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Avaliação da Diversidade Genética de Populações de Pacu (
Piaractus
mesopotamicus
Holmberg, 1887) do Pantanal Matogrossense com o
Uso de Marcadores Moleculares do Tipo Microssatélites
Cláudia Haru Suganuma
Zootecnista
CENTRO DE AQÜICULTURA (CAUNESP)
São Paulo State University – Aquaculture Center
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
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Cláudia Haru Suganuma
Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti
Co-Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Daniela Calcagnotto
Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em
A
QÜICULTURA
do centro de Aqüicultura da UNESP, campus de Jaboticabal como
parte dos requisitos para a obtenção do título de doutor em
Aqüicultura – Área de Concentração: Aqüicultura em águas
continentais.
Avaliação da Diversidade Genética de Populações de Pacu (
Piaractus
mesopotamicus
Holmberg, 1887) do Pantanal Matogrossense com o
Uso de Marcadores Moleculares do Tipo Microssatélites
CENTRO DE AQÜICULTURA (CAUNESP)
São Paulo State University – Aquaculture Center
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
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Suganuma, Cláudia Haru
S947A
Avaliação da Diversidade Genética de Populações de Pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Pantanal
Matogrossense com o Uso de Marcadores Moleculares do Tipo
Microssatélites / Cláudia Haru Suganuma. – – Jaboticabal, 2008
x, 105 f. ; il. ; 29 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de
Aquicultura, 2008
Orientador: Fausto Foresti
Banca examinadora: Alexandre Wagner Silva Hilsdorf, Emiko
Kawakami de Resende, Jeffrey Frederico Lui, Claudio de Oliveira
Bibliografia
1. Piaractus mesopotamicus. 2. Microssatélites. 3. Pacu-
estruturação genética. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura
CDU 639.3(817)
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Jorge e Masako e minha irmã Elianna.
(おとうさん、 おかあさん、 おねえさん へ )
uase
Ainda pior que a convicção do não
e a incerteza do talvez é a
desilusão de um quase
. É o quase que me incomoda, que me entristece, que me mata
trazendo tudo que poderia ter sido e não foi. Quem quase ganhou ainda joga, quem
quase passou ainda estuda, quem quase morreu está vivo, quem quase amou não
amou. Basta pensar nas oportunidades que escaparam pelos dedos, nas chances que
se perdem por medo, nas idéias que nunca sairão do papel por essa maldita mania
de viver no outono.
Pergunto-me, às vezes, o que nos leva a escolher uma vida
morna; ou melhor não me pergunto, contesto. A resposta eu sei de cór, está
estampada na distância e frieza dos sorrisos, na frouxidão dos abraços, na
indiferença dos "Bom dia", quase que sussurrados. Sobra covardia e falta coragem
até pra ser feliz. A paixão queima, o amor enlouquece, o desejo trai. Talvez esses
fossem bons motivos para decidir entre a alegria e a dor, sentir o nada, mas não são.
Se a virtude estivesse mesmo no meio termo, o mar não teria ondas, os dias seriam
nublados e o arco-íris em tons de cinza. O nada
não ilumina, não inspira, não aflige
nem acalma, apenas amplia o vazio que cada um traz dentro de si.
Não é que fé mova montanhas, nem que todas as estrelas
estejam ao alcance, para as coisas que não podem ser mudadas resta-nos somente
paciência porém, preferir a derrota prévia à dúvida da vitória é desperdiçar a
oportunidade de merecer. Pros erros há perdão; pros fracassos, chance; pros
amores impossíveis, tempo. De nada adianta cercar um coração vazio ou
economizar alma. Um romance cujo fim é instantâneo ou indolor não é romance.
Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de
tentar. Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que
sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando porque, embora quem
quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.
Sarah Westphal Batista da Silva
(Texto falsamente atribuído a Luis Fernando Veríssimo)
AGRADECIMENTOS
A Deus, que sempre está e estará ao meu lado em todos os momentos, me guiando,
protegendo e abençoando imensamente.
“Porque todo o que é nascido de Deus vence o mundo; e esta é a vitória que vence o mundo,
a nossa fé.”
I João 5:4
Ao Prof. Dr. Fausto Foresti, pela orientação, dedicação à pesquisa em genética de
peixe, enorme contribuição para a minha formação, apoio e grande incentivo. Um exemplo de
pesquisador. Mais uma vez, obrigada por acreditar em mim.
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.”
Cora Coralina
A minha co-orientadora Dra. Daniela Calcagnotto, pela orientação, ajuda e
sugestões durante a realização do meu projeto de doutorado.
Ao Prof. Dr. Claudio de Oliveira, por todas as dicas durante a realização deste.
À Profa. Dra. Lurdes Foresti de Almeida Toledo, por ter me deixado utilizar as
dependências do laboratório de Ictiogenética para a realização do meu trabalho de doutorado.
À Dra. Emiko Kawakami de Resende, por ter cedido as amostras de tecido dos pacus
utilizados neste trabalho.
Ao Prof. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf por toda ajuda e esclarecimentos que me
foram de grande valia.
Ao Prof. Dr. Edson Seizo Mori pelas sugestões que melhoraram bastante finalização
deste trabalho.
Ao Centro de Estudos do Genoma Humano, que realizou a genotipagem de
microssatélites deste trabalho.
À FAPESP, pela bolsa concedida, que serviu de apoio para a condução do
experimento, realização dos trabalhos e aprendizado
Ao curso de Pós Graduação do Centro de Aqüicultura da UNESP, pela
possibilidade de realizar meu trabalho de doutorado.
A todos os meus colegas do Departamento de Morfologia: Alex, Ana Paula, Andréia
Alves, Andréia Poletto, Adrianinha, Bruno (Guiodai), Cristiane, Daniela, Danilo (Jacu), Elisa,
Emanuel, Ernesto, Fabio (Fio), Fernando (Konrado), Gláucia, Glaura, Gleicy, Guilherme (Varvito),
Guilherme (Kbelo), Guilherme (Caruncho), Gustavo, Heleno, Igor, Irani, Jefferson, Juju Mazzucks,
Kelly, Lessandra, Márcio, Marisa, Marlon, Mahmoud, Natália, Patrícia, Paulo Vênere, Renato,
Ricardo Benine, Ricardo Paiva, Ricardo Teixeira, Rosângela, Tatiane, Dona Têra, Vanessa, Wellcy,
Dona Yolanda, Wanda, Zeca, Zé Eduardo e Zé Luis. À Karina e ao Luiz Henrique um agradecimento
especial por terem me ajudado na análise e interpretação dos meus resultados. E à Luciana por todos
os favores que requeri, toda ajuda que solicitei, todas as informações que pedi e principalmente ter
aturado tudo isso!!!!!!
A amizade não se busca, não se sonha, não se deseja; ela exerce-se: é uma virtude.”
Simone Weil
Ao meu grande amigo, meu “irmãozinho caçula” de pós graduação, Prof. Dr. Celso
Benites. Um imenso agradecimento por toda a ajuda, conversas, conselhos e desabafos nos momentos
difíceis que nos assombraram nesta fase.
“O homem de muitos amigos deve mostrar-se amigável, mas há um amigo mais chegado do
que um irmão.”
Provérbios 18:24
Aos meus amigos da USP que me receberam super bem, foram super solícitos, me
ajudaram sempre que necessário e deixaram meus dias em Sampa mais alegres. Artur, Bibi, Carlos,
Eduardo, Felippe, Marcinha, Marilena, Mateus (Groscof), Karina (Pupi’s), Karine, Raquel, Riviane,
Thiago e Vânia. Em especial à, Carolzita, Léo Ramalho (que não é da USP, mas participou
ativamente de todos os eventos sociais), Keila e Ari por todo carinho, conversas, diversão, Happy
Hours e as “poucas” risadas que demos juntos.
“Abençoados os que possuem amigos, os que os têm sem pedir. Porque amigo não se pede,
não se compra, nem se vende. Amigo a gente sente!”
Machado de Assis
Aos meus inestimáveis amigos que estiveram sempre presentes e marcaram minha
vida de forma indelével. Sílvia (lindona querida), Claudia (Guiga), Eliane (Liloca), Elson, Ritinha,
Marina, Juninho (maninho), Galera da Academia: Lúcia, Carlão, Thaís, Cecília, Erick, Keka, Mônia,
Fabíola, Guerra, Leandro e André; Fabiano Tenore, Tia Fêfe, Rodrigo e Dedé (e os gêmeos Dante e
Nicolas), Paula Miabara, Ana Elisa, Claudia e Isabele Amoroso, Mei, Camila Ítavo, Oswaldo e
Ronaldo Conti.
“A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem mesmo a delícia
da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você descobre que alguém acredita
e confia em você.”
Ralph Waldo Emerson
À Veralice, pela eficiente ajuda à distância que fizeram diferença e facilitaram
minha vida. Você caiu do céu.
“Amigo verdadeiro é aquele que nos quer apesar de nada.”
Sofocleto
À minha valiosa família de Jaboticabal; William, Naomi e seus lindos e queridos
filhos que eu tanto amo Mateus e Tiago. Obrigada por me receberam quando eu precisei de abrigo
durante as disciplinas cursadas, pelas conversas e conselhos e pelos muitos momentos de diversão. E à
querida Orlanda e sua maravilhosa família que sempre me apoiaram, torceram e acreditaram em mim.
“Todas as grandezas desse mundo não valem um bom amigo.”
Voltaire
À minha amada e abençoada família: papai Jorge, mamãe Masako e mana Elianna,
pelo apoio e fé que tiveram em mim. Sem vocês este trabalho não seria possível. À Melzinha, meu
amor, que me agraciou com seu olhar meigo, jeito alegre, imensa simpatia e ternura.
“Nada lhe posso dar que já não exista em você mesmo. Não posso abrir-lhe outro mundo de
imagens, além daquele que há em sua própria alma. Nada lhe posso dar a não ser a
oportunidade, o impulso, a chave. Eu o ajudarei a tornar visível o seu próprio mundo, e isso
é tudo”
Hermann Hesse
Enfim, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para que este
trabalho se realizasse.
“A gratidão é um fruto de grande cultura; não se encontra entre gente vulgar.”
Samuel Johnson
ありがとう ございました
SUMÁRIO
RESUMO 1
ABSTRACT 2
1) INTRODUÇÃO 3
1.1) Considerações sobre o Pantanal Matogrossense e sua Ictiofauna 3
1.2) O Pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) 8
1.3) Estudos genéticos em peixes 12
2) OBJETIVOS 19
3) MATERIAL E MÉTODOS 20
3.1) Coleta de amostras de tecido 20
3.2) Isolamento do DNA genômico 23
3.3) Verificação da integridade do material 24
3.4) Amplificação dos locos microssatélites 25
3.5) Genotipagem automática em seqüenciador 30
3.6) Forma de análise dos resultados 32
4) RESULTADOS 35
4.1) Extração e purificação do DNA das amostras 35
4.2) Amplificação dos locos microssatélites 35
4.3) Genotipagem automática em seqüenciador 37
4.4) Análises intrapopulacionais 39
4.5) Análises interpopulacionais 43
5) DISCUSSÃO 54
6) CONCLUSÕES 66
7) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68
8) ANEXOS 85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Localidades, número de amostras e nomenclatura utilizada para os tecidos de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) em estudos realizados no presente trabalho.
21
Tabela 2: Informações sobre os primers (Calcagnotto et al., 2001) utilizados para amplificar os locos microssatélites
em pacus (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887).
25
Tabela 3. Representação de um mix de PCR com seus componentes para o primer Pme2 26
Tabela 4. Representação de um mix de PCR com seus componentes para os demais primers. 27
Tabela 5. Número absoluto de alelos por locos nas populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
estudadas. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA =
Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
40
Tabela 6. Alelos exclusivos por locos nas populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) estudadas.
RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio
Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
40
Tabela 7. Análise intrapopulacional de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Pantanal Mato-
Grossense. Os parâmetros apresentados são: N = número de indivíduos, Fis = endogamia, PHE = equilíbrio de Hardy
Weinberg (e alelos nulos quando significativo), Riqueza = riqueza alélica. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz;
RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras;
RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
41
Tabela 8. Diversidade genética (Fst na diagonal inferior e Rst na diagonal superior) entre pares de populações de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) para todos os locos estudados. RCPN = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio
Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio
Paraguai/ Cáceres).
44
Tabela 9. Diferenciação populacional (teste exato de Fisher) alélica (Diagonal inferior) e genotípica (diagonal
superior). RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA =
Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
44
Tabela 10: Distância de chord de Cavalli Sforza & Edwards (1967) entre pares de populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887). RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio
Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai
Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
45
Tabela 11. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando um grupo com
todas as populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). (Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São
Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc, Rio Taquari/Caronal, Rio Taquari/Palmeiras, Rio Negro, Rio Paraguai Mirim, Rio
Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/ Cáceres).
47
Tabela 12. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as populações
de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em dois grupos (Grupo I = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz, Rio São Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc e Rio Paraguai/ Cáceres; Grupo II = Rio Taquari/Caronal, Rio
Taquari/Palmeiras, Rio Negro, Rio Paraguai Mirim e Rio Paraguai/Corumbá;).
47
Tabela 13. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as populações
de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em quatro grupos (Grupo I = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz, Rio São Lourenço e Rio Cuiabá/Sesc; Grupo II = Rio Taquari/Caronal e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo
48
III = Rio Negro;Grupo IV = Rio Paraguai Mirim, Rio Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/ Cáceres).
Tabela 14. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as populações
de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em cinco grupos (Grupo I = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz, Rio São Lourenço e Rio Cuiabá/Sesc; Grupo II = Rio Taquari/Caronal e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo
III = Rio Negro; Grupo IV = Rio Paraguai Mirim e Rio Paraguai/Corumbá; Grupo V = Rio Paraguai/ Cáceres).
48
Tabela 15. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as populações
de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em três grupos de acordo com a separação sugerida
pelo dendograma de UPGMA (Grupo I = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc, Rio
Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/ Cáceres; Grupo II = Rio Taquari/Caronal e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo III = Rio
Negro e Rio Paraguai Mirim).
49
Tabela 16. Resultado do teste de atribuição para as populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
utilizadas. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA =
Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
52
Tabela 17. Proporção de atribuição correta de cada população de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
aos clusters inferidos. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio
Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai
Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
53
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa do Pantanal Mato-Grossense com os principais rios formadores e as 11 sub-regiões (Fonte: Silva &
Abdon, 1998).
4
Figura 2: Exemplar de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Fonte: Britski (2007). 10
Figura 3: Mapa representativo do Pantanal Mato–Grossense com os locais de coleta. 1: Rio Cuiabá /Parque Nacional
– Foz; 2: Rio São Lourenço; 3: Rio Cuiabá/SESC; 4: Rio Taquari/Caronal; 5: Rio Taquari/Palmeiras; 6: Rio Negro; 7:
Rio Paraguai Mirim; 8: Rio Paraguai/Corumbá; 9: Rio Paraguai/Cáceres.
22
Figura 4. Eletroferogramas com os picos de intensidade indicando o tamanho dos alelos em Pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887). Resultados de alguns indivíduos amplificados com o primer Pme2.
38
Figura 5: Dendrograma de UPGMA utilizando a distância de chord de Cavalli Sforza & Edwards (1967),
representando a relação entre as populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) analisadas.
46
Figura 6. Ln(PD) em relação ao número de populações (K) testadas 50
Figura 7. ∆K em relação ao número de populações (K) testadas. 50
Figura 8. Estrutura bar plot representando a atribuição dos genótipos para cada população. As cores representam
cada população.
51
Figura 9: Mapa do Pantanal Mato–Grossense com o padrão de agrupamento das populações segundo o dendograma.
1: Rio Cuiabá/Parque Nacional – Foz; 2: Rio São Lourenço; 3: Rio Cuiabá /SESC Pantanal; 4: Rio Taquari Caronal; 5:
Rio Taquari Palmeiras; 6: Rio Negro; 7: Rio Paraguai Mirim; 8: Rio Paraguai/Corumbá; 9: Rio Paraguai/Cáceres.
59
ANEXOS
Anexo1. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887)
do Rio Cuiabá/Parque Nacional - Foz.
85
Anexo 2. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio São Lourenço.
86
Anexo 3. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio.Taquairi/Caronal.
86
Anexo 4. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio Cuiabá/SESC.
87
Anexo 5. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio.Taquari/Palmeiras
88
Anexo 6. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio.Negro.
88
Anexo 7. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio Paraguai Mirim.
89
Anexo 8. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio.Paraguai/Corumbá.
89
Anexo 9. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
do Rio.Paraguai/Cáceres.
90
Anexo 10. Freqüências alélicas dos oito locos microssatélites estudados nas populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Pantanal Mato–Grossense estudadas. (RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-
Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio
Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio
Paraguai/ Cáceres)
91
Anexo 11: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz (RCPN).
92
Anexo 12: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio São Lourenço (RSLO)
93
Anexo 13: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/SESC (RCSE).
94
Anexo 14: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Taquari/Caronal (RTCA)
95
Anexo 15: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Taquari/Palmeiras (RTPA)
96
Anexo 16: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Negro (RNEG).
97
Anexo 17: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai Mirim (RPMI).
98
Anexo 18: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai/Corumbá (RPCO).
99
Anexo 19: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai/ Cáceres (RPCA).
100
Anexo 20. Gel de agarose corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio São Lourenço.
101
Anexo 21. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio Cuiabá (SESC Pantanal).
101
Anexo 22. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio Cuiabá (Parque Nacional do Pantanal). Ladder 1kb plus.
102
Anexo 23. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio Paraguai. Ladder 1kb plus.
102
Anexo 24. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme2. Ladder de 10 pares de base.
103
Anexo 25. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme4. Ladder 1kb plus.
103
Anexo 26. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme21.
104
Anexo 27. Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata com DNA amplificado de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887)com primer Pme20. Ladder de 10 pares de base (L). 1 a 6: indivíduos escolhidos aleatoriamente para
a realização do ensaio. (N): amostra não diluída. (D): amostra diluída na concentração de 10:1
104
Anexo 28. Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata com DNA amplificado de Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887) com primer Pme21. Ladder de 10 pares de base (L). 1 a 6: indivíduos escolhidos aleatoriamente
para a realização do ensaio. (N): amostra não diluída. (D): amostra diluída na concentração de 5:1.
105
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo principal ampliar o conhecimento
sobre a estrutura genética e obter informações para a conservação de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887), provenientes de populações
selvagens dos rios da Bacia do Alto Paraguai. Esta espécie possui grande valor
comercial e imenso potencial para exploração em pisciculturas. Os marcadores
moleculares do tipo microssatélite utilizados neste estudo, resultaram em muitas
informações sobre a estrutura populacional desta espécie, permitindo uma
possível caracterização dos bancos genéticos para esta espécie. Exemplares
provenientes de nove sub-bacias do Pantanal Matogrossense foram coletados
para a realização da extração de DNA visando à análise do material genômico.
Para isto, foram retirados pequenos fragmentos de nadadeira de cada indivíduo. A
amplificação dos locos microssatélites foi realizada num termociclador de PCR
utilizando oligonucleotídeos marcados com fluorescência, conforme descrito na
literatura. A genotipagem foi realizada no seqüenciador automático MegaBACE
TM
1000 (Amersham Biosciences), pertencente ao Centro de Estudos do Genoma
Humano da Universidade de São Paulo. Os tamanhos dos alelos obtidos foram
organizados para a montagem das matrizes de dados que foram submetidas aos
programas computacionais para verificar a variabilidade genética nas populações.
Os parâmetros que permitiram a determinação da diversidade genética intra e
interpopulacional foram o número de alelos por loco, riqueza alélica,
heterozigosidade observada e esperada, equilíbrio de Hardy Weinberg, índices Fst
e Rst, análise de variância molecular (AMOVA), índice de fixação, desequilíbrio de
ligacão e o número de migrantes. Também foi feita uma análise bayesiana para
verificar a estrutura populacional e um dendrograma foi gerado a partir da matriz
de distância baseada nos valores de distância de chord. Todas as análises
indicaram que as populações apresentaram pequena estruturação e um intenso
fluxo gênico se fez presente entre elas. As causas prováveis destes resultados,
além das particularidades da biologia e comportamento desta espécie, também a
sua alta capacidade migratória e as características climáticas e geográficas da
região do Pantanal Matogrossense.
Palavras chaves: Piaractus mesopotamicus, microssatélites, estruturação
genética, Pantanal Matogrossense.
ABSTRACT
This work aimed to obtain information about the genetic structure of pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887), from wild populations of Alto
Paraguai Basin Rivers. This specie has a greatly commercial importance, with
huge potential for hatcheries. The pacu has a wide distribution in the Prata Basin,
formed by Paraguay, Paraná and Uruguay rivers and their tributaries
Microsatellites markers offer relevant information about this specie, allowing the
characterization of genetic stocks. Individuals from nine sampling sites in the
Pantanal Matogrossense were analysed in this study. DNA extraction methods did
not required killing the samples, we used fin clippings from each individual. The
amplification of microsatellites loci was carried out via polymerase chain reaction
(PCR) using oligonucleotide marked with fluorescent labels. The amplified
fragments were analysed on the automatic DNA sequencer MegaBACE
TM
1000
(Amersham Biosciences), belonged to Centro de Estudos do Genoma Humano
from Universidade de São Paulo. Allele sizes were organized in an input file that
was submitted statistical analysis to verify the genetic variability of populations.
The parameters used to estimate the genetic diversity intra and interpoulation were
number of allele per locus, allele richness, observed and expected
heterozygosities, Hardy Weinberg equilibrium, molecular variance analyses
(AMOVA), fixation index, linkage disequilibrium and gene flow. Bayesian estimates
were used to verify the populacional structure and a dendogram was calculated by
the distances matrix based on chord distances values. The results showed no
population structuring and intense gene flow. The most probable causes are the
hight migratory capacityof this fish and the climatic and geographic characteristics
of the Pantanal Matogrossense
.
Key Words: Piaractus mesopotamicus, microsatellites, genetic structure, Pantanal
Matogrossense.
Introdução
1) INTRODUÇÃO
1.1) Considerações sobre o Pantanal Matogrossense e sua ictiofauna
A região denominada Pantanal Matogrossense possui aproximadamente
160.000 km
2
e fica localizada no centro do continente Sul Americano (Junk &
Cunha, 2005), ocupando áreas do Brasil, Bolívia e Paraguai (da Silva & Abdon,
1998; Junk & Cunha, 2005). O Brasil possui 85% deste ecossistema (Alho et al.,
1998) distribuídos nos Estados do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul (Rizzini,
1997). É constituído por uma extensa planície sedimentar, enquadrada entre os
paralelos de 16º a 22 º de latitude sul e os meridianos de 55º a 58º de longitude
oeste (da Silva & Abdon, 1995), estando situado em uma região de clima seco
onde a pluviosidade de 1100 mm/ano é ultrapassada pela evaporação média que
é de 1400 mm/ano (Figura 1). As chuvas são concentradas nos poucos meses de
verão e são seguidas por longa seca de inverno. O Pantanal seria semi árido se
não fossem as águas trazidas pelos rios que têm sua origem fora desta região
(Por et al., 1995).
O Pantanal possui solos predominantemente arenosos revestidos com
plantas forrageiras nativas e detém aproximadamente quatro milhões de cabeças
de gado (Por et al., 2007) mantidos em grandes propriedades, fazendo da
pecuária a principal atividade econômica há mais de 200 anos (Vieira, 2005). A
pesca, profissional ou esportiva representa a segunda atividade econômica mais
importante. Ocupa mão de obra que vai desde a captura de iscas vivas até a
pesca propriamente dita, seja para fins comerciais ou de subsistência (Vieira,
2005).
Figura 1: Mapa do Pantanal Mato-Grossense com os principais rios formadores e as 11
sub-regiões (Fonte: Silva & Abdon, 1998).
Hidrograficamente, esta região faz parte da Bacia do Alto Paraguai, sendo
percorrida por rica rede hidrográfica formada de inúmeros tributários do rio
Paraguai. (Rizzini, 1997). Os principais afluentes desse rio em terras do Mato
Grosso e Mato Grosso do Sul, são os rios Jauru, Cuiabá, São Lourenço, Piquiri,
Taquari, Negro, Miranda e Apa (Britski et al., 2007).
O rio Paraguai, bem como os outros rios pantaneiros, apresenta uma baixa
declividade. A diferença no nível das águas entre as estações de seca e de cheia
é em média de quatro metros, e, em decorrência desta baixa declividade,
determinadas condições de pluviosidade podem resultar no alagamento de toda a
região do Pantanal. Nas grandes cheias, os rios Paraguai, Cuiabá, Taquari,
Miranda, São Lourenço e respectivos afluentes extravasam de seus leitos
formando uma densa rede de lagoas, baías, baixadas alagadas e varjões ligados
por cursos d’água perenes (corixos) ou efêmeros (vazantes). Quando as águas
voltam ao normal, inúmeras pequenas baías e lagoas permanecem (Por et al.,
1997).
No Pantanal predominam vastas áreas de campo com manchas esparsas
de mata que igualmente são inundadas anualmente e onde, nas áreas abertas, há
um grande crescimento de macrófitas aquáticas e de perifiton por sobre a
vegetação inundada (Resende et al., 1998). Esta região apresenta um regime
hidrológico peculiar que se caracteriza pela alteração sazonal dos níveis dos rios
chamado pulso de inundação, que está entre os principais fatores que regem o
funcionamento do sistema e garantem a biodiversidade, representada por mais de
650 espécies de aves, 80 espécies de mamíferos, 50 espécies de répteis, 2000
espécies de plantas e mais de 260 espécies de peixes (Marques, 2005). É a maior
região alagável do mundo e tem extrema importância na América do Sul, tanto
ecologicamente, devido à sua biodiversidade, como economicamente, devido aos
empreendimentos relacionados ao turismo, à pesca de peixes de água doce, à
bovinocultura de corte, à vida selvagem, às plantas forrageiras e à extração de
madeira (Heckman, 1998). Em 2000 esta região foi reconhecida como Reserva da
Biosfera e Patrimônio Natural da Humanidade pela Organização das Nações
Unidas para a Educação, Ciência e Cultura (UNESCO) (Marques, 2005; Vieira,
2005). Projetos de desenvolvimento tendem a melhorar as condições de sustento
e estimular o crescimento econômico, com conseqüências ecológicas e sócio-
econômicas (Junk & Cunha, 2005).
A diversidade da ictiofauna do Pantanal existe graças a processos
evolutivos, como o desenvolvimento de diferentes estratégias de uso dos recursos
ambientais, principalmente quanto à obtenção de energia por meio da
alimentação. Assim, nessa região, há peixes detritívoros (alimentam-se de restos
de animais e vegetais encontrados no fundo dos rios), herbívoros (alimentam-se
de folhas e frutos), piscívoros (que se alimentam de peixes) e suas variações, que
apresentam outras formas de alimentação, como por exemplo, os insetívoros,
iliófagos (que se alimentam de lama), lepidófagos (que se alimentam de escamas),
etc. (Marques, 2005).
Segundo Lévêque et al. (2008), a maior diversidade de famílias e espécies
de peixes de água doce ocorre nos grupos Ostariophysi (Characiformes,
Cypriniformes, Siluriformes e Gymnotiformes), Perciformes (que inclui a família
Cichlidae) e os Cyprinodontiformes. Na região Neotropical, cerca de 4.475
espécies estão descritas, podendo chegar a mais de 6.000 incluindo as espécies
já reconhecidas porém ainda não descritas pelos pesquisadores (Reis et al.,
2003). Sua grande maioria está distribuída em cinco grupos dominantes:
Characiformes, com cerca de 1.500 espécies descritas; Siluriformes, com pelo
menos 1.400 espécies descritas; Gymnotiformes, com cerca de 180 espécies
descritas, Cyprinodontiformes, com cerca de 400 espécies descritas; e ciclídeos,
com cerca de 450 espécies descritas (Lévêque et al., 2008).
No Pantanal, Britski et al. (2007) assinalaram 110 espécies de
Characiformes, 105 de Siluriformes, 15 de Gymnotiformes, 17 de Cichlidae, 11 de
Cyprinodontiformes e 11 espécies pertencentes a outros grupos, totalizando 269
espécies, a maior parte delas redescritas sucintamente. Os peixes do Pantanal
são grandes migradores (Por et al., 1995) e sua migração sazonal, denominada
piracema, é um fenômeno do qual participam os diversos grupos de peixes. Os
indivíduos adultos migram rio acima de maio a outubro/novembro, durante o
período das secas. De novembro a fevereiro/março, quando se iniciam as chuvas
mais intensas, ocorre o processo de reprodução nas cabeceiras. Posteriormente
alevinos e adultos carregados pelas cheias penetram nas baías alagadas onde há
produtos resultantes da decomposição de plantas e outros elementos que podem
se converter em alimentos. No Pantanal Norte, cessando as chuvas entre final de
março e meados de abril, os peixes bem alimentados voltam ao leito dos rios
(Ferraz de Lima, 1986/87). No Pantanal Sul, devido à defasagem da frente de
inundação, como conseqüência da baixa declividade, a cheia ocorre de maio a
junho, com a vazante nos meses de agosto a outubro.
Na medida em que a utilização econômica dos peixes do Pantanal
aumenta, mais e mais espécies são incluídas no rol das pescáveis, havendo uma
tendência para que os peixes da base da cadeia alimentar sejam aproveitados não
somente pelos grandes carnívoros. Essa situação já vem acontecendo no
Pantanal e pode ser evidenciada pelo fato de que, na década 70, as espécies
mais pescadas eram os grandes bagres, representados pelo pintado
(Pseudoplatystoma corruscans) e pela cachara (Pseudoplatystoma reticulatum).
Mais recentemente, o pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) tornou-se
a mais pescada (Resende et al., 1998). Assim, considerando-se que a
conservação e uso sustentável dos recursos pesqueiros dependem de estudos da
biologia, ecologia, reprodução, genética, estrutura trófica, etc., os resultados do
presente estudo poderão oferecer as ferramentas para a realização de um
planejamento de exploração racional e de manejo adequado, garantindo a
sustentabilidade neste ambiente.
1.2) O Pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887)
A espécie conhecida como pacu, pacu-caranha, caranha, pacu-guaçu, era,
anteriormente, identificada como Colossoma mitrei. Posteriormente, verificou-se
que a mesma espécie já havia sido descrita por Holmberg alguns anos antes
(Britski et al., 2007), passando então à denominação atual, Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887.
Esta espécie caracteriza-se como um serrasalmideo de grande importância
comercial (Severi et al., 1999) que apresenta ampla distribuição na bacia do
Paraná/Paraguai formada pelos rios Paraguai e Paraná; e do Prata formada pelos
rios do Prata, Uruguai e seus afluentes (Fowler, 1850; Resende, 2003). Possui
corpo ovalado e robusto, com dorso cinza escuro e ventre amarelado (Britski et al.,
2007) (Figura 2). Assim como a maioria das espécies de peixe de interesse
comercial do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, o pacu é um peixe de ambientes
lóticos e semi-lóticos (Agostinho et al., 2004) que desova após longa distância de
migração percorrida. A maturidade sexual é alcançada com cerca de três anos
(Ferraz de Lima et al., 1984) e aproximadamente 34 cm do comprimento total
(Vazzoler et al., 1997) e a maturação dos ovos leva quatro meses para se
completar (entre julho a outubro). A desova geralmente acontece em novembro
(Ferraz de Lima et al., 1984).
É considerada como uma das espécies de grande valor comercial e de
grande potencial para a piscicultura nacional (Castagnolli & Zuim, 1985;
Calcagnoto, 1998; Jomori et al., 2003; Resende, 2003; Catella, 2001 apud Peixer
& Petrere, 2007) e até internacional (Pullela, 1997) e chega a alcançar 5 kg
(Catella et al., 1996) e 60 a 82 cm de comprimento (Vazzoler et al., 1997, Britski,
et al., 2007). Ocupa atualmente posição de destaque na pesca comercial e
esportiva na região, sendo a primeira espécie em captura (Catella et al., 1996;
Resende, 2003) Seus estoques tem diminuído nas últimas décadas devido
principalmente à sobrepesca (Resende, 2003) e também devido às grandes
alterações em seu habitat (Smith et al., 2003 apud Makrakis et al., 2007). Sua
dieta é predominantemente vegetariana, alimentando-se, também de alguns
insetos (Hahn et al., 2004). Possui uma dentição particular na forma de dentes
molariformes grandes multicuspidados, especialmente adaptada para quebrar e
esmagar frutos e sementes que compõem a sua alimentação na fase adulta
(Resende et al., 1998). Durante as enchentes, os pacus costumam ficar embaixo
das palmeiras carandás (Copernicia Alba) aguardando a queda dos seus frutos
para se alimentarem (Resende et al., 1998). Devido ao seu rápido
desenvolvimento e facilidade de manejo, além da sua grande rusticidade e
adaptação à alimentação artificial (Carneiro et al., 1995), o pacu é utilizado
extensivamente em programas de aqüicultura, juntamente com o tambaqui e seus
híbridos recíprocos (Saint-Paul, 1985).
Figura 2: Exemplar de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Fonte:
Britski et al. (2007).
Embora de interesse bastante evidente, ainda são poucos os estudos
relacionados a esta espécie, principalmente estudos genéticos. Zamparette (1996)
estudou quatro populações de pacu oriundos de estoques selvagens utilizando
marcadores citogenéticos (coloração convencional, bandeamento C e NOR,
biometria cromossômica) e moleculares (Random Amplified Polymorphic DNA ou
Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso). O autor verificou que as análises
citogenéticas de coloração convencional, de bandeamento NOR e de biometria
cromossômica não apresentaram diferenças entre as populações. No
bandeamento C, alguns cromossomos mantiveram-se sem variação e outros
apresentaram variações nas marcações dos blocos de heterocromatina
constitutiva, tornando possível uma caracterização populacional com base nesta
característica. Nas análises moleculares com o uso da técnica de RAPD e
utilizando 160 primers, o autor não encontrou marcador populacional
discriminativo entre as quatro populações estudadas.
Calcagnotto et al. (2001) isolaram locos microssatélites em pacu. Os oito
locos isolados foram polimórficos apresentando média de 6,5 alelos por loco.
Cinco locos exibiram heterozigosidade maior que 60%. Os autores também
encontraram alto nível de amplificação destes primers em outras espécies do
gênero Serrasalminae.
Calcagnotto (1998) utilizou bancos genéticos selvagens de pacu para
realizar a caracterização das populações através da análise do DNA mitocondrial.
Este marcador caracteriza-se como uma molécula circular pequena, fechada
covalentemente, cujo tamanho varia de 14 a 26 kb (Bilington & Hebert, 1991).
Apresenta um conteúdo gênico altamente conservado, representado por dois
genes que codificam RNAs ribossômicos (rRNAs 12S e 16 s), 22 genes que
codificam RNAs transportadores (tRNA) e 13 genes que codificam proteínas
envolvidas no transporte de elétrons e na síntese de ATP segundo Moysés (2005).
Os resultados obtidos indicaram uma baixa variabilidade genética nos estoques
selvagens de pacu analisados.
A caracterização de um número mais representativo de estoques de pacu
da região do Pantanal Matogrossense poderia, pois, envolver implicações práticas
para o cultivo desta espécie e para o estabelecimento de estratégias relacionadas
à sua conservação (Calcagnotto et al., 2001).
1.3) Estudos Genéticos em Peixes
Muitas espécies aquáticas têm sofrido risco de extinção devido às
atividades humanas que modificam e afetam a estrutura e manutenção das
espécies na natureza, como alterações de gradientes dos leitos dos rios, criações
e/ou interrupções de fronteiras entre habitats, introdução de espécies de peixes
exóticos em ambientes naturais e de peixes nativos, sem o estabelecimento de
programas de manejo e de monitoramento genético (Futuyma, 1992; Toledo-Filho
et al., 1992, Hurt & Hedrick, 2004). Torna-se, então, importante conservar os
recursos genéticos de peixes, para garantir e manter a diversidade genética intra e
interespecífica, identificando maneiras de conservação e criando o
estabelecimento de programas de manejo e monitoramento (Zamparete, 1996).
Além disso, o incremento da investigação sobre a genética de peixes pode gerar
informações de grande importância em programas de melhoramento genético das
espécies de interesse zootécnico, promovendo o desenvolvimento da aqüicultura.
A contribuição da genética para a piscicultura abrange tanto a aplicação de
metodologia clássica como seleção, hibridação e análises dos níveis de
endocruzamento como o emprego de técnicas utilizadas em biotecnologia e
engenharia genética como manipulação cromossômica, reversão sexual, utilização
de marcadores moleculares e transgenia (Toledo-Filho et al., 1996).
As pesquisas em genética de populações de peixes têm contribuído para
elucidação de várias questões relativas à estruturação de populações selvagens
ou cultivadas de diversas espécies, da sua origem e suas características
peculiares, tais como sucesso reprodutivo, taxas de divergências genéticas entre
populações, migração, tamanhos da população, seleção natural e eventos
históricos (Sunnucks, 2000). A citogenética de peixes neotropicais tem contribuído
na separação de espécies próximas e, muitas vezes, na elucidação da história
evolutiva de espécies e populações, auxiliando na compreensão das relações de
parentesco entre ou dentro de diferentes ordens, famílias ou gêneros. Entretanto,
tais técnicas, quando aplicadas isoladamente, não são totalmente eficazes para a
elucidação de todas as questões evolutivas. Os marcadores moleculares,
portanto, podem constituir-se em ferramentas úteis na separação de espécies e
populações, quando as características morfológicas e citogenéticas não forem
suficientes (Marques, 2002). São identificados como qualquer fenótipo molecular
oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA.
O incremento tecnológico na área de marcadores moleculares tem sido
fascinante e extremamente rápido. A tecnologia de DNA recombinante e o
desenvolvimento da amplificação de segmentos de DNA via PCR (Polymerase
Chain Reaction ou reação em cadeia da polimerase), abriram caminho para uma
mudança no paradigma genético básico da inferência do genótipo a partir do
fenótipo, no qual Mendel foi pioneiro, para a análise genética da variação na
seqüência de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os marcadores moleculares têm sido amplamente utilizados na
identificação de populações de peixes, na verificação de relações filogenéticas
entre espécies e na verificação da segregação reprodutiva entre populações
isoladas, mesmo quando pertencentes ao mesmo estoque de exploração
pesqueira em zona de alimentação comum (Bernatchez et al., 1998). Também
podem auxiliar na caracterização dos estoques nos programas de melhoramento
genético de peixes. Suas aplicações em quaisquer organismos são inúmeras e
envolvem, também, a estimativa da variabilidade genética de estoques, que é de
fundamental importância para estudos de biologia básica e aplicada. Os
marcadores genéticos podem ser utilizados para estimar inúmeros parâmetros de
interesse ecológico como taxas de migração, tamanho da população, efeito
gargalo, relação de parentesco e outros (Salkoe & Toonen, 2006). Diversas
técnicas de biologia molecular estão hoje disponíveis para a detecção de
variabilidade genética ao nível de seqüências de DNA, ou seja, para a detecção
de polimorfismos genéticos, para uso tanto nos estoques em cativeiro como em
populações naturais. O RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ou
Polimorfismos de DNA Amplificados ao Acaso), por exemplo, tem sido utilizado
satisfatoriamente em estudos de genética populacional de peixes (Saitoh, 1998;
Revaldaves, 2001; Shikano & Taniguchi, 2002).
Os locos microssatélites, também conhecidos como SSR (simple sequence
repeats) ou STR (short tandem repeats), consistem em seqüências curtas de DNA
com um a seis nucleotídeos de comprimento repetidos em tandem e dispersas
pelo genoma nuclear de organismos procariotos e eucariotos (Litt & Luty, 1989). A
técnica utilizada para a análise do polimorfismo dos microssatélites se baseia na
técnica de PCR, na qual se utiliza primers específicos (de 20 a 30 bases) para a
amplificação de um determinado segmento de DNA, os quais são complementares
a seqüências únicas que, nesse caso, flanqueiam um microssatélite. Segmentos
amplificados a partir destes sítios quase que invariavelmente apresentam um
polimorfismo extensivo, resultante da presença de diferentes números de
elementos simples repetidos. Assim, cada "ilha" microssatélite,
independentemente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc), constitui um loco
genético altamente variável, multialélico, de grande conteúdo informativo (Ferreira
& Grattapaglia, 1998).
Para usufruir do grande potencial dos microssatélites torna-se necessário
entender como estes evoluem dentro e entre espécies. A identificação de um
ancestral comum pode ser prejudicada devido às altas taxas de mutação que
também pode resultar numa convergência excessiva de estados alélicos,
subestimando a divergência alélica entre populações (Fitzsimmons et al., 1995).
Dois modelos foram propostos para explicar o papel das mutações na
evolução dos microssatélites: o modelo dos alelos infinitos (IAM, Infinite Allele
Model) (Kimura & Crow, 1965 apud Moysés, 2005) e o modelo stepwise (SMM,
Stepwise Mutation Model) (Kimura & Ohta, 1978 apud Moysés, 2005). No modelo
IAM, cada mutação cria um novo alelo a uma dada taxa (u), não permitindo
homoplasia. Alelos indênticos compartilharm o mesmo ancestral e são idênticos
por descedência. O modelo SMM considera que cada mutação cria um novo alelo
através de ganho ou perda de uma repetição com probabilidade igual a u/2 em
ambas as direções. Assim, os alelos de tamanhos muito diferentes são
considerados menos relacionados que aqueles de tamanhos similares,
caracterizando uma memória em relação ao tamanho do alelo, ao contrário do
modelo IAM (Balloux & Lugon-Moulin, 2002).
Os microssatélites possuem características que os tornam excelentes
marcadores como abundância no genoma nuclear, alto polimorfismo, exibem
níveis de alelismo e de heterozigosidade, são marcadores codominantes e
apresentam herança Mendeliana. E sendo esta metodologia baseada em PCR,
pequenas quantidades de DNA são suficientes para as análises (Wright &
Bentzen, 1994). Devido a essas características, os microssatélites são
rotineiramente utilizados para investigar a estrutura genética de populações
naturais e padrões de fluxo gênico e podem ser utilizados como uma ferramenta
na seleção de linhagens para acasalamentos geneticamente controlados. Sua
aplicação é ampla, como se pode observar em alguns relatos como no trabalho de
Ward et al. (2003), que examinaram polimorfismos em 10 locos microssatélites em
populações de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) de pisciculturas para verificar
a variabilidade genética. Hara & Sekino (2003) determinaram a paternidade da
progênie de um estoque de criação de Paralichthys olivaceus usando locos
microssatélites. Cnaani et al. (2003) pesquisaram a ligação genética entre
marcadores microssatélite e QTL (Quantitative trait loci ou locos de características
quantitativas) para tolerância ao frio e tamanho de peixe em híbridos
interespecíficos de tilápia (Oreochromis niloticus).
Uma vez identificados os marcadores genéticos associados a caracteres de
importância zootécnica, estes poderiam ser utilizados para orientar programas de
seleção, auxiliando no aumento de freqüências de alelos favoráveis ou assistindo
à introgressão de genes candidatos em linhagens divergentes. O uso da
metodologia molecular na pesquisa pesqueira tem aumentado devido ao
desenvolvimento de técnicas e também pela conscientização do valor dos dados
genéticos. Nesse sentido, os marcadores moleculares têm permitido avanços nos
estudos sobre a análise de estrutura de estoques, aqüicultura e
taxonomia/sistemática (Ward & Grewe, 1995).
Os microssatélites tem se tornado o mais popular e versátil marcador para
aplicações ecológicas, pois fornecem estimativas contemporâneas de migração,
podem identificar relações de parentesco entre os indivíduos e distinguir taxas
relativamente altas de desvios da panmixia (Salkoe & Toonen, 2006).
Feldheim et al. (2001) utilizaram marcadores microssatélites para
caracterizar a estrutura genética de populações de tubarão (Negaprion
brevirostris) do oeste do Atlântico. As análises mostraram uma leve estruturação
genética em apenas uma população e a ocorrência de fluxo gênico nas demais.
Morelli et al. (2007) verificaram, através do uso de marcadores microssatélites e
DNA mitocondrial, que populações de Prochilodus lineatus apresentaram leve
estruturação entre os animais residentes e migrantes, do rio Mogi-Guaçu.
López (2006) utilizou seis locos microssatélites isolados para pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) para verificar a variabilidade genética
de populações de Brycon sinuensis. Os resultados mostraram que as populações
não se encontravam em equilíbrio de Hardy Weinberg e apresentaram baixa
estruturação. Pampoulie et al. (2006) utilizaram nove locos microssatélites e o loco
Pan I para verificar a existência de estrutura genética nas populações de bacalhau
(Gadus morhua) da Islândia.Os estudos voltados para a conservação de
populações ou espécies de importância econômica ou em risco de extinção
fornecem dados que constituem uma base essencial na tomada de medidas de
manejo de populações selvagens ou cultivadas (Marques, 2002).
O conhecimento de como a variabilidade genética é partilhada entre as
populações tem grande importância não apenas nas áreas de biologia evolutiva e
ecologia como também na biologia da conservação (Balloux & Lugon-Moulin,
2002) e as informações sobre a estrutura de populações podem fornecer valiosas
diretrizes para estratégias de conservação e manejo (Eizirik et al., 2001). Entender
o processo de fluxo gênico e seus efeitos torna-se importante para vários campos
de pesquisa incluindo a genética e ecologia de populações, epidemiologia e
conservação biológica. Estimativas confiáveis da diferenciação populacional são
primordiais na biologia da conservação no qual se considera continuamente
necessário entender se as populações são geneticamente isoladas de outras ou
se constituem uma única população panmítica (Balloux & Lugon-Moulin, 2002).
O conhecimento da estrutura de populações pode fornecer valiosas
diretrizes para estratégias de conservação e manejo.
Objetivos
2) OBJETIVOS
Considerando que os microssatélites constituem uma das mais importantes
classes de marcadores moleculares utilizados atualmente para estudos
populacionais, o presente projeto teve como objetivo principal caracterizar a
diversidade genética de populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg
1887) da Bacia do Alto Paraguai utilizando estes marcadores. A partir destas
informações tornar-se-á possível estabelecer a ocorrência de bancos genéticos
selvagens para esta espécie e avaliar a existência de diferenças entre populações
de diferentes localidades.
De forma específica, pretende-se:
a) Estudar, com uso de marcadores genéticos moleculares do tipo
microssatélite, a variabilidade genética do pacu da Bacia Hidrográfica do Alto
Paraguai,
b) Identificar geneticamente as populações e caracterizar possíveis bancos
genéticos para esta espécie naquele complexo hidrográfico,
c) Investigar a ocorrência e intensidade do fluxo gênico entre as populações,
d) Avaliar as implicações dascondições ambientais na composição genética
das populações de pacu e seu significado biológico.
Material e Métodos
3) MATERIAL E MÉTODOS
3.1) Coleta de amostras de tecido
O mapeamento das populações selvagens de pacu da região do Pantanal
Matogrossense já está em andamento, sendo desenvolvido pela EMBRAPA–
Pantanal. Esta instituição possui uma coleção de peixes que foram
disponibilizados para a realização deste trabalho. Todo material biológico
amostrado foi devidamente identificado segundo seu local de coleta para que se
iniciassem as análises moleculares. Estipulou-se, inicialmente, que fossem
coletados pelo menos 30 indivíduos de cada uma das localidades escolhidas para
este projeto. Porém nem todas as localidades puderam apresentar esse número
amostral determinado devido a disponibilidade de peixes da região.
Na Tabela 1 estão os dados de localidade, número amostral e
nomenclatura utlilizada e a Figura 3 ilustra os locais de coleta na região do
Pantanal Matogrossense.
Tabela 1: Localidades, número de amostras e nomenclatura utilizada para os tecidos
de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) nos estudos realizados.
Sub- bacias
Localidade Amostras
Nomenclatura
3
Rio Cuiabá (Parque Nacional – Foz)
Rio São Lourenço
Rio Cuiabá (SESC Pantanal)
34
31
40
RPCN
RSLO
RCSE
4
Rio Taquari Caronal
Rio Taquari Palmeiras
11
35
RTCA
RTPA
5
Rio Negro 13 RNEG
Rio
Paraguai
Rio Paraguai Mirim
Rio Paraguai Corumbá
Rio Paraguai Cáceres
16
19
25
RPMI
RPCO
RPCA
TOTAL 224
R
i
o
P
a
r
a
g
u
a
i
R
i
o
C
a
b
a
ç
a
l
Ri
o
j
a
u
r
u
J A U R U
PORTO
ESPERIDIÃO
R
i
o
S
e
p
o
t
ub
a
MIRASOL DO
OESTE
SONORA
PEDRO
GOMES
CÁCERES
Poconé
VÁRZEA
GRANDE
STO ANTONIO
DO LEVEGER
CHAPADA
GUIMARÃES
CUIABÁ
MIMOSO
RONDONOPOLIS
BARÃO DE MELGAÇO
Tangará da
Serra
Barra do
Bugre
Alto
Paraguai
Diamantino
R
i
o
C
u
i
a
b
á
Rosário do
Oeste
Descalvados
Poxoréu
MATO GROSSO
GOIÁS
MATO GROSSO
DO SUL
Porto
estrela
Jaciara
R
i
o
C
u
i
a
b
á
R
i
o
R
i
o
V
e
r
m
e
l
h
o
S
ã
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L
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C
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e
s
C
o
r
r
e
n
t
e
s
P
i
q
u
i
r
i
R
i
o
Tiquira
ALCINÓPOLIS
COXIM
R
i
o
R
i
o
T
a
q
u
a
r
í
Corumbá
Lagoa jacadigo
N
e
g
r
o
R
i
o
Rio Negro
Rio Verde do
Mato Grosso
São Gabriel
do Oeste
Camapuã
Miranda
Bandeirantes
Aquidauana
Anastácio
Terenos
Campo
Grande
A
q
u
i
d
a
u
a
n
a
A
q
u
i
d
a
u
a
n
a
R
i
o
N
i
o
a
q
u
e
R
i
o
Bodoquena
Bonito
Nioaque
Sidrolândia
Guia Lopes
Jardim
M
i
r
a
n
d
a
S
a
l
o
b
r
a
R
i
o
A
q
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a
b
ã
R
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R
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N
a
b
i
l
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q
u
e
P
a
r
a
g
u
a
i
Caracol
Bela Vista
R
i
o
A
p
a
Porto
Murtinho
P
e
r
d
i
d
o
R
i
o
R
i
o
C
a
r
a
c
o
l
Porto São
Francisco
15º S
60º W
55º W
20º S
B O L I V I A
P A R A G U A I
0 50 100 km
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura 3: Mapa representativo do Pantanal Mato–Grossense com os locais de coleta. 1: Ri
o
Cuiabá/Parque Nacional – Foz; 2: Rio São Lourenço; 3: Rio Cuiabá/SESC Pantanal; 4
: Rio
Taquari/Caronal; 5: Rio Taquari/Palmeiras; 6: Rio Negro; 7: Rio Paraguai Mirim; 8
: Rio
Paraguai/Corumbá; 9: Rio Paraguai/Cáceres.
3.2) Isolamento do DNA genômico
A extração do DNA genômico a partir das amostras de nadadeiras de cada
indivíduo coletado foi feita segundo Aljanabi e Martinez (1997).
Os procedimentos desta técnica foram:
• Colocar 290 µl de tampão de extração (30 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1%
SDS) mais 10 µl de Proteinase K (10 mg/mL) e um fragmento de tecido
(cerca de 10,5 mg);
• Incubar em banho maria à 55ºC por 2 a 3 horas ou até que a amostra esteja
digerida. Agitar o tubo periodicamente;
• Retirar do banho e acrescentar 100 µl de solução de NaCl 5M e misturar
bem invertendo o tubo vagarosamente;
• Centrifugar a 10000 RPM por 10 minutos em temperatura ambiente;
• Remover o sobrenadante e transferir para outro tubo de 1,5 mL. O tubo com
o resíduo decantado pela centrifugação pode ser descartado;
• Adicionar 600 µl de etanol 100% gelado sobre o sobrenadante e misturar o
conteúdo do tubo invertendo-o gentilmente até que os filamentos brancos
de DNA formem uma massa visível. A não formação dessa massa não
significa a não existência de DNA;
• Colocar no freezer -70ºC por 20 minutos para que o DNA se precipite;
• Centrifugar a 14000 RPM por 30 minutos à 4ºC;
• Descartar o etanol;
• Adicionar 1000 µl de etanol 70% gelado e inverter o tubo;
• Centrifugar a 14000 RPM por 5 minutos à 4ºC;
• Descartar o etanol
• Secar em estufa à 37ºC por 20 a 30 minutos. Certificar-se de que o etanol
tenha evaporado todo;
• Adicionar 200 µl de água Milli Q autoclavada;
• Deixar hidratando a temperatura ambiente por 24 horas.
3.3) Verificação da integridade do material
Após o isolamento do DNA genômico, as amostras obtidas foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1%, que foi preparado fundindo-se
0,15 g de agarose no volume de 150 ml de tampão TAE (Tris/Acetato/EDTA) 1X
em forno de microondas. Esta solução foi resfriada até temperatura próxima a
60ºC e vertida em suporte adequado para cuba de eletroforese. Deixou-se
solidificar, completou-se a cuba com tampão de corrida (o mesmo utilizado para
preparar o gel) e as amostras contendo 3 µl de material e 1 µl de corante azul de
bromofenol foram aplicadas nos poços do gel. Este corante serviu de indicador
para localização dos fragmentos de DNA no decorrer da eletroforese. As amostras
aplicadas foram submetidas a uma voltagem constante de 100 V e amperagem de
250 mA por uma hora. Após a corrida, as moléculas de DNA foram coradas
submergindo-se o gel em solução de brometo de etídeo (0,05 mg/ml) e
fotografados utilizando-se o Kodak Digital Science 1D.
Esta eletroforese permitiu verificar a integridade do DNA das amostras
indicadas para serem utilizados nas reações de amplificação.
3.4) Amplificação dos locos microssatélites
As análises dos polimorfismos de microssatélite procederam-se a partir das
amostras de DNA de cada animal, realizando a amplificação da região com as
seqüências simples repetidas em um termociclador (PTC-100
TM
Programmable
Thermal Controller MJ Research, Inc.). Para verificar a composição da estrutura
genética de populações de pacu, foram utilizados primers desenhados
especificamente para esta espécie, descritos no trabalho de Calcagnotto et al.
(2001). Na Tabela 2 estão relacionadas as informações sobre os primers utilizados
para a avaliação da diversidade genética das populações de pacu do Pantanal
Matogrossense.
Tabela 2: Informações sobre os primers (Calcagnotto et al., 2001) utilizados para
amplificar os locos microssatélites em pacus (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887).
Loco
Nº acesso no
“GenBank”
Variação do tamanho dos alelos Tipo de repetição Primer (5´-3´)
Pme2 AF362445 195 – 213 (GT)18
F: TGGGTGCACAGCACAGTAAC
R: TTTGCATTTCTGGTGCAAAG
Pme4 AF362446 191 – 213 (GT)14
F: CATGCTGCTGCAGATTAGAC
R: CGCTTGCAATTTAACGCAGT
Pme5 AF362447 182 – 200
(GA)10gggagctggta
(GT)10C(GT)12
F: CAGAGCATCTGGAGGGACAT
R: TCTGAGACACTGATATCTAAACACACA
Pme14 AF362448 195 – 208 (CTG)7
F: ACCGTTATGCCCTACCCTTC
R: GCGTTCTAGACAGAACTCATGG
Pme20 AF362449 213 – 215 (GT)15
F: CAGAGCTTTGAGGAACACGA
R: CCCATCAGTTACGGGTCATT
Pme21 AF362450 260 – 268 (GT)15
F: ATAATGCTGGCGTCAGTGGT
R: GGACAGCTGGTCTCAAGCTC
Pme28 AF362451 209 – 227 (GT)15
F: CCCAGAAGAGTGGAAGCTGT
R: TGGTGGGAATTGACAAGAAA
Pme32 AF362452 242 – 247 (CTG)7
F: GCGAGGAAATCTGCCTGTGAC
R: AGGAGGGCATCATGGAGAA
A amplificação das regiões com os microssatélites foi realizada seguindo
as orientações citadas por Calcagnotto et al. (2001). Com relação à padronização
da técnica do PCR, foram realizados ensaios variando-se as quantidades de
alguns reagentes da reação, temperatura de anelamento dos primers e tempos
nos ciclos de amplificação no termociclador, na tentativa de otimizar a técnica.
Porém, resultados mais significativos foram alcançados com a realização das
reações e dos programas de PCR segundo Calcagnotto (comunicação pessoal),
seguindo os protocolos desenvolvidos pela autora (Tabelas 3 e 4).
Tabela 3. Representação de um mix de PCR com seus componentes para o
primer Pme2
Componente Básico Reação (µl)
H
2
O Milli Q autoclavada 7,00
Tampão 10X 1,25
dNTPs 8 Mm 1,25
MgCl2 25 µM 0,37
Taq DNA polimerase 5 U/µl 0,10
Primer Forward 10 µM 0,4
Primer Reverse 10 µM 0,4
BSA (Soro Albumina Bovina) 1,25
DNA 1,0
Volume final
13,02
Tabela 4. Representação de um mix de PCR com seus componentes para os
demais primers.
Componente Básico Reação (µl)
H
2
O Milli Q autoclavada 6,10
Tampão 10X 1,25
dNTPs 8 Mm 1,25
MgCl2 25 µM 0,75
Taq DNA polimerase 5 U/µl 0,10
Primer Forward 10 µM 0,4
Primer Reverse 10 µM 0,4
BSA (Soro Albumina Bovina) 1,25
DNA 1,0
Volume final
12,5
Com relação aos programas de PCR, a temperatura de anelamento de
57ºC foi estipulada para os primers Pme2 e Pme21 e de 59ºC para os primers
Pme20 e Pme28. Para os locos Pme4, Pme5 e Pme14, utilizaram-se um ciclo
touchdown.
Os programas utilizados para realizar a amplificação dos locos citados
estão descritos abaixo:
MST 57 (para os locos Pme2 e Pme21):
• 1º passo: 4 minutos à 94ºC;
• 2º passo: 45 segundos à 94ºC;
• 3º passo: 45 segundos à 59ºC;
• 4º passo: 45 segundos à 72ºC;
• 5º passo: volta para o 2º passo por 30 vezes;
• 6º passo: 7 minutos à 72ºC;
• 7º passo: esfriar à 4ºC – Fim.
MST 59 (para os locos Pme20 e Pme28):
• 1º passo: 4 minutos à 94ºC;
• 2º passo: 45 segundos à 94ºC;
• 3º passo: 45 segundos à 59ºC;
• 4º passo: 45 segundos à 72ºC;
• 5º passo: volta para o 2º passo por 29 vezes;
• 6º passo: 10minutos à 72ºC;
• 7º passo: esfriar à 4ºC – Fim.
Touchdown (para os locos Pme4, Pme5 e Pme14):
• 1º passo: 5 minutos à 95ºC;
• 2º passo: 45 segundos à 95ºC;
• 3º passo: 45 segundos à 59ºC;
• 4º passo: 45 segundos à 72ºC;
• 5º passo: volta para o 2º passo uma vez;
• 6º passo: 45 segundos à 95ºC;
• 7º passo: 45 segundos à 57ºC;
• 8º passo: 45 segundos à 72ºC;
• 9º passo: volta para o 6º passo uma vez;
• 10º passo: 45 segundos à 95ºC;
• 11º passo: 45 segundos à 55ºC;
• 12º passo: 44 segundos à 72ºC;
• 13º passo: volta para o 10º passo uma vez;
• 14º passo: 45 segundos à 95ºC;
• 15º passo: 45 segundos à 53ºC;
• 16º passo: 44 segundos à 72ºC;
• 17º passo: volta para o 14º passo uma vez;
• 18º passo: 45 segundos à 95ºC;
• 19º passo: 45 segundos à 51ºC;
• 20º passo: 45 segundos à 72ºC;
• 21º passo: volta para o 18º passo por 25 vezes;
• 22º passo: 10 minutos à 72ºC;
• 23º passo: esfriar à 4ºC – Fim.
Para os ensaios com o material amplificado das amostras dos indivíduos
dos diferentes estoques, a separação dos alelos foi feita em gel de poliacrilamida
não desnaturante na concentração de 6% e a visualização dos alelos foi feita
utilizando-se o protocolo de coloração com nitrato de Prata, conforme descrito em
Suganuma (2004). Procedeu-se à coloração conforme descrito abaixo:
• Preparar a solução fixadora composta de 15 ml de etanol absoluto, 1 ml de
ácido acético e água destilada q.s.q. 150 ml;
• Mergulhar o gel na solução fixadora, agitar levemente e deixar por 10
minutos;
• Preparar a solução de nitrato de prata pesando-se 0,3 g de nitrato de prata
e dissolvendo em 150 ml de água destilada;
• Verter a solução de nitrato de prata no recipiente com o gel e a solução
fixadora e homogeneizar as soluções. Esperar 15 minutos;
• Descartar as soluções e lavar o gel brevemente com água destilada.
Preparar a solução reveladora composta de 10 ml de hidróxido de sódio 30%, 2 ml
de formaldeído e água destilada q.s.q. 150 ml. Colocar sobre o gel e agitar
suavemente até que as bandas apareçam.
Posteriormente, os alelos foram visualizados e fotografados utilizando-se
um transiluminador de luz branca e o programa Kodak Digital Science 1D.
Oligonucleotídeos com modificações 6-FAM (6-carboxifluoresceína) ou
HEX (hexacloro-6-carboxifluoresceína) na extremidade 5’ da direção forward
foram sintetizados e utilizados em novas reações de PCR.
3.5) Genotipagem automatica em seqüenciador
Inicialmente, a genotipagem seria realizada através de eletroforese em gel
de poliacrilamida dos produtos de PCR. Devido ao grande trabalho requerido,
demora e dificuldade da interpretação dos dados que a aplicação desta
metodologia requer, além de acentuar as dificuldades quando um grande número
de indivíduos é analisado e/ou vários locos são utilizados, optou-se pela
genotipagem em seqüenciador.
O DNA genômico extraído das amostras de nadadeira e os
oligonucleotídeos marcados com fluorescência foram utilizados nas reações de
PCR para amplificar as regiões microssatélite. Posteriormente, estes produtos de
PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% para averiguação da
concentração. Observando-se a intensidade das bandas, pode-se determinar a
diluição das amostras para serem seqüenciadas. As bandas apresentaram-se
bastante intensas, podendo-se diluir uma parte do produto de PCR em dez de
água Milli Q autoclavada.
As amostras analisadas pelo seqüenciador foram dispostas em uma placa
de 96 poços (Thermo-Fast® 96 PCR Plate Skirted, Low Profile). Em cada poço foi
possível fazer combinações das reações, desde que realizadas com os primers
marcados com fluorescências diferentes. Assim, em cada poço havia reações de
um mesmo indivíduo amplificadas com primer marcado com 6-FAM e também
com primer marcado com HEX.
Além dos produtos de PCR diluídos, foi adicionada uma mistura com o
marcador de peso molecular conhecido MegaBACE
TM
ET550-R Size Standard
(GE Healthcare), mais uma solução de carregamento de Tween20
(polioxietilenosorbitano monolaurato) a 0,1% em água destilada.
Primeiramente foi realizado um teste no qual foram escolhidas,
aleatoriamente, 36 amostras para serem genotipadas. Os resultados obtidos em
relação a diluição deste teste foram satisfatórios, permitindo a continuidade do
trabalho. Os fragmentos amplificados foram genotipados no seqüenciador
automático MegaBACE
TM
1000 (Amersham Biosciences), pertencente ao Centro
de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo e a visualização
dos resultados foi feita utilizando-se o programa GeneMarker v.1.6 (Soft Genetics
LLC). O tamanho dos alelos foi obtido por comparação com o marcador de peso
molecular MegaBACE
TM
ET550-R Size Standard (GE Healthcare).
3.6) Forma de análise dos resultados
A determinação do tamanho dos alelos foi realizada utilizando-se o
programa GeneMarker v.1.6 (Soft Genetics LLC), através da comparação com o
marcador de peso molecular MegaBACE
TM
ET550-R Size Standard (GE
Healthcare).
A variabilidade genética das populações de pacu foi determinada
utilizando-se programas computacionais como Genepop 1.2 (Raymond & Rousset,
1995), FSTAT v.1.2 (Goudet, 1995), Arlequim ver 2.000, A Software for Population
Genetics Data Analysis (Schneider et al., 1997), Structure.2.2 (Pritchard, 2000),
GeneClass2 (Piry et al., 2004) e Phylip version 3.68 (Felseintein, 2005).
Os tamanhos dos alelos foram organizados em matrizes de dados que foram
submetidas aos programas computacionais. Foram calculados vários parâmetros
que permitiram a determinação da diversidade genética intra e interpopulacional.
O número de alelos por loco e a riqueza alélica foram calculados utilizando-se o
Fstat. A heterozigosidade observada foi calculada segundo Brown & Weir (1983) e
a esperada segundo Nei (1978), utilizando o programa Arlequin. Este programa
também foi utilizado para calcular o equilíbrio de Hardy Weinberg, o índice Fst
segundo Weir & Cockerham (1984), o índice Rst, que é análogo ao Fst, segundo
Slatkin (1995) e a análise de variância molecular (AMOVA). Nesta última análise,
as populações foram agrupadas formando cinco combinações:
• Todas as populações formando um grupo.
• Quatro agrupamentos sendo Grupo l: RCPN - Rio Cuiabá /Parque Nacional
– Foz, RSLO – Rio São Lourenço e RCSE – Rio Cuiabá/SESC; Grupo ll:
RTCA – Rio Taquari/Caronal e RTPA – Rio Taquari/Palmeiras; Grupo lll:
RNEG - Rio Negro; Grupo lV: RPMI - Rio Paraguai Mirim, RPCO – Rio
Paraguai/Corumbá e RPCA – Rio Paraguai/Cáceres.
• Dois agrupamentos: Grupo l: RCPN - Rio Cuiabá /Parque Nacional – Foz,
RSLO – Rio São Lourenço, RCSE – Rio Cuiabá/SESC e RPCA – Rio
Paraguai/Cáceres; Grupo ll: Rio Taquari/Caronal, RTPA – Rio
Taquari/Palmeiras, RNEG - Rio Negro, RPMI - Rio Paraguai Mirim e RPCO –
Rio Paraguai/Corumbá.
• Cinco agrupamentos: Grupo l: RCPN - Rio Cuiabá/Parque Nacional – Foz,
RSLO – Rio São Lourenço e RCSE – Rio Cuiaba/SESC; Grupo ll: RTCA –
Rio Taquari/Caronal e RTPA – Rio Taquari/Palmeiras; Grupo lll: RNEG - Rio
Negro; Grupo lV: RPMI - Rio Paraguai Mirim e RPCO – Rio
Paraguai/Corumbá; Grupo V: RPCA – Rio Paraguai/Cáceres.
O índice de fixação de Wright (1978), que mede a deficiência de
heterozigotos, a diferenciação populacional alélica e genotípica e o teste exato
segundo Raymond & Rousset (1995), que leva em conta a freqüência das bandas
para ser calculado foram calculados utilizando o programa Genepop. A distância
de chord de Cavalli Sforza & Edwards (1967) foi calculada através do programa
GeneClass2.
O programa Structure foi utilizado para verificar a estrutura populacional.
Para a determinação do número de populações (K) existentes utilizou-se o modelo
de ancestralidade misturada (Admixture), com os alelos correlacionados, que
permite a resolução máxima na separação das populações com K variando de 1 a
12. Cinco corridas independentes com 500.000 simulações em cadeias de Monte
Carlo Markov (MCMC) e 100.000 gerações “burn in” foram usadas para cada valor
de K. O número exato de populações é esperado ser o valor K máximo estimado
pelo modelo log-likelihood, log [P(X/K)] (Falush et al., 2003).
Um dendrograma foi gerado a partir da matriz de distância baseada nos
valores de distância de chord, os quais foram agrupados pelo método UPGMA
(Unweighted pair group method with arithmetic mean) (Sneath & Sokal, 1973),
utilizando-se o programa Phylip version 3.68 (Felseintein, 2005).
O número de migrantes foi calculado com base nos alelos privativos segundo
Barton & Slatkin (1986), utilizando o programa Genepop.
Resultados
4) RESULTADOS
4.1) Extração e purificação do DNA das amostras
A extração de DNA foi realizada a partir das amostras do material
coletadas pela Embrapa–Pantanal e disponibilizadas para este trabalho, sendo
devidamente identificadas utilizando-se a nomenclatura indicada na Tabela 7. Nos
estudos de diversidade genética são necessários que as amostras sejam
identificadas corretamente para que se possa entender o comportamento dessas
populações com relação à possível troca de alelos que ocorrem entre elas.
Neste trabalho utilizou-se a metodologia de extração de DNA genômico
segundo Aljanabi e Martinez (1997) por apresentar certas vantagens como a
facilidade e rapidez da realização, a não necessidade de fenol, que é um reagente
tóxico, utilizado no protocolo segundo Sambrook e Russel (2001) e a possibilidade
de processar várias amostras de tecido ao mesmo tempo. Esta metodologia
mostrou-se bastante eficiente, resultando num material de boa qualidade (Anexos
20, 21, 22 e 23).
4.2) Amplificação dos locos microssatélites
Após a obtenção do DNA procedeu-se à amplificação dos locos
microssatélites utilizados neste trabalho para verificar a composição da estrutura
genética das populações de pacu de diferentes sub-bacias do Pantanal
Matogrossense.
Os primers utilizados são específicos para esta espécie; portanto, as
reações e os programas de PCR seguiram recomendações dos autores que os
desenharam (Calcagnotto et al., 2001). Mesmo assim foram realizados alguns
ensaios para verificar se o DNA obtido pelo método de extração de Aljanabi e
Martinez (1997) apresentaria algum problema na amplificação dos locos e também
se haveria a necessidade de alguma alteração do protocolo, referente à
temperatura de anelamento ou quantidade dos reagentes para se obter melhores
resultados. Nesta fase de padronização utilizaram-se primers não marcados, uma
vez que a verificação destes resultados seria feita no gel de poliacrilamida não
desnaturante 6%. Depois de otimizadas as reações e os programas de PCR, os
mesmos foram feitos com os primers marcados com fluorescência, para proceder
à genotipagem no seqüenciador. O protocolo de extração de DNA utilizado não
interferiu na amplificação do DNA com os primers, tornando possível a sua
utilização neste trabalho devido às vantagens já descritas anteriormente.
Com relação às temperaturas de anelamento, não foram necessárias
alterações para os primers Pme2, Pme20, Pme21 e Pme28. Os programas de
PCR utilizados mostraram-se adequados, permitindo especificidade dos locos
amplificados. Foram então realizados outros testes com alteração dos reagentes e
obtiveram-se bandas bem definidas (Anexos 24, 25, 26 e 27).
Outro fator que foi testado na amplificação dos locos microssatélites foi a
concentração do DNA. Nestes testes foram utilizadas as concentrações de 10:1 e
5:1, que foram comparadas com a concentração normal, sem diluição, para
verificar possíveis diferenças. A diluição de 5:1 apresentou bandas bem definidas
e menor incidência de sub-bandas (stutter bands), que poderiam trazer
dificuldades posteriores na análise dos dados (Anexos 26 e 27).
4.3) Genotipagem automatica em seqüenciador
As amplificações das regiões microssatélites foram feitas utilizando-se o
DNA genômico e oligonucleotídeos marcados com fluorescência para, em
seguida, serem genotipados no seqüenciador automático MegaBACE
TM
1000
(Amersham Biosciences). Os tamanhos dos alelos foram determinados por
comparações com o marcador de peso molecular MegaBACE
TM
ET550-R Size
Standard (GE Healthcare) e, utilizando o programa GeneMarker v.1.6 (Soft
Genetics LLC), visualizou-se os resultados. Nos resultados gerados pelo
seqüenciamento, o tamanho dos alelos é determinado pelos picos de intensidade
no eletroferograma como mostra a Figura 13, a seguir. Também se pode observar
o tamanho dos alelos em pares de base indicados sob seus respectivos picos,
nesta figura.
A denominação numérica dada aos alelos por loco obedeceu ao critério de
aparecimento de picos nos eletroferogramas. Por exemplo, o primeiro pico foi
denominado Alelo 1, o segundo, Alelo 2.
Os indivíduos heterozigotos para os locos estudados são caracterizados
pela presença de dois picos bem definidos, enquanto os homozigotos
apresentaram um pico apenas (Figura 13). As stutter bands se fizeram presentes,
mas sempre apresentando picos de menor intensidade ao lado das bandas
representativas, não havendo nenhuma importância para a análise dos dados e
nem prejudicando a interpretação dos resultados.
Figura 4. Eletroferogramas com os picos de intensidade indicando o tamanho dos alelos em
Pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Resultados de alguns indivíduos
amplificados com o primer Pme2.
4.4) Análises intrapopulacionais
Os tamanhos dos alelos encontrados na análise das populações de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) utilizando-se oito marcadores
microssatélites estão organizados nos Anexos 1 à 9. Anexo 10 encontra-se
relacionada as freqüências alélicas dos oito locos microssatélites utilizados.
O menor número de alelos foi encontrado nas populações do Rio Negro e
Rio Paraguai Mirim. Essa amostra apresentou apenas um alelo; caracterizando seu
monomorfismo para o loco Pme32. A população do Rio Cuiabá/Sesc apresentou o
maior número de alelos (13) para o loco Pme28. Considerando todas as
populações, o loco Pme28 mostrou-se o mais polimórfico, com 14 alelos e os locos
Pme21 e Pme32 mostraram-se menos polimórficos, com apenas cinco alelos.
Considerando todos os locos, a população que apresentou maior número médio de
alelos foi a do Rio Cuiabá/Sesc, com 6,8 alelos. O menor número médio de alelos
foi encontrado na população do Rio Negro, com 4,0 alelos (Tabela 5).
Com relação ao tamanho dos alelos, o menor valor foi encontrado na
população do Rio Taquari/Palmeiras para o loco Pme5 e apresentou 184 pb (Anexo
4). O maior alelo foi encontrado nas populações do Rio Taquari/Caronal e Rio
Paraguai Mirim para o loco Pme21, apresentando 270 pb (Anexo 9).
Alelos exclusivos foram verificados em algumas populações e para certos
locos, como podem ser vistos na Tabela 6. Na população do Rio Taquari
/Palmeiras encontrou-se o maior número de alelos exclusivos (cinco alelos).
Tabela 5. Número absoluto de alelos por locos nas populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) estudadas. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO =
Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio
Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
Locos RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA Total
Pme2
9 9 9 8 7 6 6 7 8 11
Pme4
10 7 8 6 7 6 8 5 7 11
Pme5
7 7 8 6 8 6 6 7 8 10
Pme14
6 5 5 4 4 4 5 5 4 8
Pme20
3 3 5 4 5 3 4 5 4 6
Pme21
3 3 3 3 2 2 4 2 4 5
Pme28
11 10 13 6 12 4 7 5 9 14
Pme32
2 2 3 2 3 1 1 3 2 5
Total
6,4 5,8 6,8 4,9 6,0 4,0 5,1 4,9 5,8
Tabela 6. Alelos exclusivos por locos nas populações de pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887) estudadas. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São
Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio
Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio
Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
Pme2
- - - - - - - - -
Pme4
- - - - - - 1 - -
Pme5
- - - - 1 - - - -
Pme14
- 1 - - - - - 1 -
Pme20
- - - - 1 - - - -
Pme21
- - - - - - - - 1
Pme28
- - - - 1 - - - -
Pme32
- - - - 2 - - - -
Tabela 7. Análise intrapopulacional de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Pantanal
Matogrossense. Os parâmetros apresentados são: N = número de indivíduos, Fis = endogamia, PHW
= equilíbrio de Hardy Weinberg (e alelos nulos quando significativo), Riqueza = riqueza alélica. RCPN
= Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA =
Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim;
RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA Média
População
N 34 30 40 11 32 13 16 19 31
Nº de alelos 9 9 9 8 7 6 6 7 8 7,6667
Fis 0,0251 0,1971 -0,0867 -0,1489 0,1089 0,2163 0,1475 0,0917 0,0345 0,0651
Ho 0,80769 0,69231 0,81579 0,9 0,7 0,61538 0,71429 0,75 0,73333 0,7476
He 0,82805 0,85897 0,75158 0,78947 0,78333 0,77846 0,83333 0,82246 0,7661 0,8013
PHW NS *(0,0826)
NS NS NS NS NS NS NS -
Pme2
Riqueza 6,134 6,536 5,47 6,784 5,48 5,007 5,383 6,183 5,321 5,811
Nº de alelos 10 7 8 6 7 6 8 5 7 7,1111
Fis 0,0701 0,2239 0,0202 -0,0169 -0,0057 0,0352 0,0909 -0,0128 0,2604 0,0739
Ho 0,74194 0,5 0,675 0,81818 0,625 0,61538 0,6875 0,57895 0,51613 0,6398
He 0,79693 0,64181 0,70253 0,80519 0,62153 0,63692 0,75403 0,57183 0,69487 0,6917
PHW NS NS NS NS NS NS NS NS *(0,1084)
-
Pme4
Riqueza 5,748 4,34 4,565 5,226 4,67 4,519 5,923 3,493 4,61 4,788
Nº de alelos 7 7 8 6 8 6 6 7 8 7
Fis -0,0238 0,1014 0,0374 -0,0519 0,0316 -0,0891 0,1517 -0,0286 0,0508 0,0199
Ho 0,82353 0,75 0,8 0,9 0,7931 0,83333 0,6875 0,84211 0,75862 0,7987
He 0,80465 0,83312 0,8307 0,85789 0,81851 0,76812 0,80645 0,81938 0,79855 0,8153
PHW NS NS NS NS NS NS NS NS NS -
Pme5
Riqueza 5,553 5,663 5,574 5,67 5,402 4,984 5,39 5,656 5,374 5,474
Nº de alelos 6 5 5 4 4 4 5 5 4 4,6667
Fis -0,1013 -0,1852 -0,2361 -0,0084 -0,009 0,1529 -0,3043 -0,3813 0,1107 -0,1069
Ho 0,6 0,68966 0,50002 0,54545 0,5625 0,46154 0,75 0,84211 0,48387 0,6039
He 0,54576 0,58379 0,405 0,54113 0,55754 0,54154 0,58065 0,61593 0,5431 0,5460
PHW NS NS NS NS NS NS NS *(0,0000)
NS -
Pme14
Riqueza 3,293 3,347 2,753 3,272 3,406 3,442 3,565 3,583 2,768
3,2699
Nº de alelos 3 3 5 4 5 4 4 5 4 4,1111
Fis -0,094 0,415 0,1433 0,3684 0,0278 -0,2203 0,44 0,1074 -0,1335 0,1171
Ho 0,54545 0,23333 0,42105 0,4 0,51724 0,71429 0,26667 0,47368 0,48387 0,4506
He 0,4993 0,39605 0,49053 0,62105 0,53176 0,61538 0,46897 0,52916 0,42782 0,5089
PHW NS *(0,1271)
NS NS NS NS NS NS NS -
Pme20
Riqueza 2,381 2,396 2,922 3,4 3,275 4 2,928 3,482 2,613 3,0441
Nº de alelos 3 3 3 3 2 2 4 2 4 2,8889
Fis 0,0541 0,1785 -0,0193 -0,08 0,3465 -0,0526 0,3514 1 0,0485 0,2030
Ho 0,26471 0,2069 0,35294 0,3 0,13043 0,18182 0,4 0 0,36 0,2441
He 0,27963 0,25106 0,34636 0,27895 0,19807 0,17316 0,60526 0,12874 0,37796 0,2932
PHW NS NS NS NS NS NS *(0,1652)
*(0,1703)
NS -
Pme21
Riqueza 0,124 2,334 2,443 2,621 4,853 1,879 3,679 1,724 2,902 2,5066
Nº de alelos 11 10 13 6 12 4 7 5 9 8,5556
Fis -0,0622 -0,0039 0,1608 0,3023 0,0769 -0,0811 -0,2748 -0,348 0,1165 -0,0126
Ho 0,85294 0,7931 0,64103 0,54545 0,80645 0,76923 0,9375 0,89474 0,66667 0,7675
He 0,80378 0,79008 0,76224 0,77056 0,87255 0,71385 0,74194 0,66999 0,75311 0,7642
PHW NS NS NS *(0,0915)
NS NS *(0,0000)
*(0,0000)
*(0,0719)
-
Pme28
Riqueza 6,314 5,728 5,894 5,14 7,161 3,537 5,093 3,975 5,249 5,3434
Nº de alelos 2 2 3 2 3 1 1 3 2 2,1111
Fis 0,4803 - -0,044 - 0,9129 - - -0,0149 1 0,4669
Ho 0,05882 0,03333 0,12821 0,09091 0,03125 - - 0,11111 0 0,0648
He 0,11238 0,03333 0,12288 0,09091 0,35367 - - 0,10952 0,06554 0,1269
PHW NS NS NS NS **(0,2530)
- - NS *(0,1236)
-
Pme32
Riqueza 1,612 1,233
1,734 1,636 2,192 1 1 1,778 1,415 1,5111
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
A grande maioria das populações mostrou-se em equilíbrio de Hardy
Weinberg, não apresentado desvios significativos. As populações do Rio
Cuiabá/Parque Nacional-Foz e do Rio Cuiabá/Sesc mostraram-se em equilíbrio de
Hardy Weinberg para todos os locos estudados enquanto a população do Rio
Paraguai/Corumbá apresentou desvio do equilíbrio de Hardy Weinberg para os
locos Pme14 e Pme28. Já a população do Rio Paraguai Mirim apresentou desvio
do equilíbrio de Hardy Weinberg para o loco Pme28. Nesses dois casos
verificaram-se valores de Fis negativos, indicando a existência de um excesso de
heterozigotos que provavelmente foi a causa dos desvios (Tabela 7).
As populações dos Rios Paraguai/Cáceres e Taquari/Palmeiras
apresentaram desvio do equilíbrio Hardy Weinberg para o loco Pme32 e a
população do Rio Paraguai/Corumbá; para o loco Pme21. Seus respectivos valores
de Fis foram positivos e iguais, ou muito próximos de 1, indicando déficit de
heterozigotos. Estas e as demais populações que apresentaram significância e,
conseqüentemente desvios de equilíbrio no Hardy Weinberg, acusaram a presença
de alelos nulos (Tabela 7).
A população do Rio Paraguai/Corumbá apresentou o menor valor para o
índice de fixação (Fis), que foi igual a -0,3813 para o loco Pme14. Os maiores
valores para este parâmetro foram encontrados nas populações dos Rios
Paraguai/Cáceres e Paraguai/Corumbá (Fis = 1) para os locos Pme32 e Pme21,
respectivamente.
A maior riqueza alélica foi encontrada na população do Rio
Taquari/Palmeiras nas análises do Pme28 (7,161). Considerando-se todos os
locos, esta população apresentou a maior riqueza alélica total. As populações dos
Rios Negro e Paraguai Mirim apresentaram o menor valor (1,000) para o loco
Pme32, podendo ser explicado devido a monomorfismo como citado anteriormente.
Os maiores valores de heterozigosidade observada e esperada foram
encontrados na população do Rio Taquari/Caronal, para os locos Pme2 e Pme5
(0,9000) e na população do Rio Taquari/Palmeiras para o loco Pme28 (0,87255).
Os menores valores foram encontrados na população do Rio Paraguai/Corumbá
para o loco Pme21 (0,0000) e na população do Rio São Lourenço para o loco
Pme32 (0,03333). Considerando todos os locos, a maior heterozigosidade
observada foi encontrada na população do Rio Negro (0,5987)(Tabela 7).
Nos dados de desequilíbrio de ligação (Anexos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, e 19) observou-se que não houve associações significativas nas análises par a
par realizadas para os locos estudados.
4.5) Análises interpopulacionais
A Tabela 8 apresenta os valores de diversidade genética das comparações
entre os pares de populações, sendo que na diagonal inferior estão os valores de
Fst e na diagonal superior estão os valores de Rst. Os menores valores destes
parâmetros foram -0,01463 e –0,0753, respectivamente, e os maiores valores
foram 0,02618 e 0,10100. As significâncias positivas sugerem uma leve
estruturação, porém os valores tanto de Fst quanto o de Rst são muito baixos,
não permitindo uma afirmação correta sobre tal fato. A população do Rio
Taquari/Palmeiras apresentou diferenças significativas para o parâmetro Fst em
sete das oito comparações com outras populações.
Na Tabela 9 pode-se observar o resultado do teste exato de Fisher que
avalia a heterogeneidade na distribuição de freqüências alélicas e genotípicas.
Não houve diferenças significativas para a grande maioria das comparações entre
as populações. A única exceção foi a população do Rio Taquari/Palmeiras que
mostrou-se significativa quando comparada com praticamente todas as
populações, tanto na diferenciação populacional alélica quanto genotípica.
Tabela 8. Diversidade genética (Fst na diagonal inferior e Rst na diagonal superior) entre pares de
populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) para todos os locos estudados. RCPN =
Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio
Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO
= Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
Populações RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
RCPN
x -0.00917 -0.00940 0.05001 -0.01197 0.07798* 0.01180 0.06204* 0.05987*
RSLO
0.00234 x -0.00346 0.06236* -0.0145 0.10100* 0.03228* 0.05615* 0.05932*
RCSE
0.00537 0.00874 x 0.05092* -0.02040 0.05017* 0.00600 0.04764* 0.04959
RTCA
0.00855 0.03503**
0.02229* x 0.06117* 0.02722 -0.07530 -0.02426 -0.00504
RTPA
0.01361* 0.01377* 0.01333* 0.00893 x 0.08010* 0.03093* 0.08603* 0.07285*
RNEG
-0.00498 0.01494 0.00290 -0.00229 0.00089 x 0.00479 0.03641 0.03803
RPMI
0.00149 0.01015 0.01408* 0.03014* 0.02239* 0.00091 x 0.00865 0.01432
RPCO
0.00454 -0.01216 0.00058 0.01846 0.02618**
-0.01463 0.01439* x -0.02146
RPCA
0.00855 0.00818 0.01593* 0.01513 0.01426* 0.00913 0.01183 -0.01031 x
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
* Significativo a 5%.
Tabela 9. Diferenciação populacional (teste exato de Fisher) alélica (Diagonal inferior) e genotípica
(diagonal superior). RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio
Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI =
Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
Populações RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
RCPN
xxx ns ns ns ** ns ns ns ns
RSLO
ns xxx ns ** ** ** ns ns ns
RCSE
ns ns xxx ns ** ns * ns ns
RTCA
ns ** ns xxx ns ns ns ns ns
RTPA
** ** ** ns xxx * ** ** **
RNEG
ns ** ns ns * xxx ns * ns
RPMI
ns ns ns ns ** ns xxx ns ns
RPCO
ns ns ns ns ** * ns xxx ns
RPCA
ns ns ns ns ** ns ns ns xxx
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
Um dendrograma foi construído com base nos valores de distância de chord
(Cavalli Sforza & Edwards, 1967), os quais foram agrupados pelo método UPGMA
(Unweighted pair group method with arithmetic mean) (Sneath & Sokal, 1973). Foi
possível observar a formação de três grupos principais:
• agrupamento das populações do Rio Paraguai Mirim e Rio Negro;
• agrupamento do Rio Taquari/Caronal e rio Taquari/Palmeiras;
• agrupamento do Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São
Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc, Rio Paraguai/Cáceres e Rio
Paraguai/Corumbá.
Na Tabela 10 apresentam-se os valores da distância de chord Cavalli
Sforza & Edwards (1967). Encontrou-se uma variação de 0.171 (Rio
Cuiabá/Parque Nacional-Foz x Rio São Lourenço ) a 0.284 (Rio São Lourenço x
Rio Negro).
Tabela 10: Distância de chord de Cavalli Sforza & Edwards (1967) entre pares de populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887). RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE
= Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; 5 = Rio Negro; RPMI = Rio
Paraguai Mirim; RPC = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
Populações
RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
RCPN 0
RSLO 0.171 0
RCSE 0.149 0.181 0
RTCA 0.246 0.260 0.232 0
RTPA 0.219 0.263 0.238 0.238 0
RNEG 0.241 0.284 0.237 0.263 0.265 0
RPMI 0.218 0.233 0.224 0.267 0.278 0.214 0
RPCO 0.222 0.221 0.205 0.250 0.260 0.260 0.277 0
RPCA 0.181 0.187 0.175 0.226 0.236 0.249 0.219 0.212 0
Figura 5: Dendrograma de UPGMA utilizando a distância de chord de Cavalli Sforza &
Edwards (1967), representando a relação entre as populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) analisadas.
Nas Tabelas 11, 12, 13, 14 e 15 estão descritos os resultados da análise
hierárquica de variação molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992) utilizando os
índices de Fst e Rst. A maior variabilidade foi encontrada dentro das populações,
em todos os agrupamentos testados. Os valores significativos encontrados em
alguns casos entre as populações poderiam indicar uma fraca estruturação. A
Tabela 15 apresenta os resultados da análise da variação molecular agrupando
as populações segundo a separação encontrada no dendograma de UPGMA.
Tabela 11. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando
um grupo com todas as populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). (Rio
Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc, Rio Taquari/Caronal, Rio
Taquari/Palmeiras, Rio Negro, Rio Paraguai Mirim, Rio Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/ Cáceres).
Fst Rst
Fonte de
variação
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Fst
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Rst
Entre
populações
0,94 0,01899** 2,85 3,47493**
Dentro das
populações
99,06 1,99983
0,00941 Fst
97,15 118,3895
0,02851 Rst
** Significativo a 1%
Tabela 12. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as
populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em dois grupos (Grupo I =
Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc e Rio Paraguai/ Cáceres; Grupo
II = Rio Taquari/Caronal, Rio Taquari/Palmeiras, Rio Negro, Rio Paraguai Mirim e Rio
Paraguai/Corumbá;).
Fst Rst
Fonte de
variação
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Fst
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Rst
Entre
Grupos
0,09 0,00175 0,00216 Fct -0,57 -0,69697 0,00087 Fct
Dentro dos
grupos
0,9 0,01810* 0,00767 Fsc 3,18 3,85951* 0,00897 Fsc
Dentro das
populações
99,02 1,99983* 0,00981 Fst 97,4 118,3895** 0,00983 Fst
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
Tabela 13. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as
populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em quatro grupos (Grupo I
= Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço e Rio Cuiabá/Sesc; Grupo II = Rio
Taquari/Caronal e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo III = Rio Negro;Grupo IV = Rio Paraguai Mirim, Rio
Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/ Cáceres).
Fst Rst
Fonte de
variação
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Fst
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Rst
Entre
grupos
0,53 0,01067 0,00528 Fct 3,17 3,88761* 0,03166 Fct
Dentro dos
grupos
0,54 0,01087 0,00541 Fsc 0,42 0,51644 0,00434 Fsc
Dentro das
populações
98,93 1,99983** 0,01066 Fst 96,41 118,3895** 0,03587 Fst
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
Tabela 14. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as
populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em cinco grupos (Grupo I =
Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço e Rio Cuiabá/Sesc; Grupo II = Rio Taquari/Caronal
e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo III = Rio Negro; Grupo IV = Rio Paraguai Mirim e Rio
Paraguai/Corumbá; Grupo V = Rio Paraguai/ Cáceres).
Fst Rst
Fonte de
variação
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Fst
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Rst
Entre
grupos
0,22 0,00436 0,00216 Fct 2,6 3,18091 0,02597 Fct
Dentro dos
grupos
0,77 0,01546* 0,00767 Fsc 0,73 0,89981 0,00754 Fsc
Dentro das
populações
99,02 1,99983** 0,00981 Fst 96,67 118,3895** 0,03331 Fst
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
Tabela 15. Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada em Fst e Rst, considerando as
populações de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) separadas em três grupos de acordo
com a separação sugerida pelo dendograma de UPGMA (Grupo I = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz,
Rio São Lourenço, Rio Cuiabá/Sesc, Rio Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/Cáceres; Grupo II = Rio
Taquari/Caronal e Rio Taquari/Palmeiras; Grupo III = Rio Negro e Rio Paraguai Mirim).
Fst Rst
Fonte de
variação
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Fst
Porcentagem
do total
Componente
da variância
Rst
Entre grupos
0,76 0,01544 0,00762 Fct -0,18 -0,2189 -0,00180 Fct
Dentro dos
grupos
0,52 0,01043* 0,00519 Fsc 2,95 3,59619* 0,02948 Fsc
Dentro das
populações
98,72 199.983** 0,01277 Fst 97,23 118,39** 0,02774 Fst
* Significativo a 5%. ** Significativo a 1%
A análise Bayesiana gerada pelo programa Structure. 2.2 (Pritchard,
2000) foi realizada para avaliar os níveis de relação entre as populações, a
ocorrência de fluxo gênico e a distinção do número de populações (K).
Na análise admixture testou-se a existência de 1 a 12 populações que
gerou os valores de Ln(PD), utilizados para montar o gráfico que determina o
valor de K. O número de populações (K) é determinado através do menor valor
de Ln(PD). Na ocorrência de um platô no gráfico, a escolha do valor de K é feita
com base no Ln(PD) que apresentar o menor desvio padrão. O gráfico feito com
os resultados das populações de pacu mostrou K=1 como sendo o valor mais
provável de populações existentes (Figura 6). Evanno et al. (2005) verificaram
que em muitos casos os valores de Ln(PD) não oferecem uma estimativa
acurada dos valores de K. Sendo assim, os autores delinearam uma metodologia
para a determinação do K mais provável que utiliza o delta K (∆K) dos valores de
Ln(PD). Utilizando este método obteve-se, também, K=1 (Figura 7) como sendo o
número de populações dos dados analisados nesse trabalho.
Figura 6. Ln(PD) em relação ao número de populações (K) testadas.
Figura 7. ∆K em relação ao número de populações (K) testadas.
A Figura 8 é a representação gráfica da estrutura populacional resultante da
análise bayesiana nas populações de pacu (Piaracuts mesopotamicus Holmberg,
1887). Não houve a divisão das populações, ilustrado pela ausência de divisão
vertical das cores, que representam os clusters (K).
Figura 8. Estrutura bar plot representando a atribuição dos genótipos para cada população. As
cores representam cada população.
Na Tabela 16 estão relacionados os resultados do teste de atribuição que
utilizou os genótipos multilocos de cada indivíduo para calcular a probabilidade
deste pertencer a cada população. Os maiores valores de atribuição foram
encontrados nas populações do Rio Negro e do Rio Paraguai/Corumbá (98%). O
menor valor foi encontrado na população do Rio Taquari/Palmeiras (96,8%).
Todos os valores foram altos, acima de 95%.
Tabela 16. Resultado do teste de atribuição para as populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) utilizadas. RCPN = Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz;
RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal;
RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO =
Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
RCPN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
RCPN
0,976 0,003 0,003 0,003 0,005 0,003 0,003 0,003 0,003
RSLO
0,003 0,979 0,003 0,003 0,002 0,002 0,003 0,003 0,003
RCSE
0,003 0,003 0,979 0,003 0,002 0,003 0,003 0,003 0,003
RTCA
0,003 0,003 0,003 0,975 0,004 0,003 0,003 0,003 0,003
RTPA
0,004 0,004 0,004 0,003 0,968 0,004 0,004 0,003 0,005
RNEG
0,003 0,002 0,003 0,003 0,002 0,980 0,003 0,002 0,002
RPMI
0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,004 0,976 0,003 0,003
RPCO
0.003 0.003 0.003 0.003 0.002 0.002 0.002 0,980 0.003
RPCA
0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0,978
A Tabela 17 apresenta os valores das proporções de atribuição correta
aos clusters inferidos, resultantes da análise bayesiana realizada pelo Structure.
Os valores encontrados para todas as populações e os clusters inferidos foram
próximos de 10%.
O número de migrantes ou fluxo gênico histórico calculado com base nos
alelos privativos (Barton & Slatkin, 1986) apresentou valor igual a 2,51269.
Tabela 17. Proporção de atribuição correta de cada população de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) aos clusters inferidos. RCPN = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio
Taquari/Caronal; RTPA = Rio Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio
Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA = Rio Paraguai/ Cáceres).
Cluster inferido
População
1 2 3 4 5 6 7 8 9
RCPN
0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,101 0,113 0,114
RSLO
0,109 0,111 0,113 0,114 0,11 0,108 0,113 0,111 0,110
RCSE
0,112 0,113 0,108 0,108 0,110 0,111 0,114 0,113 0,114
RTCA
0,115 0,109 0,111 0,110 0,115 0,113 0,109 0,110 0,108
RTPA
0,114 0,111 0,108 0,109 0,115 0,113 0,109 0,111 0,111
RNEG
0,114 0,113 0,109 0,111 0,112 0,114 0,111 0,108 0,109
RPMI
0,111 0,11 0,112 0,111 0,113 0,109 0,111 0,112 0,110
RPCO
0,110 0,116 0,112 0,112 0,107 0,111 0,112 0,110 0,111
RPCA
0,110 0,112 0,115 0,114 0,108 0,11 0,111 0,108 0,111
Discussão
5) DISCUSSÃO
Um dos principais objetivos da genética de populações é identificar e
quantificar a variação observada dentro e entre as populações para o estudo de
fluxo gênico, deriva genética, sistemas de acasalamento, mutação e seleção
natural. Tradicionalmente, inferências sobre as forças microevolutivas estão
baseadas no número de alelos ou haplótipos (no caso de DNA mitocondrial), nas
freqüências dos alelos e sua distribuição geográfica (Moysés, 2005).
Dos oito locos microssatélites utilizados para verificar a variabilidade
genética de populações de pacu, o loco Pme28 apresentou o maior número de
alelos (14). Calcagnotto et al. (2001) em seu estudo de isolamento e
caracterização de locos microssatélites em Piaractus mesopotamicus
provenientes da bacia do Pantanal, também encontraram o maior número de
alelos para este loco (10 alelos).
Nos casos de reposição do estoques para ambientes naturais
(repovoamento), a importância do conhecimento da variabilidade genética assim
como sua manutenção tem grande valor, pois pode evitar um impacto genético
nas populações locais (estoque receptor) e também permite que as espécies se
adaptem a mudanças que possam surgir no meio em que vivem (Toledo-Filho et
al., 1992).
O tamanho dos alelos encontrados neste estudo variou de 184 pb, para o
loco Pme5, à 270 pb, para o loco Pme 21. No estudo de Calcagnotto et al. (2001)
a variação foi de 182 a 268 pb, para os mesmos loco, respectivamente.
Os valores de heterozigosidade observada e esperada variaram de
0,0000, para o locos Pm21 e Pme32, a 0,9000, para o loco Pme2 e Pme5; e
0,0333, para o loco Pme32, a 0,8725, para o loco Pme28, respectivamente.
Calcagnotto et al. (2001) encontraram diferentes níveis de heterozigosidade após
análise dos oito locos microssatélites em populações de pacu do Pantanal
Matogrossense. Altos níveis de heterozigosidade observada foram encontrados
nos locos Pme2 (0,852), Pme14 (0,667) e Pme28 (0,643) e baixos níveis, no loco
Pme4 (0.656) e Pme32 (0.200). Com relação à heterozigosidade esperada, os
autores encontraram 0,856 para o loco Pme2 a 0,303 para o loco Pme21. Os
locos que apresentaram maior e menor valores de heterozigosidade esperada no
presente estudo apresentaram valores semelhantes, no trabalho de Calcagnotto et
al. (2001), porém não foram os extremos. O maior valor médio de
heterozigosidade observada neste trabalho foi de 0,7987. Porta et al. (2006), em
seu estudo com Solea senegalensis verificaram em animais provenientes da
natureza, valor de heterozigosidade observada elevado, igual a 0,802.
O equilíbrio de Hardy Weinberg se fez presente na maioria das populações
de pacu estudadas. Moysés (2005) em seu estudo de caracterização da estrutura
populacional de Eigenmannia também verificou uma situação de equilíbrio de
Hardy Weinberg para a maioria das populações com relação aos locos de
microssatélites estudados. Nos casos dos desvios encontrados, a autora atribuiu
a deficiência de heterozigotos à presença de alelos nulos. Benites (2008)
encontrou desvios com relação a este parâmetro em todas as 11 populações de
Pseudoplatystoma corruscans analisadas com marcadores tipo microssatélites. O
autor verificou a existência de alelos nulos para a maioria dos casos de desvio do
equilíbrio. Morelli (2008) verificou desvios em várias populações de Prochilodus
lineatus em locos específicos relacionados aos déficits de heterozigotos, também
ocasionados pela presença de alelos nulos. No presente trabalho, todas as
populações de pacu que demonstraram desvios significativos no equilíbrio de
Hardy Weinberg apresentaram excessos ou déficits de heterozigotos, sendo neste
último caso associados à presença de alelos nulos.
O alelo nulo pode ser definido como qualquer alelo em um loco de
microssatélite que não é amplificado no PCR ou pode ser fracamente amplificado
mas não é visível após a detecção. Entre as possíveis causas estão a ocorrência
de mutação de ponto dentro do sítio de hibridação do primer, grandes eventos de
inserção/deleção entre os microssatélite e o sítio de hibridação do primer, baixa
qualidade do DNA, ou ocorrência de mutações na repetição, levando a grandes
mudanças no tamanho do produto. Os alelos nulos podem ser detectados
indiretamente através do déficit de heterozigotos na população (O’Connell &
Wright, 1997).
A análise interpopulacional revelou que praticamente não houve
diferenciação genética entre as nove populações de pacu estudadas,
apresentando uma estruturação muito tênue e revelando certa homogeneidade
genética.
Os valores de Fst e Rst encontrados no presente estudo foram baixos (os
maiores valores indicaram Fst = 0,02618 e Rst = 0,10100), sugerindo pequena ou
nenhuma estruturação genética das populações analisadas. Significâncias ao
nível de 1% e 5% foram encontradas para algumas das comparações entre os
pares de populações. Considerando os baixos valores destes parâmetros não é
possível, mesmo havendo significância, afirmar ao certo se há diferença entre
elas. Wright (1978) determinou uma forma de verificar a magnitude da
variabilidade genética entre os grupos. O autor afirmou que valores de Fst entre 0
a 0,05 indicam baixa estruturação das populações; valores entre 0,05 a 0,15
evidenciam uma moderada estruturação e valores entre 0,15 a 0,25 caracterizam
alta estruturação. Os valores de Fst superiores a 0,25 indicam forte estruturação
genética das populações. No presente estudo todos os valores de Fst estiveram
dentro do intervalo de 0,00 a 0,05, demonstrando baixa estruturação das
populações. Este fato pode ser confirmado pelo teste exato de Fisher para a
diferenciação populacional, o qual não apresentou diferenças significativas para a
grande maioria das comparações entre pares de populações analisados, também
pelos valores da distância de Cavalli Sforza & Edwards (1967) que apresentou
baixos valores e também caracterizou baixa semelhança.
López (2006), verificando a variabilidade genética e estrutura populacional
de Brycon sinuensis do Rio Sinú, encontrou Fst de 0,0427, que indica baixa
estruturação, segundo Wright (1978). Pampoulie et al. (2006), verificando a
estrutura genética do bacalhau do Atlântico (Gadus morhua), encontraram
elevado valor de Fst (0,261), mostrando a alta estruturação das 22 populações
estudadas.
O índice Rst é uma das medidas usadas para análise genética com o uso
dos marcadores moleculares do tipo microssatélites (Slatkin, 1995). Ele utiliza a
variância dos números das repetições e é análogo ao F
ST
, que se baseia na
variância das freqüências alélicas. O Rst foi desenvolvido levando-se em
consideração o fato de que os dados gerados pelos locos microssatélites possuem
tanto informação de freqüência de alelos, como do tamanho dos mesmos, gerados
pelo número de unidades repetitivas que cada alelo apresenta. Quando os valores
são significativos, indicam evidência de diferenciação genética entre as
populações e indícios de estruturação entre as mesmas. Ainda assim, não são
suficientes para afirmar a existência de estruturação, mesmo quando houve
significância em algumas das comparações realizadas.
O dendograma construído a partir distância de chord de Cavalli Sforza &
Edwards (1967) e utilizando a metodologia de UPGMA (Unweighted pair group
method with arithmetic mean) (Sneath & Sokal, 1973) separou as populações em
três grupos: I - Rio Paraguai Mirim e Rio Negro; II - Rio Taquari/Caronal e Rio
Taquari/Palmeiras e III - Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz, Rio São Lourenço, Rio
Cuiabá/Sesc, Rio Paraguai/Cáceres e Rio Paraguai/Corumbá. As separações dos
grupos ll e lll concordam com a distribuição geográfica dos rios na bacia do
Pantanal, onde foram coletados os indivíduos utilizados no presente estudo,
agrupando estas populações com base nas proximidades dos rios e associações
de bacias secundárias do complexo do Rio Paraguai no Pantanal Matogrossense.
O grupo lll pode ser considerado controverso, pois o Rio Negro está isolado do
Rio Paraguai. Este resultado pode ter sido uma conseqüência do baixo número
amostral destas duas localidades.
Figura 9: Mapa do Pantanal Mato–
Grossense com o padrão de agrupamento das populações segundo o
dendograma. 1: Rio Cuiabá/Parque Nacional – Foz; 2: Rio São Lourenço; 3: Rio Cuiabá/SESC Pantanal; 4:
Rio
Taquari/Caronal; 5: Rio Taquari/Palmeiras; 6: Rio Negro; 7: Rio Paraguai Mirim; 8
: Rio
Paraguai/Corumbá; 9: Rio Paraguai/Cáceres.
A população do Rio Taquari/Palmeiras apresentou significâncias para os
valores de Fst e de diferenciação populacional (alélica e genotípica) em
praticamente todas as comparações, indicando sua maior diferenciação em
relação às demais populações. Tal fato está em concordância com o maior valor
de riqueza alélica encontrada e com a presença de cinco alelos exclusivos nesta
população, podendo ser considerada como a que apresenta maior diferenciação
genética na amostragem analisada. Este fato poder ser resultante da história
geológica deste rio. Este resultado justificaria a manutenção desta população
isolada no caso de conservação genética in situ para que não haja a perda da
maior variabilidade genética encontrada. Mais estudos são necessários para poder
afirmar a causa desta maior variabilidade genética das amostras de pacu desta
região.
A análise molecular da variância (AMOVA) calculada com os índices de Fst
e Rst evidenciou que a maior diversidade genética encontra-se significativamente
dentro das populações, para ambos os parâmetros. Este cenário se fez presente
independentemente do agrupamento das populações consideradas. Colocando
todas as populações em um único grupo, houve diferenciação significativa entre
as populações, o que indicaria estruturação. Porém os valores de Fst e Rst baixos
afirmam que se houver diversidade entre as populações, esta deve corresponder a
um processo pouco significativo.
Cenário semelhante foi encontrado por Santos et al. (2007) estudando
populações de tambaqui (Colossoma macropomum) do Rio Amazonas. Os
resultados da análise de variância indicaram maior diferenciação dentro das
populações, reforçando a hipótese da ocorrência de uma situação de panmixia.
Farias et al. (2005) verificaram que populações de Prochilodus nigricans e
Colossoma macropomum da várzea Amazônica, não formam populações
geneticamente estruturadas, apresentando-se como uma única população
panmitica, segundo a análise do DNA mitocondrial do gene da ATPase.
Quando se realizou a análise de variância molecular agrupando as
populações segundo a separação sugerida pelo dendograma de UPGMA, houve,
novamente, significância dentro dos grupos. Mais uma vez ficou evidente o
indicativo de ausente ou fraca estruturação, já que o valor de Fst foi próximo de
zero e que e a porcentagem de variação dentro foi de praticamente 99% apenas.
Os resultados encontrados na análise de variância molecular corroboraram
aqueles encontrados na análise bayesiana gerada pelo programa Structure. 2.2
(Pritchard, 2000) que, como mostrou os gráficos de bar plot e de K, indicou a
existência de apenas uma população (K = 1). Não houve evidência de
estruturação genética sugerindo-se que há apenas uma população panmítica.
Balloux & Lugon-Moulin (2002) afirmaram que, em alguns casos, os baixos
valores de FST podem indicar diferenciação genética. Considerando esta
afirmação e verificando que, além da população do Rio Taquari, as populações
dos Rios São Lourenço, Paraguai Mirim, Paraguai/Corumbá e Paraguai/Cáceres
apresentaram alelos exclusivos, pode-se considerar a presença de uma pequena
diferenciação genética entre estas populações justificando, também, a
manutenção destas isoladas para a conservação genética in situ.
Se for considerado a ausência de estruturação populacional e a existência
de apenas uma população panmítica, acende-se uma dúvida com relação ao
termo que seria melhor aplicado para se referir ao conjunto de indivíduos
coletados nas localidades estudadas e utilizados nesta caracterização genética. O
conceito de populações locais, subpopulações, estoques ou demes pode diferir
em relação ao grau de homogeneidade genética (Dizon et al., 1992 apud Hilsdorf
et al., 2006). No caso de recursos pesqueiros, o conceito de populações se
complica ainda mais por fatores políticos, econômicos e sociais (Hilsdorf et al.,
2006).
O termo que poderia se tornar adequado neste trabalho seria “amostra”.
Dessa maneira, pode-se dizer que no presente trabalho estudou-se a
variabilidade e estrutura genética de nove amostras coletadas de várias
localidades e compostas de N indivíduos.
O valor que indica a existência de fluxo gênico histórico encontrado, que é
equivalente ao número de migrantes por geração, pode ser considerado alto
(Nm = 2,51269) segundo a definição de Spieth (1974), no qual valores superiores
a 1 são indicativos de que o fluxo gênico constitui um fator atuante estando em
direção contrária à diferenciação genética entre as populações. Neste sentido,
Feldeheim et al. (2001) encontraram Nm igual 8,9 usando a mesma metodologia
de alelos privativos no estudo de populações de tubarão limão (Negraprion
brevirostris) valor este indicativo de intenso fluxo gênico entre as populações.
Santos et al. (2007) também encontraram fluxo gênico intenso entre as
populações de tambaqui (Colossoma macropomum) do Rio Amazonas. Os
autores afirmam que os altos níveis de fluxo gênico combinados com baixos
valores de Fst encontrados no seu estudo dão indicações de intensa troca
genética entre todas as populações.
A estrutura populacional é grandemente influenciada pelo fluxo gênico, que
determina até que ponto uma população local pode ser considerada uma unidade
evolutiva independente (Slatkin, 1993). Em populações com fluxo gênico intenso,
verifica-se uma evolução conjunta, pois a migração atua como fator de
homogeneização das freqüências alélicas. Na situação inversa, encontra-se uma
subdivisão populacional que freqüentemente leva à diferenciação genética entre
as subpopulações, por meio da aquisição de freqüências alélicas distintas
(Moysés, 2005).
Espécies com altas taxas de dispersão ou que ocupam habitats livres de
barreiras geográficas tendem a exibir baixos níveis de estruturação populacional,
enquanto aquelas que possuem pequena capacidade de dispersão ou estão
submetidas à separação imposta por barreiras físicas e comportamentais
acentuadas apresentam um alto grau de divergência intrapopulacional (Graves,
1998).
No presente trabalho pode-se verificar pequena diferenciação genética das
nove populações de pacu estudadas do Pantanal Matogrossense. Este resultado
corrobora os dados apresentados por Calcagnotto (1998) que não encontrou
variabilidade nos fragmentos de restrição do mtDNA, estudando animais da
mesma espécie. Algumas amostras das populações utilizadas no trabalho citado
também tiveram como origem o Pantanal Matogrossense. A autora afirma que
dois fatores parecem ter sido relevantes para explicar a ausência total da
variabilidade genética encontrada nos experimentos com o mtDNA: o fato de o
pacu ser uma espécie de grande amplitude migratória e as características
relacionadas à origem e história geológica do Pantanal Matogrossense.
No início do terciário havia um grande golfo denominado Pacífico neo-
orogênico na região onde atualmente se localiza o Pantanal. Com o soerguimento
da cordilheira dos Andes, durante o Mioceno, formou-se um grande lago de
características salobras que durou cerca de 20 m.a., até que no Pleistoceno
ocorresse a ruptura entre os planaltos Brasileiro e Guiano e os rios começassem
a escoar em direção ao oceano Atlântico. Nesse grande lago provavelmente deve
ter surgido o pacu, há cerca de 15 m.a. (Lundberg et al. 1986 apud Calcagnotto,
1998).
Considera-se ainda que a homogeneidade genética das populações
selvagens atuais de pacu também pode ter sua origem e manutenção em
decorrência das cheias anuais que acometem o Pantanal Matogrossense.
Quando os rios extravasam seus leitos e as áreas inundadas formam uma rede
de lagoas, baías e baixadas interligadas por cursos d’água (Por et al., 1997), pode
haver intensa mistura de animais provenientes de diferentes rios, pois é nesta
planície alagada que ocorre a alimentação destes peixes. E são nas cheias
anuais que ocorre a mistura populacional em função da invasão de extensas
áreas alagadas por esta espécie e de outras no Pantanal.
Em outro exemplo interessante, em que foram utilizados marcadores
moleculares do tipo RAPD para analisar a variabilidade genética em populações
de mesma espécie provenientes da bacia do Paraná-Uruguai (Zamparette, 1996),
obteve-se resultados que evidenciaram uma estreita base genética dos peixes
estudados, não identificando diferenciação das populações. Assim como
Calcagnotto (1998), este autor justifica a homogeneidade genética encontrada
nesta espécie à grande capacidade migratória. A capacidade migratória e as
características climáticas (ocorrência de cheias anuais) também podem ser as
causas da não ocorrência de diferenciação genética de populações selvagens de
Colossoma macropomum da Amazônia, como verificado por Santos et aI. (2006)
e Calcagnotto (1998).
Benites (2008), contudo, encontrou estruturação nas 11 populações de
pintado (Pseudoplatystoma corruscans) provenientes da bacia Paraná - Paraguai,
estudadas pelo autor. Esta espécie, assim como o pacu e o tambaqui, é
migradora e divide habitats semelhantes; e mesmo assim apresentou
estruturação populacional. Possíveis causas para a ocorrência dessa estruturação
poderiam estar associadas ao hábito alimentar diferenciado e comportamento de
“homing” desta espécie. Por ser um peixe geralmente de grande porte e de fundo
não realiza longas migrações.
Este estudo constatou que as populações de pacu provenientes do
Pantanal Matogrossense apresentaram pequena estruturação genética,
considerando o FST, por exemplo, ou que compõem apenas um grande banco
genético, segundo análise bayesiana gerada pelo programa Structure. Resultados
mais conclusivos seriam possíveis com o aumento do número amostral de
algumas localidades Apesar desta ambigüidade pode-se verificar que os animais
estudados apresentaram diversidade genética muito pequena.
Conclusões
6) CONCLUSÕES
Nove amostras de pacu (Piaracuts mesopotamicus Holmberg, 1887)
provenientes de diversas localidades da rede hidrográfica do Pantanal
Matogrossense foram estudadas com o objetivo principal de caracterizar a
diversidade genética, utilizando marcadores moleculares tipo microssatélite. Os
dados obtidos permitiram formular as seguintes conclusões:
Os marcadores genéticos moleculares do tipo microssatélite
mostraram-se eficientes no estudo da variabilidade genética das
amostras de pacu da Bacia do Alto Paraguai, resultando em dados
acurados sobre a estruturação genética destas populações.
Os resultados indicaram a existência de grande identidade genética
entre as amostras de pacu estudadas não sendo significativos os
valores de diferenciação genética encontrados nas comparações entre
estas.
A amostra do Rio Taquari/Palmeiras apresentou maior variabilidade
genética, conseqüência dos resultados de riqueza alélica, Fst e
diferenciação genética.
Encontrou-se intenso fluxo gênico histórico intraespecífico, fato este
que associados aos resultados de Fst, AMOVA e da análise bayesiana
justifica a uniformidade genética encontrada para as populações de
pacu do Pantanal Matogrossense.
Para a formação de bancos genéticos desta espécie, sugere-se a
formação de um único estoques compostos de animais das diversas
localidades devido a baixa estruturação encontrada para as populações.
A amostra do Rio Taquari/Palmeiras poderia ser mantida separada dos
demais animais para preservar os alelos exclusivos e também para
manter a maior variabilidade genética que apresentou.
As amostras do Rio São Lourenço, Rio Paraguai Mirim, Rio
Paraguai/Corumbá e Rio Paraguai/Cáceres que apresentaram alelos
exclusivos também poderiam ser mantidas isoladas para a conservação
genética in situ. Este resultadopoderia ser mais acurado com o aumento
do número amostral das localidades estudadas.
Referências Bibliográficas
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Anexos
Anexo1. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/Parque
Nacional - Foz.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RCPN1 207 209 192 206 190 200 203 214 216 266 209 217 250
RCPN2 197 209 202 194 198 203 210 216 266 223 231 250
RCPN3 193 205 202 208 186 198 214 260 217 223 250
RCPN4 192 206 190 203 212 214 266 209 223 250
RCPN5 207 209 206 212 186 192 203 206 214 216 266 223 229 250
RCPN6 208 186 192 203 206 214 266 211 250
RCPN7 205 206 208 198 201 203 212 214 216 260 266 225 231 250
RCPN8 205 207 206 190 194 200 203 214 216 266 225 222 250
RCPN9 205 207 206 212 190 202 203 214 260 266 209 223 250
RCPN10 205 209 202 208 190 194 206 214 216 266 217 23 250
RCPN11 199 203 208 212 186 192 203 206 214 266 268 209 23 250
RCPN12 203 211 204 192 202 203 214 266 209 233 244
RCPN13 202 206 190 192 214 216 266 215 231 250
RCPN14 207 209 206 190 194 203 214 216 266 211 223 250
RCPN15 206 192 198 203 216 266 223 227 250
RCPN16 205 207 202 212 190 203 215 214 266 209 223 250
RCPN17 202 206 192 194 214 266 209 223 250
RCPN18 197 207 202 214 190 203 206 214 266 215 223 250
RCPN19 207 209 186 192 216 266 223 229 250
RCPN20 197 205 192 206 192 198 203 206 266 215 223 250
RCPN21 205 202 206 190 198 203 214 216 266 209 223 250
RCPN22 205 202 212 190 192 206 214 216 266 209 223 250
RCPN23 207 206 192 206 214 216 260 266 209 225 250
RCPN24 207 211 202 204 190 192 203 206 214 266 209 250
RCPN25 197 205 190 192 203 206 214 216 260 266 209 231 250
RCPN26 203 205 206 212 194 198 203 214 216 266 223 250
RCPN27 212 216 192 198 197 206 210 214 266 209 223 244 250
RCPN28 205 211 208 190 203 206 214 216 260 266 223 250
RCPN29 203 202 206 186 192 203 206 214 260 266 219 223 250
RCPN30 197 213 206 210 192 196 203 214 216 260 266 209 223 250
RCPN31 205 207 198 202 196 198 203 214 216 260 266 209 2RCPN 250
RCPN32 190 202 203 214 216 266 209 223 244 250
RCPN33 206 212 192 198 203 206 214 266 223 233 250
RCPN34 193 209 202 206 192 196 203 206 216 266 215 223 250
Anexo 2. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio São Lourenço.
Indivíduo Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RSLO1 207 209 206 194 198 203 206 214 266 223 231 250
RSLO2 203 209 206 190 203 206 214 216 260 266 215 223 244 250
RSLO3 207 209 202 192 194 206 212 214 260 266 217 223 250
RSLO4 201 202 192 196 203 214 266 211 217 250
RSLO5 203 209 206 196 198 203 214 216 260 266 209 231 250
RSLO6 205 206 208 190 202 203 216 266 209 235 250
RSLO7 209 211 202 194 196 203 206 214 266 209 229 250
RSLO8 197 203 206 212 186 194 203 206 214 216 268 223 231 250
RSLO9 205 209 206 216 190 198 203 203 214 266 215 227 250
RSLO10 205 209 202 208 192 194 200 203 214 266 223 250
RSLO11 191 207 206 192 198 200 203 214 266 209 233 250
RSLO12 197 207 192 202 186 198 203 206 214 266 209 223 250
RSLO13 207 206 194 198 206 206 214 266 209 231 250
RSLO14 205 211 206 208 198 203 206 214 260 266 223 250
RSLO15 205 206 198 200 203 214 266 215 223 250
RSLO16 197 202 212 186 192 203 206 214 266 223 250
RSLO17 202 206 203 206 214 250
RSLO18 206 192 203 206 216 266 209 223 250
RSLO19 201 205 206 190 200 203 216 216 266 223 250
RSLO20 203 205 206 203 214 266 268 223 229 250
RSLO21 197 204 206 190 194 194 203 214 266 209 215 250
RSLO22 202 206 190 190 203 206 214 216 266 209 250
RSLO23 199 207 206 186 190 214 266 209 223 250
RSLO24 203 211 204 206 194 194 203 214 260 266 209 223 250
RSLO25 207 202 212 186 192 203 214 266 223 231 250
RSLO26 202 206 192 198 203 206 214 266 209 215 250
RSLO27 205 204 192 198 203 206 208 214 266 215 223 250
RSLO28 197 205 206 208 192 198 203 214 216 266 209 223 250
RSLO29 205 209 206 186 194 203 206 216 266 231 233 250
RSLO30 203 211 202 206 196 198 206 214 266 215 250
Anexo 3. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio.Taquairi/Caronal.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RTCA1 205 211 206 208 190 203 214 218 266 270 211 250
RTCA2 197 211 205 192 194 200 203 214 216 260 266 209 227 250
RTCA3 202 186 192 203 206 216 216 260 266 211 229 250
RTCA4 205 207 192 208 194 198 206 214 266 211 250
RTCA5 191 205 202 206 186 194 203 206 216 266 209 223 250
RTCA6 203 205 212 214 195 198 197 203 266 211 225 250
RTCA7 205 192 202 190 198 203 208 216 266 209 250
RTCA8 209 213 192 208 192 198 203 214 216 266 211 225 250
RTCA9 197 205 202 206 203 206 216 211 250
RTCA10 203 205 192 206 186 190 203 206 214 266 223 250
RTCA11 205 207 202 206 186 192 203 214 266 209 223 250 253
Anexo 4. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/SESC.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RCSE1 205 206 214 190 196 200 203 214 216 266 209 250
RCSE2 205 213 202 208 186 190 197 203 214 260 266 217 223 250
RCSE3 197 205 202 206 192 102 200 203 214 266 219 214 250
RCSE4 193 209 206 210 186 198 203 214 260 266 215 239 250
RCSE5 193 209 202 212 190 198 203 214 266 209 223 250
RCSE6 205 209 202 212 190 194 203 214 216 266 209 231 244 250
RCSE7 205 209 206 186 203 214 260 266 215 223 250
RCSE8 205 202 206 192 194 203 206 214 266 223 250
RCSE9 203 205 208 212 186 194 203 214 260 266 223 250
RCSE10 197 207 208 212 192 203 206 214 216 266 219 229 250
RCSE11 203 205 206 186 198 203 206 214 216 266 223 229 250
RCSE12 207 211 202 198 203 214 266 209 250
RCSE13 205 209 212 190 198 203 206 214 260 266 209 223 250
RCSE14 197 206 202 190 198 203 214 216 260 266 217 223 250 253
RCSE15 205 206 192 194 203 216 266 227 233 250
RCSE16 205 209 206 214 194 202 200 203 266 223 235
RCSE17 193 209 206 194 198 203 214 266 268 209 217 250
RCSE18 205 205 202 206 190 194 203 214 216 266 223 250
RCSE19 209 209 206 208 192 194 203 206 210 214 266 268 217 223 250
RCSE20 206 212 188 198 203 206 210 216 266 209 250
RCSE21 193 213 206 214 186 198 203 206 210 214 260 266 250
RCSE22 193 197 198 212 192 198 203 214 216 260 266 223 250
RCSE23 207 211 202 206 186 194 203 208 216 266 223 250
RCSE24 201 209 206 212 190 203 214 266 223 233 250
RCSE25 205 205 192 194 203 214 260 266 209 223 250
RCSE26 205 192 206 198 203 206 214 266 209 227 244 250
RCSE27 203 207 202 206 186 192 203 210 214 266 268 211 223 244 250
RCSE28 205 209 202 206 190 198 203 206 214 216 266 209 223 244 250
RCSE29 203 209 206 212 190 194 203 214 266 223 250
RCSE30 205 211 202 212 186 912 203 206 214 216 266 223 250
RCSE31 205 209 206 208 194 196 203 206 214 266 215 223 250
RCSE32 205 209 202 190 203 206 214 266 215 250
RCSE33 205 209 206 192 198 203 206 211 223 205
RCSE34 206 192 194 203 206 216 209 223 250
RCSE35 205 207 206 212 192 203 212 216 266 211 225 250
RCSE36 205 209 202 206 194 198 203 214 209 250
RCSE37 205 209 202 206 186 190 203 214 216 260 211 223 250
RCSE38 205 209 206 208 192 198 203 206 214 216 209 223 250
RCSE39 205 209 206 186 194 203 214 209 223 250
RCSE40 193 205 206 190 196 203 216 218 209 250
Anexo 5. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio.Taquari/Palmeiras.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RTPA1 203 209 206 190 197 203 210 214 266 250
RTPA 2 203 209 206 192 194 203 214 216 209 223 250
RTPA 3 203 207 206 212 192 194 203 211 223 250
RTPA 4 205 213 206 208 190 203 216 266 223 250
RTPA 5 203 207 206 186 198 203 218 214 266 225 239 241 247
RTPA 6 206 203 260 266 209 250
RTPA 7 197 202 214 190 203 206 214 266 215 231 250
RTPA 8 205 205 206 194 198 203 216 266 209 229 250
RTPA 9 205 205 192 206 192 200 203 214 266 209 223 250
RTPA 10 207 213 202 212 192 198 203 206 266 209 250
RTPA 11 205 211 202 206 194 198 203 214 266 211 223 247
RTPA 12 204 206 190 198 203 206 214 266 223 250
RTPA 13 206 190 200 200 203 210 214 266 209 229 250
RTPA 14 205 207 206 203 214 223 229 250
RTPA 15 205 207 202 214 194 198 203 206 214 266 225 250
RTPA 16 207 206 192 198 203 214 266 209 221 250
RTPA 17 205 205 192 206 192 198 200 203 214 266 219 225 250
RTPA 18 202 212 184 192 203 206 214 216 266 225 233 250
RTPA 19 205 211 202 206 194 203 214 216 260 266 211 225 250
RTPA 20 204 206 186 192 203 206 224 216 260 266 223 233 250
RTPA 21 207 211 206 190 194 200 203 214 216 266 211 225 250
RTPA 22 206 206 214 216 217 233 250
RTPA 23 192 206 192 194 197 206 214 211 231 250
RTPA 24 205 211 206 212 192 198 197 206 214 211 239 250
RTPA 25 205 206 192 198 198 203 214 216 266 211 225 250
RTPA 26 205 207 206 212 186 190 200 203 214 266 225 231 250
RTPA 27 202 212 190 194 206 214 216 266 217 225 247
RTPA 28 204 206 192 198 203 214 266 211 225 247
RTPA 29 206 190 192 203 206 214 225 211 225 250
RTPA 30 203 207 202 208 186 200 203 216 218 260 217 225 247
RTPA 31 206 212 194 198 203 206 214 216 211 217 247
RTPA 32 192 206 190 202 203 214 216 211 247
Anexo 6. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio.Negro.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RNEG1 205 207 206 212 190 203 210 214 266 209 223 250
RNEG 2 205 211 206 208 192 198 203 210 216 266 211 223 250
RNEG 3 197 209 206 190 198 203 214 266 211 223 250
RNEG 4 205 206 192 198 203 214 216 260 266 209 223 250
RNEG 5 209 211 206 186 190 197 203 214 216 266 209 223 250
RNEG 6 205 205 206 212 203 206 209 250
RNEG 7 197 209 192 202 192 203 206 214 266 211 250
RNEG 8 197 205 212 194 198 206 212 211 223 250
RNEG 9 205 213 206 208 192 194 197 203 260 266 211 223 250
RNEG 10 211 206 212 190 192 203 266 209 250
RNEG 11 211 206 208 190 192 197 203 214 266 209 219 250
RNEG 12 205 206 190 192 203 266 209 223 250
RNEG 13 197 209 206 216 188 192 206 266 211 223 250
Anexo 7. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai Mirim.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RPMI1 207 206 212 185 188 203 206 214 216 268 209 223 250
RPMI2 197 205 200 206 186 198 197 203 214 268 209 223 250
RPMI3 211 206 208 190 194 203 209 217 250
RPMI4 209 211 208 194 198 203 206 214 209 223 250
RPMI5 207 206 212 190 203 206 210 216 209 223 250
RPMI6 197 203 206 212 190 194 203 206 214 216 266 211 223 250
RPMI7 209 211 202 206 188 194 203 206 214 209 223 250
RPMI8 197 205 206 214 190 203 212 214 266 211 225 250
RPMI9 197 209 206 192 198 203 206 214 209 227 250
RPMI10 197 209 202 206 190 194 197 203 214 266 270 215 223 250
RPMI11 197 207 206 192 198 203 214 209 223 250
RPMI12 205 204 190 192 203 216 260 266 211 217 250
RPMI13 206 208 192 192 206 214 214 266 215 223 250
RPMI14 192 192 203 214 260 266 209 223 250
RPMI15 205 207 206 212 190 203 206 216 266 209 223 250
RPMI16 205 207 192 206 186 190 203 206 208 214 260 266 223 250
Anexo 8. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio.Paraguai/Corumbá.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RPCO1 206 208 186 202 203 206 214 216 266 209 223 250 253
RPCO2 193 205 202 206 190 192 203 206 214 209 223 250
RPCO3 202 206 198 200 203 210 216 266 209 223 250
RPCO4 199 205 192 202 190 206 209 208 214 266 209 215 250
RPCO5 192 206 192 198 203 206 214 266 209 223 250
RPCO6 197 205 202 206 186 194 203 206 214 266 211 223 250
RPCO7 205 209 202 212 194 198 203 214 216 209 223 250
RPCO8 206 184 190 203 206 214 216 266 215 223 250
RPCO9 205 209 206 192 198 203 206 214 218 211 231 250
RPCO10 192 206 192 194 203 208 214 266 209 223 250
RPCO11 202 206 192 198 200 203 214 266 209 223
RPCO12 197 207 206 186 194 206 209 214 216 266 209 250
RPCO13 207 209 206 198 202 203 214 266 211 223 244 250
RPCO14 197 203 206 186 192 197 203 214 266 209 223 250
RPCO15 202 206 192 194 203 206 208 216 266 209 223 250
RPCO16 205 202 206 192 198 203 206 216 266 209 250
RPCO17 193 206 192 198 203 206 214 266 209 223 250
RPCO18 199 207 206 192 203 206 214 209 231 250
RPCO19 205 202 190 198 203 206 214 260 209 223 250
Anexo 9. Tamanho dos alelos (pb) encontrados nos indivíduos de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio.Paraguai/Cáceres.
Pme2 Pme4 Pme5 Pme14 Pme20 Pme21 Pme28 Pme32
Indivíduo Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2
RPCA1 203 205 202 192 206 214 209 250
RPCA2 201 205 204 206 198 200 203 210 214 266 268 209 223 250
RPCA3 197 205 212 214 192 194 203 206 210 216 266 209 223 250
RPCA4 205 207 202 206 190 198 206 214 260 268 211 250
RPCA5 197 202 192 198 203 214 216 266 209 250
RPCA6 205 202 206 184 190 203 214 209 225 250
RPCA7 203 206 212 198 203 214 216 266 209 223 250
RPCA8 197 192 196 203 214 216 266 211 223 244
RPCA9 197 211 206 192 200 203 214 266 209 250
RPCA10 205 211 206 208 190 194 206 206 214 264 266 209 250
RPCA11 197 209 206 190 198 203 214 216 260 266 209 219 250
RPCA12 203 205 206 194 198 200 206 214 216 260 266 211 239 250
RPCA13 202 203 206 214 215 250
RPCA14 205 202 206 184 190 203 214 266 209 223 250
RPCA15 205 209 202 206 186 192 203 214 266 209 223 250
RPCA16 205 209 206 192 198 203 214 266 209 223 250
RPCA17 197 205 206 212 190 194 203 206 214 216 266 209 223 250
RPCA18 205 205 202 206 191 198 206 214 260 268
RPCA19 193 205 206 192 198 203 214 216 266 268 209 223 250
RPCA20 197 205 202 206 203 206 214 216 260 266 209 250
RPCA21 197 205 192 190 198 203 206 214 266 209 250
RPCA22 203 205 206 198 197 203 214 216 260 266 209 223 250
RPCA23 197 209 202 214 190 198 203 214 266 209 219 250
RPCA24 197 205 206 190 196 203 206 214 216 266 225 233 250
RPCA25 203 206 190 196 203 206 214 211 250
RPCA26 205 211 202 190 206 208 216 266 211 215 250
RPCA27 197 211 202 192 198 203 206 214 216 266 223 229 250
RPCA28 203 207 208 214 190 194 203 206 214 266 211 225 250
RPCA29 197 209 206 212 192 498 203 206 214 216 211 225 250
RPCA30 205 207 202 206 190 194 203 206 214 223 250
RPCA31 205 206 208 190 202 203 214 266 209 223 250
Anexo 10. Freqüências alélicas dos oito locos microssatélites estudados nas populações de pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg, 1887) do Pantanal Mato–Grossense estudadas. (RCPN = Rio Cuiabá/Parque
Nacional-Foz; RSLO = Rio São Lourenço; RCSE = Rio Cuiabá/Sesc; RTCA = Rio Taquari/Caronal; RTPA = Rio
Taquari/Palmeiras; RNEG = Rio Negro; RPMI = Rio Paraguai Mirim; RPCO = Rio Paraguai/Corumbá; RPCA =
Rio Paraguai/ Cáceres)
Alelos (pb) RPCN RSLO RCSE RTCA RTPA RNEG RPMI RPCO RPCA
191 0.000 0.019 0.000 0.050 0.000 0.000 0.0000 0.000 0.000
193 0.083 0.000 0.079 0.000 0.000 0.000 0.000 0.125 0.017
197 0.096 0.135 0.053 0.100 0.050 0.154 0.214 0.125 0.233
199 0.019 0.019 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.083 0.000
201 0.000 0.058 0.013 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.017
203 0.096 0.115 0.053 0.100 0.125 0.000 0.036 0.042 0.133
205 0.288 0.250 0.421 0.450 0.375 0.385 0.214 0.375 0.400
207 0.250 0.173 0.066 0.100 0.250 0.038 0.250 0.125 0.050
209 0.135 0.154 0.250 0.050 0.050 0.154 0.143 0.125 0.083
211 0.058 0.077 0.039 0.100 0.100 0.231 0.143 0.000 0.067
Pme2
213 0.019 0.000 0.026 0.050 0.050 0.038 0.000 0.000 0.000
192 0.048 0.017 0.013 0.182 0.063 0.038 0.094 0.079 0.065
198 0.016 0.000 0.013 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
200 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.031 0.000 0.000
202 0.226 0.233 0.225 0.273 0.125 0.038 0.063 0.236 0.290
204 0.048 0.067 0.000 0.000 0.047 0.000 0.063 0.000 0.016
206 0.355 0.550 0.475 0.318 0.594 0.577 0.469 0.605 0.468
208 0.129 0.067 0.075 0.136 0.031 0.115 0.125 0.026 0.048
210 0.016 0.000 0.013 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
212 0.129 0.050 0.150 0.045 0.109 0.192 0.125 0.026 0.065
214 0.016 0.000 0.037 0.045 0.031 0.000 0.031 0.000 0.048
Pme4
216 0.016 0.017 0.000 0.000 0.000 0.038 0.000 0.000 0.000
184 0.000 0.000 0.000 0.000 0.017 0.000 0.000 0.026 0.034
186 0.088 0.107 0.150 0.200 0.086 0.042 0.094 0.105 0.017
188 0.000 0.000 0.013 0.000 0.000 0.042 0.063 0.000 0.000
190 0.294 0.179 0.188 0.200 0.244 0.292 0.344 0.132 0.276
192 0.279 0.196 0.200 0.200 0.241 0.375 0.219 0.289 0.190
194 0.088 0.179 0.188 0.150 0.190 0.083 0.156 0.132 0.103
196 0.044 0.071 0.037 0.050 0.000 0.000 0.000 0.000 0.069
198 0.147 0.250 0.212 0.200 0.207 0.167 0.125 0.263 0.293
200 0.000 0.000 0.000 0.000 0.017 0.000 0.000 0.000 0.000
Pme5
202 0.059 0.018 0.013 0.000 0.017 0.000 0.000 0.053 0.017
194 0.000 0.034 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
197 0.017 0.000 0.013 0.045 0.063 0.115 0.063 0.026 0.016
200 0.033 0.069 0.037 0.045 0.094 0.000 0.000 0.053 0.048
203 0.617 0.569 0.750 0.636 0.625 0.654 0.594 0.526 0.581
206 0.283 0.310 0.188 0.273 0.219 0.192 0.281 0.342 0.355
209 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.053 0.000
212 0.033 0.017 0.013 0.000 0.000 0.038 0.031 0.000 0.000
Pme14
215 0.017 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.031 0.000 0.000
208 0.000 0.033 0.013 0.050 0.000 0.000 0.033 0.079 0.016
210 0.030 0.000 0.053 0.000 0.034 0.143 0.033 0.026 0.032
214 0.621 0.750 0.671 0.450 0.638 0.500 0.700 0.658 0.726
216 0.348 0.217 0.250 0.450 0.259 0.286 0.233 0.211 0.226
218 0.000 0.000 0.013 0.050 0.034 0.000 0.000 0.026 0.000
Pme20
224 0.000 0.000 0.000 0.000 0.034 0.000 0.000 0.000 0.000
260 0.147 0.086 0.162 0.100 0.109 0.091 0.150 0.067 0.120
264 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.020
266 0.838 0.862 0.794 0.850 0.891 0.909 0.600 0.933 0.780
268 0.015 0.052 0.044 0.000 0.000 0.000 0.200 0.000 0.080
Pme21
270 0.000 0.000 0.000 0.050 0.000 0.000 0.050 0.000 0.000
209 0.250 0.241 0.256 0.227 0.145 0.346 0.313 0.447 0.417
211 0.044 0.017 0.051 0.409 0.194 0.269 0.094 0.079 0.150
215 0.059 0.138 0.064 0.000 0.016 0.000 0.063 0.053 0.050
217 0.044 0.034 0.051 0.000 0.065 0.000 0.063 0.000 0.000
219 0.015 0.000 0.038 0.000 0.016 0.038 0.000 0.000 0.033
221 0.000 0.000 0.000 0.000 0.016 0.000 0.000 0.000 0.000
223 0.353 0.362 0.410 0.182 0.161 0.346 0.406 0.368 0.233
225 0.059 0.000 0.013 0.091 0.210 0.000 0.031 0.000 0.067
227 0.015 0.017 0.026 0.045 0.000 0.000 0.031 0.000 0.000
229 0.029 0.034 0.026 0.045 0.048 0.000 0.000 0.000 0.017
231 0.074 0.103 0.013 0.000 0.048 0.000 0.000 0.053 0.000
233 0.059 0.034 0.026 0.000 0.048 0.000 0.000 0.000 0.017
235 0.000 0.017 0.013 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Pme28
239 0.000 0.000 0.013 0.000 0.032 0.000 0.000 0.000 0.017
241 0.000 0.000 0.000 0.000 0.016 0.000 0.000 0.000 0.000
244 0.059 0.017 0.051 0.000 0.000 0.000 0.000 0.028 0.033
247 0.000 0.000 0.000 0.000 0.203 0.000 0.000 0.000 0.000
250 0.941 0.983 0.936 0.955 0.781 1.000 1.000 0.944 0.967
Pme32
253 0.000 0.000 0.013 0.045 0.000 0.000 0.000 0.028 0.000
Anexo 11: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/Parque Nacional-Foz
(RCPN).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RCPN Pme2 Pme4 1.00000 0.00000
RCPN Pme2 Pme5 0.65596 0.03930
RCPN Pme4 Pme5 0.51048 0.03860
RCPN Pme2 Pme14 0.90805 0.01507
RCPN Pme4 Pme14 0.45218 0.02928
RCPN Pme5 Pme14 0.04781 0.01007
RCPN Pme2 Pme20 0.21654 0.01859
RCPN Pme4 Pme20 0.87976 0.01474
RCPN Pme5 Pme20 0.36211 0.02071
RCPN Pme14 Pme20 0.37118 0.01606
RCPN Pme2 Pme21 0.24387 0.01922
RCPN Pme4 Pme21 0.38018 0.01885
RCPN Pme5 Pme21 0.33004 0.02035
RCPN Pme14 Pme21 1.00000 0.00000
RCPN Pme20 Pme21 0.71633 0.01015
RCPN Pme2 Pme28 0.02432 0.01284
RCPN Pme4 Pme28 0.62072 0.04316
RCPN Pme5 Pme28 0.54185 0.04291
RCPN Pme14 Pme28 0.57817 0.03627
RCPN Pme20 Pme28 0.27744 0.02998
RCPN Pme21 Pme28 0.21225 0.02719
RCPN Pme2 Pme32 0.48704 0.01260
RCPN Pme4 Pme32 0.09944 0.01074
RCPN Pme5 Pme32 0.21342 0.01258
RCPN Pme14 Pme32 0.22933 0.01136
RCPN Pme20 Pme32 0.16250 0.00716
RCPN Pme21 Pme32 1.00000 0.00000
RCPN Pme28 Pme32 0.93768 0.00935
Anexo 12: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio São Lourenço (RSLO).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RSLO Pme2 Pme4 0.91803 0.02048
RSLO Pme2 Pme5 1.00000 0.00000
RSLO Pme4 Pme5 0.30528 0.03191
RSLO Pme2 Pme14 1.00000 0.00000
RSLO Pme4 Pme14 0.34535 0.02201
RSLO Pme5 Pme14 0.78059 0.01911
RSLO Pme2 Pme20 0.46211 0.01906
RSLO Pme4 Pme20 0.84555 0.01233
RSLO Pme5 Pme20 0.72934 0.01670
RSLO Pme14 Pme20 0.94099 0.00387
RSLO Pme2 Pme21 0.04850 0.00760
RSLO Pme4 Pme21 0.81192 0.01615
RSLO Pme5 Pme21 0.82483 0.01158
RSLO Pme14 Pme21 0.55290 0.01345
RSLO Pme20 Pme21 0.36237 0.00999
RSLO Pme2 Pme28 0.50959 0.04274
RSLO Pme4 Pme28 0.74768 0.02914
RSLO Pme5 Pme28 1.00000 0.00000
RSLO Pme14 Pme28 0.39573 0.02110
RSLO Pme20 Pme28 0.82971 0.01274
RSLO Pme21 Pme28 0.86117 0.01375
RSLO Pme2 Pme32 0.75627 0.01132
RSLO Pme4 Pme32 1.00000 0.00000
RSLO Pme5 Pme32 0.85282 0.00875
RSLO Pme14 Pme32 1.00000 0.00000
RSLO Pme20 Pme32 0.36694 0.00533
RSLO Pme21 Pme32 0.23843 0.00544
RSLO Pme28 Pme32 0.66870 0.01236
Anexo 13: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Cuiabá/SESC (RCSE).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RCSE Pme2 Pme4 0.38889 0.03872
RCSE Pme2 Pme5 0.45567 0.04395
RCSE Pme4 Pme5 0.75132 0.02746
RCSE Pme2 Pme14 0.36668 0.02813
RCSE Pme4 Pme14 0.18829 0.01852
RCSE Pme5 Pme14 0.35163 0.02280
RCSE Pme2 Pme20 0.04544 0.01216
RCSE Pme4 Pme20 0.89889 0.01388
RCSE Pme5 Pme20 0.45345 0.02596
RCSE Pme14 Pme20 0.61243 0.01662
RCSE Pme2 Pme21 0.50160 0.02288
RCSE Pme4 Pme21 0.34832 0.01750
RCSE Pme5 Pme21 0.37052 0.01918
RCSE Pme14 Pme21 0.63774 0.01189
RCSE Pme20 Pme21 0.09223 0.00771
RCSE Pme2 Pme28 0.12705 0.02804
RCSE Pme4 Pme28 0.37850 0.03898
RCSE Pme5 Pme28 0.02372 0.01082
RCSE Pme14 Pme28 0.35575 0.02464
RCSE Pme20 Pme28 0.62759 0.03143
RCSE Pme21 Pme28 0.34382 0.02100
RCSE Pme2 Pme32 0.76284 0.01836
RCSE Pme4 Pme32 0.28298 0.01395
RCSE Pme5 Pme32 0.69530 0.01563
RCSE Pme14 Pme32 1.00000 0.00000
RCSE Pme20 Pme32 0.69633 0.01164
RCSE Pme21 Pme32 0.31961 0.00677
RCSE Pme28 Pme32 0.25732 0.01865
Anexo 14: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Taquari/Caronal (RTCA).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RTCA Pme2 Pme4 1.00000 0.00000
RTCA Pme2 Pme5 No information
RTCA Pme4 Pme5 1.00000 0.00000
RTCA Pme2 Pme14 1.00000 0.00000
RTCA Pme4 Pme14 0.67571 0.01752
RTCA Pme5 Pme14 1.00000 0.00000
RTCA Pme2 Pme20 0.13786 0.01239
RTCA Pme4 Pme20 0.54637 0.01571
RTCA Pme5 Pme20 1.00000 0.00000
RTCA Pme14 Pme20 0.19656 0.00794
RTCA Pme2 Pme21 0.27779 0.00996
RTCA Pme4 Pme21 0.20288 0.00870
RTCA Pme5 Pme21 1.00000 0.00000
RTCA Pme14 Pme21 0.78855 0.00690
RTCA Pme20 Pme21 0.33848 0.00766
RTCA Pme2 Pme28 1.00000 0.00000
RTCA Pme4 Pme28 0.35547 0.02164
RTCA Pme5 Pme28 1.00000 0.00000
RTCA Pme14 Pme28 1.00000 0.00000
RTCA Pme20 Pme28 1.00000 0.00000
RTCA Pme21 Pme28 0.46785 0.00946
RTCA Pme2 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme4 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme5 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme14 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme20 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme21 Pme32 1.00000 0.00000
RTCA Pme28 Pme32 0.71774 0.00732
Anexo 15: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Taquari/Palmeiras (RTPA).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RTPA Pme2 Pme4 0.14990 0.01786
RTPA Pme2 Pme5 0.80276 0.02316
RTPA Pme4 Pme5 0.99177 0.00419
RTPA Pme2 Pme14 0.84507 0.01175
RTPA Pme4 Pme14 0.26267 0.01804
RTPA Pme5 Pme14 0.86432 0.01585
RTPA Pme2 Pme20 0.31289 0.02091
RTPA Pme4 Pme20 0.59993 0.02655
RTPA Pme5 Pme20 0.15052 0.02592
RTPA Pme14 Pme20 0.59878 0.01745
RTPA Pme2 Pme21 0.76457 0.01302
RTPA Pme4 Pme21 0.39567 0.01373
RTPA Pme5 Pme21 0.05000 0.00555
RTPA Pme14 Pme21 0.86258 0.00504
RTPA Pme20 Pme21 0.03975 0.00414
RTPA Pme2 Pme28 1.00000 0.00000
RTPA Pme4 Pme28 0.24048 0.03106
RTPA Pme5 Pme28 0.66789 0.04126
RTPA Pme14 Pme28 0.90425 0.01464
RTPA Pme20 Pme28 0.70106 0.03298
RTPA Pme21 Pme28 0.93239 0.00724
RTPA Pme2 Pme32 0.73939 0.01050
RTPA Pme4 Pme32 0.30162 0.01315
RTPA Pme5 Pme32 0.37918 0.01738
RTPA Pme14 Pme32 0.91152 0.00451
RTPA Pme20 Pme32 0.20144 0.00970
RTPA Pme21 Pme32 0.37286 0.00708
RTPA Pme28 Pme32 0.31857 0.01840
Anexo 16: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Negro (RNEG).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RNEG Pme2 Pme4 0.76315 0.01444
RNEG Pme2 Pme5 0.27031 0.02273
RNEG Pme4 Pme5 1.00000 0.00000
RNEG Pme2 Pme14 0.90789 0.00837
RNEG Pme4 Pme14 0.11751 0.00803
RNEG Pme5 Pme14 0.24648 0.01845
RNEG Pme2 Pme20 0.17834 0.01064
RNEG Pme4 Pme20 0.62864 0.00821
RNEG Pme5 Pme20 1.00000 0.00000
RNEG Pme14 Pme20 0.88170 0.00409
RNEG Pme2 Pme21 0.44955 0.00579
RNEG Pme4 Pme21 1.00000 0.00000
RNEG Pme5 Pme21 0.51264 0.01005
RNEG Pme14 Pme21 1.00000 0.00000
RNEG Pme20 Pme21 1.00000 0.00000
RNEG Pme2 Pme28 0.44203 0.01494
RNEG Pme4 Pme28 0.08664 0.00771
RNEG Pme5 Pme28 1.00000 0.00000
RNEG Pme14 Pme28 0.62239 0.01258
RNEG Pme20 Pme28 0.63238 0.00923
RNEG Pme21 Pme28 1.00000 0.00000
RNEG Pme2 Pme32 Not possible
RNEG Pme4 Pme32 Not possible
RNEG Pme5 Pme32 Not possible
RNEG Pme14 Pme32 Not possible
RNEG Pme20 Pme32 Not possible
RNEG Pme21 Pme32 Not possible
RNEG Pme28 Pme32 Not possible
Anexo 17: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai Mirim (RPMI).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RPMI Pme2 Pme4 0.42446 0.02734
RPMI Pme2 Pme5 1.00000 0.00000
RPMI Pme4 Pme5 0.08105 0.01742
RPMI Pme2 Pme14 0.19108 0.00969
RPMI Pme4 Pme14 0.09865 0.01257
RPMI Pme5 Pme14 0.97734 0.00417
RPMI Pme2 Pme20 0.10180 0.00855
RPMI Pme4 Pme20 0.36641 0.02085
RPMI Pme5 Pme20 0.70274 0.01808
RPMI Pme14 Pme20 1.00000 0.00000
RPMI Pme2 Pme21 1.00000 0.00000
RPMI Pme4 Pme21 0.59998 0.01394
RPMI Pme5 Pme21 0.51870 0.01054
RPMI Pme14 Pme21 0.51633 0.00916
RPMI Pme20 Pme21 1.00000 0.00000
RPMI Pme2 Pme28 0.31749 0.02417
RPMI Pme4 Pme28 0.36748 0.03092
RPMI Pme5 Pme28 0.94170 0.00990
RPMI Pme14 Pme28 0.26317 0.01959
RPMI Pme20 Pme28 0.48464 0.02138
RPMI Pme21 Pme28 0.91249 0.00528
RPMI Pme2 Pme32 Not possible
RPMI Pme4 Pme32 Not possible
RPMI Pme5 Pme32 Not possible
RPMI Pme14 Pme32 Not possible
RPMI Pme20 Pme32 Not possible
RPMI Pme21 Pme32 Not possible
RPMI Pme28 Pme32 Not possible
Anexo 18: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai/Corumbá (RPCO).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RPCO Pme2 Pme4 1.00000 0.00000
RPCO Pme2 Pme5 1.00000 0.00000
RPCO Pme4 Pme5 0.73160 0.02584
RPCO Pme2 Pme14 0.61286 0.01671
RPCO Pme4 Pme14 0.52878 0.01620
RPCO Pme5 Pme14 0.33305 0.02495
RPCO Pme2 Pme20 1.00000 0.00000
RPCO Pme4 Pme20 0.39480 0.02012
RPCO Pme5 Pme20 0.57327 0.03121
RPCO Pme14 Pme20 0.59010 0.01686
RPCO Pme2 Pme21 1.00000 0.00000
RPCO Pme4 Pme21 0.20743 0.00561
RPCO Pme5 Pme21 0.47023 0.00889
RPCO Pme14 Pme21 1.00000 0.00000
RPCO Pme20 Pme21 1.00000 0.00000
RPCO Pme2 Pme28 1.00000 0.00000
RPCO Pme4 Pme28 0.93112 0.00934
RPCO Pme5 Pme28 0.49513 0.03299
RPCO Pme14 Pme28 0.77536 0.01615
RPCO Pme20 Pme28 0.27186 0.02305
RPCO Pme21 Pme28 1.00000 0.00000
RPCO Pme2 Pme32 0.67140 0.00750
RPCO Pme4 Pme32 0.43628 0.01412
RPCO Pme5 Pme32 0.29285 0.01544
RPCO Pme14 Pme32 0.63102 0.01171
RPCO Pme20 Pme32 0.81577 0.01046
RPCO Pme21 Pme32 1.00000 0.00000
RPCO Pme28 Pme32 0.70008 0.01622
Anexo 19: Dados de desequilíbrio de ligação para cada par de locos para a população de
pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) do Rio Paraguai/ Cáceres (RPCA).
População Loco 1 Loco 2 P S.E.
RPCA Pme2 Pme4 0.33807 0.03020
RPCA Pme2 Pme5 0.58037 0.03291
RPCA Pme4 Pme5 0.29145 0.02904
RPCA Pme2 Pme14 0.00000 0.00000
RPCA Pme4 Pme14 0.94685 0.00644
RPCA Pme5 Pme14 0.06703 0.00925
RPCA Pme2 Pme20 0.17215 0.01695
RPCA Pme4 Pme20 0.03243 0.00815
RPCA Pme5 Pme20 0.03937 0.00859
RPCA Pme14 Pme20 0.11452 0.00843
RPCA Pme2 Pme21 0.08126 0.01194
RPCA Pme4 Pme21 0.59177 0.01976
RPCA Pme5 Pme21 0.95759 0.00771
RPCA Pme14 Pme21 0.02359 0.00468
RPCA Pme20 Pme21 0.12900 0.00821
RPCA Pme2 Pme28 0.18988 0.02747
RPCA Pme4 Pme28 0.88869 0.02107
RPCA Pme5 Pme28 0.18886 0.02600
RPCA Pme14 Pme28 0.27356 0.02209
RPCA Pme20 Pme28 0.87309 0.01707
RPCA Pme21 Pme28 0.62165 0.02517
RPCA Pme2 Pme32 0.51828 0.00922
RPCA Pme4 Pme32 0.25094 0.00677
RPCA Pme5 Pme32 0.20006 0.00635
RPCA Pme14 Pme32 1.00000 0.00000
RPCA Pme20 Pme32 0.49954 0.00736
RPCA Pme21 Pme32 1.00000 0.00000
RPCA Pme28 Pme32 0.24986 0.01030
Anexo 20. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio São
Lourenço.
Anexo 21. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio
Cuiabá (SESC Pantanal).
Anexo 22. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio
Cuiabá (Parque Nacional do Pantanal). Ladder 1kb plus.
Anexo 23. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA extraído de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Amostras dos indivíduos coletados no Rio
Paraguai. Ladder 1kb plus.
Anexo 24. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme2. Ladder de 10 pares de
base.
Anexo 25. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme4. Ladder 1kb plus.
Anexo 26. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo com DNA amplificado de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com o primer Pme21.
Anexo 27. Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata com DNA amplificado de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com primer Pme20. Ladder de 10 pares de base
(L). 1 a 6: indivíduos escolhidos aleatoriamente para a realização do ensaio. (N): amostra
não diluída. (D): amostra diluída na concentração de 10:1
D
D
D
D
D
D
N
N
N
N
N
N
1
2
3
4
5
6
L
Anexo 28. Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata com DNA amplificado de pacu
(Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com primer Pme21. Ladder de 10 pares de base
(L). 1 a 6: indivíduos escolhidos aleatoriamente para a realização do ensaio. (N): amostra
não diluída. (D): amostra diluída na concentração de 5:1.
D
D
D
D
D
D
N
N
N
N
N
N
1
2
3
4
5
6
L
“Assim diz o SENHOR: Reprime a tua voz de choro,
e as lágrimas de teus olhos; porque há galardão
para o teu trabalho, diz o SENHOR, pois eles
voltarão da terra do inimigo.”
Jeremias 31: 16
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