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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE
FORMULAÇÃO COSMÉTICA CONTENDO DIGLUCONATO
DE CLOREXIDINA
Mestranda: Flávia Angélica Másquio Fiorentino
Orientadora: Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado
Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa
Araraquara, SP 2009
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Livros Grátis
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ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE
FORMULAÇÃO COSMÉTICA CONTENDO DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de
Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e
Medicamentos, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orietandor: Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado
Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa
Araraquara, SP, 2009
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iii
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus Araraquara
Fiorentino, Flávia Angélica Másquio
F518d Desenvolvimento e controle de qualidade de formulação cosmética
contendo digluconato de clorexidina / Flávia Angélica Másquio Fiorentino. –
Araraquara, 2009.
194 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós
Graduação em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Hérida Regina Nunes Salgado
Co-orientador: Marcos Antonio Corrêa
. 1.Controle de qualidade – Clorexidina. 2. Sabonete líquido.
3.Clorexidina. 4.Cosmetologia. I. Salgado, Hérida Regina Nunes, orient. II.
Corrêa, Marcos Antonio, co-orient.. III.Título.
CAPES: 403000005
iv
“Toda sabedoria vem do Senhor e está com ele para sempre
Quem poderá contar a areia das praias, as gotas da chuva e
os dias do mundo?
Quem poderá explorar a altura do céu, a extensão da terra e
a profundeza do abismo?
A sabedoria foi criada antes de todas as coisas, e a
inteligência prudente foi criada antes dos séculos
A quem foi revelada a raiz da sabedoria?
Quem conhece os seus projetos?
Somente um é sábio, e é por demais terrível quando se
assenta em seu trono: é o Senhor, ele que criou a sabedoria, a
conheceu, a enumerou e a derramou sobre todas as suas
obras
Ele a repartir entre os seres vivos, conforme sua
generosidade, e a concedeu a todos aqueles que o amam”
Eclesiático 1.
v
Aos meus queridos e amados pais Celso e Célia...
Aos meus queridos e amados pais Celso e Célia...Aos meus queridos e amados pais Celso e Célia...
Aos meus queridos e amados pais Celso e Célia...
Pelo amor em todos os dias de minha vida, pelo
apoio em todos os momentos em que foi preciso, pelos
incentivos, pelo carinho, pela preocupação, pelas orações,
pela ajuda financeira, pela confiança de que eu seria capaz
desta conquista, por sempre cuidarem do meu grande amor
para que eu ficasse tranquila e realizasse minha dissertação
da melhor maneira possível.
Desculpem-me pelos momentos em que ausência e a falta
de atenção estiveram presentes.
Obrigada por serem meus pais. Amo vocês!!!
“... Por toda a minha vida eu vou amar vocês ...”
vi
Ao meu grande amor, meu filho Gabriel...
Ao meu grande amor, meu filho Gabriel...Ao meu grande amor, meu filho Gabriel...
Ao meu grande amor, meu filho Gabriel...
Sua existência e seu amor são os motivos para
persistir e nunca desistir dos sonhos...
A distância física nunca me fez deixar de pensar
em você um dia que fosse. A saudade me colocou em dúvida
muitas vezes, mas lembrar do seu rostinho lindo é a força e a
coragem para continuar a caminhar...
Perdoe-me pela falta de paciência e pelos momentos
ausentes, e olha que não foram poucos...
Amo você mais do que tudo!!!
“... Eu tenho tanto pra te falar
Mas com palavras não sei dizer
Como é grande o meu amor por você ...”
vii
À minha
À minha À minha
À minha querida irmã, Camila...
querida irmã, Camila...querida irmã, Camila...
querida irmã, Camila...
Por sempre me incentivar na realização deste
trabalho, por sempre dizer palavras de coragem quando
foram necessárias, pelas orações, por sempre estar presente e
ter me ajudado e apoiado.
Obrigada!!!
“... Há certas horas que só queremos a mão no ombro, o abraço
apertado ou mesmo o estar ali, quietinho, ao lado...
Sem nada dizer...
Alguém que ria de nossas piadas sem graça...
Que ache nossas tristezas as maiores do mundo...
E que apesar de todas essas mentiras úteis, nos seja de uma sinceridade
inquestionável...”
Willian Shakespeare
viii
À Profª. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado...
À Profª. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado...À Profª. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado...
À Profª. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado...
Por ter sido minha orientadora!
Obrigada pela confiança, pelos ensinamentos,
incentivos e por ter-me dado a chance da realização deste
trabalho.
Obrigada por ser exemplo de uma profissional
extremamente competente e determinada.
ix
“... Depois de algum tempo você aprende a construir todas as suas
estradas no hoje, porque o terreno do amanhã é incerto demais ...
Aprende que verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a
longas distâncias
Descobre que as pessoas com quem você mais se importa na vida são
tomadas de você muito depressa... por isso sempre devemos deixar as
pessoas que amamos com palavras amorosas; pode ser a última vez que
as vejamos. Aprende que as circunstâncias e os ambientes têm
influência sobre nós, mas nós somos responsáveis por nós mesmos.
Começa a aprender que não se deve comparar com os outros, mas com o
melhor que pode ser. Descobre que se leva muito tempo para se tornar
a pessoa que quer ser, e que o tempo é curto
Aprende que, ou você controla seus atos, ou eles o controlarão...
Aprende que heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer,
enfrentando as conseqüências
Aprende que paciência requer muita prática
Aprende que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiência
que se teve e o que você aprendeu com elas do que com quantos
aniversários você celebrou. Aprende que há mais dos seus pais em você
do que você supunha e que nunca se deve dizer a uma criança que
sonhos são bobagens...
Aprende que nem sempre é suficiente ser perdoado por alguém...
Algumas vezes você tem de aprender a perdoar a si mesmo
E você aprende que realmente pode suportar... que realmente é forte, e
que pode ir muito mais longe depois de pensar que não se pode mais. E
que realmente a vida tem valor e que você tem valor diante da vida!
Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o bem que poderíamos
conquistar se não fosse o medo de tentar”.
William Shakespeare
x
AGRADECIMENTO
AGRADECIMENTOAGRADECIMENTO
AGRADECIMENTOS
SS
S
A Deus, por estar comigo todos os dias me protegendo e
fortalecendo, mas especialmente naqueles em que os momentos mais
difíceis e complicados somados à saudade dos meus queridos me davam
vontade de jogar tudo para o alto e desistir. Mas a fé, a esperança, o
otimismo, a luz do Espírito Santo me iluminaram para que conseguisse
dar mais este passo. “Guarda-me Deus, pois eu me abrigo em ti” (Salmo
16)
Ao meu querido filho Gabriel, por compreender e perdoar os
momentos de ausência, pelo seu carinho, amor e torcida para que este
trabalho fosse concluído.
Aos meus queridos pais, por serem exemplos de pessoas
batalhadoras e principalmente pelo amor.
À Camila, pelos incentivos para que eu tivesse coragem de
começar este trabalho.
À Profª. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado, pela orientação,
compreensão, confiança e acima de tudo, pela amizade.
Ao Profº. Dr. Marcos Antonio Corrêa, pela co-orientação,
colaboração e sugestões para melhoria deste trabalho.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, pelos ensinamentos compartilhados.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
xi
Ao Departamento de Fármacos e Medicamentos da FCF
(UNESP).
À Profª. Dra. Taís Maria Bauab, pela colaboração nos ensaios de
atividade antimicrobiana realizados neste trabalho.
À Profa. Dra. Vera Lúcia Isaac Borges e à Profa. Dra. Maria José
Vieira Fonseca por participarem da banca de qualificação e pelas
observações pertinentes.
À Profª Dra. Maria José Vieira Fonseca e à Profª Dra Maria
Stella Gonçalves Raddi por participarem da banca de defesa desta
dissertação e pelas sugestões e críticas para melhoria deste trabalho.
Ao Renato e Francisco, da SAEPE, pelo apoio técnico com as
fotografias utilizadas neste trabalho.
Aos funcionários da biblioteca, Max, Ana Cristina, Rita, Moacir,
Natalina, Irani e também aos demais, por sempre terem me ajudado
prontamente nos momentos de dúvida.
Às funcionárias da Pós-graduação, Cláudia, Laura e Sônia, pelos
esclarecimentos necessários.
Aos amigos e colegas deste Curso de Pós-Graduação.
Aos amigos do Laboratório de Controle Biológico de Qualidade de
Fármacos e Medicamentos, Andréia Moreno, Cristina Laignier, Débora
Perez, Sandra Monteiro, Patrícia Ricarte, Daniela Vieira, Cristiani
Lopes, Jaqueline Perez, Marcelo Hiene, Mariana Passoni, Adam de
Oliveira, pelas conversas, dicas, criticas, auxílios e momentos de
descontração para que esta caminhada fosse menos difícil.
À Maria de Fátima Rodrigues, pelo apoio técnico e acima disso
pela amizade, companheirismo, conselhos e momentos de diversão. Você
é muito especial !
À minha querida estagiária Jaqueline, que muito me auxiliou na
realização do teste desafio e nos ensaios de atividade antimicrobiana, e
xii
além disso sempre foi muito companheira, dedicada e querida. Muito
obrigada, Jaque!
À minha querida amiga Cristina Laignier pela amizade
conquistada em um dos momentos mais difíceis deste Curso de Pós-
Graduação, por muitas vezes reservar um pouquinho do seu tempo
para me auxiliar contribuindo com idéias e sugestões e principalmente
ter ajudado os dias serem menos cansativos com suas brincadeiras. Cris,
obrigada por sua amizade, você é muito querida!
Aos meus tios Zilda e Gilberto, pelas orações, apoio e por sempre
terem estado junto de mim.
A todos os outros tios, tias e primos que me fortaleceram com suas
orações e apoio.
Ao meu querido amigo Wendel Cleber Soares, que, mesmo sem
saber, sempre foi exemplo de dedicação, determinação, organização,
competência e acima de tudo, humildade.
À querida “tia” Clarice, pelas orações e amizade desde os meus
primeiros anos.
Ao meu querido amigo Marcelo Tozette, pelas descontrações para
me encorajar, apoio e torcida para que tudo desse certo.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
“ Palavras afáveis aumentam os amigos, e fala amável encontra acolhida.
Tenha muitos conhecidos, mas um só confidente entre mil ...
... Amigo fiel não tem preço e o seu valor é incalculável. Amigo fiel é remédio
que cura, e os que temem ao Senhor o encontrarão. Quem teme ao Senhor tem
amigos verdadeiros, pois tal e qual ele é, assim será o seu amigo”
Eclesiático. 6-5.
xiii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS...................................................................................................... ix
SUMÁRIO....................................................................................................................... xii
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................... xvii
LISTA DE TABELAS....................................................................................................... xx
LISTA DE MATERIAIS E EQUIPAMENTOS.................................................................. xxiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.................................................................... xxvii
RESUMO........................................................................................................................ xxix
ABSTRACT..................................................................................................................... xxxi
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS.............................................................................................................. 5
2.1. Objetivos gerais....................................................................................................... 6
2.2. Objetivos específicos............................................................................................... 6
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................
7
3.1. Microbiota ou flora normal da pele...........................................................................
8
3.2. Lavagem e desinfecção das mãos...........................................................................
9
3.3. Sabonetes................................................................................................................ 10
3.4. Anti-sépticos............................................................................................................ 13
3.5. Clorexidina............................................................................................................... 14
4. CONTROLE DE QUALIDADE DA SOLUÇÃO DE DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA................................................................................................................
34
4.1. Descrição ................................................................................................................ 35
4.1.2. Substância química de referência.........................................................................
35
4.1.3. Forma farmacêutica.............................................................................................. 35
4.2. Análise qualitativa da solução de digluconato de clorexidina.................................. 36
4.2.1. Caracteres físicos................................................................................................. 36
4.2.2. Cromatografia em camada delgada..................................................................... 36
4.2.2.1. Material ............................................................................................................. 36
4.2.2.2. Método............................................................................................................... 36
4.2.2.3. Resultados......................................................................................................... 37
4.2.3. Determinação de pH............................................................................................. 38
4.2.3.1. Material ............................................................................................................. 38
4.2.3.2. Resultados......................................................................................................... 38
4.2.4. Determinação da faixa de fusão.......................................................................... 38
xiv
4.2.4.1. Material.............................................................................................................. 38
4.2.4.2. Método............................................................................................................... 38
4.2.4.3. Resultados......................................................................................................... 39
4.2.5. Densidade relativa................................................................................................ 39
4.2.5.1. Material.............................................................................................................. 39
4.2.5.2. Método............................................................................................................... 39
4.2.5.3. Resultados......................................................................................................... 39
4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho............................... 40
4.2.6.1. Material.............................................................................................................. 40
4.2.6.2. Método............................................................................................................... 40
4.2.6.3. Resultados......................................................................................................... 40
4.2.7. Espectrofotometria na região ultravioleta..............................................................
42
4.2.7.1. Material.............................................................................................................. 42
4.2.7.2. Método............................................................................................................... 43
4.2.7.2.1. Preparo do padrão.......................................................................................... 43
4.2.7.3. Resultados......................................................................................................... 43
4.2.7.4. Discussão...........................................................................................................
45
4.3. Análise quantitativa da solução de digluconato de clorexidina ............................... 46
4.3.1. Ensaio microbiológico........................................................................................... 46
4.3.1.1. Material e método.............................................................................................. 46
4.3.1.2. Execução do ensaio...........................................................................................
47
4.3.1.3. Preparo das soluções-padrão de digluconato de clorexidina............................ 48
4.3.1.4. Preparo das soluções de digluconato de clorexidina substância-amostra........ 48
4.3.1.5. Material.............................................................................................................. 48
4.3.1.6. Preparo do inóculo............................................................................................. 48
4.3.1.7. Ensaio ............................................................................................................... 48
4.3.1.8. Resultados......................................................................................................... 49
4.3.1.9. Cálculos............................................................................................................. 50
4.3.1.9.1. Curva analítica................................................................................................ 50
4.3.1.9.2. Cálculo da potência do anti-séptico................................................................ 51
4.3.1.10. Análise estatística............................................................................................ 52
4.3.1.11. Teste de recuperação...................................................................................... 53
4.3.1.11.1. Preparo das soluções................................................................................... 53
4.3.1.11.2. Cálculo do teste de recuperação.................................................................. 55
4.3.1.12. Discussão........................................................................................................ 55
5. DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAÇÕES DOS SABONETES LÍQUIDOS
CONTENDO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA E SEU CONTROLE DE
xv
QUALIDADE.................................................................................................................. 58
5.1. Desenvolvimento das formulações de sabonete líquido com diferentes
concentrações de digluconato de clorexidina.................................................................
59
5.1.2. Material................................................................................................................. 59
5.1.3. Método.................................................................................................................. 60
5.2. Análise qualitativa das formulações desenvolvidas................................................. 61
5.2.1. Aspectos físicos.................................................................................................... 61
5.2.1.1. Discussão.......................................................................................................... 62
5.2.1.1.1. Formulações................................................................................................... 62
5.2.1.1.2. Formulação 1.................................................................................................. 62
5.2.1.1.3. Formulação 2.................................................................................................. 63
5.2.1.1.4. Formulação 3.................................................................................................. 63
5.2.1.1.5. Formulação 4.................................................................................................. 63
5.2.2. Determinação de pH............................................................................................. 64
5.2.2.1. Material e método.............................................................................................. 64
5.2.2.2. Resultados......................................................................................................... 64
5.2.3. Determinação da viscosidade............................................................................... 64
5.2.3.1. Resultados......................................................................................................... 64
5.2.3.2. Discussão.......................................................................................................... 65
5.3. Controle microbiológico das formulações desenvolvidas........................................ 66
5.3.1. Material e método................................................................................................. 66
5.3.1.1. Contagem total de microrganismos viáveis....................................................... 66
5.3.1.2. Pesquisa de Salmonella spp e Escherichia coli.................................................
66
5.3.1.3. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa................... 67
5.3.2. Resultados............................................................................................................ 67
5.3.3. Discussão............................................................................................................. 68
6. ENSAIOS DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS SABONETES LÍQUIDOS
DESENVOLVIDOS CONTENDO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA.........................
69
6.1. Métodos................................................................................................................... 70
6.1.1. Técnica de difusão em ágar..................................................................................
70
6.1.2. Técnica de microdiluição.......................................................................................
70
6.1.3. Microrganismos utilizados.....................................................................................
71
6.2. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar........................................ 71
6.2.1. Material e método................................................................................................. 71
6.2.1.1. Preparo do inóculo............................................................................................. 71
6.2.1.1.1. Padronização da suspensão bacteriana......................................................... 71
6.2.1.1.2. Padronização da suspensão fúngica.............................................................. 71
xvi
6.2.1.1.3. Padronização e adaptação dos ensaios de atividadee antimicro
biana doss
diferentes sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina a 1, 2, 3, e 4% peloo
método de difusão em ágar.............................................................................................
72
6.2.2. Resultados............................................................................................................ 73
6.2.3. Discussão............................................................................................................. 77
6.2.4. Conclusão............................................................................................................. 79
6.3. Determinação da atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes
líquidos desenvolvidos contendo digluconato de clorexidina, através do método da
microdiluição...................................................................................................................
80
6.3.1. Preparo do inoculo................................................................................................ 80
6.3.1.1. Padronização da suspensão bacteriana............................................................ 80
6.3.1.2. Padronização da suspensão fúngica................................................................. 80
6.3.1.3. Padronização e adaptação dos testes de verificação da atividade
antimicrobiana dos sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina, pelo
método da microdiluição.................................................................................................
80
6.3.1.4. Leituras.............................................................................................................. 83
6.3.2. Resultados................................................................................................ 84
6.3.3. Discussão.................................................................................................. 99
6.3.4. Conclusão................................................................................................. 104
7. TESTE DE EFICÁCIA DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA....................................... 107
7.1. Microrganismos utilizados........................................................................................ 108
7.2. Conservação dos microrganismos-teste..................................................................
108
7.3. Reativação dos microrganismos.............................................................................. 108
7.4. Repiques dos microrganismos para utilização nos testes....................................... 108
7.5. Obtenção de suspensões-mãe de microrganismos-teste e contagem do número
de microrganismos viáveis..............................................................................................
109
7.6. Avaliação da neutralização na inibição da atividade antimicrobiana....................... 1110
7.7. Teste de eficácia do sistema conservante propriamente dito.................................. 111
7.8. Resultados............................................................................................................... 113
7.8.1. Avaliação da neutralização na inibição da atividade antimicrobiana.................... 113
7.8.2. Teste de eficácia do sistema conservante propriamente dito.............................. 115
7.9. Discussão................................................................................................................ 122
7.10. Conclusão.............................................................................................................. 126
8. ANÁLISE QUANTITAVA DE SABONETE LÍQUIDO DESENVOLVIDO CONTENDO
3% DE DIGLUCONATO DE CLOREXINA......................................................................
127
8.1. Material.................................................................................................................... 128
xvii
8.1.1. Preparo da substância química padrão secundário..............................................
128
8.1. 2. Método................................................................................................................. 128
8.1.2.1. Obtenção da curva de Ringbom........................................................................ 129
8.1.2.1. Obtenção da curva analítica.............................................................................. 131
8.2. Análise estatística.................................................................................................... 133
8.3. Determinação de digluconato de clorexidina no sabonete líquido.......................... 134
8.3.1. Preparo do padrão................................................................................................ 134
8.3.2. Preparo da amostra.............................................................................................. 134
8.3.3. Resultados............................................................................................................ 135
8.4. Teste de recuperação.............................................................................................. 136
8.4.1. Preparo das soluções........................................................................................... 136
8.4.2. Cálculo do teste de recuperação.......................................................................... 137
8.4.3. Resultados............................................................................................................ 137
8.5. Validação................................................................................................................. 138
8.5.1. Linearidade........................................................................................................... 138
8.5.2. Precisão................................................................................................................ 138
8.5.3. Exatidão................................................................................................................ 139
8.5.4. Especificidade e seletividade................................................................................ 139
8.5.5. Robustez............................................................................................................... 140
8.6. Discussão................................................................................................................ 140
8.7. Conclusão................................................................................................................ 142
9. DISCUSSÃO GERAL..................................................................................................
143
10. CONCLUSÕES......................................................................................................... 149
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................
152
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química do digluconato de clorexidina............................................. 16
Figura 2. Cromatograma em camada delgada de solução de digluconato de
clorexidina.......................................................................................................................
37
Figura 3. Espectro na região de infravermelho obtido com cristais da solução-amostra
de digluconato de clorexidina..........................................................................................
40
Figura 4. Espectro na região de infravermelho obtido com cristais da solução-padrão
secundário de digluconato de clorexidina.......................................................................
41
Figura 5. Sobreposição dos espectros obtidos com cristais da solução-amostra e
solução-padrão secundário de digluconato de clorexidina.............................................
41
Figura 6. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina a
0,002% em água deionizada de 200 a 400 nm...............................................................
44
Figura 7. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina a
0,002% em etanol de 200 a 400 nm...............................................................................
44
Figura 8. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina a
0,002% em ácido clorídrico 0,1 M de 200 a 400 nm.......................................................
44
Figura 9. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina a
0,002% em hidróxido de sódio 0,1 M de 200 a 400 nm..................................................
45
Figura 10. Espectro de absorção na região de ultravioleta da solução de digluconato
de clorexidina, solução amostra a 0,002% em etanol, de 200 a 400 nm.......................
45
Figura 11. Esquema do ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar,
delineamento 3 x 3..........................................................................................................
49
Figura 12. Representação gráfica da curva analítica de solução de digluconato de
clorexidina no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar..........................
51
Figura 13. Resultado do ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar, da
solução de digluconato de clorexidina............................................................................
51
Figura 14. Esquema da disposição dos sabonetes líquidos na placa de Petri para o
ensaio de atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar............................
73
Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a S. aureus
(a) e E. faecalis (b)..........................................................................................................
75
Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a E. coli (c)
e C. albicans (d)..............................................................................................................
75
Figura 17. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a
Salmonella spp (e) e P. aeruginosa (f)...........................................................................
76
Figura 18. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a S.
epidermidis (g)................................................................................................................
76
xix
Figura 19. Esquema da realização do ensaio de atividade antimicrobiana pelo
método de microdiluição.................................................................................................
82
Figura 20. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando P. aeruginosa..................................
93
Figura 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando P. aeruginosa...................................
93
Figura 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando S. aureus.........................................
94
Figura 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando S. aureus.........................................
94
Figura 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando Salmonella spp................................
95
Figura 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando Salmonella spp................................
95
Figura 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando S. epidermidis..................................
96
Figura 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando S. epidermidis..................................
96
Figura 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando E. faecalis........................................
97
Figura 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando E. faecalis........................................
97
Figura 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando E. coli...............................................
98
Figura 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando E. coli...............................................
98
Figura 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando C. albicans.......................................
99
Figura 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido dos sabonetes da
formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando C. albicans.......................................
99
Figura 34. Esquema da realização do teste de neutralizante ........................................ 111
Figura 35. Esquema da execução das análises microbiológicas do sabonete líquido
contendo digluconato de clorexidina durante o teste desafio.........................................
113
Figura 36. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de P.
aeruginosa sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana,
no sabonete líquido isento e com digluconato de clorexidina.........................................
116
Figura 37. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de E.
xx
coli sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no
sabonete líquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................
117
Figura 38. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de S.
aureus sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no
sabonete líquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................
119
Figura 39. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de C.
albicans sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no
sabonete líquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................
120
Figura 40. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de A.
niger sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no
sabonete líquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................
121
Figura 41. Espectro de absorção na região de ultravioleta da solução de digluconato
de clorexidina padrão secundário em etanol, a 0,002%, de 200 a 400 nm....................
129
Figura 42. Curva de Ringbom obtida pelo método espectrofotométrico na região de
ultravioleta para solução de digluconato de clorexidina, utilizando etanol como
solvente, no comprimento de onda de 260 nm...............................................................
131
Figura 43. Representação da curva analítica da solução de digluconato de
clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente......................................................................................
133
Figura 44. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina
padrão secundário, solução de sabonete com clorexidina e solução de sabonete sem
clorexidina, utilizando etanol como solvente...................................................................
140
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina e seus
sais..................................................................................................................................
2
Tabela 2. Métodos descritos na literatura para análise de impurezas e produtos de
degradação da clorexidina..............................................................................................
24
Tabela 3. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em fluidos
biológicos........................................................................................................................
26
Tabela 4. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em preparações
farmacêuticas..................................................................................................................
29
Tabela 5. Absorção de digluconato de clorexidina substância-teste e substância
padrão secundário em espectro de infravermelho em pastilhas de
KBr..................................................................................................................................
42
Tabela 6. Parâmetros testados para avaliação de solução de digluconato de
clorexidina no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar .........................
47
Tabela 7. Parâmetros definidos para o ensaio microbiológico pelo método de difusão
em ágar, a serem utilizados para análise quantitativa de solução de digluconato de
clorexidina
.............................................................................................................
47
Tabela 8. Valores dos diâmetros dos halos de inibição de crescimento obtidos com a
solução de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiológico pelo método difusão
em ágar..... .....................................................................................................................
50
Tabela 9. Valores experimentais obtidos para o doseamento de solução de
digluconato de clorexidina no ensaio microbiológico pelo método de difusão em
ágar........................ ........................................................................................................
52
Tabela 10. Análise da variância dos dados obtidos no ensaio microbiológico pelo
método de difusão em ágar, da solução de digluconato de clorexidina........ ................
53
Tabela 11. Preparação das amostras de solução de digluconato de clorexidina no
teste de recuperação no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar.........
54
Tabela 12. Teste de recuperação de amostras de digluconato de clorexidina, no
ensaio microbiológico pelo método difusão em ágar............................................ .........
55
Tabela 13. Materiais utilizados para as diferentes formulações de sabonete líquido e
seus nomes na INCI.......................................................................................................
59
Tabela 14. Preparo da formulação codificada como Formulação 1.............................. 59
Tabela 15. Preparo da formulação codificada como Formulação 2.............................. 60
Tabela 16. Preparo da formulação codificada como Formulação 3.............................. 60
Tabela 17. Preparo da formulação codificada como Formulação 4.............................. 60
Tabela 18. Valores de viscosidade obtidos com os sabonetes líquidos contendo
digluconato de clorexidina em viscosímetro de Brookfield.............................................
65
xxii
Tabela 19. Valores em milímetros dos halos de inibição, obtidos no ensaio de
atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar.............................................
74
Tabela 20. Diluições utilizadas para os sabonetes líquidos no ensaio de atividade
antimicrobiana em meio líquido pelo método da microdiluição......................................
83
Tabela 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 1 contendo 1% de digluconato de clorexidina,........................................
84
Tabela 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................
85
Tabela 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 3 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................
85
Tabela 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 4 contendo 1% de digluconato de clorexidina.........................................
86
Tabela 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 1 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................
86
Tabela 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 2 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................
87
Tabela 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 3 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................
87
Tabela 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 4 contendo 2% de digluconato de clorexidina.........................................
88
Tabela 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 1 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................
88
Tabela 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 2 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................
89
Tabela 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................
89
Tabela 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 4 contendo 3% de digluconato de clorexidina.........................................
90
Tabela 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 1 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................
90
Tabela 34. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 2 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................
91
Tabela 35. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 3 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................
91
Tabela 36. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido
da formulação 4 contendo 4 % de digluconato de clorexidina........................................
92
Tabela 37. Valores de CIM encontrados para os sabonetes líquidos desenvolvidos
xxiii
com as diferentes concentrações de digluconato de clorexidina....................................
100
Tabela 38. Contagem do número de microrganismos viáveis de P. aeruginosa após
neutralização do sistema conservante............................................................................
114
Tabela 39. Contagem do número de microrganismos viáveis de E. coli após
neutralização do sistema conservante............................................................................
114
Tabela 40. Contagem do número de microrganismos viáveis de S. aureus após
neutralização do sistema conservante............................................................................
114
Tabela 41. Contagem do número de microrganismos viáveis de C. albicans após
neutralização do sistema conservante............................................................................
115
Tabela 42. Contagem do número de microrganismos viáveis de A. niger após
neutralização do sistema conservante............................................................................
115
Tabela 43. Log de UFC/g de P. aeruginosa, nas formulações com e sem a presença
da clorexidina, em função do tempo...............................................................................
115
Tabela 44. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações com e sem a presença de digluconato de clorexidina, utilizando P.
aeruginosa......................................................................................................................
116
Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulações com e sem clorexidina, em
função do tempo.............................................................................................................
117
Tabela 46. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações com e sem a presença de digluconato de clorexidina, utilizando E.
coli...................................................................................................................................
118
Tabela 47. Log de UFC/g de S. aureus, nas formulações com e sem clorexidina, em
função do tempo.............................................................................................................
118
Tabela 48. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações com e sem a presença de digluconato de clorexidina, utilizando S.
aureus.............................................................................................................................
119
Tabela 49. Log de UFC/g de C. albicans, nas formulações com e sem clorexidina, em
função do tempo............................................................................................................
1179
Tabela 50. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações com e sem a presença de digluconato de clorexidina, utilizando C.
albicans...........................................................................................................................
120
Tabela 51. Log de UFC/g de A. niger, nas formulações com e sem clorexidina, em
função do tempo.............................................................................................................
120
Tabela 52. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações com e sem a presença de digluconato de clorexidina, utilizando A.
niger................................................................................................................................
121
Tabela 53. Preparo da curva de Ringbom de digluconato de clorexidina por
xxiv
espectrofotometria na região de ultravioleta a 260 nm................................................... 130
Tabela 54. Preparo da curva analítica de digluconato de clorexidina por
espectrofotometria na região de ultravioleta a 260 nm...................................................
131
Tabela 55. Valores de absorvâncias determinados para a curva analítica de
digluconato de clorexidina padrão secundário por espectrofotometria na região de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente...................................................
132
Tabela 56. Análise da variância (ANOVA) das absorvâncias determinadas na
obtenção da curva analítica de digluconato de clorexidina pelo método
espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como
solvente...........................................................................................................................
133
Tabela 57. Parâmetros analíticos utilizados na determinação de digluconato de
clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente......................................................................................
134
Tabela 58. Valores determinados para o doseamento de sabonete líquido com
digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente.....................................................................
136
Tabela 59. Preparo das soluções para o teste de recuperação do sabonete líquido
com digluconato de clorexidina pelo espectrofotométrico na região de ultravioleta a
260 nm, utilizando etanol como solvente........................................................................
137
Tabela 60. Valores obtidos no teste de recuperação do método espectrofotométrico
na região de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete
líquido com digluconato de clorexidina...........................................................................
138
Tabela 61. Valores obtidos para a reprodutibilidade do método espectrofotométrico
na região de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete
líquido com digluconato de clorexidina...........................................................................
139
Tabela 62. Valores obtidos para a robustez do método espectrofotométrico na região
de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente para sabonete líquido com
digluconato de clorexidina..............................................................................................
140
xxv
LISTA DE MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
1. Cromatografia em camada delgada da solução de digluconato de clorexidina
Placa cromatográfica Merck (Darmstadt), TLC com sílica-gel 60 F
254
(20 x 20
cm), com espessura de 0,25 mm.
Estufa Fanem 315 SE.
Cuba de vidro.
Fase móvel: acetato de etila: amônia concentrada: água destilada: etanol
(1:1:3:5 v/v/v/v). Os reagentes utilizados foram: acetato de etila, Synth (Diadema), amônia
Synth (Diadema), etanol, Synth (Diadema).
Fase estacionária: gel de sílica F
254
(Merck, Darmstadt).
Agente revelador: solução de dicromato de potássio 50 g/L em solução de
ácido sulfúrico 40%. Os reagentes utilizados foram: dicromato de potássio (Comercial), ácido
sulfúrico (Chemis).
2. Determinação de pH da solução de digluconato de clorexidina
Peagômetro Micronal, B 474.
3. Determinação do ponto de fusão dos cristais obtidos com da solução de digluconato
de clorexidina
Papel de filtro, tubos capilares com 1 mm de espessura e 6 cm de
comprimento.
Estufa Fanem 315 SE.
Hidróxido de sódio (Synth, Diadema), amarelo titânio (Merck, Darmstadt).
Equipamento: LS Logen Scientific, LS III Basic.
4. Determinação da densidade relativa da solução de digluconato de clorexidina
Picnômetro (Hexis).
Estufa Fabbe, 116.
5. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho dos cristais obtidos com
da solução de digluconato de clorexidina
Equipamento: espectrofotômetro de infravermelho Shimadzu FTIR-8300.
Brometo de potássio (KBr) (Reagen, Rio de Janeiro).
6. Espectrofotometria na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina
Equipamento: espectrofotômetro de ultravioleta KAYAK
XA modelo HP 8453.
xxvi
Cubeta de quartzo com 1 cm de caminho óptico.
Solventes: etanol (Synth, Diadema), ácido clorídrico 0,1 M (Synth, Diadema),
hidróxido de sódio 0,1 M (Synth, Diadema).
7. Doseamento microbiológico da solução de digluconato de clorexidina
Meio de cultura: ágar Casoy (Acumedia, Lansing); ágar Brain Heart Infusion
(BHI) (Acumedia, Lansing), caldo Brain Heart Infusion (BHI) (BD, Le Pont de Claix).
Equipamentos: espectrofotômetro Quimis Q798 DRM, estufa de esterilização
Nova Ética 400/5ND, paquímetro digital Mitotoyo IP 65, estufa bacteriológica Odonto Bras
ECB 1.2 digital, autoclave vertical Phoenix AV 60.
8. Determinação de pH dos sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina
Peagômetro Micronal, B 474.
9. Determinação da viscosidade dos sabonetes líquidos
Equipamento: viscosímetro de Brookfield, P selecta modelo visco star-L.
10. Análise microbiológica das formulações desenvolvidas
Equipamentos: estufa de esterilização a 180 ºC Nova Ética 400/5ND, autoclave
vertical Phoenix AV 60, estufa bacteriológica Odonto Brás ECB 1.2 digital, estufa Fanem 315
SE.
Meios de cultura: ágar tioglicolato (Himedia), ágar Sabouraud (Acumedia,
Lansing), caldo lactosado (Acumedia, Lansing), caldo tetrationato (Acumedia, Lansing), caldo
selenito cisitina (Merck, Darmstadt), ágar verde brilhante (Difco, Le Pont de Claix), ágar
xilose-lisina-desoxicolato (Merck, Darmstadt), ágar bismuto sulfito (Acumedia, Lansing), ágar
Mac Conkey (Merck, Darmstadt), ágar eosina-azul de metileno (Difco, Lê Pont de Claix),
caldo soja-caseína (Acumedia, Lansing), ágar Vogel Johnson (Acumedia, Lansing), ágar
cetrimida (Acumedia, Lansing), ágar tríplice açúcar e ferro (Acumedia, Lansing).
11. Ensaios de atividade antimicrobiana
Equipamentos: estufa bacteriológica Odonto Bras ECB 1.2 digital,
espectrofotômetro Beckman DU 530, autoclave vertical Phoenix AV 75, paquímetro digital
Mitutoyo IP 65, estufa de esterilização Nova Ética 400/5ND, estufa Fanem 315 SE.
Meios de cultura: ágar Brain Heart Infusion (BHI) (Acumedia, Lansing), caldo
Brain Heart Infusion (BHI) (BD, Lê Pont de Claix), ágar Sabouraud (Acumedia, Lansing), caldo
Sabouraud (Merck, Darmstadt).
xxvii
12. Teste de eficácia de atividade antimicrobiana
• Equipamentos: estufa bacteriológica Odonto Bras ECB 1.2 digital, autoclave
vertical Phoenix AV 75, estufa Fanem 315 SE, estufa de esterilização Nova Ética 400/5ND.
• Meios de cultura: ágar Sabouraud (Acumedia, Lansing), ágar Casoy
(Acumedia, Lansing).
13. Espectrofotometria na região de ultravioleta para o sabonete líquido com 3% de
digluconato de clorexidina
• Solvente: etanol (Synth, Diadema).
• Equipamentos: espectrofotômetro de ultravioleta Shimadzu, UV mini-1240
(para realização do teste) e espectrofotômetro de ultravioleta Hitachi U2001 (para
parâmetro de reprodutibilidade).
xxviii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A. niger Aspergillus niger
ABS absorvância
ANOVA análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC Association of Official Analytical Chemists
APIC Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology
ATCC American Type Culture Collection
B. subtilis Bacillus subitilis
BHI ágar brain infusion
BP British Pharmacopoeia
BS ágar bismuto sulfito
C. albicans Candida albicans
CAS Chemical Abstracts Service
CBM concentração bactericida mínima
CCD cromatografia em camada delgada
CDC Centros de Controle e Prevenção de Doenças
CFM concentração fungicida mínima
CIM concentração inibitória mínima
cP Centi Poise
DCB Denominação Comum Brasileira
DCI Denominação Comum Internacional
DMSO dimetilsulfóxido
DPR desvio padrão relativo
E. coli Escherichia coli
E. faecalis Enterococcus faecalis
e.p.m erro padrão da média
EP European Pharmacopoeia
F. Bras Farmacopéia Brasileira
HIPAC Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee
IAL Instituto Adolfo Lutz
KBr brometo de potássio
L.E.S.S lauriléter sulfato de sódio
L.M.S.S lauroilmiristilsarcosinato de sódio
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
P. acnes Propioniobacterium acnes
xxix
P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
PF ponto de fusão
p/v peso/volume
Rf fator de refração
S. aureus Staphylococcus aureus
T% transmitância
TSI ágar tríplice açúcar-ferro
UFC unidade formadora de colônia
UI Unidades Internacionais
USP United States Pharmacopoeia
UV ultravioleta
v/v volume/volume
VB ágar verde brilhante
VJ ágar Vogel Johnson
XLD ágar xilose lisina desoxicolato
λ comprimento de onda
xxx
RESUMO
Os sabonetes são preparações destinadas à higiene e conhecidos há mais de
4000 anos. São constituídos por sais de ácidos graxos com propriedades
detergentes, resultantes da saponificação entre ácidos graxos superiores e seus
glicerídeos à custa de um material alcalino. Podem ser incorporados com diversas
substâncias que possuem algum efeito terapêutico ou preventivo sobre a pele, por
facilitarem o contato de tais substâncias com o tecido alvo. Porém, isto nem sempre é
possível. Por tratar-se de um tensoativo aniônico carboxilado e ter elevada
alcalinidade, muitos dos materiais ou ativos a serem incorporados a este tipo de
preparação podem apresentar instabilidade. Com o advento dos detergentes
sintéticos tal situação pode ser contornada, e apesar de constituírem-se também em
tensoativos aniônicos, e por terem origem em ácidos fortes, permitem o preparo de
sabonetes líquidos não alcalinos e apresentam maior compatibilidade frente a
diversos ativos. Entre as diversas possibilidades de ativos, os agentes
antimicrobianos, merecem atenção especial, uma vez que encontra nos sabonetes
um excelente veículo para desempenhar sua função na assepsia da pele. A
clorexidina é um anti-séptico de amplo espectro de ação, sendo ativo frente a
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, leveduras e vírus. Atua sobre a
membrana celular causando perda de material intracelular, tais como ácido nucléico e
potássio, inibição respiratória e coagulação citoplasmática. Pode apresentar-se na
forma de diversos sais como acetato, cloridrato, gluconato e digluconato. Neste
trabalho foram estudadas formulações contendo solução de digluconato de
clorexidina. A solução amostra utilizada para preparação dos sabonetes foi avaliada
quanto a alguns parâmetros como pH, densidade relativa, ponto de fusão,
cromatografia em camada delgada, espectroscopia no infravermelho e
espectroscopia no ultravioleta. Foi desenvolvida metodologia analítica para a
determinação de digluconato de clorexidina por ensaio microbiológico, pelo método
da difusão em ágar, templates em placas, utilizando S. aureus. O método
microbiológico foi validado pelos parâmetros de linearidade, exatidão, precisão e
reprodutibilidade. Os resultados foram analisados estatisticamente pela análise da
variância (ANOVA). As formulações desenvolvidas foram avaliadas quanto a
parâmetros de pH, viscosidade, ensaio de atividade antimicrobiana, demonstrando
que as formulações empregando detergentes sintéticos possuem melhor atividade
antibacteriana. Porém, a técnica de difusão em ágar não foi satisfatória para
xxxi
avaliação de atividade antimicrobiana, visto que as formulações eram
demasiadamente viscosas. Os resultados corroboram com a literatura, pois os
microrganismos Gram-positivos mostraram-se mais susceptíveis. Foi realizada
metodologia de ensaio de teste desafio para a formulação com melhor desempenho
antimicrobiano e econômico. Não foi observado melhora significativa da formulação
contendo digluconato de clorexidina em relação à formulação isenta de clorexidina.
Foi desenvolvida metodologia analítica em espectrofotometria na região de
ultravioleta a 260 nm, na faixa de concentração de 0,001% a 0,002% para a
formulação que apresentou melhores resultados microbiológicos e econômicos. A
metodologia foi validada pelos parâmetros de linearidade, precisão, exatidão,
especificidade e robustez. Os resultados foram analisados estatisticamente pela
análise de variância (ANOVA).
Palavras-chave: controle de qualidade, clorexidina, sabonete líquido, análise
microbiológica, ensaio de atividade antimicrobiana, teste desafio, espectrofotometria
de ultravioleta.
xxxii
ABSTRACT
The soaps are preparation for hygiene and they are well known for 4000 years
ago. They are constituited by salts of fatty acids with detergent properties, resulting
from saponification of fatty acids superiorities and glycerides using an alkaline
material. They may be incorporated with several substances that have a preventive or
therapeutic effect on the skin, by facilitating the contact of such substances with the
target tissue. However, this is not always possible. The soaps are anionic surfactant
and carboxylic and they have high alkalinity, many of the materials or activities to be
incorporated into this type of preparation may be instable. With the advent of synthetic
detergents such situation can be avoided, and despite of they be also anionic
surfactants, and are based on strong acids, allow the preparation of liquid soaps and
alkali not have greater compatibility front of several assets. Among the various
possibilities of active, antimicrobial agents deserve special attention, since the soap is
an excellent vehicle to perform its function in the asepsis of the skin. The
chlorhexidine is an antiseptic of wide spectrum of action, being active against the
bacteria Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Chlorhexidine is
an excellent antiseptic of wide spectrum of action, being active against the bacteria
Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Acts on the cell
membrane causing loss of intracellular material, such as nucleic acid and potassium,
respiration inhibition and cytoplasmic coagulation. The salts of chlorhexidine can be
acetate, hydrochloride, gluconate and digluconate. In this work formulation were
studied with solution of chlorhexidine digluconate. The sample solution employed to
prepare the liquid soaps was evaluated for some parameters such as pH, relative
density, melting point, thin-layer chromatography, spectroscopy in the infrared and
ultraviolet spectroscopy. Analytical methodology was developed for the determination
of chlorhexidine digluconate solution for microbiological assay, through agar diffusion
bioassay, using S. aureus. The microbiological method was validated by the
parameters of linearity, accuracy, precision and reproducibility. The results were
statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA). The developed formulations
were analyzed for parameters of pH, viscosity, assay of antimicrobial activity,
indicating that the formulations using synthetic detergents have better antibacterial
activity. However, the technique of diffusion in agar was not satisfactory to analyze
antimicrobial activity, since the formulations presented higher viscosity. . The results
corroborate the literature, since the Gram-positive microorganisms were more likely. It
xxxiii
was performed the test methodology for testing challenge for the formulations with
antimicrobial and better economic performance. There was no significant improvement
of the formulations containing chlorhexidine digluconate on the free formulations of
Chlorhexidine. Analytical methodology was developed by spectrophotometry in the
ultraviolet region of 260 nm in the range of concentration of 0.001% to 0.002% for the
formulation which had better microbiological and economic. The method was validated
by the parameters of linearity, precision, accuracy, specificity and robustness. The
results were statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA).
Key-words: quality control, liquid soap, chlorhexidine digluconate, microbiological
assay, antimicrobial activity, challenge test, UV-spectrophotometry.
1. INTRODUÇÃO
Introdução
Flávia Angélica Másquio Firoentino
2
Os sabonetes são preparações apropriadas para a limpeza da pele,
fornecendo ação detergente à água, na qual se dissolvem durante o uso. São
conhecidos há mais de 4000 anos, sendo o produto de higiene mais antigo utilizado
pelo homem. Há documentos da Ásia Menor mostrando seu uso pelos babilônios,
hebreus e romanos, que o produziam misturando substâncias graxas com cinzas
ricas em carbonato de potássio ou hidrocarbonetos ácidos de sódio (BONADEO,
1963; DRAELOS, 1999).
Os sabonetes são constituídos por sais de ácidos graxos com propriedades
detergentes, resultantes da saponificação entre um produto alcalino com ácidos
graxos superiores e seus glicerídeos. De acordo com o produto alcalino empregado,
podem se obter sabonetes sólidos ou líquidos (DRAELOS, 1999; PEYREFITTE et al.,
1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999).
Os sabonetes são produtos alcalinos, mas não danificam a pele, porque esta é
capaz de retornar ao pH normal, devido ao mecanismo de tamponamento que possui.
(PEYREFITTE et al., 1998). Para melhorar o pH dos sabonetes, detergentes
sintéticos como laurilsulfato de sódio, lauriléter sulfato de sódio, cocoamidopropil
betaína, laurilisoetionato de sódio, laurilsulfosuccinato dissódico, entre outros, estão
sendo utilizados na preparação destes produtos (DRAELOS, 1999),
Além dos glicerídeos a serem saponificados, os sabonetes podem conter
outros aditivos, entre eles, os agentes anti-sépticos (PEYREFITTE et al., 1998).
Anti-sépticos referem-se às substâncias químicas utilizadas como bactericidas
ou bacteriostáticas em tecidos vivos, sendo designadas de desinfetantes quando
usadas em objetos inanimados (Brasil, 1999)
Os anti-sépticos compreendem grande variedade de estruturas químicas e,
consequentemente têm diversos mecanismos de ação, como coagulação ou
desnaturação de proteínas protoplasmáticas, lise celular por alteração estrutural da
membrana celular, diminuição da tensão de superfície, inibição de enzimas
essenciais aos microrganismos e sua eficácia é dependente de concentração
utilizada, pH, temperatura, tempo de exposição e presença de material orgânico como
pus, sangue e tecido necrótico (KOROLKOVAS, 2001; GENARO, 2005). Quando
aplicado à pele, reduzem a microbiota residente, uma vez que a ação degermante é
apenas temporária e após alguns minutos ou horas há a multiplicação dos
microrganismos que permaneceram (GENARO, 2005).
Introdução
Flávia Angélica Másquio Firoentino
3
Os ativos anti-sépticos podem ser utilizados sozinhos ou incorporados a
detergentes, sabões, desodorantes, aerossóis, talcos, dentifrícios, antiinfecciosos
urinários entre outras preparações, enquanto que os desinfetantes são utilizados em
saneamento caseiro e hospitalar, para desinfetar água e utensílios, para esterilizar
vacinas, produtos sangüíneos e enxertos teciduais (KOROLKOVAS, 2001). A
clorexidina, um tipo de anti-séptico, é utilizada em tecidos vivos, para lavagem das
mãos e para tratamento de feridas (MAZZOLA et al., 2003), mas este último emprego
é discutido, pois alguns autores, como Korolkovas (2001) e Alcamo (2001), discordam
desta aplicação, porque a clorexidina retarda a cicatrização e pode danificar o tecido.
De acordo com Genaro (2005), os anti-sépticos melhores e mais eficazes são
o iodo e a clorexidina em combinação com etanol. No entanto, a clorexidina é
amplamente empregada em diversas áreas com diferentes finalidades por ter amplo
espectro de atividade e relativamente poucos efeitos adversos e por ser possível
incorporá-la em várias formas farmacêuticas (BRITISH CODEX, 1973, THOMAS et
al., 2001, MARTINDALE, 2007).
No comércio brasileiro, há diversos produtos contendo clorexidina, sendo eles
solução de gluconato de clorexidina, como, por exemplo, Peridex
®
, Periochip
®
,
Chlorohex solução alcoólica
®
(Johnson Diversey), Chlorohex Dermo Suave sabonete
líquido
®
(Johnson Diversey), Noplak
®
(Daudt), Marchlorex
®
, sabonete líquido com
gluconato de clorexidina 2%
®
(Cristália). Solução de digluconato de clorexidina, como
por exemplo: Merthiolate
®
(DM), Prododói
®
(Deshydrater), Asseptic
®
, solução tópica
1% (Neo Química), Perioxidin enxagüatório bucal
®
(Gross), Perioxidin gel bioadesivo
®
(Gross), PerioGard elixir oral
®
com digluconato de clorexidina 0,2% (Colgate),
Hibitane solução tópica
®
4% (AstraZeneca), Riohex
®
2% degermante (Rioquímica),
Riohex
®
4% degermante (Rioquímica), Riohex solução aquosa
®
0,2% (Rioquímica),
Riohex solução aquosa
®
0,5% (Rioquímica), Riohex solução aquosa
®
2,0%
(Rioquímica), Riohex solução alcoólica
®
0,5% (Rioquímica), Vetriderm clorexidina
®
,
(Bayer Pet) e Sabonete gel bactericida clorexidina
®
(Trilha), Savlon
®,
Sommacare,
Sabonete líquido com 2% de clorexidina (LM Farma), Sommacare loção anti-séptica
com 0,5% de clorexidina
®
(LM Farma), Sommacare solução anti séptica com 0,2% de
clorexidina
®
(LM Farma), Sommacare escova
®
(escova e esponja embebida em
sabonete líquido de digluconato de clorexidina 2,0% (LM Farma), Handex
degermante
®
2,0% clorexidina (Saneativo), Handex alcoólico
®
0,5% (Saneativo),
Introdução
Flávia Angélica Másquio Firoentino
4
Cariax
®
(clorexidina com fluoreto de sódio) (Pharmakin) e Megatrat
®
Clorexidina
veterinário (Centagro).
Este trabalho teve a finalidade de desenvolver formulações de sabonete líquido
com diversas concentrações de clorexidina e, avaliar sua atividade antimicrobiana,
bem como desenvolver e validar metodologias analíticas para o controle da qualidade
tanto da solução utilizada para preparo das formulações, quanto das formulações
finais, uma vez que na literatura não foram encontrados trabalhos com tal proposição.
2. OBJETIVOS
Objetivos 6
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
2.1. Objetivos gerais
O objetivo deste trabalho foi desenvolver quatro formulações diferentes
de sabonete líquido com concentrações de 1, 2, 3 e 4% de digluconato de
clorexidina, totalizando 16 formulações, e desenvolver métodos de avaliação
microbiológica e físico-química.
2.2. Objetivos específicos
Os objetivos específicos são:
1. Realizar o controle de qualidade qualitativo da solução de digluconato de
clorexidina utilizada no preparo das formulações.
2. Preparar formulações de sabonete líquido com diferentes concentrações de
digluconato de clorexidina.
3. Realizar o controle microbiológico e físico-químico das formulações
desenvolvidas.
4. Avaliar e comparar a atividade antimicrobiana das formulações
desenvolvidas.
5. Realizar o teste desafio para a formulação que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.
6. Desenvolver e validar metodologia de análise de espectrofotometria na
região de ultravioleta da formulação que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.
3. REVISÃO DA LITERATURA
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
8
3.1. Microbiota ou flora normal da pele
A pele íntegra é um dos maiores órgãos do corpo, em termos de área, e é
responsável por aproximadamente 16% do peso corporal. É o manto de revestimento
do organismo e tem por função isolar componentes orgânicos do meio exterior,
impedir a ação de agentes externos, evitar a perda de água, eletrólitos e outras
substâncias do meio interno, dar proteção imunológica, fazer termo-regulação,
propiciar a percepção e função secretória (BRASIL, 1989; TORTORA et al., 2006).
A estrutura básica da pele inclui, da camada externa para a interna, epiderme,
derme e hipoderme (BRASIL, 2008b). A epiderme, quando íntegra, funciona como
barreira física eficaz contra microrganismos, por estar em contato direto com o
ambiente externo. A derme contém os folículos pilosos, ductos de glândulas
sudoríparas e sebáceas, os quais possibilitam a passagem de microrganismos da
pele para os tecidos mais profundos. A superfície íntegra da epiderme saudável
raramente é penetrada por microrganismos, porém, quando rompida, infecção
subcutânea, muitas vezes, se desenvolve (ALCAMO, 2005; TORTORA et al., 2006).
Devido à sua extensão e localização, constantemente a pele é exposta a
diversos microrganismos do meio ambiente. A fim de prevenir a transmissão de
microrganismos pelas mãos, são essenciais alguns cuidados como: uso de agente
tópico com eficácia antimicrobiana, procedimento adequado ao utilizá-lo e adesão
regular no seu uso (BRASIL, 2008b).
A maioria das bactérias cutâneas reside na superfície do estrato córneo, parte
superior dos folículos pilosos, sulcos da pele e ductos das glândulas sebáceas (flora
transitória). Entretanto, a microbiota residente se encontra mais profundamente. O
simples ato de lavar as mãos com água e sabão pode diminuir em 90% o número de
microrganismos pertencentes principalmente à microbiota transitória. No entanto, em
média 8 horas após este procedimento, a população bacteriana é reconstituída pela
flora residente (TRABULSI, ALTERTHUM, 2005; BUCALEM, WEI, 2008).
A microbiota cutânea residente, estende-se por toda a pele, concentrando-se
nas áreas mais úmidas e quentes como axilas e períneo, chegando em torno de 10
6
UFC/cm
2
e nas demais regiões, em torno de 10
4
UFC/cm
2
. Os microrganismos da
flora residente não são totalmente removidos através do processo de lavagem das
mãos, no entanto alguns autores relatam que os anti-sépticos conseguem inativá-los.
Fazem parte da flora residente os gêneros Staphylococcus, Corynebacterium e
Propioniobacterium, sendo os microrganismos mais comuns o S. epidermidis, o S.
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
9
aureus e o P. acnes. A flora residente possui baixa virulência e raramente causa
infecção, contudo pode ocasionar infecções sistêmicas em pacientes
imunodeprimidos e após procedimentos invasivos, sendo responsável por infecções
cirúrgicas (BRASIL, 1989; ALCAMO, 2001; TRABULSI, ALTERTHUM, 2005;
BUCALEM, WEI, 2008).
A flora transitória adere fracamente à pele por contato e encontra-se mais
superficialmente, junto à gordura e às sujidades e sobrevive por curto período de
tempo, sendo freqüentemente constituída por S. aureus, Escherichia coli,
Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella (BRASIL, 2007;
BUCALEM, WEI, 2008) e é responsável pelas infecções hospitalares de origem
cruzada (BRASIL, 1989).
3.2. Lavagem e desinfecção das mãos
O hábito de lavar as mãos constitui uma medida primária mais importante,
mais simples e menos dispendiosa que existe para a redução dos riscos de
transmissão de microrganismos. Destaca-se como sendo um dos pilares para
prevenção tanto de infecção hospitalar de origem cruzada, disseminação de doenças
infecciosas quanto para o controle de infecção cruzada em consultórios médicos,
odontológicos, clínicas, hospitais e demais unidades de saúde (BRASIL, 1989;
MARTINS, SOARES, 1993; SILVA et al., 2000; HAAS et al., 2005; BRASIL, 2008b).
Deste modo, a lavagem das mãos consiste no simples ato que deve ser
seguido por todos os profissionais de saúde que mantêm contato direto ou indireto
com os pacientes, fluidos corpóreos, procedimentos invasivos, que atuam na
manipulação de medicamentos, alimentos e material estéril ou contaminado (COHEN
et al., 2003; BRASIL, 2007; BRASIL, 2008b).
Para a lavagem das mãos, preferencialmente, deve-se utilizar sabonete
líquido, pois a probabilidade de contaminação através de seu uso é menor em relação
ao sabonete em barra. No entanto, se o sabonete sólido for empregado, deve ter
tamanho pequeno, para que seja substituído mais frequentemente (BRASIL, 1989;
BRASIL, 2007).
Há estudos demonstrando que, nem todos os profissionais da saúde aderiram
à prática de higienização das mãos de maneira constante em sua rotina de trabalho,
devendo este hábito ser conscientizado e estimulado (COHEN et al., 2003; BRASIL,
2008b).
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
10
Entre 1975 e 1985, foram publicados guias sobre práticas de lavagem das
mãos em hospitais pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), que
recomendavam lavar as mãos com sabonete não associado a anti-séptico antes e
após contato com pacientes e lavá-las com sabonete associado a anti-séptico antes e
após a realização de procedimentos invasivos ou contato com pacientes de alto risco.
Entre 1988 e 1995, guias para lavagem e anti-sepsia de mãos, publicados pela
Associação para Profissionais de Controle de Infecções (APIC, Association for
Professionals in Infection Control and Epidemiology), foram similares às orientações
dos CDC. Em 1995 e 1996, o Comitê Consultivo em Práticas de Controle de
Infecções (HIPAC, Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee) dos
CDC recomendava que um sabonete associado a anti-séptico ou um agente não-
hidratado fosse empregado para higienizar as mãos ao deixar os quartos de
pacientes com patógenos multirresistentes (BRASIL, 2008b).
Em 1989, o Ministério da Saúde, no Brasil, publicou o manual “Lavar as mãos:
Informações para profissionais de saúde”, a fim de orientar quanto às normas e aos
procedimentos de lavagem das mãos, visando a prevenção e o controle de infecções.
Recentemente a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), disponibilizou o
guia “Higienização das mãos em serviços de saúde”, com atualizações sobre o tema
(BRASIL, 2008b).
Em 2002, o CDC substituiu o termo “lavagem das mãos” por “higienização das
mãos”, devido à maior abrangência deste procedimento. O termo engloba a
higienização simples (lavagem simples das mãos usando sabão), a higienização anti-
séptica (lavagem simples das mãos com uso de anti-séptico), a fricção anti-séptica
(para remoção microbiana, após remoção de sujidade, com uso de solução alcoólica
a 70%, por exemplo) e a anti-sepsia cirúrgica das mãos (elimina a microbiota
transitória e diminui a residente, além de efeito residual, empregando degermante e
maior tempo de procedimento) (BRASIL, 2007; BRASIL, 2008a; BRASIL, 2008b).
A anti-sepsia inadequada da pele pode resultar na perda de atividade
antimicrobiana do anti-séptico utilizado propiciando o surgimento de patógeno
resistente (WEBER et al., 2007).
3.3. Sabonetes
Existem vários tipos e apresentações de sabão: em barra, pó, líquido e
escamas. O sabonete é um tipo de sabão em barra destinado à limpeza corporal,
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
11
fornecendo ação detergente à água na qual se dissolve durante o uso. É conhecido
há mais de 4000 anos, sendo o produto de higiene mais antigo utilizado pelo homem.
Há documentos da Ásia Menor mostrando seu uso pelos babilônios, hebreus e
romanos, que o produziam misturando substâncias graxas com cinzas ricas em
carbonato de potássio ou hidrocarbonetos ácidos de sódio (BONADEO, 1963;
DRAELOS, 1999).
Nos séculos VIII e IX, passou a ser produzido na Itália, Espanha, França e
Inglaterra (BONADEO, 1963). Durante a Idade Média, a Igreja Católica proibiu seu
uso, por crer que expor a pele, mesmo durante o banho, era demoníaco. Todavia, a
necessidade de medidas sanitárias e conhecimentos sobre processos infecciosos
induzidos por bactérias valorizaram sua utilização (DRAELOS, 1999).
Quimicamente, os sabonetes são constituídos por sais alcalinos de ácidos
graxos com propriedades detergentes, resultantes da saponificação entre um produto
alcalino com ácidos graxos superiores e seus glicerídeos. De acordo com o produto
alcalino empregado podem-se obter sabonetes duros ou líquidos (DRAELOS, 1999;
PEYREFITTE et al., 1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999).
Os corpos gordurosos ou triglicerídeos podem ser de origem animal ou vegetal.
Além dos triglicerídeos a serem saponificados, os sabonetes podem conter
sobreengordurantes, umectantes, opacificantes, corantes, perfumes, antioxidantes e
anti-sépticos (PEYREFITTE et al., 1998; HERNANDEZ, MARCIER-FRESNEL, 1999;
FONSECA, PRISTA, 1993).
Os sabonetes assim obtidos são tensoativos aniônicos e alcalinos. A
alcalinidade, apesar de indesejável pela pele, não é capaz de danificá-la graças ao
mecanismo de tamponamento existente que faz com que o pH da pele retorne ao
normal, em média, 2 horas após o uso do sabonete (PEYREFITTE et al., 1998).
De acordo com Draelos (1999), tem-se tentado ajustar o pH dos sabonetes
para diminuir a irritação cutânea. Deste modo, os detergentes sintéticos, materiais
que permitem o preparo de sabonetes líquidos ou sólidos não alcalinos, com valores
de pH condizentes aos da pele, vêm sendo acrescentados ao arsenal de materiais
importantes para obtenção de preparações de limpeza. Os principais detergentes
empregados na obtenção de sabonetes com estas características são: laurilsulfato de
sódio, lauriléter sulfato de sódio, cocoamidopropilbetaína, laurilisoetionato de sódio,
lauroilsarcosinato de sódio, entre outros.
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
12
Quando lançados nos anos de 1940, os sabonetes líquidos eram baseados em
sabão de potássio e se destinavam ao uso industrial e institucional e, embora nas
décadas de 1950 e 1960, tenham ocorrido melhoras nos detergentes empregados
nestes produtos, foi apenas nos anos de 1970 que chegaram ao mercado doméstico
(LUNDMARK, 1992).
Inicialmente, os sabonetes eram uma mistura de detergentes sintéticos,
condicionadores e agentes finalizantes sendo utilizados apenas para limpeza. Após
anos de evolução, a tecnologia destes produtos inclui cuidados especiais para a pele
como ação microbiana, realce da suavidade e enfatizam a sua estética (que passou
de sabão transparente para perolado, o chamado soft soap), além de possuírem
agentes engordurantes e melhor característica espumógena. Vale lembrar que o
advento de embalagens mais sofisticadas e do tipo refil ajudou a melhorar a
aceitação destes produtos e mantê-los no mercado com vendas crescentes
(LUNDMARK, 1992).
Segundo Martins e Soares (1993), os sabões comuns têm apenas ação
mecânica de remoção dos microrganismos, por reduzirem a tensão superficial, o que
eleva o poder umectante da água na qual estão dissolvidos. Outro fator importante é
o tempo de contato necessário para que o sabão possa remover as bactérias
contaminantes presentes nas mãos, que é de 7 a 8 minutos ou ainda quando se trata
de microrganismos presentes nas camadas mais profundas da pele, estes só podem
ser removidos após 15 minutos de lavagem com água e sabão.
Os sabonetes medicinais são preparados pela adição de fármacos e ou ativos
aos sabonetes base para ação sobre a superfície cutânea. No entanto, os produtos a
incorporar devem ser compatíveis química e fisicamente e não devem perder eficácia
durante armazenamento e uso. Os sabonetes líquidos podem ser usados com maior
facilidade como sabonetes medicinais e podem ser incorporados com substâncias
antiparasitárias e antimicrobianas usadas na prática médica e veterinária (BONADEO,
1963). O primeiro sabão líquido antibacteriano foi lançado em 1987 e continha
triclosan como agente ativo (LUNDMARK, 1992).
Haas e colaboradores (2005) referem que produtos tópicos para as mãos
contendo antimicrobianos têm sido cada vez mais utilizados pelo público em geral e
sabões com agentes antimicrobianos são mais eficazes que sabonetes regulares. Os
autores referem também que os sabonetes contendo gluconato de clorexidina foram
mais eficazes que outros antimicrobianos como, por exemplo, o triclosan.
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
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3.4. Anti-sépticos
A palavra sepsis vem do grego seps e significa pútrido. Refere-se à
contaminação por microrganismos e é o passo inicial para septicemia. Desta forma,
anti-séptico significa contra infecção (ALCAMO, 2001).
A anti-sepsia é um processo de desinfecção em que se empregam usualmente
substâncias químicas (anti-sépticos).Tais substâncias devem destruir ou inibir os
microrganismos nocivos vegetativos, não formadores de endosporos em tecidos
vivos, pele e mucosas (TRABULSI, ALTERTHUM, 2005; TORTORA et al., 2006).
Anti-sépticos são substâncias geralmente bactericidas, mas ocasionalmente
podem ser bacteriostáticos, com baixa causticidade e hipoalergenicidade, destinados
a aplicações em pele e mucosa, podendo estar incorporados em sabões e
impregnados em cateteres (ALCAMO, 2001; IMBERT et al., 2003; BRASIL, 2008a).
O uso de anti-sépticos iniciou-se em 1847, quando Semmelweis comprovou a
diminuição de casos de febre puerperal empregando solução de hipoclorito na
lavagem das mãos antes de procedimentos clínico-cirúrgicos (SILVA et al., 2000). A
técnica anti-séptica em cirurgias foi introduzida por Joseph Lister, em 1867, que
utilizou o vapor de fenol dirigido para o campo cirúrgico, o que reduziu o número de
infecções pós-operatórias (SILVA et al., 2000; TRABULSI, ALTERTHUM, 2005).
As unidades de saúde utilizam anti-sépticos a fim de reduzir a microbiota
transitória das mãos dos trabalhadores, diminuir a transmissão de microrganismos,
preparar a pele para procedimentos invasivos e anti-sepsia cirúrgica das mãos
(WEBER et al., 2007).
Os anti-sépticos devem atender aos seguintes requisitos: amplo espectro de
ação antimicrobiana; ação rápida; efeito residual cumulativo; baixa ou nenhuma
toxicidade; não possuir absorção sistêmica; não causar hipersensibilidade,
ressecamento, manchas, irritação, corrosão ou fissuras; possuir odor agradável ou
ausente; boa solubilidade; adequada estabilidade química, para impedir sua
decomposição por efeito da luz e calor; baixo custo e veiculação funcional em
dispensadores ou embalagens de pronto uso (BRASIL, 2008a).
Existem surtos de doenças relacionados ao uso de preparações anti-sépticas
contaminadas que ocorrem principalmente por uso de água não esterilizada para seu
preparo, reutilização de frascos para armazenamento sem que tenham sido
completamente esvaziados e limpos adequadamente, erro de preparo (diluição acima
do indicado) sendo, portanto, indispensáveis as normas de Boas Práticas de
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
14
Fabricação (BPF) e Boas Práticas de Laboratório (BPL) no momento do preparo do
anti-séptico bem como seu armazenamento e uso (WEBER et al., 2007)
Atualmente, os procedimentos cirúrgicos são realizados de maneira asséptica,
pelo uso de instrumental cirúrgico e aventais esterilizados, escovação das mãos do
cirurgião com anti-sépticos e uso de luvas estéreis. A lavagem das mãos e
antebraços com sabões e anti-sépticos é indispensável antes do calçamento das
luvas, pois este material fura-se com grande freqüência durante as cirurgias. Além
disto, a perfuração das luvas aumenta após duas horas de trabalho. É descrito que
por um único furo de agulha na luva podem passar até 18.960 estafilococos num
período de 20 minutos (SILVA et al., 2000; BUCALEM, WEI, 2008).
A lavagem das mãos utilizando sabões degermantes é primordial para
diminuição do risco de infecções e desse modo, o ideal é o emprego de sabões
degermantes (associação de anti-séptico a um detergente) de clorexidina 2% a 4%
(CYRILLO, 2008).
Em estudos comparativos de ação microbiológica de anti-sépticos empregados
para lavagem das mãos, a clorexidina tem demonstrado resultados satisfatórios em
relação a outros anti-sépticos como PVPI, álcool 70% e triclosan, inclusive devido à
sua ação residual (SILVA et al., 2000; MAGRO-FILHO et al., 2000).
Em relação ao custo, os produtos anti-sépticos possuem valores maiores que
os sabonetes comuns. Entretanto, é claro até o momento, que elevar a adesão da
higienização das mãos pode reduzir infecções e conseqüentemente os custos, na
maioria dos serviços de saúde (BRASIL, 2008b).
3.5. Clorexidina
A clorexidina é um composto químico biguanídico catiônico com molécula
simétrica, consistindo de dois anéis 4–clorofenil e dois grupos biguanida conectados
por uma cadeia de hexametileno central (1,1’–hexametilenobis{5–(4-p-clorofenil)
biguanida)} (EP, 2005; MARTINDALE, 2007; USP, 2007). Foi sintetizada em
laboratório em 1954 por Davies, Francis, Martin, Rose e Swain e aprovada para uso
nos Estados Unidos em 1976 (SILVA et al., 2000).
A clorexidina é um anti-séptico, desinfetante não específico de segunda
geração e conservante. Embora seja bactericida de uso tópico com largo espectro de
ação, sua eficácia difere em relação aos tipos de microrganismos. É efetiva contra
bactérias Gram-positivas e menos eficaz para bactérias Gram-negativas, fungos e
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
15
algumas espécies de Proteus. Quanto aos vírus, possui atividade apenas para alguns
tipos de vírus envelopados, entre eles vírus da hepatite, herpes simples, HIV,
citomegalovírus, influenza e vírus sincicial respiratório. Para as micobactérias, a
clorexidina apresenta mínima atividade; contra endósporos e cistos de protozoários a
atividade é nula (BRITISH CODEX, 1973; NEIDLE, YAGIELA, 1991; BONACORSI et
al., 2000; THOMAS et al., 2000; TORTORA et al., 2006; MARTINDALE, 2007;
WEBER et al., 2007; BRASIL, 2008b).
A atividade antimicrobiana contra esporos é bem discutida, uma vez que
alguns autores dizem que possui pouca ação (NEIDLE, YAGIELA, 1991; TORTORA
et al., 2006), enquanto outros dizem que não possui (BRITISH CODEX, 1973; WU,
LIU, 2007; BRASIL, 2008b). Bambace e colaboradores (2003) e MARTINDALE (2007)
complementam que a clorexidina é efetiva contra esporos apenas em elevadas
temperaturas.
Atua sobre a membrana celular causando seu rompimento e conseqüente
perda de material intracelular como potássio (quando a clorexidina está em baixa
concentração), inibição respiratória e perda de ácido nucléico (quando a clorexidina
está em alta concentração) e coagulação citoplasmática (coagulação ou precipitação
de proteínas e ácidos nucléicos), em razão da interação da clorexidina com proteínas
citoplasmáticas (BONACORSI et al., 2000; THOMAS et al., 2000). As ligações na
membrana celular provavelmente ocorrem entre a carga positiva da clorexidina com a
carga negativa dos grupos carboxilas disponíveis dos proteoglicanos e os grupos
fosfatos dos ácidos teicóico e lipoteicóico na parede interna bacteriana. Em relação
ao metabolismo, a clorexidina inibe os sistemas glicosiltransferase e 2-
fosfoenolpiruvato fosfotransferase, sendo esta última, uma enzima vital para o
processamento e a manutenção da via glicolítica, uma vez que integra o sistema de
fosfotransferência, responsável pela incorporação de glicose às células bacterianas
(ARAÚJO et al., 2001).
Embora tenha ação residual, sua atividade é reduzida na presença de pus e
sangue. Entre as bactérias Gram-negativas, a P. aeruginosa é mais resistente, por
restringir seu acesso ao alvo de ação, devido à adaptação fisiológica da parede
celular, que previne a entrada do biocida (por aumentar os componentes do envelope
celular tais como lipopolissacarídeos ou fosfolipídeos causado pela mutação
progressiva e também trocas nos processos biomecânicos intracelulares) e há um
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
16
mecanismo para eliminar as substâncias nocivas de seu interior (BRITISH CODEX,
1973; THOMAS et al., 2000).
A atividade antimicrobiana imediata é mais lenta em relação aos álcoois e por
isso considerada de nível intermediário, entretanto, seu efeito residual (por ter forte
afinidade aos tecidos), torna-a o melhor dos anti-sépticos disponíveis (BRASIL,
2008b). De acordo com Southern e colaboradores (2006), é considerada como
padrão de referência em cremes orais antimicrobianos devido ao largo espectro de
ação e substantividade (8 a 12 horas).
A ação biocida da clorexidina é inibida pelo ácido nicotínico e, embora não se
saiba exatamente como ocorre esta inibição, acredita-se que seja pelo bloqueio dos
receptores de clorexidina pelo ácido (BAKER et al., 1994).
Pode apresentar-se na forma de diversos sais como acetato, cloridrato,
gluconato, digluconato, sendo este último mais solúvel em água e em pH fisiológico,
liberando o componente catiônico. As soluções aquosas dos sais alcançam sua
máxima atividade microbiológica e estabilidade química em pH 5 a 8 (THOMAS et al.,
2000; GLUCONATO, 2006).
A solução de digluconato de clorexidina é uma solução aquosa, que contém
não menos que 19% (190 g/L) e não mais que 21% (210 g/L) de digluconato de
clorexidina. É um líquido amarelo–pálido límpido, quase inodoro, miscível em água e
ácido acético glacial, solúvel em álcool e em acetona. Em solução aquosa a 5% v/v
tem pH 5,5 a 7,0. Sua densidade relativa a 20 ºC é 1,06 a 1,07 g/mL; deve ser
armazenada protegida da luz e em temperatura máxima de 25 ºC (BP, 2005;
MARTINDALE, 2007; USP, 2008).
A Figura 1 apresenta a estrutura do digluconato de clorexidina.
Figura 1. Estrutura química do digluconato de clorexidina
Fonte: EP, 2005.
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
17
Por se tratar de um material com caráter catiônico, apresenta incompatibilidade
com preparações aniônicas inorgânicas como sulfato, carbonato e fosfato e orgânicos
como os sabões, podendo resultar em turvação, precipitação e perda do poder anti-
séptico. Desta maneira, os tensoativos indicados para formulações com digluconato
de clorexidina são os catiônicos, os anfóteros e os não-iônicos (BRITISH CODEX,
1973; BONACORSI et al., 2000; MARTINDALE, 2007).
Os sais de clorexidina podem ter atividade reduzida em presença de agentes
suspensores e compostos insolúveis de cálcio, magnésio e zinco. A decomposição
dos sais de clorexidina em soluções aquosa, influenciada pela temperatura elevada e
pH alcalino, evidencia traços de 4-cloroanilina (MARTINDALE, 2007; USP, 2008).
De acordo com a literatura, o uso da clorexidina é bastante amplo e tem sido
empregada para limpeza de superfícies, equipamentos e roupas em hospitais,
consultórios odontológicos e outras unidades de saúde (GAJADHAR et al., 2003);
para anti-sepsia da pele, mãos e membranas mucosas; para tratamento de feridas e
queimaduras. Combinada a um detergente ou álcool, é usada para escovação
cirúrgica das mãos e preparo pré-operatório da pele em pacientes (BRITISH CODEX,
1973; TORTORA et al., 2006).
Trabulsi e Alterthum (2005) relatam que é usada para preparo de pacientes em
urologia, obstetrícia e ginecologia e de acordo com Galice e col. (2006) para lavagem
vaginal antes e durante o parto para prevenir infecção causada por estreptococos de
grupo B na mãe e no recém-nascido. Também é prescrita para terapia tópica de
dermatites fúngicas e piodermites em cães e gatos, podendo ser associada ao
miconazol (PEDRINI, MARGATHO, 2003; PERRINS, BOND, 2003).
Seu uso também tem sido sugerido em espermicidas, a fim de prevenir a
transmissão do vírus HIV, por possuir atividade in vitro contra o vírus; prevenir a
contracepção por difundir no muco cervical em concentrações em torno de 1 mg/mL,
formando uma barreira e impedindo a entrada do esperma (MARTINDALE, 2007). O
gel de clorexidina associado à lidocaína pode ser utilizado em cateterização e
citoscopia; a solução aquosa de clorexidina tem se mostrado muito eficaz para
controlar sepsis peritoneal na anti-sepsia de pacientes que fazem diálise. O
tratamento local com solução de clorexidina é efetivo para prevenção de infecções
nosocomiais do trato respiratório, redução de infecção maternal e morbidade neonatal
durante o nascimento e diminuição da mortalidade em sepsi intra-abdominal
experimental (KÕLJALG et al., 2002; MARTINDALE, 2007).
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
18
A clorexidina começou a ser empregada para irrigação de canais radiculares
em 1964, entretanto, seu uso mais sistemático em endodontia e avaliação de suas
propriedades ocorreu a partir de 1982 (SOUZA et al., 2006). Tem sido muito utilizada
em odontologia veiculada na forma de elixir, chiclete, dentifrício, enxagüatório, spray
ou gel, sendo muito eficaz como agente antiplaca e antigengivite, devido à acentuada
capacidade de adsorção aos dentes, às superfícies mucosas e mucina salivar, com
liberação na cavidade oral em níveis terapêuticos, em 24 horas, podendo chegar a 48
horas (LEONARDO et al., 1999).
A faixa de concentração da solução de clorexidina empregada em odontologia
é bastante ampla, sendo utilizada em concentrações entre 0,12 e 2,0%. De acordo
com a literatura, altas concentrações oferecem efeito bactericida e baixas
concentrações, bacteriostático na placa bacteriana (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001; BAMBACE et al., 2003; SOUTHERN et al., 2006).
Também é indicada para tratamento de estomatite, candidíase oral,
manutenção da higiene bucal em deficientes físicos ou mentais, em que o controle da
placa é difícil de ser atingido, e em procedimentos pré-cirúrgicos (para irrigação de
campos operatórios em cirurgias periodontais e periapicais), para evitar bacteremia,
aplicação pós-cirúrgica para auxiliar a cicatrização, embora alguns autores como
Bonacorsi e colaboradores (2000) e Korolkovas (2001) relatem que a clorexidina
retarda este processo por causar danos ao tecido. A clorexidina é indicada em
implantes dentais, higienização de próteses, pacientes com grande propensão à
cárie, pacientes com aparelho ortodôntico, instrumentação de canal, paciente
imunologicamente comprometido, idoso ou doente terminal (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001).
Ao controlar a formação do biofilme dental através da alteração da composição
bacteriana do biolfime supragengival, reduz o risco de cárie e doença periodontal,
reduzindo o número de Streptococcus mutans por períodos prolongados em
conseqüência de sua liberação lenta na cavidade bucal e ação inibidora sobre
enzimas glicosídicas e proteolíticas (BAMBACE et al., 2003; PEREIRA et al., 2006).
O uso de clorexidina para a higienização das mãos é seguro e a absorção pela
pele é mínima, senão nula. Porém, pode haver irritação na pele, sendo que esta
irritação é concentração-dependente, com probabilidade maior para produtos que
contêm 4% de clorexidina e quando utilizados com freqüência (BRASIL, 2008b).
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19
Efeitos colaterais importantes são: descoloração dos dentes, restaurações e
dorso da língua, descamação e sensibilidade oral, os quais podem ser diminuídos
pela redução da concentração da solução, além do gosto amargo e interferência no
paladar por algumas horas após o bochecho (QUIRYNEN et al., 2001;
VASCONCELOS, 2001).
Quando associada a um sabonete, pode causar toxicidade local, alteração na
flora normal da pele predispondo-a à colonização por bactérias Gram-negativas
(GONTIJO-FILHO et al., 1984).
Contato de soluções com altas concentrações de clorexidina com os olhos e
tecidos sensíveis pode causar irritação (TORTORA et al., 2006; MARTINDALE,
2007). Há registro na literatura de um recém-nascido que desenvolveu cianose e
bradicardia após sua mãe ter administrado spray de clorexidina em seus seios para
prevenir mastite. Após acidental administração intravenosa, têm sido relatados casos
de hemólise (MARTINDALE, 2007).
Embora Bonacorsi e colaboradores (2000) apresentem citotoxicidade in vitro
para clorexidina mesmo em baixas concentrações e demonstrem literatura com dados
de toxicidade da clorexidina para várias células humanas, pois seu mecanismo de
ação é o memso para células procarióticas e eucarióticas, Kudo e colaboradores
(2002) relatam que a toxicidade da clorexidina é baixa para administração oral (DL
50
1800 mg/kg , em rato), mas alta para administração intravenosa (DL
50
22 mg/kg , em
rato). Diversos testes toxicológicos têm mostrado que a molécula de clorexidina é
altamente estável, e, quando ingerida, é quase totalmente eliminada pelas fezes
(SINNES et al., 1997).
De acordo com Martindale (2007), quando ingerida, a clorexidina pode causar
irritações gastrintestinais, vômito, tontura, enquanto que toxicidade sistêmica é rara.
Entretanto, Hirata e Kurokawa (2002) relatam que um paciente de 89 anos morreu
após aspiração e ingestão acidental de solução de gluconato de clorexidina no Japão,
embora acredita-se que a morte tenha ocorrido devido à grave síndrome de angústia
respiratória (causada pela aspiração e conseqüente adsorção pelos pulmões) e não
devido aos efeitos gastrintestinais. Kudo e colaboradores (2002) também relatam a
morte de uma japonesa após acidental administração intravenosa de solução de
digluconato de clorexidina a 20%.
Hipersensibilidade severa, incluindo choque anafilático, foi relatada após
aplicação tópica de clorexidina e de seu uso em lubrificantes para cateterização
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
20
urinária ou citoscopia e há consenso que reações similares podem ocorrer quando se
utilizam produtos médico-cirúrgicos como cateteres intravenosos impregnados com
tal produto (MARTINDALE, 2007).
Ainda de acordo com USP DI (2003), a carcinogenicidade não foi observada
em estudo utilizando ratos, que receberam água com alta dose de clorexidina (38
mg/kg/dia), sendo esta dose, pelo menos, quinhentas vezes a quantidade que pode
ser ingerida pelo homem na dose diária de clorexidina em enxagüatório bucal.
A ação dos anti-sépticos sobre os microrganismos e os efeitos tóxicos que
podem causar ao hospedeiro são dependentes, por exemplo, da concentração
utilizada. Deste modo, o uso dessas substâncias é recomendado em concentrações
consideradas seguras para aplicação sobre pele e mucosas (CURY, 1986). Segundo
Imbert e colaboradores (2003), a concentração de clorexidina utilizada em mucosas
normalmente é 500-1000 mg/L e em superfícies plásticas é 5000 mg/L.
De acordo com Tambe e colaboradores (2001), o uso de anti-sépticos em
produtos médicos e domésticos aumentou na última década e o uso indiscriminado
sugere o desenvolvimento de microrganismos resistentes aos anti-sépticos.
A resistência ao germicida, na maioria dos casos, está relacionada com
constituição da parede celular bacteriana, sendo mais freqüente em microrganismos
que não são sensíveis aos anti-sépticos e desinfetantes utilizados normalmente na
prática clínica (MELO et al., 2000; KÕLJALG et al., 2002), com o surgimento de
mutação do gene cromossomal ou pela aquisição de material genético na forma de
plasmídeos (KÕLJALG et al., 2002; WEBER et al., 2007). Kõljalg e colaboradores
(2002) concordam que dados sobre espécies microbianas e susceptibilidade a
antimicrobianos de agentes infecciosos podem sugerir susceptibilidade à clorexidina.
Al-Masaudi e colaboradores (1988) descrevem que naquela época não havia
relatos de resistência à clorexidina em S. aureus antibiótico resistente e em
Pseudomonas spp. Entretanto, nos anos de 1990 e 2000, a literatura descreve casos
de resistência à clorexidina (SULLER, RUSSELL, 1999; TAMBE et al., 2001). Thomas
e colaboradores (2005) complementam que a resistência à clorexidina pode ser
adquirida devido ao uso de soluções diluídas, adaptações fenotípicas induzidas por
exposição a baixos níveis de biocida ou ainda quando há competição com outro
agente antimicrobiano pelo mesmo alvo de ação.
Algumas precauções devem ser seguidas para o emprego de solução de
clorexidina, como, por exemplo, não deve ser utilizada em cérebro, meninges, ouvido
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21
médio, olhos e outros tecidos sensíveis. Alguns cuidados também devem ser
seguidos ao preparar a solução de clorexidina, como utilizar água esterilizada, utilizar
soluções que foram recentemente preparadas, preparar soluções em concentrações
corretas e armazená-las adequadamente (MARTINDALE, 2007).
Em 2003, Farias e colaboradores compararam nistatina 100.000 UI e solução
de digluconato de clorexidina 0,2% sobre o cultivo de C. albicans (ATCC 1031) em
ágar BHI. O halo de inibição formado pela clorexidina foi de 27 mm e o formado pela
nistatina foi de 17 mm, demonstrando que a clorexidina pode ser utilizada para auxílio
de prevenção e tratamento de candidíase oral.
Amorin e colaboradores (2004) determinaram a concentração inibitória mínima
(CIM), por difusão em ágar, de digluconato de clorexidina e p-monoclorofenol, frente
a P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, E. coli, C. albicans, Prevotella intermedia,
Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella denticola e
Prevotella melaninogenica. Os valores de CIMs para clorexidina variaram de 2,67 a
80,0 µg/mL, enquanto que para p-monoclorofenol as CIMs foram 46,67 a 213,33
µg/mL. Assim, de acordo com os autores, a clorexidina deve ser a primeira escolha
por ser usada em menor concentração e ser menos tóxica que o p-monoclorofenol.
Em 2006, Gonçalves e colaboradores avaliaram (in vivo) a contaminação
bacteriana gerada pelo aerossol de procedimentos em consultórios odontológicos e a
eficácia da solução de digluconato de clorexidina 0,12% para diminuir o número de
microrganismos obtidos neste procedimento. O número médio de UFC coletado em
placa com meio de cultura que ficou afixada ao profissional do consultório
odontológico, foi de 54,93 na primeira fase (sem profilaxia com bochecho de solução
de clorexidina) e 18,93 na segunda (com bochecho); em relação às placas coletadas
com a auxiliar e com o paciente, também houve redução significativa do número de
UFC na segunda fase, o que corrobora com outros autores que também encontraram
redução no número de UFC após bochechos com clorexidina 0,12%.
Apesar de a clorexidina possuir efeito antimicrobiano, a solução de clorexidina
pode ser contaminada por bactérias. Gajadhar e colaboradores (2003), em uma
pesquisa realizada em hospitais de Trinidad (Caribe), verificaram que o anti-
séptico/desinfetante mais utilizado em 11 instituições de saúde desta ilha foi a
clorexidina. Porém, a qualidade microbiológica das soluções utilizadas em quatro dos
maiores hospitais, demonstrou contaminação por Pseudomonas spp., que prevaleceu
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
22
em 6,1% das amostras analisadas. Portanto, são essenciais as BPF e as BPL
durante seu preparo, uso e conservação.
O método oficial de análise para sais de clorexidina descritos na literatura é
titulação com ácido perclórico 0,1 M (BP, 2005; EP, 2005) e cromatografia líquida de
alta eficiência CLAE (USP, 2008). Para solução de irrigação e enxagüatório bucal de
clorexidina, o método descrito nas farmacopéias britânica (2005) e européia (2005) é
CLAE. A farmacopéia americana (2008) descreve CLAE para análise de creme oral
com gluconato de clorexidina. Todos estes compêndios oficiais descrevem o método
de CLAE para análise de substâncias relatadas. A farmacopéia americana (2008),
descreve CLAE para análise de p-cloroanilina e as farmacopéias britânica (2005) e
européia (2005) descrevem método colorimétrico. Para análise de clorexidina e seus
sais, os métodos apresentados na literatura são cromatografia gasosa (SIEFERT et
al., 1975) e CLAE (DOUB et al., 1996) e para análise de impurezas e substâncias
relatadas, são oxidação catalítica e CLAE (STEVENS et al., 1986), cromatografia
gasosa (GAVLICK, DAVIS, 1994) e CLAE (REVELLE et al., 1993) . Os parâmetros
utilizados nas análises estão apresentados nas Tabelas 1 e 2.
Revisão da Literatura
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Tabela 1. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina e seus sais
referência método λ
(nm)
fase móvel ou
solvente
coluna linearidade
amostra
USP (2008)
CLAE
239
Solução A: tampão
fosfato de sódio pH
3,0 com trietilamina
em água,
misturando com
acetonitrila
Solução B:
acetonitrila
L1
gluconato
EP (2005),
BP (2005)
potenciometria ácido perclórico sais
Siefert et
al. (1975)
Cromatografia a
gás
detector Ni Supelco 50 – 200
ppm
acetato
Doub et al.
(196)
CLAE,
gradiente
230
Fase A: acetato de
amônio pH 5,0
Fase B: acetonitrila
Nucleosil
C
18
10 µg/mL a
10 mg/mL
gluconato
Revisão da Literatura
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24
Tabela 2. Métodos descritos na literatura para análise de impurezas e produtos de degradação da clorexidina
referência método λ (nm) fase móvel ou solvente coluna linearidade produto encontrado
USP
(2008)
CLAE
239
Solução A: tampão fosfato
de sódio pH 3,0 com
trietilamina em água,
misturando com
acetonitrila
Solução B: acetonitrila
L1
substâncias relatadas e p-
cloroanilina
EP (2005),
BP (2005)
CG* e reação
colorimétrica
nitrogênio
OV – 225 4-cloroanilina
EP (2005),
BP (2005)
CLAE
254
Octanesulfato de sódio:
ácido acético: água:
metanol
Nucleosil C
18
substâncias relatadas
Gavlick,
Davis
(1994)
CG
hélio
J&W Scientific DB-
1
0,956 – 10
ppm
p-cloroanilina
Revelle et
al. (1993)
CLAE isocrático
com detector diodo
array, CLAE-EM*,
RMN***
CLAE e CLAE-
EM**: 230
RMN: 299,92
MHz
CLAE e CLAE-EM: tampão
pH 5,0: metanol acetato
RMN: D
2
O ou CD
3
OD
CLAE e CLAE-EM:
Zorbax CN
11 impurezas, chamadas de: B,
B1, C, D,D1, D2, E, F, G, G1, H
Stevens et
al. (1986)
CLAE-UV
Oxidação catalítica
(OC)
220
H
3
PO
4
: heptanesulfato de
sódio: CH
3
CN,
pH 2,2
Regis Chemical C
6
oxigênio 300
mL/min para OC
1 – 80
µg/mL
p-cloroanilina, p-clorofenil
biguanida e fenil biguanida
* cromatografia a gás; ** espectrometria de massas, *** resonância magnética nuclear
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25
Em fluidos biológicos, a clorexidina é determinada por espectrometria de
cintilação (BOSNEVOLL et al., 1974), por espectrofotometria (JENSEN,
CHRISTENSEN, 1971; VRIES et al., 1991), CLAE (LAM et al., 1993; MEDLICOTT et
al., 1994; PESONEM et al., 1995) e micro-extração em fase sólida (MUSTEATA,
PAWLISZYN, 2005) em saliva; por CLAE em urina, (GAFFNEY, COOKE, 1984;
WAINWRIGHT, COOKE, 1986), em urina e soro (HUSTON, et al., 1982; BROUGHAM
et al., 1986; BELOW et al., 2004), em soro (KUDO et al., 2002), LC-ESI-MS para
sangue hemolizado (USUI et al., 2006) e CLAE para a determinação de resíduos de
clorexidina em leite de vaca (HEBERT et al., 2003). Os parâmetros adotados para
estas análises estão descritos na Tabela 3.
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26
Tabela 3. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em fluidos biológicos
Referência método λ
(nm)
fase móvel ou solvente coluna linearidade amostra
Bosnevoll et al.
(1974).
Espectrometria de
cintilação líquida
6,9 ± 1,4 mg saliva
Jensen et al.
(1971)
UV 250 Clorofórmio 5-25 µg/mL e 25-200
µg/mL
saliva
Vries et. al.
(1991)
fluorescência 541 Tintura eosin-Y 6,7-20 µg/mL saliva
Lam et al.
(1993)
CLAE - UV
260
Acetonitrila: tampão acetato
de sódio e ácido
heptanesulfônico pH 5,0
Bekman
Ultrasphere ODS
C
18
0,05 - 20 µg/mL
saliva
Medlicott et al.
(1994).
CLAE com duplo
detector
254
Acetronitrila: ácido acético
glacial: laurilsulfato de sódio
Exsil ODS-B C
18
2 - 30 µg/mL
saliva
Pesonem et al.
(1995)
CLAE com
detector variável
260
Acetonitrila: tampão fosfato
hidrogênio dissódico, ácido
heptanesulfônico e
trietileneamine pH 2,5
LiChrospher 100
RP-18
0,5 - 100 µg/mL
saliva
Musteata et al.
(2005)
CLAE-ESI-MS
Água acidificada com ácido
fórmico (pH 3,2): acetonitrila
Zorbax Eclipse C
18
0,05 - 40 µg/mL
saliva
Gaffney, Cooke
(1984)
CLAE -UV
260
metanol: tampão acetato de
sódio pH 5,0
µBondapak C
18
1 - 10 µg/mL
urina
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Tabela 3. cont. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em fluidos biológicos
Referência método λ
(nm)
fase móvel ou solvente coluna linearidade amostra
Wainwright,
Cooke (1986)
CLAE -UV
260
metanol: solução de amônia:
nitrato de amônia
Partisil sílica
50 - 200 µg/mL
urina
Huston et al.
(1982)
CLAE -UV
238
yolueno-4-ácido sulfônico em
metanol: água
ODS Waters
1 - 20 µg/mL
urina e sangue
Brougham et al.
(1986)
CLAE -UV
260
metanol: água com
heptanosulfato de sódio
Bondapak C
18
20,2 - 808
ng/mL
soro e urina
Below et al.
(2004)
CLAE-UV, gradiente,
combinado com extração
em fase sólida
250
A: acetonitrila: tampão de solução
de amônia e ácido acético pH 8,7
B: acetonitrila: ácido acético
Coluna de
separação Luna
C
18
2,5 mg/L e 25
mg/L
soro e urina
Kudo et al.
(2002)
CLAE -UV
260
acetonitrila: água com 0,05% de
ácido trifluoroacético, 0,05% de
ácido heptafluorobutirico e 0,1%
de trietilamina
Capcell Pak C
18
0,05 - 50 µg/mL
soro
Usui et al. (2006)
LC-ESI-MS*
LC-MS: HPLC isocrático
LC-MS: acetonitrila: água: ácido
trifluoro acético
LC-MS: TSK gel
ODS 100 V
0,10 – 11,0
µg/mL
sangue
hemolizado
Hebert et al.
(2003)
CLAE -PDA 258 tampão acetato (pH 3,6):
acetonitrila
Supelco Discovery
RP-Amide C
16
1 - 100 µg/mL saliva
*cromatografia líquida – ionização elestrospray e espectrotometria de massas
Revisão da Literatura
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Em preparações farmacêuticas, a clorexidina tem sido determinada pelo
método de CLAE (BAILEY et al., 1975; BAUER et al., 1983; BAUER et al., 1984;
RICHARD et al., 1984; GAGLIARD et al., 1985; HU et al., 1990; GAVLICK, 1992; HÁ,
CHEUNG, 1996; HAVLIKOVÁ et al., 2007), extração em fase sólida combinada com
análise espectrofotométrica (BONAZZI et al., 1995), cromatografia gás-líquida,
espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear (MIRIBEL et al., 1983) e
eletroforese capilar (ABAD-VILLAR et al., 2006). Os parâmetros utilizados nestas
análises estão apresentados na Tabela 4.
Revisão da Literatura
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Tabela 4. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em preparações farmacêuticas
referência método λ
(nm)
fase móvel ou solvente coluna linearidade amostra
Bailey et al.
(1975)
CLAE -UV
254
acetonitrila: ácido sulfúrico 0,02 N
Partisil
0 - 600 µg/mL
solução degermante, loção, talco e
creme obstétrico, gel dental
Bauer et al.
(1984)
CLAE com
detector
variável
294
acetonitrila: tampão com cloreto de
sódio e sulfato hidrogênio tetrabutil
amonio pH 5,9
µBondapck C
18
0,64 - 2,56
µg/mL
pastilha
Bauer et al.
(1983)
CLAE com
detector
variável
262
tampão acetato de sódio pH 3,5:
acetonitrila com laurilsulfato de
sódio
µBondapack CN
10
0,6 – 1,4 µg/mL
pastilhas
Gagliard et al.
(1985)
CLAE -UV
264
acetonitrila: água com perclorato de
sódio
Erbasil C
18
0,02 – 6 µg/mL
creme
Hu et al.
(1991)
CLAE -UV
254
tampão fosfato de dihidrogênio pH
3,5
Nucleosil C
18
2,72 – 436
µg/mL
solução anti-séptica para lentes de
contato
Gavlick (1992) CLAE -
PDA
239
Fase A: acetonitrila
Fase B: tampão TFA pH 2,0
Suples pkb- 100
9,1 – 146 ppm
produto de limpeza das mãos
Há, Cheung
(1996)
CLAE
gradiente,
com UV-VIS
e PDA
235
Fase A: acetonitrila: tampão acetato
de amônio pH 5,0
Fase B: tampão fosfato: acetonitrila
Hamilton PRP-1
30 ppm
soluções oftálmicas
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
30
Tabela 4. cont. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em preparações farmacêuticas
referência método λ
(nm)
fase móvel ou solvente coluna linearidade amostra
Richard et al.
(1984)
CLAE – UV
gradiente,
254
Fase A: tampão acetato de sódio pH 4,0: ácido
acético: metanol: solução de heptanesulfonato
de sódio (92,1 0,2: 4,8: 2,9)
Fase B: tampão acetato de sódio pH 4,0: ácido
acético: metanol: solução de heptanesulfonato
de sódio (4,8: 0,4: 91,9: 2,9)
µBondapck
C
18
0,312 – 10
mg/100mL
colírio e soluções
anti-sépticas para
lente de contato
Havlíková et al.
(2007)
CLAE - UV-VIS
239
Acetonitrila: tampão fosfato de sódio em
trietilamina pH 3,0
Zorbax SB
Phenyl
column
51,2- 178,5
µg/mL
pomada veterinária
Bonazzi et al.
(1995)
Extração em fase
sólida (EFS)
combinada com
espectrofotometria
derivada
SPE C
18
(para EFS)
7,3 – 36,5 µg/mL
cremes
Abad-Villar et
al. (2006)
Eletroforese
capilar
capilares de
sílica fundida
10 µg/mL – 20
mg/mL
colírio
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
31
Tabela 4. cont. Métodos descritos na literatura para análise de clorexidina em preparações farmacêuticas
referência
método λ
(nm)
fase móvel ou solvente coluna linearidade amostra
Miribel et al.
(1983)
Cromatografia
gás-líquida,
espectrofotometria
de massas e
ressonância
magnética nuclear
Nitrogênio (para cromatografia gasosa)
3% OV-101
on
Chromosorb
W HP (gás)
0,2 – 2 mg/mL
creme e pomada
BP (2005), EP
(2005)
CLAE
254
Octanesulfato de sódio: ácido acético: água:
metanol
Nucleosil C
18
solução de
irrigação,
enxagüatório bucal
USP (2008)
CLAE
239
Solução A: tampão fosfato de sódio pH 3,0
com trietilamina em água, misturando com
acetonitrila
Solução B: acetonitrila
L1
creme oral
Revisão da Literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
32
Na literatura não foi encontrado método de ensaio microbiológico pela técnica
de difusão em ágar para análise quantitativa de solução de digluconato de clorexidina
e também não foi encontrado método espectrofotométrico na região de ultravioleta
para análise quantitativa de sabonete líquido contendo digluconato de clorexidina. Por
estes motivos, este trabalho se propôs a desenvolver e validar tais metodologias
analíticas.
Revisão da literatura
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
33
Publicação
FIORENTINO, F.A.M.; CORREA, M.A.; SALGADO, H.R.N.
Clorexidina, uma revisão.
Revista Bio Farma, (São Paulo), v. 3, n. 6, p. 62-72, 2008.
4. CONTROLE DE QUALIDADE DA SOLUÇÃO DE
DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
35
4.1. Descrição
4.1.1. Descrição geral
Nome genérico: digluconato de clorexidina, registro número 02437 na DCB,
(Brasil, 2006).
Descrição: solução aquosa amarelo-pálido, límpida e quase inodora com sabor
amargo (BRITISH, 2005; USP, 2007).
Nome químico: 1,1’(hexane-1,6-diyl)bis[5-(4-p-chlorophenyl)biguanide] di-D-
gluconate (BRITISH, 2005).
Nomes: Chlorhexidine digluconate; Chlorheksidino digliukonato tirpalas;
Chlorhexidin-diglukonát; Chlorhexidine, Gluconate de; Chlorhexidini Digluconatis
Solutio; Chlorhexidini Gluconas; Gluconato de clorhexidina (MARTINDALE, 2007).
Nome comercial: solução aquosa de digluconato de clorexidina
®
, Peridex
®
,
PerioGard
®
(USA); Oro-Clense
®
, Peridex
®
(Canadá); Corsody
®
, Chlorohex
®
(Reino
Unido); Chlorhexamed
®
(Alemanha); Savacol
®
(Austrália); PerioGard
®
, Cariax
®
,
Megatrat
®
, Clorexidina
®
(Brasil).
CAS: 18472-51-0
DCI: 0500
Categoria: Anti-séptico bis-biguanida.
Fórmula química: C
22
H
30
Cl
2
N
10
.2C
6
H
12
O
7
Massa molecular: 898
Faixa de fusão: Os cristais obtidos com a solução de digluconato de clorexidina
fundem entre 132 ºC a 136 ºC (BRITISH, 2005; USP, 2007).
4.1.2. Substância química de referência
Foi utilizada solução aquosa de digluconato de clorexidina padrão secundário,
gentilmente doada pela indústria Rioquímica Ltda, na pessoa da Dra. Greici Cristiani
Gomes Tozo, com teor rotulado de 20,98% e identificada pelo lote de número
07/1306, validade 13/06/2009.
4.1.3. Forma farmacêutica
Foi utilizada solução aquosa de digluconato de clorexidina, gentilmente doada
pelo Laboratório de Cosmetologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, na pessoa do Prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa, sob nome comercial
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
36
de Solução de Digluconato de Clorexidina (Henrifarma) e identificada pelo lote CS
0120705.
4.2. Análise qualitativa da solução de digluconato de clorexidina
4.2.1. Caracteres físicos
A solução de digluconato de clorexidina utilizada na preparação dos sabonetes
foi avaliada em relação ao aspecto, cor e odor.
De acordo com os resultados, a solução de digluconato de clorexidina
apresentou-se amarelo-pálida, límpida e quase inodora, demonstrando estar de
acordo com o especificado na literatura consultada (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
4.2.2. Cromatografia em camada delgada
O objetivo desta análise foi verificar se a solução de digluconato de clorexidina
a ser incorporada aos sabonetes líquidos apresenta impurezas.
4.2.2.1. Material
Foram utilizadas solução de digluconato de clorexidina padrão secundário,
solução de digluconato de clorexidina amostra e gluconato de cálcio (Henrifarma, São
Paulo).
Os solventes utilizados foram de grau analítico e estão relacionados na lista de
materiais (p. xxv, item 1): acetato de etila, amônia concentrada, água destilada e
etanol, dicromato de potássio, ácido sulfúrico, cromatoplaca de gel de sílica 60 F
254.
4.2.2.2. Método
A placa utilizada (p. xxv, item 1) para identificação foi ativada a 105 ºC por 1
hora em estufa. Foi diluído 1,0 mL da solução padrão secundário de digluconato de
clorexidina em 5,0 mL de água deionizada. O mesmo procedimento foi realizado para
o preparo da solução amostra de digluconato de clorexidina. A solução referência de
gluconato de cálcio foi preparada dissolvendo 25,0 mg de gluconato de cálcio em 1
mL de água deionizada (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2007).
A cuba foi saturada com o sistema de fase móvel. Após migração de 10 cm da
fase móvel, a placa foi seca a 100 ºC por 20 minutos, e em seguida, borrifada com
solução de dicromato de potássio em solução de ácido sulfúrico para comparação
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
37
dos cromatogramas (EP, 2005; USP, 2007). Foram determinados os valores de Rf de
cada solução.
4.2.2.3. Resultados
Finalizado o processo cromatográfico, as manchas detectadas com as
soluções de digluconato de clorexidina padrão secundário e amostra e solução de
referência foram compatíveis, entre si, quanto ao tamanho, local e cor, estando em
concordância com o especificado nas monografias e entre si, como pode ser visto na
Figura 2.
1 2 3
Figura 2. Cromatograma em camada delgada de solução de digluconato de clorexidina. (1)
solução de referência, (2), solução teste, (3), solução padrão secundário, no sistema
solvente: acetato de etila: amônia concentrada: água: etanol (1:1:3:5, V:V:V:V). Valor de Rf da
solução referência é 0,56, Rf da solução padrão é 0,60 e Rf da solução teste é 0,60
.
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes
de uma mistura, realizada através de sua distribuição entre duas fases (móvel e
estacionária). Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os
componentes da mistura se distribuem entre as fases, de forma que cada um dos
componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações
diferenciais destes compostos. É um método de fácil execução útil na separação,
identificação, análise semi-quantitativa das espécies químicas e requer o uso
modesto de equipamentos sendo um procedimento importante para locais com pouca
infra-estrutura e com treinamento limitado dos operadores, além de ser um método
rápido, preciso e com baixo custo (F. Bras., 1988; GIL, 2007).
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
38
4.2.3. pH
4.2.3.1. Material
Foi utilizada solução de digluconato de clorexidina padrão secundário e
solução de digluconato de clorexidina amostra, descritas no item 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente. A análise foi realizada em peagômetro especificado na lista de
equipamentos (p.xxv, item 2).
4.2.3.2. Resultados
O pH obtido com a solução amostra foi 5,94 e com a solução padrão
secundário foi 5,75, estando ambas as soluções de acordo com a literatura
consultada, que especifica pH entre 5,5 e 7,0 (BP, 2005; USP, 2008) e também estão
de acordo entre si.
4.2.4. Determinação da faixa de fusão
O objetivo foi verificar se a solução de digluconato de clorexidina a ser
incorporada nos sabonetes apresenta impurezas e se o material cumpre com o
requisito farmacopéico.
4.2.4.1. Material
Foram utilizadas solução padrão secundário de digluconato de clorexidina,
solução amostra de digluconato de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3
respectivamente, solução de hidróxido de sódio 10 N, álcool 70%, papel de filtro,
solução de amarelo titânio, conforme descritos em lista de materiais (p. xxv, item 3).
4.2.4.2. Método
A 1,0 mL da solução padrão secundário, foram adicionados 40 mL de água
deionizada e isenta de gás carbônico. Foi adicionada solução de hidróxido de sódio
10 N, até que produzisse cor vermelha em papel amarelo titânio, e 1,0 mL da solução
de hidróxido de sódio foi adicionado em excesso. O precipitado foi filtrado e lavado
com água até que as lavagens estivessem livres de álcalis. O resíduo foi
recristalizado com álcool (70% v/v). Os cristais foram secos a 100 ºC - 105 ºC em
estufa por 1 hora, colocados em tubos capilares e introduzidos no equipamento para
verificação da faixa de fusão (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
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39
A solução amostra de digluconato de clorexidina foi preparada da mesma
maneira que a solução padrão. Foram realizadas três determinações para os cristais
obtidos com a solução teste e três determinações para a solução padrão secundário.
4.2.4.3. Resultados
O faixa de fusão dos cristais obtidos da solução teste foi 134,03 ºC e o PF dos
cristais obtidos da solução padrão foi 133,97 ºC, estando estes valores de acordo
com a literatura consultada que especifica faixa de fusão para cristais de solução de
digluconato de clorexidina entre 132 ºC - 136 ºC (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
Além disso, estes valores indicam conformidade entre ambas as soluções.
A faixa de fusão é importante tanto para a caracterização de compostos quanto
para indicar pureza quando se compara com padrões de referência, pois a presença
de impurezas, mesmo que em pequenas quantidades, pode alterar a faixa de fusão
de um composto ou diminuir o seu ponto de fusão (GIL, 2007).
Os resultados obtidos sugerem que a solução amostra pode ser identificada
como digluconato de clorexidina, e não apresenta impurezas precipitáveis por NaOH
10 N.
4.2.5. Densidade relativa
4.2.5.1. Material
Foi utilizada solução padrão secundário de digluconato de clorexidina e
solução amostra de digluconato de clorexidina descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente.
4.2.5.2. Método
Foi realizado conforme o método do picnômetro (F. Bras., 1988). Foram
realizadas três determinações para cada solução.
4.2.5.3. Resultados
A densidade relativa da solução-teste foi 1,066 e da solução padrão secundário
foi 1,065, estando estes valores de acordo com o especificado pela literatura, que é
de 1,06 a 1,07 (BP, 2005; USP, 2008) e em conformidade entre si.
Controle de qualidade
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40
4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho
O objetivo deste estudo foi verificar se a solução de digluconato de clorexidina
a ser incorporada aos sabonetes apresenta impurezas.
4.2.6.1. Material
Foram utilizadas solução padrão secundário de digluconato de clorexidina e
solução amostra de digluconato de clorexidina descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente, espectrofotômetro de infravermelho (p. xxv, item 5) e brometo de
potássio.
4.2.6.2. Método
Os cristais foram obtidos da mesma maneira como descrito em determinação
do ponto de fusão, item 4.2.4.3 e analisados em espectrofotômetro de infravermelho
(BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008), utilizando KBr como diluente. Foram pesados
100,0 mg de KBr e 1,0 mg de cristal obtido da solução teste do digluconato de
clorexidina. O mesmo procedimento foi realizado para solução padrão secundário.
4.2.6.3. Resultados
Os espectros obtidos estão apresentados nas Figuras 3 e 4. A Figura 5
apresenta a sobreposição de ambos os espectros.
Figura 3. Espectro na região de infravermelho obtido com cristais da soluçã
o amostra de
digluconato de clorexidina, em pastilhas de KBr.
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
41
Figura 4. Espectro na região de infravermelho obtido com cristais da solução padrão
secundário de digluconato de clorexidina, em pastilhas de KBr.
Figura 5. Sobreposição dos espectros obtidos com cristais da solução amostra (azul) e
solução padrão secundário de digluconato de clorexidina (vermelho),
em pastilhas de KBr.
A substância em análise refere-se à clorexidina, pois os picos obtidos no
espectro do infravermelho são característicos dos grupamentos químicos presentes
Controle de qualidade
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42
na molécula da clorexidina, como apresentado na Tabela 5, e não demonstra a
presença de impurezas precipitáveis por NaOH 10 N.
Tabela 5. Absorção de digluconato de clorexidina substância-teste e substância
padrão secundário em espectro de infravermelho em pastilhas de KBr
cm
-1
grupamento responsável
3470- 3380 Deformação axial dos grupamentos N-H
2930-2800 Deformação axial do grupamento sp
3
CH
1600-1540-1480
Deformação axial do anel benzênico
1240 Deformação axial do grupamento C-O
Os espectros de absorção na região infravermelho em pastilhas de KBr
apresentam picos de absorção característicos como: absorção em 3470 – 3380 cm
-1
características de presença de N-H; absorção em 1600 – 1540 – 1480 cm
-1
característica de anel benzênico; absorção em 1240 cm
-1
característica de C-O,
sendo todos condizentes com a estrutura do digluconato de clorexidina como
mostrado na Figura 1.
A espectrofotometria no infravermelho situa-se entre as regiões do visível e
das microondas. Neste espectro, a correlação pico a pico é uma ótima evidência para
a identidade da amostra. O espectro de infravermelho é característico da molécula
como um todo, mas certos grupos de átomos originam picos de absorção que
ocorrem em freqüência próxima independente da estrutura da molécula
(SILVERSTEIN et al., 1994). Este método tem fundamental importância para ensaios
de identificação e de fins qualitativos, porém, para ensaios de doseamento sua
aplicação é bem limitada (GIL, 2007).
4.2.7. Espectrofotometria na região ultravioleta
4.2.7.1. Material
Foram utilizadas solução padrão secundário e solução amostra de digluconato
de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente. Os solventes
utilizados foram de grau analítico.
Os espectros na região de ultravioleta foram obtidos utilizando-se equipamento
descrito no item 6, p.xxv, e cubetas de quartzo com 1 cm de caminho óptico.
Controle de qualidade
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43
4.2.7.2. Método
A partir da solução padrão secundário de digluconato de clorexidina 20% (p/v),
foi preparada solução a 0,1%. Uma alíquota de 500,0 µL da solução padrão foi
transferida para balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída
utilizando-se água deionizada para obtenção de solução a 0,1% (solução A).
4.2.7.2.1. Em água deionizada
A partir da solução A, uma alíquota de 500,0 µL, foi tranferida para balão
volumétrico de 25 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se água
deionizada para obtenção de solução a 0,002% (QUITETE et al., 2007).
4.2.7.2.2. Em etanol
A partir da solução A, uma alíquota de 500,0 µL, foi transferida para balão
volumétrico de 25 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se etanol
para obtenção de solução a 0,002%.
4.2.7.2.3. Em ácido clorídrico 0,1 M
A partir da solução A, uma alíquota de 500,0 µL, foi transferida para balão
volumétrico de 25 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se ácido
clorídrico 0,1 M para obtenção de solução a 0,002%.
4.2.7.2.4. Em hidróxido de sódio 0,1 M
A partir da solução A, uma alíquota de 500,0 µL, foi transferida para balão
volumétrico de 25 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se hidróxido
de sódio 0,1 M para obtenção de solução a 0,002%.
4.2.7.3. Resultados
Os espectros de absorção da solução de digluconato de clorexidina na região
de ultravioleta estão representados nas Figuras 6 a 9.
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
44
Figura 7. Espectro de absorção na região de ultravioleta de 200 – 400 nm, da solução de
digluconato de clorexidina padrão secundário a 0,002%, em etanol.
Figura 8. Espectro de absorção na região de ultravioleta de 200 – 400 nm, da solução de
digluconato de clorexidina padrão secundário a 0,002%, em ácido clorídrico 0,1 M.
Figura 6. Espectro de absorção na região de ultravioleta de 200 – 400 nm, da solução de
digluconato de clorexidina padrão secundário a 0,002% em água deionizada.
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45
Figura 9. Espectro de absorção na região de ultravioleta de 200 – 400 nm, da solução de
digluconato de clorexidina padrão secundário a 0,002% em hidróxido de sódio 0,1 M.
Para o preparo da solução amostra de digluconato de clorexidina a 0,1%, uma
alíquota de 500,0 µL da solução amostra foi transferida para balão volumétrico de 100
mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se água deionizada como
solvente (solução A). A partir da solução A, uma alíquota de 500,0 µL, foi transferida
para balão volumétrico de 25 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-
se etanol para obtenção de solução a 0,002%.
O espectro de absorção de digluconato de clorexidina solução amostra obtido
em etanol, em concentração de 0,002% na região UV está apresentado na Figura 10.
As leituras foram realizadas entre 200 e 400 nm em espectrofotômetro de ultravioleta,
utilizando-se cubeta com 1 cm de caminho óptico.
4.2.7.4. Discussão
Diante dos espectros obtidos com os diferentes solventes, optou-se por fazer a
identificação da solução amostra de digluconato de clorexidina utilizando etanol como
solvente, pois além de apresentar picos bem definidos, possui facilidade de aquisição,
baixo custo e poucos resíduos. O ensaio de quantificação do digluconato de
Figura 10. Espectro de absorção na região de ultravioleta de 200 –
400 nm, da solução
amostra de digluconato de clorexidina a 0,002% em etanol.
Controle de qualidade
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46
clorexidina no sabonete líquido, utilizou etanol uma vez que o ativo apresentou maior
absorção.
Os espectros obtidos com ácido clorídrico 0,1 M e hidróxido de sódio 0,1 M não
foram adequados para identificação da clorexidina, pois para estes solventes não
ocorreram sinais que permitissem caracterizar a substância.
De acordo com os resultados obtidos nas análises qualitativas das soluções
padrão secundário e amostra de digluconato de clorexidina, concluiu-se que o
produto em estudo é realmente a clorexidina pois não houve presença de
interferentes precipitáveis por NaOH 10 N detectados nos testes de faixa de fusão e
espectroscopia no infravermelho e as análises realizadas com a solução também
cumpriram com os requisitos farmacopéicos. Portanto, esta solução apresentou-se
adequada para ser incorporada às formulações desenvolvidas.
4.3. Análise quantitativa da solução de digluconato de clorexidina
4.3.1. Ensaio microbiológico
O objetivo deste estudo foi realizar o desenvolvimento e a validação de ensaio
de quantificação de solução de digluconato de clorexidina, utilizando o ensaio
microbiológico pelo método de difusão em ágar.
4.3.1.1. Material e método
A partir de parâmetros especificados em ensaios com agentes antimicrobianos
como esparfloxacino (MARONA e SCHAPOVAL, 1998), gatifloxacino (SALGADO et
al., 2006), lomefloxacino (GOMES e SALGADO 2006), foram realizados testes
preliminares para padronizar as condições a serem empregadas. Os parâmetros
estudados encontram-se na Tabela 6.
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47
Tabela 6. Parâmetros testados para avaliação de solução de digluconato de
clorexidina no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar
Parâmetros Descrição
Microrganismo
Bacillus subtilis ATCC 9372
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Meios de cultura ágar Mueller Hinton
ágar Brain Heart Infusion (BHI)
Diluente solução tampão fosfato pH 6,8
água deionizada
Concentração da solução padrão
1,0; 2,0 e 4,0%
1,5; 3,0 e 6,0%
0,25; 1,0 e 4,0%
0,5; 1,5 e 4,5%
0,33; 1,0 e 2,0%
Concentração do inóculo 0,5% e 1,0%
4.3.1.2. Execução do ensaio
De acordo com os resultados obtidos com os diferentes microrganismos e
meios de cultura foi possível estabelecer parâmetros para realização do doseamento
microbiológico, que estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Parâmetros definidos para o ensaio microbiológico pelo método de difusão
em ágar, a serem utilizados para análise quantitativa de solução de digluconato de
clorexidina
Parâmetros Descrição
Microrganismo
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Meio de cultura ágar Brain Heart Infusion (BHI)
Diluente água deionizada
Concentração da solução padrão
0,5; 1,5 e 4,5%
Concentração do inóculo 1,0%
Temperatura de incubação 35 ± 1 ºC
Tempo de incubação 20 horas
Controle de qualidade
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48
4.3.1.3. Preparo das soluções-padrão da solução de digluconato de clorexidina
Foram transferidos 250,0 µL, 750,0 µL e 2250,0 µL de solução de digluconato
de clorexidina padrão secundário a 20% para balões volumétricos de 10,0 mL e
completou-se o volume com água deionizada estéril, obtendo-se concentrações finais
de 0,5; 1,5 e 4,5%.
4.3.1.4. Preparo das soluções de digluconato de clorexidina substância amostra
As soluções amostras foram preparadas como no item 4.3.1.3, porém,
utilizando solução amostra de digluconato de clorexidina a 20%.
4.3.1.5. Material
Para o doseamento microbiológico, foi utilizado o meio de cultura ágar Casoy
para manutenção da cepa do microrganismo em tubos com meio inclinado, meio de
cultura ágar BHI como camada base e camada de superfície contendo o inóculo e
caldo BHI para preparo e padronização do inóculo. Os meios de cultura, água
deionizada e ponteiras foram esterilizados em autoclave por 15 minutos a 121 ºC.
Foram empregadas placas de Petri com 20,0 mm de altura x 100,0 mm de
diâmetro, sendo que nas tampas foi colocado papel de filtro para impedir que
gotículas de condensação invalidassem ou dificultassem a leitura dos halos de
inibição. Estes materiais e vidraria não volumétrica foram esterilizados em estufa a
180 ºC por 1 hora.
4.3.1.6. Preparo do inóculo
O microrganismo-teste Staphylococcus aureus ATCC 25923, mantido em ágar
Casoy inclinado em tubo de ensaio, foi repicado para caldo BHI e incubado por 24
horas a 35 ºC ± 1 ºC para padronização do inóculo realizada em espectrofotômetro a
580 nm com transmitância de 25% ± 2% (F. Bras., 1988). Após a padronização, o
inóculo foi utilizado a 1% em ágar BHI, mantido em banho a 46 ºC ± 1 ºC. Os meios
de cultura foram preparados como indicado no rótulo do fabricante.
4.3.1.7. Ensaio
A camada base de 20,0 mL de ágar BHI foi adicionada às placas de Petri.
Após sua solidificação, foram adicionados 5,0 mL de ágar BHI com inóculo a 1% (v/v),
com auxílio de pipetador automático. Após a solidificação desta camada, foi colocado
Controle de qualidade
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49
o template em cada placa, cujos orifícios foram preenchidos com 200,0 µL das
soluções descritas nos itens 4.3.1.3 e 4.3.1.4, como apresentado na Figura 11. As
placas foram incubadas a 35 ± 1 ºC e após 20 horas foram realizadas as medidas dos
diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano, com auxílio de
paquímetro digital. Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar.
Foram preparadas 12 placas.
Figura 11. Esquema do ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar, delineamento
3 x 3, demonstrando a disposição das soluções-padrão (P) e amostra (A) na placa de Petri,
donde P1 (0,5%); P2 (1,5%); P3 (4,5%) e A1 (0,5%); A2 (1,5%) e A3 (4,5%).
4.3.1.8. Resultados
Os resultados dos valores dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento
bacteriano, obtidos para as soluções de diferentes concentrações de solução padrão
secundário e solução amostra de digluconato de clorexidina estão na Tabela 8.
P1
P2 P3
A1
A2
A3
Controle de qualidade
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50
Tabela 8. Valores dos diâmetros dos halos de inibição de crescimento obtidos com a
solução de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiológico pelo método de
difusão em ágar
concentração
(%)
diâmetro dos halos de
inibição (mm)*
diâmetro médio ±
e.p.m. **
DPR%***
P1
0,5
19,32 – 19,31
19,28 – 19,27
19,30 – 19,31
19,30 ± 0,0079 0,09
P2
1,5
20,81 – 20,79
20,79 – 20,83
20,84 – 20,82
20,81 ± 0,0084 0,09
P3
4,5
22,33 – 22,37
22,39 – 22,38
22,36 – 22,38
22,37 ± 0,0087 0,09
A1
0,5
19,24 – 19,27
19,23 – 19,23
19,22 – 19,24
19,24 ± 0,0070 0,08
A2
1,5
20,78 – 20,79
20,80 – 20,81
20,75 – 20,77
20,78 ± 0,0088 0,09
A3
4,5
22,30 – 22,29
22,32 – 22,31
22,30 – 22,29
22,30 ± 0,0048
0,05
(*) cada valor do halo de inibição corresponde à média de 6 determinações; (**) e.p.m. - erro
padrão da média e (***) DPR% - desvio padrão relativo percentual
4.3.1.9. Cálculos
4.3.1.9.1. Curva analítica
A reta foi construída em gráfico logaritmo da concentração versus diâmetro dos
halos de inibição, com as médias dos diâmetros de cada uma das concentrações da
Controle de qualidade
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51
substância padrão secundário. A curva analítica foi construída com os valores da
média do diâmetro das concentrações 0,5; 1,5 e 4,5% (Figura 12).
y = 1,3942Ln(x) + 20,209
R
2
= 1
y = 1,3972Ln(x) + 20,26
R
2
= 0,9999
19,0
19,5
20,0
20,5
21,0
21,5
22,0
22,5
23,0
0,1 1 10
log da concentração
halo de inibição (mm)
p
a
Log. (a)
Log. (p)
Para a construção da curva analítica foram utilizados 3 pontos como
preconizado pela Farmacopéia (1988) com delineamento 3 x 3. A disposição das
soluções-padrão secundário (P) e soluções amostras na placa de Petri após o ensaio
está demonstrada na Figura 13.
Figura 13. Resultado do ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar, da solução
de digluconato de clorexidina em concentrações de 0,5; 1,5 e 4,5% utilizando S. aureus.
4.3.1.9.2. Cálculo da potência do anti-séptico
A potência do anti-séptico foi calculada através da equação de HEWITT (1977)
apresentada na equação 1. Os ensaios foram realizados em dias diferentes, durante
3 dias consecutivos sendo cada ensaio a média de seis determinações, e em cada
dia o teste foi realizado em duplicata, denominando-se ensaios I, II, III, IV, V e VI.
Figura 12. Representação gráfica da curva analítica de solução de digluconato de clorexidina
padrão e amostra, no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar.
Controle de qualidade
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52
Equação de HEWITT
Em que: F = 1/3{(A
1
+A
2
+A
3
) – (P
1
+P
2
+P
3
)}
I = logaritmo da razão das doses
E = ¼ {A
3
+P
3
) – (A
1
+P
1
)}
Os resultados obtidos na determinação de digluconato de clorexidina em
solução no ensaio microbiológico, calculados pela fórmula de HEWITT (1977) estão
apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Valores experimentais obtidos para o doseamento de solução de
digluconato de clorexidina, no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar
dias teor de digluconato de
clorexidina
*
(%)
teor médio ± e.p.m.
**
DPR
(%)***
1 92,54
2 92,59
3 92,61
92,57 ± 0,03
0,05
(
*) cada valor encontrado é a média de duas leituras, (**) e.p.m., erro padrão da
média, (***) DPR%, desvio padrão relativo percentual.
4.3.1.10. Análise estatística
A equação da reta para representação gráfica da curva analítica foi
determinada através de regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados. Para
a construção da curva analítica foram utilizados três pontos, cada um representando
a média de três determinações.
A validação da metodologia foi realizada pela análise da variância (ANOVA),
segundo tratamento estatístico preconizado pela Farmacopéia (1988) para ensaio
3 x 3 (Tabela 10).
T/R (%) = Antilog M x 100
M = F/b b = E/I
Equação 1
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53
Tabela 10. Análise da variância dos dados obtidos no ensaio microbiológico com a
solução de digluconato de clorexidina, pelo método de difusão em ágar
Fontes de variação GL
SG QM F
calc
F
tab
Preparação
1 0,025 0,025 67,1* 4,24
Regressão
1 56,427 56,427 154264,9*
4,24
Desvio de paralelismo
1 0,00007
0,00007
0,182 4,24
Quadrático
1 0,00009
0,00009
0,243 4,24
Diferença de quadrático
1 0,00222
0,00222
6,075* 4,24
Desvio de linearidade
2 0,002 0,001 3,159 3,38
Entre doses
5 56,454 11,291 30867,7* 2,6
Entre placas
5 0,00166
0,00033
0,905 2,6
Dentro (erro)
25 0,00914
0,00037
........ .....
Total
35 56,46 ....... ......... .....
significativo para p < 0,5%.
4.3.1.11. Teste de Recuperação
O teste de recuperação foi realizado com o objetivo de determinar a exatidão
do método proposto (AOAC, 1990; BRASIL, 2003).
4.3.1.11.1. Preparo das soluções
O teste de recuperação do método microbiológico foi realizado como no item
4.3.1.7.
No desenvolvimento do teste de recuperação do doseamento microbiológico
foram padronizados valores de 5, 10 e 15% de substância padrão secundário
adicionado na amostra. A solução de substância padrão secundário está com
concentração de 20%. As soluções amostras foram preparadas transferindo-se
250,0; 750,0 e 2250,0 µL de solução de digluconato de clorexidina amostra a 20%
para balões volumétricos de 10,0 mL e o volume foi completado com água deionizada
estéril, obtendo-se concentrações finais de 0,5; 1,5 e 4,5%, respectivamente.
Para a recuperação 1, foram transferidos analiticamente 500,0 µL de solução
padrão secundário para balões volumétricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e
2250,0 µL de solução amostra e os volumes foram completados com água
deionizada. Para a recuperação 2, foram transferidos 1000,0 µL de solução padrão
secundário para cada balões volumétricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e
Controle de qualidade
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54
2250,0 µL de solução amostra e os volumes foram completado com água deionizada.
Para a recuperação 3, foram transferidos 1500,0 µL de solução padrão secundário
para cada balões volumétricos de 10,0 mL contendo 250,0; 750,0 e 2250,0 µL de
solução amostra e os volumes foram completados com água deionizada.
Desta maneira, foram obtidas concentrações teóricas de (amostra + padrão):
• Para o teste de recuperação 1: concentrações de 1,5; 2,5 e 5,5%,
representando os 5% adicionados de padrão secundário.
• Para o teste de recuperação 2: concentrações de 2,5; 3,5 e 6,5%,
representando os 10% adicionados de padrão secundário.
• Para o teste de recuperação 3: concentrações de 3,5; 4,5 e 7,5%,
representando os 15% adicionados de padrão secundário.
• Soluções padrão secundário e amostra: 0,5; 1,5 e 4,5%.
As soluções foram preparadas conforme Tabela 11.
Tabela 11. Preparação das amostras de solução de digluconato de clorexidina no
teste de recuperação no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar
volume de
solução amostra
adicionada (µL)
(20%)
volume de solução
padrão secundário
adicionada (µL)
(20%)
concentração
teórica de
amostra + padrão
( %)
Recuperação 1
Amostra a 0,5%
Amostra a 1,5%
Amostra a 4,5%
250
750
2250
500
500
500
1,5
2,5
5,5
Recuperação 2
Amostra a 0,5%
Amostra a 1,5%
Amostra a 4,5%
250
750
2250
1000
1000
1000
2,5
3,5
6,5
Recuperação 3
Amostra a 0,5%
Amostra a 1,5%
Amostra a 4,5%
250
750
2250
1500
1500
1500
3,5
4,5
7,5
Controle de qualidade
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55
Após a execução do ensaio, as placas foram incubadas em estufa a 35 ºC
± 1 ºC por 20 horas. Em seguida, os halos de inibição de crescimento foram medidos
com auxílio de paquímetro. A potência do anti-séptico foi calculada pela equação de
HEWITT (1977), e a partir do valor encontrado foi calculado o teor de recuperação.
4.3.1.11.2. Cálculo do teste de recuperação
A porcentagem de recuperação (R%) foi calculada de acordo com a expressão
descrita em AOAC (1990) e BRASIL (2003).
Em que: P
F =
potência da substância padrão secundário + amostra
P
A
=
potência da amostra
P
P =
potência da substância padrão secundário adicionada
Os resultados do método microbiológico para determinação de digluconato de
clorexidina estão apresentados na Tabela 12.
Tabela 12. Teste de recuperação de amostras de digluconato de clorexidina, no
ensaio microbiológico pelo método difusão em ágar
atividade percentual
de padrão adicionada
recuperação (%)
recuperação
média (%)
Recuperação 1 5,00 98,6
Recuperação 2
10,00 98,0
Recuperação 3
15,00 100,5
99,03
4.3.1.12. Discussão
O ensaio microbiológico é um método físico em que um microrganismo é
utilizado como revelador. Emprega-se meio de cultura sólido inoculado, distribuído em
placas, em sistema de bicamada, onde a substância teste se difunde (PINTO et al.,
2003).
A fim de assegurar a validade do ensaio microbiológico pelo método de difusão
em ágar na determinação da potência de solução de digluconato de clorexidina,
foram utilizadas três concentrações diferentes para a amostra, idênticas às da
R% = [(P
F
- P
A
)/P
P
] x 100
Equação 2
Controle de qualidade
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56
solução padrão secundário, em delineamento 3 x 3. Estas doses estão em
progressão geométrica (razão 3), já que o sistema utilizado possui relação linear
entre o logaritmo da concentração da substância testada e o diâmetro dos halos de
inibição.
As diluições foram estipuladas de acordo com o tamanho do halo produzido,
sem que houvesse sobreposição dos halos e que fosse mantida a distância entre
eles. O diluente utilizado para preparar as soluções foi água, pois em solução
tampão fosfato pH 6,8, houve precipitação da solução de clorexidina, devido à
incompatibilidade de cargas catiônicas da clorexidina com o fosfato presente na
solução tampão. O B. subtilis mostrou-se menos sensível à clorexidina com formação
de halos menores e não reprodutíveis, por isso deu-se preferência ao S. aureus. A
concentração do inóculo utilizada, previamente padronizado em espectrofotômetro
em 580 nm com 25% ± 2% de transmitância, foi 1%, porque quando se utilizou 0,5%
o crescimento de microrganismos não foi homogêneo. Desta forma, padronizou-se o
ensaio com S. aureus a 1% utilizando-se água como diluente das soluções testadas.
Com os resultados obtidos foi construída a curva analítica das soluções de
clorexidina com concentrações de 0,5%; 1,5% e 4,5%, apresentando coeficiente de
correlação para o padrão igual a 0,9999, sendo que a equação da reta foi y =
1,3972Ln(x) + 20,26. A amostra apresentou coeficiente de correlação igual a 1,
sendo que a equação da reta foi y = 1,3942Ln(x) + 20,209. O valor obtido com os
coeficientes de correlação demonstra que o método é linear.
A precisão do método foi obtida empregando-se 6 determinações de
digluconato de clorexidina em solução aquosa. O desvio padrão relativo foi 2,94% e o
teor de digluconato de clorexidina determinado nas soluções foi calculado pela
equação de HEWITT obtendo teor médio de 92,58% (BRASIL, 2003). Para a solução
de digluconato de clorexidina foi aceito como limite de variação 10%, baseado na
USP (2008), que adota como limite de variação 10% de digluconato de clorexidina em
creme oral. Por se tratar também de um produto não estéril e de uso externo, este
valor foi utilizado como limite.
A exatidão do método foi comprovada pelo teste de recuperação pelo método
de adição, no qual quantidades conhecidas da substância padrão secundário foram
adicionadas às soluções amostras de digluconato de clorexidina para sua
quantificação. A média obtida de 99,03%, demonstrou a exatidão do método
proposto, que é outro requisito obrigatório dos métodos analíticos (BRASIL, 2003).
Controle de qualidade
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
57
4.3.1.13. Conclusão
Diante dos resultados encontrados, o método proposto consiste de uma
técnica simples, sem exigir grande infra-estrutura e que permite indicar a potência do
produto uma vez que apresenta sensibilidade, linearidade, precisão e exatidão
adequadas, de acordo com a F. Bras. (1998) e BRASIL (2003).
5. DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAÇÕES DOS
SABONETES LÍQUIDOS CONTENDO DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA
Desenvolvimento das formulações
_______________________________________________________________________ _____
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59
5.1. Desenvolvimento das diferentes formulações de sabonete líquido com
diferentes concentrações de digluconato de clorexidina
Foram desenvolvidas 4 formulações contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de
clorexidina, totalizando 16 preparações. Houve variação nos tensoativos utilizados
nas formulações, a fim de verificar a atividade anti-séptica da clorexidina associada a
compostos aniônicos e anfóteros.
5.1.2. Material
Os materiais utilizados para preparação das diferentes formulações de
sabonete líquido, bem como seu nome INCI, estão apresentados na Tabela 13.
Tabela 13. Materiais utilizados para as diferentes formulações de sabonete líquido e
seus nomes na INCI
Componentes Nome INCI
Lauriléter sulfato de sódio Sodium laureth sulfate
Cocoamidopropilbetaína Cocamidopropyl betaine
Dietanolamida de ácido graxo de coco
Cocamide dea
Lauroilsarcosinato de sódio Sodium lauroyl sarcosinate
Digluconato de clorexidina Digluconate chlorhexidine
As formulações foram preparadas conforme apresentado nas Tabelas 14 a 17.
Tabela 14. Preparo da formulação codificada como Formulação 1
Lauriléter sulfato de sódio (L.E.S.S.) 25%
Dietanolamida de ácido graxo de coco (amida 90) 3%
Digluconato de clorexidina 1%, 2%, 3%, 4%
Solução de ácido cítrico a 10% qsp pH 6,0 – 6,5
Água (q.s.p.) 100%
Desenvolvimento das formulações
_______________________________________________________________________ _____
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
60
Tabela 15. Preparo da formulação codificada como Formulação 2
Lauriléter sulfato de sódio (L.E.S.S.) 25%
Cocoamidopropilbetaína 5%
Dietanolamida de ácido graxo de coco (amida 90)
3%
Digluconato de clorexidina 1%, 2%, 3%, 4%
Solução de ácido cítrico a 10% qsp pH 6,0 – 6,5
Água (q.s.p.) 100%
Tabela 16. Preparo da formulação codificada como Formulação 3
Lauroilmiristilsarcosinato de sódio (L.M.S.S.) 25%
Dietanolamida de ácido graxo de coco (amida 90)
3%
Digluconato de clorexidina 1%, 2%, 3%, 4%
Solução de ácido cítrico a 10% qsp pH 6,0 – 6,5
Água (q.s.p.) 100%
Tabela 17. Preparo da formulação codificada como Formulação 4
Lauroilmiristilsarcosinato de sódio (L.M.S.S.) 25%
Cocoamidopropilbetaína 5%
Dietanolamida de ácido graxo de coco (amida 90
)
3%
Digluconato de clorexidina 1%, 2%, 3%, 4%
Solução de ácido cítrico a 10% qsp pH 6,0 – 6,5
Água (q.s.p.) 100%
5.1.3. Métodos
Foram preparados 50 g de cada formulação.
Formulação 1. L.E.S.S., amida 90, água e solução de digluconato de clorexidina
foram adicionados em béquer de vidro, com agitação manual com auxílio de bastão
de vidro.
Como o digluconato de clorexidina está em solução a 20%, foi necessário
correção da concentração, ou seja, 1% de digluconato de clorexidina corresponde a
2,5 g de solução de digluconato de clorexidina a 20%; 2% de digluconato de
clorexidina correspondem a 5,0 g de solução de digluconato de clorexidina a 20%; 3%
de digluconato de clorexidina correspondem a 7,5 g de solução de digluconato de
Desenvolvimento das formulações
_______________________________________________________________________ _____
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61
clorexidina a 20% e 4% de digluconato de clorexidina correspondem a 10,0 g de
solução de digluconato de clorexidina a 20%.
Formulação 2. L.E.S.S., amida 90 e água foram adicionados em béquer de vidro,
fase (A). Em outro béquer de vidro, foram colocados cocoamidopropilbetaína e a
solução de digluconato de clorexidina (B). A fase A foi vertida sobre a fase B com
agitação manual com ajuda de bastão de vidro.
Foi feita a correção da concentração como descrito na formulação 1.
Formulação 3. L.M.S.S., amida 90, água e a solução de digluconato de clorexidina
foram adicionados em béquer de vidro, com agitação manual, com ajuda de bastão
de vidro.
Foi realizada a correção da concentração como descrito na formulação 1.
Formulação 4. L.M.S.S., amida 90 e água foram adicionados em um béquer de vidro,
(A). Em outro béquer de vidro, foram colocados cocoamidopropilbetaína e a solução
de digluconato de clorexidina (B). A fase A foi vertida sobre a fase B com agitação
com auxílio de bastão de vidro.
Foi realizada a correção da concentração como descrito na formulação 1.
5.2. Análise qualitativa das formulações desenvolvidas
5.2.1. Aspectos físicos
Na formulação 1, as preparações com 1 e 2% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes, enquanto que as formulações com 3 e 4% de
digluconato de clorexidina apresentaram-se turvas.
Na formulação 2, as preparações com 1 e 2% de digluconato de clorexidina,
apresentaram-se transparentes, enquanto que as formulações com 3 e 4% de
digluconato de clorexidina apresentaram-se turvas.
Na formulação 3, os sabonetes com 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes, com ausência de turvação.
Na formulação 4, os sabonetes com 1, 2 ,3 e 4% de digluconato de clorexidina
apresentaram-se transparentes com ausência de turvação.
Desenvolvimento das formulações
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62
5.2.1.1. Discussão
5.2.1.1.1. Formulações
Apesar de a clorexidina ser considerada um excelente agente anti-séptico, seu
caráter catiônico traz ressalvas à sua associação a sistemas com caráter aniônico
como os sabões e os detergentes sintéticos. A manifestação deste tipo de interação
pode ser normalmente visualizada por uma simples turvação do sistema, até
situações em que o sistema perde a homogeneidade e pode-se detectar visualmente
nítida precipitação. Em tais situações, o principal questionamento diz respeito ao
poder anti-séptico. Como os sabonetes líquidos atuais são baseados em
concentrações significativas de detergentes aniônicos, e considerando-se a possível
interação do detergente com a clorexidina, a possibilidade de interação com
manifestada turvação e ou precipitação constitui-se em uma realidade que somente
pode ser contornada pelos ajustes de concentração da clorexidina e ou pela inclusão
de matérias-primas capazes de sustentarem homogeneidade do sistema e
manutenção da possível transparência. Os ajustes quantitativos da clorexidina
podem, do ponto de vista técnico, ser realizados com bastante facilidade. Porém, isto
não garante a manutenção da atividade antibacteriana e antifúngica.
A adição de tensoativo anfótero pode contribuir para manutenção da atividade
da substância ativa, uma vez que contribui para minimizar a interação do complexo
aniônico-catiônico formado entre a substância ativa e o tensoativo utilizado, mas esta
atividade será averiguada posteriormente no ensaio de determinação da atividade
antimicrobiana dos sabonetes líquidos preparados.
Os tensoativos sarcosinatos são agentes de limpeza com boa substantividade
para pele e cabelo, sendo usados em xampus e vários tipos de produtos para limpeza
das mãos (RIEGER, 1993).
A associação da clorexidina com o tensoativo sarcosinato pode resultar em um
complexo inativo, mas solúvel no excesso de tensoativo aniônico ou então a
clorexidina permanece ativa em combinação com o sarcosinato (HART, LEVY, 1977).
5.2.1.1.2. Formulação 1
O LESS é tensoativo aniônico e por isso é incompatível com a clorexidina
causando a turvação no sabonete; já a dietanolamida do ácido graxo de coco (amida
90) é um tensoativo não iônico, importante para manutenção de viscosidade,
Desenvolvimento das formulações
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
63
sobreengorduramento e qualidade de espuma da preparação, melhorando a
formulação. Possivelmente, o excesso de tensoativo aniônico, frente à baixa
concentração de clorexidina (1% e 2%), consiga solubilizar o complexo aniônico-
catiônico formado, fato que já não é mais verificado a partir de concentrações mais
elevadas de clorexidina, como no caso de 3% e 4%, resultando em turvação (HART,
LEVY, 1977).
5.2.1.1.3. Formulação 2
Ocorrem as mesmas interações observadas na formulação 1, entretanto a
presença de cocoamidopropilbetaína, que é um tensoativo anfótero, permite uma
melhor compatibilidade entre a clorexidina e o LESS, o que possivelmente contribua
para manutenção de sua atividade. A turvação é verificada quando se aumenta a
concentração de clorexidina, porque o tensoativo já não mais consegue solubilizar o
complexo aniônico-catiônico formado (HART, LEVY, 1977).
Os detergentes anfóteros são mais caros, com baixo poder de espuma e pouca
viscosidade. Portanto, se fosse preparado o sabonete líquido apenas com esta
substância, seria obtido um produto com menos interação com a substância ativa. No
entanto, este produto tem elevado custo, dificultando a sua projeção comercial. Desta
forma é necessária, a sua associação aos detergentes aniônicos que são
economicamente mais acessíveis, com alta qualidade de espuma e alta reserva de
viscosidade.
5.2.1.1.4. Formulação 3
O LMSS é um tensoativo aniônico, que, teoricamente, também possibilita a
formação de complexo aniônico-catiônico, permitindo, porém que o sistema receba
maiores concentrações de clorexidina sem manifestação de turbidez e ou
precipitação para as concentrações propostas (HART, LEVY, 1977). Possivelmente
sua estrutura química consegue solubilizar tal complexo produzido, até mesmo
quando se têm concentrações mais elevadas de clorexidina e por isso não se
visualiza a turvação nesta formulação.
5.2.1.1.5. Formulação 4
As interações são as mesmas observadas na formulação 3, mas com a adição
de cocoamidopropilbetaína pode haver uma melhora ainda maior na manutenção do
Desenvolvimento das formulações
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sistema, manifestado visualmente pela ausência de turvação e, sugerindo que a
atividade anti-séptica da clorexidina seja menos prejudicada. Entretanto, se fosse
preparado o sabonete líquido apenas com esta substância, as mesmas condições em
relação aos detergentes anfóteros apresentadas na formulação 2 seriam verificadas.
5.2.2. Determinação de pH
5.2.2.1. Material e método
O pH dos sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina foi medido
em peagômetro especificado na lista de equipamentos (p. xxvi, item 8), e para tal os
sabonetes foram diluídos 1:10 em água, por serem viscosos e não permitir a leitura
pelo eletrodo.
5.2.2.2. Resultados
O pH dos sabonetes líquidos estava entre 8,0 e 9,0. Como este valor de pH
não é o ideal para clorexidina (o ideal é entre 5,5 e 7,0 como foi visto no item 2.1), e
para a pele, então foi realizada a correção do pH com solução de ácido cítrico a 10%
até que atingisse valor entre 6,0 e 6,5, que é condizente com o ativo e com a pele.
5.2.3. Determinação da viscosidade
Foi verificada em viscosímetro de Brookfield, utilizando-se haste L1 para os
sabonetes das formulações 1, 3 e 4 e haste L2 para a formulação 2, que por ser mais
viscosa e não permitiu leitura com haste L1.
5.2.3.1. Resultados
Os resultados da viscosidade obtida com os sabonetes líquidos contendo
digluconato de clorexidina estão apresentados na Tabela 18.
Desenvolvimento das formulações
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Tabela 18. Valores de viscosidade obtidos com os sabonetes líquidos contendo
digluconato de clorexidina em viscosímetro de Brookfield
Amostra *
Valor de viscosidade em mili Pascal
1a 20
1b 547
1c 590
1d 499
2a 9859
2b 220
2c 219
2d 109
3a 7
3b 8
3c 38
3d 1231
4a 8
4b 10
4c 159
4d 1080
* Os números indicam a formulação e as letras indicam a concentração da solução de
digluconato de clorexidina presente em cada sabonete líquido, assim, 1 é formulação 1; 2 é
formulação 2; 3 é formulação 3 e 4 é formulação 4; a, b, c, d indicam a concentração de 1, 2,
3 e 4% de digluconato de clorexidina respectivamente.
5.2.3.2. Discussão
A diferença entre as viscosidades deve-se à presença da clorexidina nas
diferentes formulações, em diferentes concentrações.
Na formulação 1, o aumento de viscosidade nas preparações com 1% e 2% de
digluconato de clorexidina é devido ao sistema micelar do tensoativo que intumesce
suas micelas, e ao adicionar maior quantidade de clorexidina, o sistema permanece
estável porque as micelas não incham mais por já terem atingido sua estabilidade
(WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
Na formulação 2 ocorrem as mesmas interações observadas na formulação 1,
entretanto a presença de cocoamidopropilbetaína aumenta o tamanho das micelas,
favorecendo a organização do sistema e, consequentemente, o aumento de
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viscosidade (com 1% de clorexidina). A partir de concentrações mais elevadas de
substância ativa, as micelas do componente anfótero não suportam o excesso de
clorexidina e o sistema perde viscosidade (WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
Nas formulações 3 e 4 com 1% e 2% de dilguconato de clorexidina não há
aumento considerável da viscosidade, pois as micelas ainda não incharam
suficientemente, entretanto, ao elevar a concentração de clorexidina para 3% e 4% há
aumento da viscosidade devido ao sistema micelar do tensoativo que intumesce suas
micelas.
A viscosidade se mantém mais estável nas formulações 3 e 4, provavelmente
devido à melhor manutenção do sistema com uso de tensoativo aniônico sarcosinato,
que possibilita a formação de complexo aniônico-catiônico estruturalmente mais
compatível com a clorexidina (WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
5.3. Controle microbiológico das formulações desenvolvidas
O objetivo deste ensaio foi avaliar a qualidade microbiológica dos sabonetes
líquidos, bem como verificar a sua concordância com a legislação vigente.
5.3.1. Material e método
5.3.1.1. Contagem do número total de microrganismos viáveis
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulação para 90,0 mL
de solução tampão fosfato pH 7,2, para a contagem dos microrganismos totais. As
amostras 1:10 foram agitadas em vortex por 10 min. Após, em placas de Petri
previamente esterilizadas, foi pipetado 1,0 mL de cada amostra 1:10 e adicionado
20,0 mL ágar tioglicolato para bactérias e ágar Sabouraud para leveduras,
previamente esterilizados e mantidos a 46
o
C ± 1 ºC. Após solidificação dos meios, as
placas foram colocadas em estufa a 35 ºC ± 1
o
C por 48 h para a pesquisa de
bactérias e 25 ºC ± 1
o
C por 7 dias para fungos. Este ensaio foi realizado em triplicata
e as placas foram incubadas em posição invertida (PINTO et al., 2003). Os meios de
cultura foram preparados como indicado no rótulo pelo fabricante.
5.3.1.2. Pesquisa de Salmonella ssp e Escherichia coli
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulação para 90,0 mL de
caldo lactosado, para pesquisa de Salmonella spp e Escherichia coli, incubados a
Desenvolvimento das formulações
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35 ºC ± 1
o
C durante 24 h. Após, 1 mL do caldo lactosado foi transferido para 1 tubo
contendo caldo tetrationato e 1 tubo contendo caldo selenito cistina, e incubados a
35 ºC ± 1
o
C por 24 h. Após, a amostra foi semeada do caldo tetrationato para 1 tubo
contendo ágar verde brilhante (VB) e duas placas de Petri contendo ágar xilose-lisina-
desoxicolato (XLD) e duas placas de Petri com ágar bismuto sulfito (BS). Foi
realizado da mesma forma com a amostra inoculada no caldo selenito cistina,
transferindo para os três meios, os quais foram incubados a 35 ºC ± 1
o
C por 24 h,
sendo que as placas foram incubadas em posição invertida. As colônias suspeitas
foram semeadas com alça reta em tubo contendo ágar tríplice açúcar-ferro (TSI) e
incubado a 35 ºC ± 1
o
C por 24 h. A confirmação da Salmonella spp, quando
presente, é feita pela técnica de Gram.
Na pesquisa de E. coli, 1,0 mL do caldo lactosado foi transferido para placa
contendo ágar Mac Conkey e incubado a 35 ºC ± 1
o
C por 24 h. As colônias suspeitas
foram semeadas em ágar eosina-azul de metileno (EMB) e incubadas a 35 ºC ± 1
o
C
por 24 h. A confirmação de E. coli, quando presente, é feita pelo método de Gram. As
placas foram incubadas em posição invertida (PINTO et al., 2003). Os meios de
cultura foram preparados como indicado no rótulo pelo fabricante.
5.3.1.3. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa
Foram transferidos, assepticamente, 10,0 g de cada formulação para 90 mL de
caldo soja-caseína, para a pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa e incubados a 35 ºC ± 1
o
C por 24 h. Após, 1,0 mL foi semeado em placa
de Petri contendo ágar Vogel Johnson (VJ), para a pesquisa de S. aureus e em placa
de Petri com ágar cetrimida, para a pesquisa de P. aeruginosa a 35 ºC ± 1
o
C por
24 h, sendo que as placas foram incubadas em posição invertida (PINTO et al.,
2003). Os meios de cultura foram preparados como indicado no rótulo pelo fabricante.
A confirmação das bactérias foi feita pelo método de Gram.
5.3.2. Resultados
Os resultados obtidos na análise microbiológicao das formulações
desenvolvidas permitiram observar que não houve crescimento de microrganismos na
contagem do número total de bactérias e fungos e também não houve presença das
bactérias pesquisadas.
Desenvolvimento das formulações
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
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5.3.3. Discussão
Em produtos não estéreis é aceitável a presença de carga microbiana dentro
dos limites recomendados pela RDC 481 de 23 de setembro de 1999, da ANVISA,
mas com ausência de determinadas cepas patogênicas. O controle de qualidade
microbiológico destes produtos assegura que a carga microbiana presente não
comprometa sua qualidade final, e nem coloque em risco a saúde do consumidor.
Para produtos farmacêuticos, o número total de microrganismos presentes
deve ser inferior a 10
2
a 10
3
UFC/g (mL) ou, no máximo, 5 x 10
2
a 5 x 10
3
UFC/g (mL)
de amostra e não apresentar S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli. Para
produtos cosméticos, há uma classificação, na qual produtos cosméticos tipo I (para
área dos olhos, para bebês e para peles com acnes), o limite é 10
2
ou, no máximo,
5 x 10
2
UFC/g (mL) de microrganismos totais aeróbicos e no caso de talcos, ausência
de clostrídios sulfito-redutores; e para produtos do tipo II (produtos para demais áreas
do corpo), é 10
3
ou, no máximo, 5 x 10
3
UFC/g (mL) de amostra. Para os dois tipos é
exigida a ausência de S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli (F. Bras.,
1988; BRASIL, 1999; PINTO et al., 2003; ANDRADE et al., 2005).
A contagem do número total de microrganismos foi realizada pela técnica de
pour plate por proporcionar crescimento de microrganismos aeróbios e anaeróbios.
6. ENSAIOS DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS
SABONETES LÍQUIDOS DESENVOLVIDOS CONTENDO
DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA
Ensaios de atividade antimicrobiana
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O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a atividade antimicrobiana in
vitro das formulações desenvolvidas de sabonetes líquidos contendo digluconato de
clorexidina em diferentes concentrações sobre bactérias patogênicas e fungos de
importância em saúde pública tais como Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecalis e Candida albicans, pois, embora a clorexidina tenha eficácia
antimicrobiana comprovada, é necessário demonstrar se tal eficácia se mantém no
produto desenvolvido, tendo em vista a possibilidade de inativação da clorexidina por
componentes da formulação.
6.1. Métodos
6.1.1. Técnica de difusão em ágar
É também chamada de método indireto para determinação da atividade
antimicrobiana ou método de Kirby e Bauer, que a desenvolveu nos anos de 1960
(TRABULSI, 1991). O potencial antimicrobiano se mostra nas áreas de inibição de
crescimento, em que uma placa com ágar nutriente é inoculada com o
microrganismo-teste e o antimicrobiano é disposto em pontos equidistantes na placa
com auxílio de discos de papel ou cilindros de aço inoxidável ou de vidro. Após
incubação por 24 a 48 h, se observa a formação de halo de inibição de crescimento
ao redor da substância testada (ALCAMO, 2001; TORTORA et al., 2005).
6.1.2. Técnica de microdiluição
Este método foi validado em 1992 e constitui uma técnica que emprega placas
de 96 poços com a transferência seriada de 100 µL entre produto a ser analisado e
caldo, totalizando 200 µL de volume em cada poço entre o microrganismo a ser
testado e a concentração do produto a ser analisado. A microplaca é incubada a
36 ºC ± 1 ºC durante 24-48 h. Depois deste período, é analisada visualmente e/ou
espectrofotometricamente quanto ao crescimento microbiano, através da turvação do
meio de cultura (KOLODZIEJ et al., 1999). Também pode ser realizada leitura através
do uso de corante. A diluição que não apresentar turvação indica a concentração
capaz de inibir o crescimento do microrganismo teste (PELCZAR et al., 1997).
Ensaios de atividade antimicrobiana
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6.1.3. Microrganismos utilizados
Foram utilizados isolados de bactérias e leveduras de coleções padrões da
American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Instituto Adolfo Lutz (IAL) (IAL 1606), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228 IAL
2150), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 IAL 1028), Enterococcus faecalis
(ATCC 10541), Escherichia coli (ATCC 25922 IAL 2393), Salmonella spp (ATCC 19196)
e Candida albicans (ATCC 64548).
6.2. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar
6.2.1. Material e método
6.2.1.1. Preparo do inóculo
6.2.1.1.1. Padronização da suspensão bacteriana
O inóculo de cada bactéria utilizada neste ensaio foi adaptado e padronizado de
acordo com os trabalhos realizados por Melo e colaboradores (2006), Souza e
colaboradores (2007), Alvarenga e colaboradores (2007) e segundo o documento do
NCCLS (2003). Cultura de colônias isoladas de cada bactéria foi obtida em caldo BHI
por 24 horas a 35 ºC ± 1 ºC. Em seguida, foi transferida uma alíquota deste inóculo
para solução salina estéril e então foi ajustada a turvação até o tubo 0,5 da escala
McFarland (1,5 x 10
8
UFC/mL).
6.2.1.1.2. Padronização da suspensão fúngica
O inóculo da levedura utilizada neste ensaio foi adaptado dos trabalhos
realizados por Lima e colaboradores (2006) e por Antunes e colaboradores (2006).
Cultura de colônias isoladas de C. albicans foi obtida em caldo Sabouraud por 24 horas
a 35 ºC ± 1 ºC. Em seguida, foi transferida uma alíquota deste inóculo para solução
salina estéril e então foi ajustada a turvação até o tubo 0,5 da escala McFarland (1,5 x
10
8
UFC/mL).
Ensaios de atividade antimicrobiana
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6.2.1.1.3. Padronização e adaptação dos ensaios de atividade antimicrobiana dos
diferentes sabonetes líquidos contendo 1, 2, 3, e 4% de digluconato de
clorexidina, pelo método de difusão em ágar
Os ensaios de atividade antimicrobiana dos diferentes sabonetes líquidos
contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, pelo método de difusão em ágar,
foram realizados de acordo com método de Kirby-Bauer, porém modificado, no qual
foram utilizados ágar BHI e ágar Sabouraud para bactérias e fungos, respectivamente.
Foram utilizados templates de aço inoxidável, em que 200 µL de cada sabonete foram
adicionados em cada orifício. Foi realizado um controle adicionando 200 µL de solução
de digluconato de clorexidina a 1%, a fim de verificar se tais microrganismos são
sensíveis a este anti-séptico e também foram adicionados 200 µL de cada preparação
de sabonete líquido sem o anti-séptico, a fim de verificar se apenas o sabonete possui
alguma atividade antimicrobiana sobre os microrganismos testados.
Foram preparados, para cada placa, 20 mL de ágar como camada base e 5,0 mL
de ágar para camada de superfície. Ao ágar superfície esterilizado e mantido líquido a
46 ºC ± 1 ºC, foram adicionados 10% do inóculo previamente padronizado. Após
solidificação, foi colocado em cada placa o template sobre o ágar. Em cada orifício foi
transferida uma alíquota de cada amostra como descrito anteriormente. As placas
foram deixadas em geladeira a 8 ºC ±
1 ºC por
2 horas para que ocorresse difusão dos
sabonetes no ágar, e impedisse o desenvolvimento microbiano. A seguir, as placas
foram incubadas por 24 horas a 35 ºC ± 1º C. Foram feitas três placas para cada
formulação com 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, solução de clorexidina a 1%
e sabonete sem o anti-séptico para cada microrganismo testado, totalizando 72 placas
para bactérias e 12 placas para fungo. Os resultados dos halos de inibição de
crescimento foram medidos com auxílio de paquímetro digital.
O esquema da distribuição das amostras está apresentado na Figura 14.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Figura 14. Esquema da disposição dos sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina,
sabonete líquido base (sem o ativo) e a solução de digluconato de clorexidina a 1%, na placa
de Petri para o ensaio de atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar.
6.2.2. Resultados
A Tabela 19 apresenta os resultados obtidos no ensaio de atividade
antimicrobiana pelo método de difusão em ágar.
Sab
base
CHX
1%
4%
3%
2%
1%
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Tabela 19. Valores em mm dos halos de inibição de crescimento obtidos no ensaio de
atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar
diâmetro dos halos de inibição (mm)
S. aureus P. aeruginosa
E. coli Salmonella
spp
S. epidermidis E. faecalis C. albicans
Sab. 1
- - - - - - -
1a
- - - - - - -
1b
- - - - - - -
1c
- - - - - - -
1d
- - - - - - -
CHX 1%
18,57 ± 0,03
14,20 ± 0,01 12,72 ± 0,03
14,90 ± 0,02
20,09 ± 0,02 29,15 ± 0,01
8,30 ± 0,03
Sab. 2
- - - - - - -
2a
- - - - - - -
2b
- - - - - - -
2c
- - - - - - -
2d
- - - - - - -
CHX 1%
18,53 ± 0,04
14,18 ± 0,03 12,80 ± 0,04
14,92 ± 0,03
20,12 ± 0,02 29,26 ± 0,03
8,14 ± 0,02
Sab. 3
21,32 ± 0,03
- - - 20,24 ± 0,03 29,24 ± 0,03
-
3a
17,35 ± 0,02
- - - 22,57 ± 0,04 23,91 ± 0,03
-
3b
15,60 ± 0,02
- - - 16,49 ± 0,03 18,04 ± 0,04
-
3c
- - - - - - -
3d
- - - - - - -
CHX 1%
18,55 ± 0,02
14,15 ± 0,02 12,88 ± 0,01
14,80 ± 0,02
20,14 ± 0,04 29,27 ± 0,02
8,36 ± 0,03
Sab. 4
21,90 ± 0,02
16,30 ± 0,02 - - 19,80 ± 0,02 28,32 ± 0,04
-
4a
17,80 ± 0,02
15,90 ± 0,03 - - 18,16 ± 0,04 22,74 ± 0,03
-
4b
13,60 ± 0,03
12,60 ± 0,02 - - 10,65 ± 0,03 17,10 ± 0,04
-
4c
- - - - - - -
4d
- - - - - - -
CHX 1%
18,48 ± 0,03
14,11 ± 0,03 12,50 ± 0,03
14,96 ± 0,02
20,20 ± 0,03 29,20 ± 0,05
8,28 ± 0,02
(Sab. 1), Sabonete base, sem adição de digluconato de clorexidina; (Sab. 2), Sabonete base, sem adição
de digluconato de clorexidina; (Sab. 3), Sabonete base, sem adição de digluconato de clorexidina, (Sab.
4), Sabonete base, sem adição de digluconato de clorexidina; (-), indica ausência de halo de inibição;
(CHX 1%), solução de digluconato de clorexidina a 1%; os números indicam a formulação; as letras
indicam a concentração de clorexidina, ou seja, a, 1%; b, 2%; c, 3% e d, 4% de clorexidina presente em
cada formulação. Os valores são médias de três determinações.
Os resultados podem ser visualizados nas Figuras 15 a 18.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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1
2
3
4
b
Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a S. aureus (a) e E.
faecalis (b), em que: 1, sabonetes base e formulação 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
2, sabonetes base e formulação 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e
formulação 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulação 4
contendo %1, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos há solução de digluconato de clorexidina a
1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
1
2
a
3
4
c
Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a E. coli (c) e C. albicans (d)
, em
que: 1, sabonetes base e formulação 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2, sabonetes base e e e
formulação 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e
formulação 3 contendo %,
1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulação 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de de
clorexidina e em todos há solução de digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na
Figura 14.
4
4
2
2
1
1
3
3
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
76
Figura 17. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a Salmonella
spp
(e)
e P. aeruginosa (f), em que: 1, sabonetes base e da formulação 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4%
de clorexidina; 2, sabonetes base e da formulação 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
3, sabonetes base e da formulação 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes
base e da formulação 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos há solução de
digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
Figura 18. Ensaio de atividade antimicrobiana por difusão em ágar frente a S. epidermidis (g),
em que: 1, sabonetes base e da formulação 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2,
sabonetes base e da formulação 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes
base e da formulação 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e da
formulação 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos há solução de digluconato
de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
3
3
4
4
f
2
2
1
1
e
1
4
2
3
g
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
77
6.2.3. Discussão
A escolha do produto ideal com a finalidade de impedir ou inibir o crescimento
microbiano tem sido motivo de grande preocupação entre os profissionais da saúde,
especialmente, considerando a diversidade de produtos, grande oferta de mercado e
variações de orientações quanto às indicações e ao uso (ANDRADE et al., 2007). Os
produtos com este objetivo devem apresentar amplo espectro de ação, menor
toxicidade, menor custo e menor indício de resistência bacteriana (ALVARENGA et
al., 2007). Alguns são ativos contra um grande número de microrganismos, enquanto
outros podem ser ativos contra poucas espécies. Entretanto, não há um
antimicrobiano ideal para todas as finalidades, por isso se faz necessário o estudo de
vantagens e desvantagens de certo antimicrobiano em cada situação em que seu uso
se faz útil (PELCZAR et al., 1997).
A clorexidina é um anti-séptico com largo espectro de ação como já foi dito na
introdução deste trabalho e diversos estudos têm sido realizados a fim de verificar sua
atividade antimicrobiana (GOMES et al., 2001; SASSONE et al., 2003; ESTRELA et al.,
2004; SEABRA et al., 2005; MOREIRA, WANDERLEY-CRUZ, 2005; TANOMARU et al.,
2005; BUXBAUM et al., 2006; TANOMARU et al., 2007).
Os sabonetes foram preparados sem adição de conservantes para que não
houvesse interferência nos resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana.
No ensaio de atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar, as
formulações 1 e 2, que contêm lauriléter sulfato de sódio, não apresentaram halo de
inibição de crescimento frente aos microrganismos testados, provavelmente por não
conseguirem se difundir no ágar devido à viscosidade destas formulações com maiores
concentrações de clorexidina, pode ter havido interferência entre a carga do tensoativo
e o pH do meio de cultura sólido, entre a concentração de clorexidina e o pH do meio
de cultura sólido e entre o tensoativo e a clorexidina, formando um complexo aniônico-
catiônico que impediu a difusão da clorexidina no ágar.
A solução aquosa de digluconato de clorexidina a 1% formou halo de inibição de
crescimento demostrando que tal substância possui atividade sobre estes
microrganismos, como é citado na literatura (GOMES et al., 2001; ESTRELA et al.,
2003 b; ESTRELA et al., 2004; RADEVA et al., 2005; TANOMARU et al., 2005;
BUXBAUM et al., 2006), e que em baixa concentração neste veículo não há
interferência com o meio de cultura sólido.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
78
Para os microrganismos S. aureus, S. epidermidis e E. faecalis, as formulações 3
e 4, que contêm lauroilmiristilsarcosinato de sódio, apresentaram halos de inibição de
crescimento microbiano para o sabonete sem adição do anti-séptico, com 1 e 2% de
clorexidina, em tamanho decrescente respectivamente. Esta diminuição da atividade
inclusive em relação ao sabonete base pode ser devido ao aumento da viscosidade ao
elevar a concentração de clorexidina e isso dificultou a difusão, ao aumento das
interações das maiores concentrações da clorexidina com o pH do meio de cultura
sólido e devido às interações da clorexidina com o tensoativo, pois apesar de o
lauroilmiristil ser estruturalmente mais compatível com a clorexidina, pode ser que com
as concentrações mais elevadas do ativo houve formação de complexo aniônico-
catiônico que impediu a difusão da clorexidina no ágar. Estas dificuldades podem ser a
causa de também não ter havido formação de halo de inibição de crescimento para os
sabonetes líquidos com 3 e 4% de clorexidina.
Frente à P. aeruginosa (Figura 17 f), apenas a formulação 4 mostrou halo de
inibição de crescimento no ensaio por difusão em ágar para os sabonetes base,
sabonetes com 1 e 2% de clorexidina, entretanto para o sabonete líquido contendo 2%
de ativo, o halo de inibição de crescimento foi menor, provavelmente pelo motivo do
aumento da viscosidade e das interações destas formulações com aumento de princípio
ativo.
Em nenhuma formulação houve formação de halo de inibição de crescimento
frente aos microrganismos E. coli, Salmonella spp e C. albicans, mas houve formação
de halo de inibição de crescimento para a solução de digluconato de clorexidina a 1%,
evidenciando que estes microrganismos são sensíveis ao anti-séptico em estudo.
Entretanto, a C. albicans mostrou halo de inibição de crescimento menor, mas de
acordo com a literatura, este microrganismo também é sensível à clorexidina (KABARA,
1984; CANDIDO et al., 1996; FARIA et al., 2003; ESTRELA et al., 2003b; IMBERT et
al., 2003; ESTRELA et al., 2004).
O fato de ter havido formação de halo de inibição de crescimento para os
sabonetes das formulações 3 e 4 (que contêm lauroilmiristilsarcosinato de sódio) e não
ter havido halo de inibição de crescimento microbiano para os sabonetes das
formulações 1 e 2 (que contêm lauriléter sulfato de sódio), pode ser porque o tensoativo
sarcosinato apresentou menor interação com o meio de cultura sólido e melhor
atividade antimicrobiana em relação ao lauriléter, uma vez que Balsam e colaboradores
(1972), relatam a redução de 20 a 30% na incidência de cáries quando os indivíduos
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
79
utilizaram dentifrícios contendo 2% de lauroilmiristilsarcosinato de sódio em relação ao
grupo controle com outros dentifrícios.
O excesso de clorexidina eleva o custo do produto, eleva o risco de toxicidade ao
paciente e eleva o risco de desenvolvimento de resistência bacteriana. Thomas e
colaboradores (2000) mencionam que uma maneira de haver resistência à clorexidina é
o modo como é usada, por exemplo, clorexidina a 4% geralmente é especificado, mas
após o uso, uma concentração residual pode permanecer abaixo da concentração
inibitória mínima para algumas bactérias, que podem desenvolver resistência.
Os microrganismos mais sensíveis aos sabonetes foram S. aureus, S.
epidermidis e E. faecalis, enquanto que os mais resistentes foram Salmonella spp, E.
coli e P. aeruginosa, dados que corroboram com a literatura, que diz que a clorexidina é
mais ativa frente a microrganismos Gram-positivos e menos ativa frente a
microrganismos Gram-negativos (HENESSEY, 1973; SILVA et al., 2000; SILVA,
JORGE, 2002; ESTRELA et al., 2003a).
Com a finalidade de facilitar a difusão dos sabonetes no ágar, foi adicionado 1%
e 2% de dimetilsulfóxido (DMSO) aos sabonetes, entretanto os resultados obtidos não
demonstraram alteração nos valores dos halos de inibição microbiana encontrados.
6.2.4. Conclusão
Diante dos resultados, a técnica de difusão em ágar foi ineficaz para analisar as
formulações pelo fato de a difusão no ágar ter sido prejudicada pela viscosidade, pelas
possíveis interações entre o tensoativo e o meio de cultura, entre o excesso de
clorexidina e o pH do meio de cultura e entre a clorexidina e o tensoativo. O resultado
apresentado pode ser falso negativo, sendo que a ausência de formação de halo de
inibição de crescimento pode ser devido à dificuldade de difusão dos produtos no ágar
e não devido realmente à falta de atividade dos produtos em análise.
Os halos de inibição de crescimento microbiano apresentados pelas formulações
3 e 4 são devido ao tensoativo sarcosinato que interagiu menos com o meio de cultura
sólido e possui atividade antimicrobiana superior à do tensoativo lauriléter, pois ao
adicionar maior quantidade de clorexidina, houve diminuição do tamanho dos halos de
inibição de crescimento por causa da interação da clorexidina com o meio de cultura
sólido e com o tensoativo sarcosinato.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
80
6.3. Determinação da atividade antimicrobiana dos sabonetes líquidos
desenvolvidos contendo 1, 2, 3 e 4% de digluconato de clorexidina, pelo método
da microdiluição em caldo
Este ensaio foi realizado no laboratório de Fisiologia de microrganismos da
Universidade Estadual Paulista (UNESP) com a colaboração da Profª. Dra. Taís
Maria Bauab.
6.3.1. Preparo do inóculo
6.3.1.1. Padronização da suspensão bacteriana
Foi realizada de acordo com o documento do NCCLS (2003) em que cultura de
colônias isoladas de cada bactéria foi obtida em caldo BHI por 24 horas a 35 ºC ± 1 ºC.
Em seguida, foi transferida uma alíquota deste inóculo para solução salina estéril e a
turvação foi ajustada até 0,5 da escala McFarland (1,5 x 10
8
UFC/mL).
6.3.1.2. Padronização da suspensão fúngica
Foi realizada segundo o documento do NCCLS (2002), em que uma subcultura
de Candida albicans em tubo de ensaio contendo ágar Sabouraud dextrose foi
incubada a 35 ºC ± 1 ºC durante 24 horas. Em seguida, foram transferidas 5 colônias
com diâmetro de aproximadamente 1 mm para 5 mL de solução salina estéril. Os
tubos foram agitados em vórtex e a densidade foi ajustada em espectrofotômetro em
530 nm, até que se obtivesse transmitância equivalente a 0,5 da escala McFarland
(1,5 x 10
8
células/mL). Logo após, foi feita diluição 1:100 em caldo Sabouraud. Foi
feita uma segunda diluição, sendo 1:20, também em caldo Sabouraud, resultando em
concentração de 5 x 10
2
a 25 x 10
2
células/mL.
6.3.1.3. Padronização e adaptação dos testes de verificação da atividade
antimicrobiana dos sabonetes líquidos contendo digluconato de clorexidina,
através do método da microdiluição
Em placa de 96 poços com fundos chatos, foram pipetados 150 µL de
sabonete puro (sem adição de clorexidina) em dois poços (A1, A2); 150 µL de
sabonete com 1% de clorexidina em dois poços (B1, B2); 150 µL de sabonete com
2% de clorexidina em dois poços (C1, C2); 150 µL de sabonete com 3% de
Ensaios de atividade antimicrobiana
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clorexidina em dois poços (D1, D2); 150 µL de sabonete com 4% de clorexidina em
dois poços (E1, E2); 150 µL de meio de cultura caldo BHI em dois poços (F1, F2); 100
µL de meio de cultura caldo BHI e 50 µL de suspensão bacteriana em solução salina
em dois poços (G1, G2); 100 µL de solução de digluconato de clorexidina a 1% e 50
µL de suspensão bacteriana em solução salina em dois poços (H1, H2); 100 µL de
meio de cultura caldo BHI e 50 µL de sabonete sem clorexidina em dois poços (A3,
B3); 100 µL de meio de cultura caldo BHI e 50 µL de sabonete com 1% de clorexidina
em dois poços (C3, D3); 100 µL de meio de cultura caldo BHI e 50 µL de sabonete
com 2% de clorexidina em dois poços (E3, F3); 100 µL de meio de cultura caldo BHI e
50 µL de sabonete com 3% de clorexidina no poço G3; 100 µL de meio de cultura
caldo BHI e 50 µL de sabonete com 4% de clorexidina no poço H3. Foram pipetados
90 µL de meio de cultura e 10 µL de sabonete com 1% de clorexidina em dois poços
(A4 e B4) e a partir desses poços foi realizada diluição seriada 1:10 até os poços
(A12 e B12), colocando em seguida 50 µL de suspensão bacteriana em solução
salina. Foram pipetados 90 µL de meio de cultura e 10 µL de sabonete com 2% de
clorexidina em dois poços (C4 e D4) e a partir disso foi realizada diluição seriada 1:10
até os poços C12 e D12, colocando em seguida 50 µL de suspensão bacteriana em
solução salina. Nos poços E4 e F4, foram pipetados 90 µL de meio de cultura e 10 µL
de sabonete com 3% de clorexidina e a partir disso foi realizada diluição seriada 1:10
até os poços E12 e F12, colocando em seguida 50 µL de suspensão bacteriana em
solução salina. Foram pipetados 90 µL de meio de cultura e 10 µL de sabonete com
4% de clorexidina em dois poços (G4 e H4) e a partir disso foi realizada diluição
seriada 1:10 até os poços G12 e H12, colocando em seguida 50 µL de suspensão
bacteriana em solução salina. Foi procedida a incubação a 35 ºC ± 1 ºC por 24 horas.
A esquematização do procedimento para a distribuição das amostras encontra-se
apresentada na Figura 19.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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82
Figura 19. Esquema da realização do ensaio de atividade antimicrobiana pelo método de microdiluição
150 µL de sabonete líquido sem clorexidina (controle negativo)
150 µL de sabonete líquido com 1% de clorexidina (controle negativo)
150 µL de sabonete líquido com 2% de clorexidina (controle negativo)
150 µL de sabonete líquido com 3% de clorexidina (controle negativo)
150 µL de sabonete líquido com 4% de clorexidina (controle negativo)
150 µL de caldo BHI (controle negativo)
100 µL de caldo BHI e 50 µL de microrganismo (controle positivo)
100 µL de solução de clorexidina a 1% e 50 µL de microrganismo
100 µL de sabonete líquido sem clorexidina e 50 µL de caldo BHI
100 µL de sabonete líquido com 1% de clorexidina e 50 µL de caldo BHI
100 µL de sabonete líquido com 2% de clorexidina e 50 µL de caldo BHI
100 µL de sabonete líquido com 3% de clorexidina e 50 µL de caldo BHI
100 µL de sabonete líquido com 4% de clorexidina e 50 µL de caldo BHI
90 µL de caldo BHI + 10 µL de sabonete com 1% de clorexidina e diluições + 50 µL de
microrganismo
90 µL de caldo BHI + 10 µL de sabonete com 2% de clorexidina e diluições + 50 µL de
microrganismo
90 µL de caldo BHI + 10 µL de sabonete com 3% de clorexidina e diluições + 50 µL de
microrganismo
90 µL de caldo BHI + 10 µL de sabonete com 4% de clorexidina e diluições + 50 µL de
microrganismo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Ensaios de atividade antimicrobiana
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83
Para a levedura C. albicans, foi realizado o mesmo procedimento, no entanto,
o meio de cultura empregado foi caldo Sabouraud.
A Tabela 20 apresenta a diluição feita para os sabonetes líquidos no ensaio de
atividade antimicrobiana em meio líquido – microdiluição.
Tabela 20. Diluições utilizadas para os sabonetes líquidos no ensaio de atividade
antimicrobiana em meio líquido pelo método da microdiluição
6.3.1.4. Leituras
Depois de 24 horas de incubação, foram realizadas leituras visuais, antes e
após a adição de corante resazurina.
Após a leitura visual, foi realizada subcultura de cada poço da microplaca em
placas de Petri contendo ágar BHI, por meio de hastes estéreis. As placas foram
incubadas por 24 horas a 35 ºC ± 1 ºC, a fim de determinar se a concentração
inibitória mínima (CIM) apresentou efeito bactericida ou bacteriostático.
A resazurina, um corante (fenoxazin-3-ona) indicador de óxido-redução, tem
sido empregada para avaliar a viabilidade bacteriana, (PALOMINO et al., 2002;
MONTEJANO et al., 2005).
A solução de resazurina foi preparada na concentração de 0,1 µg/mL de água
destilada estéril. Em todos os orifícios da microplaca, foram adicionados 30 µL de
corante. Após leitura visual, a microplaca foi reincubada a 35 ºC ± 1 ºC por 2 horas,
mantendo-as até 24 h para confirmação dos resultados. Em seguida, foi realizada
leitura visual final.
DILUIÇÕES DECRESCENTE DAS FORMULAÇÕES
AMOSTRAS
1
2 3 4 5 6 7 8 9
Sab. 1 *
1
1 x10
-1
1 x10
-2
1 x10
-3
1 x10
-4
1 x10
-5
1 x10
-5
1 x10
-7
1 x10
-8
Sab. 2 **
2
2 x10
-1
2 x10
-2
2 x10
-3
2 x10
-4
2 x10
-5
2 x10
-6
2 x10
-7
2 x10
-8
Sab. 3 ***
3
3 x10
-1
3 x10
-2
3 x10
-3
3 x10
-4
3 x10
-5
3 x10
-6
3 x10
-7
3 x10
-8
Sab. 4 ****
4
4 10
-1
4 x10
-2
4 x10
-3
4 x10
-4
4 x10
-5
4 x10
-6
4 x10
-7
4 x10
-8
(*) Sabonete com 1% de digluconato de clorexidina; (**) sabonete com 2% de digluconato de
clorexidina; (***) sabonete com 3% de digluconato de clorexidina; (****) sabonete com 4% de
digluconato de clorexidina
Ensaios de atividade antimicrobiana
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A manutenção de cor azul nos orifícios foi interpretada como ausência do
crescimento microbiano e o desenvolvimento de cor rosa, como presença de células
viáveis em crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração do sabonete
líquido capaz de inibir o crescimento de 90% das cepas, ou seja, a menor
concentração do sabonete capaz de impedir a mudança de cor azul para rosa
(ALVES et al., 2008)
6.3.2. Resultados
Os resultados encontrados para o ensaio de atividade antimicrobiana em meio
líquido pela técnica de microdiluição em caldo, após a realização de subcultura em
placas de Petri contendo ágar BHI podem ser vistos nas Tabelas 21 a 36.
Tabela 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 1 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
1 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
P. aeruginosa
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Salmonella spp
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+ + + + ++ ++ ++ ++ ++
E. coli
+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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85
Tabela 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
1 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
P. aeruginosa
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Salmonella spp
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+ + + + + + + + +
E. coli
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 3 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
1 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
P. aeruginosa
+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - ++ ++ ++ ++ ++
Salmonella spp
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+ + + + ++ ++ ++ ++ ++
E. coli
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
+ + + + + + + + +
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
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Tabela 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 4 contendo 1% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
1 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
P. aeruginosa
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - ++ ++ ++ ++ ++
Salmonella spp
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+ + + + ++ ++ ++ ++ ++
E. coli
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 1 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
2 2x10
-1
2x10
-2
2x10
-3
2x10
-4
2x10
-5
2x10
-6
2x10
-7
2x10
-8
P. aeruginosa
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
+ + + + + + + + +
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - ++ ++ ++ ++ ++
E. coli
- - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
+ + + + + + + + +
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Tabela 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 2 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
2 2x10
-1
2x10
-2
2x10
-3
2x10
-4
2x10
-5
2x10
-6
2x10
-7
2x10
-8
P. aeruginosa
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
+ + + + +
+
+
+
+
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+ + + + + + + + +
E. coli
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
+ + + + + + + + +
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 3 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
2 2x10
-1
2x10
-2
2x10
-3
2x10
-4
2x10
-5
2x10
-6
2x10
-7
2x10
-8
P. aeruginosa
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - -
-
++ ++ ++ ++
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - ++ ++
E. coli
+ +
+ +
+ +
++ ++ ++
E. faecalis
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Tabela 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 4 contendo 2% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
2 2x10
-1
2x10
-2
2x10
-3
2x10
-4
2x10
-5
2x10
-6
2x10
-7
2x10
-8
P. aeruginosa
+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - - - ++ ++ ++
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - - -
E. coli
+ + + + + + + ++ ++
E. faecalis
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
C. albicans
+ + ++ ++
++
++
++
++
++
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 1 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
3 3x10
-1
3x10
-2
3x10
-3
3x10
-4
3x10
-5
3x10
-6
3x10
-7
3x10
-8
P. aeruginosa
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - - - - - -
Salmonella spp
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - ++ ++
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
+ + + + + + + + +
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
89
Tabela 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 2 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
3 3x10
-1
3x10
-2
3x10
-3
3x10
-4
3x10
-5
3x10
-6
3x10
-7
3x10
-8
P. aeruginosa
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - - - ++ ++ ++
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - + ++ ++
E. coli
+ + + + ++ ++ ++ ++ ++
E. faecalis
+ + + + + ++ ++ ++ ++
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
3 3x10
-1
3x10
-2
3x10
-3
3x10
-4
3x10
-5
3x10
-6
3x10
-7
3x10
-8
P. aeruginosa
+ + + + + + + + +
S. aureus
- - - - - - - - -
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - - -
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
- - - - - - - - -
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
90
Tabela 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 4 contendo 3% de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
3 3x10
-1
3x10
-2
3x10
-3
3x10
-4
3x10
-5
3x10
-6
3x10
-7
3x10
-8
P. aeruginosa
+ + + + + + + + +
S. aureus
- - - - - - - - -
Salmonella spp
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - - -
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
- - - - - - - - -
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 1 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
4
4x10
-1
4x10
-2
4x10
-3
4x10
-4
4x10
-5
4x10
-6
4x10
-7
4x10
-8
P. aeruginosa
- - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - + ++ ++ ++ ++
Salmonella spp
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - ++ ++
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
- - - - - - - - -
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
91
Tabela 34. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 2 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
4 4x10
-1
4x10
-2
4x10
-3
4x10
-4
4x10
-5
4x10
-6
4x10
-7
4x10
-8
P. aeruginosa
++
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - - - - - ++
Salmonella spp
- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
+
+
+
+
+
+ ++ ++ ++
E. coli
+
+
+
+
++
++ ++ ++ ++
E. faecalis
+
+
+
+
+
+
+ ++ ++
C. albicans
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Tabela 35. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 3 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
4
4x10
-1
4x10
-2
4x10
-3
4x10
-4
4x10
-5
4x10
-6
4x10
-7
4x10
-8
P. aeruginosa
+
+ + + + ++ ++ ++ ++
S. aureus
- - - - - + ++ ++ ++
Salmonella spp
- - - - ++ ++ ++ ++ ++
S. epidermidis
- - - - - - - - -
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
- - - - - - - - -
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
92
Tabela 36. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido do sabonete líquido da
formulação 4 contendo 4 % de digluconato de clorexidina
CONCENTRAÇÕES (%)
Microrganismos
4
4x10
-1
4x10
-2
4x10
-3
4x10
-4
4x10
-5
4x10
-6
4x10
-7
4x10
-8
P. aeruginosa
+
+ + + + + + + +
S. aureus
- - - - - - - - -
Salmonella spp
- - - - - - - - -
S. epidermidis
- - - - - - - - -
E. coli
- - - - - - - - -
E. faecalis
- - - - - - - - -
C. albicans
- - - - - - - - -
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colônias de microrganismo na estria do repique; (-) ausência de crescimento
microbiano na estria do repique.
As Figuras 20 a 33 ilustram os resultados do ensaio de atividade
antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição, para os sabonetes líquidos
contendo digluconato de clorexidina. A permanência de cor azul nos orifícios indica
ausência de crescimento microbiano e o desenvolvimento de cor rosa, presença de
crescimento.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
93
Figura 20. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando P. aeruginosa. A1, A2, contêm
sabonete sem clorexidina; B1, B2, sabonete com 1% de clorexidina; C1, C2, sabonete com 2% de
clorexidina; D1, D2, sabonete com 3% de clorexidina; E1, E2, sabonete com 4% de clorexidina; F1, F2,
meio de cultura; G1, G2, controle positivo; H1 e H2, solução de clorexidina a 1% e microrganismo; A3,
B3, sabonete sem clorexidina e meio de cultura; C3, D3, sabonete com 1% de clorexidina e meio de
cultura; E3, F3, sabonete com 2% de clorexidina; G3, sabonete com 3% de clorexidina e meio de
cultura; H3, sabonete com 4% de clorexidina e meio de cultura. A4, B4, sabonete com 1% de
clorexidina, meio de cultura e microrganismo e nos demais poços destas fileiras, as diluições seriadas
1:10 do sabonete, meio de cultura e microrganismo; C4, D4, sabonete com 2% de clorexidina, meio de
cultura e microrganismo e nos demais poços dessa fileira, as diluições seriadas 1:10 do sabonete,
meio de cultura e microrganismo; E4, F4, sabonete com 3% de clorexidina, meio de cultura e
microrganismo e nos demais poços dessa fileira, as diluições seriadas 1:10 do sabonete, meio de
cultura e microrganismo; G4, H4, sabonete com 4% de clorexidina, meio de cultura e microrganismo e
nos demais poços dessa fileira, as diluições seriadas 1:10 do sabonete, meio de cultura e
microrganismo.
Figura 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando P. aeruginosa. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 20.
a b
c
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
94
Figura 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando S. aureus. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 20.
Figura 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando S. aureus. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 20.
b a
c
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
95
Figura 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando Salmonella spp. A
distribuição dos sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 19, entretanto,
houve uma modificação em G1 e G2, que contêm solução de clorexidina a 1%, meio de
cultura e microrganismo e em H1 e H2, que contêm meio de cultura e microrganismo.
Figura 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando Salmonella spp. A distribuição
dos sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
b
c
d
a
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
96
Figura 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando S. epidermidis. A distribuição
dos sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
Figura 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando S. epidermidis. A distribuição
dos sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
a b
c
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
97
Figura 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando E. faecalis. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
Figura 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando E. faecalis. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
a b
c
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
98
Figura 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando E. coli. A distribuição dos
sabonetes e das diluições dos sabonetes é igual à apresentada na Figura 24.
Figura 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando E. coli. A distribuição dos
sabonetes e das diluições dos sabonetes é igual à apresentada na Figura 24.
Para o ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido frente a C. albicans,
a coloração amarela indica crescimento microbiano, enquanto que coloração marrom,
indica ausência de crescimento microbiano.
a b
c
d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
99
Figura 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 1 (a) e formulação 2 (b), empregando C. albicans. A distribuição
dos sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
Figura 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido – técnica de microdiluição dos
sabonetes da formulação 3 (c) e formulação 4 (d), empregando C. albicans. A distribuição dos
sabonetes e das diluições é igual à apresentada na Figura 24.
6.3.3. Discussão
A determinação da CIM é um método quantitativo que analisa a menor
concentração do composto testado capaz de inibir o crescimento visível do
microrganismo em estudo. A concentração bactericida mínima (CBM) e concentração
fungicida mínima (CFM), também são métodos quantitativos em que se analisa a
menor concentração do composto testado capaz de matar 99,9% da população
bacteriana e fúngica, respectivamente (COLLINS, LYNE, 2004).
a b
c d
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
100
Os valores de CIM para os sabonetes líquidos estão apresentados na Tabela
37.
Tabela 37. Valores de CIM encontrados para os sabonetes líquidos desenvolvidos
com as diferentes concentrações de digluconato de clorexidina
Microrganismo / concentração da formulação (%)
Formulações*
P.
aeruginosa
S.
aureus
Salmonella
spp
S.
epidermidis
E. coli E.
faecalis
C.
albicans
1a - 1 - 10
-3
10
-1
10
-1
-
1b - 2x10
-8
- 2x10
-3
2x10
-2
2x10
-2
2x10
-8
1c - 3x10
-8
3 3x10
-6
3x10
-8
3x10
-8
3x10
-8
1d 4x10
-1
4x10
-4
4 4x10
-6
4x10
-8
4x10
-8
4x10
-8
2a - - - 10
-8
- - -
2b - 2x10
-8
- 2x10
-8
2 2 2x10
-8
2c - 3x10
-5
- 3x10
-5
3x10
-4
3x10
-4
-
2d - 4x10
-7
4 4x10
-5
4x10
-3
4x10
-6
4x10
-8
3a 1 10
-3
- 10
-3
- - 10
-8
3b 2 2x10
-4
- 2x10
-6
2x10
-5
2x10
-8
3c 3x10
-8
3x10
-8
- 3x10
-8
3x10
-8
3x10
-8
3x10
-8
3d 4x10
-4
4x10
-4
4x10
-3
4x10
-8
4x10
-8
4x10
-8
4x10
-8
4a - 10
-3
- 10
-3
- - 10
-1
4b 2x10
-2
2x10
-6
- 2x10
-8
2x10
-6
- 2x10
-1
4c 3x10
-4
3x10
-8
- 3x10
-8
3x10
-8
3x10
-8
3x10
-8
4d 4x10
-8
4x10
-8
4x10
-4
4x10
-4
4x10
-4
4x10
-4
4x10
-4
* Os números indicam a formulação e as letras indicam a concentração da solução de
digluconato de clorexidina presente em cada sabonete líquido, assim, 1 é formulação 1; 2 é
formulação 2; 3 é formulação 3 e 4 é formulação 4; a indica 1% de digluconato de clorexidina;
b, 2% de digluconato de clorexidina; c, 3% de digluconato de clorexidina e d, 4% de
digluconato de clorexidina; (-) ausência de atividade antimicrobiana
A CIM, com efeito bactericida da formulação 1 com 1% de clorexidina para S.
aureus foi 1%; para S. epidermidis a CIM da formulação 1 com 1% de clorexidina foi
1 x 10
-3
%, com efeito bacteriostático; contra E. faecalis, a CIM foi 1 x 10
-1
% com efeito
bacteriostático; contra E. coli, a CIM foi 1 x 10
-1
% com ação bacteriostática; diante da
Salmonella spp, P. aeruginosa e C. albicans, esta formulação não apresentou
nenhuma atividade.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
101
Para o sabonete 1 com 2% de clorexidina, diante de S. aureus, a CIM com
efeito bacteriostático, foi 2 x 10
-8
%; contra S. epidermidis a CIM foi 2 x 10
-3
% com
efeito bactericida; contra E. faecalis a CIM foi 2 x 10
-1
com ação bacteriostática e
contra E. coli, a CIM foi 2 x 10
-2
%, com ação bactericida; diante da C. albicans, a CIM
foi 2 x 10
-8
%, com efeito bacteriostático; frente à Salmonella spp e P. aeruginosa, não
houve atividade alguma.
Quando o sabonete líquido continha 3% de clorexidina, a CIM com ação
bactericida foi 3 x 10
-8
% contra S. aureus, E. coli e C. albicans; contra S. epidermidis,
a CIM com efeito bactericida foi 3 x 10
-6
%; contra E. faecalis, a CIM foi 3 x 10
-8
%, com
efeito bacteriostático; contra Salmonella spp, a CIM foi 3% com efeito bactericida e
para P. aeruginosa, não houve atividade.
Para o sabonete desta formulação com 4% de ativo, a CIM com efeito
bactericida, foi 4 x 10
-3
% contra S. aureus; contra S. epidermidis foi 4 x 10
-6
%, com
efeito bactericida, contra P. aeruginosa a CIM foi 4 x 10
-1
%, ação bactericida; contra
E. faecalis, E. coli e C. albicans a CIM foi 4 x 10
-8
%, com efeito bactericida, contra
Salmonella spp, a CIM foi 4%, com ação bactericida.
Em relação à formulação 2 contendo 1% de digluconato de clorexidina a CIM
para S. epidermidis foi 1 x 10
-8
%, com efeito bacteriostático, entretanto, para os
demais microrganismos não apresentou nenhuma atividade antimicrobiana.
O sabonete desta formulação contendo 2% de clorexidina mostrou-se
novamente bacteriostático para S. aureus, S. epidermidis e C. albicans com CIM de
2 x 10
-8
%; contra E. faecalis e E. coli, a CIM foi 2%, com ação bactericida; para os
demais microrganismos não apresentou atividade.
Com 3% de ativo, a CIM contra S. aureus e S. epidermidis foi 3 x 10
-5
%, com
ação bactericida; contra E. faecalis, a CIM foi 3 x 10
-4
% com ação bacteriostática;
contra E.
coli, a CIM foi 3 x 10
-3
%, com ação bacteriostática; diante dos demais
microrganismos não houve atividade.
Com 4% de digluconato de clorexidina, a CIM contra S. aureus foi 4 x 10
-7
%,
com ação bactericida; contra S. epidermidis a CIM foi 4 x 10
-5
%, com ação
bacteriostática; contra Salmonella spp, a CIM foi 4%, com ação bactericida; contra E.
faecalis, a CIM foi 4 x 10
-6
%, com efeito bacteriostático; contra E. coli, a CIM com
ação bactericida, foi 4 x 10
-3
%; contra C. albicans, a CIM foi 4 x 10
-8
%, com ação
bacteriostática e para P. aeruginosa não houve atividade.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
102
Esses dados ressaltam que no ensaio de atividade antimicrobiana por difusão
em ágar não houve formação de halo de inibição de crescimento para as formulações
1 e 2 contra nenhum microrganismo analisado devido à viscosidade dos sabonetes
destas formulações, às possíveis interações ocorridas entre o tensoativo lauriléter e o
meio de cultura sólido, entre o excesso de clorexidina e o pH do meio de cultura
sólido e entre o tensoativo lauriléter e a clorexidina com a formação do complexo
aniônico-catiônico que dificultou a difusão da clorexidina no ágar. Entretanto, este
complexo não impediu que a clorexidina apresentasse ação antimicrobiana frente aos
microrganismos testados pela técnica da microdiluição em caldo.
A presença do tensoativo anfótero cocoamidopropil betaína na formulação 2
não contribuiu para diminuição das interações entre a clorexidina e o tensoativo
lauriléter, fato observado por não haver melhora significativa da atividade
antimicrobiana desta formulação em relação à formulação 1, quando comparadas na
mesma concentração pelo método da microdiluição em caldo e também não houve
mudança dos aspectos físicos destas formulações.
Foi observado também que, ao elevar a concentração da clorexidina nestas
formulações houve melhora da atividade antimicrobiana pelo método da microdiluição
em caldo, ao contrário do que aconteceu no teste de atividade antimicrobiana pelo
método da difusão em ágar.
Para a formulação 3 com 1% de digluconato de clorexidina a CIM para S.
aureus foi 1 x 10
-3
%, com ação bactericida; para S. epidermidis, a CIM foi 1 x 10
-3
%
com efeito bacteriostático; contra P. aeruginosa, a CIM foi 1%, com ação
bacteriostática; contra C. albicans, a CIM foi 1 x 10
-8
% com ação bacteriostática e
para os demais microrganismos não foi observada nenhuma atividade.
Com 2% de ativo, o sabonete líquido teve CIM de 2% com ação bactericida
contra P. aeruginosa; contra S. aureus, a CIM foi 2 x 10
-4
% com ação bactericida;
contra S. epidermidis, a CIM foi 2 x 10
-6
%, com ação bactericida; contra E. coli a CIM
foi 2 x 10
-5
%, com ação bacteriostática, contra C. albicans a CIM foi 2 x 10
-8
% com
ação bactericida e para os demais microrganismos testados não houve atividade
.
Com 3% de clorexidina, o sabonete líquido desta formulação apresentou CIM
de 3 x 10
-8
% com ação bactericida contra S. aureus, E. coli, S. epidermidis, C.
albicans e E. faecalis; contra P. aeruginosa, a CIM foi 3 x 10
-8
%, com ação
bacteriostática e para Salmonella spp não houve atividade.
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
103
O sabonete líquido com 4% de clorexidina mostrou CIM de 4 x 10
-4
% com ação
bacteriostática contra P. aeruginosa; CIM de 4 x 10
-4
%, com ação bactericida contra
S. aureus; contra Salmonella, a CIM foi 4 x 10
-3
% com ação bactericida; contra S.
epidermidis, E. faecalis, E. coli e C. albicans, a CIM foi 4 x 10
-8
%, com ação
bactericida.
Em relação à formulação 4, o sabonete líquido com 1% de clorexidina contra S.
aureus mostrou CIM de 1 x 10
-3
%, com ação bactericida; contra S. epidermidis a CIM
foi 1 x 10
-3
%, com ação bacteriostática; contra C. albicans, a CIM foi 1 x 10
-2
%, com
ação bacteriostática e para os demais microrganismos, não houve ação. O sabonete
líquido com 2% de digluconato de clorexidina, apresentou CIM de 2 x 10
-1
% com ação
bacteriostática contra P. aeruginosa; CIM de 2 x 10
-6
% com ação bactericida contra S.
aureus; contra S. epidermidis, a CIM foi 2 x 10
-8
% com ação bactericida; contra E.
coli, a CIM foi 2 x 10
-6
% com efeito bacteriostático, contra C. albicans, a CIM com
ação bacteriostática, foi 2 x 10
-1
% e para os demais microrganismos testados não
houve atividade.
Com 3% de ativo, o sabonete líquido apresentou CIM de 3 x 10
-4
% com ação
bacteriostática contra P. aeruginosa; contra E. faecalis, S. aureus, S. epidermidis, E.
coli e C. albicans, a CIM com ação bactericida, foi 3 x 10
-8
% e diante da Salmonella
spp, não houve atividade.
Com 4% de clorexidina, o sabonete desta formulação mostrou CIM com ação
bacteriostática de 4 x 10
-8
% contra P. aeruginosa; contra S. aureus, Salmonella spp,
S. epidermidis, E. faecalis, E. coli e C. albicans, a CIM foi 4 x 10
-8
% com ação
bactericida.
Diante dos resultados obtidos nos ensaios de atividade antimicrobiana em
meio líquido e por difusão em ágar, as formulações 3 e 4 apresentaram melhores
resultados.
Foi possível notar pelo ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquido, que
com aumento da concentração da clorexidina, obtêm-se melhores resultados de
atividade antimicrobiana, diferentemente do ensaio de difusão em ágar, que, com
aumento da concentração da clorexidina no sabonete, houve diminuição do tamanho
do halo de inibição de crescimento. Portanto, ao elevar a concentração de clorexidina,
não há aumento de interação com o meio de cultura líquido, ao contrário do que
ocorreu com o meio de cultura sólido e que os resultdos encontrados podem ser
realmente falso-negativos. Além disso, o tensoativo sarcosinato pode ter interagido
Ensaios de atividade antimicrobiana
____________________________________________________________________________
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
104
menos com o meio de cultura líquido, resultando em melhora de atividade
antimicrobiana.
A presença do tensoativo anfótero cocoamidopropil betaína na formulação 4
não contribuiu para diminuição das interações entre a clorexidina e o tensoativo
sarcosinato, fato observado por não haver melhora significativa da atividade
antimicrobiana desta formulação em relação à formulação 3, quando comparadas na
mesma concentração pelo método da microdiluição em caldo e também não houve
mudança dos aspectos físicos destas formulações.
Confirmando os resultados encontrados no ensaio de atividade antimicrobiana
por difusão em ágar, os microrganismos Gram-positivos foram mais sensíveis à
clorexidina, enquanto que os Gram-negativos foram mais resistentes. Neste ensaio, a
C. albicans também se mostrou sensível. Entretanto, em trabalho realizado por
Bambace e colaboradores (2003), utilizando solução aquosa de clorexidina a 0,5%;
1%; 2%; 3% e 4% comparando sua eficácia com a do álcool 70% gel e líquido para
limpeza de superfícies em consultório odontológico, constatou que P. aeruginosa foi
sensível à solução de clorexidina em todas as concentrações testadas.
O método de microdiluição apresentou vantagem em relação ao método de
difusão em ágar, uma vez que empregou menor quantidade de meio de cultura,
houve facilidade de manuseio, permitiu análise qualitativa e quantitativa e também
permitiu avaliar melhor as formulações em estudo, pois a viscosidade das amostras e
as interações com o meio de cultura líquido não interferiram nos resultados de
atividade antimicrobiana. Entretanto, apresentou-se inconveniente para leitura visual,
pois em algumas vezes a turvação encontrada era causada pela própria formulação
em contato com o meio de cultura e, não pela presença de crescimento microbiano,
no entanto, esta dificuldade foi sanada ao realizar a subcultura em placas de Petri
contendo meio de cultura ágar BHI e ágar Sabouraud e com a adição do corante
resazurina.
6.3.4. Conclusão
Diante dos resultados obtidos, é necessário o emprego de mais de uma técnica
para avaliar o potencial antimicrobiano de determinado produto ou formulação. Para
os produtos viscosos e que podem interagir com o meio de cultura sólido, deve-se dar
preferência ao método de diluição em caldo.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
105
Em relação às formulações, os resultados do ensaio de atividade
antimicrobiana pelo método de diluição em caldo, demostraram que as formulações 1
e 2 (com lauriléter sulfato de sódio) possuem atividade antimicrobiana frente aos
microrganismos Gram-positivos testados e houve melhora da atividade
antimicrobiana com o aumento da concentração de clorexidina nas formulações,
demonstrando que a incompatibilidade entre o tensoativo aniônico e a clorexidina é
apenas do ponto de vista técnico, uma vez que há turvação e precipitação destas
formulações.
Foi realizado o mesmo ensaio com o sabonete sem adição de clorexidina, que
demonstrou atividade antimicrobiana apenas quando não foi diluído, portanto, a
atividade apresentada pelos sabonetes contendo o ativo, refere-se mesmo à
clorexidina.
Diante dos microrganismos Gram-negativos, estas formulações apresentaram
melhores resultados frente à E. coli. Esta atividade deveu-se à presença de
clorexidina, pois o sabonete sem o ativo apresentou atividade apenas quando não
estava diluído. Em relação aos outros microrganismos Gram-negativos, não houve
atividade antimicrobiana.
Quanto às formulações 3 e 4 (com lauroilmiristilsarcosinato de sódio), os
microrganismos Gram-positivos novamente demonstraram maior susceptibilidade. A
atividade é devido à presença de clorexidina, comprovada uma vez que no teste
realizado apenas com os sabonetes, houve atividade na amostra não diluída e na
primeira diluição. Quando obteve-se a diluição 10
-3,
o efeito foi bacteriostático,
entretanto estes resultados corroboram com a literatura, que diz que o
lauroilmiristilsarcosinato de sódio possui atividade antimicrobiana superior ao
lauriléter sulfato de sódio. Diante dos microrganismos Gram-negativos, apenas a E.
coli apresentou atividade satisfatória.
Assim como nas formulações 1 e 2, o aumento da concentração da clorexidina
nas formulações 3 e 4 melhorou a atividade antimicrobiana pelo método de diluição
em caldo.
Foi observado que houve maior interação das quatro formulações com o meio
de cultura sólido e quando utilizou maior concentração de clorexidina nas
formulações. A presença do tensoativo anfótero cocoamidopropil betaína nas
formulações 2 e 4 não melhorou a atividade antimicrobiana e os aspetos físicos em
relação às formulações 1 e 2 respectivamente.
Ensaios de atividade antimicrobiana
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Flávia Angélica Másquio Fiorentino
106
Foi observado que a formulação 3 com 3% de clorexidina apresentou resultado
semelhante em relação à mesma formulação com 4% de ativo, diferindo apenas
quanto à Salmonella spp que apresentou efeito bactericida na diluição de 4 x 10
-3
%,
enquanto que com o sabonete com 3% não houve atividade; quanto à P. aeruginosa,
que, com 3% de clorexidina houve efeito bacteriostático em todas as diluições e com
4% de clorexidina houve efeito bacteriostático até a diluição de 4 x 10
-3
% e ao S.
aureus que com 3% de clorexidina houve ação bactericida em todas as diuições e
com 4%, foi bactericida até a diluição de 4 x 10
-4
%.
Quanto à formulação 4, com 4% de clorexidina, o sabonete mostrou melhor
atividade em relação à P. aeruginosa, pois foi bacteriostático em todas as
concentrações analisadas e com 3% de clorexidina foi bacteriostático até a diluição
3 x 10
-4
%. Quanto
à Salmonella spp, a formulação 4, com 4% de ativo, foi bactericida
em todas as diluições analisadas e com 3% de ativo, não mostrou atividade
antimicrobiana.
A formulação 3 com 3% de clorexidina foi considerada, do ponto de vista
microbiológico, mais ativa, uma vez que contém menor quantidade de anti-séptico em
relação às formulações 3 e 4 com 4% de clorexidina e foi observado resultado
semelhante a estas preparações, porém, com atividade superior àquela apresentada
pelas formulações 1, 2, 3 e 4 com 1% e 2% de clorexidina. Ao levar em conta os
fatores econômicos, ambientais e risco de efeitos indesejáveis pelo consumidor como
irritação, alergia e desenvolvimento de resistência, esta formulação foi escolhida para
dar continuidade às análises realizadas neste trabalho.
7.TESTE DE EFICÁCIA DE ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
108
O objetivo deste estudo foi realizar o teste desafio do sabonete líquido
contendo 3% de digluconato de clorexidina, frente a culturas puras de
microrganismos, a fim de verificar com que velocidade o sabonete é capaz de matar
os microrganismos empregados e se esta velocidade é suficiente para que o produto
seja aceito pelos critérios farmacopéicos do teste.
7.1. Microrganismos utilizados
Foram utilizados isolados de bactérias, fungo e levedura de coleções padrões
da American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus (ATCC 25923
IAL 1606), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 IAL 1028), Escherichia coli
(ATCC 25922 IAL 2393), Candida albicans (ATCC 64548) e Aspergillus niger (ATCC
16404).
7.2. Conservação dos microrganismos-teste
Cada uma das bactérias foi repicada por semeadura em estrias, em 12 tubos
de ensaio contendo meio ágar tripticaseína-soja esterilizado e inclinado. A levedura
foi repicada em meio ágar Sabouraud dextrose, seguindo a mesma técnica. Em
seguida, os microrganismos foram levados à estufa, onde as bactérias
permaneceram por 24 horas à temperatura de 35
o
C ± 1 ºC, e a levedura por 48-72
horas a 25
o
C ± 1 ºC. Após o crescimento, em cada tubo, foi vertida uma quantidade
suficiente de óleo mineral esterilizado para conservação em congelador à
temperatura de -10
o
C ± 1 ºC. Desta maneira, para cada mês, foi preparado 1 tubo de
cada microrganismo.
O fungo A. niger, inoculado em meio ágar Sabouraud dextrose inclinado, foi
repicado com auxílio de alça de platina a outros 6 tubos, contendo o mesmo meio.
Após, os tubos foram incubados por 5 dias à 25 ºC ± 1 ºC. Após o desenvolvimento
das culturas, os tubos foram mantidos em temperatura de 4 ºC, obtendo-se assim, o
estoque semestral.
7.3. Reativação dos microrganismos
Ao início de cada mês, um tubo de cada microrganismo (bactérias e levedura)
foi retirado do congelador e submetido ao descongelamento à temperatura ambiente.
Em seguida, um tubo de cada bactéria foi transferido para Erlenmeyer contendo 50
mL de caldo tripticaseína-soja e no caso da levedura em caldo Sabouraud-dextrose e
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
109
incubados em estufa à temperatura de 35
o
C ± 1 ºC por um período de 48 horas para
as bactérias e 72 horas para a levedura. Após este período, cada microrganismo foi
repicado, em meio adequado, por semeadura em estrias em 6 tubos e novamente
incubados nas mesmas condições.
O fungo foi repicado em 2 tubos com ágar Sabouraud a 25 ºC ± 1 ºC por 7 dias
para obtenção do estoque mensal, a partir do tubo do estoque semestral.
7.4. Repiques dos microrganismos para utilização nos testes
Um tubo de cada microrganismo foi retirado do estoque mensal e repicado por
semeadura em estrias, em meio ágar inclinado adequado e incubado à temperatura
de 35
o
C ± 1 ºC por 24 horas para bactérias, para a levedura a temperatura de
incubação foi 25
o
C ± 1 ºC, por 3 dias e para o fungo foi 25 ºC, por 7 dias.
7.5. Obtenção de suspensões-mãe de microrganismos testes e contagem do
número de microrganismos viáveis
Às culturas de microrganismos-teste, adicionaram-se 9 mL de solução salina
esterilizada para a obtenção da suspensão de cada microrganismo (S. aureus, E. coli,
P. aeruginosa, C. albicans). A “suspensão-mãe” foi então ajustada quanto à escala
0,5 McFarland e submetida à diluição decimal seriada em solução salina estéril, até
obter a diluição 10
1
.
Alíquotas de 1,0 mL das diluições seriadas foram semeadas à superfície do
meio com auxílio de alça de Drigalsky esterilizada. As placas foram incubadas em
estufa a 35 ˚C ± 1 ºC por 24 horas em meio tripticaseína-soja, enquanto que a
levedura foi incubada a 25 ˚C ± 1 ºC por 72 horas em meio Sabouraud-dextrose.
Após este período, as placas que apresentavam um número de colônias entre 30 a
300, foram selecionadas para contagem do número de microrganismos viáveis.
Para o fungo, a um tubo com ágar Sabouraud dextrose inclinado, contendo A.
niger, foram adicionados 9,0 mL de solução salina estéril e, por agitação, os esporos
foram suspensos. Desta suspensão, 1,0 mL foi transferido para outro tubo de solução
salina estéril e diluída 8 vezes, também em solução salina estéril. Destas diluições
foram retirados pequenos volumes para contagem de número de esporos/mL em
câmara de Neubauer, sob microscópio óptico. A diluição que apresentou 10
8
UFC de
esporos foi selecionada para contagem do número de microrganismos viáveis.
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
110
Alíquotas de 1,0 mL da diluição que apresentou número de 10
8
esporos foram
diluídas em 9,0 mL solução salina estéril até obter a diluição 10
1
. Alíquotas de 1,0 mL
das diluições seriadas foram semeadas à superfície do meio de cultura ágar
Sabouraud-dextrose com auxílio de alça de Drigalsky esterilizada. As placas foram
incubadas a 25 ˚C ± 1 ºC por 7 dias. Após este período, as placas que apresentavam
um número de colônias entre 30 a 300, foram selecionadas para contagem do
número de microrganismos viáveis. (BP, 2003; USP, 2006).
7.6. Avaliação da neutralização na inibição da atividade antimicrobiana do
sistema
O estudo de neutralização foi feito verificando-se a inibição do crescimento dos
microrganismos S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, A. niger e C. albicans em
concentrações diferentes da formulação, obtidas a partir de diluições seriadas.
Primeiramente, a 1,0 g da formulação foram adicionados 9 mL de solução
salina estéril, obtendo-se, então, a primeira diluição (10
-1
), a partir desta foram feitas
diluições decimais até 10
-9
para as bactérias Gram-negativas, A. niger e para C.
albicans e até 10
-12
para as Gram-positivas. A cada uma das diluições, foi adicionado
1 mL da suspensão de microrganismos contendo aproximadamente 10
4
bactérias, 10
5
células de bolores para a C. albicans ou 10
5
esporos para A. niger. A seguir, os tubos
foram agitados mecanicamente e alíquotas de 1 mL foram semeadas, em duplicatas,
nas placas de Petri contendo meios adequados (BP, 2003; USP, 2006).
O mesmo procedimento foi realizado com o sabonete líquido sem adição de
clorexidina para comparação dos resultados entre as duas formulações, a fim de
garantir que os resultados encontrados sejam devido à ação da clorexidina, evitando
erros na interpretação dos resultados, pois apenas o sabonete também possui
atividade antimicrobiana como já foi discutido na revisão de literatura deste trabalho e
nos ensaios de atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar.
Para comprovação da eficiência da neutralização dos conservantes, o teste foi
acompanhado por um controle, no qual 1,0 mL da suspensão de microrganismo foi
adicionado em 9,0 mL de solução salina estéril, seguindo o mesmo procedimento da
formulação.
As placas foram incubadas em estufa por 24 horas a 35 °C ± 1 ºC, para a
contagem de bactérias, enquanto que para a levedura foi 25 °C ± 1 ºC por 72 horas e
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
111
para o fungo foi 7 dias. Após o crescimento, o número de UFC foi determinado
(Figura 34).
Figura 33: Esquema do teste da avaliação da eficácia de neutralizante sobre
Figura 34. Esquema da realização do teste de neutralizante.
7.7. Teste de eficácia do sistema conservante propriamente dito
Em embalagem adequada e esterilizada, foram colocados 20 g de formulação.
Em seguida, foi inoculado um volume de suspensão de microrganismo, para a
obtenção final de uma carga teórica de microrganismos equivalente a 10
6
bactérias ou
10
6
esporos ou células de fungo por grama de formulação. Em seguida, 1 g de
formulação foi pesado, em recipiente estéril, e adicionados de 9 mL de solução salina
estéril, sob agitação manual constante. Após a dissolução de todo conteúdo, obteve-
se a diluição 10
-1
, que foi subsequentemente diluída até 10
-5
(BP, 2003; USP, 2006).
Este procedimento foi realizado para todos os microrganismos em análise.
O mesmo procedimento foi realizado com o sabonete líquido sem adição de
clorexidina, para todos os microrganismos em análise a fim de comparar os
resultados entre as duas formulações, para garantir que os resultados encontrados
CONTROLE
1mL
1mL
10
-
1
10
-
2
10
-
3
10
-
12
Diluição seriada decimal
Semeadura em
superfície
Meio: Ágar tripticaseína
-
soja
Temperatura e tempo de
incubação: 30ºC/72 horas
9 mL diluente
(solução salina)
INOCULAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Homogeneização
manual
9mL de solução salina
+
1mL da suspensão de
microrganismos
1g/amostra
10
-
1
1mL
Suspensão (~1000 µg/mL)
1 mL
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
112
sejam devido à ação da clorexidina, evitando erros na interpretação dos resultados,
pois apenas o sabonete também possui atividade antimicrobiana.
Paralelamente, controles foram realizados, em que, nos tubos de ensaio, com
20 mL de solução salina estéril, inoculou-se a mesma carga microbiana, e foi agitado
para homogeneização das células. Em seguida, 1 mL desta suspensão foi pipetado e
adicionado a 9,0 mL de solução salina 1 estéril, dando seqüência às diluições até
10
-5
.
Da diluição 10
-5
, alíquotas de 1,0 mL, foram retiradas com auxílio de pipeta
automática e inoculadas em placas de Petri, em duplicata, contendo os meios de
cultura adequados para bactérias, levedura e fungo. As placas foram incubadas em
estufa por 24 horas à temperatura de 35 °C ± 1 ºC, para contagem de bactérias e a
25 °C ± 1 ºC por 72 horas para a levedura e 7 dias para o fungo. Após o crescimento,
o número UFC foi determinado (Figura 35).
O período do teste ocorreu nos intervalos de tempo de 0, 2, 6, 12, 24 e 48
horas; 7, 14, 21 e 28 dias. A análise dos microrganismos viáveis dos controles foi
executada somente no tempo zero, ou seja, logo após a inoculação.
Durante a execução do teste, as formulações foram mantidas à temperatura
ambiente em local livre de umidade e excesso de luz.
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
113
Figura 35: Esquema da execução das análises microbiológicas do sabonete líquido contendo
digluconato de clorexidina durante o teste desafio.
7.8. Resultados
7.8.1. Avaliação da neutralização na inibição da atividade antimicrobiana
Os resultados da avaliação da neutralização do sabonete líquido contendo 3%
de digluconato de clorexidina e do sabonete isento do anti-séptico estão
apresentados nas Tabelas 38 a 42, frente aos microrganismos em análise.
A) INOCULAÇÃO DOS MICRORGANISMOS NA AMOSTRA
(10
6
bactérias/g ou 10
5
esporos/g de
amostra)
Homogeinização
manual
Estocagem em tempera
tura
ambiente até o final do teste
B) CONTAGEM DOS MICRORGANISMOS VIÁVEIS
9mL diluente
10
-
2
10
-
3
10
-
5
0,5 mL
0,5 mL
0,5mL
1g
1mL
1mL
Amostra
Diluição seriada
decimal
Semeadura
em
superfície
CONDIÇÕES DO TESTE DESAFIO
Bactérias: Meio ágar tripticaseína-soja/35°C/24h
Levedura: Meio ágar Sabouraud-dextrose/25°C/72h
Fungo: Meio ágar Sabouraud-dextrose/25°C/7 dias
Períodos de análise: 0, 2, 6, 12, 24 e 48h; 7, 14, 21 e 28 dias
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
114
Tabela 38. Contagem do número de microrganismos viáveis de P. aeruginosa após
neutralização do sistema conservante
Amostras 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
Controle
SL 56 91 165 203 296 388 502 598 686 142
SL CHX
41 86 101 137 248 302 412 587 625 142
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
A contagem do número total de microrganismos viáveis para P. aeruginosa
demonstrou que o sabonete líquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
líquido em que o ativo não está presente.
Tabela 39. Contagem do número de microrganismos viáveis de E. coli após
neutralização do sistema conservante
Amostras 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
Controle
SL 46 103 185 241 313 388 410 473 566 240
SL CHX
0 82 164 223 297 362 368 418 528 240
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
Tabela 40. Contagem do número de microrganismos viáveis de S. aureus após
neutralização do sistema conservante
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
10
-10
10
-11
10
-12
Cont
SL
0 21 54 87 125 169 199 222 269 294 311 323 256
SL
CHX
0 0 0 0 0 0 0 0 98 127 156 256 256
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina; cont.,
controle
A contagem do número total de microrganismos viáveis para S. aureus,
demonstrou que o sabonete líquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
líquido em que o ativo não está presente.
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
115
Tabela 41. Contagem do número de microrganismos viáveis de C. albicans após
neutralização do sistema conservante
Amostras 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
Controle
SL 218 234 256 283 294 319 349 362 399 272
SL CHX 78 92 128 232 264 301 330 342 365 272
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
A contagem do número total de microrganismos viáveis para C. albicans
demonstrou que o sabonete líquido contendo clorexidina foi mais eficaz para inibir o
crescimento microbiano quando comparado com o resultado obtido para o sabonete
líquido em que o ativo não está presente.
Tabela 42. Contagem do número de microrganismos viáveis de A. niger após
neutralização do sistema conservante
Amostras 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
Controle
SL 84 103 164 206 288 359 496 562 603 278
SL CHX
63 96 122 189 247 301 397 476 562 278
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
7.8.2. Teste de eficácia do sistema conservante propriamente dito
As Tabelas 43 a 52 e as Figuras 36 a 45 apresentam os resultados obtidos nos
ensaios de teste desafio realizado tanto pelo método convencional (BP, 2003; USP,
2006) quanto pelo método do valor D (ORTH, 1989).
Tabela 43. Log de UFC/g de P. aeruginosa, nas formulações de sabonete líquido com
e sem a presença da clorexidina, em função do tempo
Sistema Conservante
0h 2h 6h 12h 24h
48h
7d 14d
21d
28d
SL 6,0
5,74
5,32
4,95
4 0 0 0 0 0
SL CHX 6,0
5,32
4,90
4,00
0 0 0 0 0 0
Controle 6,0
ND ND ND ND ND ND
ND ND ND
h = horas; d = dias; ND = não determinado; SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete
líquido com digluconato de clorexidina
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
116
O resultado do teste evidenciou que o sabonete líquido de clorexidina
apresenta atividade superior à mesma formulação isenta de clorexidina frente à P.
aeruginosa.
Os resultados das equações da reta, coeficiente de correlação (R) e valores
(D) obtidos para as formulações isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando P.
aeruginosa, estão apresentados nas Figuras 36 e Tabela 44.
Tabela 44. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações sem e com digluconato de clorexidina, utilizando P. aeruginosa
Sistema
conservante
Equação da reta Valor D
(h)
Coeficiente de correlação
(R)
SL y = -0,121x + 6,19 8,1 0,984
SL CHX y = -0,2411x + 6,166 4,06 0,981
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
O valor D confirma a redução do microrganismo P. aeruginosa quando
comparado à mesma formulação sem a presença da clorexidina.
Figura 36. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de P. aeruginosa
sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no sabonete líquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina
(cheio).
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
117
Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulações de sabonete líquido com e sem
a presença da clorexidina, em função do tempo
Sistema Conservante
0h 2h 6h 12h
24h
48h
7d 14d
21d
28d
SL 6,0
5,5 4,47
4,3 0 0 0 0 0 0
SL CHX 6,0
5,41
4,30
0 0 0 0 0 0 0
Controle 6,0
ND ND ND ND ND ND
ND ND ND
h = horas; d = dias; ND = não determinado; SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete
líquido com digluconato de clorexidina
O resultado do teste evidenciou que o sabonete líquido de clorexidina
apresenta atividade superior à mesma formulação isenta de clorexidina frente à
bactéria E. coli.
Os resultados das equações da reta, coeficiente de correlação (R) e valores
(D) obtidos para as formulações isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando E.
coli para o teste desafio, estão apresentados na Figura 37 e Tabela 46.
Figura 37. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de E. coli
sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no sabonete líquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
118
Tabela 46. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações sem e com digluconato de clorexidina, utilizando E. coli
Sistema
conservante
Equação da reta Valor D
(h)
Coeficiente de correlação
(R)
SL y = -0,2386x + 6,1538
4,06 0,970
SL CHX y = -0,4992x + 6,4233
1,95 0,974
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
O valor D confirma a redução do microrganismo E. coli quando comparado à
mesma formulação sem a presença da clorexidina.
Tabela 47. Log de UFC/g de S. aureus, nas formulações de sabonete líquido com e
sem a presença da clorexidina, em função do tempo
Sistema Conservante
0h 2h 6h 12h
24h
48h
7d 14d
21d
28d
SL 4,90
4,30
0 0 0 0 0 0 0 0
SL CHX 4,47
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Controle 6,0 ND ND
ND ND ND ND
ND ND ND
h = horas; d = dias; ND = não determinado; SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete
líquido com digluconato de clorexidina.
O resultado do teste evidenciou que o sabonete líquido de clorexidina
apresenta atividade superior à mesma formulação de sabonete líquido isento de
clorexidina frente à bactéria S. aureus.
Os resultados das equações da reta, coeficiente de correlação (R) e valores
(D) obtidos para as formulações isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando S.
aureus para o teste desafio, estão apresentados na Figura 38 e Tabela 48.
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
119
Tabela 48. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações sem e com digluconato de clorexidina, utilizando S. aureus
Sistema
conservante
Equação da reta Valor D
(h)
Coeficiente de correlação
(R)
SL y = - 0,7054x + 4,3943 1,40 0,981
SL CHX y = - 2,345x + 4,69 0,43 1
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
O valor D confirma a redução do microrganismo S. aureus na formulação com
clorexidina quando comparado à mesma formulação isenta de clorexidina.
Tabela 49. Log de UFC/g de C. albicans, nas formulações de sabonete líquido com e
sem a presença da clorexidina, em função do tempo
Sistema Conservante
0h 2h 6h 12h
24h
48h
7d 14d
21d
28d
SL 4,90
4,47
0 0 0 0 0 0 0 0
SL CHX 4,60
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Controle 6,0 ND ND
ND ND ND ND
ND ND ND
h = horas; d = dias; ND = não determinado; SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete
líquido com digluconato de clorexidina.
O resultado do teste evidenciou que o sabonete líquido de clorexidina
apresenta atividade superior à mesma formulação de sabonete líquido isento de
clorexidina frente à levedura C. albicans.
Figura 38. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de S. aureus
sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no sabonete líquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
120
Os resultados das equações da reta, coeficiente de correlação (R) e valores
(D) obtidos para as formulações isenta e com digluconato de clorexidina, utilizando C.
albicans para o teste desafio, estão apresentados na Figura 39 e Tabela 50.
Tabela 50. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
as formulações sem e com digluconato de clorexidina, utilizando C. albicans
Sistema
conservante
Equação da reta Valor D
(h)
Coeficiente de correlação
(R)
SL y = - 0,8596x + 5,4157 1,12 0,968
SL CHX y = - 2,3x + 4,6 0,43 1
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
O valor D confirma a redução de C. albicans na formulação com clorexidina
quando comparado à mesma formulação isenta do ativo.
Tabela 51. Log de UFC/g de A. niger, nas formulações de sabonete líquido com e
sem a presença da clorexidina, em função do tempo
Sistema Conservante
0h 2h 6h 12h 24h 48h
7d 14d
21d
28d
SL 6,0
5,53
5,25
4,84
4,47
0 0 0 0 0
SL CHX 6,0
5,23
5,04
4,47
0 0 0 0 0 0
Controle 6,0
ND ND ND ND ND ND
ND ND ND
h = horas; d = dias; ND = não determinado; SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete
líquido com digluconato de clorexidina.
Figura 39. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de C. albicans
sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no sabonete líquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e com digluconato de clorexidina (cheio).
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
121
O resultado do teste evidenciou que o sabonete líquido de clorexidina
apresenta atividade superior à mesma formulação de sabonete líquido isento de
clorexidina frente ao fungo A. niger.
Os resultados das equações da reta, coeficiente de correlação (R) e valores
(D) obtidos para as formulações controle e com digluconato de clorexidina, utilizando
A. niger para o teste desafio, estão apresentados na Figura 40 e Tabela 52.
Figura 40. Representação gráfica da regressão linear da relação entre o log de A. niger
sobreviventes em função do tempo de inoculação da carga microbiana, no sabonete líquido
isento de digluconato de clorexidina (azul) e contendo digluconato de clorexidina (vermelho).
Tabela 52. Equação da reta, coeficiente de correlação (R) e valores (D), obtidos para
a formulação sem digluconato de clorexidina e para a formulação com digluconato de
clorexidina, utilizando A. niger
Sistema
conservante
Equação da reta Valor D
(h)
Coeficiente de correlação
(R)
SL y = -0,1162x + 6,1302 8,3 0,962
SL CHX y = -0,2365x + 6,2293 4,1 0,958
SL = sabonete líquido; SL CHX = sabonete líquido com digluconato de clorexidina
O valor D confirma a redução do microrganismo A. niger quando comparado à
mesma formulação sem a presença da clorexidina.
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
122
7.9. Discussão
Nos anos de 1980 surgiram os testes de eficácia conservante ou teste desafio
ou ainda challenge test, que possibilitam a análise da eficácia do sistema conservante
em formulações específicas (BP, 2003).
Nestes testes, o produto é contaminado propositalmente com uma carga
microbiana específica do microrganismo-teste. O monitoramento é realizado quanto à
presença de sobreviventes em intervalos de tempo, pela contagem das unidades
formadoras de colônias (UFC) em placas de Petri de acordo com metodologias
internacionalmente recomendadas, para garantir um produto microbiologicamente
seguro e estável (ORTH, MILSTERIN, 1989; NICOLETTI et al., 1997; BP, 2003).
Os métodos convencionais baseiam-se na porcentagem de redução da carga
microbiana analisada em diferentes tempos. A carga microbiana é expressa em
logaritmo decimal (log) de UFC, a qual é obtida em intervalos de tempos variáveis,
dependendo do método oficial aplicado (CRÉMIEUX et al., 2005).
Os métodos rápidos se baseiam na inoculação proposital de microrganismos e
avaliação da morte celular em intervalos de tempo subsequentes, diferenciando do
método convencional quanto à frequência da avaliação das cargas microbianas. No
método convencional o período de avaliação é de 28 dias, enquanto que no método
rápido é de 48 horas (CRÉMIEUX et al., 2005).
Para a realização deste teste, culturas puras ou misturas de cultura de
microrganismos podem ser empregadas, no entanto, as culturas puras são mais
apropriadas, pois permitem conhecer as taxas de morte de cada microrganismo e
determinar o perfil de resistência para determinada formulação (ORTH, 1993),
enquanto que a mistura de culturas pode refletir mais corretamente o perfil de
contaminação normal de um produto (BRANNAN, 1997). Ainda de acordo com estes
autores, os microrganismos utilizados para o teste devem representar as espécies de
bactérias Gram-positivas como, por exemplo, S. aureus; Gram-negativas com
diversas capacidades metabólicas como P. aeruginosa; bactéria do grupo coliforme
como E. coli; C. albicans como levedura e fungos como Aspergillus niger.
Os testes de eficácia de conservante são executados a fim de determinar o tipo
e a concentração mínima do conservante necessária para que produtos não estéreis
acondicionados em recipientes de múltiplo uso e com base aquosa permaneçam
conservados e mantenham a estabilidade (ORTH, STEINBERG, 2003), além de
fazerem parte dos testes de segurança do produto por avaliar a qualidade
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
123
microbiológica durante sua vida útil, inclusive nas condições de uso (RODRIGUES,
SAITO, 1991).
Conservantes antimicrobianos não devem ser empregados para substituir as
boas práticas de fabricação (BP, 2003; USP, 2006), entretanto, não devem permitir a
proliferação microbiana, para que não haja comprometimento do produto, de sua
ação e da segurança do paciente (RODRIGUES, SAITO, 1991). A eficácia do
conservante deve ser demonstrada em produtos tópicos de múltiplas doses, de uso
oral, oftálmico, nasal e fluidos de diálise (USP, 2006). De acordo com Siqueira (2004),
o teste de eficácia de conservante deve também ser realizado para a embalagem do
produto, uma vez que o material de acondicionamento pode dificultar ou facilitar a
entrada de microrganismos no produto.
Para que o produto seja aceito pelo método convencional descrito na
farmacopéia britânica (2003), é necessário que haja queda de 2 log da carga
bacteriana inicialmente inoculada em 48 horas, redução de 3 log da carga inicial de
bactéria em 7 dias e não deve haver proliferação microbiana até o período final de
realização do teste. Em relação aos fungos, deve haver redução de 2 log da carga
inicialmente inoculada em 14 dias e não deve haver aumento da população fúngica
até o período final do teste. De acordo com a farmacopéia americana (2006), deve
haver redução de pelo menos 2 log em 14 dias da carga bacteriana inicialmente
inoculada e não deve haver aumento de microrganismos até o final do teste. Quanto
aos fungos, não deve haver aumento de microrganismos contatos no início do teste,
no 14º dia e no período final do teste. O método de regressão linear é outra
metodologia descrita para avaliação da eficácia do sistema conservante. Neste
método, a taxa de inativação dos microrganismos é obtida através da redução
decimal (valor D), que corresponde ao tempo necessário para que 90% (1 log) da
população microbiana do teste morra, quando submetidos ao agente letal (ORTH,
1993; MAZZOLA et al., 2003).
De acordo com Orth e Steinberg (2003), o valor D é calculado tomando-se a
recíproca negativa da inclinação da curva de sobrevida traçada, utilizando o número
log de microrganismos sobreviventes em função do tempo em que as amostras foram
coletadas para cada espécie microbiana teste. Menores valores D indicam uma taxa
de morte rápida, e, valores maiores, indicam que a taxa de morte é mais lenta.
As vantagens que podem ser conferidas ao método do valor D são resultados
rápidos, possibilidade de estimar o tempo necessário para eliminação total de
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
124
qualquer microrganismo em um produto, pode ser utilizado em estudo de efeitos
aditivos e sinérgicos de combinação de conservantes (PINTO et al., 2003).
O teste de neutralizante foi executado para permitir a contagem de
microrganismos viáveis presentes no sabonete líquido com 3% de digluconato de
clorexidina. Neste estudo, o método escolhido para neutralização da formulação foi a
diluição, pois se tivesse sido empregado algum inativante para clorexidina, o
tensoativo permaneceria exercendo sua atividade antimicrobiana, e com a diluição
este produto também foi neutralizado.
Neste trabalho foi seguida a metodologia recomendada pelas farmacopéias
britânica (2003) e americana (2006), com algumas modificações, para o método
convencional. De acordo com os compêndios, o teste é realizado em intervalos de
tempo de 0, 6 e 24 horas, 7, 14 e 28 dias (BP, 2003) e de 0 hora, 7, 14 e 28 dias
(USP, 2006). Os intervalos de tempo analisados neste trabalho foram 0, 2, 6, 12, 24 e
48 horas, 7, 14, 21 e 28 dias, a fim de obter um maior número de pontos.
Os resultados obtidos demonstram que foi necessário uma diluição do
sabonete líquido contendo clorexidina maior do que aquela recomendada pela
literatura para que fosse possível a contagem do número de microrganismos viáveis
comparáveis ao controle, tendo em vista que nas diluições sugeridas pela
metodologia seguida neste trabalho, não houve crescimento microbiano. Os
resultados obtidos no ensaio de atividade antimicrobiana em meio líquidofoi verificado
que o sabonete na concentração de 3 x 10
-8
% inibiu o crescimento de S. aureus, E.
coli e C. albicans.
Para que o valor D seja critério de aceitação no teste desafio, este número
deve ser menor ou igual a 4 horas para bactérias patogênicas e menor ou igual a 28
horas para bactérias não patogênicas e bolores (BP, 2003).
De acordo com os requisitos exigidos pelas farmacopéias britânica (2003) e
americana (2006), ambos os produtos analisados (sabonete líquido contendo ou não
digluconato de clorexidina) apresentaram eficácia para o S. aureus e foram aceitos
quanto ao teste desafio pela metodologia convencional e pelo método rápido. Houve
redução de 100% da carga microbiana inoculada antes de 48 horas e durante o
período de realização do teste não houve desenvolvimento de microrganismos e o
valor D foi inferior a 4 horas.
Os resultados encontrados para C. albicans demonstraram que as duas
formulações analisadas foram eficazes e aceitas no teste desafio pelo método
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
125
convencional e pelo método rápido. Houve morte em 100% da carga microbiana
inicialmente inoculada antes de 48 horas e durante o período de realização do teste
não houve desenvolvimento da levedura e o valor D encontrado foi menor que 28
horas. Portanto, as formulações estavam de acordo com os requisitos exigidos pelos
compêndios oficiais seguidos neste trabalho.
Para E. coli, as formulações analisadas foram eficazes e aceitas para o teste
desafio quando adotada a metodologia convencional e do teste rápido. Houve
redução de 100% dos microrganismos inicialmente inoculados em menos de 48 horas
e durante a realização do teste os mesmos não se desenvolveram. O valor D
encontrado para as formulações analisadas foi inferior a 4 horas. Portanto, as
formulações estavam de acordo com os requisitos exigidos pelos compêndios oficiais.
Para P. aeruginosa as duas formulações analisadas atenderam aos requisitos
farmacopéicos exigidos para o teste desafio pela metodologia convencional, pois
houve redução de 100% da carga microbiana inicialmente inoculada antes de 48
horas e durante o período de realização do teste não houve desenvolvimento de
microrganismos, mas apenas a formulação com clorexidina atendeu aos requisitos
farmacopéicos exigidos pelo teste rápido, pois o valor D para a formulação isenta de
clorexidina foi superior a 4 horas.
Para o fungo A. niger as duas formulações analisadas cumpriram com os
requisitos farmacopéicos exigidos para o teste desafio pela metodologia convencional
e do teste rápido. Houve redução de 100% da carga microbiana inicialmente
inoculada em menos de 48 horas e durante o perído de realização do teste não houve
proliferação deste microrganismo e ovalor D encontrado foi infeiror a 4 horas.
Diante dos resultados encontrados, foi verificado que as duas formulações
foram eficazes na eliminação dos microrganismos analisados, confirmando dados da
literatura que o tensoativo lauroilmiristilsarcosinato de sódio possui atividade
antimicrobiana (BALSAM et al., 1972). Esse fato justifica não ter havido grande
diferença nos valores D encontrados para a formulação com e sem a presença de
clorexidina diante dos microrganismos desafiados, e também em relação ao tempo
necessário para que ocorresse morte de 100% da população microbiana.
Porém, este fato favoreceu a realização de diluições altas da formulação, e
isso acarretou em diminuição da sensibilidade da técnica.
Diante dos resultados obtidos no teste desafio, foi possível concluir que não
houve formação de halo de inibição para as formulações 1 e 2 analisadas nos
Teste de eficácia
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
126
ensaios de atividade antimicrobiana por difusão em ágar, devido às interações
ocorridas entre o tensoativo e o meio de cultura sólido, ao excesso de clorexidina e o
meio de cultura, devido à viscosidade das formulações e ao complexo formado entre
a clorexidina e o tansoativo lauriléter.
Estes dados também confirmam que os resultados obtidos com o teste de
atividade antimicrobiana por difusão em ágar para as formulações 3 e 4 são devido
ao tensoativo sarcosinato.
Também confirmam os resultados obtidos nos ensaios de atividade
antimicrobiana por diluição em caldo, em que grandes diluições das formulações
mostraram-se eficazes para inibir o crescimento microbiano.
7.10. Conclusão
Foi possível concluir que tanto a clorexidina quanto o tensoativo sarcosinato
utilizado nas formulações possuem atividade conservante, mas esta ação não foi
muito potencializada quando se adicionou clorexidina à formulação de sabonete
líquido em estudo, com exceção diante da bactéria P. aeruginosa.
A metodologia do valor D estava em concordância com os resultados
encontrados pela metodologia convencional para S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C.
albicans e A. Níger para a formulação com clorexidina e para a formulação sem
clorexidina houve discordância apenas em relação à P. aeruginosa, com valor D
superior a 4 horas.
Estas informações confirmam os resultados obtidos com os ensaios de
atividade antimicrobiana, que demonstraram que grandes diluições das formulações
foram eficazes para impedir o desenvolvimento microbiano e que os resultados
obtidos pelo teste de difusão em ágar foram falso-negativos, por não haver formação
de halo de inibição devido à viscosidade, às interações ocorridas entre as
formulações e o meio de cultura sólido e entre a clrexidina e os tensoativos utilizados.
A metodologia do valore D foi importante porque considerou a resistência do
microrganismo em análise quando estva em contato direto com agente químico
possuidor de atividade antimicrobiana.
Finalmente, foi observado que entre os microrganismos testados, a P.
aeruginosa foi o mais resistente à clorexidina, conforme observado nos testes de
atividade animicrobiana pelo método de diluição em caldo e corroborando os dados
da literatura.
8. ANÁLISE QUANTITATIVA DE SABONETE LÍQUIDO
DESENVOLVIDO CONTENDO 3% DE DIGLUCONATO DE
CLOREXIDINA
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
128
Este estudo teve por objetivo avaliar o teor de digluconato de clorexidina
presente no sabonete líquido contendo 3% de digluconato de clorexidina.
8.1. Material
Foram utilizadas solução padrão secundário de digluconato de clorexidina e
solução amostra de digluconato de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3
respectivamente.
As determinações foram realizadas em espectrofotômetro especificado na
Lista de Equipamentos, (p.xxvii, item 13), utilizando etanol como solvente.
8.1.1. Preparo da substância química padrão secundário
A partir da solução padrão secundário de digluconato de clorexidina 20,98%
(p/v), foi preparada uma solução a 0,1%. Uma alíquota de 500,0 µL da solução
padrão foi diluída em balão volumétrico de 100 mL, utilizando-se água deionizada
para obtenção de solução a 0,1% (solução A).
8.1. 2. Método
A partir da solução A, uma alíquota de 200,0 µL foi transferida para balão
volumétrico de 10 mL, com auxílio de micropipeta, e foi diluída utilizando-se etanol
para obtenção de uma solução a 0,002%.
O espectro de absorção na região de ultravioleta foi obtido utilizando-se o
equipamento especificado na Lista de Equipamentos (p. xxvii, item 13) e cubeta de
quartzo de 1 cm de caminho óptico. A leitura foi realizada entre 200 e 400 nm. O
espectro de absorção de solução de digluconato de clorexidina padrão secundário,
em etanol, na região de ultravioleta pode ser visto na Figura 41.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
129
Figura 41. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina padrão
secundário em etanol, em concentração de 0,002%, de 200 a 400 nm.
8.1.2.1. Obtenção da curva de Ringbom
A curva de Ringbom foi realizada com o objetivo de determinar a faixa de
concentração na qual o método espectrofotométrico na região de ultravioleta
obedece à linearidade.
A partir da solução padrão secundário de digluconato de clorexidina 20,98%,
foi preparada uma solução a 0,1%. Uma alíquota de 500,0 µL da solução padrão foi
transferida para balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de micropipeta, e foi
diluída utilizando-se água deionizada para obtenção de uma solução a 0,1%
(solução A). A partir da solução A, foram preparadas soluções de digluconato de
clorexidina em concentrações crescentes, para obtenção da curva de Ringbom de
18 pontos. Soluções com concentrações de 0,0002 a 0,0036% de digluconato de
clorexidina foram obtidas transferindo-se alíquotas da solução A para balão
volumétrico de 10 mL e completando-se o volume com etanol (Tabela 53). As
leituras foram efetuadas no comprimento de onda de 260,0 nm.
A Figura 42 apresenta as leituras espectrofotométricas que permitiram a
construção da curva de Ringbom.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
130
Tabela 53. Preparo da curva de Ringbom de digluconato de clorexidina pelo método
espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm
Pontos
Volume (µL) solução
estoque de digluconato
de clorexidina 0,1%
Concentração
final
(%)
Absorvância
(ABS)
100-T%
1 20 0,0002 0,082 17,205
2 40 0,0004 0,173 32,857
3 60 0,0006 0,261 45,172
4 80 0,0008 0,347 55,022
5 100 0,0010 0,428 62,674
6 120 0,0012 0,501 68,449
7 140 0,0014 0,588 74,177
8 160 0,0016 0,662 78,222
9 180 0,0018 0,762 82,701
10 200 0,0020 0,839 85,512
11 220 0,0022 0,905 87,554
12 240 0,0024 0,985 89,648
13 260 0,0026 1,096 91,983
14 280 0,0028 1,185 93,468
15 300 0,0030 1,279 94,739
16 320 0,0032 1,368 95,714
17 340 0,0034 1,439 96,360
18 360 0,0036 1,526 97,021
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
131
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0,0001 0,001 0,01
Concentração (%)
100-T%
Figura 42. Curva de Ringbom obtida pelo método espectrofotométrico na região de
ultravioleta para solução de digluconato de clorexidina padrão secundário, utilizando etanol
como solvente, no comprimento de onda de 260 nm.
8.1.2.2. Obtenção da curva analítica
Para obtenção da curva analítica de solução de digluconato de clorexidina
padrão secundário, foram transferidas alíquotas de 500,0 µL da solução padrão
secundário de digluconato de clorexidina para balão volumétrico de 100 mL e seu
volume foi completado com água deionizada (solução A). A partir da solução A,
foram preparadas soluções de digluconato de clorexidina em concentrações
crescentes, de 0,001% a 0,002% para obtenção da curva analítica de 6 pontos. As
soluções foram obtidas transferindo-se alíquotas da solução A para balão
volumétrico de 10 mL e completando-se o volume com etanol (Tabela 54). Cada
concentração foi preparada em triplicata. As leituras das soluções foram efetuadas a
260 nm, utilizando etanol como branco.
Tabela 54. Preparo da curva analítica de digluconato de clorexidina pelo método
espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm
Pontos
Volume (µL) solução estoque de
digluconato de clorexidina 0,1%
Concentração final
(%)
1 100 0,0010
2 120 0,0012
3 140 0,0014
4 160 0,0016
5 180 0,0018
6 200 0,0020
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
132
Os resultados das leituras de absorvância obtidos para construção da curva
analítica estão apresentados na Tabela 55.
Tabela 55. Valores de absorvâncias determinados para a curva analítica de
digluconato de clorexidina padrão secundário por espectrofotometria na região de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Pontos
Concentração de
digluconato de clorexidina
(%)
Absorvância a 260
nm
Absorvância
média ±
e.p.m. *
DPR%**
1
0,0010
0,427
0,422
0,425
0,425 ±
0,0015
0,59
2
0,0012
0,523
0,522
0,527
0,524 ±
0,0015
0,50
3
0,0014
0,613
0,617
0,620
0,617 ±
0,0020
0,57
4
0,0016
0,714
0,707
0,704
0,708 ±
0,0030
0,72
5
0,0018
0,790
0,791
0,789
0,790 ±
0,0006
0,13
6
0,0020
0,889
0,884
0,888
0,887 ±
0,0015
0,30
* e.p.m. erro padrão da média; ** DPR desvio padrão relativo
A curva analítica de digluconato de clorexidina (Figura 48) foi construída com
as médias dos valores de absorvâncias de três curvas analíticas obtidas nos ensaios
de linearidade. A equação da reta determinada pelo método dos mínimos quadrados
é y = 457,33 x - 0,0276, com coeficiente de correlação (R) igual a 0,9997.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
133
A representação gráfica da curva analítica e o coeficiente de regressão das
soluções de digluconato de clorexidina em concentrações de 0,001 à 0,002% pelo
método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm estão representados
na Figura 43.
y = 457,33x - 0,0276
R
2
= 0,9993
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025
Concentração (%)
Absorvância
Figura 43. Representação gráfica da curva analítica da solução de digluconato de
clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm, utilizando
etanol como solvente.
8.2. Análise estatística
A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela análise de
regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. Os valores de absorvâncias
utilizados na determinação da curva analítica foram estatisticamente avaliados pela
análise da variância (ANOVA), apresentada na Tabela 56.
Tabela 56. Análise da variância das absorvâncias determinadas na obtenção da
curva analítica de digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na
região de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Fontes de variação GL
soma dos
quadrados
variância
F
calc
F
tab
ENTRE doses 5 0,43952 0,08790 732,53* 3,11
regressão linear 1 0,43893 0,43893 3657,73*
4,75
desvio de linearidade
4 0,00059 0,00015 1,23 3,26
RESÍDUO 12 0,00012 0,00001 - -
TOTAL 17 0,43964 - - -
*significativo para p< 0,5.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
134
Os parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos
para a curva analítica encontram-se na Tabela 57.
A abortividade molar (ε) foi calculada pela equação:
Equação 3
Em que: A = absorvância
c = concentração molar
b = caminho óptico da cubeta (cm)
Tabela 57. Parâmetros analíticos utilizados na determinação de digluconato de
clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente
Parâmetros Resultados
λ (nm) 260
ε (L/M.cm) 276202540783,52
Faixa de concentração utilizada (%)
0,001 – 0,002
Equação: y = ax + b
a 457,33
b 0,0276
r (coeficiente de correlação) 0,9997
n 6
8.3. Determinação de digluconato de clorexidina no sabonete líquido
8.3.1. Preparo do padrão
A solução padrão secundário de digluconato de clorexidina foi preparada
conforme descrita no item 8.1.2.
8.3.2. Preparo da amostra
Foram pesados 400,0 mg de sabonete líquido contendo 3% de digluconato de
clorexidina e transferidos para balão volumétrico de 100 mL e seu volume foi
completado com água deionizada, obtendo-se solução com concentração de
0,012%. Desta solução, 1,667 mL foram transferidos para balão volumétrico de 10
ε = A/(c.b)
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
135
mL, com auxílio de micropipeta, e seu volume foi completado com etanol, obtendo-
se concentração final de 0,002%. As soluções foram preparadas em seis réplicas.
As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 260 nm, utilizando
cubeta de quartzo com 1 cm de caminho óptico e sabonete líquido isento de
clorexidina e etanol como branco.
O cálculo do teor de digluconato de clorexidina no sabonete líquido foi feito
uilizando-se a Equação 4.
Em que: C
A
= concentração da amostra (%)
C
SP
= concentração da solução padrão secundário (%)
A
A
= absorvância da amostra
A
SP
= absorvância da solução padrão secundário
O teor percentual de digluconato de clorexidina nas amostras foi calculado
segundo a Equação 5.
Em que: C
A
= concentração de digluconato de clorexidina encontrada na
amostra (%)
C
t
= concentração teórica de digluconato de clorexidina na amostra
8.3.3. Resultados
Os valores de teor de digluconato de clorexidina no sabonete líquido,
determinados pelo método proposto, encontram-se na Tabela 58.
C
A
= A
A
. C
SP
/ A
SP
C
A
% = C
A
. 100 / C
t
Equação 4
Equação 5
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
136
Tabela 58. Valores determinados para o doseamento de sabonete líquido com
digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Ensaios
Teor de digluconato de CHX
1
sabonete
líquido* (%)
Teor médio ±
e.p.m.
DPR%
I 2,91
II 2,87 2,89 ± 0,0921 0,7877
III 2,90
*cada valor é média de três determinações
1
CHX, digluconato de clorexidina em sabonete líquido
e.p.m. – erro padrão da média; DPR% - desvio padrão relativo
8.4. Teste de recuperação
O teste de recuperação é realizado com o objetivo de determinar a exatidão
do método desenvolvido (AOAC, 1990; USP, 2004). Para a realização deste teste,
quantidades exatamente definidas de solução padrão secundário de digluconato de
clorexidina foram adicionadas às soluções amostras de sabonete líquido contendo
digluconato de clorexidina para a quantificação da substância.
8.4.1. Preparo das soluções
A partir da solução padrão secundário com concentração de 0,1%, foi
preparada solução de digluconato de clorexidina em concentração de 0,002%.
As soluções amostras foram preparadas com concentração de 0,012%, a
partir da solução de sabonete líquido com digluconato de clorexidina.
Para o ensaio de recuperação, foram transferidas alíquotas de 1,0 mL da
solução amostra para balões volumétricos de 10 mL, denominadas A, R1, R2 e R3.
Foram adicionadas quantidades de 20,0; 40,0; 60,0 e 120,0 µL de solução de
digluconato de clorexidina padrão secundário em concentração de 0,1% nos balões
R1, R2, R3 e P, respectivamente. Os volumes dos balões foram completados com
etanol, obtendo-se concentrações de 0,0012; 0,0014; 0,0016; 0,0018; 0,0012% para
os balões A, R1, R2, R3 e P, respectivamente (Tabela 59). Cada concentração foi
preparada em triplicata.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
137
Tabela 59. Preparo das soluções para o teste de recuperação de sabonete líquido
de digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Vol. Sol. da amostra
0,012% (µL)
Vol. Sol padrão sec. CHX
0,1%
Concentração final
(%)
A 1000,0 - 0,0012
R1
1000,0 20,0 0,0014
R2
1000,0 40,0 0,0016
R3
1000,0 60,0 0,0018
P - 120,0 0,0012
8.4.2. Cálculo do teste de recuperação
A percentagem de digluconato de clorexidina recuperada (R%) foi calculada
utilizando-se a Equação 6.
Em que: Cf = concentração da solução amostra adicionada de padrão (%)
Ca = concentração da amostra (%)
Cr = concentração teórica da substância padrão secundário adicionada (%)
8.4.3. Resultados
Os valores encontrados no teste de recuperação para sabonete líquido com
digluconato de clorexidina estão na Tabela 60.
%R = [(Cf-Ca)/Cr] x 100
Equação 6
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
138
Tabela 60. Valores obtidos no teste de recuperação do sabonete líquido contendo
digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região do ultravioleta
a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Digluconato
CHX SPS*
adicionado
(%)
Concentração
final
(%)
Digluconato
CHX
encontrado
(%)
*
Recuperação
(%)
Recuperação
média (%)
DPR
(%)
R1
0,0002 0,0012 0,00139 101,41
R2
0,0004 0,0014 0,00158 99,01 100,12 1,21
R3
0,0006 0,0016 0,00178 99,93
DPR, desvio padrão relativo, * digluconato de clorexidina solução padrão secundário
8.5. Validação
A validação do método espectrofotométrico de ultravioleta para sabonete
líquido contendo digluconato de clorexidina foi realizada de acordo com o guia
publicado pela ANVISA (BRASIL, 2003).
8.5.1. Linearidade
Os resultados obtidos na construção da curva analítica, descrita no item 8.1.2,
foram analisados para obtenção da equação da reta pelo método dos mínimos
quadrados e a linearidade foi verificada pela ANOVA.
8.5.2. Precisão
A precisão foi avaliada pelos ensaios para determinação de digluconato de
clorexidina em sabonete líquido, durante três dias consecutivos e o desvio padrão
relativo (DPR%) dos dados foi calculado estatisticamente. Os resultados desta
análise estão descritos no item 8.3.3, na Tabela 58.
A precisão foi avaliada pelos ensaios de repetibilidade (intradia e interdia) e
reprodutibilidade, realizados em três dias diferentes, nos quais foram analisadas seis
amostras preparadas em cada dia. O teor de digluconato de clorexidina encontrado
no sabonete líquido foi em média 2,89%. O desvio padrão relativo das absorvâncias
nas leituras foi de 1,07 e 1,05% no ensaio intradia e interdia (intermediária),
respectivamente.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
139
Ensaios preliminares de reprodutibilidade foram realizados variando o
espectrofotômetro (Tabela 61). Foram utilizados equipamentos de marcas diferentes
em diferentes laboratórios como descrito na Lista de Equipamentos (p. xxviii, item
13).
Tabela 61. Valores obtidos para a reprodutibilidade do método espectrofotométrico
na região de ultravioleta a 260 nm do sabonete líquido com digluconato de
clorexidina, utilizando etanol como solvente
Absorvâncias
Absorvância média ± e.p.m.
DPR (%)
DPR (%) total
1
0,893; 0,877
0,879; 0,891
0,886; 0,890
0,886 ± 0,0028
0,76
2
0,874; 0,863
0,874; 0,869
0,876; 0,876
0,872 ± 0,0021
0,58
0,67
DPR, desvio padrão relativo; e.p.m., erro padrão da média
Para o teste de reprodutibilidade, o desvio padrão relativo foi de 0,67%.
Assim, os desvios estão dentro do permitido, que é de, no máximo, 5% para
produtos farmacêuticos, comprovando a precisão do método.
8.5.3. Exatidão
A exatidão do método foi determinada pelo ensaio de recuperação, conforme
descrito no item 8.4. O método proposto é exato, uma vez que a média das
recuperações foi 100,12%, estando de acordo com o especificado na legislação
vigente (BRASIL, 2003), que recomenda recuperação entre 98% e 102%.
8.5.4. Especificidade e Seletividade
A especificidade do método proposto foi comprovada pela comparação da
resposta observada para o digluconato de clorexidina na ausência dos excipientes
(padrão secundário) e a resposta verificada na presença dos excipientes do
sabonete líquido (Figura 44).
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
140
Figura 44. Espectro na região ultravioleta da solução de digluconato de clorexidina padrão
secundário (em preto), solução de sabonete com clorexidina (em vermelho) e solução de
sabonete sem clorexidina (em azul), utilizando etanol como solvente.
8.5.5. Robustez
A robustez do método foi determinada pela comparação dos resultados
obtidos pela variação de parâmetros operacionais como a modificação no
comprimento de onda para leitura dos valores de absorvâncias. Desse modo,
utilizaram-se comprimentos de 260 nm e 255 nm (Tabela 62).
Tabela 62. Valores obtidos para a robustez do método espectrofotométrico na região
de ultravioleta a 260 nm para o sabonete líquido contendo digluconato de
clorexidina, utilizando etanol como solvente
Absorvância
Absorvância média ±
e.p.m.
DPR
(%)
DPR (%)
total
λ= 260 nm
0,875; 0,876
0,872; 0,881
0,875; 0,880
0,876 ± 0,0012
0,37
λ = 255
nm
0,875; 0,869
0,865; 0,872
0,869; 0,869
0,870 ± 0,0014
0,38
0,38
λ
, comprimento de onda; e.p.m., erro padrão da média; DPR, desvio padrão relativo
8.6. Discussão
A espectrofotometria é uma das técnicas mais utilizadas em análise
quantitativa, por ter facilidade de manuseio, custo relativamente baixo, boa
sensibilidade, exatidão, robustez, seletividade moderada e ampla aplicabilidade.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
141
Nesta região do espectro, ocorre absorção de moléculas com capacidade de sofrer
transições eletrônicas nos orbitais de baixa energia (GIL, 2007).
Métodos quantitativos utilizando espectrofotometria de absorção são
baseados na suposição de que a capacidade de absortividade de um sistema é
diretamente proporcional à concentração de soluto (Lei de Lambert-Beer) (ROCHA,
TEIXEIRA, 2004).
O método proposto para a quantificação de digluconato de clorexidina em
sabonete líquido foi desenvolvido utilizando etanol como solvente, uma vez que
apresentou boa intensidade de absorção da substância ativa neste meio como foi
verificado nos ensaios de identificação de digluconato de clorexidina, bem como sua
facilidade de aquisição. Embora a água também tenha demonstrado ser bom
solvente, houve interferência dos excipientes da formulação quando a utilizou como
solvente do sabonete líquido para análise quantitativa.
A linearidade refere-se à capacidade de um método analítico em produzir
respostas diretamente proporcional à concentração do analito nas amostras, em
determinada faixa de concentração (INMETRO, 2007). Desse modo, a linearidade
do método foi obtida na faixa de concentração de 0,001% a 0,002%, com coeficiente
de correlação de 0,9997, com desvio padrão relativo entre as determinações menor
que 5%, demonstrando a existência de correlação linear entre os valores analisados.
A precisão intradia (repetitividade) e intermediária também foi comprovada
com os dados do item 8.5.2, no qual se observa que os valores experimentais
obtidos estão próximos, com desvio padrão relativo inferior a 2%.
Embora a reprodutibilidade não seja necessária para validação de um método
efetuado por um só laboratório (LEITE, 2002; INMETRO, 2007), foram realizados
testes preliminares de reprodutibilidade em que se variou o equipamento e o
laboratório, obtendo desvio padrão relativo de 0,67%, estando de acordo com a
legislação, que recomenda desvio padrão relativo inferior a 5%.
A robustez tem por finalidade avaliar a sensibilidade que o método apresenta
diante de pequenas variações (INMETRO, 2007); sendo assim, a robustez do
método proposto pode ser comprovada de acordo com o item 8.5.5., no qual se
modificou o comprimento de onda de análise de absorvâncias.
A exatidão também foi comprovada demonstrando concordância entre os
valores experimentais e verdadeiros (LEITE, 2002; INMETRO, 2007), como
apresentado no item 8.5.3, com valor de recuperação de 100,12%.
Análise quantitativa
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
142
O parâmetro especificidade refere-se à resposta de apenas um analito,
enquanto que seletividade, refere-se às respostas para vários analitos, mas é
possível distinguir a resposta de um analito entre os outros (INMETRO, 2007).
A especificidade do método foi comprovada pelo percentual de resposta
observando-se as concentrações obtidas para a solução padrão secundário e
amostra. A seletividade foi demonstrada pela ausência de interferência dos
excipientes da formulação, como apresentado na Figura 49.
Como não há limite de variação de teor especificado na literatura para
sabonete líquido contendo digluconato de clorexidina, adotou-se a faixa de variação
de 10% em relação ao valor inicial de substância ativa. Neste caso, como a
formulação é sabonete líquido com 3% de digluconato de clorexidina, a faixa do teor
adotado varia de 2,7 a 3,3%. Este limite de variação foi adotado baseado na
farmacopéia americana (2008), que especifica como limite de variação 10% de
digluconato de clorexidina em creme oral. Como sabonete líquido também é um
produto não estéril e de uso externo, tomou-se este valor como limite.
8.7. Conclusão
O método espectrofotométrico na região ultravioleta a 260 nm proposto para
análise de teor de digluconato de clorexidina em sabonete líquido foi adequado, uma
vez que cumpriu com as exigências da legislação brasileira vigente em relação à
validação de métodos analíticos.
Além disso, é uma técnica de fácil e rápida execução, com pouco uso de
solvente e de baixo custo.
9. DISCUSSÃO GERAL
Discussão geral
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
144
A clorexidina é um importante anti-séptico com usos diversos em diferentes
áreas. No entanto, são necessárias as BPF e os devidos cuidados durante sua
manipulação e armazenamento para evitar que a solução contendo clorexidina seja
contaminada e comprometa sua eficácia.
Para a análise da clorexidina e seus produtos de degradação bem como suas
impurezas, há diversos métodos descritos na literatura, porém a CLAE se destaca. O
método proposto pelas farmacopéias européia e britânica (reação colorimétrica) para
análise de cloroanilina nos sais de clorexidina é menos sensível e exato. Os métodos
propostos por Revelle e colaboradores (1993) e por Doub (1996), apenas separa e
identifica as impurezas da clorexidina, mas não as quantifica.
Entre os métodos de análise para clorexidina em fluidos biológicos
encontrados na literatura, o método espectrofotométrico apresentado por Jensen e
Christensen (1971) não é específico para clorexidina, pois recupera constituintes da
saliva, embora seja um método de simples e fácil execução. Entretanto, o método de
fluorescência descrito por Vries e colaboradores (1991) é simples e exato para
determinação de clorexidina em solução aquosa e em saliva. O método proposto por
Bosnevoll e colaboradores (1974) verifica a quantidade de clorexidina que fica retida
na boca após 24 horas do enxágue com solução de digluconato de clorexidina 0,2%.
Os métodos cromatográficos de análise para clorexidina em saliva são mais
trabalhosos exigindo processos de extração mais demorados e complicados, porém
possuem maior sensibilidade e especificidade; o método de micro-extração em fase
sólida permite avaliar diversos aspectos como ligação e estabilidade da clorexidina à
saliva, farmacocinética da clorexidina após enxágue com a solução de clorexidina,
porém, exige diversas passagens para a extração da clorexidina, tornado-se
trabalhoso e necessitando de maior tempo de análise.
O método de análise apresentado por Usui e colaboradores (2006), é mais
sensível e seletivo que o método CLAE-UV e também fornece mais informações para
a identificação da clorexidina e suas impurezas.
Para determinação de clorexidina em urina, a CLAE é o método de escolha. O
método proposto por Wainwright e Cooke (1986) permite detectar p-cloroanilina na
urina, porém apenas a clorexidina foi quantificada. A técnica de CLAE associada à
extração em fase sólida, apresentada por Below e colaboradores (2004), permite
determinar o limite de quantificação de clorexidina em fluidos biológicos e em
Discussão geral
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
145
preparações farmacêuticas e também possibilita observação de p-cloroanilina e 1-
cloro-4-nitrobenzeno, mas suas quantificações não são exatas.
Em preparações farmacêuticas, a CLAE é o método mais utilizado, porém
necessita de extração da clorexidina dos produtos que em alguns casos é demorada.
O método proposto por Miribel e colaboradores (1983) necessitou de diversos
passos, e, espectrometria de massas e ressonância magnética foram realizadas para
verificar se a estrutura química era realmente da clorexidina. Os métodos propostos
por Gavlick (1992) e Bauer e colaboradores (1984) permitem quantificação de
clorexidina e cloroanilina.
Não foi encontrado na literatura método de análise para sabonete líquido
contendo digluconato de clorexidina e análise quantitativa pelo ensaio microbiológico
por difusão em ágar para solução de digluconato de clorexidina. Em virtude destes
motivos, estes métodos foram desenvolvidos e validados.
A solução de digluconato de clorexidina utilizada neste trabalho cumpriu com
os testes de identificação, uma vez que estava de acordo com os parâmetros
farmacopéicos exigidos e de acordo com a solução padrão secundário.
O método analítico de doseamento microbiológico da solução de digluconato
de clorexidina por difusão em ágar mostrou-se uma técnica eficiente, com pouco
custo e facilidade de execução. Foi possível validar este método, utilizando-se
análises de variância, no qual a solução apresentou potência de 92,58% frente ao
microrganismo S. aureus.
As formulações de sabonetes líquidos desenvolvidas demonstraram diferentes
características físicas, quando observadas visualmente, confirmando o fato de haver
precipitação e turvação das preparações contendo tensoativo aniônico lauril.
Em relação à viscosidade, também foi observado que, com aumento da
concentração de clorexidina nos produtos, houve aumento da viscosidade, até o
ponto em que o sistema micelar do tensoativo suportou a quantidade de clorexidina
presente e conseguiu manter o sistema, como observado nas formulações I e II
contendo 1% e 2% de clorexidina. No entanto, ao adicionar quantidade maior de
clorexidina, o sistema micelar não mais conseguiu estabilizar o sistema, acarretando
perda da viscosidade, como observado nas formulações I e II contendo 3% e 4% de
clorexidina.
Em relação ao tensoativo aniônico sarcosinato, houve uma melhor estabilidade
do sistema sem a presença de turvação e precipitação, demonstrando que este
Discussão geral
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
146
detergente embora seja também aniônico, foi estruturalmente mais compatível com a
clorexidina.
De acordo com resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana pelo
método de difusão em ágar foi verificado que as formulações 1 e 2 contendo
tensoativo aniônico lauril não apresentaram atividade antimicrobiana. Entretanto,
quando analisadas pelo método da microdiluição em caldo, houve atividade para
alguns dos microrganismos analisados, demonstrando que a incompatibilidade deste
produto com a clorexidina é técnica.
O fato de não ter havido resposta antimicrobiana pelo método de difusão em
ágar para as formulações 1 e 2, pode ser devido à interação entre o tensoativo
aniônico lauril e o meio de cultura sólido, entre o excesso de clorexidina e o meio de
cultura sólido, dificuldade de difusão por causa do excesso de viscosidade nas
formulações com maiores quantidades de clorexidina e pela formação do complexo
aniônico-catiônico formado entre a clorexidina e tensoativo lauril, que pode ter
dificulatado a difusão da clorexidina no ágar.
O fato de ter havido halo de inibição de crescimento microbiano menor para as
formulações 3 e 4 com maiores concentrações de clorexidina, quando analisadas
pelo método de difusão em ágar, possivelmente ocorreu porque houve maior
interação do excesso de clorexidina com o meio de cultura sólido, devido à
viscosidade das formulações com maiores concentrações de clorexidina e pode ter
havido formação de complexo aniônico-catiônico entre o tensoativo sarcosinato e o
excesso de clorexidina, que dificultou a difusão no ágar.
O tensoativo sarcosinato pode ter interagido menos com o meio de cultura
sólido e isto possibilitou a difusão do mesmo no ágar e houve formação do halo de
inibição de crescimento, pois como já foi visto anteriormente neste trabalho, este
tensoativo possui atividade antimicrobiana superior a do tensoativo lauril. Entre os
microrganismos testados, os Gram-positivos foram mais sensíveis.
Quando as formulações 3 e 4 foram analisadas pelo método de diluição em
caldo foi verificado que com o aumento da concentração da clorexidina nas
formulações houve melhora da resposta antimicrobiana, demonstrando que não
houve interações entre as formulações e o meio de cultura líquido.
O método de microdiluição em caldo foi melhor em relação à técnica de difusão
em ágar, pois a viscosidade das formulações, as interações entre o tensoativo e o
meio de cultura e a maior quantidade de clorexidina nas formulações não interferiram
Discussão geral
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
147
nos resultados como aconteceu para o método de difusão. Confirmando os dados
obtidos com o teste de atividade antimicrobiana por difusão em ágar, os
microrganismos mais sensíveis à clorexidina foram os Gram-positivos.
Houve dificuldade de análise de atividade antimicrobiana dos sabonetes
líquidos, pois os tensoativos presentes possuem atividade antimicrobiana, e
justamente por isso foram realizados controles apenas com o sabonete líquido isento
de clorexidina e também os tensoativos podem ter inferido com o meio de cultura
sólido dificultando a difusão do produto e a formação do halo de inibição de
crescimento, podendo mascarar os resultados.
O tensoativo anfótero cocoamidopropil betaína não modificou as aspectos
físicos das formulações 2 e 4 quando comparadas com as formulações 1 e 3,
respectivamente, pois as formulações 1 e 2 apresentaram-se turvas e com
precipitação enquanto que as formulações 3 e 4 apresentaram-se límpidas.
O tensoativo cocoamidopropil betaína também não alterou os resultados de
atividade antimicrobiana, pois pelo método de difusão em ágar as formulações 1 e 2
não apresentaram resposta e as formulações 3 e 4 apresentaram respostas
semelhantes. Quando comparadas pelo método de diluição em caldo, as formulações
1 e 2 apresentaram respostas antimicrobiana semelhantes, quando comparadas na
mesma concentração para o mesmo microrganismo, e as formulações 3 e 4 também
apresentaram respostas semelhantes, quando comparadas na mesma concentração
para o mesmo microrganismo.
No teste desafio foi avaliado o sabonete líquido contendo clorexidina e a
mesma formulação isenta de clorexidina, frente a S. aureus, E. coli, C. albicans, P.
aeruginosa e A. niger. Os resultados demonstraram não haver grande diferença de
atividade antimicrobiana entre as formulações analisadas, pois não houve grande
diferença de valor D encontrado para ambas as formulações.
As duas formulações analisadas cumpriram com o teste desafio diante de
todos os microrganismos analisados pelo método convencional. Quanto à
metodologia do teste rápido, apenas a formulação isenta de clorexidina não atendeu
aos requisitos exigidos pelas farmacopéias diante de P. aeruginosa, pois o valor D
obtido foi superior a 4 horas.
Como se trata de produto contendo tensoativo com atividade antimicrobiana,
foi necessário realizar diluições maiores que as diluições apresentadas pela literatura
para o teste de neutralizante, mas este fato acarretou em perda de sensibilidade da
Discussão geral
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
148
técnica. Portanto, produtos que naturalmente possuem atividade antimicrobiana,
mesmo sem a adição de ativos, dificultam a sua análise. Talvez seja este o motivo de
não ter sido encontrado na literatura trabalhos de atividade antimicrobiana de
sabonetes líquidos pelo método de difusão em ágar, diluição em caldo e teste
desafio.
Há neutralizantes para a clorexidina como solução de azolectina a 0,75% e
tween 80 a 0,5%, mas se estes produtos tivessem sido utilizados não teria sido feito a
neutralização do tensoativo presente nas formulações, por isso foi escolhido o
método da diluição para neutralizar os produtos em análise.
O método analítico na região de ultravioleta utilizando etanol como solvente
demonstrou-se sensível, de fácil aplicação, rápida execução, com baixo custo e sem
geração de resíduos tóxicos. Foi validado de acordo com análise de variância e
cumpriu com os parâmetros descritos na legislação vigente para validação de
métodos analíticos.
10. CONCLUSÕES
Conclusões
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
150
A solução de digluconato de clorexidina foi identificada e caracterizada
utilizando-se técnicas como faixa de fusão, densidade relativa, pH, cromatografia em
camada delgada, espectrofotometria na região de ultravioleta e infravermelho.
Foi possível propor ensaio microbiológico, pela técnica de difusão em ágar,
utilizando S. aureus como microrganismo indicador, para solução de digluconato de
clorexidina como método de análise quantitativa.
No estudo de atividade antimicrobiana das formulações desenvolvidas foi
constatado que a incompatibilidade entre o tensoativo aniônico lauriléter sulfato de
sódio e a clorexidina é técnica, mas ainda assim possui atividade antimicrobiana.
O estudo de atividade antimicrobiana em meio líquido foi mais favorável para
verificar a atividade das formulações sem interferentes, pois no ensaio por difusão em
ágar, a viscosidade das formulações, as interações entre o tensoativo e meio de
cultura e o excesso de clorexidina e o meio de cultura prejudicaram os resultados.
Diante dos resultados apresentados pelo ensaio de atividade antimicrobiana
por microdiluição em caldo, foi observado que há aumento de atividade
antimicrobiana quando se eleva a concentração de clorexidina de 1%, 2% e 3% em
todas as formulações. No entanto, ao elevar para 4%, não há melhora significativa de
atividade, principalmente ao se levar em conta fatores econômicos, de toxicidade e
risco de resistência bacteriana.
O tensoativo sarcosinato foi estruturalmente mais compatível com a clorexidina
uma vez que não houve precipitação e turvação das formulações com este
detergente e também interagiu menos com os meios de cultura utilizados nos ensaios
de atividade antimicrobiana.
O tensoativo cocoamidopropil betaína não melhorou os aspectos físicos e a
atividade antimicrobiana das formulações 2 e 4 em relação às formulações 1 e 3,
respectivamente.
No estudo do teste desafio, as duas formulações estudadas (com e sem a
presença de clorexidina), cumpriram com os requisitos farmacopéicos para a
metodologia convencional. Para a metodoliga do teste rápido, apenas a formulação
sem a presença de clorexidina não cumpriu com o teste para a P. aerugionosa.
Para E. coli, o valor D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 4,06
horas e para o sabonete com a clorexidina foi, 1,9 horas. Para P. aeruginosa o valor
D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 8,1 horas e para o sabonete com
a clorexidina foi 4,0 horas. Para A. niger, o valor D para o sabonete sem a clorexidina
Conclusões
Flávia Angélica Másquio Fiorentino
151
foi 8,3 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 4,1 horas. Para S. aureus o valor
D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 1,4 horas e para o sabonete com
a clorexidina foi 0,43 horas e para C. albicans, o valor D encontrado para o sabonete
sem a clorexidina foi 1,1 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 0,43 horas.
Foi possível desenvolver e validar o método de análise quantitativa de
sabonete líquido contendo digluconato de clorexidina, pela técnica de
espectrofotometria na região de ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
e faixa de concentração de 0,001% a 0,002%.
Este trabalho foi satisfatório, por conseguir desenvolver formulações distintas
com diferentes concentrações de digluconato de clorexidina e avaliar suas atividades
antimicrobianas, apesar das interferências ocorridas entre as formulações e as
técnicas utilizadas.
Diante dos resultados obtidos com estes ensaios, foi possível obter uma
formulação satisfatória em relação à ativadade antimicrobiana, custo, facilidade de
utilização e também foi possível o desenvolvimento e validação de metodologia
analítica quantitativa para esta formulação. A formulação que satisfez aos objetivos
deste trabalho foi a formulação 3 contendo 3% de digluconato de clorexidina.
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