
Blood smear screening - A total of 25 blood smears was screened by professional
biochemists in 10 laboratories of Clinical Analyses in Ponta-Grossa and Campos Gerais, PR,
Brazil. The technologists were blinded and identified only as A to J. In a first approach, the
samples were carefully examined by technologists K and L. Each laboratory received the
slides numbered from 1 to 25 and they were asked to screen from 2 to 3 times a week,
during a 5 week period, between June 25
th
and July 30
th
2008, and within 48 hours after
receiving the slides.
Statistical analyses – The Intraclass Correlation Coefficient (ICC), due to Bartko
8,9
was used
to evaluate the level of agreement or concordance among technologists for parametric
measurements, for more than 2 raters
10
. Analyses were performed with the use of the on-line
statistical package of Hong Kong University
11
at the following website:
http://department.obg.cuhk.edu.hk/researchsupport/IntraClass_correlation.asp
The data were also analyzed by Pearson correlation, one way ANOVA and with the
Levey-Jennings quality control chart
12
. The criterion for statistical significance was set at the
nominal probability (p) level of p ≤ 0.05.
RESULTS AND DISCUSSIONS
In order to observe if the two technologists, K and L, were calibrated, by the
established criteria, their data were analyzed by Pearson correlation, as shown in Figure 1.
The systematic error reflected by the slope value close to unity shows that both technologists
produced quite concordant values. The random error, reflected by the variability of counts
Anexo
__________________________________________________
108
around the regression line shows very little imprecision between them. The “r” value close to
unity shows a high degree of correlation and concordance between the two technologists, as
evidenced by a random error (1-r
2
) of only 4.1%. The plot of the 25 blood smears, arranged
form lowest to highest values, illustrates the reticulocyte counts of the samples.
The statistical analyses of agreement for intra-class correlation for parametric data,
with more than two examiners
8
, using the “on-line” statistical package of the University of
Hong Kong
11
, is illustrated in Table I. Highest concordances were obtained between
technologists K and L. They were responsible for the blood smears mounting, in accordance
with the criteria established by LEWIS et al.
7
.
According to the criteria of Cicchetti and Sparrow
14
, Intraclass Correlation Coefficients
(ICCs) can be classified for levels of clinical significance as follows: poor, < 0.40; fair, 0.40 to
0.59; good, 0.60 to 0.74; excellent, 0.75 to 1.00.
The analyses performed on the total data (Table I) show that, except for technologist
I, all the technologists can be classified as having excellent ICCs .
With the data fractionated into low, medium and high counts, the sample sizes
became small, causing some difficulty in interpreting the full meaning of the correlational
analyses. However, the technologists do show certain difficulties in agreement for low counts
(not shown).
Considering all the data, the amount of random error (1-r²) was observed as follows:
<20% among technologists G, B, C and F; 10 - 40% among technologists D, J, H and A;
>40% for technologists E and I. Technologist I with K and L showed the lowest ICC value (r =
0.64) (Table I).
Using the one-way ANOVA, we compared the mean values of counts for
technologists K and L against each rater. The result is illustrated in Table II. No significant
statistical differences were observed for the mean reticulocyte counts (p > 0.05). The mean
values obtained for each rater are illustrated in Table III where it can be observed that
technologist G showed the highest super-estimation in the reticulocyte countings, while A
showed the lowest under-estimation.
The Levey-Jennings quality control plot
12
(Figure 2) for averages shows more clearly
that technologists B, D, F, J, K and L had similar results; A, C and I tended to sub-estimate
the counts; and E, G and H tended to super-estimate the reticulocyte counts. Figure 2 also
shows the quality control chart for amplitude and the high variability of the 25 blood smear
counts, especially the data of technologist I that was greatly sub estimated (p < 0.05). All
Anexo
__________________________________________________
109
this said, technologist I did not perform within the 48 hour time span, as requested. These
results are quite useful to signal the fact that the blood smears in glass slides are not stable
beyond the 48 hour span. The stated period for counts should be observed; otherwise it will
likely result in sub estimated counts.
Interesting results were obtained with the scatterplot of the 300 data points distributed
across 25 blood smears (Figure 3). Although some numerical discordance under statistical
analysis was observed, it can be seen that, as far as the high, low and average counts are
concerned, the profile among the technologists is quite similar, and the results obtained are
therefore clinically useful. Since great discrepancies are observed for reference values due
to variability in sex, age and different pathologies, the interobserver random errors should be
around 20%. Applying this criterion, the interobserver random errors of the present work was
higher than expected.
Normally erythrocytes do not contain inclusions. However many different inclusions
may be seen in various hematological disorders, and in a supravital preparation might be
confounded with a reticulocyte:
7,14,15
i) Pappenheimer bodies are in general a sole granule,
staining darker blue then reticulocytes granule. Pappenheimer bodies are secondary
lysossomes, variable in their composition of iron and protein, or mitochondria with iron
micelles that appears as small irregular basophilic deposits at cell periphery. The protein
matrix of the granule is staining with Romanowsky stains and the iron portion of the granule
is staining with Prussian blue; ii) Heinz bodies can be visualized with supravital stains as
clearly blue. They are discrete inclusion in contrast to the reticular filament material in a
reticulocyte. They are composed of aggregated, denatured hemoglobin and appear as
masses just under or attached to the cell membrane. When appearing singly, a Heinz body is
large, but when several are present in one cell, they are small; iii) Howell-Jolly bodies are
dark purple or violet spherical granules in the erythrocyte, usually occurring singly, rarely
more than two per cell. The granules are nuclear DNA fragments; iv) Basophilic stipplings
are bluish-black granules distributed intracellular, composed of aggregated ribosomes
(RNA), and they are sometimes associated with mitochondria and siderosomes; v)
Protozoan inclusions as Malaria and Babesia present blue ring with red dot in erythrocyte
and others evolution shapes (trophozoite stages) outside cells; vi) Erythrocyte artifacts that
occurs when cells are mechanically traumatized, or remaining dyes, can also confound the
identification of reticulocyte.
The results obtained in this work suggest that the experienced technologists involved
in this work have their own criteria, and they are not calibrated as proposed by Lewis et al
7
.
Anexo
__________________________________________________
110
Acknowledgments: the authors wish to thank each of the laboratory participants, for a
clinically valuable contribution.
REFERENCES
1. Wickramasinghe SN, Bain BF. Blood and Bone Marrow. 3
.
ed., New York: Churchill
Livingstone, v. 2, 1986.
2. Lee, GR. et al. Wintrobe’s Clinical Hematology. 10. ed. Baltimore: Lippincott William’s &
Wilkins, 1999.
3. Peebles DA, Hochberg, A; Clarke, TD. Analysis of Manual Reticulocyte Counting.
American Journal of Clinical Pathologists, 1981;76(5):713-717.
4. van Hove, L.; Schisano, T.; Brace, L. Anemia Diagnosis, Classification, and Monitoring
Using Cell-Dyn Technology Reviewed for the New Millennium. Laboratory Hematology,
2000;6:93-108.
5. Bain, BJ. Células Sanguíneas: um guia prático. 2. ed., Porto Alegre: Artes Médicas, 1997.
6. Davis, BH.; Bigelow, NC. Automated Reticulocyte Analysis. Diagnostic Hematology,
1994;8(4):617-630.
7. Lewis, SM.; Bain, B.; Bates, I. Hematologia Prática. 9. ed. São Paulo: Artmed,
2006.
Lewis, SM.; Bain, BJ.; Bates, I. Laboratory Hematology. 9 ed., London: Churchill
Livingstone, 2001
8. Bartko, JJ. The intraclass correlation coefficient as a measure of reliability. Psychological
Reports, 1966;19: 3-11.
9. Bartko, J.J. Corrective note to: “the intraclass correlation as a measure of reliability.”
Psychological Reports, 1974;34:418.
10. Portney LG, Watkins MP. Foundations of Clinical Research. Applications and
Practice Norwalk, Connecticut: Appleton & Lange, ISBN 0-8385-1065-5 p. 509-516,
1993.
11. Hong Kong University. On-line statistical programs.
Anexo
__________________________________________________
111
<http://department.obg.cuhk.edu.hk/index.asp?scr=1024> Access in September, 2008.
12. Shining, D; Shining, PD. Statistical control of process. In Juran's Quality Control
Handbook. J.M. Juran and Frank M. Gryna Ed. London: McGraw Hill, 1988
13. Cicchetti, DV.; Sparrow, SS. Developing criteria for establishing interrater reliability of
specific items: applications to assessment of adaptive behavior. American Journal of Mental
Deficiency , 1981;86:127-137.
14. Mckenzie, SB. Textbook of Hematology. 2. ed. Baltimore: William’s & Wilkins, 1996.
15. Stiene-Martin, EA; Lotspeich-Steininger, CA; Koepke, J A. Clinical Hematology:
Principles, Procedures, Correlations. 2. ed., Philadelphia: Lippincott, 1998.
Anexo
__________________________________________________
112
Table I. Intraclass correlations (ICCs) for
technologists “K”, “L” and the others for
reticulocyte counts (%)
Technologists
r
KL 0.9796
K L G 0.9365
K L B 0.9289
K L C 0.9130
K L F 0.9056
K L D 0.8810
K L J 0.8415
K L H 0.8134
K L A 0.8010
K L E 0.7610
K L I 0.6395
r – Intraclass correlations (ICCs)
Table II. One-way ANOVA for data of technologists “K”, “L” and the
others for reticulocyte counts (%)
Technologists
SS DF MS F P
KLF
0.0284 2 0.0142
0.0064
0.9936
KLD 0.1655 2 0.0828
0.0320
0.9686
KLB
0.3802 2 0.1901
0.0924
0.9118
KLJ
0.4140 2 0.2070
0.1009
0.9041
KLH
1.7507 2 0.8753
0.3046
0.7384
KLC 2.4932 2 1.2466
0.5794
0.5629
KLE
2.7364 2 1.3682
0.7018
0.4990
KLG
4.1180 2 2.0590
0.8659
0.4251
KLI
3.5230 2 1.7615
1.1371
0.3264
KLA 4.6645 2 2.3323
1.2722
0.2866
Total 29.6283 11 2.6935
1.3156
0.2150
SS - sum of square; DF- degrees of freedom; MS – medium square;
F - Test F for variance comparisons; p - probability error (error I in
statistical test of null hypothesis)
Anexo
__________________________________________________
113
Table III. Descriptive statistic for the technologists data of the reticulocyte counts
(%)
Technologists
N Mean Std.Dev.
Std.Err -95,00% +95,00%
G 23 2.200 1.636 0.341 1.493 2.907
E 25 2.094 1.169 0.234 1.611 2.576
H 25 2.012 2.035 0.407 1.172 2.852
J 25 1.843 1.293 0.259 1.309 2.376
B 25 1.836 1.299 0.260 1.300 2.372
L 25 1.714 1.516 0.303 1.088 2.340
F 25 1.681 1.463 0.293 1.077 2.285
K 25 1.667 1.477 0.295 1.057 2.277
D 25 1.599 1.814 0.363 0.851 2.348
C 24 1.300 1.402 0.286 0.709 1.892
I 25 1.232 0.406 0.081 1.065 1.400
A 23 1.148 0.971 0.203 0.728 1.568
Std.Dev.- standard deviation; Std.Err – standard error; -95.00%, +95.00% -
limits of confidence
Anexo
__________________________________________________
114
Figure 1. Data of technologist L plotted as a function of the data of
technologist K
n = 25 blood smears; the Pearson correlation r was 0.96.
Solid line – estimated regression line (y = 1.018x); dotted line –
95% limit of confidence for residues. Lines in cross – averages
values for x and y.
Anexo
__________________________________________________
115
Figure 2. Quality control plot for technologist profile on average reticulocyte counts
Quality control chart for average and range (SHAININ e SHAININ, 1993);
Solid line – grand mean; dotted line – dispersion limits
Anexo
__________________________________________________
116
Figure 3. Scatterplot of all reticulocyte counts (%) and all samples
- Technologists K, L and G; - Technologists A-J; thick
line – limit normal values between 0.5 to 2.5 % RC; thin
line – grand average (1.7%). The data of technologist I was
not included in this plot.
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