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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CRISTINA RUAN FERREIRA DE ARAÚJO
ESTUDO CLÍNICO-PATOLÓGICO DO CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
E IMUNOISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA
Natal/RN
2009
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CRISTINA RUAN FERREIRA DE ARAÚJO
ESTUDO CLÍNICO-PATOLÓGICO DO CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
E IMUNOISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral do
Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, em
cumprimento às exigências para obtenção do
título de Doutora em Patologia Oral.
Orientador: Prof.Dr. Leão Pereira Pinto
Natal/RN
2009
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DEDICATÓRIAS
DEDICATÓRIAS
Realizado este meu sonho eu o dedico, acima de tudo e de todos,
primeiro a quem me deu a vida, força e coragem para alcançá-lo - DEUS.
Sei que ainda não tenho a fé inabalável que busco todos os dias em
minhas orações; sou humana, cheia de imperfeições e pecadora mas foi a fé
concedida todos os dias, que me fez superar, muitas vezes sorrindo mesmo que por
dentro estivesse chorando, os obstáculos vivenciados durante o curso.
Dedico-o também às pessoas que sempre acreditaram em mim, desde
o meu nascimento, e nunca me abandonaram onde quer que eu estivesse – MINHA
FAMÍLIA.
Jesunita, exemplo de mãe, dedicada, protetora, sempre me
defendendo contra tudo e contra todos; com suas orações, foi meu porto seguro em
todos esses anos da minha existência.
Gelmires, que me deu o exemplo de ser gente, prova viva de quem
batalha por seus ideais e os alcança. Não foi à toa que decidi seguir a carreira
acadêmica, como meu pai.
A minhas amadas irmãs: Any Giselle e Tatiana, às quais tenho um
amor incondicional, que vai além de amor de irmã; é uma mistura de irmandade,
amizade, cumplicidade e como sou a mais velha, de mãe e filhas.
Juvita, minha vó e minha madrinha, minha eterna defensora, com seu
amor e predileção incondicional, sempre me deu o apoio emocional de que sempre
precisei.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Professor Dr. Leão Pereira Pinto
Palavras não são o bastante para expressar toda a minha gratidão por
meu querido orientador. Ao longo do curso descobri que, além de excelente
profissional, o ser humano incrível que é o Dr. Leão Pereira Pinto. Nunca esquecerei
quando, aos prantos, em sua sala, ele me disse: “Não tenho nada a reclamar sobre
você, e se tivesse que escolher de novo uma orientanda, escolheria você mil
vezes”....
Obrigada por ter sido meu orientador, amigo, cúmplice, me apoiar e
facilitar minha vida em alguns momentos e sempre torcer por mim; espero que nosso
laço de amizade não acabe ao término deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Aos demais familiares, principalmente a meu cunhado Fábio e minha tias
Nemise e Ydê
Obrigada por vocês serem quem são, sempre me ajudando, escutando
e acreditando no meu potencial; esta conquista também é de vocês.
Aos mestres
Profª Drª Lélia Batista de Souza – que, no seu jeito singular de ser,
contribui com este trabalho, com paciência e compreensão, além dos conselhos,
críticas, ensinamentos e ajuda durante o curso.
Profª Drª Roseana de Almeida Freitas – por todo o seu conhecimento
transmitido, conhecimento este patológico e de vida. Ciência e inteligência é a
combinação perfeita que melhor a define como profissional. Obrigada pelo carinho e
respeito, pelos trabalhos realizados e contribuições nesta pesquisa.
Profª Drª Lélia Maria Guedes Queiroz – minha quase futura parenta, a
afinidade inicial do curso fez com que eu a admirasse desde o primeiro instante;
sou-lhe grata pelos conselhos e ensinamentos durante o curso.
Profª Drª Hébel Cavalcanti Galvão – o que falar dessa mãezona, em
todos os sentidos? nunca vou esquecer sua voz doce e suave falando ”Cris, e aí...
como você está?”, obrigada por todo carinho, preocupação, conselhos e
ensinamentos; a senhora é um exemplo a ser seguido.
Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa – nosso tão querido
“Costinha”, sempre alto astral, incentivador, profissional inigualável; obrigada pelos
ensinamentos, conselhos e exemplo.
Profª Drª Márcia Cristina da Costa Miguel – professora jovem, decidida,
determinada e inteligente; você é exemplo para os que estão iniciando a carreira
acadêmica. Agradeço por contribuir, e muito, com o conhecimento científico ao longo
do curso.
Profº Drº Ângelo Roncalli – professor culto, inteligente, que realizou a
estatística do trabalho com toda presteza e sempre teve muita paciência com todos
os meus questionamentos. Muito obrigada!
Aos demais professores que, de uma forma ou de outra, participaram
do meu doutorado: Kênio e professora Ana Myrian, por toda paciência e
ensinamentos durante o curso.
Aos colegas e amigos de turma: Deborah, Pedro Paulo, Marcelo,
Domingos, Pollianna, George, Janaína, Claudine, Ericka Janine, Roberta, Bruna
Rafaela, Cynthia, Marianne, Emeline, Maiara, Thais, Felipe e Joabe, pelo
coleguismo e amizade, a eterna ajuda que eu sempre necessitava de última hora e
troca de experiências, sentirei saudades...
Amigos especiais
Já dizia o poeta: quem tem amigos, tem tudo. Acredito muito nas
pessoas que dizem que amigos são anjos enviados por Deus para nos proteger e
cuidar de nós aqui na terra.
Graças a Deus, Ele me proporcionou, durante o curso, a construção de
amizades; digo que são meus amigos-irmãos, e tenho certeza de que nem o tempo
nem a distância apagarão todo o sentimento e gratidão que tenho por essas
pessoas.
Betânia: conheci-a no mestrado e, quem diria que nossa amizade se
fortaleceria ainda mais quando você fosse fazer doutorado em minha terra; sempre
prestativa, companheira e conselheira para todas as horas. Obrigada!
Karuza: pantera cor de rosa...que me deu o querido apelido de
presepe; obrigada pela paciência quando dividimos apartamento, pela amizade,
companheirismo e socorro sempre que precisei.
Alexandre e Bruna Amaral – pensei que no mundo não houvessem
pessoas como vocês, puras de coração, alma limpa, transparente, cuja amizade me
fez acreditar que pessoas boas realmente existem; obrigada por tudo principalmente
pela presteza em me ajudarem sempre...minha eterna gratidão.
Karina que, mesmo fazendo parte do programa de pós-graduação de
outra faculdade, também fez parte dessa história, vindo uma vez por mês,
compartilhando momentos, me escutando, ajudando sempre que podia; mais uma
amizade conquistada; obrigada mesmo.
Existem pessoas que até hoje, quando paro para pensar como defini-
las em minha vida, não consigo; é um misto de amizade, irmandade, sentimento de
mãe-filha; realmente não sei... a única coisa que posso dizer é que se eu voltasse a
esta vida, mais umas 5 vezes, não pagaria o que elas fizeram por mim: Marta, Ruth,
Líbia e Valéria.
Marta – Amiga, companheira, mãe, irmã...momentos únicos
compartilhados; além de dividir apartamento dividimos também angústias,
problemas, alegrias e família; nossa família já é só uma..você foi minha professora
particular para a vida pessoal e profissional, e não importa a distância, Deus nos
uniu com um laço forte, que não se desata; OBRIGADA POR VOCÊ SER QUEM É...
Ruth minha amiga-irmã; sempre tivemos o mesmo orientador,
comungamos de todas as idéias, trabalhos; você foi um dos meus portos seguros
em Natal; sempre prestativa, aguentou todos os meus abusos, escutou as minhas
angústias, me socorreu em todos os meus chamados; como lhe agradecer....
Obrigada por tudo, minha irmã!
Líbia – pessoa única que em tão pouco tempo se tornou minha irmã;
também dividimos apartamento e hoje ainda dividimos tudo que passamos, nossa
família passou a ser uma só, pois vez ou outra estou em Caruaru e você em
Campina..OBRIGADA POR TUDO!
Valéria – minha amiga-irmã-mãe, obrigada por ser do jeitinho que você
é; alma pura, nunca a vi desejar mal a ninguém; pessoas como você estão em
extinção; seus ensinamentos de vida e profissional se farão eternos em minha
mente.
E no âmbito da minha amizade não poderia deixar de mencionar,
pessoas muito importantes, como:
Jozinete, minha professora da graduação, que aos poucos se tornou
bem mais do que isto, nunca me esqueceu ao longo dos anos; nosso contato é
constante; obrigada pela confiança em mim e por todos os momentos
compartilhados.
Gustavo, também alma pura e sem maldade; como lhe agradecer tudo,
principalmente a ajuda inicial antes de entrar nesse curso, mesmo sem me
conhecer; pessoas como você são poucas; como você mesmo sabe, você é uma
das poucas pessoas em quem confio plenamente...OBRIGADA POR TUDO!
Rosilene, apesar do pouco convívio não posso deixar de mencioná-la
como pessoa prestativa, graças à sua ajuda, mesmo de longe; hoje sou professora
da mesma disciplina que leciona; exemplo como o seu precisa ser
seguido...OBRIGADA!
Às minhas amigas de infância, colégio, graduação e mestrado, que
sempre torceram por mim e ainda hoje me escutam e apoiam...
Aos demais contribuintes desta pesquisa
Aos bolsistas da Liga: Ricardo e Clarissa, peças fundamentais no início
da pesquisa; quantos sábados juntos na busca dos blocos.
A Dr. Edilson Pinto (DEPECOM), Dr. Carlos César Formiga
(Laboratório de Anatomia-Patológica), Joelma, Kaline, Neide e Marcos, pela ajuda,
disponibilidade, acessibilidade à Liga Norte-Riograndese Contra o Câncer (LNRCC).
Muito Obrigada.
Andréa, cujo trabalho inicial com essas proteínas na patologia foi idéia
sua, agradeço por toda ajuda desprendida, sempre que precisei.
Cassiano, agradeço a ajuda inicial na preparação do projeto,
entendimento como um todo, e ajuda na escolha dos anticorpos.
A bibliotecária Cecília por sua gentileza e disposição por ter feito toda
revisão das normas e a ficha catalográfica dessa tese.
Aos funcionários da patologia oral – Hévio, Sandrinha, Gracinha,
Canindé, Idel, Lourdinha, pela ajuda no laboratório, na faculdade, por tornar os dias
mais leves no convívio diário.
Aos pacientes que, indiretamente, tornaram possível esta pesquisa.
À CAPES, pelo apoio financeiro essencial para a minha moradia e
estudos em Natal.
À UFRN, pela estrutura, qualidade de ensino e por receber e dar apoio
a todos os estudantes.
À Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer, por me disponibilizar o
material e condições adequadas para o desenvolvimento de parte desta pesquisa.
E aos demais, cujos nomes não foram citados mas que, de alguma
forma, contribuíram não apenas para esta pesquisa mas também com a minha vida
pessoal e profissional.
“Acho que sonhos não são apenas para serem sonhados, pois que monótono seria
se nossos sonhos ficassem sempre nessa posição...Hoje posso dizer que a graça,
mesmo do sonho, é vivermos cada momento com toda intensidade desse caminho
que conduz à sua realização....minha emoção não cabe nessas singelas folhas,
REALIZEI UM SONHO DE MENINA, fiz o meu doutorado e hoje sou professora
universitária..por isso repito: que graça tem um sonho sonhado e não um sonho
vivido”...
“Quem busca seus objetivos com dignidade e humildade obtém a vitória, as
dificuldades são muitas, mas a força de vencer é maior”
Cristina Ruan
RESUMO
RESUMO
As BMPs (proteínas morfogenéticas ósseas) são citocinas relacionadas
com a proliferação e angiogênese em diversos tipos de câncer humano. Com este
trabalho foi analisada a expressão imunoistoquímica das proteínas BMP-2, BMPR-
IA, BMPR-II e endoglina (CD105), correlacionando-a com o comportamento
biológico e a angiogênese local nos carcinomas epidermóides de língua (CEL). A
amostra foi composta de 25 casos de CEL sem metástase (CELSM), 25 CEL com
metástase (CELCM) graduados segundo Bryne (1998) e adaptado por Miranda
(2002), além de 25 casos de hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI), utilizado como
grupo controle. Foi utilizado escore 0 para marcação ausente-fraca e 1 para forte;
tipo de distribuição focal ou difuso. Adicionalmente, para o CD105 foi realizada a
contagem microvascular (MVC). A maior parte dos pacientes com CEL foi do sexo
masculino, no grupo CELSM a faixa etária foi maior que 65 anos e o CELCM se
encontrou entre 45-65 anos; houve predomínio do estágio II do TNM, assim como de
espécimes de alto grau, independente do grupo estudado. Para BMP-2, 56% dos
CELSM e 72% dos CELCM exibiram escore 1, enquanto a HFI exibiu 72% de escore
0, apresentando associação estatística (p=0,007). Para BMPR-II 52% dos CELSM
exibiram escore 0; 56% CELCM e 60% da HFI escore 1 e no BMPR-IA ocorreu uma
predominância de escore 1 e para o CD105 100% de marcação forte nos CEL.
Quanto ao tipo de distribuição notou-se tendência de distribuição difusa de todas as
proteínas, em todos os grupos. Observaram-se, para MVC, médias muito
semelhantes entre os CELSM (32,91) e os CELCM (32,05) exibindo, contudo,
diferença estatística com as HFI (p<0,001).Observa-se uma associação estatística
da BMP-2 com a BMPR-II (P=0,008), BMPR-IA (p=0,006) e o CD105 (0,046). Não se
observou associação entre o TNM e a imunoexpressão da BMP-2 e seus receptores,
porém foi encontrada com a MVC (p=0,047), cujas maiores médias foram para os
estágios II (35,97) e IV (35,69), tal como não ocorreu associação entre a gradação
histológica e as proteínas. Conclui-se que a superexpressão da via de sinalização da
BMP-2 atua na proliferação celular, contribuindo para maior invasividade do CEL. O
CD105 é um potente marcador de neovascularização deste neoplasma e sua
associação com a BMP-2 e o receptor BMPR-IA, mostra que neste tipo de neoplasia
a BMP-2 se apresenta como pró-angiogênico no processo metastático.
Palavras-chave: Carcinoma epidermóide de língua, Proteínas morfogenéticas
ósseas, CD105
ABSTRACT
ABSTRACT
Bone morphogenetic proteins (BMPs) are cytokines involved in proliferation and
angiogenesis of many kind of human cancer. The present study analyzed the
immunohistochemical expression of BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA and endoglin
(CD105) and their relationship with the biological behavior and local angiogenesis in
tongue oral squamous cells carcinoma (SCC). The sample consisted of 25 cases of
tongue SCC without metastasis, 25 tongue SCC with metastasis and 25 cases of
Inflamatory Fibrous Hyperplasia (IFH).The histological grade of malignancy proposed
by Bryne (1998), adapted by Miranda (2002) was used to classify all tongue SCC
cases. Score 0 was attributed to absent-weak immunoexpression and score 1 for
strong immunostaning and pattern of distribution was focal or diffuse. Microvessel
counts (MVC) was established for CD105. Most of the patients with tongue SCC was
male. The principal age in tongue SCC without metastasis was over 65 years and in
tongue SCC with metastasis was between 45-65 years. There were predominance of
stage II in TNM and in the specimens with high-grade, independent of studied group.
For BMP-2, 56% of tongue SCC without metastasis and 72% tongue SCC with
metastasis exhibited score 1 while the IFH showed secore 0 in 72% of the cases,
with statistical association (p=0,007). Considering the BMPR-II, 52% of tongue SCC
without metastasis exhibited score 0; 56% tongue SCC with metastasis and 60% IFH
showed score 1. The majority cases of BMPR-IA demonstrated score 1 and 100% of
CD105 exhibited strong immunoexpression in tongue SCC. Regarding the pattern
distribution, it was noted a tendency to diffuse pattern for the proteins in all groups.
The means of MVC were similar in tongue SCC without metastasis (32,91) and in
tongue SCC with metastasis (32,05), however existed statistical difference with IFH
(p<0,001). There was statistical association of BMP-2 expression with BMPR-II
(p=0,008), BMPR-IA (p=0,006) and CD105 (p=0,046). An association between TNM
and BMP-2 immunoexpression and their receptors was not detected, nevertheless
this association was found with MVC (p=0,047) whose averages were higher for the
stages II (35,97) e IV (35,69). No association between histological grading and these
proteins was observed. This study suggests that the superexpression of BMP-2
signaling pathways acts on cell proliferation in tongue SCC and can be implicated
with more invasive potential. Additionaly, the CD105 is a potent biological marker of
neovascularization in this neoplasm and their association with BMP-2 and BMPR-IA
receptor, showed that this type of cancer in BMP-2 is presented as pro-angiogenic in
the metastatic process
Keywords: Tongue squamous cell carcinoma, Bone Morphogenetic Proteins, CD105
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Sinalização via BMP.................................................................................41
Figura 2 – Forte expressão da BMP-2 em Carcinoma epidermóide de língua de alto
grau (SABC - 400x)....................................................................................................75
Figura 3 – Fraca expressão da BMPR-II em Carcinoma epidermóide de língua de
baixo grau (SABC - 400x)...........................................................................................75
Figura 4 –Forte expressão da BMPR-IA em Carcinoma epidermóide de língua de
baixo grau (SABC - 200x)...........................................................................................76
Figura 5 –Forte expressão da endoglina em Carcinoma epidermóide de língua de
alto grau (SABC - 400x).............................................................................................76
Figura 6 – Fraca expressão do BMPR-IA em Hiperplasia Fibro-epitelial da mucosa
oral. Detalhe de áreas mais coradas no estrato superficial do epitélio
(SABC100X)...............................................................................................................77
Figura 7 - Front invasivo do carcinoma epidermóide de baixo grau, de acordo com o
sistema proposto por Bryne (1998) (H/E – 40x).........................................................77
LISTA DE QUADROS
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Sistema de gradação histológica de malignidade no “front de invasão”
proposto por Bryne (1998)..........................................................................................58
Quadro 2 – Sistema de estadiamento clínico TNM para o CEO...............................59
Quadro 3 – Categorias de estadiamento clínico TNM para o CEO...........................60
Quadro 4 - Clone, especificidade, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados.......................................................................... 62
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo o
gênero e a faixa etária dos pacientes. Natal, RN, 2009............................................ 66
Tabela 2. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo o
estadiamento clínico (TNM). Natal, RN, 2009........................................................... 66
Tabela 3. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo a
gradação histológica proposta por Bryne (1998) e modificada por Miranda (2002)
Natal, RN, 2009......................................................................................................... 67
Tabela 4. Distribuição da expressão imunoisquímica quanto à intensidade das
proteínas BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e endoglina nos carcinomas epidermóides de
língua e no grupo controle, Natal, RN, 2009..............................................................68
Tabela 5. Expressão imunoisquímica quanto ao tipo de distribuição das proteínas
BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e endoglina nos carcinomas epidermóides de língua e no
grupo controle. Natal,RN, 2009..................................................................................69
Tabela 6 – Contagem microvascular (MVC) da endoglina nos carcinomas
epidermóides de língua e no grupo controle. Natal, RN, 2009..................................70
Tabela 7. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2 e seus receptores: BMPR-
II e BMPR-IA no carcinoma epidermóide de língua e no grupo controle. Natal, RN,
2009............................................................................................................................70
Tabela 8. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e o
índice angiogênico no carcinoma epidermóide de língua e grupo controle. Natal,RN,
2009............................................................................................................................71
Tabela 9. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e o
estadiamento clínico (TNM) no carcinoma epidermóide de língua. Natal, RN,
2009............................................................................................................................72
Tabela 10. Associação das médias do MVC da endoglina e o estadiamento clínico
(TNM) no carcinoma epidermóide de língua. Natal, RN, 2009...................................72
Tabela 11 – Associação da imunoexpressão das BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e a
gradação histológica de malignidade proposta por Bryne(1998), modificada por
Miranda (2002). Natal/RN, 2009.................................................................................73
Tabela 12. Associação das médias da MVC da endoglina e a gradação histológica
de malignidade proposta por Bryne (1998), modificada por Miranda (2002).
Natal,RN, 2009...........................................................................................................74
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AP – Adenoma pleomórfico
BMP – Do inglês, Bone Morphogenetic Proteins (Proteína Morfogenética
óssea)
BMPR - Do inglês, Bone Morphogenetic Proteins Receptor (Receptor de
Proteína Morfogenética óssea)
CEO - Carcinoma epidermóide oral
CXAP – Carcinoma ex adenoma pleomórfico
CD (CD31, CD34, CD105) – Do inglês, Cluster designation ou Cluster of
differentiation (grupo de designação ou grupo de diferenciação)
FvW- Fator de von Willebrand
FGF - Do inglês Fibroblast growth factor (Fator de crescimento fibroblástico)
HPV - Do inglês Human papilomavirus (Papiloma vírus humano)
INCA - Instituto Nacional do Câncer
MS – Ministério da Saúde
MVC - Do inglês Microvessel counting (Contagem microvascular)
MVD - Do inglês Microvessel density (Densidade microvascular)
OMS – Organização Mundial de Saúde
PCNA - Do inglês Proliferating cell nuclear antigen (Antígeno nuclear de
proliferação celular)
RNAm - Do inglês menseger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
SABC - Do inglês streptoavidin-biotin complex (complexo estreptoavidina
biotina)
RT-PCR - Do inglês Reverse transcription polimerase chain reactio, (Reação
em cadeia da polimerase com transcrição reversa)
TGF - Do inglês Transforming growth factor (Fator transformante de
crescimento)
TNM - Do inglês Tumor- Node-Metastasis (Tamanho do tumor, envolvimento
de linfonodo regional e envolvimento por metástases distantes)
TOA – Tumor Odontogênico Adenomatóide
UICC – União Internacional Contra o Câncer
VEGF - Do inglês Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento
endotelial vascular)
SUMÁRIO
S U M Á R I O
1
INTRODUÇÃO..................................................................................
27
2
REVISÃO DA LITERATURA............................................................
30
2.1
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL ...............................................
31
2.2
BMPs: CONSIDERAÇÕES GERAIS.................................................
36
2.2.1
BMPs X câncer..................................................................................
39
2.2.2
BMPs e seus receptores..................................................................
40
2.2.3
BMPs e seus antagonistas................................................................
42
2.2.4
BMPs em lesões orais.......................................................................
45
2.2.5
BMPs e angiogenese........................................................................
47
2.3
ANGIOGENESE E ENDOGLINA......................................................
48
3
PROPOSIÇÃO.................................................................................
53
4
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................
55
4.1
CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO...................................................
56
4.2
POPULAÇÃO....................................................................................
56
4.3
SELEÇÃO DA AMOSTRA.................................................................
56
4.3.1
Critérios de inclusão da amostra.......................................................
57
4.3.2
Critérios de exclusão.........................................................................
57
4.4
ESTUDO MORFOLÓGICO...............................................................
57
4.5
ESTADIAMENTO CLÍNICO DO TUMOR (TNM)..............................
59
4.6
ESTUDO IMUNOISTOQUIMICO......................................................
60
4.6.1
Método imunoistoquímico................................................................
60
4.6.2
Análise do perfil imunoistoquímico....................................................
63
4.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................
64
4.8
IMPLICAÇÕES ÉTICAS...................................................................
64
5
RESULTADOS..................................................................................
65
5.1
DADOS CLÍNICOS............................................................................
66
5.2
RESULTADOS MORFOLÓGICOS...................................................
67
5.3
RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS...........................................
67
6
DISCUSSÃO.....................................................................................
78
7
CONCLUSÕES.................................................................................
91
REFERÊNCIAS.................................................................................................
93
APÊNDICE
ANEXO
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
O câncer oral é o oitavo tipo de câncer no universo de ocorrências
malignas, havendo diferenças de incidência, na dependência da localização
geográfica (MASSANO et al., 2006). Deste, o carcinoma epidermóide oral (CEO) é o
responsável por cerca de 90 a 95% dos casos, correspondendo de 2% a 3% de
todas as neoplasias (CHOI et al., 2006; HARDISSON, 2003; LIANG et al., 2008).
O CEO pode originar-se em qualquer parte da cavidade oral sendo que
os sítios anatômicos mais acometidos variam geograficamente, refletindo diferentes
fatores de risco, de acordo com a população estudada (JOHNSON et al., 2005).
Para os carcinomas epidermóides intra-orais, há uma maior propensão
de ocorrência na língua, sendo a borda lateral, a região mais afetada. Exibem
significativa tendência à recorrência pós-cirúrgica, apresentam grande predisposição
para produzir metástases em linfonodos regionais e são, dentre os tumores orais, os
que detem as piores taxas de sobrevida (ANTUNES et al., 2007; DANTAS et al.,
2003; HARRISON et al., 2003; NEVILLE et al., 2004; O’CHAROENRAT et al., 2003).
Segundo Whitman (1998); Botchkarev et al. (2002), as BMPs são
consideradas componentes de um sistema de sinalização capaz de regular em
animais o crescimento celular, diferenciação, apoptose, quimiotaxia, angiogênese e
produção de matriz no desenvolvimento embrionário e no pós-natal.
Estudos tem demonstrado que as BMPs tenham efetiva participação no
crescimento de neoplasias considerando-se que a mesma pode exercer efeito pró-
tumoral em estágios mais avançados do desenvolvimento neoplásico e favorecer a
disseminação de metástase ao induzir a expressão de determinadas proteínas,
como o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e, assim, ter efeito pró-
angiogênico. Portanto, a elevada expressão dessas citocinas em tumores pode estar
associada a um prognóstico pior (DERYNCK; AKHURST; BALMAIN, 2001; JANDA
et al, 2002; LEVY; HILL, 2006).
A endoglina (CD105) é uma proteína transmembrana altamente
expressa em células endoteliais vasculares humanas, sendo um potente indicador
de índice angiogênico, que interage com uma complexa via de sinalização de
receptores de múltiplos membros da superfamília TGFβ, como TGFβ1, β3, activina –
A, BMP-7 e BMP-2 (BARBARA; WRANA; LETARTE, 1999; LIORCA et al., 2007)).
A especificidade da sinalização via BMPs é controlada pelos
receptores que podem estar superexpressos ou subexpressos, porém inativos,
devido à interação com antagonistas extracelulares das BMPs, os quais podem
encontrar-se superexpressos nos estágios mais avançados da progressão tumoral
(HSU et al., 2005).
No complexo quadro da tumorigênese e sua evolução, tem-se a
considerar de fundamental importância o comportamento comprometedor que
exercem as neoplasias malignas sobre o equilíbrio biológico do corpo humano; logo,
este trabalho tem por objetivo realizar um estudo imunoistoquímico das BMP-2,
BMPR-IA e BMPR-II e da endoglina através do qual se pretende buscar novos
conhecimentos sobre o mecanismo de formação e progressão do Carcinoma
Epidermóide de língua, por ser este o tumor maligno de maior ocorrência na
cavidade oral, com severo comprometimento sobre todo o organismo, haja vista que
a lesão exibe taxas elevadas de mortalidade, apesar dos avanços terapêuticos e de
diagnósticos existentes atualmente.
REVISÃO DA LITERATURA
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço apresenta-se como
uma doença heterogênea tornando seu prognóstico difícil de ser estabelecido, por
estar condicionado a múltiplas variáveis, como características histopatológicas,
extensão e localização do tumor primário, grau de invasão das estruturas vizinhas,
presença de metástase regional e à distância e estado geral de saúde do paciente
(BRANDIZZI, 2008).
De acordo com o INCA (2008), a estimativa de incidência de câncer de
boca para 2008 no Brasil encontrou-se como o 5º mais frequente entre homens (com
10.380 casos estimados) e o 7º entre mulheres (com 3.780 casos estimados). A
região Nordeste encontrou-se na segunda posição das regiões com o maior número
de ocorrências com estimativas para a Paraíba de 110 casos/ homem para 80
casos/mulher e no Rio Grande do Norte a previsão foi de 100 casos/ homem para 90
casos/ mulher.
Os principais agentes carcinogênicos associados ao desenvolvimento
desses tumores são o tabaco, álcool e a radiação ultravioleta (relacionada ao
carcinoma de lábio inferior) embora os estudos estejam sendo direcionados para o
entendimento da ação de outros agentes oncogênicos, como a participação dos
vírus, especificamente o HPV (BRANDIZZI et al., 2008).
O carcinoma epidermóide oral (CEO) exibe elevadas taxas de
mortalidade, mesmo com o avanço nas modalidades terapêuticas nos últimos 10
anos, o que se atribui principalmente à resposta variada ao tratamento e às falhas
no diagnóstico precoce (BHATTACHARYYA; NAYAK, 2005; CHOI et al., 2006).
Justificado esse fato na pesquisa realizada por Brandizzi et al. (2008), onde, de 274
pacientes com CEO, 66% foram diagnosticados em estágios TNM avançados (III e
IV), assim como no estudo com pacientes jovens (média de 40 anos) realizado por
Ribeiro et al. (2008), 65% da amostra se encontravam nesses mesmos estágios
evidenciando que o diagnóstico tardio ocorre independente da idade da população
acometida por esta neoplasia.
Os sítios anatômicos mais acometidos pelo carcinoma epidermóide
oral envolvem língua, lábio inferior e assoalho da boca, com altos índices de
morbidade e mortalidade (NEVILLE et al., 2004; INCA 2008).
Na maioria dos países, a língua é a mais frequente localização
topográfica das neoplasias malignas da boca; entretanto, há uma significativa
variação geográfica e o aumento da incidência nessa localização tem sido registrado
principalmente em pessoas jovens, enquanto que em outras localizações tem
diminuído (SHIBOSKI; SCHMIDT; JORDAN, 2005). Em estudo retrospectivo (vinte
anos) realizado em um hospital de referência de Recife, PE, com 174 pacientes
portadores de carcinoma epidermóide de língua, observou-se que 79,2% das lesões
estavam localizadas em borda lateral (ANTUNES et al., 2007). A base da língua
possui quando acometida, o agravante de ser de difícil acesso e visualização,
fazendo com que os profissionais ignorem sua presença e o seu diagnóstico seja
tardio. Em uma amostra de 290 pacientes portadores de tal neoplasia, 32,4% eram
T3 e 50,7% T4 (AMORIM FILHO et al., 2004).
O carcinoma de língua acomete, predominantemente, o sexo
masculino, entre as quinta e sexta décadas de vida, e está diretamente relacionado
ao consumo do tabaco e álcool, com predomínio do diagnóstico nos estágios
clínicos III e IV, representando 22% a 49% de todos os cânceres orais
diagnosticados (AMORIM FILHO et al., 2003; ANTUNES et al., 2007; BAUMAN et
al., 2003; DANTAS et al., 2003).
Vários estudos epidemiológicos estão mostrando aumento da
frequência desta neoplasia em pacientes jovens (abaixo de 45 anos) não fumantes e
não etilista podendo, assim, a etiologia estar relacionada a outros fatores como o
HPV (LIANG et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008). Foi com esta proposição que Liang
et al. (2008) estudando 51 espécimes de carcinomas dos 2/3 anteriores da língua,
observaram a presença do HPV apenas em um caso porém em um estudo anterior,
realizado no mesmo hospital, com carcinoma de base de língua, observou-se uma
frequência de 51,5%, concluindo-se, assim, que a correlação HPV-carcinoma de
língua pode estar relacionada à localização da lesão (UKPO, 2007).
O tratamento para o carcinoma de língua em estágio inicial é o
cirúrgico porém a associação de cirurgia e radioterapia pós-operatória constitui o
tratamento padrão nos carcinomas epidermóides das vias aerodigestivas superiores
em estágio avançado. Tal evolução é representada pela presença de metástases
regionais ou à distância e para características que configuram o estádio clínico III
e/ou IV. Associado a essas condutas tem-se o esvaziamento cervical mesmo na
ausência de metástases clinicamente identificáveis, considerando que a taxa de
metástases ocultas é superior a 30% (AMAR et al. 2003).
O estadiamento clínico TNM constitui a forma de comunicação para
planejamento do tratamento nos centros oncológicos de todo o mundo e tem sido
universalmente aceito como indicador de agressividade dos CEOs. Este sistema
exibe muitas qualidades, pois, segundo Costa, Araújo Júnior e Ramos (2005) e Choi
et al. (2006) avalia características fundamentais do câncer como extensão local (T),
disseminação regional (N) e metástases à distância (M).
O conhecimento do comportamento biológico e da evolução das
neoplasias é essencial para adoção de medidas terapêuticas. Desta forma,
numerosas pesquisas tem sido realizadas visando encontrar mais ferramentas que
venham auxiliar, juntamente com o TNM, nos procedimentos terapêuticos
(SILVEIRA, 2007).
Os parâmetros histológicos concernentes à relação tumor-hospedeiro
do carcinoma epidermóide são considerados importantes na predição de futuras
metástases para linfonodos regionais e no prognóstico (DEDIVITIS; SEMENTILLI;
NISHIMOTO, 2003).
Histologicamente, o carcinoma epidermóide oral apresenta-se como
uma proliferação de células da camada espinhosa, que se dispõe em grupos
celulares, formando cordões e ninhos ou, isoladamente, dispersa em estroma. As
células neoplásicas exibem hipercromatismo nuclear, pleomorfismo celular, aumento
do número de figuras de mitose e mitoses atípicas, dentre outras alterações da
normalidade (NEVILLE et al. 2004).
A gradação histológica de malignidade do carcinoma epidermóide oral
é um recurso microscópico que visa classificar a lesão de acordo com o grau de
diferenciação celular, no intuito de fornecer subsídios que possibilitem a
interpretação da agressividade do tumor (MARTINS NETO, 1999).
Na busca de parâmetros morfológicos que retratassem ao máximo a
biologia e o comportamento tumoral é que inúmeras gradações histológicas de
malignidade vem sendo propostas ao longo dos anos, desde a classificação de
Broders (1920), a primeira a ser publicada, baseada na proporção de células
diferenciadas, passando por Jakobsson et al. (1973), Wahi (1971), Anneroth,
Batsakis e Luna (1987) até uma das mais atuais, como a proposta por Bryne et al.
(1989) e aperfeiçoada por ela, em 1998.
Em 1989 Bryne et al., estudando 68 espécimes de carcinomas
epidermóides orais, testaram um sistema de gradação de malignidade, baseado
naquele preconizado por Anneroth, Batsakis e Luna (1987), considerando os
seguintes parâmetros: grau de ceratinização, pleomorfismo celular, número de
mitoses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório
linfoplasmocitário mas com avaliação apenas da área mais invasiva do tumor e
sugeriram excluir o parâmetro estágio de invasão e o escore final passou a ser a
somatória dos valores obtidos por cada parâmetro, considerados de baixo escore os
valores de 5 a 10 e alto escore de malignidade os valores superiores a estes. Os
autores observaram que o sistema utilizado tem maior valor prognóstico em
carcinomas epidermóides orais que o método de Broders (1920) e concluíram que
as características histológicas das áreas mais invasivas dos tumores são
importantes indicadores do seu comportamento clínico.
Bryne (1998) revisando seus estudos sobre o sistema de gradação
histológica de malignidade, desenvolveu um sistema retirando: o parâmetro figuras
de mitose, baseando-se na análise do grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear,
padrão de invasão tumoral e infiltrado inflamatório e considerando o front de invasão
tumoral como alvo da análise; também foram atribuídos valores numéricos de 1 a 4
para cada um desses parâmetros; este sistema mostrou não ser só uma importante
ferramenta no diagnóstico mas também para a terapêutica dos tumores, sugerindo
que a gradação do “front” invasivo é um dado valioso para a análise histológica.
Miranda (2002), estudando carcinomas linguais e labiais, adotou o
sistema de gradação histopatológica de Bryne (1998); entretanto, como o parâmetro
número de mitoses foi abolido pela autora nesta gradação e nenhuma alteração foi
realizada quanto ao escore final, Miranda sugeriu que também a pontuação
necessária para a classificação do grau de malignidade da lesão fosse modificada,
passando a ser: 4 a 8 pontos para baixo grau e mais de 8 pontos para alto grau de
malignidade.
Para Costa et al. (2002), pelos seus estudos, no carcinoma
epidermóide oral existe uma correlação positiva entre o Sistema TNM e a gradação
histológica de malignidade (WAHI, 1971). Acrescentam os autores que esta
correlação pode ser evidenciada também entre o TNM e a localização anatômica da
lesão.
Em 2005 Costa, Araújo Júnior e Ramos correlacionaram a
classificação clínica TNM com as características histopatológicas (grau de
ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado
linfoplasmocitário) e os escores histológicos de malignidade (BRYNE, 1998) de 38
casos de carcinoma epidermóide oral nas áreas mais profundas da lesão. A
classificação clínica TNM teve uma correlação estatisticamente significativa com
grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e infiltrado linfoplasmocitário, tal como
com os escores médios de malignidade. Esses resultados altamente significativas
indicam que as áreas invasivas podem ser primariamente responsáveis pelo
comportamento clinico do tumor e isto pode ser imprescindível para a escolha da
terapia do carcinoma epidermóide oral.
Dantas et al. (2003) estudando a correlação entre a classificação TNM
e escores histológicos de malignidade e a correlação desses parâmetros com o
prognóstico em 16 casos de carcinoma epidermóide de língua, verificaram que não
houve correlação entre o TNM e escores histológicos de malignidade; entretanto,
ocorreu entre o TNM e o prognóstico, fato não observado entre o prognóstico e
escores histológicos de malignidade.
Silveira et al. (2007) analisando o front de invasão, como recomendado
por Bryne (1998) de 30 casos de carcinoma epidermóide de língua verificou que
esse sistema de gradação não refletiu o comportamento biológico dos carcinomas
epidermóides de língua estudados, havendo necessidade que mais pesquisas
busquem parâmetros morfológicos que possam auxiliar o oncologista no tratamento
desta neoplasia.
Nos últimos anos, com o advento de inúmeras técnicas moleculares a
busca por biomarcadores que retratem a realidade do complexo processo da
tumorigênese, e possam ser correlacionados com parâmetros clínicos e
histopatológicos, estão sendo exaustivamente pesquisados para que, ao final, se
possa correlacioná-los com o prognóstico e obter, assim, uma sobrevida maior para
os pacientes acometidos pelo câncer, dentre os quais, se destacam as BMPs.
2.2 BMPs – CONSIDERAÇÕES GERAIS
As BMPs (proteínas morfogenéticas do osso) são citocinas
pleiotrópicas, membros da superfamília TGFβ, que exercem múltiplas funções em
diversos tipos de células e tecidos, incluindo proliferação, apoptose, quimiotaxia,
angiogênese e produção de matriz durante o desenvolvimento embrionário e a vida
adulta. Cerca de vinte membros de BMPs tem sido identificados em uma ampla
variedade de organismos, desde inseto a mamíferos (HSU et al., 2005; KIM;KIM,
2006; STEINERT et al., 2008).
Em 1972 a indução de proteínas morfogenéticas humanas por
desmineralização da matriz óssea livre de células, conduziu ao isolamento e
purificação das BMPs mas, com o avanço das pesquisas, elas foram clonadas e
recombinadas. Observou-se seu relevante potencial biológico participando da
morfogênese, desenvolvimento e homeostase de diversos órgãos como o coração,
rim, cérebro, olhos, pulmão, pele, dente etc; ante esses achados se propôs que as
mesmas não fossem tão somente consideradas proteínas relacionadas com o tecido
ósseo, sendo então denominadas proteínas morfogenéticas do corpo (BMPs)
(REDDI, 2005).
Pesquisas nas áreas de embriologia, genética e carcinogênese,
evidenciam que perturbações na via de sinalização das BMPs contribuem para o
desenvolvimento de neoplasias, sendo que os primeiros indícios surgiram a partir de
estudos genéticos de síndromes de câncer familial, como a Polipose Juvenil
Familial, em que mutações do Smad-4, proteína intracelular que participa da
sinalização das BMPs, e do BMPR-IA estão implicadas na origem da doença (HSU
et al, 2005). Mutações no BMPR-IA foram identificadas em portadores da Síndrome
de Cowden, que é uma síndrome de câncer de mama hereditário. Adicionalmente, a
via de sinalização das BMPs encontra-se alterada em cânceres humanos
esporádicos e a atuação dessas proteínas em carcinogênese é complexa, pois
envolve tanto efeitos pró-tumorais, como anti-tumorais (HSU et al., 2005; DERYNCK;
AKHURST; BALMAIN, 2001).
As BMPs são proteínas diméricas com pontes dissulfeto interligando
suas cadeias; e esta conformação é requerida para sua ação biológica. Sofrem
dimerização e suas moléculas são clivadas proteoliticamente na região carboxi-
terminal durante a secreção. Uma vez secretadas, ligantes diméricos maduros com
peso de 21-25 KDa se ligam a receptores de membrana em células alvos e,
concomitantemente, reguladores como o Noggin e o Chordin, regulam a
movimentação e função dessas BMPs (BALEMANS; VAN HUL, 2002; KIM; KIM,
2006).
A sinalização pelas BMPs é mediada por receptores transmembrana
treonina- serina quinase; três tipos de receptores I tem mostrado ligar-se as BMPs:
receptor activin tipo IA (ActRIA ou Alk 2), tipo IA (BMPR-IA ou Alk3) e IB (BMPR-IB
ou Alk6). Tem-se identificado, também, três tipos de receptores II, consistindo em
receptor tipo II BMP (BMPR-II), tipo IIA (ActR-IIA) e o tipo IIB (ActR-IIB). A
especificidade de sinalização da BMP é largamente mediada por receptores tipo I.
Estudos in vitro indicam que todos os membros das BMPs se ligam a receptores
BMPR-II em combinação com BMPR-IA, embora exista uma combinação
preferencial entre ligantes e receptores (HSU et al., 2005; KIM; KIM, 2006).
O papel das BMPs no desenvolvimento de tumores epiteliais ainda é
incerto razão pela qual vários estudos tem sido realizados para elucidar os seus
mecanismos de atuação nos diversos tecidos do organismo humano. Na cavidade
oral lesões reativas e neoplásicas podem originar-se do epitélio de revestimento;
entre estas se destaca o carcinoma epidermóide oral, como já referenciado.
Para Hsu et al. (2005), as BMPs podem atuar não só como oncogene
mas também como supressor tumoral, a depender do estágio da doença e da sua
concentração fisiológica na matriz tumoral. Adicionalmente, os efeitos das BMPs são
célula-específico e, por isso, podem variar entre os diversos tipos tumorais, inclusive
naqueles de mesma origem celular. Langenfeld et al. (2005) ainda mencionam que
as condições de cultura em estudos in vitro, tal como a concentração de
antagonistas intra e extracelular, interferem na atividade biológica das BMPs.
Na complexa via de sinalização das BMPs verifica-se a participação
extracelular de antagonistas como o noggin, chordin, folistatina, proteínas da família
Dan, que controlam a concentração total de BMPs. Dentro do citoplasma existem
inibidores Smads e ainda se pode observar a participação de pseudo-receptores
transmembranas BAMBI (BMP and Activin membrane-bound inhibitor) (BALEMANS;
VAN HUL, 2002; HSU et al., 2005; SEBALD et al., 2004).
A BMP-2, uma citocina com várias funções, influencia na diferenciação
de muitos tipos celulares. Embora seu efeito esteja limitado ao tempo de exposição
e à concentração, está claro seu envolvimento no desenvolvimento das glândulas
mamárias e em eventos da tumorigênese como angiogênese, apoptose, crescimento
e migração. Foi partindo desta premissa que Steinert et al. (2008) investigaram a
influência da BMP-2 em linhagens de células de câncer de mama (MCF-7) exposto a
uma única aplicação de BMP-2 comparando-o com contínuas aplicações de altos
níveis de BMP-2. Os dados mais relevantes se referem ao fato de, em curto período
de exposição, verificou-se que 15 genes associados à apoptose estavam alterados
enquanto em período mais prolongado só se detectaram oito genes; observou-se,
também, a participação da BMP-2 no processo de migração das células tumorais,
independente do tempo de exposição.
Estudando a imunolocalização da BMP-2 em embrião humano,
observou-se sua presença nos germes dos dentes, principalmente na lâmina
dentária e no retículo estrelado do órgão do esmalte, nos osteoblastos ao redor da
matriz do osso dos maxilares, nas fibras musculares estriadas imaturas da língua e
no epitélio pavimentoso estratificado da boca e esôfago. Comparando este estudo
com outros de hibridização in situ, sugere-se que a referida proteína está envolvida
na interação epitélio-mesênquima na morfogênese dos tecidos maxilofaciais
(SUZUKI et al., 2001).
Partindo do princípio de que as células da epiderme interfolicular
sofrem continuamente um processo de auto-renovação e que suas células tem a
capacidade de sair do ciclo celular e sofrerem diferenciação terminal através da
adição da BMP-6, é que Gosselet et al. (2007) realizaram estudos em culturas de
células com três tipos de ceratinócitos epidérmicos interfolicular primários e BMP-2
e -6 e constataram que o tratamento com essas BMPs resultou em uma transição
de colônias proliferativas para colônias abortivas, sugerindo que essas proteínas
inibem a proliferação do ciclo celular e fazem com que essas células saiam do
referido ciclo. Assim como as BMPs induziram a expressão da p57 e p21, sendo que
a p57 encontra-se envolvida na inibição precoce e imediata da proliferação celular;
os autores concluíram que as BMPs (-2 e -6) inibem a proliferação celular dos
ceratinócitos, fazendo com que, consecutivamente, esses sofram diferenciação
terminal.
Para esclarecer o mecanismo de ossificação em metástase, Komai et
al. (2006) analisaram a expressão imunoistoquímica da BMP-2 e o receptor BMPR-
Ib em carcinoma urotelial de bexiga e em sua metástase no músculo psoas maior
esquerdo e notaram uma imunorreatividade no citoplasma celular para BMP-2, em
ambos os casos, enquanto o BMPR-Ib foi evidenciado nas células semelhantes a
osteoblastos na formação de osso adjacente localizado na metástase do psoas, não
sendo encontrado, no entanto no tumor primário indicando, assim, que a expressão
da BMPR-IB em células estromais pode contribuir para o desenvolvimento da
ossificação heterotópica, ocorrendo em lesões metastáticas, cujo achado está
relacionado a maior agressividade do tumor.
2.2.1 BMPs X câncer
Conforme já referido, o papel da sinalização das BMPs na
carcinogênese é bastante complexo, sendo descrito tanto efeitos anti-tumorais,
como pro-tumorais (LEVY; HILL, 2006).
Hatakeyama et al. (1997) estudaram a expressão do RNAm das BMPs
(1, -2, -3 , -4, -5, -6, -7) de células epiteliais neoplásicas originárias do estômago,
reto, bexiga, tireóide, glândula salivar, língua e gengiva e verificaram que todas as
linhagens celulares expressaram, em vários graus, a BMP-1. As células do
carcinoma epidermóide de língua, gengiva e gástrico, expressaram apenas a BMP-1
e BMP-2. O adenocarcinoma salivar expressou fracamente as BMPs (-1, -2, -6, -3 e -
7). Ao induzirem a formação de tumores epiteliais em ratos, observou-se a formação
de osso no adenocarcinoma salivar e a presença de massas calcificadas no
carcinoma de língua e gástrico; contudo, a marcação imunoistoquímica da BMP-2 só
foi evidenciada no carcinoma de língua confirmando, desta forma, sua presença
nesta neoplasia, sugerindo que as células epiteliais neoplásicas possuem alto
potencial para expressar o RNAm das BMPs.
É relevante a contribuição das vias de sinalização das BMPs nos
estudos genéticos da carcinogênese das síndromes de câncer familiar, como a
mutação do Smad 4 e BMPR-IA na participação da polipose juvenil familiar (DE
BOSSCHER; HILL; NICOLAS, 2004). Segundo Hardwick et al. (2008) sua
localização nas células epiteliais maduras intestinais indicam que tais células
constituem o principal alvo da sinalização das BMPs e ainda tem papel conservador
na manutenção da homeostase da mucosa intestinal, além de alguma interrupção
nessa sinalização iniciar a formação de hamartomas em humanos e ratos, sobretudo
na síndrome da polipose juvenil, enquanto em casos de câncer colorretal
esporádico, a alteração na sinalização atua na progressão tumoral em uma fase
mais tardia, quando ocorre a transição de adenoma para carcinoma.
A via de sinalização das BMPs tem inibido a tumorigênese em diversos
órgãos, incluindo cérebro, estômago e rins; entretanto, estudos recentes tem
evidenciado as BMPs como promotores de motilidade e invasividade em vários
cânceres, como o de cólon, melanoma e próstata (KATSUNO et al., 2008).
Um estudo realizado por Langenfeld et al. (2003) revelou que a BMP-2
é superexpressa em carcinoma pulmonar de células não pequenas estimulando, in
vitro, a migração e invasão de uma linhagem celular proveniente de câncer de
pulmão e, in vivo, aumentou o crescimento tumoral, sendo seu estímulo
antagonizado pelo noggin, sugerindo assim uma importante atividade biológica em
carcinomas pulmonares.
2.2.2 BMPs e seus receptores
De forma simplificada, a sinalização da BMP é iniciada pela associação
com receptores tipos I e II, cuja ativação conduz o receptor tipo I a fosforilar
proteínas intracelulares específicas, mediadoras de sinalização (Smads) as quais,
posteriormente, se translocam para o núcleo e regulam a transcrição de vários
genes alvo. Esta sinalização pode estimular ou inibir o crescimento de células do
câncer (Figura 1) (BALEMANS; VAN HUL, 2002). Partindo deste princípio, Pouliot,
Blais e Labrie (2003) tentaram elucidar o papel da sinalização da BMP em células de
câncer de mama humano, usando uma estratégia de domínio negativo que não
contém um domínio quinase e um receptor de BMP tipo II truncado (DN-BMPR-II),
verificando que a superexpressão estável ou transitória desse receptor bloqueia a
ativação da Smad1 pela BMP-2 e inibe o crescimento dessas células (T-47D),
sugerindo que as BMPs interagem com os BMPR-II contribuindo para a proliferação
e sobrevivência das células no câncer de mama.
Figura 1 – Sinalização via BMP.
Fonte: BALEMANS; VAN HUL, 2002.
As superfícies dos ligantes de BMP possuem duas placas
proeminentes hidrofóbicas; uma convexa, cuja interface se liga ao receptor tipo II, e
outra côncava, que se liga ao receptor tipo I. A superposição da estrutura do noggin
e da BMP- 7 dentro do modelo do complexo de sinalização mostra que o noggin se
liga, efetivamente, a ambos os pares de epítopos ligantes, confirmando a habilidade
de tal antagonista em inibir a ligação aos tipos de receptores (ZIMMERMAN; DE
JESÚS-ESCOBAR; HARLAND, 1996; GROPPE et al., 2002).
Beppu et al. (2008) estudaram o papel do BMPR-II no estroma
intestinal através da inativação desse receptor usando um transgene nestin-Cre. Os
ratos mutantes desenvolveram sangramento intestinal, hiperplasia epitelial e
múltiplos pólipos na mucosa colorretal. Esses pólipos se desenvolveram a partir da
atividade de recombinação da Cre nas células mesenquimais e não no epitélio do
cólon conduzindo, porém, a uma proliferação epitelial e extensa expansão dos
miofibroblastos, sugerindo papel central do estroma, via BMP, na iniciação dos
pólipos intestinais.
Em uma pesquisa realizada por Beck et al. (2006), para comprovar a
participação da sinalização das BMPs (-2 e -7), do receptor BMPR-IA e da Smad 1,
e seu efeito no crescimento de tecidos e linhagens de células tumorais de câncer de
cólon (HCT116, HCT116+chr3, HCT+ch2, SW480), verificaram a presença dessas
proteínas em todos os casos de câncer. A sinalização Smad, induzida por BMP e
mediada pelo BMPR1A, suprimiu moderadamente o crescimento da linhagem
HCT116 e seus derivados, tendo supressão efetiva na SW480, situação inversa
observada com DN BMPR-IA (domínio negativo BMPR-IA). Não foi evidenciada
alteração alguma no ciclo celular das linhagens HCT116 mas na SW480 se
observou aumento na transcrição da p21, podendo-se concluir que a via de
sinalização da BMP em células do câncer de cólon está intacta e seu crescimento
inibido.
Kim et al. (2004) investigaram o papel dos receptores de BMPs tipos
IA, IB e II em 30 espécimes de Carcinoma de Células Intermediárias (CCI) da bexiga
urinária e verificaram que a expressão desses receptores está localizada
preferencialmente, no epitélio de transição e que existe significativa associação
entre a perda de expressão do BMPR-II e o grau de diferenciação do tumor.
Sequencialmente se analisou a sensibilidade a BMP-4 e a expressão dos referidos
receptores em três linhagens celulares de câncer de bexiga humana (TCC-Sup, RT4
e TSU-Pr1); demonstrou-se que esta última (TSU-Pr1), exibiu uma diminuição nos
níveis de expressão do BMPR-II e foi resistente ao efeito inibitório do crescimento
pela BMP-4, a que foi transfectada com um vetor contendo o BMPR-II e a restituição
do mesmo não só restaurou a responsividade à BMP-4 como reduziu a
tumorigenicidade in vitro; conclui-se, portanto, que a superexpressão do BMPR-II
conduz a uma restauração da sinalização da BMP e é um potente supressor de
crescimento tumoral na linhagem celular, TSU-Pr1, de CCI de bexiga humana.
2.2.3 BMPs e seus antagonistas
A família da BMP é formada durante a embriogênese, conduzindo a
geração de diferentes tipos celulares, dependendo da localização; sua atividade é
fundamentalmente controlada por fatores intracelulares e extracelulares em
diferentes níveis, incluindo inibição da interação do receptor BMPR-BMP por
proteínas extracelulares que se ligam à BMP; presença de pseudo-receptores de
membrana; bloqueio da sinalização da BMP pela ligação intracelular das Smads;
ubiquitinização e degradação proteassomal das moléculas de sinalização das BMPs
(BALEMANS; VAN HUL, 2002; GAZZERRO; CANALIS, 2006).
Em nível extracelular, o controle é feito por proteínas que se ligam
seletivamente às BMPs, impedindo sua interação com seus receptores
treonina/serina quinase afins. Esses antagonistas possuem, em sua estrutura,
grupamentos cisteína, assim como os membros do TGF-β, inclusive as BMPs, e são
classificados em três subfamílias, com base no tamanho dos grupos cisteína: a
família DAN, a Tsg (Twisted gastrulation) e a Chordin e Noggin (HARRISON et al.,
2004; YANAGITA, 2005).
Estudos recentes tem identificado vários antagonistas para as BMPs,
os quais se ligam às BMPs com a mesma afinidade de seus receptores específicos,
bloqueando a transdução de sinal e diminuindo,daí, sua atividade biológica, que
pode ser, por exemplo, a formação de osso. Quando há superexpressão das BMPs
em condições patológicas, como a formação excessiva de osso, esses antagonistas
podem representar uma proposta terapêutica bastante eficaz (GROPPE et al.,
2002).
Hsu et al. (1998) observaram que o noggin compete com membros da
família do antagonista DAN para se ligar à BMP-2 sugerindo que a interação entre
BMP-2 e esses antagonistas ocorre através do domínio BMP similar.
No desenvolvimento embrionário da papila gustativa fungiforme, as
BMPs -2, -4 e -7 e o noggin apresentam distribuições distintas e desenvolvem
diferentes papéis por vias opostas, seja inibindo ou induzindo a proliferação celular,
de acordo com o estágio de formação de tal estrutura (ZHOU; LIU, MISTRETTA,
2006).
Gazzerro, Gangji e Canalis (1998) estudando a expressão das BMPs e
do noggin em cultura de osteoblastos de ratos, observaram que a BMP-2 estimulou
o aumento da síntese de noggin por mecanismos transcricionais, ao mesmo tempo
em que este último diminuiu os efeitos biológicos das BMP-2, -4 e -6 relacionado
com a função osteoclástica indicando, assim, um provável papel do noggin em
limitar as ações das BMPs em células do tecido ósseo.
Haudenschild et al. (2004) verificaram, através de microarray, cultura
de células e expressão gênica, que a adição exógena da BMP-6 em cultura de
célula de câncer de próstata (DU-145) inibiu a proliferação celular, em virtude da
super-regulação das p21, p18 e p19, além de super-regular também o antagonista
noggin que teve marcação expressiva nos componentes epiteliais do câncer, além
de inibir em torno de 50% (LNCaP) e 100% (DU-145) a atividade da BMP-6.
O pseudo-receptor de BMP (BAMBI) é uma glicoproteína
transmembrana com domínio extracelular semelhante aos receptores de BMP. Este
tipo de ligante se associa a receptores tipos IA e IB e inibe os efeitos dos receptores
ativados sem interagir diretamente com a BMP (GAZZERRO; CANALIS, 2006).
Togo et al. (2008) observaram, investigando a significância clínica
desse pseudo-receptor através da expressão imunoistoquímica em 183 espécimes
de câncer colorretal, a expressão do BAMBI em 80,8% da amostra, classificada
como forte em 46% . Esta imunomarcação foi correlacionada com o tipo histológico,
profundidade de invasão, metástase linfonodal e TNM, tal como um significativo
indicador de recorrência e concluíram que o BAMBI está associado a um fenótipo
tumoral potencialmente agressivo e preditor de recorrência tumoral no câncer
colorretal, podendo a expressão desta proteína ser aplicada na rotina clínica da
neoplasia.
A nível intracelular, a sinalização da BMP é regulada pela ação de
inibidores de Smads, 6 e 7 (I-Smads), que se liga a receptores tipo I, interferindo
com a fosforilação da Smad 1/5/8 e heterodimerização com Smad 4; também podem
prevenir a ativação da R-Smads ou competir com os Co-Smads para a formação do
complexo R-Smad/Co-Smad. A expressão das Smads 6 e 7 é induzida por múltiplos
estímulos, incluindo BMP-7 e EGF, além de condições patológicas. Pode-se, ainda,
encontrar dois fatores de ubiquitinização de Smad, isto é, Smurf 1 e 2, que são
mediadores da etapa final na ubiquinização das proteínas alvo; essas enzimas
contem o domínio catalítico HECT, que modula a sinalização do TGFβ por
selecionar, como alvo, o receptor tipo I e as proteínas smads (BALEMANS; VAN
HUL, 2002; GAZZERRO; CANALIS, 2006; SEBALD et al., 2004).
Murakami et al. (2003) demonstraram a função cooperativa da Smurf 1
e I-Smads em Xenopus e em células de mamíferos transfectadas, pois o complexo
Smurf 1- I-Smad regula negativamente a sinalização da BMP por sub-regulação dos
receptores BMP e também dos R-Smads. Segundo esta pesquisa, a Smurf 1
aumenta a habilidade da Smad 6 em inibir a sinalização da BMP in vivo em
Xenopus. A Smurf 1 é recrutada através das Smad 6 e 7 para os receptores I de
BMP; a degradação dependente de ubiquitina da Alk 6 é medida pela Smurf1-
Smad7 e a Smad 6-Smurf1 aumenta a ubiquitinização da Smad 1; comprovou-se, no
entanto, que na ausência da Smad 6 a Smurf 1 não ubiquitiniza a Smad 1;
evidencia-se, então, uma supra-regulação negativa da via de sinalização da BMP
na formação desse complexo Smurf-I-Smad.
2.2.4 BMPs em lesões orais
Como já referido, as BMPs são proteínas relacionadas a inúmeros
processos durante a embriogênese e a tumorigênese. Apesar da escassez de
trabalhos relacionando o seu papel na participação da histopatogênese das lesões
orais, alguns estudos já foram realizados tentando correlacionar sua expressão em
algumas dessas lesões.
Em um estudo realizado por Ono et al. (2007) analisou-se se o fibroma
cemento ossificante periférico tinha propriedade neoplásica semelhante ao fibroma
ossificante central, através do uso de marcadores imunoistoquímicos para BMP -2 e
-4, osteopontina, osteocalcina, PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular),
assim como para fibras oxitalânicas, que existem especificamente no tecido
periodontal; verificando-se que os fibromas ossificantes centrais demonstraram
maior expressão das BMPs -2 nas células semelhantes a fibroblastos e
osteoblastos, e a BMP-4 mostrando marcação semelhante a -2, osteopontina e
maior índice do PCNA, quando comparado com o fibroma cemento ossificante
periférico; contudo, este apresentou uma imunomarcação maior de fibras
oxitalânicas quando comparado ao fibroma ossificante central, quando apenas dois
casos exibiram um pequeno número dessas fibras sugerindo, daí, que a lesão
periférica tem menor habilidade de produzir osso e parece ser uma lesão mais
reativa; de acordo com a expressão das fibras oxitalânicas, essas lesões indicam ter
diferentes origens histológicas.
Kumamoto e Ooya (2006) estudaram o papel das BMPs e suas
moléculas associadas a tumores odontogênicos epiteliais (ameloblastomas, tumores
odontogênicos adenomatóides, ameloblastomas metastatizante e carcinoma
ameloblástico), assim como em germes dentários, através da imunoistoquímica e
RT-PCR para detecção das BMPs-2, -4 e -7, dos receptores BMPR-I e BMPR-II, do
CBFA I e Osterix. Esses últimos são fatores de transcrição envolvidos na formação
óssea. Os autores constataram a expressão dos RNAms das BMPs e BMPRs em
todos os tumores odontogênicos epiteliais e a imunorreatividade observada tanto em
células parenquimatosas como estromais sendo porém, muito fraca nos Carcinomas
Ameloblásticos. Adicionalmente, a expressão dessas BMPs e dos receptores foi
evidente nas células neoplásicas vizinhas à membrana basal nos Ameloblastomas
benignos e metastatizantes e nas células fusiformes que compõem os lençóis
tumorais e estruturas pseudoglandulares dos TOAs, sugerindo que essas moléculas
influenciam na citodiferenciação do epitélio odontogênico neoplásico; assim,
concluíram que a expressão das BMPs e das moléculas associadas a ela pode
desenvolver papel relevante na citodiferenciação do epitélio odontogênico normal e
neoplásico, via interações epitélio-mesênquima.
A expressão do RNAm para BMP-1, -2, -3, -4 e -7 em quinze casos de
adenomas pleomórficos, foi analisada por Kusafuka et al. (1998) e relacionada com
formação condróide. Verificou-se que o RNAm de todas as BMPs foi superexpresso
quando comparado com glândulas salivares normais e entre essas BMPs, o RNAm
(60%) da BMP-2 foi frequentemente superexpresso em adenoma com formação
condróide conspícua, juntamente com expressão do colágeno tipo II. Utilizando a
imunoistoquímica, demonstrou-se a presença dessa BMP em células mioepiteliais
modificadas circundando a área condróide indicando que, dentre as BMPs
expressas, a BMP-2 é a que mais correlacionada está com a formação condróide.
Kim et al. (2005) estudaram o padrão de expressão da BMP-4, em
cisto dentígero comparando com o tumor odontogênico ceratocistico e notaram que
a última lesão demonstrou expressiva marcação em células epiteliais (44.1%) e 50%
a expressaram no mesênquima capsular enquanto 86% dos casos de cisto
dentígero exibiram uma marcação insignificativa. Quando se compararam os casos
recorrentes e não recorrentes de tumor odontogênico ceratocistico, observou-se
uma diferença estatisticamente significativa de marcação para os casos recorrentes
(p=0,036), sugerindo um provável papel dessa proteína na morfogênese epitelial e
crescimento invasivo da referida lesão.
Jin et al. (2001), procurando estabelecer uma correlação entre a
expressão imunoistoquímica das BMPs-2/4 e -5 e seu receptor BMPR-IA e a
carcinogênese do epitélio oral, observaram que a intensidade e a proporção de
células marcadas positivamente estavam aumentadas nos casos de CEO quando
comparadas com as do grupo normal e benigno porém, no grupo do epitélio
adjacente ao carcinoma, esses indicadores apresentaram índices similares aos dos
casos de CEO. Observou-se analisando a marcação das células metastáticas nos
nódulos linfáticos, maior intensidade em relação às do tumor primário, fato não
observado para BMPR-IA concluindo, assim, que as BMPs-2/4 e -5, mas não o seu
receptor, estavam implicadas na metástase de alguns espécimes de CEO.
Analisando a expressão da BMP-2/4 e de seu receptor BMPR-IA em 23
espécimes de carcinoma epidermóide oral, sendo 7 casos com metástase , 16 sem
metástase e 10 espécimes de hiperplasia fibro-epitelial da mucosa oral, utilizados
como grupo controle, Soares (2008) observou uma fraca e difusa expressão de
ambos os marcadores em células diferenciadas normais, uma forte marcação da
BMP-2/4 (71,4%), predominantemente focal (57,1%) e fraca marcação da BMPR-IA
(85,7%) com predomínio da distribuição difusa nos carcinomas com metástase
enquanto o grupo sem metástase exibiu uma forte marcação e difusa para a BMP-
2/4, tal como para a BMPR-IA encontrando-se, assim, uma associação estatística
entre o prognóstico do carcinoma epidermóide oral e intensidade de marcação da
BMP 2/4 (p=0,002).
2.2.5 BMPs e angiogênese
O desenvolvimento do sistema vascular é um dos primeiros passos em
eventos precoces na organogênese. Os vasos prematuros do embrião se
desenvolvem por agregação de angioblastos, dentro de um plexo vascular primitivo
(vasculogênese), que então sofre um processo complexo de remodelação no qual o
crescimento, migração e brotamento, conduzem ao desenvolvimento de um sistema
circulatório funcional (angiogênese). Muitos desses eventos ocorrem durante a
progressão do desenvolvimento vascular normal no embrião e são recapitulados
durante situações de neo-angiogênese no adulto. Ressalta-se, contudo, que muitos
tumores promovem seu crescimento e se dispersam em forma de metástase pelo
recrutamento dos vasos sanguíneos do hospedeiro, assim como o crescimento nas
proximidades tumorais (COULTAS; CHAWENGSAKSOPHAK; ROSSANT, 2005).
As aplicações clínicas das pesquisas sobre a angiogênese seguem
três direções: terapêutica, para aceleração da angiogênese, promovendo o reparo
tecidual; terapêutica, de inibição da angiogênese e principalmente quantificação da
angiogênese objetivando o diagnóstico e o prognóstico das neoplasias (FOLKMAN,
1995).
As BMPs possuem vários mecanismos para estimular a angiogênese.
A BMP-2 atua como potente quimiotático para monócitos que se diferenciam em
macrófagos teciduais e secretam citocinas de efeito pró-angiogênico, como o VEGF
(Fator de Crescimento Endotelial Vascular). A BMP-2 também é capaz de estimular
células mesenquimais indiferenciadas a liberar o PGF-1 (Fator de Crescimento
Placentário), importante no recrutamento de células hematopoiéticas e endoteliais
indiferenciadas em condições patológicas, como isquemia, inflamação, cicatrização
e câncer (LANGENFELD; LANGENFELD, 2004; RAIDA et al., 2005).
Raida et al. (2005) investigaram o possível papel da BMP-2 sobre
células endoteliais da microcirculação da derme humana (CEMDH) e uma provável
atividade angiogênica, através da implantação subcutânea de uma esponja estéril no
dorso de ratos, inoculada com rhBMP-2 (recombinante) ou rhVEGF (recombinante),
ou combinação de ambos, diariamente, durante 7 dias (prova da esponja). Além
disso foram implantadas, em ratos, células de câncer de mama da linhagem MCF-7
transfectadas com BMP-2, para avaliar o efeito da superexpressão desta citocina
sobre a vascularização tumoral; após a prova, as esponjas removidas foram
imunomarcadas com anticorpos anti-FvW e anti-CD31, revelando aumento da
atividade angiogênica com significativo incremento da vascularização no grupo de
tratamento combinado. Nos ratos transfectados com MCF-7/BMP-2, observou-se o
desenvolvimento de tumores com diâmetro de 1-1,5 cm
2
; já aqueles transfectados
com MCF-7 sem BMP-2 não desenvolveram tumores; concluiu-se que, em câncer de
mama a BMP-2, estimula a angiogênese sugerindo que a inibição desta via de
sinalização pode ter importante valor terapêutico.
2.3 ANGIOGÊNESE E ENDOGLINA
O fenômeno da angiogênese, caracterizado pelo desenvolvimento de
novos vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura existente, é
observado em uma série de eventos fisiológicos e patológicos sediados na cavidade
oral, incluindo a inflamação, reparo tecidual e metástase tumoral (RAVI et al., 1998;
SEDIVY et al., 2003).
A endoglina (CD105) se caracteriza como uma glicoproteína
homodimérica transmembrana de 180-kDa, codificada pelo gene CD105 localizado
no cromossomo 9q34 e que apresenta grande especificidade, principalmente para
células endoteliais de capilares, veias e artérias, sendo utilizado na avaliação da
vascularização, tanto de tecidos normais como neoplásicos. Evidencia-se, também,
sua expressão em macrófagos ativados, proeritroblastos imaturos,
sinciciotrofoblastos e fibroblastos (DUFF et al., 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005;
MINHAJAT et al., 2006a; LIORCA et al., 2007; NETTO et al., 2008).
Esta proteína interage com uma complexa via de sinalização de
receptores de múltiplos membros da superfamília TGFβ, como TGFβ1, β3, activina –
A, BMP-7 e BMP-2, mas requer a co-expressão dos respectivos receptores
associados. Observou-se, através de experimentos de transfecção, que tal proteína,
sozinha, era incapaz de se ligar à BMP-2, porém a ligação ocorreu com a co-
expressão dos receptores Alk3 e Alk6, diminuindo esta ligação quando o BMPR-II foi
co-expresso, refletindo a inabilidade da endoglina de se associar a tal receptor
(BARBARA; WRANA; LETARTE, 1999).
Minhajat et al. (2006b) compararam a expressão da endoglina com os
marcadores: VEGF, Flt1, Flk1, TGF-β1, TGF-ΒrII, CD44e CD31 em espécimes de
câncer do cérebro, pulmão, mama, estômago, colon, fígado e rim, e em tecidos
normais, utilizando a técnica de microarrays e imunoistoquímica. De todos esses
marcadores a endoglina foi a única expressa apenas nos vasos sanguíneos
neoformados, e os espécimes de câncer do fígado e rim foram os únicos que não
exibiram diferença de marcação da endoglina quando comparados aos tecidos
normais; mais de 73% da amostra de câncer exibiram marcação para endoglina,
realidade não evidenciada para os demais marcadores, em que a marcação variou
de ausente – focal, assim como a maioria não exibiu diferença entre a neoplasia e o
controle.
O acesso à densidade de microvasos usando a endoglina em câncer
colorretal pode ser um parâmetro para predizer se pacientes tem risco aumentado
de desenvolver metástase, por marcar apenas os microvasos proliferantes em
carcinoma colorretal, sendo o marcador mais específico e sensível para
angiogênese tumoral. Estudando sua expressão imunoistoquímica em 150
espécimes dessa patologia, concluiu-se que o mesmo apresenta valor prognóstico
com correlação positiva para a presença de invasão angio-linfática, metástase
linfonodal, estágio tumoral e metástase hepática podendo, possivelmente, conduzir a
uma terapia angiogênica futura (SAAD et al., 2004).
Soares et al. (2007), analisaram a vascularização tumoral usando o
CD34 e a endoglina em carcinomas ex-adenoma pleomórficos (CXAP) durante a
transformação maligna do adenoma pleomórfico (AP) a carcinoma e durante a
progressão tumoral. A amostra constou de 8 casos de CXAP (intracapsular e tumor
minimamente invasivos), 8 casos de CXAP avançados (tumores amplamente
invasivos) e 10 casos de adenomas pleomórficos sem transformação maligna. A
MVD para endoglina aumentou significativamente durante a progressão tumoral do
adenoma para carcinoma, evidenciando uma significativa correlação (p<0,001),
enquanto para o adenoma pleomórfico se encontrou um pequeno número de vasos
positivos, situação não evidenciada para o CD34, em que não se observou nenhuma
diferença entre os subgrupos.
O carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço foi alvo de
estudo para avaliação do prognóstico com a endoglina em estudo realizado por
Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006) constataram que a endoglina foi mais expressa
em vasos sanguíneos intratumorais que vasos linfáticos, assim como uma fraca
marcação na mucosa oral normal adjacente. A alta densidade microvascular (MVD)
foi associada ao fenótipo mais agressivo do tumor, incluindo estágio clínico
avançado e a presença de metástases nos linfonodos no momento do diagnóstico.
Houve diferença estatisticamente significativa quando se avaliou o valor prognóstico
associado à MVD entre pacientes com tumor na cavidade oral (alta MVD) e na
laringe, sendo a alta MVD associada com pobre sobrevida dos pacientes com
carcinoma de lábio inferior; a incidência de recorrência foi significativamente mais
alta nos casos com altos valores de MVD. A endoglina apresentou-se, portanto,
como alvo promissor para o prognóstico tumoral, sendo o biomarcador mais sensível
e específico para avaliação da MVD quando comparado com os marcadores pan-
endoteliais.
Martone et al. (2005) avaliaram a relação da marcação
imunoistoquímica através da densidade microvascular (MVD) do CD34 e endoglina
em 127 casos de carcinoma epidermóide da cabeça e pescoço e notaram que a
média das MVD foi significativamente mais alta nos tumores T3-T4, estágios clínicos
mais avançados e ampla extensão tumoral, embora apenas a alta taxa MVD da
endoglina tivesse sido associada significativamente à metástase linfonodal. Os
pacientes com elevada MVD para endoglina tiveram pequeno tempo livre da doença
e o CD34 não esteve associado à sobrevivência, sugerindo que a MVD avaliada
através da expressão da endoglina poderia identificar pacientes com carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço com doença mais agressiva, ao mesmo tempo
em que poderá ser alvo das terapias anti-angiogênicas.
A expressão imunoistoquímica da p53, CD34 e endoglina, foi
correlacionada com a recorrência em 53 amostras de câncer de pulmão de células
não pequenas, além de se referenciar esses marcadores com os níveis séricos da
VEGF e bFGF. Verificou-se significativa correlação entre o CD34 e a endoglina e
entre esta e a p53, que foi superexpressa em 49% dos casos, sinal de que esta
última está envolvida no processo da angiogênese, e, ao mesmo tempo, exibe uma
correlação significativa com baixa recorrência da patologia referida. Uma correlação
entre os marcadores e VEGF e bFGF não pode ser demonstrada podendo-se
concluir que a superexpressão da p53 pode indicar baixo risco de recorrência em
pacientes que sofreram cirurgia para este tipo de lesão no estágio I-IIIA
(BRATTSTRÖM et al., 2004).
Usando três marcadores de vasos sanguíneos, o CD31, CD34 e
endoglina, para investigar a distribuição e propriedades dos vasos sanguíneos em
carcinoma epidermóide oral e, assim, correlacioná-las com a metástase linfonodal,
Nagatsuka et al. (2005) observaram que a endoglina foi positiva nas células
endoteliais dos vasos sanguíneos que estavam presentes ao redor dos ninhos das
células tumorais em tumores circunscritos, assim como na periferia da infiltração do
câncer, em tumores invasivos, em que a metástase foi mais frequente.
Chuang et al. (2006) avaliando a expressão do VEGF e da endoglina,
associando com os achados clinico - patológicos de espécimes de biópsias de
carcinoma epidermóides de língua no estágio T1 e T2, observaram que altas
expressões de ambos os marcadores foram estatisticamente correlacionadas com
estágios avançados do tumor, status nodal positivo, presença de necrose tumoral e
ampla espessura tumoral; contudo, apenas a endoglina se correlacionou com a
presença de invasão neural, assim como foi o único preditor de prognóstico
independente enfatizando, ainda, a importância da adoção de planos cirúrgicos mais
agressivos para pacientes com câncer de língua precoce com altas expressões de
VEGF e endoglina em biópsias incisionais.
PROPOSIÇÃO
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo objetivou pesquisar a imunoexpressão da BMP-2,
BMPR-IA e BMPR-II, correlacionando-a com o comportamento biológico do
carcinoma epidermóide de língua, medido pela metástase, TNM e gradação
histológica de malignidade; adicionalmente verificou-se a relação entre a expressão
dessas moléculas e o processo de angiogênese local, analisado através da
expressão imunoistoquímica da endoglina, como também o perfil do paciente
acometido por esta neoplasia.
MATERIAIS E MÉTODOS
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
A pesquisa se constituiu em um estudo imunoistoquímico no front invasivo do
carcinoma epidermóide de língua para análise quantitativa e qualitativa da
expressão de BMP-2, seus receptores BMPR-IA e BMPR-II, além da angiogênese
local analisada através da expressão da endoglina em uma série de casos de
carcinomas epidermóides de língua, correlacionando-os com o estadiamento clínico
(TNM), presença de metástase e gradação histológica de malignidade.
4.2 POPULAÇÃO
A população objeto do presente estudo se constituiu de casos de
carcinomas epidermóides de língua, registrados no Serviço de Anatomia Patológica
do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal, RN, no período de 2004-2007 e de espécimes de
Hiperplasia Fibrosa Inflamatória da mucosa oral obtidos dos arquivos do Serviço de
Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da UFRN, em Natal, RN.
4.3 SELEÇÃO DA AMOSTRA
A amostra consistiu em 50 espécimes de carcinomas epidermóides de
língua, 25 apresentando metástase linfonodal confirmado através do exame
anatomopatológico e 25 isentos de metástase. Os prontuários médicos e o material
biológico resultante da terapêutica cirúrgica instituída, permaneceram no referido
Serviço. Dos prontuários dos pacientes, obtiveram-se dados referentes a idade, sexo
e sistema TNM, enquanto os espécimes de Hiperplasia Fibrosa Inflamatória da
mucosa oral foram obtidos de 25 casos retirados dos arquivos do Serviço de
Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da UFRN, em Natal, RN, para constituir o grupo controle.
4.3.1. Critérios de Inclusão da Amostra
Na pesquisa se incluíram os casos de carcinomas epidermóides de
língua, resultantes apenas de tratamento cirúrgico excisional, sendo a presença de
metástase confirmada através do exame anatomopatológico, e os prontuários
médicos que continham todos os dados clínicos necessários ao desenvolvimento do
estudo; além disto, apenas os espécimes que apresentaram quantidades suficientes
de material biológico para análise da gradação histológica de malignidade e estudo
imunoistoquímico, foram inseridos na amostra, assim como os casos que não
sofreram tratamento de quimioterapia e radioterapia previamente; da mesma forma,
com os casos de hiperplasia fibrosa inflamatória, cujas exigências anteriormente
apontadas foram igualmente mantidas.
4.3.2. Critérios de Exclusão da Amostra
Foram excluídos da amostra os casos que não atenderam aos
requisitos dos critérios de inclusão.
4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO
Utilizaram-se para o estudo morfológico, lâminas com cortes de 5m
de espessura do material emblocado em parafina, corados pela técnica de rotina da
Hematoxilina/ Eosina. Os espécimes de carcinomas epidermóides de língua foram
examinados em microscopia de luz, com aumento de 100x e 400x (Microscópio
Olympus CH30) para análise da gradação histológica de malignidade, tendo-se
como base o sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne
(1998) (Quadro 1) no front invasivo (Figura 7) e a adaptação do critério de
classificação por Miranda (2002).
Quadro 1. Sistema de gradação histológica de malignidade no “front de invasão”
proposto por Bryne (1998).
Aspectos
Morfológicos
Escore de Malignidade
1
2
3
4
Grau de
Ceratinização
Altamente
ceratinizado
(mais de 50%
das células)
Moderadamente
ceratinizado (20
a 50% das
células)
Mínima
ceratinização
(5 a 20% das
células)
Nenhuma
ceratinização
(0 a 5% das
células)
Pleomorfismo
Nuclear
Pouco
pleomorfismo
nuclear (mais
de 75% das
células
maduras)
Moderado
pleomorfismo
nuclear (50 a
75% das células
maduras)
Abundante
pleomorfismo
(25 a 50%
das células
maduras)
Pleomorfismo
nuclear
extremo (0 a
25% das
células
maduras)
Padrão de
Invasão
Bordas
infiltrativas
bem
delimitadas
Cordões,
bandas e/ ou
trabéculas
sólidas
infiltrativas
Pequenos
grupos ou
cordões de
células
infiltrativas
(N>15)
Dissociação
celular difusa e
pronunciada,
em pequenos
grupos e/ou
células
individuais
(N<15)
Infiltrado
Inflamatório
Intenso
Moderado
Escasso
Ausente
Com o intuito de categorizar os casos de carcinomas epidermóides de
língua em baixo e alto grau de malignidade, os escores obtidos em cada parâmetro
morfológico a ser avaliado foram computados e somados, obtendo-se o escore final
para o espécime em questão. Diferente do proposto por Bryne et al. (1989), utilizou-
se a adaptação do critério de classificação realizada por Miranda (2002),
classificando-se como tumores de baixo grau de malignidade aqueles que obtiveram
escores situado entre 4 e 8 e, como tumores de alto grau de malignidade, os que
demonstraram escore a partir de 9.
4.5 ESTADIAMENTO CLÍNICO DO TUMOR (TNM)
O Sistema TNM para a classificação dos tumores malignos foi
desenvolvido por Pierre Denoix (França), entre os anos de 1943 e 1952. A partir de
1950 a UICC, juntamente com a OMS, nomeou comitês que aprimoraram este
sistema o qual se encontra, atualmente, na sexta edição (MS, 2004).
Quadro 2. Sistema de estadiamento clínico TNM para o CEO.
TAMANHO DO TUMOR PRIMÁRIO (T)
TX
Nenhuma informação disponível sobre o tumor primário
T0
Nenhuma evidência de tumor primário
T1S
Apenas carcinoma in situ em estágio primário
T1
Tumor com menos de 2 cm em seu diâmetro maior
T2
Tumor com cerca de 2 a 4 cm em seu diâmetro maior
T3
Tumor com mais de 4 cm em seu diâmetro maior
T4
Massa tumoral com mais de de 4 cm de diâmetro com
envolvimento do antro, músculos pterogóides, base da língua ou pele
ENVOLVIMENTO DE LINFONODO REGIONAL (N)
NX
Nodos não puderam ser ou não foram identificados
N0
Nenhum nodo clinicamente positivo
N1
Um único nodo homolateral clinicamente positivo com menos
de 3 cm de diámetro
N2
N2a – Um único nodo homolateral clinicamente positivo com 3
a 6 cm de diâmetro
N2b – Múltiplos nodos homolaterais clinicamente positivos,
nenhum com mais de 6 cm de diâmetro.
N3
N3a – Nodo(s) homolateral(is) clinicamente positivo(s), um
deles com mais de 6 cm de diâmetro
N3b – Nodos bilaterais clinicamente positivos
N3c – Nodo(s) contralateral(is) clinicamente positivos(s)
ENVOLVIMENTO POR METÁSTASES DISTANTES (M)
MX
Metástases distantes não foram identificadas
M0
Nenhuma evidência de metástase distante
M1
Metástase distante está presente
Fonte: Adaptado do MS, (2004).
Quadro 3. Categorias de Estadiamento clínico TNM para o CEO.
ESTÁGIO
CLASSIFICAÇÃO TNM
TAXA DE
SOBREVIVÊNCIA
DE 5 ANOS
0
Tis N0 M0
“Não relatado”
I
T1 N0 M0
85%
II
T2 N0 M0
66%
III
T3 N0 M0 ou
T1, T2 ou T3, N1 M0
41%
IV
IVA - T1, T2, T3 N2 M0 ou T4a N0, N1, N2 M0
IVB – Qualquer T N3 M0 ou T4b com qualquer N
M0
IVC - Qualquer T com qualquer N M1
9%
Fonte: Adaptado do Neville, 2004; Adaptado do MS (2004).
Informações acerca do TNM foram coletadas nas fichas clínicas dos
pacientes tratados no Hospital Dr. Luiz Antônio, em Natal, RN, seguido do
estabelecimento dos estágios, de acordo com o quadro 3.
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
4.6.1 Método Imunoistoquímico
A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina,
foi submetida a cortes de 3m de espessura e estendida em lâmina de vidro
devidamente preparada com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltrietoxi-
silano, Sigma Chemical CO, USA); posteriormente, os espécimes foram submetidos
ao método da imunoperoxidase pela técnica da estreptoavidina-biotina (SABC,
streptoavidin-biotin complex) utilizando-se anticorpos policlonais anti-BMP-2, anti-
BMPR-IA e anti-BMPR-II, além de anticorpo monoclonal anti-Endoglina (Quadro 4).
Empregaram-se como controle positivo para os anticorpos avaliados,
lisados de células PC-3 e HepG2. O controle negativo consistiu na substituição do
anticorpo primário por albumina de soro bovino a 1 % (BSA – Bovine Serum
Albumin) em solução tampão. A técnica utilizada foi realizada conforme os passos
que se seguem:
⇨ Desparafinização – realizada através de 2 banhos em xilol, sendo o primeiro
banho à temperatura de 60°C, durante 30 minutos e, o segundo, à temperatura
ambiente, por 20 minutos;
⇨ Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
Álcool etílico absoluto I (5 minutos),
Álcool etílico absoluto II (5 minutos),
Álcool etílico absoluto III (5 minutos),
Álcool etílico absoluto IV (5 minutos),
Álcool etílico 95°GL (5 minutos),
Álcool etílico 80°GL (5 minutos),
⇨ Imersão em solução de Hidróxido de Amônia a 10 % durante 10 minutos, à
temperatura ambiente, para remoção do pigmento formólico;
⇨ Lavagem do material em água corrente por 10 minutos e duas passagens por
água destilada deionizada;
⇨ Recuperação antigênica (Quadro 4);
⇨ Passagem em água corrente durante 10 minutos;
⇨ Imersão em água destilada 2 vezes, com tempo de 5 minutos cada;
⇨ Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos cada, em solução de
peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/ 1 para o bloqueio da
peroxidase endógena tecidual;
⇨ Lavagem em água corrente durante 10 minutos;
⇨ Imersão em água destilada 2 vezes, com tempo de 5 minutos cada;
⇨ Duas imersões em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCL pH 7.4, durante 5
minutos cada;
⇨ Incubação dos cortes com anticorpos primários diluídos em solução BSA a 1 %,
em TRIS-HCL pH 7.4;
⇨ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCl pH 7.4, por 5
minutos cada;
⇨ Incubação com o anticorpo secundário (Biotintylated link universal – DAKO);
⇨ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCl pH 7.4, por 5
minutos cada;
⇨ Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina (DAKO, A/S, Glostrup,
Denmark) na diluição de 1/ 100, durante 30 minutos à temperatura ambiente;
⇨ Duas incubações em TRIS-HCl, durante 5 minutos cada;
⇨ Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (DAB), durante 3 minutos,
diluído em TRIS-HCL (pH 7.4) e ativado pelo peróxido de hidrogênio 10 volumes a
0,3 %;
⇨ Lavagem em água corrente por 10 minutos;
⇨ Passagens rápidas em água destilada (3 trocas);
⇨ Contra-coloração utilizando hematoxilina de Mayer, durante 10 minutos;
⇨ Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (3 minutos);
Álcool etílico 95°GL (3 minutos);
Álcool etílico absoluto I (3 minutos);
Álcool etílico absoluto II (3 minutos);
Álcool etílico absoluto III (3 minutos);
⇨ Imersão em Xilol I (5 minutos);
⇨ Imersão em Xilol II (5 minutos);
⇨ Montagem da lamínula contra a lâmina com resina Permount (Fischer
Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) para observação ao microscópio de luz.
Quadro 4. Clone, especificidade, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados
Clone
Especificidade
Diluição
Recuperação
antigênica
Incubação
N-14
BMP-2*
1:50
Citrato, pH 6.0
panela pascal, 10
min
Overnight
(18h) a 4°C
AF 346
BMPR-IA**
1:50
Tripsina 0,1% e
CaCl
2
0,1% em
TRIS, 30’ a 37°C
Overnight
(18h) a 4°C
AF 811
BMPR-II**
1:100
Tris-EDTA, panela
pascal, 10 min
Overnight
(18h) a 4°C
SN6h
CD105***
1:500
Sem recuperação
Overnight
(18h) a 4°C
* Santa Cruz Biothecnology, Inc. ** R&D Systems, Inc., USA***Dako
4.6.2. Análise do Perfil Imunoistoquímico
A imunorreatividade da BMP-2, BMPR-II e BMPR-IA foi analisada de
forma qualitativa apenas no componente epitelial dos espécimes selecionados com
auxílio de microscópio de luz.
Os aspectos analisados nas referidas lesões foram:
Presença ou ausência de expressão imunoistoquímica
Localização da imunomarcação nas células parenquimatosas
Tipo de distribuição (focal ou difusa)
Análise da intensidade da imunoexpressão nas células imunomarcadas de
acordo com os seguintes escores (adaptado de Wakulich et al., 2002):
Escores: 0 – ausente
1 – marcação fraca
2 – marcação forte
Adicionalmente se realizou para a endoglina, além da análise
qualitativa com os aspectos acima referidos nas células endoteliais, uma análise
quantitativa com a determinação do índice angiogênico, através da técnica de
contagem microvascular (MVC), segundo Maeda et al. (1995), sendo analisadas as
áreas com maior número de vasos na profundidade da lesão, ou seja, a interface da
lesão/hospedeiro. Identificaram-se as áreas de maior vascularização utilizando-se
um aumento de 40x. Qualquer célula ou grupo endotelial corado positivamente
separado dos microvasos adjacentes das células tumorais e de outros elementos do
tecido conjuntivo, foram considerados vaso unitário, assim como os vasos contendo
lúmen. Estruturas ramificadas foram contadas como vasos, mesmo com
descontinuidade na sua estrutura. A contagem microvascular (MVC) foi realizada em
cinco campos com o microscópio de luz, regulado para um aumento de 200x, ao
qual foi adaptado um retículo para estereologia WEIBEL NGW2, objetivando-se
evitar a recontagem de estruturas, em que foi expresso como o número médio de
vasos, nessas áreas, em cada amostra das lesões.
Destaca-se, ainda, que a análise imunoistoquímica foi realizada por
dois avaliadores, os quais não tiveram acesso às informações clínicas referentes ao
caso estudado.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram submetidos a tratamento estatístico com o
objetivo de testar as hipóteses levantadas; para isto, foi utilizado o software SPSS
16.0 para Windows.
Para avaliar a diferença entre os escores e a associação entre as
proteínas: BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA, endoglina e os grupos de lesão, utilizou-se o
teste não-paramétrico do Qui-quadrado de Pearson, com nível de significância de
5% (p<0,05) e, para diminuir a dispersão dos dados, os escores foram
dicotomizados, sendo os escores 0 e 1 unidos em uma única classe, resultando em:
escore 0- ausência ou fraca expressão, e o escore 1 significando forte expressão.
Para os casos em que não foi possível aplicar o teste realizou-se uma análise
descritiva e, afim de se constatar se havia diferença de médias da contagem
microvascular da endoglina foi utilizado o teste ANOVA; já para se verificar a
correlação entre a expressão das BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e a angiogênese local,
através das médias da MVC (contagem microvascular) da endoglina, empregou-se o
teste “t” de student.
4.8. IMPLICAÇÕES ÉTICAS
Esta pesquisa teve seu projeto submetido à apreciação do Comitê de
Ética em Pesquisa da Liga Norte Rio-grandense Contra o Câncer (LNRCC), do qual
se obteve parecer número 001/001/2008 (ANEXO), favorável à sua execução.
5 RESULTADOS
5.1 DADOS CLÍNICOS
Nos prontuários dos pacientes, se verificou que o sexo masculino foi o
mais acometido (76%) pelo carcinoma epidermóide de língua, assim como se notou
um predomínio da faixa etária maior que 65 anos no grupo sem metástase (48%) e,
no grupo com metástase, houve predomínio da faixa etária entre 45 a 65 anos (60%)
(Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo o
sexo e a faixa etária dos pacientes. Natal, RN, 2009.
Dados Clínicos
Carcinoma sem
metástase
Carcinoma com
metástase
Total
Sexo
n
%
n
%
n
%
Feminino
6
24
6
24
12
24
Masculino
19
76
19
76
38
76
Total
25
100
25
100
50
100
Faixa etária
n
%
n
%
n
%
24-44 anos
2
8
6
24
8
16
45-65 anos
11
44
15
60
26
52
65 anos ou mais
12
48
4
16
16
32
Total
25
100
25
100
50
100
Pode-se observar, em relação ao estadiamento clínico, predominância
do estágio II, independente do grupo de carcinoma estudado, e no estágio I nenhum
casos apresentou metástase (Tabela 2).
Tabela 2. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo o
estadiamento clínico (TNM). Natal, RN, 2009.
Estadiamento Clínico
Carcinoma sem
metástase
Carcinoma com
metástase
Total
n
%
n
%
n
%
I
7
28
0
0
7
14
II
10
40
10
40
20
40
RESULTADOS
III
5
20
7
28
12
24
IV
3
12
8
32
11
22
Total
25
100
25
100
50
100
5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS
Em relação a gradação histológica de malignidade dos 50 casos de
carcinoma epidermóide de língua estudados, pode-se observar, que tanto o grupo
de carcinoma sem metástase (52%) como o com metástase (60%) apresentaram um
número maior de espécimes de alto grau (Tabela 3).
Tabela 3. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo a
gradação histológica proposta por Bryne (1998) e modificada por Miranda (2002)
Natal, RN, 2009.
Gradação Histológica
de malignidade
Carcinoma sem
metástase
Carcinoma com
metástase
Total
n
%
n
%
n
%
Baixo grau
12
48
10
40
22
44
Alto grau
13
52
15
60
28
56
Total
25
100
25
100
50
100
5.3 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS
A imunoexpressão da BMP-2, BMPR-II e BMPR-IA, foi evidenciada
como coloração acastanhada, com localização tipicamente citoplasmática,
apresentando variações na intensidade de expressão nas células do parênquima, a
depender do tipo de lesão em estudo, ressaltando que a análise no grupo dos
carcinomas foi realizada no front invasivo, área mais profunda do espécime. A
reatividade celular da endoglina foi restrita ao citoplasma das células endoteliais
perivasculares isoladas e grupo proliferantes sem lúmen, representada também pela
coloração acastanhada.
Observa-se predominância de marcação forte da BMP-2 para o grupo
experimental (Figura 2), 56% para o carcinoma sem metástase e 72% para o
carcinoma com metástase, enquanto o grupo controle exibiu 72% de marcação
ausente a fraca; verificou-se, assim, uma associação estatisticamente significativa
com p=0,007 (Tabela 4).
Nos carcinomas epidermóides sem metástase a BMPR-II exibiu, em
52% dos casos, uma marcação ausente a fraca (Figura 3); contudo, no grupo com
metástase (56%) e no grupo controle (60%) observou-se uma marcação forte
enquanto a BMPR-IA exibiu predominância de forte expressão (Figura 4),
independente do grupo estudado, não havendo deste modo, associação estatística
entre as expressões dessas proteínas e os grupos (p=0,68 e p=0,105)
respectivamente (Tabela 4).
A endoglina apresentou 100% de marcação forte (Figura 5) nos
carcinomas, independente da presença de metástase; entretanto, no grupo controle
80% da amostra exibiram uma marcação de ausente a fraca (Tabela 4).
Tabela 4. Distribuição da expressão imunoisquímica quanto à intensidade das
proteínas BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e endoglina nos carcinomas epidermóides de
língua e no grupo controle, Natal, RN, 2009.
GRUPOS
Expressão
Carcinoma
sem
metástase
Carcinoma
com
metástase
Hiperplasia
Fibrosa
Inflamatória
Total
Qui
2
p
*
BMP-2
n
%
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
11
44
7
28
18
72
36
48
9,93
0,007
Forte
14
56
18
72
7
28
39
52
Total
25
100
25
100
25
100
75
100
BMPR-II
n
%
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
13
52
11
44
10
40
34
45,3
0,75
0,68
Forte
12
48
14
56
15
60
41
54,7
Total
25
100
25
100
25
100
75
100
BMPR-IA
n
%
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
5
20
2
8
8
32
15
20
4,50
0,105
Forte
20
80
23
92
17
68
60
80
Total
25
100
25
100
25
100
75
100
ENDOGLINA
n
%
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
0
0
0
0
20
80
20
26,7
54,54
<0,001**
*Teste do Qui-quadrado de Pearson **Valor não aplicável com amostra disponibilizada.
A imunoexpressão das proteínas também foi avaliada quanto ao tipo
de distribuição, atribuindo-se-lhes dois padrões: focal e difusa; das proteínas
estudadas pode-se observar tendência à distribuição difusa, independente do
biomarcador e do grupo; todavia apesar da endoglina demonstrar predominância da
marcação difusa, verificou-se no grupo controle, o inverso, com 94,7% da amostra
exibindo uma marcação focal; assim sendo, não houve associação estatisticamente
significativa com relação aos receptores; e, nas proteínas BMP-2 e endoglina, não
foi possível aplicar o teste com a amostra disponibilizada (Tabela 5).
Tabela 5. Expressão imunoisquímica quanto ao tipo de distribuição das proteínas
BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e endoglina nos carcinomas epidermóides de língua e no
grupo controle. Natal, RN, 2009.
GRUPOS
Expressão
Tipo
Carcinoma
sem
metástase
Carcinoma
com
metástase
Hiperplasia
Fibrosa
Inflamatória
Total
Qui
2
p
*
BMP-2
n
%
n
%
n
%
n
%
Focal
1
4
0
0
8
38,1
9
12,7
17,58
<0,001**
Difusa
24
96
25
100
13
61,9
62
87,3
Total
25
100
25
100
21
100
71
100
BMPR-II
n
%
n
%
n
%
n
%
Focal
1
4,5
0
0
2
9,1
3
4,4
2,25
0,32
Difusa
21
95,5
24
100
20
90,9
65
95,6
Total
22
100
24
100
22
100
68
100
BMPR-IA
n
%
n
%
n
%
n
%
Focal
2
8,3
1
4
0
0
3
4,5
1,69
0,42
Difusa
22
91,7
24
96
18
100
64
95,5
Total
24
100
25
100
18
100
67
100
ENDOGLINA
n
%
n
%
n
%
n
%
Focal
3
12
1
4
18
94,7
22
31,9
48,06
<0,001**
Difusa
22
88
24
96
1
5,3
47
68,1
Total
25
100
25
100
19
100
69
100
*Teste do Qui-quadrado de Pearson **Valor não aplicável com a amostra disponibilizada.
Forte
25
100
25
100
5
20
55
73,3
Total
25
100
25
100
25
100
75
100
Determinou-se o índice angiogênico através da técnica de contagem
microvascular (MVC) no front invasivo, na qual os carcinomas apresentaram médias
muito semelhantes; contudo, exibiram diferença estatisticamente significativa
quando comparadas com o grupo controle (p<0,001)(Tabela 6).
Tabela 6. Contagem microvascular (MVC) da endoglina nos carcinomas
epidermóides de língua e no grupo controle. Natal, RN, 2009.
Contagem Microvascular da endoglina
n
Média
Desvio
Padrão
p
*
Carcinoma
sem metástase
25
32,91ª
15,15
Carcinoma
com metástase
25
32,05ª
11,85
<0,001
Hiperplasia
Fibrosa
Inflamatória
25
11,05
b
11,54
Total
75
25,34
16,33
*Teste univariado de ANOVA
A BMP-2 é uma proteína que, frequentemente, se liga ao receptor
BMPR-II e BMPR-IA para sua ação ser realizada com êxito; foi com este propósito
que se testou se, na verdade havia associação entre a expressão dessa proteína
com seus receptores, assim como a angiogênese local, avaliada através da MVC da
endoglina, verificando uma associação estatisticamente significativa entre a
expressão da proteína BMP-2 e seus receptores, visto que, quanto maior a
expressão da BMP-2, maior também a expressão da BMPR-II (p=0,008) e da BMPR-
IA (p=0,006) nos casos de carcinoma epidermóide de língua (Tabela 7).
Tabela 7. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2 e seus receptores: BMPR-
II e BMPR-IA no carcinoma epidermóide de língua e no grupo controle. Natal, RN,
2009.
Expressão BMP-2
Ausente/escassa
Intensa
Total
Qui
2
p
*
Expressão BMPR-II
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
22
61,1
12
30,8
34
45,3
6,95
0,008
Forte
14
38,9
27
69,2
41
54,7
Total
36
100
39
100
75
100
Expressão BMPR-IA
n
%
n
%
n
%
Ausente/fraca
12
33,3
3
7,7
15
20
7,69
0,006
Forte
24
66,7
36
92,3
60
80
Total
36
100
39
100
75
100
* Teste do Qui-quadrado de Pearson
Tem-se, de acordo com a avaliação realizada, que a intensidade de
expressão da BMP-2 está diretamente relacionada com a MVC da endoglina,
observando-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,046), e esta mesma
relação apenas com o receptor BMPR-IA (p=0,003) (Tabela 8).
Tabela 8. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e o
índice angiogênico no carcinoma epidermóide de língua e grupo controle. Natal,RN,
2009.
MVC da endoglina
Expressão BMP-2
n
Média
Desvio
Padrão
t
p
*
Ausente/fraca
36
21,44
15,00
2,026
0,046
Forte
39
28,93
16,87
Expressão BMPR-II
n
Média
Desvio
Padrão
t
p
Ausente/fraca
34
25,69
18,40
0,169
0,86
Forte
41
25,04
14,62
Expressão BMPR-IA
n
Média
Desvio
Padrão
t
p
Ausente/fraca
15
14,26
15,36
3,102
0,003
Forte
60
28,11
15,48
* Teste “t” de student
Referente à associação da imunorreatividade das proteínas e o
estadiamento clínico, observou-se para a BMP-2 que o estágio IV exibiu 81,8% de
marcação forte, enquanto no estágio I verificou-se que 57,1% dos casos exibiram
marcação ausente a fraca não havendo, assim, associação estatisticamente
significativa entre esta imunomarcação e o TNM (p=0,24).
A BMPR-II mostrou tendência de marcação forte, tanto para o estágio I
(57,1%) como para o IV (72,7%), não evidenciando, então, associação estatística; já
para o receptor BMPR-IA o estágio III exibiu 100% de marcação intensa, não sendo
possível aplicar teste estatístico para a endoglina visto que 100% da amostra
exibiram marcação forte (Tabela 9).
Tabela 9. Associação da imunoexpressão entre a BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e o
estadiamento clínico (TNM) no carcinoma epidermóide de língua. Natal, RN, 2009.
Expressão BMP-2
Ausente/Escassa
Intensa
Total
Qui
2
p
*
n
%
n
%
n
%
ESTADIAMENTO
I
4
57,1
3
42,9
7
100
II
9
45
11
55
20
100
4,20
0,24
III
3
25
9
75
12
100
IV
2
18,2
9
81,8
11
100
Total
18
36
32
64
50
100
Expressão BMPR-II
Ausente/Escassa
Intensa
Total
Qui
2
p
n
%
n
%
n
%
ESTADIAMENTO
I
3
42,9
4
57,1
7
100
II
11
55
9
45
20
100
2,87
0,41
III
7
58,3
5
41,7
12
100
IV
3
27,3
8
72,7
11
100
Total
24
48
26
52
50
100
Expressão BMPR-IA
Ausente/Escassa
Intensa
Total
Qui
2
p
n
%
n
%
n
%
ESTADIAMENTO
I
2
28,6
5
71,4
7
100
II
4
20
16
80
20
100
4,00
0,26
III
0
0
12
100
12
100
IV
1
9,1
10
90,9
11
100
Total
7
14
43
86
50
100
* Teste do Qui-quadrado de Pearson
Em relação à MVC e ao estadiamento clínico, tem-se as maiores
médias de vasos no estadiamento II (35,97) e IV (35,69), havendo diferença
estatisticamente significativa entre essas duas variáveis (p=0,047) (Tabela10).
Tabela 10. Associação das médias do MVC da endoglina e o estadiamento clínico
(TNM) no carcinoma epidermóide de língua. Natal, RN, 2009.
Contagem Microvascular da endoglina
ESTADIAMENTO
n
Média
Desvio
Padrão
p
*
I
7
20,51
11,59
II
20
35,97
12,47
0,047
III
12
30,71
13,21
IV
11
35,69
13,46
Total
50
32,48
13,47
*Teste univariado de ANOVA
Para BMP-2, observou-se tendência de marcação forte, independente
do grau histológico de malignidade, com 59,1% de baixo grau e 67,9% de alto grau,
fato este verificado também para a BMPR-IA, com mais de 80 % dos casos exibindo
marcação forte, independente do grau estudado enquanto para o BMPR-II se
verificou uma tendência a marcação ausente a fraca nos de baixo grau (63,6%), e
marcação forte nos de alto grau (64,3%), não sendo possível aplicar o teste
estatístico para a endoglina, visto que 100% da amostra exibiram marcação forte
(Tabela 11).
Tabela 11 – Associação da imunoexpressão das BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e a
gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998), modificada por
Miranda (2002). Natal/RN, 2009
Expressão BMP-2
Ausente/fraca
Forte
Total
Qui
2
p
*
Grau
Histológico
n
%
n
%
n
%
Baixo grau
9
40,9
13
59,1
22
100
0,41
0,52
Alto grau
9
32,1
19
67,9
28
100
Total
18
36
32
64
50
100
Expressão BMPR-II
Ausente/fraca
Forte
Total
Qui
2
p
Grau
Histológico
n
%
n
%
n
%
Baixo grau
14
63,6
8
36,4
22
100
3,84
0,05
Alto grau
10
35,7
18
64,3
28
100
Total
24
48
26
52
50
100
Expressão BMPR-IA
Ausente/fraca
Forte
Total
Qui
2
p
Grau
Histológico
n
%
n
%
n
%
Baixo grau
4
18,2
18
81,8
22
100
0,57
0,45
Alto grau
3
10,7
25
89,3
28
100
Total
7
14
43
86
50
100
*Teste do Qui-quadrado de Pearson
Em referência à MVC e à gradação histológica de malignidade, nota-se
maior média para os de baixo grau; contudo, não foi houve diferença
estatisticamente significativa (p=0,14) (Tabela 12).
Tabela 12. Associação das médias da MVC da endoglina e a gradação histológica
de malignidade proposta por Bryne (1998), modificada por Miranda (2002).
Natal,RN, 2009.
MVC da endoglina
Grau
Histológico
n
Média
Desvio
Padrão
t
p
*
Baixo grau
22
35,63
13,48
1,48
0,14
Alto grau
28
30,00
13,17
* Teste “t” de student
Figura 2 – Forte expressão da BMP-2 em Carcinoma epidermóide de
língua de alto grau (SABC - 400x).
Figura 3 – Fraca expressão da BMPR-II em Carcinoma epidermóide de
língua de baixo grau (SABC - 400x).
Figura 4 – Forte expressão da BMPR-IA em Carcinoma epidermóide de
língua de baixo grau (SABC - 200x).
Figura 5 – Forte expressão da endoglina em Carcinoma epidermóide de
língua de alto grau (SABC - 400x).
Figura 6 – Fraca expressão do BMPR-IA em Hiperplasia Fibro-epitelial da
mucosa oral. Detalhe de áreas mais coradas no estrato superficial do
epitélio (SABC-100X)
Figura 7 - Front invasivo do carcinoma epidermóide de baixo grau, de
acordo com o sistema proposto por Bryne (1998) (H/E40x)
DISCUSSÃO
6 DISCUSSÃO
A localização topográfica mais frequente dos carcinomas epidermóides
orais na maioria dos países é a língua; muito embora haja significativa variação
anatômica na sua ocorrência. Neste tipo de tumor o sítio anatômico de
acometimento, o tipo histológico e estágio clínico, são fatores prognósticos para a
doença (ANTUNES et al., 2007).
Tem-se observado, na última década, significativo aumento da
incidência dessa neoplasia em pacientes, até a quinta década; desta forma, estudos
comparativos entre grupos etários abaixo e acima dos 50 anos, estadiamento,
hábitos, carcinógenos e sua incidência em neoplasias malignas, tem sido
apresentados na literatura especializada (BAUMAN et al., 2003).
Predominantemente, o carcinoma de língua acomete o sexo masculino,
entre as quinta e sexta décadas de vida; exibem significativa tendência à recorrência
pós-cirúrgica, apresentam grande predisposição para produzir metástase em
linfonodos regionais e são, dentre os tumores orais, os que detem as piores taxas de
sobrevida (ANTUNES et al., 2007; DANTAS et al., 2003; HARRISON et al., 2003;
NEVILLE et al., 2004; O’CHAROENRAT et al., 2003).
Na presente pesquisa, dos 50 casos de carcinoma epidermóide de
língua verificou-se que o sexo masculino foi o mais acometido, com predomínio no
grupo sem metástase de pacientes apresentando-se acima dos 65 anos e,
adicionalmente, no grupo com metástase a faixa etária se encontrou entre 45 a 65
anos. Achados esses concordantes com a literatura mundial, como evidenciado no
trabalho epidemiológico realizado por Brandizzi et al. em 2008, em um hospital de
referência na Argentina, em que entre 274 casos, a língua foi a localização mais
acometida (30%); a maioria dos pacientes era do sexo masculino, a média de
idade foi 62 anos e a língua foi a localização que apresentou a pior taxa de
sobrevida, isto é até 5 anos (27%), fato este observado também em um hospital de
referência no Brasil, de vez que, em 2008 Marques et al. observaram que dentre os
198 casos de câncer de boca 85% eram do sexo masculino e a faixa etária se
encontrava entre 50-59 anos; contudo, apesar dessa neoplasia ser mais frequente
no sexo masculino, Garavello et al. (2008) verificaram que o sexo não influencia no
prognóstico em pacientes com carcinoma de língua.
As características epidemiológicas do carcinoma epidermóide de língua
não diferem das demais localizações intra-orais, como observado na pesquisa de
Amorim Filho et al., em 2003, com pacientes que apresentavam carcinoma
epidermóide em base de língua, em que a maioria dos pacientes era do sexo
masculino, estavam na 5ª década e tinham como hábito o etilismo e o tabagismo.
Um dado clínico de suma importância no estudo das neoplasias é o
estadiamento clínico TNM que constitui a forma de comunicação para planejamento
do tratamento nos centros oncológicos do mundo e tem sido universalmente aceito
como indicador de agressividade dos CEOs. Na presente pesquisa, independente do
grupo estudado, observou-se maior prevalência do estágio clínico II. Logo, apesar
da literatura ser concordante quanto ao fato que os estágios de piores taxas de
sobrevida ser o III e o IV, Amaral et al. (2004) encontraram que carcinomas
epidermóides de língua e assoalho, mesmo em estágios iniciais, como o I e o II, com
infiltração muscular, mostraram elevada probabilidade de desenvolver metástases
ocultas e baixas taxas de sobrevivência, principalmente o estágio II.
Assim como na pesquisa realizada por Wu-long et al. (2008) que foram
analisados 100 pacientes com carcinoma de língua classificados como N0; desses
60% estavam no estágio clínico T2, 22% exibiram metástase linfonodal oculta e não
se encontrou correlação entre a presença deste último parâmetro e o diâmetro da
lesão sendo justificável, assim, a dissecção linfonal eletiva nos casos de carcinoma
epidermóide de língua.
Adicionalmente aos dados clínicos é necessário conhecer o
comportamento biológico de uma lesão para a adoção das medidas terapêuticas
mais indicadas para cada caso, evitando que o paciente seja submetido a um
tratamento mais rigoroso que o necessário ou que a escolha de procedimentos
inadequados venha a aumentar os riscos de desenvolvimento de lesão recorrente ou
metastática. Este problema tem movido numerosos pesquisadores em todo o mundo
na busca de indicadores prognósticos fidedignos que complementem os indícios
fornecidos pelo estadiamento clínico do câncer, obtidos através do sistema TNM
(BARROS, 2006).
Conforme Aguiar-Júnior, Kowalski e Almeida (2007), mesmo que na
prática clínica o TNM seja utilizado para planejamento terapêutico e como indicador
de prognóstico, outros fatores são relevantes para determinação das características
biológicas do tumor, haja vista que muitas vezes, em pacientes com tumores do
mesmo tipo histológico, localização e estágio, o curso da doença pode ser
completamente diferente (NEMETH et al., 2005).
Com o intuito de melhor graduar e conhecer o comportamento
biológico tumoral é que várias gradações histológicas de malignidade são propostas
ao longo dos anos, desde Broders (1920) a Bryne (1998), são alvo de estudos e
pequenas retificações em vários trabalhos científicos na atualidade, diferindo na
adoção de parâmetros, enquanto outros são mantidos ao longo dos anos.
Nesta pesquisa se utilizou a gradação histológica de malignidade
proposta por Bryne (1998); com a qual se avaliou o grau de ceratinização,
pleomorfismo nuclear, padrão de invasão tumoral e infiltrado inflamatório, no front
invasivo. Acredita-se ser esta a gradação histológica, dentre as propostas, à que
retrata com maior exatidão o comportamento biológico tumoral, naturalmente
adicionando-se a modificação no critério de classificação adotada por Miranda
(2002), em que os escores finais receberam, classificação de 4 a 8 pontos para
baixo grau e mais de 8 pontos para alto grau de malignidade.
Assim, dos 50 casos de carcinoma epidermóide de língua analisados
verificou-se que os dois grupos, com e sem metástase, apresentaram predomínio de
lesões de alto grau; desta forma, referidos achados concordam com a pesquisa
desenvolvida por Silveira (2007) de que, apesar de ter utilizado, em sua amostra,
carcinoma de lábio e língua encontrou, em 30 casos desta última localização, um
predomínio maior de alto grau de malignidade (17casos). Comprovando o que é
relatado na literatura de que, dentre os cânceres orais, aqueles que acometem esta
localização anatômica tem o maior índice de agressividade, pior comportamento
biológico e maior índice de metástase linfonodal, mesmo quando não visualizada
clinicamente, tão quanto radiograficamente (SANO; MYERS, 2007).
O valor prognóstico da gradação histológica de malignidade ainda
permanece controverso, porém é bastante ressaltado na literatura, se a utilização de
parâmetros morfológicos presentes no tumor, poderia fornecer informações
adicionais em relação à sua atividade biológica (SILVEIRA, 2007; BARROS, 2006).
O conhecimento do comportamento biológico e da evolução das
neoplasias é essencial para a adoção de medidas terapêuticas adequadas; desta
forma, estudos nas diversas áreas da biologia molecular estão sendo realizados
buscando-se compreender a complexa via de sinalização das células neoplásicas e
as diversas proteínas utilizadas por essas células ou que, de alguma forma,
participam do processo de sobrevivência, migração e invasão neoplásica; dentre
essas, as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), da mesma forma que seus
receptores, estão sendo alvo de estudos na área da cancerologia, em geral e,
apesar dos escassos trabalhos na área do câncer oral, seu papel nos demais
cânceres está sendo exaustivamente estudado existindo, na literatura, vários
trabalhos com câncer intestinal, de mama e bexiga, dentre outros.
As BMPs e outros membros da superfamília TGFβ são secretados
como proteínas sinalizadoras participando de diversas etapas durante estágios da
embriogênese e organogênese. Após o nascimento e na vida adulta essas proteínas
e seus análogos são essenciais para o reparo tecidual e homeostase e também para
o controle do crescimento; logo, distúrbio na via de sinalização das BMPs tem sido
relacionado à patogênese de uma variedade de doenças, incluindo câncer,
displasias, osteoporoses, infertilidade, neovascularização, psoríase e fibrose
(SEBALD et al., 2004).
Conforme já referido, a sinalização das BMPs é mediada por
receptores treonina/serina quinase, expressos diferentemente em vários tecidos, e
subdividido em tipos I e II; o receptor tipo II é constitutivamente quinase ativo que
transfosforila o receptor tipo I e este fosforila substratos intracelulares, conduzindo a
transdução de proteínas. Esta sinalização, por sua vez, pode estimular ou inibir o
crescimento de células do câncer e sua atividade é fundamentalmente controlada
por fatores intracelulares e extracelulares em diferentes níveis (GAZZERRO;
CANALIS, 2006; BALEMANS; VAN HUL, 2002).
Segundo Kim e Kim (2006) o efeito preciso das BMPs em células
malignas deve ser interpretado no contexto do tipo celular e condições
experimentais haja vista que, realizando-se uma revisão da atuação dessas
proteínas em diversos tipos de câncer, e dependendo do tipo de câncer estudado,
elas poderiam estar super ou subexpressas como, por exemplo, no carcinoma de
células transicionais da bexiga, em que se verificou uma subexpressão enquanto
que no câncer colorretal e de mama, uma superexpressão.
Diante dos diversos efeitos que as BMPs podem exercer de acordo
com o tipo celular e órgão em questão, a BMP-2 encontra-se envolvida em inúmeros
processos, como formação óssea, angiogênese, gastrulação, neurogênese,
apoptose e proliferação celular (KOTZCH et al., 2008). Objetivamos com esta
pesquisa estudar a imunoexpressão da BMP-2, BMPR-II e BMPR-IA, assim como da
endoglina em carcinomas epidermóides de língua, na tentativa de elucidar o papel
dessas proteínas no comportamento biológico desta neoplasia, visto que a amostra
constou de um grupo de lesões com metástase e outro sem metástase; além disso
se estudou também, a imunomarcação no grupo das hiperplasias fibrosas já que,
segundo a literatura, essas proteínas se expressam fracamente ou não se
expressam em lesões benignas ou mucosa oral normal (JIN et al., 2001; SOARES,
2008).
Suzuki et al. (2001) estudaram a imunolocalização da BMP-2 na região
maxilofacial de embriões e observaram sua presença nos germes dentários, nas
fibras musculares imaturas da língua e no epitélio da boca e do esôfago.
O tipo de expressão das proteínas neste trabalho foi dicotomizado para
evitar dispersão dos dados, podendo-se observar predomínio de marcação forte da
BMP-2 no grupo do carcinoma epidermóide de língua, enquanto o grupo controle
exibiu 72% de marcação ausente a fraca, observando-se uma associação
estatisticamente significativa (p=0,007) concordando, assim, com os trabalhos de
Soares, em 2008, que também utilizou a hiperplasia fibrosa inflamatória como grupo
controle e encontrou, em 100% dos casos, uma fraca expressão, tal como relatado
no trabalho desenvolvido por JIN et al., em 2001, cujo grupo controle foi composto
também por mucosa oral normal, casos de hiperceratose e papiloma, contudo,
todos mostrando o mesmo padrão de imunoexpressão ora relatado.
Hatakeyama et al. (1997) induziram a formação de tumores epiteliais
em ratos e observaram a formação de osso no adenocarcinoma de glândulas
salivares, além da presença de massas calcificadas no carcinoma de língua e
gástrico; contudo, a marcação imunoistoquímica da BMP-2 só foi evidenciada no
carcinoma de língua confirmando, assim, sua presença na neoplasia.
Enquanto que com relação aos receptores se pode observar, para o
receptor BMPR-II, que 56% do grupo com metástase e 60% do grupo controle
exibiram marcação forte, no grupo sem metástase 52% exibiram marcação de
ausente a fraca, assim como para a BMPR-IA ocorreu predomínio de marcação
forte, independente do grupo, não havendo associação estatística entre a marcação
e os grupos. Não concordante com os trabalhos anteriormente referenciados,
quando Soares (2008) encontrou fraca expressão da BMPR-IA tanto para o grupo
controle como para o grupo com metástase, situação inversa encontrada no grupo
sem metástase, em que 100% dos casos exibiram marcação forte. Vários estudos
tentando elucidar a especificidade das ligações, demonstraram que o BMPR-IA se
liga preferencialmente e com alta afinidade, à BMP-2 e menos à BMP-7 e GDF-5
(BALEMANS; VAN HUL, 2002; GAZZERRO; CANALIS, 2006; REDDI,
2005;SEBALD et al., 2004).
Estudando o papel das BMPs -2, -4 e -7, receptores de BMPs – IA, IB e
II e o noggin em uma linhagem de células de adenocarcinoma de próstata
metastático, observou-se que a BMP-2 e, em menor extensão, a BMP-4,
estimularam a proliferação, migração celular, sendo a invasão celular estimulada
apenas pela BMP-2, enquanto a BMP-7 não apresentou nenhum desses efeitos. Os
três receptores foram encontrados nessas células sugerindo sua participação nos
efeitos exercidos pelas BMPs. A superexpressão do noggin inibiu todos esses
efeitos supracitados in vitro e exerceu sua função inibitória sobre o crescimento e
osteólise tumoral in vivo, sugerindo que a inibição local das atividades das BMPs no
câncer de próstata pode permitir novas modalidades terapêuticas diminuindo a
mortalidade e morbidade associada à doença metastática (FEELEY et al., 2006).
Em referência ao tipo de distribuição da BMP-2, BMPR-II e BMPR-IA,
observou-se tendência da marcação difusa, independente da lesão, enquanto no
trabalho de Soares (2008) ocorreu uma variabilidade de padrão, dependendo do
grupo estudado, como no grupo controle e experimental sem metástase observou-se
um predomínio de marcação difusa, enquanto que no grupo com metástase
marcação focal.
A BMP-2 se liga às BMPR-IA e BMPR-IB com alta afinidade, quando
comparados com os demais tipos de receptores tipo I; assim sendo, Kotzsch et al.
(2008) investigaram a interação dessa proteína com esses dois receptores na
síndrome da polipose juvenil e observaram que mutações conduzem à inativação da
BMPR-IA,o que causa perda da função supressora tumoral exercida pela BMP-2 em
células epiteliais do colon.
A concentração da BMP-2 em tecidos específicos é crítica haja vista
que níveis alterados podem ocasionar anormalidades de desenvolvimento ou
influenciar a progressão de diversas doenças; desta forma, a identificação dos
mecanismos moleculares que regulam o grau preciso de expressão da BMP-2 é de
suma importância. A expressão gênica anormal da BMP-2 está associada a
osteoartrites, câncer de pulmão, mama, colon, pâncreas e próstata, podendo seus
níveis normais suprimir tumores em alguns tecidos; em contrapartida, sua expressão
alterada pode promover a transição do normal para maligno (XU; ROGERS, 2007;
HARDWICK et al., 2004; LANGENFELD et al., 2003).
Considerando apenas o grupo experimental para BMP-2 deste trabalho
observou-se que 72% dos carcinomas com metástase exibiram uma marcação forte,
enquanto no grupo sem metástase 56% mostraram esse tipo de marcação havendo,
assim, uma associação desta proteína com o comportamento biológico tumoral.
Katsuno et al. (2008) estudando a ação do TGFβ3 e BMP-2 em uma
linhagem celular (MDA-231-D) de câncer de mama, observaram que o crescimento
dessas células não foi afetado, porém ocorreram indução da motilidade e
invasividade dessas células, através da degradação do colágeno tipo I, além de
participação no processo de metástase óssea.
As BMPs exercem duplo papel na progressão e metástase tumoral.
Durante estágios precoces da carcinogênese essas proteínas agem como
supressoras da proliferação celular e em estágios avançados, induzem a interação
epitélio-mesênquima e aumentam a motilidade e invasividade das células,
resultando em metástase (DERYNCK; AKHURST; BALMAIN, 2001). Além da sua
atuação no processo de invasão tumoral, as BMPs também participam do processo
de angiogênese e inibição da vigilância imune. Em razão de todos os seus efeitos
nas diversas etapas do câncer é que os membros da superfamília TGFβ, dentre os
quais, as BMPs, tem sido consideradas biomarcadores preditivos à progressão da
tumorigênese, também como alvo da prevenção e tratamento do câncer e metástase
(JAKOWLEW, 2006).
A angiogênese está diretamente relacionada ao crescimento tumoral e
metástase, motivo pelo qual terapias antiangiogênicas representam uma modalidade
promissora para o tratamento do câncer. A endoglina (CD105) é uma proteína
abundantemente expressa nas células endoteliais, sendo também receptoras para o
TGFβ. Estudos imunoistoquímicos revelaram que esta proteína é fortemente
expressa nos vasos sanguíneos tumorais e, ainda, que se trata de um alvo vascular
promissor, podendo ser usada para imagens tumorais e prognóstico apresentando
potencial terapêutico tanto para tumores sólidos como para outras doenças
angiogênicas (DUF et al., 2003).
Com relação à expressão e ao tipo de distribuição da endoglina,
verifica-se que 100% dos carcinomas apresentaram marcação forte e a maioria um
tipo de distribuição difuso; por outro lado, no grupo controle 80% exibiram marcação
de ausente a fraca, com predomínio de marcação focal; em relação ao índice
angiogênico, o grupo sem metástase (32,91) exibiu média muito semelhante à do
grupo com metástase (32,05) mostrando, contudo, diferença significativa com o
grupo controle (11,05), concordando com o trabalho de Schimming et al. (2004) os
quais encontraram uma expressão da endoglina muito maior nos tecidos tumorais,
média da densidade vascular de 2,58, que nos tecidos normais da mucosa oral,
média de 1,21, porém os tumores com metástase local comprovada
histopatogicamente tiveram uma expressão bem mais marcante que os sem
metástase discordando, pois, do estudo em questão; Soares et al. (2007)
observaram em sua pesquisa com carcinoma ex-adenoma e adenomas
pleomórficos, um pequeno número de vasos marcados na lesão benigna.
Segundo a literatura, a endoglina apresenta forte expressão em vasos
sanguíneos de tumores e fraca expressão em tecidos normais. Estudos realizados
em diferentes laboratórios nos quais se usaram vários anticorpos anti-CD105, tem
revelado elevada expressão dessa proteína em tumores incluindo-se os cânceres de
colon, pulmão, mama e de cabeça e pescoço indicando, desta forma, tratar-se de
um potente marcador na neovascularização de tumores sólidos (KYZAS;
AGNANTIS; STEFANOU, 2006).
Como já referido, para que a BMP-2 atue é necessário que ela se ligue
a receptores tipos I e II; nesta pesquisa se estudaram os receptores BMPR-II e
BMPR-IA; com o intuito de verificar esta ligação, realizou-se a associação entre a
marcação dessas proteínas, constatando-se que existiu uma associação significativa
entre a expressão da proteína BMP-2 e seus receptores visto que, quanto maior a
expressão da BMP-2, maior também a expressão da BMPR-II (p=0,008) e BMPR-IA
(p=0,006); Pode-se sugerir, então, uma superexpressão da via de sinalização, e a
mesma contribui para a proliferação celular o que, em consonância com o relatado
na literatura, a BMP-2 é uma citocina que, quando secretada no meio pode atuar de
forma parácrina ou autócrina, ligando-se a receptores, vários dos quais não
apresentam especificidade de ligação, podendo interagir com diferentes proteínas da
superfamília TGFβ, significando que as cadeias do receptor tipo I podem ser
ativadas por uma variedade de cadeias tipo II(BALEMANS; VAN HUL, 2002;
GAZZERRO; CANALIS, 2006; REDDI, 2005; SEBALD et al., 2004).
Avaliando a associação da marcação da BMP-2 e seus receptores com
o índice angiogênico, avaliado através da contagem microvascular, no presente
trabalho observou-se uma associação estatisticamente significativa entre a
marcação da BMP-2 (p=0,046) e o receptor BMPR-IA (0,003), corroborando com o
trabalho de Barbara, Wrana e Letarte (1999) que encontraram que a endoglina era
incapaz de ligar-se a BMP-2 sozinha, mas com a coexpressão do alk3(BMPR-IA) e
alk6 (BMPR-IB) essa interação ocorreria. Assim como na pesquisa realizada por
Langenfeld e Langenfeld (2004), que estudando o papel da BMP-2 na angiogênese,
verificaram que ela aumenta a neovascularização no desenvolvimento de tumores,
fato este confirmado pela utilização de uma BMP-2 recombinante que estimulou a
formação de vasos sanguíneos em uma linhagem celular (A549) de câncer
pulmonar; sua propriedade em ativar as células endoteliais foi demonstrada pela
habilidade de fosforilar a Smad 1/5/8 e ERK-1/2 e aumentar a expressão do id1, com
consequente proliferação e formação do tubo. Através da imunoistoquímica
observou-se um aumento 3 vezes de vasos sanguíneos em tumores tratados com
BMP-2, e os receptores BMPR-IA, IB e II foram expressos em todas as células
endoteliais. Os autores concluíram que a intensa expressão da BMP-2 promove o
crescimento tumoral, em virtude de estimular a angiogênese.
Em 2006 Raida et al. concluíram, em sua pesquisa com células
progenitoras epiteliais, células troncos mesenquimais e rhBMP-2, que a secreção da
BMP-2 associada ao tumor, pode promover a angiogênese tumoral por efeitos
quimiotáticos nas células progenitoras endoteliais circulantes do sangue periférico e
por aumento da secreção parácrina de fatores de crescimento angiogênicos,
incluindo-se o fator de crescimento placental (PIGF) e o fator de crescimento
endotelial (VEGF) em células tronco mesenquimais, no estroma tumoral.
No estudo do câncer a busca de parâmetros que retratem
fidedignamente as características clínicas e biológicas da neoplasia em questão,
constitui um objetivo desde a sua descoberta; assim, surgiu e ainda na atualidade se
utiliza o estadiamento clínico TNM, utilizado de acordo com a neoplasia e o órgão
acometido.
Analisando a relação da imunoexpressão da BMP-2, BMPR-II, BMPR-
IA (Tabela 9) e a endoglina (Tabela 10) com o TNM, observou-se que nenhuma das
proteínas apresentou associação estatisticamente significativa, exibindo p>0,05;
verificou-se, porém, uma porcentagem maior de marcação intensa para o estágio IV
da BMP-2 (81,8%), BMPR-II (72,7% ), enquanto para a BMPR-IA o estágio III exibiu
100% de marcação intensa; já para o CD105 100% da amostra, exibiu marcação
intensa.
Segundo Amar et al. (2003), a doença em estágio avançado é definida
pela presença de tumor primário extenso (> 4cm) e presença de metástases à
distância, o que configura os estágios clínicos (TNM) III e IV.
Araújo Júnior et al. (2008) estudando a correlação entre o TNM com o
prognóstico e localização anatômica em 130 casos de carcinoma epidermóide oral,
notaram que, nos estágios clínico (TNM) III e IV, os pacientes apresentaram um
índice maior de recorrência ou foram a óbito.
Contudo quando realizada a associação entre o índice angiogênico e o
TNM, obteve-se um p=0,047, cujas maiores médias foram para o estadiamento
clínico II e IV, diferindo do trabalho realizado por Xavier (2008) em que a média do
CD 105 foi mais elevada nos pacientes com T3 e T4 e não houve associação
estatisticamente significativa entre a imunoexpressão dos biomarcadores e o TNM,
talvez este fato seja justificado por este autor ter utilizado em sua amostra 30
carcinomas epidermóides orais de três diferentes localizações (10 casos de
assoalho bucal, 10 região retromolar e 10 de língua).
A classificação TNM foi idealizada como mais uma ferramenta no
planejamento do tratamento, indicador de prognóstico, e por facilitar a troca de
informações entre os oncologistas, com base assim, na história natural do câncer e
em progressão de eventos como aumento, invasão e disseminação de linfonodos
regionais e metástase. Este estadiamento é dividido em duas partes, em que na
primeira a extensão anatômica do câncer é descrita com as categorias T, N e M e,
no segundo momento, essas categorias são agrupadas em estágios unificando
pacientes com diferentes combinações de TNM à distância (HALL et al., 2009).
Apesar da ausência de trabalhos através dos quais se tenha avaliado a
associação das BMPs com o TNM, vários estudos da biologia molecular tem
demonstrado o seu papel em diversos estágios da carcinogênese, como o realizado
por Hsu et al. (2005), que, através do RT-PCR, evidenciaram a superexpressão da
BMP-2, 6, 7 e 8 em células do melanoma quando comparado a melanócitos normais
e que, em particular, a expressão da BMP-7 está correlacionada com a
agressividade tumoral.
De acordo com Baatenburg et al. (2001) este sistema deve abranger
detalhes das características anatômicas locais para que se obtenham dados sobre o
grau de envolvimento dessas estruturas pelo tumor, assim como metástases à
distância, delineando o prognóstico e a sobrevida do paciente. Muitos autores
consideram o estadiamento clínico TNM um dos melhores indicadores de
prognóstico do CEO (HERMANEK; SOBIN; FLEMIG, 1996; IRO; WALDFAHERER,
1998). Outros estudos corroboram com a afirmativa anterior tendo em vista que
demonstraram forte correlação da classificação TNM com o prognóstico do CEO
(CARINCI et al., 1999; HOSAL; UNAL; AYHAN, 1998; LACY; SPITZNAGEL JR;
PICCIRILLO, 1999) mas, conforme Dantas et al. (2003) e Sawair et al. (2003), este
sistema não fornece informações precisas sobre as características biológicas do
tumor.
Desde 1920 até a atualidade, perdura a busca por gradações que
retratem este comportamento biológico e seja mais um adicional para a escolha
adequada da terapia a ser instituída, razão por que se utilizou, neste trabalho, a
gradação de Bryne (1998), por ser de fácil reprotuditibilidade, execução e, ainda, em
virtude de não ter surgido depois desta, qualquer gradação com respaldo
metodológico e aceitável. Segundo a autora, as células presentes no “front” invasivo
do tumor exibem características moleculares diferentes daquelas situadas na região
superficial do tumor justificando, desta forma, ser esta área a mais importante para
determinação do prognóstico tumoral.
Como já referido no início do texto, o maior número de casos foi de alto
grau, independente do grupo de carcinoma estudado e, tentando-se obter alguma
associação entre as imunoexpressões das proteínas e a MVC e a gradação
histológica de malignidade, não se observou significância estatística, embora se
tenha observada tendência de marcação forte para BMP-2 e BMPR-IA,
independente do grupo estudado, enquanto para a BMPR-II se notou tendência de
marcação ausente a fraca no grupo de baixo grau (63,6%) e marcação intensa nos
de alto grau (64,3%); já para o CD105 tem-se 100% dos casos com marcação
intensa e, com relação à MVC, verifica-se maior média para os de baixo grau
(35,63), quando comparados com os de alto grau (30,00).
Devido a maioria da amostra ter sido classificada de alto grau
independente do grupo estudado, provavelmente tenha sido este o motivo de não
se encontrar associação da expressão dessas proteínas com a gradação histológica
de Bryne (1998).
Barros (2006) estudando a expressão das metaloproteinases 1, 2, 7, 9
e 26 em carcinomas epidermóides orais de lábio e língua, observou que só houve
diferença estatística entre a imunoexpressão das proteínas e a gradação também
proposta por Bryne (1998) para a MMP-7 e MMP-26, apesar de haver uma
positividade maior nas lesões de alto grau, exceto para MMP-2, em que se observou
inversão de tendência; Silveira et al., 2007, também não acharam nenhuma
correlação entre a expressão das CKs 7, 10, 13, 14, 16 e 19 com a gradação
histológica de malignidade.
Observa-se, portanto, a participação da BMP-2 na proliferação celular
do carcinoma epidermóide de língua sugerindo que a via de sinalização está supra-
regulada neste tipo de neoplasia ou, ainda, que os antagonistas não estejam
atuando visto que se encontrou uma significativa associação entre a marcação da
BMP-2 e seus receptores, assim como foi comprovado o efeito pró-angiogênico
dessa proteína, encontrando-se uma associação significativa da BMP-2 e o receptor
BMPR-IA com a marcação da endoglina sugerindo, desta forma, futuros estudos
para especificação dos mecanismos de sinalização dessa proteína no carcinoma
epidermóide de língua, já que seu efeito depende do tipo celular e do órgão
acometido.
CONCLUSÕES
7 CONCLUSÕES
1. Os dados epidemiológicos, no tocante ao sexo e faixa etária,
assemelham-se aos existentes na literatura.
2. A maioria dos carcinomas epidermóides de língua apresentaram-se no
estagio (TNM) II e graduados histopatopatologicamente, como de alto
grau, independentemente da presença de metástase demonstrando,
assim, comportamento biológico mais agressivo.
3. A superexpressão da BMP-2 no grupo experimental, contrastando com
a marcação ausente a fraca no grupo controle, assim como
correlacionando com o grupo sem metástase, demonstra a participação
desta proteína na proliferação celular neste tipo de neoplasia,
evidenciando-se também maior potencial para invasividade.
4. Através da intensidade de expressão, tipo de distribuição e índice
angiogênico da endoglina nos carcinomas epidermóides de língua,
pode-se afirmar ser este um potente marcador de neovascularização,
nesta neoplasia.
5. A associação da BMP-2 e receptor BMPR-IA com o índice angiogênico,
mostra que neste tipo de neoplasia a BMP-2 se apresenta como pró-
angiogênico no processo metastático.
6. O TNM não apresenta associação com a intensidade de expressão e o
tipo de distribuição da BMP-2, BMPR-II, BMPR-IA e endoglina, apenas
com o índice angiogênico onde as maiores médias foram para o
estágio clínico II e IV.
7. Não se evidenciou associação alguma entre a imunoexpressão dessas
proteínas e o grau histológico de malignidade.
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Trabalho de acordo com as normas de documentação da Associação Brasileira de Normas Técnicas
– ABNT a saber:
NBR 6023: Informação e Documentação – referências – elaboração, 2002;
NBR 6024:– Informação e Documentação - numeração progressiva das seções de um documento
escrito – Apresentação 2003;
NBR 6027: Informação e Documentação – sumário – Apresentação, 2003;
NBR 6028: Informação e Documentação – resumos – Apresentação, 2003;
NBR 10520: Informação e Documentação – citação em documentos– Apresentação, 2002;
NBR 14724: Informação e Documentação – trabalhos acadêmicos – Apresentação, 2002;
APÊNDICE
APÊNDICE A
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
A) OBJETIVO E JUSTIFICATIVA DA PESQUISA:
Obrigado (a) pela sua participação como voluntário (a) em nossa pesquisa!
A presente pesquisa tem por objetivo desenvolver um estudo analítico
e comparativo dos achados clínicos e imunoistoquímicos em uma série de casos de
Carcinoma Epidermóide de língua de pacientes atendidos no Serviço de Cirurgia de
Cabeça e Pescoço e no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz
Antônio, utilizando como controle positivo uma série de casos de hiperplasia fibrosa
inflamatória dos arquivos do Serviço de Anatomia patológica da Disciplina de
Patologia Oral da Faculdade de Odontologia da UFRN, em Natal/RN, com intuito de
analisar a expressão imunoistoquímica de BMP-2, seus receptores BMPR-IA e
BMPR-II, correlacionando-os com o comportamento biológico de Carcinomas
Epidermóides de língua. Além disto, pretende-se verificar a relação entre a
expressão dessas moléculas e o processo de angiogênese local, analisado através
da expressão imunoistoquimíca da Endoglina (CD-105), podendo este estudo
confirmar ou não a sua utilização como indicador de agressividade e prognóstico
tumoral.
B) RISCOS POSSÍVEIS E BENEFÍCIOS ESPERADOS:
Os sujeitos desta pesquisa não serão expostos a nenhum risco, visto que os
mesmos não serão chamados para execução da pesquisa, em nenhum momento.
Esclareço, outrossim, que os benefícios esperados envolvem o melhor
conhecimento da doença, do perfil da população do Rio Grande do Norte acometida
pelo carcinoma epidermóide de língua e, por conseguinte, um tratamento mais
adequado, sendo que os resultados obtidos serão publicados para o conhecimento
na literatura científica pertinente.
C) PROCEDIMENTOS:
Para realização desta pesquisa, serão coletados os dados clínicos contidos
nos prontuários (fichas clínicas) no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e
laudos histopatológicos arquivados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital
Dr. Luiz Antônio. Portanto, além de um processamento imunoistoquímico das peças
cirúrgicas no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
D) RESSARCIMENTO:
Não está previsto nenhum ressarcimento ou indenização para os participantes
desta pesquisa, uma vez que o estudo será realizado com dados obtidos em
prontuários (fichas clínicas) e laudos histopatológicos, que se encontram arquivados
nos Serviços de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, e, de Anatomia Patológica do
Hospital Dr. Luiz Antônio, respectivamente, além de uma análise das lâminas com
marcação imunoistoquímica processadas no laboratório de Anatomia Patológica da
Disciplina de Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
E) ACESSO ÀS INFORMAÇÕES:
Você poderá desistir de participar da pesquisa em qualquer momento, mesmo
que tenha assinado este Termo de Consentimento. As informações obtidas de cada
participante são confidenciais e somente serão usadas com o propósito científico,
sem divulgação de nomes. O pesquisador, os demais profissionais envolvidos nesse
estudo e o Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Rio-Grandense Contra o
Câncer (LNRCC), terão acesso aos arquivos dos participantes, para verificação de
dados, sem, contudo, violar a parte confidencial.
E) CONSENTIMENTO:
Declaro que, após ter lido e compreendido as informações contidas neste
documento, concordo em participar deste estudo. Portanto, autorizo o uso dos dados
contidos nos prontuários e nos laudos histopatológicos já mencionados, além da
análise imunoistoquímica de fragmento da minha peça cirúrgica, sem o que fica
prejudicada a utilização dos prontuários e laudos para os fins especificados.
E através deste instrumento e da melhor forma de direito, autorizo o Professor
Doutor Leão Pereira Pinto, RG 75.129 – SSP/RN, vinculado ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral, situado a Av. Salgado Filho, 1787, lagoa Nova –
Natal/RN CEP: 59.060-000, a incluir meu caso no estudo.
Autorizo também a publicação do referido trabalho, de forma escrita, sem citar
meu nome. Concedo também o direito do uso para fins de ensino e divulgação em
revistas científicas, desde que mantido o sigilo sobre minha identidade. Estou ciente
que deverá ser de livre e espontânea.
Em caso de alguma dúvida sobre a conduta ética nesta pesquisa posso entrar
em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Rio-Grandense
Contra o Câncer (LNRCC), pelos telefones 4009-5494 / 4009-5440 ou com o próprio
pesquisador no endereço já mencionado ou, ainda, no Programa de Pós-Graduação
em Patologia Oral, localizado no Departamento de Odontologia da UFRN, no
endereço supracitado, pelo telefone (84) 3215.4108.
Natal, _____/_____/_____.
Concordo com os termos deste documento, razão pela qual estudo de acordo:
Nome do paciente: _______________________________________________
Endereço:
_______________________________________________________________
RG: ________________ Órgão expedidor: _____________
CPF:__________________
Assinatura: ______________________________________________________
__________________________
Professor Dr. Leão Pereira Pinto
(Pesquisador responsável)
OBSERVAÇÃO: Segue, em anexo, envelope com o endereço para a remessa desta
correspondência após a sua assinatura.
APÊNDICE B
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
Orientador: Prof.Dr. Leão Pereira Pinto.
Orientanda: Cristina Ruan Ferreira de Araújo
FICHA CLÍNICA
NOME:__________________________________ PRONT:________________
IDADE: ___ SEXO:__ RAÇA: ___CIDADE DE ORIGEM:__________________
ENDEREÇO:__________________________ Nº:_______ AP:_____________
BAIRRO:_________ CEP:___________CIDADE:________________________
LOCALIZAÇÃO:_________________________________________________
DIAGNÓSTICO CLÍNICO:__________________________________________
ESTADIAMENTO CLÍNICO: T___ N___M___
TRATAMENTO: CIRURGIA ( ) RADIOTERAPIA ( ) QUIMIOTERAPIA ( )
DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO:________________________________
GRADAÇÃO HISTOLÓGICA:________________________________________
BIÓPSIA : EXCISIONAL ( ) INCISIONAL ( )
Nº DA PEÇA / BLOCO:___________________
METÁSTASE: SIM ( ) NÃO ( ) ÓBITO: SIM ( ) NÃO ( )
Natal, _____/_____/_____, ____________________________
(Assinatura)
APÊNDICE C
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
Orientador: Prof.Dr. Leão Pereira Pinto.
Orientanda: Cristina Ruan Ferreira de Araújo
FICHA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS REFERENTES À EXPRESSÃO
DO CD105
Nº
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
CAMPOS
1
2
3
4
5
INTENSIDADE
DISTRIBUIÇÃO
MVC
Nº
HIPERPLASIA FIBROSA INFLAMATÓRIA
CAMPOS
1
2
3
4
5
INTENSIDADE
DISTRIBUIÇÃO
MVC
APÊNDICE D
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS BMP-2, BMPR-IA, BMPR-II E
ENDOGLINA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
Orientador: Prof.Dr. Leão Pereira Pinto.
Orientanda: Cristina Ruan Ferreira de Araújo
FICHA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS REFERENTES À EXPRESSÃO
DA BMP-2, BMPR-II E BMPR-IA
LÂMINA
INTENSIDADE
PADRÃO
IMUNOLOCALIZAÇÃO
GRADAÇÃO
ANEXO
ANEXO
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
