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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
“ESTUDO DA EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA TUBERCULOSE EM
PACIENTES DE ARARAQUARA-SP, NO PERÍODO DE
2002 À 2006”
Adolfo Carlos Barreto Santos
ARARAQUARA - SP
Fevereiro/2009
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1
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
“ESTUDO DA EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA TUBERCULOSE EM
PACIENTES DE ARARAQUARA-SP , NO PERÍODO DE
2002 À 2006”
Adolfo Carlos Barreto Santos
Orientadora: Profª. Drª. Clarice Queico Fujimura Leite
Co-orientador: Prof. Dr. José Rodrigo Cláudio Pandolfi
Dissertação de mestrado
apresentada à Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – UNESP
– Araraquara-SP, para obtenção
do título de Mestre em Biociências
e Biotecnologia aplicada à
Farmácia.
ARARAQUARA - SP
Fevereiro/2009
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2
DEDICO
À minha mãe, Maria Adir,
Por todo o apoio e dedicação por todos esses anos,
Pela confiança em mim depositada,
Pelo incentivo ao conhecimento,
Por comemorar as vitórias e entender as derrotas junto comigo,
Por agüentar minha ausência,
Pelo seu amor de MÃE.
Ao meu pai, Roque,
Pelo apoio e incentivo ao meu desenvolvimento,
Pela atenção e compreensão,
Pelo seu jeito particular de amar.
3
A minha orientadora Profa. Dra. Clarice Queico Fujimura Leite,
Pela sua orientação em todo este trabalho,
Por sua amizade e paciência,
Por sua preocupação comigo e todos os seus orientados,
Pelo ombro amigo sempre disposto a ajudar e
Pelo seu jeito de ser e sua maneira única de formar PESSOAS.
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, sempre presente...
Ao Prof. Dr. José Rodrigo Cláudio Pandolfi, meu co-orientador e
principalmente meu amigo que confiando no meu potencial me trouxe para a
pesquisa principalmente para o Lab. de Micobactérias;
Ao amigo Fernando Rogério Pavan, pelo companheirismo e amizade
bastante sinceros que construímos nesse período;
À amiga Karina Andrade de Prince, que tive a alegria de conviver desde a
minha chegada à Araraquara sendo sempre companheira, amiga e fiel;
À amiga Ana Carolina Malaspina, pela amizade, pelas tardes animadas no
SESA e por todos os momentos agradáveis que passamos juntos;
À Dra. Daisy Nakamura Sato pela sua amizade e apoio científico durante
todo esse tempo;
À minha prima Ana Carolina Correa Refinetti, por sempre estar ao meu lado,
pelas longas conversas diárias ao telefone sempre me apoiando, me
entendendo e sempre presente mesmo distante;
Aos amigos Gustavo Monanzi e Carlos Eduardo Brantis pelas conversas
rápidas no corredor e grande amizade conquistada;
Ao amigo Marcelo Miyata por suas perguntas que me fizeram pensar e por
sua amizade;
À amiga Natália Mendes que se fez presente no fim deste trabalho me
ajudando muito para este fechamento e pela amizade incondicional;
Aos amigos do laboratório, Paulinho, Cleso, Walclécio, Soraya, Faber, Lívia,
Carol Paçoca, André e Márcio, pela ajuda e apoio técnico;
Às amigas Sílvia, Marisa, Ednéia e Bernadete, pela amizade e apoio
laboratorial e administrativo;
Ao Prof. Dr. Sandro Valentini , e demais alunos do Laboratório de Biomol
pelo uso de seus equipamentos no início deste trabalho;
À Profa. Dra. Eliana Varanda por todos esses anos de convívio e
principalmente pela sua participação na minha banca de qualificação com
suas idéias que foram bem recebidas e devidamente acatadas.
5
À Profa. Dra. Maria Helena Saad, por ter me recebido em seu laboratório no
início da minha carreira de pesquisador, ajudando e incentivando sempre.
Obrigado pela sua presença em minha banca de qualificação com suas
ótimas idéias para o crescimento deste trabalho.
Aos meus professores que com seu conhecimento foram fundamentais para
meu crescimento intelectual;
À amiga Profa. Dra. Rosilene Fressatti Cardoso, sempre disposta a dividir
seu conhecimento comigo e com todos, muito obrigado pela amizade e
confiança;
Às funcionárias da Secretaria da Pós-Graduação, Cláudia, Sônia e Laura
pela amizade e profissionalismo;
Às amigas do SESA, Brunilde, Rosângela, Leo, Elô e demais funcionárias
que ajudaram na realização deste trabalho;
Aos amigos Ronaldo, Marcela, Márcio, Juliana, Norton, Jonathas, Felipe
Leiria, Felipe Padilha, Tunico, Fabiana Mattos, Letícia, Mônica, André e
Carlos Eduardo que mesmo distante estiveram sempre presente me
incentivando e apoiando;
Aos meus padrinhos e demais tios e primos pelo orgulho e incentivo aos
meus estudos;
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo
apoio financeiro dado a este projeto (PROCESSO N.: 2005/59459-6);
Ao CNPq pela bolsa de Mestrado concedida.
6
“A vida não é um corredor reto e tranqüilo que
nós percorremos livres e sem empecilhos,
mas um labirinto de passagens,
pelas quais nós devemos procurar nosso
caminho, perdidos e confusos, de vez em quando
presos em um beco sem saída.
Porém, se tivermos fé,
uma porta sempre será aberta para nós,
não talvez aquela sobre a qual
nós mesmos nunca pensamos,
mas aquela que definitivamente
se revelará boa para nós.”
A.J. Cronin
Quem mexeu no meu queijo? (1998)
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 01
Resultado do perfil genético obtido através da técnica do PRA
dos isolados que não foram positivos através da identificação
molecular........................................................................................
43
Tabela 02
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles que não apresentaram IS6110...........
45
Tabela 03
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles no ano de 2002...................................
46
Tabela 04
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles no ano de 2003...................................
47
Tabela 05
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles no ano de 2004...................................
48
Tabela 06
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles no ano de 2005...................................
49
Tabela 07
Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos
isolados submetidos a técnica de MIRU mostrando o perfil
genético de cada um deles no ano de 2006...................................
50
Tabela 08
Relação entre Número de pacientes com tuberculose pulmonar,
cultura positiva e Genotipagem ....................................
51
Tabela 09
Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose,
segundo características demográficas............................................
55
Tabela 10
Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose,
segundo características clínicas e
laboratoriais.....................................................................................
56
Tabela 11
Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose,
segundo características epidemiológicas
adicionais........................................................................................
57
Tabela 12
Correlação entre os isolados de M. tuberculosis pertencentes a
grupos genéticos definidos pelo MIRU com os dados
epidemiológicas identificadas entre os 29 pacientes infectados
por estas cepas...............................................................................
58
8
LISTA DE QUADROS
Quadro
01
Esquemas de tratamento para pacientes portadores de
Tuberculose contendo tempo de tratamento, posologia e
indicação para cada estágio da doença.......................................
18
Quadro
02
Número total de pacientes atendidos no SESA separados por
ano, tipo de tuberculose apresentada, cultura e baciloscopia
positivas.........................................................................................
28
Quadro
03
Número da amostra bacteriana segundo o ano de
isolamento.......................................................................................
29
Quadro
04
Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR de
identificação para M. tuberculosis..................................................
31
Quadro
05
Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR de
identificação para micobactérias....................................................
33
Quadro
06
Desenho das seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores dos
12 loci de MIRU estudados.............................................................
35
Quadro
07
Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR para
realização da técnica de MIRU.......................................................
36
Quadro
08
Correlação entre os tamanhos em pb dos amplificados e os
alelos de MIRU...............................................................................
38
Quadro
09
Distribuição de isolados dentro dos grupos clonais com
similaridade igual ou superior a 94%, incluindo os isolados
agrupados com 100% de similaridade............................................
53
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Fotografia do gel de agarose a 1% na confirmação
molecular das cepas de Mycobacterium tuberculosis,
utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores INS1
e INS2 a apresentando um fragmento de 245pb, dois
marcadores de peso molecular (50pb e 100pb) e
controle negativo (C-)..................................................
40
Figura 02
Foto do gel de agarose a 1% com o produto da
amplificação do gene hsp65 apresentando um
fragmento de 439 pares de base(pb) acompanhado
do marcador molecular de 100pb.................................
42
Figura 03
Fotografia do gel de agarose a 4% da digestão com
as enzimas de restrição BstEII e HaeIII do produto
amplificado obtendo perfis eletroforéticos das
micobactérias empregando a técnica do PRA. Para
os isolados 1251, 1370, 6530 e 3884 foi obtido o
seguinte perfil eletroforético na enzima de restrição
BsteII – (235-120-85) e na HaeIII – (150-130-70), no
isolado 7496 foi obtido na digestão com a enzima
BstEII – (235-120-100) e HaeIII – (125-105-0), no
isolado 6495 foi obtido o perfil na enzima de restrição
BstEII – (235-120-100) e HaeIII – (160-105-60) e no
isolado 2923 foi obtido o perfil na enzima de restrição
BstEII – (440-0-0) e HaeIII – (160-145-
60)................................................................................
44
Figura 04
Dendrograma produzido com os resultados obtidos
pela técnica de MIRU onde se observa a formação
de12 grupos genéticos.................................................
52
10
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
®…………………. MARCA REGISTRADA
µL………………... MICROLITO
µm……………….. MICROMETROS
BAAR…………… BACILO ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTE
BK……………….. BACILOSCOPIA (BACILO DE KOCH)
Cont…………….. CONTATO
Cult……………… CULTURA
DNA……………... DEOXYRIBONUCLEIC ACID
EMB…………….. ETAMBUTOL
F…………………. FOWARD
HIV………………. VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
Hsp……………… HEAT SHOCK PROTEIN
INH………………. ISONIAZIDA
IR………………… ESQUEMA I RETRATAMENTO
IS………………… SEQÜÊNCIA DE INSERÇÃO
kDa…………….. QUILODALTONS
LJ……………….. LÖWESTEIN JENSEN
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
MDR-TB………… TUBERCULOSE MULTI-DROGA RESISTENTE
MIRU……………. MYCOBACTERIAL INTERSPERSED REPETITIVE UNITIS
mL………………. MILILITROS
N/A……………… NÃO HOUVE AMPLIFICAÇÃO
Nº………………... NÚMERO
ºC………………... GRAUS CELSIUS
OMS…………….. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE
PAST……………. PALEONTOLOGICAL STATISTICS
Pb……………….. PARES DE BASE
PCR……………... POLYMERASE CHAIN REACTION
PPD……………...
DERIVADO DE PROTEÍNA PURIFICADA (TESTE INTRADÉRMICO)
PRA……………... RESTRICTION ENZYME PATTERN ANALYSES
PZA……………… PIRAZINAMIDA
R…………………. REVERSE
RFLP……………. RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM
RIF………………. RIFAMPICINA
SESA…………… SERVIÇO ESPECIAL DE SAÚDE DE ARARAQUARA
SINAN ………….. SISTEMA DE INFORMAÇÃO DE AGRAVOS DE NOTIFICAÇÃO
SM……………..... ESTREPTOMICINA
TE……………….. TAMPÃO TRIS + EDTA
UNESP………..... UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
VNTR……………. VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS
11
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................. 14
2. OBJETIVOS..................................................................................... 26
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 27
3.1 Tipo de Estudo............................................................................... 27
3.2 Isolados de M. tuberculosis.......................................................... 27
3.3 Técnicas Moleculares.................................................................... 30
3.3.1 Reativação e confirmação de pureza da suspensão
bacteriana.......................................................................................
30
3.3.2 Confirmação da espécie M. tuberculosis através da técnica
de PCR............................................................................................
30
3.3.3 Técnica do PRA............................................................................. 32
3.3.4 Técnica de MIRU............................................................................ 34
3.3.4.1 Análise dos resultados de MIRU................................................. 37
3.4 Correlação epidemiológica..................................................... 39
4. RESULTADOS................................................................................ 40
4.1 Identificação Molecular................................................................ 40
4.2 Genotipagem pela técnica de MIRU............................................. 44
4.3 Avaliação epidemiológica clássica.............................................. 54
4.4 Correlação entre os grupos genéticos de MRU e os dados de
epidemiologia clássica..................................................................
58
5. DISCUSSÃO.................................................................................... 61
6. CONCLUSÕES............................................................................... 70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 72
8. ANEXOS.......................................................................................... 80
9. ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS......... 88
12
RESUMO
O estudo da epidemiologia molecular através de diferentes técnicas
vigentes revolucionou a compreensão da epidemiologia da tuberculose
permitindo comparação entre linhagens de Mycobacterium tuberculosis e
rastreamento da movimentação de linhagens individuais. O presente projeto teve
como objetivo utilizar as técnicas de epidemiologia molecular (MIRU) para tentar
compreender um pouco mais sobre o fenômeno da transmissão da tuberculose
entre os pacientes portadores de tuberculose pulmonar numa pequena cidade
de interior paulista , atendidos no Serviço Especial de Saúde de Araraquara
(SESA - ambulatório de referencia no diagnostico e tratamento de tuberculose)
na cidade de Araraquara. Do total de 163 culturas positivas recebidas, a técnica
de MIRU foi realizada em 74, 2% (121/163) dos isolados provenientes de
pacientes atendidos pelo SESA no período de 2002 à 2006. Foram ainda
identificados 5 isolados de micobactérias ambientais (M. avium, M. gordonae, M.
genevense, M.abcessus e M. xenopi) e 4 micobactérias não identificadas. Dos
121 isolados submetidos a genotipagem, seis não apresentaram todos os alelos
dentre os 12 locci de MIRU. Dos 115 isolados submetidos ao dendrograma, 29
(25,2%) agruparam-se em 13 grupos clonais com similaridade de 100%, sendo
10 grupos de dois isolados cada (125 e 168; 153 e 253; 95 e 97; 91 e 99; 92 e
266; 217 e 228; 27 e 117; 260 e 257; 105 e 107; 106 e 220) e 3 contendo 3
isolados cada (150, 157 e 283; 137, 147 e 155; 224, 271 e 286). Os demais 86
isolados (74,8%) apresentaram perfil genético único. Dos 29 pacientes
agrupados, apenas 10 (34,4%) eram do sexo feminino e 19 (65,6%) do sexo
masculino. Com exceção de um paciente, os demais 28 (96,5%) foram tratados
com o esquema I obtendo-se alta por cura em 82,8% dos casos. Apenas um
caso de co-infecção HIV/TB foi verificado entre os pacientes em grupos
genéticos formados, ao passo que 31% (9/29) eram etilistas, excetuando os
pacientes com os dados ignorados. Em relação às profissões, dos 19 pacientes
masculinos agrupados geneticamente, destacou-se a função de pedreiro com
21% (4/19), seguido do trabalhador rural com 15,7% (3/19) e entre os pacientes
do sexo feminino, 70% (7/10) eram domésticas ou exerciam atividades em casa
(passadeira e acompanhante).Considerando uma similaridade igual ou superior
a 83%, foi possível destacar 3 grandes grupos clonais A, B e C, envolvendo 86
(74,8%) de todos os isolados analisados. Nestes grandes grupos estavam
inseridos todos os 13 grupos clonais com 100% de similaridade. Estes dados
sugerem a possibilidade de que a tuberculose em Araraquara se deve a
presença de cepas endêmicas persistentes, responsáveis por 74,8% dos casos,
além da existência de transmissão recente que neste trabalho foi de 25,2%.
Palavras chave: Mycobacterium tuberculosis; Epidemiologia molecular;
Tuberculose
13
ABSTRACT
The molecular epidemiology study using different techniques
revolutionized the understanding of the epidemiology of tuberculosis allowing
comparison between strains of Mycobacterium tuberculosis and tracking the
movements of individual lines. This project aimed to use the techniques of
molecular epidemiology (MIRU) trying to understand more about the
phenomenon of transmission of tuberculosis among patients with pulmonary
tuberculosis in a small city of São Paulo, attended the Special Health Service of
Araraquara (SESA - clinic of reference in the diagnosis and treatment of
tuberculosis) in the city of Araraquara. From total 163 positive cultures received,
the MIRU technique was performed in 74,2% (121/163) of the isolates from
patients attended by SESA in the period from 2002 to 2006. 5 isolates were also
identified as environmental mycobacteria (M. avium, M. gordonae, M.
genevense, M.abcessus and M. xenopi) and 4 unidentified mycobacteria. From
the 121 isolates submitted to genotyping, six did not present all alleles among the
12 loci of MIRU. From the 115 isolates submitted to the dendrogram, 29 (25,2%)
are grouped into 13 clonal groups with similarity of 100%. 10 groups with two
isolates each (125 and 168, 153 and 253, 95 and 97, 91 and 99 ; 92 and 266,
217 and 228, 27 and 117, 260 and 257, 105 and 107, 106 and 220) and 3 groups
containing 3 isolates each (150, 157 and 283, 137, 147 and 155, 224, 271 and
286) . The others 86 isolates (74,8%) had a single genetic profile. About the
group of 29 patients, only 10 (34,4%) were female and 19 (65,6%) males. Except
for one patient, the other 28 (96,5%) were treated with the schedule I having cure
in 82,8% of the cases. Only one case of co-infected HIV / TB was found among
patients in genetic groups formed, while 31% (9 / 29) were drinkers, except the
patients with this data ignored. The 19 male patients grouped genetically, 21%
(4 / 19) were bricklayers, followed by the rural worker with 15,7% (3 / 19) and
among female patients, 70% (7 / 10) were domestic or they used to make
activities at home. Whereas the similarity of 83% or greater, highlighted 3 major
clonal groups called A, B and C, involving 86 (74,8%) of all isolates analyzed. In
these large groups were included all 13 clonal groups with 100% similarity.
These data suggest the possibility the tuberculosis in Araraquara is because of
the presence of persistent endemic strains responsable for 74,8% of cases,
besides the existence of recent transmission in this work was 25,2%.
Key words: Mycobacterium tuberculosis; Molecular epidemiology; Tuberculosis
14
I. INTRODUÇÃO
As micobactérias pertencem ao gênero Mycobacterium, único
representante da família Mycobacteriacae. Apresentam-se como bacilos curvos
ou retos, com 0,2µm a 0,7µm de diâmetro e 1µm a 7µm de comprimento.
Possuem propriedade de álcool-ácido resistência devido à grande quantidade de
lipídeos presentes em sua parede celular, caracterizados pelos ácidos graxos de
cadeia longa constituídos pelos ácidos micólicos. As micobactérias não se
coram pelo método de Gram, mesmo sendo consideradas Gram positivas. São
aeróbias, não esporuladas e classificadas de acordo com seu tempo de
crescimento em micobactérias de crescimento rápido quando requerem menos
de 7 dias, e de crescimento lento mais de 7 dias para produzir colônias visíveis
em meios de cultura sólidos (PANDOLFI et al., 2007; LEITE & SATO, 2006).
Compreendendo o gênero Mycobacterium, existem cerca de 100
espécies conhecidas, em sua grande maioria composta por bactérias saprófitas
no meio ambiente e apenas algumas espécies patogênicas ao homem. Dentre
as que merecem destaque, encontram-se as que são agentes etiológicos da
tuberculose, como os membros do Complexo Mycobacterium tuberculosis,
(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum,
Mycobacterium microti) e o causador da hanseníase, o Mycobacterium leprae.
Dentre algumas características em comum, as micobactérias compartilham uma
característica que as distingue das demais bactérias: a retenção de fucsina
básica pela parede celular, mesmo quando tratadas com álcool e ácido,
15
conferindo-lhes a designação de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) quando
da utilização do método de coloração Ziehl-Neelsen (DUCATI et al., 2005)
No final do século XIX e início do século XX, foi tamanha a incidência da
tuberculose entre membros da mesma família que se chegou a pensar na
tuberculose como uma doença inata, transferida de pais para filhos.
Posteriormente, descobriu-se que a simples exposição do indivíduo sadio ao
bacilo não constituía por si só condição suficiente para produzir a doença. Para
se desenvolver no organismo, o bacilo precisa de fatores intrínsecos e
extrínsecos como a imunodebilidade e a desnutrição, cujo conjunto possibilita a
sua suscetibilidade (LOPES et al., 2008).
Por ocasião da Reunião da Sociedade de Fisiologia em Berlim no ano de
1882, o alemão Robert Koch apresentou um relato importante sobre a
tuberculose. Descreveu o isolamento e forma de cultivo do M. tuberculosis a
partir de tubérculos macerados, identificando-o como agente etiológico da
tuberculose e que passou, então, a ser conhecido como bacilo de Koch
(DUCATI et al., 2005).
A principal via de transmissão da tuberculose se dá de pessoa a pessoa
através de partículas infectantes presente nas gotículas de 1,0 a 5,0 µm de
diâmetro produzidas pelos portadores de tuberculose pulmonar ou laríngea ao
tossir, espirrar ou falar (PANDOLFI et al., 2007).
Na maioria das pessoas infectadas, os bacilos inalados são fagocitados
por macrófagos alveolares, e podem seguir dois caminhos: são eliminados ou
multiplicam no interior das células originando lesões localizadas chamadas
16
tubérculos. Normalmente, duas a seis semanas após a infecção, ocorre o
estabelecimento de imunidade mediada por células, seguida de infiltração de
linfócitos e macrófagos ativados na lesão, resultando na eliminação da maior
parte da carga bacilar e no término da infecção primária. Nestes casos, a única
evidência de infecção prévia é dada pelo teste da tuberculina ou diagnosticada
através de raio-X do tórax, uma vez que a infecção ocorre sem a apresentação
de sintomas. O foco inicial da infecção pode ocorrer em qualquer lugar nos
pulmões, porém, estão geralmente localizados na porção basal e mediana dos
pulmões. (LOCHT et al., 2007).
A tuberculose infecção (aquela onde o bacilo da tuberculose se mantém
dormente, não causando dano algum ao seu hospedeiro) pode se evoluir para
tuberculose doença depois de muitas décadas, após a infecção inicial. Neste
caso ocorre expansão da reação de necrose e formação de cavidade no pulmão
possibilitando que grande quantidade de bacilos seja eliminada para o meio
ambiente através da tosse. Cerca de 15% dos pacientes com a doença ativa
podem apresentar tuberculose extra-pulmonar, acometendo principalmente a
pleura, os linfonodos, o fígado, o baço, os ossos e as articulações, o coração, o
cérebro, o sistema genito-urinário, as meninges, o peritônio ou a pele (DUCATI
et al., 2005).
Devido a fatores relacionados à imunidade do hospedeiro, sintomas
clínicos característicos da tuberculose, como enfraquecimento, sudorese
noturna, febre, perda de peso, dor no peito, insuficiência respiratória, tosse (com
produção de escarro, ou não) podem ser produzidos. Nos casos mais graves da
17
doença, quando há rompimento de algum vaso sangüíneo a tuberculose
pulmonar pode causar hemoptise (DUCATI, 2005; LOCHT et.al, 2007).
O tratamento quimioterápico padrão proposto pela OMS (Organização
Mundial da Saúde) para o controle da tuberculose no mundo, consiste na
administração combinada de drogas; esta associação se dá com o uso das
drogas: isoniazida (INH), rifampicina (RIF), pirazinamida (PZA), estreptomicina
(SM) e etambutol (EMB). Utilizando este elenco, o tratamento quimioterápico
tem como objetivos: curar o paciente com tuberculose; prevenir o óbito
associado à tuberculose ou suas complicações tardias; prevenir a recidiva da
doença; diminuir a transmissão da tuberculose para outros indivíduos e prevenir
o surgimento de M. tuberculosis resistente às drogas. Para atingir esses
objetivos, o tratamento deve seguir esquemas terapêuticos definidos adotados
pelo Ministério da Saúde no Brasil como mostrado no quadro 1.
18
Quadro 1: Esquemas de tratamento para pacientes portadores de Tuberculose contendo
tempo de tratamento, posologia e indicação para cada estágio da doença adotado pelo Ministário
da Saúde/ Brasil.
Entre os esquemas terapêuticos definidos pela OMS, o Ministério da
Saúde, optou por quatro tipos de esquemas. O Esquema I é recomendado para
pacientes que estão sendo tratados pela primeira vez e tem a duração de 6
meses. O esquema IR é recomendado para os que interromperam o tratamento
e tem a mesma duração de 6 meses. O esquema II é recomendado para os
pacientes com tuberculose meningo-encefálica com duração de 9 meses. A
posologia varia com o peso e a idade. O esquema III é recomendado para casos
de falência e tem a duração de 12 meses e sua posologia é recomendada para a
população maior que 15 anos (Programação de Medicamentos
Tuberculostáticos do II Consenso Brasileiro – OPAS, 2001).
ESQUEMA DE
TRATAMENTO
Tempo de
Tratamento
Posologia Indicação
Esquema I 6 meses
INH + RIF + PZA (2
meses)
INH + RIF (4 meses)
pacientes que
estão sendo
tratados pela
primeira vez
Esquema IR 6 meses
INH + RIF + EMB + PZA
(2meses)
INH + RIF + EMB (4
meses)
pacientes que
interromperam o
tratamento e tem
a duração de 6
meses
Esquema II 9 meses
INH + RIF + PZA (2
meses)
INH + RIF (7 meses)
pacientes com
tuberculose
meningo-
encefálica
Esquema III 12 meses
SM + PZA + ETH +
EMB (3 meses)
ETH + EMB (9 meses)
casos de falência
em algum dos
tratamentos
anteriores
19
Algumas vezes durante o tratamento, pode-se observar uma resistência
inicial do bacilo à isoniazida, tornando-se necessária a adição de outras drogas
de primeira linha, como o EMB e a SM. No caso de resistência simultânea a RIF
e INH, caracteriza-se uma bactéria resistente e é denominada na literatura
internacional de MDR-TB, tornando necessária uma extensão no período de
tratamento ou na maioria das vezes uma nova associação medicamentosa
utilizando drogas com maior toxicidade ao paciente (DUCATI, 2005).
A pandemia do HIV vem produzindo um grande reservatório de indivíduos
altamente susceptíveis, associado ao controle ineficiente da tuberculose e o
aparecimento de cepas de M. tuberculosis multi-droga resistente (MDR-TB),
aumentando os problemas já existentes, exacerbando as dificuldades de
tratamento e controle da tuberculose (CORBETT et al., 2003).
Dados publicados pela OMS (WHO, 2008) estimam que ocorreram no
ano de 2006, 9,2 milhões de novos casos de tuberculose no mundo, já inclusos
números referentes a co-infecção TBxHIV, o que resulta em uma razão de
incidência de 139/100.000 habitantes. O boletim informa ainda que a Índia, a
China, a Indonésia, a África do Sul e a Nigéria estão classificados entre os 5
países com maior incidência de tuberculose no mundo. A Ásia representa 55%
dos casos, seguido da África com 31% dos casos, e os demais 3 continentes
representam uma pequena parte dos casos de tuberculose. A OMS (WHO,
2008) estima que destes 9,2 milhões de novos casos no ano de 2006, estima-se
que 709.000 pacientes (7,7%) sejam portadores do HIV. No Brasil, no ano de
2006, foi estimada uma incidência de 104.000 casos de tuberculose (55/100.000
20
habitantes), o que deixa nosso país no 16º lugar no ranking dos 22 países
responsáveis pela maioria dos casos de tuberculose no mundo (WHO, 2008).
Localizada a 775km da capital federal do país e a 269km da cidade de
São Paulo, com altitude de 646m em relação ao nível do mar, Araraquara ocupa
a região centro-leste do estado de São Paulo. (PORTAL ARARAQUARA, 2008).
Segundo dados do CENSO publicados em maio de 2007, a cidade de
Araraquara possui a população estimada de 195.815 habitantes com a
incidência de tuberculose de 26 casos/100.000 habitantes. Esta taxa é
relativamente baixa quando comparada com a cidade de São Paulo que no ano
de 2006 encaminhou ao SINAN (Sistema de Informação de Agravos de
Notificação) 3484 notificações (32 casos/100.000 hab).
Para isso, o Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA) filiado à
Universidade de São Paulo, faz um ótimo trabalho em relação ao atendimento
da tuberculose, mas também da maioria das doenças que necessitam de
notificação compulsória. Além do excelente trabalho de diagnóstico e
tratamento, o SESA possui dados de epidemiologia clássica bastante seguros e
confiáveis.
Levantamentos epidemiológicos realizados em diversos países,
demonstraram que a tuberculose tem maior prevalência nas camadas
populacionais mais pobres. A prevalência da doença está relacionada ao
desemprego, baixo grau de escolaridade, alimentação deficiente e insuficiente,
habitação insalubre e outros fatores associados à pobreza (LOPES et al., 2008).
21
Metodologias relacionadas à epidemiologia molecular revolucionaram os
campos da pesquisa, prevenção e controle da tuberculose, permitindo a
diferenciação e a avaliação de diversidades entre as cepas do complexo M.
tuberculosis, incluindo as diferenças por região e por população, assim como a
medida de prevalência de cepas endêmicas (NIOBE-EYANGOH et. al,. 2004).
Desde o início dos anos 90, para se definir os fatores de risco para a
transmissão de tuberculose em áreas com alta incidência da doença, vem sendo
utilizada a genotipagem do M. tuberculosis que se baseia no reconhecimento
genético através de fingerprints, onde a formação de grupos genéticos nos
indica a possibilidade de uma transmissão recente. (OELLEMANN et al., 2007).
Segundo Eisenach et al.(1988), a existência de seqüências de DNA que
se repetem no genoma do M. tuberculosis apresentam um grande potencial no
uso da genotipagem através de fingerprinting. Uma dessas seqüências é
denominada de IS6110 e apresenta uma relação com a seqüência de inserção
da família IS3 encontrada na família Enterobactériaceae. Outras seqüências
como IS986 e IS987 foram descobertas em seguida sendo que esses novos
elementos se diferenciavam entre si em somente alguns pares de base. Por esta
razão, posteriormente foram classificados como um mesmo elemento e para
evitar confusões, foi recomendado o uso da inserção IS6110 no estudo genético
do M. tuberculosis.
FROTHINGHAM et al., (1994) relataram que as espécies do complexo M.
tuberculosis são geneticamente muito parecidas, com 85 a 100% de relação
DNA-DNA diferindo entre si quanto à sua epidemiologia.
22
Dentre as técnicas moleculares, o RFLP-IS6110 (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism) é considerado a técnica padrão ouro para a genotipagem
do M. tuberculosis, sendo comprovada sua eficiência no estudo da transmissão
da tuberculose (ALLIX-BÉGUEC et al., 2008).
A técnica de RFLP-IS6110 consegue discriminar as cepas de M.
tuberculosis através da inserção irregular do IS6110 no genoma das
micobactérias. Com isso, os resultados obtidos por esta técnica mostram-se
bastante estáveis na observação epidemiológica em casos de tuberculose (VAN
SOOLINGEN et al., 1993).
A metodologia utilizada na técnica de RFLP-IS6110 consiste na
genotipagem das cepas de M. tuberculosis baseada no polimorfismo gerado
pela variação do número de cópias e da posição do IS6110. A técnica do
fingerprinting se inicia com o cultivo do M. tuberculosis, extração do seu DNA,
digestão com enzimas de restrição, Southern blotting e é finalizada com a
identificação da diversidade genética de cada isolado (VAN EMBDEN et.al. ,
1993).
Entretanto, apesar dos resultados promissores, a técnica de RFLP é
trabalhosa, necessitando de pessoal altamente qualificado para a realização do
ensaio, sendo tendência mundial a substituição desta técnica por outras de
execução mais rápida e facilitada. Dentre elas, vem sendo sugerida uma outra
técnica de epidemiologia molecular denominada de MIRU (Mycobacterial
Interspersed Repetitive Units) que é uma técnica baseada em PCR. Esta técnica
foi desenvolvida por SUPPLY et al. (2000, 2001) e se baseia no estudo de
23
VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats), que são seqüências que se
repetem (Tandem Repeats) até centenas de vezes (PANDOLFI et al, 2007).
A técnica de MIRU consiste em um sistema altamente reprodutível e
rápido, e nesta técnica, há geração de genótipos confiáveis baseado no estudo
detalhado de 12 loci semelhantes à mini-satélites, contendo VNTRs do genoma
do complexo M. tuberculosis. Para tal, utilizam-se 12 pares de oligonucleotídeos
iniciadores, sendo necessário para cada isolado de M. tuberculosis 12 reações
de PCR específicas para sua genotipagem (SUPPLY et al., 2001).
Esta técnica possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes
áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens
individuais (SUPPLY et al. 2000; MAZARS et. al. 2001), de forma semelhante à
técnica de RFLP, porém de execução muito mais fácil. Este tipo de abordagem
torna possível maior número de análises e a identificação de mais focos de
contágio na população, podendo-se assim estudar métodos mais adequados
para interromper a transmissão da doença (SUPPLY et al. 2001).
A técnica de Spoligotyping descrita por Kamerbeek et al. (1997) é
baseada na amplificação in vitro de um único locus altamentamente polimórfico
no genoma da bactéria contendo múltiplas direct repeats – DRs, método que
pode ser realizado em laboratórios sem equipamentos sofisticados.
KWARA et al. (2003) avaliaram a utilidade epidemiológica dos métodos
MIRU e Spoligotyping, concluindo que a primeira técnica produz resultados
melhores do que a segunda. COWAN et al. (2002) compararam as técnicas de
MIRU, RFLP e Spoligotyping em um grupo de 180 amostras de M. tuberculosis e
24
M. bovis, com baixo número de cópias de IS6110, observando que a técnica de
MIRU possibilitou a distinção de 80 padrões, contra 58 de RFLP e 59 de
Spoligotyping. Quando estes resultados foram cruzados, 122 padrões foram
obtidos, indicando que o emprego de vários métodos é necessário para se
atingir maior especificidade.
Baseado na estabilidade dos 12 loci de MIRU, a descoberta de variações
no genótipo de MIRU-VNTR pode auxiliar na definição de re-infecção (exógena),
que é normalmente baseada na observação da variação de no mínimo 3 a 4
bandas de RFLP IS6110. Esse recurso é particularmente importante para
estimar os níveis de sucesso dos programas de controle de tuberculose e
avaliação de novos métodos clínicos e novas terapias (SAVINE et al., 2002).
Com isso, a técnica de MIRU aplicada como primeira linha na tipagem
molecular junto a técnica de Spoligotyping, tem provado uma boa discriminação
na maioria dos casos, incluindo estudos em larga escala (ALLIX-BÉGUEC et al.,
2008).
Por outro lado, para a aplicação da epidemiologia molecular, é preciso ter
a identificação correta da espécie de M. tuberculosis. Para tal, previamente a
aplicação do MIRU, são bem vindos os métodos moleculares de identificação
das espécies micobacterianas. A amplificação de um fragmento de DNA contido
na seqüência de inserção IS6110 tem sido o método de escolha na identificação
molecular pela PCR do complexo M.tuberculosis (VAN EMBDEN et al., 1993).
Outro método mais abrangente para identificação molecular de diferentes
espécies de micobactérias foi desenvolvida por Telenti et al. (1993) denominada
25
PRA (PCR-restriction enzyme pattern analyses). Nesta técnica, é feita a PCR da
seqüência do gene hsp65, que codifica a proteína de choque térmico (heat
shock protein) de 65-kDa. Esse gene é altamente conservado entre as espécies
de micobactérias, mas também apresenta regiões hipervariáveis usadas para a
identificação das diferentes espécies (TORTOLI et al., 2003). O fragmento de
439 pares de base é submetido à digestão com as enzimas de restrição BstEII e
HaeIII (TELENTI et al., 1993). Os produtos da digestão quando separados por
eletroforese em gel de agarose à 4% apresentam perfis específicos de cada
espécie de micobactéria. (TORTOLI et al., 2003).
Há cerca de 10 anos o Laboratório de Micobactérias “Dr. Hugo David”
vem trabalhando em colaboração com o SESA no quesito ao diagnóstico
molecular da tuberculose. E para tal, a técnica da PCR e do PRA foi implantada.
Por outro lado, recentemente, a técnica de MIRU foi introduzida por Pandolfi
(2006) para o estudo da epidemiologia molecular da tuberculose. Para
confrontar dados de epidemiologia clássica com os dados de epidemiologia
molecular, este trabalho foi realizado em parceria com o SESA. A pesquisa em
colaboração permitiu validar a técnica de MIRU na cidade de Araraquara, uma
vez que foi possível dispor de dados de todos os pacientes atendidos na cidade,
no intervalo dos anos em que se realizou a pesquisa. O fato de se conseguir
esta relação direta entre os dados de epidemiologia molecular e os de
epidemiologia clássica coloca o município de Araraquara em uma posição
bastante confortável em relação às grandes cidades que tem dificuldades em
obter informações fidedignas dos dados clássicos .
26
II. OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivo geral o estudo da diversidade
genética de isolados clínicos de M. tuberculosis provenientes de pacientes do
município de Araraquara – SP atendidos pelo SESA no período de 2002 à 2006.
Para tal, os seguintes objetivos específicos formam propostos:
- Confirmar a identificação bioquímica dos isolados de M. tuberculosis
provenientes do SESA (2002 a 2006) através das técnicas de PCR e
PRA;
- Realizar a genotipagem dos isolados de M. tuberculosis pela técnica
de MIRU;
- Agrupar por similaridade genética os isolados de M. tuberculosis
estudados;
- Avaliar a presença efetiva de grupos genéticos de M. tuberculosis
predominantes em Araraquara;
- Correlacionar os agrupamentos genéticos obtidos com a
epidemiologia clássica;
- Identificar os índices de tuberculose provenientes de reativação e
infecção recente;
- Organizar um banco de dados dos pacientes de tuberculose
pulmonar de Araraquara cujas cepas foram submetidas à técnica de
MIRU;
27
III. MATERIAL E MÉTODOS
Quanto ao aspecto ético, o presente estudo possui aprovação do Comitê
de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP -
Araraquara, parecer número 01/2003.
1- Tipo de estudo: Retrospectivo de identificação e tipagem molecular de
isolados clínicos de M. tuberculosis.
2- Isolados de M. tuberculosis
Local do estudo: foram analisados isolados clínicos de M. tuberculosis
provenientes de pacientes com tuberculose pulmonar residentes na cidade de
Araraquara – SP, atendidos no período de 2002 à 2006.
Nestes, o diagnóstico de tuberculose pulmonar foi suspeitado pelo
histórico clínico do paciente e confirmado pelo médico e pelo diagnóstico
laboratorial através da baciloscopia, do isolamento em cultura e da identificação
do M. tuberculosis pela metodologia clássica. As cepas foram congeladas em
água e estocadas em freezer à -20ºC. Esta primeira parte do trabalho foi
realizada no SESA da Faculdade de Saúde Pública da USP onde o número total
de pacientes atendidos, forma clínica da tuberculose e cultura se encontram no
quadro 2.
28
Quadro 2. Número total de pacientes atendidos no SESA separados por ano, tipo de
tuberculose apresentada, cultura e baciloscopia positivas.
As amostras bacterianas foram então encaminhadas para a Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – UNESP de Araraquara onde foram descongeladas,
reativadas e posteriormente analisadas pelas técnicas moleculares. Em um total
de 182 isolados congelados enviados ao nosso laboratório pelo SESA, dentre
eles alguns em duplicata. Utilizando a técnica de MIRU, foram analisados 121
isolados dos anos de 2002 à 2006.
Ano Total de
pacientes
suspeita TB
Nº pac. TB
pulmonar
Outras TB
Cult (+)
BK +
2002 56 41 15 36 31
2003 54 41 13 33 24
2004 55 43 15 25 22
2005 40 32 8 31 23
2006 52 40 12 38 25
TOTAL 257 197 63 163 125
29
Quadro 3. Número de identificação, total dos isolados de M. tuberculosis analisados, por ano de
isolamento
2002 2003 2004 2005 2006
25 119 170 211 256
27 123 173 212 257
79
124
175 213 258
86 125 176 214 259
89 129 179 215 260
90 130 181 217 261
91 133 184 218 265
92 134 186 219 266
93 135 189 220 268
95 136 193 222 269
97 137 199 224 271
98 146 203 226 272
99 147 206 228 273
100 148 207 233 274
101 149 208 234 275
103 150 209 236 276
102 151 289 238 277
104 152 290 241 278
105 153 291 244 279
106 155
246 282
107 157
250 283
108 159
253 284
112 160 285
114 161
286
117 162
287
293 164
166
167
168
30
3- Técnicas Moleculares
Todo o procedimento de manipulação de células de M. tuberculosis
viáveis foi realizado no Laboratório de Segurança Nível 3 da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas-UNESP.
3.1- A reativação e verificação da pureza da suspensão bacteriana foram
feitas segundo Malaspina, (2004). Após o descongelamento à temperatura
ambiente, 200µL de cada amostra bacteriana foi colocado em 2,0 mL do meio
7H9 enriquecido com OADC (BD BBL
®
) e acrescido de 20µL do antifúngico
Ciclohexemida a 5% e incubado a 37ºC por 7 dias, com agitação manual uma
vez ao dia. Em presença de turvação, o material foi submetido à confecção de
um esfregaço utilizando uma alíquota de 100µL que foi depositada em uma
lâmina e após o espalhamento, fixada pelo calor e corado pela técnica de Ziehl-
Neelsen para verificação de cultura pura de Bacilos Álcool-Ácido-Resistentes
(BAAR). Em caso positivo, o conteúdo de 200µL de cada tubo, com cultura
supostamente reativada, foi transferida para dois tubos contendo meio de
Löwestein-Jensen (LJ) inclinado, sendo incubado por no mínimo 21 dias a 37ºC
podendo chegar a 60 dias.
3.2- Confirmação da espécie M. tuberculosis através da PCR foi feita
segundo van Embden (1993) com pequenas modificações. Após a multiplicação
bacteriana no meio de Löwestein-Jensen (LJ), as culturas positivas foram
confirmadas como sendo de M. tuberculosis pela técnica de PCR, empregando o
par de oligonucleotídeos iniciadores INS1 (CgTgAgggCATCgAggTggC) e INS2
31
(gCgTAggCggTgACAAA) que amplificou especificamente um fragmento de
245pb contidos na seqüência de inserção IS6110.
Inicialmente, realizou-se a extração de DNA através da termólise segundo
Mazars et al., 2001, com pequenas modificações. O procedimento consistiu em
submeter, uma alçada da colônia crescida em meio sólido acrescido em 300µL
de tampão TE pH 8,0 (Tris-Hcl + EDTA) em um microtubo com tampa de trava, a
três ciclos de fervura por 10 minutos seguido de congelamento a -20ºC.
Para a amplificação (VAN EMBDEN et al., 1993), em linhas gerais, no
volume final da reação de 25µL, foram adicionados 21,5µL de “Master Mix”
(PROMEGA na diluição de 2 partes de PCR Master Mix 2x para 1 parte de água
ultrapurificada) 0,5µL dos oligonucleotídeos iniciadores na concentração de
[25pmol] INS1 e INS2 e 2,5µL do DNA de cada amostra, extraído por termólise,
e a mistura da reação foi amplificada em Termociclador (PTC–100, MJ
Research), empregando o seguinte protocolo de ciclagem:
Quadro 4. Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR de identificação para M.
tuberculosis
PASSO TEMPO TEMPERATURA
QUANTIDADE DE
CICLOS
1º 10 minutos 95ºC 1
1minuto 94ºC
2 minutos 56ºC
2º
1 minuto 72ºC
30
3º 7 minutos 72ºC 1
4º ∞ 4ºC 1
32
Na seqüência, 15µL do produto amplificado foi aplicado em gel de
agarose a 1% contendo Brometo de etídio na concentração de 10µg/mL e o
produto da amplificação foi resolvido por eletroforese a 90 volts e padrão de
peso molecular de 50pb aí adicionado. A eletroforese foi fotodocumentada
empregando Alpha Imager – Alpha Innotech
®
.
3.3- Técnica do PRA
Os isolados que não apresentaram amplificação do fragmento de 245 pb
dentro do IS6110, foram submetidos a técnica do PRA para a identificação de
outras espécies de micobactérias segundo Plikaytis et al. (1992) e Telenti et al.
(1993).
Utilizando o DNA extraído por termólise descrito anteriormente, os
isolados foram submetidos à PCR para amplificação do gene hsp65 produzida
com a utilização dos oligonucleotídeos iniciadores Tb11
(ACCAACgATggTgTgTCCAT) e Tb12 (CTTgTCgAACCgCATACCCT).
Empregando volume final de 30µL em cada reação, foram utilizados 27µL de
Master Mix (PROMEGA
®
) na diluição recomendada pelo fabricante de 1 parte de
Master Mix 2x para 1 parte de água ultra-pura e 0,25µL (25pmoles) de cada
oligonicleotídeo iniciador (Tb11 e Tb12) e 2,5µL do DNA extraído por termólise.
Para a amplificação foram utilizados os ciclos descritos no quadro 5.
33
Quadro 5: Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR de identificação para
micobactérias
PASSO TEMPO TEMPERATURA
QUANTIDADE DE
CICLOS
1º 10 minutos 94ºC 1
1minuto 94ºC
1 minuto 60ºC
2º
2 minutos 72ºC
45
3º 10 minutos 72ºC 1
4º ∞ 4ºC -
Dez microlitros dos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose a 1% contendo 6,0µL brometo de etídio (10µg/mL) e em seguida
fotodocumentado. O amplificado de 439 pares de base (figura2) foram
submetidos à digestão com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII.
Para cada enzima de restrição foi feita uma reação com volume final de
20µL. Acrescidos em 7,5µL de água ultrapurificada (MiliQ), 2,0µL do tampão da
enzima, 0,5µL de cada enzima (BstEII e HaeIII) e 10µL do produto amplificado.
Para a digestão, as enzimas possuem temperaturas específicas para tal. Para a
BstEII foi incubada a 60ºC por 1hora e para a HaeIII foi incubada 37ºC também
por 1hora. Após a incubação os produtos digeridos foram submetidos a nova
eletroforese em gel de agarose a 4% e corados com o brometo de etídio se deu
após a eletroforese. Junto com o produto da digestão foi aplicado no gel padrões
de peso molecular de 25 e 50 pares de base. Após a eletroforese o gel foi
fotodocumentado.
34
A interpretação dos resultados foi feita através de um site desenvolvido
por alguns Institutos de pesquisa internacionais em parceria com o Instituto
Adolfo Lutz (São Paulo - SP) que foi denominado PRASITE
(
http://app.chuv.ch/prasite/index.html).
O PRASITE consiste em uma página de internet onde é possível inserir
os perfis encontrados após a digestão do produto amplificado pelas enzimas de
restrição BstEII e HaeIII. A página informa a identificação da micobactéria com o
perfil eletroforético informado.
3.4- Técnica de MIRU
Confirmada a identificação de M. tuberculosis , os isolados clínicos foram
então submetidos à técnica de MIRU.
Para a técnica de MIRU foi utilizado o mesmo DNA extraído por termólise.
A amplificação dos alelos foi feita segundo SUPPLY et al. (2000) modificado por
Pandolfi, (2006) onde são utilizados 12 pares de oligonucleotídeos iniciadores,
para amplificar regiões repetitivas não codificadoras, realizando para cada cepa
um total de 12 reações com temperaturas de hibridização diferentes em 3 delas
como está descrito no quadro 6.
35
Quadro 6. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores dos 12 loci de MIRU estudados.
Locus de
MIRU
Identificação Seqüência do oligonucleotídeo Temperatura de
hibridização
2F TggACTTgCAgCAATggACCAACT
02
2R TACTCggACgCCggCTCAAAAT
60ºC
4F gCgCgAgAgCCCgAACTgC
04
4R gCgCAgCAgAAACgTCAgC
55ºC
10F gTTCTTgACCAACTgCAgTCgTCC
10
10R gCCACCTTggTgATCAgCTACCT
55ºC
16F TCggTgATCgggTCCAgTCCAAgTA
16
16R CCCgTCgTgCAgCCCTggTAC
55ºC
20F TCggAgAgATgCCCTTCgAgTTAg
20
20R ggAgACCgCgACCAggTACTTgTA
55ºC
23F CTgTCgATggCCgCAACAAAACg
23
23R AgCTCAACgggTTCgCCCTTTTgTC
55ºC
24F CgACCAAgATgTgCAggAATACAT
24
24R gggCgAgTTgAgCTCACAgAA
50ºC
26R TAggTCTACCgTCgAAATCTgTgAC
26
26F CATAggCgACCAggCgAATAg
50ºC
27F TCgAAAgCCTCTgCgTgCCAgTAA
27
27R gCgATgTgAgCgTgCCACTCAA
55ºC
31F ACTgATTggCTTCATACggCTTTA
31
31R gTgCCgACgTggTCTTgAT
55ºC
39F CgCATCgACAAACTggAgCCAAAC
39
39R CggAAACgTCTACgCCCCACACAT
55ºC
40F gggTTgCTggATgACAACgTgT
40
40R gggTgATCTCggCgAAATCAgATA
55ºC
36
Empregando volume final de 25µL em cada reação, foram utilizados 21µL
de Master Mix (PROMEGA
®
) na diluição de 1 parte de Master Mix para 2 partes
de água ultra-pura acrescido de 1µL dos oligonucleotídeos iniciadores R e F
correspondentes aos loci estudado e 2µL do DNA extraído por termólise. Para a
amplificação foram utilizados os ciclos descritos no quadro 7.
Quadro 7. Condição de amplificação dos isolados submetidos a PCR para realização da técnica
de MIRU
PASSO TEMPO TEMPERATURA
QUANTIDADE DE
CICLOS
1º 15 minutos 95ºC 1
1minuto 94ºC
1 minuto 60ºC, 55ºC, 50ºC
2º
2 minutos 72ºC
40
3º 10 minutos 72ºC 1
4º ∞ 4ºC -
Os produtos de amplificação, de tamanho variável, foram resolvidos junto
com os padrões de peso molecular (50 e 100 pares de bases) por eletroforese
em gel de agarose a 2% contendo Brometo de Etídio (10µg/mL). A eletroforese
foi fotodocumentada e as imagens dos géis foram digitalizadas para análise e
confecção de dendrograma.
37
3.4.1- Análise dos Resultados de MIRU:
Os amplificados de MIRU foram classificados em alelos para cada um dos
12 loci estudados. Após obtenção dos amplificados de todas as amostras para
um dado locus, foram determinados os tamanhos dos fragmentos em pares de
base. O seu tamanho foi determinado com o auxílio dos padrões moleculares de
50pb e 100pb e comparado com a tabela de alelos descrito no quadro 8
(MAZARS et al., 2001), que mostra o valor do alelo correspondente ao tamanho
da banda observada no gel. Determinado o perfil de alelos para cada cepa, os
MIRUs foram analisados comparativamente empregando o programa
Bionumerics (Applied Maths
®
) para construção do dendrograma.
38
Quadro 8: Correlação entre os tamanhos em pb dos amplificados e os alelos de MIRU
Alelo MIRU
02
MIRU
04
MIRU
10
MIRU
16
MIRU
20
MIRU
23
MIRU
24
MIRU
26
MIRU
27
MIRU
31
MIRU
39
MIRU
40
0
402 175 482 565 437 150 395 285 498 492 540 354
1
455 252 537 618 514 200 447 336 551 545 593 408
2
508 329 590 671 591 253 501 387 604 598 646 462
3
561 406 643 724 668 306 555 438 657 651 699 516
4
614 483 696 777 745 359 609 489 710 704 752 570
5
667 560 749 830 822 412 663 540 763 757 805 624
6
720 637 802 883 899 465 717 591 816 810 858 678
7
773 714 855 936 976 518 771 642 869 863 911 732
8
826 791 908 989 1053 571 825 693 922 916 964 786
9
879 868 961 1042 1130 624 879 744 975 969 1017 840
10
932 945 1014 1095 1207 677 933 795 1028 1022 1070 894
11
985 1022 1067 1148 1284 730 987 846 1081 1075 1123 948
12
1038 1099 1120 1201 1361 783 1041 897 1134 1128 1176 1002
13
1091 1176 1173 1254 1438 836 1095 948 1187 1181 1229 1056
14
1144 1253 1226 1307 1515 889 1149 999 1240 1234 1282 1110
15
1197 1330 1279 1360 1592 942 1203 1050 1293 1287 1335 1164
OBS. Tabela construída para permitir a correlação com amplificados obtidos com “primers”
desenhados segundo Supply et al. 2001.
39
4- Correlação epidemiológica
Para confrontar os resultados obtidos através da epidemiologia molecular
realizada com o auxílio da técnica de MIRU, foram utilizadas informações
clínico-epidemiológicas dos pacientes atendidos pelo Serviço Especial de Saúde
de Araraquara (SESA), que é a instituição responsável pelo atendimento,
tratamento e acompanhamento dos doentes na cidade de Araraquara. Foi
aplicado a todos os pacientes atendidos, um questionário elaborado
principalmente para o estudo epidemiológico (em anexo), com dados
necessários para tal correlação. As informações obtidas através dos
questionários alimentaram o programa de bioinformática EPI-INFO versão 3.5.1
para analisar e correlacionar os dados epidemiológicos com os resultados de
genotipagem.
40
IV. RESULTADOS
De um total de 182 isolados congelados recebidos, foi possível a
reativação de 158 isolados.
1- Identiificação Molecular:
A técnica da PCR confirmou a identificação do M. tuberculosis em 140
isolados que apresentaram um produto de amplificação de 245pb (Figura 1).
Figura 1: Fotografia do gel de agarose a 1% na confirmação molecular dos isolados de M.
tuberculosis, utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores INS1 e INS2 a apresentando um
fragmento de 245pb, dois marcadores de peso molecular (50pb e 100pb) e controle negativo
(C-).
245 pb
41
Nestes isolados, a pureza da cultura ainda foi verificada pela confecção
do esfregaço em lâmina, coloração pela técnica de Ziehl Nëelsen e observação
de BAAR. Posteriormente, foi verificado que dos 140 isolados, 28 eram amostras
em duplicata. Dos 18 isolados que não apresentaram amplificação de 245 pb, a
técnica do PRA (Figura 2 e 3 e Tabela 1) confirmou a identificação de mais 9
isolados de M.tuberculosis, 4 isolados tiveram resultado inconclusivo e 5 foram
identificadas como: M. xenopii, M. gordonae, M. abscesus, M. genevalensis, e
M. avium. Os resultados indicaram que 9 isolados clínicos de M. tuberculosis
não tinham a seqüência de inserção IS6110 específica de M. tuberculosis.
Outros 5 isolados identificados no SESA como M. tuberculosis pelos método
clássico, foram identificadas molecularmente como micobactérias não
tuberculosas. Os demais 4 isolados não puderam ser identificados tanto por
PCR como pelo PRA. Futuramente estes 4 isolados poderão ser submetidos ao
seqüenciamento para identificação final e quem sabe propor uma nova espécie
ou variante de alguma espécie micobacteriana.
42
Figura 2: Foto do gel de agarose a 1% com o produto da amplificação do gene hsp65
apresentando um fragmento de 439 pares de base(PB) acompanhado do marcador molecular
de 100pb.
Os isolados que foram submetidos à técnica do PRA foram identificados
conforme a tabela 1.
1251
7496
1370
6495
2923
6530
100pb
439pb
43
Tabela 1: Resultado do perfil genético dos isolados de micobactérias utilizando a técnica
do PRA.
Número da cepa Identificação pela técnica do PRA
293 Complexo Mycobacterium tuberculosis
103 Complexo Mycobacterium tuberculosis
120 Inconclusivo
124 Complexo Mycobacterium tuberculosis
135 Complexo Mycobacterium tuberculosis
151 Complexo Mycobacterium tuberculosis
169 Inconclusivo
171 Inconclusivo
180
Mycobacterium xenopi
181 Complexo Mycobacterium tuberculosis
189 Complexo Mycobacterium tuberculosis
292
Mycobacterium gordonae
191 Inconclusivo
200
Mycobacterium abcessus
204
Mycobacterium genevense
207 Complexo Mycobacterium tuberculosis
209 Complexo Mycobacterium tuberculosis
255
Mycobacterium avium
44
Figura 3: Fotografia do gel de agarose a 4% da digestão com as enzimas de restrição BstEII e
HaeIII do produto amplificado obtendo perfis eletroforéticos das micobactérias empregando a
técnica do PRA. Para os isolados 1251, 1370, 6530 e 3884 foi obtido o seguinte perfil
eletroforético na enzima de restrição BsteII – (235-120-85) e na HaeIII – (150-130-70), no isolado
7496 foi obtido na digestão com a enzima BstEII – (235-120-100) e HaeIII – (125-105-0), no
isolado 6495 foi obtido o perfil na enzima de restrição BstEII – (235-120-100) e HaeIII – (160-
105-60) e no isolado 2923 foi obtido o perfil na enzima de restrição BstEII – (440-0-0) e HaeIII –
(160-145-60).
2- Genotipagem pela técnica do MIRU:
Após a confirmação da pureza e da identificação do M. tuberculosis, a
genotipagem foi realizada em 121 isolados (112 + 9 isolados identificados pela
técnica do PRA como pertencentes ao Complexo M. tuberculosis), onde foi
BstEII
HaeIII
45
estudada a amplificação dos 12 loci de MIRU, para cada uma das cepas
isoladas pela equipe do SESA.
Foi verificado que entre os 9 isolados de M. tuberculosis, que não
apresentaram amplificação do fragmento de 245 pb (do IS6110), apenas 3
apresentaram amplificação em todos alelos e 6 falharam em amplificar certos
alelos de MIRU (tabela 2). Resultados de MIRU dos demais isolados de M.
tuberculosis que amplificaram fragmento de 245pb encontram-se divididos pelo
ano de isolamento onde as tabelas (3, 4, 5, 6 e 7) possuem o número de cada
cepa estudada e seu alelo para cada oligonucleotídeo iniciador de MIRU
analisado.
Tabela 2: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles que não apresentaram IS6110.
ALELOS
Nºamostra 02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
293 2 2 5 3 1 3 1 5 N/A 3 2 3
103 2 2 3 2 2 6 1 4 3 3 2 1
124 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
135 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
151 N/A N/A N/A 1 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
181 2 2 3 1 N/A N/A 1 5 N/A 3 2 4
189 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
207 2 2 4 3 1 6 1 4 3 2 2 8
209 2 2 4 2 1 6 1 4 2 3 2 1
N/A – Não houve amplificação
46
Tabela 3: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles no ano de 2002.
ALELOS
Nº amostra 02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
25 2 2 4 2 2 6 1 4 3 3 2 1
27 1 2 4 3 2 6 1 4 3 2 2 3
79 2 2 5 3 2 6 1 5 3 1 2 3
86 2 2 5 3 1 6 1 4 3 2 2 1
89 1 2 5 3 2 6 1 5 3 2 2 2
90 2 2 5 2 2 6 1 5 2 3 2 1
91 1 2 4 4 2 6 1 5 3 2 2 2
92 1 2 5 3 2 6 1 4 3 2 2 2
93 2 2 4 4 2 6 1 3 2 2 2 1
95 2 2 4 2 2 6 1 3 2 3 2 1
97 2 2 4 2 2 6 1 3 2 3 2 1
98 2 2 4 3 2 5 1 6 3 3 2 1
99 1 2 4 4 2 6 1 5 3 2 2 2
100 1 2 4 4 2 6 1 5 3 2 2 5
101 2 2 6 4 2 3 1 5 3 3 2 2
102 1 2 4 4 2 6 1 5 3 2 2 6
104 2 2 6 4 2 3 1 5 3 3 2 3
105 2 2 6 3 2 3 1 5 3 3 2 3
106 2 2 6 3 2 3 1 5 3 3 2 1
107 2 2 6 3 2 3 1 5 3 3 2 3
108 2 2 4 3 1 6 1 4 3 2 2 1
112 2 2 5 2 1 6 1 4 3 2 2 1
114 2 2 3 2 2 5 1 6 4 3 2 1
117 1 2 4 3 2 6 1 4 3 2 2 3
47
Tabela 4: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles no ano de 2003.
ALELOS
Nº amostra
02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
119 1 2 4 2 2 7 1 4 1 2 2 4
123 2 2 5 2 1 3 1 5 1 3 2 3
125 2 2 3 2 2 5 1 6 3 3 2 1
129 1 2 4 2 2 8 1 5 1 2 2 4
130 2 2 3 0 2 5 1 5 1 3 2 4
133 2 2 5 2 2 3 1 5 3 3 2 3
134 1 2 2 3 2 6 1 5 2 2 2 1
136 2 2 2 3 2 5 1 2 3 3 2 3
137 1 2 3 3 2 6 1 5 3 2 2 2
146 2 2 3 3 2 6 1 5 3 3 2 4
147 1 2 3 3 2 6 1 5 3 2 2 2
148 2 2 3 3 2 5 1 4 3 3 2 4
149 2 2 4 3 2 3 1 5 3 3 2 3
150 2 2 3 2 2 6 1 5 3 3 2 1
152 2 2 1 2 2 6 1 6 3 3 2 1
153 2 2 3 2 2 6 1 6 3 3 2 1
155 1 2 3 3 2 6 1 5 3 2 2 2
157 2 2 3 2 2 6 1 5 3 3 2 1
159 2 2 3 1 2 5 1 6 2 3 2 1
160 2 2 4 0 2 7 1 6 2 3 2 1
161 1 2 4 2 2 6 1 5 3 2 2 4
162 1 2 4 2 2 6 1 6 3 2 2 5
164 2 2 5 2 2 5 1 6 3 3 2 3
166 2 2 5 2 1 3 1 5 3 3 2 3
167 2 2 3 2 1 6 1 4 3 2 2 1
168 2 2 3 2 2 5 1 6 3 3 2 1
48
Tabela 5: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles no ano de 2004.
ALELOS
Nº amostra
02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
170 1 2 2 2 1 6 1 5 3 2 3 4
173 1 2 3 3 2 2 1 5 3 2 3 2
175 2 2 4 1 2 6 1 4 1 3 3 1
176 2 2 5 3 1 3 1 5 3 3 3 3
179 1 2 4 2 1 6 1 7 3 2 3 4
184 2 2 3 3 2 6 1 5 3 3 3 1
186 2 2 2 1 2 6 1 4 3 3 3 1
193 2 2 3 2 2 6 1 5 3 3 3 1
199 1 2 3 2 2 6 1 5 3 3 3 1
203 2 2 4 3 2 7 1 5 3 3 3 5
206 2 2 4 3 2 4 1 3 3 2 3 1
208 2 2 2 2 2 6 1 4 3 3 3 1
289 1 2 3 4 1 6 1 5 3 2 3 1
290 2 2 4 2 1 3 1 5 3 3 3 3
291 2 2 3 0 2 3 1 5 2 3 3 1
49
Tabela 6: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles no ano de 2005.
ALELOS
Nº amostra
02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
211 2 2 5 3 2 3 1 6 3 3 2 3
212 2 2 4 3 2 6 1 3 3 3 2 3
213 2 2 4 1 2 6 1 3 2 3 2 1
214 2 2 4 3 2 5 1 7 3 2 2 1
215 2 1 3 2 2 6 1 4 3 2 2 1
217 1 2 4 3 2 6 1 4 3 2 2 2
218 2 2 3 2 2 6 1 4 3 3 2 1
219 1 2 4 3 1 3 1 4 3 2 2 2
220 2 2 5 3 2 3 1 5 3 3 2 1
222 2 2 3 3 2 6 1 4 3 3 2 1
224 2 3 4 3 2 5 1 5 3 3 2 3
226 1 2 4 3 2 6 1 5 3 3 2 5
228 1 2 4 3 2 6 1 4 3 2 2 2
233 3 3 2 3 2 6 1 5 3 3 2 4
234 1 2 4 3 2 5 1 4 3 2 2 2
238 2 2 5 3 1 3 1 5 3 3 2 3
241 1 2 4 2 2 6 1 4 3 2 2 4
244 1 2 4 3 2 6 1 3 3 2 2 4
246 2 2 3 3 2 5 1 4 3 3 2 2
250 2 2 4 1 2 5 1 6 3 3 2 1
253 2 2 3 2 2 6 1 6 3 3 2 1
236 2 2 3 3 2 6 1 3 3 3 2 1
50
Tabela 7: Alelo correspondente ao tamanho do fragmento de cada um dos isolados submetidos a
técnica de MIRU mostrando o perfil genético de cada um deles no ano de 2006.
ALELOS
Nº amostra
02 04 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40
256 2 2 4 0 1 5 1 6 3 3 2 1
257 2 2 5 3 1 4 1 5 3 3 2 3
258 2 2 2 2 2 6 1 4 3 3 2 1
259 1 2 3 3 1 6 1 5 3 2 2 9
260 2 2 5 3 1 4 1 5 3 3 2 3
261 2 2 4 2 2 6 1 6 3 3 2 1
265 2 2 3 3 2 2 1 4 3 3 2 3
266 1 2 5 3 2 6 1 4 3 2 2 2
268 2 2 4 3 2 6 1 3 3 3 2 4
269 1 2 4 2 2 6 1 5 3 3 2 4
271 2 2 4 3 2 5 1 5 3 3 2 3
272 2 2 4 2 2 6 1 4 2 3 2 1
273 1 2 3 3 1 6 1 5 3 2 2 8
274 1 2 4 2 2 6 1 4 3 2 2 3
275 2 2 4 2 2 6 1 5 3 3 2 1
276 2 2 3 3 2 6 1 4 3 3 2 3
277 1 2 4 3 2 6 1 3 3 1 2 5
278 1 2 2 3 2 6 1 4 3 2 2 2
279 2 2 4 1 2 8 1 4 3 3 2 1
282 1 2 4 3 2 6 1 5 3 2 2 2
283 2 2 3 2 2 6 1 5 3 3 2 1
284 2 2 5 3 1 3 1 5 3 3 2 3
285 2 2 4 2 2 6 1 2 3 3 2 1
286 2 2 4 3 2 5 1 5 3 3 2 3
287 2 2 4 1 2 6 1 5 2 3 2 1
Na tabela 8 são apresentados os resultados da representatividade dos
isolados clínicos analisados pela técnica de MIRU a partir das cepas de M.
tuberculosis provenientes de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos
pelo SESA no período de 2002 a 2006.
51
Tabela 8: Relação entre Número de pacientes com tuberculose pulmonar, cultura positiva e
Genotipagem
Do total de culturas positivas recebidas, a técnica de MIRU foi realizada
em 74, 2% (121/163) dos isolados. Empregando os valores de alelos gerados
pelos 12 loci de cada isolado clinico do M. tuberculosis apresentados nas
Tabelas de 2 a 7, tendo excluído os seis que não apresentaram todos os alelos
e utilizando o programa BIONUMERICS
®
, foi gerado um dendrograma para
avaliar o nível de similaridade existente entre os 115 isolados estudados (figura
4).
Ano
Nº pacientes
atendidos
com TB
pulmonar
Nº de Cult. +
recebidas
Isolados
submetidos a
téc de MIRU
N / %
2002 41 36 26 / 72,2%
2003 41 33 29 / 87,9%
2004 43 25 19 / 76%
2005 32 31 22 / 71%
2006 40 38 25 / 65,8%
TOTAL 197 163 121 / 74,2%
52
Figura 4: Dendrograma produzido com os resultados obtidos pela técnica de MIRU onde se
observa a formação de13 grupos genéticos.
Pearson correlation
MIRU
100
98
96
94
92
90
88
86
84
82
80
78
76
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
52
50
48
146
148
203
100
102
226
161
241
269
162
119
129
170
179
244
277
212
268
027
117
274
217
228
282
089
234
092
266
137
147
155
091
099
079
246
276
224
271
286
164
134
278
289
233
209
272
090
095
097
213
175
086
108
112
025
218
279
103
167
215
222
236
186
208
258
285
250
256
159
160
287
153
253
150
157
283
261
275
125
168
114
193
199
184
098
214
152
093
206
136
173
265
133
166
149
211
238
284
257
260
176
101
104
105
107
219
290
106
220
123
130
291
259
273
207
53
Dos 115 isolados estudados por MIRU, 29 (25,2%) agruparam-se em 13
grupos clonais com similaridade de 100%, sendo 10 grupos de dois isolados
cada (125 e 168; 153 e 253; 95 e 97; 91 e 99; 92 e 266; 217 e 228; 27 e 117;
260 e 257; 105 e 107; 106 e 220) e 3 contendo 3 isolados cada (150, 157 e 283;
137, 147 e 155; 224, 271 e 286). Os demais 86 isolados (74,8%) apresentaram
perfil genético único. Entretanto, ao considerar uma similaridade igual ou
superior a 83%, foi possível destacar 3 grandes grupos clonais A, B e C,
envolvendo 86 (74,8%) de todos os isolados analisados. Nestes grandes grupos
A, B e C estavam inseridos todos os 13 grupos clonais com 100% de
similaridade. A distribuição dos isolados dentro dos referidos grupos são
apresentados na quadro 9.
Quadro 9: Distribuição de isolados dentro dos grupos clonais com similaridade igual ou
superior a 83%, incluindo os isolados agrupados com 100% de similaridade
Similaridade de 83 ou mais Total de isolados
A (27 e 117), 274, (217 e 228), 282, 89, 234, (92 e
266), (137, 147 e 155), (91 e 99), 79, 246, 276,
(224, 271, 286), 164, 134, 278, 289
25
B 209, 272, 90, (95 e 97), 213, 175, 86, 108, 112,
25, 218, 279, 103, 167, 215, 222, 236, 186, 208,
258, 285, 250, 256, 159, 160, 287, (153 e 253),
(150, 157 e 283), 261, 275, (125 e 168), 114, 193,
199, 184, 98, 214, 152
43
C 133, 166, 149, 211, 238, 284, (257 e 260), 176,
101, 104, (105 e 107), 219, 290, (106 e 220), 123
18
54
3- Avaliação epidemiológica clássica:
Foram analisados apenas os dados epidemiológicos dos 115 pacientes
dos quais foram obtidos isolados clínicos de M. tuberculosis com perfis
genotípicos de MIRU. A análise foi baseada nos questionários (modelo em
anexo), empregando o programa EPI-INFO versão 3.5.1, e os resultados estão
apresentados nas tabelas 9, 10 e 11.
Os pacientes do sexo masculino representaram 73% (84/115) e do sexo
feminino 27% (31/115) dos pacientes acometidos por tuberculose na cidade de
Araraquara. A faixa etária variou de 15 a 87 anos de idade com predominância
de 58,2% dos pacientes com idade entre 21 e 49 anos (media de 43,7 anos). Em
relação a escolaridade, 67,9% deles apresentaram no máximo o primeiro grau
completo. Quanto à procedência 45,2% dos pacientes, eram naturais da cidade
de Araraquara e 43,5% do total ganhavam alguma renda. Nesta população
avaliada, 23 (20%) pacientes foram à óbito e dentre estes, 8 (34,8%) pacientes
tiveram a causa da morte devido a tuberculose pulmonar. O tempo médio de
duração dos sintomas, desde o seu aparecimento até a procura de um
atendimento médico, foi bastante alto, com média de 63,9 dias. No diagnóstico,
81,8% (94) dos pacientes apresentaram baciloscopia positiva. Em relação ao
tratamento, na sua grande maioria, 106 (92,2%) pacientes foram tratados com o
esquema I, dos quais 97 (84,3%) obtiveram alta por cura. Em relação a fatores
predisponentes, pacientes portadores de HIV foram representados por apenas
8,7% da população ao passo que etilismo foi de 32,1%, tabagismo de 45,2% e
contatos prévios com outros pacientes com tuberculose foi de 29,6%.
55
Tabela 9: Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose, segundo características demográficas.
CARACTERÍSTICAS Nº (%) DE PACIENTES (n=115)
a
Idade (anos)
Média
Médiana
43,7 ± 15,4
43 (15 - 87)
Faixa etária
15 a 20
21 a 49
50 a 87
6 (5,3%)
67 (58,2%)
42 (36,5%)
Sexo
Feminino
Masculino
31 (27%)
84 (73%)
Natural de Araraquara
Sim
Não
52 (45,2%)
63 (54,8%)
Escolaridade
Analfabeto e 1º grau completo
2º grau incompleto ou mais
Ignorado
78 (67,9%)
33 (28,6%)
4 (3,5%)
Número de pessoas em casa
1 a 2
3 a 5
Ignorado
14 (12,2%)
67 (58,3%)
34 (29,5%)
Renda
Com renda
Sem renda
Ignorado
Valor da Renda
Média (reais)
50 (43,5%)
27 (23,4%)
38 (33,1%)
592,47 ± 446,26
(140,00 – 2.000,00)
Óbito
Sim
Não
23 (20%)
92 (80%)
Óbito por TB (n=23)
Sim
Não
8 (34,8%)
15 (65,2%)
a
- valores diferentes são descritos acompanhando a análise correspondente
56
Tabela 10: Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose, segundo características clínicas e
laboratoriais.
CARACTERÍSTICAS Nº (%) DE PACIENTES (n=115)
a
Tempo de sintomas (dias) (n=68)
Média
63,9 ± 60,55
(3-365)
Tuberculose anterior
Sim
Não
Ignorado
10 (8,7%)
84 (73%)
21 (18,3%)
Esquema de tratamento
Esquema I (INH, RIF, PZA)
Esquema IR (INH, RIF, PZA, EMB)
Ignorado*
106 (92,2%)
8 (6,9%)
1 (0,9%)
Tipo de alta
Cura
Abandono
Óbito
Outro
97 (84,3%)
6 (5,2%)
8 (7%)
4 (3,5%)
BCG
Sim
Não
Ignorado
32 (27,8%)
21 (18,3%)
62 (53,9%)
Baciloscopia
Positiva
Negativa
Não realizada
Positiva +
Positiva ++ e +++
94 (81,8%)
20 (17,4%)
1 (0,8%)
56 (58,7%)
38 (41,3%)
HIV
Positivo
Negativo
Não Raelizado
Ignorado
10 (8,7%)
83 (72,2%)
16 (13,9%)
6 (5,2%)
a
- valores diferentes são descritos acompanhando a análise correspondente
* - paciente faleceu no dia do diagnóstico
RFP - Rifampicina INH - Isoniazida PZA - Pirazinamida SM - Estreptomicina
EMB – Etambutol ETH - Etionamida CS - Cicloserina PAS - Paranitrobenzoico
57
Tabela 11: Distribuição dos 115 pacientes portadores de tuberculose, segundo características
epidemiológicas adicionais.
CARACTERÍSTICAS Nº (%) DE PACIENTES
(n=115)
Contato prévio com tuberculose
Sim
Não
Ignorado
34 (29,6%)
55 (47,8%)
26 (22,6%)
Local de procedência
São Paulo
Outros Estados
Ignorado
92 (80%)
15 (13%)
8 (7%)
Etilismo
Sim
Não
Ignorado
37 (32,2%)
58 (50%)
20 (17,8%)
Tabagismo
Sim
Não
Ignorado
52 (45,2%)
45 (39,1%)
18 (15,7%)
58
4- Correlação entre clusters de MIRU e dados de epidemiologia clássica :
O dendrograma gerou formação de 13 grupos genéticos sendo 3 grupos
com três indivíduos cada e 10 com dois indivíduos cada. Tentativa de correlação
entre os isolados em cluster e dados epidemiológicos dos pacientes que
geraram estes isolados são apresentados na tabela 12.
Tabela 12. Correlação entre os isolados de M. tuberculosis pertencentes a grupos genéticos
definidos pelo MIRU com os dados epidemiológicas identificadas entre os 28 pacientes
infectados por estas cepas
Gru-
po
Gené-
tico
Nº da
amos-
tra
Data da
Bacilos-
copia
Fatores de
Risco:
HIV/Etilis-
mo/ Cont.
Anterior
Tratamen-
to/
Tipo de
alta
Idade/
Profissão
Outras relações
Epidemiológi-
cas
I
91
99
21/03/2002
06/06/2002
Neg/Não /Sim
Neg/Não/Não
EsquemaI/
Cura
Esquema I/
Cura
23 anos
Trab.
Rural
20 anos
Balconista
II
92
266
14/02/2002
21/02/2006
Neg/ Não/Sim
Neg/Sim/Não
Esquema I/
Cura
Esquema
I/Cura
64 anos
Jardineiro
37 anos
Serv.
Gerais
III
217
228
17/02/2005
10/02/2005
Ig/ Sim/ Ig
Ig./Ig./Não
Esquema I
/Cura
Esquema I/
Cura
45 anos
Serv
Gerais
65 anos
Garçom
Moradores do
mesmo bairro
IV
27
117
29/08/2002
24/05/2002
Neg/Não/Sim
Neg/Não/Sim
Esquema
I/Cura
Esquema
I/Cura
43 anos
Pedreiro
42 anos
Do lar
Marido e esposa
V
137
147
155
13/05/2003
12/08/2003
06/10/2003
Neg/Sim/Não
Neg/Ig./Sim
Ig./Ig./Não
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Óbito
61 anos
Caseiro
50 anos
Pedreiro
38 anos
Aposenta-
do
Moradores de
bairros
próximos
59
VI
224
271
286
24/04/2005
06/11/2006
29/07/2003
Neg/Ig./Não
Ig./Ig./Ig.
Ig./ Não/ Não
Esquema I/
Cura
Esquema IR/
Transferido
Esquema I/
Cura
57 anos
Pedreiro
87 anos
Do lar
81 anos
Do lar
VII
95
97
11/04/2002
03/05/2002
Neg/Não/Não
Neg/Sim/Não
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Cura
65 anos
Caminho-
neiro
58 anos
Vendedor
VIII
125
168
04/02/2003
11/12/2003
Neg/ Ig./Sim
Neg/Não/Não
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Abandono
31 anos
Do lar
44 anos
Téc.
terapêutico
IX
153
253
20/10/2003
14/12/2005
Pos/Sim/Sim
Neg/Não/Sim
Esquema
IR/ Cura
Esquema I/
Cura
48 anos
Do lar
39 anos
Cobrador
de ônibus
Moradores de
bairros
próximos
X
150
157
283
23/07/2003
10/10/2003
27/04/2006
Neg/Não/Sim
Neg/Não/Não
Neg/Sim/ Não
Esquema I/
Cura
Esquema I
Abandono
Esquema
I/Cura
39 anos
Caminho-
neiro
26 anos
Acompa-
nhante
58 anos
Trab.
Rural
XI
105
107
30/08/2002
29/08/2002
Neg/Ig./Ig.
Neg/Não/Não
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Cura
51 anos
Jardineiro
38 anos
Do lar
XII
257
260
15/09/2006
05/07/2006
Neg/Sim/Sim.
Neg/ Ig./Ig.
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Óbito
43 anos
Trab.
Rural
48 anos
Passadeira
XIII
106
220
05/03/2004
04/03/2005
Neg/Sim/Sim
Neg/Sim/Sim
Esquema I/
Cura
Esquema I/
Cura
37 anos
Vendedor
50 anos
Pedreiro
Moradores
próximos
60
Dos 29 pacientes agrupados, apenas 10 (34,4%) eram do sexo feminino e
19 (65,6%) do sexo masculino. Com exceção de um paciente, os demais 28
(96,5%) foram tratados com o esquema I obtendo-se alta por cura em 82,8% dos
casos. Apenas um caso de co-infecção HIV/TB foi verificado entre os pacientes
em grupos genéticos formados, ao passo que 31% (9/29) eram etilistas,
excetuando os pacientes com os dados ignorados. Em relação às profissões
dos 19 pacientes masculinos agrupados por similaridade genética dos isolados
de M. tuberculosis geneticamente, destacou-se a função de pedreiro com 21%
(4/19), seguido do trabalhador rural com 15,7% (3/19) e entre os pacientes do
sexo feminino, 70% (7/10) eram domésticas ou exerciam atividades em casa
(passadeira e acompanhante).
61
V. DISCUSSÃO
O agente da tuberculose, o M. tuberculosis é transmitido principalmente
através do ar sendo responsável por aproximadamente 10 milhões de novos
casos da doença no mundo e mortalidade de cerca de 3 milhões de pessoas
anualmente. Por outro lado, é estimado que 1/3 da população apresente a
infecção latente, representando um grande reservatório da doença (SUPPLY et.
al., 2001).
Nas grandes cidades e capitais como São Paulo e Rio de Janeiro, os
problemas da tuberculose são amplamente estudados (OELEMANN et. al,
2007). Entretanto nas pequenas cidades do interior, poucas são as literaturas
pertinentes (SEVERO&LEITE, 2005, MALASPINA et.al, 2008). Neste sentido,
este trabalho objetivou estudar os fatores relacionados com a transmissão e
mobilidade das cepas de M. tuberculosis numa cidade do interior de São Paulo.
Foi empregada a técnica de MIRU para diferenciar e/ou agrupar isolados clínicos
de M. tuberculosis através de suas características genotípicas. Foi avaliado, e
também evidenciado quando a tuberculose era devido à infecção recente ou a
reativação, bem como estabelecida as possíveis ligações epidemiológicas
cruzando os resultados de genotipagem com os dados da epidemiologia
clássica, contribuindo assim para o controle da tuberculose, em uma cidade do
interior do Estado de São Paulo.
Em relação à identificação do M. tuberculosis, foi verificada a importância
de se utilizar além da metodologia clássica, os métodos moleculares como PCR
que amplificaram alelos específicos e a técnica do PRA. Em nosso trabalho, dos
62
158 isolados identificados como pertencentes ao complexo M. tuberculsis pelo
método clássico, 9 (5,7%) foram identificadas como outras espécies de
micobactérias (tabela 1), sendo identificado um isolado de cada uma das
seguintes espécies: M. xenopii, M. abscesus, M. avium, M. genevense, M.
gordonae. Em quatro isolados a identificação foi inconclusiva. Excetuando M.
gordonae e as 4 não identificadas, as demais são consideradas micobactérias
potencialmente patogênicas para humanos, causando diferentes tipos de
infecção como lesões cutâneas, e doenças pulmonares (DUCATI, 2005). A co-
infecção M. tuberculosis e outras micobactérias potencialmente patogênicas têm
sido descritas por diferentes autores (TANAKA et. al, 2003, LEITE et al., 2005).
Neste sentido, estes isolados poderiam estar contaminando o mesmo paciente,
juntamente com o M. tuberculosis. Entretanto após o procedimento de
congelamento, descongelamento e cultivo, devido à sua maior velocidade de
crescimento em relação ao M. tuberculosis, estas micobactérias podem ter
prevalecido nos subcultivos (STREIT et. al, 2008).
Por ouro lado, apesar da técnica da PCR, empregando os primers que
amplificam fragmento contido na seqüência de inserção IS6110, ser de grande
facilidade e ser um método altamente sensível (VAN EMBDEN et.al, 1993) em
nosso trabalho esta técnica deixou de identificar 5,7% (9/158) dos isolados. A
IS6110 são transposons que aparecem na freqüência de 0 a 20 vezes nas cepas
de M. tuberculosis (VAN SOOLINGEN et al., 1993). Entretanto certas cepas de
M. tuberculosis podem ou não apresentar o IS6110 como foi encontrado em
isolados no Sul da África e em um isolado em Minas Gerais onde haviam
63
deleções totais ou parciais do IS6110 (GIBSON et al., 2008). Nos isolados
estudados provenientes da cidade de Araraquara, foi verificado que dentre as
149 cepas identificadas como M. tuberculosis, 9 não apresentavam IS6110. Com
isso, a utilização da técnica do PRA nestes isolados cujo transposon está
ausente, aumentou o acerto na identificação desses isolados.
Em relação aos dados epidemiológicos obtidos com a aplicação do
questionário (tabelas 9, 10 e 11) entre os 115 pacientes com tuberculose
pulmonar, a faixa etária predominante era de 21 e 49 anos. Nesta faixa etária
estão os indivíduos economicamente ativos que estão no mercado de trabalho.
Fato demonstrado no questionário de que 43,5% tinham algum tipo de renda.
Isso traz problema social e pobreza concordando com Santos et. al (2007) e
Severo&Leite (2005). Por outro lado, observa-se ausência de casos de
tuberculose em menores de 15 anos justificado pelo fato de que 100% dos
recém nascidos em Araraquara foram vacinados com a Vacina BCG (SINAN,
2006).
Destaca-se também que na população estudada, 73% dos pacientes
eram do sexo masculino. A predominância do sexo masculino entre os pacientes
com tuberculose pulmonar na cidade de Araraquara já havia sido observado por
Malaspina (2004) que verificou freqüência de 76,1% para este sexo. Em Américo
Brasiliense, cidade que dista 21km de Araraquara, Severo&Leite (2005)
verificaram também a freqüência aumentada de 73,9% para o sexo masculino.
Entretanto, na cidade de São Paulo, os dados encontrados no ambulatório
Clemente Ferreira, a freqüência de tuberculose entre os indivíduos do sexo
64
masculino foi apenas de 1,5 vezes superior ao do sexo feminino nos anos de
2005 a 2007 (dados não publicados). Estes dados talvez possam ser explicados
pela diferença social ainda enraizado nas cidades do interior onde a grande
maioria das mulheres são do lar (maior permanência nas casas), enquanto que
os homens exercem atividades externas. Neste raciocínio, quanto a fatores de
risco, apesar da infecção pelo HIV ser verificada em apenas 8,7% dos pacientes,
o etilismo, que é também considerado fator imunodebilitante foi verificado em
32,1% dos pacientes, sendo marcante para o sexo masculino onde 41% destes
eram etilistas.
Em relação aos grupos genéticos gerados pela técnica de MIRU (figura 4
e tabela 12), 29 isolados dos 115 analisados formaram 13 agrupamentos com
100% de similaridade. Segundo Small et. al. (1994), esses grupos significam a
existência de transmissão recente. Neste sentido pode se inferir que nesta
população estudada, cerca de 25,2% dos casos de tuberculose eram
decorrentes de transmissão recente. Sendo a tuberculose uma doença
oportunista, é possível observar que alguns pacientes, cujos isolados formaram
grupos genéticos idênticos, só manifestaram a doença alguns anos depois do
contato com o paciente infectado (tabela 12). Esta afirmativa é exemplificada
pelo paciente número 92 onde o diagnóstico de tuberculose é datado de
14/02/2002 e do outro paciente de número 266 que gerou cepa em agrupamento
é de 21/02/2006, assim como os pacientes 224, 271 e 286; 153 e 253; 150, 157
e 283, 106 e 220 que apresentaram a manifestação da doença em anos
diferentes.
65
Por outro lado, 74,8% dos pacientes apresentaram isolados clínicos de M.
tuberculosis com perfil genético único o que pode inferir que na população
estudada de Araraquara, a tuberculose é decorrente de reativação em 74,8%
dos casos. Malaspina (2004) trabalhando com a técnica de RFLP verificou para
a mesma comunidade de Araraquara que 71,7% casos de tuberculose eram
devido a reativação e 28,3% em decorrencia da trasmissão, dados confirmados
por Pandolfi, (2006) utilizando a técnica de MIRU, para o mesmo período.
Para Sharma et.al. (2008), um estudo realizado em Kanpur, zona rural no
sul da Ásia, a aplicação da técnica de MIRU não apresentou a formação de
nenhum grupo genético afirmando que mesmo em pequenas populações há
uma grande diversidade desses isolados. No estudo realizado com os isolados
clínicos do maior ambulatório da cidade de São Paulo, o Instituto Clemente
Ferreira, pela técnica de MIRU, também não foi verificado grupos com 100% de
similaridade. Entretanto, das 86 cepas analisadas, 28 foram agrupadas em 14
grupos clonais com similaridade igual ou superior a 95%, e pertenciam às
mesmas famílias de Spoligotyping. A vantagem de se estudar a epidemiologia
molecular da tuberculose numa cidade menor é a possibilidade de se analisar
quase que a totalidade dos isolados clínicos, como verificado neste trabalho, que
no decorrer dos 5 anos, foi possível analisar pela técnica do MIRU 74,2% dos
isolados de tuberculose pulmonar com cultura positiva. Este fato propicia dados
mais fidedignos que possibilita analisar casos de infecção recente/reativação.
Foi verificado neste trabalho também a vantagem do MIRU em relação ao RFLP.
A técnica do MIRU é baseada na PCR sendo de execução fácil quando
66
comparado a técnica do RFLP (SUPPLY et al., 2000). E dentre os isolados
clínicos de M. tuberculosis, obtidos na cidade de Araraquara, 7,8% (9/115) não
apresentavam o IS6110. A técnica do MIRU independe da presença do IS6110,
ao passo que a tipagem por RFLP é baseada exclusivamente na quantidade e
locais de inserção do IS6110 (RITACCO et.al,, 2008). Entretanto, dos 9 isolados
sem IS6110 detectados neste trabalho apenas em 3 foi possível caracterizar
todos os 12 locci do MIRU , fato que deverá ser estudado posteriormente.
Em relação a resistência a quimioterápicos vigentes dos isolados clínicos
pertencentes a grupos clonais, no Ambulatório do Instituto Clemente Ferreira,
62,9% eram constituídos por isolados com sensibilidade a todas as 3 drogas
testadas e 37,1% com resistência a uma ou mais drogas (dados não
publicados).
Analisando os grupos genéticos encontrados neste trabalho, pode se
verificar que todos eram constituídos de isolados sensíveis uma vez que em
82,7% dos casos houve alta por cura empregando o Esquema I (tabela 12).
Houve ainda 1 caso de transferência, 2 casos de abandono , 2 casos óbito,
entretanto nenhum destes devido à Tuberculose. Os dados deste trabalho
associados aos obtidos pelo Ambulatório do Instituto Clemente Ferreira-SP
(especializados em atendimentos a pacientes MDR-TB) reforçam o
entendimento de que as cepas sensíveis as drogas é que estão
predominantemente formando grupos genéticos, isto é, são mais infectantes.
Ainda, entre os grupos formados, analisando os fatores de risco para
aquisição da Tuberculose, nossos resultados indicam que o etilismo é um dos
67
principais fatores predisponentes. Este dado difere dos encontrados nas cidades
densamente habitadas como São Paulo e Rio de Janeiro (GIBSON et. al, 2008),
bem como os descritos na literatura internacional como citado por Lannoy et. al.,
(2008) onde o HIV figura como um dos principais fatores predisponentes à
tuberculose. Em relação a profissão, no sexo masculino, os trabalhadores da
área da construção civil, como os pedreiros, seguido de trabalhadores rurais,
predominaram entre os pacientes com tuberculose.
Segundo as fontes do IBGE (Pesquisa Anual de Serviços - IBGE, 2006), a
cidade de Araraquara é uma cidade agro-industrial onde predomina a indústria
sucroalcooleira. Neste sentido, para os cortadores de cana, as condições
desgastantes e a situação de stress em decorrência de um regime de trabalho
intenso, provavelmente tenha favorecido o desenvolvimento da doença. Fato
semelhante foi verificado por Severo&Leite (2005), analisando a incidência de
Tuberculose na população de Américo Brasiliense, onde a cultura canavieira é
uma das principais fontes de renda da cidade.
Analisando os grupos genéticos encontrados neste trabalho, com
similaridade de 83% ou mais, pode se dizer que 74,8% dos isolados da cidade
de Araraquara pertenciam a um dos 3 grandes grupos A1, B1 ou C1 (quadro 9).
Malaspina (2004) também verificou algo semelhante empregando a técnica do
RFLP, onde 52% dos isolados pertenciam às famílias A e P. Esta diferença de
cerca de 20% na mesma população, provavelmente é devido à utilização de
ferramenta diferenciada para analise epidemiológica, mas, sobretudo devido ao
menor tempo de análise por Malaspina (2004).
68
Segundo Bradem et al, (1997), agrupamentos de isolados de M.
tuberculosis, nem sempre representam transmissão recente, mas pode refletir
persistência de cepas endêmicas bem conservadas. Neste sentido o que
podemos sugerir é de que a tuberculose em Araraquara se deve a presença de
cepas endêmicas persistentes, responsáveis por cerca de 74,8% dos casos,
além da existência de transmissão recente que neste trabalho foi de 25,2%.
Outro fato que pode justificar a transmissão da Tuberculose é a baciloscopia,
que em 81,8% dos casos, o paciente era bacilífero, aliado ao retardo de
diagnóstico uma vez que os pacientes na sua maioria procuraram os médicos
após 2 meses do início dos sintomas (tabela 10).
Segundo Supply et. al. (2006), os loci de MIRU são bastante estáveis e
possuem um poder discriminatório bastante confiável, porém, observando a
discriminação do locus 4, locus 24 e locus 39 nos isolados da cidade de
Araraquara – SP, percebeu-se que o poder discriminatório desses loci não foi
tão eficaz quanto os demais loci estudados.
A utilização da técnica de MIRU na genotipagem dos isolados de M.
tuberculosis se mostrou bastante eficaz durante a realização deste trabalho,
informando pacientes portadores de reativação assim como os de infecção
recente. Mostrou ainda que os isolados que não foram confirmados pela
amplificação do IS6110, e submetidos à técnica de MIRU, não foi obtido sucesso
na maioria dos isolados pois não houve amplificação na maioria dos 12 loci
estudados.
69
Percebemos que as técnicas moleculares não substituem os métodos
epidemiológicos convencionais, mas ajudam a esclarecer problemas que não
poderiam ser estudados.
Outras correlações epidemiológicas como relação familiar e proximidades
de habitação foram verificados entre os grupos genéticos formados indicando a
importância do trabalho integrado entre a epidemiologia clássica e a molecular.
70
VI. CONCLUSÕES
Em vista do trabalho apresentado, foi possível chegar a algumas conclusões
bastante interessantes sobre a transmissibilidade da Tuberculose na Cidade de
Araraquara- SP.
- A genotipagem pela técnica de MIRU é eficaz, reprodutível e de execução
prática e facilitada;
- Nas pequenas cidades a genotipagem dos isolados de M. tuberculosis pela
técnica de MIRU pode ser aplicada em porcentagem expressiva de casos de
tuberculose, havendo possibilidade de encontrar grupos genéticos em
freqüências mais próximas da realidade do que nas grandes cidades;
- A genotipagem pela técnica de MIRU aliada a epidemiologia clássica, é um
instrumento eficaz na avaliação da transmissão e fatores de riscos relacionados
com a aquisição da tuberculose;
- Na cidade de Araraquara foi verificado presença de M. tuberculosis com
ausência de IS6110 indicando a necessidade de se complementar a
identificação do M. tuberculosis pela técnica do PRA além da PCR;
-A técnica do MIRU é possível ser aplicada em isolados de M. tuberculosis sem
IS 6110;
71
- Entre os 13 grupos genéticos formados, em alguns casos foi possível confirmar
a transmissão recente, justificada pela correlação com a Epidemiologia Clássica,
como pacientes que eram casados, habitavam no mesmo bairro ou bairros
próximos e até sob o mesmo endereço;
- Em Araraquara, o etilismo é um dos fatores imunodebilitante mais importante;
- Trabalhadores da construção civil e trabalhadores rurais foram as profissões
mais representativos na formação dos grupos genéticos;
- Em 25,2% dos casos, a Tuberculose na cidade de Araraquara é em
decorrência da transmissão recente;
- Em aproximadamente 74,8% dos casos estudados de tuberculose pulmonar na
cidade a tuberculose é devido à reativação;
- Em aproximadamente 74,8% dos casos, a tuberculose em Araraquara é devido
a representantes de um dos 3 grandes grupos (A, B ou C).
72
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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80
VIII- ANEXOS
ANEXO I
SERVIÇO ESPECIAL DE SAÚDE DE ARARAQUARA - SESA
FACULDADE DE SAÚDE PÚBLICA – USP
PROGRAMA DE TUBERCULOSE
CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA E
MICROBIOLÓGICA DOS PACIENTES
Data da entrevista: ____/____/_______
1. Identificação:
Nome:_________________________________________________________________________
____
Cadastro/Matrícula:_________________________________
Nascimento: ___/___/___ Idade Presumida(em anos):____ Naturalidade: _________ Estado:
____
Endereço:______________________________________________________________________
____
Bairro:____________________________
Referência:______________________________________
Município:_________________________________________
Endereço trabalho/escola:___________________________________________ Bairro:
_________
Cor ou Raça: Branca Preta Parda Amarela Indígena Sem declaração
Procedência: ________________________________________________________
Estado: _____
Zona: Urbana Rural Sem residência fixa Penitenciária Sem dados
81
Estado civil: Casado Solteiro Viúvo Separado/Divorciado/Desquitado União
consensual
2.Caracterização sócio-econômica:
Profissão: ____________________________________
Atividad____________________________
Situação Profissional atual: Vínculo empregatício Autônomo Aposentado
Desempregado
Rendimento mensal atual: R$________________ Sem renda há quanto tempo? ______(
meses)
Escolaridade: Analfabeto Até 4ª série do 1º grau 1º grau incompleto 1º grau
completo
2º grau incompleto 2º grau completo Universitário incompleto Universitário
completo
Moradia: Unifamiliar Multifamiliar Coletiva Rua
Outra:___________________
Nº pessoas que vivem na mesma casa: 1 2 3 4 5 ou mais
Nº refeições diárias: 1 2 3 ou mais nenhuma
Onde passa a maior parte do tempo? Domicílio Trabalho Rua Clube/associação
Bar ou similar Outro: _______________________________ Nº horas/dia:
_____________
3. Situação Epidemiológica:
Notificado em : ____/____/____ Semana epidemiológica: ___/____ Ficha epidemiológica
nº:____
Notificado por:
SESA UBS PS Hospital Laboratório Médico conveniado
Médico particular Controle de comunicante Busca ativa da Vigilância
Epidemiológica
Vacina BCG-ID ____/____/____ Cicatriz : + −
Tem ou teve contato com paciente de Tuberculose?
Não Sim, há ____ meses/anos Por _______ meses/anos Nome:
_______________________
Teve Tuberculose anteriormente?
Sim Quantas vezes?______ Não
Tipo de tuberculose:_____________________________ início da doença: ____/____/____
82
Local do tratamento:__________________________ tratamento de ____/____/____a
____/____/____
Alta: cura mudança de diagnóstico abandono transferência
Tipo de tuberculose: _____________________________ início da doença: ____/____/____
Local do tratamento:_________________________ tratamento de ____/____/____ a
____/____/____
Alta: cura mudança de diagnóstico abandono transferência
Tipo de tuberculose: _____________________________ início da doença: ____/____/____
Local do tratamento: _________________________ tratamento de ____/____/____ a
____/____/____
Alta: cura mudança de diagnóstico abandono transferência
4. Antecedentes Pessoais:
Tabagismo: Sim, há ________ anos Nº cigarros/dia:________ Não
Etilismo: Sim, há _____anos Não
Comportamento de risco para HIV/AIDS? Sim, qual ? __________________________
Não
Sorologia HIV: Negativa Positiva Indeterminada Não Realizada
Recusa
ELISA1 em: ____/____/____ ELISA2 em: ____/____/____
Diabetes Candidíase oral Blastomicose Outra micose profunda
(_______________) Hanseníase Doença mental Anemia Câncer de
pulmão Outra neoplasia (_________)
Cirurgia: Sim, de _____________________________________________ Não
Uso de droga imunossupressora: Sim, qual?____________________________________
Não
5. História da doença atual:
Sintomas: Início em ___/___/___ emagrecimento febre tosse anorexia
dispnéia
escarros hemoptóicos fraqueza sudorese noturna dor torácica outro
__________
Local de diagnóstico: ________________________________________ Data:
____/____/____
83
Exames: PPD ____/____/____ Resultado : _________mm Não realizado
Baciloscopia nº ________ Data: ____/____/____ escarro outro
material:_____________
Positivo IB= _____ Negativo Não
realizado
Cultura : nº __________ escarro outro material: _______________
Positiva Negativa, realizado , ____/____/____ Não realizada
Identificação: _______________________, realizado , ____/____/____ Não realizada
Antibiograma Preencher: S (sensível) R (resistente) realizado , ___/___/___ Não
realizado
Rifampicina Isoniazida Pirazinamida Streptomicina
Etambutol Etionamida Cicloserina Paranitrobenzoico Outro
________________
PCR :
______________________________________________________________________
Raio-X de tórax: Normal Suspeita Tb Compatível c/ outras afecções Sequela Não
realizado
Raio-X de outros locais: Sim, qual? _______________________ Não
Biópsia ganglionar Biópsia pulmonar Biópsia pleural
Outros:______________________________________
Avaliação antropométrica inicial: Peso: ______Kg Altura:_________ m IMC=
___
Forma clínica: Pulmonar Pleural Ganglionar Meníngea Outra:
_____________
Início do tratamento: ___/___/___ Esquema: ______ Fim do tratamento:
___/____/____
Medicamentos utilizados: Rifampicina Isoniazida Pirazinamida Etambutol
Etionamida
Streptomicina Amicacina Clofazimina Norfloxacino Outro
_______________
Baciloscopia de Controle : Data: ___/___/___ Negativa Positiva, IB= ____ Não
realizada
84
Cultura: Data ___/___/___ Negativa Positiva Não realizada Identificação:
___________
Data: ____/____/____ Negativa Positiva, IB= _________ Não realizada
Cultura: Data ___/___/___ Negativa Positiva Não realizada
Identificação:__________
Data: ____/____/____ Negativa Positiva, IB= _________ Não realizada
Cultura: Data ___/___/___ Negativa Positiva Não realizada Identificação:
__________
Tratamento 2: Início __/___/___ Motivo: ___ Esquema: ___ Fim do tratamento 2:
___/___/___
Na Alta medicamentosa :
Baciloscopia : Data: ___/___/___ Negativa Positiva, IB= ______ Não
realizada
Cultura: Data ___/____/____ Negativa Positiva Não realizada
Identificação__________
Raio-X de tórax: Normal Suspeita Tb
Compatível c/ outras afecções Sequela Não
realizado
Outros Exames :
____________________________________________________________________
ALTA : ____/____/____ TIPO : _________________ Peso = ____________
Kg
Revisão 1 : ____/____/____ _______________ Revisão 2 : ____/____/____
_______________
Exame físico de alta:
_______________________________________________________________
*************************
Internação: ____/____/____
Motivo:__________________________________________________________________
Local: _____________________________ Alta hospitalar: ____/____/____ Tipo:____
Internação: ____/____/____
Motivo:__________________________________________________________________
Local: _____________________________ Alta hospitalar: ____/____/____ Tipo:____
85
Retorno ao SESA: ____/____/____ Esquema proposto:
____________________________
Outras intercorrências: 1) ____________________________________ Data:
____/____/____
2) _____________________________________ Data:
____/____/____
ÓBITO Devido à tuberculose : sim não
Data : ____/____/____ Local : ________________________
Causas: ____________________________________________________
____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
86
ANEXO II
87
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(Obrigatório para Pesquisa Científica em Seres Humanos-Resolução n
0
196 de 10/10/96 - Conselho
Nacional de Saúde)
Dados sobre a pesquisa
Título do Projeto: Epidemiologia Molecular da Tuberculose em pacientes da região de Araraquara
Coordenadora do projeto: Clarice Queico Fujimura Leite telefone: (0XX16) 3301 6953
Médicos responsáveis: Dr. Eduardo F. Hage e Dr. Walter Manso Figueiredo telefone: (0XX16) 222
2277
Telefone de contato do Cômite de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas –
UNESP: (0XX16) 3301 6897
Nossa preocupação com o aumento da tuberculose no Brasil é a justificativa deste estudo. Seu
objetivo é conhecer melhor a transmissão da doença em pacientes da região de Araraquara. Os
resultados desta pesquisa possivelmente oferecerão subsídios ao aprimoramento dos programas de saúde
pública. Sua participação do estudo não é obrigatória e caso não deseje participar, seu
atendimento não será prejudicado. Os dados pedidos no questionário são aqueles necessários ao seu
atendimento ambulatorial e outros que farão parte do estudo já explicado. Os dados desta pesquisa serão
sigilosos, sendo seu nome mantido sob anonimato. Caso você tenha alguma dúvida converse com um
dos responsáveis.
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Eu ______________________________________________________, declaro que, após ter
sido convenientemente esclarecido pelo médico(a) ou agente de saúde, concordei em participar do
projeto de pesquisa acima e com os seguintes termos:
1. Eu compreendo que minha participação é inteiramente voluntária e não é, de forma alguma,
condição para que receba tratamento médico neste serviço de saúde. Se eu decidir não participar desta
pesquisa ou interrompê-la a qualquer momento não serei prejudicado.
2. Eu responderei a um questionário padronizado que investigará aspectos sobre meu perfil
sócio-econômico. O questionário identificará fatores de risco que possam estar associados à transmissão
da tuberculose, além de analisar o uso de drogas e/ou tóxicos, hábitos sexuais e transmissão sanguínea
prévia.
3. Após aconselhamento sobre o significado do teste sorológico para o vírus da Aids, eu
permitirei que o resultado seja utilizado nesta pesquisa.
4. Posso me recusar a fazer o teste sorológico para o vírus da Aids, sem que isto implique na
minha exclusão desta pesquisa.
Data ____/____/______
________________________
Assinatura do paciente
Endereço:
Identidade (N
0
do RG):
ANEXO III
88
IX – ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS
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