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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
ESTUDO DA FREQUÊNCIA DE Acanthamoeba E BACTÉRIAS EM
BIOFILME E LÍQUIDO DE CONSERVAÇÃO DE ESTOJOS DE LENTES
DE CONTATO
Dissertação de Mestrado
Claiton José Pens
Porto Alegre, 2008
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
ESTUDO DA FREQUÊNCIA DE Acanthamoeba E BACTÉRIAS EM
BIOFILME E LÍQUIDO DE CONSERVAÇÃO DE ESTOJOS DE LENTE DE
CONTATO
Claiton José Pens
Dissertação apresentada como pré-requisito para a obtenção do grau de
Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
Abril, 2008
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iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço em especial às duas melhores influências científicas, que
um mestrando poderia ter minha orientadora Prof. Dra. Marilise Brittes Rott e
co-orientadora Prof. Dra. Marisa da Costa, que me mostraram como andar pelo
caminho da produção científica. Com ética profissional e paciência,
trabalharam em mim uma grande falha: a produção textual.
A todo o corpo docente do PPGMAA, pelo compartilhamento de seu
conhecimento, suas experiências profissionais, motivo que torna o professor
realmente insubstituível no processo de aprendizagem.
A todos os colegas, por participarem ativamente de discussões
científicas, ora respondendo ora perguntando. E mais ainda àqueles que direta
ou indiretamente cooperaram para o desenvolvimento deste trabalho.
À minha família, por fornecer uma base de apoio fundamental à
minha formação, apoiando no mais amplo sentido da palavra.
A todos aqueles profissionais técnicos que de alguma forma
cooperam para a funcionalidade das instalações físicas dos laboratórios, sem
os quais o trabalho seria inviabilizado.
Ao setor de oftalmologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, por
facilitar as coletas em seus pacientes.
A CAPEs por apoiar financeiramente a atividade de pesquisa.
iv
ESTUDO DA FREQUÊNCIA DE Acanthamoeba E BACTÉRIAS EM
BIOFILME E LÍQUIDO DE CONSERVAÇÃO DE ESTOJOS DE LENTE DE
CONTATO
1
.
Autor: Claiton José Pens
Orientadora: Marilise Brittes Rott
Co-orientadora: Profa. Dra. Marisa da Costa
RESUMO
A popularização das lentes de contato possibilitou um aumento na incidência
de infecções oculares causadas por diversos microrganismos. Os estojos de
lentes de contato compartilham a microbiota do meio ambiente corporal e a
ocular, podendo conter biofilmes. O presente trabalho objetivou avaliar a
presença de bactérias e Acanthamoeba spp. no biofilme e líquido de
conservação de lentes de contato. Oitenta e um voluntários requisitados no
setor de oftalmologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e no Campus
Central da UFRGS, responderam um questionário com 17 perguntas e
forneceram o estojo de lentes de contato. O material foi coletado entre julho de
2006 e fevereiro de 2007. As amostras foram inoculadas em duplicata em ágar
sangue, para isolamento de bactérias e ágar não-nutriente 1,5% com uma
sobrecamada de Escherichia coli, para isolamento de Acanthamoeba spp.
Após o isolamento, obteve-se uma contagem bacteriana que variou de zero a
3x10
6
unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Foram identificados 51
gêneros compostos por 10 espécies de bastonetes Gram-negativos, 11
espécies de bastonetes Gram-positivos, 11 de cocos Gram-positivos e. 19
espécies de cocobastonetes Gram positivos. Das 81 amostras analisadas, 7
(8,6%) foram positivas para Acanthamoeba spp. e o isolamento apresentou
correlação com o maior número de UFC/mL. O gênero Acanthamoeba foi
confirmado pela amplificação do DNA utilizando oligonucleotídeos iniciadores
específicos para o gênero. Usuários de lentes de contato mais jovens,
apresentaram maior contaminação em seus estojos.
1
Dissertação de Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Instituto de Ciências Básicas da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, RS, Brasil. (84p.) Abril, 2008.
v
STUDY OF FREQUENCY OF Acanthamoeba AND BACTERIA IN BIOFILM
AND LIQUID OF CONTACT LENS CASE
1
Author: Claiton José Pens
Supervisor: Marilise Brittes Rott
Co-Supervisor: Marisa da Costa
ABSTRACT
The popularization of contact lenses allowed an increase in the incidence of eye
infections caused by various microorganisms. The cases of contact lenses
share the microbiota of the body and eye environment and may contain
biofilms. This study aimed to evaluate the presence of bacteria and
Acanthamoeba spp. in biofilm and preservative liquid of contact lenses. Eighty
one volunteer requested in the division of ophthalmology of the Hospital de
Clinicas in Porto Alegre and the Central Campus of the Federal University of
Rio Grande do Sul, answered a questionnaire with 17 questions and provided
the case of contact lenses. The material was collected between July 2006 and
February 2007. The samples were inoculated in duplicate on blood agar, for
isolation of bacteria and non-nutrient agar 1.5% with the addition of heat-killed
Escherichia coli for isolation of Acanthamoeba spp. After isolation, the bacterial
number ranged from zero to 3x10
6
colony forming units (CFU)/mL. Fifty one
isolate of bacteria were identified including by 10 species of Gram-negative
bacilli, 11 species of Gram-positive bacilli, 11 species of Gram-positive cocci
and 19 species of Gram-positive coccobacilli. Of the 81 samples analyzed, 7
(8.6%) were positive for Acanthamoeba spp and the isolation slowed correlation
with the largest number of CFU/mL. The genus Acanthamoeba was confirmed
by DNA amplification using primers specific to the genus. Younger users of
contact lenses presented greater contamination in its contact lens case.
1
Master of Science dissertation in Agricultural and Environmental Microbiology, Instituto de Ciências
Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (84p.) April,
2008.
vi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................... 4
2.1. Lentes de contato ............................................................................................................... 4
2.2. O estojo das lentes de contatos ......................................................................................... 5
2.3. Olhos .................................................................................................................................. 6
2.4. Microbiota ocular e patologias............................................................................................ 9
2.4.1. Bactérias ...................................................................................................................... 9
2.4.2. Ceratite bacteriana..................................................................................................... 10
2.4.3. Acanthamoeba spp.................................................................................................... 11
2.4.3.1. Classificação de Acanthamoeba spp.................................................................. 12
2.4.3.2. Termotolerância de Acanthamoeba spp. ............................................................ 14
2.4.4. Patologias causadas por Acanthamoeba spp. .......................................................... 15
2.4.4.1. Ceratite por Acanthamoeba spp. ........................................................................ 15
a) Patofisiologia da ceratite amebiana ............................................................................. 17
2.4.4.2. Encefalite amebiana granulomatosa................................................................... 18
2.5. Biofilme............................................................................................................................. 19
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................... 21
3.1. Obtenção de amostras ..................................................................................................... 21
3.2. Cepas controle ................................................................................................................. 22
3.3. Processamento das amostras.......................................................................................... 22
3.3.1. Isolamento e identificação de bactérias..................................................................... 22
3.3.2. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos............................................................. 23
3.3.3. Isolamento e identificação de Acanthamoeba spp. ................................................... 23
3.4. Exflagelação dos organismos........................................................................................... 24
3.5. Axenização da cultura de Acanthamoeba spp................................................................. 24
3.6. Identificação das AVLs por critérios morfológicos............................................................ 25
3.6.1. Coloração das amebas .............................................................................................. 25
3.6.2. Confirmação do gênero Acanthamoeba spp. pela técnica da PCR. ......................... 26
3.6.2.1. Extração de DNA................................................................................................. 26
3.6.2.2. Reação em cadeia da polimerase....................................................................... 27
3.7. Criopreservação das cepas axenizadas .......................................................................... 28
3.8. Teste de tolerância à temperatura.................................................................................... 28
3.9. Análise estatística............................................................................................................. 29
3.9.1. Cálculo de número amostral...................................................................................... 29
3.9.2. Avaliação estatística .................................................................................................. 2
9
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................. 30
4.1. Caracterização dos estojos e usuários de lentes de contato a partir da análise do
questionário ............................................................................................................................. 30
4.2. Análise microbiológica...................................................................................................... 33
4.2.1. Contagem bacteriana................................................................................................. 33
4.2.2. Isolamento e Identificação bacteriana ....................................................................... 34
4.2.3. Comparação microbiológica entre os grupos de acadêmicos da UFRGS e pacientes
do HCPA. ............................................................................................................................. 39
4.3. Antibiograma com as bactérias isoladas dos estojos de lentes de contato..................... 40
4.4. Caracterização do usuário AVL positivo .......................................................................... 44
4.5. Avaliação microbiológica dos estojos AVL positivos........................................................ 45
4.5.1. Comparação entre os grupos de acadêmicos da UFRGS e pacientes do HCPA..... 45
4.6. Identificação do gênero Acanthamoeba spp.................................................................... 46
4.6.1. Teste de exflagelação das AVL ................................................................................. 49
4.6.2. Confirmação do gênero Acanthamoeba spp. ............................................................ 50
4.7. Teste de tolerância à temperatura. .................................................................................. 51
5. CONCLUSÕES E PERPECTIVAS......................................................................................... 54
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 56
vii
A. RELAÇÃO DE TABELAS
Tabela 1. Caracterização do usuário de lentes de contato................................ 30
Tabela 2. Bastonetes Gram-negativos isolados de estojos de lentes de
contato................................................................................................................
35
Tabela 3. Bastonetes Gram-positivos isolados de estojos de lentes de
contato................................................................................................................
36
Tabela 4. Cocos Gram-positivos isolados de estojos de lentes de
contato................................................................................................................
37
Tabela 5. Cocobastonetes Gram positivos isolados de estojos de lentes de
contato................................................................................................................
38
Tabela 6. Identificação dos cistos de Acanthamoeba spp. .............................. 47
Tabela 7. Teste de tolerância de Acanthamoeba spp. a diferentes
temperaturas.......................................................................................................
52
viii
B. RELAÇÃO DE FIGURAS
Figura 1. Estojo de lentes de contato...................................................... 6
Figura 2. Desenho esquemático da morfologia ocular............................ 7
Figura 3. Classificação taxonômica de AVL............................................ 11
Figura 4. Morfologia celular de Acanthamoeba spp. .............................. 12
Figura 5. Morfologia cística de Acanthamoeba spp. .............................. 13
Figura 6. Aspecto da ceratite amebiana.................................................. 15
Figura 7. Patofisiologia da ceratite.......................................................... 17
Figura 8. Comparação da microbiota existente em 81 estojos de
lentes de contato de voluntários, segundo o tipo de voluntário.............
39
Figura 9. Isolado de AVL 18M................................................................ 48
Figura 10. Isolado de AVL 20P.............................................................. 48
Figura 11. Isolado de AVL 30G.............................................................. 48
Figura 12. Isolado de AVL 32S.............................................................. 48
Figura 13. Isolado de AVL 45M............................................................. 48
Figura 14. Isolado de AVL 48 L............................................................. 48
Figura 15. Isolado de AVL 78L.............................................................. 49
Figura 16. Análise molecular................................................................. 50
ix
C. RELAÇÃO DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% percentual
- negativo
+ positivo
® marca registrada
°C Graus Celsius
µL microlitro
µL/mL microlitro por mililitro
µmol micromol
AIDS síndrome da imunodeficiência adquirida
ATCC Americam Type Culture Collection
apud
citado por
AVL amebas de vida livre
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
cm
2
centímetro quadrado
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
et al.
e colaboradores
EUA Estados Unidos da América
h hora
kDa quilodalton
PCR reação em cadeia da polimerase
RNA ácido ribonucléico
RPM rotações por minuto
RS Rio Grande do Sul
sp. espécie
spp. espécies
ssu subunidade menor
TE Tris-EDTA
TM
trade mark
TSA ágar triptose de soja
U Unidade
UFC Unidade formadora de colônia
UFRGS
Universidade Federal do Rio Grande do
Sul
V/V volume por volume
1
1
1. INTRODUÇÃO
Durante a década de 80 os avanços nas pesquisas oftalmológicas e
a tecnologia de materiais permitiram a popularização das lentes de contato,
proporcionando correções de visão, que antes não eram possíveis com a
utilização de óculos, como a ceratocone, por exemplo. Assim, o uso das lentes
de contato, principalmente as lentes flexíveis e de uso prolongado tornou-se
mais freqüente, havendo um aumento proporcional do número de casos de
inflamações oculares.
O manuseio incorreto das lentes de contato e dos produtos
envolvidos em sua manutenção serve como fonte de microrganismos
oportunistas como Acanthamoeba spp. e Pseudomonas aeruginosa.
Os olhos possuem um micro-habitat, formado pelo saco conjuntival
com uma microbiota peculiar, apresentando um grande número de
microrganismos oportunistas. Infecções oculares geralmente resultam de
desequilíbrios como a baixa de imunidade, lesão na integridade dos tecidos,
uso de antimicrobianos ou a introdução de algum patógeno capaz de superar
todas as defesas naturais e estabelecer-se.
2
Os olhos possuem uma microbiota equilibrada e bastante específica
constituída principalmente por bactérias como Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Neisseria meningitidis.
Essas três últimas espécies são freqüentemente encontradas em infecções
oculares, embora fazendo parte da microbiota. Os biofilmes, presentes nas
lentes de contato, provocam desconforto e podem causar inflamações por
trauma ou proporcionar a instalação de um processo infeccioso. A infecção
corneal é a mais séria complicação que pode ocorrer em usuários de lentes de
contato, tanto das lentes corretivas da visão como das cosméticas.
Entre as infecções oculares, a ceratite por Acanthamoeba spp. tem
mostrado um aumento significativo principalmente entre usuários de lentes de
contato. A infecção caracteriza-se por dor, fotofobia, diminuição da visão,
lacrimejamento e edemas. Em avaliações biomicroscópicas observa-se
infiltrados estromais, defeitos no epitélio da córnea e raramente esclerite.
A Acanthamoeba spp. é uma ameba de vida livre (AVL) amplamente
distribuída no ambiente. No olho seu crescimento encontra-se facilitado pela
presença da microbiota natural, fonte de alimento para este protozoário.
Inicialmente, a ocorrência da ceratite acantamebiana estava
relacionada com traumatismos oculares. Atualmente, estudos demonstram que
mais de 90% dos casos ocorrem em usuários de lentes de contato, sendo o
uso inadequado das lentes o principal fator predisponente.
O estojo de lentes de contato é o local onde as lentes são
acondicionadas quando não estão em uso e são freqüentemente contaminados
por microrganismos colonizadores primários, presentes na solução de limpeza,
3
nas lentes de contato, mãos e ar, formando o biofilme e sujeitando as lentes de
contato a um processo contínuo de contaminação.
As infecções oculares alteram a integridade do olho e produzem
uma significativa destruição tecidual, que pode culminar na perda da visão e
até na enucleação. Esses problemas necessitam de um diagnóstico e uma
terapia apropriados para melhorar o prognóstico, principalmente no caso das
ceratites e endoftalmites. Conhecer os microrganismos causadores do
processo e progressão da doença, bem como o estabelecimento de um
tratamento coerente e eficaz influenciam a evolução e o prognóstico. A ceratite
por Acanthamoeba spp., em especial, é de difícil tratamento devido às
características biológicas do protozoário, sendo o diagnóstico precoce
essencial para evitar tratamentos mais agressivos.
A proposta deste trabalho é conhecer os microrganismos presentes
em estojos de lentes de contato de usuários assintomáticos, bem como avaliar
os riscos de contaminação aos quais os usuários estão expostos, dada a
relevância das infecções oculares.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Lentes de contato
As lentes, em geral, possuem a mesma função corretiva dos óculos
convencionais, porém elas são mais leves e invisíveis sobre a córnea, podendo
ser lentes corretivas, cosméticas ou terapêuticas. Algumas condições
oftalmológicas como a ceratocone podem não ser precisamente corrigida com
o uso de óculos, fazendo-se necessária a utilização de lentes de contato (Dixie,
1998)
Estima-se que cerca de 125 milhões de pessoas no mundo usem
lentes de contato (2% da população mundial). Os tipos de lentes utilizadas e
prescritas variam consideravelmente entre os países. As lentes de contato
rígidas representam cerca de 20% das lentes prescritas no Japão, Holanda e
Alemanha, porém representam menos de 5% das prescritas na Escandinávia,
por exemplo (Dixie, 1998; Efron, 2002).
As primeiras lentes de contato foram produzidas na Alemanha em
1887 e, desde o início, procuraram-se materiais mais eficientes na sua
5
produção. Na década de 30 foi desenvolvido o polimetilmetacrilamida que foi
aperfeiçoado até a década de 80, melhorando a qualidade das lentes e
diminuindo os custos de produção, permitindo assim a sua popularização. Na
década de 90 foi desenvolvido o hidrogel (lente gelatinosa), que facilita as
trocas gasosas entre a conjuntiva e o meio ambiente (Dart, 1990; Larkin et al.,
1990).
Com a popularização do uso das lentes de contato, principalmente
as flexíveis e de uso prolongado, houve um aumento proporcional do número
de casos de inflamações oculares. Isto porque o manuseio do estojo e dos
produtos envolvidos com sua manutenção serve como veículo para
microrganismos oportunistas, como Acanthamoeba spp. e Pseudomonas
aeruginosa (Limberg, 1991). Usuários de lentes de contato estão 80 vezes
mais sujeitos às infecções causadas por Acanthamoeba spp. do que pessoas
que não as utilizam (Poggio et al., 1989).
Atualmente existe uma variedade de lentes de contato disponíveis
no mercado, ficando a critério do especialista a sua prescrição. Os tipos são
classificados conforme o material que elas são construídas: rígidas, gelatinosas
de uso diário e de uso contínuo. As gelatinosas de uso contínuo podem ser
utilizadas inclusive para dormir, caso o usuário esteja bem adaptado (Swarbrick
et al., 2001).
2.2. O estojo das lentes de contatos
O estojo (figura 1), onde habitualmente são acondicionados as
lentes de contato retém resíduos com o tempo e poderão constituir a origem da
6
contaminação das lentes. Este estojo encontra-se permanentemente banhado
pela solução de conservação, na qual as lentes ficam imersas. Caso a
manipulação, seja inadequada ocorre um processo de contaminação contínua
formando biofilmes, tanto no estojo como nas lentes de contato. A origem a
contaminação pode ser a solução de limpeza, as lentes ou as próprias mãos,
contaminados com microrganismos (Davey & O’Toole, 2000; Kyaw, 2006).
2.3. Olhos
Os olhos são órgãos receptores altamente complexos, que fazem
parte do sistema sensorial. São encarregados de captar estímulos luminosos
para que o sistema nervoso possa exercer sua função integradora e
coordenativa (Dangelo & Fattini, 2004). Possuem um sistema complexo de
proteção, formado pelos supercílios, cílios, pálpebras e glândulas lacrimais.
Internamente as pálpebras possuem uma membrana muito fina que também
reveste a córnea e está disposta em forma de saco. A conjuntiva (figura 2), por
sua vez está intimamente relacionada com o sistema linfático, constituindo-se
também em uma barreira mecânica e biológica contra microrganismos (Knop &
Knop, 2000). A lágrima, que banha a conjuntiva, contém enzimas como
FIGURA 1. Estojo de lente de contato.
7
FIGURA 2. Desenho esquemático de corte
transversal demonstrando as principais estruturas
do olho.
Fonte: Adaptado de Hamilton (1982).
lisozima, lactoferrina e betalisina, que atuam como anti-sépticos naturais
(Limberg, 1991).
A córnea é a parte anterior transparente e protetora do olho que fica
localizada na região polar anterior do globo ocular. A córnea e o cristalino têm a
função de focar a luz através da pupila para a retina, como se fosse uma lente
fixa. São as lágrimas que mantêm a córnea úmida e saudável. Sua estrutura é
avascularizada e sua inervação é desprovida de bainha de mielina, o que
garante sua total transparência (Smolin, 1987; Dangelo & Fattini, 2004).
8
A conjuntiva é a camada superficial da córnea e compõe-se de
quatro a seis camadas de células do tipo epitélio escamoso estratificado, não
sendo queratinizado. Enquanto as células mais superficiais (mais antigas)
começam a descamar, outras células novas vão tomando a forma estratificada.
O epitélio apresenta-se com uma superfície lisa e brilhante, assegurando a
capacidade refrativa. Funciona como um bloqueio contra perda de líquidos e
evita a penetração de microrganismos (Hamilton, 1982; Dangelo & Fattini,
2004).
A camada seguinte ao epitélio é a membrana de Bowman, a qual é
formada de células do epitélio basal, da lâmina basal e de fibras do estroma
anterior. A sua espessura varia de 8 a 12 µm e é formada por fibras de
colágeno e proteoglicanos, tendo o poder de se regenerar uma vez lesionada.
Sua função baseia-se em manter a integridade e a organização epitelial e
manter o epitélio separado do estroma. Profundamente ao estroma e
revestindo a superfície estromal se encontra a membrana Descemet. Esta
membrana está sob grande pressão intra-ocular e quando seccionada se retrai
não se regenerando após lesão. Quando ocorre perda de células endoteliais,
aquelas células que sobraram deslocam-se na direção da área lesionada para
preencher esse espaço, aumentando seu tamanho (polimegatismo) e sua
forma (pleomorfismo). Todo esse mecanismo é responsável pelo reparo do
endotélio, sendo a mitose nas células endoteliais adultas lenta e escassa. É
imprescindível enfatizar que o endotélio é de suma importância para manter a
transparência e organização das camadas da córnea (Hamilton, 1982; Knop &
Knop, 2000).
9
Alguns microrganismos, como a Acanthamoeba spp. podem invadir
os tecidos e se estabelecer no estroma, que é o interior da córnea causando
graves infecções que podem culminar com a enucleação do globo ocular (Khan
2002).
2.4. Microbiota ocular e patologias
Os olhos possuem uma microbiota equilibrada e bastante específica.
A composição da comunidade microbiana tem início ao nascer, quando os
olhos são rapidamente colonizados por vários microrganismos, que se mantêm
até a fase adulta com algumas modificações na composição (Kaufman et al.,
2000).
2.4.1. Bactérias
A microbiota bacteriana do indivíduo adulto é constituída
principalmente por bactérias como Staphylococcus epirdermidis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Neisseria meningitidis. O
processo infeccioso ocorre quando algum fator modifica as condições normais
do olho, podendo ser químico como a adição de medicamentos ou físico como
atritos causados pela colocação de lentes de contato. O dano causado pelos
microrganismos está relacionado com a capacidade deles produzirem fatores
agressivos às células (Limberg, 1991).
Cerca de 90% dos casos de ceratites bacterianas são causadas por
organismos incluídos nos grupos, Micrococcaceae, Pseudomonaceae e
Enterobacteriaceae. Os organismos mais comumente encontrados causando
10
infecção são Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp. e
Proteus sp. (Vieira et al.,1999; Kaufman et al., 2000).
2.4.2. Ceratite bacteriana
O uso de lentes de contato representa ser o principal fator de risco
para o desenvolvimento de ceratite bacteriana. Calcula-se um aumento de 10 a
15 vezes no risco de ceratite infecciosa pelo hábito de dormir com as lentes de
contato quando comparado com o uso diurno (Stein et al.,1995). A bactéria
Pseudomonas aeruginosa é o microrganismo isolado com maior freqüência em
ceratites bacterianas em usuários de lentes de contato hidrofílicas (gelatinosas)
(Stein et al.,1995; Liesegang, 1997).
Nos Estados Unidos, a incidência anual média estimada de ceratite
é de 21 por 10.000 usuários para uso diário de lente de contato gelatinosa
(Poggio et al.,1989). Esta média é semelhante na Suíça, Escócia e países
baixos (Nilsson & Montan, 1994; Cheng et al., 1999; Seal et al., 1999),
Os biofilmes, além de provocarem desconforto e turvação visual
podem ocasionar irritação local, facilitar a aderência de microrganismos e levar
à infecção (Liesegang, 1997). Pseudomonas aeruginosa é especialmente
capaz de aderir-se à superfície da lente, principalmente na presença de
biofilmes. A hipoxia durante o fechamento palpebral (durante o sono) resulta
em comprometimento da barreira epitelial, permitindo a adesão e subseqüente
invasão por microrganismos (Aswad et al.,1989).
11
2.4.3. Acanthamoeba spp.
A Acanthamoeba spp. é um protozoário pertencente ao filo
Sarcomastigophora e subfilo Sarcodina (figura 3). São amebas de vida livre
(AVL) ubiquitárias, presentes no solo, fontes naturais de água, rios, lagos, água
de torneira, reservatórios, soluções de lentes de contato, piscinas, água
salinizada e ar (Hargrave et al.,1999; Marciano-Cabral & Cabral, 2003).
FIGURA 3. Classificação taxonômica de amebas de vida livre.
Fonte: Adaptado de Corliss (1988).
Este protozoário possui duas formas biológicas: o trofozoíto que é a
forma vegetativa da célula e o cisto que é a forma de resistência (figura 4). Os
trofozoítos variam de 25 a 45 µm de diâmetro e apresentam uma característica
marcante do gênero que são os acantopódios, projeções da membrana celular,
os cistos possuem dupla camada e medem em média 19 µm de diâmetro (Neff
et al.,1969).
12
A significância ecológica de Acanthamoeba spp. está na participação
no ciclo dos nutrientes, fagocitando bactérias, fungos, outros protozoários,
matéria orgânica em decomposição e pinocitando partículas líquidas. Este
protozoário tem sido descrito como um patógeno oportunista, não necessitando
de um hospedeiro para seu ciclo de vida (Hargrave et al.,1999; Niederkorn et
al.,1999).
]
FIGURA 4. Morfologia celular de Acanthamoeba spp. (a) trofozoítica; (b)
cística; VC-vacúolo contrátil, VD-vacúolo digestivo, A-acantopódio, EC-
ectocisto e ED-endocisto (400X). Barra em (a) 15 µm em (b) 20 µm. Fonte:
Laboratório de Parasitologia – Departamento de Microbiologia/UFRGS.
Em condições adversas como desidratação, falta de nutrientes ou a
presença de substâncias tóxicas, os trofozoítos formam cistos resistentes às
agressões ambientais e podem permanecer viáveis no meio ambiente até
encontrar condições favoráveis para retornar à forma de trofozoíto. O maior
tempo de viabilidade já observado foi de 20 anos (Illingworth & Cook.,1998).
2.4.3.1. Classificação de Acanthamoeba spp.
A classificação taxonômica é controversa devido ao desequilíbrio
causado pela supressão de recombinação causada pela reprodução
a
b
13
assexuada. Este tipo de reprodução faz com que ocorra diferenciação
genotípica e fenotípica em uma mesma espécie, originando polimorfismo
(Futuyma, 1992). Muitos autores têm proposto diferentes metodologias para
sua identificação.
Pussard e Pons (1977) propuseram a classificação baseada na
morfologia dos cistos (figura 5), classificando Acanthamoeba spp. em três
grupos. Page (1988), utilizando os critérios morfológicos sugeridos por Pussard
e Pons, juntamente com o comportamento do trofozoíto em diferentes
temperaturas e tipo de locomoção criou uma chave dicotômica para
identificação das AVL, sendo que nesta classificação estão alocadas 22
espécies.
Grupo I – Cistos relativamente grandes, com endocisto estrelado e ectocisto
liso e esférico.
Grupo II – Endocisto levemente estrelado e poligonal com o ectocisto irregular
ou rugoso.
FIGURA 5. Morfologia cística de Acanthamoeba spp. a - Grupo I
com aparência estrelado, b- Grupo II com aparência poligonal e c-
Grupo III com aparência circular. Fonte: Adaptado de Page (1988).
a
b c
14
Grupo III – Endocisto arredondado ou fracamente angular e o ectocisto fino e
liso ou fracamente franzido
Nos últimos anos a classificação morfológica deu lugar ao uso de
técnicas moleculares, muitas vezes com o abandono de hipóteses sobre as
relações filogenéticas e o reconhecimento de novas espécies. Esta
metodologia, baseia-se principalmente na comparação da seqüência
conservada dos genes das subunidades 16S e 18S do rDNA. Por este método
o gênero Acanthamoeba está dividido em 16 diferentes genótipos, que estão
relacionados com a virulência da ameba, sendo classificados em T1,T2a e T2b,
T3 à T15 (Gast, 2001; Schuster & Visvesvara, 2004).
2.4.3.2. Termotolerância de Acanthamoeba spp.
A termotolerância é um dos fatores de virulência presentes em
algumas cepas de Acanthamoeba spp. (Walochnik et al., 2000; Khan et al.,
2001, 2002; De Jonckheere, 2003). Apesar do mecanismo de adaptação
termotolerante não estar bem definido, alguns estudos com cepas de
Acanthamoeba spp., isoladas de infecções, demonstraram que há uma
correlação entre a patogenicidade e termotolerância. A termotolerância é uma
característica genotípica de algumas AVL que pode se expressar em um
hospedeiro, conferindo a elas a capacidade de permanecerem viáveis nos
mesmos (Odom et al., 1997; Shuster & Visvesvara 2004a).
15
2.4.4. Patologias causadas por Acanthamoeba spp.
Acanthamoeba spp. é um patógeno oportunista causador de ceratite
e encefalite, entre outras infecções (Schuster & Visvesvara, 2004).
2.4.4.1. Ceratite por Acanthamoeba spp.
A ceratite causada por Acanthamoeba spp. é uma infecção da
córnea caracterizada por dor intensa, fotofobia, diminuição da visão,
lacrimejamentos e edemas. Em achados biomicroscópicos de limbite
observam-se infiltrados estromais, defeitos no epitélio da córnea e raramente
esclerite (figura 6) (Marciano-Cabral & Cabral, 2003; Schuster & Visvesvara,
2004b).
FIGURA 6. Aspecto da ceratite amebiana. a) Anel infiltrado em estágio inicial;
(b) Anel de infiltrado em ceratite em estado avançado (5 meses depois do
início dos sintomas). Fonte: Cooke, (2008)
O primeiro diagnóstico de ceratite por Acanthamoeba spp. em
humanos ocorreu em 1973 por Nagington e colaboradores (1974) na Inglaterra
e foi publicado no ano seguinte nos Estados Unidos (Nagington et al., 1974
apud Illingworth et al.,1998). No Brasil, Nosé e colaboradores (1988)
descreveram os primeiros casos.
a
b
16
Inicialmente a ocorrência da doença estava relacionada com
traumatismos oculares, principalmente em áreas rurais. Porém, estudos atuais
demonstram que mais de 90% dos casos ocorrem em usuários de lentes de
contato. Os fatores que predispõem à ceratite nos usuários de lentes de
contato são o uso de soluções não estéreis, banho de piscina usando lentes de
contato e desinfecção inadequada das lentes após o uso (Radford et al.,2002).
Apesar da ampla variabilidade de genótipos, apenas os isolados dos
genótipos T2, T3, T4, T6 e T11 têm sido associados com ceratite (Walochnik et
al., 2000; De Jonckeere, 2003). O genótipo T4 apresenta a dominância de 90%
nos casos de ceratite causadas por Acanthamoeba spp. Sete espécies têm
sido mais freqüentemente associadas a infecções oculares: Acanthamoeba
castellanii (T4), A. lugdunensis (T4), A. polyphaga (T4), A. rhysodes (T4), A.
culbertsoni (T3), A. hatchetti (T11) A. griffini (T3) (Yu et al., 2004).
A presença de endossimbiontes tem sido demonstrada em muitas
espécies de protozoários. Os simbiontes podem ocorrer naturalmente ou
podem representar organismos fagocitados que se adaptaram ao ambiente
intracelular. Bactérias fagocitadas podem crescer e se reproduzir dentro de
protozoários. Vários estudos têm especulado que a endossimbiose bacteriana
possa ser um fator de virulência potencial, pois a bactéria pode sair do
protozoário e provocar processos infecciosos (Szénási et al., 1998).
A endossimbiose ocorre comumente entre membros da família
Acanthamoebidae. O papel de tais bactérias na patogênese permanece
desconhecido, mas elas têm sido implicadas no desenvolvimento de ceratite
amebiana (Fritsche et al., 1993).
17
a) Patofisiologia da ceratite amebiana
As Acanthamoeba spp. aderem-se às glicoproteínas manosiladas,
expostas em alguma lesão do epitélio córneo, através de uma adesina. O
contato com a manose induz o trofozoíto a produzir uma protease
extremamente citotóxica e citolítica para o epitélio córneo, iniciando a invasão
córnea (Muńoz et al., 1982; Huston, 2004).
Os trofozoítos penetram pela membrana de Bowman e invadem o
estroma. Em seguida a ameba produz várias proteases como: serino-protease,
cisteíno-protease, elastase e metaloproteases (figura 7) (Hadas & Mazur, 1993;
Marciano-Cabral & Cabral, 2003).
FIGURA 7. Patofisiologia da ceratite amebiana. 1) Adesão; (2)
produção de proteinase induzida por manose; (3)
Rompimento da membrana de Bowman e invasão do
estroma; (4) Produção de proteases; (5) Ataque aos nervos
córneos; (6) Raramente evolui para endoftalmites. Fonte:
Adaptado de Clarke & Niederkorn (2006).
18
A atividade das enzimas vai produzir a lesão característica da
infecção: o infiltrado em forma de anel (He et al., 1990). A dor associada com a
ceratite amebiana é causada pela ação das enzimas sobre o tecido nervoso da
córnea e dos tecidos adjacentes, que podem ser lisados ou induzidos à
apoptose (Pettit et al., 1996).
2.4.4.2. Encefalite amebiana granulomatosa
O nome da doença se refere à formação de granuloma, devido à
presença do protozoário. Os mecanismos associados com a patologia não
estão muito claros, mas as complicações patofisiológicas envolvem o sistema
nervoso central, onde há a indução de uma resposta pró-inflamatória, a partir
da invasão pela barreira hemato-encefálica e a ligação ao tecido, seguida de
lesão neuronal (Khan, 2003; Schuster & Visvesvara, 2004).
É uma infecção considerada oportunista, que acomete o sistema
nervoso central de indivíduos imunodeprimidos. A invasão pode ocorrer pela
pele (ulcerações) ou pelo trato respiratório (neuroepitélio), seguindo então por
via sangüínea até o sistema nervoso central (Martinez & Visvesvara, 1997)
A infecção é considerada crônica, podendo levar de semanas a
anos para que os sintomas clínicos apareçam. Geralmente, o diagnóstico só é
obtido após a necropsia através da análise microscópica das formas
trofozoíticas no tecido cerebral, porém, a constatação de altos níveis de
anticorpos Acanthamoeba-específicos pode ajudar na confirmação da suspeita
da infecção. Além dessas análises, métodos baseados na reação em cadeia
19
da polimerase (PCR) estão sendo desenvolvidos para agilizar o diagnóstico e
aumentar a chance de cura (Khan, 2003; Schuster & Visvesvara, 2004).
2.5. Biofilme
O conhecimento sobre as bactérias é baseado no estudo de cultura
pura, mas em seus habitats naturais várias espécies de microrganismos vivem
associadas formando comunidades ecológicas, aderidas às superfícies,
compondo um ecossistema estruturado e dinâmico, denominado biofilme
(Ronner & Wong, 1993; Rickard, et al., 2002).
A formação de um biofilme ocorre em etapas distintas, sendo
influenciada por fatores que levarão à adesão, como a disponibilidade e
concentração de nutrientes, pH, temperatura, concentração de eletrólitos, fluxo
de material e o tipo de superfície (Marshall, 1986). Uma ou mais bactérias, da
mesma espécie ou de espécies distintas, se aderem em uma superfície com
um habitat suscetível, sintetizando uma matriz exopolissacarídica, que atua
como substrato para a aderência. As condições do microambiente são
modificadas pela colônia, para que outras bactérias venham a se aderir,
resultando a sucessão colonial na formação de uma comunidade complexa
(Jenkinson & Lappin-Scott, 2001; Richard et al., 2003).
No estojo de lentes de contato os microrganismos presentes são
oriundos das mãos do usuário, das lentes de contato, da microbiota ocular ou
outro local onde a lente tenha tocado ou da solução de manutenção utilizada
para a limpeza da lente e estojo. Após o estabelecimento do biofilme, as lentes
de contato são permanentemente colonizadas fornecendo para a
20
Acanthamoeba spp. um nicho atrativo com nutrientes abundantes e resistência
a desinfetantes (Beattie et al., 2003). Estas condições propiciam a permanência
da ameba na forma trofozoítica, que é a forma infectiva (Dudley et al., 2005;
Garate et al., 2006).
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção de amostras
O presente estudo avaliou a microbiota bacteriana e a presença ou
ausência de amebas de vida livre, em estojos de lentes de contato. Os estojos
foram cedidos sob termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO I) por
81 voluntários: 37 alunos do Campus Central da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS) e 44 pacientes do ambulatório de oftalmologia do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Para a realização da pesquisa o
projeto foi submetido à Comissão de Ética do HCPA (processo número
06290/2006).
A todos os voluntários foi aplicado um questionário (ANEXO II) com
questões envolvendo: dados pessoais, tipo de lente de contato, procedimento
de higienização, tempo e forma de utilização, histórico clínico e terapêutico,
tratamentos e medicamentos utilizados durante alguma infecção. A partir
destas informações foi possível verificar se em algum momento o paciente
apresentou qualquer patologia associada ao uso da lente.
22
3.2. Cepas controle
Foram utilizadas as cepas: Acanthamoeba castelanii (ATCC 50492),
como controle positivo para a PCR, E. coli (ATCC 25922), para cultivo
monoxênico de Acanthamoeba spp., Staphylococcus aureus (ATCC 29213),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 25922)
como cepas controle dos antibiogramas.
3.3. Processamento das amostras
Os estojos foram abertos em condições assépticas e o biofilme
existente em seu interior foi removido utilizando um suabe. A suspensão
formada pelo líquido de conservação e o biofilme removido era transferida para
um tubo de ensaio contendo 800 µL de solução salina 0,85%. O suabe,
juntamente com o líquido, foi agitado 10s à 180 rpm (vórtex Phoenix AP 56)
obtendo-se uma suspensão.
3.3.1. Isolamento e identificação de bactérias
As suspensões obtidas foram submetidas a sucessivas diluições
decimais, em salina, conforme método desenvolvido em testes pilotos, até
convencionarem-se as melhores diluições a serem utilizadas.
Uma alíquota de 100µL, da diluição 10
-1
foi semeada, em duplicata,
por espalhamento em agar acrescido de 5% de sangue ovino, sendo as placas
incubadas a 37ºC por até 48 horas, em aerobiose.
23
Após a incubação, era realizada a contagem de unidades
formadoras de colônias (UFC) nas placas com crescimento bacteriano, seguida
do isolamento de cada tipo de colônia em ágar triptose de soja (TSA).
A identificação bacteriana foi realizada conforme critérios
morfológicos e bioquímicos descritos por e MacFaddin (2000). Todas as cepas
isoladas foram congeladas em caldo infusão de cérebro e coração, 15%
glicerol e conservadas a –20ºC.
3.3.2. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos
O perfil de susceptibilidade das bactérias isoladas foi determinado
frente a vários agentes antimicrobianos através de testes de difusão em ágar,
conforme recomendações do “Clinical and Laboratory Standards Institute”
(CLSI, 2006).
Foram testados os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico,
amoxacilina, cefalotina, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, gentamicina,
rifampicina, tetraciclina e vancomicina.
3.3.3. Isolamento e identificação de Acanthamoeba spp.
Para o isolamento de Acanthamoeba spp., o restante da suspensão
retirada dos estojos foi centrifugada a 250xg durante 10min. Uma alíquota de
100µL do sedimento foi inoculada no centro de uma placa de Petri com ágar
não-nutriente (1,5%) contendo uma sobre-camada de Escherichia coli (o cultivo
de E. coli foi feito em meio TSA por 24h, sendo inativadas a 56ºC/2h antes da
utilização). Após a inoculação do sedimento a placa foi fechada, selada com
24
um filme plástico (Parafilm®) e incubada a 30ºC por até 15 dias (De Carli,
2001).
Durante o período de incubação as placas foram examinadas ao
microscópio óptico (100X) e avaliadas quanto à presença de trofozoítos ou
cistos.
A identificação das amebas foi realizada de acordo com os critérios
morfológicos estabelecidos por Page (1988).
3.4. Exflagelação das amebas
Para a exclusão da espécie Naegleria fowleri, foi realizada em
triplicata a técnica de exflagelação dos microrganismos. Após o crescimento de
trofozoítos nas placas de ágar não-nutriente (1,5%) a superfície do ágar foi
gentilmente raspada e os protozoários transferidos para garrafas de cultivo de
células (25 cm
3
) contendo 10 mL de água destilada e incubadas a 37º C por
uma hora. As garrafas foram examinadas em microscópio invertido a cada 30
min durante 4 horas, para verificar a emissão de flagelos característicos de N.
fowleri. As amostras negativas foram ainda observadas após 24 h (De Carli,
2001; Silva & Rosa, 2001).
3.5. Axenização da cultura de Acanthamoeba spp.
Após a visualização das AVL nas placas, através da observação
microscópica, subcultivos das amebas eram feitos, retirando-se um pedaço do
ágar, onde eram melhor visualizadas as AVLs e onde havia menos
contaminantes como fungos filamentosos. O pedaço de ágar era transferido
25
para outra placa nas mesmas condições da cultura primária. Este procedimento
era realizado até que apenas estivessem na placa Acanthamoeba spp. e o
mínimo possível de contaminantes.
Posteriormente o material foi raspado cuidadosamente, com alça de
platina e transferido para um tubo de ensaio com 5 mL de meio proteose
peptona 2%, extrato de levedo 0,2% e glicose 1,8 % (PYG) (ANEXO 3),
suplementado com penicilina G potássica (400 UI/mL) e estreptomicina (400
µL/mL) e incubado a 30ºC. A cada 2 dias alíquotas eram retiradas e
observadas ao microscópio óptico. Subcultivos foram realizados no mesmo
meio até a obtenção de uma cultura pura (De Carli, 2001).
3.6. Identificação das AVLs por critérios morfológicos
3.6.1. Coloração das amebas
Para a identificação, as amebas eram coradas conforme
metodologia descrita por Brückner (1993). Para a coloração eram utilizadas
culturas axênicas. Uma alíquota de 3 mL do meio com crescimento de amebas
era centrifugada a 5000xg por 3 minutos. O sedimento resultante era
ressuspenso em tampão fosfato pH 7,2 (PBS), sendo uma alíquota transferida
para uma lâmina.
Após secagem à temperatura ambiente, as lâminas eram fixadas em
fixador de Schaudinn (ANEXO 3) durante uma hora, à temperatura ambiente.
Após a fixação eram coradas em cubas de Coplin pela coloração de tricrômico
(ANEXO 3) e observada em microscópico óptico (1000X).
26
Os organismos foram avaliados quanto as suas características
morfológicas e classificados segundo critérios descritos por Page (1988), que
incluem os seguintes parâmetros: diâmetro do cisto, número de braços, forma
do endocisto, espessura e textura do ectocisto. Para a avaliação das
dimensões foram medidos 10 organismos à microscopia óptica e feita a média
aritmética.
3.6.2. Confirmação do gênero Acanthamoeba spp. pela técnica
da PCR.
3.6.2.1. Extração de DNA
As extrações de DNA foram realizadas de acordo com Salah & Iciar
(1997), utilizando a metodologia de lise alcalina, empregada para eucariotos.
Um volume de 1mL de culturas axênicas de Acanthamoeba spp., contendo
aproximadamente 10
6
amebas/mL foi transferido para um microtubo e
centrifugado à 250xg, por 10 min, sendo o sobrenadante desprezado. As
células precipitadas foram suspensas em 1 mL de PBS, homogeneizadas e
centrifugadas a 250xg por 3 min. Este procedimento foi repetido 3 vezes sendo
assim recuperado o sedimento.
Ao sedimento obtido foi adicionado 400 µL de tampão de extração
(NaCl 0,4 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH 8), 2% de sódio dodecil
sulfato (SDS) e 0,4 mg/mL de proteinase K. Os tubos foram incubados em
banho-maria por 1h, a 60°C. Após a incubação, 300 µL de NaCl (6M), foram
adicionados e os tubos agitados vigorosamente em vórtex por 30s e
centrifugados à 10000xg por 10 min. O sobrenadante foi transferido para outro
tubo, ao qual foi adicionado igual volume de isopropanol e mantido a -20°C por
27
1h. A mistura foi centrifugada a 10000xg por 20 min. O sedimento resultante foi
lavado com 1mL de etanol 70% e desidratado à temperatura ambiente. Após, o
DNA foi ressuspenso com 100µL de água ultrapura (MilliQ), quantificado pelo
método da gota e conservado a -20°C.
3.6.2.2. Reação em cadeia da polimerase
Foram utilizados os oligonucleotídeos específicos para o gênero
Acanthamoeba de acordo com Mathers et al. (2000). Para a reação foram
utilizados, de 20 ng a 40 ng de DNA, 0,2 µM de cada oligonucleotídeo
(CENBIOT
TM
) (F: 5‘ GTT TGA GGC AAT AAC AGG T 3’; R: 5’ GAA TTC CTC
GTT GAA GAT 3’), 0,2 mM dNTPs (Mix, Invitrogen
TM
), 50 mM KCl
2
, 10 mM de
Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 mM de cloreto de magnésio e 1U de Taq DNA
polimerase (Invitrogen
TM
) para um volume final de 25 µL.
A PCR foi realizada em termociclador PTC 150 Minicycler MJ
Research, como segue: desnaturação inicial de 94°C por 5 min, seguido por 35
ciclos de 94°C por 1 min, 49°C por 1 min, 72°C por 1 min e uma extensão final
de 72°C por 5 min.
Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose
2%, corados com brometo de etídeo (0,5 µg/mL), visualizados em UV. Os
resultados foram registrados por câmara digital Kodak (DC 120, versão 1.0.2) e
analisados pelo programa Kodak 1D, versão 3.5.2. Como marcador de peso
molecular foi utilizado DNA Ladder 50 pb (CENBIOT
TM
).
28
3.7. Criopreservação das cepas axenizadas
As Acanthamoeba foram criopreservadas conforme a técnica
descrita por McMillan (1989) com algumas modificações estabelecidas no
laboratório de parasitologia – UFRGS. Cultura axênicas de cinco dias foram
centrifugadas 250xg por 10 min. Após a contagem celular do sedimento foram
preparadas diluições na proporção 10
5
células/mL e misturadas com 10 % de
soro fetal bovino e 7,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) em um volume final de 1
mL.
Imediatamente após a adição do crioprotetor os criotubos foram
acondicionados em freezer -70°C por 3 dias e depois mergulhados em
nitrogênio líquido (-196ºC), contido em botijão criobiológico. Após 5 dias de
congelamento em nitrogênio líquido as cepas foram inoculadas em ágar não-
nutriente para avaliar a sua viabilidade.
3.8. Teste de tolerância à temperatura
Os isolados de Acanthamoeba spp. inoculados em triplicata, em
ágar não-nutriente (1,5%) com uma sobrecamada de E. coli, foram submetidos
a três diferentes temperaturas (30°C, 37°C e 45°C). As placas foram
observadas diariamente, à microscopia óptica (100X) por até 10 dias.
Posteriormente, os isolados submetidos às temperaturas foram inoculados em
placas de ágar não-nutriente 1,5% recobertas com E. coli e incubados a 30°C
para avaliar sua viabilidade (Mathers et al., 2000). Desta forma, estabeleceu-se
empiricamente os seguintes critérios: (-) ausência de crescimento, (+) média de
1 a 5 cistos e/ou trofozoítos por campo, (++) média de 6 a 15 cistos e/ou
trofozoítos por campo e (+++) média de 16 cistos e/ou trofozoítos por campo.
29
3.9. Análise estatística
3.9.1. Cálculo de número amostral
O critério de seleção foi a disponibilidade dos estojos por voluntários.
Para o cálculo do tamanho amostral foi considerada uma prevalência esperada
de 30%, segundo dados disponíveis na literatura, da presença de trofozoítos ou
cistos nos estojos de lentes de contato, confiança de 95% e um erro estimado
de 10%. Assim o tamanho amostral calculado foi de 81 estojos.
3.9.2. Avaliação estatística
Foram avaliados os dados de forma descritiva através de cálculo de
freqüência, percentual, média e desvio padrão. Para verificar possíveis fatores
associados à presença de Acanthamoeba spp. foi realizado o teste qui-
quadrado, quando as variáveis eram categóricas (como sexo, tipo de lente e as
respostas sim e não), teste t de student para o tempo que usa lentes e teste de
Mann-Whitney para UFC/mL relacionado com a presença de Acanthamoeba
spp.. Todas as análises estatísticas foram realizadas no setor de estatística da
Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde do HCPA.
3.10. Elaboração de um manual de boas práticas de
conservação dos estojos de lentes de contato.
Seguindo recomendações médicas e dos fabricantes de lentes de
contato foi elaborado uma manual de boas práticas de conservação dos estojos
de lentes de contato, o qual foi entregue a todos os usuários, participantes do
estudo.
30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização dos estojos e usuários de lentes de contato
a partir da análise do questionário
A síntese dos dados obtidos dos usuários de lentes de contato que
participaram do estudo está apresentada na tabela 1.
TABELA 1. Caracterização do usuário de lentes de contato.
Observado
(n=81)
%
N° de mulheres 58 72
N° de Homens 23 28
Idade média geral em anos 28 -
Estojo de lente rígida 35 43
Estojo de lente gelatinosa 30 37
Estojo de lente gelatinosa descartável 13 16
Estojo de lente gelatinosa+Lente Rígida 3 4
Uso terapêutico 72 88
Uso estético 9 11
Uso ocasional 8 10
Uso diário 70 86
Uso prolongado 3 4
31
Dos 81 indivíduos avaliados 72% (58) eram mulheres com uma
idade média de 28 anos. Na população masculina a idade média era de 31
anos. As mulheres eram a maioria dos usuários, tanto para lentes rígidas
(60%), como para gelatinosas (64%), incluindo descartáveis. Outro perfil
bastante característico foi a idade média de cada grupo de usuárias: mulheres
que utilizam lentes rígidas tinham em média, 34 anos e usuárias de lentes
gelatinosas, incluindo descartáveis, tinham em média 24 anos de idade.
O uso terapêutico de lentes foi característico da maioria dos usuários
(89%) e a média de idade desse grupo foi de 29 anos. Já a média de idade
para as pessoas que utilizam lentes cosméticas foi de 23 anos. A população
mais jovem, usuária de lentes de contato estéticas tem hábitos mais precários
de higiene, que é um dos principais fatores de risco para pessoas com este
perfil (Niederkorn, 1999).
Quanto ao tipo de lente utilizada, 35 (43%) eram tipo rígida enquanto
30 (37%) eram do tipo gelatinosa. Dos 81 usuários, 13 (16%) utilizavam lentes
gelatinosas do tipo descartável, cuja validade média era de um mês. De todos
os usuários avaliados três (4,0%) utilizavam a sobreposição de lentes, uma
lente rígida sobre uma gelatinosa.
O tempo decorrido após o início do uso de lentes de contato foi
bastante variado, de 0,1 a 360 meses. Porém, foi observado que a lente era
substituída com alguma freqüência, pois o uso médio da mesma lente foi de 9
meses.
De todos os colaboradores, 50 (62%) tinham o hábito de procurar
periodicamente o serviço de saúde para revisão médica do uso das lentes de
32
contato, independente de qualquer sintomatologia, enquanto 31 (38%) não o
faziam. Diferente dos usuários de óculos, os usuários de lentes de contato
necessitam de cuidados maiores com a saúde visual, pois podem vir a sofrer
de outras complicações, como fissuras e infecções. Esta característica peculiar
faz com que os usuários tenham como rotina procurar os serviços
oftalmológicos, com maior freqüência. O tempo médio de uso da mesma lente,
entre as pessoas que admitiram fazer revisão periodicamente foi 10 meses,
não diferindo muito dos usuários que não faziam revisão periodicamente, já
que o tempo médio de revisão foi de 8 meses.
O manuseio das lentes, estojo e o material envolvido com a sua
manutenção são fatores preponderantes para uma conservação adequada.
Quanto ao cuidado com as lentes, 59 (72%) dos indivíduos que
cederam os estojos para análise, admitiram lavar as mãos antes de manipular
o estojo e as lentes de contato, 3 (4%) lavavam as lentes friccionando-a com a
solução de limpeza, 12 (15%), admitiram não ter qualquer cuidado ao
manusear a lente de contato e 07 (9%) adotavam outros cuidados como ferver
ou lavar a lente e o estojo com sabonete.
Entre os usuários de lentes de contato a falta de higiene é o maior
fator de risco para ceratite amebiana. Niederkorn e colaboradores (1999)
observaram que 85% dos casos de ceratite por Acanthamoeba spp. ocorreu
com homens jovens, usuários de lentes de contato que relatavam pouca
higiene e a ausência do hábito de lavar as mãos
33
4.2. Análise microbiológica
4.2.1. Contagem bacteriana
Dos 81 estojos avaliados 58 (71%) apresentaram crescimento de
microrganismos A média de unidades formadoras de colônias (UFC), no líquido
do estojo de lentes de contato foi de 8,1X10
5
UFC/mL, em um área média de 3
cm
2
, por estojo e cada estojo apresentou, em média quatro tipos de colônias
bacterianas diferentes. Diferente do presente estudo Donzis e colaboradores
(1987) que encontraram 42% de positividade em estojos de lentes de contato
em um estudo realizado na Inglaterra e Wilson e colaboradores (1990) que
encontraram 46% de positividade em estudo semelhante realizado na
Califórnia. Porem Fleiszig & Efron (1992), em estudos realizados na Austrália
se aproximaram dos nossos resultados, encontrando uma positividade de 72%
de contaminação por bactérias. As recomendações médicas e dos fabricantes
não limitam a presença ou ausência de microrganismos ou a quantidade de
UFC.
Considerando-se a definição de Wirtanen e colaboradores (1996), de
que um biofilme estaria presente quando existem entre 10
3
e 10
5
bactérias por
cm
2
, podemos concluir que a maioria dos estojos analisados em nosso estudo
apresentava biofilme. Esta observação é importante, pois quanto mais
organizada a estrutura, maior a dificuldade de remoção da comunidade
bacteriana do estojo, conseqüentemente maior é a possibilidade de
contaminação microbiana das lentes e conseqüentemente dos olhos.
A comparação entre o tipo de lente e a contagem bacteriana
demonstrou que os estojos de lentes rígidas apresentavam maior quantidade
34
de UFC por mL (10
6
), enquanto os de lentes gelatinosas apresentaram menor
quantidade (10
5
). Contrariamente um estudo realizado por Dart (1990)
encontrou maior contaminação nos estojos de lentes gelatinosas, o que é
justificado pelo autor pelo fato dessas lentes possuírem um suporte maior aos
microrganismos devido ao material com que elas são confeccionadas.
4.2.2. Isolamento e Identificação bacteriana
Com o meio de cultura escolhido para o isolamento inicial de
bactérias (ágar sangue) foi possível recuperar 177 isolados bacterianos, sendo
identificadas 51 espécies. Destas 45 (25%) eram bastonetes Gram-negativos
(tabela 2), 31 (18%) bastonetes Gram-positivos (tabela 3), 45 (25%) de cocos
Gram-positivos (tabela 4) e 56 (32%) cocobastonetes (tabela 5).
Os estojos de lentes de contato apresentaram uma microbiota
variada, estando presentes bactérias ambientais como as do gênero Kurthia
sp., Listeria sp. e Xanthomonas sp. Estas bactérias, até o momento não
apresentam relatos de alguma patologia humana causada por elas (Alves et
al.,1991; Wang et al., 1998).
Em estojos de lentes gelatinosas, gelatinosas descartáveis e rígidas,
foram isoladas duas espécies de bactérias do gênero Pseudomonas (P.
aeruginosa e P. alcaligenes) (tabela 2). Estas bactérias, apesar de serem
amplamente distribuídas na natureza são patógenos oportunistas de grande
importância. A espécie P. aeruginosa está relacionada com 21% dos casos de
infecção ocular associada com o uso de lentes de contato (Schirmbeck et al.,
35
2000). As demais espécies de bastonetes Gram negativos identificadas não
apresentam significado clínico relatado na literatura.
A presença de bactérias do gênero Bacillus (B. cereus, B. circulans e
B. pumilus) (Tabela 3), se dá pela elevada prevalência ambiental, tanto da
forma vegetativa como dos esporos. Podem fazer parte tanto da microbiota,
ocular quanto do corpo. Porém as espécies isoladas não estão relacionadas
com infecções oculares. A única espécie isolada em infecções desta natureza
foi B. subtillis (Schirmbeck et al., 2000).
TABELA 2. Bastonetes Gram negativos isolados de estojos de
lentes de contato
Espécies LGD
1
LG
2
LR
3
LRG
4
Burkholderia mallei
C
1
5
4 - -
Burkholderia pseudomallei
C
- 1 - -
Capnocytophaga cynodegmi
1 - - -
Escherichia coli
C
- - 1 -
Gardnerella vaginalis
C
1 1 1 -
Pseudomonas aeruginosa
A B C
1 4 3 -
Pseudomonas alcaligenes
A B C
- 1 - -
Xanthomonas axonopodis
- 1 - -
Xanthomonas campestris
1 4 3 -
Xanthomonas fragariae
- 1 1 -
1 Lente Gelatinosa Descartável;
2 Lente Gelatinosa;
3 Lente Rígida;
4 Lente Rígida e Lente Gelatinosa (sobrepostas).
5 Número de isolados
A - Mais freqüentes em endoftalmites
B - Causadora de ceratites
C - Patogênicas oportunistas
36
Foram isoladas várias espécies do gênero Staphylococcus (S.
aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. Intermedius, S. lentus e S.
saprophyticus) (tabela 4). Os cocos Gram-positivos fazem parte da microbiota
conjuntiva, porém S. aureus e S. epidermidis são encontrados causando
infecções oftálmicas também (Alves et al., 1991; Vieira et al.,1999; Kaufman et
al., 2000). É importante observar que os usuários de lentes que participaram do
presente estudo eram assintomáticos para infecções oculares, porém a
presença destes microrganismos nos estojos é um fator predisponente para
infecções.
TABELA 3. Bastonetes Gram positivos isolados de estojos de lentes
de contato
Espécies LGD
1
LG
2
LR
3
LRG
4
Arcanobacterium pyogenes
B
- - 1
5
-
Bacillus cereus
B
- - 1 1
Bacillus circulans
B
- 1 3 1
Bacillus pumilus
B
- 1 - -
Geobacillus stearothermophilus
- - 1 -
Kurthia gibsonii
- - 2 -
Kurthia sibirica
- 1 - -
Kurthia zopfii
- - 1 -
Streptobacillus moniliformis
A B
- - 1 -
Streptomyces sp. 1 - - -
Turicella otitidis
A B
- - 1 -
1 Lente Gelatinosa Descartável
2 Lente Gelatinosa
3 Lente Rígida
4 Lente Rígida e Lente Gelatinosa (sobrepostas)
5 Número de isolados
A - Mais freqüentes em endoftalmites
B – Patogênicas oportunistas
37
As bactérias do gênero Staphylococcus têm uma história evolutiva
relacionada com o hospedeiro, pois apresentam uma distribuição ambiental
bastante limitada e são isoladas em vários mamíferos. Têm uma relação de
comensalismo e vivem nas cavidades dos animais. Esta proximidade faz com
que haja pressões evolutivas sobre elas, como o uso de medicamentos e as
mudanças ambientais, selecionando cepas com maior resistência a
antimicrobianos e maior patogenicidade (Palumbi, 2001). No momento da
avaliação nenhum dos pacientes apresentava sintomas de infecção, desta
forma, não foi possível estabelecer nenhuma relação entre a presença de
cocos e patologias.
TABELA 4. Cocos Gram-positivos isolados de estojo de lentes de contato
Espécies LGD
1
LG
2
LR
3
LRG
4
Alloiococcus otitidis
C
- 1
5
- -
Deinococcus radiophilus
- 1 1
Enterococcus faecium
B C
1 1 - -
Micrococcus luteus
- - 1 -
Micrococcus lylae
- - 1 -
Staphylococcus aureus
A B C
- 2 8 2
Staphylococcus epidermidis
A B C
- 2 1 -
Staphylococcus haemolyticus
C
- 1 1 -
Staphylococcus Intermedius
C
2 1 - -
Staphylococcus lentus
C
1 1 - -
Staphylococcus saprophyticus
C
1 1 - -
1 Lente Gelatinosa Descartável
2 Lente Gelatinosa
3 Lente Rígida
4 Lente Rígida e Lente Gelatinosa (sobrepostas)
5 Número de isolados
A - Mais freqüentes em endoftalmites
B - Causadora de ceratites
C - Patogênicas oportunistas
38
As bactérias do gênero Corynebacterium são amplamente
distribuídas no ambiente e fazem parte da microbiota humana, inclusive da
conjuntiva. São patógenos oportunistas, também causando conjuntivites e
endoftalmites (Tabela 5) (Salvanet-Bouccara et al., 1992; Euzéby, 2008).
De todos os microrganismos isolados C. diphtheriae seria o único
capaz de invadir a conjuntiva sadia e causar infecções nas estruturas oculares
(Schirmbeck et al., 2000). O colaborador, de cujo estojo foi isolado C.
TABELA 5. Cocobastonetes Gram positivos isolados estojo de lentes
de contato.
Espécies LGD
1
LG
2
LR
3
LRG
4
Brevibacterium casei
C
- - 1
5
1
Brevibacterium epidermidis
- 2 1 -
Brevibacterium iodinum
1 - - -
Brevibacterium linens
1 - 1 -
Corynebacterium diphtheriae
A C *
- 1 - -
Corynebacterium glucuronolyticum
A C *
- 3 1 1
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
A C *
- - 2 -
Corynebacterium xerosis
A C *
- - 1 1
Dermabacter hominis
- 1 1 -
Jonesia denitrificans
- - 1 -
Kocuria rosea
C
- - 1 -
Listeria grayi
- - 2 -
Listeria innocua
- 3 5 -
Listeria seeligeri
1 1 - -
Listeria welshimeri
- - 1 -
Microbacterium arborescens
- - 2 -
Microbacterium lacticum
- - 1 -
Moraxela osloensis
C
- 1 - -
Nesterenkonia halobia
- - 3 -
1 Lente Gelatinosa Descartável;
2 Lente Gelatinosa;
3 Lente Rígida;
4 Lente Rígida e Lente Gelatinosa (sobrepostas).
5 Número de isolados
A - Mais freqüentes em endoftalmites
B - Causadora de ceratites
C - Patogênicas oportunistas
* Bactéria com capacidade de invadir a conjuntiva.
39
diphtheriae, era assintomático. A quantificação foi de 10 UFC/mL e não foram
isolados outros microrganismos em seu estojo.
4.2.3. Comparação microbiológica entre os grupos de
acadêmicos da UFRGS e pacientes do HCPA.
Ao dividir os voluntários por procedência (setor de oftalmologia do
HCPA ou Campus central da UFRGS) pode-se observar a formação de dois
grupos distintos, como mostra a figura 8.
Para esta análise agrupou-se os voluntários em duas populações
distintas: uma formada por alunos do campus central da UFRGS, com idade
média de 23 anos, sendo destes 30 (81%) mulheres e outro por pacientes do
FIGURA 8. Comparação da microbiota existente em 81 estojos de lentes de
contato de voluntários, segundo o tipo de voluntário. Porto Alegre, 2008.
40
setor de oftalmologia do HCPA com idade média de 31 anos, sendo 29 (67%)
mulheres.
O grupo formado por acadêmicos era constituído basicamente por
mulheres jovens, usuárias de lentes cosméticas. Como observado (figura 8) os
bastonetes Gram negativos e cocos Gram positivos foram mais freqüentes na
população de acadêmicos, enquanto os bastonetes Gram positivos e
cocobastonetes Gram positivos foram mais freqüentes na população de
pacientes do setor de oftalmologia do HCPA.
Dentre todos os grupos bacterianos isolados na população do
Campus os bastonetes Gram negativos e cocos Gram positivos apresentaram
uma maior riqueza. As bactérias isoladas na população de estudantes são mais
freqüentemente isoladas na microbiota corporal e estão mais relacionadas com
patologias. No grupo formado por pacientes do HCPA a maior riqueza foi
representada por bastonetes Gram positivos e cocobastonetes, que são
bactérias isoladas mais freqüêntemente no meio ambiente (Salvanet-Bouccara
et al., 1992; Euzéby, 2008). Este resultado é corroborado por Niederkorn
(1999), que concluiu que os jovens, optantes por lentes coloridas como recurso
estético, possuem hábitos precários de higiene implicando em mais infecções.
4.3. Antibiograma com as bactérias isoladas dos estojos de
lentes de contato
Para a avaliação da susceptibilidade das espécies isoladas foram
selecionados os antibióticos mais comumente utilizados na rotina clínica. Os
resultados estão apresentados nas tabelas em anexo (III, IV, V e VI).
41
Nenhum dos antimicrobianos testados foi eficiente contra todos os
microrganismos isolados, o que é esperado devido à variação de
susceptibilidade entre cepas e espécies. No presente estudo, a maior
resistência foi observada para macrolídeos e vancomicina, fato já esperado,
pois estes antimicrobianos são mais eficientes contra bactérias Gram-positivas.
Para o tratamento de infecções ser considerado eficaz observa-se a
sensibilidade plena dos microrganismos frente ao antimicrobiano, não sendo os
resultados intermediários e resistentes considerados bons. Cefalotina e
estreptomicina foram os antimicrobianos que tiveram menos ação entre os
isolados testados. Amoxacilina mostrou-se o mais eficiente para uma maior
quantidade de isolados, entre os bastonetes Gram negativos (ANEXO III).
Houve uma grande variação entre isolados de uma mesma espécie.
Dois de três isolados de G. vaginalis apresentaram o mesmo perfil de
resistência.
P. aeruginosa apresentou grande variação entre isolados, onde a
maioria apresentou resistência a mais de quatro antimicrobianos. Dois destes
isolados apresentaram resistência a nove dos 10 antimicrobianos testados,
considerando os resultados intermediários. Esse resultado é importante, pois
essa espécie é frequentemente isolada de infecções intra-oculares, juntamente
com E. coli e G. vaginalis (Liesegang, 1997; Stein et al.,1995).
As espécies B. mallei e B. pseudomallei encontradas em nosso
estudo são bactérias de importância veterinária e médica por causar infecções,
sendo consideradas como agentes com potencial para o bioterrorismo, além de
42
apresentarem resistência a diversos antimicrobianos (Neubauer et al., 1997;
Heine et al., 2001). Porém, estas bactérias não têm sido relacionadas a
complicações oftálmicas.
Os resultados dos antibiogramas com o grupo dos bastonetes Gram-
positivos estão sintetizados (ANEXO IV).
Nenhum dos antimicrobianos foi eficiente contra todos os
microrganismos, porém cloranfenicol foi mais eficiente, sendo 15 isolados
sensíveis a ele. Amoxacilina e cefalotina, também apresentaram uma boa
eficiência. Ambos mostraram-se eficientes para 14 isolados.
Comparando-se com os bastonetes Gram negativos, em geral, os
bastonetes Gram positivos foram mais sensíveis a todos os antibióticos.
Apenas uma cepa de B. circulans foi sensível a todos os antimicrobianos, as
demais cepas deste gênero não foram plenamente sensíveis a todos os
antimicrobianos, se considerarmos os valores intermediários.
Estudos realizados na Índia por Anand e colaboradores (2000),
avaliando isolados de endoftalmites e de infecções oculares concluíram que os
bastonetes Gram positivos apresentaram 11 % de resistência à gentamicina e
100 % de sensibilidade à vancomicina, nos casos de endoftalmite.
Os resultados dos antibiogramas com os cocos Gram positivos
estão apresentados no anexo V.
Todas as cepas foram sensíveis a amoxacilina. Cloranfenicol,
gentamicina e vancomicina foram eficientes em 75% ou mais dos isolados
testados. O ácido nalidíxico e a eritromicina foram os antimicrobianos menos
eficientes.
43
No grupo dos cocos Gram positivos estão os microrganismos como
S. aureus e S. epidermidis que também pertencem a microbiota ocular e que
são mais freqüentemente isolados em infecções oculares (Limberg, 1991). Em
um estudo realizado por Meneghetti & Salla (2004) foi observada uma maior
resistência à cefalotina, considerando os resultados intermediários. No
presente estudo 50% dos isolados foram resistentes a este antibiótico,
considerando a suscetibilidade intermediária.
Das cepas de S. aureus três apresentaram resistência a
vancomicina, sendo dois com susceptibilidade intermediária. Infecções
causadas por cepas de S. aureus resistentes à vancomicina são de grande
relevância, pois este antibiótico é de última escolha no tratamento de infecções
com estas bactérias, além da possibilidade de disseminação destas cepas
entre as pessoas (Alves et al., 1991; Chang et al., 2003). Alguns estudos
demonstram que S. aureus com resistência à vancomicina já foram isolados
em culturas de material ocular, sem que houvesse algum sintoma presente
(Kato et al., 1999; Fukuda et al., 2002). Outras infecções causadas por S.
aureus, principalmente as transmitidas por catéter vascular causam quadros de
septicemia, levando o paciente ao óbito (Hiramatsu et al., 1997).
Os resultados dos antibiogramas com os cocobastonetes Gram
positivos estão apresentados no anexo VI.
Nenhum dos antimicrobianos foi plenamente eficiente contra todas
as cepas, porém foi observada menor resistência à amoxacilina e cloranfenicol.
Os cocobastonetes Gram positivos apresentaram maior resistência à
rifampicina seguido por vancomicina, estreptomicina eritromicina.
44
Dos grupos morfológicos avaliados os cocobastonetes Gram
positivos apresentaram uma menor resistência ou suscetibilidade intermediária
aos antibióticos testados. Quatro isolados foram plenamente sensíveis a todos
os antibióticos (M. arborexens e N. halobia).
4.4. Caracterização do usuário AVL positivo
Dos 81 estojos de lentes de contato avaliados 7 (9%) estavam
contaminados com AVL, sendo um isolado proveniente de estojo de lentes
gelatinosas descartáveis (LGD), dois de lentes gelatinosas (LG) e quatro de
lentes rígidas (LR).
A avaliação demonstrou que a idade média dos usuários de lentes
de contato com estojo AVL positivos foi de 31 anos e que os estojos
contaminados com amebas pertenciam a usuários que utilizavam lentes de
contato há mais tempo (117 meses em média).
Quanto às medidas de higiene, os estojos AVL positivos pertenciam
a indivíduos que não mostraram preocupação com a higiene das mãos.
Desses, quatro relataram lavar as mãos esporadicamente antes do manuseio
das lentes e dois admitiram não adotar nenhuma medida de higiene própria ou
com os estojos de lentes de contato.
Estudos realizados na Coréia demonstram que a presença de AVL
em estojos de lentes de contato pode variar entre 10 e 16% (Lee et al., 1997;
Yu et al., 2001). Outro estudo avaliando estojos de lentes de contato, na
Inglaterra, encontrou uma prevalência de 20% para AVL e 8 % para
Acanthamoeba spp. (Gray et al.,1995).
45
A importância da demonstração da presença de AVL em estojos de
lentes de contato ou em soluções de manutenção, está no fato da presença do
protozoário nestes locais ser um dos grandes fatores de risco predisponentes à
ceratite (Epstein et al., 1986).
4.5. Avaliação microbiológica dos estojos AVL positivos
Os estojos que apresentaram AVL, tiveram um valor mediano de 10
7
UFC/mL contra 10
5
UFC/mL dos casos negativos. O grupo morfológico de
maior freqüência nos estojos de onde foram isoladas AVL foi o dos
cocobastonetes Gram positivos, seguido pelos bastonetes Gram-negativos.
Observou-se uma diferença significativa entre a maior quantidade de
UFC/mL e a presença de Acanthamoeba spp., como esperado (p=0,008),
porém a mesma relação não foi estabelecida entre os diferentes tipos de
lentes. A maior riqueza bacteriana propicia um micro-habitat favorável para as
AVL, que utilizam estas bactérias como fonte de nutrientes (Barbeau & Buhler
2001).
4.5.1. Comparação entre os grupos de acadêmicos da UFRGS e
pacientes do HCPA.
Cinco dos sete isolados de AVL foram procedentes de estojos de
voluntários do Campus central da UFRGS, formada por acadêmicos com idade
média de 23 anos. Dos voluntários do Campus central da UFRGS, 25 eram
mulheres, todas usuárias de lentes de contato cosméticas gelatinosas. A
população com estas características é mais susceptível a infecções oculares
46
por AVL ou qualquer outro microrganismo, pois existem vários fatores de risco
relacionados a ela. Da população formada por pacientes do HCPA, 34 são
mulheres, sendo 11 dessas usuárias de lentes gelatinosas. Em estudos
realizados por Niderkorn e colaboradores (1999) e Beattie e colaboradores
(2003). foi observado que indivíduos jovens que fazem uso de lentes
gelatinosas cosméticas, em geral, apresentam hábitos de higiene inadequados
para a manutenção de todos os materiais envolvidos no uso de lentes de
contato.
4.6. Identificação do gênero Acanthamoeba spp.
Em sete dos 81 estojos avaliados foram isolados AVLs com
morfologia sugestiva de pertencer ao gênero Acanthamoeba spp. de acordo
com Page (1988) (tabela 6). Os isolados foram identificados como 18M (a, b),
20P, 30G, 32s (a, b), 45M, 48L e 78 (a,b) (Figuras 10 a 16).
A classificação por grupos (GI, GII e GIII) leva em consideração as
características morfológica dos cistos proposta por Pussard & Pons (1977).
Os isolados 18M, 32S e 78L apresentaram diferentes morfologias
císticas, sendo que o isolado 18M apresentou cistos característicos do G I
(18Ma) e II (18Mb). Já o isolado 32S apresentou cistos com característica do
GI (32Sa) e III (32Sb) e o isolado 78L apresentou dois tipos de cistos com
características do GII (78La e 78Lb). Isto pode ser explicado pela presença de
mais de uma espécie do gênero, ocorrendo simultaneamente em um mesmo
estojo. Os demais isolados apresentaram características dos grupos
morfológicos: GIII (20P), GII (30G), GII (45M) e GII (48L).
47
TABELA 6. Caracterização morfológica dos cistos de Acanthamoeba spp. isolados de usuários de lentes de contato
Morfologia cística
(n=20)*
Isolado
Diâmetro médio
do cisto
Desvio
padrão
Número médio
de Braços
Forma do
endocisto
Espessura
do
ectocisto
Textura
do
ectocisto
Provável
Grupo
18M
18Ma
18Mb
24 µm
18 µm
4 µm
3 µm
7
4
Estrelado
Poligonal
Espesso
Espesso
Liso
Ondulado
I
II
20P 18 µm 3 µm 4
Pequenos
ângulos
Delgado Rugoso III
30G 21 µm 4 µm 4 Poligonal Médio Ondulado II
32S
32Sa
32Sb
23 µm
18 µm
5 µm
2 µm
8
4
Estrelado
Redondo
Espesso
Delgado
Liso
Rugoso
I
III
45M 17 µm 2 µm 3 Poligonal Médio Ondulado II
48L 18 µm 3 µm 4 Poligonal Médio Ondulado II
78L
78La
78Lb
21 µm
20µm
3 µm
2 µm
6
4
Estrelado
Poligonal
Espesso
Médio
Ondulado
Ondulado
II
II
* Os dados foram obtidos a partir da análise de 20 cistos isolados.
48
FIGURA 13. Isolado de
AVL 45M. Trofozoíto e
cisto característico do GII.
(200X; barra= 17 µm)
FIGURA 10. Isolado de AVL
20P. a) cisto; b) trofozoíto
GIII (200X; barra=18 µm)
FIGURA 9. Isolado de
AVL 18M. a) GI; b) GII
(200X; barra=24 µm)
a
b
a
b
FIGURA 11. Isolado de AVL
30G. Cisto característico do
GII (200X; barra= 20 µm)
FIGURA 12. Isolado de
AVL 32S. a) GI; b) GIII
(200X; barra
=
23 µm)
b
a
FIGURA 14. Isolado de
AVL 48L. Cisto
característico do GII.
(200X; barra= 18 µm)
49
4.6.1. Teste de exflagelação das AVL
O teste de exflagelação foi negativo para as sete AVL isoladas dos
estojos de lentes de contato, o que exclui a possibilidade das AVL serem
Naegleria fowleri, que ao serem submetidas a situações como a privação de
nutrientes, passam por transformações morfogenéticas como o surgimento do
flagelo. Esta transformação é um estágio transitório, com o metabolismo
reduzido e sem divisão celular e acredita-se que esse flagelo seja usado para
que a ameba possa se dispersar pelo ambiente em busca de condições
favoráveis (Schuster & Visvesvara, 2004b).
A presença de Naegleria fowleri em estojos de lentes de contato não
tem significado clínico, enquanto Acanthamoeba spp. tem o potencial de causar
ceratites. (Schuster, 2002).
FIGURA 15. Isolado de AVL
78L. Diferentes espécies do
Acanthamoeba spp. a) GII; b)
GII. (200X; barra= 21 µm)
50
FIGURA 16. Análise molecular do gene ssu rDNA 18S. 1. Marcado
r
de peso molecular (50pb); 2. 18M; 3. 20P; 4. 30S; 5. 32M; 6. 45L; 7.
48L; 8. 78L; 9. C+; 10. C-; 11. DNA E. coli e 12. DNA do
contaminante.
4.6.2. Confirmação do gênero Acanthamoeba spp.
A confirmação do gênero Acanthamoeba foi realizada através da
reação de PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para este gênero,
como descrito anteriormente em materiais e métodos Os resultados da PCR
podem ser visualizados na figura 1.
Com a PCR foi possível confirmar que dentre os isolados de AVL
haviam sete amebas pertencente ao gênero Acanthamoeba spp., porém como
observado através da identificação morfológica nos isolados 18M, 32S e 78L
estariam presentes diferentes espécies de Acanthamoeba, não sendo possível
diferenciar as duas espécies presentes no mesmo isolado. O teste morfológico
indica que ambas são sugestivas de pertencer ao gênero Acanthamoeba e a
PCR confirma que entre elas há pelo menos uma pertencente a este gênero.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
750pb
500pb
250pb
229pb
200pb
50pb
51
A axenização do isolado 78L não foi possível devido a contaminação
persistente de um bastonete Gram negativo. Para confirmar que a PCR não
amplificaria material genético desta bactéria foi extraído seu DNA e submetido
à reação, utilizando os mesmos oligonucleotídeos, não tendo ocorrido
amplificação (canaleta 12). Na literatura é freqüente o relato das dificuldades
em axenizar determinados isolados de AVL, principalmente em amostras
ambientais (Tsvetkova et al., 2004), além disso, existem alguns isolados de
Acanthamoeba spp. que são difíceis de se multiplicar em meio PYG,
necessitando assim de meios mais enriquecido (Schuster, 2002).
A PCR apresenta sensibilidade e especificidade elevadas para o
diagnóstico de AVL, sendo utilizado tanto para diagnóstico confirmatório de
patologias como para diagnósticos ambientais (Mathers, et al., 2000; Tsvetkova
et al., 2004).
4.7. Teste de tolerância à temperatura.
Os isolados foram testados quanto a sua capacidade de crescer em
diferentes temperaturas (30°C, 37°C e 45°C) (tabela 7)
Na temperatura 30°C todos os isolados apresentaram bom
crescimento e todos permaneceram viáveis em todas as avaliações, esta
temperatura foi utilizada como controle positivo por ser a temperatura ótima de
crescimento (Neff et al.,1969).
52
TABELA 7. Teste de tolerância de Acanthamoeba spp. a diferentes
temperaturas.
Isolado
Crescimento em diferentes temperaturas*
30°C 37°C 45°C
18M +++ ++ ++
20P +++ +++ +
30G +++ - -
32S +++ +++ -
45M +++ +++ +++
48L +++ +++ +++
78L +++ - -
- ausência de crescimento, média de + 1 a 5 cistos e/ou trofozoítos, ++ 6 a 15 cistos e/ou
trofozoítos e +++ > 16 cistos e/ou trofozoítos.
Avaliação feita em 10 campos microrcópicos (100X).
Outros estudos semelhantes ao apresentado no presente trabalho,
já foram realizados por diferentes autores. Silva & Rosa (2003) submeteram 51
isolados hospitalares de Acanthamoeba spp. a diferentes temperaturas (37°C
e 42°C) sendo apenas um isolado resistente a 42 °C. Em 2002, Schuster usou
amostras clínicas para isolar AVL, utilizando a temperatura de 37°C em ANN
(1,5%) e E. coli inativadas pelo calor, em seguida os isolados foram submetidos
a teste de viabilidade (cultura monoxênica a 30°C) e o desencistamento
ocorreu em dois dias. Segundo Kingston & Warhurst (1969) amebas sensíveis
a temperaturas superiores a 37°C seriam capazes de causar infecção.
Os isolados de estojos de lentes de contato testados no presente
estudos apresentaram maior resistência à elevação de temperatura que
isolados ambientais testados por Carlesso e colaboradores (2006). Este
fenótipo pode ser uma importante característica para a diferenciação entre
cepas patogênicas e não patogênicas, porém em outros trabalhos os
resultados divergem quanto a esta conclusão, pois apesar de haver uma
53
correlação entre temperatura e patogenicidade os mecanismos não ficaram
estabelecidos (Khan et al., 2002; Silva & Rosa,2003; Schuster & Visvesvara
2004a).
54
5. CONCLUSÕES E PERPECTIVAS
A partir do presente estudo pode-se concluir o seguinte:
Os usuários que não observam as recomendações de conservação
do estojo de lentes de contato apresentaram maior possibilidade de
contaminação no seu estojo de lentes de contato.
Os estojos de quatro tipos de lentes de contato avaliados
apresentaram contaminação, sendo que os estojos mais contaminados foram
os de lentes de contato rígidas.
As bactérias mais comumente isoladas na conjuntiva, como os
cocos Gram positivos, apresentaram maior resistência aos antimicrobianos.
As AVL do gênero Acanthamoeba ocorreram em 9% dos estojos,
que podem conter concomitantemente mais de uma espécie. A presença das
amebas está relacionada com maior UFC/mL e ocorreu mais em indivíduos
jovens.
Os isolados do presente estudo serão futuramente testados quanto a
sua patogenicidade in vivo, serão avaliados para determinar o seu genótipo e
relacionar com sua virulência, além de serem analisados quanto à produção de
proteases e possível correlação com seu potencial patogênico.
55
Os isolados serão também analisados para a determinação da
presença de possíveis endossimbiontes.
O PCR é uma boa metodologia para confirmação do gênero
Acanthamoeba spp.
56
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, M. R.; ORÉFICE, F.; GONÇALVES, N. P.; VILA, M. F. Norfloxacina a
0,3% no tratamento das conjuntivites e blefaroconjuntivites agudas. Arquivo
Brasileiro de Oftalmologia, São Paulo, v. 54, n. 8, p. 206-212, 1991.
ANAND, A. R; THERESE, K. L.; MADHAVAN, H. N. Spectrum of aetiological
agents of postoperative endophthalmitis and antibiotic susceptibility of bacterial
isolates. Indian Journal Ophthalmology, Chennai, v. 48, n. 2, p. 123–128,
2000.
ASWAD, M. I.; BARZA, M.; BAUM, J. Effect of lid closure on contact lens-
associated Pseudomonas Keratitis. Archive Ophthalmology, Boston, v. 70, n.
7, p. 107-166, 1989.
BARBEAU, J.; BUHLER, T. Biofilmes augment the number of free-living
amoebae in dental unit waterlines. Research in Microbiology, Paris, v. 152, n.
8, p. 753 - 760, 2001.
BEATTIE, T. K.; TOMLINSON, A.; McFADYEN, A. K.; SEAL, D. V.; GRIMASON,
A. M. Enhanced attachment of Acanthamoeba to extended-wear silicone
hydrogel contact lenses: a new risk factor for infection?. Ophthalmology,
Glasgow, v. 110, n. 4, p. 765–771, 2003.
BRÜCKNER,D.; GARCIA, L.S. Diagnostic Medical Parasitology. 2
a
ed.
Washington. American Society for Microbiology, 1993.
CARLESSO, A. M.; Isolamento e identificação de amebas de vida livre
potencialmente patogênicas em amostras de ambiente do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre.[dissertação de mestrado]. Porto Alegre: UFRGS; 2006, p. 59.
57
CHANG, S.; SIEVERT, D. M.; HAGEMAN, J. C.; BOULTON, M. L.; TENOVER,
F. C.; DOWNES, F. P.; SHAH, S.; RUDRIK, J. T.; PUPP, G. R.; BROWN, W. J.;
CARDO, D.; FRIDKIN, S. K. Infection with vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. New England
Journal Medical, Atlanta, v. 348, n. 14 , p. 1342-1347, 2003
CHENG, K. H.; LEUNG, S. L.; HOEKMAN, H. W.; BEEKHUIS, W. H.; MULDER,
P. G. H.; GEERARDS, A. J. M.; KIJLSTRA, A. Incidence of contactlens-
associated microbial keratitis and its related morbidity. Lancet . The
Netherlands. v. 35, n. 4: 181–185, 1999.
CLARKE, D. W.; NIEDERKORN, J. Y. The pathophysiology of Acanthamoeba
keratitis. Trends in Parasitology, Dallas, v. 22, n. 4, p. 175-180, 2006.
COOKE, P. Acanthamoeba Keratitis: ASCRS Infectious Disease Task Force
Report and Recommendations [ homepage na internet]. Washington. The
American Society of Cataract and Refractive Surgery. [atualizada em Janeiro
de 2008. Acesso em: janeiro de 2008]. Disponível em:
http://www.ascrs.org/press_releases/images/acanth_ring_late_Fig_2_3.jpg
CORLISS, J. O. Classification of protozoa and protists: the current status. In:
COOMBS, G. H.; VICKERMAN, K.; SLEIGH, M. A.; WARREN, A. Evolutionary
relationships among protozoa. 3
a
ed. The Netherlands: Kluwer Academic
Publishers; 1998, p. 409 – 447.
DANGELO, J. G & FATTINI, C. A. 2004. Anatomia Humana sistêmica e
segmentar para o estudante de medicina. 2
a
ed. São Paulo: Editora Ateneu;
2004, p .164–166.
DART, J. Contamination of contact lens storage cases. British journal
Ophthalmology, Brisbane, n. 74, n. 3, p. 129-132, 1990.
DAVEY, M. E.; O’TOOLE, G. A.; Microbial biofilms: From ecology to molecular
genetics. Microbiology and molecular biology reviews, Burlington, v. 64, n.
4, p. 847–867, 2000.
De CARLI, G. A. Exame de outros espécimes do trato intestinal e sistema
urogenital. In: De Carli. Parasitologia Clínica. Seleção de Métodos e Técnicas
de Laboratório para o Diagnóstico das Parasitoses Humanas. 2
a
ed. Rio de
Janeiro: Atheneu; 2001. p. 156-206.
DE JONCKHEERE, J. F. Epidemiological typing of Acanthamoeba strains
isolated from Keratitis cases in Belgium. Societ Belge Ophtalmology, Brussel,
v. 28, n. 7, p. 27-33, 2003.
58
DIXIE, F. Keeping an Eye on Contact Lenses: Safety, Options Shape Contact
Lens Decisions. [ homepage na internet]. Farmington Hills: U.S. Food and Drug
Administration: FDA Consumer. [atualizada em Agosto de 1998, Acesso em:
Agosto de 2007]. Disponível em:
http://www.fda.gov/fdac/features/1998/298_lens.html
DONZIS, P. B.; MONDINO, B. J.; WEISSMAN, B. A.; BRUCKNER, D. A.
Microbial contamination of contact lens care systems. American Journal
Ophthalmology, California, v. 104, n. 4, p. 325-33, 1987.
DUDLEY, R.; MATIN, A.; ALSAM, S.; SISSONS, J.; MAHSOOD, A. H.; KHAN,
N. A. Acanthamoeba isolates belonging to T1, T2, T3, T4 but not T7 encyst in
response to increased osmolarity and cysts do not bind to human corneal
epithelial cells. Acta Tropica, London, v. 95, n. 2, p. 100–108, 2005.
EFRON, N. Historical perspective. In: Nathan Efron. Contact Lens Practice. 1
ed. Melbourne: Butterworth-Heinemann Medical; 2002, p. 3–10.
ENGLER, K. H.; WARNER, M.; GEORGE, R. C. In vitro activity of ketolides
HMR 3004 and HMR 3647 and seven other antimicrobial agents against
Corynebacterium diphtheriae. Jounal of Antimicrobial Chemotherapy,
London, v. 47, p. 27-31, 2001.
EPSTEIN, R. J.; WILSON, L. A.; VISVESVARA, G. S.; PLOURDE, E. G. Rapid
diagnosis of Acanthamoeba keratitis from corneal scrapings using indirect
fluorescent antibody staining. Archives Ophthalmology, London, v. 104, n. 9,
p. 1318–1321, 1986.
EUZÉBY, J. P. List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: LPSN
[periódico na internet], jan 2008 [acesso em novembro 2007]; 47, 590-592.
Disponível em: http://www.bacterio.net
FLEISZIG, S. J.; EFRON, N. Microbial flora in eyes of currente and former
contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology, Parkville, v. 30, n. 5,
p. 1156–1161, 1992.
FRITSCHE, T. R.; GAUTOM, R. K.; SEYEDIRASHTI, S.; BERGERON, D. L.;
LINDQUIST, T. D. Occurrence of bacterial endosymbionts in Acanthamoeba spp.
isolated from corneal and environmental specimens and contact lenses. Journal
Clinical Microbiology, Seattle, v. 31, n. 5, p. 1122-1126, 1993.
FUKUDA, M.; OHASHI, H.; MATSUMOTO, C, Mishima S, Shimomura Y.
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase
negative Staphylococcus ocular surface infection: efficacy of chloramphenicol
eye drops. Cornea, Osaka-Sayama, v. 21, n. 7, p. 86-89, 2002
FUTUYMA, D. J. Biologia Evolutiva. 2
a
ed. Ribeirão Preto: Sociedade
Brasileira de Genética; 1992. p. 207.
59
GARATE, M.; MARCHANT, J.; CUBILLOS, I.; CAO, Z.; KHAN, N. A.;
PANJWANI, N. In Vitro Pathogenicity of Acanthamoeba is associated with the
expression of the mannose-binding protein. Investigative Ophthalmology &
Visual Science, Boston, v. 47, n. 3, p. 1056–1062, 2006.
GAST, R. J. Development of Acanthamoeba- specific reverse dot-blot and the
discovery of a new ribotype. The Journal of Eukaryotic Microbiology, Woods
Hole, v. 48, n. 6, p. 609 – 615, 2001.
GRAY, T. B.; CURSONS, R. T. M.; SHERWAN, J. F.; ROSE, P. R.
Acanthamoeba, bacterial, and fungal contamination of contact lens storage
cases. British Journal of Ophthalmology, Auckland, v. 79, p. 601-605, 1995
HADAS, E., MAZUR, T. Proteolytic enzymes of pathogenic and
non-pathogenic strains of Acanthamoeba spp. Tropical Medical Parasitoligy,
Poznan, v. 44, n. 3, p. 197–200, 1993.
HAMILTON, W. J. Tratado de Anatomia Humana. 2
a
ed. Rio de Janeiro:
Interamericana Ltda; 1982. 688p.
HARGRAVE, S. C.; Mc CULLEY, J. P.; HUSSEINI, Z. Redugs of a trial of
Combines Propamidine Isethionate and Neomycn Therapy for Acanthamoeba
Keratitis. Ophthalmology, Wales, v. 106, n. 5, p. 952–956, 1999.
HE, Y.; JERRY, Y.; NIEDERKORN, J. Y.; MCCULLEY, G. L.; STEWART, D.R.;
MEYER, R. S.; DOUGHERTY, J. In vivo and in vitro collagenolytic activity of
Acanthamoeba castellanii. Investigative Ophthalmology & Visual Science,
Dallas, v. 31, n. 11, p. 2235–2240, 1990.
HEINE, H. S.; ENGLAND, M. J.; WAAG, D. M.; BYRNE, W. R. In vitro antibiotic
susceptibilities of Burkholderia mallei (causative agent of glanders) determined
by broth microdilution and E-test. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
Frederick , v. 45, n. 7, p. 2119–2121, 2001.
HIRAMATSU, K.; HANAKI, H.; INO, T.; YABUTA, K.; OGURI, T.; TENOVER, F.
C. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain which reduced
vancomycin susceptibility. Journal Antimicrobrial Chemotherapy, Tokyo, v.
40, p. 135 -136, 1997.
HOLT, H. G; KRIEG, N. R; SNEATL, P. H; SOLEY, J. T; WILLIANS, S. T.
Bergey’s Manual of Determinate Bacteriology. 9ªed. Baltimore: Willians and
Wilkins; 2001, 787p.
HUSTON, C. D. Parasite and host contributions to the pathogenesis
of amebic colitis. Trends in Parasitology, Dallas, v. 20, n. 1, p. 23–26, 2004.
ILLINGWORTH, C. D., COOK, S. D. Acanthamoeba Keratitis. Survey of
Ophthalmology, Brookline, v. 42, n. 6, p. 493–508, 1998,
60
JENKINSON, H. F.; LAPPIN-SCOTT, H. M. Biofilms adhere to stay. Trends
Microbiology, Exeter, v. 9, n. 1, p. 9-10, 2001.
KATO, T.; HAYASAKA, S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and
methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococcus from conjunctivas of
preoperative patients. Japanese Journal of Ophthalmology. Toyama, v.
42, n. 5, p. 461-465. 1999
KAUFMAN, H. E; BARRON, B.E; McDONALD, M. B; KAUFMAN, S. C.
Bacterial Keratitis. 3
a
ed. Boston: Companion Handbook to the Cornea; 2000.
p. 91-141.
KINGSTON, D.; WARHURST, D. C. Isolation of amoebae from the eye.
Journal Medical Microbiology, London, v. 2, p. 27-36, 1969.
KHAN, N.A.; JARROLL, E. L.; PAGET, T. A. Acanthamoeba can be
differentiated by the polymerase chain reaction and simple plating assays.
Current Microbiology. New York, v. 43, n. 3, p. 204–208, 2001.
KHAN, N. A; JARROLL, E. L; PAGET, T. A. Molecular and physiological
differentiation between pathogenic and nonpathogenic Acanthamoeba.
Current Microbiology, New York, v. 45, n. 3, p. 197–202, 2002.
KHAN, N. A. Pathogenesis of Acanthamoeba infections. Microbial
Pathogenesis, London, v. 34, p. 277-285, 2003.
KHOSRAVI, A. D.; MEHDINEJAD, M.; HEIDARI, M. Bacteriological findings in
patients with ocular infection and antibiotic susceptibility patterns of isolated
pathogens. Singapore Medical Journal, Singapura, v. 48, n. 8, p. 741-748,
2007.
KNOP, N; KNOP, E. Conjunctiva-Associated Lymphoid Tissue in the Human
Eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Hannover, v. 41, v. 3, p.
1270-1279, 2000.
KYAW, C. M. Biolfilmes Microbianos. UFB. [periódico na internet]. 2006 jun
[acesso em: 20 de abril de 2006], [9p]. Disponível em:
http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/biofilme/biofilme.html#indice.
LARKIN, D. F.; KILVINGTON, S.; EASTY, D. L. Contamination of contact lens
storage cases by Acanthamoeba and bacteria. British Journal of
Ophthalmology, Bristol, v. 74, n. 3, p. 133-135, 1990.
LEVEY, S. B.; KATZ, H. R.; ABRAMS, D. A.; HIRSCHBEIN, M. J.; MARSH, M.
J. The role of cultures in the management of ulcerative keratitis. Cornea, New
York, v. 16, p. 383-386, 1997.
a
61
LEE, S. M.; CHOI, Y. I.; CHUNG, D. I. Contamination of Acanthamoeba in
contact lens care system. Korean Journal Ophthalmology, Ulsan, v. 38, n. 5,
p. 756-161, 1997
LIESEGANG, J. Contact lens-related microbial keratitis: Part 1: Epidemiology,
The Journal of Córnea and External Diseases, Jacksonville, v. 16, n. 2, p.
125-132, 1997
LIMBERG, M. B. A review of bacterial keratitis and conjunctivitis. American
Journal of Ophthalmology, Liverpool, v. 112, n. 4, p. 2-9, 1991.
MACFADDIN, J. F. Biochenical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3
a
ed. Philadelfia: Lippinctl Willian & Wilkins; 2000, 912p.
MARCIANO-CABRAL, F.; CABRAL, G. Acanthamoeba spp. as agents of
disease in humans. Clinical Microbiology Reviews, Richmond , v. 16, n. 2, p.
273-307, 2003.
MARSHALL, K. C. Adsorption and adhesion process in microbial
growth at interfaces. Advances in Colloid and Interface Science, New South
Wales, v. 1, p. 59-86,1986.
MARTINEZ, A. J.; VISVESVARA, G. S. Free-living, amphizoic and opportunistic
amebas. Brain Pathology, Pittsburgh, v. 7, n. 1, p. 583–598, 1997.
MATHERS, W.; SCOTT, N. E.; LANE, J. L.; WILSON, M.; ALLEN, R. C.;
FOLBERG, R. Confirmation of Confocal Microscopy Diagnosis of
Acanthamoeba Keratitis Using Polymerase Chain Reaction Analisis. Archives
of Ophthalmology, Chicago, v. 118, n. 2, p. 178-183, 2000.
McMILLAN, A. Laboratory diagnostic Methods and Cryopreservation of
Thichomonas. In: HONIGBERG, B. M. Trichomonds Parasitic in Humans. New
York: Springer-Verlag, 1989, p 110
MUŃOZ, M. L.; CALDERÓN, J.; ROJKIND, M. The collagenase of Entamoeba
histolytica. Journal of Experimental Medicine, Mexico, v. 155, n. 1, p. 42–51,
1982.
MENEGHETTI, B. H.; SALLA, A. Bacterial and fungi infections epidemiology
diagnosed by blood culture in Hospital Universitário de Santa Maria.
RBAC,Santa Maria, v. 36, n. 3, p. 173-175, 2004.
NAGINGTON, J.; WATSON, P. G.; PLAYFAIR, T. J.; McGILL, J.; JONES, B. R.;
STEELE, A. D. Amoebic infections of the eye. Lancet, New York, v. 28, n. 2, p.
1537–1540, 1974.
62
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards
for antimicrobial disk susceptibility tests - Approved standard M2-A5. 5
a
ed.
Villanova: National Committee for Clinical Laboratory Standards; 1993.
NIEDERKORN, J. Y.; ALIZADEH, H.; LEHER, H.; MCCULLEY, J. P. The
pathogenesis of Acanthamoeba keratitis. Microbes and Infection, Dallas,
v. 1, n. 6, p. 437-443, 1999.
NEFF, R. J.; NEFF, R. H. The biochemistry of amoebic encystment. Symposia
of the Society for Experimental Biology, v. 23, p. 51–81, 1969.
NEUBAUER, H.; MEYER, H.; FINKE, E. J. Human glanders. International
Review of Armed Forces Medical Services. v. 70, n. 1, p. 258–265, 1997.
NILSSON, S. E.; MONTAN, P. G. The annualized incidence of contact lens
induced keratitis in Sweden and its relation to lens type and wear schedule:
results of a 3-month prospective study. Contact Lens Association of
Ophthalmologists, Linköping, v. 20, n. 4, p. 225-230, 1994.
NOSÉ, W.; SATO, E. H.; FREITAS, D. Úlcera de córnea por Acanthamoeba:
quatro primeiros casos no Brasil. Arquivo Brasileiro de Oftalmologia, Rio de
Janeiro, 51: 223 – 226, 1988.
ODOM, A., Del POETA, M., PERFECT, J., HEITMAN, J. The
immunosuppressant FK506 and its nonimmunosuppressive analog L-685,818
are toxic to Cryptococcus neoformans by inhibition of a common target protein.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Durham, v. 41, n. 1, p. 156–161,
1997.
ORMEROD, L. D., PATON, B. G., HAAF, J.; TOPPING, T. M.; BAKER, A. S.
Anaerobic bacterial endophthalmitis in rabbit. Association For Research In
Vision And Ophthalmology, Boston, v. 94, n. 7, p. 799-808, 1987.
PAGE, F. C. A new Key to Fresh Water and Soil Gymnamoebae. Ambleside:
Fresh Water Biological Association, 1988. 122p.
PALUMBI, S. R. Humans as the world's greatest evolutionary force. Science,
Washington, v. 293, n. 5536, p. 1786–1790, 2001.
PETTIT, D.A., WILLIAMSON, J., CABRAL, G.A., MARCIANO-CABRAL, F. In
vitro destruction of nerve cell cultures by Acanthamoeba spp.: a transmission
and scanning electron microscopy study. The Journal of Parasitology,
Richmond, v. 82, n. 5, p 769–777, 1996.
POGGIO, E. C.; GLYNN, R. J.; SCHEIN, O. D.; SEDDON, J. M.; SHANNON, M.
J.; SCARDINO, V. A.; KENYON, K. R. The incidence of ulcerative keratitis
among users of daily-wear and extended-wear soft contact lenses. Journal
Medical, New England, v. 321, n. 12, p. 779–783, 1989
63
POSENAUER, B.; FUNK, J. Chronic postoperative endophthalmitis caused by
Propionibacterium acnes. European Journal of Ophthalmology, Freiburg, v.
2, n. 2, p. 94–97, 1992.
PUSSARD, M.; PONS, R. Morphologie de la paroi kystique et taxonomie du
genre Acanthamoeba (Protozoa, Amoebida). Protistologica,
Dijon, v. 13, n. 4,
557-598, 1977.
RICKARD, A. H.; STEPHEN, A. L.; HALL, L. S.; BUSWELL, C. M.; HIGH, N. J.;
HANDLEY, P. S. Phylogenetic Relationships and Coaggregation Ability of
Freshwater Biofilm Bacteria. Wiltshire, Applied and Environmental
Microbiology, v. 68, n. 7, p. 3644–3650, 2002.
RICHARD, A. H., GILBERT, N.J., KOLENBRANDER, P.E., HANDLEY, P. S.
Coagragation: an integral process in the development of multi-species
biofilmes. Trends Microbiology, Manchester, v. 11, n. 2, p. 94-100, 2003.
RADFORT, C. F.; MINASSIAN, D. C.; DART, J. K. G. Acanthamoeba Keratitis
in England and Wales: incidence, outcome, and risk factors. British Journal of
Ophthalmology, London, v. 86, n. 5, p. 536–542, 2002.
RONNER, A. B.; WONG, A. C. L. Biofilm development and sanitizer inactivation
of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium on stainless steel and
buna-n rubber. Journal of food Protection, Beltsville v. 56, n. 9, p.750-758,
1993.
SALAH, M.; ICIAR, M. Universal and rapid salt-extraction of high quality
genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research, Brasilia, v.
25, n. 22, p. 4692-4693, 1997.
SALVANET-BOUCCARA, A.; SERRHINI, A.; FORESTIER, F.; DUBLANCHET,
A.Endophtalmie chronique a` Corynebacterium. Journal Français
d'ophtalmologie, Villeneuve-Saint-Georges, v. 15, n. 6, p. 378–383, 1992.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, 2
a
ed. New York: Cold Spring Habour Laboratory Press;
1989.
SCHIRMBECK, T.; ROMÃO, E.; RODRIGUES, M. L. V.; FIGUEIREDO, J. F. C.
Endoftalmite: análise de 58 casos. Arquivo Brasileiro de Oftalmologia, São
Paulo, v. 63, n. 1, p. 39–44, 2000.
SCHUSTER, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living
amebas. Clinical microbiology Reviews, Washington, v. 15, n. 3, p. 342-354,
2002.
64
SCHUSTER, F. L; VISVESVARA, G. S. Amebae and ciliated protozoa as
causal agents of waterborne zoonotic disease. Veterinary Parasitology,
Anmterdam, v. 126, p. 91-120, 2004a.
SCHUSTER, F. L; VISVESVARA, G. S. Free-living amoebae as opportunistic
and non-opportunistic pathogens of humans and animals. Journal of
Parasitology, Lawrence, v. 34, p. 1001–1027, 2004b.
SEAL, D. V.; KIRKNESS, C. M.; BENNETT, H. G. B. Population-based cohort
study of microbial keratitis in Scotland: incidence and features. Contact Lens
Anterior Eye, Western Infirmary, v. 22, n. 2, p. 49 – 57, 1999.
SILVA, M. A.; ROSA, J. A. Isolamento de amebas de vida livre potencialmente
patogênicas em poeira de hospitais. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v.
37, n. 2, p. 242-246, 2003.
SMOLIN, G; THOFT, R. A. 2
a
ed. Massachusetts: The cornea; 1987. p. 204 -
214.
STEARNS, S. C.; EBERT, D. Evolution in health and disease. Quarterly
Review of Biology, New Haven, v. 76, n. 4, p. 417–432, 2001.
STEIN, R; STEIN, H; RAO, G. Contact Lens Complications. In: KASTL, P. E.
Contact Lenses. The Clao Guide to Basic Science and Clinical Practice. Iowa:
Kendall/Hunt; 1995, 17p.
SWARBRICK, H. A.; NGUYEN, P.; NGUYEN, T.; PHAM, P. The ChromaGen
contact lens system: colour vision test results and subjective responses.
Ophthalmic and Physiological Optics, Sydney ,v. 21, n. 3, p. 182-196, 2001.
SZÉNÁSI, Z.; ENDO, T.; YAGITA, K.; NAGY, E. Isolated, identification and
increasing importance of “free-living” amoebae causing human disesase. Journal
Medical Microbiological, Szeged, v. 47, n. 1, p. 5-16, 1998.
TSVETKOVA, N.; SCHILD, M.; PANAIOTV, S.; KURDOVA-MINTCHEVA, R.;
GOTTSTEIN, B.; VALONIK, J.; ASPOCK, H.; LUCAS, M. S.; MULLER, N. The
identification of free-living environmental isolates of amoebae from Bulgaria.
Parasitology Research, Berlin, v. 92, p. 405-413, 2004.
VIEIRA, L. A; LIMA, A. L. H; CUNHA, M; MASCARO, V. Conceitos básicos e
clínicos de doenças externas e córnea. In: LIMA, A. L. H.; DANTAS, M. C.N.;
ALVES. M. R. Doenças externas oculares e córnea. 1ª ed. Rio de Janeiro:
Cultura Médica; 1999. p. 6-9.
WALOCHNIK, J.; OBWALLER, A.; ASPOCK, H. Correlations between
morphological, molecular, biological and physiological characteristics in clinical
and nonclinical isolates of Acanthamoeba spp. Applied Environmental
Microbiology, Vienna, v. 66, n. 10, p. 4408–4413, 2000.
65
WANG, A. G.; WU, C. C.; LIU, J. H. Bacterial corneal ulcer: a multivariate study.
Ophthalmologica, Taipei , v. 212, n. 2, p. 126-132, 1998.
WILHELMUS, K. R; ROBINSON, N. M; FONT. R. A; HAMILL, M. B; JONES, D.
B. Fungal Keratitis in contact lens wearers. Journal Ophthalmology, Huston,
v. 106, n. 6, p. 708–714, 1988.
WILSON, L. A.; SAWANT, A. D.; SIMMONS, R. B.; AHEAM, D. G. Microbial
contamination of contact lens storage cases and solutions. Americam Journal
of Ophthalmology, Atlanta, v. 110, n. 2, p. 193–198, 1990.
WIRTANEN, G.; HUSMARK, U.; MATTILA-SANDHOLM, T. Microbial evaluation
of the biotransfer potencial from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and
cleaning procedures in closed food-processing systems. Journal of Food
Protection, Göteborg, v. 59, n. 7, p. 727-733, 1996.
YU, H. S.; CHOI, K. H.; KIM, H. K.; KONG, H. H.; CHUNG, D. I. Genetic
analyses of Acanthamoeba isolates from contact lens storage cases of students
in Seoul. The Korean Journal of Parasitology, Seoul, v. 39, n. 2, p. 161-170,
2001.
YU, H.S.; KONG, H. H.; KIM, S.Y.; HAHN, Y. H.; HAHN, T. W.; CHUNG, D. I.
Laboratory investigation of Acanthamoeba lugdunensis from patients with
keratitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science, Bath, v. 45, n. 12, p.
1418–1426, 2004.
66
ANEXO I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do Projeto: Determinação da Presença de Acanthamoeba spp. em
biofilme de lentes de contato
Pesquisador Responsável: Marilise Brittes Rott
Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: Universidade Federal
do Rio Grande do Sul – UFRGS.
Telefones para contato: (51) 9321 7630 - (51) 33164111 (com Marilise ou
Claiton)
Nome do voluntário:_______________________________________________
Idade: _____________ anos
Responsável legal:________________________________________________
O Sr. (ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa
“Determinação da Presença de Acanthamoeba spp. em biofilme de lentes
de contato”, de responsabilidade do pesquisador Marilise Brittes Rott.
A pesquisa tem o objetivo de isolar os “germes” presentes no estojo
da lente de contato e os procedimentos utilizados não atentam contra a saúde
do participante. As informações serão utilizadas para que possamos
compreender melhor a doença causada pelos “germes” do estojo da lente de
contato.
A participação no projeto é voluntária. Os procedimentos não
implicarão em nenhum tipo de custo ao participante que terá acesso as
informações mediante o contato com o pesquisador responsável.
Os benefícios resultantes da participação no projeto serão
relacionados à avaliação completa no estojo da lente de contato.
A participação no projeto envolverá:
- Responder 17 perguntas sobre o uso das lentes;
- Permitir que seja coletado o líquido que está dentro do estojo onde são
guardadas as lentes de contato quando elas não estão sendo usadas.
O nome do colaborador não será publicado juntamente com os
dados obtidos na pesquisa.
Eu, _______________________, declaro ter sido informado e concordo em
participar, como voluntário, do projeto de pesquisa acima descrito.
Porto Alegre, _____ de ________________ de _______.
________________________________________________
Nome e assinatura do paciente ou seu responsável legal
67
ANEXO II
1. Nome: _______________________________________________________
2.
Idade:__________________________________________________________
3. Sexo: F Masculino F Feminino
4.Endereço:______________________________________________________
_______________________________________________________________
5. Contato. e-mail:___________________________fone:__________________
6. Profissão: _____________________________________________________
7. Tipo de lente: __________________________________________________
8. A quanto tempo usa lente de contato:_______________________________
9. Tempo que possui a mesma lente:__________________________________
10. Tipo de uso: F Ocasional F Diário F Prolongado
11. Motivos para usar a lente: FTerapêutico F Estético
12. A lente passa por revisões profissionais periódicas: F Sim F
Não
13. Tipo de desinfetante e a marca utilizada:____________________________
14. Tipo de solução de manutenção e sua marca:________________________
15. Cuidados ao manusear as lentes:_________________________________
16. Sintomas clínicos: F Esporádicos F Inexistentes F
Freqüentes
17. Tratamentos já realizados e medicamentos:_________________________
68
ANEXO III
Resultados dos antibiogramas com os bastonetes Gram negativos
isolados de estojos de lentes de contato.
Isolados AN A C Cl E Er G R T V
Burkholderia mallei
R S S S I S S I S I
B. mallei
I R R S I R S I S R
B. mallei
S S S S I R S I R I
B. mallei
S S I S R S I S S R
B. mallei
S I I S R R I S I R
Burkholderia pseudomallei
I S S I R R I S S R
Capnocytophaga cynodegmi
S S R R S R S S S R
Escherichia coli
S S S S R R I I I R
Gardnerella vaginalis
S R R S S R I R S R
G. vaginalis
S R R S S R I R S R
G. vaginalis
R R R S R S I S I I
Pseudomonas aeruginosa
S S S S S I I I S R
P. aeruginosa
S S S I I I S S I S
P. aeruginosa
I S S I I R S S S R
P. aeruginosa
S S R I S S S I I S
P. aeruginosa
R S R I R R R R R R
P. aeruginosa
S S S S I R S S I R
P. aeruginosa
S S R S I S S S S S
P. aeruginosa
R I R S R R R R R R
Pseudomonas alcaligenes
S S S S S R S S I R
P. alcaligenes
S S S S S R S S S R
Xanthomonas axonopodis
I S R S S R S S S R
Xanthomonas campestris
S S R R S R S S S R
X. campestris
S S S S S S S S R R
X. campestris
R S R S R S S I S R
X. campestris
S S R S S S S I S R
X. campestris
R S R S S S S I I R
X. campestris
S S R R S R S S S R
X. campestris
S S R R I R S S S R
X. campestris
S S R S S R S I S S
Xanthomonas fragariae
I S S S S R S S S R
X. fragariae
S S S S S S S S I S
AN- Ácido Nalidixico; A- Amoxacilina; C- Cefalotina; Cl- Cloranfenicol;
E- Estreptomicina; Er- Eritromicina; G- Gentamicina; R- Rifampicina;
T- Tetraciclina e V- Vancomicina.
S – Sensível; I – Intermediário e R – Resistente.
69
ANEXO IV
Resultados dos antibiogramas com os bastonetes Gram positivos isolados
de estojos de lentes de contato
Isolados AN A C Cl E Er G R T V
Arcanobacter pyogenes
R
S S R R R R R S S
Bacillus cereus
S R R S S S S I I S
B. cereus
I S S S S S S I S S
B. circulans
S S S S I S S I S S
B. circulans
S S S S S S S S I I
B. circulans
S S S S S S S S S S
B. circulans
S S S S S S S R S S
B. circulans
I R S S S S S I S S
Bacillus pulmilus
S S S S I I S I S I
Geobacillus stearothermophilus
R I S S S S S R S S
Kurthia gibsonii
R S S I S S I S S S
K. gibsonii
S S S S I S S I R S
Kurthia sibirica
S S S S S R S S I I
Kurthia zopfii
S S I S S R S S S R
Streptobacilus moniliformes
R S R S R S S I S R
Streptomyces sp.
S S S S S S S I S S
Turicella otitidis
S S S S I R S I I R
AN- Ácido Nalidixico; A- Amoxacilina; C- Cefalotina; Cl- Cloranfenicol;
E- Estreptomicina; Er- Eritromicina; G- Gentamicina; R- Rifampicina;
T- Tetraciclina e V- Vancomicina ;
S – Sensível; I – Intermediário e R – Resistente
.
70
ANEXO V
Resultados dos antibiogramas de cocos Gram positivos isolados
de estojos de lentes de contato
Isolados AN A C Cl E Er G R T V
Alloiococcus otitidis
R S S S S I S I S R
Deinococcus radiophilus
S S S S S I I S S S
D. radiophilus
S S S S S I S S S S
Enterococcus faecium
R S S S I S S S I S
E. faecium
S S S S I S S S I S
Micrococcus lylae
S S S S S S S I I S
Staphylococcus aureus
R S S I S S S I S S
S. aureus
R S I S S S S S I S
S. aureus
R S I I R I S R S S
S. aureus
S S I S S S S S R I
S. aureus
R S I S S S S R I S
S. aureus
R S R R I R S R S R
S. aureus
S S S S I R I S S S
S. aureus
R S S S S S S S S S
S. aureus
R S S I S R S S S S
S. aureus
R S I I S R I S S I
S. aureus
I S I I S I S S I S
S. aureus
I S S S R R S S S S
Staphylococcus epidermidis
R S I S S R S I S I
S. epidermidis
R S I S S S S S S S
S. epidermidis
R S I S I R S S S S
Staphylococcus haemolyticus
R S I I S R S S S S
S. haemolyticus
R S I S S R S S S S
Staphylococcus intermedius
R S I S I I I S S S
S. intermedius
R S S I S R S S S S
S. intermedius
R S S I S S S I S S
Staphylococcus lentus
S S S S S S S S I S
S. lentus
S S S S S S S S S S
Staphylococcus saprophyticus
R S I I I R S I S I
S. saprophyticus
R S I S S I I S I S
1
N- Ácido Nalidixico; A- Amoxacilina; C- Cefalotina; Cl- Cloranfenicol;
E- Estreptomicina; Er- Eritromicina; G- Gentamicina; R- Rifampicina;
T- Tetraciclina e V- Vancomicina ;
S – Sensível; I – Intermediário e R – Resistente.
71
ANEXO VI
Resultados dos antibiogramas com Cocobastonetes Gram positivos isolados de
estojos de lentes de contato.
Isolados NA A C Cl E Er G R T V
Brevibacterium epidermidis
R
S S S R I S I S R
B. epidermidis
S S S S S S S S I S
B. epidermidis
S S S S S S S I S S
Brevibacterium iodinum
S S S S R R S I S R
Brevibacterium casei
S S R S S R S I S R
B. casei
S S S S S R I I I R
Brevibacterium linens
S S S S S S S I S S
B. linens
R S S S S S S I S S
Corynebacterium xerosis
R S S I S S S I S S
C. xerosis
R S I S S S S I I S
Corynebacterium diphtheriae
S S S S R R I S R S
Corynebacterium glucuronolyticum
S S S S S R I S S S
C. glucuronolyticum
R S S S S S S S S S
C. glucuronolyticum
R S S S I S S I S S
C. glucuronolyticum
R S S S I S S S I S
C. glucuronolyticum
R S S S S S S S S I
Corynebacterium
pseudodiphtheriticum
S S S S S S S R S I
C. pseudodiphtheriticum
S S R R S R S S I S
Dermabacter hominis
S S S I R S S S I S
D. hominis
S S S S R R S S S R
Jonesia denitrrificans
S S S S S I S I S S
Kocuria rosea
S S S S S S I S S S
Listeria grayi
S S S S S S S R S R
L. grayi
S R R S S R S R R R
Listeria innocua
S S R S R S S S S S
L. innocua
S S R S S R S R I S
L. innocua
R S S S S R S S S S
L. innocua
S S S S S S S I S S
L. innocua
S S S S S S S I I S
L. innocua
S S S S I S I S S S
L. innocua
S S S S I S S R S R
L. innocua
S S S S S S S I S S
Listeria seeligeri
S S S S I S S S S S
L. seeligeri
R I S S I R S S S S
AN- Ácido Nalidixico; A- Amoxacilina; C- Cefalotina; Cl- Cloranfenicol;
E- Estreptomicina; Er- Eritromicina; G- Gentamicina; R- Rifampicina;
T- Tetraciclina e V- Vancomicina ;
S – Sensível; I – Intermediário e R – Resistente.
72
Continuação: Resultados dos antibiogramas com Cocobastonetes Gram
positivos isolados em estojos de lentes de conato.
Isolados NA A C Cl E Er G R T V
Listeria welshimeri
S S S S I S S S S I
Microbacterium arborexens
S S S S S S S S S S
M. arborexens
S S S S S S S S S S
Microbacterium lacticum
R S R R S R S S I S
Micrococcus luteus
S S S S R S R I S S
Moraxela osloensis
I S S S R R S S R R
Nesterenkonia halobia
S S S S S S S S S S
N. halobia
S S S S S S S S S S
N. halobia
S S S S S S S S I S
AN- Ácido Nalidixico; A- Amoxacilina; C- Cefalotina; Cl- Cloranfenicol;
E- Estreptomicina; Er- Eritromicina; G- Gentamicina; R- Rifampicina;
T- Tetraciclina e V- Vancomicina ;
S – Sensível; I – Intermediário e R – Resistente.
73
ANEXO VII
Fixador de Shaudinn modificado (Bruckner, 1993)
1. Solução de sulfato de cobre:
- Sulfato de cobre II
5
H
2
O 20g
- Água destilada-deionizada 1000mL
2. Solução estoque
- Solução de sulfato de cobre II 600mL
- Álcool etílico a 95% 30mL
- Glicerina 15mL
3. Solução fixadora:
-Solução estoque 100mL
- Ácido acético glacial 5mL
Obs: adicionar o ácido acético imediatamente antes do uso.
74
Coloração de tricrômico de Wheatiey modificada por Gomori (Bruckner,
1993).
Tricrômico:
- Cromotropo 2R 0,6g
- Light green SF 0,2g
- Ácido fosfotúngstico 0,7g
- Ácido acético gracial 1mL
- Água destilada 100mL
Procedimento.
Após fixadas as ,aminas foram tratadas como segue:
- Álcool 70% durante 5 min
- Álcool 70% iodado 1min
- Álcool 70% 5mim
- Álcool 70% 3 min
- Tricrômicro 13 min
- Álcool 90% acidificado de 1 a 3 segundos
- Álcool 100% para limpar
- Álcool 100% em duas cubas 3 min cada
75
Meio Proteose Peptona Extrato de Levedo e Glicose (PYG) pH 6,5 ± 0,2.
- Polipeptona 7,5g
- Extrato de levedo 0,75g
- Sulfato de magnésio (MgSO
4
.7H
2
O ) 0,98g
- Cloreto de cálcio (CaCl
2
.2H
2
O) 0,098g
- Citrato de sódio (Na
3
C
6
H
5
O
7
.2H
2
O) 1g
- Sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
.6 H
2
O] 0,02g
- Diidrogenofosfato de potássio (KH
2
PO
4
) 0,034g
- Hidrogenofosfato dissódico anidro 0,355g
- Glicose (C
6
H
12
O
6
) 15g
- Água destilada 1000mL
Preparação
Dissolver todos os componentes, com exceção do CaCl
2
em 900 mL
de água destilada. Adicionar o CaCl
2
atyé a completa dissolução. Distribuir em
vidro de Duran® e autoclavar (121°C/15min).
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
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Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
