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CARLA DA SILVA MOTA
Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste, Brasil
São Paulo
2008
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CARLA DA SILVA MOTA
Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste, Brasil
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Epidemiologia Experimental
Aplicada às Zoonoses da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a obtenção
do Título de Doutor em Medicina Veterinária
Departamento:
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde
Animal
Área de concentração:
Epidemiologia Experimental Aplicada às
Zoonoses
Orientador:
Prof. Dr. Fumio Honma Ito
São Paulo
2008
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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1958 Mota, Carla da Silva
FMVZ Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste, Brasil / Carla da
Silva Mota. – São Paulo: C. S. Mota, 2008.
84 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e
Saúde Animal, 2008.
Programa de Pós-Graduação: Epidemiologia Experimental e Aplicada às
Zoonoses.
Área de concentração: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses.
Orientador: Prof. Dr. Fumio Honma Ito.
1. Raiva. 2. Vírus da raiva. 3. Vacina anti-rábica. 4. Morcegos. 5. Filogenia.
I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: Mota, Carla da Silva
Título: Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste, Brasil
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Epidemiologia Experimental Aplicada às
Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo para a
obtenção do Título de Doutor em Medicina
Veterinária
Data: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Prof. Dr._________________________
Assinatura:_______________________
Instituição:_______________________
Julgamento:______________________
Aos meus pais Oswaldo Feliciano Mota e Jane da Silva Mota.
Ao meu esposo François Godin.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fumio Honma Ito, pela orientação, amizade, ensino, compreensão e
pela confiança em mim depositada.
Ao amigo e Prof. Dr. Cláudio de Moraes Andrade, com quem dei os primeiros
passos na Virologia, por toda ajuda e incentivo e pelo exemplo de integridade e
dedicação inspiradoras.
Ao amigo e MSc. Marlon Vicente da Silva, por sua dedicação e fundamental
colaboração na realização deste trabalho, enquanto chefe da Seção de
Diagnóstico de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge
Vaitsman”.
Aos parceiros japoneses Prof. Dr. Takeo Sakai e Prof. Takuya Itou, da Nihon
University, e seus alunos Go Sato e Yuki Kobayashi, que viabilizaram o
seqüênciamento dos genes da proteína N e da proteína G.
Ao Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão, pela amizade e sugestões valiosas para a
conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Antônio Jerez, pelo carinho e estímulo constantes.
Ao Prof. Dr. Sílvio Arruda Vasconcellos, pelo apoio e sugestões, enquanto
Coordenador da Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às
Zoonoses.
A Wlamir Correa, do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da
Fundação Oswaldo Cruz, que gentilmente cedeu a vacina anti-rábica referência
utilizada neste trabalho.
A Meri Baran, Superintendente de Vigilância em Saúde do Município do Rio de
Janeiro, que gentilmente forneceu a vacina anti-rábica de uso humano utilizada
neste experimento.
A Tatiana Rezende, Diretora do Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge
Vaitsman”, por permitir a realização deste trabalho na Seção de Diagnóstico de
Raiva deste Instituto.
A Marcelo Aragão, Médico-veterinário do Biotério do Instituto Municipal de
Medicina Veterinária “Jorge Vaitsman”, pela dedicação no fornecimento dos
camundongos utilizados neste trabalho.
A Alexandre Abelardo Sanches e Maria Cecília Bacil, pela amizade inestimável,
pelo apoio incansável e por sempre me proporcionarem muitos momentos felizes.
A Sheila de Matos Xavier, Beatriz Cristina Pereira dos Santos, Wildeberg Cál
Moreira, Rebeca Wanderley, Marcelo França, João Júnior, Seu Mário e Dona
Zenaide, pela amizade construída e por fazerem do ambiente de trabalho, um
prazer.
A Rosana Cleide Paick Utiama, pelo auxílio e dedicação durante a fase inicial
deste trabalho, no Laboratório de Raiva da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo.
As secretárias da Pós-Graduação, Dayse Flexa, Cláudia Lima e Tânia Delonero,
pela presteza e simpatia com que sempre me atenderam.
A Elza Faquim, bibliotecária da Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, pela revisão
deste trabalho.
Aos docentes e funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva
e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo.
A CAPES, pela bolsa concedida.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
“Se amas teu trabalho, não trabalharás nunca em tua vida”.
Confúcio
RESUMO
MOTA, C. S. Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus
da raiva isoladas de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste,
Brasil. [Biological, immunological and genetic studies of rabies virus samples
isolated from bats in Rio de Janeiro State – Southeast, Brazil]. 2008. 84 f. Tese
(Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
O presente trabalho visou estudar o comportamento biológico em camundongos
de 10 amostras de vírus da raiva isoladas de morcegos hematófagos e não-
hematófagos, no Estado do Rio de Janeiro, sua caracterização genética quanto
aos genes N e G, além da resposta de camundongos vacinados com a vacina
anti-rábica produzida pela replicação da amostra Pitman-Moore em cultivo celular,
frente ao desafio com estas amostras virais. As passagens sucessivas em
camundongos determinaram uma redução do período de incubação e a obtenção
de amostras virais com altos títulos. A vacina anti-rábica utilizada na imunização
dos camundongos ofereceu proteção em mais de 80% dos camundongos
vacinados com a diluição 1:5 da vacina, frente à maioria das amostras. A análise
filogenética do gene da proteína N apresentou um padrão de agregação dividido
em variante de morcego hematófago e variante de morcego insetívoro, com
diferenças filogenéticas entre as variantes de morcego hematófago isoladas na
Região Noroeste do Estado do Rio de Janeiro e aquelas isoladas nas Regiões
Metropolitana e Sul do Estado. A substituição do resíduo ácido aspártico por ácido
glutâmico na posição 118, encontradas na caracterização genética da proteína G
das amostras 704/97 e 151/98, permite inferir que esta posição esteja relacionada
à antigenicidade viral. Não foram observadas diferenças genéticas temporais entre
as amostras estudadas.
Palavras-chave: Raiva. Vírus da raiva. Vacina anti-rábica. Morcegos. Filogenia.
ABSTRACT
MOTA, C. S. Biological, immunological and genetic studies of rabies virus
samples isolated from bats in Rio de Janeiro State – Southeast, Brazil.
[Estudos biológico, imunológico e genético de amostras do vírus da raiva isoladas
de morcegos no Estado do Rio de Janeiro – Sudeste, Brasil]. 2008. 84 f. Tese
(Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
In the present study we analyzed the biological behavior in mice of 10 rabies virus
samples isolated from haematophagous and non-haematophagous bats in Rio de
Janeiro State, its genetic characterization from genes N and G, and we also
studied the response of mice vaccinated with cell culture rabies vaccine, produced
with the Pitman-Moore strain, after viral challenge with bat rabies virus samples.
Viral passages in mice resulted in reduced incubation period and high virus titrers.
The vaccine used conferred protection in more than 80% of the mice vaccinated
with 1:15 vaccine dilution, after viral challenge. N gene genetic analysis divided the
samples in haematophagous bat strains and insectivorous bat strains, with
phylogenetic differences between samples isolated in Northeast Region and those
isolated in the Metropolitan and South Regions of Rio de Janeiro State. The
substitution of an aspartic acid to a glutamic acid found in the position 118 of G
gene genetic characterization from samples 704/97 and 151/98 seems to be
related to viral antigenicity. There were no time-related genetic differences
between the studied samples.
Key words: Rabies, Rabies virus, Rabies vaccine, Bats, Phylogeny.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitro
BHK-21 Baby Hamster Kidney
CDC Centers for Disease Control
cDNA DNA complementar
CVS Challenge Standard Vírus
DE
50
Dose Efetiva 50%
dil Diluição
DL
50
Dose Letal 50%
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DP
50
Dose Protetora 50%
et al. E colaboradores
HDCV Human Diploid Cell Vaccine
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IgG Imunoglobulina G
IMMVJV Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge Vaitsman”
LO Latitude Oeste
log
10
Logaritmo em base 10
LS Latitude Sul
mg Miligrama
MgSO4 Sulfato de magnésio
min Minuto
mL Mililitro
N/A Não se aplica
NIH National Institutes of Health
NR Não Realizada
p/v Peso por volume
pb Pares de base
PBS Phosphate Buffered Saline
PCECV Purified Chick Embryo Cell Vaccine
pH Potencial Hidrogeniônico
PM Pitman-Moore
Proteína G Glicoproteína
Proteína N Nucleoproteína
PV Pasteur Virus
RNA Ácido ribonucléico
RNA-i Ácido ribonucléico interferente
RNP Ribonucleoproteína
RPC Rabies Peripheral Challenge
RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction
seg Segundo
SP Signal Peptide
SNC Sistema Nervoso Central
UI Unidade Internacional
V-RG Vaccinia-Rabies Glycoprotein Recombinant Virus Vaccine
Observação: Em função do uso consagrado na literatura técnica, algumas
abreviaturas utilizadas seguem as iniciais da sua grafia no idioma inglês.
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
> Maior
ºC graus Celsius
Φ Phi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema do vírus da raiva em secção longitudinal. Fonte:
http://www.cdc.gov/rabies/virus.html. Acesso em: 15 Jan.
2008................................................................................................ 21
Figura 2 - Esquema do vírus da raiva em secção transversal. Fonte:
http://www.cdc.gov/rabies/virus.html. Acesso em: 15 Jan.
2008............................................................................................... 21
Figura 3 - Esquema do genoma do vírus da raiva. Seqüência líder (seta
preta), seguida pelos genes N, P, M, G e L, e as regiões
intergênicas não-codificadoras (setas brancas). Adaptado de
http://www.cdc.gov/rabies/virus.html. Acesso em: 15 jan. 2008..... 21
Figura 4 - Distribuição, por municípios, dos casos diagnosticados positivos
para a raiva no Estado do Rio de Janeiro, no período de 2001 a
2007, segundo dados dos livros de registro do Laboratório de
Biologia Animal – Pesagro e do Instituto Municipal de Medicina
Veterinária “Jorge Vaitsman” - Rio de Janeiro – 2007....................
32
Figura 5 - Distribuição dos casos de raiva humana, de 1980 a 2005, por
regiões geográficas do Brasil, de acordo com os dados do
Ministério da Saúde (2008)............................................................. 33
Figura 6 - Mapa do Estado do Rio de Janeiro, destacando os Municípios
onde foram isoladas as amostras utilizadas deste trabalho (em
vermelho)........................................................................................ 39
Figura 7 - Dendograma da relação filogenética estabelecida entre as
amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos na Seção de
Diagnóstico de Raiva do IMMVJV (em vermelho) e de outras
espécies isoladas no Brasil (Quadro 7), com base na seqüência
de 1,353 bp do gene da proteína N – Rio de Janeiro - 2008......... 55
Figura 8 - Dendograma da relação filogenética estabelecida entre as
amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos na Seção de
Diagnóstico de Raiva do IMMVJV e as amostras padrão CVS
(GenBank – nº acesso AF406694), PM (GenBank – nº acesso
AJ871962) e PV (GenBank – nº acesso M13215, com base na
seqüência de 1,575 bp do gene da proteína G – Rio de Janeiro
– 2008............................................................................................ 56
Figura 9 - Alinhamento das seqüências de nucleotídeos do gene da
proteína G de amostras vírus da raiva isoladas de morcegos,
com as amostras padrão CVS, PV e PM. Em destaque:
substituição de uma citosina (C) por uma guanina (G), na
posição 392, nas amostras 704/97 e 151/98 – Rio de Janeiro –
2008............................................................................................... 61
Figura 10 - Alinhamento e tradução das seqüências de nucleotídeos do
gene da proteína G das amostras do vírus da raiva isoladas de
morcegos e das amostras padrão CVS, PV e PM. Destaque em
linha tracejada para a região do peptídio-sinal (ou SP – Signal
Peptide) e para o domínio transmembrana. Caixas de linha
contínua indicam os principais sítios antigênicos e epítopos. Phi
(φ) indica os resíduos envolvidos na patogenicidade. Círculo
destaca a substituição presente na posição 118 das amostras
704/97 e 151/98 – Rio de Janeiro - 2008.....................................
64
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Dados descritivos das amostras do vírus da raiva isoladas de
morcegos na Seção de Diagnóstico de Raiva do Instituto
Municipal de Medicina Veterinária “Jorge Vaitsman” – Rio de
Janeiro - 1990 – 2004................................................................... 39
Quadro 2 - Relação dos primers utilizados para o RT-PCR das amostras
quanto ao gene da proteína G...................................................... 42
Quadro 3 - Relação dos primers utilizados para o seqüenciamento genético
das amostras quanto ao gene da proteína G............................... 42
Quadro 4 - Descrição dos primers utilizados para o RT-PCR e para o
seqüenciamento genético das amostras quanto ao gene da
proteína G..................................................................................... 43
Quadro 5 -
Relação dos primers utilizados para o RT-PCR e para o
seqüenciamento genético das amostras quanto ao gene da
proteína N..................................................................................... 44
Quadro 6 - Descrição dos primers utilizados para o RT-PCR e para o
seqüenciamento genético das amostras quanto ao gene da
proteína N..................................................................................... 44
Quadro 7 - Relação das amostras de vírus da raiva disponíveis no
GenBank que foram utilizadas para a construção da árvore
filogenética, quanto ao gene da proteína N, das amostras
isoladas de morcegos – Rio de Janeiro – 2008........................... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Períodos médios de incubação, em dias, observados em
sucessivas passagens em camundongos, das amostras de vírus
da raiva isoladas em morcegos, na Seção de Diagnóstico de
Raiva do IMMVJV – Rio de Janeiro – 2005....................................
50
Tabela 2 - Resultados da titulação viral em camundongos das amostras do
vírus da raiva padrão CVS e isoladas de morcegos, e sua
variância, realizadas em triplicata na Seção de Diagnóstico de
Raiva do IMMVJV- Rio de Janeiro – 2005...................................... 51
Tabela 3 - Resultados dos ensaios imunológicos em valores absolutos e
percentuais dos camundongos sobreviventes, por diluição da
vacina anti-rábica, de acordo com a amostra utilizada para o
desafio viral, realizado na Seção de Diagnóstico de Raiva do
IMMVJV – Rio de Janeiro – 2005-2007..........................................
52
Tabela 4 - Resultados das DE
50
calculadas por Probito, e das DP
50
calculadas pelo método Reed e Müench e obtidas a partir do
desafio viral (DL
50
) dos camundongos vacinados com a vacina
anti-rábica de uso humano, utilizando-se a amostra do vírus da
raiva padrão CVS e as amostras isoladas de morcego, realizado
na Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV – Rio de Janeiro
– 2007-2008...................................................................................
53
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................... 20
2 OBJETIVOS............................................................................................. 37
3 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 38
3.1 MATERIAIS............................................................................................. 38
3.1.1 Amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos................................... 38
3.1.2 Amostra padrão CVS (Challenge Virus Standard)................................... 40
3.1.3 Animais.................................................................................................... 40
3.1.4 Diluente.................................................................................................... 40
3.1.5 Conjugado anti-rábico imunofluorescente................................................ 41
3.1.6 Vacina anti-rábica de uso humano........................................................... 41
3.1.7 Vacina anti-rábica referência.................................................................... 41
3.1.8 Primers..................................................................................................... 42
3.2 MÉTODOS............................................................................................... 44
3.2.1 Imunofluorescência direta........................................................................ 44
3.2.2 Titulação das amostras padrão CVS e isoladas de morcegos................. 45
3.2.3 Ensaio imunológico em camundongos..................................................... 46
3.2.4 Caracterização genética........................................................................... 47
3.2.5 Análise filogenética.................................................................................. 48
3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL....................................................... 49
4 RESULTADOS........................................................................................ 50
5 DISCUSSÃO............................................................................................ 65
6 CONCLUSÕES........................................................................................ 72
REFERÊNCIAS....................................................................................... 73
20
1 INTRODUÇÃO
A raiva é uma antropozoonose à qual o ser humano torna-se exposto
geralmente através da mordedura de animais infectados (ACHA; SZYFRES, 2003).
Todos os mamíferos terrestres e especialmente os morcegos podem se infectar e
transmitir a doença. Entretanto, a importância da cada espécie animal na
epidemiologia da raiva varia de acordo com a região geográfica (BRASS, 1994).
A despeito de todos os avanços científicos desde sua descoberta na
Antiguidade e da disponibilidade de vacinas efetivas para uso humano e animal, por
sua evolução freqüentemente fatal e pelo elevado número anual de casos humanos
e animais, a raiva continua representando um importante problema de saúde pública
em todo o mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005). Nas Américas, a falta
de sistemas adequados de informação e vigilância epidemiológica, na maioria dos
países, não permite conhecer a magnitude real do problema (BELOTTO et al.,
2005).
Subestimar a raiva em termos de suas implicações em saúde leva as
autoridades em saúde pública e em saúde animal ao equívoco de perceber a raiva
como uma doença rara em humanos, resultante da mordida de um animal sem
importância econômica (o cão). Desta forma, a raiva freqüentemente se encontra
entre duas jurisdições, não sendo tratada de modo adequado nem pelo Ministério da
Saúde, nem pelo Ministério da Agricultura (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2001).
O agente etiológico da raiva é um vírus pertencente à ordem
Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus (do grego lyssa= fúria)
(WUNNER, 2002). O vírus da raiva apresenta forma cilíndrica semelhante a de um
projétil, com uma extremidade arredondada e outra mais plana e um tamanho médio
de 180 nm de comprimento por 80 nm de diâmetro, variando de acordo com a
amostra considerada. Seu nucleocapsídeo helicoidal é constituído de uma molécula
de RNA unifilamentoso e uma estrutura protéica composta por três proteínas, L
21
(proteína RNA polimerase RNA dependente), P (fosfoproteína) e N (nucleoproteína),
que formam o complexo ribonucleoproteína (RNP). No envelope viral, originário da
célula hospedeira, estão inseridas as espículas de glicoproteína (Figuras 1 e 2)
(GONÇALVES; VON HUBINGER; WERMELINGER, 2002; BATISTA; FRANCO;
ROEHE, 2007).
Figura 1 – Esquema do vírus da raiva em
secção longitudinal
Fonte: http://www.cdc.gov/rabies/virus.html
Acesso em: 15 Jan. 2008.
Figura 2 – Esquema do vírus da raiva em
secção transversal
Fonte: http://www.cdc.gov/rabies/virus.html
Acesso em: 15 Jan. 2008.
O genoma do vírus da raiva é composto por uma fita simples não
segmentada de RNA não infeccioso, de polaridade negativa, cujo tamanho varia de
11 a 15 kb e peso molecular de 3,5 a 4,6 x 10
6
daltons (KOPROWSKI, 1991;
GONÇALVES; VON HUBINGER; WERMELINGER, 2002). O RNA genômico é
transcrito em cinco RNAs mensageiros subgenômicos, os quais são traduzidos em
cinco proteínas: N, P, proteína de matriz (M), glicoproteína (G) e L (Figura 3)
(FENNER et al., 1992).
Figura 3 - Esquema do genoma do vírus da raiva. Seqüência líder (seta preta),
seguida pelos genes N, P, M, G e L, e as regiões intergênicas não-
codificadoras (setas brancas). Adaptado de http://www.cdc.gov/rabies
/virus.html. Acesso em: 15 jan. 2008
22
A proteína N ou núcleoproteína é um polipeptídeo de 450 aminoácidos,
potencialmente imunogênica, produzida em abundância durante a infecção viral, a
partir da expressão do gene N (TORDO, 1996). Apresenta menor variabilidade
genética sendo caracterizada como mais adequada para a tipificação de amostras
dentro do gênero Lyssavirus (BOURHY et al., 1992), para fins diagnósticos de
amostras em decomposição (WOLDEHIWET, 2005) e no exame ante-mortem de
amostras de tecido da pele da nuca (folículo piloso) em casos de suspeita de raiva
humana (MACEDO et al., 2006).
A proteína G ou glicoproteína apresenta um ectodomínio amino-terminal
glicosilado de 439 aminoácidos, um segmento transmembrana com 22 aminoácidos
e um domínio citoplasmático de 44 aminoácidos (ANILIONIS; WUNNER; CURTIS,
1981). No domínio extracelular da glicoproteína da amostra padrão CVS (Challenge
Virus Standard) existe dois sítios antigênicos principais, a saber: o sítio II, que se
estende do aminoácido 34 ao 42, e do aminoácido 198 ao 200 (PREHAUD et al.,
1988); o sítio III, localizado do aminoácido 330 ao 338 (SEIF et al., 1985) e um
menor, o sítio “a”, representado pelos aminoácidos 342 e 343 (BENMANSOUR et
al., 1991), todos definidos pela possibilidade de ligação com diferentes anticorpos
monoclonais. O ectodomínio possui um papel fundamental na interação do vírus
com a célula-alvo, pois está envolvido com o reconhecimento do receptor viral, com
a fusão do vírus com a membrana celular, patogenicidade, além de ser o principal
alvo para o qual o sistema imune do hospedeiro está voltado (TORDO et al., 2000).
Nas amostras de vírus clássico da raiva, a neurovirulência parece estar
diretamente relacionada com a manutenção de um resíduo de arginina ou lisina na
posição 333 (sítio III). Mutantes com substituição de outro aminoácido nesta posição
não podem infectar certos tipos de neurônios, provavelmente porque não são
capazes de reconhecer seu receptor celular (DIETZSCHOLD et al., 1983).
Entretanto, o vírus Mokola, que é altamente neuropatogênico em camundongos,
possui um resíduo de aspartato na posição 333 (TORDO, 1996). De fato, os
mecanismos patogênicos da raiva são complexos, sendo improvável que sejam
explicados somente por diferenças entre as variantes virais (HEMACHUDHA et al.,
2003).
23
A proteína G é responsável pela indução da produção de anticorpos
neutralizantes no hospedeiro e media a ligação do vírus a receptores específicos na
superfície da célula-alvo e a fusão do envelope viral com a membrana do
endossoma, para permitir a liberação do complexo ribonucleoproteína no citoplasma
da célula. A glicoproteína ainda está envolvida na patogênese da raiva e acredita-se
que seja responsável por pelo menos parte do neurotropismo do vírus (TORDO,
1996).
A caracterização genética dos genes N, P e G permitiu o delineamento de
sete genótipos, confirmando e expandindo a caracterização antigênica anterior,
obtida com o uso de um painel de anticorpos monoclonais contra a nucleoproteína
viral (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005). Assim, o gênero Lyssavirus foi
subdividido em: vírus clássico da raiva, genótipo I; vírus Lagos bat, genótipo II,
isolado de morcegos frugívoros Eidolon helvum, na Nigéria, em 1956, em morcegos
Micropterus pusillus, na República Central Africana, em 1974, e ainda, de 1980 a
1990 o vírus foi isolado em um cão, quatro morcegos e dois gatos; vírus Mokola,
genótipo III, o lyssavírus mais distante geneticamente do genótipo I, isolado do
musaranho Crocidura sp., em duas crianças na Nigéria, sendo uma em 1968 e outra
em 1971, e em gatos na África do Sul, em 1995 e em 1998; vírus Duvenhage,
genótipo IV, o mais raro dos lyssavírus, isolado originalmente de um humano que foi
mordido por um morcego na África do Sul, em 1970, e em morcegos Miniopterus
sp., em 1981 e em 1986; European Bat Lyssavirus 1, genótipo V, isolado de
morcegos Eptesicus serotinus, na Europa; European Bat Lyssavirus 2, genótipo VI,
isolado de morcegos Myotis dasycneme e Myotis daubentonii, na Europa; e
Australian Bat Lyssavirus, genótipo VII,) isolado de cinco espécies de morcegos,
com relatos de dois casos em humanos em 1996 (RUPPRECHT et al., 1991;
TORDO, 1996; ARAI et al., 2003; NEL, 2003).
Durante um estudo investigativo da atividade dos lyssavírus em morcegos da
região de Osh, no sudeste do Quirguistão, Ásia Central, foi isolada uma amostra
viral cuja análise filogenética não se enquadrava nos padrões dos lyssavírus
conhecidos e, por este motivo, os autores sugeriram a inclusão de um novo
genótipo, denominado Aravan Virus (ARAI et al., 2003).
24
Outros vírus relacionados ao vírus rábico têm sido isolados de morcegos na
Eurásia: Khujand Virus, isolado de um morcego Myotis mystacinus, no Norte do
Tajiguistão, em 2001; Irkut Virus, isolado de um morcego Murina leucogaster, no
Leste da Sibéria, em 2002; e West Caucasian Bat Virus, isolado de um morcego
Miniopterus schreibersi, na parte ocidental das Montanhas do Cáucaso, a 150 Km
da fronteira leste da Turquia, em 2002. O Aravan Virus, junto com o Khujand Virus,
o Irkut Virus e os genótipos I, IV, V e VI, formam o filogrupo I, enquanto o filogrupo II
é constituído pelos dois vírus africanos divergentes, genótipos II e III, e o mais
divergente de todos eles, o West Caucasian Bat Virus (FOOKS, 2004).
Vários estudos filogenéticos utilizando o seqüenciamento parcial ou total dos
genes N, G, P e M foram realizados com amostras do vírus da raiva isoladas no
Brasil (ITO el al., 2001; ROMIJN, 2003; SCHAEFER et al., 2005; KOBAYASHI et al.,
2007a). Ito et al. (2001), analisando 203 nucleotídeos do gene da proteína N de 50
amostras oriundas do Brasil, demonstraram que as amostras se dividiam em dois
grupos: variante relacionada ao cão e variante relacionada ao morcego hematófago.
Em um estudo posterior com as mesmas amostras, mas tendo o gene da proteína G
como alvo, Sato et al. (2004) observaram o mesmo padrão de classificação. Em
adição, Carnieli et al. (2006), realizando a análise do perfil genético de amostras
brasileiras isoladas de carnívoros, revelaram a existência de dois grupos: variante
relacionada a carnívoro doméstico e variante relacionada a carnívoro silvestre.
Resultados semelhantes foram encontrados por Kobayashi et al. (2007b) e Shoji et
al. (2006), estudando canídeos silvestres do Nordeste Brasileiro.
O vírus da raiva geralmente penetra no hospedeiro suscetível por lesões na
pele provocadas, na maioria das vezes, pela mordedura de um animal infectado, que
esteja eliminando o vírus pela saliva. A infecção também pode ocorrer por feridas ou
soluções de continuidade da pele quando em contato com a saliva e tecidos de
animais contaminados, a partir do contato com aerossóis (FISHBEIN, 1991),
transplante de córnea (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION,
1992) e de órgãos sólidos (TORDO, 1996; SRINIVASAN et al., 2005). A partir do
sítio de entrada, o vírus pode alcançar diretamente os nervos periféricos. Entretanto,
na maioria das vezes há primeiramente uma amplificação da quantidade de vírus por
25
replicação nas células musculares, por períodos que podem variar de dias a meses,
ou até mesmo anos. A seguir, o vírus penetra nos terminais distais, invadindo o
sistema nervoso periférico através das terminações motoras e sensoriais. A infecção
neuronal é centrípeta, com a liberação do vírus no sistema nervoso central (SNC),
geralmente a partir dos gânglios espinhais. Ao atingir o SNC, o curso do vírus ao
cérebro é rápido, onde então causa uma encefalomielite aguda caracterizada por
paralisia muscular progressiva, coma e parada respiratória seguida de morte (BAER;
LENTZ, 1991; TORDO, 1996; GONÇALVES; VON HUBINGER; WERMELINGER,
2002).
Concomitantemente com a replicação viral no SNC, o vírus é disseminado de
forma centrífuga, através dos nervos periféricos, para diversos órgãos, incluindo o
coração, pulmão, rim, ureter, bexiga, pâncreas, fígado, pele, timo, ovário, útero,
glândula adrenal, baço, estômago, intestinos, músculo, retina, córnea, gordura
interescapular (nos morcegos) e, principalmente, as glândulas salivares (SILVA;
SOUZA, 1966; GERMANO et al., 1988; BRASS, 1994; JOGAI; RADOTRA;
BANERJEE, 2002; SCHEFFER et al., 2007). A presença do vírus nas glândulas
salivares, com sua eliminação pela saliva, torna possível a principal via de
transmissão da doença, que é a mordedura por animais raivosos, especialmente os
carnívoros.
Em humanos, após um período de incubação variável, a infecção pelo vírus
da raiva determina o aparecimento de sinais clínicos inespecíficos, que duram de 2 a
4 dias. O paciente apresenta mal-estar geral, pequeno aumento de temperatura,
anorexia, cefaléia, náuseas, dor de garganta, entorpecimento, irritabilidade,
inquietude e sensação de angústia, podendo ocorrer ainda, hiperestesia e parestesia
no trajeto dos nervos periféricos próximos ao local da mordedura e alterações de
comportamento. Com a progressão da infecção, surgem manifestações de
ansiedade e hiperexcitabilidade crescentes, febre e espasmos musculares
involuntários generalizados, os quais evoluem para um quadro de paralisia.
Observa-se, ainda, a presença de disfagia, aerofobia, hiperacusia e fotofobia. O
paciente se mantém consciente, com períodos de alucinações, até o
estabelecimento do estágio comatoso, após o qual advém o óbito (FISHBEIN, 1991).
26
Embora as proteínas do vírus da raiva sejam altamente imunogênicas, a
resposta imune contra o vírus é muito débil para conferir proteção durante sua fase
de movimentação desde o sítio de entrada até o SNC. Ao espalhar-se pelo SNC, o
desenvolvimento de sinais clínicos ocorre com o mínimo de resposta imune, pois o
vírus fica isolado dos anticorpos e células imunes pela barreira hemato-encefálica
(GONÇALVES; VON HUBINGER; WERMELINGER, 2002).
Quando a resposta imune antiviral acontece, seja tardiamente na infecção
pelo vírus da raiva, seja após a vacinação, observa-se uma mistura de resposta
imunológica específica (humoral ou mediada por células) e não-específica (atuação
dos macrófagos). A apresentação dos antígenos feita pelos macrófagos é crucial
para a produção de anticorpos pelos linfócitos B e para a estimulação de linfócitos T-
auxiliares que, por sua vez, produzirão diferentes citocinas envolvidas na eliminação
direta do vírus ou das células infectadas. Entretanto, a estimulação de linfócitos B
para a síntese de imunoglobulinas geralmente não ocorre até os sinais clínicos
aparecerem e o título de anticorpos neutralizantes permanece baixo até a fase
terminal da doença, atingindo seu pico próximo da morte do hospedeiro (ZANETTI,
2003).
A observação clínica permite levar somente à suspeição da raiva, pois os
sinais da doença não são característicos e podem variar de um animal a outro ou
entre indivíduos de uma mesma espécie. Não existe, até o momento, um teste
diagnóstico laboratorial conclusivo antes da morte do hospedeiro infectado que
expresse resultados absolutos. No entanto, existem procedimentos laboratoriais
padronizados internacionalmente para que se realize o diagnóstico post mortem de
amostras de animais ou humanos suspeitos de raiva (ORGANISATION MONDIALE
DE LA SANTÉ ANIMALE, 2008). O diagnóstico laboratorial pode ser realizado
utilizando-se principalmente dois tipos de procedimentos de rotina: o teste de
imunofluorescência direta nos tecidos removidos do SNC, seguido do isolamento
viral em camundongos ou em cultivo celular (BRASIL, 2008a).
Dois ciclos epidemiológicos da raiva podem ser identificados na natureza. A
raiva silvestre é mantida em carnívoros e morcegos na América do Norte, Europa e
27
África. Na raiva urbana, a doença é mantida na população de cães e gatos
domésticos na América Latina, África e Ásia. Na América Latina verifica-se ainda
uma situação particular, onde prevalece um ciclo silvestre mantido por morcegos
hematófagos, cujo principal transmissor é o morcego Desmodus rotundus, o qual
determina grandes prejuízos à pecuária (ciclo rural) e sérios riscos à saúde pública
devido à possibilidade de ataques a seres humanos (BRASS, 1994).
No mundo, 99% dos casos de raiva humana ocorrem nos países em
desenvolvimento e o cão ainda é o principal reservatório do vírus, sendo responsável
por 92% dos tratamentos anti-rábicos pós-exposição (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2005).
O mais importante reservatório da raiva na Europa é a raposa (Vulpes
vulpes), responsável por mais de 75% dos casos de raiva. Na América do Norte,
onde a raiva em animais domésticos foi controlada através da vacinação, espécies
silvestres como as raposas (Urocyon cinereoargentus e V. vulpes), os skunks
(Mephites mephites e Spilogale gracilis), os raccoons (Procyon lotor) e os morcegos
insetívoros são responsáveis pela circulação do vírus da raiva na natureza (KING;
TURNER, 1993; MESSENGER et al., 2003; WOLDEHIWET, 2005).
Na América Latina, a raiva ocorre principalmente em carnívoros silvestres e
em morcegos hematófagos. Em 2004, foram registrados 975 casos de raiva canina
em 14 países da região, tendo o maior número de casos ocorrido na Bolívia (355),
seguido de El Salvador (194), Venezuela (142) e Brasil (104) (SCHNEIDER et al.,
2005). Em nosso país, no ano de 2006, somente nas regiões Norte e Nordeste
foram registrados 75 casos de raiva canina (BRASIL, 2007).
No Brasil, de 1990 a 2000, os cães domésticos foram os responsáveis por
76% dos casos notificados, seguido dos morcegos, com 11% de participação nas
notificações (BRASIL, 2002). No país, identificações positivas de vírus da raiva já
foram descritas em mamíferos silvestres pertencentes à ordem Chiroptera
(morcegos hematófagos e não-hematófagos); Carnivora, nas famílias Canidae (cão,
cachorro-do-mato e raposa), Procyonidae (guaxinim, quati), Mustelidae (furão) e
28
Felidae (felinos); Marsupialia, na família Didelphidae (gambá); da ordem Primata,
nos primatas não-humanos das famílias Callithricidae (sagüi) e Cebidae (bugio,
macaco-prego, macaco-aranha) (INSTITUTO PASTEUR, 2002).
Os reservatórios mais conhecidos e considerados eficientes na transmissão
da raiva sempre foram espécies da ordem Carnivora, especialmente os canídeos,
pelo seu comportamento, geralmente agressivo, quando afetados pelo vírus.
Entretanto, no Brasil, espécies da ordem Chiroptera apresentam-se como
transmissores emergentes, em função do aumento da ocorrência de casos de raiva
humana transmitida por morcego hematófago (BRASIL, 2004). Em um estudo
epidemiológico dos casos de raiva humana em Portel (Pará), em 2004, verificou-se
que 1.558 pessoas da região do surto apresentaram histórico de agressão por
morcego hematófago (ROSA et al., 2006).
Carini (1911) foi o primeiro pesquisador a realizar o diagnóstico da raiva
bovina nas Américas, durante um surto em Santa Catarina, no sul do Brasil, tendo
sido ainda o primeiro a considerar o papel dos morcegos hematófagos como
transmissores da doença. Porém, sua assertiva só foi aceita após várias
investigações realizadas na mesma área por Haupt e Rehaag
1
(1921 apud BAER,
1991).
Quirópteros não-hematófagos podem transmitir raiva a suas vítimas, no caso
de mordeduras defensivas. Nos Estados Unidos, todos os estados, exceto o Havaí e
o Alasca, já reportaram casos de raiva em morcegos insetívoros (Lasiurus
intermedius, L. cinereus, L. seminola, Lasionycteris noctivagans, etc) e, embora a
maior parte dos animais silvestres diagnosticados positivos para a raiva sejam de
outras espécies, como os skunks, raccoons e raposas, quase todos os óbitos
humanos por raiva são associados a morcegos insetívoros (BRASS, 1994;
MESSENGER et al., 2003).
1
HAUPT, H.; REHAAG, H. Durch Fledermaeuse verbreitete seuchenhafte. Tollwut unter
Viehbestaenden in Santa Catarina (Sued-Brasilien).Zeitschrift. für. Infektionskrankh.Haustiere v.22,
p.76–88, p.104–127, 1921.
29
A raiva em morcegos hematófagos é um problema limitado à América Latina e
a algumas ilhas do Caribe, com a infecção pelo vírus rábico tendo sido comprovada
nas três espécies de morcegos hematófagos – Desmodus rotundus, Diphylla
ecaudata e Diaemus youngii, mas somente o D. rotundus é considerado de
importância epidemiológica. Na América Latina, os quirópteros, em especial os
hematófagos, representam o segundo maior grupo de animais responsável pela
transmissão da raiva para humanos e o primeiro para herbívoros. Outros animais
domésticos, como por exemplo, bovinos, eqüinos, caprinos, ovinos, suínos e
bubalinos, apresentam potencial de transmissão ao homem em casos esporádicos
(ACHA; SZYFRES, 2003).
O D. rotundus é a espécie de morcego hematófago com maior densidade
populacional e versatilidade para a exploração diversificada e oportunista de abrigos
e fonte de alimentos, possuindo ainda forte capacidade de se adaptar a novas
situações. Tendem a constituir grupos concentrados e viver em grandes colônias,
geralmente em locais de difícil acesso como covas, cavernas, ocos de árvores,
tubulações, galerias de águas pluviais, casas abandonadas e outros locais úmidos e
escuros (MÉNDEZ, 1972). Para se alimentar, o D. rotundus pode voar até 20 Km por
noite à procura de alimentos (MÁLAGA-ALBA, 1954).
Os morcegos hematófagos, que necessitam se alimentar diariamente, embora
tenham preferência por sangue de bovinos, eqüinos, suínos e aves, utilizam
humanos, especialmente crianças, como sua principal fonte de alimentos. E este fato
vem ocorrendo no Brasil em função da acentuada interferência do homem no meio
ambiente por migrações para áreas inexploradas, alterando processos produtivos e
provocando modificações no equilíbrio ecológico (KOTAIT, 2007).
A invasão crescente de morcegos hematófagos e não-hematófagos nas áreas
urbanas resulta em grande problema à saúde pública, devido ao contato mais
próximo com seres humanos provocado pela adaptação a abrigos artificiais. Na
cidade do Rio de Janeiro, o refúgio de morcegos em forros de edificações é um
problema freqüentemente relatado pelos moradores da cidade à Fundação RIOZOO
(ESBÉRARD, 2003).
30
Acha e Szyfres (2003) estimam que na América Latina, a mortalidade anual
devido à raiva é de 50.000 cabeças de gado, ao que somado a perdas indiretas de
carne e leite, além da desvalorização de peles danificadas pela mordedura de
morcegos hematófagos, representa um prejuízo anual de US$ 44 milhões.
No período de 1995-2005, 34.044 casos de raiva em diferentes espécies
animais foram notificados (BRASIL, 2008a). Em áreas rurais não é feita a cobertura
vacinal adequada em herbívoros e, mesmo em animais ditos vacinados, há a
ocorrência de casos de raiva (RODRIGUES DA SILVA et al., 2000). Com o
funcionamento adequado de um programa de cobertura vacinal, mesmo com a
presença de morcegos hematófagos, principais transmissores da raiva nessas
áreas, seria possível manter uma ocorrência aceitável e plenamente controlada da
doença (KOTAIT et al., 1998).
Entretanto, a vacinação apenas controla a ocorrência de casos clínicos. Para
o controle efetivo da raiva, deve-se controlar a população de morcegos D. rotundus
através de métodos seletivos, não causando danos ou transtornos a outras espécies
de morcegos não-relacionadas à raiva, que são importantes na manutenção do
equilíbrio ecológico na natureza. No método seletivo direto, há a necessidade da
captura do morcego e posterior aplicação da “pasta vampiricida”, composta por
warfarina, sobre o dorso do animal. Em função de seu hábito de higiene, outros
morcegos D. rotundus irão ingerir o produto químico por lambedura, vindo a óbito em
conseqüência de hemorragias internas. O método seletivo indireto consiste na
aplicação tópica do mesmo produto químico ao redor das mordeduras recentes de
morcegos hematófagos no herbívoro espoliado (NOGUEIRA, 2003; BRASIL, 2005).
Dado o sucesso no controle da raiva em algumas espécies silvestres, obtido
em países como Canadá e Estados Unidos da América pelo uso de iscas de vacina
anti-rábica recombinante (Vaccinia-Rabies Glycoprotein Recombinant Virus Vaccine
– V-RG), de uso oral, Almeida et al. (2005) realizaram a imunização oral indireta de
morcegos D. rotundus, através de sua captura e posterior aplicação, no dorso do
animal, de uma pasta de veículo neutro contendo a vacina V-RG. Como Aguilar-
Sétien et al. (1998), aqueles autores concluíram que seus resultados foram
31
promissores e, com o desenvolvimento de novos estudos a respeito, é possível que
este método se torne uma opção futura para o controle da raiva na população do D.
rotundus.
Um dos critérios importantes na definição de áreas epidêmicas de raiva é a
topografia acidentada, com conseqüente manutenção da população de morcegos
hematófagos e permanente circulação do vírus. Por este motivo, a atividade de
controle populacional do D. rotundus não pode sofrer descontinuidade e o órgão
oficial de Defesa Agropecuária deverá manter equipes, compostas de um médico
veterinário e no mínimo três auxiliares, para o desenvolvimento destas atividades
(KOTAIT et al., 1998).
No Estado do Rio de Janeiro, tem-se verificado o aumento do número de
municípios com casos de animais diagnosticados positivos para a raiva, conforme os
dados dos livros de registro do Laboratório de Biologia Animal da Pesagro (2007) e
do Laboratório de Diagnóstico da Raiva - Instituto Municipal de Medicina Veterinária
“Jorge Vaitsman” (IMMVJV) (2007), ilustrados na figura 4. Somente no ano de 2006,
foram registrados 99 casos de raiva em herbívoros, 8 casos em morcegos não-
hematófagos e 2 casos em canídeos silvestres (BRASIL, 2007).
Devido à implementação maciça da campanha de vacinação anti-rábica
animal, a cidade do Rio de Janeiro, apresentou uma drástica queda no número de
casos de raiva em cães e gatos, passando de 531 cães e 58 gatos positivos em
1981 a apenas um cão positivo em 1986 e um gato positivo em 1992. Desde então,
o ciclo urbano da raiva é considerado extinto nesta cidade (INSTITUTO MUNICIPAL
DE MEDICINA VETERINÁRIA JORGE VAITSMAN, 2007).
Em uma série histórica publicada pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2008b),
verifica-se uma maior concentração dos casos de raiva humana na Região Nordeste
do país, com 768 casos de raiva notificados, no período de 1980 a 2005, confrome
ilustra a figura 5.
32
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
200204060km
Rio de Janeiro
SÃO PAULO
MINAS GERAIS
ESPÍRITO
SANTO
RAIVA 2000
LBA/Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
20 0 20 4060km
RiodeJaneiro
S
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OP
A
ULO
MIN
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SGER
A
IS
ESPÍRITO
SANTO
RAIVA 2001
LBA
/
Pesagro-IMMV
JV
Fonte: Centro d e Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
20 0 20 40 60 k m
Rio de Janeiro
SÃO PAULO
MINAS GERAIS
ESPÍRITO
SANTO
RAIVA 2002
LBA/Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
200 204060km
Rio de Janeiro
S
Ã
OP
A
ULO
ESPÍRITO
SANTO
RAIVA 2003
LBA
/
Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
20 0 20 4060km
Rio de Janeiro
SÃO PAULO
MINAS GERAIS
ESPÍRITO
SANTO
RAIVA 2004
LBA/Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
20 0 20 40 60 k m
RiodeJaneiro
S
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OP
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MIN
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ESPÍRITO
SANTO
RAIVA
2005
L
BA
/
Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
20 0204060km
Rio de Janeiro
SÃO PAULO
ESPÍRITO SANTO
RAIVA 2006
LBA/Pesagro-IMMVJV
Fonte: Centro de Informações eDados do Ri ode Janeiro- C IDE
20 0 20 40 60 km
RiodeJaneiro
S
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A
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MIN
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S
GER
A
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ESPÍRITO SANTO
RAIVA 2007
LBA
/
Pesagro-IMMVJV
Figura 4 – Distribuição, por municípios, dos casos diagnosticados positivos para a
raiva no Estado do Rio de Janeiro, no período de 2001 a 2007, segundo
dados dos livros de registro do Laboratório de Biologia Animal – Pesagro
e do Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge Vaitsman” - Rio de
Janeiro - 2007
33
Em 2004, uma situação atípica ocorreu às margens do rio Acuty Perera, no
município de Portel, no Estado do Pará, com a detecção laboratorial de 15 casos de
raiva humana transmitida por morcegos hematófagos no período de um mês, um
evento que representou o maior surto de raiva transmitida por morcego registrado no
país (BRASIL, 2004; ROSA et al., 2006). No ano seguinte a este surto foram
registrados 42 casos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos na
Região Amazônica (KOTAIT et al., 2007).
Figura 5 – Distribuição dos casos de raiva humana, de 1980 a 2005, por regiões geográficas
do Brasil, de acordo com os dados do Ministério da Saúde (BRASIL, 2008b)
A profilaxia pré-exposição da raiva pelo uso da vacina anti-rábica é indicada
para pessoas em risco de exposição ao vírus devido a suas atividades profissionais,
tais como veterinários, laboratoristas, vacinadores, laçadores, treinadores de cães,
pesquisadores, espeleólogos, tratadores de animais domésticos de interesse
econômico, etc (COSTA et al., 2000). Para estes indivíduos, recomenda-se ainda a
avaliação laboratorial periódica dos níveis de anticorpos neutralizantes contra o vírus
(ZANETTI, 2003).
34
A profilaxia pós-exposição consiste da limpeza criteriosa da lesão e da
administração da vacina anti-rábica, isoladamente ou em associação com a
imunoglobulina anti-rábica humana, de acordo com a natureza da exposição e
espécie animal envolvida (COSTA et al., 2000).
Embora a raiva seja uma doença tida até então como fatal quando o
tratamento pós-exposição não é realizado, no ano de 2004, foi descrito o primeiro
caso de uma paciente recuperada da raiva clínica, sem administração de tratamento
pré ou pós-exposição, mas que foi submetida a um regime terapêutico que incluiu os
antivirais ribavarina e amantadina, além do anestésico dissociativo ketamina e do
sedativo midazolam (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION,
2004; WILLOUGHBY et al., 2005), mas a eficiência deste protocolo ainda não foi
reproduzida (McDERNID et al., 2008). Neste sentido, Brandão et al. (2007), ao
tratarem células BHK-21 (Baby Hamster Kidney) infectadas pelo vírus da raiva com
RNA interferente (RNAi), encontraram uma redução em cinco vezes do título viral e
acreditam que este achado seja promissor para o desenvolvimento de antivirais para
o tratamento da doença.
Por mais de 100 anos, a vacina anti-rábica originada de tecido nervoso,
Fuenzalida-Palácios, foi utilizada para a vacinação de humanos após a exposição a
animais raivosos. Estas vacinas são consideradas econômicas, mas possuem baixa
potência por dose e aquelas produzidas em cérebro de ovino ou caprino são
freqüentemente associadas a sérios efeitos adversos. A maioria da população dos
países pobres em risco de contrair a raiva ainda depende das vacinas originadas de
tecido nervoso, enquanto as vacinas produzidas com o vírus da raiva replicados em
cultivos celulares, consideradas seguras e altamente eficazes, estão disponíveis há
mais de 20 anos para as populações em menor risco de contrair a doença (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2002).
As vacinas anti-rábicas disponíveis para uso em humanos e animais são
todas de vírus inativado. Atualmente, a vacina utilizada nos programas de saúde
pública no Brasil é a vacina produzida em cultura de células Vero (Purified Vero Cell
Vaccine) e, em casos de reação de hipersensibilidade, utiliza-se a vacina produzida
35
em cultura de células diplóides humanas (Human Diploid Cell Vaccine - HDCV).
Ambas são bem toleradas e apresentam resposta e ocorrência de reações adversas
semelhantes (COSTA et al., 2000).
Cada lote de vacina anti-rábica liberada para uso deve possuir uma potência
adequada. O teste de potência recomendado pela Organização Mundial de Saúde
para a vacina anti-rábica é o National Institutes of Health (NIH), baseado na
vacinação de grupos de camundongos com múltiplas diluições da vacina, com
posterior desafio viral com a amostra padrão CVS (WILBUR; AUBERT, 1999).
Zanetti et al. (1998) estudaram a eficácia da vacina Fuenzalida-Palácios em
camundongos, utilizando os testes Habel e NIH, com a amostra padrão CVS, uma
amostra isolada de um bovino e outra originária de um morcego, e verificaram que,
nos ensaios NIH com as amostras de campo, este teste sempre apresentou
resultados inferiores a 1.0 UI/mL, quando valor de liberação de um lote de vacina
anti-rábica humana para este teste de potência é 2,5 UI/mL.
Barth, Diderrich e Weinemann (1988) investigaram as possíveis causas da
baixa reprodutibilidade do teste NIH por ensaios com a vacina referência
internacional produzida com a amostra padrão CVS, e a vacina anti-rábica humana
produzida em células de embrião de galinha (PCECV – Purified Chick Embryo Cell
Vaccine) com a amostra Flury LEP-C 26, e verificaram que ambas as vacinas
apresentaram maior eficácia quando o vírus-desafio utilizado foi homólogo ao da
produção da vacina.
Dietzschold e Hooper (1998) comparando a vacina HDCV com a vacina
PCECV, usou uma amostra isolada de morcego insetívoro e outra isolada de cão
como vírus-desafio no teste NIH e vírus de trabalho no teste sorológico de humanos
vacinados e encontraram uma correlação direta entre a eficácia das vacinas
utilizadas em camundongos e o título de anticorpos em humanos vacinados,
considerando, então, ambas as vacinas como protetoras frente às amostras de
campo. Piza et al. (2002) não encontraram a mesma correlação entre os resultados
36
do teste NIH realizado em seis lotes de uma vacina HDCV experimental e os
resultados da sorologia de bovinos vacinados.
A eficácia de duas vacinas de uso veterinário, uma brasileira e outra
importada, ambas produzidas pela replicação da amostra PV em células BHK-21, foi
verificada por Bernardi et al. (2005), que não encontraram diferenças significativas
entre os resultados para uma mesma amostra de vírus-desafio. Entretanto, para a
vacina importada, quando o ensaio de potência do CDC (Centers for Disease
Control) foi realizado com uma amostra isolada de morcego hematófago e outra
canina, a dose efetiva foi inferior que a encontrada nos ensaios com as amostras
isoladas de morcegos insetívoro, bovino e eqüino.
Apesar dos inúmeros ajustes realizados ao longo dos seus mais de 40 anos
de existência, o teste de potência NIH permanece sendo alvo de muitas críticas, por
apresentar desvantagens intrínsecas à sua metodologia, tais como: a via de
administração da dose do vírus desafio em camundongos, que não mimetiza a
infecção natural pelo vírus da raiva; a amostra do vírus da raiva padrão CVS
apresenta patogenia e neurotropismo diferentes da maioria das amostras isoladas a
campo; a via intra-peritoneal para a vacinação, com intervalo de sete dias, pode
levar a uma resposta imune diferente daquela induzida pela vacinação intramuscular
realizada; e ainda a baixa reprodutibilidade do método (BARTH; DIDERRICH;
WEINMANN, 1988; WUNDERLI et al., 2006).
Considerando-se o potencial de casos de raiva humana transmitida por
morcegos hematófagos e não-hematófagos em função de sua crescente
proximidade ao ambiente urbano, estudos que visem analisar a eficiência da
resposta imune humoral conferida pela vacina anti-rábica atualmente utilizada na
profilaxia pré e pós-exposição da raiva frente a amostras oriundas de morcegos são
necessários.
37
2 OBJETIVOS
Este trabalho teve por objetivos:
• Estudar amostras do vírus da raiva oriundas de morcegos hematófagos e
não-hematófagos diagnosticadas positivas no Estado do Rio de Janeiro, do
ano de 1990 a 2004, verificando:
- o comportamento biológico das amostras em camundongos;
- o efeito do desafio de camundongos previamente vacinados com a vacina
anti-rábica purificada produzida em cultura de células Vero, frente a
amostras isoladas de morcegos;
- a diversidade genética das amostras quanto ao gene da proteína N e ao
gene da proteína G, comparando com outras amostras do Brasil através
de dados disponíveis no GenBank .
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
Nesta seção serão descritos os materiais utilizados neste trabalho de tese.
3.1.1 Amostras do vírus da raiva
Foram utilizadas 10 amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos
hematófagos e não-hematófagos, no período 1990 a 2004, na Seção de Diagnóstico
de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge Vaitsman”, oriundas de
seis Municípios do Estado do Rio de Janeiro, a saber: Valença, Paracambi, Mesquita,
Rio de Janeiro, Itaperuna e Laje do Muriaé.
Todas as amostras foram diagnosticadas positivas para a raiva pela prova de
imunofluorescência direta, em impressões do tecido cerebral dos morcegos
suspeitos, verificando-se a presença de inclusões intracitoplasmáticas com
fluorescência característica da raiva, pelo uso de conjugado policlonal anti-rábico
imunofluorescente. Os resultados foram confirmados com o isolamento do vírus em
camundongos, através da realização da prova de inoculação intracerebral
(KOPROWSKI, 1996), pela presença de sinais clínicos característicos da raiva em
camundongos, após passar por um período de incubação e período clínico variável e
esperado para esta espécie, seguido de nova confirmação por imunofluorescência
direta.
As amostras deste trabalho se encontravam congeladas a –20ºC, liofilizadas e
com no mínimo uma passagem em camundongos. Seus dados de origem se
encontram no Livro de Registro da Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVIV e
estão resumidos no quadro 1 e ilustrados na figura 5.
39
CÓDIGO
DA
AMOSTRA
ANO ESPÉCIE ANIMAL
MUNICÍPIO PASSAGENS
222/90 1990
Tadarida laticaudata
Rio de Janeiro Terceira
419/90 1990
Tadarida laticaudata
Rio de Janeiro Primeira
704/97 1997
Desmodus rotundus
Itaperuna Terceira
151/98 1998
Desmodus rotundus
Laje do Muriaé Terceira
204/01 2001
Artibeus lituratus
Rio de Janeiro Terceira
399/02 2002
Artibeus fimbriatus
Rio de Janeiro Segunda
624/02 2002
Desmodus rotundus
Valença Segunda
755/02 2002
Artibeus sp.
Paracambi Segunda
046/04 2004
Nyctinomops laticaudata
Rio de Janeiro Primeira
384/04 2004
Artibeus sp.
Mesquita Primeira
Quadro 1 - Dados descritivos das amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos na Seção
de Diagnóstico de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterinária “Jorge
Vaitsman” – Rio de Janeiro - 1990 - 2004
Fonte: Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro - CIDE
200204060km
Itaperuna
Paracambi
Valença
Rio de Janeiro
SÃO PAULO
MINAS GERAIS
ESPÍRITO SANTO
Laje do
Muriaé
Rio de Janeiro - LS LO 43º12'27"
Mesquita - LS 22º46 55 LO 43º25 44
Paracambi - LS 22º36'39" LO 43º42'33"
Valença - LS 22º14'44" LO 43º42'01"
Laje do Muriaé - LS 21º12'23" LO 42º07'21"
Itaperuna - LS 21º12'18" LO 41º53'16"
'’' '’'
22 54'10"
o
624/02
755/02
384/04
222/90
419/90
204/01
399/02
046/04
151/98
704/97
Figura 6 - Mapa do Estado do Rio de Janeiro
2
, destacando os Municípios onde foram
isoladas as amostras utilizadas deste trabalho (em vermelho)
2
Centro de Informações e Dados do Rio de Janeiro – CIDE.
40
3.1.2 Amostra padrão CVS (Challenge Virus Standard) do vírus da raiva
Foi utilizada a amostra padrão CVS, cedida pelo antigo Centro Pan-
americano de Zoonoses, mantida por passagens em camundongos e acondicionada
sob a forma liofilizada a – 20 ºC, em sua trigésima oitava passagem na Seção de
Diagnóstico de Raiva do IMMVJV.
3.1.3 Animais
Foram utilizados camundongos albinos suíços (Mus musculus) procedentes
do Biotério do IMMVJV para as provas de inoculação intracerebral, estudo do
comportamento biológico das amostras de vírus rábico isoladas de morcegos, teste
imunológico e reativação e titulação das amostras de vírus. Todos os animais
sobreviventes ao final das provas foram submetidos à eutanásia por inalação do
anestésico halotano (2-bromo-2-cloro-1,1,1-trifluoretano).
3.1.4 Diluente
Para a preparação das suspensões de cérebros para a prova biológica e
diluição das amostras de vírus rábico foi utilizado um diluente constituído de solução
salina fisiológica esterilizada por autoclavagem, adicionada de penicilina (1000
UI/mL) e estreptomicina (2 mg/mL), no momento do uso, conforme Koprowski
(1996), exceto pela ausência de soro eqüino.
Para a diluição da vacina para o teste imunológico foi utilizada apenas a
solução salina tamponada com fosfatos, esterilizada por autoclavagem, segundo
Wilbur e Aubert (1999).
41
3.1.5 Conjugado anti-rábico imunofluorescente
O conjugado anti-rábico imunofluorescente utilizado foi produzido pela Seção
de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV, a partir de soro de coelhos hiperimunizados
com vacina preparada com vírus CVS. A imunoglobulina IgG foi marcada com o
isotiocianato de fluoresceína e o conjugado obtido foi titulado, antes da sua
utilização, para determinação da diluição de trabalho.
3.1.6 Vacina anti-rábica de uso humano
Para o ensaio imunológico com amostras do vírus da raiva isoladas de
morcegos foi utilizada a vacina anti-rábica purificada produzida a partir da replicação
da amostra WISTAR PM/WI 38-1503M em cultura de células Vero, inativada pela
beta-propriolactona, pelo laboratório Aventis Pasteur (Lyon, França), distribuída e
envasada pelo Instituto Butantan (lote 04411167), usualmente empregada para a
imunização pré e pós-exposição humana no Brasil, e gentilmente cedida pela
Secretaria Municipal de Saúde do Estado do Rio de Janeiro.
3.1.7 Vacina anti-rábica de referência
Para o teste de potência da vacina anti-rábica de uso humano, foi utilizada a
vacina de referência padrão produzida a partir de cérebros de camundongos
lactentes infectados com a amostra padrão CVS-32 do vírus da raiva, com posterior
inativação por beta-propriolactona. A vacina contendo 1,9 UI/mL pertence ao lote
BR008, tendo sido produzida e gentilmente cedida para este trabalho pelo Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz.
42
3.1.8 Primers
Para a amplificação do RNA por RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase
Chain Reaction) extraído das amostras e seqüenciamento genético, quando o alvo
foi o gene da proteína G, foram utilizados os primers relacionados nos quadros 2 e
3, respectivamente, e descritos no quadro 4.
Quadro 2 - Relação dos primers utilizados para o RT-PCR das amostras quanto ao gene da
proteína G
AMOSTRAS PRIMERS USADOS PARA O SEQÜENCIAMENTO GENÉTICO
222/90
Ga3222-40, Gb4119-39, GS3994, RVLa-1, RVLa-5
046/04
Ga3222-40, Gb4119-39, VT1551, RVLa-3
704/97
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, Gb4119-39-1, VT129, VT1391
151/98
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, Gb4119-39-1, GS3994, VT129,
VT1391
204/01
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, GS3994, VT1391, VT1551, RVLa-5,
G-antiBR2072-1
399/02
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, GS3994, VT129, VT1391
624/04
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, Gb4119-39-1, GS3994, VT129,
VT1551
755/02
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39, VT129, VT1391, VT1551,
G-antiBR2072-1
384/04
Ga3222-40, Ga3222-40-1, Gb4119-39-1, GS3994, VT129, VT1391
Quadro 3 - Relação dos primers utilizados para o seqüenciamento genético das amostras
quanto ao gene da proteína G
AMOSTRAS PRIMERS USADOS PARA O RT-PCR
222/90 Ga3222-40, RVLa-1
046/04 Ga3222-40, RVLa-3
704/97
151/98
204/01
399/02
624/04
755/02
384/04
Ga3222-40, Gb4119-39, GS3994, G-antiBR2072
43
1
Numeração nucleotídica baseada na seqüência da amostra PV (GenBank n.M13215)
Quadro 4 - Descrição dos primers utilizados para o RT-PCR e para o seqüenciamento
genético das amostras quanto ao gene da proteína G.
Para o RT-PCR, a área contendo o gene da proteína G foi dividida em região
anterior (nucleotídeos 3221-4135) e região posterior (nucleotídeos 3995-5382).
Assim, para a região anterior foram usados os pares de primers Ga3222-40 e
Gb4119-39 e, para a região posterior foram utilizados os primers senso GS 3994 e
anti-senso G-antiBR2072, com exceção para as amostras 222/90 e 046/04, visto que
só foi possível obter-se o produto amplificado pelo RT-PCR utilizando-se o primer
senso Ga3222-40 com os primers anti-senso RVLa-1 e RVLa-3, respectivamente.
Para a amplificação do RNA extraído das amostras e seqüenciamento
genético, quando o alvo foi o gene da proteína N, foram utilizados os primers
relacionados no quadro 5 e descritos no quadro 6.
PRIMERS SENTIDO POSIÇÃO
1
SEQÜÊNCIA
Ga3222-40 + 3221-3229 5'CGCTGCATTTT(A/G)TCA(A/G)AGT3'
VT129 - 3438-3419 5'GGTGATGTATATCGATGGGG3'
Ga3222-40-1 + 3518-3536 5'GGGATACATCTCTGCCATA3'
Gb4119-39-1 - 3819-3801 5'GGGATTTGTCGTATGGGTC3'
GS3994 + 3995-4019 5'CGG(A/C)TTTGTGGATGAAAG(A/G)GGC3'
Gb4119-39 - 4135-4116 5'GGAGGGCACCATTTGGT(A/C)TC3'
GS3994-1 + 4373-4392 5'GACTTGGAACGAGATCATCC3'
VT1391 - 4700-4681 5'CAGGAGATATTTCCCCCAAC3'
RVLa-5 - 4857-4836 5'CCCA(C/G)GAAGATAT(A/G)ACTTTCCC3'
VT1551 + 4852-4859 5'GTCGTATCTTCATGGGAG3'
G-antiBR2072-1 - 4996-4978 5'CATGAAGTATGTGAAGGGC3'
RVLa-3 - 5114-5091 5'GCACCATTGGT(C/T)ACTGATACTGTC3'
G-antiBR2072 - 5375-5356 5'TGCTGATTGC(A/G)CCTACATT3'
RVLa-1 - 5435-5416 5'AT(A/G)GGGTCATCATAAACCTC3'
44
Quadro 5 - Relação dos primers utilizados para o RT-PCR e para o seqüenciamento
genético das amostras quanto ao gene da proteína N
PRIMERS SENTIDO POSIÇÃO
1
SEQÜÊNCIA
P1 + 66-86 5’CTACAATGGATGCCGACAAGA3’
N8 - 1585-1568 5’AGTTTCTTCAGCCATCTC3’
BRABN-S1 + 336-355 5’GGACTAGCTATGGAATCCTG3’
BRABN-S3 + 782-801 5’GGACTGGTGTCATTTACAGG3’
BRABN-C3 - 537-519 5’TGTCCAGAGATTTTGCTCA3’
P2 - 1029-1007 5’CCCATATAACATCCAACAAAGTG3’
1
Numeração nucleotídica baseada na seqüência da amostra PV (GenBank n. M13215)
Quadro 6 - Descrição dos primers utilizados para o RT-PCR e para o seqüenciamento
genético das amostras quanto ao gene da proteína N.
3.2 MÉTODOS
Nesta seção será descrita a metodologia dos testes utilizados neste trabalho
de tese.
3.2.1 Imunofluorescência Direta
Os fragmentos de cérebro obtidos dos camundongos que apresentaram
sintomatologia compatível com a raiva durante o período de observação do ensaio
biológico, do teste de NIH e do ensaio imunológico, foram pressionados em lâminas
de microscopia para a obtenção da impressão do antígeno. As impressões foram
delimitadas pelo uso de esmalte e fixadas pelo calor. As lâminas foram
PRIMERS USO
P1 RT-PCR / Seqüenciamento
N8 RT-PCR / Seqüenciamento
BRABN-S1 Seqüenciamento
BRABN-S3 Seqüenciamento
BRABN-C3 Seqüenciamento
P2 Seqüenciamento
45
acondicionadas em uma bandeja de inox com tampa contendo um fundo de espuma
umedecida. O conjugado anti-rábico foi colocado em contato com a impressão, a
caixa de inox foi tampada e acondicionada em estufa por 30 minutos à temperatura
de 37 ºC. Em seguida foram realizadas três lavagens com solução salina fosfatada
(PBS, pH 7,8). Na leitura em microscópio de imunofluorescência, as lâminas com
inclusões intracitoplasmáticas fluorescentes foram registradas como sendo positivas,
de conformidade com o método descrito por Dean, Abelseth e Atanasiu (1996).
3.1.2 Titulação das amostras padrão CVS e isoladas de morcegos
A amostra padrão CVS do vírus da raiva, após reativação por via intracerebral
em camundongos, foi titulada em diluições seriadas em fator 10, com o diluente,
partindo-se de uma suspensão inicial de cérebro de camundongos a 20% (p/v).
Cada diluição do vírus foi inoculada por via intracerebral em 8 camundongos recém-
desmamados, com um volume de 0,03 mL, nas diluições de 10
-4
a 10
-8
.
As amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos hematófagos e não-
hematófagos foram inoculadas em diluições decimais seriadas, partindo-se de uma
suspensão inicial de cérebro de morcego ou cérebro de camundongos previamente
infectados com a amostra isolada de morcego, a 20% (p/v). Cada diluição do vírus
foi inoculada por via intracerebral em 8 camundongos recém-desmamados, com um
volume de 0,03 mL, nas diluições de 10
-1
a 10
-5
.
Os camundongos inoculados foram observados por 21 dias à procura de
sinais da raiva. Todos os camundongos mortos a partir do quinto dia pós-inoculação
e manifestando sinais nervosos característicos da raiva foram considerados
positivos. Nos casos de morte súbita ou morte com ausência de sinais clínicos foi
realizada a confirmação por imunofluorescência direta do tecido cerebral. A
presença ou ausência de sinais clínicos foi anotada diariamente e o título do vírus foi
calculado de acordo com o método descrito por Reed e Müench (1938) expressos
em log
10
da DL
50
.
46
3.2.3 Ensaio imunológico em camundongos
Camundongos previamente vacinados com a vacina anti-rábica purificada
produzida em cultura de células Vero foram submetidos ao desafio viral com a
amostra padrão CVS e com as amostras isoladas de morcegos, em um ensaio
imunológico realizado à semelhança do teste NIH. Um grupo de camundongos foi
vacinado com a vacina de referência, com posterior desafio com a amostra padrão
CVS (WILBUR; AUBERT, 1999).
A vacina anti-rábica foi diluída a 1:5, 1:25 e 1:125. Para cada diluição foi
vacinado um grupo de 16 camundongos, por via intra-peritoneal, com 0,5 mL da
vacina diluída, perfazendo um total de duas doses, administradas com um intervalo
de 7 dias.
O desafio viral foi realizado 14 dias após a primeira vacinação, por via
intracerebral, com um volume de 0,03 mL da suspensão do vírus-desafio, para cada
uma das dez amostras estudadas. O controle desta suspensão foi realizado através
da sua titulação em camundongos não-vacinados, devendo a dose desafio se
encontrar na faixa entre 12 a 50 DL
50
para o ensaio ser considerado válido.
Os animais inoculados foram observados por 14 dias, à procura de sinais
clínicos da raiva, tais como: excitação, pêlos eriçados, emagrecimento progressivo
e paralisia. Os animais encontrados mortos, sem apresentar sinais clínicos
previamente, tiveram seus cérebros submetidos ao teste de imunofluorescência
direta para a detecção do vírus da raiva.
Para o ensaio imunológico utilizando-se as amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos foram realizados o cálculo da Dose Efetiva 50% (DE
50
/0,5mL)
com o teste de Probito, com o uso do programa StatsDirect Statistical Software
versão 2.6.2 (2007), com intervalo de confiança de 95%; e o cálculo da Dose
Protetora 50% (DP
50
/0,5mL) com o método de Reed e Müench (1938).
47
3.2.4 Caracterização genética
A extração de RNA das amostras foi realizada a partir do sobrenadante da
suspensão viral a 10%, de acordo com o método desenvolvido pela Qiagen e
utilizado no kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN, Hilden, Germany), onde o RNA é
adsorvido em uma matriz de sílica e posteriormente eluído com tampão específico.
Um microlitro de cada RNA (0,2-0,4 μg) foi adicionado a 25μl do mix 2x
SUPERSCRIPT One-Step RT-PCR (Invitrogen, CA, USA), 2μL do primer senso
(10μM), 2μL do primer anti-senso (10μM), 1,8μL de MgSO
4
(50μM), 1μL do mix RT-
PCR/Platinum Taq (Invitrogen) e 17,2 μL de água destilada autoclavada, para uma
reação final de 50μL e submetidos a uma etapa inicial de transcrição reversa de
50ºC por 60 min., seguidos de 40 ciclos de PCR a 94ºC por 30 seg., 58ºC por 20
seg. e 68ºC por 2 min, no termociclador PTC-0200 DNA Engine (MJ Research Inc.,
Waltham, MA, USA) (SATO et al., 2004; SATO et al., 2005).
Os produtos da RT-PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5% corado
com brometo de etídio. Nesta etapa utilizou-se 1μL do produto amplificado, 1μL de
tampão e 2μL de peso molecular (100bp). A banda contendo o fragmento de
tamanho esperado foi extraída do gel. O DNA complementar (cDNA) foi eluído com o
uso do kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA) e
submetido a reação de seqüenciamento de DNA com o uso dos kits ABI Prism
Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction version 2.0 (Applied
Biosystems, CA, USA) e BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied
Biosystems), conforme as instruções do fabricante. As seqüências foram resolvidas
em seqüenciador automático ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) (SATO et al.,
2004; SATO et al., 2005).
48
3.2.5 Análise filogenética
Para o gene da proteína N, as seqüências de nucleotídeos consensuais de
cada amostra foram alinhadas pelo método CLUSTAL W (THOMPSON; HIGGINS;
GIBSON, 1994), com o uso do programa BioEdit Sequence Alignment Editor versão
7.0.5.2 (HILLS, 1999). Para a construção da árvore filogenética foi utilizado o
programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis – MEGA, versão 3.1 (TAMURA
et al., 2004), com o algoritmo de Neighbor-Joining, modelo evolutivo Kimura-2-
parâmetros e bootstrap com 1000 replicações. As amostras do vírus da raiva
isoladas de morcegos foram comparadas com amostras disponíveis no GenBank e
listadas no quadro 7.
Para o gene da proteína G, cada seqüência nucleotídica foi traduzida em
resíduos de aminoácidos e comparadas manualmente com o uso do programa
BioEdit Sequence Alignment Editor versão 7.0.5.2 (HILLS, 1999). A construção da
árvore filogenética, com base nas seqüências de nucleotídeos, obedeceu ao mesmo
critério usado para a análise das seqüências de nucleotídeos da proteína N, exceto
por terem sido comparadas somente entre si.
*Número de acesso AF406696; N/A = Não se aplica; (-) Dados não disponíveis.
Quadro 7 - Relação das amostras de vírus da raiva disponíveis no GenBank que foram
utilizadas para a construção da árvore filogenética, quanto ao gene da proteína
N, das amostras isoladas de morcegos – Rio de Janeiro – 2008
NÚMERO DE
ACESSO
ESTADO DE
ORIGEM
CIDADE
DE ORIGEM
VARIANTE VIRAL ANO
AB201803.1 São Paulo Lindóia
Desmodus rotundus
2000
AB201804.1 São Paulo Lindóia
Desmodus rotundus
2000
AB083806.1 São Paulo Taubaté
Desmodus rotundus
-
AB083807.1 São Paulo Pindamonhangaba
Desmodus rotundus
1998
AB201805.1 São Paulo S.José do Barreiro
Desmodus rotundus
2001
EF428576.1 Rio de Janeiro Quissamã
Desmodus rotundus
2006
EF428577.1 Rio de Janeiro Quissamã
Desmodus rotundus
2006
EF428578.1 Rio de Janeiro Quissamã
Desmodus rotundus
2006
CVS* N/A - - -
49
3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
As amostras de morcegos hematófagos e não-hematófagos diagnosticadas
positivas para a raiva pela Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV foram
submetidas às seguintes etapas:
- Na Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV foram realizados os estudos
de comportamento biológico das amostras em camundongos através da
inoculação intracerebral, avaliando-se o período de incubação e os sinais
clínicos; a prova de NIH da vacina anti-rábica humana produzida em cultura
de células Vero; e o ensaio imunológico, à semelhança do teste NIH, através
do desafio viral dos camundongos vacinados com a vacina anti-rábica de uso
humano, frente às amostras selecionadas de vírus rábico isoladas de
morcegos no Estado do Rio de Janeiro.
- As amostras foram enviadas ao Laboratório de Raiva do Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo - FMVZ-USP, onde
foram realizados os procedimentos de extração do RNA viral.
- O material obtido na extração de RNA foi enviado ao Veterinary Research
Center do Department of Preventive Veterinary Medicine and Animal Health,
da Nihon University, no Japão, onde foi realizado o RT-PCR e o
seqüenciamento genético.
50
4 RESULTADOS
Os períodos médios de incubação das amostras isoladas de morcegos,
observados nas passagens sucessivas realizadas em camundongos de 21 dias de
idade, estão representados na tabela 1. Os valores foram obtidos mediante a soma
individual dos dias ao longo das cinco passagens realizadas e, posteriormente,
divididos pelo total de camundongos inoculados, usualmente oito por passagem.
Pelos dados assim gerados observou-se a diminuição do período médio de
incubação das amostras conforme o aumento do número de passagens.
Durante a fase clínica com sintomatologia da doença, os camundongos
apresentaram pêlos arrepiados, prostração, convulsão, paralisia, seguida de morte.
Os animais inoculados com a amostra 222/90 ainda apresentaram canibalismo e,
alguns machos, priapismo.
Tabela 1- Períodos médios de incubação, em dias, observados em sucessivas passagens
em camundongos, das amostras de vírus da raiva isoladas em morcegos, na
Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV – Rio de Janeiro – 2005
(-) Passagens previamente realizadas pela Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV.
Os resultados dos títulos da amostra padrão CVS e das amostras de vírus
isoladas de morcegos (em sua quinta passagem) foram calculados pelo método
descrito por Reed e Müench (1938) e estão apresentados na tabela 2.
PASSAGENS
AMOSTRAS
Primeira Segunda Terceira Quarta Quinta
222/90 - - - 8,0 7,0
419/90 - 8,0 10,0 7,3 7,9
704/97 - - - 8,0 7,0
151/98 - - - 8,0 7,0
204/01 - - - 8,0 7,0
399/02 - - 8,0 7,0 6,0
624/02 - - 7,0 10,0 6,6
755/02 - - 11,0 10,0 8,2
046/04 - 8,0 8,1 6,3 6,6
384/04 - 8,0 7,0 6,0 6,3
51
Tabela 2 - Resultados da titulação viral em camundongos das amostras do vírus da raiva
padrão CVS e isoladas de morcegos, e sua variância, realizadas em triplicata na
Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV - Rio de Janeiro – 2005
1
Titulação realizada em dias separados.
NR= não-realizada
Para reduzir a possibilidade de erro no desafio viral em função de uma
variação inadequada da dose-desafio calculada para o ensaio imunológico, optou-se
por realizar a titulação das amostras em triplicata e utilizar a média dos resultados
obtidos para o cálculo da dose do vírus-desafio.
A menor variação entre os resultados das três titulações de cada amostra foi
observada para amostra 755/02. A máxima variação foi observada para a amostra
222/90, cujas titulações não foram realizadas no mesmo dia.
A vacina anti-rábica purificada produzida em cultura de células Vero, utilizada
neste trabalho, apresentou no ensaio de potência valor >2,5 UI/mL, sendo
considerada aprovada para uso, com base no valor de potência estabelecido no
teste NIH para a liberação de seu lote.
Os resultados dos ensaios imunológicos realizados com base no protocolo do
teste de potência da vacina anti-rábica humana (NIH), com as amostras do vírus da
raiva isoladas de morcegos e padrão CVS, estão apresentados na tabela 3.
AMOSTRA TÍTULO DAS AMOSTRAS (log
10
dil
-1
)/0,03 mL
VARIÂNCIA (%)
222/90
1
5,62
5,00
6,00
9,11
419/90 4,50
4,87
4,75
4,01
704/97 5,90
6,00
6,25
2,98
151/98 5,35
5,12
5,62
5,77
204/01
5,63
NR NR NR
399/02 4,75
4,50
4,75
3,09
624/02 4,87
4,50
4,12
8,34
755/02 4,25
4,25
4,25
0
046/04 4,87
4,25
4,75
7,11
384/04 4,25
4,00
4,25
3,46
CVS 7,01
7,18
7,01
1,39
52
Tabela 3 - Resultados dos ensaios imunológicos em valores absolutos e percentuais dos
camundongos sobreviventes, por diluição da vacina anti-rábica, de acordo com a
amostra utilizada para o desafio viral, realizado na Seção de Diagnóstico de
Raiva do IMMVJV – Rio de Janeiro – 2005-2007
DILUIÇÃO DA VACINA
AMOSTRA VIRAL
1:5 1:25 1:125
222/90
15/16
1
93.8%
2
8/16
50.0%
8/16
50.0%
419/90
15/16
93.8%
10/16
62.5%
5/16
31.3%
704/97
9/7
56.3%
2/14
12.5%
0/16
0.0%
151/98
7/16
43.8%
7/16
43.8%
4/16
25.0%
204/01
14/16
87.5%
12/16
75.0%
9/16
56.3%
399/02
11/16
68.8%
11/16
68.8%
8/16
50.0%
624/02
10/16
62.5%
6/16
37.5%
6/16
37.5%
755/02
14/16
87.5%
7/16
43.8%
5/16
31.3%
046/04
16/16
100.0%
11/16
68.8%
6/16
37.5%
384/04
15/16
93.8%
14/16
87.5%
10/16
62.5%
CVS
16/16
100.0%
15/16
93.8%
13/16
81.3%
1
Sobreviventes/Animais desafiados
2
Percentual de sobreviventes
Dos camundongos vacinados com a vacina anti-rábica de uso humano diluída
1:5, a proteção conferida pela vacina foi maior que 80% para a maioria das amostras
do vírus da raiva utilizadas no desafio viral dos ensaios imunológicos, à exceção das
amostras 704/97, 151/98, 399/02 e 624/02.
No desafio viral realizado com a amostra padrão CVS, a proteção conferida
pela vacina anti-rábica humana (teste) foi maior que 80%, nos três grupos de
camundongos vacinados com diluições diferentes da vacina. Para a vacina anti-
rábica de referência, cujo ensaio NIH foi realizado no mesmo momento do ensaio
com a vacina teste e com a mesma suspensão de vírus-desafio, 81,25% dos
53
camundongos vacinados foram protegidos na diluição 1:5 da vacina, 68,75% na
diluição 1:25 e 43,75% na diluição 1:125.
A tabela 4 apresenta os resultados dos ensaios imunológicos em Dose
Efetiva 50% por 0,5 mL de vacina, calculada através do teste de Probito; a Dose
Protetora a 50% por 0,5mL de vacina e as Dose Letal 50% por 0,03mL do vírus-
desafio, ambas calculadas pelo método de Reed e Müench (1938).
Tabela 4 - Resultados das DE
50
calculadas por Probito, e das DP
50
calculadas pelo método
Reed e Müench e obtidas a partir do desafio viral (DL
50
) dos camundongos
vacinados com a vacina anti-rábica de uso humano, utilizando-se a amostra do
vírus da raiva padrão CVS e.as amostras isoladas de morcego, realizado na
Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV – Rio de Janeiro – 2007-2008
(-) O teste não forneceu resultados com intervalo de confiança de 95%.
Para as amostras 151/98, 399/02 e 624/02 o teste de Probito não foi capaz de
fornecer resultados com intervalo de confiança de 95% porque o número de
animais sobreviventes foi igual em diluições diferentes da vacina. Para a amostra
padrão CVS, o teste também não produziu resultados em função do número de
animais sobreviventes ter sido elevado e próximo entre diluições diferentes da
vacina.
AMOSTRAS
DE
50
/ 0,5 mL
(PROBITO)
DP
50
/0,5mL
(REED E MÜENCH)
DL
50
/0,03 mL
(REED E MÜENCH)
222/90 1:73 1:51 14,54
419/90 1:49 1:47 17,78
704/97 1:6 1:7 31,62
151/98 - 1:13 50,69
204/01 1:224 1:84 13,33
399/02 - 1:51 56,23
624/02 - 1:18 13,33
755/02 1:33 1:28 42,17
046/04 1:75 1:62 23,71
384/04 1:312 >1:125 36,30
CVS - >1:125 18,62
54
Os piores resultados da DP
50
foram encontrados para as amostras 704/97,
151/98 e 624/02, isoladas de morcegos hematófagos. Para as amostras 384/04 e
padrão CVS não foi possível calcular o valor exato da DP
50
, pois o acumulado de
camundongos sobreviventes foi superior a 50% para todas as diluições da vacina.
Para os ensaios imunológicos realizados com as amostras 204/01 e 624/02,
para uma mesma dose-desafio, a vacina apresesentou resultado 4,6 vezes
superior frente à amostra 204/01. De modo semelhante, o ensaio com a amostra
padrão CVS apresentou resultado pelo menos 2 vezes superior ao realizado com a
amostra 419/90. Por outro lado, com a amostra 704/97, geneticamente relacionada
à amostra 151/98, a vacina apresentou resultado inferior, frente uma dose menor
do vírus-desafio.
Excetuando-se duas amostras, para todas as outras foram realizados de 1 a 2
repetições do ensaio, até que se atingisse a dose do vírus-desafio dentro ou
próximo da faixa 12 a 50 DL
50
preconizado pela Organização Mundial de Saúde.
Assim, a maior DL
50
obtida foi de 56,23 para a amostra 399/02 e a menor foi de
13,33 para as amostras 204/01 e 624/02.
Comparando-se o gene N das amostras do vírus da raiva isoladas de
morcegos estudadas neste trabalho com outras amostras isoladas no Brasil, a
relação filogenética estabelecida segregou as amostras em dois grupos distintos:
variante de morcego hematófago e variante de morcego insetívoro, conforme
ilustrado na figura 7.
Em relação ao gene da proteína N, as amostras 704/97 e 151/98, isoladas na
Região Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, formaram um agrupamento junto com
outras amostras originárias de morcegos D. rotundus, isoladas no Município de
Quissamã, Região Norte do estado, em 2006. As amostras 384/04, 755/02 e 399/02,
isoladas de morcegos Artibeus sp. na região Metropolitana do Rio de Janeiro e
Municípios adjacentes formaram um agrupamento relacionado com uma amostra do
Sul do Estado de São Paulo. De forma semelhante, a amostra 624/02 agrupou com
amostras do Município de Lindóia (São Paulo).
55
Ainda em relação ao gene da proteína N, a amostra 222/90, isolada de um
morcego insetívoro T. laticaudata, em 1990, no Município do Rio de Janeiro, e a
amostra 046/04, isolada de um morcego insetívoro N. laticaudata, em 2004, no
mesmo Município, agregaram-se na árvore filogenética com um valor de bootstrap
de 88.
Figura 7 - Dendograma da relação filogenética estabelecida entre as amostras do vírus da
raiva isoladas de morcegos na Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV (em
vermelho) e de outras espécies isoladas no Brasil (Quadro 7), com base na
seqüência de 1,353 bp do gene da proteína N – Rio de Janeiro – 2007-2008
EF428576.1
EF428578.1
EF428577.1
151/98
704/97
AB083806.1
AB083807.1
204/01
AB201805.1
399/02
755/02
384/04
624/02
AB201803.1
AB201804.1
419/90
222/90
046/04
CVS
88
100
99
100
97
75
93
100
37
87
87
100
98
69
90
0.02
56
A árvore filogenética obtida a partir das amostras seqüenciadas quanto ao
gene da proteína G, seguiu o mesmo padrão de agregação estabelecido na análise
do gene da proteína N, conforme ilustrado na figura 8.
704/97
151/98
204/01
624/02
399/02
755/02
384/04
046/04
222/90
419/90
Pitman Moore
CVS
PV
100
86
100
100
100
94
82
100
51
100
0.05
Figura 8 -. Dendograma da relação filogenética estabelecida entre as amostras do vírus da
raiva isoladas de morcegos na Seção de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV e as
amostras padrão CVS (GenBank – nº acesso AF406694), PM (GenBank – nº
acesso AJ871962) e PV (GenBank – nº acesso M13215, com base na seqüência
de 1,575 bp do gene da proteína G - Rio de Janeiro – 2007-2008
As amostras 704/97 e 151/98, isoladas de morcegos D. rotundus na Região
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro e que apresentaram resultados semelhantes
no ensaio imunológico formaram um agrupamento isolado sustentado por um valor
de bootstrap de 100, com base na seqüência de 1,575 bp do gene da proteína G.
57
Os resultados dos alinhamentos das seqüências nucleotídicas do gene da
proteína G das amostras do vírus da raiva e sua tradução em resíduos de
aminoácidos encontram-se apresentados nas figuras 9 e 10, respectivamente.
AMOSTRAS SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS
PV -19 ATGGTGCCGC AGGCGCTGCT GTTTGTGCCG CTGCTGGTGT TTCCGCTGTG CTTTGGCAAA TTTCCGATTT 51
Pitman Moore -19 .....T..T. ....T..C.. ......A..C ..T....GT. ..T..T....
T..C..G..G ..C..C.... 51
222/90 -19 ...A.C..T. ....T..T.. AC.G.....T ..TG..A.C. CCT.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
419/90 -19 ...A.C..T. ....T..T.. AC.G.....T
..TG..A.C. CCT.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
704/97 -19 ...A.C.TT. ....C..C.. .........T ..C..AA.C. C.T..T.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
151/98 -19 ...A.C.TT
. ....C..C.. .........T ..C..AA.C. C.T..T.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
204/01 -19 ...A.C.TT. ....C..T.. .........T ..C..AA.C. C.T..T.... TC.C..G... ..
C..C..C. 51
399/02 -19 ...A.T.TT. ....C..T.. .........T ..C..AA.C. C.T.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
624/02 -19 ...A.C.TT. ....C..T.. .........T ..C..AA.C. C.T
..T.... .C.C..G... ..C..C..C. 51
755/02 -19 ...A.T.TT. ....C..T.. .........T ..C..AA.C. C.T.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
046/04 -19 ...A.C..T. ....T..T.. AC.
G.....T ..TG..A.C. CCT.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
384/04 -19 ...A.T.TT. ....C..T.. .........T ..C..AA.C. C.T.AT.... TC.C..G... ..C..C..C. 51
CVS -19 ..
...T..T. ....T..C.. ......A..C ..T.....T. ....AT.... T.....G... ..C..T.... 51
PV 52 ATACCATTCC GGATAAACTG GGCCCGTGGA GCCCGATTGA TATTCATCAT CTGAGCTG
CC CGAACAACCT 121
Pitman Moore 52 .C..G..A.. A..CG....T ..T..C.... ....T..... C..A..C... ..C.....T. .A..T..... 121
222/90 52 .C..G..A.. A..C..G..C .....T....
.T..C..C.. ...A...... ..C.....T. .T..T..TT. 121
419/90 52 .C..G..A.. A..C..G..C .....T.... .T..C..C.. ...A...... ..C.....T. .T..
T..TT. 121
704/97 52 .C..A..A.. ...C..G..T ..T..T.... ....C..C.. ...A.....C ..C.....T. .A..T..TT. 121
151/98 52 .C..A..A.. ...C..G..T ..T..T.... ....C..C.. .
..A.....C ..C.....T. .A..T..TT. 121
204/01 52 .C..A..A.. ...C..G..T ..T..T.... ....C..C.. ...A.....C ..C.....T. .A..T..TT. 121
399/02 52 ....A..A.. A
.....G..T ..T..T.... ....C..C.. ...A.....C ..C.....T. .A..T..TT. 121
624/02 52 .C..A..A.. A..C..G..T ..T..C.... ....C..C.. ...A.....C ..C.
....T. .A..T..TT. 121
755/02 52 ....A..A.. ......G..T ..T..T.... ....C..C.. ...A.....C ..C.....T. .A..T..TT. 121
046/04 52 .C..G..A.. C..C..G..C .....T...
. .T..C..C.. ...A...... ..C.....T. .T..T..TT. 121
384/04 52 ....A..A.. A.....G..T ..T..T.... ....C..C.. ...A.....C ..C.....T. .A..T..
TT. 121
CVS 52 .C..G..A.. A..C..G..T ..T..C.... .......... C..A.....C ..C....... .A.....TT. 121
PV 122 GGTGGTGGAA GATGAAGGCT GCACCAACCT GAGCGGCTTT
AGCTATATGG AACTGAAAGT GGGCTATATT 191
Pitman Moore 122 ...T.....G ........A. .T........ .TC..AG..C TC...C.... ....C..... ...A..C..C 191
222/90 122 ...T.....G ..C
..G..G. ....T.GT.. .TCA..G... TCT..C.... .......G.. A..A..C..C 191
419/90 122 ...T.....G ..C..G..G. ....T.GT.. .TCA..G... TCT..C.... .......G.
. A..A..C..C 191
704/97 122 A..T.....G .....G..G. .T.....T.. ATCA..G..C TC...C.... ....A..G.. ...A..C..C 191
151/98 122 A..T.....G .....G..G. .T.....T..
ATCA..G..C TC...C.... ....A..G.. ...A..C..C 191
204/01 122 A..T.....G ..C..G..G. .T.....T.. ATCA..G..C TCT..C.... ....C..G.. ...A..C..C 191
399/02 122 A..T.
....G ..C..G..G. .......T.. ATCA..G..C TCT..C.... ....A..G.. ...A..C..C 191
624/02 122 A..T.....G ..C.....G. .......T.. ATCA..A..C TCT..C....
....A..G.. ...A..C..C 191
755/02 122 A..T.....G ..C..G..G. .......T.. ATCA..G..C TCT..C.... ....A..G.. ...A..C..C 191
046/04 122 ...T.....G ..C..G..G. ....T.
GT.. .TCA..G... TCT..C.... .......G.. A..A..C..C 191
384/04 122 A..T.....G ..C..G..G. .......T.. ATCA..G..C TCT....... ....A..G.. ...A..C..C 191
CVS
122 ...A.....G ..C.....A. .......... .TCA..G..C TC...C.... ....T..... T..A..C..C 191
PV 192 AGCGCGATTA AAATGAACGG CTTTACCTGC ACCGGCGTGG TGA
CCGAAGC GGAAACCTAT ACCAACTTTG 261
Pitman Moore 192 TCA..C..C. ..G....... G..C..T... ..A..T..T. ....A..G.. A..G.....C .......... 261
222/90 192 TCT..C..A. ..G....
... G..C..T..T .....T..T. ....A..... T..G...... .......... 261
419/90 192 TCT..C..A. ..G....... G..C..T..T .....T..T. ....A..... T..G.....
. .......... 261
704/97 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....T..T. ....A..G.. T......... .......... 261
151/98 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....
T..T. ....A..G.. T......... .......... 261
204/01 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....T..T. ....A..G.. T..G...... .......... 261
399/02 192 TCT..C.
.A. .GG....... G..C..T..T .....T.... ....A..G.. T......... .......... 261
624/02 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....T..T. ....A..G.. T.
........ .......... 261
755/02 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....T.... ....A..G.. T......... .......... 261
046/04 192 TCT..T..A. ..G....... G..C..T..
T .....T..T. ....A..... T..G...... .......... 261
384/04 192 TCT..C..A. .GG....... G..C..T..T .....T.... ....A..G.. T......... .......... 261
CVS 192 TT
A..C..A. .......... G..C..T... ..A.....T. ....G..G.. T........C ..T.....C. 261
(continua)
58
(continuação)
PV 262 TGGGCTATGT GACCACCACC TTTAAACGTA AACATTTTCG TCCGACCCCG GATGCGTGCC GTGCGGCGTA 331
Pitman Moore 262 .T..T..... C..A.....A ..C..GA.A. .G.....C.. C..C.....A
..C..A..TA .A..C..... 331
222/90 262 .T..T..... C..T.....A ..C..GA.A. ....C..... C..A.TGT.A .....A...A .A..T..C.. 331
419/90 262 .T..T..... C..T.
....A ..C..GA.A. ....C..... C..A.TGT.A .....A...A .A..T..C.. 331
704/97 262 .T..T..... C........A ..C..GA.G. .......C.. C..T.TA... .....A...
A .G..T..A.. 331
151/98 262 .T..T..... C........A ..C..GA.G. .......C.. C..T.TA... .....A...A .G..T..A.. 331
204/01 262 .T..T..... C.....A..A ..C..GA.G. ..
.....C.. C..T.TA... .....A...A .G..T..A.. 331
399/02 262 .T..T..... C........A ..C..GA.G. .......... C..T.TG... .....A...A .G..T..A.. 331
624/02 262 .T..T.
.... C........A ..C..GA.G. .......C.. C..T.TA... .....A...A .G..T..A.. 331
755/02 262 .T..T..... C........A ..C..GA.G. .......... C..TGTA... ..
...A...A .G..T..A.. 331
046/04 262 .T..T..... C..T.....A ..C..GA.A. ....C..... C..A.TGT.. .....A...A .A..T..C.. 331
384/04 262 .T..T..... C........A
..C..GA.G. .......... C..TGTA... .....A...A .G..T..A.. 331
CVS 262 .T..T..... C..A.....G ..C...A.A. .G.....C.. C..A..A..A .....A..TA .A..C..
... 331
PV 332 TAACTGGAAA ATGGCGGGCG ATCCGCGTTA TGAAGAAAGC CTGCATAACC CGTATCCGGA TTATCATTGG 401
Pitman Moore 332 .........G .....C..T. .C..CA.A.. ......GTC.
..A..C..T. .A..C..C.. C..C..C... 401
222/90 332 C........G G....C..T. .C..TA.A.. C.....GTCT ..T..A..T. .......T.. ...C...... 401
419/90 332 C........G G...
.C..T. .C..TA.A.. ......GTCT ..T..A..T. .......T.. ...C...... 401
704/97 332 C........G .....T..T. ....TA.A.. ...G..GTCT ..T..A..T. .T.....T.
. G..C..C... 401
151/98 332 C........G .....T..T. ....TA.A.. ...G..GTCT ..T..A..T. .T.....T.. G..C..C... 401
204/01 332 C........G .....T..T. ....TA.A
.. ......GTCT ..T..A..T. .T.....T.. ...C..C... 401
399/02 332 C........G ...A.T..T. .C..TA.A.. ...G..GTCT ..T..A..T. .T.....T.. ...C..C... 401
624/02
332 C........G .....T..T. ....TA.A.. ...G..GTCT ..T..A..T. .T.....T.. ...C..C... 401
755/02 332 C......... .....T..T. .C..TA.A.. ...G..GTCT ..T
..A..T. .T.....T.. ...C..C... 401
046/04 332 C........G G....C..T. .C..TA.A.. ......GTCT ..T..A..T. .......T.. ...C...... 401
384/04 332 C........G ..TA.T..T.
.C..TA.A.. ...G..GTCT ..T..A..T. .T.....T.. ...C..C... 401
CVS 332 C........G .....C..T. .C..CA.A.. ......GTCT ..A..C..T. ....C..T.. C.
.C..C... 401
PV 402 CTGCGTACCG TGAAAACCAC CAAAGAAAGC CTGGTGATTA TTAGCCCGAG CGTGGCGGAT CTGGATCCGT 471
Pitman Moore 402 ..T..A..T. .A.G...... ......GTC. ..C
A.T..C. .ATC...A.. T...A.A... T....C..A. 471
222/90 402 ..T..G..T. ....G..... ......GTCG ..TA.T..C. .ATCT..A.. T.....T... ........C. 471
419/90 402 ..T
..G..T. ....G..... ......GTCG ..TA.T..C. .ATCT..A.. T.....T..C ........C. 471
704/97 402 ..A..G.... .A..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .A
TCT..A.. T.....T... T.A..C..A. 471
151/98 402 ..A..G.... .A..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT..A.. T.....T... T.A..C..A. 471
204/01 402 ..A..G....
.A..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT..... T.....T... T.A..C.... 471
399/02 402 ..A..G.... .A..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT....
. T.....T... ..A..C..A. 471
624/02 402 ..A..G.... .A..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT..... T.....T... T.A..C..A. 471
755/02 402 ..A..G.... .A..G
..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT..... T.....T... ..A..C..A. 471
046/04 402 ..T..G..T. ....G..... ......GTCG ..TA.T..C. .ATCT..A.. T
.....T..C ........C. 471
384/04 402 ..A..G.... .C..G..... T..G..GTCT ..TA.C..C. .ATCT..... T.....T... ..A..C..A. 471
CVS 402 ..T..A..T. .A........
...G..GTCT ..C..T..C. .ATCT..A.. T.....A... T....C..A. 471
PV 472 ATGATCGTAG CCTGCATAGC CGTGTGTTTC CGGGCGGCAA CTGCAGCGGC GTGGC
GGTGA GCAGCACCTA 541
Pitman Moore 472 ....CAAATC ...T..CTCA A.G..C..C. .T.....A.. G...TCA..A A.AA.....T C.TCT..... 541
222/90 472 .C..CAAATC .....GGTCA A.AA.T..
C. .T..A..G.. G...TTG..A A.AA.A..CT CTTCT..... 541
419/90 472 .C..CAAATC .....GGTCA A.AA.T..C. .T..A..G.. G...TTG..A A.AA.A..CT CTTCT..... 541
704/97 472 .C.
..AAATC ...T...TCT A.G.....C. .T.....G.. G..TTTG..A A.AA....TT CTTC...... 541
151/98 472 .C...AAATC ...T...TCT A.G.....C. .T.....G.. G..TTTG..A A.AA....TT CTTC..
.... 541
204/01 472 .C...AAATC ...T...TCT A.G.....C. .T..T..G.. G..TTTG..A A.AA....TT CTTC...... 541
399/02 472 .C..CAAATC ...C...TCT A.G.....C. .T..T..G.. G..TCTG..A
A.AA....TT CTTC...... 541
624/02 472 .C..CAAATC ...T...TCT A.G.....C. .T..T..G.. A..TTTG..A A.AA....TT CTTC...... 541
755/02 472 .C..CAAATC ...C...TCT A.G.....C. .T..T..G
.. G..TTTG..A A.AA....TT CTTC...... 541
046/04 472 .C..CAAATC .....GGTCA A.AA.T..C. .T..A..G.. G...TTG..A A.AA.A..CT CTTCT..... 541
384/04 472 .C..CAAATC ...C...TC
T A.G.....C. .T..T..G.. G..TTTG..A A.AA....TT CTTC...... 541
CVS 472 ....CA.ATC ...T..CTCG A.G..C..C. .TA....G.. G...CCA..A ..A......T CTTCT.....
541
PV 542 TTGCAGCACC AACCATGATT ATACCATTTG GATGCCGGAA AACCCGCGTC TGGGCATGAG CTGCGATATT 611
Pitman Moore 542 C...TCA..T .......... .C........ ......C..G
..T...A.A. CAA.G.CACC T..T..C... 611
222/90 542 C...TCA..T .......... .C..T..C.. ......A... G.AG.AA.A. .C..G.CATC T..T..C... 611
419/90 542 C...T
CA..T .......... .C..T..C.. ......A... G.AG.AA.A. .C..G.CATC T..T..C... 611
704/97 542 ....TCA... .......... .C.....C.. ......C..G G.A..AA
.A. .C..G.CATC T.....C... 611
151/98 542 ....TCA... .......... .C.....C.. ......C..G G.A..AA.A. .C..G.CATC T.....C... 611
204/01 542 ....TCA... ........
.. .C.....C.. ......C..G G.A..AA.A. .C..G.CATC T.....C... 611
399/02 542 C...TCA... .......... .C.....C.. ......C..G G.A...A.A. .C..G.CAT
C T.....C... 611
624/02 542 C...TCA... .......... .C.....C.. ......C..G G.A..AA.A. .C..G.CATC T.....C... 611
755/02 542 C...TCA... .......... .C.....C
.. ......C..G G.A..AA.A. .C..G.CATC T.....C... 611
046/04 542 C...TCA..T .......... .C..T..C.. ......A... G.AG.AA.A. .C..G.CATC T..T..
C... 611
384/04 542 C...TCA... .......... .C.....C.. ......C..G G.A..AA.A. .C..G.CATC T.....C... 611
CVS 542 C...TC...T .....C.... .C........ ......C
..G ..T...A.A. .A..G...TC T..T..C... 611
(continua)
59
(continuação)
PV 612 TTTACCAACA GCCGTGGCAA ACGTGCGAGC AAAGGCAGCG AAACCTGCGG CTTTGTGGAT GAACGTGGCC 681
Pitman Moore 612 ........T. ..A.A..G.. GA.A..ATC. .....G.A.A .G..T...
.. .......... ...A.A.... 681
222/90 612 .....T.... ..AAA..G.. GA.A..TTCT ..G..AG..A .G.TT..... A..C...... ...A.G..AT 681
419/90 612 .......... ..AAA..G.. GA.A..TTCT ..G..A
G..A .G.TT..... A..C...... ...A.G..AT 681
704/97 612 .......G.. ..AAA..G.. .AAG..ATCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
151/98 612 .......G.. ..AAA..G.. .AAG..A
TCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
204/01 612 .......G.. ..AAA..G.. .AAG..ATCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
399/02 612 .......G.. .TAAA
..G.. GAAG..ATCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
624/02 612 ..C....G.. .TAAA..G.. .AAG..ATCT .....AG..A .G..T..T.. A......... ...A.G...T 681
755/02 612 ....
...G.. .TAAA..G.. GAAG..TTCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
046/04 612 .......... ..AAA..G.. GA.A..TTCT ..G..AG..A .G.TT..... A..C...... ...A
.G..AT 681
384/04 612 .......G.. .TAAA..G.. GAAG..TTCT ..G..AG..A .G..T..... A......... ...A.G...T 681
CVS 612 ........T. .TA.A..G.. GA.A..ATC. .....G..T. .G..T.....
......A... ...A.A.... 681
PV 682 TGTATAAAAG CCTGAAAGGC GCGTGCAAAC TGAAACTGTG CGGCGTGCTG GGCCTGCGTC TGATGGATGG 751
Pitman Moore 682 .......GTC T..A.....A .
.A....GG. .C..GT.A.. T..A..T..T ..A..TA.A. .T........ 751
222/90 682 .......GTC T..A.....A ..A..T.GG. .T..GT.... ...A..TTCT ..A..TA.A. .T....
.... 751
419/90 682 .......GTC T..A.....A ..A..T.GG. .T..GT.... ...A..TTCT ..A..TA.A. .T........ 751
704/97 682 ....C..GTC T..A.....A ..A..T.... .C..GT...
. ...A..T..C ..A..TA.A. .T........ 751
151/98 682 ....C..GTC T..A.....A ..A..T.... .C..GT.... ...A..T..C ..A..TA.A. .T........ 751
204/01 682 ....C..GT
C T..A.....A ..A..T.... .C..GT.... ...A..T..C ..A..TA.A. .T........ 751
399/02 682 ....C..GTC T..A.....A ..A..T.... .C..G..... ...A..T..C ..
A..TA.A. .T.....C.. 751
624/02 682 ....C..GTC T..A.....G ..A..T.... .C..G..... ...A..T..C ..A..TA.A. .T........ 751
755/02 682 ....C..GTC T..A.....G ..A.
.T.... .C..G..... ...A..T..C ..A..TA.A. .T.....C.. 751
046/04 682 .......GTC T..A.....A ..A..T.GG. .T..GT.... ...A..TTCT ..A..TA.A. .T......
.. 751
384/04 682 ....C..GTC T..A.....A ..A..T.... .C..G..... ...A..T..C ..A..TA.A. .T.....C.. 751
CVS 682 .A.....GTC TT.A.....A ..A....... .C..GT.A..
T..A..T..A ..A..TA.A. .T........ 751
PV 752 CACCTGGGTG GCGATGCAGA CCAGCAACGA AACCAAATGG TGCCCGCCGG GCCAGCTGGT GAACCTGCAT 821
Pitman Moore 752 A..A.....C .
.......A. .ATCAG.T.. G......... .....T..A. AT...T.... ...TT....C 821
222/90 752 A........C .....T.... .GTCAG.G.. G.T....... .....TT.T. AT..AT.
... ...T..A... 821
419/90 752 A........C .....T.... .GTCAG.G.. G......... .....TT.T. AT..AT.... ...T..A... 821
704/97 752 A........T T.A..T..A. ..TCAG.... C
......... .....T.... AT..AT.... ...T..A... 821
151/98 752 A........T T.A..T..A. ..TCAG.... C......... .....T.... AT..AT.... ...T..A... 821
204/01 752 A........T T.A..T.
.A. ..TCAG.... T......... .....T.... AT..AT.... ...T..A... 821
399/02 752 A........T T....T..A. .ATCAG.... T......... ..T..T.... AT..AT.... ...T..A.
.. 821
624/02 752 A........T T.A..T..A. .ATCAG.... T......... .....T.... AT..AT.... ...T..A... 821
755/02 752 A........T T....T..A. .ATCAG.... T......... .....T....
AT..AT.... ...T..A... 821
046/04 752 A........T .....T.... .GTCAG.G.. G......... .....TT.T. AT..AT.... ...T..A... 821
384/04 752 A........T T....T..A. .ATCA
G.... T......... ..T..T.... AT..AT.... ...T..A... 821
CVS 752 A..A.....C ........A. .ATCA..T.. .......... .....T..C. AT...T.... .........C 821
PV
822 GATTTTCGTA GCGATGAAAT TGAACATCTG GTGGTGGAAG AACTGGTGAA AAAACGTGAA GAATGCCTGG 891
Pitman Moore 822 ..C.....CT CA..C..G.. ...G.....C ..T.....G. .
GT.A..C.. G...A.A..G .....T.... 891
222/90 822 ..C....ACT CA.....G.. A........T ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... .....T.... 891
419/90 822 ..C....ACT C
A.....G.. A........T ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... .....T.... 891
704/97 822 ..C....ACT CA..C..... A..G.....C ..C.....G. .GT....C.. G
..GA.G... ..G..TT... 891
151/98 822 ..C....ACT CA..C..... A..G.....C ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT... 891
204/01 822 ..C....ACT CA..C..... A..G
.....C ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT... 891
399/02 822 ..C....ACT CA..C..... A..G.....C ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT...
891
624/02 822 ..C....ACT CA..C..... A..G.....C ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT... 891
755/02 822 ..C....ACT CA..C..... A..G.....C ..C....
.G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT... 891
046/04 822 ..C....ACT CA.....G.. A........T ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... .....T.... 891
384/04 822 ..C....ACT
CA..C..... A..G.....C ..C.....G. .GT....C.. G..GA.G... ..G..TT... 891
CVS 822 ..C.....CT CA..C..... ...G..C..T ..T..A..G. .GT....C.G G..
GA.A..G ..G..T.... 891
PV 892 ATGCGCTGGA AAGCATTATG ACCACCAAAA GCGTGAGCTT TCGTCGTCTG AGCCATCTGC GTAAACTGGT 961
Pitman Moore 892 ....AT.A.. GTC.
..C... ........GT CA..A..T.. CA.A.....C ..T..C...A .A.....T.. 961
222/90 892 .CA.A..... GTC...C... .........T CA..A..T.. CA.A.....C ..
...CT..A .A.....T.. 961
419/90 892 .CA.A..... GTC...C... .........T CA.....T.. C..A.....C .....CT..A .A.....T.. 961
704/97 892 .C..AT.... GTC...C... ...
......T CT.....T.. .A.A.....C ...T.....A .A.....T.. 961
151/98 892 .C..AT.... GTC...C... .........T CT..A..T.. .A.A.....C ...T.....A
.A.....T.. 961
204/01 892 .C..AT.... GTC...C... ........GT CT..A..T.. .A.A.....C ...T..T..A .A.....T.. 961
399/02 892 .C..AT.... GTC...C... .........T CT
..A..T.. .A.A.....C ...T.CT..A .A.....T.. 961
624/02 892 .C..AT.... GTC...C... ..A......T CT..A..T.. .A.A.....C ...T..T..A .A.....T.. 961
755/02 892 .C
..AT.... GTC...C... .........T CT..A..T.. .A.A.....C ...T..T..A .A.....T.. 961
046/04 892 .CA.A..... GTC...C... .........T CA..A..T.. C..A..
...C .....CT..A .A.....T.. 961
384/04 892 .C..AT.... GTC...A... .........T CT.....T.. .A.A.....C ...T..T..A .A.....T.. 961
CVS 892 ....A..A.. GTC..
.C... ..A.....GT CA.....T.. CA.A.....C ..T...T.AA .A.....T.. 961
(continua)
60
(continuação)
PV 962 GCCGGGCTTT GGCAAAGCGT ATACCATTTT TAACAAAACC CTGATGGAAG CGGATGCGCA TTATAAAAGC 1031
Pitman Moore 962 C..A..G... ..A.....A. .......A.. C......... T.......G. .T.....
T.. C..C..GTCA 1031
222/90 962 T..A..A... ..G..G..T. ....T..A.. C.....G..T T.A....... .T.....T.. C.....CTCA 1031
419/90 962 T..A..A... ..G..G..T. ....T..A..
C.....G..T T.A....... .T.....T.. C.....CTCA 1031
704/97 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C..C.. C..C..GTCA 1031
151/98 962 C..T
..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C..C.. ...C..GTCA 1031
204/01 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C
..C.. C..C..GTCA 1031
399/02 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C..C.. C..C..GTCA 1031
624/02 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C...
..G..T T.......G. .T..C..C.. C..C..GTCA 1031
755/02 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C..C.. C..C..GTCA 1031
046/04 962 T..A..A...
..G..G..T. ....T..A.. C.....G..T T.A....... .T.....T.. C.....CTCA 1031
384/04 962 C..T..G... ..A..G..A. .C..T..A.. C.....G..T T.......G. .T..C.
.C.. C..C..GTCA 1031
CVS 962 C..T..G... ..A.....A. .......A.. C.....G... T......... .C.....T.. C..C..GTCA 1031
PV 1032 GTGCGTACCT GGAACGAAAT TATTCCGAGC
AAAGGCTGCC TGCGTGTGGG CGGCCGTTGC CATCCGCATG 1101
Pitman Moore 1032 ..C..G.... ....T..G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..T.. A..AA.G... .....T.... 1101
222/90 1032 ..T..A..
T. ....T..G.. C..C..CTCA .....G..T. .AAAA..C.. A..GA.A..T .....T.... 1101
419/90 1032 ..T..A..T. ....T..G.. C..C..CTCA .....G..T. .AAAA..C.. A..GA.A..T
.....T.... 1101
704/97 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
151/98 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G
..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
204/01 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
399/02 1032 ..T..G..
T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
624/02 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G
..T .....T.C.. 1101
755/02 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
046/04 1032 ..T..A..T. ....T..G.. C..C..CTCA
.....G..T. .AAAA..C.. A..GA.A..T .....T.... 1101
384/04 1032 ..T..G..T. .......G.. C..C..CTCA .....G..TT ..AAA..CA. A.AGA.G..T .....T.C.. 1101
CVS 1032 ..CA.
A..T. ....T..G.. CC.C..TTCA .....G..TT .AA.A..T.. G..GA.G..T .....T.... 1101
PV 1102 TGAACGGCGT GTTTTTTAAC GGCATTATTC TGGGCCCGGA TGGCAACGTG CTGATTCCGG AAA
TGCAGAG 1171
Pitman Moore 1102 .......G.. ......C..T ..T..A..AT .A..G..T.. C...C.T..C ..A..C..A. .G.....ATC 1171
222/90 1102 ..G....A.. ......C..T ..T..A.... .T..T..A.. C
..G..T..C T....C.... .G.....ATC 1171
419/90 1102 ..G....A.. ......C..T ..T..A.... .T..T..A.. C..G..T..C T....C.... .G.....ATC 1171
704/97 1102 ..G....A.. ...C.....T ..
...A.... ....T..... C..G..T..C .....A..A. .G.....ATC 1171
151/98 1102 ..G....A.. ...C..C..T .....A.... ....T..... C..G..T..C .....A..A. .G.....A
TC 1171
204/01 1102 ..G....A.. ...C..C..T .....A.... ....T..... C..G..T..C .....A..A. .G.....ATC 1171
399/02 1102 ..G....A.. ...C..C..T .....A.... ....T..... C..G
..T..C .....A..T. .G.....ATC 1171
624/02 1102 ..G....A.. ...C..C..T ..A..A.... ....T..... C..G..T..C .....A..A. .G.....ATC 1171
755/02 1102 ..G....A.. ...C
..C... .....A.... ....T..... C..G..T..C .....A..T. .G.....ATC 1171
046/04 1102 ..G....A.. ......C..T ..T..A.... .T..T..A.. C..G..T..C T....C.... .G...
..ATC 1171
384/04 1102 ..G....A.. ...C..C... .....A.... ....T..... C..G..T..C .....A..T. .G.....ATC 1171
CVS 1102 .......G.. ......C..T ..T..A..AT .A..A..T.. C
.....T..C T.A..C..A. .G.....ATC 1171
PV 1172 CAGCCTGCTG CAGCAGCATA TGGAACTGCT GGTGAGCAGC GTGATTCCGC TGATGCATCC GCTGGCGGAT 1241
Pitman Moore 1172 AT
C...C..C .....A.... ....GT..T. .AAATCTTCA ..T..C..C. .......C.. C.....A..C 1241
222/90 1172 GTC...A..C ..A..A.... ....GT..T. ..A.TC.TCT ..A..C..C. .A.
....... CT....A..C 1241
419/90 1172 GTC...A..C ..A..A.... ....GT..T. ..A.TC.TTT ..A..C..C. .A........ CT....A..C 1241
704/97 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G.
..T. ..A.TCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
151/98 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G...T. ..A.TCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.A.....C 1241
204/01 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G...T. ..A.TCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
399/02 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G...T. ..A.TCTTCT
..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
624/02 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G..AT. ..A.TCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
755/02 1172 GTCT..A..T .
.A..A.... ....G...T. ..A.TCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
046/04 1172 GTC...A..C ..A..A.... ....GT..T. ..A.TC.TCT ..A..C..C. .A........
CT....A..C 1241
384/04 1172 GTCT..A..T ..A..A.... ....G...T. ..AATCTTCT ..A..C..CT .A........ CT.......C 1241
CVS 1172 ATC...C..C .....A.... ....GT..T. ..
AATC.TCG ..T..C..C. .TG....C.. C.....A..C 1241
PV 1242 CCGAGCACCG TGTTTAAAAA CGGCGATGAA GCGGAAGATT TTGTGGAAGT GCATCTGCCG GATGTGCATG 1311
Pitman Moore 1242 ..TTCT.
.A. .T..C...G. A..T.....G ..T..G.... ....T..... T..C..C..C ......T.CA 1311
222/90 1242 ..ATCA..T. .C..C..GG. A........G ..A..GA.C. ....T..G..
T..CT..... ...A.T..CA 1311
419/90 1242 ..ATCA..T. .C..C..GG. A........G ..A..GA.C. ....T..G.. T..CT..... ...A.T..CA 1311
704/97 1242 ...TCA..A. .C..C
..GG. A..G...... .....G.... ....T..... T..C..C..A .....T..CA 1311
151/98 1242 ...TCA..A. .C..C..GG. A..G...... .....G.... ....T..... T..C..C..A .....T.
.CA 1311
204/01 1242 ...TCA..A. .C..C..GG. A..G...... .....G.... ....T..... T..C..C..A .....T..CA 1311
399/02 1242 ...TCA..A. .C..C..GG. A..G...... .....G..C. ...
.T..... T..C..T..A .....T..CA 1311
624/02 1242 ...TCA..A. .C..C..GG. A..G...... .....G.... ....T..... T..C..C..A .....T..CA 1311
755/02 1242 ...TCA..A. .C..C..GG
. A..G...... .....G..C. ....T..... T..C..C..A .....T..CA 1311
046/04 1242 ..ATCA..T. .C..C..GG. A........G ..A..GA.C. ....T..G.. T..CT..... .
..A.T..CA 1311
384/04 1242 ...TCA..A. .C..C..GG. A..G...... .....G..C. ....T..... T..C..C..A .....T..CA 1311
CVS 1242 ...TCT.... .T..C..GG. ...T..C..G ..T.
.G.... ....T..... T..C..T..C ........CA 1311
(continua)
61
(continuação)
PV 1312 AACGTATTAG CGGCGTGGAT CTGGGCCTGC CGAACTGGGG CAAATATGTG CTGCTGAGCG CGGGCGCGCT 1381
Pitman Moore 1312 ...AG..CTC A..G..T..C .....T..C. ..........
A..G.....A T..A...CT. .A..G..CA. 1381
222/90 1312 ...AGG.CTC ...GA.T..C ..T..T..C. .A........ G......T.. ...A....T. .A..T..T.. 1381
419/90 1312 ...AGG.CTC ...GA
.T..C ..T..T..C. .A........ G......T.. ...A....T. .A..T..T.. 1381
704/97 1312 ...AG..CTC ...G..T..C ..T..T..C. ...GT..... G......C.C ...A...TT. .
A..T.GT.. 1381
151/98 1312 ...AG..CTC ...G..T..C ..T..T..C. ...GT..... G......C.C ...A...TT. .A..T.GT.. 1381
204/01 1312 ...AG..CTC ...G..T..C ..T..T..C. ...G
T..... G......C.C ...A...TT. .A..T.GT.. 1381
399/02 1312 ...AG..CTC T..G..T..C ..T..T..C. ...GT..... G......C.C ...A...TT. .A..T.GT.. 1381
624/02 1312 ...AG..
CTC A..G..T... ..T..T..C. ...GT..... G......C.C ...A...TT. .A..T.GT.. 1381
755/02 1312 ...AG..CTC T..G..T..C ..T..T..C. ...GT..... G......C.C ...A
...TT. .A..T.GT.. 1381
046/04 1312 ...AGG.CTC ...GA.T..C ..T..T..C. .A........ G......C.. ...A....T. .A..T..T.. 1381
384/04 1312 ...AG..CTC T..G..T..C ..T..T
..C. ...GT..... G......C.C ...A...TT. .A..T.GT.. 1381
CVS 1312 .T.AGG.CTC A..A..T..C T....T..C. .......... G..G.....A T.A.....T. .A..G..C.. 1381
PV 1382 GACCGCGCTG ATGCTGATTA TTTTTCTGAT GACCTGCTGG CGTCGTGTGA ACCGTAGCGA ACCGACCCAG 1451
Pitman Moore 1382 ..TT.GC... G..T....AT ...CC..A.. ...A..G
..C A.AA.A.CC. .T..ACCA.. .T...AA..A 1451
222/90 1382 .G.A..A..A ..T....CA. .C..CT.A.. T..A..T..C A.AA.G..C. .TA.A.CA.. .T.A.TAA.. 1451
419/90 1382 .G.A
..A..A ..T....CA. .C..CT.A.. T..A..T..C A.AA.G..C. .TA.A.CA.. .T.A.TAA.. 1451
704/97 1382 .G.GA....A G.T.....A. .C.GCTCT.. .G.A.....T
A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
151/98 1382 .G.GA.A..A G.T.....A. .C.GCTCT.. .G.A.....T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
204/01 1382 .G.
GA.A..A G.T.....A. .C.GCTC... .G.A.....T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
399/02 1382 .G.G..A..A G.T.....A. .C.GCTC... .G.A..
...T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
624/02 1382 .G.GA.A..A GCT.....A. .C.GCTC... .G.A.....T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA
1451
755/02 1382 .G.G..A..A G.T.....A. .C.GCTC... .G.A.....T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
046/04 1382 .G.A..A..A ..T....CA. .C..CT.A.. T...
..T..C A.AA.G..C. .TA.A.CA.. .T.A.TAA.. 1451
384/04 1382 .G.G..A..A G.T.....A. .C.GCTC... .G.A.....T A.AA.AACC. .G..A.CA.. GT.A.GAAGA 1451
CVS
1382 ...T..CT.. ...T....A. ....C..... ...A..T..T A.AA.A..C. .T..ATCA.. ...T..G..A 1451
PV 1452 CATAACCTGC GTGGCACCGG CCGTGAAGTG AGCGT
GACCC CGCAGAGCGG CAAAATTATT AGCAGCTGGG 1521
Pitman Moore 1452 .GC.GTT.TG .A..G..A.. GA.GA.T... TCA..C..TT .C..A..... A...G.C..A CCTTCA.... 1521
222/90 1452 ..AGGT.CTG AG.AG
T.AA. AA.GA....A TCT..A..T. .C..A.A... G...G.C..A TCTTCA.... 1521
419/90 1452 ..AGGT.CTG AG.AGT.AA. AA.GA....A TCT..A..T. .C..A.A... G...G.C..A TCTTCA....
1521
704/97 1452 .GAGG.TCTG .A.AGT.A.A GAAAA.T... .CG.CA.... .C....CTA. G...G.CG.A TCTTCA.... 1521
151/98 1452 .GAGG.TCTG .A.AGT.A.A GAAAA.T... .CG.CA....
.C....CTA. G...G.CG.A TCTTCA.... 1521
204/01 1452 .GAGG.TCTG .A.AGT.A.A GA.AA.G..A .CG.CA.... .C....CTA. G...G.CG.A TCTTCA.... 1521
399/02 1452 .GAGG.TCTG
.A.AGT.A.A AAAGA.G..A .CG.CA.... .C..A.CTA. G...G.CG.A TCTTCA.... 1521
624/02 1452 .GAGG.TCT. .A.AGT.A.A GAAAA.G..A .CG.CA.... .C....CTA. G...G.CG
.A TCTTCA.... 1521
755/02 1452 .GAGG.TCTG .A.AGT.A.A AAAGA.G..A GCG.CA.... .C..A.CTA. G...G.C..A TCTTCA.... 1521
046/04 1452 ..AGGT.CTG AG.AGT.AA. AA.GA....A TCT
..A..T. .C..A.A... G...G.C..A TCTTCA.... 1521
384/04 1452 .GAGG.TCTG .A.AGT.A.A AAAGA.G..A .CG.CA.... .C..A.CTA. G...G.CG.A TCTTCA.... 1521
CVS 1452 ..C..T..CA
.A..G..A.. GA.G..G... TCA..C..T. .C..A..... G..G..C..A TCTTCA.... 1521
PV 1522 AAAGCTATAA AAGCGGCGGC GAAACCGGCC TG--- 1553
Pitman Moore 1522 ..TCA..... G..T..G..T
C.G...A.A. ..TGA 1556
222/90 1522 .GCTG..C.. ..AT..A... ..G...AAG. ..TGA 1556
419/90 1522 .GCTG..C.. ..AT..A... ..G...AAG. ..TGA 1556
704/97 1522 .GTTG..C.. G..T.AA
... ..TG..A.G. ..TGA 1556
151/98 1522 .GTTG..C.. G..T.AA... ..TG..A.G. ..TGA 1556
204/01 1522 .GTTG..C.. G..T.AA... ..TG..A.G. ..TGA 1556
399/02 1522 .GTTG..C.. G.
.T.AA... ..TG..A.GT ..TGA 1556
624/02 1522 .GTTA..C.. G..T.AA... ..TG..A.T. ..TGA 1556
755/02 1522 .GTTG..C.. G..T.AA... ..TG..A.GT ..TGA 1556
046/04 1522 .GTTG..
C.. ..AT..A... ..G...AAG. ..TGA 1556
384/04 1522 .GTTG..C.. G..T.AA... ..TG..A.GT ..TGA 1556
CVS 1522 ..TCAC.C.. G..T..G..T C.G...A.A. ..TGA 1556
Figura 9 - Alinhamento das seqüências de nucleotídeos do gene da proteína G de amostras
vírus da raiva isoladas de morcegos, com as amostras padrão CVS, PV e PM.
Em destaque: substituição de uma citosina (C) por uma guanina (G), na posição
392, nas amostras 704/97 e 151/98 – Rio de Janeiro – 2007-2008
62
Amostras
φ
φ φ
φ
(continua)
PV -19 MVPQALLFVP LLVFPLCFGK FPIYTIPDKL GPWSPIDIHH LSCPNNLVVE DEGCTNLSGF SYMELKVGYI
Pitman Moore -19 .......... ..G.S..... ........E.
.......... .......... ........E. .......... 51
222/90 -19 .I.....L.. .VISS..L.. .......... .......... .......... .....S.... ......
.... 51
419/90 -19 .I.....L.. .VISS..L.. .......... .......... .......... .....S.... .......... 51
704/97 -19 .IL....... ..ISS..L.. ..........
.......... .......... .......... .......... 51
151/98 -19 .IL....... ..ISS..L.. .......... .......... .......... .......... ...
....... 51
204/01 -19 .IL....... ..ISS..L.. .......... .......... .......... .......... .......... 51
399/02 -19 .IL....... ..ISS..L.. .....
..... .......... .......... .......... .......... 51
624/02 -19 .IL....... ..ISS..L.. .......... .......... .......... .........
. .......... 51
755/02 -19 .IL....... ..ISS..L.. .......... .......... .......... .......... .......... 51
046/04 -19 .I.....L.. .VISS..L.. .
......... .......... .......... .....S.... .......... 51
384/04 -19 .IL....... ..ISS..L.. .......... .......... .......... ......
.... .......... 51
CVS -19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 51
Pe
p
tídeo-sinal
EctodomínioÆ
II b
PV 52 SAIKMNGFTC TGVVTEAETY TNFVGYVTTT FKRKHFRPTP DACRAAYNWK MAGDPRYEES LHNPYPDYHW 121
Pitman Moore 52 ....V..... .......... ....
...... .......... .......... .......... .......... 121
222/90 52 ....V..... .......... .......... ........MS .......... V
......... .Q........ 121
419/90 52 ....V..... .......... .......... ........MS .......... V......... .Q........ 121
704/97 52 ....V
..... .......... .......... ........I. .......... .......... .Q....E... 121
151/98 52 ....V..... .......... .......... ..
......I. .......... .......... .Q....E... 121
204/01 52 ....V..... .......... .......... ........I. .......... .........
. .Q........ 121
399/02 52 ....V..... .......... .......... ........M. .......... .T........ .Q........ 121
624/02 52 ....V..... .
......... .......... ........I. .......... .......... .Q........ 121
755/02 52 ....V..... .......... .......... ........V
. .......... .......... .Q........ 121
046/04 52 ....V..... .......... .......... ........MS .......... V......... .Q...
..... 121
384/04 52 ....V..... .......... .......... ........V. .......... IT........ .Q........ 121
CVS 52 L......... .........
. .......... .......... .......... .......... .......... 121
PV 122 LRTVKTTKES LVIISPSVAD LDPYDRSLHS RVFPGGNCSG VAVSSTYC
ST NHDYTIWMPE NPRLGMSCDI 191
Pitman Moore 122 ....R..... .I......T. .....K.... ......K... IT........ .......... ...PRTP... 191
222/90 122 ...
....... .I........ .....K..R. .I....K.L. IT........ .......... EA...T.... 191
419/90 122 .......... .I........ .....K..R. .I..
..K.L. IT........ .......... EA...T.... 191
704/97 122 .......... .I........ .....K.... ......K.L. IT........ .......... E....
T.... 191
151/98 122 .......... .I........ .....K.... ......K.L. IT........ .......... E....T.... 191
204/01 122 .......... .I........ ....
.K.... ......K.L. IT........ .......... E....T.... 191
399/02 122 .......... .I........ .....K.... ......K.L. IT........ .....
..... E....T.... 191
624/02 122 .......... .I........ .....K.... ......K.L. IT........ .......... E....T.... 191
755/02 122 .......... .I..
...... .....K.... ......K.L. IT........ .......... E....T.... 191
046/04 122 .......... .I........ .....K..R. .I....K.L. IT
........ .......... EA...T.... 191
384/04 122 .......... .I........ .....K.... ......K.L. IT........ .......... E....T.... 191
CVS 122
.......... .......... .......... ....S.K.P. .......... .......... .......... 191
II
II
PV 192 FTNSRGKRAS KGSETCGFVD ERGLYKSLKG ACKLKLCGVL GLRLMDGTWV AMQTSNETKW CPPGQLVNLH 261
Pitman Moore 192 .......... ..NK...... ...
....... ..R....... .......... .....D.... ...D...... 261
222/90 192 ....K..... ..GKI..... .......... ..R......S ..........
.I...E.I.. ..SD...... 261
419/90 192 ....K..... ..GKI..... .......... ..R......S .......... .I...E.... ..SD...... 261
704/97 192 ..S.K
..K.. ..GK...... .......... .......... .......... SI...DD... ...D...... 261
151/98 192 ..S.K..K.. ..GK...... .......... .....
..... .......... SI...DD... ...D...... 261
204/01 192 ..S.K..K.. ..GK...... .......... .......... .......... SI...DD... ...D.....
. 261
399/02 192 ..S.K..K.. ..GK...... .......... .......... .......... SI...DD... ...D...... 261
624/02 192 ..S.K..K.. ..GK...... ........
.. .......... .......... SI...DD... ...D...... 261
755/02 192 ..S.K..K.. ..GK...... .......... .......... .......... SI...DD...
...D...... 261
046/04 192 ....K..... ..GKI..... .......... ..R......S .......... .I...E.... ..SD...... 261
384/04 192 ..S.K..K.. ..GK..
.... .......... .......... .......... SI...DD... ...D...... 261
CVS 192 .......... .......... .......... .......... .
......... .......... ...D...... 261
II a
63
(continuação)
φ
φ
(continua)
PV 262 DFRSDEIEHL VVEELVKKRE ECLDALESIM TTKSVSFRRL SHLRKLVPGF GKAYTIFNKT LMEADAHYKS 331
Pitman Moore 262 .......... .......... .......... ...
....... .......... .......... .......... 331
222/90 262 ..H....... .......... ....T..... .......... .......... .......... ....
....N. 331
419/90 262 ..H....... .......... ....T..... .......... .......... .......... ........N. 331
704/97 262 ..H....... .......... ....
...... .......... .Y........ .......... .......... 331
151/98 262 ..H....... .......... .......... .......... .Y........ ......
.... .......... 331
204/01 262 ..H....... .......... .......... .......... .Y........ .......... .......... 331
399/02 262 ..H....... ......
.... .......... .......... .Y........ .......... .......... 331
624/02 262 ..H....... .......... .......... .......... .Y.......
. .......... .......... 331
755/02 262 ..H....... .......... .......... .......... .Y........ .......... .......... 331
046/04 262 ..H...
.... .......... ....T..... .......... .......... .......... ........N. 331
384/04 262 ..H....... .......... .......... ..........
.Y........ .......... .......... 331
CVS 262 .......... ......R... .......... .......... .......... .......... ..........
331
IV
III
PV 332 VRTWNEIIPS KGCLRVGGRC HPHVNGVFFN GIILGPDGNV LIPEMQSSLL QQHMELLVSS VIPLMHPLAD 401
Pitman Moore 332 .......... ....K..... .......... .....
...H. .......... .......K.. .......... 401
222/90 332 .......... ....K..... ....D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
419/90 332
.......... ....K..... ....D..... .......... .......... .......E.F .......... 401
704/97 332 .......... ....K.RE.. ..P.D..... .....
..... .......... .......E.. .......... 401
151/98 332 .......... ....K.RE.. ..P.D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
204/01 332
.......... ....K.RE.. ..P.D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
399/02 332 .......... ....K.RE.. ..P.D..... ......
.... .......... .......E.. .......... 401
624/02 332 .......... ....K.RE.. ..P.D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
755/02 332 .
......... ....K.RE.. ..P.D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
046/04 332 .......... ....K..... ....D..... .......
... .......... .......E.. .......... 401
384/04 332 .......... ....K.RE.. ..P.D..... .......... .......... .......E.. .......... 401
CVS 332 ..
.....L.. .......... .......... .......... .......... .......E.. ....V..... 401
III a
III
PV 402 PSTVFKNGDE AEDFVEVHLP DVHERISGVD LGLPNWGKYV LLSAGALTAL MLIIFLMTCW RRVNRSEPTQ 471
Pitman Moore 402 ......E... .......... ..YKQ.....
.......... .MT...MIG. V..FS...WC ..A..P.SK. 471
222/90 402 ......E... ..N....... .I.KQV..I. .........L .M.....A.. I.T...I..C
.....T.SIK 471
419/90 402 ......E... ..N....... .I.KQV..I. .........L .M.....A.. I.T...I..C .....T.SIK 471
704/97 402 ......E... ........
.. ...KQ..... ....S....L .MI..G.AT. V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
151/98 402 ......E... .......... ...KQ..... ....S....L .MI..G.AT.
V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
204/01 402 ......E... .......... ...KQ..... ....S....L .MI..G.AT. V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
399/02 402 ......E... ......
.... ...KQ..... ....S....L .MI..G.A.. V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
624/02 402 ......E... .......... ...KQ..... ....S....L .MI..G.AT.
A...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
755/02 402 ......E... .......... ...KQ..... ....S....L .MI..G.A.. V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
046/04 402 ......E... ..N.
...... .I.KQV..I. .........L .M.....A.. I.T...I..C .....T.SIK 471
384/04 402 ......E... .......... ...KQ..... ....S....L .MI
..G.A.. V...CS.A.C ..TK.T.SRR 471
CVS 402 ......D... .......... ...NQV.... .......... .......... .........C .......... 471
Transmembrana
ÅEctodomínio
EndodomínioÆ
64
(continuação)
Figura 10. Alinhamento e tradução das seqüências de nucleotídeos
do gene da proteína G
das amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos e das amostras padrão CVS, PV e
PM. Destaque em linha tracejada para a região do peptídio-sinal (ou SP – Signal Peptide) e
para o domínio transmembrana. Caixas de linha contínua indicam os principais sítios
antigênicos e epítopos. Phi (φ) indica os resíduos envolvidos na patogenicidade. Círculo
destaca a substituição presente na posição 118 das amostras 704/97 e 151/98 – Rio de
Janeiro – 2007-2008
A região do ectodomínio do gene da proteína G das amostras do vírus da
raiva isoladas de morcegos apresenta-se mais conservada, com 89,75% de
identidade entre os aminoácidos, enquanto a região do peptídeo de sinal apresenta
63,15% de identidade, seguida da região do endodomínio com 38,63% e o domínio
transmembrana com 33,33%, quando comparado à amostra vacinal Pitman-Moore.
As três amostras isoladas de morcegos insetívoros (222/90, 419/90 e 046/04)
apresentaram o mesmo padrão de substituições de aminoácidos, à exceção de uma
substituição de uma serina por uma fenilalanina na posição 391 da amostra 419/90.
Algumas destas substituições estão presentes nas regiões II b (posição 37), II
(posição 147), II a (posição 199), “a” (posição 264) e III (posição 330), que são sítios
antigênicos e epítopos.
A substituição de uma citosina (amostras PM e CVS)/timina (amostra PV) por
uma guanina na posição 392 da seqüência de nucleotídeos das amostras 704/97 e
158/98, determinou a substituição do aminoácido ácido aspártico pelo ácido
glutâmico.
PV 472 HNLRGTGREV SVTPQSGKII SSWESYKSGG ETGL 505
Pitman Moore 472 RSFG....N. ...S....V. P......... Q.R.* 505
222/90 472 QGPEESR.K. .....N..V. ....
L..N.. ..K.* 505
419/90 472 QGPEESR.K. .....N..V. ....L..N.. ..K.* 505
704/97 472 RGSGESEKN. TA...TR.VV ....L...E. DAR.* 505
151/98 472 RGSGESEKN
. TA...TR.VV ....L...E. DAR.* 505
204/01 472 RGSGESE.K. TA...TR.VV ....L...E. DAR.* 505
399/02 472 RGSGESEKK. TA...TR.VV ....L...E.
DAR.* 505
624/02 472 RGS.ESEKK. TA...TR.VV ....L...E. DAS.* 505
755/02 472 RGSGESEKK. AA...TR.V. ....L...E. DAR.* 505
046/04 472 QGPEESR.K. .....N
..V. ....L..N.. ..K.* 505
384/04 472 RGSGESEKK. TA...TR.VV ....L...E. DAR.* 505
CVS 472 .......... .......... .....H.... Q.R.* 505
65
5 DISCUSSÃO
O período de incubação da raiva é longo e variável em humanos e animais,
geralmente de 20 a 90 dias, podendo ser superior a um ano, em alguns casos
(SMITH et al., 1991). Entretanto, uma característica biológica do vírus da raiva
relaciona-se à diminuição e fixação deste período quando são realizadas passagens
seriadas em laboratório (KING; TURNER, 1993). No presente estudo, nas
passagens realizadas com as amostras isoladas de morcegos, pôde-se verificar a
redução do período médio de incubação, após o qual se observou a ocorrência dos
sinais clínicos característicos da infecção pelo genótipo 1 do vírus da raiva em
camundogos (WINKLER, 1991).
Na fase inicial deste experimento, verificou-se que a dose do vírus-desafio do
ensaio imunológico, calculada com base em apenas uma titulação das amostras de
quinta passagem, freqüentemente não apresentou o resultado esperado e tampouco
se manteve na faixa de validação do teste. Ainda que tenhamos utilizado a média de
três titulações para o cálculo da dose do vírus-desafio e sua variância tenha sido
inferior a 10%, enfrentamos as mesmas dificuldades nos ensaios posteriores.
Para o cálculo da potência relativa da vacina anti-rábica de uso humano
produzida em células Vero, considerou-se que: quando a DE
50
da vacina teste
excede a última diluição, mas os critérios de validação da dose do vírus-desafio e da
DE
50
da vacina referência forem alcançados, o ensaio deve ser considerado válido e
o título da vacina teste deve ser expresso como >2,5 UI/dose (INSTITUTO
NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, 2004). Assim, a vacina
utilizada neste experimento atingiu a potência mínima estabelecida para a liberação
de um lote de vacina de uso humano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1994).
Wilbur e Aubert (1999) recomendam o uso do teste estatístico de Probito
para a determinação da DE
50
. Entretanto, quando o número de animais
sobreviventes em uma diluição é igual ou próximo ao número de animais
sobreviventes na diluição anterior ou posterior, os dados não se ajustam ao modelo
66
matemático, que, então, não produz dados significativos ou gera dados aberrantes.
Por este motivo, optamos por calcular a DP
50
pelo método de Reed e Müench
(1938), à semelhança de outros autores (ZANETTI et al., 1998).
Um dos critérios de validação do teste NIH é a proteção de mais de 70% dos
camundongos vacinados com a diluição 1:5 (WILBUR; AUBERT, 1999) - valor este
que não foi alcançado nos ensaios imunológicos realizados com as amostras
704/97, 151/98, 399/02 e 624/02, isoladas de morcegos hematófagos. Este
resultado está em conformidade com o achado de Bernardi et al. (2005) para uma
vacina anti-rábica de uso veterinário importada, que não apresentou resultado
satisfatório no teste CDC, quando este foi realizado com uma amostra de morcego
hematófago.
Zanetti et al. (1998) avaliaram a atividade protetora da vacina Fuenzalida-
Palácios modificada, utilizando como vírus-desafio (30 a 50 DL
50
/0,03 mL) as
amostras padrão CVS e outra isolada de morcego hematófago, nos testes de Habel
e NIH, e verificaram que 94,4% dos camundongos foram protegidos pela vacina
diluída a 1:5, no desafio com a amostra CVS e apenas 36,2% dos camundongos
foram protegidos quando o desafio foi realizado com a variante de morcego
hematófago. Utilizando a vacina anti-rábica de uso humano produzida em células
Vero, encontramos 100% de proteção dos camundongos para o teste NIH realizado
com a amostra CVS e, dentre os desafios realizados com as amostras de morcego,
o pior resultado encontrado foi 43,8% de proteção na diluição 1:5 da vacina, quando
a amostra utilizada foi a 151/98.
Dietzschold e Hooper (1998) estudaram a imunidade conferida pela vacina
anti-rábica produzida em célula diplóide humana, vacinando os camundongos nos
dias 0 e 10 (100 μL por via intra-peritoneal), com posterior desafio no dia 20, por via
intracerebral, utilizando como vírus-desafio (100 DL
50
) uma amostra de vírus da
raiva isolada de morcego insetívoro (Silver-haired bat) e observaram que 100% dos
camundongos foram protegidos com a diluição 1:5 da vacina e 30% com a diluição
1:125, tendo a vacina utilizada apresentado uma DE
50
de 1:54,7. Em nosso
trabalho, a dose de vacina aplicada nos camundogos foi 5 vezes maior que a
67
utilizada por estes autores e a dose do vírus-desafio foi cerca de um quinto inferior
para as amostras isoladas de morcegos insetívoros, as quais apresentaram um
percentual de proteção de 93,8% (222/90), 93,8% (419/90) e 100% (046/04), donde
se pode concluir que as diferenças de proteção observadas em nosso trabalho
estão relacionadas com a amostra viral utilizada, em conformidade com a assertiva
de Barth, Diderrich e Weineman (1988) e Zaneti et al. (1998). Em adição, para o
ensaio imunológico realizado com as amostras 704/97 e 151/98, relacionadas
quanto ao gene G e as únicas a apresentarem uma substituição de aminoácido em
comum na posição 118 deste gene, verificou-se que, para o desafio com 31,62 DL
50
da amostra 704/97, a DP
50
foi inferior à obtida com 50,69 DL
50
da amostra 151/98.
Vários trabalhos que estudaram a proteção conferida pela vacina anti-rábica
frente a amostras de campo do vírus da raiva, em camundongo, (ZANETTI et al.,
1998; PIZA et al., 2002; BERNARDI et al., 2005; WUNDERLI et al., 2006), relatam
apenas o intervalo da dose do vírus-desafio utilizada no ensaio, e não o seu valor
exato, obtido na sua titulação-controle, realizada em concomitância ao desafio dos
animais vacinados.
Uma das grandes dificuldades deste trabalho foi o estabelecimento da dose
do vírus-desafio dentro dos limites estabelecidos pelo teste NIH, não só para as
amostras isoladas de morcegos, como também para a amostra padrão CVS do
vírus da raiva. Desta forma, para cada ensaio imunológico realizado à semelhança
do teste NIH, cerca de uma a duas repetições se fizeram necessárias para a
padronização da dose de desafio viral entre 12 e 50 DL
50
– uma dificuldade não
relatada em outros trabalhos.
Wunderli et al. (2006) propuseram uma nova metodologia, chamada de RPC
(Rabies Peripheral Challenge), para testar a potência da vacina anti-rábica. O
método, baseado na vacinação de camundongos por via intramuscular, em uma
única dose (0,1 mL), com desafio viral após 28 dias, utilizando a amostra do vírus
da raiva padrão CVS, por via intramuscular (50-200 DL
50
/0.03mL) apresentou
valores de potência relativa quase três vezes maiores do que o teste NIH, para a
vacina de uso humano, e valores similares para a vacina de uso veterinário,
68
sugerindo que o teste RPC apresenta-se como um modelo que oferece uma melhor
sensibilidade analítica e está mais próximo de refletir a realidade da vacinação
rotineiramente aplicada.
Dada a existência de amostras antigenicamente distintas do vírus da raiva, o
teste de potência da vacina anti-rábica deveria ter, como vírus-desafio, uma
amostra circulante em uma dada região geográfica, onde a vacina é utilizada.
Assim, se uma vacina não oferecesse resultados satisfatórios, a amostra vacinal
poderia ser substituída por outra capaz de oferecer proteção contra a amostra de
campo local (WIKTOR; KOPROWSKI, 1980).
A árvore filogenética das amostras isoladas de morcego, quanto ao gene da
proteína N, apresentou o padrão de agregação esperado, com a formação de dois
grupos distintos denominados variante de morcego hematófago e variante de
morcego insetívoro, em concordância com os resultados de Kobayashi et al. (2005)
e Kobayashi et al. (2007c). O mesmo padrão de agregação das amostras foi
observado na árvore filogenética contruída com base nas seqüências obtidas do
gene da proteína G.
Em relação ao gene N, as amostras 704/97 e 151/98, isoladas na Região
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, formaram um agrupamento com amostras
isoladas do Município de Quissamã, Norte do Estado, isoladas de morcegos D.
rotundus, em 2006. Romijn et al. (2003) relatam diferenças no agrupamento de
amostras das mesmas regiões, por estarem em bacias hidrográficas distintas, mas
este padrão não foi observado em nosso estudo, nem por aquele realizado por
Vieira (2007). O contraste entre os agrupamentos da árvore filogenética construída
foi observado entre as amostras das Regiões Noroeste e Sul, visto que a amostra
624/02 está agrupada com amostras do Município de Lindóia, na Região Norte do
Estado de São Paulo.
No presente estudo não foram encontradas diferenças temporais entre as
amostras estudadas, visto que a amostra 046/04, de 2004, se relaciona com o
agrupamento formado pelas amostras 222/90 e 419/90, de 1990, sustentada por um
69
valor de bootstrap de 100, quanto aos genes da proteína G e da proteína N, em
conformidade com o achado de Heinemann (2000) que estudou o polimorfismo da
proteína N. Em adição, a substituição do aminoácido lisina (posição 330), envolvido
na patogenicidade, por um resíduo de asparagina, foi encontrado nas seqüências
do gene da proteína G das três amostras.
Uma correlação entre os dados imunológicos, genéticos e geográficos foi
notada entre as amostras 704/97 e 151/98, pois seus resultados no ensaio
imunológico foram semelhantes e as mesmas estão intimamente relacionadas
quanto às suas seqüências da proteína G e quanto à sua localização espacial, a
noroeste do Estado do Rio de Janeiro e são, provavelmente, pertencentes ao
mesmo surto. Estas amostras foram as únicas a apresentar a substituição de um
ácido aspártico por um ácido glutâmico na posição 118 e as únicas em cujos
ensaios imunológicos a vacina anti-rábica de uso humano apresentou o mais baixo
desempenho, podendo-se inferir que esta substituição pode ter alterado a
antigenicidade das amostras.
O gene que codifica a proteína G é composto das regiões: peptídeo de sinal,
ectodomínio, região transmembrana e endodomínio. Na região do ectodomínio
estão localizados os sítios antigênicos II e III e epítopos (aminoácidos 33-42, 147,
183, 198-202, 264, 330-338 e 357) e resíduos envolvidos na patogenicidade
(aminoácidos 33, 132, 147, 198, 330 e 333) (BADRANE et al., 2001).
Entre as variantes de morcego hematófago e as variantes de morcegos
insetívoros o alinhamento das seqüências de aminoácidos do gene da proteína G
apresentou 3 diferenças em sítios antigênicos e muitas diferenças nas regiões do
peptídeo de sinal, transmembrana e endodomínio. Como Badrane et al. (2001),
verificamos que a região mais conservada é do ectodomínio, com 89,75% de
identidade entre os aminoácidos, quando a comparação é realizada com a amostra
vacinal Pitman-Moore.
A proteína G não é somente o principal antígeno responsável pela indução
da produção de anticorpos neutralizantes (WIKTOR et al., 1973), mas também é a
70
principal proteína envolvida na patogenicidade do vírus da raiva. A presença do
resíduo arginina na posição 333 do gene da proteína G é descrita como sendo
necessária para infecção viral (DIETZSCHOLD et al., 1983; SEIF et al., 1985), pois
sua substituição pode afetar a disseminação do vírus célula-célula, tornando a
amostra menos patogênica ou apatogênica (WUNNER, 2002).
Em nosso estudo, a única substituição encontrada em um resíduo envolvido
na patogenicidade viral está relacionada às três variantes de morcegos insetívoros
e foi mesma substituição da amostra mutante desenvolvida por Coulon et al. (1998)
que, estudando um vírus mutante da amostra CVS (RK-4), com a substituição do
resíduo lisina (posição 330) por uma asparagina, verificaram que a amostra mutante
apresentou-se altamente patogênica para camundongos adultos. No ensaio
biológico, verificou-se que a inoculação intracerebral dos camundongos com a
amostra 222/90 determinava sintomatologia clínica com quadro exacerbado de
excitação e canibalismo, diferente das outras amostras. Entretando, em todos os
ensaios imunológicos realizados com estas amostras (222/90, 419/90 e 046/04), o
percentual de proteção dos camundongos vacinados com a vacina diluída a 1:5 foi
superior a 90%, ressaltando a eficiência da neutralização viral conferida pelos
anticorpos induzidos pela vacinação.
A divergência observada no dendograma da relação filogenética entre as
amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos e padrão PV, CVS e PM não é
uma surpresa, visto que a maioria dos vírus-fixo são originários da amostra isolada
por Pasteur, após muitas passagens em cérebro de coelhos e adaptação a
diferentes sistemas hospedeitos in vivo e in vitro (SACRAMENTO et al., 1992).
No Brasil, a raiva humana transmitida por morcegos hematófagos atingiu seu
número máximo de casos nos anos de 2004 e 2005, na Região Amazônica
(ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD, 2006). No Estado do Rio de
Janeiro, há mais de 20 anos a raiva permanece esporádica no ambiente urbano,
mas continuam ocorrendo casos de raiva transmitida por morcegos hematófagos a
herbívoros, no ambiente rural, principalmente em bovinos e eqüinos.
71
Nos conglomerados urbanos uma atenção especial deve ser dada para a
raiva em morcegos não-hematófagos, já detectada em várias espécies (UIEDA;
HARMANI; SILVA, 1995; MARTORELLI et al., 1995; BERNARDI et al., 1998;
UIEDA, 1998; SILVA et al., 2007).
Atualmente existe uma grande população de cães de rua e, embora o ciclo
urbano da raiva com a variante canina seja considerado extinto na cidade do Rio de
Janeiro, nada impede que um spillover ocorra e, um morcego infectado pelo vírus
da raiva entre em contato com estes animais e disto resulte um aumento do risco de
transmissão da raiva a humanos.
Neste contexto, encontramos que a vacina anti-rábica de uso humano
utilizada na imunização pré e pós-exposição no Brasil protegeu mais de 80% dos
camundongos na diluição 1:5 frente ao desafio com maioria das amostras isoladas
de morcegos do Estado do Rio de Janeiro. Entretanto, dada a alteração genética e
resultados inferiores do ensaio imunológico com as amostras 704/97 e 151/98,
novos estudos moleculares acerca das amostras do vírus da raiva isoladas da
Região Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, associados a ensaios
imunobiológicos, devem ser realizados para que se possa conhecer a extensão da
importância deste achado para humanos e animais vacinados frente ao risco de
exposição às amostras do vírus da raiva isoladas de morcegos.
72
6 CONCLUSÕES
- As amostras de vírus estudadas apresentaram comportamento biológico em
camundongos compatíveis com aqueles descritos para o vírus clássico da raiva,
genótipo 1.
- O desafio viral de camundongos previamente vacinados com a vacina anti-rábica
de uso humano apresentou resultados satisfatórios, com mais de 80% dos
camundongos protegidos, para a maioria das amostras estudadas.
- A análise genética do gene da proteína N permitiu segregar as amostras em
variante de morcego hematófago e variante de morcego insetívoro, com diferenças
filogenéticas entre as variantes de morcego hematófago isoladas na Região
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro e aquelas isoladas nas Regiões Metropolitana
e Sul do Estado.
- A substituição do resíduo ácido aspartico por ácido glutâmico na posição 118,
encontradas na caracterização genética da proteína G das amostras 704/97 e
151/98, permite inferir que esta posição esteja relacionada à antigenicidade viral.
73
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