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FLÁVIA MORATO
Avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes químicos utilizando a
técnica de cultivo em camada de ágar Middlebrook 7H11
São Paulo
2007
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FLÁVIA MORATO
Avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes químicos
utilizando a técnica de cultivo em camada de ágar Middlebrook 7H11
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Epidemiologia Experimental e
Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Mestre em
Medicina Veterinária
Departamento:
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal
Área de concentração:
Epidemiologia Experimental e Aplicada às
Zoonoses
Orientadora:
Prof
a
. Dr
a
. Sônia Regina Pinheiro
São Paulo
2007
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FICHA DE AVALIAÇÃO
Nome: MORATO, Flávia
Título: Avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes químicos utilizando a técnica
de cultivo em camada de ágar Middlebrook 7H11
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Epidemiologia Experimental e
Aplicada às Zoonoses da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Medicina Veterinária
Data:___/___/___
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________ Instituição____________________
Assinatura__________________ Julgamento___________________
Prof. Dr. ___________________ Instituição____________________
Assinatura__________________ Julgamento___________________
Prof. Dr. ___________________ Instituição____________________
Assinatura__________________ Julgamento___________________
Dedico
Aos meus pais,
José Petrônio (in memoriam)
e Ivone
AGRADECIMENTOS
À Professora Sônia Regina Pinheiro, pela orientação, amizade, confiança e incentivo mesmo
nas etapas mais difíceis deste projeto.
Ao Professor Silvio Arruda Vasconcellos pelo acolhimento no Laboratório de Zoonoses
Bacterianas.
Ao Professor Ricardo Dias pela amizade, paciência e essencial apoio na análise estatística
dos resultados.
A Zenaide e à Gisele pela amizade, pela ajuda imprescindível na realização de todo o
experimento, pelo aprendizado, dedicação, sugestões e principalmente pela paciência.
À minha família (Lu & Lu e Marininha) pelo apoio, incentivo e companheirismo. As Tias
Glória e Paula pela presença e ajuda nas últimas etapas.
Ao Gustavo pelo companheirismo e carinho.
À amiga Amane pela ajuda técnica, emocial e incentivo desde o inicio dessa jornada.
Ao Bispo pela amizade e ajuda com as fotos do projeto.
A Jucélia pela ajuda com os resultaods estatíticos.
Ao Lincoln pela ajuda na formatação e Maria Clara pela ajuda na revisão.
À todos os amigos do Laboratório de Zoonoses Bacterianas: Viviane, Marianna, André,
Daniela, Paty, FlaviaCarol, Pilar, Pancho, Carlos, Dona Odete e aos estagiários e residentes
que passaram por lá.
Aos amigos do VPS: Alessandra, Iara, Sheila, Sandra, Danival, Cristina, Virginia, Sabrina,
Fernanda, Carol pelo companheirismo, apoio e incentivo, e por todos os inúmeros momentos
de diversão.
À FAPESP pela concessão da bolsa de mestrado, e apoio financeiro
para a
realização desta pesquisa.
Aos funcionários da Biblioteca pelas sugestões e ajuda crucial na conclusão deste trabalho.
RESUMO
MORATO, F. Avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes químicos
utilizando a técnica de cultivo em camada de ágar Middlebrook 7H11. [Evaluation of
mycobactericidal activity of chemical disinfectants using the Middlebrook 7H11 agar medium
technique]. 2007. xx f. Dissertação. (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Avaliou-se a atividade micobactericida de cinco desinfetantes químicos frente a uma estirpe
de Mycobacterium bovis isolada de caprinos, tipificada por PCR (polymerase chain reaction)
e com 32 dias de cultivo no meio de Stonebrink. O teste de desinfetantes foi realizado
utilizando-se a técnica de cultivo em camada delgada de ágar Middlebrook 7H11 modificado
e foi comparado ao teste em tubos com meio de Stonebrink, tradicionalmente utilizado no
laboratório de zoonoses bacterianas da FMVZ/USP. Os cinco desinfetantes ensaiados foram:
“A” : grupo controle; “B” - hipoclorito de sódio (2,5 % de cloro ativo); “C”- glutaraldeído (2
%); “D” – ácido peracético 0,25 % e peróxido de hidrogênio 5 %; “E” – iodóforo (2,6% de
iodo) e “F”- compostos fenólicos (orto-fenilfeno 12,243 g; orto-benzil paraclorofenol 11,080
g; para-terceário amilfeno 4,1222 g.). A diluição destes produtos foi feita conforme
recomendação do fabricante. Os meios de cultura adotados para o procedimento de
isolamento e preparo da suspensão bacteriana foram o meio de Stonebrink e o meio de
Middlebrook 7H11 modificado. Os testes foram realizados na presença e ausência de matéria
orgânica e à temperatura ambiente (21 ± 2°C) e à temperatura de 4 °C. Os resultados obtidos
nas contagens de colônias foram transformados em percentual de redução para análise
estatítica e demostraram que: a técnica de cultivo de micobactérias em camada delgada no
meio de Middlebrook 7H11 permitiu uma visualização precoce das micobactérias e se
mostrou viável para realização de testes de desinfetantes; os cinco tipos de desinfetantes
analisados apresentaram atividade micobactericida e o melhor desempenho foi obtido pelo
ácido peracético seguido pelo hipoclorito de sódio. A atividade micobactericida dos iodóforos
foi instisfatória na presença de matéria orgânica.
Palavras-chave: Desinfetantes; Mycobacterium bovis; tuberculose; Middlebrook; caprino.
ABSTRACT
MORATO, F. Evaluation of mycobactericidal activity of chemical disinfectants using the
Middlebrook 7H11 agar medium technique. [Avaliação da atividade micobactericida de
desinfetantes químicos utilizando a técnica de cultivo em camada de ágar Middlebrook
7H11]. 2007. xx f. Dissertação. (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
The mycobactericidal activity of five chemical disinfectants was evaluated against a strain of
Mycobacterium bovis isolated from a goat, typified by PCR (polymerase chain reaction) and
with 32 days of growth in the Stonebrink medium. The disinfectants were tested using the
modified thin layer Middlebrook 7H11 cultivation technique and it was compared to the test
made in tubes with Stonebrink medium, which is tradicionally used at the Bacterian Zoonosis
Laboratory of the Veterinary Medicice Faculty of the University of São Paulo. The five
disinfectants were: “A” was the control group; “B”- sodium hypochlorite (2,5% of active
chlorine); “C”- glutaraldehyde (2 %); “D”- peracetic acid (0,25 %) and hydrogen peroxide (5
%); “E” – iodine compounds (2,6%) e “F”- fenolic compounds (orto-fenilfeno 12,243 g; orto-
benzil paraclorofenol 11,080 g; para-terceario amilfeno 4,122 g.). The products were diluted
according to label instructions. The culture media used for the isolation procedure and
preparation of the bacterian suspension were the Stonebrink and modified Middlebrook
7H11 medium. The assays were performed either in the presence or absence of organic
matter, at temperatures of 4 °C and 21 ± 2°C The colony counting results were transformed
into reduction percentages for the statistical analysis and concluded in: the modified thin
layer Middlebrook 7H11 cultivation technique permitted an earlier visualization of the
colonies and was practible for the realization of the disinfectants tests; the five disinfectants
showed mycobactericidal activity and the peracetic acid had the best performance followed
by the sodium hypochlorite. The mycobactericidal activity of the iodine compound was
unsatisfactory when in the presence of organic matter.
Key-words: Disinfectants; Mycobacterium bovis, tuberculosis, Middlebrook; caprine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Placa de Petri com quadriculado e área de leitura demarcada (L) ... 34
Figura 2 - Colônias de M. bovis aos 7 dias de cultivo em meio de
Middlebrook 7H11 modificado. Visualização sob microscopia
óptica com aumento de 100 x ...........................................................
40
Figura 3 - Colônias de M. bovis aos 7 dias de cultivo em meio de
Middlebrook 7H11 modificado. Visualização sob microscopia
óptica com aumento de 100 x ...........................................................
40
Figura 4 -
Colônias de M. bovis aos 21 dias de cultivo em meio de
Stonebrink ........................................................................................
41
Figura 5 -
Colônias de M. bovis aos 28 dias de cultivo em meio de
Stonebrink ........................................................................................
41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Percentual de redução de crescimento de M.bovis em placas com 7H11,
segundo o princípio ativo do desinfetante químico, a temperatura de
contato, presença ou ausência de matéria orgânica. São Paulo –
2007...............................................................................................................
47
Tabela 2 - Percentual de redução de crescimento de M.bovis na superfície do meio
de Stonebrik em tubos, segundo o princípio ativo do desinfetante
químico, a temperatura de contato e presença ou ausência de matéria
orgânica. São Paulo – 2007..........................................................................
48
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio
7H11 na temperatura ambiente e ausência de matéria orgânica..........
49
Gráfico 2 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio
7H11 na temperatura ambiente e presença de matéria orgânica..........
49
Gráfico 3 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio
7H11 na temperatura de 4 °C e ausência de matéria orgânica............
50
Gráfico 4 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio
7H11 na temperatura de 4 °C e presença de matéria orgânica............
50
Gráfico 5 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de
Stonebrink na temperatura ambiente e ausência de matéria orgânica..
51
Gráfico 6 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio
7H11 na temperatura ambiente e presença de matéria orgânica..........
51
Gráfico7 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de
Stonebrink na temperatura de 4 °C e ausência de matéria orgânica....
52
Gráfico 8 - Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de
Stonebrink na temperatura de 4 °C e presença de matéria orgânica.
52
LISTA DE ABREVIATURAS
%:
Por cento
°
C: Graus Celsius
µL: Microlitro
AFNOR: Association Française de Normalization
AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome
AOAC: Association of Official analytical chemists
cm: Centímetro
cmo: Com matéria orgânica
FMVZ: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecni
g: Grama
HIV: Human Immunodeficiency vírus
M. bovis: Mycobacterium bovis
M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
mL: Mililitro
mo: Matéria orgânica
P.C.R.:
Polymerase Chain Reaction
p.s.: Pós semeadura
pH: Potencial hidrogeniônico
PNCBET: Programa Nacional de Combate e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose
q.s.p: Quantidade suficiente para
smo: Sem matéria orgânica
Ta: Temperatura ambiente
U.F.C.: Unidades Formadoras de Colônias
USP: Universidade de São Paulo
WHO: World Health Organization
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 15
2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 27
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 28
3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 29
3.1 SUSPENSÃO DO MICRORGANISMO TESTE....................................................... 30
3.2 CARREADOR............................................................................................................ 30
3.3 MEIOS DE CULTURA.............................................................................................. 30
3.4 FONTE DE MATÉRIA ORGÂNICA........................................................................ 31
3.5 DESINFETANTES QUÍMICOS ............................................................................ 31
3.6 SOLUÇÃO NEUTRALIZANTE............................................................................... 32
3.7 DILUENTE................................................................................................................ 33
3.8 TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DAS UNIDADES FORMADORAS DE
COLÔNIAS (U.F.C.) PARA LEITURA DO CRESCIMENTO NO MEIO DE
STONEBRINK............................................................................................................. 33
3.9 TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DAS UNIDADES FORMADORAS DE
COLÔNIAS (U.F.C.) PARA LEITURA DO CRESCIMENTO NAS PLACAS DE
CAMADA DELGADA DE MIDDLEBROOK 7H11 MODIFICADO...................... 33
3.10 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.................................................................... 34
3.10.1 Delineamento Experimental......................................................................................... 35
3.10.2 Inoculação dos Meios de Cultura................................................................................. 36
3.11 TRATAMENTO ESTATÍSTICO ............................................................................... 36
3.12 FLUXOGRAMA.......................................................................................................... 38
4 RESULTADOS.......................................................................................................... 39
4.1 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS DESINFETANTES NO TESTE EM
PLACAS COM MEIO 7H11....................................................................................... 42
4.1.1 Avaliação da atividade micobactericida entre os desinfetantes na técnica em placas. 43
4.1.2 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável matéria
orgânica na técnica em placas...................................................................................... 43
4.1.3 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável
temperatura na técnica em placas................................................................................. 44
4.2 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS DESINFETANTES NO TESTE EM
TUBOS COM MEIO DE STONEBRINK................................................................ 44
4.2.1 Avaliação da atividade micobactericida entre os desinfetantes na técnica em tubos... 45
4.2.2 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável matéria
orgânica na técnica em tubos...................................................................................... 45
4.2.3 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável
temperatura na técnica em tubos.................................................................................. 46
5 DISCUSSÃO............................................................................................................... 53
6 CONCLUSÕES…………………………………………………….......................... 59
REFERÊNCIAS…………………………………………………........................... 61
ANEXO........................................................................................................................ 74
APÊNDICE................................................................................................................. 77
15
INTRODUÇÃO
16
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose é uma doença transmissível de grande importância em saúde
pública e saúde animal, pois determina um quadro de doença de elevada gravidade no
homem, e acarreta acentuadas perdas econômicas, devido à diminuição da produtividade dos
rebanhos afetados (PINHEIRO,1990; PINHEIRO, 1999).
Kleeberg (1984), citou que a tuberculose humana, provocada geralmente pelo
Mycobacterium tuberculosis, acarretou, anualmente na Europa, a morte de pelo menos três
milhões de pessoas e enumeravam-se dez milhões de novos casos a cada ano. Sob condições
favoráveis, o Mycobacterium bovis pode causar, em seres humanos, as mesmas formas
clínicas e lesões patológicas que o M.tuberculosis (ACHA; SZYFRES, 1986), e a infecção de
seres humanos pelo M.bovis ocorre, principalmente pela via aerógena, ou pela ingestão de
alimentos contaminados.
A informação epidemiológica sobre o impacto da tuberculose zoonótica provocada
pelo M.bovis no homem, na América Latina, é escassa ou limitada a algumas regiões
(KANTOR; RITACCO, 1994; ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD,
1995). Há necessidade de um trabalho conjunto entre profissionais da área humana e
veterinária, pois o M.bovis tem particularidades que dificultam o seu isolamento, quando
feito sem uma solicitação específica do médico junto ao laboratório de análise (PINHEIRO,
1999).
A pandemia da síndrome da imunodeficiência adquirida, AIDS, está associada a
infecções oportunistas, principalmente tuberculose e doenças causadas pelo complexo M.
avium (FREITAS et al., 2001). A tuberculose é a principal infecção oportunista em pessoas
HIV - positivas, e a maioria das pessoas duplamente infectadas pelo M.bovis e pelo vírus HIV
vive em países em desenvolvimento. A epidemia de infecção pelo HIV nestes países,
particularmente naqueles em que a infecção por M.bovis está presente nos animais e há
condições favoráveis à transmissão desta zoonose, pode fazer da tuberculose zoonótica uma
séria ameaça de saúde pública para populações de risco (COSIVI et al., 1998). Na década de
17
90, a tuberculose atingiu pessoas infectadas pelo HIV com uma severidade alarmante,
causando uma doença rapidamente disseminada que envolvia vários órgãos (MILLER;
PAIGE, 1998).
O M.bovis tem sido considerado agente causador de infecção em caprinos, ovinos,
suínos, animais de zoológico e de vida selvagem (LUKE 1958; THOEN, 1988; BERNABÉ et
al., 1991; MORRIS; PFEIFFER; JACKSON, 1994).
Mohan (1950), revisando a literatura sobre a tuberculose em caprinos, descobriu que o
primeiro relato da enfermidade foi realizado por Robert Koch, em 1884. Contudo, os caprinos
eram considerados resistentes à infecção natural pela tuberculose, sendo tal “crença”
confirmada pelo fato do consumo de leite de vaca ter sido substituído pelo de cabra, como
medida profilática contra a tuberculose humana (MURRAY; MCNUTT; PURWIN, 1921;
SOLIMAN et al., 1953; LUKE, 1958).
No Brasil, em relação ao manejo nutricional dos caprinos jovens, é frequentemente,
fornecido leite de bovinos para esta categoria animal. Esta prática poderia propiciar a
transmissão de infecção a estes animais, pois já no início do século passado, Griffith (1928)
relatou o diagnóstico da tuberculose em caprino amamentado com leite de vaca.
A incidência da tuberculose nos caprinos, faz desta espécie uma fonte potencial de
infecção aos seres humanos, devendo ser considerada um problema no avanço de programas
de erradicação da tuberculose (THOREL, 1980; LIÉBANA et al., 1998; SEVA et al., 2002).
O Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal
(PNCEBT) foi instituído em 2001 pelo MAPA com o objetivo de diminuir o impacto negativo
dessas zoonoses na saúde comunitária e de promover a competitividade da pecuária nacional.
O PNCEBT introduziu a vacinação obrigatória contra brucelose bovina e bubalina em todo o
território nacional e definiu uma estratégia de certificação de propriedades livres ou
monitoradas onde essas enfermidades são controladas com rigor (MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, BRASIL 2007).
18
Evoluindo de criações voltadas para a subsistência, hoje a expansão do agronegócio da
caprino e ovinocultura está transformando o cenário produtivo no Brasil. O mercado vem
crescendo rapidamente, exigindo uma maior preocupação com aspectos sanitários. A
produção de caprinos e ovinos deve ser fundamentada em sistemas de exploração que possam
garantir melhores condições sanitárias para estes animais, através de medidas de
Biossegurança e de exames diagnósticos confiáveis e acessíveis. Através da Instrução
Normativa Nº 87 da Secretaria de Defesa Agropecuária, de 10 de dezembro de 2004, foi
aprovado o regulamento técnico do PNSCO. O controle e erradicação das doenças de caprinos
e ovinos, por meio de ações sanitárias e de vigilância epidemiológica definidas pelo Diretório
de Defesa Animal (DDA-MAPA) e executadas pelos serviços oficiais e médicos veterinários
cadastrados, estão entre os objetivos do programa. Dentre as estratégias de atuação, serão
destacadas: o cadastro de estabelecimentos, o controle de trânsito de animais, a certificação de
estabelecimentos, o cadastramento de médicos veterinários do setor privado e o
credenciamento de laboratórios para realização de exames diagnósticos das doenças de
controle oficial (MAPA, 2007).
Atualmente, o PNSCO encontra-se em fase de estruturação. Foi formado um comitê
técnico científico, composto de profissionais dos diversos setores da caprino e ovinocultura,
com o objetivo de dar suporte técnico às decisões do programa. As propostas sanitárias estão
em fase de conclusão e estão sendo disponibilizadas por meio de consulta pública, de maneira
a permitir a participação de todos setores interessados (MAPA, 2007).
Nos países onde foram executados programas de controle da tuberculose bovina,
houve uma drástica redução na freqüência de casos humanos por este agente. Muito antes da
descoberta de medicamentos para o tratamento dos doentes, a tuberculose já estava
diminuindo nos países desenvolvidos, pois os programas sanitários adotados abrangiam linhas
de ação em relação às fontes de infecção, às vias de transmissão e aos animais suscetíveis
(KLEEBERG, 1984). Dentre as principais ações aplicadas nos programas sanitários,
destacam-se os procedimentos de desinfecção como instrumento efetivo no combate ao agente
da doença no meio ambiente (POLIAKOV, 1975; VERA et al., 1985).
19
Bier (1985) conceituou desinfecção como sendo o ato de destruir apenas os
microrganismos patógenos. A desinfecção é, pois, um caso particular da esterilização, que se
refere especificamente à eliminação dos germes patogênicos, sem que haja, necessariamente,
a destruição de todos os microrganismos.
Kroning e Paul (apud BLOCK, 1983) publicaram, em 1897, um trabalho onde
relataram que as bactérias, imersas em uma solução desinfetante, não morriam todas ao
mesmo tempo e que a taxa de redução do seu número variava, em função da temperatura e da
concentração da solução empregada. Concluíram, portanto, que se fazia necessário controle
das condições gerais ao se avaliar a ação dos desinfetantes. O número de bactérias deveria ser
constante na ausência da matéria orgânica, pois esta interferia sob o mecanismo de ação dos
produtos.
A necessidade de uma freqüente avaliação dos desinfetantes está embasada no
princípio de que a análise química dos produtos não fornece todas as informações necessárias
para a mensuração de sua atividade antimicrobiana (ALTERTHUM, 1977); isto é possível
com a execução de ensaios que avaliem adequadamente a influência de outros fatores tais
como: o tipo e a origem da estirpe que está sendo testada, o preparo do inóculo, o princípio
ativo do produto químico e a sua respectiva concentração, bem como a seleção dos produtos
neutralizantes (TILLEY, 1939; TILLEY, 1942; WHITMORE; MINER, 1976; WIEST, 1978;
CROSHAW, 1981; GÉLINAS; GOULET, 1983; WORLD HEALTH ORGANIZATION,
1984; GAGLARDI, 1985; GONTIJO FILHO; ROMÃO, 1986; HURTADO; VERA, 1986;
TIMENETSKY, 1987; TIMENETSKY, 1990; PINHEIRO et al., 1992; CASTILLO
GUERRERO et al., 1993; PINHEIRO et al., 1997).
Dentre os fatores que podem modificar a eficiência dos desinfetantes químicos,
merecem especial destaque os seguintes: a concentração do desinfetante, a temperatura, o pH
ambiental, a dureza da água, o tipo de microrganismo e a presença de matéria orgânica
(SARAUT; LAUTIÉ, 1960; ITO et al., 1978; KRONING; PAUL, 1897 apud BLOCK, 1983;
RUSSEL, 1982;; JONES et al., 1983; GÉLINAS et al., 1984; HERNANDEZ; ESTRADA,
1984; KOSTENBAUDER, 1983; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1984).
20
No âmbito dos desinfetantes químicos com atividade sobre micobactérias, os ensaios
já realizados têm destacado a eficácia dos produtos cujo mecanismo de ação é representado
pela desnaturação das proteínas microbianas (HUGO, 1967; HUGO, 1982). Neste particular,
os compostos fenólicos, o formaldeído, o glutaraldeído, os compostos clorados, o iodo e os
iodóforos têm sido os mais eficazes (COSTIGAN, 1936; COLLINS; MONTALBINI, 1976;
COLLINS, 1986; WAIBICH, 1986; PINHEIRO, 1990).
As micobactérias apresentam elevada capacidade de sobrevivência às mais variadas
condições ambientais, e por este motivo, têm sido alvo de estudo por parte de outros
pesquisadores há décadas. Wang et al. (2005) afirmou que as micobactérias são mais
resistentes a desinfetantes que às demais bactérias em estado vegetativo devido à parede
celular rica em lipídios. Os valores fornecidos pela World Health Organization (1984)
demonstraram a sobrevivência de micobactérias por períodos de até dois anos em instalações
contaminadas, e de um ano, na água e no esterco. Blood e Anderson (1983) citaram o
isolamento destes microrganismos em fezes de bovinos, mantidas em condições ambientais,
por períodos com duração variável de até oito semanas. Williams e Hoy (1930) isolaram o
bacilo da tuberculose bovina, em estrume animal armazenado durante quatro meses.
Com relação aos testes para avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes
químicos, a escolha da estirpe teste tem sido bastante variada; no entanto, como as
micobactérias mais patogênicas (como a M.bovis) apresentam crescimento muito lento nos
meios de cultura tradicionais, nos ensaios preliminares tem sido dada à preferência para as
micobactérias menos patogênicas e de rápido crescimento nos meios de cultura (PINHEIRO,
1990). Desta forma o M.smegmatis é preconizado pela AFNOR (1977) e AOAC (1990) e o
M.fortuitum é recomendado pela WHO (1984).
Do ponto de vista diagnóstico, principalmente de tuberculose provocada por M.bovis,
as principais desvantagens da cultura são: a necessidade de cuidados na manipulação dos
espécimes clínicos e o tempo necessário entre a semeadura e o surgimento de colônias
macroscopicamente visíveis, o que leva de 24 a 40 dias em média (KONEMAN et al., 2001).
21
Alguns países desenvolveram métodos próprios para avaliar a atividade
micobactericida dos produtos químicos, mas de uma maneira geral, todos recomendam que,
nos testes finais, seja feita uma avaliação utilizando-se estirpes patogênicas (BERGAN;
LISTAD, 1971). Deste modo, o M.bovis é recomendado nos ensaios confirmativos da AOAC
(1990) e o M.tuberculosis nos testes da DGHM (DEUTSCHE GESELLSCHAFT FUR
HYGIENE UND MIKROBIOLOGIE-DGHM, 1972). No Brasil, as normas vigentes
preconizam a utilização de M.bovis e M.tuberculosis (FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ,
1985).
Os ensaios confirmatórios para a avaliação da atividade micobactericida dos
desinfetantes químicos de uso pecuário deverão ser executados com amostras recém isoladas
de tecidos animais (PINHEIRO, 1990, 1994, 2001).
No comércio estão disponíveis diversos tipos de desinfetantes químicos; no entanto , o
critério para a escolha de um determinado princípio ativo é o potencial que o mesmo
apresenta para o combate ao agente que se deseja eliminar. Os produtos com atividade
micobactericida recomendados são os compostos fenólicos, o ácido peracético, os álcoois e o
glutaraldeído (CROSHAW, 1971; ASCENZI, 1996; AYLIFEE et al., 1993; RUSSEL, 1996).
Rubin (1983) destaca a atividade do formaldeído, iodo, iodóforos e dos compostos clorados.
O fenol é um dos mais antigos germicidas, sua eficácia foi demonstrada por Lister em
1867. Como grupo, os fenóis e cresóis, particularmente os compostos à base de orto-
fenilfenol, em solução a 1:200, têm revelado atividade sobre micobactérias de um modo geral
(MCDONNELL; RUSSELL, 1999). São considerados estáveis e não são inativados pelo
sabão, nem pela matéria orgânica, razão pela qual têm sido considerados como desinfetantes
de escolha para tratamento de superfícies com contaminação fecal. Apresentam ação
corrosiva e são irritantes de mucosas (SPAULDING et al., 1977; PRINDLE, 1983).
A atividade micobactericida dos compostos iodados, geralmente comercializados
como iodóforos, pode ser alterada quando estes produtos são diluídos em água alcalina (água
dura ou seja, com alto teor de sais de cálcio e magnésio dissolvidos) ou na presença de
matéria orgânica (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1984).
22
Os compostos clorados incluem o cloro, os hipocloritos, as cloraminas, o ácido
cloroisocianúrico e seus derivados. Estes produtos apresentam um largo espectro de atividade
antimicrobiana; no entanto, apresentam baixa atuação sobre esporos e seu poder
micobactericida é discutido (ZANON, 1973). Zanon (1973) e Linton et al. (1987) alegaram
que a atividade micobactericida dos clorados é deficiente; no entanto Smith (1971) indicou o
hipoclorito de sódio como potente agente micobactericida e a WHO (1984) descreveu a
descontaminação de diversos materiais que possa tido contato com micobactérias, através da
cloramina a 5 %.
Pinheiro et al. (1992) investigaram a influência da matéria orgânica na atividade
micobactericida de cinco desinfetantes, utilizando para o teste uma estirpe de M. fortuitum ,
obtendo bons resultados com o hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo) e com uma mistura
de aldeídos. Castillo-Guerrero et al. (1993) avaliaram a ação micobactericida de diversas
concentrações de hipoclorito de sódio comercial com 2,5 % de cloro ativo, contra estirpe de
M. fortuitum, observando que a ausência de matéria orgânica determinou uma atividade
micobactericida quatro vezes mais elevada. Pinheiro (2001), avaliou a atividade
micobactericida de desinfetantes químicos sobre estirpes de M. avium isoladas de suínos
abatidos no Estado de Santa Catarina e conclui que o produto à base de fenóis e o hipoclorito
de sódio apresentaram as melhores atividades micobactericidas em relação a uma estirpe de
M. avium testada.
Dentre os fatores que podem influenciar a atuação dos hipocloritos são mencionados o
pH, a temperatura, a concentração do produto e a matéria orgânica. A elevação do pH diminui
a atividade do hipoclorito (HEKMATI; BRADLEY, 1979; DYCHDALA, 1983; GÉLINAS;
GOULET, 1983; RUBIN, 1983; GÉLINAS et al., 1984; WHO, 1984; LINTON et al., 1987;
SAKO et al., 1988; BEST et al., 1990).
No grupo dos aldeídos, os produtos com ação germicida mais estudada são: o
glutaraldeido e o formaldeido (LINTON et al., 1987). O glutaraldeido possui atividade
esporicida duas a oito vezes mais elevada que a apresentada pelo formaldeído, não é corrosivo
nem irritante, no entanto também apresenta alguma toxicidade (BORICK, 1968). Quando o
glutaraldeido é alcalinizado, em solução aquosa a 2 %, apresenta grande atividade bactericida
23
e esporicida. A atividade antimicrobiana do glutaraldeído depende do pH, sendo mais intensa
em pH alcalino (COLLINS, 1986; LINTON et al. 1987). Em solução de pH 4 e com aumento
da temperatura, há uma elevação do seu poder germicida; no entanto, em pH 8, as elevações
da temperatura são acompanhadas de reduções na atividade bactericida (SCOTT; GORMAN,
1983).
A potente atividade micobactericida do glutaraldeído foi relatada por Borick et al.
(1964) e Snyder e Cheatle (1965); no entanto Rubbo et al. (1967) demonstraram que a sua
ação sobre o M. tuberculosis foi lenta e, segundo Bergan e Listad (1971), menos efetiva do
que o formaldeído e inclusive o hipoclorito (RELYVELD, 1977).
Collins e Montalbine (1976) demonstraram a rápida ação dos aldeídos em temperatura
ambiente. Miner et al. (1977), empregando o método preconizado pela AOAC, testaram o
glutaraldeído alcalinizado sobre M.bovis, obtendo 100% de eficiência em dez minutos. Carson
et al. (1978) obtiveram o mesmo resultado, com dois minutos de exposição, empregando M.
chelonei e M. fortuitum como microrganismo teste.
Leers (1980) recomendou o uso do glutaraldeído a 2 % para a desinfecção de
endoscópios. Os aldeídos são comumente utilizados para desinfecção em hospitais, sendo o
glutaraldeído o mais utilizado principalmente para desinfecção de equipamentos, devido ao
seu amplo espectro de ação e potencial microbicida (BRITISH SOCIETY OF
GASTROENTEROLOGY, 1993 apud Vizcaino et. al., 2002). Entretanto, sua atividade
micobactericida já foi questionada pela incapacidade de penetração nas camadas mais internas
da parede celular da micobactéria. Apesar do uso de maquinários automatizados ter diminuído
a exposição dos trabalhadores ao glutaraldeído e conseqüentes efeitos colaterais de sua
toxicidade, isso permanece um problema para a saúde dos trabalhadores (RUSSEL, 1982).
Segundo Hernandez et al. (2003b) o ácido peracético pode ser uma alternativa viável ao
glutaraldeído, pois possui amplo espectro de ação microbicida mesmo na presença de matéria
orgânica, e é considerado um desinfetante de alto nível de desinfecção pela FDA (Food and
Drug Association). O ácido perácetico é hidro e lipossolúvel e se torna não tóxico quando é
decomposto. É um agente oxidante potente e pode ser corrosivo. No entanto, existem
24
formulações comerciais de misturas balanceadas de ácidos peracéticos e acéticos com
peróxido de hidrogênio que não são corrosivos e possuem rápida atividade micobactericida
(HOLTON et al., 1995). Hernández et al. (2002) utilizou um produto comercial, com 0,26%
de ácido peracético, contra estirpes de M. tuberculosis, M. avium-intracellulare, M. fortuitum
and M. chelonae, e obteve boa ação micobactericida em 20 minutos.
O peróxido de hidrogênio está entre os microbicidas mais antigos que se conhece, e é
gerado naturalmente em muitas condições. Entretanto, é relativamente instável por natureza e
sua ação é relativamente lenta quando utilizado sozinho (OMIDBAKHSH et al., 2006). Essas
características do peróxido de hidrogênio foram analisadas e atualmente é possível produzir
formas estáveis de H
2
O
2
em solução e acelerar sua atividade microbicida. A tecnologia AHP
(Peróxido de hidrogênio acelerado) combinou esses avanços para aumentar a capacidade
microbicida do peróxido de hidrogênio, resultando em formulações variadas de diversas
aplicações (SATTAR et al., 2002).
O cultivo das micobactérias é muitos mais caro do que a baciloscopia. Requer estufas
incubadoras, meios de cultura, autoclaves para preparação e descontaminação dos materiais
utilizados e exige recurso humano mais qualificado, uma vez que o risco de infecção quando
se trabalha com culturas de bactérias patogênicas são maiores. Entretanto, esta técnica é muito
mais acessível aos laboratórios com menos recursos (principalmente nos paises em
desenvolvimento) e aos médicos veterinários do que as modernas técnicas radiométricas e
métodos envolvendo engenharia molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR),
dado o alto custo dos equipamentos para esses exames (SCHABERG et al., 1995; MEJIA et
al., 1999).
Os meios de Löwenstein-Jensen para o M. tuberculosis e Stonebrink para o M.bovis, são
habitualmente empregados nos laboratórios de diagnóstico bacteriológico da tuberculose pela
alta eficácia no primo-isolamento dessas micobactérias em material de campo (CENTRO
PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1988). Outros meios utilizados com resultados
variáveis são os meios ATS (American Thoracic Society), Petragnani e Coletsos para o M.
tuberculosis e, para o M.bovis, os meios de Löweinstein-Jensen com piruvato, TB agar sangue
25
(B83), meio de Gerloff e meio de Herrold com gema de ovo (CORNER; NICOLAPOULOS,
1988; KONEMAN et al., 1993; IDIGORAS et al., 1995).
O M.bovis tem difilculdade em se desenvolver em meios glicerinados, e por este motivo
se desenvolve melhor no meio de Stonebrink, onde o glicerol é substituído pelo piruvato de
sódio. Para o isolamento primário do M.bovis recomenda-se uma pequena concentração de
CO
2
(não superior à 5%), já que o M.bovis é microaerófilo (ABRAHÃO, 1998).
Considerando o fator crescimento lento de micobactérias patogênicas nos meios de
cultura tradicionais, atualmente, uma avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes
químicos que atenda às recomendações já mencionadas anteriormente, levaria cerca de quatro
meses para ser realizado.
O aperfeiçoamento do método microbiológico convencional para um rápido
diagnóstico representa uma grande vantagem na luta contra a tuberculose no homem e no
bovino (SCHABERG et al., 1995; MEJIA et al., 1999). Além disso, permitiria a realização de
avaliações da atividade de produtos químicos frente a micobactérias patogênicas em um
período de tempo mais curto, influenciando diretamente na velocidade das ações profiláticas e
sanitárias dos programas de controle da tuberculose.
Durmaz et al. (1985), Welch et al. (1993), Idigoras el al. (1995), Mejia et al. (1999) e
Smoskovi e Magyar (1999) demonstraram as vantagens do diagnóstico da técnica de camada
delgada que se baseia na observação precoce de microcolônias de micobactérias em placas
com uma fina camada de meio de Middlebrook 7H11, frente ao método tradicional de cultivo
em meios de Löwenstein-Jensen e Stonebrink. Esses trabalhos demonstram significativa
redução no tempo para a observação das primeiras colônias com elevada sensibilidade em
favor da técnica de camada delgada, além de permitir a identificação preliminar das
micobactérias por suas características morfológicas.
Marcondes, em 2002, concluiu que a técnica de camada delgada em placas permitiu
visualização precoce das micobactérias, quando comparadas aos meios de Stonebrink e
Petragnani. Apesar do abundante crescimento de colônias com três dias de cultivo, as
26
colônias puderam ser melhor visualizadas a partir do 5° e 6° dia, quando o fator corda passou
a ser mais evidente. Além disso, a técnica da camada delgada permitiu a diferenciação
morfológica entre as estirpes padrão M.bovis (AN5) e M.tuberculosis (H37Rv) aos 13 dias de
cultivo.
Dib, em 2005, utilizou a técnica de cultivo de micobactérias em camada delgada no
meio de Middlebrook 7H11, em amostras de leite experimentalmente inoculado, empregando
a estirpe padrão M.bovis (AN5), provando ser viável a utilização dessa técnica quando
comparada às técnicas tradicionais. Concluiu também que a técnica da camada delgada
permitiu a visualização precoce das micobactérias, quando comparada ao meio de Stonebrink.
A técnica da camada delgada oferece como principais vantagens, resultados mais
precoces e a possibilidade do estabelecimento de uma identificação preliminar da
micobactéria isolada, baseando-se nas características morfológicas das colônias e, portanto,
pode ser utilizada como um método complementar para o diagnóstico da tuberculose humana
e animal (MARCONDES, 2002; DIB, 2005).
A técnica de camada delgada dispensa microscópios especiais ou qualquer outro
aparato técnico sofisticado, e pode ser usada em qualquer laboratório. Os técnicos que a
executam devem ser treinados; porém, o aprendizado é rápido (IDIGORAS et al., 1995).
Até o momento, não há registros na literatura pesquisada sobre um “teste rápido” de
desinfetantes utilizando-se estirpes patogênicas de M.bovis recém isoladas de material de
campo. Desta forma, justifica-se o presente trabalho, que pretende validar uma técnica de
cultivo em camada delgada de ágar Middlebrook 7H11 para o teste da atividade
micobactericida de desinfetantes químicos, com a intenção de reduzir assim o tempo de
realização do teste, acelerando a indicação de um produto desinfetante eficaz.
27
OBJETIVOS
28
2 OBJETIVOS
Utilizando uma estirpe de M. bovis isolada de caprinos, provenientes de uma
propriedade localizada no Estado de São Paulo, foi delineado o presente estudo com o
objetivo de verificar a viabilidade da utilização da técnica de cultivo em camada delgada de
ágar Middlebrook 7H11 (modificado) em testes com desinfetantes químicos.
2.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Comparar resultados obtidos no cultivo em placas com os resultados dos testes
efetuados em tubos, com meio de Stonebrink, tradicionalmente utilizados no laboratório
de zoonoses bacterianas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, para avaliação da desinfetantes químicos.
• Avaliar a atividade micobactericida de cinco desinfetantes químicos de diferentes
categorias, testados frente à estirpe de M. bovis isolada de caprinos.
29
MATERIAL E MÉTODOS
30
3 MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia empregada para a realização das dez repetições feitas no projeto é
descrita nos tópicos abaixo.
3.1 SUSPENSÃO DO MICRORGANISMO TESTE
A estirpe de Mycobacterium bovis utilizada neste experimento foi isolada de um
caprino atendido no hospital veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da
Universidade de São Paulo no ano de 2001 (BENESI et. al., 2006). A amostra foi então
tipificada por PCR e mantida em meio de cultura de Stonebrink (CENTRO
PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1979) (Anexo A).
A diluição empregada foi de 0,06g de colônias raspadas da superfície (peso úmido) do
meio de cultura com 32 dias de cultivo em 100mL de salina (PINHEIRO et al., 1997). Estas
proporções foram determinadas com base em ensaios piloto, de modo que as contagens nos
controles estivessem ajustadas na faixa de leitura 300 a 400 Unidades Formadoras de
Colônias (U.F.C.) segundo Pinheiro (1990).
3.2 CARREADOR
Círculos de dois centímetros de diâmetro, desenhados com grafite e recortados de uma
folha de papel de filtro do tipo xarope (50 x 50 cm), gramatura de 250 g/m
2
, foram utilizados
como agente carreador.
31
3.3 MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura adotados para o procedimento de isolamento e preparo do inóculo
foram o meio de Stonebrink e o meio Middlebrook 7H11 modificado (UNIVERSIDAD DE
LAS NACIONES UNIDAS, 1998) (Anexo B). O meio de Stonebrink foi distribuído em
tubos de vidro (180 x 18 mm) com tampa de algodão hidrofóbico, em volume de 7 mL por
tubo, enquanto que o meio de Middlebrook 7H11 modificado foi distribuído em placas de
Petri de plástico (60 X 15mm), no volume de 7 mL por unidade. Todas as partidas foram
submetidas aos testes de esterilidade e crescimento.
3.4 FONTE DE MATÉRIA ORGÂNICA
Soro de coelho esterilizado por processo de filtração em placas Seitz
®
com meio
filtrante do tipo EKS/2 foi utilizado como fonte de matéria orgânica.
3.5 DESINFETANTES QUÍMICOS
Foram utilizados cinco desinfetantes químicos pertencentes a categorias diferentes
frente a um grupo controle que utilizou a solução salina 0,85% . Do grupo dos halogênios foi
selecionado o hipoclorito de sódio; do grupo dos aldeídos, o glutaraldeído; do grupo dos
ácidos e dos agentes oxidantes utilizou-se um produto com ácido peracético e peróxido de
hidrogênio; dos compostos iodados, escolheu-se o iodophor e para representar o grupo dos
fenóis, um desinfetante à base de compostos fenólicos. A diluição destes produtos foi feita
conforme recomendação do fabricante.
Produto A( placebo) : solução salina a 0.85%
32
Desinfetante A: Hipoclorito de sódio
1
. Produto com a seguinte composição:
Cloro ativo............................................................................... 2,50 %
Veículo qsq ..........................................................................100,00 mL
Desinfetante B: Glutaraldeído
2
. Produto com a seguinte composição:
Glutaraldeído............................................................................2,00 %
Veículo qsq ..........................................................................100,00 mL
Desinfetante C: Ácido peracético
3
. Produto com a seguinte composição:
Ácido peracético .....................................................................0,25 %
Peróxido de hidrogênio.............................................................5,00 %
Veículo estabilizante............................................................100,00 mL
Desinfetante D: iodóforo
4
. Produto com a seguinte composição:
Iodo .........................................................................................2,60 %
Veículo .................................................................................100,00 mL
Desinfetante F: Compostos fenólicos
5
. Produto com a seguinte composição:
Orto-fenilfeno ........................................................................12,24 g
Orto-benzil paraclorofenol......................................................11,08 g
Para-terceário amilfeno.............................................................4,12 g
Veículo..................................................................................100,00 mL
3.6 SOLUÇÃO NEUTRALIZANTE
Um caldo composto por meio de cultura TSB enriquecido com 5% de soro de coelho
estéril foi utilizado para neutralizar os desinfetantes. Este caldo foi inativado por 30 minutos a
56° C positivos, acrescido de 0,05% v/v de Tween 80
6
(polioxietilensorbitano monooleato)
para prevenir a formação de películas.
1 Água de lavadeira (Super Cândida®)
2 Glutaraldeído da Reagentes analítcos Dinâmica®
3 Proxitane Alfa ®
4 Biocid ®
laboratório Phizer
5 Poly-phen
laboratório Lab-tek
6
Laboratório DIFCO
33
3.7 DILUENTE
Os desinfetantes foram diluídos em água de fonte (pH em torno de 7) não tratada,
bidestilada em equipamento de vidro, autoclavada a 120°C por 15 minutos e armazenada sob
temperatura de refrigeração.
3.8 TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DAS UNIDADES FORMADORAS DE
COLÔNIAS (U.F.C.) PARA LEITURA DO CRESCIMENTO NO MEIO DE
STONEBRINK
As leituras nos tubos contendo o meio de Stonebrink, foram realizadas no 21º e no 28º
dia após a semeadura. A área da superfície do meio de cultura foi demarcada contando-se 6
cm lineares a partir da extremidade inferior da superfície exposta, segundo o critério de leitura
estabelecido por Pinheiro (2001):
0: Ausência de crescimento bacteriano
1: 0 a 20% da superfície demarcada
2: 21 a 40% da superfície demarcada
3: 41 a 60% da superfície demarcada
4: 61 a 80% da superfície demarcada (colônias quase confluentes)
5: 81 a 100% da superfície demarcada (toda a superfície do meio tomada por colônias)
3.9 TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DAS UNIDADES FORMADORAS DE
COLÔNIAS (U.F.C.) PARA LEITURA DO CRESCIMENTO NAS PLACAS DE
CAMADA DELGADA DE MIDDLEBROOK 7H11 MODIFICADO
(MARCONDES, 2002)
34
As leituras das U.F.C. nas placas de camada delgada de Middlebrook 7H11 foram
feitas no 5º e 7º dias após semeadura. A análise quantitativa das placas foi feita demarcando-
se cada placa com 49 quadrados de 0,5 cm cada lado (Figura 1); desses, dez foram escolhidos
aleatoriamente para leitura. Optou-se pelo formato de “L” para facilitar o deslocamento da
placa no microscópio optico
7
. As U.F.C. foram contadas nos 10 quadrados, e o resultado final
foi calculado através da média aritmética destas contagens.
Figura 1 – Placa Petri quadriculada e área de leitura (“L”) delimitada
3.10 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
O inóculo utilizado foi uma suspensão de M.bovis a 0,06g/%. A bactéria foi
conservada em tubos com meio de Stonebrink e mantida em temperatura de 37°C, com idade
de cultivo de 32 dias. As colônias eram maceradas com ajuda de um pistilo e um cadinho
estéreis em 1 mL de salina com 0,05% de Tween 80, para facilitar a homogeneização do
inóculo. O inóculo era então transferido para um frasco estéril do tipo “shot” com pérolas de
vidro, adicionava-se os 99 mL restantes de solução salina 0,85%, o frasco era agitado e as
pérolas auxiliavam na homogeneização final do inóculo.
7
Microscópio CBA – Olympus – American Co
.
35
3.10.1 Delineamento experimental
Inicialmente pilotos foram feitos para determinar a diluição das suspensões bacterianas
de M.bovis ,os melhores tempos de leitura das placas com meio de cultura 7H11 e dos tubos
com Stonebrink. Posteriormente, foram feitas dez repetições, utilizando-se as suspensões
bacterianas padronizadas anteriormente, em que se avaliou o desempenho dos desinfetantes
frente a estirpe de M.bovis isolada de caprinos e devidamente tipificada pelo PCR. Em cada
repetição utilizou-se 24 placas de Petri de vidro estéreis de 9,5 cm de diâmetro, cada um delas
com quatro círculos de papel filtro (carreador). Essas placas receberam 4 mL de suspensão
bacteriana e foram então divididas em seis grupos com quatro placas cada. O grupo A, grupo
controle, recebeu solução salina estéril 0,85%; o grupo B correspondeu ao grupo testado com
hipoclorito de sódio; o grupo C foi o grupo testado com glutaraldeído; o grupo D foi testado
com a mistura de ácido peracético e peróxido de hidrogênio; o grupo E recebeu o iodóforo; e
o grupo F foi testado com o produto a base de compostos fenólicos. Cada grupo foi dividido
em dois lotes: um recebeu matéria orgânica (1 mL de soro de coelho estéril) e o outro recebeu
o placebo (1 mL de solução salina estéril), portanto duas placas de cada grupo com matéria
orgânica e duas placas sem matéria orgânica. Após a aplicação da suspensão bacteriana, da
matéria orgânica e da solução salina, as placas foram armazenadas à temperatura ambiente
(21 ± 2 °C ) durante 30 minutos para que houvesse contato entre a suspensão e o papel filtro.
Depois deste período, foram acrescidos os desinfetantes (4 mL) e a solução salina estéril (4
mL). Metade das placas (duas placas por lote) foram mantidas à temperatura ambiente e as
outras, à temperatura de 4°C por 60 minutos, tempo de ação dos desinfetantes. Em seguida ,
foram recolhidos três dos quatro círculos de papel de filtro por placa avaliada, os quais foram
macerados em cadinho com auxílio de um pistilo (estéreis) com 10 mL da solução
neutralizante estéril. Retirou-se então 1 mL desta solução para fazer uma nova diluição com 9
mL de água destilada estéril, e obteve-se assim uma suspensão a 1:100. Depois de concluída
esta neutralização, as suspensões foram centrifugadas a 1000 G durante 15 minutos, e o
sedimento foi suspenso em 2 mL de solução salina 0,85% estéril. A partir das suspensões
finais (obtidas de cada placa de cada lote e grupo) foram semeadas duas placas com meio de
Middlebrook 7H11 modificado e dois tubos contendo meio de Stonebrink com 100µL cada
(vide Fluxograma).
36
3.10.2 Inoculação dos meios de cultura
As placas foram fechadas com fita adesiva Micropore® e incubadas em estufa a 37°C,
em condições de microaerofilia (Anexo C), dentro de caixas plásticas tipo “tuperware”
contendo uma pastilha de Sonrisal®
8
numa placa de Petri aberta e um pedaço de palha de aço
embebida em 5mL de solução de sulfato de cobre numa outra placa aberta dentro do
“tuperware”. A caixa foi vedada com filme plástico tipo Parafilme®
9
. As leituras foram feitas
todo quinto e sétimo dia após semeadura.
O meio de Stonebrink inoculado foi incubado horizontalmente a 37°C por 24 horas, até
a obtenção da secagem da porção líquida. Transcorrido este período, os tubos tiveram as
tampas bem fechadas; em seguida, foram incubados em posição horizontal a 37°C durante 21
dias, quando foi realizada a primeira leitura.
3.11 TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Para realização da análise estatística, foram calculadas as médias das contagens, das
duas duplicatas, das U.F.C. nas placas e dos escores nos tubos gerando os Apêndices C e D.
O valor médio obtido foi transformado em percentual de redução gerando as tabelas 1 e 2.
Utilizou-se somente as leituras do segundo dia de leitura, que representaram os valores finais
dos testes, obedecendo-se o critério descrito por Pinheiro (2001):
Média do controle X (nas condições de temp e mo) = 100% de crescimento
Média do desinfetante Y (nas mesmas condições de temp e mo) = Y% crescimento
100 – Y = % de redução
Exemplificando:
Média de UFC, Repetição 1 (placa/controle/4°C/ smo) = 44,55..............100% de crescimento
8
Alka Seltzer: Bayer do Brasil S.A.
9
Parafilm M: American natinal can TM – Chicago, IL 60631
37
Média de UFC Repetição 1 ( placa/ glutaraldeído/4°C/ smo) = 0,00.......Y %
100-Y= % de redução do desinfetante
100-0,00= 100% de redução do desinfetante glutaraldeído na repetição 1.
A análise dos percentuais de redução foi efetuada com o auxílio dos softwares SPSS for
Windows- Realese 9.01 (1999) e INSTAT 3.01 (1998). Foram feitos 8 gráficos (gráficos 1 a
8) do tipo “boxplot” representando a ação dos desinfetantes nas diferentes condições testadas.
Inicialmente os desinfetantes foram avaliados em conjunto, nas diferentes situações de
temperatura e matéria orgânica, nesta etapa foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis e o teste de
Dunn como confirmatório. Adotou-se aqui um nível de confiança α = 5% (vide apêndices E e
F). Posteriormente, os percentuais de redução produzidos pelos diferentes desinfetantes foram
avaliados em pares, frente as variáveis matéria orgânica (cmo e smo) e temperatura (4°C e
ambiente) separadamente. Nesta etapa utilizou-se o teste de Mann-Wihtney.
38
3.12 FLUXOGRAMA
Princípios ativos:
A: grupo controle
B: hipoclorito de sódio
C: glutaraldeído
D: ácido peracético e peróxido de
hidrogênio
E: iodóforo
F: composto fenólico
cmo: com matéria orgânica
smo: sem matéria orgânica
amb: temperatura ambiente (20-22°C)
4 °C: temperatura de geladeira
39
RESULTADOS
40
4 RESULTADOS
Nas condições determinadas pelo presente estudo, houve crescimento da estirpe testada
nas placas e tubos semeados. Nas placas, a melhor leitura de U.F.C de M. bovis foi obtida a
partir do quinto dia pós-semeadura (p.s.) onde se pode quantificar e observar, com ajuda do
microscópio óptico, o crescimento de colônias com aspecto rugoso, bordos irregulares e de
coloração acastanhada (Figuras 1 e 2). Nos tubos, tal visualização e contagem só foi possível
à partir do 21° dia (Figuras 3 e 4).
Figura 2- Colônias de M. bovis em placa com meio 7H11, com 7 dias de cultivo,
microscopia óptica sob aumento de 100 x; grupo A (controle)
Figura 3- Colônias de M. bovis em placa com meio 7H11 ,com 7 dias de cultivo, microscopia
óptica sob aumento de 100 x; grupo F (composto fenólico)
41
Figura 4 - Colônias de M.bovis do grupo E (iodóforo), com 21 dias de cultivo, em tubos
com meio de Stonebrink
Figura 5- Colônias de M.bovis do grupo A (controle) , com 28 dias de cultivo, em tubos
com meio de Stonebrink
42
As contagens das U.F.Cs nas placas com meio 7H11 estão descritas no Apêndice A, e
os escores de crescimento das colônias nos tubos com Stonebrink estão dispostos no Apêndice
B. A partir dessas contagens foram calculadas as médias das U.F.C. encontradas nas duas
duplicatas, obtendo-se um único valor médio para cada dia de leitura nas dez repetições, essas
médias estão relacionados no Apêndice C. O mesmo raciocínio vale para os valores de escore
obtidos na leitura dos tubos (Apêndice B e D).
A partir das médias de contagens de U.F.C. em placas e dos escores em tubos foi
calculado o percentual de redução obtido pelos desinfetantes nas duas técnicas gerando as
tabelas 1 e 2, as quais foram utilizadas para análise dos resultados.
4.1 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS DESINFETANTES NO TESTE EM
PLACAS COM MEIO 7H11
A avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes foi feita comparando-se os
percentuais de redução de U.F.C., obtidos nas diferentes condições testadas, em relação ao
valor correspondente observado no grupo controle, obedecendo às mesmas condições de
temperatura, presença e ausência de matéria orgânica (mo). Os valores são apresentados nas
tabelas 1 e 2, dados os quais originaram os gráficos 1 a 8 sendo que os gráficos 1 a 4
representam os testes efetuados em placas e os demais, os tubos. Nas placas onde houve
contaminantes (vide Apêndice A) foi considerado o percentual obtido em sua duplicata para a
elaboração da tabela 1.
Nas tabelas 1 e 2 pode-se verificar que houve casos em que o resultado obtido foi
negativo, indicando que o controle teve crescimento inferior ao do teste, e o produto testado
não teve ação micobactericida. Nesses casos o percentual de redução foi considerado como
zero.
A visualização dos gráficos 1 a 4 revela que todos os produtos testados apresentaram
atividade micobactericida.
43
4.1.1 Avaliação da atividade micobactericida entre os desinfetantes na técnica em placas
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos mesmos entre si nas diferentes condições testadas (Teste de Mann-Whitney),
obtendo-se os resultados descritos a seguir.
À temperatura ambiente, na ausência de mo (Gráfico 1), todos os produtos
apresentaram atividades micobactericida iguais. Na presença de mo (Gráfico 2), os produtos
B (hipoclorito), C (glutaraldeido), D (acido peracético) e F (composto fenólico) mantiveram o
mesmo percentual de redução, já o produto E (iodóforo) apresentou pouca atividade
micobactericida nessa condição, obtendo percentual de redução significativamente menor em
relação aos demais desinfetantes.
À temperatura de 4°C, na ausência de mo (Gráfico 3) , todos os produtos apresentaram
atividades micobactericida iguais (100%) exceto pelo produto C que obteve percentual de
redução significativamente menor em relação aos demais desinfetantes. O produto D manteve
a mesma performance quando submetido à presença de mo, já os demais desinfetantes
(Gráfico 4) tiveram sua atividade reduzida nessa condição. Os produtos B e D (4°C; cmo)
obtiveram percentagens de redução semelhantes e significativamente maiores em relação à C,
E e F, que por sua vez apresentaram reduções semelhantes entre si.
4.1.2 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável matéria
orgânica na técnica em placas
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos produtos frente a variável matéria orgânica (Teste de Mann-Whitney),
obtendo-se os resultados descritos a seguir.
44
À temperatura de 4 °C, os produtos B, E e F obtiveram percentuais de redução maiores
na ausência de mo em relação aos percentuais na presença da mesma. Já os produtos C e D
apresentaram percentuais de redução semelhantes em ambas as condições de presença e
ausência de mo.
À temperatura ambiente, todos os produtos obtiveram percentuais de redução
semelhantes em ambas as condições de presença e ausência de mo, exceto o produto E que
apresentou percentual de redução maior na ausência de mo.
4.1.3 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável temperatura
na técnica em placas
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos produtos frente à variável temperatura (Teste de Mann-Whitney), obtendo-se
os resultados descritos a seguir.
Na presença de mo, os produtos B, C e F obtiveram percentuais de redução maiores à
temperatura ambiente em relação aos percentuais a 4°C. Já os produtos D e E apresentaram
percentuais de redução iguais em ambas as condições de temperatura.
Na ausência de mo, todos os produtos obtiveram percentuais de redução semelhantes
em ambas as condições de temperatura, exceto o produto C que apresentou percentual de
redução maior à temperatura ambiente.
4.2 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS DESINFETANTES NO TESTE EM TUBOS
COM MEIO DE STONEBRINK
Os resultados da ação micobactericida dos produtos químicos testados, nos tubos,
frente à estirpe de M. bovis foram analisados e originaram os gráficos 5 a 8.
45
A visualização dos gráficos 5 a 8 revela que todos os desinfetantes químicos testados
apresentaram atividade micobactericida.
4.2.1 Avaliação da atividade micobactericida entre os desinfetantes na técnica em tubos
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos mesmos entre si na diferentes condições testadas (Teste de Mann-Whitney),
obtendo-se os resultados descritos a seguir.
À temperatura ambiente, na ausência de mo (Gráfico 5), todos os produtos
apresentaram atividades micobactericida semelhantes (próximas de 100%). Na presença de
mo (Gráfico 6), os produtos B (hipoclorito), C (glutaraldeido), D (acido peracético) e F
(composto fenólico) mantiveram o mesmo percentual de redução, já o produto E (iodóforo)
apresentou pouca atividade micobactericida nessa condição, obtendo percentual de redução
significativamente menor em relação aos demais desinfetantes.
À temperatura de 4°C, na ausência de mo (Gráfico 7), todos os produtos apresentaram
atividades micobactericida semelhantes, exceto pelo produto C que obteve percentual de
redução significativamente menor em relação aos demais desinfetantes. O produto D manteve
a mesma performance quando submetido à presença de mo, já os demais desinfetantes
(Gráfico 8) tiveram sua atividade reduzida nessa condição. Os produtos B e D (4°C; cmo)
obtiveram percentagens de redução semelhantes e significativamente maiores em relação à C,
E e F, que por sua vez apresentaram reduções semelhantes entre si.
4.2.2 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável matéria
orgânica na técnica em tubos.
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos produtos frente a variável matéria orgânica (Teste de Mann-Whitney),
obtendo-se os resultados descritos a seguir.
46
À temperatura de 4 °C, os produtos B, E e F obtiveram percentuais de redução maiores
na ausência de mo em relação aos percentuais na presença da mesma. Já os produtos C e D
apresentaram percentuais de redução semelhantes em ambas as condições de presença e
ausência de mo.
À temperatura ambiente, todos os produtos obtiveram percentuais de redução iguais em
ambas as condições de presença e ausência de mo, exceto o produto E que apresentou
percentual de redução maior na ausência de mo.
4.2.3 Avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes frente à variável temperatura
na técnica em tubos.
A atividade micobactericida dos desinfetantes foi avaliada comparando-se o
desempenho dos produtos frente a variável temperatura (Teste de Mann-Whitney), obtendo-se
os resultados descritos a seguir.
Na presença de mo, os produtos B, C e F obtiveram percentuais de redução maiores à
temperatura ambiente em relação aos percentuais à 4°C. Já os produtos D e E apresentaram
percentuais de redução semelhantes em ambas as condições de temperatura.
Na ausência de mo, todos os produtos apresentaram percentuais de redução
semelhantes em ambas as condições de temperatura, exceto o produto C que apresentou
percentual de redução maior à temperatura ambiente.
Tabela 1 – Percentual de redução de crescimento de M.bovis em placas com 7H11, segundo o princípio ativo do desinfetante químico, a
temperatura de contacto, presença ou ausência de matéria orgânica - São Paulo – 2007
Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
R L 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 91,0 100,0 100,0 100,0 98,4 100,0 100,0
2ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 21,1 100,0 -34,9 100,0 58,9 100,0 100,0
3ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 98,4 89,4 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 3,6 100,0 -20,6 100,0 92,7 100,0 100,0
4ª 2 100,0 98,6 100,0 100,0 80,9 97,9 100,0 89,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -33,2 100,0 34,8 100,0 93,1 100,0 100,0
5ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 86,8 89,1 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -16,1 100,0 7,4 100,0 94,8 100,0 100,0
6ª 2 100,0 97,7 100,0 100,0 97,7 99,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 44,6 92,9 26,9 100,0 100,0 100,0 100,0
7ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 99,8 77,3 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -15,0 100,0 -75,1 100,0 79,3 100,0 93,8
8ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 65,0 27,6 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -20,4 100,0 -10,4 100,0 86,3 100,0 100,0
9ª 2 100,0 81,8 100,0 100,0 4,0 76,4 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 31,7 100,0 14,9 100,0 65,5 100,0 100,0
10ª 2 100,0 89,0 100,0 100,0 65,1 45,2 99,5 98,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 29,3 100,0 6,4 100,0 90,7 100,0 100,0
R
Repetições
Ta
Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius CMO Presença de matéria orgânica
47
Tabela 2 – Percentual de redução de crescimento de M.bovis na superfície do meio de Stonebrik em tubos, segundo o princípio ativo do
desinfetante químico, a temperatura de contacto e presença ou ausência de matéria orgânica - São Paulo – 2007
Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
R L 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 40,0 75,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -100,0 100,0 83,3 100,0 0,0 100,0 100,0
2ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 75,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 87,5 -50,0 100,0 -11,1 100,0 16,7 100,0 100,0
3ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 71,4 33,3 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -16,7 85,7 25,0 100,0 33,3 100,0 100,0
4ª 2 100,0 71,4 100,0 100,0 -12,5 71,4 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -42,9 100,0 0,0 100,0 42,9 100,0 100,0
5ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 28,6 77,8 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 11,1 100,0 37,5 100,0 55,6 100,0 100,0
6ª 2 100,0 60,0 100,0 100,0 60,0 60,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 90,0 20,0 50,0 11,1 100,0 80,0 100,0 100,0
7ª 2 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 33,3 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 83,3 -33,3 100,0 -33,3 100,0 33,3 100,0 83,3
8ª 2 100,0 88,9 100,0 100,0 0,0 11,1 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 11,1 100,0 -25,0 100,0 55,6 100,0 100,0
9ª 2 100,0 33,3 100,0 100,0 -11,1 11,1 55,6 55,6 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 -11,1 100,0 -11,1 100,0 11,1 100,0 55,6
10ª 2 100,0 40,0 100,0 77,8 10,0 20,0 60,0 55,6 100,0 100,0 100,0 100,0 80,0 0,0 100,0 -11,1 100,0 40,0 100,0 100,0
R
Repetições
Ta
Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius CMO Presença de matéria orgânica
48
49
Gráfico 1– Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio 7H11 na
temperatura ambiente e ausência de matéria orgânica
Gráfico 2– Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio 7H11 na
temperatura ambiente e presença de matéria orgânica
FEDCB
100
99
98
97
96
95
94
93
92
Desinfetant es
% de redução
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100100100100100
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetant es
% de r e duç ã o
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100
6,86335
100100100
50
Gráfico 3– Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio 7H11 na
temperatura de 4 °C e ausência de matéria orgânica
Gráfico 4– Atividade micobactericida dos desinfetantes em placas com meio 7H11 na
temperatura de 4 °C e presença de matéria orgânica
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetant es
% de r e duç ã o
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100100100
92,2501
100
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetant es
% de r e duç ã o
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
91,7026
12,3732
100
89,2459
100
51
Gráfico 5– Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de Stonebrink na
temperatura ambiente e ausência de matéria orgânica
Gráfico 6– Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de Stonebrink na
temperatura ambiente e presença de matéria orgânica
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetant es
% de r e duç ã o
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100
0
100100100
FEDCB
100
90
80
70
60
50
Desinfetantes
% de r e d uç ã o
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100100100100100
52
Gráfico 7– Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de Stonebrink na
temperatura de 4 °C e ausência de matéria orgânica
Gráfico 8– Atividade micobactericida dos desinfetantes em tubos com meio de Stonebrink na
temperatura de 4 °C e presença de matéria orgânica
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetant es
% de redução
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
36,6667
0
100
46,6667
94,4444
FEDCB
100
80
60
40
20
0
Desinfetantes
% de r eduç ão
B hipoclorito
C glutaraldeido
D ac. peracético
E iodóforo
F fenólico
Desinfetantes
100100100
34,2857
100
53
DISCUSSÃO
54
5 DISCUSSÃO
A visualização microscópica do crescimento de colônias (M. bovis) com aspecto rugoso,
bordos irregulares e de coloração acastanhada, obtidos no meio de cultura de Middlebrook
7H11 a partir do quinto dia pós-semeadura (p.s) (Figuras 1 e 2) também foi observado por
Marcondes (2002) que, trabalhando com a estirpe padrão M. bovis (AN5) constatou que as
colônias podiam ser melhores visualizadas a partir do 5° e 6° dia p.s. A morfologia inicial e
aspecto das bordas das colônias também foram observados sendo coincidentes com a
morfologia encontrada neste estudo embora as cepas sejam oriundas de espécies diferentes.
As repetições do teste de desinfetantes realizado em placas, com meio 7H11, puderam
ser efetuadas em aproximadamente sete dias, entretanto, o tempo de execução das etapas
realizadas nos tubos foi de 28 dias. A variável “tempo de execução” foi avaliada por
Marcondes (2002) que comparou o tempo de crescimento nas placas e nos tubos,
demonstrando que o método de cultivo em placas possibilita a realização de leitura em menor
tempo e o possível estabelecimento de uma identificação prelimimar da micobactéria isolada,
baseando-se nas características morfológicas das colônias.
Durmaz et al. (1985), Welch et al. (1993), Idigoras et al. (1995), Mejia et al. (1999) e
Somoskovi e Magyar (1999) também demonstraram as vantagens do diagnóstico da técnica
de camada delgada frente ao método tradicional de cultivo em meios de Löwenstein- Jensen e
Stonebrink relatando significativa redução no tempo para a observação das primeiras colônias
com elevada sensibilidade em favor da técnica de camada delgada.
A contagem precisa em menor período de tempo é um aspecto que valoriza o teste
realizado em placas (MARCONDES, 2002; MARCONDES et al., 2006; DIB, 2005; DIB et
al., 2006), pois a visualização tardia de colônias em meios de cultura tradicionais é um fator
que limita a recomendação dos testes que avaliam a atividade micobactericida de
desinfetantes químicos (PINHEIRO et al., 1992, PINHEIRO et al., 1997; PINHEIRO, 2001).
Dib (2005) observou que a visualização das U.F.C. das estirpes de M. bovis foi facilitada nas
55
placas quando comparada aos tubos, e concluiu que o meio de Middlebrook 7H11
modificado, por ser transparente, permite a observação das colônias ao microscópio.
Pinheiro (1990), portanto, concluiu que experimentos visando o aperfeiçoamento do
método microbiológico convencional para um rápido diagnóstico representam uma grande
vantagem na luta contra a tuberculose no homem e nos animais (SCHABERG et. al. 1995;
MEJIA et. al., 1999).
O teste em tubos foi realizado para permitir comparação dos resultados da
performance dos produtos químicos avaliados com a técnica em placas, entretanto a técnica
desenvolvida por Pinheiro (1990) tem o fator “tempo” como uma ressalva a ser feita, levando-
se em conta que há a limitação de no mínimo quatro meses (PINHEIRO, 1994) para que todas
as repetições necessárias, para validar estatisticamente o teste, sejam efetuadas.
A leitura das U.F.C. de M. bovis efetuada nos tubos (Tabela 2 e Figuras 3 e 4) foram
realizadas à partir do 21° dia, terminando no 28 dia p.s. Esta condição de tempo foi adaptada
dos trabalhos de Pinheiro (1994) onde se ressalta a necessidade de padronização do tempo de
leitura diante da velocidade de crescimento da estirpe testada. Marcondes (2002) obteve
crescimento em 74,2% dos tubos semeados com M.bovis a partir do 14° dia, e de cerca de
99% no 21° dia. Dib (2005) observou crescimento nos tubos semeados com M. bovis à partir
do 21° dia de cultivo, com grande maioria dos tubos apresentando crescimento aos 28 dias
p.s;, Koneman et al. (2001) citaram o tempo médio de crescimento de amostras de campo
como sendo de 24 a 40 dias. Córner e Nicolapoulos (1998) utilizando estirpes de M. bovis
(AN5) e M. bovis (M86/90) em diversos meios de cultura, entre eles o Stonebrink e o
Middlebrook 7H11, obtiveram como médias de crescimento 27,3 (AN5) e 28 dias (M86/90)
no meio de Middlebrook fazendo leitura sem auxilio de microscópio. No meio de Stonebrink
as médias foram 32,8 (AN5) e 30,6 dias (M86/90).
Pinheiro (1994) recomendou que, os ensaios confirmatórios para a avaliação da
atividade micobactericida dos desinfetantes químicos fossem executados com amostras de M.
bovis recém isoladas de tecidos animais. O teste realizado com estirpes submetidas a
56
sucessivos repiques pode apresentar resultado diferente da amostra recém isolada (ZIEGLER;
GRÄTSCH, 1987; PINHEIRO, 1994).
No presente estudo, os testes foram efetuados utilizando o M. bovis recém isolado de
caprinos, isto é, com poucas passagens em meios de cultura. A variação de resistência aos
desinfetantes químicos entre estirpes de micobactérias utilizadas como microrganismos teste
já foi relatada por Croshaw (1971), Russel (1982), Lind et al. (1986), e Best et al (1990) que
consideraram o M. tuberculosis mais resistente aos desinfetantes do que o M. bovis e o M.
smegmatis. Pinheiro (2001) trabalhando com quatro estirpes de M. avium observou diferenças
de resistência entre elas.
Tendo em vista que, um dos objetivos deste trabalho era o de recomendar produtos
químicos de eficácia comprovada, optou-se pela reavaliação dos grupos de desinfetantes já
testados, em diferentes micobactérias, por Pinheiro et al. (1992, 1997) e Pinheiro (2001)
incluindo dois diferentes princípios ativos.
A atividade micobactericida dos produtos escolhidos já foi relatada: aldeídos
(BORICK et al., 1964; SNYDER; CHEATLE, 1965; PINHEIRO, 1990; PINHEIRO, 1994);
clorados (COSTIGAN, 1936; SMITH, 1971; PINHEIRO, 1990; CASTILLO GUERRERO,
1991); ácido peracético (LYNAM et al., 1995; HERNANDEZ et al., 2003a; HERNANDEZ et
al., 2003b); iodóforos (KNAYSI,1932; GERSHENFELD et al., 1954) e compostos fenólicos
(BERGAN; LISTAD, 1971; McDONNELL; RUSSELL, 1999).
Em relação aos produtos testados contra a estirpe de M. bovis, observou-se que todos
apresentaram atividade micobactericida nas duas técnicas (placas e tubos) efetuadas,
confirmando as recomendações de uso dos desinfetantes (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1984).
Os percentuais de redução descritos nas tabelas 1 e 2, e visualizados nos gráficos 1 a 8,
favorecem a compreensão dos valores obtidos, uma vez que trabalha considerando o
percentual de redução do produto quando comparado com o seu respectivo grupo controle.
Tal recurso foi preconizado por Pinheiro (1990, 1994, 2001).
57
À temperatura ambiente, nas condições de presença e ausência de matéria orgânica, os
melhores resultados nas placas e nos tubos foram obtidos pelos produtos B (hipoclorito), C
(glutaraldeido), D (acido peracético) e F (composto fenólico) (Gráficos 1, 2, 5 e 6). A boa
atividade micobactericida dos clorados, aldeídos e compostos fenólicos foi descrita por
Pinheiro et al. (1992) e Pinheiro (1997); a do acido peracético por Hernandez et al. (2003a) e
Hernandez et al. (2003b).
O desempenho do produto E foi prejudicado pela presença de mo nas duas condições
de temperatura testadas, concordando com a interferência desta variável sobre os iodóforos,
descrita por Gélinas e Goulet (1983), WORLD HEALTH ORGANIZATION (1984) e
Pinheiro (1990). Segundo Zanon, (1973), os iodóforos podem ter o seu potencial oxidante
consumido pelo excesso de material orgânico, antes que ocorra a destruição microbiana.
Na condição de temperatura de 4°C e ausência de mo, nas placas e nos tubos (Gráficos
3 e 7), os produtos B (hipoclorito), D (acido peracético), E (iodóforo) e F (composto fenólico)
apresentaram atividades micobactericida superiores à 80% de redução, performance esta que
foi mantida pelo produto D quando submetido à presença de mo, já os demais desinfetantes
(Gráfico 4) tiveram sua atividade reduzida nessas condições (4°C, cmo).
A diminiução da atividade micobactericida do hipoclorito de sódio na presença de mo
já foi relatada por Hekmati e Bradley, (1979), Gélinas e Goulet (1983), Pinheiro (1990),
Castillo Guerrero (1991) e Pinheiro (1994, 2001). Além disso, o efeito da temperatura sobre
os produtos clorados foi demonstrado por Costigan (1936) e Dychdala (1983), os quais
constataram que o aumento da temperatura ocasionou um aumento da atividade bactericida do
desinfetante, concordando com os resultados obtidos neste experimento, onde o produto B
teve queda no desempenho à 4°C e presença de mo.
O produto F apresentou boa atividade micobactericida, concordando com relatos de
Bergan e Lystad (1971), mas também teve sua atividade diminuída na presença de mo e
temperatura de 4°C, discordando da indicação desse produto para ambientes com alto teor de
matéria orgânica (SPAULDING et. al., 1977; PRINDLE, 1983).
58
Borick; Dondershine e Chandler (1964), WORLD HEALTH ORGANIZATION
(1984) e Pinheiro et al. (1992,1997) descreveram o efeito micobactericida dos aldeídos,
concordando com os resultados obtidos neste experimento. Deve-se ressaltar entretanto que o
glutaraldeido, neste estudo, teve sua atividade micobactericida significativamente diminuída à
temperatura de 4°C, resultando em atividade inferior a dos compostos fenólicos, o que
também foi observado por Pinheiro 2001. Em contra partida, Scott e Gorman (1983),
observaram redução na atividade do glutaraldeido quando utilizado em pH 8 e condições de
elevada temperatura ambiente (32°C). Confirmando-se, portanto, que a temperatura em que
são conduzidos os ensaios de avaliação da atividade micobactericida dos desinfetantes
químicos, pode interferir nos resultados obtidos (TILLEY, 1942; PINHEIRO, 1994).
O ácido peracético (produto D) apresentou atividade micobactericida em todas as
condições testadas de temperaturas e presença e ausência de mo. Hernandez (2003b) observou
atividade micobactericida no ácido peracético (0,26%) em 20 minutos de ação contra estirpes
de M. tuberculosis, M.avium-intracellurare, M.fortuitum e M. chelonae. Lynam et al. (1995),
constatou que um produto com 0,35% de ácido peracético e 0,96% de peróxido de hidrogênio
foi bem mais efetivo contra vários tipos de micobactérias quando comparado ao glutaraldeído
2 %.
O produto D apresentou o melhor desempenho micobactericida em todas as condições
testadas, seguido pelo produto B (exceto condição de 4° C; cmo), produto F (exceto condição
de 4° C; cmo), produto C (exceto condição de 4° C; smo e cmo) e produto E (exceto condição
de ta e 4° C; cmo).
Na avaliação da performance, obtida pelos produtos testados, a seqüência de melhores
desempenhos foi a mesma nas duas técnicas (tubos e placas), confirmando a possibilidade de
se utilizar a técnica em placas com meio 7H11 para o teste de desinfetantes.
59
CONCLUSÕES
60
4 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos nas condições em que o presente estudo foi realizado oferecem as
seguintes conclusões:
• A técnica de cultivo de micobactérias em camada delgada no meio de Middlebrook
7H11 permitiu uma visualização precoce das micobactérias e se mostrou viável para
realização de testes de desinfetantes
• Os cinco tipos de desinfetantes analisados apresentaram atividade micobactericida
• O melhor desempenho foi obtido pelo ácido peracético seguido pelo hipoclorito de
sódio
• A atividade micobactericida dos iodóforos foi insatisfatória na presença de matéria
orgânica
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74
ANEXO A - Método de preparo do meio de Stonebrink
Base de sais
Fosfato monopotássico (KH
2
PO
4
) ....................................................3,50 g
Fosfato dissódico (Na
2
HPO
4
2H
2
O)....................................................0,00 g
Piruvato de sódio ...............................................................................6,25 g
Água destilada q.s.p. -.......................................................................500,00 mL
OBS: caso se utilize fosfato dissódico com 12 moléculas de H
2
0, utilizar 4,0 g. se
for o fosfato
,
dissódico anidro, utilizar 1,59 g.
Conteúdo de ≈ 20 ovos (suspensão) ..................................................1000,00 mL
Solução aquosa de verde de malaquita a 2%.....................................20,00 mL
Dissolver os sais na água destilada e autoclavar a 121°C por 15 minutos. Aguardar
esfriar a base e acrescentar os ovos e o verde de malaquita. Homogeneizar em agitador
magnético por uma hora. Filtrar em gaze estéril (dobrada em 4) e distribuir nos tubos.
Coagular
1
a 80°C por 30 minutos.
+
1
Coaguladora vertical ELETROLAB – câmara climática
75
ANEXO B - Método de preparo do Meio de Middlebrook 7H11 modificado
Middlebrook 7H11 ágar.........................................................................18,00g
Hidrolizado de caseína (digestão pancreática de caseína) ....................1,00 g
Glicerol (glicerina).................................................................................5,00 mL
Água destilada ......................................................................................900,00 mL
Enriquecimento OADC
1
........................................................................100,00 mL
Misturar no Erlenmeyer o ágar, a caseína e o glicerol. Acrescentar a água
destilada pelas paredes para evitar a formação de espuma. Depois de tudo misturado,
agitar lentamente para que o glicerol se misture com a solução. Autoclavar a 121ºC por
15 minutos. Aguardar o resfriamento a 56°C e adicionar assepticamente o enriquecimento
OADC. O enriquecimento deve ser retirado da geladeira antes, para que esteja na
temperatura ambiente na hora de ser adicionado ao meio. Homogeneizar novamente
cuidando para evitar a formação de bolhas. Distribuir em placas e após a solidificação
proceder aos testes de esterilidade por no mínimo 48 horas.
Na hora de distribuir, deixar a ponta da pipeta no canto da placa e descer o meio
devagar para evitar a formação de bolhas. Não deixar descer todo o meio da pipeta;
deixar um pouco de meio no funil da pipeta para que não fiquem bolhas.
1
BBLtn Middlebrook OADC Enrictunent - I3ecton Dickson Microbiology, Systems - Sparks, MD 21 1 52
76
ANEXO C - Preparo do ambiente de microaerofilia para incubação das placas com meio
Middlebrook 7H11 modificado
Preparo da solução de sulfato de cobre
CuSO
4
5H
2
O ................................................................................... 25,00 g
H
2
0 (destilada).................................................................................500,00 mL
H
2
S0
4
(PA).....................................................................................1,60 mL
Tween 80
4
.................................................................................................................................
1,00 mL
Depois de secas e vedadas, as placas são colocadas nas caixas tipo
"tuperware" com a tampa para baixo. Em um dos cantos da caixa é colocada
uma placa de Petri vazia (aberta) contendo um chumaço de palha de aço comum
(Bombril®
1
) e no outro canto outra placa vazia contendo uma pastilha de
antiácido efervescente Alka Seltzer. Em seguida, a palha de aço é molhada com
5 ml da solução de sulfato de cobre. A caixa então deve ser lacrada rapidamente
com a película plástica
2
para evitar a entrada de ar.
1
Bombril®
2
Parafilm M: American National Can TM – Chicago, IL 60631
Apêndice A – Médias das contagens das U.F.C. de M.bovis em placas com 7H11, segundo o princípio ativo do desinfetante químico, a
temperatura de contacto, presença ou ausência de matéria orgânica. São Paulo – 2007.
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
R/L/D
smo cmo smo Cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1.1.1 60 119,6 51,6 81,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8,5 0 0 0 0,6 0 0
1.2.1 70,8 124,4 57,1 103,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10,9 0 0 0 1,9 0 0
1.1.2 29,1 81,3 44,3 74,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,4 0 0 0 1,3 0 0
1.2.2 34,1 97 52,7 95,8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9,1 0 0 0 1,7 0 0
2.1.1 78,5 126,7 78,9 103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111,4 0 117,5 0 61,6 0 0
2.2.1 129 196,5 112,5 160,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 196 0 177,5 0 89 0 0
2.1.2 129 168,4 116 78,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 86,3 0 130 0 55,3 0 0
2.2.2 190,5 238,6 169,3 119,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 147,3 0 199,5 0 90 0 0
3.1.1 90,9 78,9 C 30,1 0 0 0 0 0,1 3,5 0 0 0 0 0 0 0 73,6 0 90,9 0 2 0 0
3.2.1 116,2 107,5 C 118,3 0 0 0 0 1,2 12,7 0 0 0 0 0 0 0 90,4 0 121,1 0 5,8 0 0
3.1.2 83,3 64,5 113,4 59,3 0 0 0 0 0,5 1,7 0 0 0 0 0 0 0 72,2 0 93,9 0 2,1 0 0
3.2.2 105,8 84,4 130,2 82,6 0 0 0 0 2,3 7,7 0 0 0 0 0 0 0 94,5 0 121,1 0 8,2 0 0
4.1.1 110,8 97,8 81 106,8 0 0,4 0 0 10,3 0,1 0 3,5 0 0 0 0 0 87,5 0 50,9 0 0,9 0 0
4.2.1 174,2 116,5 122,6 155,8 0 1,1 0 0 27,1 2,1 0 12,4 0 0 0 0 0 128 0 84,2 0 5,1 0 0
4.1.2 71,4 52,5 70 57,9 0 0,2 0 0 5,4 0,2 0 C 0 0 0 0 0 79,7 0 48,2 0 0,7 0 0
4.2.2 106,2 68,2 91,4 90,4 0 1,5 0 0 26,4 1,7 0 C 0 0 0 0 0 118 0 76,4 0 7,6 0 0
5.1.1 38,8 13,8 17,8 13,6 0 0 0 0 3,9 0,9 0 0 0 0 0 0 0 16,6 0 13,4 0 0,6 0 0
5.2.1 70,2 35,5 40,9 29,8 0 0 0 0 10 4,5 0 0 0 0 0 0 0 43,5 0 33,9 0 2,1 0 0
5.1.2 35,2 21,6 20,4 17,8 0 0 0 0 2,2 0,5 0 0 0 0 0 0 0 19,6 0 11,8 0 0,8 0 0
5.2.2 65,2 45,4 48,9 40,9 0 0 0 0 7,9 4,3 0 0 0 0 0 0 0 50,4 0 31,6 0 2,1 0 0
6.1.1 117 102,6 257 74,3 0 1,7 0 0 0,4 0 0 0 0 0 0 0 0 39 12,8 30,2 0 0 0 0
6.2.1 188,5 181 302,5 108,5 0 4 0 0 3,7 0,2 0 0 0 0 0 0 0 67,1 27,5 51,6 0 0 0 0
6.1.2 116,7 115 262,5 C 0 0,3 0 0 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 78,1 7,1 51,5 0 0 0 0
6.2.2 197,5 164,5 310 C 0 4 0 0 5,1 0 0 0 0 0 0 0 0 124,4 16,2 107 0 0,1 0 0
7.1.1 124 97,6 92 77,5 0 0 0 0 0,1 7,8 0 0 0 0 0 0 0 137,7 0 140,4 0 20,4 0 1,1
7.2.1 174 100,7 145 89,2 0 0 0 0 0,1 24,2 0 0 0 0 0 0 0 144,5 0 152,2 0 35,8 0 3,7
7.1.2 151,5 142,7 139,3 57,4 0 0 0 0 0,4 11,2 0 0 0 0 0 0 0 126,8 0 109 0 9,4 0 4,2
7.2.2 198,2 146,5 159,8 73,4 0 0 0 0 0,8 31,9 0 0 0 0 0 0 0 139,8 0 132,5 0 15,4 0 6,3
8.1.1 128,7 110,3 118,6 104,7 0 0 0 0 15,4 52,9 0 0 0 0 0 0 0 114,5 0 128 0 3,8 0 0
8.2.1 145 C 146 126 0 0 0 0 50,9 109,6 0 0 0 0 0 0 0 144 0 156 0 15,1 0 0
8.1.2 112,9 95,3 177,8 138 0 0 0 0 9,1 34,7 0 0 0 0 0 0 0 117,5 0 129,5 0 4,2 0 0
77
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
R/L/D
smo cmo smo Cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
8.2.2 131,5 119,8 176,5 152,9 0 0 0 0 45,9 63,8 0 0 0 0 0 0 0 144,5 0 151,8 0 17,8 0 0
9.1.1 165 276 166,5 177,5 0 30,9 0 0 139,3 25,9 0 0 0 0 0 0 0 162 0 181,5 0 47,5 0 0
9.2.1 204 301 177,5 210,5 0 64,2 0 0 192,8 59 0,2 0 0 0 0 0 0 190,5 0 147,3 0 80,4 0 0,1
9.1.2 170 222 216 191,5 0 22,2 0 0 144,5 38,3 0 0 0 0 0 0 0 195 0 131,5 0 74,9 0 0
9.2.2 186 279,5 231 222,5 0 41,4 0 0 181,5 77,8 0 0 0 0 0 0 0 206 0 221 0 120 0 0,1
10.1.1 276 213,5 167 183,5 0 17,4 0 0 81,4 102,8 0,2 1,7 0 0 0 0 0 132 0 179 0 12,2 0 0
10.2.1 277,5 217,5 188,5 193,5 0 22,8 0 0 100 113,7 0,8 3 0 0 0 0 0 145 0 182,8 0 15,9 0 0
10.1.2 255 173 171,5 199 0 16,5 0 0 70 85,4 0,6 0,6 0 0 0 0 0 115,5 0 176 0 15,9 0 0
10.2.2 269 175 182,5 202 0 20,2 0 0 90,7 101,5 1,2 1,4 0 0 0 0 0 132,5 0 187,5 0 20,6 0 0
R Repetições Ta Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
D Duplicatas CMO Presença de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius
78
Apêndice B – Escores de crescimento de M.bovis na superfície do meio de Stonebrik em tubos, segundo o princípio ativo do desinfetante
químico, a temperatura de contacto e presença ou ausência de matéria orgânica. São Paulo – 2007.
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4º TA 4º TA 4º TA 4º TA 4º TA 4º TA
R/L/D
Smo cmo smo Cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1.1.1 5 1 1 1 0 0 0 0 4 1 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0
1.2.1 5 2 2 1 0 0 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0 4 0 1 0 1 0 0
1.1.2 3 1 3 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0
1.2.2 5 2 5 5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0
2.1.1 5 2 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 4 0 1 0 0
2.2.1 5 3 3 4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 5 0 2 0 0
2.1.2 3 3 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 0 2 0 0
2.2.2 3 3 2 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 5 0 5 0 3 0 0
3.1.1 1 2 1 4 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 4 0 0 0 0
3.2.1 4 3 3 4 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 2 0 3 0 2 0 0
3.1.2 2 2 3 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 5 0 2 0 0 0 0
3.2.2 3 3 4 4 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 5 1 3 0 2 0 0
4.1.1 3 2 3 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 0 1 0 0
4.2.1 4 4 3 3 0 1 0 0 5 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 2 0 0
4.1.2 2 2 3 3 0 1 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 1 0 1 0 0
4.2.2 4 3 4 4 0 1 0 0 4 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 2 0 2 0 0
5.1.1 2 2 3 4 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 3 0 1 0 0
5.2.1 4 4 4 5 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 3 0 2 0 0
5.1.2 3 5 3 1 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 1 0 1 0 0
5.2.2 3 5 4 3 0 0 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 2 0 2 0 0
6.1.1 4 5 5 3 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 1 3 0 0 0 0
6.2.1 5 5 5 5 0 2 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 1 4 2 4 0 1 0 0
6.1.2 4 5 5 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0 0
6.2.2 5 5 5 4 0 2 0 1 2 1 0 0 0 0 0 0 0 4 3 4 0 1 0 0
7.1.1 3 3 5 3 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 3 0 1 0 0
7.2.1 3 3 5 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 0 2 0 0
79
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4º TA 4º TA 4º TA 4º TA 4º TA 4º TA
R/L/D
Smo cmo smo Cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
7.1.2 3 3 5 3 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 3 0 1 0 0
7.2.2 3 3 5 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 0 2 0 0
8.1.1 4 5 5 4 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 0 0 0 3 0 5 0 1 0 0
8.2.1 4 5 5 4 0 1 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 3 0 5 0 2 0 0
8.1.2 4 3 5 4 0 0 0 0 3 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 1 0 0
8.2.2 4 4 5 4 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 2 0 0
9.1.1 4 4 4 4 0 3 0 0 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 1
9.2.1 4 4 4 4 0 3 0 0 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 2
9.1.2 5 5 5 5 0 3 0 2 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 1
9.2.2 5 5 5 5 0 3 0 2 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 2
10.1.1 5 5 5 4 0 3 0 0 4 4 1 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 2 0 0
10.2.1 5 5 5 4 0 3 0 1 4 4 2 2 0 0 0 0 1 5 0 5 0 3 0 0
10.1.2 5 5 5 5 0 3 0 0 5 4 2 1 0 0 0 0 0 5 0 5 0 3 0 0
10.2.2 5 5 5 5 0 3 0 1 5 4 2 2 0 0 0 0 1 5 0 5 0 3 0 0
R Repetições Ta Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
D Duplicatas CMO Presença de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius
80
Apêndice C – Médias das contagens das U.F.C. de M.bovis em placas com 7H11, segundo o princípio ativo do desinfetante químico, a
temperatura e contacto, presença ou ausência de matéria orgânica. São Paulo – 2007.
R
Repetições
Ta
Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius CMO Presença de matéria orgânica
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
R
L
smo cmo smo Cmo Smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1 44,55 100,45 47,95 78,05 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,45 0 0 0 0,95 0 0
1ª
2 52,45 110,7 54,9 99,75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 1,8 0 0
1 103,75 147,55 97,45 90,95 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 98,85 0 123,75 0 58,45 0 0
2ª
2 159,75 217,55 140,9 139,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 171,65 0 188,5 0 89,5 0 0
1 87,1 71,7 113,4 44,7 0 0 0 0 0,3 2,6 0 0 0 0 0 0 0 72,9 0 92,4 0 2,05 0 0
3ª
2 111 95,95 130,2 100,45 0 0 0 0 1,75 10,2 0 0 0 0 0 0 0 92,45 0 121,1 0 7 0 0
1 91,1 75,15 75,5 82,35 0 0,3 0 0 7,85 0,15 0 3,5 0 0 0 0 0 83,6 0 49,55 0 0,8 0 0
4ª
2 140,2 92,35 107 123,1 0 1,3 0 0 26,75 1,9 0 12,4 0 0 0 0 0 123 0 80,3 0 6,35 0 0
1 37 17,7 19,1 15,7 0 0 0 0 3,05 0,7 0 0 0 0 0 0 0 18,1 0 12,6 0 0,7 0 0
5ª
2 67,7 40,45 44,9 35,35 0 0 0 0 8,95 4,4 0 0 0 0 0 0 0 46,95 0 32,75 0 2,1 0 0
1 116,85 108,8 259,75 74,3 0 1 0 0 0,55 0 0 0 0 0 0 0 0 58,55 9,95 40,85 0 0 0 0
6ª
1 193 172,75 306,25 108,5 0 4 0 0 4,4 0,1 0 0 0 0 0 0 0 95,75 21,85 79,3 0 0,05 0 0
1 137,75 120,15 115,65 67,45 0 0 0 0 0,25 9,5 0 0 0 0 0 0 0 132,25 0 124,7 0 14,9 0 2,65
7ª
2 186,1 123,6 152,4 81,3 0 0 0 0 0,45 28,05 0 0 0 0 0 0 0 142,15 0 142,35 0 25,6 0 5
1 120,8 102,8 148,2 121,35 0 0 0 0 12,25 43,8 0 0 0 0 0 0 0 116 0 128,75 0 4 0 0
8ª
2 138,25 119,8 161,25 139,45 0 0 0 0 48,4 86,7 0 0 0 0 0 0 0 144,25 0 153,9 0 16,45 0 0
1 167,5 249 191,25 184,5 0 26,55 0 0 141,9 32,1 0 0 0 0 0 0 0 178,5 0 156,5 0 61,2 0 0
9ª
2 195 290,25 204,25 216,5 0 52,8 0 0 187,15 68,4 0,1 0 0 0 0 0 0 198,25 0 184,15 0 100,2 0 0,1
1 265,5 193,25 169,25 191,25 0 16,95 0 0 75,7 94,1 0,4 1,15 0 0 0 0 0 123,75 0 177,5 0 14,05 0 0
10ª
2 273,25 196,25 185,5 197,75 0 21,5 0 0 95,35 107,6 1 2,2 0 0 0 0 0 138,75 0 185,15 0 18,25 0 0
81
Apêndice D – Média dos escores de crescimento de M.bovis na superfície do meio de Stonebrik em tubos, segundo o princípio ativo do
desinfetante químico, a temperatura de contacto e presença ou ausência de matéria orgânica. São Paulo – 2007.
Controle Hipoclorito de sódio Glutaraldeído Ácido peracético Iodóforo Fenol
4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA 4ºC TA
R
L
smo cmo smo cmo Smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo smo cmo
1 4 1 2 3 0 0 0 0 2,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 3,5 0 0 0 1 0 0
1ª
2 5 2 3,5 3 0 0 0 0 3 0,5 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0,5 0 2 0 0
1 4 2,5 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3,5 0 4 0 1,5 0 0
2ª
2 4 3 2,5 4,5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0,5 4,5 0 5 0 2,5 0 0
1 1,5 2 2 4 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 4 0 3 0 0 0 0
3ª
2 3,5 3 3,5 4 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 3,5 0,5 3 0 2 0 0
1 2,5 2 3 3 0 0,5 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 2,5 0 1 0 0
4ª
2 4 3,5 3,5 3,5 0 1 0 0 4,5 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 3,5 0 2 0 0
1 2,5 3,5 3 2,5 0 0 0 0 1,5 1 0 0 0 0 0 0 0 2,5 0 2 0 1 0 0
5ª
2 3,5 4,5 4 4 0 0 0 0 2,5 1 0 0 0 0 0 0 0 4 0 2,5 0 2 0 0
1 4 5 5 2,5 0 0,5 0 0 1 0,5 0 0 0 0 0 0 0 3 1 2,5 0 0 0 0
6ª
1 5 5 5 4,5 0 2 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0,5 4 2,5 4 0 1 0 0
1 3 3 5 3 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0,5 2,5 0 2,5 0 1 0 0,5
7ª
2 3 3 5 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0,5 4 0 4 0 2 0 0,5
1 4 4 5 4 0 0 0 0 2,5 4 0 0 0 0 0 0 0 4 0 5 0 1 0 0
8ª
2 4 4,5 5 4 0 0,5 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 4 0 5 0 2 0 0
1 4,5 4,5 4,5 4,5 0 3 0 0 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 1
9ª
2 4,5 4,5 4,5 4,5 0 3 0 0 5 4 2 2 0 0 0 0 0 5 0 5 0 4 0 2
1 5 5 5 4,5 0 3 0 0 4,5 4 1,5 1,5 0 0 0 0 0 5 0 5 0 2,5 0 0
10ª
10.2 5 5 5 4,5 0 3 0 1 4,5 4 2 2 0 0 0 0 1 5 0 5 0 3 0 0
R
Repetições
Ta
Temperatura ambiente (20° a 22° C)
L Leituras (1º e 2º dias) SMO Ausência de matéria orgânica
4°C Temperatura de 4 Graus Celsius CMO Presença de matéria orgânica
82
83
Apêndice E – Valores de significância p para a comparação dos resultados obtidos nas placas
com meio 7H11 pelos produtos químicos testados frente à estirpe de M. bovis,
nas condições estabelecidas. São Paulo – 2007. São Paulo - 2007
Desinfetante SMO 4°C CMO 4°C SMO Ta CMO Ta
B x C p<0,001 p>0,05 p>0,05 p>0,05
B x D p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
B x E p>0,05 p<0,001 p>0,05 p<0,001
B x F p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
C x D p<0,001 p<0,05 p>0,05 p>0,05
C x E p<0,001 p>0,05 p>0,05 p<0,001
C x F p<0,001 p>0,05 p>0,05 p>0,05
D x E p>0,05 p<0,01 p>0,05 p<0,001
D x F p>0,05 p<0,05 p>0,05 p>0,05
E x F p>0,05 p>0,05 p>0,05 p<0,001
B Hipoclorito de sódio 4°C Temperatura de 4 Graus Celsius
C Glutaraldeído Ta Temperatura ambiente (20° a 22° C)
D Ácido peracético SMO Ausência de matéria orgânica
E Iodóforo CMO Presença de matéria orgânica
F Fenol
84
Apêndice F - Valores de significância p para a comparação dos resultados obtidos nos tubos
com Stonebrink pelos produtos químicos testados frente à estirpe de M. bovis,
nas condições estabelecidas. São Paulo – 2007
Desinfetante SMO 4°C CMO 4°C SMO Ta CMO Ta
B x C p<0,001 p>0,05 p>0,05 p>0,05
B x D p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
B x E p>0,05 p<0,001 p>0,05 p<0,001
B x F p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
C x D p<0,001 p<0,05 p>0,05 p>0,05
C x E p<0,05 p>0,05 p>0,05 p<0,001
C x F p<0,001 p>0,05 p>0,05 p>0,05
D x E p>0,05 p<0,001 p>0,05 p<0,001
D x F p>0,05 p<0,01 p>0,05 p>0,05
E x F p>0,05 p>0,05 p>0,05 p<0,001
B Hipoclorito de sódio 4°C Temperatura de 4 Graus Celsius
C Glutaraldeído Ta Temperatura ambiente (20° a 22° C)
D Ácido peracético SMO Ausência de matéria orgânica
E Iodóforo CMO Presença de matéria orgânica
F Fenol
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