( PDF ) Ação da dexametasona sobre o movimento dentário induzido em ratos. Estudo histológico

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM ORTODONTIA

LUÉGYA AMORIM HENRIQUES KNOP

AÇÃO DA DEXAMETASONA SOBRE O MOVIMENTO DENTÁRIO INDUZIDO EM

RATOS. ESTUDO HISTOLÓGICO

CURITIBA

2008

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LUÉGYA AMORIM HENRIQUES KNOP

AÇÃO DA DEXAMETASONA SOBRE O MOVIMENTO DENTÁRIO INDUZIDO EM

RATOS. ESTUDO HISTOLÓGICO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Pontifícia Universidade

Católica do Paraná, como parte dos requisitos para

obtenção do Título de Mestre em Odontologia – Área

de concentração em Ortodontia

Pós-graduanda: Luégya Amorim Henriques Knop

Orientador: Prof. Dr. Orlando Tanaka

Co-orientadora: Prof

Maria Ângela Naval Machado

CURITIBA

2008

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Dados da Catalogação na Publicação

Pontifícia Universidade Católica do Paraná

Sistema Integrado de Bibliotecas – SIBI/PUCPR

Biblioteca Central

Knop, Luégya Amorim Henriques

K72a Ação da dexametasona sobre o movimento dentário induzido em ratos :

2008 Estudo histológico / Luégya Amorim Henriques Knop ; orientador, Orlando

Tanaka ; co-orientadora, Maria Ângela Naval Machado. – 2008.

79 p. : il. ; 30 cm

Dissertação (mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Paraná,

Curitiba, 2008

Inclui bibliografia

1. Ortodontia corretiva. 2. Dexametasona. 3. Agentes antiinflamatórios.

4. Hormônios adenocórticos. I. Tanaka, Orlando. II. Machado, Maria Ângela

Naval. III. Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Programa de Pós-

Graduação em Odontologia. IV. Título.

CDD 20. ed. 617.643

Há homens que lutam um dia e são bons.

Há outros que lutam um ano e são melhores.

Há os que lutam muitos anos e são muito bons.

Porém, há os que lutam sempre.

Esses são os imprescindíveis.

Bertolt Brecht

Aos meus pais, Lúcio e Emília,

Por todo incentivo, amor e força incondicionais dedicados a mim. Obrigada por

sempre acreditar e torcer por mim e não medir esforços para minha educação.

Obrigada por estar sempre ao meu lado, dedicando-me amor, carinho, compreensão e

conforto,

À minha irmã, Laianne,

por dividir comigo momentos alegres e angústias,

Dedico.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao orientador desta pesquisa e amigo Prof. Dr. Orlando Tanaka, por ser essa

pessoa maravilhosa. Tenho muito orgulho de ter sido sua orientada. Muito obrigada

pelos ensinamentos “ortodônticos” e pelos exemplos de dedicação, perseverança,

confiança e otimismo. Sem suas palavras e ensinamentos não conseguiria cursar o

Mestrado com tamanha vontade e alegria,

À Prof

Sílvia Regina de Almeida Reis, que me iniciou na vida científica e

sempre me ensinou com muita paciência, dedicação e amor. Sinto-me muito honrada

por tê-la tido como minha orientadora durante a Graduação.

AGRADECIMENTOS

À DEUS, por ter me permitido o dom da vida e a concretização deste sonho,

À minha madrinha Angélica Lopes, por ser essa pessoa companheira,

carinhosa e dedicada,

À minha tia Jucília Bispo, pelo apoio, força e carinho,

Aos meus avós Rubens Knop e Mariza Knop, pelo exemplo de vida e amor,

Ao meu namorado, Ricardo Shintcovsk, por sempre estar ao meu lado.

Agradeço pelas palavras de conforto e confiança quando eu mais precisava, e

principalmente pelo amor que me dedicou e me dedica a cada dia,

Aos meus tios e primos, por todos os momentos alegres em família, em

especial ao tio Guilherme Amorim,

Aos meus amigos e companheiros Saulo Régis e Taís Cunha, por compartilhar

esses dois anos intensos e harmoniosos comigo. Vocês foram essenciais,

Ao coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Dr.

Sérgio Vieira, pelo apoio e atenção,

À Prof

. Dr

. Elisa Souza Camargo, pela convivência nestes dois anos e por ser

este exemplo de mãe e profissional,

Aos Prof. Dr. Hiroshi Maruo e Prof. Dr. Odilon Guariza Filho, pelos dois anos de

convivência, amizade, incentivos e aprendizados,

À Prof

Maria Ângela Naval Machado, pela co-orientação valiosa,

À Prof

Ana Maria Trindade Grégio pela ajuda, atenção e incentivo,

À Prof

Telma Martins Araújo, pelo incentivo, apoio e exemplo de

professora e profissional,

Aos meus colegas de turma do mestrado, por esses dois anos de aprendizado.

Agradeço em especial a Jucienne, Luciana e Ricardo por ter ajudado a sonhar e

concretizar esta pesquisa. Obrigada também a Marcos e Luís Filipe, a quem dedico

muito carinho,

Ao Grupo PET, por ter me formado uma profissional mais científica e humana,

Ao grupo GAT, por ter permitido concretizar outro sonho e desvendar mais

horizontes, em especial à Prof

. Dr

. Luciana Azevedo Alanis, por ter abraçado esta

causa e compartilhado comigo momentos de felicidade e aprendizado,

Ao funcionário da PUCPR Daniel Fiedler, pelo apoio, confiança e otimismo

incondicionais,

À secretária do Programa de Pós-Produção em Odontologia da PUCPR, Neide

Reis Borges, pela amizade e por sempre estar disposta a compartilhar meus

problemas e resolvê-los,

À José Vinícius Maciel, pela ajuda e apoio sempre que necessário,

Aos funcionários da Clínica de Odontologia da PUCPR, em especial a Silvana

Casagrande Gabardo,

Aos funcionários do Biotério da PUCPR e em especial a Rafael Zotz e Cândido

Pereira por todo apoio,

Ao funcionário Misael, pela ajuda e disposição na execução do experimento,

Às funcionárias do Laboratório de Patologia da PUCPR, Ana Paula e Marina,

pela ajuda na execução deste trabalho,

À Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR), minha escola de Pós-

Graduação e segundo lar nesses dois anos,

À CAPES, pela bolsa de estudos concedida,

À Todos que participaram direta ou indiretamente deste trabalho.

SUMÁRIO

1. ARTIGO EM PORTUGUÊS

PÁGINA TÍTULO................................................................................

RESUMO............................................................................................

INTRODUÇÃO...................................................................................

MATERIAL E MÉTODOS...................................................................

RESULTADOS...................................................................................

DISCUSSÃO......................................................................................

CONCLUSÃO.....................................................................................

REFERÊNCIAS..................................................................................

TABELAS...........................................................................................

FIGURAS...........................................................................................

LEGENDAS........................................................................................

2. ARTIGO EM INGLÊS

TITLE PAGE.......................................................................................

ABSTRACT.........................................................................................

KEY-WORDS......................................................................................

INTRODUCTION................................................................................

MATERIALS AND METHODS………………………...………………...

RESULTS...........................................................................................

DISCUSSION.....................................................................................

REFERENCES...................................................................................

TABLES..............................................................................................

FIGURES............................................................................................

LEGEND.............................................................................................

3. ANEXOS

ANEXO I - REVISÃO DE LITERATURA............................................

ANEXO II - ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................

ANEXO III - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA.........................

ANEXO IV - NORMAS PARA PUBLICAÇÃO – BONE......................

1. ARTIGO EM PORTUGUÊS

AÇÃO DA DEXAMETASONA SOBRE O MOVIMENTO DENTÁRIO INDUZIDO EM RATOS.

ESTUDO HISTOLÓGICO

Luégya Amorim Henriques Knop

Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de concentração em Ortodontia

Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

Orlando Tanaka

Professor Titular do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de

concentração em Ortodontia

Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

Maria Ângela Naval Machado

Professora Titular do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de

concentração em Estomatologia

Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

Autor para correspondência

Prof. Dr. Orlando Tanaka

Mestrado em Odontologia

R. Imaculada Conceição, 1155

Fone: 55 41 3271-1637 / Fax 55 41 3271-1405

80215-901 – Curitiba-PR

BRASIL

e-mail:[email protected]m

RESUMO

AÇÃO DA DEXAMETASONA SOBRE O MOVIMENTO DENTÁRIO INDUZIDO EM RATOS.

ESTUDO HISTOLÓGICO

A movimentação dentária é caracterizada inicialmente por uma inflamação aguda estéril,

seguida por reações múltiplas seqüenciais no ligamento periodontal em resposta às forças

biomecânicas. Os corticosteróides são agentes antiinflamatórios potentes, amplamente

utilizados na Clínica médica e odontológica. Diante disso, o objetivo deste estudo foi analisar

a remodelação óssea durante o movimento dentário induzido sob a ação do antiinflamatório

esteróide dexametasona. Para tanto, sessenta ratos machos Wistar foram divididos em 3

grupos: C (controle), CM (controle com indução do movimento dentário) e DM

(dexametasona com indução do movimento dentário). Os animais dos grupos C e CM

receberam solução salina 0,9% e os do grupo DM, o fosfato dissódico dexametasona

DEXANIL

(2 mg/kg). Após a eutanásia dos animais, em 3, 7 e 14 dias de uso de mola

ortodôntica, os espécimes foram processados histologicamente e quantificados os vasos

sanguíneos, as lacunas de Howship e as células osteoclásticas nos lados de tração e

compressão do ligamento periodontal do primeiro molar superior. A neoformação óssea foi

avaliada sob luz polarizada e o software 4,5 Image Pro-Plus

calculou a porcentagem de

colágeno maduro e imaturo. Por meio do teste de comparações múltiplas não-paramétricas

de Kruskal-Wallis, no grupo DM observou-se menor quantidade de vasos sanguíneos,

lacunas de Howship e células osteoclásticas no ligamento periodontal, quando comparado

ao grupo CM (p<0,01), no terceiro dia após a aplicação da força. No sétimo dia, havia menor

porcentagem de colágeno maduro no grupo DM em relação ao grupo CM (p<0,01).

Concluiu-se que a dexametasona inibe a reabsorção óssea no período inicial do movimento

dentário em ratos e atrasa o processo de maturação de colágeno na matriz óssea

neoformada.

PALAVRAS-CHAVE:

Movimento dos dentes, Histologia, Reabsorção óssea, Formação óssea,

exametasona

INTRODUÇÃO

O período inicial do movimento dentário induzido envolve uma resposta inflamatória

aguda, caracterizada por vasodilatação periodontal e migração de leucócitos a partir dos

capilares sanguíneos. Estas células, por sua vez, produzem citocinas, moléculas

sinalizadoras, que interagem com células do ligamento periodontal e estimulam a síntese e

liberação de diversos mediadores, como fatores de crescimento, prostaglandinas e outras

citocinas [1]. Segue-se uma série de eventos seqüenciais biológicos, que resultam em

remodelação óssea a fim de permitir o movimento do dente no alvéolo [2,3].

Reabsorção e neoformação compõem a remodelação óssea inerente ao movimento

dentário induzido. O osso neoformado é depositado na parede alveolar do lado de tração

quando aplicadas forças mecânicas leves ou pesadas. No lado de compressão, sob forças

leves, o osso alveolar é reabsorvido diretamente por osteoclastos situados nas lacunas de

Howship [4].

Tem sido demonstrado que o movimento dentário induzido pode ser alterado pela

administração local ou geral de agentes farmacológicos [5].

Os corticosteróides são agentes imuno-supressores e antiinflamatórios amplamente

utilizados em processos inflamatórios, embora seu uso a longo prazo esteja associado à

osteoporose secundária in vivo [6].

A dexametasona, potente antiinflamatório esteróide, inibe a liberação de

prostaglandinas e leucotrienos por meio do bloqueio da fosfolipase A

[7,8]. Esta droga pode

alterar ainda a atividade de fatores de crescimento, a exemplo do TGF-β1 [9]. Como

conseqüência da inibição desses mediadores, nota-se atraso no reparo de úlceras gástricas

em ratos [8] e menor síntese de colágeno em feridas cutâneas quando avaliadas sob luz

polarizada [10].

A ação dos corticosteróides sobre os componentes do tecido ósseo permanece

incerta. Pharoah e Heersche [11] sugerem que a dexametasona inibe a formação dos

osteoclastos, enquanto para Hofbauer et al. [12] e Swanson et al. [9] a dexametasona

promove a osteoclastogênese e estimula a reabsorção óssea.

A prevalência de processos patológicos tratados pelos corticosteróides é ampla na

clínica médica e odontológica, e os pacientes em tratamento ortodôntico podem apresentar

variações na remodelação óssea normal devido ao uso destas drogas [5], o que implica em

tratamento ortodôntico diferenciado.

O objetivo deste estudo foi investigar a ação da dexametasona sobre a remodelação

óssea durante o movimento dentário induzido em ratos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Animais (CEUA) da Pontifícia

Universidade Católica do Paraná (PUCPR), sob parecer n

69.07.

Foram utilizados sessenta ratos machos da linhagem Wistar (Rattus norvergicus

albinus) com 12 semanas de vida, pesando aproximadamente 300 – 350g, provenientes do

Biotério da PUCPR. Os animais permaneceram acondicionados em caixas de propileno

semi-fosco, com locais específicos para alimento e água fornecidos ad libitum e temperatura

entre 19°C e 22°C. Foi realizado controle de fotoperíodo de 12 horas claro e 12 horas

escuro para evitar alterações no ciclo metabólico.

Os ratos foram divididos em três grupos, o grupo C (controle, sem indução de

movimento dentário), CM (controle com indução do movimento dentário) e DM

(dexametasona com indução do movimento dentário). Os animais dos grupos C e CM

receberam solução salina 0,9%-0,5ml/kg a cada 24 horas para simular o estresse recebido

pelos animais com a injeção. O grupo DM recebeu fosfato dissódico dexametasona com

dose de 2 mg/kg (DEXANIL

, Lab. Ducto Indústria Farmacêutica Ltda., Lote 50185,

Anápolis-GO, Brasil), via intramuscular, a cada 24 horas. A dose utilizada baseou-se no

estudo conduzido por Thompson et al. [13]. As aplicações iniciaram 1 dia antes da

instalação do acessório ortodôntico e prosseguiram com uso contínuo até o final do

experimento.

Em todos os grupos, o estudo focalizou as raízes mésio-vestibulares dos primeiros

molares superiores. As hemi-maxilas direitas constituíram os grupos CM e DM; e as

esquerdas, o grupo C, como realizado nos estudos de Kalia et al. [5] e Bletsa et al. [14].

O movimento dentário foi induzido por meio de mola fechada de níquel-titânio (G&H

Wire Company REF CCOF9XL, Lote 103946, Hanover, Germany), que produziu força

recíproca entre os incisivos superiores e o primeiro molar superior direito (Figura 1) com

magnitude de 30gf, mensurada por meio de dinamômetro de precisão Dentaurum, n

1005004, devidamente calibrado e aferido. Após a ativação inicial, o dispositivo não foi

reativado, no entanto seu posicionamento conferido diariamente. A mola foi instalada nos

animais sob anestesia geral, induzida por injeção intramuscular de ketamina (Vetanarcol

Lab. Konig S.A., Lote 00103, Avellaneda, Argentina) na dose de 1,8 mg/kg e xilazina

(Rompun

, Lab. Bayer, Lote 00404, São Paulo, Brasil) na dose de 1,1 mg/kg.

Os ratos foram eutanasiados após 3, 7 e 14 dias da instalação da mola ortodôntica

com ketamina na dose de 5,4 mg/kg, via intraperitoneal. Após a eutanásia, as maxilas foram

dissecadas e imersas em solução de formalina a 10% tamponada para fixação, por um

período de 72 horas. Os espécimes foram então colocados em solução aquosa

desmineralizante EDTA a 4,13%, por 12 semanas. Seguiu-se o protocolo convencional e

cortes transversais de 4 µm foram preparados e corados para análise microscópica. De

cada espécime, foram obtidos 16 cortes escalonados, desde a crista óssea alveolar até o

ápice radicular, sendo 12 corados com Hematoxilina-Eosina e 4 com Picrossirius.

O estudo histológico das lâminas coradas com Hematoxilina-Eosina foi do tipo cego,

conduzido por um avaliador, devidamente calibrado. Os parâmetros histológicos avaliados

foram as células osteoclásticas, as lacunas de Howship ativas e os vasos sanguíneos,

quantificados sob microscopia de luz com aumento original de 400X ao longo do ligamento

periodontal. O critério histológico para identificação de células osteoclásticas foi a presença

de células multinucleadas e eosinofílicas adjacentes à superfície óssea [15]. As lacunas de

Howship contadas foram aquelas próximas às células osteoclásticas, consideradas ativas.

Foi obtida a média de cada uma das variáveis estudadas para cada espécime do estudo.

As lâminas coradas por Picrossirius foram analisadas sob microscopia de luz

polarizada com aumento original de 100X. O colágeno maduro apresenta birrefringência

intensa, de coloração entre amarelo e vermelho, enquanto o colágeno imaturo produz

coloração esverdeada sob microscopia de luz polarizada [16]. A análise foi realizada por

meio do software 4,5 Image Pro-Plus

(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA), que

calculou a porcentagem de colágeno maduro e imaturo presente na matriz óssea adjacente

ao lado de tração. Foi analisado um campo para cada secção e obtida a média para cada

espécime.

Os valores obtidos foram analisados estatisticamente nos softwares SPSS 15.0 e

Statistica 7.0. Os testes Kolmogorov-Sminorv e Levene avaliaram a normalidade das

variáveis para cada tratamento (grupo x tempo) e a homogeneidade de variâncias entre os

tratamentos da amostra. Como os testes acusaram que as variáveis não apresentavam

distribuição normal e homogeneidade de variâncias entre os tratamentos, em seguida,

aplicou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparações

múltiplas não-paramétricas de Kruskal-Wallis. O nível de significância adotado foi p<0,05,

para comparar a média entre os tratamentos.

RESULTADOS

ANÁLISE QUALITATIVA

O estudo histológico demonstrou aspectos estruturais característicos entre os

diferentes grupos do estudo no decorrer de todo o período experimental.

Grupo controle (C)

O ligamento periodontal do grupo C apresentou-se, em todos os períodos

analisados, moderadamente vascularizado com largura uniforme. As fibras colágenas

mantiveram-se, em geral, paralelas entre si, com inserção perpendicular nas superfícies

óssea e cementária (Figuras 2A e 2B). No tecido ósseo, raras lacunas de Howship

associadas a células osteoclásticas ocasionais foram observadas.

Grupo controle com movimento dentário (CM)

No grupo CM foram analisadas as áreas de compressão e de tração do ligamento

periodontal. Nas áreas de compressão, no terceiro dia após a aplicação da força, notou-se

ampla desorganização das fibras colágenas. Numerosos vasos sanguíneos encontravam-se

distribuídos no ligamento, alguns deles dilatados e congestos (Figura 2C). O osso alveolar

mostrou-se irregular, com a presença de pequeno contingente de células osteoclásticas,

dispostas em lacunas de Howship ou justapostas à superfície óssea. Não foram visualizadas

áreas hialinas. No lado de tração, as fibras colágenas do ligamento estavam estiradas,

dispostas de forma mais organizada (Figura 2D). Observou-se predomínio de fibras

colágenas de coloração esverdeada, imaturas, entremeadas por fibras de cor vermelho-

amarelada, maduras, na matriz óssea adjacente ao lado de tração (Figura 4A).

No sétimo dia, no lado de compressão, o ligamento periodontal encontrava-se

alargado devido ao intenso processo de reabsorção. A superfície óssea adjacente ao

ligamento periodontal apresentava-se com grande número de lacunas de Howship

associadas à presença de diversas células osteoclásticas (Figura 2E). Não foi possível

visualizar áreas hialinas. Poucos vasos sanguíneos foram observados. No lado de tração, as

fibras colágenas do ligamento estavam estiradas, com organização característica (Figura

2F). Evidenciou-se maiores níveis de fibras colágenas com intensidade de coloração

vermelho-amarelada e birrefringência mais evidente na matriz óssea neoformada (Figura

4C).

Ao décimo quarto dia, os parâmetros histológicos estudados diminuíram seus níveis

de expressão. Poucas células osteoclásticas próximas às lacunas de Howship ou

justapostas à superfície óssea foram observadas (Figura 2G). No lado de tração, o

ligamento periodontal apresentava aspectos de retorno à normalidade (Figura 2H). O tecido

ósseo encontrava-se completamente preenchido por fibras de coloração vermelha e havia

um contingente maior das fibras espessas (Figura 4E).

Grupo dexametasona com movimento dentário (DM)

No grupo DM, foi possível notar níveis menores de expressão dos parâmetros

histológicos estudados quando comparado ao grupo CM.

No terceiro dia após a indução do movimento dentário, nas áreas em que o

ligamento foi comprimido, houve redução da sua espessura e desorganização das fibras

colágenas (Figura 3A). O tecido ósseo mostrou- se irregular, com ausência de lacunas de

Howship e células osteoclásticas ocasionais, que foram visualizadas justapostas à superfície

do osso alveolar. Não foi possível detectar áreas hialinas. No lado de tração, as fibras

colágenas do ligamento estavam estiradas, com disposição paralela e oblíqua entre si.

Alguns vasos sanguíneos distribuídos em toda a extensão foram observados (Figura 3B).

Observou-se predomínio de fibras de cor esverdeada e fibras pouco espessas, de coloração

vermelho- amarelada na matriz óssea adjacente ao lado de tração (Figura 4B).

Observou-se, no sétimo dia, que nas áreas de compressão, as fibras colágenas

encontravam-se desorganizadas, e o tecido ósseo irregular, com algumas lacunas de

Howship e células osteoclásticas (Figura 3C). Não foi possível detectar áreas hialinas. No

lado de tração, as fibras colágenas do ligamento estavam estiradas e havia poucos vasos

sanguíneos (Figura 3D). Notou-se predomínio de fibras de cor esverdeada, dispostas em

várias direções, com birrefringência irregular, na matriz óssea neoformada (Figura 4D).

Ao décimo quarto dia, nas áreas de compressão, as fibras colágenas ainda

encontravam-se desorganizadas (Figura 3E), e poucas lacunas de Howship e células

osteoclásticas foram visualizadas. No lado de tração, as fibras colágenas estavam estiradas

(Figura 3F). Notou-se finas fibras de cor vermelho-amarelada e de cor esverdeada

distribuídas de forma similar, mas com padrão organizacional da matriz colagênica do tecido

ósseo ainda difuso (Figura 4F).

ANÁLISE QUANTITATIVA

As médias, desvios-padrão e valores p obtidos estão descritos nas tabelas 1 e 2.

No terceiro dia após a indução do movimento dentário, o teste de comparações

múltiplas não-paramétricas de Kruskall-Wallis identificou existir diferença significante entre

os grupos C x CM (p<0,01) e CM x DM (p<0,01) em relação aos parâmetros células

osteoclásticas e lacunas de Howship. Nos vasos sanguíneos, observou-se diferença

significante entre os grupos CM x DM (p<0,01), com médias e desvios-padrão 25,5±1,95 e

7,6±1,5, respectivamente.

No sétimo dia, notou-se diferença significante entre os grupos C x CM (p<0,001) no

que diz respeito às células osteoclásticas e lacunas de Howship, que apresentaram médias

e desvios-padrão 0,5±0,7 e 0,3±0,48, respectivamente, no grupo C, e 16,9±3,34 e

17,8±2,57C no grupo CM. Entre os grupos C x DM, houve diferença significante (p<0,05) em

todos os parâmetros analisados. Quanto à deposição de colágeno maduro e imaturo,

observou-se diferença significante entre os grupos CM x DM (p<0,01). As médias e desvios-

padrão para o colágeno imaturo foi de 61,7±4,29 no grupo CM e 90,8±3,11 no grupo DM.

No décimo quarto dia, houve diferença significante entre os grupos C x CM (p<0,05)

e C x DM (p<0,001) em relação aos vasos sanguíneos.

DISCUSSÃO

Uma reação inflamatória aguda e estéril inicia imediatamente após a aplicação da

força ortodôntica. Células e fibras colágenas são comprimidas e estiradas, nos lados de

compressão e tração, respectivamente. O processo biológico prossegue com o

recrutamento de osteoclastos e osteoblastos e remodelação do osso alveolar [1].

No grupo CM, observou-se que o número de vasos sanguíneos aumentou em

relação ao grupo C no terceiro dia após a indução do movimento dentário, em toda a

extensão do ligamento periodontal. Esse resultado corrobora com Ren et al. [17], que

demonstraram que a aplicação de força ortodôntica em ratos aumenta a vascularização no

ligamento periodontal, de forma similar nos lados de tração e compressão, nas fases iniciais

do movimento. O aumento do número de vasos sanguíneos e da permeabilidade capilar

favorece a produção de moléculas sinalizadoras e maior migração de células precursoras

dos osteoclastos [1] e osteoblastos [18].

As citocinas desempenham importante função na quimiotaxia, cito-diferenciação e

ativação dos osteoclastos [1,19]. Investigações clínicas têm demonstrado que interleucina 1-

β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), IL-6 e IL-10 estão em concentração elevada

no fluido crevicular gengival e no ligamento periodontal de pacientes em tratamento

ortodôntico [3,20]. IL-1 e TNF-α são típicos mediadores da resposta inflamatória envolvidos

no processo de reabsorção óssea [19].

As prostaglandinas, por sua vez, têm sido associadas ao aumento do número de

osteoclastos [21] e estímulo à diferenciação de osteoblastos [1].

Outro mediador frequentemente envolvido no movimento ortodôntico é o fator de

crescimento transformador-β (TGF-β), conforme demonstrado por Garlet et al. [20]. O TGF-

β1 exerce função importante ao recrutar precursores de osteoblastos e estimular sua

diferenciação, além de favorecer a produção de proteínas da matriz óssea e mineralização

[21].

A dexametasona é um análogo sintético da hidrocortisona utilizado pela sua potente

ação antiinflamatória em diversos processos patológicos, como rinites alérgicas, asma

brônquica, bursites agudas, crises agudas de artrite reumatóide e colites. Além disso, esta

droga é comumente prescrita após procedimentos cirúrgicos bucais, como em cirurgias de

terceiros molares e caninos inclusos pela capacidade de reduzir edema e dor.

O mecanismo de ação antiinflamatório dos corticosteróides é diverso. Citam-se

diminuição da migração celular para o foco inflamatório, alteração da atividade de fatores de

crescimento, como o TGF-β1 [22], inibição da transcrição do gene da ciclooxigenase-2

(COX-2) e maior síntese da lipocortina 1, que por sua vez inibe fosfolipase A

e diminui

consequentemente a produção de prostaglandinas e leucotrienos [23].

Ademais, os corticosteróides inibem a produção e ação de citocinas, a saber IL-1, IL-

2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-8 [23,24]. Lee et al. [25] demonstraram in vitro a ação inibitória da

dexametasona sobre a expressão do RNAm da IL-8 em células do ligamento periodontal

obtidas a partir de pacientes tratados ortodonticamente. Segundo Hübner et al. [26], a

dexametasona inibe a expressão de IL-1α, IL-1β e TNF- α no reparo de feridas em

camundongos.

A ação da dexametasona sobre o tecido ósseo é motivo de controvérsia. Para

Pharoah e Heersche [11], esta droga reduz de forma dose-dependente o número de células

multinucleadas semelhantes à osteoclastos em cultura de células da medula óssea de

gatos, enquanto Hofbauer et al. [12] e Swanson et al. [9] defendem que os corticosteróides

estimulam a reabsorção óssea in vitro, em tempo e concentração dependentes, via aumento

da atividade e/ou da formação de osteoclastos [9]. A osteoporose e a reabsorção óssea têm

sido associadas ao hiperparatireoidismo secundário induzido pelos corticosteróides [23].

Ong et al. [27] relatam que a ação desta droga pode prejudicar a formação dos osteoblastos

a partir de células osteoprogenitoras e diminuir a síntese de colágeno por osteoblastos

maduros.

A atuação da dexametasona sobre o movimento dentário induzido in vivo não foi

elucidada, embora alguns estudos demonstrem a ação de outros corticosteróides

[5,27,28,29].

No presente estudo, no grupo DM, observou-se diminuição do número de vasos

sanguíneos (p<0,01), células osteoclásticas (p<0,01) e lacunas de Howship (p<0,01) em

relação ao grupo CM no terceiro dia após a aplicação da força ortodôntica. No sétimo dia,

ainda foi possível notar diminuição destas variáveis, mas sem diferença estatisticamente

significante (p>0,05). Observou-se, portanto que a dexametasona foi capaz de inibir os

parâmetros relacionados à reabsorção óssea durante o movimento dentário induzido em

ratos. Esses resultados foram consistentes com os de Ong et al. [27], que observaram após

doze dias de movimentação dentária em ratos submetidos à ação da prednisolona (1mg/kg),

menos células TRAP-positivas no lado de compressão. Yamane et al. [28], ao administrar

hidrocortisona (10mg/kg/dia) em ratos por um período de sete dias antes da indução do

movimento dentário, observaram menor quantidade de movimentação dos primeiros e

segundos molares superiores.

Com o objetivo de avaliar a possível ação do acetato de cortisona sobre o movimento

dentário em coelhos, Ashcraft et al. [29] administraram esta droga na dosagem de 15 mg/kg,

quatro dias antes e durante o período experimental de quatorze dias. Observou-se taxa

aumentada de movimento dentário no grupo tratado com a droga, cerca de três a quatro

vezes mais, além de histologicamente notar-se maior reabsorção óssea.

Kalia et al. [5] administraram metilprednisolona a 8mg/kg/dia de forma aguda e

crônica e observaram resultados diferentes entre os dois grupos. No grupo agudo, houve

redução na porcentagem de reabsorção, enquanto que no crônico a taxa de movimento

dentário aumentou, em função da indução de hiperparatireoidismo secundário.

Nota-se, portanto, que os corticosteróides podem produzir efeitos antagônicos sobre

a reabsorção óssea durante o movimento dentário induzido. De acordo com Ong et al. [27],

essas diferenças podem ser explicadas pelas variações nas espécies de animais estudadas,

magnitude de força utilizada, dosagem, período de administração e potência da droga.

Neste estudo buscou-se também avaliar as mudanças estruturais na matriz

trabecular óssea neoformada quando aplicadas simultaneamente força ortodôntica e

dexametasona. Pelo método de Picrossirius e luz polarizada, é possível detectar os

colágenos maduro e imaturo e correlacionar a distribuição tridimensional das fibras

colágenas com o estágio de formação óssea [16]. Sabe-se que a coloração e a intensidade

da birrefringência do colágeno variam a depender do seu grau de polimerização, que por

sua vez reflete a idade e o diâmetro das fibras. Num estágio precoce da síntese, o colágeno

é depositado como finas fibrilas, que se tornam cada vez mais unidas até formar fibras mais

largas ou até mesmo feixes [30].

A matriz orgânica do osso alveolar é composta fundamentalmente por colágeno tipo I

(95% da matriz orgânica), além de proteoglicanas e glicoproteínas [31]. A neoformação

óssea resulta de eventos complexos e inter-dependentes, que envolvem desde a

diferenciação dos osteoblastos a partir de células mesenquimais primitivas, a síntese da

matriz orgânica, sua maturação, até completa mineralização [32].

Neste estudo, no grupo DM, observou-se que a porcentagem de colágeno maduro foi

menor em todos os períodos analisados, com diferença significante no sétimo dia (p<0,01).

No décimo quarto dia, ainda havia fibras colágenas imaturas na trabécula óssea

neoformada, dispostas em um padrão organizacional difuso, mas sem diferença

estatisticamente significante em relação ao grupo CM (p>0,05). Desta forma, nota-se que a

dexametasona foi capaz de atrasar o processo de maturação das fibras colágenas

presentes na matriz óssea neoformada. Esses resultados corroboram com os de Ashcraft et

al. [29] e Kalia et al. [5], que observaram atraso na neoformação óssea quando utilizaram

corticosteróides em animais submetidos ao movimento dentário induzido.

Reis et al. [10] demonstraram, em estudo com microscopia de luz polarizada, que a

dexametasona inibiu a síntese de colágeno em feridas cutâneas induzidas no dorso de

ratos. Coelhos que sofreram injúrias em tendões e que foram tratados com betametasona

apresentaram na área lesionada poucos fibroblastos e baixa síntese de colágeno tipo III

[33]. Em outro estudo, o reparo de úlceras induzidas em ratos e tratadas com doses

fracionadas de dexametasona sofreu atraso, de forma dose-dependente, em função de uma

menor produção de prostaglandinas e de fatores angiogênicos, importantes para

cicatrização [8]. Embora estes trabalhos tenham sido conduzidos com o objetivo de avaliar o

reparo de injúrias teciduais, corroboram com o presente estudo, pois demonstraram a ação

inibitória dos corticosteróides sobre o metabolismo do colágeno.

Diante da interpretação dos resultados desta pesquisa é possível sugerir que a

dexametasona inibiu o processo de reabsorção óssea no período inicial do movimento

dentário induzido dada sua potente ação antiinflamatória, via inibição de citocinas, como IL-

1α, IL-1β e TNF- α, prostaglandinas e fatores de crescimento (TGF-β1). Estes mediadores

químicos apresentam funções importantes no desencadeamento e regulação do movimento

ortodôntico como, por exemplo, no recrutamento de precursores de osteoclastos e de

osteoblastos [1,21]. Observou-se ainda atraso na maturação do colágeno presente na matriz

óssea neoformada. Como o movimento dentário induzido compreende uma série de eventos

sequenciais e orquestrados [1], a inibição de algum estágio inicial, como a

neovascularização, a diferenciação de osteoblastos ou até mesmo a síntese de colágeno

poderá afetar os eventos subseqüentes, e desta forma atrasar o processo de maturação do

colágeno durante a neoformação óssea.

A partir dos resultados desta pesquisa, recomenda-se que, nos pacientes em

tratamento ortodôntico associado à corticoterapia, os intervalos entre as consultas sejam

mais longos, já que há atraso no processo de remodelação óssea. Adicionalmente, torna-se

imperioso que os pacientes sejam questionados quanto ao uso dos corticosteróides durante

a anamnese.

CONCLUSÃO

A dexametasona inibiu a reabsorção óssea no período inicial do movimento dentário

induzido em ratos e atrasou o processo de maturação de colágeno na matriz óssea

neoformada.

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TABELAS

Parâmetros Dia CM

Células osteoclásticas 3 6,3±1,33

7 16,9±3,34

14 3,3±1,05

Lacunas de

Howship

3 6,5±1,95

7 17,8±2,57

14 3,9±1,19

Vasos Sanguíneos

3 25,5±1,95

7 7,1±1,44

14 3,1±1,19

TABELA 1 - MÉDIAS, DESVIOS-PADRÃO E VALORES p, SEGUNDO GRUPOS E DIAS, PUCPR-2008

3,7±2,8614,9±2,18

0,4±0,51 0±0

5,8±3,73

2,1±1,59

0,3±0,48

**CM x DM

*C x DM

*C x CM, ***C x DM

7,6±1,5

0,5±0,70

14,8±2,04

14,6±1,26

1,6±2,17

0,7±0,94 2±2,26

**C x CM, **CM x DM

***C x CM, *C x DM

Média±DP

0,5±0,7 7,5±2,9 ***C x CM, *C x DM

DMC

0,6±0,84 0,7±0,94

Diferença entre os grupos

**C x CM, **CM x DM

Média±DP Média±DP

FONTE: dados da pesquisa

NOTA: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 indicam diferença estatisticamente significante

LEGENDA: C = controle / CM = controle com movimento / DM = dexametasona com movimento /

NS = não significante

Parâmetros Dia CM

Média±DP

% Colágeno maduro 3 10,5±2,83

7 38,3±4,29

14 100±0

% Colágeno imaturo 3 89,5±2,83

7 61,7±4,29

14 0±0

LEGENDA: C = controle / CM = controle com movimento / DM = dexametasona com movimento /

55,7±2,58 NS

NS = não significante

FONTE: dados da pesquisa

NOTA: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 indicam diferença estatisticamente significante

94,5±2,06 NS

90,8±3,11 **CM x DM

44,3±2,58 NS

5,5±2,06 NS

9,2±3,11 **CM x DM

TABELA 2 - MÉDIAS, DESVIOS-PADRÃO E VALORES p, SEGUNDO GRUPOS E DIAS, PUCPR-2008

DM Diferença entre os grupos

pMédia±DP

FIGURAS

Figura 1

14 dias

3 dias

7 dias

Controle com

movimento

Mesial Distal

Figura 2

Controle

CEM

Dexametasona com movimento

Distal Mesial

CEM

OA CEM

14 dias

7 dias

3 dias

Figura 3

dias

CEM

dias

CEM

dias

CEM

14 dias

Controle com movimento

Dexametasona com movimento

Figura 4

7 dias

3 dias

CEM

LEGENDAS

Figura 1: Aspectos intrabucais da mola ortodôntica utilizada para induzir o movimento dentário nos 1

molares superiores direitos nos ratos.

Figura 2: Fotomicrografias das raízes mésio-vestibulares dos 1

molares superiores referentes aos

grupos controle e controle com movimento (HE). A,B: lados distal e mesial. C,E,G: lado de

compressão nos períodos de 3, 7 e 14 dias. D,F,H: lado de tração nos períodos de 3, 7 e 14 dias. OA,

osso alveolar; CEM, cemento; LP, ligamento periodontal; VS, vasos sanguíneos; OC, células

osteoclásticas (aumento original 400X).

Figura 3: Fotomicrografias das raízes mésio-vestibulares dos 1

molares superiores referentes ao

grupo dexametasona com movimento (HE). A,C,E: lado de compressão nos períodos de 3, 7 e 14

dias. B,D,F: lado de tração nos períodos de 3, 7 e 14 dias. OA, osso alveolar; CEM, cemento; LP,

ligamento periodontal; VS, vasos sanguíneos; OC, células osteoclásticas (aumento original 400X).

Figura 4: Fotomicrografias das raizes mésio-vestibulares dos 1

molares superiores referentes aos

grupos controle com movimento e dexametasona com movimento (Picrossirius). A,C,E: lado de

tração nos períodos de 3, 7 e 14 dias. B,D,F: lado de tração nos períodos de 3, 7 e 14 dias. OA, osso

alveolar; CEM, cemento; LP, ligamento periodontal (aumento original 100X).

2. ARTIGO EM INGLÊS

THE EFFECT OF DEXAMETHASONE ON ORTHODONTIC TOOTH MOVEMENT IN RATS.

Luégya Amorim Henriques Knop

Pontifical Catholic University of Paraná (PUCPR)

Orlando Motohiro Tanaka

Pontifical Catholic University of Paraná (PUCPR)

Maria Ângela Naval Machado

Pontifical Catholic University of Paraná (PUCPR

Correspondence to:

Prof. Dr. Orlando Tanaka

Mestrado em Odontologia

Rua Imaculada Conceição, 1155

Phone: 55 41 3271-1637 / Fax 55 41 3271-1405

80215-901 – Curitiba-PR

BRAZIL

e-mail:[email protected]m

ABSTRACT

THE EFFECT OF DEXAMETHASONE ON ORTHODONTIC TOOTH MOVEMENT IN RATS

The early phase of orthodontic tooth movement involves sterile acute inflammation of the

periodontal ligament in response to biomechanical forces. Corticosteroids are potent anti-

inflammatories widely used in medical and dentistry clinics. The aim of this study was to

analyze the effect of steroids on bone remodeling during orthodontic movement. To this end,

male Wistar rats (n=60) were randomly divided into 3 groups: C (control without orthodontic

movement), CM (control with orthodontic movement) and DM (dexamethasone with

orthodontic movement). The animals in groups C and CM received 0.9% saline solution and

the DM group received phosphate disodic dexamethasone DEXANIL

(2 mg/kg). Animals

were sacrificed 3, 7 and 14 days after the placement of orthodontic appliances. The upper

first molar periodontal ligament was processed histologically. We quantified the blood

vessels, Howship’s lacunae and osteoclast-like cells present on the tension and compression

sides. Bone formation was evaluated under a polarized light microscope and the 4.5 Image

Pro-Plus

software was used to calculate the percentage of immature/mature collagen

present. The non-parametric Kruskal-Wallis test revealed fewer blood vessels, Howship’s

lacunae and osteoclast-like cells in periodontal ligaments from the DM group as compared to

the CM group (p<0.01) on the third day after force application. On the seventh day, there was

a lower mature collagen percentage in the DM group (p<0.01). These data demonstrate that

dexamethasone inhibits bone resorption during the initial period of orthodontic movement

and delays collagen maturation on developed bone matrix.

KEYWORDS: orthodontic tooth movement, histology, bone resorption, bone formation,

dexamethasone

INTRODUCTION

The early phase of orthodontic tooth movement always involves an acute

inflammatory response, characterized by periodontal vasodilatation and migration of

leucocytes out of the capillaries. These migratory cells produce various cytokines, the local

biomechanical signal molecules that interact with the entire population of native paradental

cells. Cytokines evoke the synthesis and secretion of numerous mediators by target cells,

including growth factors, prostaglandins and other cytokines [1]. Subsequent biological

events occur and result in bone remodeling to accommodate movement of the tooth [2,3].

Bone resorption and bone formation are parts of the remodeling process during

orthodontic tooth movement. Bone is deposited on the alveolar wall on the tension side of the

tooth with both heavy and light forces, and newly formed bone spicules follow the orientation

of the periodontal fiber bundles. On the pressure side, with light forces, alveolar bone is

resorbed directly by numerous osteoclasts in Howship’s lacunae [4].

It has been demonstrated that orthodontic tooth movement may be influenced by

general and local administration of pharmaceutical agents [5].

Corticosteroids are potent immunosuppressive and anti-inflammatory agents

prescribed for inflammatory processes, although their long-term use is associated with

secondary osteoporosis in vivo [6].

Dexamethasone, a potent steroid anti-inflammatory, inhibits prostaglandin and

leukotriene release through A

phospholipase down-regulation [7,8] and alters growth factors

(e.g., TGF-β1) activity [9]. These effects delay gastric ulcer repair in rats [8] and decrease

collagen synthesis in cutaneous wounds [10].

The effect of corticosteroids on bone components remains to be elucidated. Pharoah

and Heersche [11] suggest that dexamethasone inhibits the formation of osteoclasts, while

Hofbauer et al. [12] and Swanson et al. [9] maintain that dexamethasone increases

osteoclastogenesis and stimulates bone resorption.

Due to the increasing prevalence of allergies and diseases requiring corticosteroid

treatment observed in medical and dentistry clinics, it can be anticipated that a significant

number of orthodontic patients will present abnormal bone turnover following treatment with

this steroid [5], requiring modified orthodontic treatment.

The aim of this study was to investigate the effect of dexamethasone on bone

remodeling during orthodontic movement in rats.

MATERIALS AND METHODS

The research was approved by the Ethics Committee for Animals of PUCPR (#69.07)

according to the guiding principles outlined in the “Care and Use of Animals”.

Sixty 3-month male Wistar rats were used in this study. Animals were kept in

polycarbonate boxes at temperatures between 19°C and 22°C, with a standard 12-hour light-

dark cycle. They were fed a diet of finely ground laboratory food ad libitum to minimize any

discomfort to the animal following orthodontic appliance insertion.

The rats were divided into three groups; group C (control, without orthodontic

appliances); CM (control, with orthodontic appliances); and DM (dexamethasone with

orthodontic appliances). The C and CM groups received 0.9% saline solution at 0.5ml/kg

every 24 hours to simulate stress, via injection. The DM group received a daily dose of 2

mg/kg disodic phosphate dexamethasone (DEXANIL

, Lab. Ducto Indústria Farmacêutica

Ltda., Anápolis-GO, Brazil), intramuscularly. The dosage was based on the study by

Thompson et al. [13]. The pharmacological treatment began one day before orthodontic

appliance insertion and was not reinitiated during the experimental period.

The study focused on the mesio-buccal roots of maxillary first molars. The right hemi-

maxillae was used for the CM and DM groups and the left hemi-maxillae was used for the C

group, according to Kalia et al. [5] and Bletsa et al. [14].

The orthodontic movement was produced by a nickel-titanium closed-coil spring

(G&H

Wire Company REF CCOF9XL, Hanover, Germany), that applied a reciprocal force of

30gf magnitude between the maxillary right first molar and central incisors, measured using a

Dynamometer gauge (Dentaurum, #1005004). The coil spring was inserted while the animal

was sedated by an intramuscular injection of 1.8 mg/kg ketamine (Vetanarcol

, Konig,

Argentina) and 1.1 mg/kg xylazine (Rompun

, Bayer, Brazil).

Following euthanasia with ketamine (5.4 mg/kg) via intraperitoneal injection on days

3, 7 or 14, maxillae were immediately removed and fixed in 10% neutral formalin for 72

hours. The specimens were decalcified for approximately 12 weeks in a 4.13% EDTA

aqueous solution. Transversal cuts of 4-µm thickness were obtained and stained using

conventional methodology. Sixteen cuttings were obtained from the alveolar crest to the

apices of each specimen; twelve were stained with hematoxylin-eosin (HE) and four were

stained with picrosirius.

The histological study was performed by one researcher, blinded to treatment group.

Osteoclast-like cells, active Howship’s lacunae and blood vessels were quantified under

x400 magnification using a light microscope. The histological criterion to identify osteoclast-

like cells was the presence of multinuclear and eosinophilic cells on the bone surface [15].

Histological sections stained by the picrosirius method were viewed at x100

magnification under a polarized light microscope. This method allows an indirect evaluation

of the stage of bone matrix organization, based on birefringence of the collagen fiber bundles

[16]. The analysis was performed by 4.5 Image Pro-Plus

software (Media Cybernetics,

Silver Spring, MD, USA), which calculated the percentages of immature and mature collagen

present on bone matrix close to the tension side.

The mean values obtained were analyzed statistically by the SPSS 15.0 and

Statistica 7.0 software programs. Kolmogorov-Sminorv and Levene tests evaluated treatment

normality and homogeneity. For intergroup comparisons, the Kruskal-Wallis non-parametric

multiple comparisons test was used with a level of significance at p<0.05.

RESULTS

HISTOLOGY

The histological study demonstrated characteristic structural aspects among the

various groups throughout the experimental period.

Control Group (C)

The periodontal ligament showed moderate vascularization with uniform width. The

collagen fibers presented in a parallel fashion and inserted perpendicular to the cementum

and bone surface. On the bone surface, Howship’s lacunae were rarely observed, in

association with osteoclast-like cells.

Control with orthodontic movement group (CM)

In the sections of these samples, at day 3, collagen fibers were elongated on the

tension side and compressed and completely disorganized on the compression side. We

also observed angiogenesis with congested vessels (Figure 1A). The compression side

showed irregular alveolar bone due to a small population of osteoclast-like cells localized in

Howship’s lacunae. No hyalinized areas were present. Under polarized light, the bone matrix

demonstrated a predominance of immature, greenish fibers and a few yellowish-orange

fibers.

At day 7, the compression side showed evidence of an active resorption process,

including the accumulation of osteoclast-like cells associated with numerous Howship’s

lacunae (Figure 1C). On the tension side, the fibers were elongated and better organized.

We observed thicker and yellowish-orange collagen fibers in more compact areas (Figure

1E). At day 14, on the compression side, we observed few osteoclast-like cells and

Howship’s lacunae. On the tension side, the periodontal ligament appeared normal. The

bone matrix formed was completely filled by thick red collagen fibers.

Dexamethasone with orthodontic movement group (DM)

On day 3, we examined the compression and tension sides. The periodontal ligament

on the compression side displayed almost no osteoclast-like cells or Howship’s lacunae

(Figure 1B). No hyalinized zones were present. On the tension side, the periodontal ligament

fibers were elongated, oriented parallel to the root. Some blood vessels were visible. Under

polarized light, we observed a predominance of thin greenish fibers in the bone matrix. At

day 7, the compression side showed disarranged collagen fibers and irregular bone tissue,

with some Howship’s lacunae and osteoclast-like cells (Figure 1D). On the tension side, the

fibers were elongated and fewer blood vessels were visible. We observed a predominance of

greenish collagenous fibers, extending in several directions, with irregular birefringence

(Figure 1F). At day 14, on the compression side, the periodontal ligament fibers were still

disorganized, exhibiting few Howship’s lacunae and osteoclast-like cells. The bone matrix

presented greenish and yellow-orange fibers distributed in a similar way and in a diffuse

pattern.

QUANTITATIVE ANALYSIS

All means, standard-deviations (SD) and p-values obtained are described in Tables 1

and 2.

Kruskal-Wallis non-parametric multiple comparisons showed significant differences in

the number of osteoclast-like cells and Howship’s lacunae on day 3 in the C group, as

compared to the CM group (p<0.01), as well as between numbers observed in the CM group

as compared to the DM group (p<0.01). There was also a significant difference in the

quantity of blood vessels visible in the CM group as compared to the DM group (p<0.01),

with mean and SD of 25.5±1.95 and 7.6±1.5, respectively.

At day 7, we found a significant difference between the C and CM groups (p<0.001) in

terms of osteoclast-like cells and Howship’s lacunae. All parameters studied varied

significantly between the C and DM groups. The proportion of mature collagen as opposed to

immature collagen varied significantly among the CM and DM groups (p<0.01).

At day 14, area density of the vasculature varied significantly among the C and CM

groups (p<0.05), as well as between the C and DM groups (p<0.001).

DISCUSSION

Cellular and tissue inflammatory reactions start during the initial phase of orthodontic

movement, immediately after force application. Cells and collagen fibers are elongated and

compressed on the tension and compression sides, respectively. This biological process

triggers the recruitment of osteoblasts and osteoclasts, as well as bone remodeling [1].

In our investigation, area density of the vasculature increased in the CM group when

compared to the C group, after 3 days of force application. This result is supported by Ren et

al. [17], who demonstrated that force application in rats results in increased vascularity on

both the tension and compression sides. Vascularity and permeability increased, resulting in

the release of biomechanical signal molecules followed by osteoclast [1] and osteoblast

precursor migration [18].

Cytokines play an important role in osteoclast chemoattraction, differentiation and

activation [1,19]. Clinical investigations have demonstrated elevated expression levels of

interleukin1-β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6 and IL-10 in gingival crevicular

fluid and periodontal ligaments during orthodontic tooth movement in humans [3,20]. IL-1 and

TNF-α are the typical mediators involved in the bone resorption process [19]. Prostaglandins

have been associated with increased numbers of osteoclasts [21] as well as enhanced

osteoblast differentiation [1]. Another mediator involved in orthodontic movement is

transforming growth factor-β (TGF-β), as demonstrated by Garlet et al. [20]. TGF-β1

enhances the recruitment of osteoblast precursors, speeds differentiation, and stimulates the

production of protein in the bone matrix as well as mineralization [21].

Dexamethasone is a synthetic analogue of hydrocortisone used to treat many

pathological processes due to its potent anti-inflammatory effect. Allergy, asthma, bursitis,

rheumatoid arthritis are all diseases treated with this corticosteroid. Furthermore, this drug is

commonly prescribed after oral surgery procedures (including those on third molars and

canines) because of its ability to reduce pain and edema.

The corticosteroid anti-inflammatory mechanism is complex, thought to include:

decreased cellular migration to the inflammatory focus; altered growth factor (e.g. TGF-β1)

activity [22]; inhibition of COX-2 gene transcription; increased lipocortine 1 synthesis, and

consequent inhibition of A

phospholipase, as well as the release of leukotrienes and

prostaglandins [23].

Furthermore, corticosteroids inhibit the production and activity of interleukins, such as

IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-8 [23,24]. Lee et al. [25] demonstrated in vitro that

dexamethasone inhibits IL-8 mRNA expression in periodontal ligament cells obtained from

orthodontically-treated patients. According to Hübner et al. [26], dexamethasone inhibits IL-

1α, IL-1β and TNF- α expression during injury repair in mice.

The effect of dexamethasone on bone tissue remains unclear. Pharoah and Heersche

[11] reported that this drug reduces, in a dose-dependent manner, the number of osteoclast-

like cells in cat bone marrow cultures; Hofbauer et al. [12] and Swanson et al. [9] affirm that

corticosteroids stimulate in vitro bone resorption via osteoclast activity and/or increased bone

formation [9]. Osteoporosis and bone resorption have been associated with secondary

hyperparathyroidism induced by corticosteroids [23]. Ong et al. [27] maintain that this drug

may be harmful to the formation of osteoblast precursors and decrease collagen synthesis by

mature osteoblasts.

The effect of dexamethasone on induced orthodontic movement in vivo has not been

elucidated, although some studies have evaluated other effects of corticosteroids

[5,27,28,29].

Our results demonstrated a lower number of blood vessels (p<0.01), osteoclast-like

cells (p<0.01) and Howship’s lacunae (p<0.01) in the DM group as compared to the CM

group, on the third day after force application. On day 7, these variables were still decreased,

but without a statistically significant difference. We also observed that dexamethasone

inhibits parameters related to bone resorption during the initial period of orthodontic

movement. These results are in agreement with those of Ong et al. [27], who observed lower

numbers of TRAP-positive cells on the compression side after twelve days of tooth

movement in rats treated with prednisolone (1mg/kg). Yamane et al. [28] recorded the rate of

mandibular first and second molar movement in rats treated with hydrocortisone

(10mg/kg/day) for seven days.

Ashcraft et al. [29] evaluated the effect of 15 mg/kg cortisone acetate on orthodontic

movement in rabbits and observed that the mean incremental active tooth movement was

three to four times greater in the treatment rabbits than in the controls.

Kalia et al. [5] used methylprednisolone (8mg/kg/day) for chronic and acute treatment;

they observed different results among these groups. In the acute treatment group, the

authors observed a reduced percentage of resorption. In the chronic treatment group, the

rate of tooth movement increased, due to secondary hyperparathyroidism.

Thus, it is observed that corticosteroids may produce antagonistic effects upon bone

resorption during tooth movement. For Ong et al. [27], these differences may be explained by

variations among the animal species studied; forces used to move teeth, experimental

durations; dosages; time intervals of administration; and the potency of the steroids used.

In this study, we evaluated structural changes in the bone matrix formed when

dexamethasone and orthodontic force were applied simultaneously. The picrosirius-

polarization method allows researchers to detect mature and immature collagen. This

method also allows the three-dimensional distribution of collagen fibers to be correlated with

the stage of bone formation [16]. Collagen color and birefringence vary according to

polymerization degree, which reflects fiber age and diameter. The collagen is first deposited

as thin fibrils that aggregate to form larger fibers or bundles [30].

The organic matrix of alveolar bone is composed fundamentally of type I collagen

(95%), proteoglycans and glycoproteins [31]. Bone formation results from complex and inter-

dependent processes that involve osteoblast differentiation from primitive mesenchymal

cells, organic matrix synthesis and maturation, until mineralization is completed [32].

In the DM group of this study, we observed that the mature collagen percentage was

lower in all analyzed periods, with a statistically significant difference observed on day 7

(p<0.01). On day 14, there were still immature fibers in the matrix, in a diffuse organizational

pattern. Thus, we observed that dexamethasone was able to delay collagen fiber maturation.

These results support findings by Ashcraft et al. [29] and Kalia et al. [5], who observed a

delay in bone formation when corticosteroids were administered to animals submitted to

orthodontic movement.

Reis et al. [10] demonstrated, in a study utilizing polarized light microscopy, that

dexamethasone inhibits collagen synthesis in the cutaneous wounds of rats. Rabbits that

suffered tendon injuries and were treated with betamethasone presented few fibroblasts and

low type III collagen synthesis [33]. In another study, gastric ulcers treated with

dexamethasone presented delay, in a dose-dependent pattern, because of lower

prostaglandin and angiogenic factor production [8]. Although these works have aimed to

evaluate tecidual injury repair, they are in agreement with our results demonstrating the

inhibitory effects of corticosteroids on collagen metabolism.

Based upon our results, it is possible that dexamethasone inhibited the bone

resorption process during the initial period of orthodontic movement via potent anti-

inflammatory action, inhibiting cytokines (like IL-1α, IL-1β and TNF- α), prostaglandins and

growth factors (like TGF-β1). These chemical mediators trigger and regulate orthodontic

movement, for example, through the recruitment of osteoblast and osteoclast precursors

[1,21]. We observed a delay in the emergence of mature collagen fibers throughout the

matrix. Orthodontic movement comprises complex orchestrated events [1]; by inhibiting

some initial stage such as neovascularization, osteoblast differentiation or collagen

synthesis, other stages like collagen maturation may be delayed during bone formation.

The present study recommends that in patients treated with corticosteroids, clinical

appointments should be scheduled with longer intervals, as bone turnover will be delayed.

Additionally, the patients should be questioned in relation to drug use during anamnesis.

In conclusion, we showed that dexamethasone inhibits bone resorption during the

initial period of orthodontic tooth movement in rats and delays the collagen maturation

process in developed bone matrix.

REFERENCES