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Mariana Duarte de Cerqueira
Papel dos glicoesfingolipídeos (GSL) na secreção da
glucuronoxilomanana de Cryptococcus neoformans, e
influência deste polissacarídeo na regulação de GSL
em macrófagos.
Orientadores: Leonardo Nimrichter
Marcio Lourenço Rodrigues
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2009
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos nec
essários à
obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia)
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2
FICHA CATALOGRÁFICA
Cerqueira, Mariana Duarte
Papel dos glicoesfingolipídeos (GSL) na secreção da glucuronoxilomanana, de
Cryptococcus neoformans, e influência deste polissacarídeo na regulação de GSL em
macrófagos./Mariana Duarte de Cerqueira – Rio de Janeiro, 2009
Xiii, 70
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, 2008.
Orientadores: Leonardo Nimrichter e Marcio Lourenço Rodrigues
Referências bibliográficas: f 60
1. Cryptococcus neoformans 2. Glucuronoxilomanana 3. Glicoesfingolipídeo
4. Glucosilceramida 5.Vesículas
I. Nimrichter, Leonardo. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
Mestrado em Ciências Biológicas. III. Papel dos glicoesfingolipídeos (GSL) na
secreção de glucuronoxilomanana, polissacarídeo capsular majoritário de
Cryptococcus neoformans, e influência desse antígeno na regulação de GSL em
macrófagos.
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3
Mariana Duarte de Cerqueira
Papel dos glicoesfingolipídeos (GSL) na secreção da glucuronoxilomanana, de
Cryptococcus neoformans, e influência deste polissacarídeo na regulação de GSL
em macrófagos.
Rio de Janeiro, 9 de fevereiro de 2009
(Leonardo Nimrichter, Doutor, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes -
UFRJ)
(Marcio Lourenço Rodrigues, Doutor, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de
Góes - UFRJ)
(Eliana Barreto-Bergter, Doutora, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes
- UFRJ)
(Leila Maria Lopes Bezerra,Doutora, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes,
Departamento de Biologia Celular e Genética - UERJ)
(Rossiane Claudia Vommaro, Doutora, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho -
UFRJ)
(André Luis Souza dos Santos, Doutor Instituto de Microbiologia Professor Paulo de
Góes - UFRJ)
4
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Estudos Integrados em
Bioquímica Microbiana, Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade
Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação dos Profs Leonardo Nimrichter e Marcio
Lourenço Rodrigues.
5
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Professor Marcio Lourenço Rodrigues e Professor Leonardo
Nimrichter. Ao Marcio por ter me acolhido em seu grupo de pesquisa, pela paciência, apoio,
por ser um exemplo para mim de profissionalismo e dedicação e principalmente por sua
amizade durante todo esse tempo. Ao Léo, pessoa essencial na minha formação, pelo
entusiasmo, bom humor, por acreditar em mim e pela paciência.
A minha segunda família e companheiras do Laboratório de Estudos Integrados em
Bioquímica Microbiana, Camila, Carol 1, Carol 2, Deborah, Gabriele, Jéssica 1, Jéssica 2,
Juliana, Luna, Patrícia e Raquel. Em especial as amigas Débora, Fabiane e Fernanda, pelos
momentos de descontração pela ótima convivência e por transformarem cada dia de trabalho
em um dia de risadas e alegrias.
Ao Professor André Santos pela revisão e valiosas sugestões no texto desta
dissertação e a seu grupo de pesquisa, Bianca, Fernanda, Camila, Lys, Ana Carolina, Ana
Luiza, Carina, Roberta e Polly pela amizade e ótima convivência.
A Geralda pela preciosa ajuda fundamental para o bom andamento do trabalho.
Ao Professor Igor C. Almeida da Universidade do Texas, El Paso, EUA pela
doação de reagentes e material.
Ao Professor Arturo Casadevall, do Albert Einstein College of Medicine
(EUA), pela doação do anticorpo anti-cápsula.
A Deus pelas minhas conquistas, por ter me apontado este caminho e por ter
sempre me acompanhado nele.
Aos meus pais Fátima e Tenório por acreditarem em mim e me apoiarem em
todas as minhas escolhas, pelo amor, carinho e dedicação. Sem eles nada disso seria possível.
A minha irmã Cristiana por sua espontaneidade e alegria. Por me fazer sorrir em
momentos difíceis.
A minha tia Yolanda e a Sônia por terem sempre me acompanhado e incentivado.
6
As amigas de longa data do Colégio Marista São José (Ana, Balbi, Carol, Dani,
Fê, Flávia, Marcella, Mari, Patty, Renata) e as amigas da faculdade em especial as MAP
quinases (Amina, Ivana, Lívia, Michelle, Nathalie, Sabrina e Simone) pela imensa amizade.
Vocês moram no meu coração.
Ao Du, pelo carinho e apoio em todos os momentos.
A FAPERJ, CNPq, CAPES pelo suporte financeiro.
7
RESUMO
Mariana Duarte de Cerqueira
Papel dos glicoesfingolipídeos (GSL) na secreção da glucuronoxilomanana de
Cryptococcus neoformans, e influência deste polissacarídio na regulação de GSL
em macrófagos.
Orientadores: Leonardo Nimrichter e Marcio Lourenço Rodrigues
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
O fungo encapsulado Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da
criptococose. A internalização de C. neoformans por macrófagos envolve o
reconhecimento do polissacarídeo capsular do fungo por receptores em células do
hospedeiro. Os componentes da cápsula são constantemente secretados tanto “in
vitro” como “in vivo” através de transporte vesicular. É sabido que, “in vivo”, os
polissacarídeos capsulares secretados são endocitados por macrófagos, neutrófilos e
células epiteliais alveolares. Em nosso estudo buscamos estudar a influência de
glicoesfingolipídeos nos processos de secreção de glucuronoxilomanana (GXM),
polissacarídeo capsular majoritário, por C. neoformans e na endocitose dessa
macromolécula por macrófagos animais. Estudos recentes desenvolvidos em nosso
laboratório mostraram que ceramida monohexosídeos (CMH) estão presentes em
vesículas secretórias carreadoras de GXM. Utilizando um modelo de leveduras
mutantes com deficiência na síntese de CMH, observamos que a ausência do
glicolipídeo acarreta na redução de tamanho capsular, em comparação com a cepa
selvagem e a reconstituída. Os mutantes também apresentaram deficiência na
secreção de GXM para o meio extracelular. A análise do conteúdo de lipídeos nas
vesículas extracelulares nas três cepas revelou que a deficiência na síntese de CMH
gera conteúdos reduzidos de GXM nos mutantes, mas não altera o conteúdo lipídico
total.
8
Corroborando os dados acima, fungos selvagens tratados com um inibidor da
síntese de CMH, o D, L-treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol
(PDMP), apresentaram cápsula reduzida tanto em análise por citometria de fluxo,
usando anticorpos anti-GXM, quanto por microscopia eletrônica de transmissão.
Além disso, a microscopia eletrônica mostrou que o inibidor utilizado não causa
danos à célula fúngica e, portanto, não compromete a interpretação do resultado.
Esses resultados indicam que o CMH atua na incorporação de GXM em vesículas
secretórias e, conseqüentemente, afeta o crescimento da cápsula do fungo.
Em uma segunda fase de nosso estudo, objetivamos avaliar a capacidade da
GXM em modular a distribuição e expressão de gangliosídeos em macrófagos. A
exposição das células animais a GXM em tempos de 30min e 2h, não promoveu
nenhuma alteração na redistribuição de Galβ3GalNAcβ4(Neu5Aca3)Galβ4GlcCer
(GM1) e Neu5Acα3Galβ3GalNAcβ4 (Neu5Acα3)Galβ4GlcCer (GD1a) na superfície
celular. No entanto, o tratamento de macrófagos com o polissacarídeo pelo período de
dois dias resultou em aumento da síntese de GD1a e de GM1 por células hospedeiras.
Esses resultados sugerem que a GXM pode influenciar o processo de síntese e/ou
degradação dos gangliosídeos. A regulação de expressão de gangliosídeos pode estar
relacionada com efeitos imunomodulatórios da GXM sobre macrófagos, tópico sob
investigação em nosso laboratório.
Palavras-chave: Cryptococcus neoformans, Glucuronoxilomanana, Vesículas,
Glicoesfingolipídeos, Glucosilceramida.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2009
9
ABSTRACT
Mariana Duarte de Cerqueira
Role of glycosphingolipids (GSLs) in the secretion of glucuronoxylomannan of
Cryptococcus neoformans, and influence of this polysaccharide in the GSL
modulation in macrophages.
Orientadores: Leonardo Nimrichter e Marcio Lourenço Rodrigues
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
The encapsulated yeast Cryptococcus neoformans is the etiologic agent of
cryptococcosis. Internalization of this pathogen by macrophages involves recognition
of fungal capsular polysaccharides by host cell receptors. In addition, capsular
components are continually secreted in vitro and in vivo through a vesicular transport
mechanism. Our first goal was to determine the influence of the neutral
glycosphingolipid, glucosylceramide (CMH), during secretion of
glucuronoxylomannan (GXM), the major capsular component of C. neoformans. It is
well known that secreted GXM is ingested by host cells, such as macrophages,
neutrophils and alveolar epithelial cells. In these cells, GXM modulated cytokine
production and physiological functions. Our second goal was the study of correlation
between GXM adhesion/internalization with GSL distribution and expression by
macrophages.
Recent studies conducted in our laboratory showed that secretory vesicules
carrying GXM are CMH-enriched. Using a mutant strain with deffective CMH
synthesis we observed a significant reduction in capsule size. Furthermore, the
secretion of GXM by the mutant strain is significantly reduced when compared with
the wild type, suggesting that the decrease on capsular size is related to GXM
secretion. Lipid analysis confirmed the presence of secreted vesicles by the mutant
strain with no significant difference on sterol contents in comparison to wild type.
Accordingly, using anti-GXM we demonstrated capsule reduction by flow cytometry,
and electron microscopy after fungal treatment with drugs that inhibit the enzyme
10
glucosylceramide transferase. Furthermore, electron microscopy showed that at the
concentrations used in our studies the inhibitor does not damage the fungal cell and
therefore does not compromise data interpretation. These results indicate that the
CMH somehow participates on addressing of GXM into secretory vesicles, and
consequently affects the capsular growth of C. neoformans.
In a second step of our study, we tried to evaluate the capacity of GXM to
modulate the distribution and expression of gangliosides in macrophages. The
exposure of cells to GXM in short periods of time did not promote any change in
gangliosides distribution. GM1 Galβ3GalNAcβ4(Neu5Acα3)Galβ4GlcCer and GD1a
Neu5Acα3Galβ3GalNAcβ4(Neu5Acα3)Galβ4GlcCer presented similar location on
the macrophage cell surface. Interestingly, treatment of macrophages with the
polysaccharide for a long time resulted in a significant increase of GD1 and GM1
expression by host cells. These results suggested that GXM influences the process of
synthesis and / or degradation of gangliosides by host cells. The regulation of
expression of gangliosides may be related to the GXM immunomodulatory effects on
macrophages, a topic under investigation in our laboratory.
Palavras-chave: Cryptococcus neoformans, Glucuronoxylomannan, Vesicles,
glycosphingolipids, Glucosylceramide.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2009
11
ÍNDICE
Introdução 1-27
1) Cryptococcus neoformans 2-9
2) Glicoesfingolipídeos 9-17
2.1) Biossíntese e função de GSL 10
2.2) GSL e “lipid rafts” 12
2.3) Aspectos funcionais de glucosilceramidas fúngicas 14
3) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células
fúngicas
17-20
4) Infecção por C. neoformans: interação com células hospedeiras e
disseminação
20-25
4.1) Interação de C. neoformans com macrófagos 20
4.2) Interação de C. neoformans com células epiteliais e endoteliais 23
4.3) Interação de C. neoformans com células do sistema nervoso
central
23
4.4) Interação de C. neoformans com amebas 25
5) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos endocíticos 26-27
Justificativa e objetivos 28-29
Materiais e métodos 30-37
Resultados 38-50
Discussão 51-57
Considerações finais 57-58
Conclusões 59
Referências bibliográficas 60-70
12
LISTA DE ABREVIATURAS:
APC – Célula apresentadora de antígenos
App1 – Proteína antifagocítica
BSA – Soro albumina bovina
CMH – Ceramida monohexosídeo
CTAB – Brometo de Hexadecil-trimetil amônio
DAB – Diaminobenzidina
DMEM – Dubelco’s modified Eagle medium
ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Ensaio imunoenzimático)
ERK-2 – Extracellular signal-regulated kinase 2 (Quinase 2 extracelular regulada por
sinal)
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
Gab-2 – Associated binding protein 2 (Proteína 2 associada a ligação)
GalCer – Galactosilceramida
GalXM – Galactoxilomanana
GCS – Glucosilceramida sintase
GD1a - Neu5Acα3Galβ3GalNAcβ4 (Neu5Acα3)Galβ4GlcCer
GIPC – Glicosilinositolfosfoceramida
GlcA – Ácido glucurônico
GlcCer – Glucosilceramida
GPI – Glicosilfosfatidilinositol
GPL – Glicopeptídeolipídeo
GSL – Glicoesfingolipídeo
GM1 - Galβ3GalNAcβ4(Neu5Acα3)Galβ4GlcCer
GXM – Glucuronoxilomanana
HSP – Proteína de choque térmico
HPTLC – Cromatografia em camada fina de alta resolução
ICAM-1 – Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 (Molécula de adesão inter-celular-1)
IL - Interleucina
LAL – Limulus amebocyte lysate assay (ensaio do lisado de Limulus amebocyte)
LacCer – Lactosilceramida
LFA-1 – Lymphocyte function-associated antigen 1 (Antígeno associado a função de
linfócitos-1)
13
LPS - Lipopolissacarídeo
mAbs – Anticorpos monoclonais
MAP kinase – Mitogen-activated protein kinase (Proteína quinase ativada por
mitógeno)
MHC – Major histocompatibility complex (Complexo maior de histocompatibilidade)
MyD88 – Myeloid differentiation primary response gene 88 (Gen 88 de resposta
primária a diferenciação mielóide)
NO – Óxido nítrico
PBS – Tampão fosfato salina
PDMP - D, L-treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol
PIBM – Poliisobutilmetacrilato
ROS – Espécies reativas de oxigênio
RsAFP2 – Raphanus sativus antifungal peptide 2 (Peptídeo antifúngico 2 de
Raphanus sativus)
SNC – Sistema nervoso central
TEM – Microscopia eletrônica de transmissão
TLR – Receptor do tipo “toll”
TNF – Fator de necrose tumoral
14
Introdução:
O estudo das infecções fúngicas tornou-se mais importante nas últimas
décadas, devido ao aumento no número de pacientes imunocomprometidos e,
portanto, mais susceptíveis a esse tipo de infecção. Esse aumento se deve tanto a
doenças que comprometem as defesas do organismo, onde se inclui a síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS) quanto a tratamentos com drogas
imunossupressoras, tais como aquelas usadas em pacientes com câncer ou
transplantados (Dromer & Dupont, 1996). Embora ainda não tão numerosas quanto as
infecções bacterianas, as micoses vêm despertando atenção crescente na comunidade
científica, principalmente, devido à grande ineficiência no tratamento das infecções
sistêmicas, a forma mais grave das infecções fúngicas.
A maior dificuldade no tratamento das micoses reside no fato de que as células
fúngicas são bastante similares às células de mamíferos. A maioria das drogas
disponíveis hoje em dia têm como alvo o ergosterol e as enzimas de sua via
biossintética (Carrillo-Muñoz et al., 2006). O ergosterol é um lipídeo encontrado na
membrana plasmática dos fungos, mas não é sintetizado por células de mamíferos,
sendo considerado assim um alvo seletivo para agentes antifúngicos. No entanto,
apesar de eficazes, os antifúngicos cujos mecanismos de ação baseiam-se na presença
do ergosterol podem provocar efeitos colaterais severos que muitas vezes são
responsáveis pela interrupção do tratamento. Além disso, um aumento de cepas
resistentes a drogas convencionais vem sendo recentemente observado (Mitrovic et
al., 2007). Esta situação reforça a importância da pesquisa de novos alvos para a ação
antifúngica e, obviamente, a descrição e maior estudo de fatores fúngicos associados
com a sua virulência, o que também poderá contribuir com o aprimoramento das
condutas clínicas. Nesse contexto, a parede celular dos fungos apresenta diferentes
componentes estruturais que não são encontrados em células hospedeiras e que
participam direta ou indiretamente do processo infeccioso. Entre estas moléculas
podemos destacar: melanina, histonas, proteínas de choque térmico, glucanas,
adesinas e glicoesfingolipídeos. Muitos desses componentes são considerados fatores
de virulência e potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas
(Nimrichter et al., 2005). Diante disso, tanto a composição da parede como o
endereçamento de moléculas para essa região são pontos relevantes na área em
questão.
15
Embora a maioria dos fungos causadores de micoses sistêmicas seja
encontrada no solo, alguns deles são também capazes de se multiplicar dentro de
células hospedeiras. De fato, acredita-se que essa propriedade é adquirida ainda no
ambiente, onde os fungos interagem com outros microrganismos (Steenbergen,
Shuman & Casadevall, 2001). Para compreender os mecanismos de patogenicidade
dos microrganismos intracelulares é essencial que se conheça a forma pela qual eles
interagem e são internalizados por células do hospedeiro. Devido à complexidade e a
presença de múltiplas etapas na interação entre patógeno e hospedeiro esta é uma área
pouco conhecida, principalmente quando se estuda patógenos intracelulares
facultativos. Alguns desses microrganismos são capazes de sobreviver e, muitas
vezes, se replicar tanto intra como extracelularmente, tornando esse estudo ainda mais
complexo. Neste caso, a fagocitose pode ser considerada tanto como um benefício
quanto um obstáculo para patogênese microbiana.
Dentre os patógenos intracelulares facultativos podemos incluir o fungo C.
neoformans, alvo dos nossos estudos. Conforme será discutido posteriormente, esse
fungo é capaz de utilizar estratégias distintas durante a infecção de diferentes células
hospedeiras. Para tal, C. neoformans é capaz de desenvolver fatores de virulência,
onde se destaca sua cápsula polissacarídica, que regulam a patogênese, invasão e
disseminação e que podem ser baseados na sua capacidade de atingir compartimentos
intra e extracelulares (Feldmesser et al., 2000). A identificação de fatores do patógeno
ou do hospedeiro que contribuam para um modelo de replicação (intracelular) em
detrimento do outro (extracelular) pode ser explorado para o desenvolvimento de
novas estratégias de prevenção e tratamento não somente para a criptococcose mais
também de outras infecções fúngicas.
1) Cryptococcus neoformans
C. neoformans, agente etiológico da criptococose, é um patógeno fúngico de
caráter oportunista. Este microrganismo pode causar desde uma infecção autolimitada
e assintomática em pacientes imunocompetentes até uma infecção pulmonar grave em
imunossuprimidos. Uma evolução da infecção pode ser observada em pacientes com
imunossupressão severa, onde o fungo se dissemina pela circulação linfática e/ou
sangüínea podendo alcançar o cérebro. No sistema nervoso central ele pode causar um
16
quadro de meningoencefalite, uma manifestação muitas vezes letal (Perfect et al.,
1998).
Apesar de ser capaz de colonizar e causar doença em humanos, C. neoformans
é normalmente encontrado no solo, na excreta de pombos e em ocos de árvore.
Morfologicamente, este fungo é descrito como uma levedura encapsulada e esférica
(Figura 1), que entra no hospedeiro humano pelo trato respiratório. Apesar de ser um
fungo patogênico ele não necessita do hospedeiro mamífero para completar seu ciclo
de vida (Ellis & Pfeiffer, 1990). A infecção se dá através da inalação de basidiosporos
ou leveduras dessecadas e pouco encapsuladas presentes no ambiente. Garcia-
Hermoso e colaboradores (1999) demonstraram que indivíduos podem portar
leveduras dormentes ao longo de 13 anos antes da infecção ser ativada. Esse estudo
levantou questões adicionais, ainda sem respostas completas, tais como: onde o
microrganismo reside em seu estado de dormência, como ele é capaz de sobreviver e
o que o leva à reativação (Del Poeta, 2004). O que se pode afirmar, até então, é que os
principais fatores que determinam que direção que a infecção vai tomar são a
eficiência da expressão dos fatores de virulência do fungo, a imunidade do hospedeiro
e a quantidade de partículas infecciosas presentes (Rodrigues, Alviano & Travassos,
1999).
Figura 1. Microscopia óptica de C. neoformans corado com tinta nanquim.
C. neoformans apresenta diferentes fatores de virulência que o tornam capaz
de escapar das defesas do hospedeiro e, conseqüentemente, causar doença. Dentre eles
destacam-se a cápsula polissacarídica, a melanina, a fosfolipase B1 e a produção de
17
manitol. (Casadesavall, Steenbergen & Nosanchuck, 2003). De fato, a associação
desses fatores é essencial para determinar a capacidade patogênica de uma
determinada cepa. Considerando todos esses fatores, pode-se afirmar que o mais
importante deles é a cápsula polissacarídica. Mutantes acapsulados deste fungo não
são capazes de estabelecer infecção em camundongos (Bulmer et al., 1968). A
necessidade da expressão da cápsula na patogenicidade foi comprovada, uma vez que
a re-introdução dos genes envolvidos na sua expressão resultou na restituição da
virulência fúngica (Fromtling et al., 1982; Kwon-Chung & Rhodes, 1986).
Sabe-se relativamente pouco sobre a estrutura da cápsula de C. neoformans. Esta
possui ao menos três componentes, glucuronoxilomanana (GXM), galactoxilomanana
(GalXM) e manoproteínas, sendo que a maior parte da massa capsular vem da GXM
(~90%), e a este componente capsular, conseqüentemente, vem se dando maior
atenção em estudos imunológicos (Bose et al, 2003) (Figura 2). Grande parte das
informações sobre a cápsula foi adquirida estudando-se o polissacarídeo liberado no
meio de cultura durante o crescimento in vitro assumindo que este teria as mesmas
características estruturais daquele polissacarídeo que compõe a cápsula. Porém, a
comparação entre o exopolissacarídeo purificado do sobrenadante de cultivo por duas
técnicas diferentes e o polissacarídeo capsular removido das células com radiação
gama ou dimetilsulfóxido revelou diferenças significativas na composição, massa,
tamanho, carga, viscosidade e reatividade com anticorpos monoclonais (Frases et al.,
2008). Neste mesmo estudo, foi observado que o exopolissacarídeo purificado por
precipitação com brometo de hexadecil-trimetil amônio
(CTAB), método mais usado e difundido, apresentou maior massa e uma
conformação diferente daquele obtido por concentração e filtração. Isso sugere que
dependendo do processo de purificação podem ocorrer alterações significativas na
estrutura da GXM.
A expressão de cápsula por C. neoformans pode variar dependendo da cepa e
das condições de crescimento (Bose et al, 2003). Em cultura, o tamanho da cápsula é
normalmente pequeno, embora possa ser estimulado por diversos fatores que incluem
altas concentrações de CO
2
e baixas concentrações de ferro (Zaragoza & Casadevall,
2004). A expressão do polissacarídeo capsular varia também de acordo com o órgão
colonizado, havendo uma expressão máxima de cápsula no espaço alveolar e uma
diminuição na sua produção no cérebro (Rivera et al.,1998).
18
Figura 2. Estrutura dos polissacarídeos componentes da cápsula de C. neoformans. (A) GXM (sorotipo
B). (B) GalXM.
Entender o mecanismo de crescimento capsular em C. neoformans é
importante uma vez que o aumento no tamanho da cápsula ocorre durante a infecção e
este fenômeno é também associado à virulência. Neste contexto, um recente estudo
mostrou que a cápsula de C. neoformans é secretada e, então, re-incorporada pelo
fungo, crescendo de forma distal. Os autores mostraram que os polissacarídeos recém
sintetizados atravessam a parede celular e o material capsular mais antigo, atingindo a
parte externa da cápsula onde é associado (Zaragoza et al., 2006). Além disso, para
investigar a relação entre diâmetro capsular e tamanho molecular, Frases e
colaboradores (2009) analisaram as dimensões das fibras de GXM em solução usando
uma técnica denominada dispersão dinâmica da luz (“dynamic light scattering”) que
se baseia no desvio da trajetória ou espalhamento da luz causada por partículas de
acordo com seu tamanho e movimento Browniano (Frases et al., 2008). Os resultados
revelam a distribuição do tamanho das partículas em função de intensidade, volume e
número. Esses autores observaram que o comprimento molecular definia o diâmentro
capsular analisado por microscopia.
As informações sobre o mecanismo de crescimento da cápsula geraram novas
e importantes perguntas. A adição de “novos” polissacarídeos na extremidade da
cápsula implicava na necessidade desses polissacarídeos em passar por diversas
19
barreiras da célula fúngica, tais como a própria camada capsular já presente na
superfície e a parede celular.
Em fungos, a parede celular desempenha papéis relevantes em processos
biológicos. Ela é responsável pela forma celular, confere proteção osmótica e física,
além de estar envolvida com a morfogênese, a reprodução e a interação com outras
células e com o meio ambiente (Nimrichter et al., 2005). Formada principalmente, por
polissacarídeos como as quitinas e as glucanas, que se associam covalentemente entre
si e com proteínas presentes na parede, outros componentes dessa malha envoltória
vêm sendo revelados nos últimos anos. (Nimrichter et al., 2005). Na verdade, a parede
celular fúngica pode variar consideravelmente, dependendo da espécie analisada, mas
o seu dinamismo é um tema que requer maior atenção.
Como discutido acima, a necessidade da chegada de polissacarídeo capsular
recém sintetizado no meio extracelular, atravessando barreiras complexas, exige uma
forma eficiente de transporte molecular que não havia sido descrito para células
fúngicas. Neste contexto, Yoneda e Doering (2006) demonstraram que a mutação de
uma GTPase (sec4p) em C. neoformans resultava no acúmulo de vesículas pós-Golgi,
que reagiam intensamente com anticorpos anti-GXM. Adicionando essa informação
às observações do nosso grupo onde glicolipídeos enriquecidos na parede celular se
mostravam envolvidos na formação de vesículas que brotavam a partir da membrana
plasmática, uma hipótese foi formulada e posteriormente confirmada. Componentes
de superfície de C. neoformans, incluindo a cápsula, seriam sintetizados no
citoplasma e exportados para o exterior da célula por vesículas secretoras que
atravessariam a parede celular. Neste estudo, uma correlação entre crescimento
capsular e detecção de vesículas associadas à GXM foi observada, sugerindo que C.
neoformans pode liberar o polissacarídeo da vesícula no meio extracelular e este seria
incorporado na superfície celular (Rodrigues et al., 2007).
A associação direta da cápsula com a superfície de C. neoformans parece
envolver um componente específico da parede celular, a α-1,3 glucana (Reese &
Doering, 2003). Mutantes que não expressam α-1,3 glucana na parede celular também
não são capazes de ancorar a cápsula, embora ainda sejam capazes de secretá-la. Além
disso, um estudo recente mostrou uma associação entre estruturas derivadas de quitina
com a GXM e com o brotamento de C. neoformans, o que pode representar um novo
mecanismo pelo qual o polissacarídeo capsular interage com a parede celular e é
20
rearranjado durante a replicação (Rodrigues et al., 2008). Já a associação dos
polissacarídeos “novos” às primeiras fibras poderia ocorrer também através de
ligações cruzadas do polissacarídeo com metais divalentes do meio, que levariam a
GXM a se agregar na superfície de C. neoformans e esse processo contribuiria para o
crescimento da cápsula (Nimrichter et al., 2007) (Figura 3).
Figura 3. Modelo proposto para agregação de GXM na superfície celular fúngica. (A) Polímeros de
GXM são primeiramente ligados covalentemente à parede celular. Cadeias de GXM extracelulares
(GXM livre) são então depositadas por uma ligação cruzada mediada por metal. Cada átomo de Ca
+2
promove a associação entre dois resíduos de ácido glucurônico (GlcA). (B) Ligação de íons divalentes
a resíduos de GlcA numa proporção 1:2 a qual suporta o crescimento capsular. (C) Concentração
excessiva de cátions divalentes a qual neutraliza as cargas negativas do GlcA e reduz a formação das
pontes, impedindo o crescimento capsular (adaptado de Nimrichter et al., 2007).
Como observado acima, a cápsula de C. neoformans é uma estrutura
complexa. Ao mesmo tempo, ela também possui funções importantes na capacidade
do fungo de escapar das defesas do hospedeiro. Neste contexto, além de funcionar
como uma barreira física contra diferentes condições adversas ao C. neoformans, a
cápsula também possui carga negativa, reduzindo a capacidade fagocítica de células
hospedeiras (Nosanchuk & Casadevall, 1997). Seus componentes isoladamente
21
também parecem modular a resposta do hospedeiro durante a infecção. Nesse
contexto, a GXM se destaca mais uma vez como importante molécula moduladora do
sistema imune, estando, ainda, associada à redução do influxo de leucócitos em sítios
inflamatórios conforme descrito por Dong & Murphy (1995, 1996). De acordo com
esses autores a GXM é capaz de inibir o recrutamento de células inflamatórias
promovendo o “shedding” de L-selectina. Também já foi descrito que os
polissacarídeos da cápsula são capazes de se associar a cadeia β da β2-integrina, o
CD18. A ligação da GXM ou da GalXM nessa cadeia pode evitar que o LFA-1 dos
neutrófilos se associem a ICAM-1 expresso nas células endoteliais (Dong & Murphy,
1997). Ainda com relação à diminuição do recrutamento leucocitário, a GXM pode
bloquear a interação entre neutrófilos e endotélio pela interação com selectinas e seus
receptores de superfície no neutrófilo (Ellerbroek et al., 2004).
Mais recentemente, foi definido um novo mecanismo pelo qual a GXM pode
expandir a virulência fúngica inibindo diretamente a proliferação de célula T. Neste
estudo foi mostrado que a GXM é capaz de ser internalizada, processada e
apresentada por células dendríticas à célula T, porém a proliferação da última é
diretamente inibida pelo polissacarídeo. Análises de viabilidade de célula T revelaram
que a redução na proliferação na presença de GXM não é resultado do aumento na
morte celular (Yauch, Lam & Levitz. 2006). Outros estudos mostram que isolados de
C. neoformans altamente encapsulados e opsonizados com proteínas do sistema
complemento não estimulam monócitos e macrófagos a produzirem citocinas como
TNF, IL-1ß e IL-6 de forma tão eficiente quanto os fungos não encapsulados ou com
pouca produção de cápsula (Levitz et al., 1994, Delfino et al., 1997). Aparentemente,
a cápsula polissacarídica bloqueia o acesso das células de defesa a componentes da
parede celular do fungo que seriam necessários para a estimulação das citocinas.
As informações discutidas acima confirmam que a GXM é o principal fator de
virulência de C. neoformans. Muitos dos efeitos causados pela GXM estão
relacionados com o bloqueio de moléculas na superfície da célula hospedeira,
enquanto outros parecem envolver modificações na fisiologia celular. No entanto, o
mecanismo pelo qual essas modulações têm início ainda é desconhecido.
22
2) Glicoesfingolipídeos
Inicialmente identificados pelo alemão Johann L. W. Thudichum em 1884
como estruturas presentes no cérebro bovino, os glicoesfingolipídeos (GSL) são hoje
conhecidos como moléculas normalmente distribuídas na membrana citoplasmática de
células eucarióticas (Hakomori, 1993; Merrill et al., 1997). A complexidade estrutural
dos GSL e o limitado conhecimento sobre suas funções e metabolismo fizeram com
que esses compostos anfipáticos fossem denominados glicoesfingolipídeos, referindo-
se ao enigmático mistério da esfinge (Merrill et al., 1997). Dentre os vários
glicolipídeos produzidos, os GSL são os mais abundantes em células eucarióticas.
Eles consistem em ceramida (N-acilesfingosina) ligada a uma ou mais unidades
sacarídicas (Sandhoff & Kolter, 2003). A ceramida, por sua vez, é formada pela
associação de uma base de cadeia longa com um ácido graxo através de uma ligação
amida (Figura 4).
A natureza hidrofóbica dessa cauda lipídica é responsável pela inserção dessas
moléculas no folheto externo da membrana plasmática, juntamente com fosfolipídeos,
colesterol e glicerolipídeos. Essa conformação permitiu a primeira sugestão de
funções para essas estruturas na formação e organização estrutural da membrana
plasmática (Hakomori, 1993). A orientação dos GSL permite que a porção sacarídica
dessas moléculas esteja voltada para o meio extracelular, o que sugere o envolvimento
com processos de interação célula-célula e célula-meio extracelular (Hakomori,
1993).
Figura 4. Exemplo de estrutura de um glicoesfingolipídeos (ceramida monohexosil).
Dependendo do repertório enzimático de cada tipo celular, os GSLs podem
variar no comprimento e na composição da cadeia sacarídica e também na parte
lipídica. Como conseqüência, uma enorme variedade de GSL pode ser formada
23
(Kolter et al., 2002). Além disso, a razão molar entre os GSL e os demais lipídeos
presentes na membrana pode ser extremamente variada. Pode-se observar até mesmo
uma mudança no padrão de GSL de acordo com o crescimento e diferenciação
celular, transformação viral e oncogênese (Hakomori, 1981). De fato, um estudo
mostrou que até mesmo o tratamento de células apresentadoras de antígenos (APC)
com componentes microbianos clássicos como o lipopolissacarídeo (LPS) pode
influenciar a expressão de GSL nessas células. Nesse trabalho foi observado um
aumento na síntese de GSL, incluindo GM1 (De Libero, et al., 2005).
Todas essas diferenças nos levam a crer que os GSL podem estar envolvidos
em vários processos biológicos, ao invés de apenas representarem componentes
estruturais relacionados com à arquitetura das membranas biológicas. De fato, muitas
funções associadas a GSL vêm sendo descritas e serão discutidas mais adiante.
2.1) Biossíntese e função de GSL
A porção ceramida dos GSL pode ser sintetizada “de novo” no retículo
endoplasmático ou pode ser gerada pela degradação ou “turnover” de
(glico)esfingolipídeos complexos (Merrill et al., 1997, Obeid, Okamoto & Mao,
2002). A grande variedade natural que ocorre entre os glicoesfingolipídeos pode ser
atribuída à combinação de atividades de glicosiltransferases encontradas em
diferentes espécies e tipos celulares. As glicosiltransferases são enzimas que atuam na
etapa de transferência de sacarídeos para a ceramida ou para o GSL em extensão.
Dentre estas, a ceramida glucosiltransferase e a ceramida galactosiltransferase atuam
na última etapa da formação do GSL mais simples. Estas enzimas podem transferir
para a ceramida dois açúcares diferentes, a glucose formando a glucosilceramida
(GlcCer) ou a galactose formando a galactosilceramida (GalCer). O uso de inibidores
específicos para a glucosiltransferase, como por exemplo, o PDMP (1-fenil-2-
decanoilamino-3-morfolino-1-propanol) pode bloquear a formação de GlcCer, e serve
como uma potente ferramenta no estudo da importância fisiológica dos GSLs para a
biologia celular (Inokuch et al., 1989).
Para a formação de outros GSL mais complexos a atuação de outras
glicosiltransferases é requerida. A formação de lactosilceramida (LacCer) e também
as reações que levam à formação de lipídeos altamente polares como os gangliosídeos
ocorrem no Golgi. Outras séries de GSL encontrados em tecidos humanos são, globo,
isoglobo e muco séries, esses lipídeos são classificados assim de acordo com a porção
24
sacarídica e a orientação planar desses açúcares. A Figura 5 mostra a síntese de GSLs
resumidamente.
Figura 5. Biossíntese de glicoesfingolipídeos em células eucarióticas.
2.2) GSL e “Lipid Rafts”
Desde 1972, acreditava-se que a membrana era formada por fosfolipídeos e
proteínas que se encontravam distribuídos de acordo com o modelo de mosaico fluido
de Singer e Nicholson (Singer & Nicholson, 1972). Entretanto, recentemente, um
novo conceito relacionado à organização dos GSL na membrana foi proposto, tendo
como base as propriedades físicas da porção lipídica desses compostos (Rietveld &
Simons, 1998). Evidências cumulativas sugerem que a membrana plasmática não é
formada simplesmente por uma bicamada lipídica uniforme, apresentando
25
microdomínios com elevado teor de esfingolipídeos, esteróis e proteínas. Essas
regiões de composição, espessura e elétrondensidade distintas foram inicialmente
denominadas de “lipid rafts” ou plataformas lipídicas (Brown, 1992).
Esses domínios têm como característica comum, observada em todas as
células estudadas, a resistência ao tratamento por detergentes não iônicos e o
enriquecimento em proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI), além de
estarem acoplados a moléculas sinalizadoras (Hakomori, 2000). A camada externa
desses microdomínios é composta, principalmente, por esfingolipídeos enriquecidos
em cadeias acil saturadas, que se apresentam compactadas, e colesterol, que ao
interagir com esses esfingolipídeos forma uma matriz organizada relativamente fluida,
porém distinta da porção mais fluida da membrana (Dykstra et al., 2003). A camada
interna, que juntamente com proteínas é responsável pela associação da membrana
plasmática com o citoplasma, é enriquecida em fosfolipídeos. Embora questionados
durante muito tempo, a presença desses domínios vêm sendo confirmada nos últimos
anos por técnicas refinadas e a literatura atual reconhece a presença e importância
dessas regiões na superfície celular. Atualmente, essas regiões são denominadas
simplesmente de “domínios de membrana” (Pike et al. 2006).
A presença de (glico)esfingolipídeos nesses domínios vem associando esses
gliconjugados a outras funções, como por exemplo na participação do direcionamento
de moléculas em vesículas, ainda no retículo endoplasmático (no caso dos
esfingolipídeos), onde esses domínios começam a ser formados (Ikonen, 2001). Além
disso, mecanismos de endocitose que envolvem os domínios lipídicos já foram
demonstrados (Kenworthy, 2002, Watarai et al., 2002). Nesse sentido, a participação
dos GSL na adesão e endocitose de microrganismos e moléculas derivadas de
microrganismos por células hospedeiras vem sendo crescentemente estudada. As
investigações nessa área tiveram seu início com base na capacidade de toxinas
bacterianas de reconhecer estruturas associadas a “lipid rafts”, como, por exemplo, a
toxina da bactéria Vibrio cholerae. Essa toxina se liga ao gangliosídeo GM1,
considerado um marcador de “lipid raft” (Holmgren et al., 1975). Vale ressaltar aqui
uma das propriedades fundamentais desses domínios, a capacidade de gerar um
fenômeno de multivalência pela associação de seus receptores. A grande maioria das
funções dos GSL foi obtida a partir de estudos que utilizam células animais como
26
modelo experimental. No entanto, muito pouco se conhece com relação à função dos
GSLs em células fúngicas.
Conforme descrito anteriormente os GSLs isolados de células fúngicas
apresentam diferenças estruturais significativas quando comparados com GSLs de
células hospedeiras. Essas diferenças podem ser também responsáveis por uma
organização distinta nas estruturas dos domínios de membrana nessas células. A
fitoesfingosina, por exemplo, possui uma hidroxilação no carbono 4. Isso faz com que
o GSL que a contém seja capaz de formar pontes de hidrogênio com outros lipídeos
estabilizando domínios de membrana (Idkowiak-Baldys et al., 2004). Nesse mesmo
estudo foi demonstrado que a preparação de domínios de membrana obtidos de
leveduras deficientes na hidroxilação do carbono 4 contém apenas fragmentos lineares
de membrana, não sendo capazes de formar estruturas vesiculares observadas na cepa
selvagem. Da mesma forma, a presença de ácidos graxos hidroxilados em
glucosilceramidas fúngicas pode influenciar na formação desses domínios. Além
disso, a dupla ligação no anel B (entre os carbonos 7 e 8) no ergosterol torna essa
estrutura mais eficiente que o colesterol, principal esterol de células animais, na
organização dos domínios de membrana (Xu et al., 2006). Dessa forma, os domínios
lipídicos formados em células fúngicas podem estar envolvidos na formação de
vesículas mais estáveis e resistentes e, possivelmente, capazes de atravessar regiões
mais polares, como, por exemplo, a parede celular.
2.3) Aspectos funcionais de glucosilceramidas fúngicas
Em células fúngicas, a GlcCer, ou CMH, é o GSL neutro mais abundante e,
durante décadas, foi considerado como um componente meramente estrutural da
membrana. Entretanto, recentemente, esta molécula vem sendo implicada como vital
em diversos processos como secreção, montagem da parede celular, reconhecimento
pelo sistema imune e regulação da virulência. De fato, todos os fungos patogênicos
estudados até o momento, exceto Candida glabrata (Saito et al., 2006), são capazes
de sintetizar CMH (Nimrichter et al., 2005). A elucidação estrutural dos CMHs
isolados desses organismos revelou a ocorrência de moléculas extremamente
conservadas. No entanto, quando comparamos estruturalmente os CMHs de células
animais e de células fúngicas, diferenças significativas na porção ceramida são
observadas. Em fungos, a base esfingóide da ceramida apresenta uma metilação no
carbono 9 e uma insaturação extra no carbono 8 formando, então, a 9-metil1-4,8-
27
esfingodianina (Barreto-Bergter et al., 2004; Nimrichter et al., 2005). Por ser essa
molécula altamente conservada em fungos patogênicos e estruturalmente diversa dos
CMHs de mamíferos, os CMHs de fungos são atualmente estudados como um
possível e promissor alvo para agentes antifúngicos. A adição de uma galactose a esse
GSL também já foi observada em células fúngicas, formando a lactosilceramida,
porém a ceramida apresenta a fitoesfingosina como base de cadeia longa majoritária
nesses GSLs (Maciel et al., 2002). Seguindo uma outra via biossintética, uma outra
classe de GSL pode ser formada nos fungos pela associação de mono e
oligossacarídeos à ceramida via uma unidade de mio-inositol, formando os GSL
denominados glicosilinositolfosforilceramidas (GIPC) (Heise et al., 2002).
Além das características dos CMHs, expostas acima, algumas outras reforçam
a importância desse GSL como um promissor alvo para o desenvolvimento de novas
drogas. Dentre estas, a imunogenicidade dessa molécula demonstrada através da
presença de anticorpos anti-CMH no soro de indivíduos com criptococose merece
destaque (Rodrigues et al., 2000). Anticorpos anti-CMH purificados do soro de
pacientes com criptococose reagiram de forma cruzada com CMH isolados de outras
espécies fúngicas, e ainda inibiram, “in vitro”, a germinação de C. neoformans, o que
sugere o envolvimento dessas estruturas no processo replicativo do fungo. De fato, a
administração passiva de anticorpos anti-CMH a animais letalmente infectados com
C. neoformans resultou em aumento de sobrevida (Rodrigues et al., 2007).
A diferenciação fúngica também foi afetada pela presença de anticorpos anti-
CMH. Foi demonstrado que este processo era bloqueado em Pseudallescheria boydii
e Candida albicans quando estes eram incubados com o anticorpo anti-CMH (Pinto et
al., 2002). Posteriormente, Da Silva e colaboradores (2004) demonstraram que
anticorpos monoclonais (mAb) anti-CMH também eram capazes de inibir o processo
de diferenciação do fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides. O envolvimento do
CMH com o dimorfismo já foi sugerido em duas outras espécies fúngicas
patogênicas, Sporothrix schenckii e Histoplasma capsulatum (Toledo et al., 2000;
2001).
Em estudos posteriores, esses mesmos anticorpos se mostraram microbicidas
frente à forma infectiva do fungo patogênico Fonsecaea pedrosoi, o principal agente
etiológico da cromoblastomicose humana. Quando pré-incubados com o fungo, esses
anticorpos foram, ainda, capazes de aumentar o índice de fagocitose e a atividade
28
microbicida de macrófagos murinos (Nimrichter et al., 2004). O reconhecimento da
GlcCer por esses anticorpos, assim como a sensibilidade desse fungo a esses mAbs,
são bloqueados pela alta concentração de melanina na parede celular das formas
fúngicas encontradas na lesão da cromoblastomicose (Nimrichter et al., 2005).
Os anticorpos citados acima não são as únicas moléculas capazes de se ligar
ao CMH e impedir o crescimento de fungos. Em 2004, Thevissen e colaboradores
mostraram que o peptídeo RsAFP2, purificado de rabanete, era fungicida e também
tinha como alvo a GlcCer. Interessantemente, as GlcCer de mamíferos não eram
reconhecidas por essa defensina (Thevissen et al., 2004). Experimentos posteriores
mostraram que a associação entre RsAFP2 e CMH ativava a produção de espécies
reativas de oxigênio (ROS) endógenas (Aerts et al., 2007). Além disso, um recente
estudo do nosso grupo mostrou que o peptídeo em questão apresentava atividade
contra C. albicans, assim como contra outras espécies de Candida, embora células
animais não se mostrem susceptíveis. Além disso, os níveis de CMH nas espécies de
Candida estavam correlacionados com a sensibilidade ao peptídeo onde cepas com
maior expressão de CMH foram mais sensíveis ao peptídeo (Tavares, et al., 2008).
Os dados apresentados acima confirmam que os CMHs são estruturas
antigênicas e estão relacionados com processos fisiológicos vitais em fungos. Assim,
o estudo dessas estruturas, bem como seus intermediários biossintéticos como
possíveis alvos para ação de antimicrobianos vem crescendo nos últimos anos. De
fato, o uso recente de inibidores da enzima glucosilceramida sintase em modelos de
diferenciação fúngica demonstrou que a germinação de esporos, o ciclo celular e o
crescimento de hifas das espécies Aspergillus nidulans e A. fumigatus são bloqueados
quando a enzima é inibida (Levery et al., 2002). O papel do CMH como regulador de
virulência durante a criptococose foi descrito por Rittershaus e colaboradores (2006).
Esses autores demonstraram que a GlcCer é essencial para o crescimento de C.
neoformans no ambiente extracelular em vasos sanguíneos do hospedeiro e no espaço
alveolar nos pulmões, que em contraste com o ambiente ácido do fagolisossoma,
caracteriza-se por possuir um pH neutro. Para realizar este estudo, os autores geraram
um mutante no gene GCS que codifica uma glucosiltransferase responsável por
catalisar o primeiro passo na biossíntese de glicoesfingolipídeos que leva a formação
da GlcCer. O mutante obtido gsc1 apresentou um fenótipo incomum: era
completamente avirulento em camundongos quando estes eram infectados por
29
inalação, mas causavam infecção letal quando a via de infecção utilizada era a
intravenosa. Nas condições experimentais utilizadas não foi encontrada no mutante
nenhuma alteração em outros fatores de virulência que poderia explicar o defeito em
desencadear a infecção. Através dessas observações os autores chegaram à seguinte
conclusão; o crescimento de gcs1 era bloqueado especificamente na presença de
altos níveis de CO
2
(5%) e somente em pH neutro. O mutante cresce perfeitamente
dentro de macrófagos, onde é transportado para lisossomas (ambiente ácido).
Entretanto, é incapaz de atravessar o tecido do pulmão e sobreviver nos vasos
sanguíneos (ambiente neutro).
3) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células fúngicas
Como discutido anteriormente, a necessidade da chegada de polissacarídeo
capsular recém sintetizado no meio extracelular, atravessando barreiras complexas,
exige uma forma eficiente de transporte molecular em C. neoformans. Neste contexto,
observações do nosso grupo sugeriram que CMHs se mostravam envolvidos na
formação de vesículas que brotavam a partir da membrana plasmática (Rodrigues et
al., 2000). Esses resultados nos levaram a supor que componentes de superfície de C.
neoformans, incluindo a cápsula, seriam sintetizados no citoplasma e exportados para
o exterior da célula por vesículas secretoras que atravessariam a parede celular. De
fato, outros componentes extracelulares, como a glicoproteína de 43 kDa de
Paracoccidioides brasiliensis (Straus et al., 1996), as fosfatases acídicas de
Saccharomyces cerevisiae (Blinnikova et al., 2002) e esterases de Candida lipolytica
(Adoga & Mattey, 1985) também foram associadas a mecanismos de secreção
vesicular. Sendo verdadeira, essa hipótese estaria de acordo com a detecção de
vesículas secretórias em sobrenandantes de cultivo de C. neoformans.
Análises por microscopia eletrônica de frações extracelulares de C.
neoformans, obtidas após centrifugação a 100.000g, revelaram a presença de
vesículas contendo uma bicamada lipídica (Figura 6; Rodrigues et al., 2007). As
frações vesiculares carreiam GXM, conforme demonstrado por métodos sorológicos e
microscópicos. O CMH também foi detectado nas vesículas por métodos
cromatográficos e espectroscópicos (Rodrigues et al., 2007). Foi também
demonstrado que as vesículas extracelulares de C. neoformans, cuja morfologia é
30
bastante variável, carreiam também uma combinação de 76 proteínas diferentes,
incluindo fatores de virulência (Rodrigues et al., 2008). A GalXM, componente
secundário da cápsula de C. neoformans, foi também detectada em estruturas
vesiculares (De Jesus et al., 2009). Esses resultados revelam um mecanismo eficiente
e genérico de secreção de moléculas relacionadas à patogênese em C. neoformans,
sugerindo que essas vesículas extracelulares podem funcionar como “sacos de
virulência” (Rodrigues et a.l, 2008).
Figura 6. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de vesículas em C. neoformans acapsulado (A
e B) e encapsulado (C, D e E). A ocorrência de vesículas em associação com a parede celular do fungo
acapsulado (A) ou no espaço extracelular (B) é evidenciada após crescimento in vitro. Barras, 100 nm
(A e B). As setas apontam para vesículas e os asteriscos evidenciam a parede celular do fungo. O
sedimento obtido por ultracentrifugação foi isolado por centrifugações diferenciais e analisado por
TEM. Vesículas extracelulares com bicamada lipídica e diferentes perfis de eletrondensidade foram
observadas. Barras, 100 nm (C e D) e 50 nm (E). (Adaptado de Rodrigues et al., 2008).
De acordo com nossos estudos, a secreção de vesículas também ocorre durante
a infecção de macrófagos com C. neoformans (Rodrigues et al., 2007). Isso sugere
que essas vesículas teriam importante papel na patogênese da criptococose. De fato,
dados similares foram descritos na infecção por Mycobacterium avium. Macrófagos
infectados com esta bactéria liberam exossomas contendo glicopeptídeolipídeos
(GPLs), que parecem desempenhar um importante papel na patogênese desse
microrganismo (Bhatnagar & Schorey, 2007). Esses GPLs podem interagir com
membranas de células hospedeiras promovendo a sobrevivência da bactéria, por
interferir com funções mediadas pela membrana (Vergne et al., 1995). Os exossomas
31
contendo GPLs liberados induzem uma resposta pró-inflamatória em macrófagos não
infectados. Esse estudo foi o primeiro a sugerir um novo mecanismo pelo qual
moléculas estimuladoras presentes em patógenos intracelulares podem ser liberadas
de células infectadas e promover resposta imune (Bhatnagar & Schorey, 2007).
Possivelmente o mesmo evento pode ocorrer com as vesículas liberadas por C.
neoformans.
A existência de vesículas contendo CMH em C. neoformans, associada à
hipótese de que possivelmente a inibição da síntese desse lipídeo resulte em redução
da expressão capsular sugere a correlação entre a síntese dessa molécula e o
crescimento da cápsula polissacarídica. Em uma analise comparativa realizada por
Albuquerque e colaboradores (2008) foi observado que as vesículas produzidas por S.
cerevisiae, fungo que não apresenta CMH, possuem um diâmetro menor do que
aquelas produzidas e secretadas por C. neoformans e outros fungos que também
sintetizam CMH.
Como descrito acima, a presença de vesículas que brotam a partir da
membrana plasmática de C. neoformans e a elevada expressão de CMH na parede
celular sugere que esses GSLs estão envolvidos com o transporte de estruturas para a
superfície e isso pode estar ligado com a formação de “lipid rafts”. Conforme
discutido anteriomente os domínios de membranas presentes nesses organismos
podem ser ainda mais compactos e mais estáveis (Nimrichter et al., 2005). Assim
como C. albicans e S. cerevisiae, C. neoformans apresenta “lipid rafts” e, nesse
fungo, determinantes de virulência como fosfolipase B1 e superóxido dismutase
foram encontrados concentrados nesses domínios, além do já extensamente discutido
CMH (Siafakas et al., 2006). É interessante notar que superóxido dismutase foi
identificada como uma das proteínas presente em vesículas extracelulares (Rodrigues
et a.l, 2008) o que pode ser um indício da importância e da relevância de “lipid rafts”
nesse mecanismo de secreção.
Associando as informações discutidas, seria plausível supor que o CMH é
importante durante a biogênese e endereçamento do principal fator de virulência de C.
neoformans. Nesse contexto, acreditamos que outras moléculas podem ter sua
secreção comprometida na ausência desse glicoesfingolipídeo, como, por exemplo,
aquelas que se encontram presentes em domínios lipídicos produzidos por esse fungo.
32
4) Infecção por C. neoformans: interação com células hospedeiras e disseminação
A capacidade de C. neoformans em disseminar por diferentes tecidos, após sua
passagem pelos alvéolos pulmonares, indica que esse fungo pode interagir com
diferentes tipos celulares. Além disso, deve-se considerar que o ponto de contato do
fungo com a célula hospedeira é a sua cápsula polissacarídica. Por esses motivos há
um número relativamente grande de trabalhos na literatura que discutem a interação
de C. neoformans e diferentes células hospedeiras e alguns deles serão discutidos a
seguir.
4.1) Interação de C. neoformans com macrófagos
A presença da cápsula, a produção de uma proteína antifagocítica (App1) e
evidências histológicas de localização extracelular em tecidos indicam que C.
neoformans cause doença como resultado de seu crescimento extracelular (Casadevall
& Perfect, 1998). Entretanto, dados recentes revelam que esse fungo também é capaz
de sobreviver e se multiplicar dentro de macrófagos (Feldmesser, Tucker &
Casadevall, 2001). Para sobreviver e proliferar intracelularmente, os microrganismos
precisam desenvolver mecanismos para evitar sua destruição por vias degradativas,
que podem incluir o escape do fagossoma no citosol do hospedeiro, a prevenção da
fusão do fagolisossoma ou mesmo a capacidade de sobreviver dentro de
fagolisossoma (Del Poeta, 2004). No caso de C. neoformans, o que parece ocorrer é a
última hipótese descrita. A infecção criptocóccica dentro de macrófagos inicia-se com
a internalização do fungo por um mecanismo de endocitose ainda não totalmente
conhecido, mas que provavelmente tem a participação de receptores do tipo Toll
(TLR), CD18 ou CD14, já que dados da literatura sugerem que o principal
componente da cápsula de C. neoformans (GXM) pode se associar e mediar respostas
por intermédio desses receptores (Chang et al., 2006). Ainda nessas células foram
observadas a fusão e a acidificação do fagolisossoma, mas o fungo é capaz de
sobreviver provavelmente devido à presença de alguns fatores de virulência, tais
como:
(i) Cápsula polissacarídica, que permite a sobrevivência do fungo em baixo pH
(ambiente encontrado nos fagolisossomas);
(ii) Melanina, que neutraliza os radicais livres produzidos pelo macrófago;
33
(iii) Fosfolipase B, que supostamente hidrolisa componentes lipídicos da
membrana do fagossoma permitindo o acesso ao ambiente citoplasmático de
macrófagos.
Com o progresso da infecção, dentro do macrófago, é observada uma
vacuolização citoplasmática intensa associada a uma desorganização celular. A
presença de fosfatase ácida confirma a origem lisossomal desses vacúolos
(Feldmesser et al., 2000). Aparentemente, o acúmulo desses vacúolos no citoplasma é
causado pela desordem do tráfego lisossomal decorrente da secreção intracelular do
polissacarídeo capsular pelo fungo (Feldmesser, Tucker & Casadevall, 2001).
Paralelamente, ocorre a replicação do patógeno resultando em seu acúmulo dentro dos
fagossomas e a ruptura do mesmo. Em seguida, o macrófago é rompido e ocorre a
liberação dos fungos, que poderão infectar novas células (Figura 7) (Feldmesser,
Tucker & Casadevall, 2001). Alternativamente, em alguns macrófagos ocorre um
processo de extrusão após a replicação dos fungos no fagolisossomo. Como
conseqüência, os fungos presentes no fagolisossomo são liberados para o meio
extracelular sem nenhum tipo de dano para as células hospedeiras, que, em seguida, se
dividem normalmente. Esse mecanismo de extrusão parece ser dependente,
principalmente, da presença de cápsula e independente do funcionamento do
citoesqueleto (Alvarez & Casadevall, 2006; Ma et al., 2006). Esses dados sugerem
que o fungo é o responsável direto por esse evento.
Recentemente, um novo mecanismo de disseminação do fungo foi descrito.
Este permite ao microrganismo escapar de componentes antimicrobianos do espaço
extracelular como anticorpos, complemento e drogas que tenham penetração limitada
nas células. A nova estratégia descoberta seria de uma passagem lateral do fungo de
uma célula para outra, evitando assim o espaço extracelular e escapando do
reconhecimento e ação da resposta imune. Essa nova forma de disseminação direta de
uma célula infectada para uma não infectada requer contato entre as células e depende
da motilidade das mesmas, ou seja, seu citoesqueleto deve estar funcionando
normalmente. O estudo desse mecanismo de disseminação pelo C. neoformans é
importante porque a passagem do patógeno de um fagócito frágil pára um saudável
assegura a persistência intracelular do patógeno mesmo se a célula hospedeira
começar a morrer. Além disso, os macrófagos infectados podem viajar através do
sistema circulatório e linfático do hospedeiro onde podem interagir entre si e com
outros tipos celulares. Especula-se também que C. neoformans internalizado pode
34
usar esse contato para atravessar a barreira hematoencefálica por passagem direta
célula a célula (Alvarez & Casadevall, 2007; Ma, et al., 2007).
O fato de C. neoformans sobreviver dentro de fagócitos e de nem sempre levá-
los à lise, pode ter uma grande influência na patologia causada por este fungo. O
macrófago poderia servir como uma espécie de “veículo” para o fungo, já que através
desta célula do hospedeiro o patógeno pode se disseminar para outros órgãos e tecidos
escapando da resposta imune do hospedeiro. Estratégias como essas, denominadas de
“cavalo de Tróia”, já foram descritas na literatura (Alvarez & Casadevall, 2006).
Figura 7. Infecção em macrófagos por C. neoformans, ilustrando potenciais papéis dos fatores de
virulência do fungo na sua patogênese intracelular (Adaptado de Feldmesser, Tucker & Casadevall,
2001). Após a fagocitose, ocorre a fusão do fagossoma com o lisossoma com transferência do
polissacarídeo capsular que se encontrava no fagolisossoma e de produtos lisossomais para o
fagolisossoma. A desordem do tráfego lisossomal, devido à presença do polissacarídeo, resulta no
acúmulo de vacúolos citoplasmáticas com subseqüente lise da célula do hospedeiro e liberação do
microrganismo para o meio extracelular.
4.2) Interação de C. neoformans com células epiteliais e endoteliais
Em estudos realizados no nosso laboratório observamos que C. neoformans se
liga a células epiteliais alveolares, a primeira barreira encontrada pelo fungo durante a
instalação da infecção, através da associação da GXM a receptores de superfície da
célula hospedeira (Barbosa et al., 2006). O processo de internalização tanto da GXM
35
quanto do fungo por essas células dura cerca de 1 hora e é parcialmente bloqueado
por lipopolissacarídeo (LPS). Nossos achados mais recentes apontam a molécula de
CD14 como principal candidato a receptor para GXM nas células alveolares (Barbosa
et al., 2007). Embora a GXM isolada não tenha nenhum efeito citotóxico sobre essas
células, o fungo é capaz de provocar a sua morte. Esses dados fornecem a base para
um potencial mecanismo de infecção de células alveolares por C. neoformans. Nesse
processo o fungo aderiria ao epitélio alveolar por intermédio da sua cápsula, seria em
seguida internalizado e esse processo culminaria com a morte das células hospedeiras
e passagem do fungo para o interstício pulmonar (Barbosa et al., 2006).
Alternativamente, a endocitose de C. neoformans por células chave do
hospedeiro pode também ocorrer sem replicação do fungo ou dano celular. Chang e
colaboradores (2004) demonstraram que C. neoformans é capaz de usar um
mecanismo de transcitose para atravessar o endotélio vascular cerebral, o principal
sítio de entrada para o fungo no cérebro. O fungo permanece em vesículas no interior
das células e em um período de aproximadamente 3 horas atravessa o endotélio. O
mecanismo exato para essa transcitose ainda não foi determinado.
4.3) Interação de C. neoformans com células do sistema nervoso central
Inúmeros estudos na literatura vêm avaliando os mecanismos de interação de
C. neoformans e macrófagos. No entanto, pouco se sabe com relação a esse processo
em células do sistema nervoso central (SNC) e como se dá, em detalhes, a chegada do
fungo nessa região. O SNC é revestido por ossos do crânio e espinha, meninges,
fluido cérebro espinhal dentro do espaço subaracnóideo e pela barreira
hematoencefálica. Entretanto, despistando tais proteções, o SNC pode ser invadido e
danificado por uma variedade de microrganismos, dentre eles C. neoformans,
causando infecções em sua maioria fatais (Scheld, Whitley & Durack, 1991). As
defesas do hospedeiro contra tais infecções envolvem células residentes do SNC,
particularmente astrócitos e microglias, e células sanguíneas que invadem o
parênquima neural vindas da circulação (Scheld, Whitley & Durack, 1991). A
patogênese da infecção do SNC por C. neoformans ainda é pouco entendida, mas é
provável que a imunidade local seja importante em limitar a infecção no cérebro.
Modelos de infecção intracerebral de C. neoformans em camundongos sugerem que
mecanismos de fagocitose no SNC podem ser importantes para limitar a infecção.
(Blasi et al., 1992). Similarmente, foi mostrado que células da microglia fagocitam
36
com avidez C. neoformans na presença de anticorpos específicos (Lee et al., 1995).
Além do mecanismo de fagocitose, foi demonstrado por Lee e colaboradores (1994)
que astrócitos ativados são capazes de inibir o crescimento de C. neoformans “in
vitro” através de mecanismos mediados pela produção de óxido nítrico (NO).
Entre as células do SNC, as astroglias desempenham um papel relevante. Elas
fornecem suporte crucial para os neurônios e outras células do SNC, produzem fatores
neurotrópicos e eliminam neurotoxinas (Kimelberg & Noremberg, 1989; Barres,
1991; Eddleston & Mucke, 1993). Além dessas funções essas células respondem
vigorosamente a infecções no SNC, podem regular inflamação e são capazes de
funcionar como células apresentadoras de antígenos. Além disso, o impedimento das
funções da astroglia ou o desequilíbrio entre as atividades da astroglia e da microglia,
ocasionados por certos patógenos, podem contribuir para o desenvolvimento de
doenças neurológicas (Mucke & Eddleston, 1993).
Como descrito acima, as astroglias também são importantes no combate a
patógenos que conseguem atravessar todas as barreiras e chegar ao SNC. No entanto,
para que ocorra a contenção da infecção é preciso que essas células interajam com
outras diversas. As interações do SNC com fatores e células do sangue são
importantes para o afastamento dos microrganismos do SNC infectado assim como na
imunopatogênese das doenças imunoinflamatórias demielinizantes. Essas interações
são parcialmente controladas pela barreira hematoencefálica que é formada pelas
propriedades únicas das células endoteliais do SNC (Goldstein & Betz, 1986).
A detecção do polissacarídeo capsular de C. neoformans no soro e no fluido
cérebro espinhal é usada para fazer o diagnóstico de infecção criptocócica, porém,
pouco se sabe sobre a distribuição e a localização no tecido do antígeno capsular.
Dessa forma, Lee, Casadevall e Dickson (1996) investigaram essa distribuição
e a localização celular do polissacarídeo em tecidos do sistema nervoso central de
uma série de pacientes com meningoencefalite criptocócica. O resultado reforçou a
idéia de que na meningoencefalite o polissacarídeo capsular dissociado do fungo
resulta na formação de depósitos no tecido. Além disso, foi observado que células do
cérebro têm mecanismos de endocitose para polissacarídeo solúvel (Lee, Casadevall
& Dickson, 1996). Microscopicamente, a imunoreatividade com o antígeno capsular
nas meninges foi associada com macrófagos e microglia. Uma reatividade menos
freqüente foi detectada em astrócitos e células endoteliais, mas não em linfócitos.
37
4.4) Interação de C. neoformans com amebas
Como descrito acima, os fatores de virulência de C. neoformans são essenciais
para a sobrevivência deste fungo no interior de células de defesa do hospedeiro. Para
o sucesso de tal estratégia de sobrevivência, foi necessário um processo de adaptação
pelo fungo a esse novo ambiente, o intracelular. No entanto, por ser um
microrganismo do solo e não necessitar de hospedeiros para desenvolver seu ciclo de
vida, surge uma questão intrigante: como esse fungo teria se adaptado a um ambiente
intracelular?
De acordo com Steenbergen, Shuman e Casadevall (2001), C. neoformans
pode ter adquirido a capacidade de causar doença em humanos através de mecanismos
de defesa desenvolvidos para evadir de predadores do ambiente. A capacidade de
algumas cepas de C. neoformans de se desenvolver dentro de amebas, causando
muitas vezes a morte desse hospedeiro, pode explicar essa adaptação. Dados da
literatura sugerem que as amebas apresentam sistema de fagocitose e degradação
intracelular similares ao observado em macrófagos (Swanson & Hammer, 2000). Por
outro lado, leveduras sem nichos ambientais, como C. albicans e S. cereviseae, se
mostraram incapazes de sobreviver dentro desses hospedeiros. Além de C.
neoformans, outros patógenos fúngicos detectados no solo e capazes de se
desenvolver no interior de células hospedeiras, como Histoplasma capsulatum,
Sporothrix schenckii e Blastomyces dermatitidis, também infectam e sobrevivem
dentro de amebas (Steenbergen et al., 2004).
5) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos endocíticos
Como discutido acima, C. neoformans apresenta um eficiente mecanismo de
secreção vesicular de moléculas associadas à sua virulência e, neste contexto, a
secreção de GXM afeta diretamente o crescimento capsular. Durante a infecção, este
fungo secreta o polissacarídeo capsular constantemente no espaço extracelular. Nesta
situação, esta molécula pode interagir com células do sistema imune e ser
internalizada (Chang et al., 2006), desencadeando eventos subseqüentes importantes
como, por exemplo, a produção de citocinas por células epiteliais (Barbosa et al.,
2007), apoptose em macrófagos (Chiapello et al., 2008; Villena et al., 2008) e
inibição direta na proliferação de células T (Yauch, Lam & Levitz, 2006). Dessa
38
forma, nosso estudo busca estudar o mecanismo pelo qual a GXM é internalizada por
macrófagos e como isso afetará a resposta imune contra o patógeno em questão.
Como a endocitose ocorre a partir da membrana plasmática, é comum estudar
moléculas presentes neste ambiente quanto à sua interferência nesse evento.
Aparentemente, a participação direta dos GSL e “lipid rafts” na internalização
de microrganismos tem como conseqüência a modificação no direcionamento
intracelular (Kim et al., 2002). Dessa maneira, patógenos intracelulares poderiam
regular as moléculas envolvidas na endocitose e assim se sobrepor às defesas do
hospedeiro. Conforme discutido anteriormente, C. neoformans é um patógeno
intracelular facultativo, sendo capaz de se multiplicar em macrófagos provocando ou
não a lise dessas células (Feldmesser, Tucker & Casadevall, 2001; Alvarez &
Casadevall, 2006; Ma et al., 2006). Além disso, possui como receptores da sua
cápsula polissacarídica moléculas GPI-ancoradas, como CD14, e moléculas que são
recrutadas para os domínios lipídicos após interação com estruturas produzidas por
microrganismos, como o TLR2 (Olsson & Sunler, 2005). Outras moléculas derivadas
de patógenos têm seu processo de sinalização/internalização muito bem estudado,
como por exemplo, os LPS de bactérias Gram-negativas. A sinalização por LPS se
inicia com a ligação a TLR4 e do co-receptor CD14, conduzindo a ativação de alvos
“downstream” como as proteínas MAP quinases. DeLibero e colaboradores (2005)
demonstraram que o tratamento de células T com LPS aumenta a expressão de
gangliosídeos nessas células. Como o LPS compartilha os mesmos receptores que a
GXM respostas similares podem ser esperadas.
39
Justificativa e objetivos
A) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células fúngicas
O polissacarídeo capsular é sintetizado no citoplasma e exportado para a
superfície dentro de vesículas que têm como constituinte, dentre outras moléculas, o
CMH. Acreditamos que este glicoesfingolipídeo desempenha um papel chave na
formação da vesícula e no endereçamento de moléculas para seu interior. Neste
contexto, acreditamos que a secreção de GXM e de outros componentes essenciais
para a manutenção da virulência da patógenos fúngicos para o meio extracelular possa
ser modificada na alteração da expressão do CMH.
Diante do colocado acima, foram nossas metas nesse tópico:
- Analisar o tamanho da cápsula polissacarídica das cepas selvagem, mutante (onde
não há a enzima responsável pela adição da glucose à ceramida) e reconstituída, após
crescimento do fungo em meio de indução do crescimento capsular;
- Obter vesículas das cepas selvagem, mutante e reconstituída e analisar a expressão
de esterol nas mesmas, o que refletirá a quantidade de vesículas;
- Analisar o tamanho das vesículas secretadas pelas cepas selvagem, mutante e
reconstituída;
- Analisar a quantidade de GXM nas vesículas secretadas pelo fungo;
- Analisar o efeito de inibidores da glucosiltransferase sobre o tamanho capsular na
cepa selvagem.
B) Papel da GXM na modulação da expressão de gangliosídeos em células
hospedeiras
A GXM é constantemente secretada durante a infecção por C. neoformans,
interagindo com diversos tipos celulares. Em macrófagos, esse polissacarídeo
compartilha dos mesmos receptores de superfície que o LPS.
Dados da literatura mostram que o LPS pode modular a expressão de
gangliosídeos em células T; dessa forma, nossos experimentos visam verificar se a
40
interação da GXM com macrófagos pode alterar a expressão e a localização de GSL
em macrófagos.
Metas nesse tópico:
- Verificar a influência da GXM na distribuição dos GSLs (GM1 e GD1a) na
superfície de macrófagos;
- Analisar o efeito da GXM como modulador da expressão de GM1 e GD1a em
células fagocíticas.
41
Materiais e Métodos:
A) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células
fúngicas
Células fúngicas: As cepas de C. neoformans (H99, gcs1 e rec gcs1),
gentilmente cedidas pelo Dr. Maurizio Del Poeta e a cepa T
1
444, foram cultivadas em
meio mínimo (glucose 15 mM de, MgSO
4
10 mM , KH
2
PO
4
24,4 mM , glicina 13
mM e tiamina 3 µM) , conforme descrito previamente (Rodrigues et al., 2000), por
48 h à temperatura ambiente, sob agitação. As células foram colhidas por
centrifugação a 12.000 rpm e lavadas em PBS (NaCl 137 mM, Fosfato de potássio 10
mM, KCl 2.7 mM, pH 7.4), para uso nos experimentos descritos a seguir.
Envolvimento de GlcCer na fisiologia fúngica: Para analisar as funções da GlcCer
na fisiologia de C. neoformans, vários parâmetros foram analisados. Nesses modelos,
leveduras mutantes deficientes na produção de GlcCer, assim como células tratadas
com inibidor da sua síntese, o t-PDMP, foram utilizados conforme descrito adiante.
As células controle foram tratadas com um análogo estrutural inativo do inibidor da
síntese de GlcCer (e-PDMP) (Levery et al., 2002).
Alterações morfológicas e produção de cápsula: As cepas mutante, selvagem e
reconstituída foram cultivadas em placa de Petri com meio Sabouraud 10% em PBS
(meio de indução do crescimento capsular) por 24 h à 37ºC e sem agitação. As
alterações morfológicas decorrentes da ausência de GlcCer foram avaliadas por
microscopia óptica. Alterações nos tamanhos celulares e de cápsula foram
determinadas depois de coloração das suspensões celulares com tinta nanquim. A
espessura do polissacarídeo capsular foi definida como a distância entre a parede
celular e a borda externa da cápsula (Barbosa et al., 2006). Foram analisadas 200
células de cada cepa em microscópio Axioplan 2 (Zeiss, Germany). As imagens foram
obtidas usando a câmera digital color view SX e processadas pelo software system
analySIS (Soft Image System).
Quantificação de GXM liberada no meio de cultura: Os sobrenadantes das cepas
crescidas em meio de indução do crescimento capsular foram avaliados quanto à
concentração de GXM. O método usado foi ELISA com anticorpo anti-GXM (mAb
42
18B7 cedido pelo Dr Arturo Casadevall). No procedimento descrito a seguir, todos os
anticorpos foram utilizados na concentração de 1 µg/ml. As etapas de incubação
foram realizadas por 1 h a 37
o
C ou durante 12 h a 4
o
C, sempre intercaladas por três
lavagens com PBS suplementado com Tween 0.05%. Placas de 96 poços foram
revestidas com 50 µl de uma solução de anticorpo monoclonal anti-GXM (IgM) na
concentração de 10 µg/ml. As amostras foram adicionadas após terem sido diluídas,
seguindo-se da etapa de bloqueio usando PBS suplementado com 10 mg/ml de soro
albumina bovina (PBS-BSA) e lavagem das placas. Foi então adicionado IgG
monoclonal anti-GXM. Para posterior detecção de IgGs ligadas adicionamos ao
sistema anticorpo secundário conjugado à fosfatase alcalina. As reações foram
reveladas pela adição de solução contendo o substrato cromogênico p-NPP (5 mg/ml
em 0.1 M glicina, 1 mM MgCl
2
, 1 mM ZnCl
2
, pH 10.4) e a absorbância detectada
espectrofotometricamente por leitura a 405 nm. O resultado obtido foi normalizado de
acordo com a quantidade de células presentes na cultura.
Efeitos do PDMP sobre crescimento do C. neoformans: Para estabelecer a
concentração do inibidor que poderia ser usada sem afetar o crescimento celular
fizemos um ensaio de viabilidade celular. Cultivamos as células em placa de 96 poços
com fundo em U na ausência do PDMP e em concentrações variando de 160µM a
0,33µM por 48 h em temperatura ambiente. A forma inativa do PDMP foi utilizada
como controle nas mesmas condições. Depois da exposição a um dos dois compostos,
as suspensões celulares foram analisadas quanto à formação de botão. Utilizamos a
concentração sub-inibitórias do PDMP para os experimentos posteriores.
Efeito do PDMP sobre a expressão da cápsula: C. neoformans (cepa T
1
444) foi
cultivado na presença do inibidor t-PDMP ou de seu análogo inativo e-PDMP. Os
fungos (10
4
células) foram cultivados em meio quimicamente definido por 48 h na
presença de ambos os isômeros de PDMP (40µM). Após esse período, as células
foram lavadas com meio e incubadas sob as mesmas condições por mais 48 h. Após
isso, as células foram lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% e
bloqueadas por 1 h a 37ºC em PBS suplementado com 10 mg/ml de soro albumina
bovina (PBS-BSA). As células bloqueadas foram lavadas três vezes com PBS e então
incubadas com anticorpo anti-GXM mAb 18B7 (10 µg/ml) por 1 h à temperatura
ambiente. Novas lavagens das células com PBS foram feitas seguido de incubação
43
com anticorpo anti-camundongo conjugado à FITC. As células fúngicas foram então
analisadas por citometria de fluxo. O controle foi feito como descrito acima exceto
pela incubação com anticorpo anti-GXM.
Análise do tamanho capsular por microscopia eletrônica: Os fungos (T
1
444)
tratados com t-PDMP ou e-PDMP conforme descrito anteriormente foram analisados
por microscopia eletrônica buscando-se observar diferenças no tamanho da cápsula
(Rodrigues et al., 2000). Para isso as células fúngicas foram lavadas com PBS e
fixadas em uma solução contendo paraformaldeído 4% e glutaraldeído 2,5% em
tampão cacodilato 0,1M durante 30 min. Em seguida, as células foram lavadas em
PBS e fisicamente removidas das placas. As células foram pós-fixadas com OsO
4
por
40 min à temperatura ambiente e desidratadas em soluções de acetona, sendo em
seguida incluídas em resina. O material foi observado em um microscópio de
transmissão Zeiss 900.
Isolamento de vesículas e análise do conteúdo lipídico e GXM: As células fúngicas
das cepas H99, gcs1 e rec gcs1 foram separadas dos sobrenadantes de cultura por
centrifugação a 4000 g por 15 min a 4
o
C. Os sobrenadantes foram colhidos e
novamente centrifugados a 15,000g (4
o
C), para remover fragmentos celulares. Os
sedimentos foram descartados e os sobrenadantes resultantes foram concentrados
aproximadamente 20 vezes usando sistema de ultrafiltração Amicon (cutoff = 100
kDa). Os sobrenadantes concentrados foram então centrifugados a 100.000 g, por 1 h
a 4
o
C. Os sobrenadantes foram descartados e os sedimentos lavados por
centrifugações e ressuspensões seqüenciais. O número de vesículas foi normalizado
pela contagem do número de células realizadas em câmara de Neubauer. Cada
amostra obtida foi testada quanto ao conteúdo de lipídeos e GXM por extração com
solventes orgânicos (Nimrichter et al., 2004) e ELISA de captura (Garcia-Rivera et
al., 2004), respectivamente. Para a análise lipídica, os sedimentos obtidos da
centrifugação à 100.000g foram ressuspendidos em metanol e então 2 volumes de
clorofórmio foram adicionados. O material foi centrifugado para descartar o
precipitado, e levados à secura em nitrogênio. Após partição de Folch (1957), a fase
inferior obtida, contendo os lipídeos neutros, foi recuperada e analisada por
cromatografia em camada fina (HPTLC). Para as análises de esterol, o extrato lipídico
foi resolvido por HPTLC, utilizando como sistema solvente uma mistura de hexano-
44
éter-ácido acético (80:40:2 vol/vol/vol) e revelado com uma solução contendo 50 mg
de FeCl
3
, 90 ml de água, 5 ml de ácido acético e 5ml de ácido sulfúrico. Após a placa
ter sido aquecida a 100°C por um período em torno de 3 à 5 min, as bandas de esterol
foram visualizadas e comparados com o padrão. Os volumes aplicados nas placas
foram definidos de acordo com o número de células obtido inicialmente.
Análise das vesículas por dispersão dinâmica de luz (dynamic light scattering): O
tamanho das vesículas obtidas das cepas H99, gsc1 e rec gsc1 foi mensurado por
QELS em um Analisador multi-ângulo de tamanho de partículas 90Plus/BI-MAS
(Brookhaven
Instruments Corp., Holtsville, NY). As vesículas foram obtidas
conforme descrito acima e ressuspendidas em PBS. A flutuação do sinal, originada do
movimento randômico das partículas em fase líquida e as alterações associadas na
intensidade de “scattered light”, foram processadas pela função de autocorrelação
C(t), C(t)=Ae
2Γt
+B. Nesta equação, t é o tempo de atraso, A é a constante óptica
determinada pelo designer do instrumento, e Γ é relacionado ao relaxamento das
flutuações por Γ=Dq
2
. O valor de q é calculado através do ângulo θ do scattering, do
comprimento de onda do laser λ
0
, e do índice de refração n da suspensão, de acordo
com a equação q=(2πn/λ
0
)2Sin(θ/2). O tamanho da partícula é relacionado ao
coeficiente (D) de difusão translacional como função do formato molecular.
significante. A polidispersão foi definida como igual a µ
2
/Γ
2
, onde µ
2
é proporcional a
variação de distribuição de intensidade. A distribuição multimodal do diâmetro do
tamanho da particular foi gerada por “Non-Negatively constrained Least Squares
algorithm” (NNLS) baseado na intensidade do “light scattered” para cada partícula.
Para correlacionar o diâmetro efetivo das vesículas, as medidas QELS foi utilizado
um “cut off” de 80%, o que representa a população mais prevalente de polissacarídeo.
Todas as amostras de vesículas foram analisadas sob as mesmas condições. Esse
experimento foi realizado pela Drª Susana Frases-Carvajal no Albert Einstein College
of Medicine, divisão de Microbiologia e Imunologia, Bronx, Nova York.
45
B) Papel da GXM na modulação da expressão de gangliosídeos em células
hospedeiras
Cultivo de células fúngicas e animais:
Células fúngicas: As células fúngicas foram cultivadas em meio mínimo por 48 h sob
agitação e preparadas conforme descrito previamente (Rodrigues et al., 2000).
Células animais: As células RAW 264.7 (linhagem derivada de macrófagos
murinos), foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e
glutamina 2 mM a 37
0
C e 5% de CO
2
.
Isolamento de GXM extracelular de sobrenadantes de cultura por filtração: O
polissacarídeo secretado pela cepa H99 foi isolado por ultrafiltração como descrito
recentemente por nosso grupo (Nimrichter et al., 2007). Primeiramente, as células de
C. neoformans foram separadas do sobrenadante por centrifugação e o sobrenadante
resultante foi concentrado aproximadamente 20 vezes usando sistema de ultrafiltração
Amicon (cutoff = 100 kDa). Após a formação de um filme viscoso em cima da
membrana a fase flúida foi descartada e o material gelatinoso foi recolhido com
auxílio de um “scrapper”. A concentração de GXM na solução foi determinada por
ELISA de captura (Casadevall et al., 1992), diluída e esterilizada, por filtração em
membrana, para utilização nos experimentos descritos a seguir.
Análise da presença de endotoxina na preparação de GXM: A presença de
endotoxina na solução de GXM foi verificada através do teste LAL, usando o kit LAL
pyrogen plus (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc Estados Unidos), de
sensibilidade igual à 0,03 EU/ml, de acordo com as instruções fornecidas pelo
fabricante.
Remoção de endotoxina através de coluna de polimixina: Primeiramente, a GXM
foi diluída em água apirogênica, em um volume final de 5 ml, com uma concentração
final de 0,6 mg/ml. A solução foi então filtrada para esterilização e o volume
recuperado foi igual à 4,5 ml. A coluna de polimixina Detoxi-Gel Endotoxin
Removing Gel foi previamente preparada e equilibrada de acordo com as instruções
do fabricante (Thermo Scientific). A GXM foi passada na coluna seguindo as
46
instruções detalhadas neste manual. Após passagem da amostra a solução de
polissacarídeo teve a concentração de GXM determinada por ELISA de captura
(Casadevall et al., 1992) conforme descrito anteriormente.
Distribuição dos GSLs (GM1 e GD1a) na superfície dos macrófagos após
interação com GXM: As células RAW 264.7 foram cultivadas em placa de 24 poços
(5x10
5
células/poço) com lamínulas por 2 dias, a 37
0
C e 5% de CO
2
. Os macrófagos
foram incubados na presença de GXM por intervalos de tempo distintos de acordo
com o descrito a seguir.
Primeiramente, a GXM foi adicionada a cultura nas concentrações de 10
µg/ml e a incubação foi realizada por 30 min à temperatura ambiente. Após o período
de incubação, as células foram lavadas 3 vezes com meio DMEM. Para confirmar a
ligação da GXM à superfície das células animais algumas lamínulas foram
imediatamente fixadas com 4% de paraformaldeído (“overnight”/4ºC). As demais
lamínulas foram mantidas a 37ºC por um período final de 2 h. Decorrido o tempo de
incubação, as células foram fixadas nas mesmas condições anteriores. Após 3
lavagens com PBS, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,2% por 5
min e foi realizado o bloqueio das ligações inespecíficas com uma solução de
PBS/BSA a 5% por 30 min à temperatura ambiente. As lamínulas foram lavadas 4
vezes com PBS e os anticorpos monoclonais anti-GD1a ou anti-GM1, ambos na
concentração de 4 µg/ml, foram adicionados de acordo com cada experimento.
Após incubação por 1 h à temperatura ambiente os poços foram lavados com
PBS, seguidos pela incubação com o anticorpo secundário anti-mouse conjugado à
FITC nas mesmas condições. Finalmente, todos os poços foram lavados e a
fluorescência de cada sistema foi analisada em microscópio de fluorescência axioplan
II (Zeiss, Germany).
Análise da expressão de gangliosídeos em células animais após tratamento com
GXM: As células RAW 264.7 foram cultivados na presença de GXM (50 µg/ml) por
48 h a 37ºC e 5% de CO
2
. Após 24 h de incubação, o meio de cultura foi trocado e
uma nova dose de GXM foi adicionada na mesma concentração. A expressão de GSL
nas células tratadas com GXM foi avaliada por cromatografia em camada fina após
47
etapas de extração e purificação descritas abaixo. As bandas reativas com o reagente
resorcinol-sulfúrico, e que apresentaram diferença de expressão quando comparadas
ao controle, foram quantificadas através do programa Scion Image Analysis
(Nimrichter et al., 2005).
Extração e purificação dos glicoesfingolipídeos de macrófagos: As células RAW
264.7 foram ressuspendidos em água gelada (3 mL) e homogeneizados com “Potter-
Elvehjem Homogeneizer” sob refrigeração. Em seguida foram adicionados aos
sistemas metanol (8 mL), e, após breve agitação, clorofórmio (4 mL). Após 1 h de
agitação, a suspensão celular foi centrifugada e o sobrenadante removido. O
sedimento foi re-extraído com clorofórmio:metanol:água (C:M:H) (4:8:3, v/v/v) e
novamente centrifugado. Os extratos foram combinados e ajustados, com adição de
água, para uma mistura final contendo C:M:H (4:8:5,6). A mistura foi centrifugada e a
fase superior contendo os lipídeos polares removida. A fase inferior foi levada à
secura em evaporador rotatório e re-extraída com C:M:H (4:8:5,6). As fases
superiores foram combinadas.
Remoção dos sais e contaminantes hidrofílicos: Os extratos lipídicos foram
submetidos à cromatografia em fase reversa para eliminação dos sais e, em seguida
analisados em HPTLC (Schnaar, 1994a). Para tal, os extratos foram ressuspendidos
em uma mistura contendo C:M:H (2:43:55, v/v/v) e injetados em colunas Sep-Pak C
18
previamente equilibradas com 5 ml de água, metanol:água (1:1, v/v), metanol,
metanol:água (1:1, v/v) e, finalmente, C:M:H (2:43:55, v/v/v). O eluato foi re-injetado
e a coluna submetida a subseqüentes lavagens com 5 ml de C:M:H (2:43:55, v/v/v),
metanol:água (1:1, v/v) e os glicoesfingolipídeos eluídos com 5 ml de metanol e
clorofórmio:metanol (1:1, v/v). Essas duas últimas frações continham os GSL livres
de contaminantes hidrofílicos e prontos para serem analisados por TLC.
Visualização dos GSL por cromatografia em camada fina: Para a visualização dos
gangliosídeos foi utilizado o sistema solvente composto por C:M:KCl 0.25%
(60:35:8) (Schnaar, 1994b) e as bandas foram visualizadas após utilização do reagente
Resorcinol-HCl-Cu
++
(Nilsson & Svennerholm, 1982) e aquecimento a 125
0
C por 20
min. Os gangliosídeos apresentam uma coloração azul-violeta enquanto os
48
glicoesfingolipídeos neutros, sulfatados e os fosfolipídeos apresentam uma coloração
marrom. Foram utilizadas misturas padrão para comparação do R.f. das amostras
estudadas.
Identificação dos gangliosídeos expressos nas células RAW 264.7: As células
tratadas com o polissacarídeo foram lavadas exaustivamente com PBS e os lipídeos
extraídos conforme descrito acima. Os GSLs foram resolvidos em HPTLC e as placas
impermeabilizadas com 0,1% de poliisobutilmetacrilato (PIBM) em hexano (o PIBM
foi diluído em 2 ml de clorofórmio e 18 ml de hexano foram adicionados a solução).
Após esse período, as placas foram levadas à secura à temperatura ambiente e, em
seguida, bloqueadas com PBS/BSA 1% “overnight”. Posteriormente, as placas foram
lavadas 3 vezes com PBS e seguidamente expostas aos anticorpos específicos, anti-
GM1 e anti-GD1a ambos na concentração de 4 µg/ml, por 1 h à temperatura
ambiente. Decorrido o tempo de incubação, as placas foram lavadas novamente com
PBS (3 vezes) e foi usado anticorpo anti-camundongo acoplado à peroxidase na
concentração de 1:500 por 1 h, também à temperatura ambiente. Uma nova etapa de
lavagem igual as anteriores se seguiu e, finalmente, a revelação foi feita com 5 mg de
diaminobenzidina (DAB), 10 µl de H
2
O
2
e 10 ml de PBS
.
Testes estatísticos: O teste t-Students foi usado para comparar as diferenças entre os
grupos. As diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P
encontrou-se abaixo de 0,05.
49
Resultados:
A) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células fúngicas
Análise do tamanho capsular de H99,
gcs1 e rec
gcs1:
As leveduras de C. neoformans cultivadas em meio mínimo e com expressão
reduzida de cápsula foram transferidas para o meio de indução capsular conforme
descrito anteriormente. Em seguida, analisamos o tamanho capsular por coloração
com tinta nanquim e medimos a distância entre o corpo celular e o limite da cápsula
usando o programa ImageJ. Observamos que o mutante, que não apresenta CMH,
possui uma cápsula reduzida quando comparado com as cepas selvagem e
reconstituída (Figura 8).
Figura 8. Análise do tamanho capsular: As cepas selvagem (H99), gcs1 (mutante que não sintetiza
GlcCer) e recombinante gcs1 (Rec) foram coradas com tinta nanquim e analisadas por microscópio
óptico (C). A média ± desvio padrão da medida da distância do corpo celular até a borda da cápsula (A)
de 200 células é mostrada em B.
50
Quantificação de GXM liberada no sobrenadante:
Quantificamos a GXM liberada no sobrenadante de cultivo por ELISA usando
anticorpo anti-GXM (18B7). O resultado obtido foi normalizado de acordo com o
número de células. As 3 cepas apresentaram uma taxa de crescimento similar (dados
não mostrados). Após um período de 24 horas observamos que a cepa mutante
apresentava uma quantidade reduzida de GXM (22% do valor observado para o
controle) no sobrenadante. Por outro lado, a quantidade de GXM detectada no
sobrenadante de cultivo das cepas selvagem e reconstituída foi de 67% quando
comparada ao controle (Figura 9).
Figura 9. Quantificação de GXM no sobrenadante: Análise do sobrenadante das cepas selvagem
(H99), gcs1 (Mut) e recgcs1 (Rec) quanto à quantidade de GXM por ELISA. Os sobrenadantes
das três cepas foram obtidos após centrifugação a 12.000 rpm. Em seguida, eles foram diluídos e a
quantificação de GXM foi realizada por ELISA com anticorpo anti-GXM. Os valores obtidos foram
normalizados pelo número de células contados em câmara de Neubauer.
51
Correlação entre a síntese de GlcCer e expressão capsular:
Para confirmar a correlação entre a síntese de GlcCer e a expressão capsular
em C. neoformans tratamos os fungos da cepa T
1
444 com um inibidor da síntese de
CMH e analisamos o tamanho capsular por citometria de fluxo utilizando anticorpos
anti-GXM. O inibidor usado (t-PDMP) age na enzima glucosilceramida transferase
impedindo a transferência de glucose para a ceramida. Pudemos observar que, quando
fizemos o tratamento com o inibidor, houve um deslocamento do pico de
fluorescência para a esquerda em relação às células tratadas com o análago inativo (e-
PDMP). Isso indica uma menor marcação das células com o anticorpo anti-GXM, ou
seja, uma cápsula reduzida em comparação com as células tratadas com o análago
inativo (Figura 10).
Figura 10. Análise das células tratadas com inibidor de síntese de GlcCer ou seu análogo inativo
quanto a quantidade de antígeno capsular. As células (10
4
) foram cultivadas em meio quimicamente
definido e tratadas com t-PDMP ou e-PDMP (40 µM) por 48 h. Após esse período, as células foram
lavadas e incubadas sob as mesmas condições por mais 48 h. Posteriormente, foram fixadas com
paraformaldeído 4%, bloqueadas com PBS-BSA e marcadas com anticorpo anti-GXM. Como
anticorpo secundário, foi utilizado anti-mouse conjugado à FITC. As células foram, finalmente,
analisadas por citometria de fluxo. O controle foi feito como descrito acima exceto pela incubação com
anticorpo anti-GXM.
52
Análise do tamanho capsular por microscopia eletrônica:
As células fúngicas tratadas com o inibidor de síntese de CMH foram
analisadas por microscopia eletrônica de transmissão. Conforme observado na Figura
11, as leveduras tratadas com o análogo ativo do PDMP aprsentaram uma cápsula
significativamente reduzida quando comparada com o tratamento do fungo na
presença do análogo inativo. Também foi observado um aumento na distância entre a
parede celular e cápsula do fungo tratado com t-PDMP. As estruturas celulares
internas parecem morfologicamente mantidas, o que sugere a presença de células
viáveis nos dois sistemas de tratamento.
Figura 11. Análise ultraestrutural de C. neoformans tratados com t-PDMP e e-PDMP. Os fungos
(T
1
444) foram tratados com e-PDMP (A e B) ou t-PDMP (C, D e E) na concentração final de 40µM e,
em seguida, lavados e fixados. Posteriormente, as células foram lavadas e removidas das placas. As
células foram pós-fixadas e desidratadas, sendo em seguida incluídas na resina. O material foi
observado em um microscópio de transmissão Zeiss 900. Barra de escala representa 0,5 µm.
53
Análise de esterol presente nas vesículas obtidas de H99,
gcs1 e rec
gcs1:
De acordo com resultados prévios do nosso laboratório, as vesículas
produzidas e secretadas por C. neoformans contém como um de seus principais
lipídeos o ergosterol (Rodrigues e, al., 2007). Por esse motivo decidimos quantificar
relativamente as vesículas através da dosagem desse lipídeo. Após a obtenção das
vesículas das três cepas, os lipídeos totais foram extraídos com solventes orgânicos e
os esteróis resolvidos por HPTLC e quantificados por densitometria.
O resultado mostra que o esterol foi detectado nas preparações de vesícula das
três cepas aparentemente na mesma quantidade (Figura 12). Esse resultado indica que
o mutante não é deficiente na produção de vesículas extracelulares, mas,
provavelmente, no endereçamento de GXM para o interior delas.
Figura 12. Análise de esterol presente nas vesículas secretadas por C. neoformans:
Vesículas obtidas após centrifugações diferenciais, das cepas H99 (a), gcs1 (b) e rec gcs1 (C)
foram submetidas à extração lipídica por solventes orgânicos. Após partição de Folch (1957), a fase
inferior obtida, contendo os lipídeos neutros, foi recuperada e resolvidas em HPTLC utilizando como
sistema solvente uma mistura de hexano-éter-ácido acético (80:40:2 vol/vol/vol). A revelação foi feita
com uma solução contendo 50 mg de FeCl
3
, 90 ml de água, 5 ml de ácido acético e 5ml de ácido
sulfúrico. Os volumes aplicados nas placas foram definidos de acordo com o número de células obtido
inicialmente. Como controle positivo utilizamos ergosterol, ausente na figura.
54
Quantificação de GXM nas vesículas obtidas de H99,
gcs1 e rec
gcs1:
As vesículas obtidas das três cepas foram analisadas quanto ao conteúdo de
GXM. Para tal utilizamos a detecção da GXM pelo método de ELISA utilizando
anticorpos anti-GXM. O resultado obtido foi normalizado de acordo com o número de
células. Observamos que o mutante foi o que menos apresentou GXM nas vesículas
(Figura 13). Ou seja, apesar de produzir vesículas, fato confirmado pela presença de
esterol e pelas análises de “light scattering” demonstradas adiante, o mutante não
endereça a mesma quantidade de GXM para o meio extracelular. Isso poderia então
estar associado ao reduzido tamanho capsular. A cepa reconstituída apresentou
também uma quantidade reduzida de GXM em relação à cepa selvagem. Porém essa
quantidade foi muito superior àquela encontrada nas vesículas do mutante.
Figura 13. Quantificação de GXM nas vesículas secretadas pelas diferentes cepas de C.
neoformans Vesículas obtidas por centrifugações diferenciais das cepas H99 (azul), gcs1 (verde) e
rec gcs1 (preto), foram analisadas quanto à concentração de GXM por ELISA com anticorpos anti-
GXM.
55
Análise do tamanho das vesículas por light scatering:
As vesículas das cepas H99, gsc1 e rec gsc1, obtidas conforme descrito
anteriormente, foram ressuspendidas em 3 ml de PBS e analisadas quanto ao seu
tamanho pela técnica de “light scattering”. Conforme podemos observar na Figura 14,
um número maior de vesículas com diâmetro reduzido foi produzido e secretado pelo
mutante incapaz de sintetizar CMH. Embora a cepa reconstituída também apresente
um número maior de vesículas de tamanho reduzido, o nível de expressão pode ser
diferente nessa cepa. Também na cepa reconstituída observamos um aumento no
diâmetro das vesículas maiores, que também pode estar associado a um controle
diferenciado na expressão do CMH.
Figura 14. Análise por light scattering do tamanho das vesículas obtidas por centrifugações
diferenciais das cepas H99, gcs1 e rec gcs1. O tamanho das vesículas obtidas das três cepas foi
mensurado por QELS em um Analisador multi-ângulo de tamanho de partículas 90Plus/BI-MAS
(Brookhaven
Instruments Corp., Holtsville, NY).
56
B) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos endocíticos
Envolvimento dos GSL de RAW264.7 na associação e internalização da GXM :
Estudos recentes mostraram que certos microrganismos como B. subtilis e S.
aureus, bem como o LPS podem modular a expressão de um GSL identificado como
GM1 em linfócitos T (De Libero et al., 2005). Além disso, essa regulação pode induzir
uma morte celular pelo mecanismo de apoptose (Sohn et al., 2006). Nesse contexto,
decidimos avaliar se a GXM estaria influenciando a expressão dos GSL na linhagem
RAW 264.7. Para tal, fizemos uma imunofluorescência com a finalidade de observar
a distribuição dessas moléculas na superfície das células RAW264.7 após tratamento
com o polissacarídeo (10 µg/ml) por tempos curtos (30 min e 2 h). Utilizando
anticorpos anti-GM1, observamos em 30 min de interação com a GXM que o
gangliosídeo em questão encontrava-se distribuído por toda a superfície celular. O
mesmo foi observado quando procedemos a interação com a GXM por 2 h (Figura
15). Não foram observadas diferenças significativas na distribuição dos gangliosídeos
comparando os tempos utilizados de interação do polissacarídeo com o macrófago.
Figura 15. Distribuição de GM1 e GD1a nas células RAW 264.7 após tratamento com GXM.
As células foram incubadas com GXM (10µg/ml por 30 minutos ou 2 horas), em seguida foram
permeabilizadas, fixadas e bloqueadas. Foram feitas, então, incubações com os anticorpos anti-GM1 e
30 min
30 min
2h
2h
Controle
Anti
-
GM1
Anti
-
GD1a
57
anti-GD1a seguido de incubações com anticorpo anti-camundongo FITC. As mesmas condições foram
usadas no controle na ausência de anticorpos anti-GM1 e anti-GD1a.
Regulação da expressão de glicoesfingolipídeos por GXM em macrófagos:
Durante a infecção a GXM é secretada constantemente no hospedeiro. Isso faz
com que essa molécula esteja permanentemente em contato com as células desse
hospedeiro por períodos longos, onde é normalmente internalizada (Barbosa et al.,
2006). Como no resultado acima não observamos modificações na expressão de GSL
quando tratamos os macrófagos por períodos curtos (30 min e 2 h), resolvemos avaliar
se mudanças na expressão dos GSL ocorreriam quando o polissacarídeo era deixado
em cultura por tempos maiores. Para isso, as células foram então incubadas na
presença de GXM (50 µg/ml) por 2 dias, e o perfil dos GSL avaliado por
cromatografia em camada fina. Observamos em nossos resultados uma alteração na
expressão de GSL na presença da GXM (Figura 16).
Figura 16. Regulação da expressão de glicoesfingolipídeos de RAW264.7 por GXM. A interação de
RAW 264.7 com GXM (50 µg/ml) foi feita por 2 dias, seguida de extração de lipídeos e avaliação por
cromatografia em camada fina (A). A quantificação das bandas foi feita através do programa Scion
Image (B). A quantificação das bandas das regiões 1, 2, 3 e 4 é mostradas em B. Padrão de
gangliosídeos de cérebro bovino.
Os dados obtidos na figura 16 foram repetidos e diferentes concentrações de
GXM utilizadas. Como podemos observar na Figura 17, a GXM é capaz de modular a
expressão de GSL acídicos de maneira dose-dependente (Figura 18). A expressão
máxima foi observada na concentração final de 50 µg/ml. Em concentrações maiores
58
de GXM acredita-se que o polissacarídeo seja capaz de agregar e alterar suas
propriedades (Nimrichter et al., 2007). Observamos que os glicoesfingolipídeo
regulados eram os que apresentavam migração similar ao GD1a e ao GM1
apresentando maior expressão (Figura 16).
Figura 17. Regulação da expressão de glicoesfingolipídeos de RAW264.7 por GXM em diferentes
concentrações. A interação de RAW 264.7 com GXM (1, 10 e 50 µg/ml) foi feita por 2 dias, seguida de
extração de lipídeos e avaliação por cromatografia em camada fina (A). A quantificação das bandas foi
feita através do programa Scion Image (B). A quantificação das bandas é mostradas em B.
Figura 18. Confirmação da regulação dose-dependente da expressão de glicoesfingolipídeos de
RAW264.7 por GXM. O gráfico representa os valores obtidos através da quantificação das bandas
observadas na Figura 17 frente à concentração de GXM usada.
59
Identificação dos gangliosídeos expressos em RAW 264.7:
Após demonstrar o aumento da expressão de GSL sialilados nas células RAW
264.7 tratadas com GXM, partimos para a identificação dessas moléculas. De acordo
com o rf de cada uma delas suspeitávamos da presença de GM1 e GD1a como
principais GSL acídicos nesses macrófagos. Para tal, as células foram mais uma vez
tratadas com GXM (50 µg/ml) por 48 h. Após esse período os lipídeos foram obtidos
e resolvidos por cromatografia em camada fina. As placas foram expostas a dois
anticorpos diferentes, anti-GM1 e anti-GD1a. O resultado da Figura 19 mostra um
aumento na expressão de GM1 e, principalmente de GD1a .
Figura 19. Identificação de GSL expressos por RAW264.7 e regulados por GXM. A interação de
RAW 264.7 com GXM (50 µg/ml) foi feita por 2 dias, seguida de extração de lipídeos e por
cromatografia em camada fina. A placa (C) foi revelada com reagente resorcinol sulfúrico enquanto a
placa (B) foi exposta primeiramente ao anticorpo anti-GM1 e a placa (A) foi exposta primeiramente ao
anticorpo anti-GD1a. As placas (A) e (B) foram posteriormente incubadas com anticorpo anti-mouse
peroxidase e reveladas com DAB e H
2
O
2
.
Análise da preparação de GXM quanto à contaminação por endotoxina:
A GXM é uma macromolécula que compartilha vários aspectos funcionais
com o LPS bacteriano, incluindo afinidade por receptores na célula hospedeira e
padrões de resposta (Levitz, 1994; Shoham et al., 2001; Barbosa et al., 2006). De fato,
conforme descrito anteriormente, o LPS é capaz de aumentar a expressão de certos
gangliosídeos em linfócitos (De Libero et al., 2005). Esses fatos nos levaram a avaliar
a presença desse componente microbiano como contaminante em nossas amostras de
polissacarídeo. De acordo com o teste de LAL as amostras se mostraram positivas
para a presença de LPS. Entretanto, a presença de LPS em nossas amostras foi
considerada incerta, já que polissacarídeos fúngicos são capazes de gerar resultados
falsos positivos no teste de LAL (Miyazaki et al., 1995).
60
Por esse motivo resolvemos remover os posíveis contaminantes de nossas
amostas utilizando uma coluna de polimixina B. Para padronização do método, um
volume de 10 ml de uma solução de GXM (0,33 µg/ml) foi aplicada em coluna de
polimixina B. Houve perda de 2 ml após a passagem da solução na coluna restando,
então, 8 ml (80% do valor inicial). Procedemos a quantificação do polissacarídeo total
em solução, pelo método de ELISA, antes da passagem pela coluna (2,64 mg) e
depois (0,933 mg). Observamos, portanto, que recuperamos somente 35% da amostra
em relação ao volume recuperado inicialmente (80%), o que leva à perda de
aproximadamente 45% de GXM. Esses resultados foram resumidos na Tabela 1 e
mostraram que a GXM apresenta alta capacidade de ligação à resina, o que
impossibilitou, em nosso modelo, o uso da coluna de polimixina B para retirada de
endotoxina de amostras de GXM.
Tabela 1. Quantificação de GXM antes e depois da passagem da amostra em coluna
de polimixina B.
Diante da impossibilidade de uso da polimixina B como agente removedor de
possíveis contaminações por LPS em amostras de GXM e dos problemas técnicos na
utilização do teste de LAL resolvemos testar a presença de LPS em todos os materiais
e solventes utilizados para diluição de amostras, preparo de meios e tampões. Em
todas as situações, os resultados foram negativos, o que nos faz acreditar que
trabalhamos em condições livres de contaminações por endotoxina.
61
Discussão:
Nesse estudo, investigamos a importância de GSL em duas frentes.
Analisamos, primeiramente, a importância da GlcCer na secreção da GXM, o
principal fator de virulência desse fungo, no meio extracelular. Paralelamente,
iniciamos os estudos para o entendimento da internalização da GXM por células
hospedeiras e o efeito deste polissacarídeo na expressão de gangliosídeos por essas
células.
A) Secreção de GXM
A elucidação de um mecanismo eficiente e ainda não descrito de secreção de
moléculas para o meio extracelular em C. neoformans levou a um grande avanço no
estudo da patogênese deste microrganismo. Análises de microscopias e a descoberta
de vesículas no sobrenadante de cultivo desse fungo levaram a crer que a secreção de
diversas moléculas, incluindo aquelas presentes na cápsula, seria através de um
transporte vesicular, o que permitiria a passagem através de estruturas complexas
como a parede celular fúngica e a cápsula já formada (Rodrigues et al., 2007;
Nosanchuk et al., 2008; Rodrihues et al., 2008; De Jesus et al., 2009). Após a chegada
de vesículas contendo GXM no espaço extracelular, essas se romperiam deixando a
GXM livre, que seria então utilizada para crescimento capsular (Nimrichter et al.,
2007).
Analisando a composição lipídica das vesículas de C. neoformans, nosso
grupo demonstrou a presença de GlcCer como componente lipídico. Em paralelo,
Rittershaus e colaboradores (2006), utilizando como ferramenta um mutante em
ceramida glucosil transferase, enzima que catalisa o primeiro passo na biossíntese de
glicoesfingolipídeos, associaram a presença de CMH à sobrevivência extracelular de
C. neoformans. Este lipídeo, portanto, passou a ser considerado uma molécula
essencial para a colonização inicial do pulmão e um importante regulador de
virulência.
Baseados na importância do CMH e na presença desta molécula nas vesículas
decidimos avaliar a correlação entre este lipídeo e a secreção de GXM. Para isso,
inicialmente, tentamos associar o tamanho da cápsula com a presença desse lipídeo.
Três diferentes cepas de C. neoformans: H99 (selvagem), gcs1 (mutante em GlCer)
e rec gcs1 (reconstituída) foram cultivadas em meio de indução do crescimento
62
capsular seguido da análise por microscopia óptica do tamanho das cápsulas. A
cápsula da cepa mutante mostrou-se bastante reduzida em comparação com as outras
cepas (Figura 8). Com este resultado pudemos correlacionar a ausência do CMH com
a redução do tamanho da cápsula polissacarídica de C. neoformans. Porém, algumas
questões permaneciam em aberto. Ainda não era possível saber, por exemplo, se o
tamanho reduzido da cápsula observado em gcs1 era devido a uma falha genérica
em processos secretórios ou simplesmente uma deficiência na incorporação de GXM
pelas vesículas destinadas para o transporte do polissacarídeo.
O conteúdo de GXM no meio de cultivo e em frações vesiculares foi reduzido
nas células incapazes de sintetizar CMH. Entretanto, análises cromatográficas
revelaram que o conteúdo total de esterol nas frações vesiculares foi similar em todas
as células estudadas. Esses resultados sugerem que as células mutantes mantém
funcionais os seus mecanismos de secreção vesicular, apesar de apresentarem cápsula
e conteúdo de GXM secretada diminuídos. Essas observações apontam para um
envolvimento dos CMHs na incorporação de GXM por vesículas secretórias, o que
pode, de acordo com a literatura, regular os mecanismos principais de patogênese do
C. neoformans.
Para garantir que era realmente a ausência de CMH que alterava a secreção de
GXM, e não algum efeito secundário que a mutação poderia gerar, analisamos o
efeito de um inibidor da glucosilceramida sintase, o PDMP sobre células selvagens.
Nossas análises por citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão
confirmaram os dados ultilizando células mutantes, revelando claramente que a
deficiência na síntese de CMH afeta diretamente a expressão de componentes
capsulares.
Conforme descrito por Albuquerque e colaboradores (2008), vesículas
fúngicas extracelulares que não contém CMH apresentam tamanho reduzido,
sugerindo uma participação do lipídeo na compactação e estabilização de vesículas.
Em estudos já publicados pelo nosso grupo foram descritas diferenças morfológicas
significativas entre as vesículas secretadas por C. neoformans (Rodrigues et al.,
2008), o que pode estar associado a mecanismos seletivos de distribuição de
componentes destinados à via secretória. Nesse sentido, utilizamos a técnica de
dispersão dinâmica da luz para avaliar o tamanho das vesículas das cepas selvagem,
mutante e reconstituída. Conforme discutido anteriormente a cepa que não produz
63
CMH possui um porcentual maior de vesículas menores, embora a média não seja tão
distinta das demais cepas. Por outro lado, a cepa recombinante onde a expressão e
regulação na síntese de CMH pode ser maior do que aquela observada na selvagem,
possui vesículas de tamanho maior (Figura 14). Esses dados podem sugerir que o
CMH participa diretamente no controle do tamanho das vesículas secretadas, o que
poderia estar associado a incorporação de diferentes componentes pelas vesículas
secretórias.
A maioria dos resultados obtidos nesse trabalho podem ser justificados através
das características estruturais presentes no CMH. Por ser um glicoesfingolipídeo essa
molécula pode se localizar em microdomínios de membrana. Conforme discutido
anteriormente, esses microdomínios podem ser importantes na formação das vesículas
e, em fungos, as mesmas levariam a formação de vesículas mais compactas, estáveis e
resistentes. Essas características podem ser cruciais na passagem das vesículas pelo
ambiente polar e complexo da parede celular. Em análises futuras pretendemos avaliar
com maiores detalhes a influência dos domínios de membrana na formação
(biogênese) das vesículas de C. neoformans bem como em sua composição.
B) GXM e GSL
C. neoformans deve ser capaz de interagir com diversas células para
estabelecer uma infecção bem sucedida. Entre estas, os fagócitos são de especial
importância, já que, como C. neoformans é um patógeno intracelular facultativo, eles
podem representar tanto um benefício quanto um obstáculo para patogênese
microbiana. Já se sabe que C. neoformans é capaz de sobreviver dentro de fagócitos
devido a diversos fatores de virulência. Além disso, um estudo recente mostrou que
este fungo pode ser, ainda, expelido por macrófagos. Após este evento, ambos, o
fungo expelido e o macrófago hospedeiro, permanecem íntegros e capazes de
proliferar. Este processo pode representar um importante mecanismo pelo qual C.
neoformans escaparia das células fagocíticas sem levar à morte da célula hospedeira,
evitando assim que ocorra inflamação no local. Alternativamente, essa integração
pode fazer com que o macrófago funcione como um carreador (um “cavalo de Tróia”)
do fungo sem que o mesmo seja reconhecido por outras células de defesa (Alvarez &
Casadevall, 2006).
64
Independente do modelo estudado, a internalização de C. neoformans ocorre
após a adesão do seu fator de virulência principal, a cápsula polissacarídica, a
receptores presentes na superfície das células hospedeiras. Porém o mecanismo pelo
qual o fungo é internalizado ainda não é totalmente conhecido. Alguns receptores para
GXM vêm sendo estudados. Em diferentes modelos, foram caracterizados como
receptores para esse polissacarídeo as moléculas TLR-2, TLR-4, CD14 e CD18
(Shoham et al., 2001; Levitz, 2002). Recentemente, nosso grupo demonstrou que o
CD14 funciona como receptor para GXM nas células do epitélio alveolar A549
(Barbosa et al., 2006). Neste contexto, nossos objetivos se voltaram para tentar
esclarecer a forma pela qual ocorre a ligação e internalização da GXM, seu
polissacarídeo majoritário, por macrófagos. Posteriormente pretendemos estudar esse
mecanismo em outros tipos celulares.
A presença de domínios enriquecidos em GSL na membrana vem sendo
relacionada com a endocitose em diversos microrganismos como, por exemplo, a
bactéria Brucella (Watarai et al., 2002), e o protozoário Leihmania chagasi
(Kenworthy, 2002). Nestes casos específicos ainda pode-se citar a influência dos
domínios lipídicos sobre o destino intracelular dos patógenos. Dependendo da forma
pela qual os microrganismos são endocitados, a resposta celular hospedeira pode ser
diferente e resultar na morte ou sobrevivência do patógeno. Essa resposta é
reconhecidamente dependente da cascata de sinalização iniciada após a interação com
os patógenos ou moléculas por eles secretadas. A correlação entre domínios de
membrana e adesão/internalização de C. neoformans foi levantada pelo nosso grupo e
poderia estar associada com uma resposta muito mais ampla gerada pela constante
secreção da GXM em indivíduos infectados por C. neoformans. Diferentes artigos na
literatura sugerem que a GXM modula negativamente a resposta de células do sistema
imune, muito embora pouco se saiba com relação aos mecanismos iniciais desses
processos. Como os receptores já caracterizados para GXM podem ser moléculas
enriquecidas em domínios de membrana, como o CD14, e receptores do tipo toll,
como o TLR4 e TLR2, que pode ser recrutado para os mesmos domínios após
interação com estruturas produzidas por microrganismos (Olsson & Sunler, 2006), é
possível que a GXM use essas plataformas para a entrada na célula hospedeira e assim
module a resposta celular. O LPS, por exemplo, possui receptores em comum com a
GXM na superfície de células hospedeiras, é capaz de controlar a resposta celular
65
através da interação e modificação na composição de moléculas presentes em
domínios de membrana (Olsson & Sunler, 2006).
Diante dessas informações decidimos avaliar a distribuição de gangliosídeos
na superfície de macrófagos após o tratamento dos mesmos com GXM. O tamanho
desse polissacarídeo, associado com a possível multivalência dessa estrutura nos
levaram a crer que observaríamos uma reorganização desses GSLs na superfície dos
macrófagos. No entanto, nossos resultados revelaram que em um período de até duas
horas, tempo suficiente para que a GXM seja internalizada, não houve uma
redistribuição dessas moléculas. A reatividade com anticorpos anti-GM1 e anti-GD1a
foi similar em todos os experimentos realizados na presença de GXM (Figura 15). No
entnato, esses resultados não nos possibilitem descartar uma modificação dos
componentes estruturais presentes nos domínios de membrana a nível protéico.
Como descrito anteriormente, ao sofrer algum estímulo extracelular a célula
do hospedeiro pode recrutar algumas moléculas para dentro de domínios lipídicos a
fim de facilitar ou mesmo regular a endocitose. Conforme descrito anteriormente, De
Libero e colaboradores (2005) mostraram que o tratamento de APC com LPS pode
influenciar a expressão de GSL nessas células. Nesse trabalho foi observado um
aumento na síntese de GSL incluindo o marcador de domínios de membrana GM1.
Baseando-se neste trabalho e no fato de o LPS compartilhar alguns receptores com a
GXM, como o TLR2 e TLR4, fomos avaliar se este polissacarídeo seria capaz de
modular de alguma forma a expressão de certos GSL na célula hospedeira. Após
interação de 48 h com a GXM, os macrófagos foram submetidos à extração de
lipídeos e o perfil destas moléculas foi avaliado. Observamos que o tratamento de
macrófagos com a GXM por um período de dois dias alterou a expressão de GSL em
relação ao controle (Figura 16). Além disso, demonstramos também que o evento
acima relatado ocorre de forma dose dependente, ou seja, aumentando-se a
concentração de GXM a interagir com macrófagos, a quantidade dessas estruturas
também aumentava (Figura 17 e Figura 18). Os resultados acima nos levam a crer que
a GXM pode promover o aumento da expressão ou a redução das vias de degradação
de certas moléculas na superfície da célula hospedeira. Além disso, não podemos
eliminar a possibilidade de que essas moléculas possam estar relacionadas com a
reorganização de domínios de membrana e, conseqüentemente, com a endocitose do
polissacarídeo e da sua participação na modulação da resposta celular.
66
Usando como ferramenta anticorpos anti-gangliosídeos específicos (GM1 e
GD1a) prosseguimos nosso estudo com a tentativa de identificação dos GSL que
tiveram sua reciclagem ou expressão alterada pela interação com a GXM. Pela técnica
de “immunostaining” identificamos que os dois principais GSL expressos por
macrófagos eram encontrados em concentrações maiores que nos controles (Figura
19). Dessa forma demonstramos que a presença da GXM por períodos maiores, fato
corrente em indivíduos com criptococose, é capaz de modular a quantidade de GSLs
nas células hospedeiras e isso poderia participar da regulação da resposta celular.
Uma vez que os GSL estão envolvidos com diferentes eventos celulares, esses
resultados nos abrem uma gama de possibilidades a serem estudadas no futuro.
Como o LPS de bactérias Gram negativas compartilha diversas características
com a GXM como, receptores na célula hospedeira (Shoham et al., 2001; Levitz,
2002; Barbosa et al., 2006) e modulação de expressão de gangliosídeos (De Libero et
al., 2005), avaliamos nossos sistemas quanto a presença deste contaminante. Baseado
na coagulação de amebócitos (células sanguíneas) do caranguejo Limulus
polyphemus, o teste de LAL é bastante sensível e por isso largamente utilizado para
detecção de endotoxina (Levin et al., 1970; 1972). A solução de GXM testada
apresentou positividade para endotoxina, porém, para este polissacarídeo, o uso deste
ensaio não representa definitivamente contaminação, já que β-glucanas de fungos
podem produzir um resultado falso positivo (Miyazaki et al., 1995).
Alternativamente, passamos nossas amostras em uma coluna de polimixina B para
assim eliminar qualquer molécula de LPS presente. Observamos que ao passar a
GXM pela coluna tivemos uma perda de 45% de polissacarídeo demonstrando que o
polissacarídeo também se ligava a polimixina B, competindo, assim, com o LPS que
poderia estar presente na amostra. No contexto funcional do uso da coluna de
polimixina devemos considerar que essas duas moléculas são bastante similares
apresentando cargas negativas similares. O método da coluna de polimixina B,
portanto, mostrou-se ineficaz e não deve ser usado para eliminar contaminantes de
amostra de GXM.
Como observado, é um desafio encontrar um método eficiente de análise
quanto à presença de LPS em amostras de GXM, entretanto, estamos confiantes que
os resultados de regulação de gangliosídeos obtidos não são produtos de
contaminação pelos seguintes motivos: (i) uso de água apirogênica para preparo de
67
meios de cultura e soluções; (ii) uso de materiais plásticos descartáveis livres de LPS
e materiais de vidro após tratamento para eliminação de endotoxinas; (iii) e, por
útimo, precauções extremas foram tomadas durante todas as fases do estudo para
manter condições livres de LPS.
Em conjunto nossos resultados sugerem que gangliosídeos podem influenciar
na associação de C. neoformans a macrófagos e na sua subseqüente endocitose, e
ainda, a GXM secretada pode modular a expressão desses glicolipídeos. A regulação
da expressão de gangliosídeos pode estar relacionada com efeitos modulatórios da
GXM nos macrófagos, tópico sob investigação em nosso laboratório.
C) Considerações finais
Com os resultados obtidos neste estudo, propomos um modelo
correlacionando a secreção de GXM por C. neoformans e o impacto desse processo
em mecanismos de crescimento capsular e distribuição do polissacarídeo em células
hospedeiras (Figura 19). Dentro desse modelo, os GSL mostraram-se essenciais em
dois fenômenos distintos: (i) o endereçamento da GXM para vesículas de C.
neoformans, o que conseqüentemente afeta a secreção do polissacarídeo e o
crescimento capsular e (ii) na endocitose da GXM por macrófagos, possivelmente
envolvendo a participação de “lipid rafts”.
68
Figura 19. Esquema de secreção e endocitose de GXM. O polissacarídeo é sintetizado por C.
neoformans e endereçado para vesículas. Nesta etapa o CMH parece desempenhar um papel crucial. As
vesículas, então, atravessam a parede celular e a cápsula já formada para chegada ao meio extracelular
onde se rompem. A GXM liberada é utilizada pelo fungo para crescimento capsular por agregação das
fibras. Durante a infecção, C. neoformans produz e secreta GXM constantemente, o que faz com que
este polissacarídeo entre em contato com células do sistema imune. Em macrófagos esta interação
parece levar a uma alteração na reciclagem ou na expressão de certos gangliosídeos como GM1 e
GD1a presentes na membrana. Hipoteticamente, esta regulação lipídica pode ajudar na formação dos
domínios lipidicos que facilitariam a endocitose do polissacarídeo e participariam na regulação da
resposta do hospedeiro.
69
Conclusões:
A) Papel dos glicoesfingolipídeos em processos secretórios em células
fúngicas
- A cepa gcs1 mostrou-se menos eficiente em responder ao sistema de
indução de cápsula;
- O conteúdo de GXM no meio de cultivo e em frações vesiculares foi reduzido
nas células incapazes de sintetizar CMH. Entretanto, análises cromatográficas
revelaram que o conteúdo total de esterol nas frações vesiculares foi similar
em todas as células estudadas.
- Análises por citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão em
células tratadas com PDMP confirmaram os dados utilizando células mutantes,
revelando que a deficiência na síntese de CMH afeta diretamente a expressão
de componentes capsulares.
- A cepa que não produz CMH possui um porcentual maior de vesículas
menores, embora a média não seja tão distinta das demais cepas.
B) Papel da GXM na modulação da expressão de gangliosídeos em células
hospedeiras
- Tratando macrófagos com GXM por um período de até duas horas, não
observamos uma redistribuição de GM1 e GD1a na superfície.
- O tratamento de macrófagos com a GXM por um período de 48 h alterou a
expressão de GSL. Esse evento ocorreu de forma dose dependente,
- Os dois principais GSL expressos por macrófagos (GM1 e GD1a) foram
encontrados em concentrações maiores que nos controles quando tratamos as
células com GXM.
70
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