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Paulo Bentes de Carvalho Neto
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO SISTEMA FAS/FASL
EM PACIENTES PORTADORES DE CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE BOCA E OROFARINGE
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós - Graduação em Ciências da
Saúde do Hospital Heliópolis –
HOSPHEL para obtenção do Título
de Mestre em Ciências da Saúde.
São Paulo
2009
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ii
Paulo Bentes de Carvalho Neto
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO SISTEMA FAS/FASL
EM PACIENTES PORTADORES DE CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE BOCA E OROFARINGE
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós - Graduação em Ciências da
Saúde do Hospital Heliópolis –
HOSPHEL para obtenção do Título
de Mestre em Ciências da Saúde.
Área de concentração: Cirurgia de Cabeça e Pescoço
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Madeira Álvares da Silva
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Maria da Cunha Mercante
São Paulo
2009
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iii
Dedicatória
Aos meus Avós Paulo Bentes de Carvalho (In Memorian) e Pedro Nolasco
Buarque de Gusmão Filho (In Memorian) pelo caráter, dignidade, por serem
exemplos de vida...
À minha Esposa Viviane, pelo amor e cumplicidade ao longo desses anos
juntos...
Aos meus Pais Paulo e Ana, pelo exemplo de simplicidade, dignidade e amor
incondicional, pela minha formação pessoal e profissional... devo tudo a eles...
Ao meu Irmão Rafael, pelo amor, amizade e carinho... por toda vida...
À minhas Avós Eunice e Dulce, pelo carinho e dedicação ao longo da minha
vida...
iv
Agradecimentos
À Profa. Dra. Adriana Madeira Álvares de Silva, minha orientadora, pelo seu
exemplo de garra, seus ensinamentos, confiança, parceria e apoio para a
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcos Brasilino de Carvalho, pelo seu exemplo de ética,
sabedoria e amizade durante minha formação na especialidade.
À Profa. Dra Ana Maria da Cunha Mercante, pela valiosa colaboração nas
análises histopatológicas.
À Rossana Verónica Mendoza Lopez, da Epidemiologia da USP, pela
importante ajuda na análise estatística.
Ao Prof. Dr. Abrão Rapoport, Coordenador do curso de Pós-Graduação do
Hospital Heliópolis, pela oportunidade de crescimento acadêmico.
Ao Prof. Dr. Carlos Neutzling Lehn, Chefe do Departamento de Cirurgia de
Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia, pelos ensinamentos durante a
residência e o curso de pós-graduação.
Ao Corpo Docente e funcionários do Curso de Pós-Graduação, pelo apoio e
dedicação.
Ao Corpo Clínico do Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e
Otorrinolaringologia, pela minha formação na especialidade.
Ao Departamento de Patologia do Hospital Heliópolis, pela ajuda fundamental
neste trabalho.
Aos alunos Viviane Priscila Pina dos Santos, Roberta Lelis Dutra, Jáfia Lacerda
Alves, Diana Gazito, Marcelo dos Santos, Jean Tetsuo Takamori e a todos que
v
fazem do Laboratório de Biologia Molecular do Hospital Heliópolis um local
especial.
Aos grandes amigos Ivo Marquis Bezerra Junior e Valéria, Paulo Hypacio
Espinola e Marcela, pela amizade e companheirismo na vida em São Paulo.
Aos meus Tios e Tias, Primos, Sogros e Cunhados por todo apoio e confiança
em todas as etapas da minha vida.
vi
SUMÁRIO
Dedicatória......................................................................................................... iii
Agradecimentos................................................................................................. iv
Lista de Figuras................................................................................................ viii
Lista de Tabelas................................................................................................. ix
Lista de Abreviações......................................................................................... xi
Lista de Nomenclaturas.................................................................................... xiii
Resumo............................................................................................................ xiv
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 1
2 OBJETIVOS..................................................................................................... 4
3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 6
3.1 Apoptose e Câncer....................................................................................... 7
3.2 Genes FAS e FASL...................................................................................... 8
3.3 Sistema FAS/FASL e prognóstico.............................................................. 12
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS........................................................................... 15
4.1 Casuística................................................................................................... 16
4.2 Perfil da amostra......................................................................................... 17
4.3 Material....................................................................................................... 18
4.4 Métodos...................................................................................................... 19
4.4.1 Extração DNA.......................................................................................... 19
4.4.2 Reação em cadeia da polimerase........................................................... 20
4.4.3 Digestão com Enzimas de Restrição....................................................... 21
vii
4.4.4 Forma de análise dos resultados............................................................. 21
4.4.5 Imuno-histoquímica.................................................................................. 25
4.4.6 Forma de análise dos resultados............................................................. 27
4.5 Análise Estatística....................................................................................... 28
4.6 Aspectos éticos........................................................................................... 29
5 RESULTADOS............................................................................................... 30
5.1 Estudo dos polimorfismos nos genes FAS e FASL.................................... 31
5.2 Relação dos polimorfismos dos genes FAS e FASL com a expressão das
proteínas FAS e FASL...................................................................................... 33
5.3 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis clínicas,
histopatológicas e prognóstico.......................................................................... 34
5.3.1 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis clínicas......... 34
5.3.2 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis histopatológicas
.......................................................................................................................... 37
5.3.3 Expressão do gene FAS e FASL e relação com prognóstico.................. 38
6 DISCUSSÃO.................................................................................................. 42
7 CONCLUSÕES.............................................................................................. 50
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 52
Abstract
Apêndices
viii
Lista de Figuras
Figura 1 – Visualização da reação de PCR em gel com a amplificação dos
fragmentos dos genes FAS e FASL................................................................. 21
Figura 2 – Sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição MvaI......... 22
Figura 3 – Gel com o resultado da reação de digestão do fragmento de 331pb
do gene FAS..................................................................................................... 23
Figura 4 – Sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição BseMI....... 23
Figura 5 – Gel com o resultado da reação de digestão do fragmento de 401pb
do gene FASL................................................................................................... 24
Figura 6: Curva de sobrevida livre de doença e expressão do FAS................ 38
Figura 7: Curva de sobrevida especifica e a expressão do FAS..................... 40
Figura 8: Curva de sobrevida especifica e a expressão do FASL................... 40
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Perfil da Amostra............................................................................ 17
Tabela 2 – Distribuição dos pacientes por sítios e subsítios............................ 18
Tabela 3 – Distribuição dos pacientes por estadiamento clínico...................... 18
Tabela 4. Primers utilizados nas reações de PCR........................................... 19
Tabela 5 – Listagem dos anticorpos utilizados no projeto................................ 26
Tabela 6 – Graduação da reação imuno-histoquímica de acordo com a
intensidade........................................................................................................ 27
Tabela 7 – Graduação da reação imuno-histoquímica de acordo com o número
de células coradas............................................................................................ 28
Tabela 8 – Freqüência dos alelos FAS e FASL................................................ 31
Tabela 9: Modelo de regressão logística das variáveis FAS e FASL ajustada
para tabagismo, etilismo, idade e gênero......................................................... 32
Tabela 10: associação entre genótipos do FAS e FASL com sua respectiva
expressão......................................................................................................... 33
Tabela 11: Expressão do FAS e características clínicas.................................. 35
Tabela 12: Modelo de regressão logística segundo a variável FAS................. 35
Tabela 13: Expressão do FASL e características clínicas................................ 36
Tabela 14: Modelo de regressão logística segundo a variável FASL............... 36
x
Tabela 15: Expressão do FAS e FASL e características patológicas............... 37
Tabela 16: Análise multivariada dos fatores de sobrevida livre de doença...... 39
Tabela 17: Análise multivariada dos fatores de sobrevida específica para
doença.............................................................................................................. 41
Lista de Abreviações
A Adenina
C Citosina
CEC Carcinoma espinocelular
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CI Intervalo de confiança
CID Código Internacional de Doenças
DNA Ácido desoxirribonucléico
FADD
Domínio de morte associado ao FAS
FASL FAS ligante
G Guanina
HE Hematoxilina – eosina
HPV Papiloma vírus humano
INCA Instituto Nacional de Câncer
kDa Kilodalton
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
OR
Odds ratio
pb Pares de bases
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
RT-PCR Reação em Cadeia de Polimerase Reversa
SEER Surveillance Epidemiology and End Results
T Timina
TE Tampão
TMA
tissue microarray
TNF Fator de necrose tumoral
xii
TNM Sistema internacional de classificação da extensão do
Tumor, onde “T” representa o tamanho do tumor, o “N”
classifica a metástase linfonodal e o “M” classifica a
metástase à distância
TNRF Família dos receptores do fator de necrose tumoral
xiii
Lista de Nomenclaturas
Mutação Mudança brusca na informação genética
Polimorfismo A ocorrência de dois ou mais genótipos alternativos, quando
a freqüência de cada um deles é superior a 1% da população
Primer
Iniciador da reação de PCR
Promotor Sequência de DNA localizada anteriormente ao gene que
determina sua regulação
xiv
Resumo
Introdução: Os genes FAS e FASL, componentes da grande família do TNF,
fazem parte de uma das vias da apoptose, sendo importantes no controle e
desenvolvimento de vários tipos de neoplasias, em sítios como esôfago,
pulmão e cabeça e pescoço. Objetivo: Correlacionar os polimorfismos FAS –
670A/G e FASL –844T/C com risco de desenvolvimento de carcinoma
epidermóide de boca e orofaringe. Correlacionar os polimorfismos com suas
respectivas proteínas expressas no tumor e relacionar essa expressão com
prognóstico da doença. Método: 250 pacientes portadores de carcinoma
epidermóide de Boca e orofaringe foram comparados com 215 pacientes
controles, avaliados por PCR para identificação dos polimorfismos FAS –
670A/G e FASL –844T/C. Dos pacientes operados, 85 foram avaliados entre si
para correlacionar a expressão da proteína com prognóstico, através de imuno-
histoquímica. Resultados: Não houve diferença significativa entre o grupo de
casos e controles quanto a presença dos polimorfismos FAS –670A/G e FASL
–844T/C (p=0,66 e 0,88, repectivamente). Também não houve relação
significativa entre os genótipos do FAS e FASL com a expressão de suas
proteínas no tumor (p=041 e p=029, respectivamente). A expressão positiva
tanto do FAS como do FASL se mostraram como fatores de proteção contra
recidivas tumorais [OR=0,2 (CI = 0,06-0,7; p=0,01)] e [OR= 0,34 (CI = 0,14-
0,85; p=0,01)], respectivamente. Pacientes com expressão positiva do FAS
apresentaram melhor sobrevida livre de doença (p=0,03) e melhor sobrevida
específica da doença (p=0,008). Conclusão: a presença dos polimorfismos
FAS –670A/G e FASL –844T/C não influenciou no risco de câncer de boca e
orofaringe e na expressão de suas proteínas. Pacientes positivos para as
proteínas FAS e FASL apresentaram uma diminuição do risco de recidiva
quando comparados com pacientes negativos. Concluímos também que
pacientes com expressão positiva do FAS apresentaram melhor sobrevida livre
de doença e melhor sobrevida específica.
INTRODUÇÃO
2
1 – INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas o câncer tem se tornado um problema de saúde
pública mundial. Com o aumento da expectativa de vida e envelhecimento da
população, a incidência global desta doença está aumentando.
Esses dados não são diferentes para os tumores de cabeça e pescoço.
As estimativas mundiais de incidência e mortalidade do câncer da cavidade
oral e orofaringe têm aumentado em ambos os gêneros. (PISANE et al., 2002;
CURADO e MARTINS, 2006).
Os tumores de cabeça e pescoço, pela expressiva incidência e
morbidade, assim como alta mortalidade, constituem relevante preocupação
para a saúde no mundo, particularmente nos países em desenvolvimento. O
Câncer de cabeça e pescoço é representado na sua imensa maioria por
neoplasias epiteliais do tipo carcinoma espinocelular (CEC), também chamado
de carcinoma epidermóide (AMAR et al., 2003; PISANE et al., 2002).
O Carcinoma epidermóide é a neoplasia maligna mais comum das vias
aero-digestivas superiores, ocorrendo em cerca de 90 a 95% dos casos, sendo
a boca e a orofaringe uns dos principais sítios acometidos (AMAR et al., 2003).
As neoplasias localizadas no soalho da boca e língua correspondem a 50% dos
tumores de cabeça e pescoço, enquanto as de orofaringe representam quase
um terço (KENADY et al., 2002).
A prevalência e o prognóstico desse câncer são dependentes de múltiplas
variáveis, como exposição a fatores de risco, estadiamento clínico,
comorbidades, características moleculares do tumor, tratamentos realizados,
entre outros. Pacientes com lesões avançadas determinam um aumento da
taxa de sequelas e deformidades, reduzindo a qualidade de vida dos pacientes,
tornando oneroso seu tratamento e acompanhamento. Esses fatores
caracterizam bem esse tipo de câncer como importante questão de saúde
pública (BERGAMASCO et al., 2008).
Muitos estudos têm ajudado a detectar novos fatores de risco, fatores de
respostas a tratamentos, fatores prognósticos e métodos avançados de
diagnóstico precoce da doença ou da recidiva (INOUE et al.)
3
A biologia molecular chega como importante componente dessa busca. A
pesquisa de fatores genéticos relacionados à suscetibilidade e evolução do
câncer tem facilitado a compreensão das alterações funcionais a nível celular
(INOUE et al., 2005; CHAN et al., 2006).
Os genes FAS e FASL, componentes da grande família do TNF, fazem
parte de uma das vias da apoptose, sendo importantes no controle e
desenvolvimento destas doenças. A apoptose é um processo biológico de
morte celular, que ocorre em diferentes tecidos e organismos, com a função de
manutenção da hemostasia. Evidências sugerem que a regulação anormal da
apoptose contribui na patogênese de várias doença, inclusive o câncer
(ZHANG et al.,2006).
A literatura mundial mostra a relação de polimorfismos dos genes FAS e
FASL com desenvolvimento de vários tipos de neoplasias, em sítios como
esôfago, pulmão, tecido linfóide, cabeça e pescoço, entre outros. A presença
de polimorfismos na região promotora nesses genes, alteram a expressão de
suas proteínas, modificando as suas funções na cascata da apoptose. (ITOH et
al., 1991; SUN et al., 2004).
Em CEC de esôfago e cabeça e pescoço, pacientes que apresentavam
em seu genótipo os polimorfismos FAS –1377G/A, FAS –670A/G e FASL –
844T/C tinham um risco aumentado de desenvolvimento da doença
comparados com a população normal (SUN et al., 2004; ZHANG et al.,2006).
Estudos demonstraram também que a expressão das proteínas FAS e
FASL no tumor está relacionada com prognóstico da doença. Tumores com
aumento da expressão do FAS apresentam-se menos agressivos, levando a
um melhor prognóstico. Já em relação ao FASL, o aumento da sua expressão
nas células tumorais cria um mecanismo de escape do sistema imunológico,
tornando estas células mais resistentes, contribuindo para um pior prognóstico
(SHIBAKITA et al., 2000).
Através de dados que demonstram a importância da relação do sistema
FAS/FASL com o desenvolvimento e evolução do carcinoma epidermóide,
sentimos a necessidade de realizar um estudo em sítios específicos como boca
e orofaringe.
4
OBJETIVOS
5
2 – OBJETIVOS
• Avaliar a associação dos polimorfismos FAS –670A/G e FASL –844T/C
com risco de desenvolvimento de carcinoma epidermóide de boca e
orofaringe.
• Relacionar a ocorrência dos polimorfismos FAS –670A/G e FASL –
844T/C com a expressão das proteínas no tumor.
• Correlacionar a expressão das proteínas FAS e FASL no tumor com
variáveis clínicas, histopatológicas e com o prognóstico da doença.
6
REVISÃO DA LITERATURA
7
3 – REVISÃO DA LITERATURA
3.1 – Apoptose e Câncer
A apoptose é um programa codificado geneticamente de morte celular e
tem uma função crítica no desenvolvimento e homeostase de organismo
multicelulares (SHIBATIKA et al., 2000). Este processo complexo que envolve
muitos genes, mutações e polimorfismos podem levar à sinalização de morte
deficiente, potencializando a agressividade tumoral. Estudos demonstraram
que algumas células tumorais adquiriram com sucesso a habilidade de resistir
ao estímulo apoptótico ou de induzir a apoptose de linfócitos tumor-específicos
favorecendo a progressão tumoral. (ZHANG et al., 2005). A capacidade de
resistir aos estímulos apoptóticos é compartilhada por quase todos os tipos de
doenças malignas. Mutação nos componentes da cascata de apoptose é um
dos principais mecanismos no desenvolvimento do câncer e está relacionada
com agressividade tumoral, grau de diferenciação histológica e prognóstico
(VOLM et al., 2000; SUN et al., 2004).
A apoptose pode ser deflagrada por duas vias: a intrínseca ou
mitocondrial e a extrínseca ou citoplasmática. A via intríseca ocorre através da
presença de sinais de estresse intracelular, ativando o apoptossomo executor
(complexo multiprotéico) e liberando o citocromo-c do espaço intramembranoso
da mitocôndria para o citoplasma. A apoptose pela via extrínseca ocorre
através de estímulos externos, por meio da ativação de receptores específicos
presentes na superfície celular, chamados receptores da morte. Essas vias
culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases executoras
que clivam o DNA levando a célula à morte. O processo é regulado por
inúmeros fatores inibidores e ativadores (ZAPATA et al., 2001; ASHE et al.,
2003; BERGANTINI et al., 2005; GHOBRIAL et al., 2005).
Oito receptores de membrana são capazes de ativar a apoptose, entre
eles o FAS, TNF-R1, TRAMP, TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR-6, EDA-R e NGF-R.
Eles fazem parte de uma grande família de proteínas transmembrânicas do tipo
1 que contêm de dois a quatro domínios extracelulares ricos em cisteínas, além
de um domínio citoplasmático denominado domínio de morte, ubíquo aos seus
8
integrantes, essencial para a transdução intracelular do sinal de morte. Os
receptores são capazes de detectar a presença de sinalização extracelular
específica, acionando a maquinaria intrínseca de apoptose, sendo
intensamente investigados como modelo na terapia do câncer (ASHKENAZI et
al., 1999; FRENCH e TSCHOPP, 2003).
Dentre os diversos receptores estudados o mais conhecido e melhor
compreendido é o FAS (CD95/APO-1) e seu ligante FASL (CD178). Logo
depois da ativação do receptor através de seu ligante, o sinal apoptótico é
transmitido através da molécula adaptadora FADD (FAS-associeted Death
Domain), que é recrutada por possuir complementação ao domínio de morte do
receptor. Esta fará a adaptação da forma zimogênica da cisteíno-aspartato
protease (caspase-8) que sofrerá autoclivagem passando para sua forma ativa,
sendo uma protease fará a ativação de outras caspases, dando início à
cascata. Esta cascata irá culminar na ativação de uma DNAse específica que
irá fragmentar o DNA nuclear entre os nucleossomos, culminado nas
modificações morfológicas e bioquímicas características da apoptose, que
levará à morte da célula (OHNO et al., 2000; ASHE et al., 2003; FRENCH e
TSCHOPP, 2003).
3.2 – Genes FAS e FASL
Alguns membros da família dos receptores do fator de necrose tumoral
(TNFR) estão diretamente envolvidos na iniciação da cascata de morte celular
e sendo conhecidos como família dos receptores da morte. Um dos membros
desta família é um receptor de superfície conhecido como FAS, CD95 ou APO1
(ITOH et al., 1991).
O gene FAS foi mapeado no cromossomo 10q24.1, em 1992, pela técnica
de hibridização in situ. Através de técnicas de clonagem, foi demonstrado que a
molécula FAS é uma glicoproteína transmembrânica tipo I com 319
aminoácidos possuindo 48 kDa. Como um membro da superfamília TNFR, o
FAS é caracterizado por três domínios extracelulares ricos em cisteína. A
região intracelular é composta por uma sequência de 80 aminoácidos,
9
conhecida como domínio da morte, que é um sinalizador importante para
apoptose. A molécula é funcional apenas depois de oligomerizada em trímero,
na qual o próprio FASL, seu ligante natural acarretaria essa oligomerização
(Inazawa et al., 1992).
A regulação da expressão positiva do gene FAS é feita através de seus
elementos responsivos identificados no íntron 1 e também pelo gene Tp53.
Variações na região promotora do gene podem influenciar na expressão e
desregulação da sinalização de morte, podendo contribuir para carcinogênese
(INAZAWA et al., 1992; SUDA et al., 1993; NAGATA et al., 1999; ZHANG et al.,
2006).
A apoptose mediada pelo FAS é desencadeada pelo seu ligante natural, o
FASL ou CD178. O gene humano FASL foi mapeado no cromossomo 1q23 por
hibridação in situ. O gene foi isolado através de Reação em Cadeia de
Polimerase Reversa (RT-PCR), de mRNA de linfócitos humanos de sangue
periférico (TAKAHASHI et al., 1994). O FASL é uma proteína de membrana tipo
II com 40 kDa, apresenta 281 resíduos de aminoácidos, com 150 na sua região
extracelular e como os outros membros da família TNF, 77 aminoácidos na
região citoplasmática. Ela pode ser clivada, através de proteólise, para uma
forma solúvel bioativa. O FASL também pode se ligar a microvesículas
lipídicas, tornando-se mais estável e prolongando sua meia-vida biológica. As
três formas descritas do FASL são biologicamente ativas (MUSCHEN et al.,
2000; REICHMANN, 2002).
Enquanto a expressão do FAS e sua relação com a apoptose mediada por
FASL é uma característica comum da maioria dos tecidos não neoplásicos, a
expressão do FASL é restrita a estruturas anatomicamente bem definidas.
Além de células do sistema imune, como linfócitos T e células “natural killers”,
células de Sertoli nos testículos, células epiteliais da câmara anterior do olho e
células de Kupffer ao longo dos sinusóides hepáticos constitucionalmente
expressam o FASL. Estudos revelaram que a expressão do FASL nestes sítios
confere um privilégio imunológico localizado. Em consequência disto, estes
sítios imunoprivilegiados criam um “micro-ambiente” onde a infiltração de
linfócitos FAS positivos sejam rapidamente destruídos por apoptose após
ligação com FASL (MUSCHEN et al., 2000).
10
A interação entre efetuador e o alvo na citotoxicidade mediada pelo FASL,
pode ser modulada de diversas formas. O FASL pode ser neutralizado por uma
molécula solúvel de FAS. A molécula solúvel de FAS é gerada pela quebra do
domínio transmembrânica que ancora o receptor na membrana celular da
célula alvo. A molécula solúvel do FAS não traduz o sinal de morte após
ligação com o FASL, apenas compete com o receptor transmembrânico FAS. O
antagonismo do FASL por FAS solúvel previne eficientemente a destruição de
linfócitos in vitro e in vivo. De fato, a expressão aberrante de moléculas
solúveis de FAS é um mecanismo envolvido na patogênese de algumas
doenças autoimunes (MUSCHEN et al., 2000).
A perda da função do FAS ocorre freqüentemente no processo de
progressão tumoral em seres humanos. Tais perdas podem ocorrer pela
diminuição da regulação da transcrição do gene FAS, produção seletiva da
forma alternativa da proteína FAS solúvel ou pela perda da sinalização do FAS
como consequência da expressão de marcadores como bcl-2, bcl-xL, FAP-1 ou
FLIP. A diminuição da função ou da expressão do FAS já foi demonstrada em
carcinoma de cólon, esôfago, mama, melanoma, carcinoma hepatocelular e
adenocarcinoma de pulmão (REICHMANN E, 2002).
Na maioria destes tumores foi demonstrada também a expressão de
FASL constitucional, criando um sitio imunoprivilegiado, levando à fuga da
vigilância imunológica. Isto sugere que o desenvolvimento e a progressão de
tumores sólidos podem representar um continuum, na qual a expressão ou
função do FAS está diminuída e/ou a expressão do FASL constitucional é
adquirida. Esta premissa é mantida por evidências obtidas através de vários
modelos experimentais (REICHMANN E, 2002). A expressão do FASL pelo
câncer não só previne contra a rejeição do sistema imunológico, como também
contribui com danos teciduais e disseminação metastática (MUSCHEN et al.,
2000).
Os genes FAS e FASL são polimórficos, especialmente em suas regiões
promotoras. Dois polimorfismos foram reportados em cada região promotora
dos genes.
Na região promotora do gene FAS existem os polimorfismos -1377 G>A
na região silenciadora e na posição -670 A>G na região acentuadora da
transcrição. A alteração no nucleotídeo –1377 G>A modifica o sítio de ligação
11
do fator de transcrição SP-1. Já a outra substituição A>G na posição -670 cria
um sítio de restrição para a enzima MvaI e abole o sítio de ligação do elemento
nuclear de transcrição GAS. Estes polimorfismos estão relacionados com
diminuição da atividade da região promotora, consequentemente diminuindo a
sua expressão. A frequência de heterozigose para o polimorfismo –670 é de
52% com frequência alélica respectiva de 0,49 para G e 0,51 para A (HUANG
et al., 1997; SIBLEY et al., 2003; SUN et al.,2004; ZHANG et al., 2006).
A região promotora do FASL possui os polimorfismos -844T T>C e -124
A>G. O polimorfismo -T844C da região promotora do FASL leva a alterações
da atividade do gene com aumento da expressão devido sua localização,
dentro do motif do fator de transcrição CAAT/sítio de ligação proteína β (WU et
al., 2003). Níveis elevados de expressão do FASL estão relacionados com o
alelo -844C quando comparados com o alelo -844T (ZHANG et al., 2005).
Estudos mostram que no carcinoma epidermóide de esôfago em
humanos, a expressão do FAS é baixa e a expressão do FASL é alta, quando
comparado com tecido normal, indicando uma associação entre expressão
alterada do FAS e do FASL com o carcinoma epidermóide de esôfago
(SHIBAKITA et al., 1999).
Em estudo com 588 pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago e
648 controles, foi analisada a presença de polimorfismos na região promotora
do FAS (FAS –1377G/A e FAS –670A/G) e FASL (FASL –844T/C). A presença
dos polimorfismos –1377AA e –670GG está associada ao aumento significante
do risco de desenvolver o tumor, assim como o presença do polimorfismo
FASL –844CC. Também houve uma interação estatisticamente significante
com o consumo de tabaco (SUN et al., 2004).
A presença destes polimorfismos descritos acima, também se mostrou
importante no desenvolvimento do câncer de pulmão. Em um estudo com 1000
pacientes com câncer de pulmão e 1270 controles, na qual foi avaliada a
presença dos polimorfismos FAS –1377G/A e FASL –844T/G, os autores
evidenciaram a associação destes com um aumento significante do risco de
câncer. Foi demonstrado também um aumento acumulativo do risco quando
associado os dois genes e o uso de tabaco (ZHANG et al., 2005).
12
Zhang et al., estudando 721 pacientes com câncer de cabeça e pescoço,
comparando com 1234 controles, demonstrou uma forte associação entre a
presença dos genótipos FAS -1377 GG e FAS -167 AA, FAS -1377 AA e FAS -
167 (GG + AG) e o aumento de risco de desenvolvimento de câncer. Isto não
ocorreu em relação ao gene FASL. Este estudo demonstrou também que o
aumento do risco foi particularmente evidente na faringe, em pacientes com
grandes lesões e pescoço negativo para metástases. Esses achados sugerem
que alterações no gene FAS pode contribuir tanto no aumento do risco de
desenvolvimento quanto na progressão de doença (ZHANG et al., 2006).
3.3 – Sistema FAS/FASL e prognóstico
Múltiplos fatores são responsáveis pela modulação do crescimento
tumoral e prognóstico em pacientes com tumores malignos. Recentemente,
muita atenção tem sido dada para fatores que alteram a proliferação celular e
apoptose. Acredita-se que um desequilíbrio entre apoptose e proliferação seja
o ponto chave para o desenvolvimento e prognóstico do tumor. Por isso, é
importante notar que uma combinação de medições de proliferação e apoptose
poderia fornecer uma previsão mais realista do comportamento do tumor
(SHIBAKITA et al., 2000).
O sistema FAS/FASL, como outros marcadores moleculares, já
demonstrou desempenhar um papel importante na regulação da apoptose de
células tumorais. Vários estudos, em uma variedade de tumores, indicaram que
imunomodulações causadas pela alteração da expressão do FAS/FASL pode
ter um impacto significante na sobrevida do paciente (OHNO et al., 2000).
A apoptose é um fator importante na diferenciação e agressividade
tumoral. Em um estudo realizado com CEC de esôfago, o índice apoptótico ,
combinado com índice de proliferação celular, foi um fator independente de
prognóstico. O baixo índice apoptótico foi relacionado com fraca expressão do
FAS, levando a uma pior sobrevida, quando comparado a tumores que
apresentam alto índice apoptótico. Este estudo sugere que a expressão do
FAS é responsável por este aumento do índice apoptótico (SHIBAKITA et al.,
2000).
13
Um estudo realizado em pacientes portadores de adenocarcinoma
gástrico demonstrou que uma alta percentagem de pacientes com carcinoma
gástrico (83%) apresentava FAS expresso nos tumores. A proteína FAS foi
detectada mais comumente nos tumores em estágios iniciais e bem
diferenciados do que em lesões mais avançadas e mal diferenciadas. Os
resultados encontrados neste estudo indicam que a apoptose mediada pelo
FAS pode ser um dos mecanismos de defesa do organismo para restringir o
crescimento tumoral em uma fase inicial desenvolvimento do tumor. (OHNO et
al., 2000)
Foi demonstrado, através da imuno-histoquímica, que o FAS e FASL são
expressos em mucosa esofágica normal, FASL sendo predominantemente na
camada basal e suprabasal, enquanto FAS está em células mais diferenciadas,
ou seja, células da camada intermediária e células escamosas que formam a
camada exterior. (GRATAS et al., 1998)
Nas lesões invasivas, a expressão do FASL foi encontrada em mais de
50% das células tumorais. Em contrapartida, a maior parte dos tumores (79%)
não mostrou qualquer expressão do FAS ou mostrou expressão em menos de
5% das células tumorais. Estes resultados sugerem que o aumento da
expressão do FASL e a diminuição da expressão FAS são freqüentes
manifestações associadas com a evolução do CEC de esôfago (GRATAS et
al., 1998).
Estudos em 58 pacientes com CEC de esôfago, avaliados com
imunohistoquímica, a expressão da proteína FAS foi detectada em 89,7% dos
pacientes. A expressão aumentada do FAS foi correlacionada com tumores
mais bem diferenciados e com melhor sobrevida geral, sugerindo que a
apoptose modulada pelo FAS é importante na patogênese do CEC de esôfago
(CHAN et al., 2006).
Em carcinomas uroepiteliais, a expressão diminuída do FAS foi associada
a tumores de alto grau (p< 0.0001), estágios mais avançados da doença
(p=.023) e pior prognóstico ( p=0.01). Este estudo mostra que a expressão
diminuída do FAS pode ser um fator importante na seleção de pacientes que
irão necessitar de tratamentos mais agressivos (YAMANA et al., 2005).
Em um estudo realizado na China, com 42 pacientes e 10 controles, foram
avaliadas as expressões das proteínas FAS e FASL, através da imuno-
14
histoquímica, de carcinoma epidermóide de laringe. A taxa de positividade do
FAS e FASL foi comparada com o grau de diferenciação histológica,
estadiamento clínico e metástases linfonodais. A expressão do FAS está
diminuída e a do FASL aumentada significativamente quanto comparado com
tecidos normais. O FAS foi significativamente relacionado com metástases e o
FASL com diferenciação tumoral, estádio e metástases. Isto sugere que o FAS
e FASL possam ser um preditor de prognóstico (SHI et al., 2002).
15
CASUÍSTICA E MÉDOTOS
16
4 – CASUÍSTICA E MÉTODOS
4.1 – Casuística
O Estudo foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular e no
Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital Heliópolis – São Paulo. Foram
estudados pacientes com carcinoma epidermóide da boca e orofaringe
acompanhados e tratados pelo Departamento de Cirurgia de Cabeça e
Pescoço e Otorrinolaringologia do Hospital Heliópolis, Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e do Instituto Arnaldo
Viera de Carvalho a partir de 2001, integrantes de parte da casuística do
Projeto Genoma Clínico.
Todos os pacientes, casos e controles, possuem um termo de
consentimento livre e esclarecido assinado, permitindo o uso do material
biológico armazenado para pesquisas. Responderam a questionário detalhado,
que incluem informações epidemiológicas relevantes quanto aos fatores de
risco a que foram expostos e histórico familiar de câncer.
Para controle e acompanhamento do desenvolvimento da doença, os
pacientes do grupo de casos possuem ainda um questionário com informações
clínicas, patológicas e de seguimento, que foi realizado por uma equipe
multidisciplinar de acordo com a rotina estabelecida nos serviços, garantindo
um seguimento mínimo de 24 meses após o tratamento inicial.
Para a seleção de casos foi utilizado o diagnóstico de carcinoma
epidermóide da boca e orofaringe, classificado de acordo com o CID10. Todos
os pacientes têm confirmação histológica do diagnóstico, bem como amostras
congeladas, blocos parafinizados do tumor primário e amostras de sangue.
Foram excluídos do estudo os pacientes que apresentaram históricos de outras
neoplasias malignas prévias ou foram submetidos a tratamento com
radioterapia ou quimioterapia.
Os indivíduos do grupo controle foram selecionados entre os pacientes
internados no Hospital Heliópolis sem histórico de câncer ou doenças
relacionadas com o uso do tabaco e álcool, doenças da boca, orofaringe,
17
laringe, diabetes, doenças auto-imunes, condições psicóticas, senilidade ou
retardo mental e doenças do sistema nervoso central. Foram excluídos ainda
indivíduos incapacitados de responder o questionário.
4.2 – Perfil da amostra
O presente estudo analisou 215 indivíduos controles e 250 pacientes com
carcinoma epidermóide da boca e orofaringe. As características dos pacientes
estão distribuídas na Tabela 1.
Tabela 1 – Perfil da Amostra
Caso Controle
Gênero
Feminino
39 15,6% 23 10,7%
Masculino
211 84,4% 192 89,3%
Tabagismo
Não
24 9,6% 42 19,5%
Sim
226 90,4% 173 80,5%
Etilismo
Não
43 17,2% 52 24,2%
Sim
207 82,8% 163 75,8%
Idade
<40 11 4,4% 11 5,1%
40-49 65 26,0% 73 34,0%
50-59 89 35,6% 70 32,6%
60-69 58 23,2% 46 21,4%
>70 27 10,8% 15
7,0%
A idade variou entre 24 e 93 anos, com média de idade foi de 55,6 anos
para o grupo de casos e de 53,8 anos para o grupo controle. A boca foi o sítio
primário mais acometido, em 65,6% dos pacientes e a orofaringe em 34,4%,
como pode ser visto na Tabela 2.
18
Tabela 2 – Distribuição dos pacientes por sítios e subsítios
Boca
164 65,6%
Orofaringe
86 34,4%
Área retromolar 17 10,4% Base língua 19 22,1%
Borda língua 42 25,6% Loja tonsilar 43 50,0%
Corpo língua 22 13,4% Palato mole 17 19,8%
Gengiva 27 16,5% Parede posterior 4 4,7%
Mucosa jugal 4 2,4% Valécula 3 3,5%
Soalho 52 31,7%
A maioria dos pacientes era tabagistas e etilistas (82%) e apenas 5%
foram classificados com não tabagistas e não etilistas .
Em relação ao estádio clínico, a maioria (78%) foi diagnosticada em
estádio avançado (estádio III e IV), enquanto os estádios iniciais somaram 22%
(estádio I e II). Os dados da Tabela 3 mostram a distribuição da amostra em
relação ao estadiamento clínico da doença.
Tabela 3 – Distribuição dos pacientes por estadiamento clínico
Estadiamento Prevalência
I 3%
II 19%
III 27%
IV 51%
Dos 250 do grupo de casos, 196 foram submetidos à cirurgia,
acompanhados ou não de tratamento adjuvante, de acordo com a indicação
clínica.
4.3 – Material
Para a realização desse estudo, foram colhidos 5mL de sangue
periférico dos pacientes, tanto do grupo de casos como o de controles, para a
extração de DNA genômico e estudo dos polimorfismos -670 do gene FAS e -
19
844 do gene FASL. Para os indivíduos controle, também foram utilizados 5mL
de sangue periférico.
Os Primers utilizados no estudo são do Laboratório Biobrás® (São
Paulo, SP, Brasil), cujas sequências estão demonstradas na Tabela 4.
Para a digestão foi utilizada a enzima de restrição MvaI, do laboratório
Santa Cruz, para o polimorfismo FAS -670 e a enzima BsrDI para o
polimorfismo FASL -844
Tabela 4. Primers utilizados nas reações de PCR com temperatura de anelamento (T°A) e
tamanhos dos fragmentos gerados pela reação.
GENE
POSIÇÃO SEQÜÊNCIA T°A FRAGMENTO
F: - 5’CTA CCT AAG AGC TAT CTA CCG TTC - 3’
FAS
-670A>G
R: - 5’GGC TGT CCA TGT TGT GGC TGC - 3’
54°C 331 pb
F: - 5´CAG CTA CTC AGG AGG CAA AG - 3’
FASL
-844T>C
R:
-
5’ GCT CTG AGG GGA GAG ACC AT
-
3’
62°C 401 pb
4.4 – Métodos
4.4.1 – Extração DNA
Para a extração do DNA de sangue, empregamos a metodologia de
extração por sal, na qual o sangue periférico coletado de pacientes e indivíduos
controle foi misturado a 25 mL de tampão 1 (Quadro 3), em seguida o material
foi homogeneizado por inversão e colocado no gelo por 30 minutos. Após esse
período, foi centrifugado por 15 minutos a 1800 rpm a 4°C e o sobrenadante
descartado. Adicionou-se ao pellet 5 mL tampão 1 e centrifugou-se por 5
minutos a 1800 rpm a 4°C. Posteriormente descartou-se o sobrenadante e
suspendeu-se o pellet em 3 mL de tampão 2 através de agitação (Vórtex).
Junto à solução foi misturado, 10 µL de proteinase-K e posteriormente
adicionado 300µL de SDS 10%. Em seguida, a solução foi incubada a 37°C por
16 horas. Após o período de repouso, adicionou-se 1 mL de NaCl saturado
(6M) e foi homogeneizado vigorosamente por 15 segundos (Vórtex), sendo
20
centrifugado em seguida por 20 minutos a 3000 rpm. Após esse período, o
sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde o DNA será precipitado
quando adicionado 2 volumes de etanol absoluto em temperatura ambiente. O
DNA precipitado foi içado e mergulhado rapidamente em etanol 70% à
temperatura ambiente. Posteriormente, o DNA foi dissolvido em TE de acordo
com a quantidade de DNA içado e colocado em um microtubo (Quadro 5),
posteriormente incubou-se a 65°C por 30 minutos.
Em todas as amostras, foi realizada a quantificação do DNA extraído pelo
espectrofotômetro.
As amostras na qual a extração por sal foi inviável, foram encaminhadas
para a extração de DNA por coluna segundo o protocolo da QUIGEN minikit
de extração DNA genômico de sangue por coluna de sílica.
4.4.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Na reação de PCR foram utilizados de 100 a 200ng de DNA genômico
para um volume total de reação de 50-µL, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50
mmol/L KCl, 200 µmol/L de cada deoxy-NTPs, 1.5 mmol/L de MgCl2, 1U Taq
DNA polimerase (Life Technologies, Inc®, Rockville, MD, USA) e 25 pmoL de
cada primer específico (Biobrás®, São Paulo, SP, Brasil).
As condições de ciclagem para gerar o fragmento de 331pb (-670) e
401pb (-844) incluem uma desnaturação por 4 e 2 minutos a 94°C, seguida de
40 ciclos de 94°C por 30 segundos, anelamento durante 30 segundos em
temperatura específica (56° - FAS e 62° - FASL ) para cada par de primers e
extensão por 1 minuto e 45 segundos a 72°C, respectivamente. Os produtos de
PCR foram visualizados em gel de agarose 1% e corados com brometo de
etídio.
Os géis abaixo apresentam o resultado da reação de PCR do gene FAS
e FASL com a amplificação de seus produtos (Figura 1)
21
1 2 3 4 5 6 7 8
331pb
401pb
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura A Figura B
1 2 3 4 5 6 7 8
331pb
401pb
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura A Figura B
1 2 3 4 5 6 7 8
331pb331pb
401pb
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura A Figura B
Figura 1 – Visualização dos resultados das reações de PCR em gel de agarose 1% corado com
brometo de etídio com a amplificação dos fragmentos dos genes FAS e FASL. Na Figura A –
FAS: as colunas de 2 a 7 referem-se às amostras incluídas no estudo indicando na seta o
fragmento de 331 pares de bases (pb). Na Figura B – FASL: as colunas 2 a 7 referem-se às
amostras incluídas no estudo indicando na seta o fragmento de 401pb. A coluna 1 das figuras
A e B representa o marcador de peso molecular de 100 pb.
4.4.3 – Digestão com Enzimas de Restrição
Para as reações de digestão de cada fragmento específico, obtido através
da PCR para os genes FAS-670 e FASL -844, foram utilizados 5µL do produto
de PCR para 1µL das enzimas MvaI (FAS) e 0,5µL BsrDI (FASL) (10U;
Fermentas Life Sciences®, USA), 1µL de 10X Buffer R e 8µL de H
2
O nuclease-
free para um volume final de 15µL de reação. Estes componentes foram
incubados em temperatura específica de 37°C e 55°C, respectivamente,
conforme a orientação do fabricante, e após o término da reação, 10µL da
reação de digestão foram misturados ao corante- Loading Buffer e submetidos
à eletroforese em gel de agarose, corado com brometo de etídio (1mg/mL) e
visualizado em transiluminador Amersham Bioscience® Macro UV 25.
4.4.4 – Forma de análise dos resultados
O programa de análise de imagens utilizada para a visualização das
imagens obtidas nos géis de PCR e digestão foi o Gel Quant Olimpus®
Camedia C-5060 Wide Zoom.
22
O polimorfismo -670 do gene FAS (A→G) cria um sítio de restrição para
a enzima MvaI (EcoRII*) como ilustrado na Figura 2 abaixo. A endonuclease de
restrição MvaI, reconhece o seguinte sítio: CCWGG ou GGWCC, onde a letra
W representa uma adenina ou uma timina (Figura 2).
Figura 2 – Sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição MvaI, onde há a substituição
de uma Adenina ou de uma Timina.
Indivíduos homozigotos AA foram identificados no gel através das
bandas com 233 e 98 pares de bases. Indivíduos heterozigotos para o
polimorfismo AG apresentaram um padrão com 4 bandas com: 233, 189, 98 e
44 pb. Os indivíduos homozigotos GG apresentaram um padrão de bandas de
189, 98 e 44pb como mostra a Figura 3.
23
Figura 3 – Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio com o resultado da reação de
digestão do fragmento de 331pb do gene FAS. A coluna 3 indica a clivagem realizada pela
enzima formando fragmentos de 233 e 98 pares de bases em indivíduos homozigotos AA. As
colunas 2, 4 e 5 representam a clivagem em indivíduos heterozigotos, formando fragmentos de
233, 189, 98 e 44 pares de bases. As colunas 6, 7 e 8 indicadas na figura, mostra indivíduos
homozigotos GG com fragmentos de 189, 98 e 44 pb. Na coluna 1 está o marcador de peso
molecular de 100 pares de bases.
O polimorfismo -844 do gene FASL (T→C) cria um sítio de restrição
para a enzima BseMI (BsrDI) como ilustrado na Figura 4 abaixo. A
endonuclease de restrição BseMI, reconhece os sítios: GCAATGNN ou
CGTTACNN, onde a letra N representa uma adenina ou timina (figura 4).
Figura 4 – Sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição BseMI.
24
Indivíduos do tipo homozigotos TT são identificados no gel através da
banda não digerida com 401 pb. Indivíduos heterozigotos para o polimorfismo
(TC) apresentam um padrão com 3 bandas com: 401, 233, 168pb. Os
indivíduos homozigotos CC apresentaram um padrão de bandas de 233 e
168pb como mostra a Figura 5.
Figura 5 – Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio com o resultado da reação de
digestão do fragmento de 401pb do gene FASL. As colunas 3, 6 e 7 o fragmento não digerido
de 401 pares de bases, em indivíduos homozigotos TT. As colunas 5 e 8 representam a
clivagem em indivíduos heterozigotos, formando fragmentos de 401, 233 e 168 pb. As colunas
2 e 4 indicadas, mostra indivíduos homozigotos CC com fragmentos de 233 e 168pb. Na
coluna 1 está o marcador de peso molecular de 100 pares de bases.
25
4.4.5 – Imuno-histoquímica
Dos pacientes operados, do grupo de casos, 85 blocos de parafina com
material do tumor apresentaram condições técnicas para realização do estudo.
Para melhor aproveitamento do uso dos anticorpos e economia de material
emblocado, optamos pela montagem de um tissue microarray (TMA) de
carcinoma epidermóide de boca e orofaringe.
Após a revisão das 85 lâminas coradas pelo método de hematoxilina e
eosina (HE) dos blocos selecionados, estas foram analisadas e duas áreas
foram delimitadas com caneta apropriada para marcação (as áreas marcadas
foram representativas do tumor). Posteriormente, foram delimitadas as áreas
nos blocos de parafina, chamados de blocos doadores.
Dos blocos doadores foram retirados fragmentos cilíndricos de 1mm e
estes acondicionados em um outro bloco chamado de bloco receptor. Cada
bloco doador foi representado em duplicata no bloco receptor. Esta etapa foi
realizada em um aparelho preciso (“Tissue Arrayer”) da marca Beecher
Instruments® (Silver Spring MD), no Departamento de Anatomia Patológica do
Hospital do Câncer A. C. Camargo, São Paulo. Os casos foram previamente
dispostos em ordem numérica crescente de acordo com o registro de
prontuário da cabeça e pescoço do Hospital Heliópolis e amostrados em
duplicata.
Em seguida esses blocos foram levados ao micrótomo de parafina e
obtidos cortes histológicos seqüenciais de 3µ que foram dispostos em lâminas
com adesivos da marca Microsystems Inc®.
As lâminas de TMA foram desparafinizadas, desidratadas e cortes
histológicos a cada 9 níveis diferentes foram corados pelo HE. Posteriormente
foram e selecionadas duas lâminas de cada bloco para cada anticorpo para
serem submetidas à reação imuno-histoquímica.
Todas as lâminas foram revisadas pelo mesmo patologista (AMCM),
confirmando o grau de diferenciação histológica, presença de infiltrado
inflamatório, invasões vasculares linfática e sanguínea, e invasão perineural.
Uma vez selecionados os casos e construído o bloco de tissue
microarray dos blocos de tumores o painel imuno-histoquímico foi completado,
realizando-se reações para os anticorpos: anti-FAS e anti-FASL como pode ser
26
observado na Tabela 5 que apresenta a lista completa dos anticorpos com
respectivos clones e origem de fabricação.
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas pela técnica de
complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (StreptABC, DAKO®).
Após a hidratação do tecido em álcool em progressiva graduação,
seguiu-se a inibição da peroxidase endógena utilizando o tratamento com
peróxido de hidrogênio a 3% durante 10 minutos. Após lavagem em PBS, as
lâminas foram imersas em ácido cítrico (pH 6,0) e aquecidas em panela a
vapor a 90ºC por 30 minutos.
O anticorpo primário foi purificado por coluna de afinidade e diluído em
PBS/1%BSA, sendo incubado durante 60 minutos. Após nova lavagem com
PBS, as lâminas foram incubadas com os anticorpos secundário e terciário
durante 30 minutos. A revelação empregou a 3,3'-diaminobenzidina, contra-
corado por hematoxilina de Mayer.
Tabela 5 – Listagem dos anticorpos utilizados no projeto em relação ao antígeno, clone e
origem.
Anticorpo Clone Origem
Anti-FAS B10 mouse monoclonal IgG
1
Anti-FASL 4H9 Hamster IgG
Os passos técnicos realizados foram os já tradicionalmente descritos na
literatura e podem ser vistos em livros texto. Foram utilizados também os
protocolos descritos nos manuais de laboratório da Sociedade Brasileira de
Patologia.
27
4.4.6 – Forma de análise dos resultados
A leitura das lâminas foi realizada sob supervisão (AMCM), em
microscópio óptico (100x).
Como cada lâmina do tissue array possui dois spots de tecido tumoral do
mesmo paciente, foram analisados 2 spots por paciente e calculada uma média
do resultado das análises.
A marcação das proteínas FAS e FASL foi padronizada de forma
individual. Os critérios utilizados para a semi-quantificação das proteínas por
imuno-histoquímica dependeram da intensidade da expressão e da localização
da marcação na célula (membrana, citoplasma e núcleo)
Para a semi-quantificação foi utilizado o método descrito por Shibakita et
al., em 1999, na qual foi avaliada a intensidade de coloração e a quantidade de
células coradas.
A Intensidade da marcação foi subdividida em 4 graus com a seguinte
graduação demonstrada na Tabela 6.
Tabela 6 – Graduação da reação imuno-histoquímica de acordo com a intensidade.
Descrição da intensidade Grau
Negativa 0
Positivo Fraco 1
Positivo Moderado 2
Positivo Forte 3
Quanto ao número de células coradas, a marcação foi dividida em 4
graus conforme demonstrado na Tabela 7.
28
Tabela 7 – Graduação da reação imuno-histoquímica de acordo com o número de células
coradas.
Descrição do número de células coradas Grau
Menor que 5 % 0
Entre 5 % e 10 % 1
Entre 11 % e 50 % 2
Entre 51 % e 100% 3
Os resultados obtidos em cada escala foram multiplicados entre si,
produzindo um valor único para cada spot. Após cálculo do escore final nas
duas observações, foi calculada a média entre eles.
Os pacientes foram categorizados de acordo com os escores: 0,
negativo; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 e 3,5 foram categorizados como positivos fracos;
e maior que 4, como positivo forte. Uma segunda categorização foi definida
como negativo (menor que 4) ou positivo (maior ou igual a 4).
4.5 – Análise Estatística
Para análise comparativa de variáveis qualitativas foi utilizado o método
Qui-quadrado com ou sem correção de Yates, sendo complementado com o
teste Exato de Fisher para situações onde a frequência esperada de alguma
associação fosse menor que 5.
A análise multivariada foi realizada através do modelo de regressão
logística para as variáveis independentes categóricas e contínuas.
A sobrevida foi estimada pelo método de Kaplan-Meier, e a análise
estatística foi realizada pelo teste de Log-Rank, no qual foi testado a igualdade
entre as curvas de sobrevida.
Foi ainda utilizado o modelo de Cox proportional Harzard para a
identificação de variáveis independentes de prognóstico, em análise
multivariada.
29
O nível de significância utilizada para a rejeição da hipótese de
igualdade foi 5% (p<0,05).
Para a realização dos testes foi utilizado o software estatístico SSPS
16.0 (SSPS Inc., Chicago 2007).
4.6 – Aspectos éticos
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do
Hospital Heliópolis em 12 de Agosto de 2008, sob número 637 (anexo I) é
subprojeto do Projeto Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço,
também aprovado pelo CEP do Hospital Heliópolis sob número 386 aprovado
em 15 de abril de 2005 (Anexo II).
O material utilizado para a realização do estudo consistiu em amostras
de sangue e de tecido parafinizado. Do sangue coletado foi extraído o DNA e
armazenado de acordo com as normas técnicas no Laboratório de Biologia
Molecular do Hospital Heliópolis, fazendo parte do acervo de material do
Projeto Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço e são da
responsabilidade da Profa. Dra. Adriana Madeira Álvares da Silva. Os blocos
parafinizados de tecido cirúrgico estão armazenados no Serviço de Anatomia
Patológica do Hospital Heliópolis, sob a responsabilidade da Dra. Ana Maria da
Cunha Mercante - Chefe do Serviço.
Os participantes do estudo assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido do Projeto Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço
A relação entre a genética e os benefícios diretos aos pacientes está
bem estabelecida em câncer medular de tiróide, câncer de mama e cólon, na
qual marcadores moleculares são utilizados na prática clínica. Porém para os
marcadores em questão, ainda em estudos preliminares, muito possivelmente,
não haverá benefícios diretos em decorrência da pesquisa aos pacientes deste
estudo, porém, os resultados poderão beneficiar, no futuro, outros pacientes.
Os resultados obtidos desse trabalho serão enviados à publicação em
revista científica, garantindo o sigilo e respeito a confidencialidade dos sujeitos
envolvidos no trabalho.
30
RESULTADOS
31
5. RESULTADOS
5.1 Estudo dos polimorfismos nos genes FAS e FASL
As frequências dos alelos dos genes FAS e FASL, tanto no grupo de
pacientes como de controle estão distribuídas na Tabela 8.
A frequência do alelo G do polimorfismo -670 do gene FAS em casos e
controles foi de 0,57 e 0,53 respectivamente e de 0,43 e 0,47 para o alelo A
sem diferença significativa (p=0,66).
Em relação ao alelo T para o polimorfismo -844 do gene FASL foi de
0,43 e 0,53 em casos e controles respectivamente. Para o alelo C, a frequência
encontrada foi de 0,57 e 0,47 entre casos e controles, também sem diferença
significante (p=0,88) (Tabela 8).
Tabela 8 – Frequência dos alelos FAS e FASL
Frequências Alelos Caso Controle
FAS
A 0,43 0,47 p=0,66
G 0,57 0,53
FASL
T 0,43 0,53 P=0,88
C 0,57 0,47
Houve equilíbrio de Hardy-Weinberg para os alelos do gene FAS em
casos e controles (χ2= 1,11; p=0,53 e χ2=0,64; p=0,58; respectivamente) e
também para o gene FASL nos casos (χ2=2,12; p=0,32) e controles (χ2=0,32;
p=0,60).
A frequência dos genótipos FAS -670 AA, -AG e -GG do grupo de casos
não diferiu do grupo controle (p=0,44). A frequência dos genótipos FASL -844
CC, CT e TT também não apresentaram diferença significante entre casos e
controle (p=0,09). Os dados são apresentados na Tabela 9.
32
Tabela 9: Modelo de regressão logística das variáveis FAS e FASL ajustada para
tabagismo, etilismo, idade e sexo.
Caso Controle OR IC(95%) p
FAS
AA 43 (17,2%) 45 (20,9%) 1,00 Referência
AG 131 (52,4%) 113 (52,5%) 1,22 0,74-2,02 0,44
GG 76 (30,4%) 57(26,5%) 1,46 0,84-2,56 0,18
FASL
TT 75 (30%) 50 (23,3%) 1,00 Referência
TC 134 (53,6%) 103 (47,9%) 1,53 0,92-2,53 0,09
CC 41(16,4%) 62 (28,8%) 1,50 0,87-2,60 0,14
Ajuste de modelo p=0,5098
A análise dos dados em relação à interação dos genótipos FAS e FASL
e o aumento do risco de desenvolvimento da neoplasia não mostrou valores
significantes para pacientes portadores do alelo G no gene FAS -670 e que
também carregavam o alelo C no gene FASL -844.
33
5.2 Relação dos polimorfismos dos genes FAS e FASL com a expressão
das proteínas FAS e FASL.
O resultado da análise da associação entre os genótipos do FAS e FASL
com a expressão de suas proteínas no tumor não mostrou relação significante
entre estas variáveis (p=041 e p=029, respectivamente) (Tabela 10).
Tabela 10: associação entre genótipos do FAS e FASL com sua respectiva expressão
Genótipos
Expressão FAS
FAS
Negativo Positivo
p
AA 12 17,6% 4 23,5% 0,41
AG 40 58,8% 7 41,2%
GG 16 23,5% 6 35,3%
Expressão FASL
FASL
Negativo Positivo
p
TT 12 25,0% 6 16,2% 0,29
TC 23 47,9% 24 64,9%
CC 13 27,1% 7 18,9%
34
5.3 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis clínicas,
histopatológicas e prognóstico
5.3.1 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis clínicas
Em relação ao status dos pacientes, nossos dados mostraram que dos
85 pacientes estudados, 48 (56,4%) estavam vivos, sendo 39 (45,8%)
assintomáticos e 9 (10,5%) com doença recidivada em tratamento paliativo.
Ainda do total de pacientes, 6 (7,0%) morreram de causas não relacionadas
com o câncer de boca e orofaringe e os 31 (36,4%) pacientes restantes
morreram de recidiva da doença.
Dos pacientes analisados e acompanhados neste estudo, 45 (52,9%)
apresentaram alguma forma de recorrência. A maioria ocorreu no sítio primário,
correspondendo a 68,9% das recidivas, sendo que 3 (6,7%) estavam em
associação com recidiva regional. Doze pacientes (26,6%) apresentam recidiva
regional, e em apenas 2 (4,4%) foi diagnosticado metástase à distância.
Em relação à expressão dos genes avaliada por imuno-histoquímica, a
positividade da proteína FAS foi detectada em 17 (20%) de 85 tumores com
marcação predominantemente citoplasmática.
A expressão positiva do FAS foi observada em 29,4% dos tumores
iniciais e em 70,6% dos tumores avançados (p = 0,98). Não houve diferença
estatisticamente significante entre expressão do FAS e grau de diferenciação e
presença de metástase linfonodal no diagnóstico (Tabela 11).
A expressão positiva do FAS se mostrou como fator protetor contra
recidivas tumorais [OR=0,2 (CI = 0,06-0,7; p=0,01)]. No grupo com expressão
positiva, a recidiva ocorreu em 23,5% dos pacientes, contra 60,3% do grupo
negativo (Tabelas 11 e 13).
35
Tabela 11: Expressão do FAS e características Clínicas
Expressão FAS
Negativo Positivo
p
Mestástase LN
Negativo 25 36,8% 8 47,1%
0,76
Positivo 43 63,2% 9 52,9%
Estadiamento
Inicial 16 23,5% 5 29,4%
0,98
Avançado 52 76,5% 12 70,6%
Recidiva
Não 27 39,7% 13 76,5%
0,006
Sim 41 60,3% 4 23,5%
Tabela 12: Modelo de regressão logística segundo a variável FAS
Variável OR CI (95%) Coeficiente p
Metástase LN (Sim/Não) 0,7718 0,16 – 3,6 -0,2591 0,7450
Estadiamento (Inicial/Avançado) 1,0191 0,18 – 5,71 0,0189 0,9829
Recidiva (Sim/Não) 0,2083 0,06 – 0,71 -1,5689 0,0122
A proteína FASL foi detectada em 43,5% dos 85 tumores de boca e
orofaringe analisados. O FASL foi predominantemente expresso no citoplasma
das células e apenas quando na expressão forte, houve marcação na
membrana celular. Não houve relação entre a expressão do FASL e
estadiamento clínico, grau de diferenciação histológica ou metástase linfonodal
(Tabela 12).
O FASL também mostrou ser um fator de proteção contra recidiva
tumoral, quando o mesmo é expresso de forma positiva [OR= 0,34 (CI = 0,14-
0,85; p=0,01)] No grupo com expressão positiva, a recidiva ocorreu em 37,8%
dos pacientes, contra 62,2% do grupo negativo (Tabelas 12 e 14).
36
Tabela 13: Expressão do FASL e características clínicas
Expressão FASL
Negativo Positivo
P
Metástase LN
Negativo 16 33,3% 17 45,9%
0,23
Positivo 32 66,7% 20 54,1%
Estadiamento
Avançado 37 77,1% 27 73,0%
0,66
Inicial 11 22,9% 10 27,0%
Recidiva
Não 17 35,4% 23 62,2%
0,01
Sim 31 64,6% 14 37,8%
Tabela 14: Modelo de regressão logística segundo a variável FASL
Variável OR CI (95%) Coeficiente p
Metástase LN (Sim/Não) 0,6729
0,15-2,95
-0,3962
0,59
Estadiamento (Inicial/Avançado) 0,5038
0,13-1,88
-0,6856
0,30
Recidiva (Sim/Não) 0,3489
0,14-0,85
-1,0529
0,02
37
5.3.2 Expressão do gene FAS e FASL e relação com variáveis
histopatológicas
Correlacionando o FAS com achados histopatológicos, encontramos a
associação com a invasão vascular linfática, na qual a expressão positiva foi
fator de proteção [OR= 0,12 (CI= 0,01-0,96; p=0,01)]. Não houve relação com
as demais variáveis (Tabela 15).
Não houve associação significativa entre expressão do FASL e
características clínico-patológicas exceto pela invasão perineural, na qual a
expressão positiva do FASL mostrou ser um fator de proteção [OR=0,25 (CI=
0,06-0,93; p= 0,01)] (Tabela 15).
Tabela 15: Expressão do FAS e FASL e características patológicas
FAS FASL
Negativo Positivo P Negativo Positivo P
Infiltrado Inflamatório
Escasso 15 22,4% 5 33,3% 0,67
10 21,3% 10 28,6% 0,56
Moderado 36 53,7% 7 46,7% 27 57,4% 16 45,7%
Intenso 16 23,9% 3 20,0% 10 21,3% 9 25,7%
Invasão Sangüinea
Ausente 62 95,4% 16 94,1% 0,61
46 97,9% 32 91,4% 0,18
Presente 3 4,6% 1 5,9% 1 2,1% 3 8,6%
Invasão Linfática
Ausente 44 65,7% 16 94,1% 0,01
33 70,2% 27 75,0% 0,61
Presente 23 34,3% 1 5,9% 14 29,8% 9 25,0%
Invasão Perineural
Ausente 47 71,2% 15 93,8% 0,06
31 66,0% 31 88,6% 0,01
Presente 19 28,8% 1 6,3% 16 34,0% 4 11,4%
38
5.3.3 Expressão do gene FAS e FASL e relação com prognóstico
Para análise da sobrevida específica a expressão das proteínas FAS e
FASL no tumor foi classificada em positivo forte, positivo fraco e negativo. Sete
pacientes (8,2%) não expressaram o FAS. Dos tumores FAS positivos, 61
(71,8%) tiveram marcação fraca e 17 (20%) tiveram marcação forte. Em
relação ao FASL, os tumores foram assim distribuídos: 15 (17,6%) negativos,
33 (38,8%) positivos fracos e 37 (43,5%) positivos fortes.
As curvas de sobrevida livre de doença mostraram diferenças entre elas,
sendo a sobrevida livre de doença significativamente menor em pacientes com
expressão negativa do FAS (p=0,03) (Figura 6). Após 36 meses, cerca de 80%
dos pacientes FAS positivo não apresentaram recidiva, comparados com os
49% dos pacientes negativos.
Figura 6: Curva de Sobrevida Livre de Doença em Relação à Expressão do FAS
0 12 24 36 48 60 72
Tempo livre de doença (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Taxa de sobrevida
Categorização FAS 2
Negativo
Positivo
p= 0,03
39
O fator de risco independente para recidiva da doença foi determinado
através de análise multivariada por regressão de Cox, na qual apenas a
expressão do FAS foi estatisticamente significante (hazard ratio = 0,27; p=0,01)
(Tabela 16). Já em relação ao FASL, não houve diferença significativa entre
pacientes positivos e negativos quanto à sobrevida livre de doença (p=0,13).
Tabela 16: Análise multivariada dos fatores de sobrevida livre de doença usando o modelo de
regressão de Cox’s proportional hazard.
Variáveis
Hazard Ratio
C.I. (95%) Coeficiente p
Expressão FAS (Positivo/Negativo) 0,27 0,09-0,77 -1,2934 0,01
Estadiamento 1,37 0,95-1,98 0,3219 0,08
Grau(II/I) 0,97 0,52-1,79 -0,0277 0,92
Grau(III/I) 0,90 0,26-3,04 -0,1038 0,86
As curvas de sobrevida específica da doença estão representadas nas
Figuras 7 e 8. Os dados demonstraram associação da sobrevida com a
expressão do FAS (p=0,008). Os pacientes com expressão positiva forte do
FAS apresentaram melhor sobrevida que os pacientes com a expressão
positivo fraca e negativa. Dos pacientes com expressão positivo forte, após 36
meses, 75% estavam vivos, contra 57% com expressão positivo fraco e 28%
com expressão negativa.
Já em relação à expressão do FASL, não houve diferença
estatisticamente significante entre quanto à sobrevida específica para doença
(p=0,09).
40
0 12 24 36 48 60 72
Tempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Taxa de sobrevida
Categorização FAS 1
Forte
Fraco
Negativo
Figura 7: Curva de Sobrevida Especifica em Relação à Expressão do FAS
0 12 24 36 48 60 72
Tempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Taxa de sobrevida
Categorização
FASL 1
Negativo
Positivo forte
Positivo fraco
Figura 8: Curva de Sobrevida Especifica em Relação à Expressão do FASL
p=0,008
p=0,09
41
Através de análise multivariada, foram determinados os fatores de risco
independentes para a sobrevida específica da doença. Estes foram: o
estadiamento (p=0,007) e a expressão do FAS (p=0,006) (Tabela 17).
Pacientes com expressão negativa apresentaram um pior prognóstico quando
comparados com pacientes positivo forte (hazard ratio = 6,74; p=0,006).
Tabela 17: Análise multivariada dos fatores de sobrevida específica para doença usando o
modelo de regressão de Cox’s Proportional Hazard
Variáveis Hazard Ratio CI (95%) Coefficient p
Expressão FAS (Fraco/Forte) 2,11 0,71-6,2 0,7482 0,17
Expressão FAS (Negativo/Forte) 6,74 1,69-26,81 1,9093 0,006
Estadiamento 5,34 1,56-18,20 1,676 0,007
Metástase Linfonodal 0,92 0,15-5,57 -0,0814 0,92
42
DISCUSSÃO
43
6 – DISCUSSÃO
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço tem sido estudado, pois
é um tumor que está associado à alta mortalidade e morbidade, como seqüelas
na deglutição, respiração e fala. Dependendo do estadiamento clínico e
características clínico-patológicas, esta doença pode estar associada a um pior
prognóstico (KENADY et al., 2002, ZIOBER et al., 2006).
No presente estudo, tentamos relacionar alterações polimórficas nos
genes FAS e FASL e o risco de desenvolvimento do CEC de boca e orofaringe.
Estas alterações localizadas na região promotora desses genes atribuiriam
uma maior ou menor expressão da proteína, criando assim situações
favoráveis ao desenvolvimento e/ou progressão da doença. A literatura
relaciona a alteração do alelo A para G na posição -670 do gene FAS, com
uma diminuição da expressão da proteína. Já em relação ao gene FASL, o
polimorfismo de T para C aumentaria a expressão da proteína, criando assim o
chamado sítio imuno-privilegiado, isto é um mecanismo de defesa do tumor
contra células do sistema imunológico (SUN et al., 2004; ZHANG et al., 2006;
SIBLEY et al., 2003; HUANG et al., 1997).
Em relação à frequência do alelo G do polimorfismo -670 do gene FAS
nossos achados em casos (0,53) e controles (0,57) não diferiram dos
encontrados na população chinesa em pacientes com CEC de esôfago (0,41) e
controles (0,37) (p=0,55). Os dados de frequência alélica do C -844 do FASL
também não apresentaram diferença dos encontrados na população chinesa
(p=0,21) (SUN et al., 2004).
Quanto ao equilíbrio de Hard-Weinberg nossos dados mostraram que
houve equilíbrio entre casos e controles tanto para o polimorfismo -670 FAS
quanto para o polimorfismo -844 FASL.. Esse equilíbrio pode indicar que não
houve interferência na relação entre a presença do polimorfismo -844 FASL e a
presença do tumor, porém esses dados devem ser avaliados com ressalvas, já
que a amostragem analisada não está compatível com os grandes estudos
populacionais.
A associação da presença do polimorfismo dos genes FAS -670 A/G e
FASL -844 T/C e o risco de desenvolvimento de câncer tem sido estudada em
44
sítios como esôfago, pulmão, estomago e a própria região da cabeça e
pescoço (SUN et al., 2004; ZHANG et al., 2005; ZHANG 2006).
Sun et al. (2004) em seu estudo, analisou um grupo de 588 pacientes
com CEC de esôfago, comparando com 648 controles, onde encontrou um
aumento do risco de 1,72 vezes para portadores do genótipo FAS -670 GG
(p<0,001) e de 2,06 vezes para portadores do genótipo FASL -844 CC
(p<0,001). Ele também encontrou uma interação estatisticamente significante
deste polimorfismo com o uso do tabaco.
Estudando 1000 pacientes com câncer de pulmão, Zhang et al. (2005)
demonstrou a associação dos polimorfismos FAS -1377G/A e FASL -844T/C
com risco de câncer e um aumento acumulativo associado ao tabagismo.
Um estudo realizado também com um grande número de pacientes, 721
casos e 1234 controles, demonstrou a forte associação dos polimorfismos
descritos acima com risco de desenvolver CEC de cabeça e pescoço (ZHANG
et al., 2006).
Os nossos dados não mostraram uma relação significante entre o grupo
de casos e controle, com a presença do polimorfismo tanto para o gene FAS
quanto para o FASL (p= 0,66 e p=0,88, respectivamente). Apesar de nossos
resultados não terem sido estatisticamente significantes, eles demonstram uma
tendência para aumento do risco em portadores dos polimorfismos no caso dos
heterozigotos (p=0,09).
Como escolhemos sítios mais específicos da cabeça e pescoço para a
pesquisa, tivemos uma restrição também no nosso número de pacientes
estudados. Apesar do nosso grupo de casos ser composto por 250 pacientes,
ele é ainda é pequeno quando comparado com vários artigos na literatura. Isto
talvez justifique o fato de não termos comprovação estatística significante.
Apoptose pode ser regulada por diversos fatores, como fator de necrose
tumoral, incluindo FAS e FASL, e de vários genes, como as proteínas p53, bcl-
2, c-myc, ras, e c-FOS importantes no ciclo celular. A literatura demonstrou que
o sistema FAS/FASL afeta significativamente a sobrevida dos pacientes com
tumores em vários sítios, através da diminuição da expressão do FAS e
aumento da expressão do FASL. Estudos em carcinoma de pulmão (ZHANG et
al., 2005), CEC de esôfago (SHIBAKITA et al., 2000) e hepatocarcinoma
(NAGAO et al.,1999) relataram que a fraca expressão do FAS está relacionada
45
com pior prognóstico. O sistema FAS/FASL é mediador da citotoxicidade de
células T e assim, células T FASL-positivas podem eliminar as células tumorais
FAS-positivas por induzir apoptose. A perda da expressão do FAS poderia
resultar em diminuição da sensibilidade das células tumorais para a atividade
citotóxica dos linfócitos T.
A literatura demonstra a correlação positiva entre a expressão do FAS e
apoptose. Este achado foi encontrado por vários autores como Gratas et al.
(1998) em CEC de esôfago, Nagao et al. (1999) no carcinoma hepatocelular e
Ohno et al. (2000) no carcinoma gástrico. Assim, a diminuição da expressão do
FAS poderia prejudicar apoptose de células tumorais não apenas em resposta
a células T citotóxicas, mas também em resposta ao suicídio autócrino via
células tumorais FASL positivas.
Em nosso estudo encontramos uma expressão diminuída do FAS na
maioria dos pacientes estudados. O FAS foi classificado como positivo forte em
apenas 20% dos tumores, enquanto que 80% foram negativos ou positivos
fracos. Este achado está de acordo com a literatura.
Gratas et al. (2000) demonstraram que a expressão do FAS foi limitada
apenas a uma pequena população de células neoplásicas, na maioria dos
carcinomas epidermóides de esôfago. Esta diminuição da regulação da
expressão FAS pode ser um mecanismo de defesa das células tumorais para
escapar do ataque de células T citotóxicas ativadas, que estão freqüentemente
presente nesses tumores.
Estes achados também foram semelhantes no fígado, que mostraram
uma perda significativa da expressão FAS na maioria dos hepatocarcinomas,
enquanto os hepatócitos normais expressam o FAS constitutivamente (NAGAO
et al.,1999).
Analisamos também a ocorrência de relação entre o genótipo e a
expressão da proteína tanto para o gene FAS quanto para o gene FASL.
Apesar de vários autores, como Huang et al. (1997), Sibley et al. (2003), Sun et
al. (2004) e Zhang et al. (2006) terem demonstrado que o polimorfismo -670
A/G na região promotora do gene FAS causava diminuição da expressão desse
gene, enquanto o polimorfismo -844 T/C do gene FASL aumentava a sua
expressão, nossos resultados não confirmaram esses dados. Não houve
relação significante entre esses dados.
46
Nossos dados também foram discordantes da literatura em relação ao
estadiamento e grau de diferenciação histológica. Autores como Gratas et al.
(1998), Shibakita et al. (2000) e Ohno et al. (2000), demonstraram que a
expressão positiva do FAS estava relacionada a tumores em fases mais iniciais
e bem diferenciados histologicamente, comparados a expressão fraca ou
negativa. Não encontramos diferença significante entre os dois grupos
relacionados ao estadiamento e ao grau de diferenciação histológica (p=0,98 e
p=0,53, respectivamente).
Quanto às características patológicas, encontramos apenas a
associação da expressão do FAS com invasão linfática (p=0,01), achado
interessante já que este dado pode estar associado à recidiva. A literatura
mostra a associação da invasão vascular linfática com recidiva regional, isto é
maior risco de metástase linfonodal. A expressão do FASL teve associação
com invasão perineural, importante fator de recidiva local (p=0,01). Porém este
dado foi o oposto do esperado, já que a expressão do FASL se mostrou como
fator de proteção. Não houve relação significante com a presença de infiltrado
inflamatório tanto para o FAS quanto para o FASL (p=0,67 e p=0,56,
respectivamente).
Para análise da sobrevida, nossos pacientes foram acompanhados por
pelo menos 36 meses. Avaliamos a sobrevida livre de doença e a sobrevida
específica dividindo os pacientes em grupos de acordo com as variáveis
estudadas. Apesar da diferença de comportamento dos tumores de boca e
orofaringe, em relação à evolução e prognóstico, em nosso estudo optamos
pela análise em conjunto, já que este fator não influenciou estatisticamente na
sobrevida livre de doença e específica (p=0,80 e p=0,96, respectivamente).
Em relação à sobrevida, nossos dados deixam demonstram associação
entre a expressão do FAS e o prognóstico. A expressão positiva do FAS e
FASL foram fatores independentes de para sobrevida livre de doença, em
análise multivariada.
Os pacientes que tiveram expressão positiva do FAS, apresentaram uma
melhor sobrevida livre de doença. A sobrevida livre de doença foi
significativamente menor em pacientes com expressão negativa do FAS
(p=0,03). A curva de sobrevida livre de doença confirma esta afirmação. Até 3º
ano, a maioria dos pacientes FAS positivo, cerca de 80%, não apresentaram
47
recidiva, comparado com apenas 49% dos pacientes negativos. Isto significa
que a expressão do FAS está relacionada à possibilidade de recidiva tumoral,
sugerindo que este marcador possa ser um preditor independente de
recorrência da doença.
Um estudo realizado com pacientes portadores de CEC de esôfago,
demonstrou resultados semelhantes aos nossos. Neste estudo, 81,2% dos
pacientes que tinham a expressão forte do FAS estavam vivos sem doença
após 5 anos, enquanto apenas 38,1% dos que tinham expressão fraca da
proteína se encontravam nestas condições (Shibakita et al., 1999).
Outro estudo utilizando CEC de faringe encontrou uma associação entre
expressão positiva do FAS e FASL e a presença de metástase linfonodal (Shi
et al., 2002).
Em nosso estudo, dos 17 pacientes positivos para o FAS, 5 (30%)
apresentavam lesões em fase inicial ( estadiamento clínico II), enquanto 12
(70%) apresentavam lesões avançadas, sendo 5 (30%) no estadiamento
clínico III e 7 (40%) estadiamento clínico IV. Destes pacientes 7 (40%)
apresentaram recidivas durante a evolução da doença, distribuídas da seguinte
forma: 3 locais, 3 regionais e 1 metástase à distância.
Dos pacientes com expressão do FAS negativa, 32 (47%) apresentaram
recidivas, sendo a maioria recidivas locais (63%). Neste grupo foi mais difícil
controlar a doença após a recidiva, ocasionando a morte por câncer em 18
(56%) pacientes e deixando 7 (22%) vivos com a doença. Já no grupo de
pacientes positivo para o FAS o controle das recidivas ocorreu em 4 pacientes
(57,1%).
Diante deste quadro poderíamos sugerir a utilização da expressão do
FAS como marcador de recidiva. Já que os pacientes com expressão negativa
apresentaram principalmente recidivas locais, nestes poderiam ser realizado
um tratamento mais agressivo localmente, isto é com uma margem mais
ampla, na tentativa de um melhor controle da doença. Além disto, poderíamos
intensificar o acompanhamento destes pacientes com intuito de
diagnosticarmos recidivas precoces, onde teríamos mais chances de controle
da doença.
A expressão positiva do gene FASL já foi relacionada, por vários
autores, com estadiamento avançado, diferenciação histológica, metástase
48
linfonodal e pior prognóstico, demonstrado por curva de sobrevida livre de
doença e sobrevida global. Isto seria explicado pela formação de um sítio
imuno-privilegiado, causado pelo aumento da expressão do FASL pelas células
tumorais, com o objetivo de escapar do ataque do sistema imunológico. (HO et
al., 2004; LORO et al., 1999; XU et al., 2005). Em nossos dados encontramos
uma relação significante da expressão positiva do FASL com recidiva tumoral,
porém como fator de proteção [OR=0,33 (CI:0,13-0,81) (p=0,01)], isto é,
contrário a literatura descrita. Porém muitas questões ainda precisam ser
esclarecidas: será que a proteína do FASL detectada por imuno-histoquímica é
funcional? Há relatos de que, em outros tecidos tumorais, de que a proteína de
membrana FASL tenha sido clivada, porém as conseqüências funcionais ainda
não foram compreendidas (LORO et al., 1999).
A análise da curva de sobrevida específica demonstrou uma importante
relação entre a expressão do FAS e prognóstico em nosso estudo, sendo
coincidente com dados da literatura.
Conforme o esperado, os pacientes que não expressaram a proteína
apresentaram uma pior sobrevida específica, comparado com os pacientes
com expressão positiva fraca e positiva forte (p=0,008). Aos 36 meses, apenas
28% dos pacientes negativos estavam vivos, contra 57% dos positivos fracos e
78% dos positivos fortes.
Utilizando análise multivariada, apenas a expressão do FAS e o
estadiamento influenciaram na sobrevida específica da doença. Os pacientes
com expressão negativa tinham um risco aumentado em 5,91 vezes de morte
relacionada com a doença quando comparado com pacientes positivos fortes
(p=0,01). Como já foi citado anteriormente, o sítio primário também não
influenciou na sobrevida especifica (p=0,96).
Esses dados concordam com o estudo realizado por Shibakita et al.
(2000), em pacientes portadores de CEC de esôfago que demonstraram que a
expressão do FAS foi fator independente para sobrevida, no qual pacientes
com expressão fraca do FAS tinham o risco aumentado comparado com
pacientes com expressão forte (p=0,01).
O Papel da expressão do FAS também foi demonstrado em pacientes
portadores de CEC de laringe. Uma série com 45 pacientes, analisados através
de imunohistoquímica, demonstrou que a expressão do FAS está associada
49
com uma maior sobrevida, isto é um melhor prognóstico. Os resultados deste
estudo são semelhantes aos encontrados no nosso, onde os autores concluem
que esse marcador poderia ser importante na utilização clínica (Asensio et al.,
2007)
Estudos demonstram que a apoptose espontânea é um importante fator
de prognóstico em carcinoma gástrico. Eles referem ainda que a expressão
positiva do FAS e a presença de linfócitos CD8 ativados influenciam a
apoptose de forma significante, estando assim associado à melhor sobrevida
global (Ohno et al., 2000).
Diante dos achados acima descritos, podemos sugerir que a análise da
expressão das proteínas FAS e FASL possa fazer parte de um painel
histoquímico utilizado para a avaliação da possível evolução da doença nos
pacientes com CEC. Acreditamos que essas proteínas poderão ser úteis na
indicação da extensão do tratamento e acompanhamento, já que as sobrevidas
dos pacientes foram modificadas segundo a expressão do FAS e FASL.
50
CONCLUSÕES
51
7 - CONCLUSÕES
De acordo com nossos resultados chegamos as seguintes conclusões:
Não há relação dos polimorfismos FAS -670 A/G e FASL -844 T/C com o
risco de desenvolvimento de carcinoma epidermóide de boca e
orofaringe.
A presença dos polimorfismos FAS –670A/G e FASL –844T/C não
influenciam a expressão das proteínas no tumor.
Pacientes FAS positivos e pacientes FASL positivos apresentam uma
diminuição do risco de recidiva comparado com pacientes negativos.
Pacientes com expressão positiva do FAS apresentam maior sobrevida
livre de doença e maior sobrevida específica. A expressão do FASL não
influencia as sobrevidas.
52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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58
Abstract
Introduction: Genes FAS and FASL, components of the large family of TNF,
are part of one of the pathways of apoptosis, are important in the control and
development of various types of cancer in sites such as esophagus, lung and
head and neck. Objectives: To correlate the polymorphisms FAS-670A / G and
FASL-844T / C at risk of developing squamous cell carcinoma of the mouth and
oropharynx. The polymorphisms correlate to their respective proteins expressed
in tumor and that expression correlates to the prognosis of the disease.
Methods: 250 patients with squamous cell carcinoma of the mouth and
oropharynx were compared to 215 control patients, evaluated by PCR for
identification of polymorphisms FAS-670A / G and FASL-844 T / C. The gene
expression was assessed by immunohistochemistry in 85 cases. Results:
There was no significant difference between the group of cases and controls for
the presence of polymorphisms FAS-670A / G and FASL-844T / C (p = 0.66
and 0.88, respectively). Also there was no significant relationship between the
genotypes of FAS and with tumor expression of FASL protein (p = 0.41 e p=
0.29, respectively). The positive expressions of both the FAS and the FASL
were factors of protection against tumor recurrence [OR = 0.2 (CI = 0,06-0,7; p
= 0.01)] and [OR = 0.34 ( CI = 0,14-0,85, p = 0.01)], respectively. Patients with
positive expression of the FAS had higher disease-free survival (p = 0.03) and
higher disease specific survival (p = 0008). Conclusion: the presence of
polymorphisms FAS-670A / G and FASL-844T / C did not influence the risk of
cancer of the mouth and oropharynx and the expression of its protein. Patients
positive for the FAS and FASL protein showed a reduced risk of recurrence.
Inconclusion, patients with positive expression of the FAS have higher disease-
free survival and higher survival specific.
59
Apêndice
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